ES2952603T3 - Método para generar células dendríticas humanas para inmunoterapia - Google Patents

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Abstract

En diversas realizaciones, se proporcionan métodos para producir una población celular enriquecida en células dendríticas CLEC9A+ donde los métodos implican cultivar células madre y/o células progenitoras en un cultivo celular que comprende medio de cultivo, un ligando notch, factor de células madre (SCF), ligando FLT3 (FLT3L); trombopoyetina (TPO); e IL-3 y/o GMCSF. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para generar células dendríticas humanas para inmunoterapia
Antecedentes
El uso de células dendríticas (CD) para presentar antígenos asociados a tumores a linfocitos T autólogos (las llamadas "vacunas con células dendríticas" o "vacunas contra el cáncer") se ha investigado ampliamente como un enfoque para la inmunoterapia contra el cáncer y ha dado lugar a una terapia aprobada por la FDA (sipuleucel-T). En conjunto, sin embargo, este enfoque ha demostrado solo una modesta eficacia clínica, que puede deberse a múltiples factores, incluidas las propiedades intrínsecas de las CD, las propiedades del antígeno tumoral, la activación de puntos de control de linfocitos T endógenos y las respuestas tumorales adaptativas in vivo (revisado en Palucka y Banchereau (2012) Nat. Rev. Cancer, 12: 265-277). De estas, las propiedades intrínsecas de las CD pueden presentar una barrera inicial decisiva para el desarrollo de vacunas con CD eficaces, ya que la primovacunación con linfocitos T adecuada es un requisito para la eficacia posterior.
Un determinante clave de las propiedades intrínsecas de las CD es la fuente y el tipo de CD utilizado. Las vacunas con CD clínicas se han basado casi exclusivamente en CD procedentes de monocitos (CDMo, también conocidas como "CD inflamatorias"), que, normalmente, son células presentadoras de antígeno CD14+ CD-SIGN+ generadas a partir de monocitos sanguíneos o HSPC CD34+ mediante cultivo en condiciones libres de estroma en presencia de GM-CSF e IL-4, seguido de "maduración" con estímulos proinflamatorios como interferón-gamma, TNF-a, LPS o poli I:C. Las CDMo tienen varias limitaciones: En primer lugar, son relativamente ineficaces en la presentación cruzada de antígenos celulares a los linfocitos T CD8+ y en la estimulación de las respuestas de los linfocitos T citotóxicos (CTL, del inglés cytotoxic T cell), y, por lo tanto, deben cargarse con péptidos exógenos. Esto ha necesitado el conocimiento previo y la síntesis de epítopos con especificidad HLA y, dependiendo del péptido, puede restringir la presentación del antígeno a un contexto del MHC de clase I. La restricción de clase I puede impedir la inducción de respuestas Th1/Th2, que se necesitan para respuestas citotóxicas y de memoria T duraderas in vivo. Además, el requisito de carga de péptidos exógenos limita el uso de vacunas con CDMo en pacientes con haplotipos HLA para los que se conocen secuencias peptídicas de unión a HLA inmunodominantes. La electroporación de CDMo con ARNm procedente de tumores o ARNm que codifica antígenos asociados a tumores es un enfoque experimental para promover la presentación de antígenos sin restricciones de clase y haplotipo; sin embargo, este enfoque aún puede dar como resultado una eficacia variable según la eficiencia de la transcripción del ARNm y la presentación del antígeno a través de las vías de clase I y clase II, y también tiene el coste de una menor viabilidad celular debido a la electroporación. Finalmente, tras la transferencia adoptiva, las CDMo de procedencia in vitro son relativamente ineficaces para dirigirse a órganos linfoides secundarios (OLS), que pueden limitar de manera decisiva su actividad in vivo. Balan et al. (The Journal of Immunology 193.4 (2014): 1622-1635) se refiere a células dendríticas XCR1+ humanas de procedencia in vitro de progenitores CD34+ que se parecen mucho a las células dendríticas sanguíneas, incluyendo su capacidad de respuesta adyuvante, contrario a las células dendríticas procedentes de monocitos. Aurélie, et al. (Blood 107.7 (2006): 2694-2701) se refiere al ligando Notch delta-1 que es un cofactor de desarrollo hematopoyético para células dendríticas plasmocitoides. El documento WO2011/131944 se refiere a métodos para obtener células dendríticas. Van der Aa et al. (Seminars in cell & developmental biology, vol. 41, págs. 39-48, Academic Press, 2015) se refiere a la función y el desarrollo de las células dendríticas humanas BCDA3+ CLEC9A+.
Sumario de la invención
La invención proporciona un método para producir una población celular enriquecida en células dendríticas CLEC9A+, comprendiendo dicho método cultivar células madre y/o células progenitoras en un cultivo celular que comprende: medio de cultivo que comprende uno o más de factor de células progenitoras (SCF, del inglés stem cell factor), ligando FLT3 (FLT3L), trombopoyetina (TPO), IL-3 y GM-CSF; y células del estroma que comprenden un ácido nucleico que codifica y expresa un ligando Notch.
La invención también proporciona un método para preparar una vacuna con células dendríticas para un sujeto, comprendiendo dicho método: preparar una población celular enriquecida en células dendríticas CLEC9A+ mediante el método de la invención; y pulsar y/o cargar dichas células dendríticas con un antígeno de células tumorales y/o un lisado de células tumorales o preparación de células tumorales, en donde opcionalmente dicho método comprende: (a) proporcionar un agonista de TLR3 y/o un agonista de TLR8 a dichas células dendríticas; y/o (b) pulsar y/o cargar dichas células dendríticas con un antígeno de células tumorales, neoantígeno de células tumorales, o con un lisado o preparación de células tumorales.
Sumario de las enseñanzas técnicas
La invención se define en las reivindicaciones independientes. Los aspectos y realizaciones preferentes adicionales se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona meramente con fines ilustrativos.
En el presente documento se describen métodos para generar y/o expandir de manera eficaz un gran número de células dendríticas CLEC9A+ humanas. De manera adicional, en el presente documento se describen células dendríticas CLEC9A+ y poblaciones de células dendríticas CLEC9A+ producidas por estos métodos.
Las CD CLEC9A+ son un tipo de CD de origen natural que presentan una potente capacidad de presentación cruzada y estimulación de CTL, así como el potencial para provocar respuestas de linfocitos T Th1 y Th2 in vivo (revisado en Van der Aa et al. (2014) Semin. Cell Dev. Biol. PMID: 24910448; y Tullett et al. (2014) Front Immunol. 22(5): 239). Estas propiedades intrínsecas de las células permiten el procesamiento y la presentación cruzada de epítopos globales de células tumorales o preparaciones de células tumorales inalteradas, obviando la necesidad de carga in vitro con péptidos dirigidos a HLA definidos o electroporación de ARNm. Se cree que la provisión de grandes cantidades de CD CLEC9A+ como se describe en el presente documento permite el desarrollo de "vacunas" contra el cáncer sin necesidad de identificación y síntesis de epítopos específicos de tumores. Las CD CLEC9A+ permiten el procesamiento y la presentación de antígenos a través de las vías del MHC de clase I y clase II; y permiten su uso en pacientes de cualquier haplotipo del HLA.
A medida que las CD CLEC9A+ de origen natural circulan fisiológicamente en la sangre y se dirigen a los OLS, se cree que las CD generadas como se describe en el presente documento demostrarán ser superiores a las CDMo en la búsqueda de OLS. Por lo tanto, mediante los métodos descritos en el presente documento, las CD CLEC9A+ presentan una oportunidad única para desarrollar mejores inmunoterapias con CD. Se cree que esto no ha sido posible antes debido a la rareza de las CD CLEC9A+ en la sangre y la incapacidad in vitro para generar o expandir cantidades suficientes para su uso en estudios humanos.
La invención proporciona un método para producir una población celular enriquecida en células dendríticas CLEC9A+, comprendiendo dicho método cultivar células madre y/o células progenitoras en un cultivo celular que comprende: medio de cultivo que comprende uno o más de factor de células progenitoras (SCF, del inglés stem cell factor), ligando FLT3 (FLT3L), trombopoyetina (TPO), IL-3 y GM-CSF; y células del estroma que comprenden un ácido nucleico que codifica y expresa un ligando Notch.
Dicho cultivo celular puede comprender factor de células progenitoras (SCF).
Dicho cultivo celular puede comprender el ligando FLT3 (FLT3L).
Dicho cultivo celular puede comprender trombopoyetina (TPO).
Dicho cultivo celular puede comprender IL-3 y/o GM-CSF.
Dicho ligando Notch puede comprender un ligando Notch natural o un fragmento del mismo.
Dicho ligando Notch natural se puede seleccionar del grupo que consiste en el ligando 4 de tipo delta (DLL4), ligando 1 de tipo delta (DLL1), Jagged 1 (JAG1), Jagged 2 (JAG2), ligando 3 de tipo delta (DLL3) y X-delta 2.
Dicho ligando Notch natural puede ser DLL4.
Dicho ligando Notch natural puede ser DLL1.
Dicho ligando Notch puede comprender un ligando Notch no natural.
Dicho ligando Notch no natural se puede seleccionar del grupo que consiste en contactina-1, NOV/CCN3, contactina-6, periostina/OSF-2, DLK2/EGFL9, Pref-1/DLK1/FA1, DNER, trombospondina-2, MAGP-1/MFAP2, trombospondina-3, m Ag P-2/MFAP5, trombospondina-4 y netrina-1.
Dichas células madre y/o células progenitoras pueden comprender células madre y/o células progenitoras hematopoyéticas (HSPC).
Dichas células pueden comprender una población celular enriquecida en células CD34+.
Dichas células pueden proceder de la médula ósea, del cordón umbilical, de la sangre periférica o de la sangre periférica movilizada.
Dicho ligando Notch se puede proporcionar mediante el cultivo conjunto con una estirpe celular estromal humana o murina.
Dichas células estromales pueden comprender células madre.
Dichas células madre pueden ser células madre mesenquimatosas (CMM).
Dichas células estromales pueden comprender células madre pluripotentes inducidas (IPSC, del inglés induced pluripotent stem cells) o procedentes de IPSC, o células madre embrionarias humanas.
Dicho medio puede complementarse con dipéptido de L-alanil-L-glutamina.
Dicho cultivo puede comprender: medio MEM con dipéptido de L-alanil-L-glutamina (por ejemplo, Glutamax); suero bovino fetal o suero AB humano; SCF recombinante; FLT3L recombinante; e IL-3 o g M-CSF.
Dicho cultivo puede comprender: aproximadamente un 5 % de suero AB humano; aproximadamente 5 ng/ml de SCF; aproximadamente 5 ng/ml de FLT3L; y aproximadamente 5 ng/ml de IL-3 o aproximadamente 10 ng/ml de GM-CSF.
La invención también proporciona un método para preparar una vacuna con células dendríticas para un sujeto, comprendiendo dicho método: preparar una población celular enriquecida en células dendríticas CLEC9A+ mediante el método de la invención; y pulsar y/o cargar dichas células dendríticas con un antígeno de células tumorales y/o un lisado de células tumorales o preparación de células tumorales, en donde opcionalmente dicho método comprende: (a) proporcionar un agonista de TLR3 y/o un agonista de TLR8 a dichas células dendríticas; y/o (b) pulsar y/o cargar dichas células dendríticas con un antígeno de células tumorales, neoantígeno de células tumorales, o con un lisado o preparación de células tumorales.
El método puede comprender pulsar y/o cargar dichas células dendríticas con un neoantígeno de células tumorales.
Definiciones
Los "ligandos Notch naturales" se caracterizan por dominios extracelulares que normalmente comprenden un dominio aminoterminal (NT, del inglés N-terminal) seguido de un dominio Delta/Serrate/LAG-2 (DSL) y múltiples repeticiones de tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF, del inglés Epidermal Growth Factor) dispuestas en tándem. El dominio DSL junto con el dominio NT flanqueante y las dos primeras repeticiones del EGF que contienen el motivo de las proteínas Delta y OSM-11 (DOS) suelen ser necesarios para que los ligandos naturales se unan a Notch. Los dominios intracelulares de algunos ligandos naturales contienen un motivo PSD-95/Dlg/ZO-1-ligando (PDZL) carboxiterminal que desempeña un papel independiente de la señalización de Notch. Los ligandos DSL de C. elegans carecen de un motivo DOS, pero se han propuesto que cooperan con ligandos que solo contienen DOS para activar la señalización de Notch. Los ligandos Notch naturales ilustrativos incluyen, pero sin limitación, ligando de tipo delta 4 (DLL4), ligando 1 de tipo delta (DLL1), Jagged 1 (JAG1), Jagged 2 (JAG2) y similares.
Los "ligandos Notch no naturales" carecen de un dominio DSL (Delta/Serrate/LAG-2), son estructuralmente diversos e incluyen proteínas de membrana integrales y unidas a GPI, así como varias proteínas secretadas.
En el presente documento cuando se hace referencia a un "fragmento de ligando Notch" o a un "fragmento de ligando Notch natural", se contempla que el fragmento es un fragmento que se une a Notch.
Los "agonistas del receptor 3 de tipo Toll (agonistas de TLR3)" son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero sin limitación, agonistas de TLR3 de origen natural aislados; y agonistas de TLR3 sintéticos. Los agonistas de TLR3 aislados de una fuente natural de agonista de TLR3 generalmente se purifican, por ejemplo, el agonista de TLR3 purificado tiene al menos aproximadamente un 80 % de pureza, al menos aproximadamente un 90 % de pureza, al menos aproximadamente un 95 % de pureza, al menos aproximadamente un 98 % de pureza, al menos aproximadamente un 99 % de pureza o más del 99 % de pureza. Los agonistas de TLR3 sintéticos se pueden preparar mediante métodos convencionales y, por lo general, tienen al menos aproximadamente un 80 % de pureza, al menos aproximadamente un 90 % de pureza, al menos aproximadamente un 95 % de pureza, al menos aproximadamente un 98 % de pureza, al menos aproximadamente un 99 % de pureza o más del 99 % de pureza. Los agonistas de TLR3 incluyen agonistas de TLR3 que no están unidos a ningún otro compuesto. Los agonistas de TLR3 incluyen agonistas de t LR3 que se unen, de manera covalente o no covalente, a un segundo compuesto. En algunos aspectos, un agonista de TLR3 se une directamente a otro compuesto. En otros aspectos, un agonista de TLR3 se une a otro compuesto a través de un enlazador. En determinados aspectos, los agonistas de TLR3 incluyen ARN bicatenario de origen natural (ARNbc); ARNbc sintético; y análogos de ARNbc sintéticos; y similares (Alexopoulou et al. (2001) Nature, 413: 732-738). Un ejemplo no limitante ilustrativo de un análogo de ARNbc sintético es poli(I:C). Otros agonistas de TLR3 ilustrativos incluyen, pero sin limitación, estatmina (véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.°: 2009/253622) y los agonistas descritos en la publicación PCT n.°: WO 2012027017 A2.
Los "agonistas del receptor 8 de tipo Toll (agonistas de TLR8)" son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero sin limitación, compuestos tales como R-848 y derivados y análogos del mismo. Agonistas de TLR8 adecuados incluyen compuestos que tienen una 2-aminopiridina fusionada con un anillo heterocíclico de cinco miembros que contiene nitrógeno. Dichos compuestos incluyen, por ejemplo, aminas de imidazoquinolina que incluyen, pero sin limitación, aminas de imidazoquinolina sustituidas tales como, por ejemplo, aminas de imidazoquinolina sustituidas con amida, aminas de imidazoquinolina sustituidas con sulfonamida, aminas de imidazoquinolina sustituidas con urea, aminas de imidazoquinolina sustituidas con éter de arilo, aminas de imidazoquinolina sustituidas con éter heterocíclico, aminas de imidazoquinolina sustituidas con éter de amido, aminas de imidazoquinolina sustituidas con éter de sulfonamido, éteres de imidazoquinolina sustituidos con urea, aminas de imidazoquinolina sustituidas con tioéter y aminas de imidazoquinolina sustituidas con 6-, 7-, 8- o 9-arilo o heteroarilo; aminas de tetrahidroimidazoquinolina que incluyen, pero sin limitación, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con amida, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con sulfonamida, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con urea, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con éter de arilo, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con éter heterocíclico, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con éter de amido, aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con éter de sulfonamido, éteres de tetrahidroimidazoquinolina sustituidos con urea y aminas de tetrahidroimidazoquinolina sustituidas con tioéter; aminas de imidazopiridina, que incluyen, pero sin limitación, aminas de imidazopiridina sustituidas con amida, aminas de imidazopiridina sustituidas con sulfonamida, aminas de imidazopiridina sustituidas con urea, aminas de imidazopiridina sustituidas con éter de arilo, aminas de imidazopiridina sustituidas con éter heterocíclico, aminas de imidazopiridina sustituidas con éter de amido, aminas de imidazopiridina sustituidas con éter de sulfonamido, éteres de imidazopiridina sustituidos con urea y aminas de imidazopiridina sustituidas con tioéter; aminas de imidazoquinolina con puentes en 1,2; aminas de cicloalquilimidazopiridina fusionadas en 6,7; aminas de imidazonaftiridina; aminas de tetrahidroimidazonaftiridina; aminas de oxazoloquinolina; aminas de tiazoloquinolina; aminas de oxazolopiridina; aminas de tiazolopiridina; aminas de oxazolonaftiridina; aminas de tiazolonaftiridina; y dímeros de 1H-imidazo fusionados con aminas de piridina, aminas de quinolina, aminas de tetrahidroquinolina, aminas de naftiridina o aminas de tetrahidronaftiridina. En un aspecto particular, el agonista de TLR8 es una amina de imidazoquinolina sustituida con amida. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazoquinolina sustituida con sulfonamida. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazoquinolina sustituida con urea. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazoquinolina sustituida con éter de arilo. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazoquinolina sustituida con éter heterocíclico. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazoquinolina sustituida con éter de amido. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazoquinolina sustituida con éter de sulfonamido. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es un éter de imidazoquinolina sustituido con urea. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazoquinolina sustituida con tioéter. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazoquinolina sustituida con 6-, 7-, 8- o 9-arilo o heteroarilo. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tetrahidroimidazoquinolina sustituida con amida. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tetrahidroimidazoquinolina sustituida con sulfonamida. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tetrahidroimidazoquinolina sustituida con urea. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tetrahidroimidazoquinolina sustituida con éter de arilo. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tetrahidroimidazoquinolina sustituida con éter heterocíclico. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tetrahidroimidazoquinolina sustituida con éter de amido. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tetrahidroimidazoquinolina sustituida con éter de sulfonamido. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es un éter de tetrahidroimidazoquinolina sustituido con urea. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tetrahidroimidazoquinolina sustituida con tioéter. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazopiridina sustituida con amida. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazopiridina sustituida con sulfonamida. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazopiridina sustituida con urea. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazopiridina sustituida con éter de arilo. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazopiridina sustituida con éter heterocíclico. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazopiridina sustituida con éter de amido. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazopiridina sustituida con éter de sulfonamido. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es un éter de imidazopiridina sustituido con urea. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazopiridina sustituida con tioéter. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazoquinolina con puente en 1,2. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de cicloalquilimidazopiridina fusionada en 6,7. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de imidazonaftiridina. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tetrahidroimidazonaftiridina. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de oxazoloquinolina. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tiazoloquinolina. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de oxazolopiridina. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tiazolopiridina. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de oxazolonaftiridina. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es una amina de tiazolonaftiridina. Aún en determinados aspectos, el agonista de TLR8 es un dímero 1 H-imidazo fusionado con una amina de piridina, amina de quinolina, amina de tetrahidroquinolina, amina de naftiridina o una amina de tetrahidronaftiridina. En determinados aspectos, el agonista de TLR8 es un agonista de TLR8 selectivo, por ejemplo, el agonista modula la actividad celular a través de TLR8, pero no modula la actividad celular a través de TLR7. Los agonistas de TLR8 selectivos incluyen los de la publicación de la patente de EE. UU.
2004/0171086. Dichos compuestos agonistas de TLR8 selectivos incluyen, pero sin limitación, los compuestos que se muestran en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2004/0171086 que incluyen N-{4-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]butil}quinolin-3-carboxamida, N-{4-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]butil}quinoxalin-2-carboxamida y N-[4-(4-amino-2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)butil]morfolina-4-carboxamida. Otros agonistas de TLR8 selectivos adecuados incluyen, pero sin limitación, 2-propiltiazolo[4,5-c]quinolin-4-amina (patente de EE. UU. n.° 6.110.929); N.sup.1-[2-(4-amino-2-butil-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftridin-1-il)etil]-2-amino-4-metilpentanamida (Patente de EE. UU. n.° 6.194.425); N.sup.1-[4-(4-amino-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)butil]-2-fenoxi-benzamida (Patente de EE. UU. n.° 6.451.810); N.sup.1-[2-(4-amino-2-butil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)etil]-1-propano-sulfonamida (Patente de EE. UU. n.° 6.331.539); N-{2-[2-(4-amino-2-etil-1Himidazo[4,5-c]quinolin-1-il)etioxi]etil}-N'-fenilurea (publicación de patente de EE. UU. 2004/0171086); 1-{4-[3,5-didorofenil)tio]butil}-2-etil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (publicación de patente de EE. UU. 2004/0171086); N-{2-[4-amino-2-(etoximetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etil}-N'-(3-cianofenil)urea (Documento WO 00/76518 y publicación de patente de EE. UU. n.° 2004/0171086); y 4-amino-.alfa.,.alfa.-dimetil-2-metoxietil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-etanol (Patente de EE. UU. n.° 5.389.640). Se incluyen para su uso como agonistas de TLR8 selectivos los compuestos de la publicación de patente de EE. UU. n.° 2004/0171086. También es adecuado para su uso el compuesto 2-propiltiazolo-4,5-c]quinolin-4-amina.
Breve descripción de los dibujos
En la figura 1 se muestra que la diferenciación de las CD CLEC9A+ de las HSPC CD34+ de sangre de cordón umbilical humano se potencia mediante la presentación del ligando Notch DLL4 en el estroma de MS5. Se muestran los datos de las células recogidas después de 15 días de cultivo conjunto en monocapas de células estromales MS5 o MS5-hDLL4 en MEMa y FBS al 20 % con 5 ng/ml de SCF, 5 ng/ml de FLT3L, 50 ng/ml de TPO y 10 ng/ml de GM-CSF. Los monocitos CD14+, las CD CD1c+ y las CD plasmocitoide (CDp) se muestran para comparación. Las frecuencias se muestran como porcentaje de células CD45+ totales aisladas de cultivos. Las barras de error representan la desviación típica de pocillos de cultivo por triplicado.
En la figura 2 se muestran gráficos de citometría de flujo representativos de cultivos del día 15, como se muestra en la figura 1, seleccionados en células CD45+ totales. Las CD CLEC9A+ se separan en función de la expresión conjunta de CLEC9A y CD141 (BCDA-3).
En la figura 3 se muestra el rendimiento de las CD CLEC9A+ de cultivos del día 15, como se muestra en la figura 1, expresado como el número absoluto de CD CLEC9A+ por pocillo el día 15 (sembrado el día 0 con 5.000 células CD34+ por pocillo); y como el rendimiento de las CD CLEC9A+ respecto al número de células CD34+ aportadas.
En la figura 4 se muestran los niveles basales e inducidos de receptores coestimuladores, coinhibidores y de quimiocinas en CD CLEC9A+ aisladas de cultivos CB CD34+ MS5-hDLL4 del día 15 y estimuladas durante 12 h con los ligandos indicados para TLR3, TLR8 o TLR4 (poli(I:C), R848 o LPS, respectivamente frente a sin estimular).
En la figura 5 se muestra la capacidad de las CD CLEC9A+ diferenciadas in vitro para activar los linfocitos T. Las CD CLEC9A+ generadas en cultivos CB CD34+ MS5-hDLL4 se aislaron de cultivos estromales y se cultivaron conjuntamente con linfocitos T indiferenciados alogénicos marcados con CFSE en una relación CD:T de 1:5 durante 5 días. Las CD CELC9A+ no se trataron con estímulos de maduración antes o durante el ensayo. Los gráficos están separados en linfocitos T respondedores CD3+ CD4+ o CD3+ CD8+.
Descripción detallada
En varios aspectos, se proporcionan métodos para generar y/o expandir de manera eficaz un gran número de células dendríticas CLEC9A+ humanas. De manera adicional, en determinados aspectos, se proporcionan células dendríticas CLEC9A+ y poblaciones de células dendríticas CLEC9A+ producidas mediante estos métodos. En determinados aspectos, se proporcionan células dendríticas CLEC9A+ cargadas y/o pulsadas con antígenos particulares (por ejemplo, antígenos tumorales) o con, entre otras cosas, lisados tumorales o preparaciones de células tumorales. En determinados aspectos, las CD CLED9A+ proporcionan vacunas eficaces contra tumores. Las células también encuentran utilidad en una serie de otros contextos que incluyen, pero sin limitación, la regulación de respuestas inmunitarias/autoinmunitarias, la enfermedad de injerto contra hospedador y similares.
Las CD CLEC9A+ son células presentadoras de antígenos especializadas normalmente presentes en la sangre humana, ganglios linfáticos, bazo y otros órganos. También se conocen como CD BCDA3+, Cd CD141+, CD XCR1 o CD BATF3+, y se pueden identificar en función de la elevada expresión de ARNm o proteína de CLEC9A, CD141 (BCDA3/trombomodulina), XCR1, BATF3, CADM1 (NECL2), TLR3 o IDO1 (revisado en Vander Aa, et al. 2014).
Las CD CLEC9A+ son eficaces en la presentación cruzada de antígenos de fuentes celulares a los linfocitos T y, por lo tanto, es probable que participen en la regulación de las respuestas inmunitarias a patógenos, en la inmunidad antitumoral y, en determinados entornos clínicos, en la autoinmunidad, el rechazo de trasplantes y en la enfermedad de injerto contra hospedador (revisado en Tullett et al. (2014) Front Immunol. 22(5): 239). También están presentes en el timo humano, donde pueden estar implicadas en la selección negativa de timocitos autorreactivos y/o en la generación de linfocitos T reguladores (Lei et al. (2011) J. Exp. Med. 208(2): 383-394). La capacidad de generar grandes cantidades de CD CLEC9A+, como se describe en el presente documento, se cree que permite el desarrollo de inmunoterapias para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades y otras patologías.
En varios aspectos, los métodos descritos en el presente documento proporcionan métodos de cultivo celular in vitro que utilizan un ligando Notch para generar y expandir grandes cantidades de CD CLEC9A+ humanas a partir de células madre y/o progenitoras (u otras) hematopoyéticas (HSPC). El cultivo de HSPC en estas condiciones da como resultado una inhibición de la generación de células mieloides y la generación/expansión selectiva de CD CLEC9A+.
Si bien los métodos se describen en el presente documento principalmente con respecto a las células madre y/o progenitoras hematopoyéticas, se cree que los métodos se pueden utilizar para expandir/generar células dendríticas CLEC9A+ de muchas otras fuentes, por ejemplo, de células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células hematopoyéticas malignas y similares.
En determinados aspectos, los métodos implican comprender el cultivo de células madre y/o células progenitoras en un cultivo celular que comprende medio de cultivo, uno o más ligandos Notch; factor de células progenitoras (SCF); ligando de FLT3 (FLT3L); e IL-3 y/o GMCSF.
Se pueden utilizar varios medios de cultivo. Los medios de cultivo ilustrativos, pero no limitantes, incluyen, pero sin limitación MEM (Medio esencial mínimo), DMEM (Medio de Eagle modificado de Dulbecco), BME (Medio basal de Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-12 (Medio de Eagle modificado por Dulbecco:mezcla de nutrientes F-12), DMEM/F-10 (Medio de Eagle modificado por Dulbecco:mezcla de nutrientes F-10), a-MEM (Medio esencial mínimo a), G-MEM (Medio esencial mínimo de Glasgow), IMDM (Medio de Dulbecco modificado de Iscove), medio esencial 8 (E8), DMEM inactivado, AIM V, X-VIVO-15, StemSpan, medio de células dendríticas CellGro y similares.
Las células se cultivan con uno o más ligandos Notch que pueden incluir ligandos Notch naturales (porejemplo, ligando 4 de tipo delta (DLL4), ligando 1 de tipo delta (DLL1), Jagged 1 (JAG1), Jagged 2 (JAG2), ligando 3 de tipo delta (DLL3) y X-delta 2 y similares) y/o uno o más ligandos Notch no naturales (por ejemplo, contactina-1, NOV/CCN3, contactina-6, periostina/OSF-2, DLK2/EGFL9, Pref-1/DLK1/FA1, DNER, trombospondina-2, MAGP-1/MFAP2, trombospondina-3, MAGP-2/MFAP5, trombospondina-4, netrina-1 y similares).
En determinados aspectos, el (los) ligando(s) Notch se proporcionan mediante cultivo conjunto con células estromales humanas o murinas que expresan el (los) ligando(s) Notch. En determinados aspectos, las células estromales comprenden células de una estirpe celular del estroma humano o murino (por ejemplo, MS5, OP9, S17, HS-5, HS-27A) o células estromales/mesenquimatosas humanas (primarias o procedentes de ES o iPSC) transducidas o transfectadas con el ADNc o ARNm para un ligando Notch humano o murino.
En determinados aspectos, el ligando Notch se puede proporcionar como un ligando inmovilizado en una superficie en el cultivo celular (por ejemplo, en una superficie del recipiente de cultivo, unido a perlas y similares). En determinados aspectos, en particular cuando el ligando Notch se proporciona inmovilizado en una superficie, las células estromales pueden omitirse.
En un aspecto, las condiciones de cultivo optimizadas son MEMa con Glutamax, suero de ternera fetal definido al 20 %, SCF 5 ng/ml, FLT3L 5 ng/ml e IL-3 5 ng/ml o GM-CSF 10 ng/ml, sin embargo, las variaciones de estas condiciones de cultivo también son eficaces, por ejemplo, condiciones sin suero, sustitución del suero humano, condiciones mínimas de citocinas, etc.).
Las células madre y/o progenitoras utilizadas en los métodos descritos en el presente documento se pueden proporcionar mediante cualquiera de una serie de métodos conocidos por los expertos en la materia. En determinados aspectos, las células se obtienen de un proveedor comercial. En determinados aspectos, las células proceden de un hospedador al que se van a administrar las células CLEC9A+. En determinados aspectos, las células de partida pueden ser una población de HSPC enriquecida (por ejemplo, definida como CD34+, linaje CD34+ o linaje-) o fracciones de la misma, que incluye células madre hematopoyéticas o poblaciones de células progenitoras hematopoyéticas. En determinados aspectos, la fuente de HSPC puede ser la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica o sangre periférica movilizada (por ejemplo, después del tratamiento con G-CSF) de un donante autólogo o alogénico, dependiendo del entorno clínico.
Los métodos descritos anteriormente producen una población de células altamente enriquecida en células CLEC9A+. En determinados aspectos, las CD CLEC9A+ se identifican y/o aíslan del sistema de cultivo. Esto se logra a través de métodos inmunológicos disponibles comercialmente, tal como citometría de flujo, clasificación de células basada en perlas magnéticas y similares. Las CD CLEC9A+ se pueden identificar o aislar fácilmente en función de la unión de uno o más clones de anticuerpos disponibles comercialmente que reconocen CLEC9A, CD141 (BDCA3), XCR1, NECL-2 (CADM1) u otros marcadores presentes en las CD CLEC9A+.
En determinados aspectos, las células dendríticas CLEC9A+ se cargan y/o se pulsan con antígeno tumoral y/o lisados tumorales o preparaciones de células tumorales para producir una "vacuna" contra el cáncer. Los antígenos tumorales ilustrativos para su uso en vacunas con células dendríticas incluyen, pero sin limitación, WT1, MUC1, MP2, E6 E7 del VPH, EGFRvlII, HER-2/neu, diotipo, MAGE A3, p53 no mutante, NY-ESO-1, PSMA, GD2, CEA, MelanA/MART1, Ras mutante, gp100, p53 mutante, proteinasa 3 (PR1), bcr-abl, tirosinasa, survivina, PSA, hTERT, puntos de ruptura de translocación de sarcoma, EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, EpCAM, ERG (fusión TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógenos, ciclina B1, ácido polisiálico, My Cn , RhoC, t Rp -2, GD3, fucosil GM1, mesotelina, PSCA, MAGE A1, sLe (animal), CYP1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, PAX5, OY-TES1, proteína de esperma 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, legumaína, Tie 2, Page4, VEGFR2, Ma D-CT-1, FAP, PDGFR-p, MAD-CT-2, antígeno 1 relacionado con Fos y similares (véase, por ejemplo, Cheever et al. (2009) Clin. Cancer Res., 15(17): 5323-5337; Palucka y Banchereau (2012) Nat. Rev. Cáncer, 12: 265-277).
En determinados aspectos, las células dendríticas CLEC9A+ se cargan y/o se pulsan con neoantígenos tumorales. Los neoantígenos son antígenos codificados por genes de antígenos mutados específicos de tumores. En particular, los neoantígenos específicos de tumores surgen normalmente a través de mutaciones que alteran las secuencias de codificación de aminoácidos (mutaciones somáticas no sinónimas). Algunos de estos péptidos mutados se pueden expresar, procesar y presentar en la superficie celular, y posteriormente reconocerse por los linfocitos T. Debido a que los tejidos normales no poseen estas mutaciones somáticas, los linfocitos T específicos de neoantígeno no están sometidos a tolerancia central y periférica, y también carecen de la capacidad de inducir la destrucción de tejido normal. Como resultado, los neoantígenos parecen representar dianas ideales para la inmunoterapia contra el cáncer. Los neoantígenos de células tumorales son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Lu y Robbins (2016) Seminars Immunol., 28(1): 22-27), y una lista ilustrativa, pero no limitativa, de neoantígenos se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Neoantí enos humanos ilustrativos ero no limitativos.
Figure imgf000008_0001
Cuando las CD se van a pulsar con (por ejemplo, cultivar con) un lisado tumoral o una preparación de células tumorales, los tipos de tumores/cánceres ilustrativos, pero no limitativos, incluyen leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), carcinoma adrenocortical, cáncer relacionado con SIDA (por ejemplo, sarcoma de Kaposi y linfoma), cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitomas, tumor rabdoideo/teratoideo atípico, cáncer del conducto biliar, cáncer extrahepático, cáncer de vejiga, cáncer de hueso (por ejemplo, sarcoma de Ewing, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno), glioma del tronco encefálico, tumores cerebrales (por ejemplo, astrocitomas, tumores de cerebro y de médula espinal, glioma del tronco encefálico, tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central, tumores embrionarios del sistema nervioso central, tumores de las células germinales del sistema nervioso central, craneofaringioma, ependimoma, cáncer de mama, tumores bronquiales, linfoma de Burkitt, tumores carcinoides (por ejemplo, infantil y gastrointestinal), tumores cardíacos, cáncer del cuello del útero, cordoma, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena crónica (LMC), trastornos crónicos mieloproliferativos, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo de linfocitos T, cánceres de conducto por ejemplo (bilis, extrahepático), carcinoma ductal in situ (CDIS), tumores embrionarios, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragonadales, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer de ojo (por ejemplo, melanoma intraocular y retinoblastoma), histiocitoma fibroso de hueso, carcinoma y osteosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumores estromales gastrointestinales (TEGI), tumores de células germinales (por ejemplo, cáncer de ovario, cáncer testicular, cánceres extracraneales, cánceres extragonadales y del sistema nervioso central), tumor trofoblástico gestacional, cáncer del tronco cerebral, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cardíaco, cáncer hepatocelular (hígado), histiocitosis, cáncer de células de Langerhans, linfoma hodgkiniano, cáncer hipofaríngeo, melanoma intraocular, tumores de células de los islotes, tumores neuroendocrinos pancreáticos, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (por ejemplo, de célula renal, tumor de Wilms y otros tumores renales), histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, leucemia, linfoblástica agudo (LLA), mieloide agudo (LMA), linfocítico crónico (LLC), mielógeno crónico (LMC), de células pilosas, cáncer de labios y de la cavidad oral, cáncer de hígado (primario), carcinoma lobulillar in situ (CLIS), cáncer de pulmón (por ejemplo, infantil, no microcítico y microcítico), linfoma (por ejemplo, relacionado con el SIDA, de Burkitt (por ejemplo, linfoma no de Hodgkin), de linfocitos T cutáneos (por ejemplo, micosis fungoide y síndrome de Sezary), de Hodgkin, no de Hodgkin, primario del sistema nervioso central (SNC)), macroglobulinemia, Waldenstrom, cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de hueso y osteosarcoma, melanoma (por ejemplo, infantil, intraocular (ojo)), carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico, carcinoma del tracto de la línea media, cáncer de boca, síndromes múltiples de neoplasia endocrina, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, leucemia mielógena, mieloma múltiple crónico (MMC), cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de labio y orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, tumores neuroendocrinos pancreáticos (tumores de células de los islotes), papilomatosis, paraganglioma, cáncer del seno paranasal y de la cavidad nasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumor de la pituitaria, neoplasia de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central (SNC), cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de células renales (riñón), pelvis renal y uréter, cáncer de células transicionales, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma (por ejemplo, de Ewing, de Kaposi, osteosarcoma, radomiosarcoma, de tejidos blandos y uterino), síndrome de Sézary, cáncer de piel (por ejemplo, melanoma, carcinoma de células de Merkel, carcinoma de células basales y no melanoma), cáncer del intestino delgado, carcinoma epidermoide, cáncer epidermoide de cuello con tumor primario oculto, cáncer de estómago (gástrico), cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, tumor trofoblástico, cáncer de uréter y pelvis renal, cáncer de uretra, cáncer de útero, cáncer de endometrio, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilm y similares.
Los expertos en la materia conocen métodos para pulsar CD con lisado tumoral (véase, por ejemplo, Lawman y Lawman (eds.), Cancer Vaccines: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1139, DOI 10.1007/978-1-4939-0345-0, Springer, Nueva York (2014)).
Mediante las enseñanzas descritas en el presente documento, los expertos en la materia dispondrán de numerosos métodos para generar/expandir células dendríticas CLEC9A+, poblaciones de células dendríticas CLEC9A+ y células dendríticas CLEC9A+ modificadas.
Ejemplos
Ejemplo 1
Generación y expansión de células dendríticas CLEC9A+ a partir de células CD34+ de la médula ósea humana utilizando un ligando Notch
Se encontró que las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) CD34+ cultivadas en presencia de citocinas hematopoyéticas y un ligando Notch producen cultivos altamente enriquecidos en células dendríticas (CD) CLEC9A+. Aquí se muestra un experimento representativo que utiliza HSPC CD34+ de la médula ósea humana primaria cultivadas en células estromales MS5 transducidas con DLL4 humano en presencia de SCF, FLT3L y GM-CSF o IL-3. El cultivo de HSPC durante 14 días en estas condiciones dio como resultado cultivos de células hematopoyéticas CD45+ que contenían un 19 % y un 30 % de CD CLEC9A+ CD141+, respectivamente, mientras que los cultivos de control en células MS5 no transducidas con DLL4 generaron de un 2 a un 3 % de CD CLEC9A+. Se concluyó que el cultivo de HSPC humanas en presencia de un ligando Notch más SCF, FLT3L e IL-3 o GM-CSF es un método eficaz para diferenciar y expandir CD CLEC9A+.
Materiales y métodos
Aislamiento de HSPC CD34+ de la MO
Los aspirados de la médula ósea se obtuvieron de donantes sanos. Las células mononucleares se aislaron mediante centrifugación por densidad en Ficoll-Paque (GE Healthcare) según el protocolo del fabricante. Las HSPC CD34+ se aislaron de manera magnética utilizando el kit CD34 Ultrapure y una columna MACS LS (Miltenyi) según el protocolo del fabricante.
Estirpe celular del estroma que expresa DLL4
El DLL4 humano de longitud completa se clonó a partir de una preparación universal de ARN humano (Agilent) mediante RT-PCR y se ligó en pCCL-c-MNDU3-x-IRES-GFP en el sitio EcoR1. El sobrenadante lentivírico se preparó mediante transfección conjunta de células 293T con el vector DLL4, pCMV-AR8.9 y pCAGGS-VSV-G usando TransIT 293T (Mirus). Los sobrenadantes se recogieron a las 48 h y se concentraron con un filtro Amicon 100K (Millipore). Se utilizó el sobrenadante concentrado para infectar células estromales de la médula ósea murina MS5. Las células GFPhi se clasificaron a las 72 h (MS5-hDLL4, en lo sucesivo).
Cultivos conjuntos para generar CD CLEC9A+
Las células MS5-hDLL4 se colocaron en placas de 8 a 9 * 103 células por pocillo de una placa de 96 pocillos el día antes del cultivo conjunto con HSPC. Para cultivos conjuntos con HSPC, el sobrenadante se aspiró de células MS5-hDLL4 y se añadieron HSPC purificadas a 5 x 103 células por pocillo en 200 μl de MEM-alfa con Glutamax (Life Technologies) complementado con suero de ternera fetal al 20 % (HyClone), s Cf humano recombinante (5 ng/ml), FLT3L (5 ng/ml), e IL-3 (5 ng/ml) o GM-CSF (10 ng/ml) (todos de Peprotech). Las células se incubaron a 37 °C/CÜ2 al 5 % durante 15 días, durante los cuales la mitad del volumen del medio se reemplazó cada 3 a 4 días con medio fresco que contenía una concentración de citocinas 2*. El día 15, las células se recogieron mediante pipeteo y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando los siguientes clones de anticuerpos: CD45 (HI30), CLEC9A (8F9), CD141 (M80) y CD14 (M5E2). Las CD CLEC9A+ se definieron como CD45+ CD14- CD141+ CLEC9A+.
Resultados
El cultivo de HSPC CD34+ CB durante 15 días en MS5-hDLL4 con SCF, FLT3L y GM-CSF dio como resultado cultivos de células hematopoyéticas CD45+ que contenían alrededor del 67 % de CD CLEC9A+ CD141+, mientras que los cultivos de control en células MS5 no transducidas con DLL4 generaron alrededor del 8 % de CD CLEC9A+ (Figuras 1 a 5).
Conclusiones
El cultivo ex-vivo de HSPC CD34+ con células estromales que expresan el ligando Notch DLL4 en presencia de SCF, FLT3L, e IL-3 o GM-CSF es un método novedoso para la generación y expansión de CD CLEC9A+.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir una población celular enriquecida en células dendríticas CLEC9A+, comprendiendo dicho método cultivar células madre y/o células progenitoras en un cultivo celular que comprende:
medio de cultivo que comprende uno o más de factor de células progenitoras (SCF), ligando FLT3 (FLT3L), trombopoyetina (t Po ), IL-3 y GM-CSF; y
células del estroma que comprenden un ácido nucleico que codifica y expresa un ligando Notch.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho cultivo celular comprende SCF, FLT3L, e IL-3 o GM-CSF.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ligando Notch comprende un ligando Notch natural, o un fragmento del mismo, seleccionado del grupo que consiste en ligando 1 de tipo delta (DLL1), ligando 4 de tipo delta (DLL4), Jagged 1 (JAG1), Jagged 2 (JAG2), ligando 3 de tipo delta (DLL3) y X-delta 2.
4. El método de la reivindicación 2, en donde dicho ligando Notch es DLL1 o un fragmento del mismo.
5. El método de la reivindicación 1, en donde dicho ligando Notch comprende un ligando Notch no natural seleccionado del grupo que consiste en contactina-1, NOV/CCN3, contactina-6, periostina/OSF-2, DLK2/EGFL9, Pref-1/DLK1/FA1, DNER, trombospondina-2, MAGP-1/MFAP2, trombospondina-3, MAGP-2/MFAP5, trombospondina-4 y netrina-1.
6. El método de la reivindicación 1, en donde dichas células madre y/o células progenitoras comprenden células madre y/o células progenitoras hematopoyéticas (HSPC), en donde dichas células están enriquecidas en células CD34+.
7. El método de la reivindicación 1, en donde dichas células proceden de la médula ósea, del cordón umbilical, de la sangre periférica o de la sangre periférica movilizada.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichas células estromales comprenden células estromales humanas o murinas.
9. El método de la reivindicación 1, en donde dichas células estromales comprenden células madre y, opcionalmente: (a) dichas células madre son células madre mesenquimatosas (MSC); o
(b) dichas células estromales comprenden células madre pluripotentes inducidas (IPSC) o procedentes de IPSC, o células madre embrionarias humanas.
10. El método de la reivindicación 1, en donde dicho medio se complementa con dipéptido de L-alanil-L-glutamina.
11. El método de la reivindicación 1, en donde dicho cultivo comprende:
medio MEM con dipéptido de L-alanil-L-glutamina (por ejemplo, Glutamax);
suero bovino fetal o suero AB humano;
SCF recombinante;
FLT3L recombinante; e
IL-3 o GM-CSF,
opcionalmente en donde dicho cultivo comprende:
aproximadamente un 5 % de suero AB humano o aproximadamente un 20 % de suero fetal de ternera; aproximadamente 5 ng/ml de SCF;
aproximadamente 5 ng/ml de FLT3L; y
aproximadamente 5 ng/ml de IL-3 o aproximadamente 10 ng/ml de GM-CSF.
12. Un método para preparar una vacuna con células dendríticas para un sujeto, comprendiendo dicho método: preparar una población celular enriquecida en células dendríticas CLEC9A+ utilizando el método de acuerdo con la reivindicación 1; y
pulsar y/o cargar dichas células dendríticas con un antígeno de células tumorales y/o un lisado de células tumorales o preparación de células tumorales, en donde opcionalmente dicho método comprende:
(a) proporcionar un agonista de TLR3 y/o un agonista de TLR8 a dichas células dendríticas; y/o
(b) pulsar y/o cargar dichas células dendríticas con un antígeno de células tumorales, neoantígeno de células tumorales, o con un lisado o preparación de células tumorales.
13. El método de la reivindicación 1, en donde dicha población celular comprende al menos un 25 % de células CD45+ en dicho cultivo sin clasificación celular o purificación basada en inmunoafinidad; y/o son competentes en la presentación cruzada de antígenos sin adyuvante y/o sin maduración.
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