ES2942442T3

ES2942442T3 - Derivados de [1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona

Info

Publication number: ES2942442T3
Application number: ES19707923T
Authority: ES
Inventors: Nicholas Paul Camp; Chafiq Hamdouchi; Jayana Pankaj Lineswala; John Richard Morphy; Qing Shi
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2023-06-01
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: US20200399277A1; JP7488768B2; EP3749671A1; JP2021512154A; CN111699188A; US11453673B2; EP3749671B1; JP2022137065A; WO2019156861A1; CN111699188B

Abstract

La presente invención proporciona un compuesto de fórmula I: en la que R1 es metilo, etilo o ciclopropilo; R2 es hidrógeno, metilo o etilo; R3 es metilo o AA; y R4 es alquilo C2-C4, BB; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables; para su uso como inhibidor de la PDE1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de [1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona

La presente invención se refiere a determinados inhibidores de PDE1 humana, a composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos y a procesos para preparar dichas composiciones farmacéuticas, y a los compuestos para su uso en métodos para tratar trastornos fisiológicos.

Las fosfodiesterasas (PDE) son enzimas que regulan los niveles celulares de AMPc y GMPc controlando la velocidad a la que se hidrolizan estos nucleótidos cíclicos. La PDE1, una PDE dependiente de calcio y calmodulina, es una de al menos 11 familias de PDE conocidas. La PDE1 se expresa en muchos tejidos, incluyendo el cerebro, corazón, pulmón, riñón y músculo liso. La PDE1 comprende tres isoformas conocidas, PDE1A, PDE1B y PDE1C.

Los pacientes que padecen diabetes con frecuencia desarrollan una forma de enfermedad renal crónica denominada enfermedad renal diabética (o nefropatía diabética). Se ha estimado que la enfermedad renal diabética puede afectar tanto como al 40 por ciento de los pacientes diabéticos. Las opciones de tratamiento de la enfermedad renal diabética son limitadas e incluyen el uso de medicamentos que reducen la presión arterial, el control de los niveles de glucosa en sangre, la dieta y el peso, y la implementación de actividad física regular. Por lo tanto, existe la necesidad de opciones de tratamiento adicionales para los pacientes que padecen enfermedad renal crónica, particularmente enfermedad renal diabética.

La Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 2017/0233396 A1 desvela una determinada [1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-ona y el uso de la misma en el tratamiento de determinadas enfermedades, tales como la enfermedad renal crónica y la enfermedad renal diabética. El documento WO 2016/055618 A1 desvela determinadas triazolopirazinonas como inhibidores de la PDE1 y su uso para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y trastornos psiquiátricos.

La presente invención proporciona determinados compuestos novedosos que son inhibidores de la PDE1 humana. La presente invención proporciona determinados compuestos novedosos que son inhibidores selectivos de la PDE1A, la PDE1B y la PDE1C humanas con respecto a otras PDE humanas, tales como PDE3A, PDE4D y PDE6AB.

En consecuencia, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I:

en donde R1 es metilo, etilo o ciclopropilo;

R2 es hidrógeno, metilo o etilo;

R3 es metilo o

y

R4 es alquilo C2-C4 seleccionado del grupo que consiste en etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, secbutilo, isobutilo, ferc-butilo y ciclobutilo, o

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Además, la invención proporciona un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en terapia. La invención proporciona además un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de la enfermedad renal crónica. Además, la invención proporciona un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de la enfermedad renal diabética.

La invención proporciona además una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. La invención proporciona además un proceso para preparar una composición farmacéutica, que comprende mezclar un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Como se usan en el presente documento, los términos "tratando", "tratamiento" o "tratar" incluyen prohibir, restringir, ralentizar, detener o revertir el avance o gravedad de un síntoma o trastorno existente.

Como se usa en el presente documento, el término "paciente" se refiere a un mamífero, tal como un perro o un ser humano, siendo el ser humano preferido.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad o dosis de compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que, tras la administración de una dosis única o múltiple al paciente, proporciona el efecto deseado en el paciente en diagnóstico o tratamiento.

Como se usa en el presente documento, la expresión "alquilo C2-C4" se refiere a grupos alquilo de cadena lineal, ramificados y cíclicos seleccionados del grupo que consiste en etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, secbutilo, isobutilo, tere-butilo y ciclobutilo, prefiriéndose etilo, n-propilo, ciclopropilo, n-butilo y ciclobutilo.

Un experto en la materia puede determinar con facilidad una cantidad eficaz usando técnicas conocidas y observando los resultados obtenidos en circunstancias análogas. Al determinar la cantidad eficaz para un paciente, un experto en la materia considera una serie de factores, incluyendo, pero sin limitación: el tamaño del paciente, la edad y la salud general; la enfermedad o trastorno específico implicado; el grado de o la afectación o la gravedad de la enfermedad o trastorno; la respuesta del paciente individual; el compuesto administrado particular; el modo de administración; las características de biodisponibilidad de la preparación administrada; la posología seleccionada; el uso de medicación simultánea; y otras circunstancias relevantes.

Los compuestos de la presente invención son eficaces a una dosificación por día que está dentro del intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal. En algunos casos, los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo mencionado anteriormente pueden ser más que adecuados, mientras que en otros casos pueden emplearse dosis aún mayores con efectos secundarios aceptables y, por lo tanto, el intervalo de dosificación anterior no pretende limitar en modo alguno el alcance de la invención.

Los compuestos de la presente invención se formulan en forma de composiciones farmacéuticas administradas por cualquier vía que hace biodisponible el compuesto, incluyendo las vías oral y parenteral. Mucho más preferentemente, dichas composiciones son para administración oral. Dichas composiciones farmacéuticas y los procesos para preparar las mismas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen, Editor, 22a edición, Pharmaceutical Press, 2012).

Los compuestos de Fórmula I son particularmente útiles en los métodos de tratamiento desvelados en el presente documento, pero se prefieren determinados grupos, sustituyentes y compuestos. Los párrafos siguientes describen dichos grupos, sustituyentes y compuestos preferidos. Se entenderá que estas preferencias son aplicables tanto a los nuevos compuestos de la invención como a los compuestos para su uso en los métodos de tratamiento de la invención. Se prefiere que R1 sea ciclopropilo.

Se prefiere que R2 sea metilo.

Se prefiere que R3 sea metilo.

Se prefiere además que cuando R1 sea ciclopropilo, R2 sea metilo.

Se prefiere además que cuando R2 sea metilo, R3 sea metilo.

Se prefiere más que cuando R1 sea ciclopropilo, R2 y R3 sean metilo.

Se prefieren especialmente los siguientes compuestos:

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, prefiriéndose mucho más especialmente las bases libres correspondientes de cada compuesto.

Una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de la invención se puede formar, por ejemplo, por la reacción de una base libre apropiada del compuesto de la invención y un ácido farmacéuticamente aceptable apropiado en un disolvente adecuado en condiciones convencionales bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs", International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities", Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); y Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977).

Los isómeros, los enantiómeros y los diastereómeros individuales pueden ser separados o redisueltos por un experto en la materia en cualquier punto conveniente en la síntesis de compuestos de la invención, mediante métodos tales como técnicas de cristalización selectiva o cromatografía quiral (véase, por ejemplo, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, y E.L. Eliel y S. H. Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). Las designaciones "isómero 1" e "isómero 2" se refieren a los compuestos que eluyen de la cromatografía quiral en condiciones específicas, primero y segundo, respectivamente.

Determinadas abreviaturas se definen de la siguiente manera: "ACN" se refiere a acetonitrilo; "BSA" se refiere a albúmina sérica bovina; "AMPc" se refiere a adenosín-3',5'-monofosfato cíclico; "CDI" se refiere a 1,1'-carbonildiimidazol; "GMPc" se refiere a monofosfato de guanosina cíclico; "DCC" se refiere a 1,3-diclohexilcarbodiimida; "DCM" se refiere a diclorometano o cloruro de metileno; "DIC" se refiere a 1,3-diisopropilcarbodiimida; "DIPEA" se refiere a N,N-diisopropiletilamina; "DMF" se refiere a N,N-dimetilformamida; "DMAp " se refiere a dimetilaminopiridina; "DMSO" se refiere a dimetilsulfóxido; "EDCI" se refiere a clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; "EDTA" se refiere a ácido etilendiaminotetraacético; "EN/EM" se refiere a espectrometría de masas por electronebulización; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "Et2O" se refiere a dietil éter; "EtOH" se refiere a etanol o alcohol etílico; HATU" se refiere a hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-6]piridinio; "HBTU" se refiere a hexafluorofosfato de (1H-benzotriazol-1-iloxi)(dimetilamino)-N,N-dimetilmetaniminio; "HIS" se refiere a la histidina; "HOAt" se refiere a 1 -hidroxi-7-azobenzotriazol; "HOBt" se refiere a hidrato de 1-hidroxilbenzotriazol; "CI50" se refiere a la concentración de un agente que produce el 50 % de la respuesta inhibidora máxima posible para ese agente; "MeOH" se refiere a metanol o alcohol metílico; "MTBE" se refiere a metil terc-butil éter; "NiNTA" se refiere a cromatografía con una fase estacionaria de agarosa funcionalizada con ácido nitrilotriacético como quelante; "PDE" se refiere a fosfodiesterasa; "PyBOP" se refiere a (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio); "PyBrOP" se refiere a hexafluorofosfato de bromo(tripirrolidinil)fosfonio; "t(R)" se refiere a tiempo de retención; "SFC" se refiere a cromatografía de fluidos supercríticos; "SPA" se refiere a ensayo de proximidad de centelleo; "TEA" se refiere a trietilamina; "THF" se refiere a tetrahidrofurano; "Tris" se refiere a 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol; "U/ ml" se refiere a unidades por mililitro; "XPhos Pd G2" se refiere a cloro(2-diclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropil-1,1'-bifenil)[2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladio(N); y "ee" se refiere a exceso enantiomérico.

Los compuestos de la presente invención se pueden preparar mediante diversos procedimientos conocidos por un experto habitual en la materia, algunos de los cuales se ilustran en los esquemas, preparaciones y ejemplos a continuación. Un experto habitual en la materia reconoce que las etapas de síntesis específicas para cada una de las vías descritas pueden combinarse de diferentes formas o junto con etapas de esquemas diferentes, para preparar compuestos de la invención. Los productos de cada etapa a continuación pueden recuperarse mediante métodos convencionales bien conocidos en la técnica, que incluyen extracción, evaporación, precipitación, cromatografía, filtración, triturado y cristalización. En los esquemas a continuación, todos los sustituyentes, a menos que se indique lo contrario, son como se ha definido anteriormente. Los reactivos y materiales de partida están fácilmente disponibles para un experto habitual en la materia. Sin limitar el alcance de la invención, los siguientes esquemas, preparaciones y ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la invención.

Esquema 1

5 6 Fórmula I

El Esquema 1 representa la alquilación de una amina (1) con un nitrilo sustituido para proporcionar el compuesto (2) como se muestra en la etapa 1. Puede usarse trimetilsililcianuro como fuente de nitrilo con un aldehído en un disolvente tal como 1,2-dimetoxietano y calentando a aproximadamente 70 °C para lograr la alquilación. El producto puede tratarse con un ácido tal como HCl para aislar el compuesto (2) en forma de una sal ácida. Como alternativa, la alquilación puede completarse usando una fuente de hidroxinitrilo y agitarse en un disolvente tal como THF a temperatura ambiente y tratarse con un ácido tal como HCl para proporcionar el compuesto (2). En la etapa 2, el compuesto (2) puede tratarse con un cloruro ácido, tal como cloruro de oxalilo, gota a gota a aproximadamente 0 °C seguido de calentamiento de la reacción a 50-100 °C para ciclar el nitrilo a la 3,5-dicloro-pirazin-2-ona 1,6-sustituida, compuesto (3). En la etapa 3, el compuesto (3) puede convertirse después en una hidrazida con monohidrato de hidrazina en un disolvente tal como THF a temperatura ambiente o en EtOH con calentamiento a aproximadamente 100 °C para proporcionar el compuesto correspondiente (4). En la etapa 4, puede realizarse un acoplamiento amida en el compuesto (4) con el ácido carboxílico apropiado, una base orgánica tal como DIPEA en un disolvente tal como DMF o DCM y un agente de acoplamiento tal como hexafluorofosfato de N-[(5-cloro-3-oxido-1H-benzotriazol-1-il)-4-morfolinilmetilen]-N-metilmetanaminio para proporcionar el compuesto (5). Un experto en la materia reconocerá que existe una serie de métodos y reactivos para la formación de amidas resultado de la reacción de ácidos carboxílicos y aminas. Por ejemplo, la reacción del compuesto de amina con un ácido carboxílico apropiado en presencia de un reactivo de acoplamiento con o sin una base orgánica tal como DIPEA o TEA puede proporcionar un compuesto de la etapa 4. Los reactivos de acoplamiento incluyen carbodiimidas, tales como DCC, DIC, EDCI o un carbonildiimidazol tal como CDI. También pueden usarse aditivos de acoplamiento de amidas, tales como HOBt y HOAt para potenciar la reacción. Adicionalmente, en lugar de los reactivos de acoplamiento más tradicionales podrían usarse sales de uronio o fosfonio de aniones no nucleófilos, tales como HBTU, HATU, PyBOP y PyBrOP. Puede usarse un aditivo tal como DMAP para potenciar la reacción. Como alternativa, el compuesto (4) puede acilarse usando el cloruro ácido apropiado en presencia de una base, tal como TEA o piridina para proporcionar el compuesto (5). En la etapa 5, el compuesto (5) puede ciclarse en condiciones básicas o ácidas al triazol (6). Por ejemplo, el tratamiento del compuesto (5) con una base, tal como TEA, y cloruro de tionilo en un disolvente tal como 1,4-dioxano y calentando a aproximadamente 80 °C en un sistema cerrado puede proporcionar triazol (6). Como alternativa, puede usarse hexametildisilazano como base y la reacción puede calentarse a aproximadamente 120 °C. Después de enfriar a temperatura ambiente, puede añadirse MeOH para facilitar la ciclación. Como alternativa, el compuesto (5) puede ciclarse a un triazol en condiciones ácidas usando un ácido tal como ácido acético a una temperatura de aproximadamente 130 °C con condiciones de microondas para proporcionar triazol (6). En la Etapa 6, pueden lograrse dos reacciones. El sustituyente 5-cloro del compuesto (6) puede desplazarse dando como resultado el sustituyente R2 de hidrógeno y R3 puede funcionalizarse adicionalmente en condiciones de acoplamiento cruzado de paladio Suzuki con una base tal como carbonato de potasio, un reactivo borónico adecuado y un catalizador de paladio tal como dicloruro de bis(di-terc-butilfosfino)ferroceno paladio. La reacción puede calentarse en un disolvente tal como DMF a una temperatura de aproximadamente 120 °C para proporcionar compuestos de Fórmula I. El experto reconocerá que existe una diversidad de condiciones útiles para facilitar dichas reacciones de acoplamiento cruzado. Los reactivos de paladio adecuados incluyen XPhos Pd Gen 2, cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(11), tris(dibencilidenacetona)dipaladio (0) con triciclohexilfosfina, cloruro de (1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno)paladio(II), tetraquistrifenilfosfina de paladio o acetato de paladio(II). Las bases adecuadas incluyen carbonato de cesio, carbonato de sodio, carbonato de potasio, terc-butóxido de litio o monohidrato tribásico de fosfato de potasio.

Esquema 2

En el Esquema 2, etapa 1, el sustituyente 3-cloro del compuesto (3) preparado en el Esquema 1, puede desplazarse con un metoxi usando metóxido de sodio a aproximadamente 0 °C en un disolvente tal como MeOH para proporcionar el compuesto (7). En la etapa 2, el sustituyente 5-cloro del compuesto (7) puede después funcionalizarse a sustituyentes de R2 en una reacción de acoplamiento cruzado de paladio Negishi con un catalizador tal como [1,3-bis(difenilfosfino)propano]dicloroniquel(II) y un reactivo de organocinc apropiado en un disolvente tal como hexanos y con calentamiento a aproximadamente 80 °C para proporcionar el compuesto (8). Un experto en la materia estaría familiarizado con los acoplamientos Negishi que implican un acoplamiento cruzado catalizado por metal de transición. La reacción acopla triflatos o haluros orgánicos con compuestos de organocinc formando enlaces carbono-carbono. Comúnmente se usa una especie de paladio (0) como catalizador de metal, pero también puede utilizarse un catalizador de níquel como se ha descrito anteriormente. En la etapa 3, puede usarse un ácido de Lewis fuerte, tal como tribromuro de boro, para desproteger el hidroxi, dando como resultado una 2,3-diona del compuesto (9). En la etapa 4, la cetona en la posición 2 puede clorarse selectivamente usando una fuente de cloro tal como cloruro de tionilo y cloruro de oxalilo en una cantidad catalítica de DMF para proporcionar el compuesto (10). En la etapa 5, el sustituyente cloro en el compuesto (10) puede desplazarse después con la carbohidrazida apropiada con calentamiento a aproximadamente 100 °C en un disolvente tal como THF para proporcionar el compuesto (11). En la etapa 6, el compuesto (11) puede ciclarse después como se describe en el Esquema 1, Etapa 5 para proporcionar compuestos de Fórmula I.

Esquema 3

En el Esquema 3, etapa 1, el sustituyente 2-cloro de una 2,3-dicloro pirazina sustituida (12) puede convertirse en el compuesto (13) de manera análoga al Esquema 1, etapa 3. En el Esquema 3, etapa 2, el compuesto (13) puede convertirse en el compuesto (14) de manera análoga al Esquema 1, etapa 4 con un acoplamiento de amida usando una base tal como DIPEA en un disolvente tal como DCM con un agente de acoplamiento tal como HATU. En el Esquema 3, etapa 3, el compuesto (14) puede ciclizarse de manera análoga al Esquema 1, etapa 5 para proporcionar el compuesto (15). En el Esquema 3, etapa 4, el nitrógeno de la pirazin amida, compuesto (15), se alquila con un R4-haluro usando una base no nucleófila fuerte tal como bis(trimetilsilil)amida de litio en un disolvente tal como DMF y yoduro de potasio sirviendo como catalizador nucleófilo para proporcionar compuestos de Fórmula I. Como alternativa, otras bases, tales como carbonato de cesio o hidruro de sodio, pueden sustituir a la bis(trimetilsilil) amida de litio y la mezcla puede agitarse a temperatura ambiente o calentarse aproximadamente a 60-80 °C. El DMSO puede servir como otro disolvente y el catalizador nucleófilo puede no ser necesario para el éxito de la reacción.

Preparación 1

Clorhidrato de 2-(ciclopropilmetilamino)propanonitrilo

Esquema 1, etapa 1: Se añade acetaldehído (7,89 g, 179,1 mmol) lentamente a una solución de ciclopropanometilamina (10,00 g, 137,7 mmol) en 1,2-dimetoxietano (78,40 ml, 756,4 mmol) a 0 °C y se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de la adición gota a gota de trimetilsililcianuro (20,29 ml, 151,5 mmol). La mezcla de reacción resultante se calienta a 70 °C durante 4 horas y se enfría a temperatura ambiente. La reacción se enfría a 0 °C y se añade HCl (37,893 ml, 151,570 mmol) gota a gota en atmósfera de N2. El precipitado resultante se filtra y se lava con éter (200 ml) para proporcionar el compuesto del título (22,31 g, 97 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8 11,08-11,04 (s a, 1H), 4,42 (c, J = 7,0 Hz, 1H), 3,19 (dd, J= 7,1, 13,0 Hz, 1H), 2,97 (dd, J= 7,8, 12,7 Hz, 1H), 1,95 (d, J= 7,3 Hz, 3H), 1,37-1,29 (m, 1H), 0,81-0,73 (m, 2H), 0,58-0,52 (m, 2H).

Preparación 2

2-(Butilamino)propanonitrilo; clorhidrato

Esquema 1, etapa 1: Una solución de butilamina (6,77 ml, 68,4 mmol) y 2-hidroxipropanonitrilo (7,39 ml, 103 mmol) en THF (68,4 ml) se agita a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentra a presión reducida, se diluye con Et2O y se añade HCl (68 ml, 1,0 mol/l en EtzO) gota a gota. El sólido formado se recoge por filtración para proporcionar el compuesto del título (9,67 g, 86,9 %). RMN de 1H (400 MHz, d6-DMSO) 89,96 (s a, 2H), 4,62 (s a, 1H), 2,96 (t, J = 8 Hz, 2 H), 1,64-1,56 (m, 5H), 1,39-1,30 (m, 2H), 0,885 (t, J = 7,2 Hz, 3H).

Preparación 3

Clorhidrato de 1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida

A una solución agitada de ácido 1-ciclopropilciclopropanocarboxílico (9,63 g, 76,3 mmol) y HATU (32,3 g, 83,2 mmol) en DMF (300 ml) se le añade carbazato de tere-butilo (5,00 g, 37,8 mmol) seguido de DlpEA (14,5 ml, 83,1 mmol), y la reacción se agita a temperatura ambiente durante 5 días. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y se lava con HCl 1,0 N, NaHCO3 saturado y agua. La capa orgánica se aísla, se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra a presión reducida. Se añade 1,4-dioxano (50 ml) al residuo, se añade HCl (4 mol/l) en 1,4-dioxano (100 ml, 400 mmol) durante 20 minutos y la reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución se filtra, la torta de filtración se lava con MTBE y se seca a presión reducida para proporcionar el compuesto del título (8,01 g, 58,7 %). EM (m/z) 141 (M+H).

Preparación 4

Metanosulfonato de (1-metilcidopropil)metilo

Una solución agitada de (1-metilciclopropil)metanol (500 mg, 5,805 mmol) y TEA (0,89 ml, 6,39 mmol) en DCM (30 ml) se enfría a 0 °C en un baño de hielo/agua. Se añade cloruro de metanosulfonilo (0,5 ml, 6,46 mmol) gota a gota a través de una jeringa. Se deja que la mezcla de reacción se caliente a temperatura ambiente; después se agita durante 1 hora. La reacción se diluye con NaHCO3 saturado y se extrae con DCM. Los extractos orgánicos se secan sobre sulfato de sodio anhidro, se filtran y se concentran a presión reducida para proporcionar el compuesto del título (1,00 g, 94 %). RMN de 1H (400 MHz, d6-DMSO) 83,97 (s, 2H), 3,11 (s, 3 H), 1,09 (s, 3H), 0,534-0,509 (m, 2H), 0,404-0,378 (m, 2H).

Preparación 5

3,5-Dicloro-1-(ciclopropilmetil)-6-metil-pirazin-2-ona

Esquema 1, etapa 2: Una solución de 2-(ciclopropilmetilamino)propanonitrilo; clorhidrato (22,31 g, 134,71 mmol) en 1,2-dimetoxietano (216,41 ml; 2,09 moles) se enfría a 0 °C y se añade cloruro de oxalilo (23,37 ml, 269,42 mmol) gota a gota en atmósfera de N2. Después, se deja que la mezcla de reacción alcance la temperatura ambiente y se calienta a 100 °C durante 6 horas. La reacción se enfría a temperatura ambiente y se agita durante la noche. El exceso de cloruro de oxalilo se retira a presión reducida. La mezcla se neutraliza con solución saturada de bicarbonato (100 ml) y se extrae con EtOAc (3 x 350 ml). Los extractos orgánicos se combinan y se lavan con salmuera, se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran a presión reducida para proporcionar material en bruto. El residuo se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc:hexanos para proporcionar el compuesto del título (21,33 g, 67,93 %). EM (m/z) 235 (M+H).

Preparación 6

1-Butil-3,5-dicloro-6-metil-pirazin-2-ona

Esquema 1, etapa 2: Una suspensión agitada de clorhidrato de 2-(butilamino)propanonitrilo (9,67 g, 59,4 mmol) en tolueno (300 ml) se enfría a 0 °C en un baño de hielo/agua. Se añade cloruro de oxalilo (26,0 ml, 299,7 mmol) gota a gota. La reacción se agita a 55 °C durante 16 horas, se enfría a temperatura ambiente y se concentra a presión reducida. El residuo se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice, eluyendo con EtOAc al 0-20 % en hexanos para proporcionar el compuesto del título (14,93 g, >99 %). EM (m/z) 235 (M+H).

Preparación 7

1-Butil-5-cloro-3-metoxi-6-metil-pirazin-2-ona

Esquema 2, etapa 1: Una solución agitada de 1-butil-3,5-didoro-6-metil-pirazin-2-ona (12,61 g, 50,42 mmol) en MeOH (15 ml) se enfría a 0 °C en un baño de hielo/agua. Se añade metóxido de sodio (15 ml, 67 mmol, al 25 % en masa en MeOH) y la mezcla se agita durante 20 minutos. La reacción se diluye con agua, los sólidos se recogen por filtración y se secan a presión reducida para proporcionar el compuesto del título (9,39 g, 80,8 %). EM (m/z) 231 (M+H). Preparación 8

1-Butil-5-etil-3-metoxi-6-metil-pirazin-2-ona

Esquema 2, etapa 2: Se combinan 1-butil-5-cloro-3-metoxi-6-metil-pirazin-2-ona (500 mg, 2,16 mmol) y [1,3-bis(difenilfosfino)propano]dicloroníquel(II) (120 mg, 0,221 mmol) en un vial. El vial se sella en atmósfera de N2, se añaden THF (5,5 ml) y una solución de dietilcinc (6,5 ml, 6,5 mmol, 1 mol/l en hexanos), y la reacción se agita a 80 °C durante la noche. La reacción se enfría a temperatura ambiente, se combina con material preparado esencialmente mediante el mismo método (reacción a escala de 50 mg) y se filtra sobre tierra de diatomeas. La tierra de diatomeas se lava con MTBE y agua, y el filtrado se recoge. El material acuoso se extrae con MTBE (2x), los extractos orgánicos combinados se lavan con salmuera, se secan sobre sulfato de sodio anhidro, se filtran y se concentran a presión reducida. El residuo se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice, eluyendo con EtOAc al 0-70 % en hexanos para proporcionar el compuesto del título (343,1 mg, 64 %, rendimiento combinado). EM (m/z) 225 (M+H).

Preparación 9

4-Butil-6-etil-5-metil-1H-pirazina-2,3-diona

Esquema 2, etapa 3: Una solución agitada de 1-butil-5-etil-3-metoxi-6-metil-pirazin-2-ona (343,1 mg, 1,53 mmol) en DCM (10 ml) se enfría a 0 °C en un baño de hielo/agua. Se añade tribromuro de boro (3 ml, 3 mmol, 1 mol/l en DCM), la reacción se agita durante 2 horas y, después, se calienta a temperatura ambiente y se agita durante 45 minutos. La reacción se interrumpe con NaHCO3 saturado y el extracto acuoso se extrae con ^dC^m(3x). Los extractos orgánicos combinados se lavan con salmuera, se secan sobre sulfato de sodio anhidro, se filtran y se concentran a presión reducida para proporcionar el compuesto del título (320,3 mg, 89 %). EM (m/z) 211 (M+H).

Preparación 10

1-Butil-3-cloro-5-etil-6-metil-pirazin-2-ona

Esquema 2, etapa 4: Una solución de 4-butil-6-etil-5-metil-1H-pirazina-2,3-diona (301,3 mg, 1,29 mmol), cloruro de tionilo (1,0 ml, 13,73 mmol) y DMF catalítica (3 gotas) en DCM (6 ml) se agita a temperatura ambiente durante 45 minutos. Se añade cloruro de tionilo adicional (1,0 ml, 13,73 mmol) y la reacción se agita durante 45 minutos adicionales. La reacción se concentra a presión reducida. El residuo se suspende en tolueno y se concentra a presión reducida (2x) para proporcionar el compuesto del título (475,9 mg, 96,8 %, al 60 % en masa). EM (m/z) 229 (M+H).

Preparación 11

5-Cloro-1-(ciclopropilmetil)-3-hidrazino-6-metil-pirazin-2-ona

Esquema 1, etapa 3: Se añade monohidrato de hidrazina (15,3 ml, 201,3 mmol) gota a gota a una solución de 3,5-dicloro-1-(ciclopropilmetil)-6-metil-pirazin-2-ona (21,33 g, 91,51 mmol) en THF (106,7 ml, 1311 mmol), la mezcla se enfría a 0 °C y se agita durante 15 minutos, después a temperatura ambiente durante 16 horas. Se añade agua (100 ml) y la mezcla se extrae con DCM (300 ml). El extracto orgánico se concentra a presión reducida para proporcionar un sólido de color amarillo que se tritura en Et2O (100 ml) y después se filtra para proporcionar el compuesto del título (0,26 g, 82 %). EM (m/z) 229 (M+H).

Preparación 12

N'-[6-Cloro-4-(ciclopropilmetil)-5-metil-3-oxo-pirazin-2-il]-1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida

Esquema 1, etapa 4: Se añade ácido 1-ciclopropilciclopropanocarboxílico (10,13 g, 80,28 mmol) a una disolución agitada de 5-cloro-1-(ciclopropilmetil)-3-hidrazino-6-metil-pirazin-2-ona (16,69 g, 72,98 mmol) y DIPEA (42,00 ml, 240,8 mmol) en DMF seca (417,3 ml) en atmósfera de N2 a temperatura ambiente, seguido de la adición de hexafluorofosfato de N-[(5-cloro-3-oxido-1H-benzotriazol-1-il)-4-morfolinilmetilen]-N-metilmetanaminio (36,59 g, 80,28 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añade agua (1,4 l) a la mezcla de reacción y se forma un precipitado. La mezcla de reacción se filtra y el sólido aislado se lava con Et2O (1 l) para proporcionar el compuesto del título (16,06 g, 65 %). EM (m/z) 339 (M+H).

Preparación 13

N'-(4-Butil-6-etil-5-metil-3-oxo-pirazin-2-il)-1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida

Esquema 2, etapa 5: Se combinan 1-butil-3-doro-5-etil-6-metil-pirazin-2-ona (475,9 mg, 1,25 mmol, al 60 % en masa), 1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida; clorhidrato (221 mg, 1,25 mmol) y THF (4 ml) en un vial de microondas sellado en atmósfera de N2 y se agita a 100 °C durante 2 horas en condiciones de microondas. La reacción se diluye con agua y se extrae con DCM (3x). Los extractos orgánicos combinados se lavan con salmuera, se secan sobre sulfato de sodio anhidro, se filtran y se concentran a presión reducida para proporcionar el compuesto del título (320,3 mg, 89 %, al 70 % en masa). EM (m/z) 333 (M+H).

Preparación 14

(3-Cloro-5,6-dimetil-pirazin-2-il)hidrazina

Esquema 3, etapa 1: Una solución agitada de 2,3-dicloro-5,6-dimetil-pirazina (2,0 g, 11,298 mmol) e hidrazina (0,943 ml, 28,2 mmol, al 95 % en masa) en EtOH (15 ml) se calienta a 100 °C durante la noche. La mezcla de reacción se concentra a presión reducida para proporcionar el compuesto del título (1,94 g, 84,6 %). EM (m/z) 173 (M+H). Preparación 15

N'-(3-Cloro-5,6-dimetil-pirazin-2-il)-1-ciclopropil-ciclopropanocarbohidrazida

Esquema 3, etapa 2: Se disuelven (3-cloro-5,6-dimetil-pirazin-2-il)hidrazina (4,08 g, 23,6 mmol), ácido 1-ciclopropilciclopropanocarboxílico (4,77 g, 37,8 mmol), HATU (14,7 g, 37,9 mmol) y DIPEA (14,4 ml, 82,6 mmol) en DCM (120 ml) y se agitan a temperatura ambiente durante 45 minutos. La mezcla de reacción se lava con agua, se seca sobre sulfato de sodio y se concentra a presión reducida. El residuo se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice, eluyendo con EtOAc al 0-100 % en hexanos para proporcionar el compuesto del título (4,37 g, 65,8 %). EM (m/z) 280 (M+H).

Los siguientes compuestos se preparan de manera esencialmente análoga al método de la Preparación 15.

Tabla 1

Preparación 18

5-Cloro-3-(1-cidopropilcidopropil)-7-(cidopropilmetil)-6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona

Esquema 1, etapa 5: Se añade N-[6-cloro-4-(ciclopropilmetil)-5-metil-3-oxo-pirazin-2-il]-1-ciclopropilddopropanocarbohidrazida (18,44 g, 54,75 mmoles) a 1,4-dioxano (547,5 ml, 6413 mmol) seguido de la adición de TEA (30,52 ml, 219,0 mmoles) y cloruro de tionilo (7,98 ml, 109,5 mmoles). El reactor se cierra y se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos y, después, se calienta a 80 °C durante dos horas. La reacción se enfría a temperatura ambiente y se añade agua (1 l). La mezcla se extrae con DCM (2 x 750 ml). Los extractos orgánicos se combinan y se secan sobre sulfato de sodio; se filtran y se concentran a presión reducida para proporcionar un residuo. El residuo se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc: hexanos para proporcionar el compuesto del título (9,2 g, 52 %). EM (m/z) 321 (M+H).

Preparación 19

3-(1-Ciclopropilciclopropil)-5,6-dimetil-7H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona

Esquema 3, etapa 3: Se disuelve N'-(3-cloro-5,6-dimetil-pirazin-2-il)-1-ciclopropilciclopropanocarbohidrazida (3,74 g, 7,99 mmol, al 60 % en masa) en ácido acético (15 ml), y se calienta con irradiación de microondas durante 3 horas a 130 °C. La reacción se enfría a temperatura ambiente, los sólidos se recogen por filtración y se lavan con hexanos para proporcionar el compuesto del título (1,98 g, 100 %). EM (m/z) 245 (M+H).

Los siguientes compuestos se preparan de manera esencialmente análoga al método de la Preparación 19.

Ejemplo 1

3-(1-Cidopropilcidopropil)-7-(cidopropilmetil)-6-[(1-metilpirazol-4-il)metil]-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona

Esquema 1, etapa 6: Se añade carbonato de potasio (0,127 g, 0,922 mmol) a la solución de 5-cloro-3-(1-cidopropilcidopropil)-7-(cidopropilmetil)-6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona (0,098 g, 0,307 mmol) y 1-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)pirazol (0,0476 g, 0,229 mmol) en DMF (4,0 ml). La reacción se desgasifica y se purga en atmósfera de N2 durante 10 minutos. Se añade a la reacción dicloruro de 1,1'-bis(di-fercbutilfosfino)ferroceno paladio (0,015 g, 0,022 mmol) y la mezcla se calienta a 120 °C durante 16 horas. La reacción se reparte entre EtOAc y solución saturada fría de NaHCO3, y se separa. La capa orgánica se lava con cloruro de litio al 5 % (acuoso), seguido de salmuera, se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se filtra y se concentra a presión reducida. El residuo se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con acetona al 0-100 % en hexanos para proporcionar el compuesto del título (0,015 mg, 13 %). EM (m/z) 365 (M+H).

Ejemplo 2

3-(1-Ciclopropilciclopropil)-7-(ciclopropilmetil)-5,6-dimetil-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona

Esquema 3, etapa 4: Se añade bis(trimetilsilil)amida de litio (2,5 ml, 2,5 mmol, 1 mol/l en MTBE) a 3-(1-cidopropilcidopropil)-5,6-dimetil-7H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona (202 mg, 0,827 mmol) en DMF (8 ml) y la reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añaden (bromometil)ciclopropano (400 pl, 4 mmol) y yoduro de potasio (15 mg, 0,0909 mmol) y la reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. Se añaden (bromometil)ddopropano (80 pl, 0,8 mmol) y yoduro de potasio (15 mg, 0,0909 mmol), la reacción se agita a temperatura ambiente durante 4 horas y después se agita a 35 °C durante la noche. La reacción se reparte entre EtOAc y agua, y se separa. El material acuoso se extrae con EtOAc. Las capas orgánicas se lavan con cloruro de litio al 5 % (acuoso), seguido de salmuera, se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se filtra y se concentra a presión reducida. El residuo se combina con materiales anteriores preparados esencialmente de la misma manera que la descrita en el Ejemplo Alternativo 2 y se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con MeOH al 0-10 % en DCM. El material aislado se combina con material anterior preparado esencialmente de la misma manera (reacción a escala de 51 mg) y se recristaliza en EtOAc y se seca en estufa de vacío para proporcionar el compuesto del título (140,3 mg, rendimiento combinado del 16 %). EM (m/z) 299 (M+H).

Los siguientes compuestos se preparan de manera esencialmente análoga al método del Ejemplo 2

Ejemplo alternativo 2

Esquema 3, etapa 4: Se combinan 5,6-dimetil-3-(1-metilciclopropil)-7H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona (25 mg, 0,07 mmol), carbonato de cesio (100 mg, 0,31 mmol), yoduro de potasio (3 mg, 0,02 mmol) y bromometilciclopropano (25 pl, 0,26 mmol) en DMF (1 ml). La mezcla se agita en atmósfera de N2 a 80 °C durante la noche. La reacción se enfría a temperatura ambiente y se diluye con EtOAc y se lava con agua (2x). La capa orgánica se lava con cloruro de litio al 5 % (acuoso), se seca sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentra a presión reducida. El residuo se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con MeOH al 0-15 % en DCM para proporcionar el compuesto del título (8 mg, 3,7 %). EM (m/z) 299 (M+H).

Ejemplo 5

7-Butil-3-(1-ciclopropilciclopropil)-5,6-dimetil-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona

Esquema 3, etapa 4: Se añade hidruro de sodio (950 mg, 23,75 mmol, al 60 % en masa en aceite mineral) a 3-(1-cidopropilcidopropil)-5,6-dimetil-7H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona (1,95 g, 7,98 mmol) en DMF (50 ml) a 0 °C. Se añade 1-bromobutano (2,15 ml, 19,9 mmol) y la reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. Después, la reacción se agita a 60 °C durante 2 horas. La reacción se enfría a temperatura ambiente y se diluye con EtOAc. La capa orgánica se lava con salmuera, se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se filtra y se concentra a presión reducida. El residuo se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice, eluyendo con EtOAc al 0-50 % en hexanos y después MeOH al 0-10 % en DCM. Las fracciones cromatográficas que contienen producto se combinan y se concentran a presión reducida. El residuo impuro se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice, eluyendo en EtOAc al 0-100 % en DCM. Las fracciones cromatográficas que contienen producto se combinan, se concentran a presión reducida y se liofilizan para proporcionar el compuesto del título (100 mg, 4,7 %) EM (m/z) 301 (M+H).

Ejemplo 6

3-(1-Ciclopropilciclopropil)-5,6-dimetil-7-(tetrahidropiran-2-ilmetil)-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona racémica

Esquema 3, etapa 4: Se combinan 3-(1-ciclopropilciclopropil)-5,6-dimetil-7H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona (1,95 g, 7,98 mmol), carbonato de cesio (7,75 g, 23,8 mmol), yoduro de potasio (131 mg, 0,789 mmol) y 2-(bromometil)tetrahidro-2H-pirano (1,80 ml, 17,8 mmol) en DMF (66 ml). La mezcla se agita en atmósfera de N2 a 80 °C durante 6 horas. La reacción se enfría a temperatura ambiente y se diluye con cloroformo/isopropanol 3:1. Los extractos orgánicos se lavan con NaHCO3 saturado, seguido de salmuera, se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se filtra y se concentra a presión reducida. El residuo se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice sobre sílice, eluyendo con EtOAc al 0-100 % en hexanos y después MeOH al 0-10 % en DCM para proporcionar el compuesto del título (275 mg, 10 %). EM (m/z) 343 (M+H).

Los siguientes compuestos se preparan de manera esencialmente análoga al método del Ejemplo 6.

Ejemplo 9

3-(1-Cidopropilcidopropil)-5,6-dimetil-7-(tetrahidropiran-2-ilmetil)-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona; Isómero 1 y Ejemplo 10

3-(1-Cidopropilcidopropil)-5,6-dimetil-7-(tetrahidropiran-2-il]metil]-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona; Isómero 2

La 3-(1-cidopropilcidopropil)-5,6-dimetil-7-(tetrahidropiran-2-il]metil]-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona racémica (250 mg, 0,730 mmol) se separa en sus enantiómeros constituyentes mediante cromatografía quiral con las siguientes condiciones: Columna (S,S) Whelk-01 25 cm x 21,2 mm, 10 p; 21 x 250 mm, fase móvil MeOH al 35 %: CO2 al 65 %, temperatura de la columna 40 °C, caudal 5 ml/minuto, UV 225. El primer material de elución se liofiliza para proporcionar el compuesto del título del Ejemplo 9 (95 mg, 38 %), EM (m/z) 343 (M+H), t(R) = 1,81 minutos, ee >99 %. El segundo isómero eluyente se liofiliza para proporcionar el compuesto del título del Ejemplo 10 (95 mg, 38 %), EM (m/z) 343 (M+H), t(R) = 2,62 minutos, ee >99 %.

Ejemplo 11

3-(1-Etilciclopropil)-5,6-dimetil-7-(tetrahidropiran-2-ilmetil)-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona, Isómero 1 y Ejemplo 12

3-(1-Etilciclopropil)-5,6-dimetil-7-(tetrahidropiran-2-ilmetil)-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona; Isómero 2

La 3-(1-etilcidopropil)-5,6-dimetil-7-(tetrahidropiran-2-ilmetil)-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona racémica (564 mg, 1,71 mmol) se separa en sus enantiómeros constituyentes mediante SFC quiral usando las siguientes condiciones: Columna (S,S) Whelk-01 25 cm x 21,2 mm, 10 m, fase móvil EtOH al 40 % CO2 al 75 %, caudal 5 ml/minuto, UV 225 nm, temperatura de la columna 35 °C. El primer material de elución se aísla como el compuesto del título del Ejemplo 11 (262 mg, 46,5 %), EM (m/z) 331 (M+H), t(R) = 1,99 minutos, ee >99 %. El segundo material de elución se aísla como el compuesto del título del Ejemplo 12 (248 mg, 44 %), EM (m/z) 331 (M+H), t(R) = 3,03 minutos, ee >99 %.

Ejemplo 13

5.6- Dimetil-3-(1-metilciclopropil)-7-(tetrahidropiran-2-ilmetil)-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona; Isómero 1 y Ejemplo 14

5.6- Dimetil-3-(1-metilciclopropil)-7-(tetrahidropiran-2-ilmetil)-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona; Isómero 2

La 5,6-dimetil-3-(1-metilciclopropil)-7-(tetrahidropiran-2-ilmetil)-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona racémica (210 mg, 0,664 mmol) se separa en sus enantiómeros constituyentes mediante SFC quiral usando las siguientes condiciones: Columna (S,S) Whelk-01 25 cm x 21,2 mm, 10 m, fase móvil EtOH al 35 %/CO2, caudal 5 ml/minuto, UV 225 nm, temperatura de la columna 40 °C. El primer material de elución se aísla para proporcionar el compuesto del título del Ejemplo 13 (60 mg, 28,6 %), EM (m/z) 317 (M+H), t(R) = 1,84 minutos, ee >99 %. El segundo material de elución se aísla para proporcionar el compuesto del título del Ejemplo 14 (55 mg, 26,2 %), EM (m/z) 317 (M+H), t(R) = 2,65 minutos, ee >99 %.

Ejemplo 15

3-(1-Ciclopropilciclopropil)-5,6-dimetil-7-[(1-metilciclopropil)metil]-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona

Esquema 3, etapa 4: Se combinan 3-(1-ciclopropilciclopropil)-5,6-dimetil-7H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona (350 mg, 1,43 mmol), carbonato de cesio (1,40 g, 4,3 mmol) y metanosulfonato de (1-metilciclopropil)metilo (250 mg, 1,52 mmol) en DMSO (7 ml). La mezcla se agita en atmósfera de N2 a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se diluye con EtOAc y se lava con salmuera. La capa acuosa se extrae con EtOAc y los extractos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de sodio anhidro, se filtran y se concentran a presión reducida. El residuo se purifica mediante cromatografía ultrarrápida de fase inversa sobre C18, eluyendo con ACN al 10-60 % en H2O y se liofiliza para proporcionar el compuesto del título (2 mg, 0,45 %). EM (m/z) 313 (M+H).

Ejemplo 16

7-Butil-3-(1-ciclopropilciclopropil)-5-etil-6-metil-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-8-ona

Esquema 2, etapa 6: Se agita N'-(4-butil-6-etil-5-metil-3-oxo-pirazin-2-il)-1-ciclopropil-ciclopropanocarbohidrazida (576,1 mg, 1,213 mmol, al 70 % en masa) en hexametildisilazano (4 ml) a 120 °C durante la noche. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente, se vierte en MeOH. Tras la adición a MeOH, la mezcla de reacción estalló violentamente. El residuo resultante se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con MeOH al 0-10 % en DCM. El residuo resultante se disuelve en hexametildisilazano (4 ml) y se agita a 120 °C durante la noche. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente, se añade MeOH, la reacción se agita a 50 °C durante 30 minutos y se concentra a presión reducida. El residuo se purifica mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con MeOH al 0-10 % en DCM. El material se purifica adicionalmente mediante cromatografía ultrarrápida de fase inversa sobre C18, eluyendo en ACN al 10-100 % en H2O (bicarbonato de amonio al 0,1 %) para proporcionar el compuesto del título (101,7 mg, 27 %). EM (m/z) 315 (M+H).

Generación de proteínas PDE

Las secuencias de nucleótidos que codifican la PDE1A humana de longitud completa (NP_001003683.1) y PDE1C (NP_005011.1) se insertan en el vector pFastBac1 (Invitrogen) con un marcador HIS N-terminal. Las secuencias de nucleótidos que codifican la PDE4D humana de longitud completa (NP_006194.2) y el dominio catalítico (resto 641 1141) de PDE3A (NP_000912.3) se insertan en el vector pFastBac1 (Invitrogen) con un marcador HIS C-terminal. Las secuencias de nucleótidos que codifican la PDE6A humana de longitud completa (NP_000431.2) y PDE6B (AAH00249.1) se insertan en el vector pFastBacDual (Invitrogen) con un marcador HIS N-terminal y un marcador Flag N-terminal, respectivamente, para la producción del dímero PDE6A/6B. La generación de baculovirus y la expresión de proteínas en células Sf9 se realizan de acuerdo con el protocolo del sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen). La secuencia de nucleótidos que codifica PDE1B (NP_000915.1) humana de longitud completa se inserta en pIEX4 (Novagen) con un marcador HIS C-terminal y ambas producciones de proteínas en células Sf9 se realizan de acuerdo con el protocolo del proveedor (Novagen). Las proteínas PDE marcadas con His se purifican usando agarosa Ni-NTA (Qiagen) seguido de cromatografía de exclusión por tamaño en una columna SUPERDEX® 200 (GE Healthcare) en tampón de almacenamiento (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %). Las proteínas PDE marcadas con Flag incluyendo PDE6A/6B se purifican usando anti-Flag M2-agarosa (Sigma), después de la purificación a través de cromatografía en columna NiNTA y se eluyen en tampón de almacenamiento (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, péptido Flag 0,1 mg/ml). Todas las proteínas purificadas se almacenan a -80 °C en pequeñas alícuotas.

Ensayos enzimáticos de fosfodiesterasa

Todas las actividades de la enzima PDE de nucleótidos cíclicos 3', 5' se miden con un ensayo enzimático radiométrico basado en el sistema de detección de SPA. Los compuestos que han de someterse a ensayo se diluyen en DMSO puro usando curvas de respuesta de concentración de diez puntos. La concentración máxima de compuesto en la mezcla de reacción es 10 o bien 100 pM. Los compuestos a la concentración apropiada se preincuban con cualquiera de las enzimas PDE durante 30 minutos antes de que comience la reacción mediante la adición de sustrato. Se deja que las reacciones se produzcan durante 60 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las reacciones se detienen mediante la adición de perlas SPA. Las muestras se leen 12 horas después en un contador MICROBETA™ TRILUX®. Los valores de CI50 se calculan representando los datos normalizados frente a log [compuesto] y ajustando los datos usando una ecuación logística de cuatro parámetros.

Ensayos enzimáticos de PDE dependiente de Ca2+-calmodulina

La PDE1B, PDE1A y PDE1C se clonan y se purifican siguiendo procedimientos de generación de proteínas convencionales. El tampón de ensayo se prepara para proporcionar una concentración final en el ensayo de Tris-HCl 50 mM, MgClz 50 mM, CaCb 4 mM, BSA al 0,1 % y Calmodulina 6 U/ml en agua, a pH 7,5. La concentración enzimática final es 0,25, 0,074 y 0,0012 nM, para PDE1A, PDE1B y PDE1C, respectivamente. Las reacciones se inician mediante la adición del sustrato, [3H]AMPc, para proporcionar una concentración final de 47 nM.

Potencia in vitro de los compuestos de los Ejemplos contra PDE1A, PDE1B y PDE1C humanas

Tabla 5

Los datos de la Tabla 5 demuestran que los compuestos de los Ejemplos 1-16 inhiben la actividad de las enzimas PDE1A, PDE1B y PDE1C humanas in vitro.

Ensayos enzimáticos de PDE usando [3H]AMPc como sustrato

Las siguientes actividades PDE se miden usando [3H]AMPc como sustrato de reacción: PDE3A humana (dominio catalítico) y PDE4D humana. Ambas enzimas se clonan y se purifican siguiendo procedimientos convencionales. El tampón de ensayo se prepara para proporcionar una concentración final en el ensayo de Tris-HCl 50 mM, MgCb 8,3 mM, EDTA 1,7 mM y BSA al 0,1 % a pH 7,5. Las concentraciones enzimáticas finales son 0,008 y 0,021 nM para PDE3A y PDE4D, respectivamente. Las reacciones se inician mediante la adición del sustrato, [3H]AMPc, para proporcionar una concentración final de 47 nM.

Potencia in vitro de los compuestos de Ejemplos contra la PDE3A (dominio catalítico) y PDE4D humanas Tabla 6

Ensayos enzimáticos de PDE usando [3H]GMPc como sustrato

Las siguientes actividades fosfodiesterasa se miden usando [3H]GMPc como sustrato de reacción: PDE6A/6B humanas. La forma catalítica activa de PDE6 humana es un dímero compuesto por una subunidad a (PDE6A humana) y una subunidad p (PDE6B humana). El dímero de PDE6A/6B humanas se produce mediante la estrategia de coexpresión y purificación, usando dos etapas de purificación, es decir, cromatografía NiNTA y anti-FLAG Sepharose. El tampón de ensayo se prepara para proporcionar una concentración final en el ensayo de Tris-HCl 50 mM, MgClz 8,3 mM, EDTA 1,7 mM y BSA al 0,1 % a pH 7,5. La concentración final de enzima es 5 nM. Las reacciones se inician mediante la adición del sustrato, [3H]GMPc, para proporcionar una concentración final de 80 nM.

Potencia in vitro de los compuestos de Ejemplo contra PDE6AB

Tabla 7

Los datos de las Tablas 5, 6 y 7 demuestran que los compuestos de los Ejemplos 1-16 son inhibidores selectivos de PDE1A, PDE1B y PDE1C humanas con respecto a PDE3A, PDE4D y PDE6AB humanas in vitro.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula:

en donde R1 es metilo, etilo o ciclopropilo;

R2 es hidrógeno, metilo o etilo;

R3 es metilo o

y

R4 es alquilo C2-C4 seleccionado del grupo que consiste en etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, secbutilo, isobutilo, ferc-butilo y ciclobutilo,

o

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R1 es ciclopropilo.

3. El compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde R2 es metilo.

4. El compuesto o sal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde R3 es metilo.

5. El compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es:

6. El compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es:

7. El compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es:

8. El compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es:

9. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en terapia.

10. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de la enfermedad renal crónica.

11. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de la enfermedad renal diabética.

12. Una composición farmacéutica, que comprende un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

13. Un proceso para preparar una composición farmacéutica, que comprende mezclar un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.