ES2939617T3 - Líneas celulares estables para producción retroviral - Google Patents

Líneas celulares estables para producción retroviral

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Abstract

La invención se refiere a células productoras de retrovirus que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican: proteínas gag y pol; proteína de envoltura o un sustituto funcional de la misma; y el genoma de ARN de la partícula del vector retroviral, en el que dichas secuencias de ácido nucleico están todas ubicadas en un solo lugar dentro del genoma de la célula productora retroviral. La invención también se relaciona con vectores de ácidos nucleicos que comprenden un origen de replicación no mamífero y la capacidad de contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN, caracterizados porque dicho vector de ácidos nucleicos comprende secuencias de ácidos nucleicos retrovirales que codifican: proteínas gag y pol, y una proteína env o un sustituto funcional de la misma. La invención también se refiere a usos y métodos que usan dicho vector de ácido nucleico para producir líneas celulares productoras y de empaquetamiento retroviral estables. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Líneas celulares estables para producción retroviral
Campo de la invención
La invención se refiere a vectores de ácido nucleico que comprenden genes requeridos para la producción retroviral y a usos de los mismos. También se proporcionan métodos de producción de líneas celulares de empaquetamiento/producción retroviral que comprenden los vectores de ácido nucleico tal como se describen en el presente documento.
Antecedentes de la invención
En terapia génica, se suministra material genético a células endógenas en un sujeto que necesita tratamiento. El material genético puede introducir genes novedosos al sujeto, o introducir copias adicionales de genes previamente existentes, o introducir diferentes alelos o variantes de genes que están presentes en el sujeto. Se han propuesto sistemas de vectores virales como método de suministro génico para su uso en terapia génica (Verma y Somia (1997) Nature 389: 239-242).
En particular, estos vectores virales se basan en miembros de la familia de retrovirus debido a su capacidad de integrar su carga útil genética en el genoma del huésped. Los vectores retrovirales están diseñados para conservar las proteínas esenciales requeridas para el empaquetamiento y suministro del genoma retroviral, pero se elimina cualquier proteína auxiliar no esencial incluyendo aquellas responsables de su perfil de enfermedad. Los ejemplos de vectores retrovirales incluyen vectores lentivirales, tales como los basados en virus de la inmunodeficiencia humano tipo 1 (VIH-1), que se usan ampliamente porque pueden integrarse en células no proliferativas.
Actualmente, la mayor parte de los vectores virales se producen mediante cotransfección transitoria de genes virales en una línea celular huésped. Los genes virales se introducen usando plásmidos bacterianos que existen en la célula huésped durante tan solo un periodo de tiempo limitado porque los genes virales permanecen en los plásmidos y no se integran en el genoma. Como tal, el material genético transfectado de manera transitoria no se pasa a generaciones posteriores durante la división celular.
Hay varios inconvenientes asociados con la transfección transitoria, tales como variabilidad entre lotes, el alto coste de reactivos de transfección y la dificultad para mantener un control de calidad (véase Segura et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(7): 987-1011). El propio proceso de transfección también requiere mucho trabajo y es difícil de ampliar a escala. También está la difícil tarea de eliminar impurezas de plásmido que se arrastran durante la preparación del vector (véase Pichlmair et al. (2007) J. Virol. 81(2): 539-47).
Con el fin de abordar problemas asociados con la transfección transitoria, ha habido un deseo de desarrollar líneas celulares de empaquetamiento y producción retroviral con el fin de simplificar la producción de vectores retrovirales.
Se han generado líneas celulares de empaquetamiento transfectando una línea celular que puede empaquetar vectores retrovirales con plásmidos, en la que plásmidos individuales portan los genes de empaquetamiento retrovirales y marcadores de selección eucariotas únicos. Los genes de empaquetamiento se integran en el genoma de la línea celular de empaquetamiento y se describe que se transfectan de manera estable. A lo largo de los últimos 20 años, se han realizado diversos intentos por generar líneas celulares de empaquetamiento y producción estables para vectores retrovirales.
El documento WO2012/028681 describe métodos para producir líneas celulares de empaquetamiento lentiviral semiestables usando un vector híbrido de baculovirus-virus adenoasociado (AAV). El documento WO2003/064665 describe un sistema de producción lentiviral independiente de rev para producir una partícula de vector derivada de lentivirus.
Se han notificado muchos problemas en las líneas celulares de empaquetamiento y producción producidas mediante integración de componentes de vector retroviral en el genoma de la célula huésped. En primer lugar, la introducción secuencial de componentes de vector retroviral puede ser laboriosa e inflexible. También ha habido problemas con la inestabilidad genética y/o de transcripción de componentes de vector retroviral cuando se integran en el genoma de la célula huésped porque el sitio de integración es impredecible (Ni et al. (2005) J. Gene Med. 7: 818-834.). También se ha notificado una disminución significativa de la productividad de vector viral durante la adaptación de la suspensión y el aumento a escala de las líneas celulares de producción (Farson et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12: 981-997; Guy et al. (2013) Hum. Gene Ther. Methods. 24(2): 125-39).
Por tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método de producción de líneas celulares de empaquetamiento y producción retroviral estables que supere una o más de las desventajas asociadas con métodos existentes.
Sumario de la invención
Los presentes inventores han desarrollado una nueva manera de producir líneas celulares de empaquetamiento y producción que implica el uso de vectores de ácido nucleico que comprenden un origen de replicación no de mamífero y la capacidad de contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN, tal como cromosomas artificiales bacterianos, que comprende los genes retrovirales esenciales para la producción de vector retroviral. Esto permite la expresión de los genes retrovirales requeridos para la producción de partículas de vector retroviral defectuosas para la replicación para mejorar problemas asociados con métodos de transfección transitoria.
El uso de un vector de ácido nucleico que comprende un origen de replicación no de mamífero y que tiene la capacidad de contener al menos 25 kb de ADN (es decir, ADN de constructo grande) tiene varias ventajas. En primer lugar, los vectores pueden manipularse en primer lugar en células no de mamífero (por ejemplo, células microbianas, tales como células bacterianas) en vez de células huésped de mamífero, lo cual hace que sean mucho más fáciles de usar (por ejemplo, pueden manipularse en primer lugar cromosomas artificiales bacterianos en E. coli). Una vez que se ha preparado el vector de ácido nucleico, puede introducirse en una célula huésped de mamífero y puede seleccionarse cualquier célula de mamífero que tenga el vector de ácido nucleico integrado en los cromosomas endógenos con el fin de aislar una línea celular estable.
La introducción de los ácidos nucleicos retrovirales en la célula huésped de mamífero también se produce en una única etapa, lo cual ayuda a reducir la presión de selección y el intervalo de tiempo de silenciamiento. Esto permite un examen más rápido para seleccionar posibles células de empaquetamiento y reduce el coste de materiales porque solo se usa un único vector, en vez de métodos anteriores que usan múltiples vectores de plásmidos. En particular, el uso del sistema actual reduce el coste de fabricación ahorrando costes de plásmidos, reactivos de transfección requeridos (por ejemplo, polietilenimina [PEI]), reduciendo la cantidad de tratamiento con Benzonase requerido (hay una cantidad reducida de ADN en la recogida lentiviral, por tanto se necesita menos Benzonase para eliminar el exceso en el procesamiento aguas abajo) y un coste reducido de pruebas (no hay necesidad de realizar pruebas para detectar plásmido residual en el producto lentiviral).
Además, los genes retrovirales esenciales para la producción retroviral (con o sin el vector de transferencia) están presentes dentro del vector de ácido nucleico de modo que, cuando se introduce el vector en células huésped de mamífero, todos los genes retrovirales incorporados en el vector de ácido nucleico se integrarán en un locus dentro del genoma endógeno de la célula huésped de mamífero. Esto puede superar problemas tales como gene silenciamiento que puede producirse cuando los genes retrovirales se integran de manera aleatoria y en diferentes loci dentro del genoma de la célula huésped.
Por tanto, el uso de vectores de ácido nucleico de la invención proporciona ventajas en la generación de líneas celulares de empaquetamiento y producción retroviral.
En un aspecto de la invención, se proporciona un vector de ácido nucleico que comprende un origen de replicación no de mamífero, uno o una pluralidad de sitios de recombinación y la capacidad de contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN seleccionado de: un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial derivado de P1, un fásmido o un cósmido, que comprende secuencias de ácido nucleico retroviral que codifican para:
proteínas gag y pol, y
una proteína env obtenida o derivada a partir de un virus seleccionado de un Vesiculovirus, Lyssavirus, Arenavirus, Alphavirus, Filovirus, Coronavirus, Respirovirus, Hepacivirus, Influenzavirus y Nucleopolyhedrovirus
en el que cada una de las secuencias de ácido nucleico retroviral está dispuesta como constructos de expresión individuales dentro del vector de ácido nucleico.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método de producción de una línea celular de empaquetamiento retroviral estable, que comprende:
(a) introducir un vector de ácido nucleico que comprende un origen de replicación no de mamífero, uno o una pluralidad de sitios de recombinación y la capacidad de contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN seleccionado de: un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial derivado de P1, un fásmido o un cósmido, que comprende secuencias de ácido nucleico retroviral que codifican para:
proteínas gag y pol, y
una proteína env obtenida o derivada a partir de un virus seleccionado de un Vesiculovirus, Lyssavirus, Arenavirus, Alphavirus, Filovirus, Coronavirus, Respirovirus, Hepacivirus, Influenzavirus y Nucleopolyhedrovirus, en el que cada una de las secuencias de ácido nucleico retroviral tiene su propio promotor dentro del vector de ácido nucleico, en un cultivo de células huésped de mamífero; y
(b) seleccionar dentro del cultivo una célula huésped de mamífero que tiene las secuencias de ácido nucleico codificadas en el vector integradas en un cromosoma endógeno de la célula huésped de mamífero.
Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de producción de una partícula de vector retroviral defectuosa para la replicación, que comprende:
(a) introducir el vector de ácido nucleico que comprende un origen de replicación no de mamífero, uno o una pluralidad de sitios de recombinación y la capacidad de contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN seleccionado de: un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial derivado de P1, un fásmido o un cósmido, que comprende secuencias de ácido nucleico retroviral que codifican para:
proteínas gag y pol, y
una proteína env obtenida o derivada a partir de un virus seleccionado de un Vesiculovirus, Lyssavirus, Arenavirus, Alphavirus, Filovirus, Coronavirus, Respirovirus, Hepacivirus, Influenzavirus y Nucleopolyhedrovirus, en el que cada una de las secuencias de ácido nucleico retroviral tiene su propio promotor dentro del vector de ácido nucleico, en un cultivo de células huésped de mamífero;
(b) seleccionar dentro del cultivo una célula huésped de mamífero que tiene las secuencias de ácido nucleico codificadas en el vector integradas en un cromosoma endógeno de la célula huésped de mamífero; y
(c) cultivar adicionalmente la célula huésped de mamífero en condiciones en las que se produce la partícula de vector retroviral defectuosa para la replicación.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: guía paso a paso para la construcción de BACpack-WTGP-277deIU5 y BACpack-SYNGP-277deIU5. Figura 2: selección de una combinación policlonal estable. Se transfectaron células adherentes HEK293T con BACpackWTGagPol-Transfer usando fosfato de calcio. Se generaron combinaciones estables después de una selección con Zeocin de 2 semanas. Para ver si los transfectantes estables podían generar virus, se indujeron las combinaciones policlonales estables con doxiciclina durante 48 horas. Se recogió el sobrenadante viral 48 horas tras la inducción, se filtró a través de un filtro de 0,22 pm y se determinó su título transduciendo células HEK293T. Se usaron células transducidas positivas para GFP para calcular las unidades de transducción/ml (UT/ml).
Figura 3: generación de clones en suspensión de transfección estables. Se transfectaron células HEK293 6E con BACpackWTGagPol-Transfer usando reactivo 293fectin. Se generaron combinaciones estables después de una selección con Zeocin de 2 semanas. Se clonaron las combinaciones estables mediante dilución limitativa en placas de 96 pocillos para obtener clones celulares individuales, que posteriormente se expandieron. GFP detectada mediante microscopia de fluorescencia de los mejores clones 1, 14, 15 y 16, obtenidos con medio adherente (DMEM FBS) seguido por adaptación de suspensión (medio FreeStyle).
Figura 4: inducción de lentivirus en los clones en suspensión. Para ver si los transfectantes de HEK6E estables podían generar virus, se indujeron 20 ml de los clones en suspensión estables con doxiciclina (2 pg/ml) durante 48 horas. Se recogió el sobrenadante viral 48 horas tras la inducción, se filtró a través de un filtro de 0,45 pm y se determinó su título transduciendo células HEK293T. Se usaron células transducidas positivas para GFP para calcular las unidades de transducción/ml (UT/ml).
Figura 5: títulos de vector de clones producidos según el ejemplo 4. Los resultados muestran que los títulos de vector a partir de los clones 1 y 16 aumentaron de manera moderada entre el pase 5 y el pase 21.
Descripción detallada de la invención
DEFINICIONES
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
El término “que comprende” abarca “que incluye” o “que consiste”, por ejemplo, una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X Y.
El término “que consiste esencialmente en” limita el alcance de la característica a los materiales o etapas especificados y aquellos que no afectan sustancialmente a la(s) característica(s) básica(s) de la característica reivindicada.
El término “que consiste en” excluye la presencia de cualquier componente adicional.
El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10%, 5%, 2% o 1 %.
El término “vector” o “vector de ácido nucleico” se refiere a un vehículo que puede portar artificialmente material genético extraño (es decir, exógeno) al interior de otra célula, en la que puede replicarse y/o expresarse. Los ejemplos de vectores incluyen vectores de ácido nucleico no de mamífero, tales como cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC), cromosomas artificiales derivados de P1 (PAC), cósmidos o fásmidos.
Otros ejemplos de vectores incluyen vectores virales, tales como vectores retrovirales y lentivirales, que son de particular interés en la presente solicitud. Los vectores lentivirales, tales como los basados en virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), se usan ampliamente ya que pueden integrarse en células no proliferativas. Puede hacerse que los vectores virales sean defectuosos para la replicación dividiendo el genoma viral en partes independientes, por ejemplo, mediante colocación en plásmidos independientes. Por ejemplo, la denominada primera generación de vectores lentivirales, desarrollada por el Salk Institute for Biological Studies, se construyó como un sistema de expresión de tres plásmidos que consiste en un casete de expresión de empaquetamiento, el casete de expresión de envuelta y el casete de expresión de vector. El “plásmido de empaquetamiento” contiene las secuencias de gag-pol completas, las secuencias reguladoras (tat y rev) y las auxiliares (vif, vpr, vpu, nef). El “plásmido de envuelta” contiene la glicoproteína de virus de la estomatitis vesicular (VSVg) en sustitución de la proteína de la envuelta de VIH-1 nativa, bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV). El tercer plásmido (el “plásmido de transferencia”) porta las repeticiones terminales largas (LTR), secuencia de encapsulación (y ), la secuencia de elemento de respuesta a Rev (RRE) y el promotor de CMV para expresar el transgén dentro de la célula huésped.
La segunda generación de vector lentiviral se caracterizó por la deleción de las secuencias de virulencia vpr, vif, vpu y nef. El vector de empaquetamiento se redujo a los genes gag, pol, tat y rev, aumentando por tanto la seguridad del sistema.
Para mejorar el sistema lentiviral, de los vectores de tercera generación se han diseñado eliminando el gen tat a partir del constructo de empaquetamiento e inactivando la LTR a partir del casete de vector, reduciendo por tanto problemas relacionados con efectos de mutagénesis por inserción.
Las diversas generaciones de lentivirus se describen en las siguientes referencias: primera generación: Naldini et al. (1996) Science 272(5259): 263-7; segundo generación: Zufferey et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15(9): 871-5; tercera generación: Dull et al. (1998) J. Virol. 72(11): 8463-7, puede encontrarse una revisión sobre el desarrollo de vectores lentivirales en Sakuma et al. (2012) Biochem. J. 443(3): 603-18 y et al. (2008) Exp. Opin. Therap. Patents 18(5):525-539.
El término “origen de replicación no de mamífero” se refiere a una secuencia de ácido nucleico en la que se inicia la replicación y que se deriva a partir de una fuente no de mamífero. Esto permite que los vectores de ácido nucleico de la invención se repliquen de manera estable y se segreguen junto con cromosomas endógenos en una célula huésped adecuada (por ejemplo, una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o de levadura) de modo que puede transmitirse a la progenie de la célula huésped, excepto cuando la célula huésped es una célula huésped de mamífero. En células huésped de mamífero, los vectores de ácido nucleico con orígenes de replicación no de mamífero o bien se integrarán en los cromosomas endógenos de la célula huésped de mamífero o bien se perderán tras la replicación de la célula huésped de mamífero. Por ejemplo, los vectores de ácido nucleico con orígenes de replicación no de mamífero, tales como cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosoma artificial derivado de P1 (PAC), cósmidos o fásmidos, pueden replicarse de manera estable y segregarse junto con cromosomas endógenos en células bacterianas (tales como E. coli), sin embargo, si se introducen en células huésped de mamífero, el BAC, PAC, cósmido o fásmido o bien se integrará o bien se perderá tras la replicación de la célula huésped de mamífero. Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) pueden replicarse de manera estable y segregarse junto con cromosomas endógenos en células de levadura, sin embargo, si se introducen en células huésped de mamífero, el YAC o bien se integrará o bien se perderá tras la replicación de la célula huésped de mamífero. Por tanto, en este contexto, los vectores de ácido nucleico de la invención actúan como reservorios de ADN (es decir, para los genes esenciales para la producción retroviral) que pueden transferirse fácilmente al interior de células de mamífero para generar líneas celulares estables para la producción retroviral. Los ejemplos de orígenes de replicación no de mamífero incluyen orígenes de replicación bacterianos, tales como oriC, oriV u oriS, u orígenes de replicación de levadura, también conocidos como secuencias de replicación autónoma (elementos de ARS).
Los vectores de ácido nucleico de la presente invención comprenden un origen de replicación no de mamífero y pueden contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN. En una realización, el vector de ácido nucleico tiene la capacidad de contener al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 o 350 kb de ADN. Se entenderá que las referencias a la “capacidad de contener” tienen su significado habitual e implican que el límite superior para el tamaño de inserto para el vector de ácido nucleico no es menor que el tamaño reivindicado (es decir, no menos de 25 kb de ADN).
El objetivo de la presente invención es incluir los genes esenciales para el empaquetamiento retroviral en un único constructo (es decir, el vector de ácido nucleico). Por tanto, los vectores de ácido nucleico de la invención, deben poder contener grandes insertos ADN. Para evitar cualquier duda, se entenderá que referencias a “vectores de ácido nucleico” o “cromosomas artificiales” no se refieren a plásmidos bacterianos naturales (por ejemplo, tales como los plásmidos actualmente usados en métodos de transfección transitoria) porque no pueden contener al menos 25 kb de ADN. El tamaño máximo de inserto que puede contener un plásmido es de aproximadamente 15 kb. Tales vectores de ácido nucleico tampoco se refieren a bacteriófagos que generalmente solo contienen insertos máximos de 5-11 kb. Por tanto, en una realización el vector de ácido nucleico de la invención no es un plásmido, bacteriófago o episoma.
El término “cromosomas endógenos” se refiere a cromosomas genómicos encontrados en la célula huésped antes de la generación o introducción de un vector de ácido nucleico exógeno, tal como un cromosoma artificial bacteriano.
Los términos “transfección”, “transformación” y “transducción”, tal como se usan en el presente documento, pueden usarse para describir la inserción del vector viral o no de mamífero en una célula diana. La inserción de un vector se denomina habitualmente transformación para células bacterianas y transfección para células eucariotas, aunque la inserción de un vector viral también puede denominarse transducción. El experto conocerá los diferentes métodos de transfección no virales habitualmente usados, que incluyen el, pero no se limitan al, uso de métodos físicos (por ejemplo, electroporación, apriete de células, sonoporación, transfección óptica, fusión de protoplastos, impalefección, magnetofección, pistola génica o bombardeo de partículas), reactivos químicos (por ejemplo, fosfato de calcio, compuestos orgánicos altamente ramificados o polímeros catiónicos) o lípidos catiónicos (por ejemplo, lipofección). Muchos métodos de transfección requieren el contacto de disoluciones de ADN de plásmido con las células, que después se hacen crecer y se seleccionan para detectar la expresión de gen marcador.
El término “promotor” se refiere a una secuencia que impulsa la expresión génica. Con el fin de impulsar un alto nivel de expresión, puede resultar beneficioso usar un promotor de alta eficiencia, tal como un promotor de alta eficiencia no retroviral. Los ejemplos de promotores adecuados pueden incluir un promotor tal como el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) humano, promotor de virus de formación de foco de bazo (VFFB), promotor de virus del sarcoma de Rous (VSR) o promotor de factor de elongación 1 -alfa (pEF) humano.
Puede usarse un operón Tet (activación transcripcional controlada por tetraciclina) en un método de expresión génica inducible, en el que la transcripción se activa o desactiva de manera reversible en presencia del antibiótico tetraciclina o uno de sus derivados (por ejemplo, doxiciclina). En la naturaleza, el promotor de Ptet expresa TetR, el represor, y TetA, la proteína que bombea antibiótico tetraciclina fuera de la célula. En la presente invención, el operón Tet puede estar presente o ausente, por ejemplo, en una realización el operón Tet puede estar presente en el promotor.
El término “marcador seleccionable” se refiere a un gen que ayudará a seleccionar células que expresan de manera activa un gen insertado (por ejemplo, un transgén). Los ejemplos de marcadores de selección adecuados incluyen enzimas que codifican para resistencia a un antibiótico (es decir, un gen de resistencia a antibiótico), por ejemplo, kanamicina, neomicina, puromicina, higromicina, blasticidina o Zeocin. Otro ejemplo de marcadores de selección adecuados son proteínas fluorescentes, por ejemplo proteína verde fluorescente (GFP), proteína roja fluorescente (RFP) o proteína azul fluorescente (BFP).
El término “señal de poliA” se refiere a una secuencia de señal de poliadenilación, por ejemplo colocada en 3’ de un transgén, que permite que factores huésped añadan una cola de poliadenosina (poliA) al extremo del ARNm naciente durante la transcripción. La cola de poliA es un tramo de hasta 300 ribonucleótidos de adenosina que protege al ARNm frente a la degradación enzimática y también ayuda en la traducción. Por consiguiente, los vectores de ácido nucleico de la presente invención pueden incluir una secuencia de señal de poliA tal como las señales de poliA de beta-globina humana o de beta-globina de conejo, las señales de poliA temprana o tardía de virus del simio 40 (VS40), la señal de poliA de insulina humana, o la señal de poliA de hormona del crecimiento bovina. En una realización, la secuencia de señal de poliA es la señal de poliA de beta-globina humana.
El término “secuencia de intrón” se refiere a una secuencia de nucleótidos que se retira a partir del producto génico final mediante corte y empalme de ARN. Se ha mostrado que el uso de un intrón en el sentido de 3’ de la región de potenciador/promotor y en el sentido de 5’ del inserto de ADNc aumenta el nivel de expresión génica. El aumento de la expresión depende del inserto de ADNc particular. Por consiguiente, el vector de ácido nucleico de la presente invención puede incluir intrones tales como intrón de beta-globina humana, intrón II de beta-globina de conejo o un intrón quimérico de globina-inmunobeta-globina humana. En una realización, el intrón es un intrón de beta-globina humana y/o un intrón II de beta-globina de conejo.
El término “línea celular de empaquetamiento” se refiere a una línea celular con genes de proteína gag y pol y de glicoproteína de la envuelta insertados de manera estable. Alternativamente, el término “línea celular productora” se refiere a una línea celular de empaquetamiento con un vector de transferencia insertado de manera estable que contiene un transgén de interés. Un experto en la técnica entenderá que los vectores de ácido nucleico descritos en el presente documento pueden usarse para generar líneas celulares de empaquetamiento (es decir, cuando al menos los genes gag, pol y env están presentes en el vector de ácido nucleico y se incorporan en una célula huésped) o líneas celulares productoras (es decir, cuando el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente los componentes de vector de transferencia que van a incorporarse en una célula huésped junto con los genes gag, pol y env).
El término “transfectado de manera estable” se refiere a líneas celulares que pueden pasar genes retrovirales introducidos a su progenie (es decir, células hijas), o bien porque el ADN transfectado se ha incorporado en los cromosomas endógenos o bien mediante herencia estable de cromosomas exógenos.
VECTORES DE ÁCIDO NUCLEICO
Según un aspecto de la invención, se proporciona un vector de ácido nucleico que comprende un origen de replicación no de mamífero, uno o una pluralidad de sitios de recombinación y la capacidad de contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN seleccionado de: un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial derivado de P1, un fásmido o un cósmido, que comprende secuencias de ácido nucleico retroviral que codifican para:
proteínas gag y pol, y
una proteína env obtenida o derivada a partir de un virus seleccionado de un Vesiculovirus, Lyssavirus, Arenavirus, Alphavirus, Filovirus, Coronavirus, Respirovirus, virus sincitial respiratorio, Hepacivirus, Influenzavirus y Nucleopolyhedrovirus
en el que, cada una de las secuencias de ácido nucleico retroviral tiene su propio promotor dentro del vector de ácido nucleico.
Los métodos actuales para generar vectores retrovirales implican la transfección transitoria de los genes retrovirales al interior de una célula huésped. Sin embargo, se han asociado muchas desventajas con este método porque es costoso, laborioso y difícil de aumentar a escala. Una solución sería modificar por ingeniería una línea celular de empaquetamiento que incorpore de manera estable los genes de empaquetamiento retrovirales para evitar los problemas asociados con la transfección transitoria y reducir la y salida de vector retroviral variable.
Los presentes inventores han encontrado que pueden usarse vectores de ácido nucleico descritos en el presente documento para generar una línea celular de empaquetamiento retroviral que mejora dificultades anteriores asociadas con métodos de producción de vectores retrovirales. Por ejemplo, los métodos conocidos de producción de líneas celulares de empaquetamiento retrovirales implican múltiples rondas de selección después introducirse cada gen retroviral. Este procedimiento puede tardar hasta seis meses y requiere mucho trabajo. Incluyendo todos los genes retrovirales en el vector de ácido nucleico, entonces pueden insertarse los genes retrovirales en los cromosomas endógenos de una célula huésped de mamífero en una única etapa. Por tanto, el uso de un vector de ácido nucleico, tal como se propone en el presente documento, reducirá la presión de selección, reducirá el intervalo de tiempo de silenciamiento y permitirá una selección más rápida de posibles células de empaquetamiento. Además, los genes retrovirales incluidos en el vector de ácido nucleico se integrarán todos ellos en los cromosomas endógenos de la célula huésped de mamífero en un único locus, lo cual reducirá el riesgo de que se silencien genes retrovirales individuales y garantizará que todos los genes retrovirales se expresan de manera uniforme.
En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican para el genoma de ARN de una partícula de vector retroviral. Se entenderá que el genoma de ARN de la partícula de vector retroviral se incluye habitualmente en el “vector de transferencia” usado en los métodos de transfección transitoria. El plásmido de vector de transferencia contiene generalmente un promotor (tal como CMV), la 3’-LTR (que puede o no ser una 3’-LTR autoinactivante (es decir, SIN)), la 5’-LTR (que puede o no contener la región U5), la secuencia de encapsidación (y ) y posiblemente el transgén unido a un promotor.
En una realización, múltiples copias del genoma de ARN de la partícula de vector retroviral (es decir, el vector de transferencia) están incluidas en el vector de ácido nucleico. Se espera que múltiples copias del vector de transferencia den como resultado un título de vector viral superior. Por ejemplo, el vector de ácido nucleico puede incluir dos o más, tal como tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o más copias del genoma de ARN de la partícula de vector retroviral (es decir, el vector de transferencia).
En una realización, el vector de ácido nucleico contiene uno o una pluralidad de sitios de recombinación. Esto permite integrar secuencias diana en los cromosomas endógenos de la célula huésped de mamífero de una manera específica del sitio en presencia de una enzima recombinasa. La enzima recombinasa cataliza la reacción de recombinación entre dos sitios de recombinación.
En la técnica se conocen muchos tipos de sistemas de recombinación específicos del sitio, y puede usarse cualquier sistema de recombinación adecuado en la presente invención. Por ejemplo, en una realización, el/los sitio(s) de recombinación se selecciona(n) o se deriva(n) a partir del sistema de int/att de fago lambda, el sistema de Cre/lox de bacteriófago P1, el sistema de FLP/FRT de levadura, el sistema de recombinasa Gin/gix de fago Mu, el sistema de recombinasa Cin, el sistema de recombinasa Pin de E. coli y el sistema de R/RS del plásmido pSR1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización adicional, el sitio de recombinación es un sitio de att (por ejemplo, del fago lambda), en el que el sitio de att permite la integración dirigida al sitio en presencia de una integrasa lambda. Se entenderá que la referencia a “integrasa lambda” incluye referencias a integrasas mutantes que todavía son compatibles con el sistema de int/att, por ejemplo las integrasas lambda modificadas descritas en el documento WO 2002/097059.
En una realización, el vector de ácido nucleico se selecciona de: un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial derivado de P1 (PAC), fásmido o un cósmido. En una realización adicional, el vector de ácido nucleico es un cromosoma artificial bacteriano (BAC).
Cromosomas artificiales bacterianos
El término “cromosoma artificial bacteriano” o “BAC” se refiere a un constructo de ADN derivado a partir de plásmidos bacterianos que puede contener un gran inserto de ADN exógeno. Habitualmente pueden contener un inserto de ADN máximo de aproximadamente 350 kb. Los BAC se desarrollaron a partir del plásmido de fertilidad funcional bacteriano bien caracterizado (plásmido F) que contiene genes de reparto que fomentan la distribución uniforme de plásmidos tras la división de células bacterianas. Esto permite que los BAC se repliquen y segreguen de manera estable junto con genomas bacterianos endógenos (tales como E. coli). El BAC habitualmente contiene al menos una copia de un origen de replicación (tal como el gen oriS o oriV), el gen repE (para replicación de plásmidos y regulación del número de copias) y genes de reparto (tales como sopA, sopB, parA, parB y/o parC) lo cual garantiza el mantenimiento estable del BAC en células bacterianas. Los BAC son de manera natural circulares y están superenrollados, lo cual hace que sean más fáciles de recuperar que cromosomas artificiales lineales, tales como los YAC. También pueden introducirse en células huésped bacterianas de manera relativamente fácil, usando métodos sencillos tales como electroporación.
En una realización, el cromosoma artificial bacteriano comprende un gen oriS. En una realización, el cromosoma artificial bacteriano comprende un gen repE. En una realización, el cromosoma artificial bacteriano comprende genes de reparto. En una realización adicional, los genes de reparto se seleccionan de sopA, sopB, parA, parB y/o parC. En aún una realización adicional, el cromosoma artificial bacteriano comprende un gen sopA y sopB.
El BAC para su uso en la presente invención puede obtenerse a partir de fuentes comerciales, por ejemplo el pSMART BAC de LUCIGEN™ (véase el n.° de registro de genoma EU101022.1 para la secuencia de estructura principal completa). Este BAC contiene el sistema de “aumento de copias” de L-arabinosa que también contiene el origen de replicación de número de copias medio oriV, que solo es activo en presencia de la proteína de replicación TrfA. El gen para TrfA puede incorporarse en el genoma de células huésped bacterianas bajo el control del promotor inducible por L-arabinosa araC-PBAD (véase Wild et al. (2002) Genome Res. 12(9): 1434-1444). La adición de L-arabinosa induce la de TrfA, que activa oriV, haciendo que el plásmido se replique hasta 50 copias por célula.
Cromosomas artificiales de levadura
El término “cromosoma artificial de levadura” o “YAC” se refiere a cromosomas en los que se incorpora ADN de levadura en plásmidos bacterianos. Contienen una secuencia de replicación autónoma (ARS) (es decir, un origen de replicación), un centrómero y telómeros. A diferencia de los BAC, el YAC es lineal y, por tanto, contiene telómeros de levadura en cada extremo del cromosoma para proteger los extremos frente a la degradación a medida que se pasa a la progenie de la célula huésped. Los YAC pueden contener un intervalo de tamaños de inserto de ADN; cualquier tamaño entre 100-2000 kb.
Cromosomas artificiales derivados de P1
El término “cromosoma artificial derivado de P1” o “PAC” se refiere a constructos de ADN derivados a partir del ADN del bacteriófago P1 y plásmido F bacteriano. Habitualmente pueden contener un inserto de ADN máximo de aproximadamente 100-300 kb y se usan como vectores de clonación en E. coli. Los PAC tienen ventajas similares a los BAC, tales como ser fáciles de purificar e introducir en células huésped bacterianas.
Cósmidos y fásmidos
El término “cósmido” se refiere a constructos de ADN derivados a partir de plásmidos bacterianos que adicionalmente contienen sitios de cos derivados a partir de bacteriófago lambda. Los cósmidos contienen generalmente un origen de replicación bacteriano (tal como oriV), un marcador de selección, un sitio de clonación y al menos un sitio de cos. Los cósmidos pueden aceptar habitualmente un inserto de ADN máximo de 40-45 kb. Se ha mostrado que los cósmidos son más eficientes para infectar células de E. coli que los plásmidos bacterianos convencionales. El término “fásmidos” se refiere a vectores de ácido nucleico no de mamífero que son similares a los cósmidos, excepto porque se basan en el plásmido F bacteriano. En particular, usan el origen de replicación de plásmido F y mecanismos de reparto para permitir la clonación de grandes fragmentos de ADN. Los fásmidos pueden aceptar habitualmente un inserto de ADN máximo de 40 kb.
RETROVIRUS
Los retrovirus son una familia de virus que contienen un genoma de ARN monocatenario pseudodiploide. Codifican para una transcriptasa inversa que produce ADN a partir del genoma de ARN que entonces puede insertarse en el ADN de la célula huésped. La invención descrita en el presente documento puede usarse para producir partículas de vector retroviral defectuosas para la replicación. La partícula de vector retroviral de la presente invención puede seleccionarse o derivarse a partir de cualquier retrovirus adecuado.
En una realización, la partícula de vector retroviral se deriva o selecciona de un lentivirus, alfa-retrovirus, gammaretrovirus o retrovirus espumoso, tal como un lentivirus o gamma-retrovirus, en particular un lentivirus. En una realización adicional, la partícula de vector retroviral es un lentivirus seleccionado del grupo que consiste en VIH-1, VIH-2, VIS, VIF, VAIE y Visna. Los lentivirus pueden infectar células que no están en división (es decir, quiescentes) lo cual hace que sean vectores retrovirales atractivos para terapia génica. En aún una realización adicional, la partícula de vector retroviral es VIH-1 o se deriva a partir de VIH-1. La estructura genómica de algunos retrovirus puede encontrarse en la técnica. Por ejemplo, pueden encontrarse detalles sobre VIH-1 a partir del NCBI Genbank (n.° de registro de genoma AF033819). VIH-1 es uno de los retrovirus mejor entendidos y, por tanto, se usa con frecuencia como vector retroviral.
Genes retrovirales
Las secuencias de ácido nucleico comunes para todos los retrovirus pueden explicarse en más detalle de la siguiente manera:
Repeticiones terminales largas (LTR): la estructura básica de un genoma de retrovirus comprende una 5’-LTR y una 3’-LTR, entre o dentro de las cuales están ubicados los genes requeridos para la producción retroviral. Las lTr se requieren para la integración y transcripción retroviral. También pueden actuar como secuencias de promotor para controlar la expresión de los genes retrovirales (es decir, son genes que actúan en cis). Las LTR están compuestas por tres subregiones denominadas U3, R, U5: U3 se deriva a partir de la secuencia única del extremo 3’ del ARN; R se deriva a partir de una secuencia repetida en ambos extremos del ARN; y U5 se deriva a partir de la secuencia única del extremo 5’ del ARN. Por tanto, en una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente una 5’ y 3’-LTR. En una realización adicional, la región U5 de la 5’-LTR puede delecionarse y sustituirse por una cola de poliA distinta de VIH-1 (véase Hanawa et al. (2002) Mol. Ther. 5(3): 242-51).
Con el fin de abordar preocupaciones de seguridad referentes a la generación de virus competentes para la replicación, se ha desarrollado un vector autoinactivante (SIN) delecionando una sección en la región U3 de la 3’-LTR, que incluye la caja TATA y sitios de unión para factores de transcripción Sp1 y NF-kB (véase Miyoshi et al. (1998) J. Virol. 72(10):8150-7). La deleción se transfiere a la 5’-LTR después de la transcripción inversa y la integración en células infectadas, lo cual da como resultado la inactivación transcripcional de la LTR. Esto se conoce como sistema de vector basado en lentivirus autoinactivante que puede incluirse en la presente invención.
i^: la encapsidación de los ARN retrovirales se produce gracias a una secuencia ^ (psi) ubicada en el extremo 5’ del genoma retroviral. También se conoce bien en la técnica que las secuencias en el sentido de 3’ de la secuencia psi y que se extienden a la región que codifica para gag participan en la producción de vector retroviral eficiente (véase Cui et al. (1999) J. Virol. 73(7): 6171-6176). En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente una secuencia ^ (psi).
Sitio de unión a cebador (PBS): el genoma retroviral contiene un PBS que está presente después de la región U5 de la 5’-LTR. Este sitio se une al cebador de ARNt requerido para la iniciación de la transcripción inversa. En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente una secuencia de PBS.
PPT: los genomas retrovirales contienen tramos cortos de purina, denominados tractos de polipurina (PPT), cerca del extremo 3’ del genoma retroviral. Estos PPT funcionan como cebadores de ARN para la síntesis de ADN de cadena positiva durante la transcripción inversa. Los retrovirus complejos (tales como VIH-1) contienen un segundo PPT ubicado de manera más central (es decir, un tracto de polipurina central (cPPT)) que proporciona un segundo sitio para la iniciación de la síntesis de ADN. Se ha mostrado que los vectores retrovirales que codifican para un cPPT tienen una transducción y expresión transgénica potenciadas (véase Barry et al. (2001) Hum. Gene Ther.
12(9):1103-8). En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente una secuencia de 3’-PPT y/o una secuencia de cPPT.
La estructura genómica de las regiones no codificantes descritas anteriormente la conoce bien un experto en la técnica. Por ejemplo, detalles sobre la estructura genómica de las regiones no codificantes en VIH-1 pueden encontrarse a partir del NCBI Genbank con el n.° de registro de genoma AF033819, o para VIH-1 HXB2 (una cepa de referencia de VIH-1 habitualmente usada) con el n.° de registro de genoma K03455. En una realización, las regiones no codificantes se derivan a partir de las secuencias disponibles en el n.° de registro de genoma K03455, por ejemplo a partir de los pares de bases 454-1126 (para R-U5-PBS-Gag), 7622-8479 (para RRE) o 7769-8146 (para RRE), 4781-4898 (para cPPT), 9015-9120 y 9521 -9719 (para dNEF-PPT-sinU3-R-U5).
Gag/pol: la expresión de los genes gag y pol se basa en un desplazamiento de marco de traducción entre gag y gagpol. Ambas son poliproteínas que se escinden durante la maduración. Las proteínas de la matriz estructural principal, la cápside y la nucleocápside del vector retroviral se codifican por gag. El gen pol codifica para las enzimas retrovirales: i) transcriptasa inversa, esencial para la transcripción inversa del genoma de ARN retroviral para dar ADN bicatenario, ii) integrasa, que permite la integración del genoma de ADN retroviral en el cromosoma de una célula huésped, y iii) proteasa, que escinde la poliproteína sintetizada con el fin de producir las proteínas maduras y funcionales del retrovirus. En una realización, la secuencia de ácido nucleico retroviral que codifica para las proteínas gag y pol se deriva a partir de la secuencia de VIH-1 HXB2, que está disponible en el n.° de registro de genoma K03455, por ejemplo a partir de los pares de bases 790-5105.
Env: el gen env (“envuelta”) codifica para los componentes de superficie y transmembrana de la envuelta retroviral (por ejemplo, glicoproteínas gp120 y gp41 de VIH-1) y participa en la fusión de retrovirus-membrana celular. Con el fin de ampliar el tropismo tisular del vector retroviral, los vectores retrovirales descritos en el presente documento pueden pseudotiparse con una proteína de la envuelta de otro virus. El pseudotipado se refiere al proceso mediante el cual puede expandirse o alterarse la gama de células huésped de vectores retrovirales, incluyendo vectores lentivirales, cambiando las glicoproteínas (GP) en las partículas de vector retroviral (por ejemplo, usando GP obtenidas o derivadas a partir de otros virus con envuelta o usando GP sintéticas/artificiales). La glicoproteína más habitualmente usada para pseudotipar vectores retrovirales es la GP de virus de la estomatitis vesicular (VSVg), debido a su amplio tropismo y alta estabilidad de partículas de vector. Sin embargo, el experto entenderá que pueden usarse otras glicoproteínas para el pseudotipado (véase Cronin et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5(4):387-398). La elección del virus usado para el pseudotipado también puede depender del tipo de célula y/u órgano que va a seleccionarse como diana, porque se ha mostrado que algunos pseudotipos tienen preferencias de tipo de tejido.
En una realización, la proteína env o un sustituto funcional de la misma se obtiene o deriva a partir de un virus seleccionado de un Vesiculovirus (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular), Lyssavirus (por ejemplo, virus de la rabia, virus Mokola), Arenavirus (por ejemplo, virus de la coriomeningitis linfocítica (VCML)), Alphavirus (por ejemplo, virus del río Ross (VRR), virus Sindbis, virus del bosque Semliki (VBS), virus de la encefalitis equina de Venezuela), Filovirus (por ejemplo, virus del Ébola de Reston, virus del Ébola de Zaire, virus Lassa), Coronavirus (por ejemplo, SARS-CoV), Respirovirus (por ejemplo, virus de Sendai, virus sincitial respiratorio (VSR)), Hepacivirus (por ejemplo, virus de la hepatitis C (VHC)), Influenzavirus (por ejemplo, virus influenza A) y Nucleopolyhedrovirus (por ejemplo, múltiples nucleopolihedrovirus de Autographa californica (AcMNPV)). En una realización adicional, la proteína env o un sustituto funcional de la misma se obtiene o deriva a partir de virus de la estomatitis vesicular. En esta realización, puede usarse la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSVg) lo que permite que las partículas retrovirales infecten una gama más amplia de células huésped y elimina las probabilidades de recombinación para producir proteínas de la envuelta de tipo natural. En una realización adicional, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína env, se deriva a partir de la secuencia disponible en el n.° de registro de genoma J02428.1, por ejemplo a partir de los pares de bases 3071 a 4720.
Los genes estructurales descritos en el presente documento son comunes a todos los retrovirus. Pueden encontrarse genes auxiliares adicionales en diferentes tipos de retrovirus. Por ejemplo, los lentivirus, tales como VIH-1, contienen seis genes auxiliares adicionales conocidos como rev, vif, vpu, vpr, nef y tat. Otros retrovirus pueden tener genes auxiliares que son análogos a los genes descritos en el presente documento, sin embargo puede no habérseles dado siempre el mismo nombre en la bibliografía. Referencias tales como Tomonaga y Mikami (1996) J. Gen. Virol. 77(Pt 8):1611-1621 describen diversos genes auxiliares de retrovirus.
Rev: El gen auxiliar rev (“regulador de virión”) codifica para una proteína auxiliar que se une al elemento de respuesta a Rev (RRE) y facilita la exportación de transcritos retrovirales. El producto de proteína del gen permite exportar fragmentos de ARNm retroviral que contienen el elemento de respuesta a Rev (RRE) desde el núcleo hasta el citoplasma. Se predice que la secuencia de RRE forma una estructura plegada compleja. Esta función particular de rev refleja un estrecho acoplamiento de las etapas de corte y empalme y de exportación nuclear. En una realización, el vector de ácido nucleico comprende una secuencia de RRE. En una realización adicional, la secuencia de RRE se deriva a partir de la secuencia de VIH-1 HXB2, que está disponible en el n.° de registro de genoma K03455, por ejemplo a partir de los pares de bases 7622 a 8479, o 7769 a 8146, en particular los pares de bases 7622 a 8479.
Rev se une a RRE y facilita la exportación de transcritos virales sometidos a un único corte y empalme (env, vif, vpr y vpu) o no sometidos a corte y empalme (gag, pol y ARN genómico), conduciendo por tanto a acontecimientos aguas abajo tales como traducción génica y empaquetamiento (véase Suhasini y Reddy (2009) Curr. VIH Res. 7(1): 91-100). En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente el gen auxiliar rev o un gen análogo al mismo (es decir, procedente de otros retrovirus o un sistema funcionalmente análogo). La inclusión del gen rev garantiza la exportación eficiente de transcritos de ARN del genoma de vector retroviral desde el núcleo hasta el citoplasma, especialmente si también se incluye un elemento RRE en el transcrito que va a transportarse. En una realización adicional, el gene rev comprende al menos el 60% de identidad de secuencia, tal como al menos el 70% de identidad de secuencia con respecto a los pares de bases 970 a 1320 del n.° de registro de genoma M11840 (es decir, ADNc de clon 12 de VlH-1, el locus HIVPCV12). En una realización alternativa, el gen rev comprende al menos el 60% de identidad de secuencia, tal como al menos el 70%, 80%, 90% o 100% de identidad de secuencia con respecto a los pares de bases 5970 a 6040 y 8379 a 8653 del n.° de registro de genoma K03455.1 (es decir, virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1, HXB2).
Se piensa que los genes auxiliares desempeñan un papel en la replicación retroviral y la patogénesis, por tanto muchos sistemas de producción de vectores virales actuales no incluyen algunos de estos genes. La excepción es rev, que habitualmente está presente o posiblemente se usa un sistema análogo al sistema de rev/RRE. Por tanto, en una realización, las secuencias de ácido nucleico que codifican para uno o más de los genes auxiliares vpr, vif, vpu, tat y nef, o genes auxiliares análogos, se alteran de tal manera que dichos genes auxiliares se eliminan del genoma de ARN de la partícula de vector retroviral o no pueden codificar para proteínas auxiliares funcionales. En una realización adicional, al menos dos o más, tres o más, cuatro o más, o la totalidad de los genes auxiliares vpr, vif, vpu, tat y nef, o genes auxiliares análogos, se alteran de tal manera que dichos genes auxiliares se eliminan del genoma de ARN de la partícula de vector retroviral o no pueden codificar para proteínas auxiliares funcionales. La eliminación del gen auxiliar funcional puede no requerir la eliminación de todo el gen; la eliminación de una parte del gen o la alteración del gen será suficiente.
Se entenderá que las secuencias de ácido nucleico que codifican para la partícula de vector retroviral defectuosa para la replicación pueden ser las mismas que, o derivarse a partir de, los genes de tipo natural del retrovirus en el que se basa la partícula de vector retroviral, es decir las secuencias pueden ser versiones modificadas genéticamente o de otro modo de secuencias contenidas en el virus de tipo natural. Por tanto, los genes retrovirales incorporados en los vectores de ácido nucleico o genomas de célula huésped, también pueden referirse a versiones de codones optimizados de los genes de tipo natural.
COMPONENTES ADICIONALES
Los vectores de ácido nucleico de la invención pueden comprender otros componentes adicionales. Estas características adicionales pueden usarse, por ejemplo, para ayudar a estabilizar transcritos para la traducción, aumentar el nivel de expresión génica y activar/desactivar la transcripción génica.
Las partículas de vector retroviral producidas por la invención pueden usarse en métodos de terapia génica. Por tanto, en una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente uno o más transgenes. Este transgén puede ser un gen terapéuticamente activo que codifica para un producto génico que puede usarse para tratar o mejorar una enfermedad diana. El transgén puede codificar, por ejemplo, para un ARN antisentido, una ribozima, una proteína (por ejemplo, una proteína supresora de tumor), una toxina, un antígeno (que puede usarse para inducir anticuerpos o células T cooperadoras o células T citotóxicas) o un anticuerpo (tal como un anticuerpo de cadena sencilla). En una realización, el transgén codifica para beta-globina.
Se espera que múltiples copias del vector de transferencia que contiene el transgén den como resultado un título de vector retroviral superior, por tanto, en una realización, el vector de ácido nucleico comprende múltiples copias del transgén, tal como dos o más, en particular tres o más, copias del transgén. En algunos casos, se requiere más de un producto génico para tratar una enfermedad, por tanto, en una realización adicional, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente dos o más, tal como tres o más, o cuatro o más, transgenes diferentes.
Las referencias en el presente documento a “transgén” se refieren a ADN heterólogo o extraño que no está presente o no se expresa suficientemente en la célula huésped de mamífero en la que se introduce. Esto puede incluir, por ejemplo, cuando un gen diana no se expresa correctamente en la célula huésped de mamífero, por tanto se introduce una versión corregida del gen diana como transgén. Por tanto, el transgén puede ser un gen con posible interés terapéutico. El transgén puede haberse obtenido a partir de otro tipo de célula, u otra especie, o haberse preparado de manera sintética. Alternativamente, el transgén puede haberse obtenido a partir de la célula huésped, pero unido operativamente a regiones reguladoras que son diferentes de las presentes en el gen nativo. Alternativamente, el transgén puede ser un alelo o variante diferente de un gen presente en la célula huésped.
El objetivo de terapia génica es modificar el material genético de células vivas con fines terapéuticos, e implica la inserción de un gen funcional en una célula para lograr un efecto terapéutico. El vector retroviral producido usando los vectores de ácido nucleico y las células huésped descritos en el presente documento puede usarse para transfectar células diana e inducir la expresión del gen de posible interés terapéutico. Por tanto, el vector retroviral puede usarse para el tratamiento de un sujeto mamífero, tal como un sujeto humano, que padece un estado incluyendo, pero sin limitarse a trastornos hereditarios, cáncer y determinadas infecciones virales.
En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente un elemento de regulación de la transcripción. Por ejemplo, cualquiera de los elementos descritos en el presente documento puede unirse operativamente a un promotor de modo que puede controlarse la expresión. Los promotores a los que se hace referencia en el presente documento pueden incluir promotores conocidos, en su totalidad o en parte, que pueden actuar de manera constitutiva o ser inducibles, por ejemplo, en presencia de una proteína reguladora. En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente un promotor de alta eficiencia, tal como un promotor de CMV. Este promotor tiene la ventaja de promover un alto nivel de expresión de los elementos codificados en el vector de ácido nucleico no de mamífero. En una realización adicional, el promotor de CMV comprende una secuencia derivada a partir de la cepa de citomegalovirus humano AD169. Esta secuencia está disponible en el n.° de registro de genoma X17403, por ejemplo a partir de los pares de bases 173731 a 174404.
En una realización, el promotor (tal como un promotor de CMV) comprende adicionalmente al menos un operón Tet. El sistema de operón Tet puede usarse para controlar la expresión de las secuencias retrovirales contenidas dentro del vector de ácido nucleico. En resumen, la proteína represora de Tet bloquea la expresión mediante unión al sitio de operón Tet que se introduce en el promotor. Por tanto, cuando se une el represor de Tet al operón Tet, no hay ninguna expresión génica. Al añadir tetraciclina o doxiciclina, el represor de Tet se secuestra permitiendo la actividad de promotor, por tanto se activa la expresión génica. Los sistemas de operón Tet están ampliamente disponibles, tales como el operón Tet usado en el vector de expresión de mamífero pcDNN™4/TO disponible de Invitrogen.
En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente una proteína represora de operón de resistencia a tetraciclina (“represor de Tet” o “TetR”). En una realización adicional, el represor de Tet presenta codones optimizados.
En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente un aislante, tal como un aislante de cromatina. El término “aislante” se refiere a una secuencia genética que bloquea la interacción entre promotores y potenciadores. En una realización adicional, el aislante (tal como un aislante de cromatina) está presente entre cada una de las secuencias de ácido nucleico retroviral. Esto ayuda a impedir la interferencia de promotor (es decir, cuando el promotor de una unidad de transcripción altera la expresión de una unidad de transcripción adyacente) entre secuencias de ácido nucleico retroviral adyacentes. Se entenderá que si los aislantes están presentes en el vector de ácido nucleico entre cada una de las secuencias de ácido nucleico retroviral, entonces pueden estar dispuestos como constructos de expresión individuales dentro del vector de ácido nucleico. Por ejemplo, cada secuencia que codifica para las secuencias de ácido nucleico retroviral tiene su propio promotor y/o un intrón y/o señal de poliA. En una realización, el aislante de cromatina tiene al menos el 90% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos el 95% de identidad de secuencia, con respecto a la secuencia de aislante de HS4 de pollo (Gallus gallus) (por ejemplo, véase el n.° de registro de genoma U78775.2, pares de bases 1 a 1205).
En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente un marcador seleccionable. Esto permite seleccionar las células que han incorporado las secuencias de ácido nucleico que codifican para una partícula de vector retroviral defectuosa para la replicación. En una realización adicional, el marcador seleccionable es un gen de resistencia a antibiótico, tal como un gen de resistencia a Zeocin, kanamicina o puromicina, en particular un gen de resistencia a Zeocin (ZeoR). En aún una realización adicional, el gen de resistencia a Zeocin se deriva a partir del gen ble de Streptoalloteichus hindustans, por ejemplo véase el n.° de registro de genoma X52869.1 a partir de los pares de bases 3 a 377.
En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente una señal de poliA. El uso de una señal de poliA tiene la ventaja de proteger el ARNm frente a la degradación enzimática y ayudar en la traducción. En una realización adicional, la señal de poliA se obtiene o deriva a partir de VS40, hormona del crecimiento bobina y/o beta-globina humana. En una realización, la señal de poliA se deriva a partir de la señal de poliA temprana de VS40 (por ejemplo, véase el n.° de registro de genoma EF579804.1, pares de bases 2668 a 2538 a partir de la cadena negativa). En una realización, la señal de poliA se deriva a partir de la señal de poliA de beta-globina humana (por ejemplo, véase el n.° de registro de genoma GU324922.1, pares de bases 3394 a 4162).
En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente una secuencia de intrón. Se sabe que el uso de un intrón en el sentido de 3’ de la región de potenciador/promotor y en el sentido de 5’ del inserto de ADNc (es decir, el transgén) aumenta el nivel de expresión del inserto. En una realización adicional, la secuencia de intrón es un intrón de beta-globina humana o la secuencia de intrón II de beta-globina de conejo. En una realización, el intrón de beta-globina humana se deriva a partir de la secuencia disponible en el n.° de registro de genoma KM504957.1 (por ejemplo, a partir de los pares de bases 476 a 1393). En una realización, el intrón II de beta-globina de conejo se deriva a partir de la secuencia disponible en el n.° de registro de genoma V00882.1 (por ejemplo, a partir de los pares de bases 718 a 1290).
En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente un elemento regulador postranscripcional de la hepatitis de la marmota (WPRE). Se ha mostrado que la presencia de WPRE potencia la expresión y, como tal, es probable que sea beneficioso para alcanzar altos niveles de expresión. En una realización adicional, el WPRE se deriva a partir de la secuencia disponible en el n.° de registro de genoma J04514.1 (por ejemplo, a partir de los pares de bases 1093 a 1684).
En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES). Un IRES es un elemento de ARN estructurado que se encuentra habitualmente en la región no traducida en 5’ en el sentido de 3’ de la caperuza en 5’ (que se requiere para el ensamblaje del complejo de iniciación). El IRES se reconoce por factores de iniciación de la traducción y permite la traducción independiente de caperuza. En una realización adicional, el IRES se deriva a partir del genoma del virus de la encefalomiocarditis (VEMC) (por ejemplo, véase el n.° de registro de genoma KF836387.1, pares de bases 151 a 724).
En una realización, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente un sitio de clonación múltiple (MCS). Un MCS es un segmento corto de ADN dentro del vector de ácido nucleico que contiene múltiples sitios de restricción (por ejemplo, 10, 15 o 20 sitios). Habitualmente estos sitios solo se producen una vez dentro del vector de ácido nucleico para garantizar que la endonucleasa solo corta en un sitio. Esto permite que los genes retrovirales se inserten fácilmente usando las endonucleasas apropiadas (es decir, enzimas de restricción).
Un experto en la técnica entenderá que los constructos pueden disponerse en cualquier orden dentro del vector de ácido nucleico. En una realización a modo de ejemplo, el vector de ácido nucleico comprende el siguiente inserto: una secuencia de ácido nucleico retroviral que codifica para las proteínas gag y pol, una secuencia de ácido nucleico de VSVg que codifica para la proteína env, una secuencia de ácido nucleico retroviral que codifica para el gen auxiliar rev (tal como una secuencia de rev de codones optimizados) o un gen análogo al mismo o un sistema funcionalmente análogo, una proteína represora de operón de resistencia a tetraciclina (TetR), un sitio de entrada al ribosoma interno y un marcador seleccionable (tal como un marcador de selección de resistencia a Zeocin) (es decir, GagPol-Env-Rev-represor de Tet-IRES-marcador de resistencia a antibiótico-secuencia de BAC restante (“estructura principal de BAC”); tal como: GagPol-VSVg (tipo natural)-Rev (codones optimizados)-represor de Tet-IRES-resistencia a Zeocin-pSMARTBAC). En una realización adicional, un aislante (tal como un aislante de cromatina) está presente entre cada una de las secuencias de gagpol, env y rev. En una realización adicional, un promotor está presente delante de cada una de las secuencias de gagpol, env y rev. En aún una realización adicional, al menos una copia del vector de transferencia secuencia (es decir, que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para el genoma de ARN de una partícula de vector retroviral) está presente antes de la secuencia de gagpol.
En una realización, el vector de ácido nucleico comprende el siguiente inserto: un aislante (tal como un aislante de cromatina), un promotor (tal como un promotor de CMV que comprende opcionalmente una secuencia de operón Tet), un intrón (tal como un intrón de beta-globina humana), una secuencia de ácido nucleico retroviral que codifica para las proteínas gag y pol, un ácido nucleico retroviral que codifica para RRE, una señal de poliA (tal como una señal de poliA de beta-globina humana), un aislante (tal como un aislante de cromatina), un promotor (tal como un promotor de CMV que comprende opcionalmente una secuencia de operón Tet), un intrón (tal como un intrón de beta-globina humana), una secuencia de ácido nucleico de VsVg que codifica para la proteína env, una señal de poliA (tal como una señal de poliA de beta-globina humana), un aislante (tal como un aislante de cromatina), un promotor (tal como un promotor de CMV que comprende opcionalmente una secuencia de operón Tet), una secuencia de ácido nucleico retroviral que codifica para el gen auxiliar rev o un gen análogo al mismo o un sistema funcionalmente análogo, una señal de poliA (tal como una señal de poliA de beta-globina humana), un aislante (tal como un aislante de cromatina), un promotor (tal como un promotor de CMV), un intrón (tal como un intrón de betaglobina de conejo), una proteína represora de operón de resistencia a tetraciclina proteína (TetR), un sitio de entrada al ribosoma interno, un marcador seleccionable (tal como un marcador de selección de resistencia a Zeocin), una señal de poliA y un sitio de clonación múltiple.
Las secuencias de ácido nucleico pueden introducirse en el vector de ácido nucleico de manera secuencial. Esto permite la selección después de cada integración para garantizar que todas las secuencias de ácido nucleico requeridas se integran satisfactoriamente en el vector de ácido nucleico. Alternativamente, al menos dos o más de las secuencias de ácido nucleico se introducen en el vector de ácido nucleico simultáneamente.
Se entenderá que los genes adicionales descritos en el presente documento pueden introducirse en el vector de ácido nucleico mediante técnicas de clonación molecular convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo usando endonucleasas de restricción y técnicas de ligación. Además, el vector de ácido nucleico, en particular BAC, PAC, fásmidos y/o cósmidos, puede introducirse en células huésped bacterianas (tales como células de E. coli, en particular la cepa DH10B de E. coli) mediante técnicas convencionales, tales como electroporación.
USOS
Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona el vector de ácido nucleico tal como se define en el presente documento para su uso en la producción de una línea celular de empaquetamiento o producción retroviral.
Los vectores de ácido nucleico descritos en el presente documento pueden usarse para crear una línea celular de empaquetamiento retroviral que simplificará en gran medida la producción de vectores retrovirales. Se entenderá que si se incluye un transgén en el vector de ácido nucleico, entonces se usará para crear una línea celular productora.
Tal como se describe en el presente documento, será útil desarrollar una línea celular de empaquetamiento (o producción) retroviral estable con el fin de superar las dificultades asociadas con la transfección transitoria. Los vectores de ácido nucleico descritos en el presente documento pueden usarse para preparar dichas líneas celulares de empaquetamiento porque pueden contener grandes insertos de ADN que contienen los genes esenciales requeridos para el empaquetamiento retroviral que entonces pueden integrarse en el genoma endógeno de células huésped de mamífero en una etapa.
CÉLULAS HUÉSPED
Esta memoria descriptiva describe una célula de empaquetamiento retroviral que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para:
proteínas gag y pol; y
proteína env o un sustituto funcional de la misma, en la que dichas secuencias de ácido nucleico están todas ubicadas en un único locus dentro del genoma de la célula de empaquetamiento retroviral.
La ventaja de incluir todos los genes retrovirales en un gran vector de ácido nucleico es que pueden prepararse en primer lugar en células microbianas (tales como células bacterianas o de levadura), que son mucho más fáciles de manejar y manipular, antes de integrarse en células de mamífero en una única etapa. Esto alivia la presión de selección y reduce el intervalo de tiempo de silenciamiento una vez que se han integrado los genes retrovirales en una célula huésped de mamífero. El rasgo característico de este método es que todos los genes retrovirales requeridos para crear una línea celular de empaquetamiento están presentes en un único locus en el genoma endógeno, en vez de estar dispersos de manera aleatoria a lo largo de todo el genoma endógeno. Esto tiene la ventaja de producir una célula de empaquetamiento retroviral que expresa todos los genes retrovirales al mismo nivel porque están ubicados en el mismo locus, en comparación con métodos anteriores en los que los genes retrovirales están integrados de manera aleatoria a lo largo de todo el genoma endógeno lo cual puede provocar niveles de expresión no uniformes.
En una realización, la célula de empaquetamiento retroviral comprende adicionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican para el genoma de ARN de la partícula de vector retroviral. Estas también pueden estar ubicadas en el locus individual con las secuencias de ácido nucleico que codifican para las proteínas gag y pol y la proteína env o un sustituto funcional de la misma.
Esta memoria descriptiva describe una célula de producción retroviral que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para:
proteínas gag y pol;
proteína env o un sustituto funcional de la misma; y
el genoma de ARN de la partícula de vector retroviral,
en la que dichas secuencias de ácido nucleico están todas ubicadas en un único locus dentro de la célula de producción retroviral genoma.
En una realización, la célula de empaquetamiento retroviral es una célula de mamífero. En una realización adicional, la célula de mamífero se selecciona de una célula HEK 293, célula CHO, célula Jurkat, célula KS62, célula PerC6, célula HeLa o un derivado o equivalente funcional de las mismas. En aún una realización adicional, la célula huésped de mamífero es una célula HEK 293 o derivado de una célula HEK 293. Tales células pueden ser líneas celulares adherentes (es decir, crecen en una única capa unida a una superficie) o líneas celulares adaptadas en suspensión/no adherentes (es decir, crecen en suspensión en un medio de cultivo). En aún una realización adicional, la célula HEK 293 es una célula HEK 293T. El término “célula HEK 293” se refiere a la línea celular de riñón embrionario humano 293 que se usa habitualmente en biotecnología. En particular, las células HEK 293T se usan habitualmente para la producción de diversos vectores retrovirales. Otros ejemplos de líneas celulares comercialmente disponibles adecuadas incluyen líneas celulares T-REX™ (Life Technologies).
MÉTODOS
Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de producción de una línea celular de empaquetamiento retroviral estable, que comprende:
(a) introducir un vector de ácido nucleico que comprende un origen de replicación no de mamífero, uno o una pluralidad de sitios de recombinación y la capacidad de contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN seleccionado de: un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial derivado de P1, un fásmido o un cósmido, que comprende secuencias de ácido nucleico retroviral que codifican para:
proteínas gag y pol, y
una proteína env obtenida o derivada a partir de un virus seleccionado de un Vesiculovirus, Lyssavirus, Arenavirus, Alphavirus, Filovirus, Coronavirus, Respirovirus, Hepacivirus, Influenzavirus y Nucleopolyhedrovirus
en un cultivo de células huésped de mamífero; y
(b) seleccionar dentro del cultivo una célula huésped de mamífero que tiene las secuencias de ácido nucleico codificadas en el vector integradas en un cromosoma endógeno de la célula huésped de mamífero.
En una realización, la célula huésped de mamífero se selecciona de una célula HEK 293, célula HEK 6E, célula CHO, célula Jurkat, célula KS62, célula PerC6, célula HeLa o un derivado o equivalente funcional de las mismas. En una realización adicional, la célula huésped de mamífero es una célula HEK 293 o derivado de una célula HEK 293. Tales células pueden ser líneas celulares adherentes (es decir, crecen en una única capa unida a una superficie) o líneas celulares adaptadas en suspensión/no adherentes (es decir, crecen en suspensión en un medio de cultivo). En aún una realización adicional, la célula HEK 293 es una célula HEK 293T o célula HEK 6E. Otros ejemplos de líneas celulares comercialmente disponibles adecuadas incluyen líneas celulares T-REX™ (Life Technologies).
El experto sabrá que la introducción del vector de ácido nucleico en la célula huésped puede realizarse usando métodos adecuados conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección mediada por lípidos, microinyección, fusión celular (tal como microcélulas), electroporación o bombardeo con microproyectiles. En una realización, el vector de ácido nucleico se introduce en la célula huésped mediante electroporación. Se entenderá que la elección del método que va a usarse para introducir el vector de ácido nucleico puede elegirse dependiendo del tipo de célula huésped de mamífero usada.
Una vez dentro de la célula huésped de mamífero, el vector de ácido nucleico se integrará de manera aleatoria en el genoma endógeno de la célula huésped de mamífero. Por tanto, el método comprende adicionalmente seleccionar la célula huésped de mamífero en la que se han integrado los ácidos nucleicos codificados en el vector de ácido nucleico (por ejemplo, usando un marcador de selección de resistencia a antibiótico, tal como un marcador de resistencia a Zeocin).
El experto conocerá métodos para motivar la integración del vector de ácido nucleico, por ejemplo, linealizar el vector de ácido nucleico si es circular de manera natural (por ejemplo, BAC, PAC, cósmidos o fásmidos). El vector de ácido nucleico puede comprender adicionalmente zonas de homología compartida con los cromosomas endógenos de la célula huésped de mamífero para guiar la integración a un sitio seleccionado dentro del genoma endógeno. Además, si están presentes sitios de recombinación en el vector de ácido nucleico, entonces pueden usarse para una recombinación dirigida. Por ejemplo, el vector de ácido nucleico puede contener un sitio loxP que permite la integración dirigida cuando se combina con recombinasa Cre (es decir, usando el sistema de Cre/lox derivado a partir del bacteriófago P1). Alternativamente (o de manera adicional), el sitio de recombinación es un sitio att (por ejemplo, a partir de fago lambda), en el que el sitio att permite la integración dirigida al sitio en presencia de una integrasa lambda. Esto permitirá dirigir los genes retrovirales a un locus dentro del genoma endógeno que permite una expresión alta y/o estable.
Otros métodos de integración dirigida se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse métodos de inducir la escisión dirigida de ADN genómico para motivar la recombinación dirigida en un locus cromosómico seleccionado. Estos métodos implican con frecuencia el uso de sistemas de escisión modificados por ingeniería para inducir una rotura de cadena doble (DSB) o una mella en el genoma endógeno para inducir la reparación de la rotura mediante procesos naturales tales como unión de extremos no homólogos (NHEJ) o reparación usando un molde de reparación (es decir, reparación dirigida por homología o HDR).
La escisión puede producirse mediante el uso de nucleasas específicas tales como nucleasas de dedos de cinc (ZFN) modificadas por ingeniería, nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), usando el sistema de CRISPR/Cas9 con un ARN de crRNA/tracr modificado por ingeniería (“ARN de guía individual”) para guiar la escisión específica, y/o usando nucleasas basadas en el sistema de Argonauta (por ejemplo, de T. thermophilus, conocida como “TtAgo”, véase Swarts et al. (2014) Nature 507(7491): 258-261). La escisión dirigida usando uno de estos sistemas de nucleasa puede aprovecharse para insertar un ácido nucleico en una ubicación diana específica usando procesos mediados o bien por HDR o bien por NHEJ. Por tanto, en una realización, el método comprende adicionalmente integrar las secuencias de ácido nucleico codificadas en el vector de ácido nucleico en el genoma (es decir, un cromosoma endógeno) de la célula huésped de mamífero usando al menos una nucleasa, en el que la al menos una nucleasa escinde el genoma de la célula huésped de mamífero de tal manera que las secuencias de ácido nucleico se integran en el genoma de la célula. En una realización adicional, la al menos una nucleasa se selecciona del grupo que consiste en una nucleasa de dedos de cinc (ZFN), una nucleasa de TALE (TALEN), un sistema de nucleasa de CRISPR/Cas y combinaciones de los mismos.
Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula de empaquetamiento retroviral obtenida mediante el método definido en el presente documento.
La línea celular obtenida usando los métodos definidos en el presente documento puede usarse para producir un alto título de vector retroviral.
Las referencias en el presente documento al término “alto título” se refieren a una cantidad eficaz de vector retroviral o partícula que puede transducir una célula diana, tal como una célula de un paciente. En una realización, un alto título es superior a 106 UT/ml sin concentración (UT = unidades de transducción).
Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de producción de una partícula de vector retroviral defectuosa para la replicación, que comprende:
(a) introducir un vector de ácido nucleico que comprende un origen de replicación no de mamífero, uno o una pluralidad de sitios de recombinación y la capacidad de contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN seleccionado de: un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial derivado de P1, un fásmido o un cósmido, que comprende secuencias de ácido nucleico retroviral que codifican para:
proteínas gag y pol, y
una proteína env obtenida o derivada a partir de un virus seleccionado de un Vesiculovirus, Lyssavirus, Arenavirus, Alphavirus, Filovirus, Coronavirus, Respirovirus, Hepacivirus, Influenzavirus y Nucleopolyhedrovirus
en el que cada una de las secuencias de ácido nucleico retroviral tiene su propio promotor dentro del vector de ácido nucleico en un cultivo de células huésped de mamífero en un cultivo de células huésped de mamífero;
(b) seleccionar dentro del cultivo una célula huésped de mamífero que tiene las secuencias de ácido nucleico codificadas en el vector integradas en un cromosoma endógeno de la célula huésped de mamífero; y
(c) cultivar adicionalmente la célula huésped de mamífero en condiciones en las que se produce la partícula de vector retroviral defectuosa para la replicación.
Tal como se describió anteriormente en el presente documento, en una realización, la célula huésped de mamífero se selecciona de una célula HEK 293, célula CHO, célula Jurkat, célula KS62, célula PerC6, célula HeLa o un derivado o equivalente funcional de las mismas. En una realización adicional, la célula huésped de mamífero es una célula HEK 293 o derivado de una célula HEK 293. Tales células pueden ser líneas celulares adherentes (es decir, crecen en una única capa unida a una superficie) o líneas celulares adaptadas en suspensión/no adherentes (es decir, crecen en suspensión en un medio de cultivo). En aún una realización adicional, la célula HEK 293 es una célula HEK 293T. Otros ejemplos de líneas celulares comercialmente disponibles adecuadas incluyen líneas celulares T REX™ (Life Technologies).
El experto entenderá que las condiciones usadas en el método descrito en el presente documento dependerán de la célula huésped usada. Las condiciones típicas, por ejemplo el medio de cultivo o la temperatura que va a usarse, se conocen bien en la técnica. En una realización, el cultivo se realiza incubando la célula huésped de mamífero en condiciones humidificadas. En una realización adicional, las condiciones humidificadas comprenden incubar las células transfectadas a 37°C al 5% de CO2. En una realización, el cultivo se realiza usando un medio de cultivo seleccionado de: medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene el 10% (vol/vol) de suero bovino fetal (FBS), medio UltraCULTURE™ libre de suero (Lonza, n.° de cat. 12-725F) o medio de expresión FreeStyle™ (Thermo fisher, n.° de cat. 12338-018).
En una realización, el método comprende adicionalmente aislar la partícula de vector retroviral defectuosa para la replicación. Por ejemplo, en una realización el aislamiento se realiza usando un filtro. En una realización adicional, el filtro es una membrana de baja unión a proteína (por ejemplo, una membrana de baja unión a proteína de 0,22 pm o una membrana de baja unión a proteína de 0,45 pm), tal como membranas artificiales de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) o polietersulfona (PES).
Una vez dentro de la célula huésped de mamífero, los ácidos nucleicos retrovirales presentes en el vector de ácido nucleico pueden integrarse en un único locus aleatorio dentro del genoma endógeno. La etapa de integración puede motivarse tal como se describió anteriormente en el presente documento, por ejemplo usando linealización y/o zonas de homología compartida. También pueden usarse sitios de recombinación para la recombinación dirigida.
Si los genes diana se integran en los cromosomas endógenos con un marcador selectivo, tal como un gen de resistencia a antibiótico, entonces el método puede comprender adicionalmente seleccionar las células huésped de mamífero en las que se han integrado satisfactoriamente los ácidos nucleicos retrovirales.
Una vez aisladas, las partículas de vector retroviral pueden concentrarse para aplicaciones in vivo. Los métodos de concentración incluyen, por ejemplo, ultracentrifugación, precipitación o cromatografía de intercambio aniónico. La ultracentrifugación es útil como método rápido para la concentración de vectores retrovirales a pequeña escala. Alternativamente, la cromatografía de intercambio aniónico (por ejemplo, usando cartuchos de membrana de intercambio aniónico Mustang Q) o la precipitación (por ejemplo, usando PEG 6000) son particularmente útiles para procesar grandes volúmenes de sobrenadantes de vector lentiviral.
Ahora se describirá la invención en más detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
EJEMPLO 1: guía de construcción
La figura 1 muestra una guía paso a paso para la construcción de BACpack-WTGP-277deIU5 y BACpack-SYNGP-277deIU5. Debido a los extremos compatibles de un digesto de Xbal y de Nhel, se cargaron progresivamente los genes de empaquetamiento lentiviral en el vector pSmart BAC. En el punto de adición de GagPol, se prepararon 2 constructos que contenían o bien GagPol de tipo natural (WTGP) o bien GagPol de codones optimizados, SYNGP. A los mismos se les asignó la nomenclatura de BACpack-WTGP y BACpack-SYNGP, respectivamente. Después se cargó el casete de transferencia en ambos de estos constructos y de ese modo se generaron BACpackWTGP-277deIU5 y BACpackSYNGP-277deIU5.
EJEMPLO 2: selección de una combinación policlonal estable
Se generaron combinaciones de transfectantes estables policlonales mediante transfección de la línea celular adherente, HEK293T, con BACpackSYNGP-277deIU5 o BAcpackWTGP-277deIU5. Después se seleccionaron los acontecimientos de integración satisfactorios con Zeocin.
Para evaluar la capacidad de estas combinaciones policlonales para generar vector lentiviral, se indujeron las células con doxiciclina (I) o se dejaron sin inducir (UI) y se compararon con células HEK293T no transfectadas.
Los resultados muestran el título en unidades de transducción (UT)/ml, del sobrenadante de vector lentiviral recogido a partir de cada condición de transfección. A partir de los resultados de titulación en la figura 2 puede observarse que las combinaciones policlonales estables, generadas o bien con BACpackSYNGP-277deIU5 o bien con BACpackWTGP-277deIU5, pueden producir vector lentiviral a concentraciones en la región de 10e7 UT/ml, lo cual es comparable al sistema de transfección transitoria actual.
Los resultados confirman que el vector de BAC individual que contiene todos los genes de empaquetamiento necesarios para la producción lentiviral puede generar líneas celulares que pueden producir vector lentiviral a un título adecuado.
EJEMPLO 3: generación de clones en suspensión de transfección estables
El propósito principal de generar líneas celulares de producción de vector lentiviral usando la tecnología de BAC es aplicar rápidamente nuevos avances a la plataforma. Es probable que estos avances incluyan la modificación de líneas celulares especializadas. Por ejemplo, una norma en la industria es aumentar el rendimiento produciendo productos biológicos en células en suspensión ya que crecen hasta densidades mayores que las células adherentes. Sin embargo, el sistema de producción de vector lentiviral actual se basa en altas tasas de transfección que son más difíciles de alcanzar en células en suspensión que en células HEK293T adherentes. Dado que la eficiencia de transfección es una preocupación menor cuando se genera una línea celular estable debido a la selección de integrantes satisfactorios, el constructo de BAC es una solución ideal para generar líneas celulares en suspensión de producción de vector lentiviral.
Tal como se demostró anteriormente, el constructo de BAC puede generar líneas celulares de producción de vector lentiviral a partir de células HEK293T adherentes. Para demostrar la flexibilidad de los constructos de BAC, se generaron líneas celulares transfectantes estables a partir de la línea celular en suspensión HEK293 6E. Se transfectaron las células HEK293 6E con el constructo de BAC, BACpackWTGP-277deIU5, después se seleccionaron con Zeocin. Esto estuvo seguido por clonación para generar líneas celulares clonales. Los resultados en la figura 3 muestran la señal de GFP generada por las líneas celulares estables. Esto indica tanto la presencia de resistencia a Zeocina como un casete de expresión de GFP funcional en el segmento de vector de transferencia.
Este resultado sugiere que el constructo de BAC puede generar clones estables a partir de múltiples líneas celulares.
EJEMPLO 4: inducción de lentivirus en los clones en suspensión
Con el fin de confirmar la capacidad de los clones en suspensión estables para producir vector lentiviral, se indujeron los clones 1, 14, 15 y 16 con doxiciclina 2 gg/ml y se midió el sobrenadante para determinar el título viral mediante transducción de células HEK293T.
Los resultados en la figura 4 muestran el título en unidades de transducción (UT)/ml del sobrenadante de vector lentiviral recogido a partir de cada clon. Los resultados muestran claramente que las líneas celulares generadas mediante transfección estable de la línea celular en suspensión HEK2936E con BACpackWTGP-277deIU5 pueden producir vector lentiviral a rendimientos comparables al sistema de transfección transitoria actual.
EJEMPLO 5: título de vector de clones
Se sometieron los clones 1 y 16, tal como se describen en la figura 4, a pases en cultivo y se indujeron y se determinó su título en puntos de tiempo posteriores para determinar si la producción de vector era estable a partir de estos clones altamente productores. Tal como se muestra en las figuras 5A y 5B, los títulos de vector a partir de estos clones aumentaron realmente de manera moderada entre el pase 5 y el pase 21, posiblemente debido a un aumento en la concentración de butirato de sodio introducido en el método de inducción.
Se entenderá que las realizaciones descritas en el presente documento pueden aplicarse a todos los aspectos de la invención.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Método de producción de una línea celular de empaquetamiento retroviral estable, que comprende:
    (a) introducir un vector de ácido nucleico que comprende un origen de replicación no de mamífero, uno o una pluralidad de sitios de recombinación y la capacidad de contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN seleccionado de: un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial derivado de P1, un fásmido o un cósmido que comprende secuencias de ácido nucleico retroviral que codifican para:
    proteínas gag y pol, y
    una proteína env obtenida o derivada a partir de un virus seleccionado de un Vesiculovirus, Lyssavirus, Arenavirus, Alphavirus, Filovirus, Coronavirus, Respirovirus, Hepacivirus, Influenzavirus y Nucleopolyhedrovirus,
    en el que cada una de las secuencias de ácido nucleico tiene su propio promotor dentro del vector de ácido nucleico, en un cultivo de células huésped de mamífero; y
    (b) seleccionar dentro del cultivo una célula huésped de mamífero que tiene las secuencias de ácido nucleico codificadas en el vector integradas en un cromosoma endógeno de la célula huésped de mamífero.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican para el genoma de ARN de una partícula de vector retroviral.
  3. 3. Método según las reivindicaciones 1 o 2, en el que el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente el gen auxiliar rev.
  4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector de ácido nucleico es un BAC.
  5. 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la célula de mamífero es una célula HEK 293, célula CHO, célula Jurkat, célula KS62, célula PerC6, célula HeLa.
  6. 6. Método según la reivindicación 5, en el que la célula de mamífero es una célula adaptada/no adherente en suspensión.
  7. 7. Método de producción de una partícula de vector retroviral defectuosa para la replicación, que comprende:
    (a) introducir un vector de ácido nucleico que comprende un origen de replicación no de mamífero, uno o una pluralidad de sitios de recombinación y la capacidad de contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN seleccionado de: un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial derivado de P1, un fásmido o un cósmido que comprende secuencias de ácido nucleico retroviral que codifican para:
    proteínas gag y pol, y
    una proteína env obtenida o derivada a partir de un virus seleccionado de un Vesiculovirus, Lyssavirus, Arenavirus, Alphavirus, Filovirus, Coronavirus, Respirovirus, Hepacivirus, Influenzavirus y Nucleopolyhedrovirus,
    en el que cada una de las secuencias de ácido nucleico tiene su propio promotor dentro del vector de ácido nucleico, en un cultivo de células huésped de mamífero;
    (b) seleccionar dentro del cultivo una célula huésped de mamífero que tiene las secuencias de ácido nucleico codificadas en el vector integradas en un cromosoma endógeno de la célula huésped de mamífero; y
    (c) cultivar adicionalmente la célula huésped de mamífero en condiciones en las que se produce la partícula de vector retroviral defectuosa para la replicación.
  8. 8. Método según la reivindicación 7, que comprende adicionalmente aislar la partícula de vector retroviral defectuosa para la replicación.
  9. 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las secuencias de ácido nucleico retroviral se derivan a partir de un retrovirus seleccionado de lentivirus, alfa-retrovirus, gamma-retrovirus o retrovirus espumoso.
  10. 10. Método según la reivindicación 9, en el que las secuencias de ácido nucleico retroviral se derivan a partir de un lentivirus seleccionado del grupo que consiste en VIH-1, VIH-2, VIS, VIF, VAIE y Visna.
  11. 11. Método según la reivindicación 10, en el que las secuencias de ácido nucleico retroviral se derivan a partir de VIH-1.
  12. 12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la proteína env se deriva a partir de virus de la estomatitis vesicular.
  13. 13. Vector de ácido nucleico que comprende un origen de replicación no de mamífero, uno o una pluralidad de sitios de recombinación y la capacidad de contener al menos 25 kilobases (kb) de ADN seleccionado de: un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial derivado de P1, un fásmido o un cósmido que comprende secuencias de ácido nucleico retroviral que codifican para:
    proteínas gag y pol, y
    una proteína env obtenida o derivada a partir de un virus seleccionado de un Vesiculovirus, Lyssavirus, Arenavirus, Alphavirus, Filovirus, Coronavirus, Respirovirus, Hepacivirus, Influenzavirus y Nucleopolyhedrovirus,
    en el que cada una de las secuencias de ácido nucleico tiene su propio promotor dentro del vector de ácido nucleico.
  14. 14. Vector de ácido nucleico según la reivindicación 13, que comprende adicionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican para el genoma de ARN de una partícula de vector retroviral.
  15. 15. Vector de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, que comprende adicionalmente el gen auxiliar rev.
  16. 16. Vector de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, que es un BAC.
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