ES2939084T3 - Células asesinas naturales y líneas de células asesinas naturales modificadas que tienen citotoxicidad aumentada - Google Patents

Células asesinas naturales y líneas de células asesinas naturales modificadas que tienen citotoxicidad aumentada Download PDF

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Abstract

Las células NK y las líneas de células NK se modifican para aumentar la citotoxicidad, en donde las células y las composiciones de las mismas tienen un uso en el tratamiento del cáncer. La producción de células NK modificadas y líneas de células NK se realiza mediante modificación genética para eliminar la expresión del receptor inhibidor del punto de control y/o agregar la expresión del ligando TRAIL mutante (variante). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Células asesinas naturales y líneas de células asesinas naturales modificadas que tienen citotoxicidad aumentada Introducción
La presente invención se refiere a la modificación de células asesinas naturales (NK) y líneas de células NK para producir derivados de las mismas con un fenotipo más citotóxico. Además, la presente invención se refiere a métodos para producir células NK y líneas de células NK modificadas, composiciones que contienen las células y líneas celulares y usos de dichas composiciones en el tratamiento del cáncer.
Antecedentes de la invención
Típicamente, las células inmunitarias requieren que una célula objetivo presente el antígeno a través del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) antes de desencadenar una respuesta inmunitaria que dé como resultado la muerte de la célula objetivo. Esto permite que las células cancerosas que no presentan m Hc de clase I evadan la mayoría de las respuestas inmunitarias.
Sin embargo, las células NK son capaces de reconocer células cancerosas en ausencia de expresión de MHC de clase I. Por tanto, desempeñan un papel fundamental en la defensa del cuerpo contra el cáncer.
Por otro lado, en ciertas circunstancias, las células cancerosas demuestran la capacidad de amortiguar la actividad citotóxica de las células NK mediante la expresión de ligandos que se unen a los receptores inhibidores en la membrana de las células NK. La resistencia al cáncer puede implicar un equilibrio entre estos y otros factores.
La citotoxicidad, en este contexto, se refiere a la capacidad de las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, las células NK, para inducir la muerte de las células cancerosas, por ejemplo, liberando compuestos citolíticos o uniéndose a receptores en las membranas de las células cancerosas e induciendo la apoptosis de dichas células cancerosas. La citotoxicidad se ve afectada no solo por señales que inducen la liberación de compuestos citolíticos sino también por señales que inhiben su liberación. Por lo tanto, un aumento en la citotoxicidad llevará a una destrucción más eficiente de las células cancerosas, con menos posibilidades de que las células cancerosas amortigüen la actividad citotóxica de las NK, como se ha mencionado con anterioridad.
Se ha sugerido la modificación genética para eliminar la función inhibidora del receptor en las células NK como un método para aumentar la citotoxicidad de las células NK contra las células cancerosas que carecen de expresión de MHC de clase I pero que pueden amortiguar la citotoxicidad de las NK (Bodduluru et al. 2012). NKG2A se ha establecido como un receptor inhibidor que vale la pena silenciar en estas circunstancias, ya que se sabe que ciertas células cancerosas expresan MICA que se une a NKG2A e inhibe la citotoxicidad de las células NK en ausencia de expresión de MHC de clase I (Shook et al. 2011; WO 2006/023148).
Se ha demostrado otro método para regular por disminución la expresión de NKG2A en células NK-92, en el que se demostró que la transfección con un gen que codifica IL-15 estaba asociada con una reducción en la expresión de NKG2A (Zhang et al. 2004). Sin embargo, a pesar de un aumento observado en la citotoxicidad de las células NK, el aumento probablemente fue el resultado de un aumento concomitante en la expresión del receptor de activación NKG2D. Esto está respaldado por la observación de que el bloqueo de los receptores NKG2A en las células NK-92 no se asoció con un aumento de la citotoxicidad contra las células de mieloma múltiple (Heidenreich et al. 2012). Sin embargo, cabe señalar que la línea celular NK-92 es una línea celular altamente citotóxica con una expresión muy baja de receptores inhibidores. Por lo tanto, cualquier aumento de la citotoxicidad asociado con la expresión de NKG2A disminuida podría haber sido demasiado trivial para detectarlo.
Se han llevado a cabo estudios similares en ratones. Por ejemplo, los ratones expresan un receptor llamado Ly49 en las células NK, que es análogo a los receptores KIR inhibidores humanos. Se ha demostrado que bloqueando el receptor Ly49 con fragmentos de anticuerpos, las células NK son más citotóxicas y capaces de destruir células de leucemia murina in vitro e in vivo (Koh et al. 2001).
Sin embargo, como consecuencia de la reducción de la función inhibidora del receptor, las células 'normales' del cuerpo también se vuelven más susceptibles al ataque de las células NK modificadas, ya que las células NK modificadas se vuelven menos capaces de distinguir entre células 'normales' y células cancerosas. Esta es una desventaja significativa de reducir la función del receptor inhibidor 'clásico'.
Otra manera en la que se sabe que las células NK destruyen las células cancerosas es expresando TRAIL en su superficie. El ligando TRAIL es capaz de unirse a los receptores de TRAIL en las células cancerosas e inducir la apoptosis de dichas células cancerosas. Un enfoque especulativo describe la sobreexpresión de TRAIL en las células NK, para aprovechar este mecanismo anticancerígeno (EP1621550). Además, se ha informado que IL-12 aumenta la expresión de TRAIL en las células NK (Smyth et al. 2001).
Sin embargo, las células cancerosas han desarrollado mecanismos evasivos y protectores para hacer frente a las células NK que expresan TRAIL. Los receptores señuelo TRAIL se expresan a menudo en las membranas de las células cancerosas, y la unión de TRAIL a estos receptores señuelo no puede inducir la apoptosis; todavía no se han buscado métodos para superar tales mecanismos.
La leucemia mieloide aguda (AML) es una enfermedad maligna hematopoyética que implica células precursoras comprometidas con el desarrollo mieloide y representa una proporción significativa de leucemias agudas tanto en adultos (90%) como en niños (15-20%) (Hurwitz, Mounce et al. 1995; Lowenberg, Downing et al. 1999). A pesar de que el 80% de los pacientes logran la remisión con quimioterapia estándar (Hurwitz, Mounce et al. 1995; Ribeiro, Razzouk et al. 2005), la supervivencia sigue siendo insatisfactoria debido a las altas tasas de recaída de la enfermedad residual mínima (MRD). La supervivencia a cinco años depende de la edad; 60% en niños (Rubnitz 2012), 40% en adultos menores de 65 años (Lowenberg, Downing et al. 1999) y 10% en adultos mayores de 65 años (Ferrara y Schiffer 2013). Estos resultados pueden mejorarse si los pacientes tienen un donante de células hematopoyéticas adecuado, pero muchos no lo tienen, recalcando la necesidad de en un enfoque alternativo para el tratamiento.
Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos citotóxicos, con fenotipos y funciones efectoras distintos que difieren de, por ejemplo, las células T asesinas naturales (NK-T). Por ejemplo, mientras que las células NK-T expresan tanto CD3 como receptores de antígenos de células T (TCR), las células NK no lo hacen. Generalmente se encuentra que las células NK expresan los marcadores CD16 y CD56, en donde CD16 funciona como un receptor Fc y media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) que se analiza a continuación. KHYG-1 es una notable excepción en este sentido. A pesar de que las células NK son naturalmente citotóxicas, se han desarrollado líneas de células NK con citotoxicidad aumentada. NK-92 y KHYG-1 representan dos líneas de células NK que se han investigado ampliamente y se muestran prometedoras en agentes terapéuticos contra el cáncer (Swift et al. 2011; Swift et al. 2012).
La inmunoterapia celular adoptiva para su uso en el tratamiento del cáncer implica normalmente la administración de células T naturales y modificadas a un paciente. Las células T pueden modificarse de varias maneras, por ejemplo genéticamente, para que expresen receptores y/o ligandos que se unen específicamente a ciertas células cancerosas objetivo. La transfección de células T con receptores de células T de alta afinidad (TCR) y receptores de antígenos quiméricos (CAR), específicos para antígenos de células cancerosas, puede dar lugar a respuestas de células T específicas de cáncer altamente reactivas. Una limitación importante de este enfoque inmunoterapéutico es que las células T deben obtenerse del paciente para la expansión ex vivo autóloga o deben usarse células T emparejadas con MHC para evitar la erradicación inmunológica inmediatamente después de la transferencia de las células al paciente o, en algunos casos, la aparición de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Además, las células T transferidas con éxito a menudo sobreviven durante períodos prolongados en la circulación, lo que dificulta el control de los efectos secundarios persistentes resultantes del tratamiento.
En el trasplante de haplotipos, se cree que el efecto de injerto contra leucemia está mediado por las células NK cuando hay un desajuste entre el receptor inhibidor de KIR y el ligando, lo que puede llevar a una supervivencia mejorada en el tratamiento de la AML (Ruggeri, Capanni et al. 2002; Ruggeri, Mancusi et al. 2005). Además, la rápida recuperación de las NK se asocia con un mejor resultado y un efecto más fuerte de injerto contra leucemia (GVL) en pacientes sometidos a trasplante de células hematopoyéticas (HCT) con depleción de haplotipo T en AML (Savani, Mielke et al. 2007). Otros ensayos han usado células Nk haploidénticas expandidas ex vivo para tratar la AML en adultos (Miller, Soignier et al. 2005) y niños (Rubnitz, Inaba et al. 2010).
Se han establecido varias líneas de células NK permanentes, y la más notable es NK-92, derivada de un paciente con linfoma no Hodgkin que expresa marcadores de células NK típicos, con la excepción de CD16 (receptor Fc gamma III). NK-92 se ha sometido a extensas pruebas preclínicas y muestra una lisis superior frente a una amplia gama de tumores en comparación con las células NK activadas y las células asesinas activadas por linfoquinas (LAK) (Gong, Maki et al. 1994). Se ha establecido la citotoxicidad de las células NK-92 contra la AML primaria (Yan, Steinherz et al. 1998).
Otra línea de células NK, KHYG-1, se identificó como un candidato potencial para uso clínico (Suck et al.
2005), pero tiene una citotoxicidad reducida, por lo que ha recibido menos atención que NK-92. Se sabe que las células KHYG-1 están preactivadas. A diferencia de las células NK endógenas, las células KHYG-1 están polarizadas en todo momento, aumentando su citotoxicidad y haciéndolas más rápidas para responder a los estímulos externos. Las células NK-92 tienen una citotoxicidad inicial más alta que las células KHYG-1.
Por lo tanto, está claro que los protocolos actuales de inmunoterapia adoptiva se ven afectados por la variabilidad de los donantes en la cantidad y calidad de las células efectoras, variables que podrían eliminarse si se dispusiera de líneas celulares eficaces para proporcionar una terapia más estandarizada. Se ha realizado una cantidad considerable de investigación sobre la citotoxicidad de las células NK usando modelos de ratón. Un ejemplo es el descubrimiento de que el ARNm de perforina y granzima B se transcriben constitutivamente en células NK de ratón, pero se detectan niveles mínimos de proteína hasta la estimulación o activación de las células NK (Fehniger et al, 2007). Aunque este trabajo y otros trabajos que usan células NK de ratón son de interés, no se puede confiar en ellos como evidencia concluyente de la citotoxicidad de las células NK en humanos. Al contrario que el ejemplo anterior, las células NK humanas expresan altos niveles de proteína de perforina y granzima B antes de la estimulación (Leong et al, 2011). El resultado es que cuando las células NK de ratón o humanas se aíslan recientemente en cultivo, las células NK de ratón tienen una actividad citolítica débil, mientras que las células NK humanas muestran capacidades citolíticas fuertes.
Las células NK de ratón y humanas también varían mucho en sus marcadores de expresión, cascadas de señalización y distribución tisular. Por ejemplo, CD56 se usa como marcador para las células NK humanas, mientras que las células NK de ratón no expresan este marcador en absoluto. Además, un mecanismo bien establecido para regular la citotoxicidad de las células NK es mediante la activación de NK de unión al ligando y los receptores inhibidores. Se sabe que dos de los receptores de activación de NK humanos más destacados son NKp30 y NKp44, ninguno de los cuales se expresa en células NK de ratón. Con respecto a los receptores inhibidores de NK, mientras que las células NK humanas expresan KIR que reconocen MHC de clase I y amortiguan la actividad citotóxica, las células NK de ratón no expresan KIR en absoluto, sino que expresan Ly49 (Trowsdale et al, 2001). Considerándolo todo, a pesar de que las células NK de ratón logran la misma función que las células NK humanas en su entorno fisiológico natural, los mecanismos que cumplen este papel varían significativamente entre especies.
Por tanto, hay una necesidad de células NK humanas y líneas de células NK humanas alternativas y preferiblemente mejoradas, por ejemplo, con un perfil más citotóxico.
Un objeto de la invención es proporcionar células NK y líneas de células NK con un fenotipo más citotóxico. Otro objeto es proporcionar métodos para producir células NK y líneas de células NK modificadas, composiciones que contengan las células o líneas celulares y usos de dichas composiciones en el tratamiento de cánceres. Realizaciones más particulares se dirigen a proporcionar tratamientos para cánceres identificados, por ejemplo, cánceres de la sangre, como las leucemias. Realizaciones específicas se dirigen a combinar dos o más modificaciones de células NK y líneas de células NK para mejorar aún más la citotoxicidad de las células modificadas.
Sumario de la invención
En la presente se proporcionan células NK y líneas de células NK modificadas con un fenotipo más citotóxico, y métodos para fabricar las células y líneas celulares. También se proporcionan composiciones de células NK y líneas de células NK modificadas, y usos de dichas composiciones para tratar el cáncer.
La invención proporciona una célula asesina natural (NK) o una línea de células NK humana con citotoxicidad aumentada, en donde la célula NK o la línea de células NK ha sido modificada mediante ingeniería genética para expresar una variante de TRAIL, en donde la variante de TRAIL tiene una afinidad aumentada, con respecto a TRAIL de tipo salvaje, para receptores de TRAIL, y en donde la célula NK o la línea de células NK se ha modificado adicionalmente para expresar uno o más receptores de antígenos quiméricos (CAR), en donde los CAR se unen específicamente a uno o más ligandos en células cancerosas. La invención también proporciona una célula asesina natural (NK) o una línea de células NK humana con citotoxicidad aumentada para su uso en el tratamiento de células cancerosas en un paciente, en donde la célula NK o la línea de células NK ha sido modificada mediante ingeniería genética para expresar una variante de TRAIL, en donde la variante TRAIL tiene una afinidad aumentada, con respecto a TRAIL de tipo salvaje, para receptores de TRAIL, y en donde la célula NK o la línea de células NK se ha modificado adicionalmente para expresar uno o más receptores de antígenos quiméricos (CAR), en donde los CAR se unen específicamente a uno o más ligandos en células cancerosas.
Además, las composiciones de la invención incluyen células NK y líneas de células NK en las que se proporcionan dos o más modificaciones, en donde múltiples modificaciones potencian aún más la actividad citotóxica de la composición.
De acuerdo con la divulgación, se proporcionan además métodos para tratar el cáncer, por ejemplo, cáncer de la sangre, usando líneas de células NK modificadas, por ejemplo, derivados de células KHYG-1, en donde las líneas de células NK modificadas se manipulan para que carezcan de expresión de receptores inhibidores de puntos de control, expresen variantes de ligandos TRAIL y/o expresen CAR y/o receptores Fc.
Las enfermedades que pueden tratarse particularmente de acuerdo con la invención incluyen cánceres, cánceres de la sangre, leucemias y específicamente leucemia mieloide aguda. Pueden tratarse tumores y cánceres en humanos en particular. Las referencias a tumores en la presente incluyen referencias a neoplasias.
Detalles de la invención
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona una célula asesina natural (NK) o una línea de células NK que se ha modificado genéticamente para aumentar su citotoxicidad.
Como se describe con detalle a continuación en los ejemplos, las células NK y las líneas de células NK se han modificado genéticamente para aumentar su actividad citotóxica contra el cáncer.
Juntas, a las células NK y las líneas de células NK de la invención se hará referencia como células NK (a menos que el contexto requiera lo contrario).
En ciertas realizaciones de la invención, se proporcionan células NK que tienen una función del receptor inhibidor del punto de control reducida o ausente. Por tanto, en los ejemplos a continuación, se producen células NK que tienen uno o más genes de receptores inhibidores de puntos de control desactivados. Preferiblemente, estos receptores son receptores inhibidores de puntos de control específicos. Preferiblemente, estos receptores inhibidores de puntos de control son uno o más o todos de CD96 (TÁCTIL), CD152 (CTLA4), CD223 (lAg -3), CD279 (PD-1), CD328 (SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT y/o TIM -3.
En otras realizaciones, se proporcionan células NK en las que una o más vías de señalización del receptor inhibidor están anuladas o muestran una función reducida - el resultado de nuevo es una función del receptor inhibidor reducida o ausente. Por ejemplo, las vías de señalización mediadas por SHP-1, SHP-2 y/o SHIP se desactivan mediante la modificación genética de las células.
Las células NK resultantes muestran una citotoxicidad mejorada y, por lo tanto, son de mayor uso en la terapia contra el cáncer, especialmente en la terapia del cáncer de la sangre, en particular en el tratamiento de leucemias y mieloma múltiple.
En una realización, la modificación genética se produce antes de que la célula se haya diferenciado en una célula NK. Por ejemplo, las células madre pluripotentes (por ejemplo, iPSC) pueden modificarse genéticamente para perder la capacidad de expresar uno o más receptores inhibidores de puntos de control. Luego, las iPSC modificadas se diferencian para producir células NK modificadas genéticamente con citotoxicidad aumentada.
Se prefiere reducir la función de los receptores inhibidores de puntos de control sobre otros receptores inhibidores, debido a la expresión de los primeros después de la activación de las células NK. Los receptores inhibidores normales o "clásicos", como la mayoría de la familia KIR, NKG2A y LIR-2, se unen al MHC de clase I y, por lo tanto, están implicados principalmente en la reducción del problema de la autodeterminación. Preferiblemente, por lo tanto, los receptores inhibidores de puntos de control están desactivados. La función reducida o ausente de estos receptores de acuerdo con la invención evita que las células cancerosas supriman la función efectora inmunitaria (lo que de otro modo podría producirse si los receptores fueran completamente funcionales). Por tanto, una ventaja clave de estas realizaciones de la invención reside en las células NK que son menos susceptibles a la supresión de sus actividades citotóxicas por parte de las células cancerosas; como resultado son útiles en el tratamiento del cáncer.
Como se usa en la presente, las referencias a receptores inhibidores generalmente se refieren a un receptor expresado en la membrana plasmática de una célula efectora inmune, por ejemplo, una célula NK, después de lo cual la unión de su ligando complementario da como resultado señales intracelulares responsables de reducir la citotoxicidad de dicha célula efectora inmune. Estos receptores inhibidores se expresan durante los estados de 'reposo' y 'activado' de la célula efectora inmunitaria y, a menudo, se asocian con proporcionar al sistema inmunitario un mecanismo de 'autotolerancia' que inhibe las respuestas citotóxicas contra las células y tejidos del cuerpo. Un ejemplo es la familia de receptores inhibidores 'KIR' que se expresan en las células NK y reconocen el MHC de clase I expresado en las células sanas del cuerpo.
También como se usa en la presente, los receptores inhibidores de puntos de control se consideran habitualmente como un subconjunto de los receptores inhibidores anteriores. Sin embargo, a diferencia de otros receptores inhibidores, los receptores inhibidores de puntos de control se expresan a niveles más altos durante la activación prolongada y la citotoxicidad de una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, una célula NK. Este fenómeno es útil para amortiguar la citotoxicidad crónica en, por ejemplo, sitios de inflamación. Los ejemplos incluyen los receptores inhibidores de puntos de control PD-1, CTLA-4 y CD96, todos los cuales se expresan en las células NK.
Por lo tanto, la invención también proporciona una célula NK que carece de un gen que codifica un receptor inhibidor de puntos de control seleccionado de CD96 (TÁCTIL), CD152 (CTLA4), CD223 (La G-3), CD279 (PD-1), CD328 (SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT y TIM-3.
Una célula NK que carece de un gen puede referirse a una deleción total o parcial, una mutación o cualquier otra cosa que dé como resultado en que no se exprese ningún producto génico funcional. En realizaciones, la célula NK carece de genes que codifican dos o más de los receptores inhibidores.
Realizaciones más específicas comprenden una célula NK que carece de un gen que codifica un receptor inhibidor de punto de control seleccionado de CD96 (TÁCTIL), CD152 (CTLA4) y CD279 (PD-1). Las realizaciones preferidas comprenden una célula NK que es un derivado de KHYG-1.
En los ejemplos que se describen a continuación, los inventores han mostrado de manera fiable los efectos citotóxicos de usar ARNip para desactivar la expresión del receptor inhibidor de puntos de control CD96 en células KHYG-1. Las células CD96 desactivada (KD) KHYG-1 demostraron una citotoxicidad mejorada contra las células de leucemia en una variedad de proporciones efector:objetivo (E:T).
De acuerdo con la invención, se proporcionan células NK que expresan un ligando TRAIL mutante (variante) en donde la variante de TRAIL tiene una afinidad aumentada, con respecto al TRAIL de tipo salvaje, para los receptores de TRAIL. Como se describe adicionalmente en los ejemplos a continuación, las modificaciones de las células NK que mejoran la citotoxicidad también incluyen, por lo tanto, una expresión aumentada tanto del ligando TRAIL como de las variantes del ligando TRAIL mutado.
Las células NK resultantes muestran una unión aumentada a los receptores TRAIL y, como resultado, una citotoxicidad aumentada contra los cánceres, especialmente los cánceres de la sangre, en particular las leucemias.
Los mutantes/variantes tienen preferentemente una menor afinidad (o, de hecho, ninguna afinidad) por los receptores 'señuelo', en comparación con la unión de TRAIL de tipo salvaje a los receptores señuelo. Dichos receptores señuelo representan una clase de receptores TRAIL que se unen al ligando TRAIL pero no tienen la capacidad de iniciar la muerte celular y, en algunos casos, actúan para antagonizar la vía de señalización de la muerte. Los ligandos mutantes/variantes de TRAIL pueden prepararse de acuerdo con WO 2009/077857.
Los mutantes/variantes pueden tener por separado una afinidad aumentada por los receptores TRAIL, por ejemplo, DR4 y DR5. Se sabe que TRAIL de tipo salvaje tiene una Kd de >2 nM por DR4, >5 nM por DR5 y >20 nM por el receptor señuelo DcR1 (WO 2009/077857; medido por resonancia de plasmones superficiales), o alrededor de 50 a 100 nM por DR4, de 1 a 10 nM por DR5 y de 175 a 225 nM por DcR1 (Truneh, A. et al. 2000; medido por calorimetría de titulación isotérmica y ELISA). Por lo tanto, una afinidad aumentada por DR4 se define adecuadamente como una Kd de <2 nM o <50 nM, respectivamente, mientras que una afinidad aumentada por DR5 se define adecuadamente como una Kd de <5 nM o <1 nM, respectivamente. Una afinidad reducida por el receptor señuelo DcR1 se define adecuadamente como una Kd de >50 nM o >225 nM, respectivamente. En cualquier caso, un aumento o disminución en la afinidad mostrada por la variante/mutante de TRAIL es relativa a una afinidad de referencia mostrada por TRAIL de tipo salvaje. Preferiblemente, la afinidad se aumenta en por lo menos un 10%, más preferiblemente por lo menos un 25%, en comparación con la mostrada por TRAIL de tipo salvaje.
La variante de TRAIL tiene preferiblemente una afinidad aumentada por DR5 en comparación con su afinidad por DR4, DcR1 y DcR2. Preferiblemente, la afinidad es por lo menos 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces o incluso 1000 veces o más por DR5 que por uno o más de DR4, DcR1 y DcR2. Más preferiblemente, la afinidad es por lo menos 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces o incluso 1000 veces o más por DR5 que por al menos dos, y preferiblemente todos, DR4, DcR1 y DcR2.
Una ventaja clave de estas realizaciones de la invención reside en las células NK que tienen una mayor potencia para destruir células cancerosas.
Realizaciones específicas adicionales comprenden una célula NK que expresa un ligando TRAIL mutante que tiene afinidad reducida o ninguna por los receptores señuelo de TRAIL. Preferiblemente, esta célula NK es un derivado de KHYG-1. Realizaciones específicas adicionales comprenden una célula NK que expresa un ligando TRAIL mutante que tiene afinidad reducida o ninguna por los receptores señuelo de TRAIL y afinidad aumentada por DR4 y/o DR5.
En ejemplos de la invención, descritos con más detalle a continuación, se modificaron genéticamente células NK para que expresasen un TRAIL mutante. Las células KHYG-1 modificadas expresaron TRAIL mutante y NK-92 expresaron un TRAIL mutante. Las células KHYG-1 modificadas mostraron una citotoxicidad mejorada contra las líneas celulares de cáncer in vitro. Las células KHYG-1 expresan receptores TRAIL (por ejemplo, DR4 y DR5), pero a niveles bajos. Otras realizaciones preferidas de las células NK modificadas no expresan o no expresan sustancialmente receptores de TRAIL, o lo hacen solo a un nivel bajo, lo suficientemente bajo como para que la viabilidad de las células NK modificadas no se vea afectada negativamente por la expresión del TRAIL mutante.
En una realización opcional, el tratamiento de un cáncer usando células NK modificadas que expresan TRAIL o una variante de TRAIL se potencia administrando a un paciente un agente capaz de regular por incremento la expresión de los receptores de muerte de TRAIL en las células cancerosas. Este agente puede administrarse antes, en combinación con o posteriormente a la administración de las células NK modificadas. Sin embargo, es preferible que el agente se administre antes de administrar las células NK modificadas.
En una realización preferida, el agente regula por incremento la expresión de DR5 en células cancerosas. El agente puede ser opcionalmente un medicamento quimioterapéutico, por ejemplo, Bortezomib, y administrarse en una dosis baja capaz de regular por incremento la expresión de DR5 en el cáncer. La invención no se limita a ningún agente particular capaz de regular por incremento la expresión de DR5, pero los ejemplos de agentes inductores de DR5 incluyen bortezomib, gefitinib, piperlongumina, doxorrubicina, succinato de alfa-tocoferilo e inhibidores de HDAC.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, el ligando TRAIL mutante/variante está enlazado a uno o más dominios coestimuladores de células NK, por ejemplo, 41BB/CD137, CD3zeta/CD247, DAP12 o DAP10. La unión de la variante a su receptor en una célula objetivo promueve por tanto señales apoptóticas dentro de la célula objetivo, además de estimular señales citotóxicas en la célula NK.
De acuerdo con realizaciones preferidas adicionales de la invención, se proporcionan células NK que tienen una función de receptor inhibidor de punto de control reducida y también expresan un ligando TRAIL mutante, como se ha descrito con más detalle con anterioridad con respecto a estas modificaciones de células NK respectivas. En realizaciones incluso más preferidas, una célula NK que expresa un ligando TRAIL mutante que tiene afinidad reducida o nula por los receptores señuelo TRAIL y puede ser un derivado de KHYG-1, carece además de un gen que codifica un receptor inhibidor de punto de control seleccionado de CD96 (TÁCTIL), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG-3), CD279 (PD-1), CD328 (SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT y TIM-3.
La presente invención proporciona células NK y líneas de células NK, preferiblemente células KHYG-1 y derivados de las mismas, modificadas para expresar una o más CAR.
Convenientemente para usos de terapia contra el cáncer, los CAR se unen específicamente a uno o más ligandos en células cancerosas, por ejemplo, CS1 (SLAMF7) en células de mieloma. Para su uso en el tratamiento de cánceres específicos, por ejemplo, mieloma múltiple, el CAR puede unirse a CD38. Por ejemplo, el CAR puede incluir las propiedades de unión de, por ejemplo, regiones variables derivadas, similares o idénticas a las del anticuerpo monoclonal conocido daratumumab. Tales células NK pueden usarse en la terapia contra el cáncer en combinación con un agente que inhibe la angiogénesis, por ejemplo, lenalidomida. Para su uso en la terapia de cánceres, especialmente leucemias y AML en particular, CAR puede unirse a CLL-1.
Las CAR-NK pueden ser biespecíficas, siendo su afinidad por dos ligandos/antígenos distintos. Las CAR-NK biespecíficas pueden usarse para aumentar el número de sitios de unión potenciales en las células cancerosas o, alternativamente, para localizar las células cancerosas en otras células efectoras inmunitarias que expresan ligandos específicos de la NK-CAR. Para su uso en la terapia contra el cáncer, un CAR biespecífico puede unirse a una célula tumoral objetivo y a una célula efectora, por ejemplo, una célula T, una célula NK o un macrófago. Así, por ejemplo, en el caso de mieloma múltiple, un CAR biespecífico puede unirse a un antígeno de células T (por ejemplo, CD3, etc.) y un marcador de células tumorales (por ejemplo, CD38, etc.). Un CAR biespecífico puede unirse alternativamente a dos marcadores de células tumorales separados, aumentando la afinidad de unión general de la célula NK por la célula tumoral objetivo. Esto puede reducir el riesgo de que las células cancerosas desarrollen resistencia regulando por disminución uno de los antígenos objetivo. Un ejemplo en este caso, en el mieloma múltiple, sería una unión de CAR tanto a CD38 como a CS-1/SLAMF7. Otro marcador de células tumorales dirigido adecuadamente por CAR es un marcador de tipo "no me comas" en tumores, ejemplificado por CD47.
Las características opcionales de la invención incluyen proporcionar modificaciones adicionales a las células NK y las líneas de células NK descritas anteriormente en donde, por ejemplo, un receptor Fc (que puede ser CD16, CD32 o CD64, incluyendo los subtipos y derivados) se expresa en la superficie de la célula. En uso, estas células pueden mostrar un reconocimiento aumentado de las células cancerosas recubiertas de anticuerpos y mejorar la activación de la respuesta citotóxica.
Características opcionales adicionales de la invención incluyen la adaptación de las células NK y las líneas de células NK modificadas para adaptarse mejor a regiones objetivo específicas del cuerpo. Las células NK de la invención pueden dirigirse a localizaciones específicas de células cancerosas. En realizaciones preferidas para el tratamiento de cánceres de la sangre, los efectores NK de la invención están adaptados para alojarse en la médula ósea. Las células NK específicas se modifican mediante fucosilación y/o sialilación para alojarlas en la médula ósea. Esto puede lograrse modificando genéticamente las células NK para que expresen la fucosiltransferasa y/o la sialiltransferasa apropiadas, respectivamente. También puede ser posible una localización aumentada de las células efectoras NK en los sitios del tumor mediante la alteración de la vasculatura del tumor, por ejemplo, mediante quimioterapia metronómica, o mediante el uso de fármacos dirigidos a la angiogénesis (Melero et al, 2014) para normalizar la infiltración de células NK a través de vasos sanguíneos de cáncer.
Otra característica opcional más de la invención es proporcionar células NK y líneas de células NK modificadas con una capacidad intrínseca aumentada para un crecimiento y proliferación rápidos en cultivo. Esto puede lograrse, por ejemplo, transfectando las células para que sobreexpresen las citoquinas IL-2 e IL-15 que inducen el crecimiento. Además, esta alteración opcional proporciona una alternativa rentable a la reconstitución del medio de crecimiento con citoquinas de manera continua.
La divulgación también incluye un método para elaborar una célula NK o una línea celular NK modificada, que comprende modificar genéticamente la célula o línea celular como se describe en la presente para aumentar su citotoxicidad. Esta modificación genética puede ser una desactivación estable de un gen, por ejemplo, por CRISPR, o una desactivación transitoria de un gen, por ejemplo, por ARNip.
En una realización preferida, se usa una técnica de modificación genética estable, por ejemplo, CRISPR, para proporcionar una nueva línea de células NK con citotoxicidad aumenta, por ejemplo, un derivado de las células KHYG-1.
En realizaciones, el método es para elaborar una célula NK o una línea de células NK que se ha modificado para reducir la función del receptor inhibidor. Preferiblemente, estos receptores inhibidores son receptores inhibidores de puntos de control.
Realizaciones más específicas comprenden un método para elaborar una célula NK o una línea de células NK con una función de receptor inhibidor reducida, en donde los receptores inhibidores del punto de control se seleccionan de CD96 (TÁCTIL), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG-3), CD279 (PD- 1), CD328 (SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT y TIM-3.
En realizaciones preferidas, el método comprende modificar las células NK para reducir la función de dos o más de los receptores inhibidores.
La divulgación proporciona además un método para elaborar una célula NK o una línea de células NK modificada que comprende modificar genéticamente la célula o la línea celular para que exprese el ligando TRAIL o el ligando TRAIL mutante (variante).
En realizaciones, el método comprende modificar una célula NK o una línea de células NK para que expresen un ligando TRAIL mutante que tiene una afinidad aumentada por los receptores de TRAIL. Preferiblemente, los receptores de TRAIL son DR4 y/o DR5. Las realizaciones preferidas proporcionan un método para modificar las células NK o las líneas de células NK para que expresen un ligando TRAIL mutante que tiene una afinidad reducida por los receptores de TRAIL señuelo.
En realizaciones preferidas adicionales, el método comprende modificar una célula NK o una línea de células NK para eliminar la función de un receptor inhibidor de punto de control y también para expresar un ligando TRAIL mutante con afinidad de unión reducida o nula por los receptores TRAIL señuelo. Realizaciones adicionales típicas proporcionan un método para elaborar una célula NK o una línea de células NK, en la que se ha eliminado la función de uno o más receptores inhibidores de puntos de control y/o se expresa un ligando TRAIL mutante, que tiene una afinidad de unión reducida o nula por los receptores TRAIL señuelo, y la célula se modifica adicionalmente para que exprese un CAR o un CAR biespecífico. Las propiedades del CAR son opcionalmente como se ha descrito con anterioridad.
En realizaciones, el método comprende elaborar una célula NK o una línea de células NK, en la que se ha eliminado la función de uno o más receptores inhibidores de puntos de control y/o se expresa un ligando TRAIL mutante, que tiene una afinidad de unión reducida o nula por los receptores TRAIL señuelo, y la célula se modifica opcionalmente para que exprese un CAR o un CAR biespecífico, y la célula se modifica adicionalmente para que exprese uno o más receptores Fc. Los receptores Fc adecuados se seleccionan de CD16 (FcRIII), CD32 (FcRII) y CD64 (FcRI).
Las realizaciones preferidas de todo lo anterior comprenden un método para elaborar células NK y líneas de células NK que son un derivado de KHYG-1.
Según los objetos de la invención, las células NK modificadas, la línea de células NK o la composición de las mismas con citotoxicidad aumentada son para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente, especialmente el cáncer de la sangre.
En realizaciones preferidas, la células NK modificada, la línea de células NK o la composición son para su uso en el tratamiento de cánceres de la sangre que incluyen leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, incluyendo los linfomas de células T y los linfomas de células B, mieloma asintomático, mieloma múltiple latente (SMM), mieloma activo o mieloma de cadena ligera.
En realizaciones incluso más preferidas, la invención es una línea de células NK obtenida como un derivado de KYHG-1 mediante la reducción de la función del receptor inhibidor del punto de control en una célula KHYG-1 o la expresión de un ligando TRAIL mutante en una célula KHYG-1, o ambos, para su uso en el tratamiento del cáncer de sangre.
Las células NK modificadas, las líneas de células NK y las composiciones de las mismas descritas en la presente, con anterioridad y a continuación, son adecuadas para el tratamiento del cáncer, en particular el cáncer en humanos, por ejemplo, para el tratamiento de cánceres de células sanguíneas o cánceres sólidos. Las células NK y derivados son preferiblemente células NK humanas. Para la terapia humana, se usan preferiblemente células NK humanas.
Los expertos en la técnica conocerán varias vías de administración para administrar agentes activos y combinaciones de los mismos a un paciente con necesidad de ello. Las realizaciones de la invención son para el tratamiento del cáncer de sangre. La administración de las células NK modificadas y/o líneas de células NK puede ser sistémica o localizada, como por ejemplo por vía intraperitoneal.
En otras realizaciones, el agente activo se administra más directamente. Así, la administración puede ser directamente intratumoral, adecuada especialmente para tumores sólidos.
En general, se cree que las células NK son adecuadas para los métodos, usos y composiciones de la invención. Según las células usadas en ciertos ejemplos de la presente, la célula NK puede ser una célula NK obtenida de una línea de células cancerosas. Ventajosamente, una célula NK, preferiblemente tratada para reducir su tumorigenicidad, por ejemplo haciéndola mortal y/o incapaz de dividirse, puede obtenerse de una línea celular de cáncer de sangre y usarse en métodos de la invención para tratar cáncer de sangre.
Para hacer que una célula derivada de cáncer sea más aceptable para uso terapéutico, generalmente se trata o se trata previamente de alguna manera para reducir o eliminar su propensión a formar tumores en el paciente. Las líneas de células NK modificadas específicas usadas en los ejemplos son seguras porque se han vuelto incapaces de dividirse; se irradian y conservan su capacidad de matar, pero mueren en unos 3-4 días. Por lo tanto, las células y líneas celulares específicas son incapaces de proliferación, por ejemplo, como resultado de la irradiación. Los tratamientos de células NK potenciales para su uso en los métodos de la presente incluyen la irradiación para evitar que se dividan y formen un tumor in vivo y la modificación genética para reducir la tumorigenicidad, por ejemplo, para insertar una secuencia que codifica un gen suicida que puede activarse para evitar que las células se dividan y formen un tumor in vivo. Los genes suicidas pueden ser activados por agentes exógenos, por ejemplo circulantes, que luego provocan la muerte celular en aquellas células que expresan el gen. Una alternativa adicional es el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos a células NK específicas de la terapia. CD52, por ejemplo, se expresa en células KHYG-1 y la unión de anticuerpos monoclonales a este marcador puede provocar citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y muerte de células KHYG-1.
Como se analizó en un artículo publicado por Suck et al, 2006, las líneas celulares y las células NK derivadas del cáncer se irradian fácilmente usando irradiadores como el Gammacell 3000 Elan. Se usa una fuente de Cesio-137 para controlar la dosificación de la radiación y puede usarse una curva de respuesta a la dosis entre, por ejemplo, 1 Gy y 50 Gy para determinar la dosis óptima para eliminar la capacidad proliferativa de las células, manteniendo al mismo tiempo los beneficios de una citotoxicidad aumentada. Esto se logra analizando la citotoxicidad de las células después de que se haya administrado cada dosis de radiación.
Hay beneficios significativos en usar una línea de células NK irradiadas para la inmunoterapia celular adoptiva sobre el enfoque bien establecido de células T autólogas o emparejadas con MHC. En primer lugar, el uso de una línea celular NK con una naturaleza altamente proliferativa significa que la expansión de las líneas celulares NK modificadas puede lograrse más fácilmente y a un nivel comercial. Luego, puede llevarse a cabo la irradiación de la línea de células NK modificada antes de la administración de las células al paciente. Estas células irradiadas, que retienen su citotoxicidad útil, tienen una vida útil limitada y, a diferencia de las células T modificadas, no circularán durante largos períodos de tiempo provocando efectos secundarios persistentes.
Además, el uso de células NK y líneas de células NK modificadas alogénicas significa que las células que expresan MHC de clase I en el paciente no pueden inhibir las respuestas citotóxicas de NK de la misma manera que lo pueden hacer con las respuestas citotóxicas de NK autólogas. El uso de células NK alogénicas y líneas celulares para eliminar células cancerosas se beneficia del efecto GVL mencionado anteriormente y, a diferencia de las células T, las células NK alogénicas y líneas celulares no estimulan la aparición de GVHD, lo que las convierte en una opción más preferida para el tratamiento del cáncer a través de la inmunoterapia celular adoptiva.
Ejemplos
La presente invención se describe ahora con más detalles específicos en relación con la producción de derivados de la línea de células NK KHYG-1, modificados para que muestren más actividad citotóxica y, por lo tanto, capacidad para provocar la muerte de células leucémicas en humanos.
La invención se ilustra ahora en realizaciones específicas con referencia a los dibujos acompañantes en los que:
La Fig. 1 muestra la secuencia de ADN de la región objetivo del gen LIR2 y marca las regiones flanqueantes del ARNg;
La Fig. 2 muestra la secuencia de ADN de la región objetivo del gen CTLA4 y marca las regiones flanqueantes del ARNg;
La Fig. 3 muestra el constructo de ARNg (vector de expresión) usado para la transfección;
La Fig. 4 muestra bandas de electroforesis en gel para ADN de LIR2 original y mutado, antes y después de la transfección;
La Fig. 5 muestra bandas de electroforesis en gel para ADN de CTLA4 original y mutado, antes y después de la transfección;
La Fig. 6A es un gráfico FACS que muestra la desactivación con éxito de CD96 usando electroporación;
La Fig. 6B es un gráfico FACS que muestra la desactivación con éxito de CD96 usando electroporación;
La Fig. 7 es un gráfico de barras que muestra la citotoxicidad aumentada de las células KHYG-1 desactivadas por CD96 frente a las células K562 en diversas proporciones E:T;
La Fig. 8 muestra la desactivación de CD328 (Siglec-7) en células NK-92;
La Fig. 9 muestra una citotoxicidad mejorada de las células NK con desactivación de CD328 (Siglec-7);
La Fig. 10 muestra un gráfico FACS de la expresión inicial de TRAIL en células KHYG-1;
La Fig. 11 muestra un gráfico FACS de la expresión de TRAIL y la variante de TRAIL después de la transfección de células KHYG-1;
La Fig. 12 muestra un gráfico FACS de la expresión de CD107a después de la transfección de células KHYG-1; La Fig. 13 muestra los efectos de la transfección de células KHYG-1 con TRAIL y la variante TRAIL sobre la viabilidad celular;
La Fig. 14 muestra un gráfico FACS de la expresión de referencia de DR4, DR5, DcR1 y DcR2 tanto en células KHYG-1 como en células NK-92;
Las Figs. 15, 16 y 17 muestran los efectos de expresar TRAIL o la variante de TRAIL en células KHYG-1 sobre la apoptosis de tres poblaciones de células objetivo: K562, RPMI8226 y MM1.S, respectivamente;
La Fig. 18 muestra dos gráficos FACS de la expresión de DR5 en células RPMI8226 y células MM1.S, respectivamente, en donde se muestran los efectos del tratamiento con bortezomib sobre la expresión de DR5; La Fig. 19 muestra gráficos FACS de apoptosis en células MM1.S pretratadas/no tratadas con bortezomib cocultivadas con células KHYG-1 con/sin la variante TRAIL;
La Fig. 20 muestra un gráfico FACS de los niveles de expresión de perforina en células KHYG-1 tratadas con CMA 100 nM durante 2 horas;
La Fig. 21 muestra gráficos FACS de la viabilidad de las células KHYG-1 después del tratamiento con CMA 100 nM o vehículo;
La Fig. 22 muestra gráficos FACS de apoptosis en células MM1.S cocultivadas con células KHYG-1 con/sin la variante TRAIL y pretratadas con/sin CMA;
La Fig. 23 muestra gráficos FACS de apoptosis en células K562 cocultivadas con células KHYG-1 con expresión de variante CD96-ARNip y/o TRAIL; y
La Fig. 24 muestra gráficos FACS de apoptosis en células MM1.S cocultivadas con células KHYG-1 con expresión de variante CD96-ARNip y/o TRAIL.
A continuación se hace referencia a las secuencias de ADN, ARN y aminoácidos, en las que:
SEQ ID NO: 1 es la secuencia completa de ADN de LIR2;
SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de LIR2;
SEQ ID NO: 3 es la secuencia de ARNg de LIR2 g9;
SEQ ID NO: 4 es la secuencia de ARNg de LIR2 g18;
SEQ ID NO: 5 es la secuencia del cebador directo de LIR2;
SEQ ID NO: 6 es la secuencia del cebador inverso de LIR2;
SEQ ID NO: 7 es la secuencia completa de ADN de CTLA4;
SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de CTLA4;
SEQ ID NO: 9 es la secuencia de ARNg g7 de CTLA4;
SEQ ID NO: 10 es la secuencia de ARNg g15 de CTLA4;
SEQ ID NO: 11 es la secuencia del cebador directo de CTLA4; y
SEQ ID NO: 12 es la secuencia del cebador inverso de CTLA4.
Ejemplo 1 - Desactivación de la función del receptor inhibidor
CRISPR/Cas9
Las células se prepararon de la siguiente manera, habiéndose eliminado la función inhibidora del receptor. Los constructos de ARNg se diseñaron y prepararon para que se dirigiesen a los genes que codifican el receptor inhibidor 'clásico' LIR2 y el receptor inhibidor de 'punto de control' CTLA4 en el genoma humano de las células NK. Luego, se usó la edición del genoma CRISPR/Cas9 para desactivar los genes objetivo LIR2 y CTLA4.
Se seleccionaron dos candidatos de ARNg para cada gen objetivo y se determinaron sus eficacias de escisión en células K562. Las secuencias de los candidatos de ARNg se muestran en la Tabla 1 y el Motivo adyacente al protoespaciador (PAM) se relaciona con las últimas 3 bases de la secuencia. Las regiones flanqueantes de las secuencias de ARNg en el gen LIR2 (SEQ ID NO: 1) y el gen CTLA4 (SEQ ID NO: 7) se muestran en las Figuras 1 y 2, respectivamente.
Tabla 1. Candidatos secuencias de ARN
Figure imgf000011_0001
Las células K562 se transfectaron con los constructos de ARNg preparados (Figura 3) y posteriormente se recogieron para la amplificación por PCR. La presencia de expresión de GFP se usó para informar sobre la incorporación exitosa de la construcción de ARNg en las células K562. Esto confirmó la expresión del gen Cas9 y, por lo tanto, la capacidad de anular la expresión de los genes LIR2 y CTLA4.
La actividad de escisión de los constructos de ARNg se determinó usando un ensayo de detección de malapareamientos in vitro. La endonucleasa I T7E1 reconoce y escinde el ADN que no coincide perfectamente, lo que permite comparar los genes LIR2 y CTLA4 originales con los genes mutados después de la transfección CRISPR/Cas9 y la unión de extremos no homólogos (NHEJ).
La Figura 4 muestra las bandas resultantes después de la electroforesis en gel de agarosa después de la desactivación del gen LIR2 con las secuencias de ARN g g9 y g18. Las tres bandas correspondientes a cada mutación se relacionan con el gen original y las dos cadenas resultantes tras la detección de un malapareamiento en la secuencia de ADN después de la transfección. La secuencia ARNg g9 dio como resultado una tasa de éxito de transfección del 1 %, mientras que ARNg g18 dio como resultado un 10%.
La Figura 5 muestra las bandas resultantes después de la electroforesis en gel de agarosa después de la desactivación del gen CTLA4 con las secuencias de ARNg g7 y g15. La secuencia de ARNg g7 dio como resultado una tasa de éxito de transfección del 32%, mientras que la ARNg g15 dio como resultado un 26%.
Tras la desactivación con éxito de LIR2 y CTLA4 en células K562, las células KHYG-1 se transfectaron con constructos de ARNg.
Se seleccionaron clones derivados de KHYG-1 que tenían deleciones homocigóticas. Para este propósito se usó un vector de expresión Cas9/puromicina acetiltransferasa (PAC). Se seleccionaron las células transfectadas con éxito en base a su resistencia al antibiótico puromicina.
Cas9 RNP
Otro protocolo usado para la desactivación de los receptores inhibidores de puntos de control en las células NK fue el de la transfección Cas9 RNP. Una ventaja de usar este protocolo fue que se lograron eficiencias de transfección similares pero con una toxicidad significativamente menor en comparación con el uso de los plásmidos de ADN del protocolo CRISPR/Cas9.
Para cada experimento de transfección se recogieron 1x106 células KHYG1. Las células se lavaron con PBS y se centrifugaron en una centrífuga. Luego se descartó el sobrenadante. Luego, se prepararon los materiales CRISPR RNP (proteína de unión a ARN) de la siguiente manera:
(1) Se preparó una solución 20 pM de los ARNcr y ARNt sintetizados requeridos (adquiridos de Dharmacon). (2) Se mezclaron 4 pl de ARNcr (20 pM) y 4 pl de ARNt (20 pM).
(3) Luego, la mezcla se añadió a 2 pl de proteína Cas9 (5 pg/pl).
(4) Todos los componentes se mezclaron e incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Siguiendo el Sistema de Transfección Neon®, las células se mezclaron con Cas9 RNP y se realizó la electroporación usando los siguientes parámetros:
Voltaje: 1450v
Ancho de pulso: 30ms
Número de pulso: 1
Luego, las células se transfirieron a un pocilio de una placa de 12 pocilios que contenía medio de crecimiento (incl. IL-2 e IL-15).
Las células se recogieron después de 48-72 horas para confirmar la eficacia de la edición de genes mediante el ensayo de endonucleasa T7 y/o secuenciación de Sanger. Se confirmó la presencia de indeles, lo que indica la desactivación con éxito de CTLA4, PD1 y CD96 en células KHYG1.
Nucleasas específicas del sitio
Otro protocolo usado para la desactivación de los receptores inhibidores de puntos de control en las células NK fue el de la transfección XTN TALEN. Una ventaja de usar este protocolo fue que se logró un nivel particularmente alto de especificidad en comparación con CRISPR de tipo salvaje.
Paso 1: Preparación de reactivos
Las células KHYG-1 se analizaron para determinar ciertos atributos, incluyendo la eficiencia de transfección, la eficiencia de clonación de células individuales y el cariotipo/número de copias. Luego, las células se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
Dependiendo de la desactivación del receptor inhibidor de punto de control, se prepararon nucleasas mediante un diseño personalizado de por lo menos 2 pares de XTN TALEN. El paso de diseño personalizado incluye la evaluación del locus del gen, el número de copias y la evaluación funcional (es decir, homólogos, evaluación fuera del objetivo).
Paso 2: Manipulación de líneas celulares
Las células se transfectaron con las nucleasas del Paso 1; este paso se repitió hasta 3 veces para obtener altos niveles de corte y los cultivos se dividieron y los cultivos intermedios se mantuvieron antes de cada transfección.
La selección inicial se produjo varios días después de cada transfección; se probó la eficiencia de corte de los grupos de células a través del ensayo Cel-1. Después de que el nivel de corte alcanzara niveles aceptables o mesetas después de transfecciones repetidas, las células se consideraron listas para la clonación de células individuales.
Las células agrupadas se clasificaron en una célula por pocillo en una placa de 96 pocillos; el número de placas para cada grupo dependía de la eficiencia de clonación de células individuales determinada en el Paso 1. Las placas se dejaron incubar durante 3-4 semanas.
Paso 3: Selección y expansión
Una vez que las células confluyeron en las placas de 96 pocillos, los cultivos se consolidaron y se dividieron en placas de 96 pocillos por triplicado; una placa se congeló como reserva, una placa se volvió a sembrar para continuar con la expansión de los clones y la placa final se usó para la confirmación del genotipo.
Se analizó la pérdida de señal de qPCR en cada clon de la placa de genotipo, lo que indicaba que se habían modificado todos los alelos. Los clones negativos se amplificaron mediante PCR y se clonaron para determinar la naturaleza de los indeles y la falta de indeles de tipo salvaje o en el marco.
Los clones con la inactivación confirmada se consolidaron en no más de una placa de 24 pocillos y se expandieron adicionalmente; típicamente se produjeron 5-10 crioviales congelados que contenían 1 x 106 células por vial para hasta 5 clones individuales por desactivación.
Paso 4 - Validación
Las células se almacenaron en bancos en condiciones asépticas.
Los criterios básicos de liberación para todas las células almacenadas incluyeron el número de células viables (precongelación y posdescongelación), confirmación de identidad a través de STR, garantía de esterilidad básica y prueba de micoplasma; se aplicaron otros criterios de liberación cuando era necesario (cariotipo, expresión de marcadores de superficie, esterilidad de alto nivel, evaluación de inactivación de transcrito o proteína, etc.). Ejemplo 2 - Desactivación de la función CD96 del receptor inhibidor del punto de control a través de ARNi La desactivación de ARNip de CD96 en células KHYG-1 se realizó mediante electroporación. Se usó el kit de Nucleofección Kit T, junto con Amaxa Nucleofector II, de Lonza, ya que es apropiado para su uso con líneas celulares y puede transfectar con éxito células tanto en división como no en división y logra eficiencias de transfección de hasta el 90%.
El ARNip de control (número de catálogo: sc-37007) y el ARNip de CD96 (número de catálogo: sc-45460) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology. Se usó RPMI-1640 libre de antibióticos que contenía FBS al 10%, L-glutamina 2 mM para el cultivo posterior a la nucleofección. Se obtuvo CD96-APC antihumano de ratón (número de catálogo: 338409) de Biolegend para tinción.
Se preparó una solución madre de ARNip 20 pM. El dúplex de ARNip liofilizado se volvió a suspender en 33 pl de agua libre de ARNasa (tampón de dilución de ARNip: sc-29527) a FITC-control/control-ARNip, en 165 pl de agua libre de ARNasa para el ARNip del gen objetivo (ARNip CD96). El tubo se calentó a 90° C durante 1 minuto y luego se incubó a 37° C durante 60 minutos. A continuación, la solución madre de ARNip se almacenó a -20° C hasta que se necesitó.
Las células KHYG-1 se pasaron uno o dos días antes de la nucleofección, ya que las células deben estar en fase de crecimiento logarítmico.
La solución de Nucleofector se calentó a temperatura ambiente (100 ul por muestra). También se precalentó a 37° C una alícuota de medio de cultivo que contenía suero y suplementos en un tubo de 50 ml. Se prepararon placas de 6 pocillos añadiendo 1,5 ml de medio de cultivo que contenía suero y suplementos. Las placas se preincubaron en una incubadora humidificada a 37° C/CO2 al 5%.
Se mezclaron suavemente 2x106 células en 100 pl de solución de Nucleofección con 4 pl de solución de ARNip 20 pM (1,5 pg de ARNip). Se evitaron las burbujas de aire durante el mezclado. La mezcla se transfirió a cubetas certificadas Amaxa y se colocó en el portacubetas Nucleofector y se seleccionó el programa U-001.
Se dejó que terminara el programa y se retiraron inmediatamente las muestras de las cubetas. A continuación, se añadieron a cada cubeta 500 pl de medio de cultivo preequilibrado. Luego, la muestra de cada cubeta se transfirió suavemente a un pocillo correspondiente de la placa de 6 pocillos preparada, para establecer un volumen final de 2 ml por pocillo.
Luego, las células se incubaron en un incubador humidificado a 37°C/CO2 al 5% hasta que se realizó el análisis de transfección. El análisis de citometría de flujo se realizó 16-24 horas después de la electroporación para medir los niveles de expresión de CD96. Este protocolo de electroporación se llevó a cabo varias veces y se encontró que resultaba fiable en la desactivación de CD96 en células KHYG-1 (ver, por ejemplo, las Figuras 6A y 6B).
Ejemplo 3 - Citotoxicidad mejorada de las células NK con una desactivación de CD96
Las células KHYG-1 con y sin la desactivación de CD96 se cocultivaron con células K562 en diferentes proporciones efector:objetivo (E:T).
La citotoxicidad se midió 4 horas después del cocultivo, usando el kit de citotoxicidad DELFIA EuTDA de PerkinElmer (número de catálogo: AD0116).
Las células objetivo K562 se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía FBS al 10%, L-glutamina 2 mM y antibióticos. Se adquirieron de SARSTEDT placas con fondo en V de 96 pocillos (número de catálogo: 83.3926). Se usó una centrífuga Eppendorf 5810R (con rotor de placas) para hacer girar la placa. Se usó un VARIOSKAN FLASH (con el software Scanlt 2.4.3) para medir la señal de fluorescencia producida por las células K562 lisadas.
Las células K562 se lavaron con medio de cultivo y el número de células se ajustó a 1 x 106 células/ml con medio de cultivo. Se añadieron 2-4 ml de células a 5 pl de reactivo BATDA y se incubaron durante 10 minutos a 37° C. Dentro de la célula, los enlaces éster se hidrolizan para formar un ligando hidrófilo, que ya no atraviesa la membrana. Las células se centrifugaron a 1500 RPM durante 5 minutos para lavar las células K562 cargadas. Esto se repitió 3-5 veces con medio que contenía probenecid 1 mM (Sigma P8761). Después del lavado final, el sedimento celular se volvió a suspender en medio de cultivo y se ajustó a aproximadamente 5 x 104 células/ml.
Se configuraron los pocillos para la detección de fondo, liberación espontánea y liberación máxima. Se transfirieron 100 pl de células objetivo cargadas (5000 células) a los pocillos en una placa con fondo en V y se añadieron 100 pl de células efectoras (células KHYG-1) a concentraciones celulares variables, para producir proporciones de efector a objetivo que varían entre 1:1 a 20:1. La placa se centrifugó a 100xg durante 1 minuto y se incubó durante 4 horas en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2 a 37° C. Para pocillos de liberación máxima, se añadieron 10 pl de tampón de lisis a cada pocillo 15 minutos antes de recoger el medio. La placa se centrifugó a 500xg durante 5 minutos.
Se transfirieron 20 pl de sobrenadante a una placa de 96 pocilios de fondo plano y se añadieron 200 pl de solución de europio precalentada. Esto se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos usando un agitador de placas. A medida que las células KHYG-1 lisan las células K562, liberan el ligando en el medio. Este ligando luego reacciona con la solución de europio para formar un quelato fluorescente que se correlaciona directamente con la cantidad de células lisadas.
Luego, se midió la fluorescencia en un fluorómetro de resolución temporal usando VARIOSKAN FLASH. La liberación específica se calculó usando la siguiente fórmula:
% de liberación específica = Liberación del experimento - Liberación espontáneo / Liberación máxima -Liberación espontánea
El análisis estadístico se realizó usando el software Graphpad Prism 6.04. Se usó una prueba t pareada para comparar la diferencia entre las células KHYG-1 CD96 desactivado ARNip y los grupos de control (n=3).
Se descubrió que la liberación específica aumentaba significativamente en los cocultivos que contenían las células KHYG-1 CD96 desactivado. Este fue el caso en todas las relaciones E:T (ver Figura 7).
Como la fluorescencia se correlaciona directamente con la lisis celular, se confirmó que la desactivación de la expresión de CD96 en las células KHYG-1 dio como resultado un aumento de su capacidad para destruir las células objetivo del cáncer K562.
Ejemplo 4 - Citotoxicidad mejorada de las células NK con una desactivación de CD328 (Siglec-7)'
Desactivación mediada por ARNip de CD328 en células NK-92
Materiales, reactivos e instrumentos
El ARNip de control (número de catálogo: sc-37007) y el ARNip de CD328 (número de catálogo: sc-106757) se compraron a Santa Cruz Biotechnology. Para lograr eficiencias de transfección de hasta el 90% con alta viabilidad celular (>75%) en células NK-92 con el dispositivo Nucleofector™ (Nucleofector II, Lonza), se usó un Nucleofector™ Kit T de Lonza. Se usó RPMI-1640 que contenía FBS al 10%, L-glutamina 2 mM, libre de antibióticos, para el cultivo posterior a la nucleofección. Se compró CD328-APC antihumano de ratón (número de catálogo: 339206) a Biolegend.
Protocolo
Para elaborar 10 pM de solución madre de ARNip
• Volver a suspender el dúplex de ARNip liofilizado en 66 pl de agua libre de ARNasa (tampón de dilución de ARNip: sc-29527) a FITC-control/control-ARNip, en 330 pl de agua libre de ARNasa para el ARNip del gen objetivo (ARNip CD328).
• Calentar el tubo a 90° C durante 1 minuto.
• Incubar a 37° C durante 60 minutos.
• Almacenar el stock de ARNip a -20° C si no se usa directamente.
• Una muestra de nucleofección contiene (para una cubeta estándar de 100 pl)
• Número de células: 2x106 células
• ARNip: 4 pl de stock 10 pM
• Solución de nucleofector: 100pl
Nucleofección
• Cultivar el número requerido de células. (Pase uno o dos días antes de la Nucleofección, las células deben estar en fase de crecimiento logarítmico).
• Preparar ARNip para cada muestra.
• Precalentar la solución de Nucleofector a temperatura ambiente (100 pl por muestra).
• Precalentar una alícuota de medio de cultivo que contenga suero y suplementos a 37° C en un tubo de 50 ml. Preparar placas de 6 pocillos llenándolas con 1,5 ml de medio de cultivo que contenga suero y suplementos y preincubar las placas en una incubadora humidificada a 37° C/5% de CO2.
• Tomar una alícuota de cultivo celular y contar las células para determinar la densidad celular.
• Centrifugar el número requerido de células a 1500 rpm durante 5 min. Descartar el sobrenadante por completo para que ningún medio residual cubra el sedimento celular.
• Volver a suspender el sedimento celular en solución de Nucleofector a temperatura ambiente hasta una concentración final de 2 x 106 células/100 pl. Evitar almacenar la suspensión celular durante más de 15-20 minutos en solución de nucleofector, ya que esto reduce la viabilidad celular y la eficiencia de la transferencia de genes.
• Mezclar 100 gl de suspensión celular con ARNip.
• Transferir la muestra a una cubeta certificada por amaxa. Asegurarse que la muestra cubra el fondo de la cubeta, evitar las burbujas de aire mientras se pipetea. Cerrar la cubeta con la tapa azul.
• Seleccionar el programa de Nucleofector apropiado (A-024 para células NK-92). Insertar la cubeta en el portacubetas (Nucleofector II: rotar el carrusel en el sentido de las agujas del reloj hasta la posición final) y presionar el botón "x" para iniciar el programa.
• Para evitar daños a las células, retirar las muestras de la cubeta inmediatamente después de que el programa haya finalizado (la pantalla muestra "OK"). Añadir 500 gl del medio de cultivo precalentado a la cubeta y transferir la muestra a la placa de 6 pocillos preparada.
• Incubar las células en una incubadora humidificada a 37° C/5% de CO2. Realizar un análisis de citometría de flujo y un ensayo de citotoxicidad después de 16 a 24 horas.
Resultados: seguimos el protocolo anterior y realizamos análisis de citometría de flujo del nivel de expresión de CD328 en células NK-92. Los resultados de un experimento representativo se muestran en la Fig. 8, confirmando una desactivación con éxito.
La desactivación de CD328 mejora la citotoxicidad
Materiales, reactivos e instrumentos
Se compró el kit de citotoxicidad DELFIA EuTDA basado en un ligando potenciador de la fluorescencia (Número de catálogo: AD0116) de PerkinElmer. Las células objetivo K562 se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía FBS al 10%, L-glutamina 2 mM y antibióticos. Las placas con fondo en V de 96 pocillos (número de catálogo: 83.3926) se compraron a SARSTEDT. Se usó una centrífuga Ependrof 5810R (con rotor de placa) para hacer girar la placa. Se usó VARIOSKAN FLASH (con el software Scanlt 2.4.3) para medir la señal de fluorescencia producida por las células K562 lisadas.
Protocolo
• Cargar las células K562 objetivo con el ligando potenciador de fluorescencia reactivo DELFIA BATDA • Lavar las células K562 con medio, ajustar el número de células a 1 x 106 células/ml con medio de cultivo.
Añadir 2-4 ml de células a 5 gl de reactivo BATDA, incubar durante 10 minutos a 37° C.
• Centrifugar a 1500 RPM durante 5 minutos para lavar las células K562 cargadas de 3 a 5 veces con medio que contiene probenecid 1 mM (Sigma P8761).
• Después del último lavado, volver a suspender el sedimento celular en medio de cultivo y ajustar a aproximadamente 5 x 104 células/ml.
Ensayo de citotoxicidad
• Configurar los pocillos para la detección de fondo, liberación espontánea y liberación máxima.
• Pipetear 100 gl de células objetivo cargadas (5000 células) en una placa con fondo en V.
• Añadir 100 gl de células efectoras (NK-92) de varias concentraciones celulares. La proporción entre el efector y el objetivo varía entre 1:1 y 20:1.
• Centrifugar la placa a 100xg de RCF durante 1 minuto.
• Incubar durante 2 horas en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37° C. Para pocillos de liberación máxima, añadir 10 gl de tampón de lisis a cada pocillo 15 minutos antes de recoger el medio.
• Centrifugar la placa a 500xg durante 5 minutos.
• Transferir 20 gl de sobrenadante a una placa de 96 pocillos de fondo plano, añadir 200 gl de solución de europio precalentada, incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos usando un agitador de placas.
• Medir la fluorescencia en un fluorómetro de resolución temporal usando VARIOSKAN FLASH. La liberación específica se calculó usando la siguiente fórmula:
• % de liberación específica = Liberación del experimento - Liberación espontánea / Liberación máxima -Liberación espontánea
Resultados: seguimos lo anterior para determinar el efecto sobre la citotoxicidad de la desactivación de CD328. En la Figura 9 se muestran los resultados de un experimento representativo. Como se ve, la citotoxicidad contra las células objetivo aumentó en las células con la desactivación de CD328.
Ejemplo 5 - Protocolo para la terapia contra el cáncer de sangre mediante desactivación/desactivación de receptores inhibidores de puntos de control
Como se demuestra en los Ejemplos anteriores, la función del receptor inhibidor del punto de control puede desactivarse o anularse de varias maneras. El siguiente protocolo se desarrolló para su uso en el tratamiento de pacientes con cáncer de la sangre:
Después del diagnóstico de un paciente con un cáncer tratado adecuadamente con la invención, puede descongelarse y cultivarse una alícuota de células NK modificadas antes de la administración al paciente.
Alternativamente, puede prepararse una mutación transitoria usando, por ejemplo, ARNip en el plazo de uno o dos días, como se ha descrito anteriormente. La plataforma MaxCyte Flow Electroporation ofrece una solución adecuada para lograr transfecciones rápidas a gran escala en la clínica.
La eliminación de ciertos receptores inhibidores de puntos de control puede ser más beneficiosa que otras. Es probable que esto dependa del paciente y del cáncer. Por esta razón, opcionalmente se realiza una biopsia del cáncer y las células cancerosas se cultivan ex vivo. Por tanto, pueden probarse una variedad de células NK con diferentes modificaciones del receptor inhibidor de puntos de control para determinar la citotoxicidad contra el cáncer específico. Este paso puede usarse para seleccionar la célula NK o derivado de la misma más apropiada para la terapia.
Después de una modificación con éxito, las células se vuelven a suspender en un portador adecuado (por ejemplo, solución salina) para inyección intravenosa y/o intratumoral en el paciente.
Ejemplo 6 - Activación de KHYG-1 de TRAIL/variante de TRAIL
Las células KHYG-1 se transfectaron tanto con TRAIL como con la variante TRAIL, para evaluar su viabilidad y capacidad para destruir las células cancerosas después de la transfección.
La variante de TRAIL usada es la descrita en la WO 2009/077857. Está codificada por el gen TRAIL de tipo salvaje que contiene la mutación D269H/E195R. Esta mutación aumenta significativamente la afinidad de la variante de TRAIL por DR5, a la vez que reduce la afinidad por ambos receptores señuelo (DcR1 y DcR2).
Expresión de TRAIL de referencia
La expresión de referencia de TRAIL (CD253) en células KHYG-1 se analizó usando citometría de flujo. Se usaron CD253-APC antihumano de ratón (número de catálogo de Biolegend: 308210) y control de isotipo (número de catálogo de Biolegend: 400122) para teñir muestras de células y se analizaron en un citómetro de flujo BD FACS Canto II.
Las células KHYG-1 se cultivaron en medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (100 mg/ml) e IL-2 (10 ng/ml). Se recogieron 0,5-1,0 x 106 células/prueba mediante centrifugación (1500 rpm x 5 minutos) y se aspiró el sobrenadante. Las células (suspensión de células individuales) se lavaron con 4 ml de tampón FACS enfriado con hielo (PBS, BSA al 0,5-1%, azida sódica de NaN3 al 0,1%). Las células se volvieron a suspender en 100 gl de tampón FACS enfriado con hielo, se añadieron 5 gl de anticuerpo a cada tubo y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron 3 veces por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. A continuación, las células se volvieron a suspender en 500 gl de tampón FACS enfriado con hielo y se mantuvieron temporalmente en la oscuridad sobre hielo.
Posteriormente, las células se analizaron en el citómetro de flujo (BD FACS Canto II) y los datos generados se procesaron con el software FlowJo 7.6.2.
Como puede verse en la Figura 10, el análisis FACS mostró una débil expresión de referencia de TRAIL en la superficie celular de KHYG-1.
Activación de TRAIL/variante de TRAIL por electroporación
El ARNm de TRAIL de tipo salvaje y la variante de ARNm de TRAIL (D269H/195R) se sintetizó mediante TriLink BioTechnologies, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80° C. Se usaron anticuerpos CD253-APC antihumano de ratón (número de catálogo de Biolegend: 308210) y control de isotipo (número de catálogo de Biolegend: 400122), y CD107a-PE antihumano de ratón (número de catálogo de eBioscience: 12-1079-42) y control de isotipo (catálogo de eBioscience número: 12-4714) para teñir muestras de células y se analizaron en un citómetro de flujo BD FACS Canto II. Se usó colorante de ADN SYTOX-Green (número de catálogo de Life Technologies: S7020; solución 5 mM en DMSO). Para lograr eficiencias de transfección de hasta el 90% con alta viabilidad celular en células KHYG-1 con el dispositivo Nucleofector™ (Nucleofector II, Lonza), Se usó un Kit T Nucleofector™ de Lonza. Se usó RPMI 1640 libre de antibióticos que contenía FBS al 10%, L-glutamina (2 mM) e IL-2 (10 ng/ml) para el cultivo posterior a la nucleofección.
Las células KHYG-1 y NK-92 se sometieron a pases uno o dos días antes de la nucleofección, ya que las células deben estar en la fase de crecimiento logarítmico. La solución de Nucleofector se precalentó a temperatura ambiente (100 gl por muestra), junto con una alícuota de medio de cultivo que contenía suero y suplementos a 37° C en un tubo de 50 ml. Se prepararon placas de 6 pocillos llenándolas con 1,5 ml de medio de cultivo que contenía suero y suplementos y se preincubaron en un incubador humidificado a 37° C/CO2 al 5%. Se preparó una alícuota de cultivo celular y se contaron las células para determinar la densidad celular. Se centrifugó el número de células requerido a 1500 rpm durante 5 min, antes de descartar completamente el sobrenadante. El sedimento celular se volvió a suspender en solución Nucleofector a temperatura ambiente hasta una concentración final de 2 x 106 células/100gl (tiempo máximo en suspensión = 20 minutos). Se mezclaron 100 gl de suspensión celular con 10 gg de ARNm (volumen de ARN <10 gl). La muestra se transfirió a una cubeta certificada por Amaxa (asegurándose de que la muestra cubriera el fondo de la cubeta y evitando las burbujas de aire). Se seleccionó el programa Nucleofector apropiado (es decir, U-001 para células KHYG-1). Luego, las cubetas se insertaron en el portacubetas. Se añadieron 500 gl de medio de cultivo precalentado a la cubeta y la muestra se transfirió a una placa de 6 pocillos preparada inmediatamente después de que terminara el programa, para evitar dañar las células. Las células se incubaron en una incubadora a 37° C/5% de CO2 humidificada. Se realizaron análisis de citometría de flujo y ensayos de citotoxicidad 12-16 horas después de la electroporación. La tinción por citometría de flujo se llevó a cabo como anteriormente.
Como puede verse en las Figs. 11 y 12, la expresión de TRAIL/ variante de TRAIL y CD107a (marcador de activación de NK) aumentó después de la transfección, lo que confirma la activación con éxito de los genes TRAIL en las células KHYG-1.
La Fig. 13 proporciona evidencia de la viabilidad de las células KHYG-1 antes y después de la transfección mediante electroporación. Puede verse que no se observan diferencias estadísticamente significativas en la viabilidad celular después de la transfección de las células con TRAIL/variante de TRAIL, lo que confirma que la expresión de TRAIL de tipo salvaje o variante no es tóxica para las células. Esta observación contradice los descubrimientos correspondientes en las células NK-92, que sugieren que la activación del gen de la variante de TRAIL es tóxica para las células (no se muestran los datos). Sin embargo, esto probablemente se explica por los niveles de expresión relativamente altos de los receptores de TRAIL DR4 y DR5 en la superficie de la célula NK-92 (ver la Fig. 14).
Efectos de TRAIL/variante de TRAIL sobre la citotoxicidad de células KHYG-1
Se usó anticuerpo anti-CD2-APC humano de ratón (número de catálogo de BD Pharmingen: 560642). Se usó anticuerpo anexina V-FITC (número de catálogo de ImmunoTools: 31490013). Se usó colorante de ADN SYTOX-Green (número de catálogo de Life Technologies: S7020). Se usó una placa de cultivo celular de 24 pocillos (número de catálogo SARSTEDT AG: 83.3922). Como células objetivo se usaron la línea celular de leucemia mielógena K562, la línea celular de mieloma múltiple RPMI8226 y MM1.S. K562, RPMI8226, MM1.S se cultivaron en medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10%, L-glutamina 2 mM y penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (100 mg/ml).
Como se ha explicado anteriormente, las células KHYG-1 se transfectaron con TRAIL/variante de TRAIL. Las células objetivo se lavaron y sedimentaron mediante centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Las células KHYG-1 transfectadas se diluyeron a 0,5 x 106/ml. Luego, se ajustó la densidad de células objetivo en medio RPMI 1640 precalentado, para producir proporciones efector:objetivo (E:T) de 1:1.
Luego, se mezclaron 0,5 ml de células KHYG-1 y 0,5 ml de células objetivo en una placa de cultivo de 24 pocillos y se colocaron en una incubadora humidificada a 37° C/CO2 al 5% durante 12 horas. Luego se usó el análisis de citometría de flujo para ensayar la citotoxicidad de las células KHYG-1; las células cocultivadas (en diferentes momentos) se lavaron y luego se tiñeron con anticuerpo CD2-APC (5 gl/prueba), anexina V-FITC (5 gl/prueba) y SYTOX-Green (5 gl/prueba) usando tampón de unión de anexina V.
Los datos se analizaron adicionalmente usando el software FlowJo 7.6.2. Se establecieron puertas CD2-positivas y CD2-negativas, que representan poblaciones de células KHYG-1 y células objetivo, respectivamente. Luego, se analizó la apoptosis inducida por TRAIL en las células positivas para anexina V-FITC y SYTOX-Green en la población negativa para CD2.
Las Figs. 15, 16 y 17 muestran los efectos de ambas células KHYG-1 que expresan TRAIL o la variante de TRAIL sobre la apoptosis para las tres líneas celulares objetivo: K562, RPMI8226 y MM1.S, respectivamente. Es evidente para todas las poblaciones de células objetivo que la expresión de TRAIL en las células KHYG-1 aumentó el nivel de apoptosis, en comparación con las células KHYG-1 normales (no transfectadas con TRAIL). Además, la expresión de la variante TRAIL en las células KHYG-1 aumentó adicionalmente la apoptosis en todas las líneas celulares objetivo, en comparación con las células KHYG-1 transfectadas con TRAIL de tipo salvaje.
Las células de la invención, que expresan la variante de TRAIL, ofrecen una ventaja significativa en la terapia contra el cáncer, debido a que muestran mayores afinidades por el receptor de muerte DR5. Cuando son desafiadas por estas células de la invención, se evita que las células cancerosas desarrollen estrategias defensivas para eludir la muerte a través de una vía determinada. Por tanto, los cánceres no pueden eludir eficazmente la muerte celular inducida por TRAIL mediante la regulación por incremento de los receptores señuelo de TRAIL, ya que las células de la invención se modifican para que sigan siendo citotóxicas en esas circunstancias.
Ejemplo 7 - Protocolo para la terapia contra el cáncer de sangre usando células NK con variantes de TRAIL activadas
Se transfectaron células KHYG-1 con la variante TRAIL, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 6. Se desarrolló el siguiente protocolo para su uso en el tratamiento de pacientes con cáncer de la sangre:
Tras el diagnóstico de un paciente con un cáncer tratado adecuadamente con la invención, se administra un agente inductor de DR5, por ejemplo, Bortezomib, antes de la administración de las células NK modificadas y, por lo tanto, se usa en dosis bajas para regular por incremento la expresión de DR5 en el cáncer, lo que hace que la terapia con células NK modificadas sea más eficaz.
Luego se descongela, cultiva y administra al paciente una alícuota de células NK modificadas.
Como la variante de TRAIL expresada por las células NK usadas en la terapia tiene una menor afinidad por los receptores señuelo que el TRAIL de tipo salvaje, hay una mayor unión de los receptores de muerte en la superficie de las células cancerosas y, por lo tanto, más apoptosis de las células cancerosas como resultado.
Otra opción, antes de la implementación del protocolo anterior, es realizar una biopsia del cáncer y cultivar células cancerosas ex vivo. Este paso puede usarse para identificar aquellos cánceres que expresan niveles particularmente altos de receptores señuelo y/o niveles bajos de receptores de muerte, para ayudar a determinar si un agente inductor de DR5 es apropiado para un paciente dado. Este paso también puede llevarse a cabo durante la terapia con el protocolo anterior, ya que un cáncer dado podría ser capaz de adaptarse para, por ejemplo, reducir su expresión de DR5 y, por lo tanto, puede volverse adecuado para tratar con un agente inductor de DR5 a mitad de la terapia.
Ejemplo 8 - Una dosis baja de bortezomib sensibiliza las células cancerosas a las células NK que expresan la variante de TRAIL
El bortezomib (Bt) es un inhibidor del proteasoma (fármaco similar a la quimioterapia) útil en el tratamiento del mieloma múltiple (MM). Se sabe que bortezomib regula por incremento la expresión de DR5 en varios tipos diferentes de células cancerosas, incluyendo las células MM.
Las células KHYG-1 se transfectaron con la variante de TRAIL, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 6, antes de usarse para dirigirse a las células MM con o sin exposición a bortezomib.
Expresión de DR5 inducida por bortezomib
El bortezomib se compró a Millennium Pharmaceuticals. El DR5-AF647 antihumano de ratón (número de catálogo: 565498) se compró a BD Pharmingen. Las muestras de células teñidas se analizaron en BD FACS Canto II.
(1) Las líneas celulares de MM RPMI8226 y MM1.S se cultivaron en medio RPMI1640 (Sigma, St Louis, MO, USA) suplementado con L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, bicarbonato de sodio 24 mM, 0,01% de antibióticos y 10% de suero bovino fetal (Sigma, St Louis, MO, USA), en una atmósfera de CO2 al 5% a 37° C.
(2) Se sembraron células MM en placas de 6 pocillos a 1 x 106/ml, 2 ml/pocillo.
(3) Luego las células MM se trataron con diferentes dosis de bortezomib durante 24 horas.
(4) Luego se analizó la expresión de DR5 en células de MM tratadas/no tratadas con bortezomib mediante citometría de flujo (Fig. 18).
Se descubrió que el tratamiento con bortezomib en dosis bajas aumenta la expresión de DR5 en ambas líneas celulares de MM (Fig. 18). La regulación por incremento de DR5 se asoció con una inducción menor de apoptosis (datos no mostrados). Sin embargo, se descubrió que la expresión de DR5 no podía regularse por incremento con dosis altas de bortezomib, debido a la alta toxicidad que provocaba la muerte de la mayoría de las células MM.
Sensibilización de células cancerosas inducida por bortezomib
Las células KHYG-1 se transfectaron con la variante de TRAIL (TRAIL D269H/E195R), como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 6.
(1) Se usaron células MM1.S tratadas/no tratadas con bortezomib como células objetivo. Las células MM1.S se trataron con 2,5 nM de bortzeomib o vehículo (control) durante 24 horas.
(2) 6 horas después de la electroporación del ARNm de la variante de TRAIL, las células KHYG-1 se cultivaron con células MM en una placa de 12 pocillos. Después del lavado, las concentraciones de células se ajustaron a 1 x 106/ml, antes de mezclar las células KHYG-1 y MM1.S en una proporción de 1:1 con el cultivo durante 12 horas.
(3) Se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo de la citotoxicidad de las células KHYG-1. Las células cocultivadas se recogieron, se lavaron y luego se tiñeron con anticuerpo CD2-APC (5 ul/prueba), Anexina V-FITC
(5 ul/prueba) y SYTOX-Green (5 ul/prueba) usando el tampón de unión Anexina V.
(4) Los datos se analizaron adicionalmente con el software FlowJo 7.6.2. La población CD2 negativa representa las células MM1.S. Las células KHYG-1 son fuertemente positivas para CD2. Finalmente, se analizaron las células positivas para Anexina V-FITC y SYTOX-Green en la población negativa para CD2.
El análisis de citometría de flujo de la apoptosis se realizó en células MM1.S pretratadas/no tratadas con bortezomib cocultivadas con células KHYG-1 electroporadas con/sin variante TRAIL (Fig. 19).
Se descubrió que el bortezomib inducía la sensibilidad de las células MM a las células KHYG-1 que expresaban la variante de TRAIL. Por lo tanto, los datos indicaron que un agente que inducía la expresión de DR5 era eficaz en el modelo para aumentar la citotoxicidad contra las células cancerosas y, por lo tanto, puede ser útil para mejorar la terapia contra el cáncer de la presente invención.
Ejemplo 9 - Confirmación de apoptosis inducida por la variante de TRAIL
A pesar de la evidencia concluyente de la citotoxicidad aumentada de las células NK resultante de la expresión de la variante de TRAIL en los Ejemplos anteriores, deseábamos confirmar si la citotoxicidad aumentada se debió a la inducción de la apoptosis de las células cancerosas (lo más probable) o a la activación inadvertida de las células NK para mostrar un fenotipo más citotóxico y, por lo tanto, matar las células cancerosas a través de la secreción de perforina.
Se ha demostrado que la concanamicina A (CMA) inhibe la actividad citotóxica mediada por perforina de las células NK, principalmente debido a la degradación acelerada de la perforina por un aumento en el pH de los gránulos líticos. Investigamos si la citotoxicidad de las células KHYG-1 que expresan la variante de TRAIL podría resaltarse cuando la citotoxicidad mediada por perforina se eliminó parcialmente con CMA.
Reducción de la expresión de perforina inducida por CMA
La perforina-AF647 antihumana de ratón (número de catálogo: 563576) se compró a BD pharmingen. La concanamicina A (número de catálogo: SC-202111) se compró a Santa Cruz Biotechnology. Las muestras de células teñidas se analizaron usando un BD FACS Canto II.
(1) Las células KHYG-1 se cultivaron en medio RPMI1640 que contenía FBS al 10% (suero bovino fetal), L-glutamina 2 mM, penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (100 mg/ml) e IL-2 (10 ng/ml).
(2) Las células KHYG-1 (6 horas después de la electroporación, cultivadas en medio RPMI1640 libre de penicilina/estreptomicina) se trataron adicionalmente con CMA 100 nM o un volumen igual de vehículo (DMSO) durante 2 horas.
(3) Las células se recogieron (1 x 106 células/prueba) mediante centrifugación (1500 rpm x 5 minutos) y se aspiró el sobrenadante.
(4) Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% en solución de PBS a temperatura ambiente durante 15 minutos.
(5) Las células se lavaron dos veces con 4 ml de tampón FACS (PBS, BSA al 0,5-1%, azida sódica al 0,1%).
(6) Las células se permeabilizaron con 1 ml de PBS/tampón de saponina al 0,1% durante 30 minutos a temperatura ambiente.
(7) Las células se lavaron con 4 ml de PBS/tampón de saponina al 0,1%.
(8) Las células se volvieron a suspender en 100 ul de PBS/tampón de saponina al
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0,1%, antes de añadir 5 u anticuerpo a cada tubo e incubar durante 30 minutos en hielo.
(9) Las células se lavaron con PBS/tampón de saponina al 0,1% 3 veces mediante centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos.
(10) Las células se volvieron a suspender en 500 ul de tampón FACS enfriado con hielo y se mantuvieron en la oscuridad sobre hielo o a 4° C en un frigorífico brevemente hasta el análisis.
(11) Las células se analizaron en el citómetro de flujo (BD FACS Canto II). Los datos se procesaron usando el software FlowJo 7.6.2.
El tratamiento con CMA disminuyó significativamente el nivel de expresión de perforina en las células
KHYG-1 (Figura 20) y no tuvo efectos negativos sobre la viabilidad de las células KHYG-1 (Fig. 21).
Citotoxicidad de variantes de TRAIL de células NK en presencia de CMA
Las células KHYG-1 se transfectaron con la variante de TRAIL (TRAIL D269H/E195R), como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 6.
(1) Se usaron células MM1.S como células objetivo.
(2) 6 horas después de la electroporación del ARNm de TRAIL, las células KHYG-1 se trataron con CMA 100 mM o un volumen igual de vehículo durante 2 horas.
(3) Las células KHYG-1 se lavaron con medio RPMI1640 mediante centrifugación y se volvieron a suspender en medio RPMI1640 que contenía IL-2, ajustando las concentraciones celulares a 1 x 106/ml.
(4) Las células MM1.S se volvieron a suspender en medio RPMI1640 que contenía IL-2 ajustando las concentraciones celulares a 1 x 106/ml.
(5) Las células KHYG-1 y MM1.S se mezclaron en una proporción de 1:1 y se cocultivaron durante 12 horas. (6) Se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo de la citotoxicidad de las células KHYG-1. Las células cocultivadas se lavaron y tiñeron con anticuerpo CD2-APC (5 ul/ensayo).
(7) Después del lavado, se realizó una tinción adicional con Anexina V-FITC (5 ul/prueba) y SYTOX-Green (5 uL/prueba) usando el tampón de unión de Anexina V.
(8) Los datos se analizaron adicionalmente con el software FlowJo 7.6.2. La población CD2 negativa representa las células MM1.S. Las células KHYG-1 son fuertemente positivas para CD2. A continuación, se analizaron las células positivas para Anexina V-FITC y SYTOX-Green en la población negativa para CD2.
Se demostró de nuevo que las células NK que expresan la variante de TRAIL muestran una citotoxicidad más alta que las células de control que carecen de expresión de la variante de TRAIL (Fig. 22). En este Ejemplo, sin embargo, se demostró además que CMA no pudo disminuir significativamente la actividad citotóxica de las células NK que expresan la variante de TRAIL, al contrario que el descubrimiento para las células NK de control tratadas con CMA.
Se demostró que las células NK sin la variante de TRAIL (células NK de control o simuladas) inducen un 48% de muerte de células cancerosas en ausencia de CMA y un 35,9% de muerte de células cancerosas en presencia de CMA (Fig. 22). Las células NK que expresan la variante de TRAIL pudieron inducir más muerte de células cancerosas que las células NK de control tanto en presencia como en ausencia de CMA. De hecho, incluso con la presencia de CMA, las células NK que expresan la variante de TRAIL indujeron más muerte de células cancerosas que las células NK de control en ausencia de CMA.
Por tanto, estos datos muestran la importancia de la variante de TRAIL en la citotoxicidad aumentada de las células NK contra las células cancerosas a través de un mecanismo menos susceptible a la regulación por disminución relacionada con la perforina. Como las células NK usan comúnmente la perforina para destruir las células objetivo, y muchas células cancerosas han desarrollado mecanismos para reducir la expresión de perforina de las células NK, para evadir el ataque citotóxico, las células NK de la invención representan una poderosa alternativa menos susceptible a la atenuación por las células cancerosas.
Ejemplo 10 - Expresión combinada de la variante muíante de TRAIL y desactivación del receptor inhibidor de punto de control CD96 en células KHYG-1
Se observaron aumentos en la citotoxicidad de las células NK al desactivar la expresión del receptor inhibidor del punto de control CD96 y también al expresar la variante de TRAIL. También probamos la combinación de las dos modificaciones genéticas para provocar un efecto sinérgico sobre la citotoxicidad de las células NK.
La expresión de CD96 se desactivó en las células KHYG-1, como se describe en el Ejemplo 2.
Las células KHYG-1 se transfectaron con la variante de TRAIL (TRAIL D269H/E195R), como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 6.
(1) 12 horas después de la electroporación, las células KHYG-1 se cocultivaron con células objetivo (K562 o MM1.S) a una concentración de 1 x 106/ml en placas de 12 pocillos (2 ml/pocillo) durante 12 horas. La proporción de E:T fue 1:1.
(2) 12 horas después del cocultivo, las células se recogieron, lavaron, tiñeron con CD2-APC, se lavaron de nuevo y se tiñeron más con Anexina V-FITC (5 ul/prueba) y SYTOX-Green (5 ul/prueba) usando tampón de unión de Anexina V.
(3) Las muestras de células se analizaron usando un citómetro de flujo BD FACS canto II. Los datos se analizaron adicionalmente usando el software FlowJo 7.6.2. La población negativa para CD2 representa las células MM1.S. Las células KHYG-1 son fuertemente positivas para CD2. A continuación, se analizaron las células positivas para Anexina V-FITC y SYTOX-Green en la población negativa para CD2.
Se descubrió que la desactivación simultánea de la expresión de CD96 y la expresión de la variante de TRAIL en las células KHYG-1 mejoraba sinérgicamente la citotoxicidad de las células tanto contra las células objetivo K562 (Fig. 23) y las células objetivo MM1.S (Fig. 24). Esto se indicó por el hecho de que en ambos grupos de células objetivo, se produjo más muerte celular por la modificación genética simultánea que la resultante de las modificaciones individuales aisladas.
Al mismo tiempo, se obtuvieron evidencias adicionales que muestran que la desactivación de CD96 aumenta la citotoxicidad de las células NK (Fig. 23 y 24), además de evidencias adicionales que muestran que la expresión del mutante/variante de TRAIL aumenta la citotoxicidad de las células NK (Fig. 23 y 24).
Por tanto, la invención proporciona células NK y líneas celulares, y la producción de las mismas, para su uso en la terapia del cáncer de sangre.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una célula asesina natural humana (NK) o una línea de células NK con citotoxicidad aumentada para su uso en el tratamiento de células cancerosas en un paciente, en donde la célula NK o la línea de células NK ha sido modificada mediante ingeniería genética para expresar una variante de TRAIL, en donde la variante de TRAIL tiene una afinidad aumentada, con respecto al TRAIL de tipo salvaje, por los receptores de TRAIL, y en donde la célula NK o la línea de células NK se ha modificado adicionalmente para expresar uno o más receptores de antígenos quiméricos (CAR), en donde los CAR se unen específicamente a uno o más ligandos en las células cancerosas.
2. Una célula NK humana o una línea de células NK para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer es un cáncer de la sangre.
3. Una célula NK humana o una línea de células NK para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el cáncer de la sangre es una leucemia.
4. Una célula NK humana o una línea de células NK para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el cáncer de la sangre es leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, incluyendo los linfomas de células T y los linfomas de células B, mieloma asintomático, mieloma múltiple latente (SMM), mieloma activo o mieloma de cadena ligera.
5. Una célula NK humana o una línea de células NK para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la variante de TRAIL tiene una afinidad aumentada, con respecto a TRAIL de tipo salvaje, por DR4 y/o DR5.
6. Una célula NK humana o una línea de células NK para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la variante de TRAIL tiene una afinidad reducida, con respecto a TRAIL de tipo salvaje, por los receptores de TRAIL señuelo.
7. Una célula NK humana o una línea de células NK para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en donde la variante de TRAIL está enlazada a uno o más dominios coestimuladores de células NK, por ejemplo, 41BB/CD137, CD3zeta/CD247, DAP12 o DAP10.
8. Una célula NK humana o una línea de células NK para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el CAR se une a CS1 (SLAMF7), CD38, CLL-1 o la combinación de CD38 y CS1.
9. Una célula NK humana o una línea de células NK para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula NK o la línea de células NK se ha modificado genéticamente para desactivar o anular la expresión de un receptor inhibidor de punto de control.
10. Una célula NK humana o una línea de células NK para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el receptor inhibidor del punto de control es CD96 (TÁCTIL), CD328 (SIGLEC7), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG-3), CD279 (PD-1), SIGLEC9, TIGIT y/o TIM-3.
11. Una célula NK humana o una línea de células NK para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula NK humana o la línea de células NK se modifican genéticamente para desactivar o anular la expresión de dos o más receptores inhibidores de puntos de control seleccionados de CD96 (TÁCTIL), CD328 (SIGLEC7), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG-3), CD279 (PD-1), SIGLEC9, TIGIT y TIM-3.
12. Una célula asesina natural humana (NK) o una línea de células NK con citotoxicidad aumentada, en donde la célula NK o la línea de células NK ha sido modificada mediante ingeniería genética para que exprese una variante de TRAIL, en donde la variante de TRAIL tiene una afinidad aumentada, con respecto a TRAIL de tipo salvaje, por receptores de TRAIL, y en donde la célula NK o la línea celular NK se ha modificado adicionalmente para que exprese uno o más receptores de antígenos quiméricos (CAR), en donde los CAR se unen específicamente a uno o más ligandos en células cancerosas.
13. Una composición que comprende una célula NK humana o una línea de células NK de acuerdo con la reivindicación 12.
14. Una célula NK humana o una línea de células NK de acuerdo con la reivindicación 12, o una composición de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la célula NK o la línea celular NK se define según cualquiera de las reivindicaciones 5-11.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US10906951B2 (en) 2015-07-29 2021-02-02 Onk Therapeutics Limited Modified natural killer cells and natural killer cell lines having increased cytotoxicity
AU2016300128B2 (en) 2015-07-29 2022-03-17 Onk Therapeutics Limited Modified natural killer cells and natural killer cell lines having increased cytotoxicity
EP3443001A4 (en) 2016-04-11 2020-04-29 Obsidian Therapeutics, Inc. REGULATED BIOCIRCUIT SYSTEMS
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
CN110248669B (zh) 2016-12-09 2023-09-08 昂克医疗有限公司 工程化天然杀伤细胞及其用途
AU2018206401B2 (en) * 2017-01-06 2022-07-21 Immunitybio, Inc. Genetically modified NK-92 cells with decreased CD96/TIGIT expression
WO2018148462A1 (en) 2017-02-09 2018-08-16 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and compositions and methods thereof
DE102017002645A1 (de) * 2017-03-17 2018-09-20 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Bestrahlung von Säugetierzellen mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen
AU2018303686A1 (en) 2017-07-21 2020-02-13 Cellectis Engineered immune cells resistant to tumor microoenvironment
WO2019016360A1 (en) * 2017-07-21 2019-01-24 Cellectis MODIFIED IMMUNE CELLS RESISTANT TO TUMOR MICRO-ENVIRONMENT
WO2019101998A1 (en) 2017-11-24 2019-05-31 Onkimmune Limited Modified natural killer cells and natural killer cell lines targetting tumour cells
WO2019222503A1 (en) * 2018-05-16 2019-11-21 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins
US20210230542A1 (en) * 2018-06-06 2021-07-29 Stemcell Technologies Canada Inc. Kits, compositions and methods for cell enrichment
CN108743595B (zh) * 2018-06-08 2020-11-27 厦门诺康得生物科技有限公司 一种nk细胞免疫检查点抑制剂及其制备方法
MX2021009742A (es) * 2019-02-15 2021-12-10 Editas Medicine Inc Celulas asesinas naturales (nk) modificadas para inmunoterapia.
CN109908155A (zh) * 2019-03-11 2019-06-21 上海中医药大学 丹参酮ⅱa的药物用途
KR102292657B1 (ko) 2019-03-15 2021-08-24 한국과학기술연구원 암 상살 능력이 향상된 면역세포
WO2020189942A1 (ko) * 2019-03-15 2020-09-24 한국과학기술연구원 암 상살 능력이 향상된 면역세포
MX2021011373A (es) 2019-03-21 2022-01-06 Onk Therapeutics Ltd Celulas efectoras inmunitarias modificadas con mayor resistencia a la muerte celular.
EP3712257A1 (en) 2019-03-21 2020-09-23 ONK Therapeutics Limited Modified natural killer cells with increased resistance to cell death
CN109970869A (zh) * 2019-04-12 2019-07-05 南京卡提医学科技有限公司 一种靶向人trail死亡受体的嵌合受体配体及其应用
RU2731293C1 (ru) 2019-04-12 2020-09-01 Игорь Петрович Белецкий Способ получения генно-модифицированных линий клеток натуральных киллеров с нокаутированным геном PD-1 и повышенной экспрессией белков семейства Фактора Некроза Опухолей для иммунотерапии онкологических заболеваний
EP3789485A1 (en) 2019-09-06 2021-03-10 ONK Therapeutics Limited Cellular therapies for cancer
CN115103910A (zh) 2019-10-03 2022-09-23 工匠开发实验室公司 具有工程化的双引导核酸的crispr***
CN111849896B (zh) * 2020-07-31 2022-07-01 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种car-nk细胞培养基及其应用
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2022133169A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
WO2022256448A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
WO2022263682A1 (en) 2021-06-18 2022-12-22 Onk Therapeutics Limited Double knockout natural killer cells
EP4370676A2 (en) 2021-06-18 2024-05-22 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
CN113684180B (zh) * 2021-08-31 2023-05-26 山东大学第二医院 一种提高骨髓瘤杀伤活性的nk细胞制备方法
WO2023167882A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Artisan Development Labs, Inc. Composition and methods for transgene insertion
CN114796483B (zh) * 2022-06-28 2022-11-08 北京大学 活化t细胞与阻断性抗体联合制备抗肿瘤药物的用途及抗肿瘤药物
EP4353741A1 (en) 2022-10-14 2024-04-17 ONK Therapeutics Limited Double knockout natural killer cells
WO2024100203A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Onk Therapeutics Limited Combined therapies using immunomodulating drugs
CN116590237B (zh) * 2023-05-29 2023-10-31 上海贝斯昂科生物科技有限公司 一种遗传修饰的自然杀伤细胞及其制备和用途

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1299522B1 (en) 2000-06-30 2011-11-02 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Alteration of cell membrane
CA2388441A1 (en) 2002-06-10 2003-12-10 Wei-Ping Min Immunomodulation using rna interference
EP1781777A1 (en) * 2004-07-02 2007-05-09 Avaris AB Method for the genetic activation of cells and uses of said cells
CA3052445C (en) * 2004-07-10 2023-08-22 Kerry S. Campbell Genetically modified human natural killer cell lines
EP1621550A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-01 Dompé S.P.A. Tumor-homing cells engineered to produce tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)
GB0724532D0 (en) * 2007-12-17 2008-01-30 Nat Univ Ireland Trail variants for treating cancer
CA2804914A1 (en) 2010-07-22 2012-01-26 Nadir Askenasy Regulatory immune cells with enhanced targeted cell death effect
ES2824024T3 (es) * 2012-10-10 2021-05-11 Sangamo Therapeutics Inc Compuestos modificadores de células T y usos de los mismos
KR20150126882A (ko) * 2013-02-27 2015-11-13 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 T 세포의 균형 유전자 발현, 물질의 조성물 및 이의 사용 방법
CN105393019B (zh) 2013-07-25 2017-10-17 株式会社普利司通 隔振装置
KR102357968B1 (ko) * 2013-10-15 2022-02-03 더 스크립스 리서치 인스티튜트 키메라 항원 수용체 t 세포 스위치 및 이의 용도
WO2015142675A2 (en) * 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
CA2940671A1 (en) 2014-04-07 2015-10-15 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
IL292512B2 (en) 2014-04-18 2024-07-01 Editas Medicine Inc CRISPR-CAS-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
CN114621969A (zh) * 2014-09-17 2022-06-14 诺华股份有限公司 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞
MX2017012407A (es) 2015-03-27 2018-03-07 Harvard College Celulas t modificadas y métodos para hacer y usar las mismas.
EP4043556B1 (en) * 2015-06-30 2024-02-07 Cellectis Methods for improving functionality in nk cell by gene inactivation using specific endonuclease
EP3325504A1 (en) * 2015-07-21 2018-05-30 Novartis AG Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
AU2016300128B2 (en) 2015-07-29 2022-03-17 Onk Therapeutics Limited Modified natural killer cells and natural killer cell lines having increased cytotoxicity

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