ES2948902T3 - Variantes de cápsides de virus adenoasociado y procedimientos de utilización de las mismas - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se proporcionan proteínas variantes de la cápsida del virus adenoasociado (AAV) que tienen una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos con respecto a una proteína de la cápside de AAV parental, que, cuando están presentes en un virión de AAV, confieren una mayor infectividad de uno o más tipos de células musculares. en comparación con la infectividad de las células musculares por un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental no modificada. También se proporcionan viriones de AAV recombinantes y composiciones farmacéuticas de los mismos que comprenden una proteína de la cápsida de AAV variante como se describe en el presente documento, métodos para producir estas proteínas y viriones de la cápsida de rAAV, y métodos para usar estas proteínas y viriones de la cápsida de rAAV en investigación y en la práctica clínica, por ejemplo en , por ejemplo, la administración de secuencias de ácido nucleico a una o más células musculares para el tratamiento de trastornos y enfermedades musculares. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de cápsides de virus adenoasociado y procedimientos de utilización de las mismas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención descrita en el presente documento se refiere generalmente al campo de los viriones de virus adenoasociados (AAV) que comprenden variantes de proteínas de la cápside y la generación de dichas variantes de cápsides utilizando técnicas de evolución dirigida.
ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN
[0002] El músculo está asociado con una variedad de trastornos genéticos graves. El músculo es el tejido diana en terapia génica para muchas enfermedades de distrofia muscular y también se puede explotar como un biofactor para producir factores secretores para tratar una enfermedad sistémica. El suministro de genes terapéuticos al tejido muscular en humanos puede decirse que es la necesidad no cubierta más urgente en el tratamiento de enfermedades relacionadas con los músculos.
[0003] Un enfoque para abordar el suministro de genes dirigido a los músculos es la terapia mediada por virus adenoasociados (AAV) basada en genes, en la que se usa un virus adenoasociado recombinante (rAAV) para suministrar un gen a uno o más tipos de células del músculo, por ejemplo, para reemplazar un gen que falta, para corregir un gen defectuoso dominante o para proporcionar una plantilla para la terapia continua de proteínas. Si bien la terapia génica clínica basada en AAV ha tenido un éxito cada vez mayor, todavía está plagada de deficiencias con respecto a las propiedades del vector viral, que incluyen, por ejemplo, dirigirse a las células deseadas del músculo con alta eficiencia. En consecuencia, existe la necesidad en la técnica de nuevas variantes de AAV con capacidades de transducción superiores que proporcionen un suministro basado en genes más eficaz a las células del músculo para el tratamiento de enfermedades. Existe una necesidad en la técnica de tales variantes de AAV que muestren un perfil de transducción en el músculo mejorado, en algunos casos ampliamente, en otros casos preferentemente a ciertos tipos de células del músculo, en comparación con los AAV de tipo salvaje y las variantes de AAV conocidas en la técnica.
[0004] El AAV de origen natural es un virus de ADN monocatenario que contiene tres marcos de lectura abiertos, rep, cap y aap. El primer gen, rep, codifica cuatro proteínas necesarias para la replicación del genoma (Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40), el segundo, cap, expresa tres proteínas estructurales (VP1-3) que se ensamblan para formar la cápside viral, y el tercero expresa la proteína activadora del ensamblaje (AAP) que es esencial para el ensamblaje de la cápside. El AAV depende de la presencia de un virus auxiliar, tal como un adenovirus o un herpesvirus, para la replicación activa. En ausencia de un virus auxiliar, el AAV establece un estado latente en el que su genoma se mantiene episomalmente o se integra en el cromosoma huésped en el locus AAVS1.
[0005] Pueden usarse técnicas de evolución dirigida in vitro e in vivo para seleccionar variantes de AAV que ofrezcan una mejora con respecto a los vectores actuales de suministro de genes basados en AAV. Dichas técnicas de evolución dirigida se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la publicación PCT WO 2014/194132 y Kotterman & Schaffer (Nature Review Genetics, AOP, publicada en línea el 20 de mayo de 2014; doi: 10.1038/nrg3742).
[0006] La evolución dirigida es un enfoque de ingeniería de la cápside que emula la evolución natural a través de rondas iterativas de diversificación genética y procesos de selección, lo que permite la acumulación de mutaciones beneficiosas que mejoran progresivamente la función de una biomolécula, tal como un virión basado en AAV. En este enfoque, los genes cap de AAV de tipo salvaje se diversifican para crear grandes bibliotecas genéticas que se empaquetan para generar bibliotecas de partículas virales, y se aplica una presión selectiva para aislar variantes únicas con fenotipos superiores que pueden superar las barreras de administración de genes.
[0007] Se han descrito variantes de AAV, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 9.193.956; 9;186;419; 8.632.764; 8.663.624; 8.927.514; 8.628.966; 8.263.396; 8.734.809; 8.889.641; 8.632.7; 8.691.948; 8.299.295; 8.802.440; 8.445.267; 8.906.307; 8.574.583; 8.067.015; 7.588.772; 7.867.484; 8.163.5 43; 8.283.151; 8.999.678; 7.892.809; 7.906.111; 7.259.151; 7.629.322; 7.220.577; 8.802.080; 7.198.951; 8.31 8.480; 8.962.332; 7.790.449; 7.282.199; 8.906.675; 8.524.446; 7.712.893; 6.491.907; 8.637.255; 7.186.522; 7 .105.345; 6.759.237; 6.984.517; 6.962.815; 7.749.492; 7.259.151; y 6.156.303; Números de publicación de Estados Unidos 2013/0295614; 2015/0065562; 2014/0364338; 2013/0323226; 2014/0359799; 2013/0059732; 2014/0037585; 2014/0056854; 2013/0296409; 2014/0335054; 2013/0195801; 2012/0070899; 2011/0275529; 2011/0171262; 2009/0215879; 2010/0297177; 2010/0203083; 2009/0317417; 2009/0202490; 2012/0220492; 2006/0292117; y 2004/0002159; Números de publicación europea 2692731 A1; 2383346 B1; 2359865 B1; 2359866 B1; 2359867 B1; y 2357010 B1; 1791858 B1; 1668143 B1; 1660678 B1; 1664314 B1; 1496944 B1; 1456383 B1;2341068 B1; 2338900 B1; 1456419 B1; 1310571 B1; 1456383 B1; 1633772 B1; y 1135468 B1; y números de publicación internacional (PCT) WO 2014/124282; WO 2013/170078; WO 2014/160092; documento WO 2014/103957; WO 2014/052789; documento WO 2013/174760; WO 2013/123503; WO 2011/038187; y WO 2008/124015; WO 2003/054197; sin embargo, ninguna de estas referencias divulga las realizaciones y/o las características y/o la composición de las estructuras de materia de las variantes de AAV descritas en el presente documento.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0008] La presente invención está definida por las reivindicaciones. En el presente documento se proporcionan variantes de proteínas de la cápside de virus adenoasociado (AAV), según se reivindica, que tienen una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos en relación con una proteína de la cápside del AAV parental, que, cuando están presentes en un virión del AAV, confieren una mayor infectividad de uno o más tipos de células del músculo en comparación con la infectividad de las células del músculo por un virión de AAV que comprende una proteína de la cápside de AAV parental no modificada. También se proporcionan viriones de AAV recombinantes y composiciones farmacéuticas de los mismos que comprenden una variante de la proteína de la cápside de AAV, tal como se reivindica, procedimientos para producir variantes de proteínas de la cápside de AAV y viriones, y procedimientos para usar estas proteínas de la cápside de AAVr y viriones en investigación y en la práctica clínica, por ejemplo, en el suministro de secuencias de ácidos nucleico a una o más células musculares para el tratamiento de trastornos y enfermedades de la retina.
[0009] En algunos aspectos de la descripción, se proporcionan variantes de proteínas de la cápside del virus adenoasociado (AAV), tal como se reivindican, teniendo estas variantes de proteínas de la cápside del AAV una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos en relación con una cápside del AAV parental, que, cuando están presentes en un virión de AAV, confieren una mayor infectividad de uno o más tipos de células musculares (por ejemplo, células musculares esqueléticas y/o células musculares cardiacas) en comparación con la infectividad de las células musculares por un virión de AAV que comprende una proteína de la cápside de AAV parental que no comprende la modificación de la secuencia de aminoácidos. En aspectos relacionados de la descripción, las variantes de proteínas de la cápside de AAV, según se reivindica, cuando están presentes en un virión de AAV, también confieren una mayor resistencia a la neutralización por anticuerpos anti-AAV.
[0010] En algunos aspectos de la descripción, se proporcionan viriones de AAV recombinantes (rAAV), comprendiendo estos viriones de rAAV una variante de la proteína de la cápside, tal como se reivindica, donde los viriones de rAAV exhiben una mayor infectividad de uno o más tipos de células musculares (por ejemplo, células musculares esqueléticas y/o células musculares cardiacas) en relación con la infectividad de la célula muscular por un virión de AAV que comprende una proteína de cápside de AAV parental no modificada correspondiente. En algunas realizaciones, el virión de rAAV exhibe una mayor infectividad de todas las células musculares en relación con el virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental. En otras realizaciones, el virión de rAAV exhibe una mayor infectividad de ciertos tipos de células musculares, pero no de otros en relación con el virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental. Dicho de otra manera, el virión de rAAV exhibe una mayor infectividad que es preferencial para ciertos tipos de células musculares, pero no para otros, por ejemplo, el rAAV muestra una infectividad preferentemente aumentada de uno o más tipos de células seleccionadas entre fibroblastos de músculo esquelético, células satélite de músculo esquelético, fibroblastos cardiacos, células progenitoras cardiacas, células de músculo liso y/o células de músculo del diafragma, pero no muestran una infectividad aumentada de todos los tipos de células.
[0011] En algunas realizaciones, el virión de rAAV comprende un ácido nucleico heterólogo. En algunas de dichas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo codifica un ARN que codifica un polipéptido. En otras de dichas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico heterólogo codifica un ARN que no codifica un polipéptido, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico heterólogo es un agente de interferencia en ARN, un ARN guía para una nucleasa, etc.
[0012] También se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden los viriones de rAAV infecciosos en cuestión y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0013] También se proporciona un virión de rAAV que comprende una variante de la proteína de la cápside, tal como se reivindica, para su uso en un procedimiento de suministro de un ácido nucleico heterólogo a una célula diana (tal como un cardiomiocito) poniendo en contacto la célula diana con el virión de rAAV. En algunas realizaciones, la célula diana está in vivo, tal como en el corazón de un individuo que necesita tratamiento para un trastorno cardiovascular. En otras realizaciones, la célula diana es in vitro.
[0014] También se proporciona una variante de la proteína de la cápside o composición farmacéutica, según se reivindica, para su uso en procedimientos de tratamiento de una enfermedad enfermedad (por ejemplo, un trastorno de músculo cardiaco o esquelético) administrando a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de viriones de rAAV que comprenden una variante de la proteína de la cápside o una composición farmacéutica, tal como se reivindica, que comprende una cantidad efectiva de los viriones de rAAV.
[0015] También se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica una variante de la proteína de la cápside de AAV, tal como se reivindica, y una célula huésped que comprende el ácido nucleico aislado. En aún otras realizaciones, el ácido nucleico aislado y/o la célula huésped aislada comprende el rAAV.
[0016] La variante de AVV se define en la reivindicación 1. La variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una inserción de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 20 aminoácidos (un "péptido heterólogo" o "inserción peptídica") en el bucle GH de la proteína de la cápside, en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente, en la que la variante de la proteína de la cápside, cuando está presente en un virión de AAV, confiere una mayor infectividad de una célula muscular en comparación con la infectividad de una célula muscular por un virión AAV que comprende la proteína de la cápside AAV parental correspondiente. En algunas realizaciones, el péptido comprende o consiste esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), NKTTNKD (SEQ ID NO: 14).
[0017] En algunos aspectos, la variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una o más sustituciones de aminoácidos en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente, en la que la variante de la proteína de la cápside, cuando está presente en un virión AAV, confiere una mayor infectividad de una célula muscular en comparación con la infectividad de una célula muscular por un virión AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.
[0018] En algunas realizaciones, se describe una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende una sustitución P363L con respecto a AAV2 y opcionalmente comprende además una sustitución E347k y/o V708I con respecto a AAV2.
[0019] En aspectos relacionados, la proteína de la cápside de AAV variante comprende una inserción peptídica, tal como se reivindica, y una o más sustituciones de aminoácidos en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente, en el que la variante de la proteína de la cápside, cuando está presente en un virión de AAV, confiere una mayor infectividad de una célula muscular en comparación con la infectividad de una célula muscular por un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente. En varias realizaciones, se proporciona una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende una inserción peptídica y una sustitución V708I con respecto a AAV2, en la que la inserción peptídica es tal como se reivindica.
[0020] En algunas realizaciones, se describe una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende el péptido heterólogo LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) y una sustitución V708I con respecto a AAV2 y, opcionalmente, que comprende además una sustitución A593E y/o S109T y/o T330A y/o R588M con respecto a AAV2. En otras realizaciones, se describe una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende el péptido heterólogo LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) y una sustitución A35P con respecto a AAV2. En otras realizaciones, se describe una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende el péptido heterólogo LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) y las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, N551S, I698V y L735Q con respecto a AAV2 y, opcionalmente, que comprende además una sustitución V708I con respecto a AAV2.
[0021] En algunas realizaciones, se describe una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende el péptido heterólogo LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) y una sustitución V708I con respecto a AAV2 y, opcionalmente, que comprende además una sustitución S109T y/o W694C y/o W606C con respecto a AAV2. En otras realizaciones, se describe una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende el péptido heterólogo LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) y una sustitución I698V con respecto a AAV2. En otras realizaciones, se describe una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende el péptido heterólogo LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) y las sustituciones de aminoácidos N312K, N449D, N551S, I698V y L735Q con respecto a AAV2 y, opcionalmente, que comprende además una sustitución V708I con respecto a AAV2.
[0022] En algunas realizaciones, se describe una variante de la proteína de la cápside de AAV, tal como se reivindica, que comprende un péptido heterólogo, tal como se describe en el presente documento, y una sustitución de P363L con respecto a AAV2.
[0023] También se describen en este documento procedimientos para la fabricación y/o suministro de un rAAV que comprende una variante de la cápside de AAV, tal como se reivindica. Además, en el presente documento se proporcionan kits que comprenden un rAAV que comprende una variante de la cápside del AAV, según se reivindica, y para usar en los procedimientos descritos en el presente documento.
[0024] En otras realizaciones, el virión de AAV que comprende la variante de la proteína de la cápside, según se reivindica, puede incorporar cualquiera de las realizaciones anteriores o posteriores descritas. De hecho, se entiende que ciertas características de la presente invención, que se describen, para mayor claridad, en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. A la inversa, diversas características de la presente invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una sola realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones pertenecientes a la presente invención están específicamente abarcadas por la presente invención y se describen aquí como si todas y cada una de las combinaciones se divulgaran individual y explícitamente. Además, todas las subcombinaciones de las diversas realizaciones y elementos de las mismas también están específicamente abarcadas por la presente invención y se describen en el presente documento como si todas y cada una de las subcombinaciones se divulgaran individual y explícitamente en el presente documento
[0025] La presente invención se define por las reivindicaciones.
[0026] Otras características y ventajas de la presente invención descrita en este documento serán evidentes a partir de las siguientes figuras, descripción detallada y reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0027] La presente invención se comprende mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. El expediente de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. La Oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos en color previa solicitud y pago de la tasa necesaria. Se enfatiza que, de acuerdo con la práctica común, las diversas características de los dibujos no están a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características se amplían o reducen arbitrariamente para mayor claridad. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras.
La Figura 1 representa realizaciones de una metodología de evolución dirigida. La etapa (a) representa la generación de una biblioteca de cápside viral que comprende combinaciones de técnicas de mutación de ADN y genes cap. La etapa (b) representa el empaquetamiento de los virus de modo que cada partícula viral está compuesta por una cápside mutante que rodea el gen cap que codifica esa cápside y se purifica. A continuación, la biblioteca de la cápside se somete a presión selectiva in vitro o in vivo. En este aspecto de la tecnología de evolución dirigida, se recolectan tejidos o material celular de interés para el aislamiento de variantes de AAV que han infectado con éxito esa diana, y se recuperan los virus exitosos. La etapa (c) representa el enriquecimiento de la Etapa 1 de los clones exitosos a través de la selección repetida. La etapa (d) representa el enriquecimiento de la etapa 2 de los genes cap seleccionados que se someten a rediversificación y etapas de selección adicionales para aumentar iterativamente la aptitud viral. La etapa (e) representa las variantes, identificadas como aciertos durante las etapas 1 y 2 de selección de vectores, que se fabricarán como vectores de AAV recombinantes y se caracterizarán por el nivel de transducción de varios tipos de células y dianas de tejido. Por la naturaleza del proceso de evolución dirigido por AAV, las variantes que se describen en este documento ya han demostrado la capacidad de transducir células musculares y suministrar un genoma (el genoma que codifica el gen cap variante) durante el proceso de selección.
La figura 2 muestra una amplificación por PCR de genomas virales de los tejidos de músculo cardiaco y esquelético de una ronda representativa de selección. Las bandas dentro de los recuadros rojos representan la amplificación exitosa de los genomas virales.
Las Figuras 3A-3C muestran la frecuencia de motivos dentro del análisis de secuenciación. La Fig. 3A proporciona un análisis de secuenciación de la Ronda 4 para la presión selectiva de la administración intravenosa al tejido cardíaco. La Fig. 3B proporciona el análisis de secuenciación de la Ronda 2 para la presión selectiva de la administración intravenosa en presencia de anticuerpos neutralizantes al tejido cardíaco. La Fig. 3C proporciona el análisis de secuenciación de la Ronda 3 para la presión selectiva de la administración intravenosa al tejido del músculo esquelético. La Figura 3A muestra un 57,40 % de Motivo LANKIQRTDA, 16,96 % de Motivo LANKTTNKDA, 7,32 % de Motivo A593E, 7,32 % de Otro, 4,88 % de Motivo V708I y 4,88 % de Motivo LASNTVKAIA. La figura 3B muestra 21,14 % de Otro, 20,33 % de Motivo LAQADTTKNA, 15,45 % de Motivo LANKTTNKDA, 15,45 % de Motivo LAASNITKAA, 15,45 % de Motivo quimera AAV6/AAV5 y 12,20 % de Motivo LANTVKLSTA. La figura 3C muestra un 43,21 % de motivo A593E, un 41,98 % de motivo P363L y un 14,81 % de otro.
Figuras 4A-4C. La Fig. 4A es un modelo tridimensional representativo de AAV2 que contiene un heptámero aleatorio después del aminoácido 587 y una sustitución V708I. La Fig. 4B es un modelo tridimensional representativo de la quimera AAV6/AAV5 que contiene las sustituciones V229I, A490T y A581T (correspondientes a la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:62). La Fig. 4C es un modelo tridimensional representativo de AAV2 que contiene una sustitución de P363L.
La Figura 5 proporciona una alineación de AAV de tipo salvaje de SEQ ID NOS: 1-11 que muestra las ubicaciones de aminoácidos entre y a través de los serotipos de tipo salvaje (de origen natural) AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B y AAV4-10.
Las Figuras 6A-6E proporcionan datos sobre la transducción de cardiomiocitos humanos in vitro por el virus AAV recombinante que comprende la nueva variante de cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I, la nueva variante de la cápside de Aa V LANKTTNKDA+V708I y la nueva variante de la cápside LATNKIGVTA+V708I, cada una expresando un transgén de GFP bajo el control del promotor CAG. Figura 6A: Las células que se diferenciaron en cardiomiocitos de una línea de células madre pluripotentes humanas se infectaron con la nueva variante de AAV LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP, la nueva variante de AAV LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP, la nueva variante de AAV LATNKIGVTA+V708I.CAG.GFP o controles de tipo salvaje AAV1.CAG.GFP, AAV2.CAG.GFP y AAV9.CAG.GFP a MOI de 20, 100, 500 y 2500. Las imágenes de inmunofluorescencia de los cultivos celulares 6 días después de la infección a todas las MOI demuestran que las nuevas variantes de cápsides de AAV transducen los cardiomiocitos mejor que las cápsides de tipo salvaje AAV1, AAV2 o AAV9. Figura 6B: La cuantificación del porcentaje de cardiomiocitos positivos para GFP en cada cultivo mediante citometría de flujo revela que las nuevas variantes de cápsides de AAV proporcionan una mejora significativa, dependiente de la dosis, en el número de células transducidas sobre las cápsides AAV1, a AV2 o AAV9 de tipo salvaje. * p < 0,05 Figuras 6C-6D: la cuantificación de la cantidad de GFP en cada cultivo por transferencia Western revela que las nuevas variantes de AAV proporcionan una mejora significativa en la expresión del transgén sobre las cápsides de AAV1, AAV2 o AAV9 de tipo salvaje. NT = no transducido. Figura 6E: Las células que se diferenciaron en cardiomiocitos a partir de una línea de células madre pluripotentes humanas se infectaron con la nueva variante de AAV LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP, la nueva variante de AAV LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP, la nueva variante de AAV LATNKIGVTA+V708I.CAG.GFP o controles de tipo AAV1.CAG.GFP, AAV2.CAG.GFP y AAV9.CAG.GFP. Las imágenes de inmunofluorescencia de los cultivos celulares en los días 1, 2, 3 y 5 después de la infección a una MOI de 500 demuestran que las nuevas variantes de cápsides de Aa V transducen mejor los cardiomiocitos y comienzan a expresar el transgén de GFP antes que las cápsides de tipo salvaje AAV1, AAV2 o AAV9.
Las Figuras 7A-E proporcionan datos sobre la transducción de cardiomiocitos humanos in vitro por el virus AAV recombinante que comprende la nueva variante de la cápside de AAV quimera AAV6/AAV5 de SEQ ID NO: 62, que expresa un transgén de GFP bajo el control del promotor CAG. Figura 7A: Las células que se diferenciaron en cardiomiocitos a partir de una línea de células madre pluripotentes humanas se infectaron con la nueva variante de la cápside de AAV quimera AAV6/AAV5 o controles de tipo salvaje AAV1.CAG.GFP, AAV8.CAG.GFP y AAV9.CAG.GFP a MOI de 100, 500 y 2500. Las imágenes de inmunofluorescencia de los cultivos celulares 6 días después de la infección en todas las MOI demuestran que la nueva variante de cápside de AAV transduce los cardiomiocitos mejor que las cápsides de tipo salvaje AAV1, AAV8 o AAV9. Figura 7B: La cuantificación del porcentaje de cardiomiocitos positivos para GFP en cada cultivo mediante citometría de flujo revela que la nueva variante de la cápside de AAV proporciona una mejora significativa, dependiente de la dosis, en el número de células transducidas sobre las cápsides de AAV1, AAV8 o AAV9 de tipo salvaje. * p < 0,05 Figuras 7C-7D: La cuantificación de la cantidad de GFP en cada cultivo mediante transferencia Western revela que la nueva variante de AAV proporciona una mejora significativa en la expresión del transgén sobre las cápsides de tipo salvaje AAV1, AAV8 o AAV9. vehículo = no transducido. Figura 7E: Las células que se diferenciaron en cardiomiocitos a partir de una línea de células madre pluripotentes humanas se infectaron con la nueva variante de la cápside de AAV quimera AAV6/AAV5 o el control de tipo salvaje AAV8.CAG.GFP. Las imágenes de inmunofluorescencia de los cultivos celulares en los días 3, 4, 5, después de la infección a una MOI de 2500 demuestran que las nuevas variantes de cápsides de AAV transducen cardiomiocitos mejor y empiezan la expresión del transgén de GFP antes que la cápside de AAV8 de tipo salvaje.
Las Figuras 8A-C proporcionan datos sobre la transducción de miofibras esqueléticas humanas in vitro por el virus AAV recombinante que comprende la nueva variante de la cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I, la nueva variante de la cápside de AAV LANKTTNKDA+V708I y la nueva variante de la cápside de AAV quimera AAV6/AAV5, cada una expresando un transgén de GFP bajo el control del promotor cAg . Figura 8A: Las células que se diferenciaron en miofibras esqueléticas a partir de mioblastos primarios humanos se infectaron con la nueva variante de AAV LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP, la nueva variante de AAV LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP, la nueva variante de AAV quimera AAV6/AAV5.CAG.GFP o controles de tipo salvaje AAV8.CAG.GFP y AAV9.CAG.GFP en MOI de 100, 500 y 2500. Las imágenes de inmunofluorescencia de los cultivos celulares 7 días después de la infección en todas las MOI demuestran que las nuevas variantes de cápsides de AAV transducen las miofibras esqueléticas mejor que las cápsides de AAV8 o AAV9 de tipo salvaje. Figura 8B: La cuantificación del porcentaje de miofibras esqueléticas positivas para GFP en cada cultivo mediante citometría de flujo revela que las nuevas variantes de cápsides de AAV proporcionan una mejora significativa, dependiente de la dosis, en el número de células transducidas sobre las cápsides AAV8 o AAV9 de tipo salvaje. * p < 0,05 Figura 8C: Las células que se diferenciaron en miofibras esqueléticas a partir de mioblastos primarios humanos se infectaron con la nueva variante de AAV LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP, la nueva variante de AAV quimera AAV6/AAV5.CAG.GFP o controles de tipo salvaje AAV8.CAG .GFP y AAV9.CAG.GFP. Las imágenes de inmunofluorescencia de los cultivos celulares en los días 2-7 después de la infección a una MOI de 2500 demuestran que las nuevas variantes de cápsides de AAV transducen miofibras esqueléticas mejor y empiezan la expresión del transgén de GFP antes que la cápside de AAV8 de tipo salvaje.
Las Figuras 9A-B proporcionan datos sobre la transducción de células progenitoras de músculo humano in vitro por el virus AAV recombinante que comprende la nueva variante de la cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I, la nueva variante de la cápside de AAV LANKTTNKDA+V708I y la nueva variante de la cápside de AAV quimera AAV6/AAV5, cada una expresando un transgén de GFP bajo el control del promotor cAg . Figura 9A: Las células que se diferenciaron en células progenitoras musculares a partir de una línea de células madre pluripotentes humanas se infectaron con la nueva variante de AAV LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP, la nueva variante de AAV LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP, la nueva variante de AAV quimera AAV6/AAV5.CAG.GFP o control de tipo salvaje AAV9.CAG.GFP a una MOI de 500. Las imágenes de inmunofluorescencia de los cultivos celulares 6 días después de la infección en todas las MOI demuestran que las nuevas variantes de cápsides de AAV transducen las células progenitoras musculares mejor que el AAV9 de tipo salvaje. Figura 9B: La cuantificación del porcentaje de células progenitoras musculares positivas para GFP en cada cultivo mediante citometría de flujo revela que las nuevas variantes de cápsides de AAV proporcionan una mejora significativa en el número de células transducidas sobre el AAV9 de tipo salvaje. * p < 0,05.
Las Figuras 10A-B proporcionan datos sobre la magnitud de la mejora de la transducción de cardiomiocitos humanos y miofibras esqueléticas humanas in vitro por el virus AAV recombinante que comprende la nueva variante de la cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I, la nueva variante de la cápside de AAV LANKTTNKDA+V708I y la nueva variante de la cápside de AAV quimera AAV6/AAV5, cada una expresando un transgén de GFP bajo el control del promotor CAG. Figura 10A: Número de veces del aumento en la transducción de cardiomiocitos humanos por las nuevas variantes de la cápside de AAV en comparación con AAV8 y AAV9 de tipo salvaje, los serotipos más utilizados en aplicaciones clínicas para enfermedades musculares. Figura 10B: Número de veces del aumento en la transducción de miofibras esqueléticas humanas por las nuevas variantes de cápside de AAV en comparación con AAV8 y AAV9 de tipo salvaje. Las Figuras 11A-B proporcionan datos sobre la transducción de tejido de ratón in vivo por virus a Av recombinante que comprende la nueva variante de la cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I que expresa un transgén de luciferasa bajo el control del promotor CAG. Los ratones recibieron una única inyección intravenosa a través de la vena de la cola de 2 x 1011 genomas virales por animal. Figura 11A: Las imágenes in vivo de la luciferasa en el día 14 (izquierda) y el día 28 (derecha) después de la administración demuestran que la nueva variante de la cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I puede transducir células de ratón in vivo. Figura 11B: La actividad de la luciferasa en el corazón, el diafragma y el cuádriceps 56 días después de la administración demuestra que la nueva variante de la cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I puede transducir el músculo cardíaco y esquelético de ratón in vivo.
Las Figuras 12A-B proporcionan datos sobre la transducción de músculo esquelético de primate no humano in vivo por virus a Av recombinante que comprende la nueva variante de la cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I que expresa un transgén de GFP bajo el control del promotor CAG. El primate no humano recibió 3 inyecciones intramusculares de 1011 genomas virales cada uno en el vasto lateral izquierdo, y el tejido muscular se analizó 4 semanas después de la administración. Figura 12A: Imágenes representativas de hematoxilina y eosina (H&E) y tinción de anticuerpos anti-GFP de cortes transversales del sitio de biopsia proximal con aumentos de 2x, 4x y 20x demuestran que la nueva variante de la cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I puede transducir células de músculo esquelético de primate in vivo. Figura 12B: Imágenes representativas de hematoxilina y eosina (H&E) y tinción de anticuerpos anti-GFP de secciones longitudinales del sitio de biopsia distal con aumentos de 2x, 4x y 20x demuestran que la nueva variante de la cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I puede transducir células del músculo esquelético de primates in vivo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0028] La presente invención se define mediante las reivindicaciones.
[0029] La presente invención descrita en este documento se ilustra en las figuras y la descripción. Sin embargo, aunque en las figuras se ilustran realizaciones particulares, no se pretende limitar la presente invención a la realización o realizaciones específicas ilustradas y/o descritas.
[0030] Por tanto, las figuras pretenden ser ilustrativas y no restrictivas.
[0031] Cuando se proporciona un rango de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese rango también se describen de manera específica. Cada rango más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un rango establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese rango establecido está abarcado dentro de la presente invención. Los límites superior e inferior de estos rangos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el rango, y cada rango en el que alguno, ninguno o ambos límites están incluidos en los rangos más pequeños también está incluido dentro de la presente invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango indicado. Cuando el rango establecido incluye uno o ambos límites, los rangos que excluyen alguno o ambos de los límites incluidos también están incluidos en la presente invención.
[0032] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden habitualmente los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen algunos procedimientos y materiales potenciales y preferidos.
[0033] Tal como será evidente para los expertos en la técnica al leer esta descripción, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en este documento tiene componentes y características discretos que pueden separarse fácilmente o combinarse con las características de cualquiera de las otras varias realizaciones sin apartarse del alcance o espíritu de la presente invención. Cualquier procedimiento citado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos citados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.
[0034] Se observa que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el"/”la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un virión de AAV recombinante" incluye una pluralidad de dichos viriones y la referencia a "la célula muscular" incluye la referencia a una o más células musculares y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Por tanto, esta afirmación pretende servir como base antecedente para el uso de dicha terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la mención de los elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".
[0035] Las publicaciones discutidas en este documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo aquí contenido debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden diferir de las fechas de publicación reales, por lo que es posible que sea necesario confirmarlas de forma independiente.
DEFINICIONES
[0036] El virus adenoasociado es un parvovirus no patógeno compuesto por un genoma de ADN monocatenario de 4,7 kb dentro de una cápside icosaédrica sin envoltura. El genoma contiene tres marcos de lectura abiertos (ORF) flanqueados por repeticiones terminales invertidas (ITR) que funcionan como el origen viral de la replicación y la señal de empaquetamiento. El ORF de rep codifica cuatro proteínas no estructurales que desempeñan funciones en la replicación viral, la regulación transcripcional, la integración específica del sitio y el ensamblaje del virión. El ORF de cap codifica tres proteínas estructurales (VP 1-3) que se ensamblan para formar una cápside viral de 60 unidades. Finalmente, un ORF presente como un marco de lectura alternativo dentro del gen cap produce la proteína activadora de ensamblaje (AAP), una proteína viral que localiza las proteínas de la cápside de AAV en el nucléolo y funciona en el proceso de ensamblaje de la cápside.
[0037] Hay varios serotipos naturales ("de tipo salvaje") y más de 100 variantes conocidas de AAV, cada una de las cuales difiere en la secuencia de aminoácidos, particularmente dentro de las regiones hipervariables de las proteínas de la cápside y, por lo tanto, en sus propiedades de suministro de genes. Ningún AAV se ha asociado con ninguna enfermedad humana, lo que hace que el AAV recombinante sea atractivo para aplicaciones clínicas.
[0038] A los efectos de la presente descripción, la terminología "AAV" es una abreviatura de virus adenoasociado, que incluye, sin limitación, el propio virus y sus derivados. Excepto donde se indique lo contrario, la terminología se refiere a todos los subtipos o serotipos y a las formas recombinantes y competentes para la replicación. El término "AAV" incluye, sin limitación, AAV tipo 1 (AAV-1 o AAV1), AAV tipo 2 (AAV-2 o AAV2), AAV tipo 3A (AAV-3A o AAV3A), AAV tipo 3B (AAV-3B o AAV3B), AAV tipo 4 (AAV-4 o AAV4), AAV tipo 5 (AAV-5 o AAV5), AAV tipo 6 (AAV-6 o AAV6), AAV tipo 7 (AAV-7 o AAV7), AAV tipo 8 (AAV-8 o AAV8), AAV tipo 9 (AAV-9 o AAV9), AAV tipo 10 (AAV-10 o AAV10 o AAVrh10), AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV caprino, AAV equino, AAV de primate , AAV de no primates y AAV ovino. "AVV de primate" se refiere a AAV que infecta primates, “AVV de no primates” se refiere a AAV que infecta a mamíferos que no son primates, “AAV bovino” se refiere a AAV que infecta a mamíferos bovinos, etc.
[0039] Las secuencias genómicas de varios serotipos de AAV, así como las secuencias de las repeticiones terminales nativas (TR), las proteínas Rep y las subunidades de la cápside son conocidas en la técnica. Tales secuencias se pueden encontrar en la literatura o en bases de datos públicas, tales como GenBank. Véase, por ejemplo, los números de acceso de GenBank NC_002077.1 (AAV1), AF063497.1 (AAV1), NC_001401.2 (AAV2), AF043303.1 (AAV2), J01901.1 (AAV2), U48704.1 (AAV3A), NC_001729 .1 (AAV3A), AF028705.1 (AAV3B), NC_001829.1 (AAV4), U89790.1 (AAV4), NC_006152.1 (AA5), AF085716.1 (AAV-5), AF028704.1 (AAV6), NC_006260.1 (AAV7), AF513851.1 (AAV7), AF513852.1 (AAV8) NC_006261.1 (AAV-8), AY530579.1 (AAV9), AAT46337 (AAV10) y AA088208 (AAVrh10).
[0040] Véase también, por ejemplo, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. J. Virology 73:1309; Según Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Según Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et al. Alabama. (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Morris et al. (2004) Virology 33:375-383; publicaciones de patentes internacionales WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; y la patente de EE.UU. No. 6.156.303.
[0041] Las secuencias de proteínas cap (cápside) existentes de forma natural asociadas con los serotipos de AAV se conocen en la técnica e incluyen las descritas en el presente documento como AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3A (SEQ ID NO: 3 ), AAV3B (SEC ID NO: 4), AAV4 (SEC ID NO: 5), AAV5 (SEC ID NO: 6), AAV6 (SEC ID NO: 7), AAV7 (SEC ID NO: 8), AAV8 (SEC ID NO: 9), AAV9 (SEC ID NO: 10), AAV10 (SEC ID NO: 11) y AAVrh10 (SEC ID NO: 12). Los términos "variante de la proteína de la cápside de AAV" o "variante de AAV" se refieren a una proteína de la cápside de AAV que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una modificación o sustitución (incluida la eliminación, inserción, mutación puntual, etc.) en relación con secuencias de proteínas de la cápside de AAV existentes de forma natural o de "tipo salvaje", por ejemplo, tal como se establece en SEQ ID NO: 1-12 en este documento. Una variante de la proteína de la cápside de AAV puede tener aproximadamente un 80 % de identidad o más con la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de tipo salvaje, por ejemplo, un 85 % de identidad o más, un 90 % de identidad o más, o un 95 % de identidad o más con la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de tipo salvaje, por ejemplo, un 98 % o 99 % de identidad con la proteína de la cápside de tipo salvaje. Una variante de la proteína de la cápside de AAV puede no ser una proteína de la cápside de tipo salvaje.
[0042] Para los fines de la presente descripción, "virión de AAV" o "partícula viral de AAV" se refiere a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV y un polinucleótido de AAV encapsidado.
[0043] Para los fines de la descripción del presente documento, la terminología "rAAV" es una abreviatura que se refiere a virus adenoasociado recombinante. "Recombinante", tal como se aplica a un polinucleótido, significa que el polinucleótido es el producto de varias combinaciones de etapas de clonación, restricción o ligadura, y otros procedimientos que dan como resultado una construcción que es distinta de un polinucleótido que se encuentra en la naturaleza. Un virus recombinante es una partícula viral que comprende un polinucleótido recombinante. Los términos incluyen, respectivamente, réplicas de la construcción de polinucleótidos original y la progenie de la construcción de virus original.
[0044] El término "vector de rAAV" abarca viriones de rAAV (es decir, partículas virales de rAAV) (por ejemplo, un virión de rAAV infeccioso), que por definición incluyen un polinucleótido de rAAV; y también abarca polinucleótidos que codifican rAAV (por ejemplo, un polinucleótido monocatenario que codifica rAAV (ss-rAAV); un polinucleótido bicatenario que codifica rAAV (ds-rAAV), por ejemplo, plásmidos que codifican rAAV y similares).
[0045] Si un virión de AAV comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido que no sea un genoma de AAV de tipo salvaje, por ejemplo, un transgén que se suministrará a una célula diana, un agente de ARNi o un agente CRISPR que se suministrará a una célula diana, etc.), normalmente se denomina "virión de AAV recombinante (rAAV)" o "partícula viral de rAAV". En general, el polinucleótido heterólogo está flanqueado por al menos una, y generalmente por dos, secuencias repetidas terminales invertidas (ITR) de AAV.
[0046] El término "empaquetamiento" se refiere a una serie de eventos intracelulares que dan como resultado el ensamblaje y la encapsidación de una partícula de AAV. Los genes "rep" y "cap" de AAV se refieren a secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas de replicación y encapsidación de virus adenoasociados. rep y cap de AAV se denominan en el presente documento "genes de empaquetamiento" de AAV.
[0047] La terminología "virus auxiliar" para AAV se refiere a un virus que permite que AAV (por ejemplo , AAV de tipo salvaje) sea replicado y empaquetado por una célula de mamífero. Se conocen en la técnica una variedad de tales virus auxiliares para AAV, incluidos adenovirus, herpesvirus y poxvirus, tales como vaccinia. Los adenovirus abarcan varios subgrupos diferentes, aunque el adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el más utilizado. Numerosos adenovirus de origen humano, de mamíferos no humanos y de aves son conocidos y están disponibles en depósitos, tales como la ATCC. Los virus de la familia del herpes incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (HSV) y virus de Epstein-Barr (EBV), así como citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorrabia (PRV); que también están disponibles en depósitos, tales como ATCC.
[0048] La terminología "función o funciones del virus auxiliar" se refiere a la función o funciones codificadas en un genoma de virus auxiliar que permite la replicación y el empaquetamiento de AAV (junto con otros requisitos para la replicación y el empaquetamiento descritos en este documento). Tal como se describe en el presente documento, la "función del virus auxiliar" se puede proporcionar de varias formas, incluso proporcionando virus auxiliares o proporcionando, por ejemplo, secuencias de polinucleótidos que codifican la función o funciones requeridas a una célula productora en trans. Por ejemplo, un plásmido u otro vector de expresión que comprende secuencias de nucleótidos que codifican una o más proteínas adenovirales se transfecta en una célula productora junto con un vector de rAAV.
[0049] La terminología virus o partícula viral "infecciosa" es aquella que comprende una cápside viral ensamblada competentemente y es capaz de suministrar un componente de polinucleótido en una célula para la cual la especie viral es trópica. El término no implica necesariamente ninguna capacidad de replicación del virus. Los ensayos para contar partículas virales infecciosas se describen en otra parte de esta descripción y en la técnica. La infectividad viral se puede expresar como la proporción de partículas virales infecciosas con respecto a partículas virales totales. Los procedimientos para determinar la proporción de partículas virales infecciosas con respecto a partículas virales totales son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11: S337 (que describe un ensayo de título infeccioso TCID50); y Zolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6:973. Ver también los Ejemplos.
[0050] El término "tropismo", tal como se usa en el presente documento, se refiere al reconocimiento preferencial por parte de un virus (por ejemplo, un AAV) de células de una especie huésped particular o de tipos de células particulares dentro de una especie huésped. Por ejemplo, un virus que puede infectar células del corazón, pulmón, hígado y músculo tiene un tropismo más amplio (es decir, aumentado) en relación con un virus que puede infectar sólo células de pulmón y músculo. El tropismo también puede incluir la dependencia de un virus de tipos particulares de moléculas de la superficie celular del huésped. Por ejemplo, algunos virus pueden infectar solo células con glicosaminoglicanos de superficie, mientras que otros virus pueden infectar solo células con ácido siálico (estas dependencias pueden probarse utilizando varias líneas celulares deficientes en clases particulares de moléculas como posibles células huésped para la infección viral). En algunos casos, el tropismo de un virus describe las preferencias relativas del virus. Por ejemplo, un primer virus puede infectar todos los tipos de células, pero tiene mucho más éxito en infectar aquellas células con glicosaminoglicanos de superficie. Se puede considerar que un segundo virus tiene un tropismo similar (o idéntico) al primer virus si el segundo virus también prefiere las mismas características (por ejemplo, el segundo virus también tiene más éxito en infectar aquellas células con glicosaminoglicanos de superficie), incluso si el las eficiencias de transducción absolutas no son similares. Por ejemplo, el segundo virus podría ser más eficiente que el primer virus para infectar cada tipo de célula determinada probada, pero si las preferencias relativas son similares (o idénticas), aún se puede considerar que el segundo virus tiene un tropismo similar (o idéntico) al primer virus. En algunas realizaciones, el tropismo de un virión que comprende una variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión no está alterado en relación con un virión de origen natural. En algunas realizaciones, el tropismo de un virión que comprende una variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión se expande (es decir, se amplía) en relación con un virión de origen natural. En algunas realizaciones, el tropismo de un virión que comprende una variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión se reduce en relación con un virión de origen natural.
[0051] La terminología virus "competente para la replicación" (por ejemplo, un AAV competente para la replicación) se refiere a un virus fenotípicamente salvaje que es infeccioso y también es capaz de replicarse en una célula infectada (es decir, en presencia de un virus auxiliar o que funciona como un virus auxiliar). En el caso de AAV, la competencia de replicación generalmente requiere la presencia de genes de empaquetamiento de AAV funcionales. En general, los vectores de rAAV, tal como se describen en este documento, son incompetentes para la replicación en células de mamífero (especialmente en células humanas) en virtud de la falta de uno o más genes de empaquetamiento de AAV. Típicamente, tales vectores de rAAV carecen de secuencias de genes de empaquetamiento de AAV para minimizar la posibilidad de que se generen AAV competentes para la replicación mediante la recombinación entre genes de empaquetamiento de AAV y un vector de rAAV entrante. En muchas realizaciones, las preparaciones de vector de rAAV, tal como se describen en el presente documento, alguna, si las tienen, AvV competentes para la replicación (rcAAV, también denominado como TCA) (por ejemplo, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 102 partículas de rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 104 partículas de rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 10 partículas rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 1012 partículas de rAAV, o ningún rcAAV).
[0052] El término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, incluidos desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, y puede estar interrumpido por componentes que no son nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones en la estructura de nucleótidos pueden impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. El término polinucleótido, tal como se usa en el presente documento, se refiere indistintamente a moléculas monocatenarias y bicatenarias. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier realización del presente documento que comprenda un polinucleótido abarca tanto la forma de doble cadena como cada una de las dos formas complementarias de cadena única conocidas o previstas para formar la forma de doble cadena.
[0053] Un polinucleótido o polipéptido tiene un cierto porcentaje de "identidad de secuencia" con otro polinucleótido o polipéptido, significa que, cuando se alinea, ese porcentaje de bases o aminoácidos es el mismo cuando se comparan las dos secuencias. La similitud de secuencia se puede determinar de varias maneras diferentes. Para determinar la identidad de la secuencia, las secuencias se pueden alinear utilizando procedimientos y programas informáticos, incluido BLAST, disponible en la red en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Otro algoritmo de alineación es FASTA, disponible en el paquete Genetics Computing Group (GCG), de Madison, Wisconsin, EE. UU., una subsidiaria de propiedad total de Oxford Molecular Group, Inc. Otras técnicas de alineación se describen en Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., una división de Harcourt Brace & Co., San Diego, California, EE. UU. De particular interés son los programas de alineación que permiten espacios en la secuencia. El Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite espacios en las alineaciones de secuencias. Ver Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Además, el programa gAp que utiliza el procedimiento de alineación de Needleman y Wunsch se puede utilizar para alinear secuencias. Véase J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).
[0054] El término "gen" se refiere a un polinucleótido que realiza una función de algún tipo en la célula. Por ejemplo, un gen puede contener un marco de lectura abierto que sea capaz de codificar un producto génico. Un ejemplo de un producto génico es una proteína, que se transcribe y traduce a partir del gen. Otro ejemplo de un producto génico es un ARN, por ejemplo, un producto de ARN funcional, por ejemplo, un aptámero, un a Rn de interferencia, un ARN ribosómico (ARNr), un ARN de transferencia (ARNt), un ARN no codificante (ARNnc), un ARN guía para nucleasas, etc., que se transcribe pero no se traduce.
[0055] La terminología "producto de expresión génica" o "producto génico" es una molécula resultante de la expresión de un gen particular, tal como se define anteriormente. Los productos de expresión génica incluyen, por ejemplo, un polipéptido, un aptámero, un ARN de interferencia, un ARN mensajero (ARNm), un ARNr, un ARNt, un ARN no codificante (ARNnc) y similares.
[0056] El término "agente de ARNsi" ("pequeño ARN de interferencia" o "ARN de interferencia corto" (o ARNsi)) es una doble cadena de ARN de nucleótidos que reconoce un gen de interés (un "gen diana"). Una "cadena doble de ARN" se refiere a la estructura formada por el emparejamiento complementario entre dos regiones de una molécula de ARN, formando una región de ARN de doble cadena (ARNds). El ARNsi "reconoce" un gen porque la secuencia de nucleótidos de la porción de doble cadena del ARNsi es complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen diana. En algunas realizaciones, la longitud de la doble cadena de ARNsi es inferior a 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la doble cadena puede tener una longitud de 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 nucleótidos. En algunas realizaciones, la longitud de la doble cadena es de 19 a 25 nucleótidos. En algunas realizaciones, el reconocimiento de genes mediado por ARNsi se logra mediante el uso de ARN de interferencia dirigido por ADN (ddARNi), que es una técnica de silenciamiento de genes que utiliza construcciones de ADN para activar las vías de interferencia de ARN endógeno (ARNi) de una célula animal. Tales construcciones de ADN están diseñadas para expresar ARN de doble cadena autocomplementarios, típicamente ARN de horquilla corta (ARNsh), que una vez procesados provocan el silenciamiento de un gen o genes diana. Cualquier ARN, incluidos los ARNm endógenos o los a Rn virales, se puede silenciar mediante el diseño de construcciones para expresar ARN de doble cadena complementario a la diana de ARNm deseado. Como tal, la porción de doble cadena de ARN de un agente de ARNsi puede ser parte de una estructura de horquilla corta denominada ARNsh. Además de la parte de doble cadena, la estructura de horquilla puede contener una porción de bucle colocada entre las dos secuencias que forman la doble cadena. El bucle puede variar en longitud. En algunas realizaciones, el bucle tiene una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 nucleótidos. La estructura de horquilla también puede contener porciones salientes en 3' o 5'. En algunas realizaciones, el saliente es un saliente en 3' o 5' de 0, 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud. En general, el nivel del producto de expresión (por ejemplo, ARNm, polipéptido, etc.) de un gen diana se reduce mediante un agente de ARNsi (por ejemplo, un ARNsi, un ARNsh, etc.) que contiene secuencias específicas de nucleótidos de doble cadena que son complementarias a al menos un segmento de 19-25 nucleótidos de longitud (por ejemplo, una secuencia de 20-21 nucleótidos) del transcrito del gen diana, incluida la región 5' no traducida (UT), el ORF o la región 3' UT. En algunas realizaciones, los ARN de interferencia cortos tienen una longitud de aproximadamente 19-25 nt. Véanse, por ejemplo, las solicitudes PCT WOO/44895, WO99/32619, WO01/75164, WO01/92513, WO01/29058, WO01/89304, WO02/16620 y WO02/29858; y la Publicación de Patente de EE. UU. No. 20040023390 para descripciones de la tecnología de ARNsi. El ARNsi y/o el ARNsh pueden estar codificados por una secuencia de ácido nucleico, y la secuencia de ácido nucleico también puede incluir un promotor. La secuencia de ácido nucleico también puede incluir una señal de poliadenilación. En algunas realizaciones, la señal de poliadenilación es una señal de poliadenilación mínima sintética.
[0057] La terminología "ARN antisentido" abarca ARN que es complementario a un producto de expresión génica. Por ejemplo, un ARN antisentido dirigido a un ARNm específico es un agente basado en ARN (o puede ser un ARN modificado) que es complementario al ARNm, donde la hibridación del ARN antisentido con el ARNm altera la expresión del ARNm (por ejemplo, alterando la estabilidad del ARN, alterando la traducción del ARN, etc.). También se incluyen en "ARN antisentido" los ácidos nucleicos que codifican un ARN antisentido.
[0058] Con respecto a los "agentes CRISPR/Cas9", el término "CRISPR" abarca repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas/sistemas asociados a CRISPR (Cas) que evolucionaron para proporcionar a bacterias y arqueas una inmunidad adaptativa contra virus y plásmidos mediante el uso de ARN CRISPR (ARNcr) para guiar el silenciamiento de los ácidos nucleicos invasores. La proteína Cas9 (o equivalente funcional y/o variante de la misma, es decir, proteína similar a Cas9) contiene de forma natural actividad de ADN endonucleasa que depende de la asociación de la proteína con dos moléculas de ARN naturales o sintéticas llamadas ARNcr y ARNtracr (también llamadas ARN guía). En algunos casos, las dos moléculas se unen covalentemente para formar una sola molécula (también denominada ARN guía único ("ARNsg")). De este modo, la Cas9 o proteína similar a Cas9 se asocia con un ARN de reconocimiento de ADN (cuyo término abarca la configuración de ARN guía de dos moléculas y la configuración de ARN guía de una sola molécula), que activa la Cas9 o proteína similar a Cas9 y guía la proteína a una secuencia de ácido nucleico diana.
[0059] Si la proteína Cas9 o similar a Cas9 conserva su función enzimática natural, escindirá el ADN diana para crear una rotura de doble cadena, lo que puede conducir a la alteración del genoma (es decir, edición: eliminación, inserción (cuando está presente un polinucleótido donante), reemplazo, etc.), alterando así la expresión génica. Algunas variantes de Cas9 (cuyas variantes están abarcadas por el término similar a Cas9) se han alterado de tal manera que tienen una menor actividad de escisión de ADN (en algunos casos, escinden una sola cadena en lugar de ambas cadenas del ADN diana, mientras que en otros casos, se han reducido severamente a ninguna actividad de escisión de ADN). Las proteínas similares a Cas9 con actividad de escisión de ADN disminuida (incluso sin actividad de escisión de ADN) aún pueden guiarse a un ADN diana para bloquear la actividad de la ARN polimerasa. De manera alternativa, la proteína Cas9 o similar a Cas9 puede modificarse fusionando un dominio de activación de la transcripción VP64 a la proteína Cas9 y coadministrando la proteína de fusión con una proteína auxiliar MS2-P65-HSF1 y un único ARN guía que comprende aptámeros de ARN MS2 en el tetrabucle y el tallo-bucle para formar un complejo mediador de activación sinérgica (Cas9-SAM) en la célula que activa la transcripción. Por lo tanto, las proteínas similares a Cas9 enzimáticamente inactivas pueden dirigirse a una ubicación específica en un ADN diana mediante un ARN de reconocimiento de ADN para bloquear o activar la transcripción del ADN diana. El término "agentes CRISPR/Cas9", tal como se usa en el presente documento, abarca todas las formas de CRISPR/Cas9 tal como se describe anteriormente o como se conoce en la técnica.
[0060] Se puede encontrar información detallada sobre los agentes CRISPR, por ejemplo, en (a) Jinek et al., Science. 2012 17 de agosto; 337 (6096): 816-21: "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptative bacterial immunity"; (b) Qi et al., Cell. 201328 de febrero; 152(5): 1173-83: "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression", y (c) solicitud de patente estadounidense número 13/842,859 y solicitud PCT número PCT/US13/32589;
[0061] Por lo tanto, el término "agente CRISPR", tal como se usa en el presente documento, abarca cualquier agente (o ácido nucleico que codifica dicho agente), que comprende secuencias naturales y/o sintéticas, que se pueden usar en el sistema basado en Cas9 (por ejemplo, una Cas9 o proteína similar a Cas9; cualquier componente de un ARN dirigido a ADN, por ejemplo, un ARN similar a crARN, un ARN similar a tracrARN, un ARN guía único, etc.; un polinucleótido donante; y similares).
[0062] Por "nucleasas con dedos de zinc" (ZFN) se entiende endonucleasas de ADN artificiales generadas mediante la fusión de un dominio de unión a ADN con dedos de zinc a un dominio de escisión de ADN. Los ZFN se pueden diseñar para reconocer secuencias de ADN deseadas y esto permite que las nucleasas con dedos de zinc escindan secuencias diana únicas. Cuando se introducen en una célula, los ZFN se pueden usar para editar el ADN diana en la célula (por ejemplo, el genoma de la célula) mediante la inducción de roturas de dobles cadenas. Para obtener más información sobre el uso de ZFN, véase, por ejemplo: Asuri et al., Mol Ther. febrero de 2012; 20(2):329-38; Bibikova et al. Science. 2 de mayo de 2003; 300 (5620): 764; Madera et al. Science. 15 de julio de 2011; 333 (6040): 307; Ochiai et al. Genes Cells. 2010 agosto; 15 (8): 87S-85; Takasu et. al., Insect Biochem Mol Biol. 2010 octubre; 40 (10): 759-65; Ekker et al, Zebrafish 2008 Summer; 5(2): 121-3; Young et al, Proc Natl Acad Sci USA. 26 de abril de 2011; 108(17): 7052­ 7; Goldberg et al., Cell. 5 de marzo de 2010; 140(5): 678-91; Geurts et al., Science. 24 de julio de 2009; 325 (5939): 433; Flisikowska y otros, PLoS One. 2011;6(6): e21045. doi: 10.1371/journal.pone.0021045. Epub 13 de junio de 2011; Proc Natl Acad Sci USA. 19 de julio de 2011; 108 (29): 12013-7; y Yu et al., Cell Res. 2011 noviembre; 21 (11): 1638-40.
[0063] El término "agente ZFN" abarca una nucleasa con dedos de zinc y/o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una nucleasa con dedos de zinc.
[0064] La terminología "nucleasa efectora de tipo activador de transcripción" o agentes "TALEN" se refiere a las nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción (TALEN) que son endonucleasas de ADN artificiales generadas mediante la fusión de un dominio de unión de a Dn efector TAL (tipo activador de transcripción) a un dominio de escisión del ADN. Las TALENs se puede diseñar rápidamente para unir prácticamente cualquier secuencia de ADN deseada y, cuando se introducen en una célula, se pueden usar TALENs para editar el ADN diana en la célula (por ejemplo, el genoma de la célula) mediante la inducción de roturas de doble cadena. Para obtener más información sobre el uso de TALEN, consulte, por ejemplo: Hockemeyer et al. Nat Biotechnol. 7 de julio de 2011; 29 (8): 731-4; Wood et al. Science. 15 de julio de 2011; 333 (6040): 307; Tesson et al. Nat Biotechnol. 5 de agosto de 2011; 29 (8): 695-6; y Huang et. al., Nat Biotechnol. 5 de agosto de 2011; 29 (8): 699-700.
[0065] El término "agente TALEN" abarca un TALEN y/o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un TALEN.
[0066] La terminología "elemento de control" o "secuencia de control" se refiere a una secuencia de nucleótidos involucrada en una interacción de moléculas que contribuye a la regulación funcional de un polinucleótido, incluida la replicación, duplicación, transcripción, corte y empalme, traducción o degradación del polinucleótido. La regulación puede afectar la frecuencia, la velocidad o la especificidad del proceso, y puede ser de naturaleza potenciadora o inhibidora. Los elementos de control conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripción, tales como promotores y potenciadores. Un promotor es una región de ADN capaz, en determinadas condiciones, de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una región codificante normalmente situada aguas abajo (en la dirección 3') del promotor. Los promotores pueden actuar de forma ubicua, es decir, activos en muchos tipos de células, por ejemplo, promotores CAG o CMV; o específico de tejido o célula, por ejemplo, el promotor puede ser específico de tejido para la expresión en cardiomiocitos.
[0067] La terminología "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición de elementos genéticos, en la que los elementos están en una relación que les permite operar de la manera esperada. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una región codificante si el promotor ayuda a iniciar la transcripción de la secuencia codificante. Puede haber residuos intermedios entre el promotor y la región codificante siempre que se mantenga esta relación funcional.
[0068] La terminología "vector de expresión" abarca un vector que comprende una región polinucleotídica que codifica un polipéptido de interés y se usa para efectuar la expresión de la proteína en una célula diana deseada. Un vector de expresión también puede comprender elementos de control unidos operativamente a la región codificante para facilitar la expresión de la proteína en la diana. La combinación de elementos de control y un gen o genes a los que están unidos operativamente para la expresión se denomina a veces "cassette de expresión", un gran número de los cuales son conocidos y están disponibles en la técnica o pueden construirse fácilmente a partir de componentes que están disponibles en la técnica.
[0069] El término "heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta del resto de la entidad con la que se compara. Por ejemplo, un polinucleótido introducido mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una especie diferente es un polinucleótido heterólogo. Un promotor extraído de su secuencia de codificación nativa y unido operativamente a una secuencia de codificación con la que no se encuentra unido de forma natural es un promotor heterólogo. Por lo tanto, por ejemplo, un rAAV que incluye una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica un producto génico heterólogo es un rAAV que incluye un polinucleótido que normalmente no se incluye en un AAV de tipo salvaje de origen natural, y el producto génico heterólogo codificado es un producto génico que normalmente no está codificado por un AAV de tipo salvaje de origen natural.
[0070] La terminología "alteración genética" y "modificación genética" (y variantes gramaticales de las mismas) se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un proceso en el que un elemento genético (por ejemplo, un polinucleótido) se introduce en una célula que no sea por mitosis o meiosis. El elemento puede ser heterólogo a la célula, o puede ser una copia adicional o una versión mejorada de un elemento ya presente en la célula. La alteración genética puede efectuarse, por ejemplo, transfectando una célula con un plásmido recombinante u otro polinucleótido a través de cualquier proceso conocido en la técnica, tal como electroporación, precipitación con fosfato de calcio o contacto con un complejo de polinucleótido-liposoma. La alteración genética también puede efectuarse, por ejemplo, mediante transducción o infección con un virus de ADN o ARN o un vector viral. Generalmente, el elemento genético se introduce en un cromosoma o minicromosoma en la célula; pero se incluye en este término cualquier alteración que cambie el fenotipo y/o genotipo de la célula y su progenie.
[0071] Con respecto a la modificación celular, la terminología "modificado genéticamente" o "transformado" o "transfectado" o "transducido" por ADN exógeno (por ejemplo, a través de un virus recombinante) se refiere a cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. La presencia del ADN exógeno da como resultado un cambio genético permanente o transitorio. El ADN transformante puede estar integrado o no (unido covalentemente) en el genoma de la célula. Un "clon" es una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.
[0072] Tal como se usa en el presente documento, se dice que una célula está alterada, transducida, modificada genéticamente o transformada "de manera estable" con una secuencia genética si la secuencia está disponible para realizar su función durante el cultivo prolongado de la célula in vitro y/o durante un período prolongado de tiempo in vivo. Generalmente, dicha célula está alterada hereditariamente (modificada genéticamente) en el sentido de que se introduce una alteración genética que también es heredable por la progenie de la célula alterada.
[0073] Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, fosforilación o conjugación con un componente marcador. Los polipéptidos, tales como los polipéptidos antiangiogénicos, los polipéptidos neuroprotectores y similares, cuando se analizan en el contexto de la administración de un producto génico a un sujeto mamífero, y sus composiciones, se refieren al polipéptido intacto respectivo, o cualquier fragmento o derivado genéticamente modificado del mismo, que conserva la función bioquímica deseada de la proteína intacta. De manera similar, las referencias a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos antiangiogénicos, ácidos nucleicos que codifican polipéptidos antiangiogénicos y otros de dichos ácidos nucleicos para usar en el suministro de un producto génico a un sujeto mamífero (que puede denominarse “transgenes” para suministrar en una célula diana), incluyen polinucleótidos que codifican el polipéptido intacto o cualquier fragmento o derivado modificado genéticamente que posea la función bioquímica deseada.
[0074] Tal como se usa en el presente documento, un plásmido, ácido nucleico, vector, virus, virión, célula huésped, proteína u otra sustancia "aislados" se refiere a una preparación de la sustancia desprovista de al menos algunos de los otros componentes que también pueden estar presentes cuando la sustancia o una sustancia similar tiene lugar de forma natural o se prepara inicialmente a partir de la misma. Así, por ejemplo, se puede preparar una sustancia aislada usando una técnica de purificación para enriquecerla a partir de una mezcla de origen. El enriquecimiento se puede medir sobre una base absoluta, tal como el peso por volumen de solución, o se puede medir en relación con una segunda sustancia potencialmente interferente presente en la mezcla de origen. Los enriquecimientos crecientes de las realizaciones de esta divulgación son cada vez más aislados. Un plásmido, ácido nucleico, vector, virus, célula huésped u ora sustancia aislados están purificados, en algunas realizaciones, por ejemplo, son puros desde aproximadamente el 80 % hasta aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, o más.
[0075] Tal como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar" y similares, se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se usa en este documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad (y/o los síntomas causados por la enfermedad) aparezcan en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o en riesgo de adquirir la enfermedad pero aún no ha sido diagnosticado de tenerla; (b) inhibir la enfermedad (y/o los síntomas causados por la enfermedad), es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad (y/o los síntomas causados por la enfermedad), es decir, provocar la regresión de la enfermedad (y/o los síntomas causados por la enfermedad), es decir, mejorar la enfermedad y/o uno o más síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, las composiciones y procedimientos en cuestión pueden estar dirigidos al tratamiento de enfermedades del músculo. Los procedimientos no limitativos para evaluar las enfermedades musculares y su tratamiento incluyen medir la producción de proteínas terapéuticas (por ejemplo, biopsia del músculo, seguido de inmunohistoquímica o muestreo de suero, seguido de ELISA o ensayos de actividad enzimática), medir los síntomas de insuficiencia cardíaca (por ejemplo, la clasificación funcional de la New York Heart Association o el cuestionario de Minnesota Living With Heart Failure), estado cardíaco funcional (por ejemplo, la prueba de marcha de 6 minutos o el consumo máximo de oxígeno pico), análisis de biomarcadores (por ejemplo, péptido natriurético cerebral prohormonal N-terminal), función/remodelación del ventrículo izquierdo (por ejemplo, fracción de eyección o volumen sistólico final del ventrículo izquierdo), fuerza muscular (por ejemplo, las escalas del Consejo de Investigación Médica Investigación clínica de la distrofia de Duchenne, dinamometría manual o levantamiento de peso máximo), función muscular (por ejemplo, escala de Vignos, las pruebas de función cronometradas, la puntuación de capacidad motora de Hammersmith, tiempo para levantarse del suelo, pruebas de marcha, escala de medición de la función motora, evaluación ambulatoria de North Star, prueba de la clavija de 9 agujeros o prueba infantil de trastornos neuromusculares del Children's Hospital of Philadelphia), síntomas de enfermedades musculares (por ejemplo, la puntuación de síntomas neuromusculares o impresiones globales clínicas), función mitocondrial (por ejemplo, espectroscopia de resonancia magnética 31P), evaluaciones basadas en cuestionarios de la calidad de vida, los resultados informados por el paciente o las actividades diarias.
[0076] Los términos "individuo", "huésped", "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en este documento y se refieren a un mamífero, incluidos, pero sin limitación, seres humanos; primates no humanos, incluidos los simios; animales mamíferos deportivos (por ejemplo, caballos); animales de granja mamíferos (por ejemplo, ovejas, cabras, etc.); mamíferos mascotas (perros, gatos, etc.); y roedores (por ejemplo, ratones, ratas, etc.).
[0077] En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano que previamente ha estado expuesto de forma natural a AAV y, como resultado, alberga anticuerpos anti-AAV (es decir, anticuerpos neutralizantes de AAV). En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano al que se le ha administrado previamente un vector de AAV (y como resultado puede albergar anticuerpos anti-AAV) y necesita la readministración del vector para el tratamiento de una afección diferente o para un tratamiento adicional de la misma afección. En base a los resultados positivos en los ensayos clínicos que involucran el suministro del gen de AAV a, por ejemplo, el hígado, el músculo y la retina, todos los tejidos afectados por los anticuerpos neutralizantes contra este vehículo, existen muchas aplicaciones terapéuticas/dianas de enfermedades.
[0078] El término "cantidad eficaz", tal como se usa en el presente documento, es una cantidad suficiente para lograr resultados clínicos beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más administraciones. A los fines de esta divulgación, una cantidad eficaz de un compuesto (por ejemplo, un virión de rAAV infeccioso) es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, retardar o retrasar la progresión de (y/o los síntomas asociados con) un estado de enfermedad particular (por ejemplo, una enfermedad de la retina). Por consiguiente, una cantidad eficaz de un virión de rAAV infeccioso es una cantidad del virión de rAAV infeccioso que es capaz de suministrar de manera eficaz un ácido nucleico heterólogo a una célula diana (o células diana) del individuo. Las cantidades efectivas pueden determinarse de forma preclínica, por ejemplo, detectando en la célula o tejido el producto génico (ARN, proteína) que está codificado por la secuencia heteróloga de ácido nucleico utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, RT-PCR, transferencia Western, ELISA, fluorescencia u otras lecturas de indicadores, y similares. Las cantidades efectivas pueden determinarse clínicamente, por ejemplo, detectando un cambio en el inicio o la progresión de la enfermedad utilizando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, autofluorescencia de fondo, angiografía con fluoresceína, OCT, microperimetría, óptica adaptativa, etc. y similares, tal como se describe en este documento y se conoce en la técnica.
[0079] La terminología "célula muscular" o “tejido muscular” se refiere en el presente documento a una célula o grupo de células derivadas del músculo de cualquier tipo, incluidos, pero sin limitación, músculo esquelético, músculo cardíaco, músculo liso (por ejemplo, del tracto digestivo, vejiga urinaria y vasos sanguíneos) y el músculo del diafragma. Tales células musculares pueden ser diferenciadas o no diferenciadas, tales como mioblastos, miocitos, miotubos, cardiomiocitos y cardiomioblastos. Dado que el tejido muscular es fácilmente accesible al sistema circulatorio, una proteína producida y secretada por las células musculares y el tejido in vivo entrará lógicamente en el torrente sanguíneo para el beneficio sistémico, proporcionando así niveles terapéuticos sostenidos de secreción de proteína del músculo.
[0080] La terminología "evolución dirigida" se refiere a una metodología de ingeniería de la cápside, in vitro y/o in vivo, que emula la evolución natural a través de rondas iterativas de diversificación genética y procesos de selección, acumulando así mutaciones beneficiosas que mejoran progresivamente la función de una biomolécula. La evolución dirigida a menudo implica un procedimiento in vivo denominado "biopanning" para la selección de variantes de AAV de una biblioteca cuyas variantes poseen un nivel más eficiente de infectividad de un tipo de célula o tejido de interés.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0081] Los virus adenoasociados (AAV) son una familia de parvovirus con un genoma de ADN monocatenario de 4,7 kb contenido dentro de una cápside sin envoltura. El genoma viral de un AAV natural tiene 2 repeticiones terminales invertidas (ITR), que funcionan como el origen viral de la replicación y la señal de empaquetamiento, que flanquean 2 marcos de lectura abiertos (ORF) primarios: rep (que codifican proteínas que funcionan en la replicación viral, regulación transcripcional, integración específica del sitio y ensamblaje del virión) y cap. El ORF de cap codifica 3 proteínas estructurales que se ensamblan para formar una cápside viral de 60 unidades. Se han aislado muchas variantes y serotipos de AAV de origen natural, y ninguno se ha asociado con enfermedades humanas.
[0082] Las versiones recombinantes de AAV se pueden usar como vectores de administración de genes, donde se inserta un marcador o gen terapéutico de interés entre las ITR en lugar de rep y cap. Se ha demostrado que estos vectores transducen tanto las células en división como las que no se dividen in vitro e in vivo y pueden dar como resultado una expresión transgénica estable durante años en tejido posmitótico. Véase, por ejemplo, Knipe DM, Howley PM. Virología de Fields. Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania, EE. u U., 2007; Gao GP, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 11854-9; Atchison RW, Casto BC, Hammon WM Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science. 1965; 149: 754-6; Hoggan MD, Blacklow NR, Rowe WP. Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations: physical, biological, and immunological characteristics. Proc Natl Acad Sci USA 1966; 55: 1467-74; Blacklow NR, Hoggan MD, Rowe WP. Isolation of adenovirus-associated viruses from man. Proc Natl Acad Sci USA 1967; 58: 1410-5; Bantel-Schaal U, zur Hausen H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology 1984; 134: 52-63; Mayor HD, Melnick JL. Small deoxyribonucleic acid-containing viruses (picodnavirus group). Nature 1966; 210: 331­ 2; Mori S, Wang L, Takeuchi T, Kanda T. Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein. Virology 2004; 330: 375-83; Flotte TR. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther 2004; 11: 805-10.
[0083] El AAV recombinante (denominado en el presente documento simplemente como "AAV") ha dado resultados prometedores en un número creciente de ensayos clínicos. Sin embargo, existen impedimentos para la administración de genes que pueden limitar la utilidad de AAV, tales como respuestas inmunitarias contra la cápside, baja transducción de ciertos tejidos, incapacidad para la administración dirigida a tipos de células específicos y una capacidad de carga relativamente baja. En muchas situaciones, no hay suficiente conocimiento mecanístico para potenciar de manera efectiva el diseño racional con la capacidad de mejorar AAV. Como alternativa, ha surgido la evolución dirigida como estrategia para crear nuevas variantes de AAV que satisfagan necesidades biomédicas específicas. Las estrategias de evolución dirigida aprovechan la diversificación genética y los procesos de selección para permitir la acumulación de mutaciones beneficiosas que mejoran progresivamente la función de una biomolécula. En este proceso, los genes cap de AAV de tipo salvaje se diversifican mediante varios enfoques para crear grandes bibliotecas genéticas que se empaquetan para generar bibliotecas de partículas virales, y, a continuación, se aplica presión selectiva para aislar variantes novedosas que pueden superar las barreras de suministro de genes. Es importante destacar que no es necesario conocer la base mecánica que subyace a un problema de suministro de genes para la evolución dirigida de la función, lo que puede acelerar el desarrollo de vectores mejorados.
[0084] Normalmente, las variantes descritas en el presente documento se generaron mediante el uso de una biblioteca y/o bibliotecas de AAV. Dicha biblioteca o bibliotecas de AAV se generan mutando el gen cap, el gen que codifica las proteínas estructurales de la cápside de AAV, mediante una serie de técnicas de evolución dirigida conocidas y fácilmente disponibles para el experto en el campo de la ingeniería de genoma viral. Véase, por ejemplo, Bartel et al. Am. Soc. Gene Cell Ther. 15° Anu. Meet. 20, S140 (2012); Bowles, D. et al. J.Virol. 77, 423-432 (2003); Gray et al. Mol. Ther. 18, 570-578 (2010); Grimm, D. et al. J.Virol. 82, 5887­ 5911; Koerber, J.T. et al. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008); Li W. et al. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008); Koerber, J.T. et al. Methods Mol. Biol. 434, 161-170 (2008); Koerber, J.T. et al. Hum. Gene Ther. 18, 367-378 (2007); y Koerber, J.T. et al. Mol. Ther. 17, 2088-2095 (2009). Dichas técnicas, sin limitación, son las siguientes: i) PCR propensa a errores para introducir mutaciones puntuales aleatorias en el marco de lectura abierto (ORF) de cap de AAV a una tasa modificable predeterminada; ii) recombinación viral in vitro o in vivo o "reordenamiento de ADN" para generar quimeras aleatorias de genes cap de AAV para producir una biblioteca de genes con múltiples serotipos de AAV; iii) Inserciones aleatorias de péptidos en sitios definidos de la cápside mediante ligación de oligonucleótidos degenerados en el ORF de cap; iv) inserciones definidas de secuencias que codifican péptidos en ubicaciones aleatorias del ORF de cap de AAV usando mutagénesis de transposones; v) Reemplazar los bucles de superficie de las cápsides de AAV con bibliotecas de secuencias peptídicas diseñadas bioinformativamente en función del nivel de conservación de cada posición de aminoácido entre los serotipos y variantes naturales de AAV para generar bibliotecas "bucle-intercambio”; vi) sustitución aleatoria de aminoácidos en posiciones de degeneración entre los serotipos de AAV para generar bibliotecas de variantes ancestrales (Santiago-Ortiz et al. 2015); y una combinación de dichas técnicas de las mismas.
[0085] El reordenamiento aleatorio de ADN genera quimeras que combinan sus propiedades parentales de formas únicas y, a menudo, beneficiosas; sin embargo, algunas pueden ser incapaces de empaquetarse lo que, en efecto, reduce la diversidad de la biblioteca. La concentración de diversidad de la biblioteca en la región o regiones específicas de la cápside se logra a través de técnicas de inserción peptídicas, tales como, sin limitación, iii-iv) anteriores. La diversidad de la biblioteca también se concentra en la región o regiones específicas de la cápside en técnicas, tales como v) anterior, y dicha concentración se dirige a múltiples regiones hipervariables, que se encuentran en bucles expuestos a la superficie, de la cápside de AAV. Si bien muchas de las técnicas generan variantes de cápsides con solo una pequeña área de la cápside mutada, estas técnicas pueden combinarse con estrategias de mutagénesis adicionales para modificar la cápside completa.
[0086] Una vez que se generan la biblioteca o bibliotecas de AAV, a continuación, los virus se empaquetan, de modo que cada partícula de AAV se compone de una cápside mutante que rodea un gen cap que codifica esa cápside, y se purifica. A continuación, las variantes de la biblioteca se someten a técnicas de presión selectiva in vitro y/o in vivo conocidas y fácilmente disponibles para los expertos en el campo de AAV. Véase, por ejemplo, Maheshri, N. et al. Nature Biotech. 24, 198-204 (2006); Dalkara, D. et al. Sci. Transl. Med. 5, 189ra76 (2013); Lisowski, L. et al. Nature. 506, 382-286 (2013); Yang, L. et al. PNAS. 106, 3946-3951 (2009); Gao, G. et al. Mol. Ther. 13, 77-87 (2006); y Bell, P. et al. Hum. Gene. Ther. 22, 985-997 (2011). Por ejemplo, sin limitación, las variantes de AAV se pueden seleccionar usando i) columnas de afinidad en las que la elución de diferentes fracciones produce variantes con propiedades de unión alteradas; ii) células primarias, aisladas de muestras de tejido o líneas de células inmortales que imitan el comportamiento de las células en el cuerpo humano, que producen variantes de AAV con mayor eficiencia y/o especificidad de tejido; iii) modelos animales, que imitan un entorno de terapia génica clínica, que producen variantes de AAV que han infectado con éxito el tejido diana; iv) modelos de xenoinjertos humanos que producen variantes de AAV que tienen células humanas injertadas infectadas; y/o una combinación de técnicas de selección de las mismas.
[0087] Una vez que se seleccionan los virus, pueden recuperarse mediante técnicas conocidas, tales como, sin limitación, replicación mediada por adenovirus, amplificación por PCR, secuenciación y clonación de próxima generación, y similares. A continuación, los clones de virus se enriquecen a través de rondas repetidas de las técnicas de selección y el ADN de AAV se aísla para recuperar los genes cap variantes seleccionados de interés. Dichas variantes seleccionadas pueden someterse a más modificaciones o mutaciones y, como tales, sirven como un nuevo punto de partida para etapas de selección adicionales para aumentar iterativamente la aptitud viral de AAV. Sin embargo, en ciertos casos, se han generado cápsides exitosas sin mutación adicional.
[0088] Las variantes de AAV descritas en el presente documento se generaron, al menos en parte, mediante el uso de metodología de evolución dirigida in vivo, tales como las técnicas descritas anteriormente, que implican el uso de cribados de músculo cardiaco y esquelético de primates después de la administración intravenosa. Como tales, las variantes de cápsides de AAV descritas en el presente documento comprenden una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos que confieren una transducción más eficaz de las células musculares de primate que una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente. Tal como se usa en el presente documento, una "proteína de la cápside de AAV parental correspondiente" se refiere a una proteína de la cápside de AAV del mismo serotipo de AAV de tipo salvaje o variante que la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión, pero que no comprende una o más modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión. En realizaciones particulares, un AAV que comprende una variante de la proteína de la cápside de AAV, tal como se reivindica, tiene un tropismo sistémico hacia el músculo cardiaco y/o múltiples grupos de músculos esqueléticos a lo largo del cuerpo después de la administración sistémica o dirigida a tejidos.
[0089] La variante de AAV se define en la reivindicación 1. La variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión comprende un péptido heterólogo de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 20 aminoácidos insertado mediante enlace covalente en un bucle GH, o bucle IV, de la proteína de la cápside de AAV, en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente. Por "bucle de GH", o bucle IV, de la proteína de la cápside de AAV se entiende la porción accesible al disolvente denominada en la técnica bucle de GH o bucle IV de la proteína de la cápside de AAV. Para el bucle de GH/bucle IV de la cápside de AAV, véase, por ejemplo, van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047; y Shen et al. (2007) Mol. Ther. 15:1955. El sitio de inserción se define en la reivindicación 1.
[0090] Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar dentro de los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV1, aminoácidos 570-611 de VP1 de AAV2, dentro de los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV3A, dentro de los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV3B, dentro de los aminoácidos 569-610 de VP1 de AAV4, dentro de los aminoácidos 560-601 de VP1 de AAV5, dentro de los aminoácidos 571 a 612 de VP1 de AAV6, dentro de los aminoácidos 572 a 613 de VP1 de AAV7, dentro de los aminoácidos 573 a 614 de VP1 de AAV8, dentro de los aminoácidos 571 a 612 de VP1 de AAV9, o dentro de los aminoácidos 573 a 614 de VP1 de AAV10, o los aminoácidos correspondientes de cualquier variante de los mismos. Los expertos en la técnica sabrían, basándose en una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la cápside de varios serotipos de AAV, donde estaría un sitio de inserción "correspondiente a los aminoácidos de AAV2" en una proteína de la cápside de cualquier serotipo de AAV determinado. Véase también la figura 6 para una alineación de las SEQ ID NOS: 1-11 de AVV de tipo salvaje que proporciona las localizaciones de aminoácidos entre y a lo largo de los serotipos de tipo salvaje (naturales) AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B y AAV4-10.
[0091] En ciertas realizaciones, el sitio de inserción es un sitio de inserción único entre dos aminoácidos adyacentes ubicados entre los aminoácidos se define en la reivindicación 1 de VP1 de cualquier serotipo de AAV de tipo salvaje o variante de AAV.
[0092] Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 580 y 581, los aminoácidos 581 y 582, los aminoácidos 583 y 584, los aminoácidos 584 y 585, los aminoácidos 585 y 586, los aminoácidos 586 y 587, los aminoácidos 587 y 588, los aminoácidos 588 y 589, o los aminoácidos 589 y 590. El sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 575 y 576, los aminoácidos 576 y 577, los aminoácidos 577 y 578, aminoácidos 578 y 579, o aminoácidos 579 y 580. El sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 590 y 591, los aminoácidos 591 y 592, los aminoácidos 592 y 593, aminoácidos 593 y 594, aminoácidos 594 y 595, aminoácidos 595 y 596, aminoácidos 596 y 597, aminoácidos 597 y 598, los aminoácidos 598 y 599 o los aminoácidos 599 y 600. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre aminoácidos 587 y 588 de AAV2, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV1, entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV3A, entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV3B, entre los aminoácidos 584 y 585 de AAV4, entre los aminoácidos 575 y 576 de AAV5, entre los aminoácidos 590 y 591 de AAV6, entre los aminoácidos 589 y 590 de AAV7, entre aminoácidos 590 y 591 de AAV8, entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV9, o entre los aminoácidos 588 y 589 de AAV10.
[0093] En otra realización, una inserción peptídica descrita en el presente documento comprende de 1 a 4 aminoácidos espaciadores en el extremo amino terminal (terminal N) y/o en el extremo carboxilo (terminal C) de cualquiera de las inserciones peptídicas descritas en el presente documento. Los aminoácidos espaciadores ejemplares incluyen, sin limitación, leucina (L), alanina (A), glicina (G), serina (S), treonina (T) y prolina (P). En ciertas realizaciones, una inserción peptídica comprende 2 aminoácidos espaciadores en el extremo N-terminal y 2 aminoácidos espaciadores en el extremo C-terminal. En otras realizaciones, una inserción peptídica comprende 2 aminoácidos espaciadores en el extremo N-terminal y 1 aminoácido espaciador en el extremo C-terminal.
[0094] Las inserciones peptídicas descritas en el presente documento no se han descrito previamente y/o insertado en una cápside de AAV. Sin desear limitarse a la teoría, la presencia de cualquiera de las inserciones peptídicas descritas puede actuar para reducir la afinidad de la variante de la cápside por el sulfato de heparina, lo que podría alterar las etapas extracelulares e intracelulares dentro de la vía de transducción viral. Además, los motivos de inserción peptídicas descritos en el presente documento pueden conferir una transducción mejorada de las células musculares (por ejemplo, cardiomiocitos) mediante la adición de un dominio de unión al receptor de la superficie celular.
[0095] El péptido de inserción se define en las reivindicaciones.
[0096] El péptido de inserción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) y NKTTNKD (SEQ ID NO: 14).
[0097] En otras realizaciones preferidas, el péptido de inserción tiene de 1 a 3 aminoácidos espaciadores (Y1-Y3) en el extremo amino y/o carboxilo de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) y NKTTNKD (SEQ ID NO: 14).
[0098] En ciertas de dichas realizaciones, el péptido de inserción se selecciona del grupo que consiste en: LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) y LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28).
[0099] En algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión no incluye ninguna otra modificación de la secuencia de aminoácidos distinta de una inserción peptídica, tal como se reivindica de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 20 aminoácidos en el bucle GH o el bucle IV. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión comprende una inserción peptídica que comprende un aminoácido, tal como se define en las reivindicaciones, y la variante de la cápside de AAV no incluye ninguna otra sustitución, inserción o deleción de aminoácidos (es decir, la variante de la proteína de la cápside de AAV comprende dicha inserción y, por lo demás, es idéntica a la proteína de la cápside de AAV correspondiente). Dicho de otro modo, la variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende dicha inserción es por lo demás idéntica a la proteína de la cápside de AAV parental en la que se ha insertado el péptido. Como otro ejemplo, la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión comprende una inserción peptídica tal como se reivindica, en la que la inserción peptídica se encuentra entre los aminoácidos 587 y 588 de la VP1 de la cápside de AAV2, entre los aminoácidos 588 y 589 de VP1 de AAV3A, AAV3B, AAV9 o AAV10, entre los aminoácidos 589 y 590 de VP1 de AAV7, entre los aminoácidos 590 a 591 de VP1 de AAV1, AAV6 o AAV8, entre los aminoácidos 584 y 585 de VP1 de AAV4, o entre los aminoácidos 575 y 576 de AAV5, en la que la variante de la secuencia de la proteína de la cápside de AAV es, de otro modo, idéntica a la secuencia de la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente, por ejemplo cualquiera de las SEQ ID NO: 1-12.
[0100] En otras realizaciones, la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión, además de comprender una inserción peptídica, tal como se reivindica en el bucle GH, comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 sustituciones o deleciones de aminoácidos, por ejemplo, de 1 a aproximadamente 5, de aproximadamente 2 a aproximadamente 4, de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, de aproximadamente 25-50, de aproximadamente 50-100 sustituciones o deleciones de aminoácidos en comparación con la proteína de la cápside de AAV parental. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una variante de la proteína de la cápside en cuestión comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, o 98 % o más, por ejemplo, o 99 % de identidad con la correspondiente cápside de AAV parental, por ejemplo, una proteína de cápside de tipo salvaje, tal como se establece en SEQ ID NO: 1-12.
[0101] En una realización adicional, la una o más sustituciones de aminoácidos están en el residuo o residuos de aminoácidos 35, 109, 195, 213, 222, 229, 312, 319, 330, 333, 347, 363, 427, 447, 449, 453, 490, 527, 551, 581, 585, 588, 593, 606, 649, 651, 694, 698, 708 y/o 735 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2, tal como se enumeró antes de la inserción del péptido, o el correspondiente residuo o residuos de aminoácido de otra proteína de la cápside de AAV. En algunas de tales realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en A35P, S109T, P195L, D213N, G222S, V229I, N312K, A319T, T330A, A333S, E347K, P363L, A427D, V447F, N449D, N449K , G453R, A490T, K527Q, N551S, A581T, Y585S, R588M, A593E, W606C, K649E, R651H, W694C, I698V, V708I y L735Q de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 numerada antes de la inserción del péptido, o el correspondiente residuo o residuos de aminoácidos de otra proteína de la cápside de AAV.
[0102] En una realización preferida, se proporciona una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende a) una inserción peptídica en el bucle GH de la proteína de la cápside, en la que la inserción peptídica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), y NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) y b) una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la sustitución correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2), en la que el aminoácido o aminoácidos sustituidos no se encuentran de forma natural en las posiciones correspondientes: A35P, S109T, P195L, D213N, G222S, V229I, N312K, A319T, T330A, A333S, E347K, P363L, A427D, V447F, N449D, N449K, G453R , A490T, K527Q, N551S, A581T, Y585S, R588M, A593E, W606C, K649E, R651H, W694C, I698V, V708I, L735Q y una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, las una o más sustituciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en: V708I, V708I+A593E, V708I+S109T, V708I+T330A, A35P, V708I+R588M, V708I+W606C, V708I+W694C, I698V, N312K+N449D+NS S 1 S+I698 V+L735Q, N312K+N449D+N551S+I698V+V708I+L735Q, V708I+N449K y V708I+G222S. Preferiblemente, el sitio de inserción del péptido está ubicado entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2, entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2, entre los aminoácidos 588 y 589 de la cápside de AAV3A, AAV3B, AAV9 o AAV10, entre los aminoácidos 589 y 590 de la cápside de AAV7, entre los aminoácidos 590 a 591 de la cápside de AAV1, AAV6 o AAV8, entre los aminoácidos 584 y 585 de la cápside de AAV4, o entre los aminoácidos 575 y 576 de la cápside de AAV5.
[0103] En una realización particularmente preferida, la variante de la cápside de AAV comprende una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) o que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en la secuencia de aminoácidos LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) entre los aminoácidos 587 y 588 de VP1 de AAV2 o los aminoácidos correspondientes de otra cápside de AAV, y además comprende una sustitución de aminoácido V708I en el residuo 708 con respecto a la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO:2) y opcionalmente comprende además una sustitución A593E y/o S109T y/o T330A y/o R588M con respecto a AAV2 o las sustituciones correspondientes en otro serotipo parental de AAV, en la que el aminoácido o aminoácidos sustituidos no se encuentran de forma natural en la posición correspondiente. En otra realización particularmente preferida, la variante de la cápside de AAV comprende una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) o que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en la secuencia de aminoácidos LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) entre los aminoácidos 587 y 588 de VP1 de AAV2 o los aminoácidos correspondientes de otra cápside de AAV, y además comprende una sustitución de aminoácido A35P en el residuo 35 con respecto a la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la sustitución correspondiente en otro serotipo parental de AAV. La variante de la cápside de AAV puede tener al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:2 o la cápside de AAV parental correspondiente. En una realización particularmente preferida, la variante de la cápside de AAV tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia con o es 100 % idéntica a la siguiente secuencia de aminoácidos:
Figure imgf000020_0001
[0104] En otra realización particularmente preferida, la variante de la cápside de AAV comprende una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) o que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) entre los aminoácidos 587 y 588 de la proteína de la cápside de AAV2 o la correspondiente posición en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV y comprende una sustitución de aminoácido N312K en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la sustitución correspondiente en otro AAV serotipo parental y opcionalmente comprende además las sustituciones de aminoácidos (i) N449D, N551S, I698V y L735Q o (ii) N449D, N551S, I698V, L735Q y V708I, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 o las correspondientes sustituciones en otro serotipo parental de AAV. La variante de la cápside de AAV puede tener al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2. En una realización particularmente preferida, la variante de la cápside de AAV tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia o es 100 % idéntica a la siguiente secuencia de aminoácidos:
Figure imgf000021_0001
[0105] En otra realización, se proporciona una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende a) una inserción peptídica ubicada entre los aminoácidos 588 y 589 de VP1 de AAV3A, AAV3B, AAV9 o AAV10, entre los aminoácidos 589 y 590 de AAV7, entre los aminoácidos 590 a 591 de AAV1, AAV6 o AAV8, entre los aminoácidos 584 y 585 de AAV4 o entre los aminoácidos 575 y 576 de AAV5, comprendiendo la inserción peptídica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) y LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28), y b) una sustitución de valina por isoleucina en el aminoácido 709 de AAV3A o AAV3B, una sustitución de alanina por isoleucina en la posición 709 de AAV1 o AAV6, una sustitución de asparagina por isoleucina en el aminoácido 707 de AAV4 o el aminoácido 709 de AAV9 o una sustitución de treonina por isoleucina en el aminoácido 710 de AAV7 o el aminoácido 711 de AAV8 o AAV10 o una sustitución de glutamina por isoleucina en el aminoácido 697 de AAV5 y es opcionalmente de otro modo idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 3-12. En realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende a) una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) o que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 y b) una sustitución del aminoácido valina por isoleucina en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2, en la que la variante de proteína de la cápside comprende de 2 a 5, de 5 a 10, o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos.
[0106] En aún otra realización, la variante de la proteína de la cápside comprende a) una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) o que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos LANKIQRTDA (s Eq ID NO :27) entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 y b) una sustitución del aminoácido valina por isoleucina en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y, de otro modo, es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
[0107] En otra realización más, la variante de la proteína de la cápside comprende a) una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) o que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos LANKIQRTDA (SEq ID NO: :27) entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 y, por lo demás, es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la cápside de AAV variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia o es 100 % idéntica a la siguiente secuencia de aminoácidos:
Figure imgf000022_0001
[0108] En otra realización preferida, la variante de la cápside de AAV comprende una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) o LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 y comprende además una sustitución de aminoácido V708I en el residuo 708 en relación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la sustitución correspondiente en otro serotipo parental de AAV y, opcionalmente, comprende además una sustitución de aminoácido S109T y/o W694C y/o W606C en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 o la sustitución correspondiente en otro serotipo parental de AAV, en la que el o los aminoácidos sustituidos no se encuentran de forma natural en la posición correspondiente. En otra realización particularmente preferida, la variante de la cápside de AAV comprende una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) o que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en la secuencia de aminoácidos LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) entre los aminoácidos 587 y 588 de VP1 de AAV2 o los aminoácidos correspondientes de otra cápside de AAV, y además comprende una sustitución de aminoácido I698V en el residuo 698 con respecto a la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o el residuo correspondiente de otra cápside de AAV. La variante de la cápside de AAV puede tener al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o una identidad de secuencia de aminoácidos superior a la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:2 o la cápside de AAV parental correspondiente. En una realización particularmente preferida, la variante de la cápside de AAV que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia con o es un 100% idéntica con la siguiente secuencia de aminoácidos:
Figure imgf000023_0001
[0109] En otra realización particularmente preferida, la variante de la cápside de AAV comprende una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) o que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) entre los aminoácidos 587 y 588 de la proteína de la cápside de AAV2 o la posición correspondiente en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV y comprende una sustitución de aminoácido N312K en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO:2) o la sustitución correspondiente en otro serotipo parental de AAV y opcionalmente comprende además sustituciones de aminoácidos N449D, N551S, I698V y L735Q y, opcionalmente, V708I, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 o las sustituciones correspondientes en otro serotipo parental de AAV. La variante de la cápside de AAV puede tener al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En una realización particularmente preferida, la variante de la cápside de AAV tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia o es 100 % idéntica a la siguiente secuencia de aminoácidos:
Figure imgf000024_0001
[0110] En otra realización, se proporciona una variante de la proteína de la cápside de AAV que comprende a) una inserción peptídica ubicada entre los aminoácidos 588 y 589 de VP1 de AAV3A, AAV3B, AAV9 o AAV10, entre los aminoácidos 589 y 590 de AAV7, entre los aminoácidos 590 a 591 de AAV1, AAV6 o AAV8, entre los aminoácidos 584 y 585 de AAV4 o entre los aminoácidos 575 y 576 de AAV5, comprendiendo la inserción peptídica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) y LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28), y b) una sustitución de valina por isoleucina en el aminoácido 709 de AAV3A o AAV3B, una sustitución de alanina por isoleucina en la posición 709 de AAV1 o AAV6, una sustitución de asparagina por isoleucina en el aminoácido 707 de AAV4 o en el aminoácido 709 de AAV9 o una sustitución de treonina por isoleucina en el aminoácido 710 de AAV7 o en el aminoácido 711 de AAV8 o AAV10 o una sustitución de glutamina por isoleucina en el aminoácido 697 de AAV5 y es opcionalmente de otro modo idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 3-12. En realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende a) una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) o que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos LANKTTNKDA (SeQ ID NO: 28) entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 y b) una sustitución del aminoácido de valina por isoleucina en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2, en la que la variante de la proteína de la cápside comprende de 2 a 5, de 5 a 10, o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos.
[0111] En aún otra realización, la variante de la proteína de la cápside comprende a) una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) o que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos LANKTTNKDA (s Eq ID NO: 28) entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 y b) una sustitución de aminoácido de valina por isoleucina en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y, de otro modo, es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
[0112] En otra realización, la variante de la cápside comprende una inserción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) o que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en la secuencia de aminoácidos LANKTTNKDA (SeQ ID NO: 28) entre los aminoácidos 587 y 588 de la cápside de AAV2 y, de otro modo, es idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la variante de la cápside de AAV tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia o es 100 % idéntica a la siguiente secuencia de aminoácidos:
Figure imgf000025_0001
[0113] En varios aspectos, se proporciona una variante de la proteína de la cápside de AAV según se reivindica que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente, en el que la variante de la proteína de la cápside, cuando está presente en un virión de AAV, confiere una mayor infectividad de una célula muscular (por ejemplo, una célula muscular esquelética o cardíaca) en comparación con la infectividad de una célula muscular por un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.
[0114] En algunas realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 363 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2). En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de la secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácidos en el aminoácido 363 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones preferidas, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido P363L en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2), cápside de AAV3A (SEQ ID NO: 3) o cápside de AAV3B (SEQ ID NO: 4); o una sustitución de aminoácidos de P364L en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV1 (SEQ ID NO: 1) o la cápside de AAV6 (SEQ ID NO: 7); o una sustitución de aminoácidos de P354L en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV4 (SEQ ID NO: 5) o la cápside de AAV5 (SEQ ID NO: 6); o una sustitución de aminoácidos de P365L en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV7 (SEQ ID NO: 8) o la cápside de AAV9 (SEQ ID NO: 10); o una sustitución de aminoácidos de P366L en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV8 (SEQ ID NO: 9) o la cápside de AAV10 (SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de P363L en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o la sustitución correspondiente en comparación con cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3-12, y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2, o cualquiera de SEQ ID NO : 1 y 3-12. En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución de aminoácidos de P363L en comparación con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y, por lo demás, es idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos de P363L en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o la sustitución correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2) en el que la variante de la proteína de la cápside comprende de 1 a 5, de 5 a 10, o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de AAV2 establecida en SEQ ID NO: 2 o en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside en otro serotipo parental de AAV. En otra realización preferida, la variante de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos de P363L y además comprende la sustitución o sustituciones de aminoácido E347K y/o V708I en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o las sustituciones correspondientes en una cápside de otro AAV serotipo parental (es decir, distinto de AAV2). En otra realización preferida, la variante de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos de P363L en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o la sustitución correspondiente en una cápside de otro serotipo parental de AAV y además comprende una inserción peptídica, preferiblemente localizada entre los aminoácidos 587 y 588 de VP1 de AAV2, los aminoácidos 588 y 589 de AAV3A, AAV3B, AAV9 o AAV10, los aminoácidos 589 y 590 de VP1 de AAV7, los aminoácidos 590 a 591 de VP1 de AAV1, AAV6 o AAV8, los aminoácidos 584 y 585 de VP1 de AAV4 o los aminoácidos 575 y 576 de AAV5, en la que la inserción peptídica preferiblemente comprende una secuencia de aminoácidos, tal como se reivindica, y opcionalmente comprende de 2 a 5, de 5 a 10, o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos o, de otro modo, es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o a la correspondiente secuencia de proteína de la cápside de AAV parental.
[0115] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 593 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2). En algunas realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 593 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 2 o es de otro modo idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido de glicina por glutamato en el aminoácido 594 en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV1, AAV3A, AAV6 o AAV9, o en el aminoácido 583 de AAV5, o en el aminoácido 596 de AAV8 o AAV10, o una sustitución del aminoácido arginina por glutamato en el aminoácido 594 de AAV3B, o una sustitución del aminoácido aspartato por glutamato en el aminoácido 592 de AAV4 o una sustitución del aminoácido glutamina por glutamato en la posición 595 de AAV7. En otras realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos A593E en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y no comprende una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2: I19V, V369A, K26R, N215D, G355S, V46A y S196P. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende sustituciones de aminoácidos A593E y V708I en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o es de otro modo idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende sustituciones de aminoácidos A593E y S109T en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos al menos aproximadamente 99% de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o es de otro modo idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende sustituciones de aminoácidos A593E, V708I y S109T en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99% de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o es de otro modo idéntica a SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la variante de la cápside comprende sustituciones de aminoácidos A593E, V708I y N551S en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o es de otro modo idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la variante de la cápside comprende las sustituciones de aminoácidos A593E, V708I y K649E en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 % de identidad en toda la longitud de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o es de otro modo idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la variante de la cápside comprende sustituciones de aminoácidos A593E, V708I, S109T y K527Q en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 o es de otro modo idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2.
[0116] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en otro serotipo parental de AAV (es decir, distinto de AAV2), en la que el aminoácido sustituido no se encuentra de forma natural en la posición correspondiente. Preferiblemente, el virión de rAAV no comprende una sustitución de prolina por serina en el aminoácido 250 en comparación con AAV2 o un aminoácido correspondiente en otro serotipo parental de AAV. En algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 (SEQ ID NO: 2) y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99%, o más, de identidad de la secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 2 o es de otro modo idéntica a SEQ ID NO:2. En realizaciones preferidas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de valina por isoleucina (V708I) en el aminoácido 708 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 2 o es de otro modo idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que la variante de la proteína de la cápside no comprende una sustitución de aminoácido P250S. En algunas realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de valina por isoleucina en el aminoácido 709 de AAV3A o AAV3B, una sustitución de alanina por isoleucina en la posición 709 de AAV1 o AAV6, una sustitución de asparagina por isoleucina en el aminoácido 707 de AAV4 o el aminoácido 709 de AAV9 o una sustitución de treonina por isoleucina en el aminoácido 710 de AAV7 o el aminoácido 711 de AAV8 o AAV10 o una sustitución de glutamina por isoleucina en el aminoácido 697 de AAV5. En realizaciones relacionadas, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos V708I en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2, en la que la variante de la proteína de la cápside comprende de 2 a 5, de 5 a 10 o de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos y en la que la variante de la proteína de la cápside no comprende una sustitución de aminoácido P250S. En otras realizaciones, la variante de la proteína de la cápside comprende una sustitución de aminoácidos V708I y también comprende una sustitución de aminoácidos A333S y/o S721L en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2. En otras realizaciones relacionadas, la variante de la cápside comprende una sustitución de aminoácido V708I y también comprende una sustitución de aminoácido A333S y/o S721L en comparación con la secuencia de aminoácidos de AAV2 y tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, o más, de identidad de secuencia de aminoácidos con la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 2 o es de otro modo idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
[0117] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % a una secuencia de la cápside de AAV de tipo salvaje seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12 y también comprende i) una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en A35P, D213N, A319T+P195L, P363L, P363L+V708I, G453R, R651H, I698V, V708I, V708I+A593, V708I+S109T, V708I+T330A, V708I+R588M, V708I+W694C, V708I+W606C, V708I+N449K, V708I+G222S, N312K+N449D+N551S+ I698V+L735Q, N312K+N449D+N551S+I698V+V708I+L735Q, y/o (ii) una inserción peptídica tal como se reivindica. En algunas realizaciones, la variante de la cápside de AAV comprende una o más sustituciones de aminoácidos y/o inserciones peptídicas y es, de otro modo, idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-12.
[0118] En algunas realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV es una proteína de la cápside ancestral que comprende una o más inserciones peptídicas y/o sustituciones de aminoácidos tal como se describe en el presente documento. Por proteína de la cápside ancestral se entiende un ancestro evolutivo de una proteína de la cápside que se encuentra en la naturaleza hoy en día, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AA Vrh10, AAV11, AAV12, AAV13, que se genera in silico mediante la sustitución aleatoria de aminoácidos en posiciones de degeneración entre las proteínas de la cápside de AAV que se encuentran en la naturaleza en la actualidad.
[0119] En otras realizaciones, una variante de la proteína de la cápside de AAV es una quimera que comprende los aminoácidos 130-725 de la cápside de AAV5 (SEQ ID NO: 6) o una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 % idéntica a la misma.
[0120] En algunos aspectos, una variante de la proteína de la cápside de AAV es una quimera que comprende (i) los aminoácidos 1-129 de AAV6 (SEQ ID NO: 7) o una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos 98 % idéntica a la misma y (ii) los aminoácidos 130-725 de AAV5 (SEQ ID NO: 6) o una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 % a la misma y que comprende además V229I, A490T y A581T y opcionalmente las sustituciones de aminoácidos V447F o Y585S con respecto a la secuencia de AAV5 (SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, la variante de la cápside de AAV tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia o es 100 % idéntica a la siguiente secuencia de aminoácidos:
Figure imgf000028_0001
[0121] En otros aspectos, una variante de la proteína de la cápside de AAV es una quimera que comprende (i) los aminoácidos 1-61 de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o una secuencia de aminoácidos de al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos 98 % idéntica a la misma, (ii) los aminoácidos 62-129 de AAV6 (SEQ ID NO: 7) o una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 % a la misma, y (iii) los aminoácidos 130-725 de AAV5 (SEQ ID NO: 6) y que además comprende sustituciones de aminoácidos V229I, A490T y A581T en relación con la secuencia de AAV5 (SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, la variante de la cápside de AAV tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad de secuencia o es 100 % idéntica a la siguiente secuencia de aminoácidos:
Figure imgf000028_0002
[0122] Las variantes de AAV descritas en el presente documento se generaron mediante el uso de evolución dirigida in vivo que implica el uso de cribados de músculo esquelético y cardíaco de primates después de la administración intravenosa. En algunas realizaciones, las variantes de proteínas de la cápside descritas en el presente documento, cuando están presentes en un virión de AAV, confieren una mayor transducción de una célula muscular en comparación con la transducción de la célula muscular por un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente o el AAV de tipo salvaje. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las variantes de proteínas de la cápside descritas en el presente documento, cuando están presentes en un virión de AAV, confieren una transducción más eficiente de células musculares de primates que los viriones de AAV que comprenden la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente o la proteína de la cápside de AAV de tipo salvaje, por ejemplo, las células musculares captan más viriones de AAV que comprenden la variante de la proteína de la cápside de AAV en cuestión que viriones de AAV que comprenden la proteína de la cápside de AAV parental o el AAV de tipo salvaje. En algunas de tales realizaciones, el virión de la variante de AAV o la variante de rAAV exhibe al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, un aumento de la transducción de una célula muscular en comparación con la transducción de la célula muscular por un virión de AAV de tipo salvaje o rAAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente. En realizaciones preferidas, el virión de la variante de AAV o la variante de rAAV exhibe al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces o más de 1000 veces, un aumento de la transducción de una célula muscular, en comparación con la transducción de la célula muscular por un virión AAV8 o AAV9 de tipo salvaje. En ciertas de dichas realizaciones, las variantes de proteínas de la cápside descritas en el presente documento, cuando están presentes en un virión de AAV, confieren una transducción más amplia de las células musculares de primate que los viriones de AAV que comprenden la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente o la proteína de la cápside de AAV de tipo salvaje. En otras palabras, el virión de AAV variante transduce tipos de células no transducidas por viriones que comprenden la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente y, por lo tanto, más tipos de células en el músculo que el virión de AAV parental correspondiente. En algunas realizaciones, el virión de variante de AAV transduce preferentemente una célula muscular, por ejemplo, un virión de AAVr en cuestión infecta una célula muscular con una especificidad de 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50 veces o más de 50 veces, que otra célula muscular o una célula no muscular. En algunas realizaciones, la célula muscular transducida es una célula muscular cardíaca (por ejemplo, cardiomiocito, fibroblasto cardíaco o una célula progenitora cardíaca). En algunas realizaciones, la célula muscular es una célula muscular esquelética (por ejemplo, un mioblasto, un miotubo o una célula satélite). Un aumento en la transducción de una célula muscular, por ejemplo, una mayor eficiencia de transducción, transducción más amplia, transducción más preferencial, etc. pueden evaluarse fácilmente in vitro o in vivo mediante cualquier serie de métodos en la técnica para medir la expresión génica. Por ejemplo, el AAV se puede empaquetar con un genoma que comprende un casete de expresión que comprende un gen informador, por ejemplo, una proteína fluorescente, bajo el control de un promotor ubicuo o específico de tejido, y se puede evaluar el grado de transducción detectando la proteína fluorescente mediante, por ejemplo, microscopía de fluorescencia. Como otro ejemplo, el AAV se puede empaquetar con un genoma que comprende una secuencia de ácido nucleico con código de barras, y evaluar el grado de transducción detectando la secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante PCR. Como otro ejemplo, el AAV se puede empaquetar con un genoma que comprende un casete de expresión que comprende un gen terapéutico para el tratamiento de una enfermedad muscular, y se puede evaluar el grado de transducción detectando el tratamiento de la enfermedad muscular en un paciente afectado al que se le administró el AAV.
[0123] Las enfermedades que se pueden tratar usando un vector o virión de rAAV variante y/o el procedimiento descrito en el presente documento incluyen, pero sin limitación, enfermedades monogénicas, enfermedades complejas y lesiones traumáticas. Los ejemplos de enfermedades monogénicas incluyen, pero no sin limitación, distrofias musculares, tales como Duchenne, Becker, congénitas (incluyendo, pero sin limitación, miopatía de Bethlem, distrofia muscular de Ullrich, distrofia muscular de Fukuyama, distrofia muscular deficiente en integrina, distrofia muscular deficiente en merosina y síndrome de Walker-Warburgh), distrofias distales (que incluyen, pero sin limitación, Gowers-Laing, Miyoshi y Nonaka), distrofias de Emery-Dreifuss, facioescapulohumeral, cinturas, miotónicas y musculares; miotonía congénita y paramiotonía congénita; miopatía miotubular; miopatía centronuclear; miopatía miofibrilar, relacionados con la desmina; anemia; síndrome de Andersen-Tawil; miopatía nemalínica; enfermedad de Brody; trastornos de almacenamiento lisosomal, tales como alfa-manosidosis, aspartilglucosaminuria, beta-manosidosis, cistinosis, enfermedad de Farber, fucosidosis, enfermedad de Gaucher, galactosialidosis, gangliosidosis (incluidas, pero sin limitación, variante AB, deficiencia de activador, deficiencia de beta-galactosidasa, enfermedad de Fabry, enfermedad de Sandhoff y enfermedad de Schindler), trastornos del almacenamiento de glucógeno (incluidos, pero sin limitación, enfermedad de Andersen, enfermedad de Cori, enfermedad de Danon, enfermedad de Forbes, defecto de glucosa-6-fosfato, enfermedad de Hers, deficiencia de lactato deshidrogenasa A, enfermedad de Pompe, enfermedad de Tarui , y enfermedad de von Gierke), enfermedad infantil por almacenamiento de ácido siálico libre, deficiencia de lipasa ácida lisosomal, enfermedad de Krabbe, leucodistrofia metacromática, mucopolisacaridosis (incluyendo, pero sin limitación, deficiencia de hialuronidasa, síndrome de Hunter, síndrome de Hurler, síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Maroteaux Lamy, síndrome de Morquio, síndrome de Sanfilippo, síndrome de Scheie y síndrome de Sly), mucolipidosis (que incluye, pero sin limitación, sialidosis, enfermedad de células I, deficiencia de mucolipidina 1 y polidistrofia de Psuedy-Hurler), deficiencia múltiple de sulfasa, enfermedad de Niemann-Pick, lipofuscinosis ceroide neuronal (incluyendo, pero sin limitación, la enfermedad de Batten-Spielmeyer-Vogt, deficiencia congénita de catepsina D, infantil tardía alemana/serbia, enfermedad de Jansky-Bielschowsky, enfermedad de Kufs, infantil tardía, variante infantil tardía, epilepsia del norte, enfermedad de Santavuori-Haltia e infantil tardía turca), picnodisostosis, enfermedad de Salla, deficiencia de saposina B, enfermedad de Tay-Sach y enfermedad de Wolman; trastornos metabólicos, tales como deficiencia de adenosina monofosfato desaminasa, alcaptonuria, deficiencia de carnitina, deficiencia de carnitina palmitil transferasa, trastorno de Hartnup, homocistinuria, enfermedad de orina con olor de jarabe de arce, deficiencia de miofosforilasa, deficiencia de fosfofuctoquinasa, deficiencia de fosfoglicerato quinasa, deficiencia de fosfoglicerato mutasa, deficiencia de fosforilasa y enfermedad de Tangier; ataxia de Friedreich; ataxia talengiectasia; ataxia con deficiencia de vitamina E; parálisis periódica, tal como enfermedad de Gamstorp y parálisis periódica hipopotasémica; enfermedades mitocondriales, tales como el síndrome de Barth, síndrome de Kearns-Sayre, miopatía mitocondrial, encefalopatía mitocondrial, acidosis láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares, epilepsia mioclónica con fibras rojas rasgadas, y síndrome de Pearson; cardiomiopatías hipertróficas familiares; cardiomiopatías dilatadas; enfermedades cardíacas congénitas familiares, tales como enfermedad de la válvula aórtica familiar y no compactación del ventrículo izquierdo con defectos cardíacos congénitos; arritmias familiares, tales como parálisis periódica cardiodisrítmica de Anderson, defectos del tabique interauricular con defectos de conducción Av , síndrome de Brugada, defecto de conductancia cardíaca, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica y bloqueo cardíaco congénito; trastornos vasculares familiares, tales como síndrome de tortuosidad arterial, arteriopatía cerebral autosómica dominante con defectos sobcorticales y leucoencefalopatía, arteriopatía cerebral recesiva dominante con defectos sobcorticales y leucoencefalopatía, aneurisma aórtico de tipo familiar, síndrome de Marfan, síndrome de Ehlers-Danlos, aracnodactilia contractural congénita de Beals, síndrome de Loeys-Dietz y pseudoxantoma elástico; miocardiopatía arritmogénica del ventrículo derecho; displasia ventricular derecha arritmogénica familiar; enfermedad de Naxos; no compactación del ventrículo izquierdo; fibrilación auricular familiar; taquicardia ventricular familiar; síndrome de Wolff-Parkinson-White familiar; síndromes de QT largo; síndrome de QT corto; síndromes del seno enfermo; enfermedades de las lipoproteínas, tales como abetalipoproteinemia y deficiencia de lipoproteína lipasa; deficiencia de alfa-1 antitripsina; deficiencia del factor de coagulación VIII (hemofilia A) o deficiencia del factor de coagulación IX (hemofilia B); talasemia; fibrodisplasia osificante progresiva; laminopatías; enfermedad de Huntington; síndromes miasténicos congénitos; síndrome de Hutchinson-Gilford Progeria; síndrome de Noonan; miopatía congénita de desproporción del tipo de fibras; fibrosis congénita de los músculos extraoculares; miopatía minicore; enfermedad muscular ondulante; síndrome de Schwartz-Jampel; miopatía de agregados tubulares; y miopatía de cuerpo de cebra. Los ejemplos de enfermedades complejas incluyen, pero sin limitación, enfermedad cardiaca/cardiovascular (por ejemplo, insuficiencia cardiaca congestiva, infarto de miocardio, angina, arteriopatía coronaria, cardiopatía isquémica, cardiomiopatía); cáncer; diabetes; e infección. Los ejemplos de lesiones traumáticas incluyen, pero sin limitación, infección viral del músculo, laceración muscular; y contusión muscular. En realizaciones preferidas, una variante del vector o virión de rAAV y/o el procedimiento descrito en el presente documento se usa para tratar la enfermedad de Fabry, la ataxia de Friedreich, la distrofia muscular de Duchenne, la distrofia muscular de Becker, la enfermedad de Pompe, la deficiencia de miofosforilasa, la distrofia muscular facioescapulohumeral, la distrofia muscular de cinturas o distrofia miotónica.
[0124] En otra realización, una variante de la cápside según se reivindica comprende un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico, tal como, sin limitación, un ARN de interferencia, un ARN no codificante largo, un ARN no codificante corto, un ARN antisentido, un aptámero, un polipéptido, un anticuerpo secretado, un anticuerpo monocatenario, un dominio Vhh, un receptor soluble, un aficuerpo, una knottina, una DARPin, una centurina, una chaperona, una nucleasa específica de sitio que proporciona una reducción de la expresión específica del sitio de la función del gen o una nucleasa específica del sitio modificada que proporciona la activación de la transcripción específica del gen.
[0125] Un virión de variante de rAAV descrito en el presente documento comprende un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico. En algunas realizaciones, el producto génico es un ARN antisentido, un microARN (ARNmi), un ARN de horquilla corta (ARNhc) o un ARN de interferencia pequeño (ARNsi) o un precursor o mimético del mismo. En algunas realizaciones, el producto génico es un ARN largo no codificante. En algunas realizaciones, el producto génico es un ARN corto no codificante. En algunas realizaciones, el producto génico es un ARN antisentido. En algunas realizaciones, el producto génico es un aptámero. En algunas realizaciones, el producto génico es un polipéptido. En algunas realizaciones, el producto génico es un anticuerpo secretado. En algunas realizaciones, el producto génico es un anticuerpo monocatenario. En algunas realizaciones, el producto génico es un dominio Vhh. En algunas realizaciones, el producto génico es un receptor soluble. En algunas realizaciones, el producto génico es un aficuerpo. En algunas realizaciones, el producto génico es un knottin. En algunas realizaciones, el producto génico es una DARPin. En algunas realizaciones, el producto génico es una centurina. En algunas realizaciones, el producto génico es una chaperona. En algunas realizaciones, el producto génico es una nucleasa específica del sitio que proporciona la desactivación específica del sitio de la función del gen.
[0126] Los usos del producto génico incluyen, pero sin limitación, aumentar el nivel de un factor en una célula, aumentar el nivel de un factor en una célula vecina o distante a través de la secreción de un factor, disminuir el nivel de un factor en una célula, o disminuir el nivel de un factor en una célula vecina o distante a través de la secreción de un factor. El producto génico puede diseñarse para complementar el nivel de un producto génico defectuoso o ausente, disminuir el nivel de un producto génico defectuoso o ausente, introducir un nuevo producto génico de soporte, complementar el nivel de un producto génico de soporte, disminuir el nivel de un producto génico obstaculizador, o reducir el nivel de un producto génico obstaculizador e introducor o complementar el nivel de un producto génico de soporte.
[0127] Los productos génicos suministrados por las variantes de AAV en cuestión se pueden usar para alterar el nivel de los productos génicos o la actividad de los productos génicos directa o indirectamente relacionados con enfermedades y traumatismos musculares. El músculo esquelético, cardíaco o liso transducido con variantes de AAV en cuestión también se puede usar como biofábrica para producir y secretar proteínas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades in trans en órganos distantes. Los genes cuyos productos génicos están directa o indirectamente relacionados con enfermedades genéticas incluyen, por ejemplo, genes que codifican cualquiera de los siguientes productos génicos: distrofina, incluidas minidistrofinas y microdistrofinas (DMD; por ejemplo, número de acceso de GenBank NP_003997.1; SEQ ID NO: 64); titina (TTN); tapa de titina (TCAP) a-sarcoglicano (SGCA), p-sarcoglicano (SGCB), y-sarcoglicano (SGCG) o 8-sarcoglicano (SGCD); alfa-1-antitripsina (A1-AT); cadena pesada de miosina 6 (MYH6); cadena pesada de miosina 7 (MYH7); cadena pesada de miosina 11 (MYH11); cadena ligera de miosina 2 (ML2); cadena ligera de miosina 3 (ML3); quinasa de cadena ligera de miosina 2 (MYLK2); proteína C de unión a miosina (MYBPC3); desmina (DES); dinamina 2 (DNM2); laminina a2 (LAMA2); lámina A/C (LMNA); lámina B (LMNB); receptor de lamina B (LBR); disferlina (DYSF); emerina (EMD); insulina; factores de coagulación sanguínea, incluidos, pero sin limitación, factor VIII y factor IX; eritropoyetina (EPO); lipoproteína lipasa (LPL); Ca2++-ATPasa de retículo sarcoplasmático (SERCA2A), proteína A1 de unión a calcio S100 (S100A1); miotubularina (MTM); proteína quinasa DM1 (DMPK; por ejemplo, número de acceso de GenBank NG_009784.1; SEQ ID NO: 65); glucógeno fosforilasa L (PYGL); glucógeno fosforilasa, asociada al músculo (PYGM; por ejemplo, número de acceso de GenBank NP_005600.1; SEQ ID NO: 66); glucógeno sintasa 1 (GYS1); glucógeno sintasa 2 (GYS2); a-galactosidasa A (GLA; por ejemplo, número de acceso de GenBank NP_000160.1; SEQ ID NO: 67); a-N-acetilgalactosaminidasa (nAg A); a-glucosidasa ácida (GAA; por ejemplo, número de acceso de GenBank NP_000143.2; SEQ ID NO: 68), esfingomielinasa fosfodiesterasa 1 (Sm PD1); lipasa ácida lisosomal (LIPA); cadena a1 de colágeno tipo I (COL1A1); cadena a2 de colágeno tipo I (COL1A2); cadena a1 de colágeno tipo III (COL3A1); cadena a1 de colágeno tipo V (COL5A1); cadena a2 de colágeno tipo V (COL5A2); cadena a1 de colágeno tipo VI (COL6A1); cadena a2 de colágeno tipo VI (COL6A2); cadena a3 de colágeno tipo VI (COL6A3); procolágeno-lisina 2-oxoglutarato 5-dioxigenasa (PLOD1); lipasa ácida lisosomal (LIPA); frataxina (FXN; por ejemplo., número de acceso de GenBank NP_000135.2; SEQ ID NO: 69); miostatina (MSTN); p-N-acetilhexosaminidasa A (HEXA); p-N-acetilhexosaminidasa B (HEXB); p-glucocerebrosidasa (g Ba ); adenosina monofosfato desaminasa 1 (AMPD1); p-globina (HBB); iduronidasa (IDUA); iduronato 2-sulfato (IDS); troponina 1 (TNNI3); troponina T2 (TNNT2); troponina C (TNNC1); tropomiosina 1 (TPM1); tropomiosina 3 (TPM3); N-acetil-a-glucosaminidasa (NAGLU); N-sulfoglucosamina sulfohidrolasa (SGSH); heparan-a-glucosaminida N-acetiltransferasa (HGSNAT); integrina a 7 (IGTA7); integrina a 9 (IGTA9); glucosamina(N-acetil)-6-sulfatasa (GNS); galactosamina (N-acetil)-6-sulfatasa (GALNS); p-galactosidasa (GLB1); p-glucuronidasa (GUSB); hialuronoglucosaminidasa 1 (HYAL1); ceramidasa ácida (ASAH1); galactosilcermidasa (GALC); catepsina A (CTSA); catepsina D (CTSA); catepsina K (CTSK); activador de gangliósido GM2 (GM2A); arilsulfatasa A (ARSA); arilsulfatasa B (ARSB); enzima generadora de formilglicina (SUMF1); neuraminidasa 1 (NEU1); N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa a (GNPTA); N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa p (GNPTB); N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa y (GNPTG); mucolipina-1 (MCOLN1); transportador intracelular NPC 1 (NPC1); transportador intracelular 2 de NPC (NPC2); lipofuscinosis ceroide 5 (CLN5); lipofuscinosis ceroide 6 (CLN6); lipofuscinosis ceroide 8 (CLN8); palmitoil proteína tioesterasa 1 (PPT1); tripeptidil peptidasa 1 (TPP1); battenina (CLN3); familia de proteínas de choque térmico DNAJ 40, miembro C5 (DNAJC5); dominio de la superfamilia de facilitadores principales que contiene 8 (MFSD8); miembro 1 de manosidasa a clase 2B (MAN2B1); manosidasa p (MANBA); aspartilglucosaminidasa (AGA); a-L-fucosidasa (FUCA1); cistinosina, transportador de cisteína lisosomal (CTNS); sialina; miembro 10 de la familia 2 de portadores de soluto (SLC2A10); miembro 5 de la familia de portadores de soluto 17 (SLC17A5); miembro 19 de la familia 6 de portadores de soluto (SLC6A19); miembro 5 de la familia 22 de portadores de soluto (SLC22A5); miembro 4 de la familia de portadores de soluto 37 (SLC37A4); proteína 2 de membrana asociada a lisosomas (LAMP2); subunidad 4 del canal a controlado por voltaje de sodio (SCN4A); subunidad 4 del canal p controlado por voltaje de sodio (SCN4B); subunidad 5 del canal a controlado por voltaje de sodio (SCN5A); subunidad 4 del canal a controlado por voltaje de sodio (SCN4A); subunidad a1c del canal controlado por voltaje de calcio (CACNA1C); subunidad a is del canal controlado por voltaje de calcio (CACNA1S); fosfoglicerato quinasa 1 (PGK1); fosfoglicerato mutasa 2 (PGAM2); amilo-a-1,6-glucosidasa, 4-a-glucanotransferasa (AGL); miembro 1 de la subfamilia relacionada con ISK del canal voltaje de potasio (KCNE1); miembro 2 de la subfamilia relacionada con ISK del canal controlado por voltaje de potasio (KCNE2); miembro 2 de la subfamilia J de canales controlados por voltaje de potasio (KCNJ2); miembro 5 de la subfamilia J de canales controlados por voltaje de potasio (KCNJ5); miembro 2 de la subfamilia H de canales controlados por voltaje de potasio (KCNH2); miembro 1 de la subfamilia similar a KQT del canal controlado por voltaje de potasio (KCNQ1); canal 4 de potasio controlado por nucleótidos cíclicos activado por hiperpolarización 4 (HCN4); canal 1 controlado por voltaje de cloruro (CLCN1); carnitina palmitoiltransferasa 1A (CPT1A); receptor de rianodina 1 (RYR1); receptor de rianodina 2 (RYR2); integrador puente 1 (BIN1); La R9 E xilosil- y glucuroniltransferasa 1 (LARGE1); proteína docking 7 (DOK7); fukutina (FKTN); proteína relacionada con fukutina (FKRP); selenoproteína N (SELENON); proteína O-manosiltransferasa 1 (POMT1); proteína O-manosiltransferasa 2 (POMT2); proteína manosa N-acetilglucosaminiltransferasa 1 ligada a O (POMGNT1); proteína manosa N-acetilglucosaminiltransferasa 2 ligada a O (POMGNT2); proteína-O-manosa quinasa (POMK); dominio que contiene isoprenoide sintasa (ISPD); plectina (PLEC); subunidad épsilon nicotínica del receptor colinérgico (CHRNE); colina O-acetiltransferasa (CHAT); colina quinasa p (CHKB); subunidad de cola similar a colágeno de acetilcolinesterasa asimétrica (COLQ); proteína asociada al receptor de la sinapsis (RAPSN); cuatro dominios y medio LIM 1 (FHL1); p-1,4-glucuroniltransferasa 1 (B4GAT1); p-1, 3-N-acetilgalactosaminiltransferasa 2 (B3GALNT2); distroglicano 1 (DAG1); proteína transmembrana 5 (TMEM5); proteína transmembrana 43 (TMEM43); proteína de unión a s Ec IS 2 (SECISBP2); glucosamina (UDP-N-acetil)-2-epimerasa/N-acetilmanosamina quinasa (GNE); anoctamina 5 (ANOS); mantenimiento estructural del dominio bisagra flexible de los cromosomas que contiene 1 (SMCHD1); lactato deshidrogenasa A (LDHA); lactato deshidrogenasa B (LHDB); calpaína 3 (CAPN3); caveolina 3 (CAV3); motivo tripartito que contiene 32 (TRIM32); proteína de unión a ácido nucleico con dedos de zinc (CNBP) de tipo CCHC; nebulina (NEB); actina, a1, músculo esquelético (ACTA1); actina, a1, músculo cardíaco (ACTC1); actinina a2 (ACTN2); proteína de unión a poli(A) nuclear 1 (PABPN1); proteína 3 que contiene el dominio LEM (LEMD3); metaloproteinasa de zinc STE24 (ZMPSTE24); proteína microsómica de transferencia de triglicéridos (MTTp ); subunidad a1 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNA1); subunidad a2 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNA2); subunidad a3 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNA3); subunidad a4 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNA4); subunidad a5 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNA5); subunidad a6 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNA6); subunidad a7 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNA7); subunidad a8 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNA8); subunidad a9 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNA9); subunidad a10 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNA10); subunidad p1 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNB1); subunidad p2 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNB2); subunidad p3 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNB3); subunidad p4 del receptor nicotínico colinérgico (CHRNB4); subunidad y del receptor nicotínico colinérgico (CHRNG1); subunidad a del receptor nicotínico colinérgico (CHRND); subunidad £ del receptor nicotínico colinérgico (CHRNE1); miembro 1 de la subfamilia A del cassette de unión a ATP (ABCA1); miembro 6 de la subfamilia C del casete de unión a ATP (ABCC6); miembro 9 de la subfamilia C del casete de unión a ATP (ABCC9); miembro 1 de la subfamilia D del cassette de unión a ATP (ABCD1); ATPasa sarcoplásmica/retículo endoplásmico Ca2+ transportador 1 (ATP2A1); ATM serina/treonina quinasa (ATM); proteína a tocoferol transferasa (TTPA); miembro de la familia de cinesinas 21A (KIF21A); homeobox de tipo emparejado 2a (PHOX2A); heparán sulfato proteoglicano 2 (HSPG2); molécula de interacción estromal 1 (STlM1); notch 1 (NOTCH1); notch 3 (NOTCH3); distrobrevina a (DTNA); proteína quinasa activada por AMP, y2 no catalítica (PRKAG2); proteína 3 rica en cisteína y glicina (CSRP3); viniculina (VCL); miozenina 2 (MyoZ2); miopaladina (MYPN); junctofilina 2 (JPH2); fosfolambano (PLN); calreticulina 3 (CALR3); proteína de unión a actina F nexilina (NEXN); Unión al dominio LIM 3 (LDB3); “eyes absent” 4 (EYA4); huntingtina (HTT); receptor de andrógenos (AR); proteína tirosina fosfato no receptora tipo 11 (PTPN11); placoglobina de unión (JUP); desmoplaquina (DSP); placofilina 2 (PKP2 ); desmogleína 2 (DSG2); desmocolina 2 (DSC2); catenina a3 (CTNNA3); homeobox 5 de NK2 (NKX2-5); proteína de anclaje de A-quinasa 9 (AKAP9); proteína de anclaje de A-quinasa 10 (AKAP10); polipéptido 2 de la actividad inhibidora de la proteína a de unión a nucleótidos de guanina (GNAI2); anquirina 2 (ANK2); sintrofina a-1 (SNTA1); calmodulina 1 (CALM1); calmodulina 2 (CALM2); HTrA serina peptidasa 1 (HTRA1 ); fibrilina 1 (FBN1 ); fibrilina 2 (Fb N2); xilosiltransferasa 1 (x YlT1); xilosiltransferasa 2 (XYLT2); tafazzin (TAZ); homogentisato 1,2-dioxigenasa (HGD); subunidad catalítica de glucosa-6-fosfatasa (G6PC); enzima 1,4-alfa-glucano (GBE1); fosfofructoquinasa, músculo (PFKM); subunidad reguladora alfa 1 de la fosforilasa quinasa (PHKA1); subunidad reguladora alfa 2 de la fosforilasa quinasa (PHKA2); subunidad reguladora beta de la fosforilasa quinasa (PHKB); subunidad catalítica gamma 2 de fosforilasa quinasa (PHKG2); fosfoglicerato mutasa 2 (PGAM2); cistationina-beta-sintasa (CBS); metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR); 5-metiltetrahidrofolato-homocisteína metiltransferasa (MTR); 5-metiltetrahidrofolatohomocisteína metiltransferasa reductasa (MTRR); aciduria metilmalónica y homocistinuria tipo cblD (MMADHC); ADN mitocondrial, incluido, pero sin limitación, NADH codificado mitocondrialmente: subunidad central 1 de ubiquinona oxidorreductasa (MT-ND1); NADH codificado mitocondrialmente: subunidad central 5 de ubiquinona oxidorreductasa (MT-ND5); ARNt ácido glutámico codificado mitocondrialmente (MT-TE); ARNt histadina codificado mitocondrialmente (MT-TH); ARNt leucina 1 codificado mitocondrialmente (MT-TL1);ARNt lisina codificado mitocondrialmente (MT-TK); ARNt serina 1 codificado mitocondrialmente (MTTS1); ARNt valina codificado mitocondrialmente (MT-TV); proteína quinasa quinasa 1 activada por mitógeno (MAP2K1); protooncogén B-Raf, serina/treonina quinasa (BRAF); protooncogén raf-1, serina/treonina quinasa (RAF1); factores de crecimiento, incluidos, pero sin limitación, factor de crecimiento de insulina 1 (IGF-1); factor de crecimiento transformante p3 (TGFp3); receptor del factor de crecimiento transformante p, tipo I (TGFpRI); receptor del factor de crecimiento transformante p, tipo II (TGFpR2), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2 ), factor de crecimiento de fibroblastos 4 (Fg f4), factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), factor de crecimiento endotelial vascular B (VEGF-B); factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C), factor de crecimiento endotelial vascular D (VEGF-D), receptor de factor de crecimiento endotelial vascular 1 (VEGFR1) y receptor de factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGFR2); interleucinas; inmunoadhesinas; citocinas; y anticuerpos.
[0128] En realizaciones preferidas, los productos génicos suministrados por las variantes de AAV en cuestión se seleccionan entre alfa galactosidasa A (GLA), frataxina (FXN), distrofina (DMD), alfa glucosidasa ácida (GAA) y glucógeno fosforilasa muscular (PYGM). En algunas realizaciones preferidas, una variante de AAV en cuestión comprende un segmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica (i) un polipéptido GLA que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 67, (ii) un polipéptido FXN que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 69, (iii) un polipéptido DMD que comprende o consiste en un fragmento funcional (por ejemplo, mini o micro distrofina, preferiblemente que comprende un dominio de unión a actina intacto, al menos 4 de las 24 repeticiones de tipo espectrina y el dominio de unión a distroglicano) de la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 64, (iv) un polipéptido GAA que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 68, (v) un polipéptido PYGM que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 66, una secuencia de aminoácidos de (vi) o (v) al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % a cualquiera de las SEQ ID Nos: 64 y 66-69.
[0129] En otra realización preferida, una variante de AAV en cuestión comprende un transgén que codifica un ARN de interferencia, por ejemplo, un ARN antisentido, un ARNmi, un ARNhc o un ARNsi, que disminuye la expresión de DMPK. En algunos aspectos, el ARN de interferencia disminuye la expresión de DMPK codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se establece como SEQ ID NO: 65 o una secuencia al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos al menos 95% idéntica a SEQ ID NO:65.
[0130] Los genes cuyos productos génicos inducen o promueven la apoptosis se denominan en el presente documento "genes proapoptóticos" y los productos de esos genes (ARNm; proteína) se denominan "productos génicos proapoptóticos". Las dianas proapoptóticas incluyen, por ejemplo, productos génicos Bax; productos génicos Bid; productos génicos Bak; productos génicos Bad; Bci-2 ; Bcl-Xl. Los productos génicos antiapoptóticos incluyen un inhibidor de la apoptosis ligado al cromosoma X.
[0131] Los genes cuyos productos génicos inducen o promueven la angiogénesis se denominan en el presente documento "genes proangiogénicos" y los productos de esos genes (ARNm; proteína) se denominan "productos génicos proangiogénicos". Las dianas proangiogénicas incluyen, por ejemplo, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFa, VEGFb, VEGFc, VEGFd); receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1); receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2); tirosina quinasa 1 relacionada con Fms (Flt1); factor de crecimiento de placenta (PGF); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); angiopoyetinas; sonic hedgehog. Los genes cuyos productos génicos inhiben la angiogénesis se denominan en el presente documento "genes antiangiogénicos" y los productos de esos genes (ARNm; proteína) se denominan "productos génicos antiangiogénicos". Los productos génicos antiangiogénicos incluyen endostatina, tumstatina, angiostatina, factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y proteínas de fusión o anticuerpos que son específicos para dianas proangiogénicas y/o sus receptores, por ejemplo, el anticuerpo específico de VEGF Avastatin™, etc.
[0132] Los genes cuyos productos génicos funcionan como inmunomoduladores, por ejemplo, factores del complemento, receptores tipo toll, se denominan "genes inmunomoduladores". Ejemplos de genes inmunomoduladores incluyen citocinas, quimiocinas y proteínas de fusión o anticuerpos que son específicos para ellas y/o sus receptores, por ejemplo, la proteína de fusión anti-IL-6 Rilonacept™, el anticuerpo específico del factor H del complemento lampamizumab , etc. Los genes cuyos productos génicos funcionan como factores protectores del músculo, por ejemplo, factor de crecimiento de insulina 1 (IGF-1); factor de crecimiento transformante p (TGFp); factor de crecimiento de fibroblastos (FGF).
[0133] En algunos casos, un producto génico de interés es una endonucleasa específica del sitio que proporciona la reducción específica del sitio de la función de un gen, por ejemplo, cuando la endonucleasa desactiva un alelo asociado con una enfermedad muscular. Por ejemplo, cuando un alelo dominante codifica una copia defectuosa de un gen que, cuando es de tipo salvaje, es una proteína estructural del músculo y/o proporciona una función muscular normal, una endonucleasa específica del sitio puede dirigirse al alelo defectuoso y desactivar el alelo defectuoso.
[0134] Además de desactivar un alelo defectuoso, también se puede usar una nucleasa específica de sitio para estimular la recombinación homóloga con un ADN donante que codifica una copia funcional de la proteína codificada por el alelo defectuoso. Por lo tanto, por ejemplo, un virión de rAAV en cuestión se puede usar para suministrar una endonucleasa específica del sitio que desactiva un alelo defectuoso y se puede usar para suministrar una copia funcional del alelo defectuoso, lo que resulta en la reparación del alelo defectuoso, proporcionando así la producción de una proteína muscular funcional (por ejemplo, lámina A/C funcional, fibrilina funcional, colágeno tipo VI funcional, etc.). En algunas realizaciones, un virión de rAAV descrito en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una endonucleasa específica del sitio; y una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una copia funcional de un alelo defectuoso, donde la copia funcional codifica una proteína muscular funcional. Las proteínas musculares funcionales incluyen, por ejemplo, lamina A/C, fibrilina 1, COL6A1, COL6A2, COL6A3 y similares.
[0135] Las endonucleasas específicas de sitio que son adecuadas para su uso incluyen, por ejemplo, meganucleasas; nucleasas con dedos de zinc (ZFN); nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN); y Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas/asociadas a CRISPR (Cas), donde dichas endonucleasas específicas de sitio no se producen de forma natural y se modifican para dirigirse a un gen específico. Dichas nucleasas específicas de sitio pueden diseñarse para cortar ubicaciones específicas dentro de un genoma, y la unión de extremos no homólogos puede reparar la ruptura mientras se insertan o eliminan varios nucleótidos. Dichas endonucleasas específicas de sitio (también denominadas "INDEL") arrojan entonces la proteína fuera del marco y desactivan de manera efectiva el gen. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2011/0301073.
[0136] En algunas realizaciones de la variante del vector de rAAV descrita en el presente documento, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés se une operativamente a un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos adecuados incluyen, por ejemplo, promotor de citomegalovirus (CMV) (Stinski et al. (1985) Journal of Virology 55(2): 431-441), potenciador temprano de CMV/promotor de pactina de pollo (CBA)/intrón de p-globina de conejo ( CAG) (Miyazaki et al. (1989) Gene 79(2): 269-277, CBSB (Jacobson et al. (2006) Molecular Therapy 13(6): 1074-1084), promotor del factor de elongación humano 1a (EF1a) (Kim et al. (1990) Gene 91(2): 217-223), promotor de la fosfoglicerato quinasa humana (PGK) (Singer-Sam et al. (1984) Gene 32(3): 409-417, promotor de cadena pesada mitocondrial (Loderio et al. (2012) PNAS 109(17): 6513-6518), promotor de ubiquitina (Wulff et al. (1990) FEBS Letters 261: 101-105). En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está unido operativamente a un promotor inducible. En algunos casos, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está unido operativamente a un elemento regulador específico de tejido o de tipo de célula. Por ejemplo, en algunos casos, una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés está unida operativamente a un elemento regulador específico del músculo (por ejemplo, un promotor específico cardíaco o un promotor específico del músculo esquelético), por ejemplo, un elemento regulador que confiere la expresión selectiva del gen unido operativamente en una célula muscular. Los elementos reguladores específicos del músculo adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor de la a-actina del músculo esquelético (Muscat y Kedes (1987) Mol. Cell. Biol. 7:4089-4099); promotor de a-actina de músculo cardíaco (Minty y Kedes (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2125-2136); promotor de a-actina de músculo liso (Nakano et al. (1991) Gene 99:285-289); promotor de a-actina de músculo liso vascular (Keogh et al. (1999) Gene Therapy 6(4):616-628); promotor de la creatina quinasa muscular (Bartlett et al. (1996) Cell Transplantation 5(3):411-419); promotores de la cadena ligera de miosina 1 y de la cadena ligera de miosina 3 (Seidel y Arnold (1989) J. BioL Chem. 264(27):16109-16117); promotor de la cadena ligera de miosina 2v (MLC2v) (Su et al. (2004) PNAS 101(46): 16280-16285); promotor del factor miogénico 5 (Myf5) (Fujimaki et al. (2004) Journal of Biological Chemistry 289(11): 7399-7412); promotor de la diferenciación miogénica 1 (Myod1) (Zingg et al. (1994) Nucleic Acids Research 22(12): 2234-2241); promotor de miogenina (Myog) (Salminen et al. (1991) Journal of Cell Biology 115(4): 905-917); promotor del gen de caja emparejada 7 (Pax7) (Murmann et al. (2000) Biol Chem. 381(4):331-335); promotor del homeodominio 3 de tipo emparejado (Pitx3) (Coulon et al. (2007) Journal of Biological Chemistry 282:33192-33200); promotor de MHCK7 (Salva et al. (2007) MoL Ther.
15(2):320-329); promotor de MCK/SV40 (Takeshita et al. (2007) International Journal of Molecular Medicine 19:309-315); promotor C5-12 (Li et al. (1999) Nature Biotechnology 17:241-245); potenciadores/promotores de MCK en tándem doble y triple (Wang et al. (2008) Gene Therapy 15: 1489-1499); promotor de la cadena pesada de miosina 7 (MYH7); (iwaki et al. (2104) PLoS ONE 9(4):e88610); promotor de la cadena pesada de miosina 6 (MYH6) (Pacak et al. (2008) Genet. Vaccines Ther. 6:13); promotor de troponina cardíaca T (TNNT2) (Farza y col. (1998) J. Mol. Cell Cardiol. 30(6): 1247-53); promotor de a-tropomiosina (Helfman et al. (1986) Molecular and Cellular Biology 6(11): 3582-3595); promotor de la troponina C cardíaca (TNNC1) (Scheier et al. (1990) Journal of Biological Chemistry 34(5): 21247-21253); promotor de la proteína C de unión a la miosina cardíaca (Lin et al. (2013) PLoS ONE 8(7): e69671); promotor de troponina cardíaca I (TNNL3) (Bhavsar et al. (1996) Genomics 35(1):11-23); el promotor de desmina (Li et al. (1991) Journal of Biological Chemistry 10(5):6562-6570); promotor del intercambiador de sodio-calcio (NCX1 ) (Scheller et al. (1997) Journal of Biological Chemistry 273(13): 7643-7649); promotor del factor natriurético atrial (Durocher et al. (1996) Molecular and Cellular Biology 16(9):4648-4655); y promotor SM22a (Kemp et al. (1995) Biochemical Journal 310(3):1037-1043.
[0137] Para los fines de la invención, la descripción del presente documento proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de la proteína de la cápside de AAV tal como se reivindica. Un ácido nucleico aislado puede ser un vector AAV, por ejemplo, un vector AAV recombinante.
[0138] La divulgación en el presente documento también proporciona un virión de la variante de rAAV, tal como se reivindica para su uso, en un método de tratamiento de una enfermedad muscular, comprendiendo el método administrar a un individuo que lo necesite una cantidad eficaz de un virión de la variante de rAAV que comprende un transgén de interés, tal como se describe anteriormente y se divulga en el presente documento. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica podría determinar fácilmente una cantidad efectiva del virión de rAAV en cuestión y que la enfermedad había sido tratada analizando un cambio en uno o más parámetros anatómicos o funcionales, por ejemplo, biopsia muscular, seguida de inmunohistoquímica, muestreo de suero seguido de ELISA o ensayos de actividad enzimática, prueba de marcha, consumo máximo de oxígeno pico, análisis de biomarcadores, fracción de eyección del ventrículo izquierdo, volumen sistólico final del ventrículo izquierdo, dinamometría manual, levantamiento de peso máximo, pruebas de función cronometradas, puntuación de la capacidad motora de Hammersmith, tiempo para levantarse del suelo, prueba de la clavija de 9 agujeros.
[0139] Los métodos no limitantes para evaluar la función muscular y sus cambios incluyen evaluar la prueba de marcha, el consumo máximo de oxígeno pico, el análisis de biomarcadores, la fracción de eyección del ventrículo izquierdo, el volumen sistólico final del ventrículo izquierdo, la escala de Vignos, las pruebas de función cronometradas, la puntuación de la capacidad motora de Hammersmith, tiempo para levantarse del suelo, escala de medición de la función motora, evaluación ambulatoria de North Star, prueba de la clavija de 9 agujeros o prueba infantil de trastornos neuromusculares del Children's Hospital of Philadelphia.
[0140] En algunas realizaciones, una cantidad eficaz del virión de rAAV en cuestión da como resultado una disminución en la tasa de pérdida de la función muscular, la integridad muscular anatómica o la masa muscular, por ejemplo, una disminución de 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces o más en la tasa de pérdida y, por lo tanto, progresión de la enfermedad, por ejemplo, una disminución de 10 veces o más en la tasa de pérdida y, por lo tanto, progresión de la enfermedad. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz del virión de rAAV en cuestión da como resultado una ganancia en la función muscular, una ganancia en la fuerza muscular, una ganancia en la masa muscular y/o una mejora en la integridad muscular anatómica o biomarcadores, por ejemplo, una mejora de 2 veces, 3 veces 4 veces, o 5 veces o más en la función muscular, fuerza muscular, masa muscular y/o mejora en la integridad muscular anatómica o biomarcadores, por ejemplo, una mejora de 10 veces o más en la función muscular, fuerza muscular, masa muscular y/o mejora de la integridad muscular anatómica o biomarcadores. Tal como se entenderá fácilmente por el experto en la materia, la dosis requerida para lograr el efecto de tratamiento deseado estará típicamente en el intervalo de 1 * 108a aproximadamente 1 * 1016viriones recombinantes, típicamente denominados por el experto en la materia como de 1 * 108 a aproximadamente 1 * 1016"genomas vectoriales" y preferiblemente estarán en el intervalo de aproximadamente 1 * 1011 a aproximadamente 1 * 1015 viriones recombinantes.
[0141] Un virión de rAAV en cuestión puede suministrarse al músculo esquelético mediante administración intravascular (intravenosa o intraarterial), administración intraperitoneal, perfusión de extremidades y/o inyección intramuscular directa o mediante cualquier otro modo o vía de administración conveniente que resulte en el suministro del virión de rAAV al músculo esquelético. El virión de rAAV se puede suministrar al músculo cardíaco mediante administración intravascular (intravenosa o intraarterial), inyección cardíaca directa (en la aurícula izquierda, aurícula derecha, ventrículo derecho y/o tabique), infusión anterógrada o retrógrada en la arteria coronaria (a través de las arterias coronarias descendente anterior izquierda o circunfleja izquierda), recirculación, inyección intrapericárdica, inyección transendocárdica, o por cualquier otro modo o vía de administración conveniente que resulte en el suministro del virión de rAAV al músculo cardíaco. En una realización preferida, un virión de rAAV en cuestión se suministra al músculo esquelético y/o cardíaco mediante administración intravenosa sistémica. Cuando se administra a través de una inyección intravenosa, el virión de rAAV en cuestión puede moverse a través del sistema circulatorio y transducir células musculares de manera más eficiente, en comparación con la capacidad de un virión de AAV de tipo salvaje o un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de a Av parental correspondiente.
[0142] Se aísla, por ejemplo, se purifica una variante de la proteína de la cápside descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, una variante de la proteína de la cápside descrita en el presente documento se incluye en un vector AAV o un virión de AAV recombinante (rAAV). En otras realizaciones, dichos vectores variantes de AAV y/o viriones variantes de AAV se usan en un método in vivo o ex vivo para tratar una enfermedad muscular en músculo cardíaco o esquelético de primate.
[0143] La divulgación en el presente documento proporciona además células huésped, tales como, sin limitación, células huésped aisladas (modificadas genéticamente) que comprenden un ácido nucleico en cuestión. Una célula huésped según la invención, descrita en el presente documento, puede ser una célula aislada, tal como una célula procedente de un cultivo celular in vitro. Dicha célula huésped es útil para producir una variante de virión de rAAV en cuestión, tal como se describe en este documento. En una realización, dicha célula huésped se modifica genéticamente de forma estable con un ácido nucleico. En otras realizaciones, una célula huésped se modifica genéticamente de forma transitoria con un ácido nucleico. Dicho ácido nucleico se introduce de forma estable o transitoria en una célula huésped, utilizando técnicas establecidas, que incluyen, pero sin limitación, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por liposomas y similares. Para una transformación estable, un ácido nucleico generalmente incluirá además un marcador seleccionable, por ejemplo, cualquiera de varios marcadores seleccionables bien conocidos, tales como la resistencia a la neomicina y similares. Dicha célula huésped se genera introduciendo un ácido nucleico en cualquiera de una variedad de células, por ejemplo, células de mamíferos, incluidas, por ejemplo, células murinas y células de primate (por ejemplo, células humanas). Los ejemplos de células de mamífero incluyen, pero sin limitación, células primarias y líneas celulares, donde los ejemplos de líneas celulares incluyen, pero sin limitación, células 293, células COS, células HeLa, células Vero, fibroblastos de ratón 3T3, fibroblastos C3H10T1/2, células CHO, y similares. Los ejemplos de células huésped incluyen, pero sin limitación, células HeLa (por ejemplo, American Type Culture Collection (ATCC) No. Cc L-2), células CHO (por ejemplo, ATCC Nos. CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por ejemplo, ATCC No. CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por ejemplo, ATCC No. CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por ejemplo, ATCC No. CCL10), células PC12 (ATCC No. CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC No. c Rl 1651), células RAT1, células L de ratón (ATCC No. CCLI.3), células de riñón embrionario humano (HEK) (ATCC No. CRL1573), células HLHepG2, y similares. También puede fabricarse una célula huésped usando un baculovirus para infectar células de insecto, tales como células Sf9, que producen AAV (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. N° 7,271,002; solicitud de patente de EE.UU. N° de serie 12/297,958). En algunas realizaciones, una célula huésped modificada genéticamente incluye, además de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de la proteína de la cápside de AAV, como se describió anteriormente, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas rep de AAV. En otras realizaciones, una célula huésped comprende además un vector variante de rAAV. Se puede generar una variante de virión de rAAV utilizando dichas células huésped. Los procedimientos para generar un virión rAAV se describen, por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. N° 2005/0053922 y la publicación de patente de EE. UU. N° 2009/0202490.
[0144] La divulgación en el presente documento proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende: a) la variante de virión de rAAV, tal como se describe anteriormente y se divulga en el presente documento; y b) un portador, diluyente, excipiente o tampón farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el portador, diluyente, excipiente o tampón farmacéuticamente aceptable es adecuado para su uso en un paciente humano o no humano. Dichos excipientes, portadores, diluyentes y tampones incluyen cualquier agente farmacéutico que pueda administrarse sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Además, en dichos vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias reguladoras del pH y similares. Se conoce en la técnica una amplia variedad de excipientes farmacéuticamente aceptables y no es necesario discutirlos en detalle en este documento. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se han descrito ampliamente en una variedad de publicaciones, que incluyen, por ejemplo, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) HC Ansel et al., eds., 7a ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) AH Kibbe et al., eds., 3a ed. Amer. Pharmaceutical Assoc. En algunos aspectos de la presente invención, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 * 1015 virus recombinantes o de 1 * 108a aproximadamente 1 * 1015genomas vectoriales, en la que cada uno de dichos virus recombinantes comprende un genoma que codifica uno o más productos génicos.
EJEMPLOS
[0145] Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y una descripción completas de cómo fabricar y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a ella.
[0146] Los procedimientos generales en bioquímica molecular y celular se pueden encontrar en libros de texto estándar como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short protocols in Molecular Biology, 4a ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998), las divulgaciones de los mismos se incorporan en el presente documento por referencia. Los reactivos, vectores de clonación y kits para la manipulación genética a los que se hace referencia en esta descripción están disponibles de proveedores comerciales, tales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech.
Ejemplo 1
[0147] Inyección intravenosa y recogida de tejido. Se dosificó mediante inyección intravenosa a través de la vena safena a un único macaco cynomolgus macho (Macaca fascicularis) de 3 a 10 años de edad y que pesaba al menos 3 kg para cada ronda de selección. El animal fue anestesiado y se administraron 1-5 ml de la biblioteca (en la primera ronda, la biblioteca consiste en variantes generadas usando todas las técnicas de mutagénesis descritas en la Figura 1A; en cada ronda subsiguiente, las variantes aisladas de la ronda anterior), en algunos casos preincubados con IVIG humana durante 30 minutos a 37 °C.
[0148] Se sacrificó el animal por personal veterinario capacitado usando una inyección intravenosa de pentobarbital sódico de 100 mg/kg el día 14 ± 3 o 21 ± 3, dependiendo de la selección. Se extrajo el tejido del músculo cardíaco y/o esquelético del cuádriceps y se aisló el ADN del tejido. En algunos casos, el tejido cardíaco se dividió en varias regiones: la aurícula, el tabique ventricular, el músculo papilar izquierdo, el músculo papilar derecho, el ventrículo izquierdo y el ventrículo derecho.
[0149] Evolución Dirigida. El proceso de evolución dirigida se muestra en las Figuras 1A-1E. Brevemente, se crea una biblioteca de cápsides virales que comprende más de 20 combinaciones patentadas de técnicas de mutación de ADN y genes cap (Figura 1A). A continuación, los virus se empaquetan (Figura 1B), de modo que cada partícula esté compuesta por una cápside mutante que rodea el gen cap que codifica esa cápside, y se purifica. La biblioteca de las cápsides se coloca bajo presión selectiva in vivo. El tejido o material celular de interés se recoge para aislar las variantes de AAV que han infectado con éxito esa diana, y los virus exitosos se recuperan. Los clones exitosos se enriquecen a través de la selección repetida (Etapa I - Figura 1D). Los genes cap seleccionados se someten a continuación a una rediversificación patentada y se enriquecen a través de más etapas de selección para aumentar iterativamente la aptitud viral (Etapa 2 - Figura 1D). Las variantes identificadas durante las etapas 1 y 2 de selección de vectores demuestran la capacidad de transducir células musculares de primates (figura 1E).
[0150] Recuperación exitosa de genomas de la cápside de AAV. Las cápsides recuperadas de cada ronda de selección se usaron para empaquetar la biblioteca inyectada para iniciar la ronda de selección subsiguiente. La recuperación de los genes de la cápside del tejido representa la internalización exitosa de los vectores de la biblioteca en el tejido de interés. La recuperación de genomas virales de tejido muscular cardiaco y esquelético de una ronda representativa de selección se muestra en la Figura 2. Las bandas dentro de los recuadros representan la recuperación exitosa de los genomas virales.
[0151] Análisis de secuenciación. Durante las rondas 3-4 de selecciones que incluyen la presión selectiva de administración intravenosa a tejido cardiaco o a tejido de músculo esquelético y las rondas 1-2 de una selección que incluye la presión selectiva de administración intravenosa en presencia de anticuerpos neutralizantes al tejido cardiaco, se realizó la secuenciación sobre clones individuales dentro de la biblioteca para determinar la frecuencia de variantes dentro de la población. Las variantes se evaluaron por la presencia de motivos dentro de los datos de secuenciación. Las variantes se agruparon en motivos en función de la presencia de una variación unificadora (por ejemplo, una mutación puntual específica o una secuencia de inserción peptídica específica en una ubicación consistente dentro de la cápside) que se produjo en múltiples secuencias. Los motivos que representan al menos el 5 % de la población secuenciada en dos o más rondas de selección o al menos el 10 % de la población secuenciada en una o más rondas de selección se representan en la Figura 3A (Análisis de secuenciación de la Ronda 4 para la presión selectiva de administración intravenosa a tejido cardiaco), 3B (Análisis de secuenciación de la Ronda 2 para la presión selectiva de administración intravenosa en presencia de anticuerpos neutralizantes a tejido cardiaco), y figura 3C (proporciona el análisis de secuenciación de la ronda 3 para la presión selectiva de administración intravenosa a tejido muscular esquelético).
[0152] Varios clones representativos que se identificaron como que conferían una mayor infectividad de células musculares cardiacas y/o esqueléticas se enumeran en la Tabla 1 a continuación (cada clon contiene la sustitución o sustituciones identificadas y/o la inserción peptídica y, por lo demás, es idéntica a la SEQ ID NO: 2; la ronda de selección, el número y la frecuencia (entre paréntesis) se enumeran para cada clon): Tabla 1. Modificaciones de la secuencia de aminoácidos en la proteína de la cápside de VP1 de AAV que confieren una mayor infectividad de células musculares cardiacas y/o esqueléticas. Las sustituciones enumeradas en la columna 2 se basan en la secuencia de aminoácidos para AAV2 de tipo salvaje, es decir, en ausencia de péptido insertado. “Cardiaco NAb” en la columna 5 indica que las modificaciones en la secuencia de aminoácidos deberían conferir una resistencia aumentada a la neutralización por anticuerpos ______________anti-AAV además de una mayor infectividad de células musculares cardiacas.____________
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[0153] También se identificaron las siguientes quimeras como cápsides que confieren una mayor infectividad de las células del músculo cardíaco y una mayor resistencia a la neutralización por anticuerpos anti-AAV: una quimera con (i) los aminoácidos 1-129 de AAV6 y (ii) los aminoácidos 130-725 de AAV5 y que tiene las siguientes sustituciones de aminoácidos con respecto a AAV5: V229I+A490T+A581T (la secuencia de SEQ ID NO:62).
[0154] Una quimera con (i) los aminoácidos 1-61 de AAV2, (ii) los aminoácidos 62-129 de AAV6 y (iii) los aminoácidos 130-725 de AAV5 y que tiene las siguientes sustituciones de aminoácidos con respecto a AAV5: V2291+A490T+A581T (la secuencia de SEQ ID NO: 63).
[0155] Una quimera con (i) los aminoácidos 1-129 de AAV6 y (ii) los aminoácidos 130-725 de AAV5 y que tiene las siguientes sustituciones de aminoácidos con respecto a AAV5: V229I+A490T+A581T+Y585S [0156] Una quimera con (i) los aminoácidos 1-129 de AAV6 y (ii) los aminoácidos 130-725 de AAV5 y que tiene las siguientes sustituciones de aminoácidos con respecto a AAV5: V229I+A447F+A490T+A58 1T [0157] Los viriones variantes de AAV descritos en el presente documento pueden incorporar parámetros, características, modificaciones, ventajas y variaciones de diseño racional razonables que son fácilmente evidentes para los expertos en la técnica en el campo de la ingeniería de vectores virales de AAV.
Ejemplo 2
[0158] El tropismo celular de viriones de AAV recombinantes que comprenden las nuevas variantes de AAV LANKIQRTDA+V708I (SEQ ID NO:43), LANKTTNKDA+V708I (SEQ ID NO:48) y LATNKIGVTA+V708I (SEQ ID NO: 46) para cardiomiocitos se evaluó in vitro utilizando cardiomiocitos generados a partir de células madre embrionarias humanas (ESC).
[0159] Se fabricaron utilizando procedimientos estándar viriones de AAV recombinantes que comprenden una cápside de AAV1, una cápside de AAV2, una cápside de AAV9, la nueva variante de la cápside LANKIQRTDA+V708I, la nueva variante de la cápside LANKTTNKDA+V708I o la nueva variante de la cápside LATNKIGVTA+V708I y un genoma que comprende un transgén de una proteína verde fluorescente (EGFP) unidos operativamente a un promotor CAG (AA V1.CAG.Eg FP, AAV2.CAG.EGFP, AAV9.CAG.EGFP, LANKIQRTDA+V708I.CAG.EGFP, LANKTTNKDA+V708I.CAG.EGFP y LATNKIGVTA+V708I. CAG.GFP, respectivamente). Se generaron cardiomiocitos a partir de una línea de células madre embrionarias humanas, ESI-017, mediante la modulación de la señalización de Wnt utilizando moléculas pequeñas. Después de 14 días de inducción del mesodermo cardíaco, los cultivos se enriquecieron adicionalmente en cardiomiocitos por privación de glucosa. Después de aproximadamente 24 días de diferenciación, la mayoría de las células expresaron el marcador de miocitos cardíacos, troponina T cardíaca (cTnT), y un marcador específico ventricular, MLC-2V. En los cardiomiocitos generados se evaluó la expresión de la proteína de unión gap Conexina 43, la fluctuación del potencial de membrana, la manipulación del calcio y la función contráctil para garantizar que los cardiomiocitos generados alcanzaran un estado maduro antes de la caracterización del vector.
[0160] En relación con AAV1, AAV2 y AAV9, las variantes LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I y LATNKIGVTA+V708I proporcionaron una eficiencia de transducción y expresión de transgenes significativamente mayor en cultivos de cardiomiocitos humanos seis días después de la infección, según lo determinado por inmunofluorescencia (Figura 6A), citometría de flujo (Figura 6b ) y análisis de transferencia Western (Figuras 6C-D). Además, en relación con AAV1, AAV2 y AAV9, LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I y LATNKIGVTA+V708I proporcionaron un inicio más rápido de la expresión génica en cultivos de cardiomiocitos humanos, según lo determinado por inmunofluorescencia (Figura 6E). En relación con AAV8 y AAV9, que exhiben tropismo de células musculares esqueléticas y cardíacas, el número de unidades infecciosas por genoma viral administrado fue varios órdenes de magnitud mayor para LANKIQRTDA+V708I y LANKTTNKDA+V708I (Figura 10A). Este estudio ilustra la mayor capacidad de las variantes de la cápside de AAV que comprenden NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) y TNKIGVT (SEQ ID NO: 15) para suministrar genes a células cardiacas.
Ejemplo 3
[0161] El tropismo celular de los viriones de AAV recombinantes que comprenden la nueva variante de AAV la quimera AAV6/AAV5 para cardiomiocitos se evaluó in vitro utilizando cardiomiocitos generados a partir de células madre embrionarias humanas (ESC).
[0162] Se fabricaron utilizando procedimientos estándar viriones de AAV recombinantes que comprenden una cápside de AAV1, una cápside de AAV8, una cápside de AAV9 o la variante nueva de la quimera AAV6/AAV5 de la cápside (de SEQ ID NO: 62) y un genoma que comprende un transgén de proteína fluorescente verde (EGFP) unidos operativamente a un promotor Ca G (AAV1.CAG.EGFP, AAV8.Ca G.EGFP, AAV9.CAG.EGFP, quimera AAV6/AAV5.CAG.EGFP, respectivamente). Se generaron cardiomiocitos a partir de una línea de células madre embrionarias humanas, ESI-017, mediante la modulación de la señalización de Wnt utilizando moléculas pequeñas. Después de 14 días de inducción del mesodermo cardíaco, los cultivos se enriquecieron adicionalmente en cardiomiocitos por privación de glucosa. Después de aproximadamente 24 días de diferenciación, la mayoría de las células expresaron el marcador de miocitos cardíacos, troponina T cardíaca (cTnT), y un marcador específico ventricular, MLC-2V. En los cardiomiocitos generados se evaluó la expresión de la proteína de unión gap Conexina 43, la fluctuación del potencial de membrana, la manipulación del calcio y la función contráctil para garantizar que los cardiomiocitos generados alcanzaran un estado maduro antes de la caracterización del vector.
[0163] En relación con AAV1, AAV8 y AAV9, la quimera AAV6/AAV5 proporcionó una eficiencia de transducción y expresión de transgenes significativamente mayor en cultivos de cardiomiocitos humanos seis días después de la infección según lo determinado por inmunofluorescencia (Figura 7A), citometría de flujo (Figura 7B ), y análisis de transferencia Western (Figuras 7C-D). Además, en relación con AAV8, la quimera AAV6/AAV5 proporcionó un inicio más rápido de la expresión génica en cultivos de cardiomiocitos humanos, según lo determinado por inmunofluorescencia (Figura 7E). En relación con AAV8 y AAV9, el número de unidades infecciosas por genoma viral administrado fue varios órdenes de magnitud mayor para la quimera AAV6/AAV5 (Figura 10A). Este estudio ilustra la mayor capacidad de las variantes de la cápside de aAv que comprenden SEQ ID NO: 62 para suministrar genes a las células cardíacas.
Ejemplo 4
[0164] El tropismo celular de los viriones de AAV recombinantes que comprenden las nuevas variantes de AAV LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I y la quimera AAV6/AAV5 para miofibras esqueléticas se evaluó in vitro utilizando miofibras esqueléticas generadas a partir de mioblastos humanos primarios.
[0165] Se fabricaron utilizando métodos estándar viriones de AAV recombinantes que comprenden una cápside de AAV8, una cápside de AAV9, la nueva variante de la cápside LANKIQRTDA+V708I, la nueva variante de la cápside LANKTTNKDA+V708I o la nueva variante de la cápside quimera AAV6/AAV5 y un genoma que comprende un transgén de proteína fluorescente verde (EGFP) unidos operativamente a un promotor CAG (AAV8.CAG.EGFP, AAV9.CAG.EGFP, LANKIQRTDA+V708I.CAG.EGFP, LANKTTNKDA+V708I.CAG.EGFP y quimera AAV6/AAV5.CAG.GFP, respectivamente). Se generaron miofibras esqueléticas a partir de mioblastos esqueléticos humanos primarios obtenidos de un hombre sano de 51 años (Cook Myosites). Los mioblastos se diferenciaron durante 30 días para formar fibras musculares esqueléticas multinucleadas maduras. En las miofibras se evaluó la expresión de la cadena pesada de miosina (MHC) y distrofina para garantizar que la mayoría de las miofibras esqueléticas generadas alcanzaran un estado maduro antes de la caracterización del vector.
[0166] En relación con AAV8 y AAV9, las quimeras LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I y AAV6/AAV5 proporcionaron una eficiencia de transducción y expresión de transgenes significativamente mayor en cultivos de miofibras esqueléticas humanas siete días después de la infección, según lo determinado por inmunofluorescencia (Figura 8A) y citometría de flujo (Figura 8B). Además, en relación con AAV8 y AAV9, LANKIQRTDA+V708I y LANKt TNk DA+V708I proporcionaron un inicio más rápido de la expresión génica en cultivos de miofibras esqueléticas humanas, según lo determinado por inmunofluorescencia (Figura 8C). En relación con AAV8 y AAV9, el número de unidades infecciosas por genoma viral administrado fue de una magnitud varias veces mayor para LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I y la quimera AAV6/5 (Figura 10B). Este estudio ilustra la capacidad superior de variantes que comprenden NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) y SEQ ID NO: 62 para suministrar genes a miofibras esqueléticas.
Ejemplo 5
[0167] El tropismo celular de los viriones de AAV recombinantes que comprenden las nuevas variantes de AAV LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I y la quimera AAV6/AAV5 para células progenitoras de músculo esquelético se evaluó in vitro utilizando células progenitoras de músculo esquelético generadas a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas derivadas de fibroblastos (FB-iPSC) o células madre embrionarias humanas (ESC).
[0168] Se fabricaron utilizando métodos estándar viriones de AAV recombinantes que comprenden una cápside de AAV9, la nueva variante de la cápside LANKIQRTDA+V708I, la nueva variante de la cápside LANKTTNKDA+V708I o la nueva variante de la cápside quimera AAV6/AAV5 y un genoma que comprende un transgén de proteína fluorescente verde (EGFP) unidos operativamente al promotor CAG (AAV8.CAG.EGFP, AAV9.CAG.EGFP, LANKIQRTDA+V708I.CAG.EGFP, LANKTTNKDA+V708I.CAG.EGFP y quimera AAV6/AAV5.CAG.GFP, respectivamente). Se generaron progenitores de músculo esquelético a partir de una línea de células madre embrionarias humanas, ESI-017 (ESI-BIO) siguiendo la estrategia de diferenciación descrita en Shelton et al. Methods, 2016 con modificaciones menores. Después de aproximadamente 40 días de diferenciación, la restricción del linaje a los progenitores del músculo esquelético se confirmó mediante la expresión de PAX7, y MyoD en la mayoría de células antes de utilizar los cultivos para la caracterización del vector.
[0169] En relación con AAV9, LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I y quimera AAV6/AAV5 proporcionaron una eficiencia de transducción y expresión de transgenes significativamente mayor en cultivos de progenitores de músculo esquelético humano seis días después de la infección según lo determinado por inmunofluorescencia (Figura 9A) y citometría de flujo (Figura 9B). Este estudio ilustra la mayor capacidad de variantes de la cápside de AAV que comprenden NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) y SEQ ID NO: 62, para suministrar genes a los progenitores del músculo esquelético.
Ejemplo 6
[0170] Se empleó la evolución dirigida para descubrir nuevas variantes de virus adenoasociados (AAV) con un suministro de genes superior a las células del músculo esquelético y cardíaco después de la administración intravenosa (IV), una vía de administración con ventajas significativas sobre otros procedimientos de suministro de genes al corazón humano y músculo esquelético (Ejemplo 1). Se evaluó in vivo el tropismo celular después de la administración intramuscular de viriones de AAV recombinantes que comprenden la nueva variante de AAV que comprende una sustitución V708I y el péptido LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) insertado entre los aminoácidos 587 y 588 (LANKIQRTDA+V708I; SEQ ID NO: 43) en ratones como un ejemplo representativo de la capacidad de los viriones de rAAV que comprenden variantes de la cápside de a Av que contienen NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) para transducir células musculares.
[0171] Se fabricaron usando métodos estándar viriones de AAV recombinantes que comprenden la nueva variante de cápside LANKIQRTDA+V708I y un genoma que comprende un transgén de luciferasa unidos operativamente a un promotor CAG (LANKIQRTDA+V708I.CAG.luciferasa). A los ratones albinos B6 (C57BL/6) se les inyectó por vía intravenosa en la vena de la cola 2 * 1012vg, y la transducción se evaluó en vivo mediante imágenes de luciferasa y post-mortem mediante actividad de luciferasa tisular. Las imágenes en vivo de la luciferasa en el día 14 (izquierda) y el día 28 (derecha) después de la administración demuestran que la nueva variante de cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I puede transducir células de ratón in vivo (Figura 11A). La actividad de la luciferasa en el corazón, el diafragma y el cuádriceps 56 días después de la administración demuestra que la nueva variante de la cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I puede transducir el músculo cardíaco y esquelético de ratón in vivo (Figura 11B).
[0172] Este estudio ilustra el suministro de genes mediante la variante que comprende NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) siguiendo una de varias vías de administración clínicamente aceptables. Se puede lograr una eficacia similar con otras variantes que comprenden este motivo de inserción de péptido. Asimismo, se puede lograr una eficacia similar con otras variantes descritas en el presente documento que se identificaron utilizando el mismo enfoque de evolución dirigida.
Ejemplo 7
[0173] Se empleó la evolución dirigida para descubrir nuevas variantes de virus adenoasociados (AAV) con un suministro de genes superior a las células del músculo esquelético y cardíaco después de administración intravenosa (IV), una vía de administración con ventajas significativas sobre otros métodos de suministro de genes al corazón humano y músculo esquelético (Ejemplo 1). Se evaluó in vivo el tropismo celular después de la administración intramuscular de viriones de AAV recombinantes que comprenden la nueva variante de AAV que comprende una sustitución V708I y el péptido LANKIQRTDA (SEQ iD NO: 27) insertado entre los aminoácidos 587 y 588 (LANKIQRTDA+V708I; SeQ ID NO: 43) en primates no humanos (NHP) como un ejemplo representativo de la capacidad de las variantes de rAAV que comprenden variantes de la cápside de AAV que contienen NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) para transducir células musculares.
[0174] Se fabricaron usando métodos estándar viriones de AAV recombinantes que comprenden la nueva variante de la cápside LANKIQRTDA+V708I y un genoma que comprende un transgén de proteína verde fluorescente (GFP) ligados operativamente a un promotor CAG (LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP). Se inyectaron a macacos Cynomolgus mediante inyección intramuscular con tres dosis de vector en sitios en el vasto lateral de 1 * 1011 vg y la transducción de las células de musculo esquelético se evaluó post-mortem mediante obtención de imágenes de inmunofluorescencia. Las imágenes representativas de hematoxilina y eosina (H&E) y tinción de anticuerpos anti-GFP de cortes transversales del sitio de biopsia proximal con aumentos de 2x, 4x y 20x demuestran que la nueva variante de cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I puede transducir células musculares esqueléticas de primates in vivo (Figura 12A). Las imágenes representativas de hematoxilina y eosina (H&E) y tinción de anticuerpos anti-GFP de secciones longitudinales del sitio de biopsia distal con aumentos de 2x, 4x y 20x demuestran que la nueva variante de cápside de AAV LANKIQRTDA+V708I puede transducir células musculares esqueléticas de primates in vivo (Figura 12B).
[0175] Este estudio ilustra el suministro de genes mediante la variante que comprende NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) siguiendo una de varias vías de administración clínicamente aceptables. Se puede lograr una eficacia similar con otras variantes que comprenden este motivo de inserción peptídica. Asimismo, se puede lograr una eficacia similar con otras variantes descritas en el presente documento que se identificaron utilizando el mismo enfoque de evolución dirigida.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Variante de la proteína de la cápside del virus adenoasociado (AAV) que comprende una inserción peptídica de 7 aminoácidos a 20 aminoácidos en el bucle de GH de la proteína de la cápside en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente que es la misma proteína de la cápside de AAV del mismo serotipo de AAV de tipo salvaje que la variante de la proteína de la cápside de AAV, pero que no comprende la inserción peptídica de la variante de la proteína de la cápside de AAV,
en la que la inserción peptídica comprende la secuencia de aminoácidos NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), en la que el sitio de inserción está ubicado entre dos aminoácidos adyacentes en una posición entre los aminoácidos 570 y 611 de VP1 de AAV2 (SEQ ID NO: 2), o la posición correspondiente en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV, en la que el sitio de inserción está ubicado dentro de:
(i) los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV1,
(ii) los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV3A,
(iii) los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV3B,
(iv) los aminoácidos 569-610 de VP1 de AAV4,
(v) los aminoácidos 560-601 de VP1 de AAV5,
(vi) los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV6,
(vii) los aminoácidos 572-613 de VP1 de AAV7,
(viii) los aminoácidos 573-614 de VP1 de AAV8,
(ix) los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV9, o
(x) los aminoácidos 573-614 de VP1 de AAV10;
en la que la variante de la proteína de la cápside, cuando está presente en un virión de AAV, confiere una infectividad aumentada de una célula muscular en comparación con la infectividad de una célula muscular por un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.
2. Variante de AAV, según la reivindicación 1, en la que:
(a) el sitio de inserción está ubicado entre los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 587 y 588 de VP1 de AAV2 (SEQ ID NO: 2);
(b) la inserción peptídica tiene una longitud de 7 a 10 aminoácidos; y/o
(c) la inserción peptídica tiene de 1 a 4 aminoácidos espaciadores en su extremo amino y/o carboxilo terminal.
3. Variante de la proteína de la cápside de AAV, según la reivindicación 1, en la que la inserción peptídica comprende la secuencia de aminoácidos NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) y en la que la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido V708I con respecto a VP1 de AAV2 (SEQ ID NO: :2) o la posición correspondiente en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV y opcionalmente comprende además uno o más de una sustitución de aminoácido S109T, una sustitución de aminoácido R588M y una sustitución de amino A593E con respecto a VP1 de AAV2 (SEQ ID NO: 2) o la posición o posiciones correspondientes en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV; opcionalmente
en la que la proteína de la cápside de AAV comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos un 90 % idéntica, al menos un 95 % idéntica, al menos un 98 % idéntica o 100 % a la longitud total de la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 43, y preferiblemente en la que la proteína de la cápside de AAV consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43.
4. Variante de la cápside de AAV, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína de la cápside confiere a un virión de rAAV infeccioso una infectividad aumentada, preferiblemente, una infectividad aumentada al menos 2 veces o al menos 5 veces, de una célula muscular en comparación con la infectividad de la célula muscular por un virión de AAV que comprende una proteína de la cápside de AAV de tipo salvaje y/o en la que la proteína de la cápside confiere a un virión de rAAV infeccioso una mayor resistencia, preferiblemente una resistencia aumentada de al menos 2 veces o al menos 5 veces, a la neutralización por un anticuerpo neutralizante en comparación con un AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.
5. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de la proteína de la cápside, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Virión de AAV recombinante infeccioso (rAAV) que comprende una variante de la proteína de la cápside de AAV, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Virión de rAAV, según la reivindicación 6, que comprende además un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico, preferiblemente, en el que el producto génico es una proteína, un ARN pequeño de interferencia, un ARN antisentido, un microARN o un ARN de horquilla corta.
8. Virión de rAAV, según la reivindicación 7, en el que el virión de rAAV comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína seleccionada entre alfa galactosidasa A (GLA), frataxina (FXN), distrofina (DMD) o un fragmento funcional de la misma, alfa glucosidasa ácida (GAA) y glucógeno fosforilasa muscular (PYg M).
9. Composición farmacéutica que comprende un virión de rAAV, según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, y un portador, diluyente, excipiente o tampón farmacéuticamente aceptable.
10. Virión de rAAV, o composición farmacéutica que comprende dicho virión de rAAV, para usar en un método de tratamiento de una enfermedad muscular mediante el suministro de un ácido nucleico heterólogo a una célula muscular, preferiblemente a una célula muscular cardíaca y/o esquelética, preferiblemente mediante inyección intravenosa y/o intramuscular;
en el que el virión de rAAV comprende una variante de la proteína de la cápside de AAV y un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico;
en el que la variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una inserción peptídica de 7 aminoácidos a 20 aminoácidos en el bucle GH de la proteína de la cápside en relación con una proteína de la cápside de AAV parental correspondiente que es la misma proteína de la cápside de AAV del mismo serotipo de AAV de tipo salvaje que la variante de la proteína de la cápside de AAV, pero que no comprende la inserción peptídica de la variante de la proteína de la cápside de AAV,
en el que la inserción peptídica comprende la secuencia de aminoácidos NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) o NKIQRTD (SEQ ID NO: 13),
en el que el sitio de inserción está ubicado entre dos aminoácidos adyacentes en una posición entre los aminoácidos 570 y 611 de VP1 de AAV2 (SEQ ID NO: 2), o la posición correspondiente en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV, en la que el sitio de inserción está ubicado dentro de:
(i) los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV1,
(ii) los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV3A,
(iii) los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV3B,
(iv) los aminoácidos 569-610 de VP1 de AAV4,
(v) los aminoácidos 560-601 de VP1 de AAV5,
(vi) los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV6,
(vii) los aminoácidos 572-613 de VP1 de AAV7,
(viii) los aminoácidos 573-614 de VP1 de AAV8,
(ix) los aminoácidos 571-612 de VP1 de AAV9, o
(x) los aminoácidos 573-614 de VP1 de AAV10;
en el que la variante de la proteína de la cápside, cuando está presente en un virión de AAV, confiere una infectividad aumentada de una célula muscular en comparación con la infectividad de una célula muscular por un virión de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV parental correspondiente.
11. Virión de rAAV o composición farmacéutica para usar, según la reivindicación 10, en el que el virión de rAAV comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína seleccionada entre alfa galactosidasa A (GLA), frataxina (FXN), distrofina (DMD) o un fragmento funcional de la misma, alfa glucosidasa ácida (GAA) y glucógeno fosforilasa muscular (PYGM); preferiblemente en el que la variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos o que tiene un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 48 y en el que el ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína alfa galactosidasa A (GLA), preferiblemente en el que la secuencia de nucleótidos que codifica GLA está unida operativamente a un promotor CAG.
12. rAAV o composición farmacéutica para usar, según la reivindicación 11, para usar en el tratamiento de la enfermedad de Fabry, preferiblemente, en la que el rAAV o composición se administran mediante inyección intravenosa y/o intramuscular.
13. Virión de rAAV o composición farmacéutica para usar, según la reivindicación 10, en el que la variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos o que tiene un 100 % identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 48 y en el que el ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína frataxina, preferiblemente en el que la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína frataxina está unida operativamente a un promotor CAG.
14. rAAV o una composición farmacéutica para usar, según la reivindicación 13, para usar en el tratamiento de la ataxia de Friedreich, preferiblemente en el que el rAAV o composición se administra mediante inyección intravenosa.
15. Virión de rAAV o la composición farmacéutica para usar, según la reivindicación 10, en el que la variante de la proteína de la cápside de AAV comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos o que tiene un 100 % identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 48 y en la que el ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína GAA, preferiblemente en el que la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína GAA está unida operativamente a un promotor CBA.
16. rAAV o composición farmacéutica para usar, según la reivindicación 15, para usar en el tratamiento de la enfermedad de Pompe, preferiblemente en el que el rAAV o composición se administra mediante inyección intravenosa y/o intramuscular.
17. Virión de rAAV o composición farmacéutica para usar, según la reivindicación 10, en el que la inserción peptídica es LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) o LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27).
18. Virión de rAAV o composición farmacéutica para usar, según la reivindicación 10, en el que la inserción peptídica comprende la secuencia de aminoácidos NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) y en el que la proteína de la cápside de AAV comprende una sustitución de aminoácido V708I con respecto a VP1 de AAV2 ( SEQ ID NO: 2) o la posición correspondiente en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV, y opcionalmente comprende además uno o más de una sustitución de aminoácido S109T, una sustitución de aminoácido W694C y una sustitución de amino W606C con respecto a VP1 de AAV2 (SEQ ID NO:2) o la posición o posiciones correspondientes en la proteína de la cápside de otro serotipo de AAV.
19. Virión de rAAV o composición farmacéutica para usar, según la reivindicación 18, en el que la proteína de la cápside de AAV comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica, al menos un 95 % idéntica, al menos un 98 % idéntica o un 100 % idéntica en toda la longitud de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:48, preferiblemente en el que la variante de la proteína de la cápside de AAV consiste en la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:48.
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Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3066569A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
FI3684423T3 (fi) 2017-09-20 2023-06-15 4D Molecular Therapeutics Inc Adenoassesioidun viruksen kapsidivariantteja ja niiden käyttömenetelmiä
SG11202004545XA (en) 2017-11-27 2020-06-29 4D Molecular Therapeutics Inc Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis
KR20210102870A (ko) 2018-08-30 2021-08-20 테나야 테라퓨틱스, 인코포레이티드 미오카르딘 및 ascl1을 사용한 심장 세포 재프로그래밍
US11149256B2 (en) 2018-09-26 2021-10-19 California Institute Of Technology Adeno-associated virus compositions for targeted gene therapy
CN110437317B (zh) * 2019-01-30 2023-05-02 上海科技大学 具有变异衣壳蛋白的腺相关病毒及其用途
US20220184232A1 (en) * 2019-03-25 2022-06-16 The Regents Of The University Of California Methods of treating tnni3-mediated cardiomyopathy
CA3135609A1 (en) * 2019-04-01 2020-10-08 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
WO2021007515A1 (en) 2019-07-11 2021-01-14 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors
JP2022553406A (ja) * 2019-10-23 2022-12-22 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 導入遺伝子発現のｄｒｇ特異的低減のための組成物
CA3159113A1 (en) * 2019-11-22 2021-05-27 Beverly Davidson Adeno-associated viral vector variants
CA3171166A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene therapy vectors for treating heart disease
WO2021207327A1 (en) * 2020-04-08 2021-10-14 University Of Utah Research Foundation Methods for rehabilitating heart failure using gene therapy
CN115515613A (zh) * 2020-04-27 2022-12-23 4D分子治疗有限公司 密码子优化的gla基因及其用途
US11900272B2 (en) 2020-05-13 2024-02-13 Factset Research System Inc. Method and system for mapping labels in standardized tables using machine learning
MX2022014256A (es) 2020-05-13 2023-01-11 Voyager Therapeutics Inc Redirección del tropismo de las cápsides de aav.
EP4149519A4 (en) * 2020-05-14 2024-06-12 The Trustees of The University of Pennsylvania COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF POMPE DISEASE
CN116209477A (zh) * 2020-06-30 2023-06-02 儿童国家医疗中心 使用重组人酸性鞘氨醇酶改善骨骼肌纤维的修复
US20230313186A1 (en) * 2020-07-24 2023-10-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Trophin genome editing for treating duchenne muscular dystrophy (dmd)
CN113754728B (zh) * 2020-09-30 2022-07-12 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用
US11781156B2 (en) 2020-10-09 2023-10-10 Tenaya Therapeutics, Inc. Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions
CA3196439A1 (en) * 2020-11-10 2022-05-19 Avirmax, Inc. Engineered viral capsids and methods of use
CN112725342B (zh) * 2021-02-02 2024-05-17 中国科学院深圳先进技术研究院 一种启动子pCALM2及其应用
US20230062110A1 (en) * 2021-03-26 2023-03-02 Adverum Biotechnologies, Inc. Intravitreal dosing for delivery of polynucleotides to retinal cones
EP4322974A2 (en) * 2021-04-13 2024-02-21 Capsida, Inc. Adeno-associated virus compositions having increased brain enrichment
CN113121653B (zh) * 2021-04-19 2021-11-19 上海信致医药科技有限公司 肌肉和视网膜特异性的新型腺相关病毒衣壳蛋白
EP4347621A1 (en) * 2021-06-03 2024-04-10 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid variants and methods of using the same
WO2023005906A1 (zh) * 2021-07-30 2023-02-02 上海信致医药科技有限公司 新型腺相关病毒血清型介导的血管生成抑制剂及其应用
CN113480615B (zh) * 2021-07-30 2022-05-31 上海信致医药科技有限公司 高视网膜亲和性的新型腺相关病毒衣壳蛋白及其应用
AU2022335593A1 (en) * 2021-08-25 2024-03-14 Canbridge Pharmaceuticals, Inc. Aav particles comprising liver-tropic capsid protein and acid alpha-glucosidase and use to treat pompe disease
CA3242262A1 (en) * 2021-12-10 2023-06-15 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Methods and compositions for treating mybpc3 related hypertrophic cardiomyopathy with a viral vector
WO2023172873A2 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids with improved lung tropism and uses thereof
TW202404992A (zh) * 2022-04-11 2024-02-01 美商特納亞治療股份有限公司 用於斑菲素蛋白—２（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｌｉｎ—２）基因療法之蛋白殼
WO2024054864A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective heart disease therapies
WO2024064782A2 (en) * 2022-09-21 2024-03-28 Rejuvenate Bio Adeno-associated virus capsids
US20240182904A1 (en) * 2022-09-30 2024-06-06 University Of Massachusetts Oligonucleotides targeting s6k1
CN115960177B (zh) * 2022-10-09 2023-07-07 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用
CN117304256B (zh) * 2022-12-08 2024-04-16 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用
WO2024130070A2 (en) * 2022-12-17 2024-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav capsids with cardiac- and skeletal muscle- specific targeting motifs and uses thereof
CN116041443B (zh) * 2022-12-30 2023-09-22 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用
CN115925819B (zh) * 2022-12-30 2023-10-13 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030215422A1 (en) 1996-09-11 2003-11-20 John A. Chiorini Aav4 vector and uses thereof
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US7323179B2 (en) 1997-12-19 2008-01-29 Naomi Balaban Methods and compositions for the treatment and prevention of Staphylococcus and other bacterial infections
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6984517B1 (en) 1998-05-28 2006-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector and uses thereof
DE69939169D1 (de) 1998-05-28 2008-09-04 Us Gov Health & Human Serv Aav5 vektoren und deren verwendung
EP1127150B1 (en) 1998-11-05 2007-05-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
US6759237B1 (en) 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
DE69941905D1 (de) 1998-11-10 2010-02-25 Univ North Carolina Virusvektoren und verfahren für ihre herstellung und verabreichung.
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
AU1086501A (en) 1999-10-15 2001-04-30 Carnegie Institution Of Washington Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
IL151928A0 (en) 2000-03-30 2003-04-10 Whitehead Biomedical Inst Rna sequence-specific mediators of rna interference
CA2410536A1 (en) 2000-05-23 2001-11-29 University Of Rochester Method of producing herpes simplex virus amplicons, resulting amplicons, and their use
JP4901051B2 (ja) 2000-05-30 2012-03-21 ジョンソン アンド ジョンソン リサーチ プロプライアトリー リミテッド ＲＮＡｉを増強する因子を使用することによって遺伝子抑制を媒介する方法
US20040053869A1 (en) 2000-08-19 2004-03-18 Peter Andrews Stem cell differentiation
WO2002029858A2 (en) 2000-09-29 2002-04-11 Infineon Technologies North America Corp. Deep trench etching method to reduce/eliminate formation of black silicon
WO2002053703A2 (en) 2001-01-05 2002-07-11 Children's Hospital, Inc. Aav2 vectors and methods
US7749492B2 (en) 2001-01-05 2010-07-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. AAV vectors and methods
CA2467959C (en) 2001-11-09 2009-03-10 Robert M. Kotin Production of adeno-associated virus in insect cells
CN103555677B (zh) 2001-11-13 2018-01-30 宾夕法尼亚大学托管会 检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法
ES2717377T3 (es) 2001-12-17 2019-06-20 Univ Pennsylvania Secuencias de serotipo 8 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen y usos de las mismas
ES2526341T3 (es) 2001-12-17 2015-01-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Secuencias de serotipo 9 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen, y usos de las mismas
US20050106558A1 (en) 2001-12-21 2005-05-19 Luca Perabo Library of modified structural genes or capsid modified particles useful for the identification of viral clones with desired cell tropism
AU2003253595A1 (en) 2002-04-05 2003-11-03 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods for the production of chimeric adeno-associated virus (aav) vectors, compositions of chimeric aav vectors, and methods of use thereof
WO2003089612A2 (en) 2002-04-17 2003-10-30 University Of Florida Research Foundation, Inc. IMPROVED rAAV VECTORS
NZ561656A (en) 2002-05-01 2009-03-31 Univ Florida Improved rAAV expression systems for genetic modification of specific capsid proteins
US20040023390A1 (en) 2002-08-05 2004-02-05 Davidson Beverly L. SiRNA-mediated gene silencing with viral vectors
WO2004020600A2 (en) 2002-08-28 2004-03-11 University Of Florida Modified aav
US20070172460A1 (en) * 2003-03-19 2007-07-26 Jurgen Kleinschmidt Random peptide library displayed on aav vectors
US7186522B2 (en) 2003-03-31 2007-03-06 Cytyc Corporation Papanicolau staining process
WO2004106360A2 (en) 2003-05-23 2004-12-09 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Viral vectors with improved properties
EP1486567A1 (en) 2003-06-11 2004-12-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved adeno-associated virus (AAV) vector for gene therapy
US8071028B2 (en) 2003-06-12 2011-12-06 Abbott Diabetes Care Inc. Method and apparatus for providing power management in data communication systems
PT1633772E (pt) 2003-06-19 2016-03-22 Avigen Inc Viriões aav com imunorreatividade diminuída e seus usos
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9441244B2 (en) * 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
JP5054975B2 (ja) 2003-09-30 2012-10-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）の同源系統群、配列、それらを含有するベクターおよびそれらの用途
PT1791858E (pt) 2004-09-24 2010-07-26 Intercell Ag PROTENA DE CáPSIDE VP1 MODIFICADA DO PARVOVRUS B19
JP5136766B2 (ja) 2004-12-15 2013-02-06 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル キメラベクター
EP3603676A1 (en) 2005-04-07 2020-02-05 The Trustees of the University of Pennsylvania Method of increasing the function of an aav vector
US8283151B2 (en) 2005-04-29 2012-10-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (AAV) serotypes
EP1945779B1 (en) 2005-10-20 2013-03-06 UniQure IP B.V. Improved aav vectors produced in insect cells
WO2007089632A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Heparin and heparan sulfate binding chimeric vectors
EP2007795B1 (en) 2006-03-30 2016-11-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid proteins
CN101495624A (zh) 2006-04-28 2009-07-29 宾夕法尼亚州立大学托管会 衣壳免疫原性降低的经修饰aav载体及其用途
WO2008124015A1 (en) 2007-04-09 2008-10-16 The Regents Of The University Of California Methods for purifying adeno-associated virus virions
DK2191001T3 (en) 2007-04-09 2016-09-19 Univ Florida RAAV VECTOR COMPOSITIONS WITH TYROSIN MODIFIED CAPSIDE PROTEINS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
EP2012122A1 (en) 2007-07-06 2009-01-07 Medigene AG Mutated parvovirus structural proteins as vaccines
US20100203083A1 (en) 2007-05-31 2010-08-12 Medigene Ag Mutated structural protein of a parvovirus
US8299215B2 (en) 2007-07-14 2012-10-30 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating brain diseases
US20090215879A1 (en) 2008-02-26 2009-08-27 University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for adeno-associated virus (aav) with hi loop mutations
WO2009137006A2 (en) 2008-04-30 2009-11-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
WO2009154452A1 (en) 2008-06-17 2009-12-23 Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. Parvoviral capsid with incorporated Gly-Ala repeat region
JP2010002479A (ja) 2008-06-18 2010-01-07 Crossfor:Kk メガネレンズ用装飾体およびメガネ用装飾体装着具
EP2342567A1 (en) 2008-09-19 2011-07-13 Charité Universitätsmedizin Berlin Identification and characterisation of recombinant viral gene therapy vectors
US8889641B2 (en) 2009-02-11 2014-11-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
WO2010141706A1 (en) 2009-06-03 2010-12-09 Cedars-Sinai Medical Center Effective vector platform for gene transfer and gene therapy
WO2011038187A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Controlled adeno-associated virus (aav) diversification and libraries prepared therefrom
US8299295B2 (en) 2009-10-15 2012-10-30 Johnson Matthey Public Limited Company Polymorphs of bromfenac sodium and methods for preparing bromfenac sodium polymorphs
US8263396B2 (en) 2010-04-01 2012-09-11 Weidong Xiao Methods and compositions for the production of recombinant virus vectors
DK2561073T3 (en) 2010-04-23 2016-12-12 Univ Massachusetts Aav vectors targeted to central nervous system and methods of use thereof
US8927514B2 (en) 2010-04-30 2015-01-06 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment
US8628966B2 (en) 2010-04-30 2014-01-14 City Of Hope CD34-derived recombinant adeno-associated vectors for stem cell transduction and systemic therapeutic gene transfer
AU2011256838B2 (en) 2010-05-17 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel DNA-binding proteins and uses thereof
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2012064960A2 (en) 2010-11-10 2012-05-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for generating adeno-associated viral vectors with undetectable capsid gene contamination
JP6042825B2 (ja) 2011-02-10 2016-12-14 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 改変された形質導入プロファイルを有するウイルスベクターならびにその製造および使用の方法
CA2827375C (en) 2011-02-14 2022-07-19 The Children's Hospital Of Philadelphia Improved aav8 vector with enhanced functional activity and methods of use thereof
AU2012219380B2 (en) 2011-02-17 2017-04-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for altering tissue specificity and improving AAV9-mediated gene transfer
EP2500434A1 (en) * 2011-03-12 2012-09-19 Association Institut de Myologie Capsid-free AAV vectors, compositions, and methods for vector production and gene delivery
DK3254703T3 (da) 2011-04-22 2020-05-11 Univ California Adeno-associerede virusvirioner med variant capsid og fremgangsmåder til anvendelse deraf
EP3795581A3 (en) 2011-08-24 2021-06-09 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University New avv capsid proteins for nucleic acid transfer
US20140359799A1 (en) 2011-12-23 2014-12-04 Case Western Reserve University Targeted gene modification using hybrid recombinant adeno-associated virus
SG11201404956PA (en) 2012-02-17 2014-09-26 Philadelphia Children Hospital Aav vector compositions and methods for gene transfer to cells, organs and tissues
RU2683497C2 (ru) 2012-04-18 2019-03-28 Дзе Чилдрен'З Хоспитал Оф Филадельфия Композиция и способы высокоэффективного переноса генов с помощью вариантов капсида aav
US20140162319A2 (en) 2012-05-02 2014-06-12 Sangeetha Hareendran Nucleotide sequences, methods, kit and a recombinant cell thereof
WO2013170078A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Oregon Health & Science University Adeno associated virus plasmids and vectors
WO2013174760A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Deutsches Krebsforschungszentrum Optimized aav-vectors for high transduction rates in dendritic cells
EP2692731A1 (en) 2012-07-31 2014-02-05 Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe Recombinant Adeno-Associated virus (AAV) vector particles displaying high-affinity ligands for cell-type specific gene delivery
CN111621507A (zh) * 2012-09-28 2020-09-04 北卡罗来纳-查佩尔山大学 靶向少突胶质细胞的aav载体
WO2014103957A1 (ja) 2012-12-25 2014-07-03 タカラバイオ株式会社 Ａａｖ変異体
US9567376B2 (en) 2013-02-08 2017-02-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Enhanced AAV-mediated gene transfer for retinal therapies
WO2014160092A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 The Children's Hospital Of Philadelphia Adeno-associated virus vectors and methods of use thereof
ES2897508T3 (es) 2013-05-31 2022-03-01 Univ California Variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de las mismas
EP4331590A3 (en) 2013-10-29 2024-04-17 President and Fellows of Harvard College Nuclear factor erythroid 2-like 2 (nrf2) for use in treatment of age-related macular degeneration
CN106414474B (zh) * 2014-03-17 2021-01-15 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于视锥细胞中增强的基因表达的组合物和方法
MY187898A (en) * 2015-03-02 2021-10-27 Adverum Biotechnologies Inc Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
ES2860712T3 (es) 2015-03-24 2021-10-05 Univ California Variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de las mismas
EP3384034B1 (en) * 2015-12-02 2020-07-08 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Novel recombinant adeno-associated virus capsids with enhanced human skeletal muscle tropism
CA3023592C (en) 2016-05-13 2020-12-08 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
US11554180B2 (en) * 2016-07-29 2023-01-17 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
FI3684423T3 (fi) * 2017-09-20 2023-06-15 4D Molecular Therapeutics Inc Adenoassesioidun viruksen kapsidivariantteja ja niiden käyttömenetelmiä
CN115515613A (zh) * 2020-04-27 2022-12-23 4D分子治疗有限公司 密码子优化的gla基因及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020537508A (ja) 2020-12-24
US11613766B2 (en) 2023-03-28
PT3684423T (pt) 2023-06-09
FI3684423T3 (fi) 2023-06-15
US20220251145A1 (en) 2022-08-11
MX2020003176A (es) 2020-08-20
EP4218828A2 (en) 2023-08-02
EP3684423A2 (en) 2020-07-29
US20210380643A1 (en) 2021-12-09
CL2020000728A1 (es) 2020-07-31
CO2020004738A2 (es) 2020-05-05
US11118192B2 (en) 2021-09-14
AU2018337833B2 (en) 2020-06-25
CR20200165A (es) 2020-06-05
EP3684423B1 (en) 2023-03-29
IL273261A (en) 2020-04-30
JP6825167B2 (ja) 2021-02-03
US11840704B2 (en) 2023-12-12
BR112020005436B1 (pt) 2022-08-02
PH12020550094A1 (en) 2020-09-14
CN111836649A (zh) 2020-10-27
EP4218828A3 (en) 2023-09-27
SG11202002276VA (en) 2020-04-29
RU2020113681A (ru) 2021-10-20
BR112020005436A2 (pt) 2020-09-24
WO2019060454A2 (en) 2019-03-28
PE20201264A1 (es) 2020-11-19
US20230279435A1 (en) 2023-09-07
UA127455C2 (uk) 2023-08-30
NZ763018A (en) 2023-02-24
CA3076348A1 (en) 2019-03-28
DK3684423T3 (da) 2023-06-12
US20200248205A1 (en) 2020-08-06
KR20200052333A (ko) 2020-05-14
RU2770922C2 (ru) 2022-04-25
AU2018337833A1 (en) 2020-04-16
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