ES2941913T3

ES2941913T3 - Composiciones y procedimientos para el direccionamiento eficaz de transgenes

Info

Publication number: ES2941913T3
Application number: ES16879934T
Authority: ES
Inventors: Christine Ellis; Michael Goley; Clayton Larue; Sherry Leclere; Qungang Qi; Aihua Shao; Kwan Thai
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2016-12-19
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2036-12-19
Also published as: EP4219729A3; BR102016029899A2; MX2018007705A; PE20181540A1; UA126554C2; JP2019500060A; JP2022009102A; CN116355928A; CO2018007568A2; RS64091B1; KR20180089518A; WO2017112589A1; RU2751238C2; PL3394272T3; EP4219729A2; CN108463554B; ECSP18054745A; EP3394272A1; CN108463554A; ZA201803723B

Abstract

La invención proporciona construcciones y moléculas de ADN recombinante útiles para proporcionar una localización subcelular transgénica eficiente de proteínas en plantas transgénicas. Se proporcionan además moléculas de ADN recombinante y construcciones para conferir tolerancia o resistencia a herbicidas a las plantas, así como plantas que exhiben tolerancia a herbicidas y métodos para producir o utilizar tales plantas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para el direccionamiento eficaz de transgenes

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 62/270,180, presentada el 21 de diciembre de 2015 y la solicitud provisional estadounidense n.° 62/364,715, presentada el 20 de julio de 2016, que se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad.

Campo de la invención

La invención se refiere generalmente a los campos de la agricultura, biotecnología vegetal y biología molecular. Más específicamente, la invención se refiere a composiciones y procedimientos para producir plantas transgénicas que presentan tolerancia o resistencia a herbicidas.

Incorporación del listado de secuencias

Un formulario legible por computadora de un listado de secuencias se presenta con esta solicitud de manera electrónica y se incorpora en esta solicitud mediante referencia en su totalidad. Este listado de secuencias está contenido en el archivo llamado MONS389US_sequence_listing.txt, que tiene 125.128 kilobytes de tamaño (medido en el sistema operativo MS Windows) y fue creado el 22 de noviembre de 2016.

Descripción de la técnica relacionada

La producción de plantas transgénicas novedosas ofrece el potencial de plantas de cultivo considerablemente mejoradas que presentan rasgos beneficiosos, como mejor tolerancia a herbicidas para permitir mejores estrategias de control de malezas. Sin embargo, si bien las proteínas útiles para producir rasgos beneficiosos en los cultivos son conocidas, la localización subcelular eficaz (conocida como direccionamiento) y el procesamiento de estas proteínas recombinantes en células vegetales transgénicas sigue siendo un obstáculo importante. Por lo tanto, existe una necesidad de péptidos de tránsito novedosos capaces de localizar de manera eficaz proteínas recombinantes dentro de las células vegetales.

Compendio

Un aspecto de la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un péptido de tránsito de cloroplastos (CTP) unido operativamente a una secuencia de ADN que codifica una dicamba monooxigenasa (DMO) o una protoporfirinógeno oxidasa (PPO), donde el CTP comprende una secuencia de SEQ ID NO:1. En determinadas modalidades, la secuencia de ADN que codifica un CTP comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:7-11. En modalidades adicionales, DMO o PPO comprende un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, 20, 40, 43, 50 y 54. En una modalidad, la secuencia de ADN de DMO o PPO comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 30 y 71, 74, 76, 81, 85, 88, 93, 96 y 98. En modalidades específicas, DMO o PPO se define como una proteína con tolerancia a herbicidas que puede conferir tolerancia a herbicidas cuando se expresa en una célula vegetal. En modalidades particulares, la proteína con tolerancia a herbicidas es una proteína DMO y el CTP comprende una secuencia de SEQ ID No:1 o la proteína con tolerancia a herbicidas es una proteína PPO y el CTP comprende una secuencia de SEQ ID No: 1.

En otro aspecto, la invención provee una construcción de ADN que comprende la molécula de ADN recombinante como se describe en la presente unida operativamente a un promotor heterólogo funcional en una célula vegetal.

En aun otro aspecto, la invención provee una planta transgénica, célula vegetal, parte de planta o semilla transformada con una molécula de ADN recombinante de la invención. En modalidades específicas, la planta es una planta monocotiledónea. Las plantas monocotiledóneas que se pueden usar con la invención incluyen, de modo no taxativo, plantas de maíz o trigo. En otra modalidad, la planta es una planta dicotiledónea. Las plantas dicotiledóneas que se pueden usar con la invención incluyen, de modo no taxativo, una planta de soja, algodón o Brassica.

En aun otro aspecto, se provee una molécula de ADN recombinante de la invención que está presente dentro de un material de planta inerte. En un ejemplo, las células vegetales están dentro del alcance de la invención cuando estas contienen una molécula de ADN recombinante de la presente invención. En una modalidad, estas células vegetales pueden ser células vegetales regenerables o pueden ser células vegetales no regenerables que no se pueden regenerar en una planta.

En aun otro aspecto, la invención provee procedimientos para producir productos básicos que comprenden una cantidad detectable de una molécula de ADN recombinante de la invención, incluyendo los productos producidos de ese modo. En determinadas modalidades, los productos básicos provistos por la invención incluyen semillas no viables o partes de estas, tejido de planta deshidratado, tejido de planta congelado, tejido de planta procesado, harina, copos, salvado y fibras. Los productos básicos pueden ser viables o no viables. Los productos básicos no viables incluyen, de modo no taxativo, semillas y granos no viables; semillas procesadas, partes de semillas y partes de plantas; tejido de planta deshidratado, tejido de planta congelado y tejido de planta procesado. Los productos básicos de la invención contienen una cantidad detectable de una molécula de ADN recombinante como se describe en la presente. Los procedimientos para detectar una molécula de ADN recombinante de la invención se conocen en la técnica.

En un aspecto adicional, la invención provee un procedimiento para producir una planta con tolerancia a herbicidas que comprende los pasos de a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN de la invención y b) regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada que comprende la construcción de ADN. En una modalidad del procedimiento, la planta regenerada es tolerante a un herbicida que se selecciona del grupo que consiste en dicamba y un inhibidor de PPO.

En aun otro aspecto, la invención provee un procedimiento para expresar PPO o DMO en una célula vegetal que comprende introducir una molécula de ADN recombinante de la invención en una célula vegetal. En una modalidad de la invención, introducir una molécula de ADN recombinante comprende transformar la célula vegetal.

En otro aspecto, la invención provee un procedimiento para controlar el crecimiento de malezas en un entorno donde crecen cultivos que comprende los pasos de: a) plantar una planta o semilla de la invención en un entorno donde crecen cultivos y b) aplicar al entorno donde crecen cultivos una cantidad de dicamba o un herbicida inhibidor de PPO eficaz para controlar el crecimiento de malezas. En modalidades específicas, la aplicación de herbicida se hace antes o después del brote. En una modalidad, la cantidad de herbicida no daña la planta o semilla. En determinadas modalidades del procedimiento, la planta o semilla es una planta o semilla monocotiledónea, como una planta o semilla de maíz o trigo. En otras modalidades, la planta o semilla es una planta o semilla dicotiledónea, como una planta de soja, algodón o Brassica. En modalidades adicionales, el herbicida es dicamba o un inhibidor de PPO.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Plantas de maíz transgénico F1 que expresan H_N10 (SEQ ID NO:43) unido operativamente a APG6 (SEQ ID NO:1) o 12G088600TP (SEQ ID NO:38) después del tratamiento con aplicación de herbicida de 0,036 libras ai/acre de S-3100 aplicado en V2 seguido de V4 seguido de V8.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoácidos de Arabidopsis thaliana albino y CTP verde pálido (APG6).

SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos de una variante optimizada en el extremo amino de APG6 CTP de SEQ ID NO:1.

SEQ ID NO:3 es la secuencia de aminoácidos de CTP de la proteína de choque de calor Arabidopsis thaliana de 90 kDa (CR88).

SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos de Ph.ShkG-CTP4 CTP.

SEQ ID NO:5 es la secuencia de aminoácidos de Ps.RbcS-3C CTP.

SEQ ID NO:6 es la secuencia de aminoácidos de Os.Waxy CTP.

SEQ ID NO:7-11 son secuencias de ácidos nucleicos que codifican APG6 CTP de SEQ ID NO:1 optimizado para la expresión de monocotiledóneas o dicotiledóneas.

SEQ ID NO:12 es la secuencia de ácidos nucleicos que codifica APG6 CTP de SEQ ID NO:2.

SEQ ID NO:13 y 14 son secuencias de ácidos nucleicos que codifican At.CR88 CTP optimizado para la expresión de dicotiledóneas o monocotiledóneas, respectivamente.

SEQ ID NO:15-17 son secuencias de ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO:4-6, respectivamente.

SEQ ID NO:18-27 son secuencias de ácidos nucleicos que codifican variantes de dicamba monooxigenasa (DMO). SEQ ID NO:28-37 son secuencias de ácidos nucleicos que codifican variantes de DMO de SEQ ID NO:18-27, respectivamente.

SEQ ID NO:38 es la secuencia de aminoácidos del péptido de tránsito de cloroplastos de algodón 12G088600TP optimizado para la expresión de dicotiledóneas.

SEQ ID NO:39 son secuencias de ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO:38.

SEQ ID NO:40 es la secuencia de aminoácidos de H_N90.

SEQ ID NO:41 es la secuencia de aminoácidos de H_N20.

SEQ ID NO:42 es la secuencia de aminoácidos de H N60.

SEQ ID NO:43 es la secuencia de aminoácidos de H_N10.

SEQ ID NO:44 es la secuencia de aminoácidos de H_N30.

SEQ ID NO:45 es la secuencia de aminoácidos de H_N40.

SEQ ID NO:46 es la secuencia de aminoácidos de H_N50.

SEQ ID NO:47 es la secuencia de aminoácidos de H_N70.

SEQ ID NO:48 es la secuencia de aminoácidos de H_N100.

SEQ ID NO:49 es la secuencia de aminoácidos de H_N110

SEQ ID NO:50-56 son secuencias de aminoácidos que no tienen la metionina de partida que corresponde a SEQ ID NO:40, 41, 43, 44, 45, 46 y 48, respectivamente.

SEQ ID NO:57-58 son variantes de aminoácidos de SEQ ID NO:50.

SEQ ID NO:59 es una variante de aminoácido de SEQ ID NO:56.

SEQ ID NO:60 es la secuencia de aminoácidos de la protoporfirinógeno oxidasa de Amaranthus tuberculatus (cáñamo de agua) (WH_PPO).

SEQ ID NO:61-70 son secuencias de nucleótidos que codifican SEQ ID NO:40-49, respectivamente, con codones optimizados para la expresión de E. coli.

SEQ ID NO:71-80 son secuencias de nucleótidos que codifican SEQ ID NO:40-49, respectivamente, con codones optimizados para la expresión de dicotiledóneas.

SEQ ID NO:81-87 son secuencias de nucleótidos que codifican SEQ ID NO:50-56, respectivamente, con codones optimizados para la expresión de dicotiledóneas.

SEQ ID NO:88 y 91 son variantes de nucleótidos de SEQ ID NO:50 y 51, respectivamente.

SEQ ID NO:89, 90 y 92 son secuencias de nucleótidos que codifican SEQ ID NO:57-59, respectivamente.

SEQ ID NO:93-102 son secuencias de nucleótidos que codifican SEQ ID NO:40-49, respectivamente, con codones optimizados para la expresión de monocotiledóneas.

Descripción detallada

Los péptidos de tránsito de cloroplastos (CTP) para localizar proteínas con tolerancia a herbicidas dentro de las células se conocen en la técnica, pero el grado de localización y procesamiento subcelular eficaz para cualquier combinación de CTP y proteína con tolerancia a herbicidas es difícil de predecir. La localización y el procesamiento determinan el nivel de expresión y función de una proteína con tolerancia a herbicidas y por lo tanto afecta el fenotipo de tolerancia a herbicidas de una célula, planta o semilla transgénica que comprende la proteína. Se han evaluado varios CTP con proteínas con tolerancia a herbicidas útiles incluyendo dicamba monooxigenasas (DMO) y protopofirinógeno oxidasas (PPO) en plantas transgénicas. Sin embargo, con frecuencia se ven procesamientos y localizaciones pobres o incompletos de la proteína.

La invención supera estos obstáculos al proveer moléculas de ADN recombinante novedosas capaces de proveer una mejor localización y procesamiento de cloroplastos, así como composiciones y procedimientos para usarlas. Las moléculas de ADN recombinante de la invención comprenden una secuencia de ADN que codifica un CTP unido operativamente a DMO o PPO. Las moléculas de ADN recombinante de la invención proveen la localización de protoplastos de DMO o PPO y mejor tolerancia a dicamba o herbicida de PPO en plantas que comprenden las moléculas de ADN recombinante.

En determinadas modalidades, la invención provee moléculas de ADN recombinante que comprenden una secuencia de ADN que codifica un CTP de SEQ ID NO:1 unida operativamente a una secuencia de ADN que codifica una proteína con tolerancia a herbicidas. En algunas modalidades, la invención provee moléculas de ADN recombinante que comprenden secuencias de ADN que codifican CTP con una secuencia de SEQ ID No:1-, unida operativamente a una secuencia de ADN que codifica una proteína DMO seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:18 y 20. En modalidades adicionales, la invención provee moléculas de ADN recombinante que comprenden secuencias de ADN que codifican CTP con una secuencia de SEQ ID No:1, unida operativamente a una secuencia de ADN que codifica una proteína PPO, tal como una proteína PPO con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:40, 43, 50 y 54.

Moléculas de ADN recombinante

Tal como se utiliza en la presente, el término “recombinante” se refiere a un ADN, polipéptido, proteína, célula, semilla o planta no natural que es el resultado de modificación genética y, como tal, normalmente no se encontraría en la naturaleza y fue creado por intervención del ser humano. Una “molécula de ADN recombinante” es una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que no se produce de forma natural y que es el resultado de la intervención humana, por ejemplo una molécula de ADN compuesta por una combinación de al menos dos moléculas de ADN heterólogas entre sí. Un ejemplo de una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN que codifica un CTP de SEQ ID No:1 unida operativamente a una secuencia de ADN que codifica una proteína DMO que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:18 y 20. Se proporcionan ejemplos de proteínas DMO en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1. Dicamba Monooxigenasas (DMO)

Otro ejemplo de una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN que codifica un CTP que comprende una secuencia de SEQ ID No:1 unida operativamente a una secuencia de ADN que codifica una proteína ^pP^oque comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:40, 43, 50 y 54. Una célula, semilla o planta recombinante es una célula, semilla o planta que comprende ADN transgénico, por ejemplo, una célula, semilla, planta o parte de planta transgénica que comprende una molécula de ADN recombinante de la invención. Se proporcionan ejemplos de proteínas PPO en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2. Protoporfirinógeno oxidasas (PPO)

Los ejemplos de secuencias de CTP que se pueden usar de acuerdo con la invención se proporcionan en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3. Péptidos de tránsito de cloroplastos (CTP)

Tal como se usa en la presente, el término “molécula de ADN aislada” significa que una molécula de ADN está presente sola o en combinación con otras composiciones pero que no está dentro de su entorno natural. Por ejemplo, una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia codificante de proteínas y secuencia de CTP heteróloga es una molécula de ADN aislada cuando está presente en el genoma de una planta, célula o semilla transgénica debido a que los componentes de esa molécula de ADN recombinante no están en su entorno natural (es decir, el genoma del organismo en el que cada componente se observó por primera vez). Una molécula de ADN recombinante presente en el genoma de una planta transgénica es una molécula de ADN aislada siempre que la molécula de ADN recombinante no se encontrara naturalmente en el genoma de esa planta y por lo tanto esté aislada de su entorno natural.

Tal como se utiliza en la presente, el término “modificación genética” se refiere a la creación por intervención humana de un ADN, proteína u organismo que normalmente no se encontraría en la naturaleza. Se puede utilizar modificación genética para producir un ADN, polipéptido, proteína, célula, semilla o planta que se concibió y se creó en el laboratorio utilizando una o más técnicas de biotecnología, tal como biología molecular, bioquímica de proteína, transformación bacteriana y transformación de plantas. Por ejemplo, la modificación genética se puede usar para crear un gen quimérico que comprende una molécula de ADN que codifica un CTP que comprende SEQ ID No:1, unida operativamente a una proteína DMO que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID No:18 y 20, y opcionalmente también puede comprender un promotor heterólogo funcional en una célula vegetal. En otro ejemplo, la modificación genética se puede usar para crear un gen quimérico que comprende una molécula de ADN que codifica un CTP de SEQ ID No:1, unida operativamente a una proteína PPO que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en s Eq ID No:40, 43, 50 y 54, y opcionalmente también puede comprender un promotor heterólogo funcional en una célula vegetal. Este gen quimérico se puede producir usando una o más de las técnicas de biología molecular, como clonación de genes, ligadura de ADN y síntesis de ADN.

El término "transgén" se refiere a una molécula de ADN incorporada artificialmente en el genoma de un organismo debido a la intervención humana, por ejemplo, procedimientos de transformación de plantas. Como se usa en la presente, el término "transgénico" se refiere a que comprende un transgén, por ejemplo, una "planta transgénica" se refiere a una planta que comprende un transgén en su genoma y un "rasgo transgénico" se refiere a una característica o fenotipo portado u obtenido por la presencia de un transgén incorporado en el genoma de la planta. Debido a dicha alteración genómica, la planta transgénica es algo claramente diferente de la planta silvestre relacionada y el rasgo transgénico es un rasgo que no se encuentra naturalmente en la planta silvestre. Las plantas transgénicas de la invención comprenden las moléculas de ADN recombinante proporcionadas por la invención.

Tal como se utiliza en la presente, el término “heterólogo” se refiere a la relación entre dos o más materiales derivados de diferentes fuentes y, por ende, no asociados normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína DMO es heteróloga con respecto a un CTP unido operativamente si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza. En otro ejemplo, una molécula de ADN recombinante que codifica un CTP unido operativamente a una proteína DMO es heteróloga respecto a un promotor unido operativamente que es funcional en una célula vegetal si tal combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza. Una molécula de ADN recombinante particular también puede ser heteróloga con respecto a una célula, semilla u organismo en el cual se inserta cuando no se produce naturalmente en esa célula, semilla u organismo particular.

Tal como se usa en la presente, el término “molécula de ADN codificante de proteína” o “molécula de ADN codificante de polipéptido” se refiere a una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína o polipéptido, como una proteína o polipéptido para conferir tolerancia a herbicidas o control de insectos. Una “secuencia codificante de proteínas” o “secuencia codificante de polipéptidos” significa una secuencia de ADN que codifica una proteína o polipéptido. Una “secuencia” significa una disposición secuencial de nucleótidos o aminoácidos. Los límites de una secuencia codificante de proteínas o una secuencia codificante de polipéptidos se pueden determinar generalmente por un codón de inicio de traducción en el extremo 5' y un codón de detención de traducción en el extremo 3'. Una molécula codificante de proteínas o molécula codificante de polipéptidos puede comprender una secuencia de ADN codificante de una secuencia de proteínas o polipéptidos. Tal como se utilizan en la presente, “expresión transgénica”, “expresar un transgén”, “expresión de proteínas”, “expresión de polipéptidos”, “expresar una proteína” y “expresar un polipéptido” significan la producción de una proteína o un polipéptido a través del procedimiento de transcripción de una molécula de ADN en ARN mensajero (ARNm) y traducción del ARNm en cadenas polipeptídicas, que en última instancia se pueden plegar en proteínas. Una molécula de ADN codificante de proteínas o molécula de ADN codificante de polipéptidos puede estar unida operativamente a un promotor heterólogo en una construcción de ADN para su uso en la expresión de la proteína o polipéptido en una célula transformada con la molécula de ADN recombinante. Tal como se utiliza en la presente, “unidas operativamente” se refiere a dos moléculas de ADN unidas de tal manera que una puede afectar la función de la otra. Las moléculas de ADN unidas operativamente pueden ser parte de una molécula contigua simple y pueden ser adyacentes o no. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una molécula de ADN codificante de proteínas o una molécula de ADN codificante de polipéptidos en una construcción de ADN donde las dos moléculas de ADN están dispuestas de tal manera que el promotor puede afectar la expresión del transgén.

Las moléculas de ADN recombinante de la invención incluyen una secuencia de ADN codificante de un DMO unido operativamente a una secuencia de CTP. Tal como se usa en la presente, “dicamba monooxigenasa” o “DMO” se refiere a una oxigenasa capaz de catalizar enzimáticamente la degradación de dicamba (ácido 3,6-dicloro-o-anísico) a ácido 3,6-diclorosalicílico (3,6-DCSA), como la dicamba monooxigenasa codificada por el gen de demetilasa (dmo) de Stenotrophomonas maltophilia. Las dicamba monooxigenasas se conocen en la técnica e incluyen las secuencias de proteínas provistas como SEQ ID No:18-27 e identificadas en la Tabla 1.

Las moléculas de ADN recombinante de la invención incluyen una secuencia de ADN que codifica un PPO unido operativamente a una secuencia de CTP. Como se usa en la presente, “protoporfirinógeno oxidasa” o “PPO” se refiere a una oxidasa capaz de convertir enzimáticamente protoporfirinógeno IX en protoporfirina IX. Las protoporfirinógeno oxidasas se conocen en la técnica e incluyen las secuencias de proteínas provistas como SEQ ID No:40, 43, 50 y 54 e identificadas en la Tabla 2.

Las moléculas de ADN recombinante de la invención incluyen una secuencia de ADN codificante de una secuencia de CTP unida operativamente a las moléculas de ADN codificantes de la proteína provistas por la invención, por lo cual el CTP facilita la localización de la molécula de proteína recombinante dentro de la célula. Los CTP también se conocen en la técnica como secuencias de señal, secuencias de direccionamiento, péptidos de direccionamiento y secuencias de localización. Los cloroplastos también se conocen en la técnica como plástidos. Al facilitar la localización de proteínas en la célula, el CTP asegura la localización de una proteína al cloroplasto para actividad enzimática óptima y puede aumentar la acumulación de proteína recombinante y proteger la proteína de la degradación proteolítica. Luego de la translocación en el cloroplasto, el CTP se escinde típicamente de la proteína, también denominado procesamiento. El procesamiento de CTP puede ser completo (es decir, el CTP completo se escinde del extremo amino terminal de la proteína), incompleto (es decir, uno o más aminoácidos del CTP permanecen en el extremo amino terminal de la proteína) o resultar en la remoción de uno o más aminoácidos del extremo amino terminal de la proteína. El procesamiento completo del CTP de una proteína DMO aumenta el nivel de acumulación de proteína, aumentando así la tolerancia a dicamba y reduciendo los niveles de lesión en la célula, semilla u organismo transgénico luego de la aplicación de herbicida. Los CTP se proveen como SEQ ID NO:1-6 y 38 y se identifican en la Tabla 3. La secuencia de ADN codificante de cada CTP, optimizada por la expresión en dicotiledóneas y monocotiledóneas, se provee como SEQ ID NO:7-11.

Las moléculas de ADN recombinante de la presente descripción se pueden sintetizar y modificar a través de procedimientos conocidos en la técnica, ya sea completamente o en parte, especialmente donde es deseable proporcionar secuencias útiles para la manipulación de ADN (tal como la restricción de sitios de reconocimiento de enzimas o sitios de clonación basada en recombinación), secuencias preferidas de plantas (tal como uso de codón de planta o secuencias de consenso Kozak) o secuencias útiles para el diseño de construcciones de ADN (tales como secuencias espaciadoras o enlazadoras). Las moléculas de ADN recombinante de esta descripción incluyen secuencias de ADN degeneradas que codifican la misma secuencia de aminoácidos que una secuencia de ADN provista en la presente. Las secuencias de ADN degeneradas se pueden hacer usando procedimientos conocidos en la técnica y la tabla de codones de ADN.

Tal como se utiliza en la presente, una “construcción de ADN” es una molécula de ADN recombinante que comprende dos o más secuencias de ADN heterólogo. Las construcciones de ADN son útiles para la expresión transgénica y pueden estar comprendidas en vectores y plásmidos. Las construcciones de ADN se pueden utilizar en vectores para la transformación, es decir, la introducción de ADN heterólogo en una célula hospedadora, para producir plantas y células transgénicas, y como tal también pueden estar comprendidas en el ADN plástido o ADN genómico de una planta, semilla, célula o parte de planta transgénica. Tal como se utiliza en la presente, un “vector” significa cualquier molécula de ADN recombinante que se puede utilizar para la transformación de plantas. Las moléculas de ADN recombinante establecidas en el listado de secuencias, por ejemplo, se pueden insertar en un vector como parte de una construcción que tiene la molécula de ADN recombinante unida operativamente a un elemento de expresión génica que funciona en una planta para afectar la expresión de la proteína codificada por la molécula de ADN recombinante. Los procedimientos para construir vectores y construcciones de ADN se conocen en la técnica. Los componentes de una construcción de ADN, o un vector que comprende una construcción de ADN, generalmente incluyen uno o más elementos de expresión génica unidos operativamente a una secuencia de ADN que se puede transcribir, por ejemplo los siguientes: un promotor para la expresión de un ADN unido operativamente, una molécula de ADN codificante de proteínas unida operativamente y una región no traducida 3'. Los elementos de expresión génica útiles en la práctica de la invención incluyen, entre otros, uno o más de los siguientes tipos de elementos: promotor, región no traducida 5', potenciador, líder, elemento que actúa en cis, intrón, región no traducida 3' y uno o más transgenes marcadores seleccionables.

Las construcciones de ADN de la invención pueden incluir un promotor unido operativamente a una molécula de ADN codificante de proteínas proporcionada por la invención, por la cual el promotor dirige la expresión de la molécula de proteína recombinante. Los promotores útiles para la práctica de la invención incluyen los que funcionan en una célula para la expresión de un polinucleótido unido operativamente, por ejemplo un promotor bacteriano o vegetal. Los promotores vegetales son variados y conocidos en la técnica e incluyen los que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos, regulados temporalmente, regulados espacialmente y/o regulados espacio-temporalmente.

Tal como se usa en la presente, “control negativo” y “control positivo” se refieren a un control experimental diseñado con fines de comparación. Por ejemplo, un control negativo o control positivo en un análisis de una planta transgénica puede ser una planta del mismo tipo que la planta experimental (es decir, la planta a evaluarse) pero no contiene el inserto transgénico, la molécula de ADN recombinante o construcción de ADN de la planta experimental. Un ejemplo de una planta útil para comparación con plantas de maíz transgénico es maíz LH244 no transgénico (patente estadounidense n.° 6,252,148), o maíz 01DKD2 no transgénico (patente estadounidense n.° 7,166,779), para compararse con plantas de soja transgénicas: soja A3555 no transgénica (patente estadounidense n.° 7,700,846), o soja A3244 no transgénica (patente estadounidense n.° 5,659,114, PVP 9600246), para compararse con canola transgénica o plantas Brassica napus: Brassica napus no transgénica variedad 65037 línea Restorer, para compararse con plantas de trigo transgénico: trigo no transgénico variedad Samson germoplasmo (PVP 1994), y para compararse con plantas de algodón transgénico: DP393 no transgénico (patente estadounidense n.° 6,930,228 PVP 200400266).

Plantas transgénicas

Un aspecto de la invención incluye células vegetales transgénicas, tejidos de plantas transgénicas, plantas transgénicas y semillas transgénicas que comprenden las moléculas de ADN recombinante proporcionadas por la invención. Estas células, tejidos, plantas y semillas que comprenden las moléculas de ADN recombinante presentan tolerancia a herbicidas.

La inserción de ADN transgénico (conocido como “transgén”) en el genoma de una planta se puede lograr por el acto de transformación vegetal y resulta en la creación de una nueva secuencia molecular genómica transgénica, conocida como “evento”. Cada evento es único y la secuencia de ADN del evento es específica para el evento. Los procedimientos adecuados para la transformación de células vegetales hospedadoras para su uso con la presente invención incluyen prácticamente cualquier procedimiento a través del cual se puede introducir ADN en una célula (por ejemplo, cuando una construcción de ADN recombinante está integrada en forma estable en un cromosoma de planta) y son conocidos en la técnica. Una construcción de ADN recombinante insertada en los procedimientos de ejemplo para introducir una construcción de ADN recombinante en plantas incluye el sistema de transformación de Agrobacterium y el bombardeo de partículas de ADN, ambos de los cuales se conocen por los expertos en la técnica. Otro ejemplo de procedimiento para introducir una construcción de ADN recombinante en plantas es la inserción de una construcción de ADN recombinante en un genoma de planta en un sitio predeterminado a través de procedimientos de integración dirigida al sitio. La integración dirigida al sitio se puede lograr mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de nucleasas de dedos de cinc, meganucleasas modificadas genéticamente o naturales, TALE-endonucleasas, o una endonucleasa guiada por ARN (por ejemplo, un sistema CRISPR/Cas9). Las plantas transgénicas se pueden regenerar a partir de una célula vegetal transformada mediante los procedimientos de cultivo de células vegetales. Una planta transgénica homocigota con respecto a un transgén (es decir, dos copias alélicas del transgén) se puede obtener mediante autopolinización (autofecundación) de una planta transgénica que contiene un único alelo de transgén consigo misma, por ejemplo, una planta R0, para producir semillas R1. Un cuarto de la semilla R1 producida será homocigota con respecto al transgén. Las plantas cultivadas a partir de la germinación de semilla R1 se puede evaluar para detectar la cigosidad, típicamente utilizando un ensayo SNP, una secuenciación de ADN o un ensayo de amplificación térmica que permite la distinción entre heterocigotas y homocigotas, denominado ensayo de cigosidad.

Las plantas, semillas, partes de plantas, tejidos de plantas y células provistas por la invención pueden presentar tolerancia a herbicidas a dicamba. Dicamba se puede aplicar a un área de cultivo de plantas que comprende las plantas y semillas proporcionadas por la invención como un procedimiento para controlar malezas, incluyendo prevenir el crecimiento de malezas. Las plantas y semillas proporcionadas por la invención comprenden un rasgo de tolerancia a herbicidas y, como tal, son tolerantes a la aplicación de dicamba. La aplicación de herbicida puede ser la tasa comercial recomendada (1X) o cualquier fracción o múltiplo de la misma, por ejemplo, dos veces la tasa comercial recomendada (2X). Las tasas de aplicación de dicamba se pueden expresar como un equivalente ácido por libra por acre (libra ae/acre) o equivalente ácido por gramo por hectárea (g ae/ha). El área de cultivo de plantas puede comprender o no plantas de malezas en el momento de la aplicación de herbicida. Una dosis eficaz como herbicida de dicamba para su uso en un área para controlar malezas puede consistir en un intervalo de entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 30X tasas de etiqueta durante una temporada de cultivo. La tasa de etiqueta 1X de dicamba es de 0,5 libra ae/acre. Las tasas de herbicidas se pueden convertir entre unidades inglesas y métricas de la siguiente manera: (libra ai/ac) *1,12 = (kg ai/ha) y (kg ai/ha) *0,89 = (libra ai/ac).

Las plantas, semillas, partes de plantas, tejidos de plantas y células pueden presentar tolerancia a uno o más inhibidores de PPO, denominados herbicidas de PPO. Uno o más herbicidas de PPO se pueden aplicar a un área de cultivo de plantas que comprende las plantas y semillas proporcionadas por la invención como un procedimiento para controlar malezas, incluyendo prevenir el crecimiento de malezas. Las plantas y semillas proporcionadas por la invención comprenden un rasgo de tolerancia a herbicidas y, como tal, son tolerantes a la aplicación de uno o más herbicidas de PPO. La aplicación de herbicidas puede ser la tasa comercial recomendada (1X) o cualquier fracción o múltiplo de la misma, por ejemplo, dos veces la tasa comercial recomendada (2X). El área de cultivo de plantas puede comprender o no plantas de malezas en el momento de la aplicación de herbicida. Una dosis eficaz como herbicida de PPO para su uso en un área para controlar malezas puede consistir en un intervalo de entre aproximadamente 0,1X y aproximadamente 30X tasas de etiqueta durante una temporada de cultivo. Los herbicidas de PPO son conocidos en la técnica y se encuentran disponibles a nivel comercial. Los ejemplos de herbicidas de PPO incluyen, de modo no taxativo, difeniléteres (como acifluorfén, sus sales y ésteres, aclonifén, bifenox, sus sales y ésteres, etoxifén, sus sales y ésteres, fluoronitrofén, furiloxifén, halosafén, clometoxifén, fluoroglicofén, sus sales y ésteres, lactofén, sus sales y ésteres, oxifluorfén, y fomesafén, sus sales y ésteres); tiadiazoles (por ejemplo flutiacet-metilo y tidiazimina); pirimidindionas o feniluracilos (por ejemplo, benzfendizona, butafenacil, [3-2-cloro-4-fluoro-5-(1-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidin-3-il)fenoxi]-2-piridiloxi]acetato de etilo (número de registro CAS 353292-31-6 y denominado en la presente S-3100), flupropacilo, saflufenacilo y tiafenacilo); fenilpirazoles (por ejemplo, fluazolato, piraflufén y piraflufén-etilo); oxadiazoles (por ejemplo, oxadiargilo y oxadiazon); triazolinonas (por ejemplo, azafenidin, bencarbazona, carfentrazona, sus sales y ésteres y sulfentrazona); oxazolidindionas (por ejemplo, pentoxazona); N-fenilftalimidas (por ejemplo, cinidon-etilo, flumiclorac, flumiclorac-pentilo y flumioxazin); derivados de benzoxazinona (por ejemplo, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-trifluoro-3,4-dihidro-3-oxo-4-prop-2-inil-2H-1,4-benzoxazin-6-il)-1,3,5-triazinana-2,4-diona); flufenpir y flufenpir-etilo; piraclonil; y profluazol.

Las aplicaciones de herbicida se pueden mezclar secuencialmente o en tanques con uno, dos o una combinación de varios herbicidas o cualquier otro herbicida compatible. Se pueden utilizar múltiples aplicaciones de un herbicida o de dos o más herbicidas, en combinación o solos, durante una temporada de cultivo en áreas que comprenden las plantas transgénicas de la invención para el control de un amplio espectro de malezas dicotiledóneas, malezas monocotiledóneas o ambas, por ejemplo, dos aplicaciones (por ejemplo, una aplicación antes de la siembra y una aplicación después del brote, o una aplicación antes del brote y una aplicación después del brote) o tres aplicaciones (por ejemplo, una aplicación antes de la siembra, una aplicación antes del brote y una aplicación después del brote, o una aplicación antes del brote y dos aplicaciones después del brote).

Tal como se utiliza en la presente, “tolerancia” o “tolerancia a herbicidas” significa la capacidad de una planta, semilla o célula de resistir los efectos tóxicos de un herbicida cuando se aplica. La tolerancia a herbicidas de una planta, semilla, tejido de planta, parte de planta o célula se puede medir comparando la planta, semilla, tejido de planta, parte de planta o célula a un control experimental adecuado. Por ejemplo, la tolerancia a herbicidas se puede medir o evaluar aplicando un herbicida a una planta que comprende una molécula de ADN recombinante que codifica una proteína capaz de conferir tolerancia a herbicidas (la planta de prueba) y una planta de la misma especie que no comprende la molécula de ADN recombinante que codifica la proteína capaz de conferir tolerancia a herbicidas (la planta de control negativo) y luego comparando la lesión de planta de ambas plantas, donde la tolerancia a herbicidas de la planta de prueba se indica por una menor velocidad de lesión en comparación con la velocidad de lesión de la planta de control negativo. Una planta, semilla, tejido de planta, parte de planta o célula tolerante a herbicidas presenta una menor respuesta a los efectos tóxicos de un herbicida al compararla con una planta, semilla, tejido de planta, parte de planta o célula de control negativo. Tal como se utiliza en la presente, un “rasgo de tolerancia a herbicidas” es un rasgo transgénico que imparte tolerancia a herbicidas mejorada a una planta en comparación con la planta de control negativo.

Las plantas, progenie, semillas, células vegetales y partes de plantas transgénicas de la invención también pueden contener uno o más rasgos transgénicos adicionales. Los rasgos transgénicos adicionales pueden ser introducidos mediante el cruzamiento de una planta que contiene un transgén que comprende las moléculas de ADN recombinante proporcionadas por la invención con otra planta que contiene uno o más rasgos transgénicos adicionales. Tal como se utiliza en la presente, “cruza” significa la reproducción de dos plantas individuales para producir una planta progenie. Por lo tanto, se pueden cruzar dos plantas transgénicas para producir progenie que contiene los rasgos transgénicos. Tal como se utiliza en la presente, “progenie” significa la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora, y la progenie transgénica comprende una construcción de ADN proporcionada por la invención y heredada de al menos una planta progenitora. De manera alternativa, uno o más rasgos transgénicos adicionales se pueden introducir mediante la transformación conjunta de una construcción de ADN para esos rasgos transgénicos adicionales con una construcción de ADN que comprende las moléculas de ADN recombinante proporcionadas por la invención (por ejemplo, con todas las construcciones de ADN presentes como parte del mismo vector utilizado para la transformación de plantas) o mediante la inserción de los rasgos adicionales en una planta transgénica que comprende una construcción de ADN proporcionada por la invención o viceversa (por ejemplo, mediante el uso de cualquiera de los procedimientos de transformación de plantas en una planta o célula vegetal transgénica). Dichos rasgos transgénicos adicionales incluyen, de modo no taxativo, mayor resistencia a insectos, mayor eficacia del uso del agua, mayor rendimiento, mayor resistencia a las sequías, mayor calidad de semilla, mayor calidad nutricional, producción de semillas híbridas y tolerancia a herbicidas, donde el rasgo se mide con respecto a una planta silvestre. Dichos rasgos transgénicos adicionales son conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, y el Servicio de Inspección de Salud Animal y Vegetal (APHIS) del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) proporciona una lista de dichos rasgos.

Las plantas y progenie transgénicas que contienen un rasgo transgénico proporcionado por la invención se pueden utilizar con cualquier procedimiento de reproducción conocido comúnmente en la técnica. En las líneas de plantas que comprenden dos o más rasgos transgénicos, los rasgos transgénicos se pueden segregar o unir independientemente, o una combinación de ambos, en líneas de plantas que comprenden tres o más rasgos transgénicos. Se contemplan también el retrocruzamiento a una planta progenitora y el cruzamiento con una planta no transgénica, como en el caso de la propagación vegetativa. Las descripciones de los procedimientos de reproducción que se utilizan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos son conocidas por los expertos en la técnica. Para confirmar la presencia de uno o más transgenes en una planta o semilla particular, se pueden realizar diversos ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos de biología molecular, por ejemplo, transferencia Southern y Northern, PCR y secuenciación de ADN; ensayos bioquímicos, por ejemplo, detección de la presencia de un producto de proteína, por ejemplo, a través de medios inmunológicos (ELISA o transferencias Western) o a través de función enzimática; ensayos de partes de plantas, por ejemplo, ensayos de hojas o raíces; y además, a través del análisis del fenotipo de la planta completa. Para analizar el procesamiento de CTP en una planta o semilla transgénica particular, los ensayos como secuenciamiento de degradación Edman o análisis de espectrometría de masas se pueden llevar a cabo en una proteína DMO o PPO recombinante obtenidas de la célula, planta o semilla transgénica y los datos de secuencia resultantes compararse con los de la proteína DMO o PPO, respectivamente.

La introgresión de un rasgo transgénico en un genotipo de planta se logra como resultado del procedimiento de conversión por retrocruzamiento. Un genotipo de planta en el cual se ha realizado una introgresión de un rasgo transgénico se puede denominar híbrido, endógamo, línea o genotipo convertido por retrocruzamiento. De forma similar, un genotipo de planta que carece del rasgo transgénico deseado se puede denominar híbrido, endógamo, línea o genotipo no convertido.

Tal como se usa en la presente, el término “que comprende” significa "incluye de modo no taxativo”.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar las modalidades de la invención. Los expertos en la técnica deberían apreciar que, a la luz de la presente descripción, es posible realizar muchos cambios a las modalidades específicas provistas y aun así obtener un resultado similar sin alejarse del espíritu y el alcance de concepto de la invención. De forma más específica, resultará evidente que se pueden sustituir los agentes descritos en la presente con determinados agentes química y fisiológicamente relacionados y obtener los mismos resultados o resultados similares. Se considera que todos los sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu, alcance y concepto de la presente invención.

Ejemplo 1: Expresión y localización de CTP-DMO en protoplastos de soja

Un ensayo de protoplasto de soja se utilizó para evaluar la eficacia de direccionamiento de cloroplasto relativa de proteína recombinante que comprende uno de cinco CTP unidos operativamente a una secuencia de DMO (SEQ ID NO:27). Para monitorear la distribución de citosol y cloroplasto de la proteína recombinante, una secuencia codificante de una proteína fluorescente verde se agregó al casete que codifica la combinación de CTP y DMO recombinante (denominada en la presente CTP-DMO) de forma tal que la proteína fluorescente verde se fusionara con el extremo carboxi terminal de la DMO.

Los protoplastos se prepararon a partir de cotiledóneas de frijol (germoplasma A3244). Las vainas de semilla de soja inmaduras se cosecharon y las semillas (4-6 mm de largo) se retiraron usando una técnica estéril. Las cotiledóneas de cada semilla se retiraron manualmente, se cortaron transversalmente en pedazos de 1 mm y se incubaron en amortiguador CPW (pH 5,8) con 0,7 M de manitol durante 1 hora a 24-26 °C al oscuro mientras se agitaba a 40 RPM. Luego se retiró el amortiguador y se remplazó con amortiguador de enzima (4% de Celulasa 'onozuka' R-10; 2% de Hemicelulasa; 0,3% de Macerozima R-10; en amortiguador CPW (pH 5,8; con 0,49 M de manitol). El tejido de la cotiledónea se incubó en un agitador giratorio a 50 rpm a 24-26 °C durante 2 horas. Los protoplastos de soja se liberaron del tejido de la cotiledónea al final de esta incubación agitando el plato manualmente y filtrando la suspensión a través de una capa doble de una malla de nylon de 60 um en un tubo cónico de 50 ml. Los protoplastos se lavaron suavemente una vez con resuspensión y centrifugación. El sedimento final se volvió a suspender en amortiguador (4 mM de MES, pH 5,7; 150 mM de NaCl; 5 mM de CaCl2; 0,5 M de Manitol) y se dejó reposar durante 1 hora sobre hielo. Luego los protoplastos se centrifugaron y el sedimento se volvió a suspender en amortiguador de transformación (0,4 M de Manitol; 15 mM de MgCl2; 4 mM de MES, pH 5,7). El volumen se ajustó para permitir 1 x 10.000.000 protoplastos/ml. La transformación se logró mezclando 12,5 |jg de ADN por cada construcción. El ADN se combinó lentamente con 1,5 x 1.000.000 protoplastos, seguido de la adición de un volumen igual de amortiguador PEG. Esto se incubó durante 5 minutos y luego se diluyó lentamente con 300 j l de amortiguador W5 (154 mM de NaCl; 125 mM de CaCh; 5 mM de KCl; 2 mM de MES, pH 5,7). Esto se incubó durante 5-10 minutos y luego se agregaron lentamente 900 j l de amortiguador W5. Los protoplastos se sedimentaron y volvieron a suspender en amortiguador WI (0,5 M de Manitol; 4 mM de MES (pH 5,7); 20 mM de KCl) y luego se incubaron a 24-26 °C en el oscuro. Se realizó análisis microscópico usando un microscopio de escaneo láser Zeiss LSM510 META (Carl Zeiss Microlmaging, Inc., Thornwood, NY) equipado con un láser de ion de criptón y argón (458, 488 nm), un láser verde (543 nm) de helio y neón y conjuntos de filtros FITC y rojo de Texas. La adquisición y análisis de imágenes se realizó usando ZEN 2012 v.8.1 (Carl Zeiss Microlmaging, Inc., Thornwood, NY) y un objetivo de apertura numérica 1,240X agua. Las longitudes de onda de excitación usadas fueron 488 nm (GFP) y 543 nm (autofluorescencia de cloroplastos) y los filtros de emisión fueron de 500-530 nm (GFP) y 630-700 nm (autofluorescencia de cloroplastos). Para cada construcción, al menos 50 células individuales se puntuaron según la localización de la construcción: citosol, plástido o citosol y plástido. Los resultados se registraron como porcentaje de células con proteína localizada en el citosol o plástido (o ambos) de la cantidad total de células analizadas y se proporcionan en la Tabla 4.

Tabla 4. Ensayo de direccionamiento de protoplasto de soja

De las cinco combinaciones de CTP-DMO analizadas, solo APG6 CTP (SEQ ID NO:1) resultó en un 100% de las células mostrando localización de la proteína solo en el plástido. At.CR88 CTP (SEQ ID NO:3) resultó en un 94% de las células mostrando localización de la proteína solo en el plástido y 6% de las células mostrando localización de la proteína en el citosol y plástido. 'A' CTP resultó en un 79% de las células mostrando localización de la proteína solo en el plástido y 21% de las células mostrando localización en el citosol y plástido. 'B' CTP resultó en un 9% de las células mostrando localización de la proteína solo en el plástido y 91% de las células mostrando localización en el plástido y citosol. 'C' CTP resultó en un 18% de las células mostrando localización de la proteína solo en el plástido y 82% de las células mostrando localización en el plástido y citosol. Sin CTP, la proteína estaba presente solo en el citosol. Estos resultados indican que APG6 CTP fue 100% eficaz para dirigir CTP-DMO a los plástidos y At.CR88 CTP fue 94% eficaz para dirigir CTP-DMO a los plástidos.

Ejemplo 2: Procesamiento de CTP-DMO en trigo transgénico

Las plantas de trigo transgénico transformadas con una construcción de ADN que comprende una molécula de ADN recombinante que codifica uno de cuatro CTP separados unido operativamente a DMO se usaron para evaluar la expresión de proteínas y para determinar el procesamiento de CTP.

Las plantas de trigo transgénico se produjeron usando cuatro vectores de transformación de plantas diferentes, cada uno con una construcción de ADN que contiene uno de cuatro CTP diferentes unido operativamente a DMO unida operativamente a un promotor. Los embriones inmaduros cultivados previamente de trigo del germoplasmo Samson (PVP 1994) se transformaron usando Agrobacterium tumefaciens para producir plántulas transgénicas usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Se tomaron muestras de hojas para el análisis molecular para confirmar el número de copias de transgenes en el genoma de cada evento único y las plantas R0 con una copia del transgén se autofecundaron y se recogió la semilla R1.

La semilla (50 g) se molió hasta formar un polvo que luego se agregó a 250 ml de amortiguador de extracción (1xTBE (89 mM de Tris-borato, 2 mM de EDTA, pH 8,4), 200 mM de NaCl, 10% de glicerina, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 5 mM de benzamidina, 2 mM de ditiotreitol (DTT), inhibidores de proteasa cOmplete™ (Roche Diagnostics Corporation, Indianopolis, IN)) y se homogeneizaron con un Polytron® (v W r , Radnor, PA) por alrededor de 20 segundos, luego se incubaron con agitación a 4 °C durante 1 a 2 horas. La mezcla se centrifugó a 4 °C durante 25 min a 9.000 rpm y el sobrenadante se precipitó secuencialmente con 10% y 55% de sulfato de amonio saturado (AS), con cada paso de precipitación centrifugado a 18.000 rpm durante 20 minutos. El sedimento de la precipitación al 10% de AS se descartó.

El sedimento de la fracción de 10-55% se disolvió en 30 ml de PBS (0,1 M de fosfato de sodio, 0,15 M de NaCl) con 1 comprimido de los inhibidores de proteasa cOmplete™. El sedimento disuelto se centrifugó y el sobrenadante se filtró a través de una membrana de 0,22 um. Un suero de anticuerpo policolnal de cabra contra DMO se mezcló con una suspensión 1:1 de resina de proteína A/ G agarosa Pierce™ (ThermoFischer Scientific, Grand Island, NY), después de 1,5 horas el Ab anti-DMO cargado con resina de proteína A/ G agarosa se lavó 3 veces con PBS y se agregó a alrededor de 30 ml de la fracción filtrada de AS al 10% - 55%. Después de la incubación, la resina se centrifugó y lavó 3 veces con PBS, luego se volvió a suspender en 1 ml de PBS y se transfirió a un tubo de microcentrífuga y se volvió a sedimentar.

El sedimento final se volvió a suspender en amortiguador 2X Laemmli, se hirvió durante 5 minutos y las muestras se corrieron en un gel SDS-PAGE al 10% en amortiguador de Tris-glicina a 185 V (constante). Las proteínas en el gel SDS-PAGE se transfirieron a una membrana de PVDF usando amortiguador de transferencia CAPS, durante 30 min a 4 °C y 100V. Las proteínas unidas a la membrana de PDVF se tiñeron con azul Coomassie por aproximadamente 30 segundos y las bandas que correspondían a cada una de las proteínas de DMO en la fracción de AS al 10%-55% se extirparon de la mancha de PVDF y se usaron para el análisis de secuencia de proteína de extremo amino. La secuenciación de proteínas de extremo amino se llevó a cabo por química de degradación Edman automática, con cada análisis realizado durante 15 ciclos usando química de degradación Edman automática. Se usó un sistema de secuenciación Applied Biosystems 494 Procise® con una bomba de microgradiente 140C y detector UV/Vis Perkin Elmer Series 200 para el análisis con software Procise Control (versión 2.1) (ThermoFischer Scientific, Grand Island, NY). Se recogieron los datos cromatográficos usando el software de análisis de secuenciación de proteínas SequencePro® (versión 2.1). Se estableció la identidad para cada proteína si se observaban al menos 8 aminoácidos coherente con la secuencia predicha de la proteína observada. Los resultados de la secuenciación de extremo amino se presentan en la Tabla 5.

Tabla 5. Secuenciación de extremo amino de la proteína recombinante

Las designaciones de DMO, DMO+1, DMO+10 y DMO+12 se usaron para indicar que la secuenciación de proteínas indicaba que quedaban 0, 1, 10, o 12 aminoácidos del CTP en el extremo amino terminal de DMO después del procesamiento, respectivamente. La designación de DMO-1 se usó para indicar que la primera metionina de DMO se retiró después del procesamiento. Se evaluaron dos eventos únicos para APG6 CTP (SEQ ID NO:1) unido operativamente a d Mo (SEQ ID NO:18). Ambas muestras mostraron un aminoácido del CTP restante en el extremo amino terminal de DMO después del procesamiento (DMO+1). Se evaluaron tres eventos únicos para At.CR88 CTP (SEQ ID NO:3) unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:18). Las tres muestras mostraron cero o un aminoácido del CTP restante en el extremo amino terminal de DMO después del procesamiento (DMO y DMO+1). El evento evaluado de CTP4 (SEQ ID NO:4) unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:19) mostró doce aminoácidos del CTP restantes en el extremo amino terminal de DMO después del procesamiento (DMO+12). Se evaluaron dos eventos únicos para Os.Waxy CTP (SEQ ID NO:6) unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:18). Un ejemplo mostró diez aminoácidos del CTP restantes en el extremo amino terminal de DMO después del procesamiento (DMO+10) y uno mostró que la primera metionina de DMO se retiró después del procesamiento (DMO-1). Estos resultados indican que APG6 CTP y At.CR88 CTP se procesan de manera eficaz de DMO cuando se expresan en plantas transgénicas.

Ejemplo 3: Expresión de CTP-DMO en Brassica napus transgénica

La capacidad de las construcciones de ADN que comprenden una molécula de ADN recombinante que codifica uno de tres CTP separados unido operativamente a DMO de proveer tolerancia a dicamba se evaluó con plantas Brassica napus transgénicas.

Las plantas Brassica napus transgénicas se produjeron usando tres vectores de transformación de plantas diferentes, cada uno con una construcción de ADN que contiene uno de tres CTP diferentes unido operativamente a DMO unida operativamente a un promotor. La Brassica napus variedad 65037 línea Restorer se usó para la transformación mediada por Agrobacterium y las plantas R0 se cultivaron en el invernadero. Se analizaron eventos únicos para determinar el número de copia del transgén. Las plantas R0 con una copia del transgén se autofecundaron y se recogieron las semillas R1.

La tolerancia a dicamba se evaluó usando plantas R0 con una copia del transgén con estructura de vector o dos copias del transgén. La tolerancia a dicamba se designó lesión de dicamba de 20% o menos en condiciones de invernadero. Los eventos R0 en macetas se dividieron en tres grupos y se aplicó dicamba (Clarity®) a una de tres tasas: (1) sin dicamba, (2) 1 libra ae/acre de dicamba (tasa 2X), o (3) 2 libra ae/acre de dicamba (tasa 4X). Las plantas transgénicas se rociaron y las clasificaciones de lesión se registraron 21 días después. Las plantas que contenían el “A” CTP unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:21) no mostraron eventos de tolerancia a dicamba. Las plantas que contenían RbcS CTP (SEQ ID NO:5) unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:21) mostraron 8 de 9 eventos con tolerancia a la tasa 2X de dicamba y 7 de 7 eventos con tolerancia a la tasa 4X de dicamba. Las plantas que contenían APG6 CTP (SEQ ID NO:1) unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:20) mostraron 7 de 14 eventos con tolerancia a la tasa 2X de dicamba y 6 de 18 eventos con tolerancia a la tasa 4X de dicamba. Los resultados se proporcionan en la Tabla 6.

Tabla 6. Tolerancia a dicamba en R0 Brassica napus

La tolerancia a dicamba se evaluó en plantas R0 con una copia del transgén. Las plantas se rociaron en el invernadero con dicamba (Clarity) a 1 libra ae/acre (tasa 2X) y se determinó la tolerancia a dicamba 14 a 21 días después. Las plantas que contenían el APG6 CTP unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:20) mostraron 13 eventos de 31 con tolerancia a dicamba. Las plantas que contenían el RbcS CTP unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:21) mostraron 13 eventos de 17 con tolerancia a dicamba. Las plantas que contenían el “A” CTP unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:21) mostraron 7 eventos de 18 con tolerancia a dicamba. Los resultados se proporcionan en la Tabla 7.

Tabla 7. Tolerancia a dicamba en R0 Brassica napus

Diez semillas de cada una de 28 plantas R1 con el APG6 CTP unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:20) (APG6+DMO) y diez semillas de cada una de 17 plantas R1 con RbcS Ct P unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:21) (RbcS+DMO) se cultivaron en un invernadero. Las plantas se rociaron con 2 libra ae/acre de dicamba (4X) el día del plantado, seguido de 1 libra ae/acre de dicamba (2X) dicamba en la etapa V3 y 1 libra ae/acre de dicamba (2X) dicamba en la primera floración (definida como >90% de plantas arrancadas y alrededor de 25% con al menos una flor abierta). Se tomaron las clasificaciones de lesión siete días después de cada rociado y se expresaron como porcentaje de lesión en comparación con los controles rociados. Para las plantas que contienen APG6+DMO, hubo un total de 9 progenies de 2 eventos con clasificaciones de lesión de dicamba de < 20% en cada uno de los tres períodos de clasificación. Para las plantas que contienen RbcS+DMO, hubo 77 plantas en 16 eventos con tolerancia a dicamba menor que 20% en cada uno de los tres períodos de clasificación.

La caracterización de proteínas se realizó usando hojas cosechadas de los eventos R0. El tejido de hojas se molió en nitrógeno líquido y se extrajo con dos volúmenes de 2X amortiguador Laemmli (BioRad, Hercules, CA) que contiene 10% de 2-mercaptoetanol y 5 mM de DTT. Las muestras se hirvieron y se cargaron 10 pl en 4-20% de gel Criterion™ fundido previamente (BioRad, Hercules, CA) y se corrieron en amortiguador de Tris/glicina/SDS a 250V durante 45 minutos. La proteína en el gel se transfirió a la membrana PVDF a 400 mA durante 30 minutos en amortiguador Tris/glicina que contenía 20% de metanol. La proteína DMO se detectó usando antisuero anti-DMO de conejo policlonal y un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con HRP. La señal se detectó usando un kit quimioluminiscente SuperSignal™ West Pico (ThermoFischer Scientific, Grand Island, NY). Hubo una banda única de aproximadamente 38 kDa, que tiene el tamaño esperado para una proteína DMO completamente procesada, para cada uno de los tres eventos que contienen APG6-DMO. Hubo dos bandas de aproximadamente 38 kDa y aproximadamente 41 kDa para cada uno de seis eventos que contienen RbcS-DMO. La banda de 41 kDa es coherente con DMO+27 y se ha informado en soja que contenía RbcS-DMO anteriormente (patente estadounidense n.° 7.838.729). Hubo una expresión muy baja de la proteína DMO en todos los eventos que contienen “A” CTP-DMO y la señal detectada después de una larga exposición fue una banda de aproximadamente 50 kDa y una banda de aproximadamente 39 kDa. La banda de 50 kDa tiene aproximadamente el tamaño esperado de un “A” CTP-DMO no procesado. Estos resultados indican que APG6-DMO produjo una única banda del tamaño esperado coherente con una DMO totalmente procesada.

La proteína recombinante se purificó a partir de tejido de hoja de plantas R0 que contienen APG6-DMO o RbcS-DMO. El análisis de secuencia de extremo amino se realizó usando química de degradación Edman como se describió. El análisis de secuencia de extremo amino confirmó la presencia de secuencias de extremo amino de DMO de DMO+27 y DMO-1 en plantas que contienen RbcS-DMO, coherente con el tamaño de las bandas de DMO en la transferencia Western. El análisis de secuencia de extremo amino confirmó la presencia de solo secuencias de extremo amino de DMO de DMO+1 en plantas que contienen APG6-DMO, coherente con el tamaño de las bandas de DMO en la transferencia Western. Este resultado confirma que el uso de APG6 CTP resulta en el procesamiento completo de una DMO unida operativamente en plantas.

Ejemplo 4: Expresión de CTP-DMO en maíz transgénico

La expresión de las construcciones de ADN que comprenden una molécula de ADN recombinante que codifica uno de dos CTP separados unido operativamente a DMO se analizó en plantas y células de maíz transgénico.

La transformación transitoria de protoplastos de maíz mesófilo se usó para evaluar la expresión de DMO relativa de las dos combinaciones de CTP-DMO. Las construcciones de ADN fueron idénticas excepto que CTP unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:18) fue APG6 (SEQ ID NO:1) o CTP4 (SEQ ID NO:4). Los protoplastos se prepararon esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Después de la transformación, las células se cosecharon y los niveles de proteína DMO se determinaron con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La proteína de cuatro muestras de protoplasto transformado se midió para cada combinación de CTP-DMO como nanogramo (ng) de DMO por miligramo (mg) de proteína total. Los protoplastos transformados con APG6-DMO tenían niveles aproximadamente 4 veces mayores de DMO en comparación con los protoplastos transformados con CTP4-DMO. Los datos se proporcionan en la Tabla 8.

Se generaron plantas de maíz transgénico usando las construcciones de ADN y se cultivaron plantas R0. Se recogieron las muestras de hojas de plantas R0 que representan ocho eventos únicos de copia simple y se usaron para ELISA cuantitativo para medir los niveles de DMO. La expresión de DMO en el tejido de hojas R0 fue aproximadamente 4 veces mayor para eventos que contienen APG6-DMO en comparación con eventos que contienen CTP4-DMO. Los datos se proporcionan en la Tabla 8.

La secuenciación de extremo amino se realizó para DMO expresada en plantas de maíz transgénico. La proteína se purificó a partir de plantas de maíz transgénico que expresan CTP4-DMO o APG6-DMO y se prepararon para la secuenciación de degradación Edman esencialmente como se describe en el Ejemplo 2. El análisis de secuencia de extremo amino confirmó secuencias de extremo amino de DMO de DMO+6, DMO+7 y DMO+12 presentes en plantas que contienen CTP4-DMO. El análisis de secuencia de extremo amino confirmó secuencias de extremo amino de DMO de DMO+1 en plantas que contienen APG6-DMO. Estos resultados indican que el procesamiento de CTP es más completo con APG6 en comparación con CTP4, según se evidencia por el hecho de que hay menos aminoácidos de CTP restantes en el extremo amino terminal de DMO. Los datos se proporcionan en la Tabla 8.

Tabla 8 Expresión de proteína DMO en maíz

El maíz transgénico se generó por transformación mediada por Agrobacterium usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica con una construcción de ADN que contiene una molécula de ADN recombinante que codifica APG6-DMO o CTP4-DMO. La tolerancia a dicamba se evaluó en un ensayo de campo para las plantas transgénicas híbridas F1. El ensayo de campo incluía cuatro tratamientos en dos ubicaciones con dos replicaciones cada uno. Los cuatro tratamientos fueron: (1) dicamba (Clarity®) aplicado a 2 libras ae/acre (4X) en V2 seguido de V4 seguido de V8; (2) dicamba aplicado a 4 libras at/acre (8X) en V2 seguido de V4 seguido de V8; (3) dicamba aplicado a 8 libras at/acre (16X) en V2 seguido de V4 seguido de V8; y (4) dicamba aplicado a 16 libras at/acre (32X) en V2 seguido de V4 seguido de V8. La lesión del cultivo se clasificó diez días después del tratamiento y se midió como porcentaje de lesión de cultivo por etapa V (CIPV2, CIPV4 o CIPV8). Al final de la temporada, se cosecharon los granos y se midió el rendimiento en bushels/acre. Tanto para las clasificaciones como el rendimiento de CIPV, se calculó la diferencia menos significativa (LSD) a una probabilidad de 5% (p=0,05). Las mayores tasas de dicamba (16X y 32X) aplicadas a plantas híbridas F1 que contenían APG6-DMO mostraron un poco menos de lesión vegetativa y mayor rendimiento de granos que las plantas que contienen CTP4-DMO. Los datos se proporcionan en la Tabla 9.

Tabla 9. Evaluación de ensayo de campo de híbrido F1 de lesión y rendimiento de dicamba

Ejemplo 5: Expresión de CTP-DMO en algodón y soja transgénicos

Las plantas de soja transgénica se generaron con dos construcciones de ADN que eran idénticas excepto por APG6 CTP. La primera construcción de ADN tenía APG6 (SEQ ID NO:1) unido operativamente a DMO (SEQ ⁱD NO:18). Cada construcción de ADN se usó para transformar soja A3555 por procedimientos de transformación mediados por Agrobacterium. Después de la transformación, las plantas transgénicas R0 que contenían una única copia del transgén se identificaron por ensayo PCR. Las plantas R0 de copia única se cultivaron en invernadero y se cosechó la semilla R1. Diez semillas R1 por evento de 4 eventos generados usando cada una de dos construcciones de ADN y semilla AG3555 se plantaron para la evaluación de la tolerancia del cultivo al tratamiento con dicamba después del brote en condiciones de crecimiento en invernadero estándar. Se aplicó dicamba (Clarity) en la etapa V4 a 1120 g ai/ha. Se tomaron clasificaciones de lesiones de cultivo 10 días después del tratamiento. Las muestras de hoja de plantas de soja tolerantes a dicamba se tomaron para mediciones del nivel de proteína recombinante y análisis de secuencia de extremo amino. El nivel de proteína DMO se detectó por ELISA y era de 13,35 ± 2,7 ng/mg para las plantas de soja transgénica R1 tolerantes a dicamba de copia única con el APG6 CTP (SEQ ID NO:1) unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:18). No se detectó proteína DMO en el tejido de hoja de soja A3555 de control negativo. La clasificación de lesión de dicamba para las plantas de soja transgénica R1 de copia única con el APG6 CTP (SEQ ID NO:1) unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:18) fue de 3,6%. La soja A3555 de control negativo tenía una clasificación de lesión de dicamba de 99,8%. Las muestras de hojas de las plantas de soja transgénica R1 tolerantes a dicamba de copia única se usaron para la secuenciación de extremo amino (como se describe en los Ejemplos 2 y 4). El análisis de secuencia de extremo amino confirmó que el procesamiento de APG6-DMO y APG6-DMO optimizado resultó en el procesamiento completo del CTP del extremo amino de la proteína DMO. Los niveles de DMO, lesión de dicamba y procesamiento de APG6-DMO indicaron que APG6 y APG6 optimizado estaban unidos operativamente a DMO para proveer tolerancia a dicamba y ambos CTP se procesaron completamente en las plantas. Los datos se proporcionan en la tabla 10.

Tabla 10. Evaluación de invernadero de soja R1

Las plantas de algodón transgénico se generaron con dos construcciones de ADN que eran idénticas excepto por APG6 CTP. La primera construcción de ADN tenía APG6 (SEQ ID NO:1) unido operativamente a DMO (Se Q ID NO:18). Cada construcción de ADN se transformó en algodón por transformación mediada por Agrobacterium usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Después de la transformación, las plantas de algodón transgénico R0 que contenían una única copia del transgén se identificaron por ensayo PCR, se cultivaron en invernadero y se cosechó la semilla R1. Diez semillas R1 por evento de 10 eventos para cada construcción y semilla de algodón DP393 se plantaron para evaluar la tolerancia del cultivo a la aplicación de dicamba después del brote. Se aplicó dicamba (Clarity) en la etapa V4 a 1120 g ai/ha. Se tomaron clasificaciones de porcentaje de lesión de cultivo 9 días después del tratamiento. Las muestras de hoja de plantas de algodón tolerantes se usaron para mediciones del nivel de proteína y análisis de secuencia de extremo amino de APG6-DMO. El nivel de proteína DMO detectado por ELISA fue de 176,2 ± 103 ng/mg para las plantas de algodón transgénico R1 tolerantes a dicamba de copia única con el APG6 CTP (SEQ ID NO:1) unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:18). No se detectó proteína DMO en el tejido de hoja de algodón DP393 de control negativo. La lesión de dicamba para las plantas de algodón transgénico R1 de copia única con el APG6 CTP (SEQ ID NO:1) unido operativamente a DMO (SEQ ID NO:18) fue de 2,6%. La lesión de algodón DP393 de control negativo fue de 85%. Las muestras de hojas de las plantas R1 tolerantes a dicamba de copia única se usaron para la secuenciación de extremo amino (como se describe en los Ejemplos 2 y 4). El análisis de secuencia de extremo amino confirmó que el procesamiento de APG6-DMO resultó en el procesamiento completo del CTP del extremo amino de la proteína d Mo . El nivel de expresión de proteína DMO, lesión de dicamba y procesamiento de extremo amino de APG6-DMO indicaron que APG6 estaban unidos operativamente a DMO para proveer tolerancia a dicamba y CTP se procesaron completamente en las plantas. Los datos se proporcionan en la Tabla 11.

Tabla 11. Evaluación de invernadero de algodón R1

Ejemplo 6: Expresión de CTP-PPO en maíz transgénico

Se identificaron PPO novedosas que son tolerantes a los herbicidas de PPO utilizando un sistema de detección bacteriano herbicida. Este sistema de detección utilizó un ensayo de crecimiento de la cepa de E. coli inactivada en medio líquido LB con un herbicida de PPO para identificar las PPO que no eran sensibles al herbicida de PPO.

La cepa de E. coli inactivada se transformó con un vector de expresión bacteriana que contenía la actividad de la PPO confirmada y se cultivó en medio líquido LB. La forma cristalina purificada de uno de cinco herbicidas de PPO diferentes (acifluorfén (1 mM), flumioxazin (0,5 mM), lactofén (0,5 mM), fomesafén (1 mM) y S-3100 (100 j M), que representa tres subclases de químicos de PPO diferentes, se añadió al medio. Se expresaron proteínas recombinantes y se midieron las tasas de crecimiento de E. coli. Se midieron las curvas de crecimiento (OD600) para las diferentes variantes con y sin los herbicidas de PPO en momentos seleccionados desde el momento cero hasta veinticuatro horas. El crecimiento de una cepa de E. coli inactivada transformada en medio LB en presencia de un herbicida de PPO indicó que el gen utilizado para transformar E. coli codificaba una protoporfirinógeno oxidasa insensible a herbicidas (iPPO).

Se descubrió que diez PPO proporcionadas como SEQ ID NO: 40 y 43 conferían tasas de crecimiento normales a la cepa de E. coli inactivada en medio LB con un herbicida de PPO, lo que indica que estas proteínas son protoporfirinógeno oxidasas insensible a herbicidas (iPPO). La cepa de E. coli inactivada que expresa WH_PPO (SEQ ID n O:60) fue sensible a los cinco herbicidas de PPO, lo que confirma que el ensayo pudo distinguir entre PPO sensibles e insensibles para cada uno de los herbicidas.

Se crearon cuatro vectores de transformación de planta para expresar PPO H_N10 (SEQ ID NO:43) in planta. Las construcciones de transformación 1 y 11 tenían la misma combinación promotor más líder más intrón, la misma secuencia 3'UTR, el mismo PPO H_N10 (SEQ ID NO:43), pero diferían en las secuencias de CTP y se usaron en la transformación de la soja. Las construcciones de transformación 6 y 16 tenían la misma combinación promotor más líder más intrón, la misma secuencia 3'UTR, el mismo PPO H_N10 (SEQ ID NO:43), pero diferían en las secuencias de CTP y se usaron en la transformación del maíz. La Tabla 12 provee la configuración de las construcciones de transformación de planta PPO H_N10.

Tabla 12. Configuración de construcción con PPO H_N10

Se expresaron las enzimas de PPO en plantas de maíz transgénico y se analizaron las plantas transgénicas para determinar la tolerancia al herbicida de PPO. Se construyeron vectores de transformación de plantas que comprenden una molécula de ADN recombinante que codifica una de las enzimas de PPO proporcionadas como SEQ ID NO:40, 43, 50 y 54. La secuencia de ADN codificante de una enzima PPO puede incluir en el extremo 5' un codón para una metionina, denominado comúnmente codón de inicio, o este codón se puede eliminar para facilitar un enlace operativo de una secuencia de péptido de tránsito de cloroplastos con el extremo 5' de la secuencia codificante. Ejemplos de secuencias de proteína enzimática de PPO que contienen una metionina en el extremo amino se proporcionan como SEQ ID NO:40 y 43. Ejemplos de secuencias de proteína enzimática de PPO sin una metionina en el extremo amino se proporcionan como s Eq ID NO:50 y 54. Para una transformación de planta, las secuencias de nucleótidos codificantes de las enzimas de PPO putativas se optimizaron por codones para la expresión de dicotiledóneas o monocotiledóneas. La Tabla 2 proporciona las SEQ ID NO correspondientes a la proteína y las secuencias de nucleótidos de las enzimas de PPO en los vectores de transformación.

Para las evaluaciones in planta del maíz, se transformó maíz (LH244) utilizando Agrobacterium tumefaciens y procedimientos estándar conocidos en la técnica. Las plantas transgénicas F1 producidas por el cruzamiento de las plantas R0 de copia única que expresan H_N10 (SEQ ID NO:43) en una de dos configuraciones de construcciones se evaluaron en el invernadero para determinar la tolerancia al herbicida. Se trataron las plantas con 40 gramos/ha de S-3100 en la etapa de crecimiento V3 y se tomaron clasificaciones de las lesiones siete días después del tratamiento. Las plantas de maíz transgénico que expresan H_N10 (SEQ ID NO:43) en la configuración de la construcción 6 (APG6 (S^eQ ID NO:1) unida operativamente a PPO H_N10 (S^eQ ID NO:43)) resultaron en 13 de 18 eventos que producen plantas altamente tolerantes (10 % o menos de lesión) pero la configuración de la construcción 16 (12G088600TP (SEQ ID NO:38) unida operativamente a PPO H_N10 (SEQ ID NO:43)) no resultó en ningún evento que produce plantas altamente tolerantes.

Las plantas transgénicas F1 producidas por el cruzamiento de las plantas R0 de copia única que expresan H_N10 (SEQ ID NO:43) en una de dos configuraciones de las construcciones (construcciones 6 y 16) se evaluaron en el campo en cuanto a la tolerancia al herbicida. Esta población de F1 fue segregante (50 % hemicigota y 50 % nula) y la selección para las plantas transgénicas no se realizó antes de las clasificaciones de las lesiones. Se espera que las clasificaciones de lesiones promedio generales para una población sean superiores a una población transgénica homogénea ya que es difícil discernir plantas no transgénicas de plantas transgénicas. Los ensayos se realizaron en dos ubicaciones con dos replicados y 3 tratamientos por construcción. Se utilizaron plantas de maíz no transgénico como un control negativo. Los tratamientos de aplicación de herbicidas fueron los siguientes: El tratamiento 1 fue de 0,036 libra ai/acre de S-3100 aplicado en V2 seguido de (fb) V4 fb V8; el tratamiento 2: fue de 0,072 libra ai/acre de S-3100 aplicado en V2 fb V4 fb V8; el tratamiento 3: fue de 0,144 libra ai/acre de S-3100 aplicado en V2 fb V4 fb V8. Las clasificaciones de porcentaje de lesiones de cultivo se evaluaron en la etapa de crecimiento V2 (CIPV2) y en la etapa de crecimiento V4 (CIPV4) de 5 a 7 días después del tratamiento (el error V2 y el error V4 son la mitad de la diferencia menos significativa (LSD)). Las clasificaciones de lesiones de cultivo se combinaron para ambas ubicaciones. Todas las plantas no transgénicas y las plantas con eventos generados utilizando la construcción 16 (12G088600TP (SEQ ID NO:38) unida operativamente a PPO H_N10 (SEQ ID NO:43)) mostraron entre 94,6- 99,5% de lesión después de la aplicación de herbicida V2 y V4 para cada uno de los tres tratamientos. Las plantas con eventos generados utilizando la construcción 6 (APG6 (SEQ ID NO:1) unida operativamente a PPO H_N10 (SEQ ID NO:43)) mostraron solamente entre 30 % y 50 % de lesión después de la aplicación de herbicida V2 y ninguna lesión después de la aplicación de herbicida V4. Los datos se proporcionan en la Tabla 13.

Tabla 13. Ensayo de campo de eficacia de maíz F1 que contiene PPO H_N10 (SEQ ID NO:43)

Los datos de invernadero de maíz transgénico F1 y de campo demostraron que APG6 (SEQ ID NO:1) unido operativamente a PPO H_N10 (SEQ ID NO:43) produjo menores tasas de lesión al expresarse en plantas transgénicas en comparación con las tasas de lesión cuando 12G088600TP (SEQ ID NO:38) unido operativamente a PPO H_N10 (SEQ ID NO:43) se expresaba en plantas transgénicas. Véase Figura 1.

Los vectores de transformación de planta se crearon para expresar in planta PPO H_N40 (SEQ ID NO:54) o PPO H_N90 (SEQ ID NO:50) unido operativamente a APG6 (SEQ ID NO:1), CTP D, o CTP E. El maíz (01DKD2) se transformó usando Agrobacterium tumefaciens y procedimientos estándar conocidos en la técnica. Las muestras de hojas tomadas de las plantas R0 resultantes se analizaron por PCR para determinar el número de copia del inserto de transgén. Las plantas R0 que contenían un único evento de transformación se rociaron con 40 g ai/ha o 80 g ai/ha de S-3100 en aproximadamente la etapa de crecimiento V5 y se tomaron clasificaciones de las lesiones 4-7 días después del tratamiento. Se registró la cantidad de plantas con <10% de lesión (altamente tolerantes) o <20% de lesión (tolerantes) de la cantidad total de plantas rociadas. Las plantas que se determinó que eran eventos de copia única y las que pasaron la pulverización a <20% de lesión avanzaron a la autofecundación y cruzamiento. Los datos se presentan en la Tabla 14.

Tabla 14. Evaluación de tolerancia a herbicidas CTP-PPO en maíz transgénico

(continuación)

Los resultados muestran que APG6 (SEQ ID NO:1) produjo sistemáticamente una mayor tolerancia a herbicidas en comparación con plantas transformadas con CTP D o CTP E cuando están unidas operativamente a H_N40 (SEQ ID NO:54) o H_N90 (SEQ ID NO:50). APG6, cuando estaba unido operativamente a H_N40, resultó en 21,4% a 40,2% de plantas transgénicas altamente tolerantes y 41,1% a 58,9% de plantas transgénicas tolerantes a S-3100 a 80 g ai/ha. APG6, cuando estaba unido operativamente a H_N90, resultó en 49,1% de plantas transgénicas altamente tolerantes y 56,3% de plantas transgénicas tolerantes a S-3100 a 40 g ai/ha. CTP D, cuando estaba unido operativamente a H_N40, resultó en 0% de plantas transgénicas altamente tolerantes y 2,2% tolerantes a S-3100 a 80 g ai/ha. CTP E, cuando estaba unido operativamente a H_N40, resultó en 0% a 8% de plantas transgénicas altamente tolerantes y 12,9% a 32,1% tolerantes a S-3100 a la menor tasa de herbicida de 40 g ai/ha.

El maíz híbrido F1 transgénico que expresa APG6 unido operativamente a PPO H_N10 se evaluó para determinar la tolerancia a siete diferentes herbicidas de PPO: S-3100, Fomesafén, Acifluorfén, Lactofén, Flumioxazina, Sulfentrazona y Saflufenacilo. Las semillas agrupadas que representaban 5 eventos únicos se plantaron en macetas en un invernadero junto con semillas de maíz híbrido como control negativo.

Para evaluar la tolerancia a herbicidas antes del brote, se aplicaron herbicidas de PPO individualmente a una de dos tasas con seis repeticiones por tratamiento de la siguiente manera: S-3100 (80 o 160 g ai/ha), fomesafén (Reflex®, 840 o 1680 g ai/ha), flumioxazina (Valor® SX, 210 o 420 g ai/ha), sulfentrazona (Spartan® 4L, 840 o 1680 g ai/ha), y saflufenacilo (Sharpen®, 200 o 400 g ai/ha). Las plantas se clasificaron por porcentaje de lesión de cultivo 20 días después del tratamiento y la semilla de maíz se incluyó como control negativo. Las plantas transgénicas con APG6 unido operativamente a PPO H_N10 tenía clasificaciones de lesión para los diferentes herbicidas de PPO aplicadas antes del brote que varían de 0% a 5,8%, lo que indica que APG6 unido operativamente a PPO H_N10 proporcionaba excelente tolerancia antes del brote al maíz a ambas tasas de herbicida para los cinco herbicidas de PPO. Las plantas de maíz de control negativo tuvieron clasificaciones de lesión que varían de 17,5% a 94,2%, con la excepción de saflufenacilo, que era esperable ya que este herbicida se comercializa para usarse en plantas de maíz convencionales.

Los datos se presentan en la Tabla 15 con un error estándar indicado como /-.

Tabla 15. Clasificaciones de lesión anterior al brote de herbicida de PPO en maíz

Para evaluar la tolerancia a herbicidas después del brote (V3 a V4), se aplicaron herbicidas de PPO individualmente a una de tres tasas con seis repeticiones por tratamiento de la siguiente manera: S-3100 (40, 80 o 160 g ai/ha), fomesafén (Reflex®, 420, 840 o 1680 g ai/ha), acifluorfén (Ultra Blazer®, 420, 840 o 1680 g ai/ha), lactofén (Cobra®, 220, 440 o 880 g ai/ha), flumioxazina (Valor® SX, 105, 210 o 420 g ai/ha), sulfentrazona (Spartan® 4L, 420, 840 o 1680 g ai/ha) y saflufenacilo (Sharpen®, 100, 200 o 400 g ai/ha). Las plantas se clasificaron por porcentaje de lesión de cultivo 14 días después del tratamiento y la semilla de maíz híbrido convencional se incluyó como control negativo. Las plantas transgénicas con APG6 unido operativamente a PPO H_N10 tuvieron clasificaciones de lesión para los diferentes herbicidas de PPO aplicados después del brote que varían de 0,5% a 5,8%, con la excepción de fomesafén a 1680 g ai/ga donde la clasificación de lesión fue de 13,8%, lo que indica que APG6 unido operativamente a PPO H_N10 proveía excelente tolerancia posterior al brote al maíz a todas las tasas de herbicida para los siete herbicidas de PPO. Las plantas de maíz de control negativo tuvieron clasificaciones de lesión que varían de 36,7% a 100%. Los datos se presentan en la Tabla 16 con un error estándar indicado como /-.

Tabla 16. Clasificaciones de lesión posterior al brote de herbicida de PPO en maíz

Ejemplo 7: Expresión de CTP-PPO en soja transgénica

Se expresaron las enzimas PPO unidas operativamente a diferentes CTP en plantas de soja transgénica y se analizaron las plantas transgénicas para determinar la tolerancia al herbicida de p Po .

Se crearon vectores de transformación de planta para la expresión in planta de 12G088600TP (SEQ ID NO:38) unida operativamente a PPO H_N10 (SEQ ID NO:43) o APG6 (SEQ ID NO:1) unida operativamente a PPO H_N10 (SEQ ID NO:43). La soja A3555 se transformó usando estos vectores de transformación de plantas y Agrobacterium tumefaciens usando procedimientos estándar conocidos en la técnica. Las plántulas transgénicas ^r0 regeneradas se cultivaron en el invernadero, se autofecundaron y las semillas R1 se recogieron. Las plantas R1 transgénicas se rociaron en el invernadero con uno de los tres tratamientos de herbicida aplicados en V4 y R1: (1) 5 gramos ai/ha S-3100, (2) 10 gramos ai/ha S-3100, o (3) 30 gramos ai/ha S-3100. Las clasificaciones de lesión de cultivo se evaluaron diez días después del tratamiento. Las plantas transgénicas que expresan APG6 (SEQ ID NO:1) unido operativamente a PPO H_N10 (SEQ ID NO:43) tuvieron clasificaciones de lesión de 4,2%, 7,8%, y 9,4% en la etapa V4 y 3%, 6,5%, a 15,7% en la etapa R1, a las tasas de 5, 10 y 30 g ai/ha, respectivamente. Las plantas transgénicas que expresan 12G088600TP (Se Q ID NO:38) unido operativamente a PPO H_N10 (SEQ ID NO:43) tuvieron clasificaciones de lesión promedio de 82,7%, 92,7%, a 98,2%% a las tasas de 5, 10 y 30 g ai/ha, respectivamente y no sobrevivieron para ser clasificado en la etapa R1. Las plantas de control negativo tuvieron clasificaciones de lesión promedio similares de 89%, 98%, a 100% a las tasas de 5, 10 y 30 g ai/ha, respectivamente y no sobrevivieron para ser clasificadas en la etapa R1. Los datos se proporcionan en la Tabla 17.

Tabla 17: Evaluación de herbicida de PPO de soja R1

Los vectores de transformación de planta se crearon para expresar in planta PPO H_N90 (SEQ ID NO:40) unido operativamente a uno de tres diferentes CTP, APG6 (S^eQ ID NO:1) CTP F y CTP H. La soja A3555 se transformó usando estos vectores de transformación de planta y Agrobacterium tumefaciens usando procedimientos estándar conocidos en la técnica. Las plántulas transgénicas R0 regeneradas se cultivaron en el invernadero y las muestras de hoja tomadas de las plantas R0 resultantes se analizaron por PCR para identificar las plantas que contienen una única copia de un evento. Las plantas R0 transgénicas de copia única, cada una representa un evento único, se rociaron en el invernadero con el tratamiento con herbicida de 20 g ai/ha de S-3100 aplicado aproximadamente en la etapa V3. Las clasificaciones de lesiones se tomaron 14 días después del tratamiento como la cantidad que se consideraba altamente tolerante (<10% de lesión) o tolerante (<20% de lesión). Las plantas transgénicas que expresan APG6 (SEQ ID NO:1) unido operativamente a P^pO H_N90 (SEQ ID NO:40) resultaron en 21,4% de eventos únicos altamente tolerantes y 57,1% tolerantes. Las plantas transgénicas que expresan CTP F unido operativamente a PPO H_N90 (SEQ ID NO:40) resultaron en 11,7% de eventos únicos altamente tolerantes y 41,1% tolerantes. Las plantas transgénicas que expresan CTP H unido operativamente a PPO H_N90 PPO H_N90 (SEQ ID NO:40) no resultaron en ningún evento único altamente tolerante o tolerante. Los datos se presentan en la Tabla 18.

Tabla 18. Evaluación de eficacia de S-3100 en soja R0

Estos datos demostraron que el CTP específico que está unido operativamente a la enzima PPO es crítico para lograr tolerancia a herbicidas, mostrando así la importancia de la elección de CTP y la inesperada superioridad de APG6 CTP en comparación con otros CTP para usarse en la producción de plantas transgénicas con tolerancia a herbicidas.

Ejemplo 8: Expresión de CTP-PPO en algodón transgénico

Se crearon vectores de transformación de plantas para expresar APG6 (SEQ ID NO:1) unido operativamente a PPO H_N10 (SEQ ID NO:43) en plantas de algodón transgénico y las plantas transgénicas se analizaron para determinar la tolerancia a herbicida de PPO. El algodón DP393 se transformó usando los vectores de transformación de plantas y Agrobacterium tumefaciens con procedimientos estándar conocidos en la técnica. Las plántulas transgénicas R0 regeneradas se cultivaron en el invernadero y las muestras de hoja tomadas de las plantas R0 resultantes se analizaron por PCR para identificar plantas que contienen una única copia de un evento. Las plantas R0 transgénicas de copia única, cada una representa un evento único, se rociaron en el invernadero con el tratamiento con herbicida de 20 g ai/ha de S-3100 aplicado en la etapa V2. Adicionalmente, múltiples copias transgénicas (>2 copias/plantas) se rociaron en el invernadero con el tratamiento con herbicida de 20 g ai/ha de S-3100 aplicado en la etapa V2. Las clasificaciones de lesión se tomaron tres días después del tratamiento.

El control negativo, algodón DP393, tuvo 100% de lesión tres días después del tratamiento con herbicida con 20 g ai/ha de S-3100. Por el contrario, 21 plantas R0 de copia única tuvieron una lesión promedio de 26,7%. La distribución de la lesión para las 21 plantas R0 de copia única fue: 3 plantas sin lesión; 3 plantas con 10% de lesión; 3 plantas con 15 % de lesión; 2 plantas con 20% de lesión; 7 plantas con 30% de lesión y 3 plantas con 40% de lesión. Para las plantas R0 de múltiples copias, 14 plantas recibieron tratamiento con herbicida y la lesión promedio fue de 10,4%. La distribución de la lesión para las 14 plantas de múltiples copias fue: 5 plantas sin lesión; 3 plantas con 5% de lesión; 1 planta con 10% de lesión; 2 plantas con 15% de lesión; 1 planta con 20% de lesión; 1 planta con 30% de lesión y 1 planta con 40% de lesión. Estos datos demostraron que el algodón transgénico R0 que expresa APG6 (SEQ ID NO:1) unido operativamente a PPO H_N10 (SEQ ID NO:43) tenía tolerancia a la aplicación de herbicida S-3100 a 20 g ai/ha aplicado en la etapa V2.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN codificante de un péptido de tránsito de cloroplastos (CTP) de SEQ ID NO:1, unida operativamente a una secuencia de ADN codificante de (i) una dicamba monooxigenasa (DMO) de SEQ ID NO: 18 o 20, o (ii) una protoporfirinógeno oxidasa (PPO) de SEQ ID NO: 43, 40, 50 o 54.

2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ADN codificante del CTP comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:7-11.

3. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1 o 2, en el que la secuencia de ADN codificante de DMO o PPO comprende una secuencia de polipéptidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:28, 30, 71, 74, 76, 81, 85, 88, 93, 96 y 98.

4. Una construcción de ADN que comprende la molécula de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 unida operativamente a un promotor heterólogo funcional en una célula vegetal.

5. Una planta, célula vegetal, parte de planta o semilla transgénica que comprende la molécula de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la construcción de ADN de la reivindicación 4.

6. La planta, célula vegetal, parte de planta o semilla transgénica de la reivindicación 5, en la que la planta es una planta monocotiledónea o una dicotiledónea.

7. Un procedimiento para producir una planta con tolerancia a herbicidas que comprende los pasos de:

a) transformar una célula vegetal con la construcción de ADN de la reivindicación 4 y

b) regenerar una planta de la célula vegetal transformada que comprende la construcción de ADN.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la planta regenerada es tolerante a un herbicida que se selecciona del grupo que consiste en dicamba y un inhibidor de PPO.

9. Un procedimiento para expresar dicamba monooxigenasa (DMO) o protoporfirinógeno oxidasa (PPO) que comprende introducir la construcción de ADN de la reivindicación 4 en una célula vegetal mediante

(a) transformación en Agrobacterium;

(b) bombardeo de partículas de ADN; o

(c) inserción de una construcción de ADN en un genoma de una planta en un sitio predeterminado mediante procedimientos de mutagénesis dirigida al sitio

10. Un procedimiento para controlar el crecimiento de malezas en un entorno en el que crecen cultivos que comprende los pasos de:

a) plantar la planta o semilla de la reivindicación 5 en un entorno en el que crecen cultivos; y

b) aplicar al entorno en el que crecen cultivos

(i) dicamba en una cantidad entre 1,12 kg ai/ha a 17,92 kg ai/ha o

(ii) en el caso de un herbicida inhibidor de PPO:

S-3100 en una cantidad de 40-160 g ai/ha,

fomesafén en una cantidad de 420-1680 g ai/ha,

acifluorfén en una cantidad de 420-1680 g ai/ha,

lactofén en una cantidad de 220-880 g ai/ha,

flumioxazina en una cantidad de 105-420 g ai/ha,

sulfentrazona en una cantidad de 420-1680 g ai/ha o

saflufenacil en una cantidad de 100-400 g ai/ha.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la planta es una planta monocotiledónea o dicotiledónea o una semilla de la misma.