ES2938850T3 - Elementos reguladores de las plantas y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente descripción proporciona composiciones y métodos para regular la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta. Las composiciones incluyen una nueva secuencia de nucleótidos para elementos reguladores del virus Eupatorium Vein Clearing. Se proporciona un método para expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta utilizando las secuencias de elementos reguladores descritas en el presente documento. El método comprende transformar una planta o célula vegetal con una secuencia de nucleótidos unida operativamente a uno de los elementos reguladores de la presente descripción. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Elementos reguladores de las plantas y métodos de uso de los mismos

CAMPO

La presente descripción se refiere al campo de la biología molecular de plantas, más particularmente a la regulación de la expresión génica en plantas.

ANTECEDENTES

La expresión de secuencias de ADN heterólogas en un hospedante vegetal depende de la presencia de un elemento regulador ligado operativamente que sea funcional dentro del hospedante vegetal. La elección de la secuencia del elemento regulador determinará cuándo y dónde dentro del organismo se expresa la secuencia de ADN heteróloga. Cuando se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, se pueden usar elementos reguladores preferidos de tejido. Cuando se desea la expresión génica en respuesta a un estímulo, los elementos reguladores inducibles son el elemento regulador de elección. Por el contrario, cuando se desea una expresión continua en todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. En los constructos de expresión de los vectores de transformación se pueden incluir secuencias reguladoras adicionales, en dirección 5’ y/o en dirección 3’ de la secuencia del elemento regulador central, para producir niveles variables de expresión de secuencias nucleotídicas heterólogas en una planta transgénica.

Frecuentemente es deseable expresar una secuencia de ADN constitutivamente en una planta. Por ejemplo, el aumento de la resistencia de una planta a la infección por patógenos transportados por el suelo y el aire podría lograrse mediante la manipulación genética del genoma de la planta para comprender un elemento regulador constitutivo ligado operativamente a un gen de resistencia a patógenos heterólogo, de modo que se produzcan proteínas de resistencia a patógenos en el tejido vegetal deseado.

Alternativamente, podría ser deseable inhibir la expresión de una secuencia de ADN nativa dentro de los tejidos de una planta para lograr un fenotipo deseado. En este caso, dicha inhibición podría lograrse con la transformación de la planta para que comprenda un promotor constitutivo ligado operativamente a una secuencia nucleotídica antisentido, de modo que la expresión de la secuencia antisentido produzca un transcrito de ARN que interfiere con la traducción del ARNm de la secuencia de ADN nativa.

Alterar genéticamente plantas mediante el uso de técnicas de ingeniería genética, y producir así una planta con rasgos útiles, requiere la disponibilidad de una variedad de promotores. Una acumulación de promotores permitiría al investigador diseñar moléculas de ADN recombinante que sean capaces de expresarse en los niveles y lugares celulares deseados. Por lo tanto, una colección de promotores constitutivos permitiría expresar un nuevo rasgo al nivel deseado en el tejido deseado. Por lo tanto, el aislamiento y la caracterización de elementos reguladores constitutivos que pueden servir como regiones reguladoras para la expresión de secuencias nucleotídicas heterólogas de interés de una manera constitutiva medida son necesarios para la manipulación genética de plantas.

SUMARIO

Se proporcionan composiciones y métodos para regular la expresión de una secuencia nucleotídica heteróloga de interés en una planta o célula vegetal. Se proporcionan moléculas de ADN que comprenden nuevas secuencias nucleotídicas para elementos reguladores que inician la transcripción. Los elementos reguladores tienen actividad promotora que inicia la transcripción en la célula vegetal.

La invención proporciona un constructo de ADN; que comprende:

(a) un elemento regulador seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un polinucleótido con al menos un 90 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 y 5, en el que dicho polinucleótido dirige la expresión de un polinucleótido transcribible ligado operativamente en una planta,

(ii) un polinucleótido con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 y 5, en el que dicho polinucleótido dirige la expresión de un polinucleótido transcribible ligado operativamente en una planta,

(iii) el polinucleótido de una cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 y 5; y

(b) una molécula polinucleotídica transcribible heteróloga ligada operativamente al elemento regulador.

Además, la invención proporciona una planta transgénica o una célula vegetal transformada de forma estable con el constructo de ADN como se ha descrito anteriormente.

Todavía más, la invención proporciona una parte de la planta transgénica como se describe anteriormente, en la que la parte de la planta comprende el constructo de ADN.

La invención proporciona además una semilla de la planta transgénica como se describe anteriormente, en la que la semilla comprende el constructo de ADN.

Los aspectos de la descripción comprenden la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SeQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SeQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, o un complemento de la misma, una secuencia nucleotídica que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SeQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, en el que dicha secuencia inicia la transcripción en una célula vegetal, y una secuencia nucleotídica que comprende una secuencia que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, en el que dicha secuencia inicia la transcripción en la célula vegetal.

Se describe un método para expresar una secuencia nucleotídica heteróloga en una planta o célula vegetal. El método comprende introducir en una planta o célula vegetal un casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica heteróloga de interés ligada operativamente a uno de los elementos reguladores de la presente descripción. De esta manera, las secuencias de elementos reguladores son útiles para controlar la expresión de la secuencia nucleotídica heteróloga ligada operativamente.

También se describe un método para expresar una secuencia nucleotídica de interés de manera constitutiva en una planta. El método comprende introducir en una célula vegetal un casete de expresión que comprende un elemento regulador de la descripción ligado operativamente a una secuencia nucleotídica heteróloga de interés.

La expresión de la secuencia nucleotídica de interés puede proporcionar la modificación del fenotipo de la planta. Tal modificación incluye modular la producción de un producto endógeno, en cuanto a cantidad o distribución relativa, o la producción de un producto de expresión exógeno para proporcionar una nueva función o producto en la planta. En métodos y composiciones específicos, la secuencia nucleotídica heteróloga de interés comprende un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, resistencia a patógenos, resistencia a insectos, y/o tolerancia alterada a la sal, al frío o a la sequía.

Se proporcionan casetes de expresión que comprenden las secuencias promotoras de la descripción ligadas operativamente a una secuencia nucleotídica heteróloga de interés. Adicionalmente se proporcionan células vegetales transformadas, tejidos vegetales, semillas y plantas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra la estructura de la región reguladora del virus del aclaramiento de las nervaduras de Eupatorium (EVCV) y los truncamientos de la región reguladora. La región reguladora (FL) de EVCV de 1104 pares de bases consiste en una parte de la región intergénica larga (LIR) en dirección 5’ de un ORF corto y una estructura de bucle de tallo. La secuencia se extiende 5’ hacia el extremo 3’ del último ORF del genoma de EVCV. La región reguladora se truncó (TR) desde el extremo 5’ hasta segmentos que consistieron en 821 pb, 514 pb, 431 pb, 283 pb, y 116 pb. La posición de la caja TATA putativa está representada por la flecha.

La Figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico del elemento regulador de EVCV de longitud completa de 1104 pares de bases (SEQ ID NO: 1). La caja TATA putativa está subrayada. También se indican mediante flechas insertadas los extremos 5’ de los elementos reguladores de EVCV truncados según se representan por la secuencia de ácido nucleico del elemento regulador truncado de 821 pares de bases EVCV TR1 (SEQ ID NO: 2), la secuencia de ácido nucleico del elemento regulador truncado de 514 pares de bases EVCV TR2 (SEQ ID NO: 3), la secuencia de ácido nucleico del elemento regulador truncado de 431 pares de bases EVCV TR3 (SEQ ID NO: 4, la secuencia de ácido nucleico del elemento regulador truncado de 283 pares de bases EVCV TR4 (SEQ ID NO: 5), y la secuencia de ácido nucleico del elemento regulador truncado de 116 pares de bases EVCV TR5 (SEQ ID NO: 6).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La descripción se refiere a composiciones y métodos relacionados con promotores de plantas, y métodos para su uso. Las composiciones comprenden secuencias nucleotídicas para la región reguladora del virus del aclaramiento de las nervaduras de Eupatorium (EVCV). Las composiciones comprenden además constructos de ADN que comprenden una secuencia nucleotídica para la región reguladora de EVCV ligada operativamente a una secuencia nucleotídica heteróloga de interés. En particular, la presente descripción proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden la secuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID NO: 1, y fragmentos, variantes y complementos de la misma.

Las secuencias de elementos reguladores de EVCV de la presente descripción incluyen constructos nucleotídicos que permiten el inicio de la transcripción en una planta. En realizaciones específicas, la secuencia del elemento regulador de EVCV permite el inicio de la transcripción de manera constitutiva. Tales constructos de la descripción comprenden regiones de iniciación de la transcripción reguladas asociadas con la regulación del desarrollo de la planta. Por lo tanto, las composiciones de la presente descripción incluyen constructos de ADN que comprenden una secuencia nucleotídica de interés ligada operativamente a la secuencia del elemento regulador de EVCV. Una fuente para la secuencia de la región reguladora de EVCV se expone en SEQ ID NO: 1.

Las composiciones de la descripción incluyen las secuencias nucleotídicas para elementos reguladores de EVCV, y fragmentos y variantes de las mismas. En realizaciones específicas, las secuencias de elementos reguladores de la descripción son útiles para expresar secuencias de interés de manera constitutiva. Las secuencias nucleotídicas de la descripción también encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la expresión subsiguiente de una secuencia nucleotídica heteróloga en una planta de interés, o como sondas para el aislamiento de otros elementos reguladores similares a EVCV.

Elementos reguladores

Un elemento regulador es una molécula de ácido nucleico que tiene actividad reguladora de genes, es decir, que tiene la capacidad de afectar la transcripción y/o traducción de una molécula polinucleotídica transcribible ligada operativamente. La expresión “actividad reguladora de genes” se refiere así a la capacidad de afectar la expresión de una molécula polinucleotídica transcribible ligada operativamente al afectar la transcripción y/o traducción de esa molécula polinucleotídica transcribible ligada operativamente. La actividad reguladora de genes puede ser positiva y/o negativa, y el efecto puede caracterizarse por sus cualidades de respuesta temporal, espacial, de desarrollo, tisular, ambiental, fisiológica, patológica, del ciclo celular, y/o químicamente, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas.

Los elementos reguladores, tales como promotores, líderes, intrones y regiones de terminación de la transcripción, son moléculas de ácido nucleico que tienen actividad reguladora de genes y juegan un papel integral en la expresión general de genes en células vivas. La expresión “elemento regulador” se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene actividad reguladora de genes, es decir, aquella que tiene la capacidad de afectar la transcripción y/o traducción de una molécula polinucleotídica transcribible ligada operativamente. Los elementos reguladores aislados, tales como los promotores y los líderes que funcionan en las plantas, son por lo tanto útiles para modificar los fenotipos de las plantas a través de los métodos de ingeniería genética.

Los elementos reguladores pueden caracterizarse por su patrón de expresión, es decir, como constitutivos, y/o por su patrón de expresión temporal, espacial, de desarrollo, tisular, ambiental, fisiológico, patológico, del ciclo celular y/o químicamente sensible, y cualquier combinación de los mismos, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas. Un promotor es útil como elemento regulador para modular la expresión de una molécula polinucleotídica transcribible ligada operativamente.

Como se usa aquí, un “patrón de expresión de genes” es cualquier patrón de transcripción de una molécula de ácido nucleico ligada operativamente en una molécula de ARN transcrita. La expresión puede caracterizarse por sus cualidades de respuesta temporal, espacial, de desarrollo, tisular, ambiental, fisiológica, patológica, del ciclo celular, y/o químicamente, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas. La molécula de ARN transcrita puede traducirse para producir una molécula de proteína, o puede proporcionar una molécula de ARN antisentido u otra molécula de ARN reguladora, tal como un ARNbc, un ARNt, un ARNr, y un ARNmi.

Como se usa aquí, el término “expresión de proteínas” es cualquier patrón de traducción de una molécula de ARN transcrita en una molécula de proteína. La expresión de proteínas puede caracterizarse por sus cualidades temporales, espaciales, de desarrollo, o morfológicas, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas.

Como se usa aquí, el término “promotor” se refiere generalmente a una molécula de ácido nucleico que está implicada en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa II y otras proteínas (factores de transcripción que actúan en trans) para iniciar la transcripción. Un promotor puede aislarse inicialmente de la región no traducida 5’ (UTR 5’) de una copia genómica de un gen. Alternativamente, los promotores pueden ser moléculas de ADN manipuladas o producidas sintéticamente. Los promotores también pueden ser quiméricos, es decir, un promotor producido mediante la fusión de dos o más moléculas de ADN heterólogas.

En un aspecto, se proporcionan fragmentos de una secuencia promotora descrita aquí. Los fragmentos de promotor pueden exhibir actividad promotora, y pueden ser útiles solos o en combinación con otros promotores y fragmentos de promotor, tal como en la construcción de promotores quiméricos. Se proporcionan fragmentos de un promotor que comprenden al menos alrededor de 50, 95, 150, 250, 500 o alrededor de 750 nucleótidos contiguos de una molécula polinucleotídica que tiene la actividad promotora descrita aquí. Dichos fragmentos pueden presentar al menos alrededor de 85 por ciento, alrededor de 90 por ciento, alrededor de 95 por ciento, alrededor de 98 por ciento, o alrededor de 99 por ciento, o más, de identidad con una secuencia de referencia cuando se alinean de forma óptima con la secuencia de referencia.

Un promotor o fragmento de promotor también se puede analizar para detectar la presencia de elementos promotores conocidos, es decir, características de la secuencia de ADN, tal como una caja TATA y otros motivos del sitio de unión del factor de transcripción conocidos. Un experto en la técnica puede usar la identificación de dichos elementos promotores conocidos para diseñar variantes del promotor que tengan un patrón de expresión similar al del promotor original.

Como se usa aquí, el término “potenciador” o “elemento potenciador” se refiere a un elemento regulador de la transcripción que actúa en cis, también conocido como elemento cis, que confiere un aspecto del patrón de expresión general, pero normalmente es insuficiente por sí solo para dirigir la transcripción, de un secuencia polinucleotídica ligada operativamente. A diferencia de los promotores, los elementos potenciadores no suelen incluir habitualmente un sitio de inicio de la transcripción (TSS) o una caja TATA. Un promotor puede comprender de forma natural uno o más elementos potenciadores que afectan a la transcripción de una secuencia polinucleotídica ligada operativamente. Un elemento potenciador aislado también puede fusionarse con un promotor para producir un elemento cis del promotor quimérico, que confiere un aspecto de la modulación global de la expresión génica. Un promotor o fragmento de promotor puede comprender uno o más elementos potenciadores que efectúan la transcripción de genes ligados operativamente. Se cree que muchos elementos potenciadores del promotor se unen a las proteínas de unión al ADN y/o afectan la topología del ADN, produciendo conformaciones locales que permiten o restringen selectivamente el acceso de la ARN polimerasa al molde de ADN, o que facilitan la apertura selectiva de la doble hélice en el sitio de iniciación de la transcripción. Un elemento potenciador puede funcionar para unir factores de transcripción que regulan la transcripción. Algunos elementos potenciadores se unen a más de un factor de transcripción, y los factores de transcripción pueden interactuar con diferentes afinidades con más de un dominio potenciador. Los elementos potenciadores pueden identificarse mediante varias técnicas, incluyendo el análisis de eliminación, es decir, eliminar uno o más nucleótidos del extremo 5’ o interno a un promotor; análisis de proteínas de unión al ADN usando huella de ADNasa I, interferencia de metilación, ensayos de cambio de movilidad por electroforesis, huella genómica in vivo mediante PCR mediada por ligación, y otros ensayos convencionales; o por análisis de similitud de secuencias de ADN usando motivos de elemento cis conocidos o elementos potenciadores como una secuencia diana o motivo diana con métodos convencionales de comparación de secuencias de ADN, tal como BLAST. La estructura fina de un dominio potenciador puede estudiarse adicionalmente mediante mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos o mediante otros métodos convencionales. Los elementos potenciadores se pueden obtener por síntesis química o por aislamiento de elementos reguladores que incluyen dichos elementos, y se pueden sintetizar con nucleótidos flanqueantes adicionales que contienen sitios de enzimas de restricción útiles para facilitar la manipulación de la subsecuencia. Por lo tanto, el diseño, la construcción y el uso de elementos potenciadores según los métodos descritos aquí para modular la expresión de moléculas polinucleotídicas transcribibles ligadas operativamente están abarcados por la presente descripción.

Como se usa aquí, la expresión “región flanqueante no traducida 5’” se refiere a una molécula de ADN aislada de la región 5’ no traducida (UTR 5’) de una copia genómica de un gen y definida generalmente como un segmento nucleotídico entre el sitio de inicio de la transcripción (TSS) y el sitio de inicio de la secuencia que codifica la proteína. Estas secuencias, o líderes, pueden ser elementos de ADN manipulados o producidos sintéticamente. Se puede usar un líder como un elemento regulador 5’ para modular la expresión de una molécula polinucleotídica transcribible ligada operativamente. Las moléculas líder pueden usarse con un promotor heterólogo o con su promotor nativo. Por lo tanto, las moléculas promotoras de la presente descripción pueden unirse operativamente a su líder nativo, o pueden unirse operativamente a un líder heterólogo.

Como se usa aquí, el término “quimérico” se refiere a una única molécula de ADN producida fusionando una primera molécula de ADN con una segunda molécula de ADN, en la que ni la primera ni la segunda molécula de ADN normalmente se encontrarían en esa configuración, es decir, fusionada con la otra. La molécula de ADN quimérica es, por lo tanto, una nueva molécula de ADN que normalmente no se encuentra en la naturaleza. Como se usa aquí, la expresión “promotor quimérico” se refiere a un promotor producido a través de tal manipulación de moléculas de ADN. Un promotor quimérico puede combinar dos o más fragmentos de ADN; un ejemplo sería la fusión de un promotor con un elemento potenciador. Por lo tanto, el diseño, la construcción y el uso de promotores quiméricos según los métodos descritos aquí para modular la expresión de moléculas polinucleotídicas transcribibles ligadas operativamente están abarcados por la presente descripción.

Debe entenderse que las secuencias nucleotídicas, ubicadas dentro de los intrones, o 3’ de la secuencia de la región codificante, también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Los ejemplos de intrones adecuados incluyen, pero no se limitan a, el intrón IVS6 de maíz, o el intrón de actina de maíz. Un elemento regulador también puede incluir aquellos elementos ubicados en dirección 3’ (3’) del sitio de inicio de la transcripción, o dentro de las regiones transcritas, o ambos. En el contexto de la presente descripción, un elemento regulador postranscripcional puede incluir elementos que son activos después del inicio de la transcripción, por ejemplo potenciadores de la traducción y la transcripción, represores de la traducción y la transcripción, y determinantes de la estabilidad del ARNm.

Los elementos reguladores, o variantes o fragmentos de los mismos, de la presente descripción pueden asociarse operativamente con elementos reguladores heterólogos o promotores para modular la actividad del elemento regulador heterólogo. Dicha modulación incluye potenciar o reprimir la actividad transcripcional del elemento regulador heterólogo, modular los sucesos postranscripcionales, o potenciar o reprimir la actividad transcripcional del elemento regulador heterólogo y modular los sucesos postranscripcionales. Por ejemplo, uno o más elementos reguladores, o fragmentos de los mismos, de la presente descripción pueden asociarse operativamente con promotores constitutivos, inducibles o específicos de tejido, o con fragmentos de los mismos, para modular la actividad de tales promotores dentro de los tejidos deseados en células vegetales.

La descripción abarca composiciones de ácidos nucleicos aislados o recombinantes. Una molécula de ácido nucleico (o ADN) “aislada” o “recombinante” se usa aquí para referirse a una secuencia de ácido nucleico (o ADN) que ya no se encuentra en su entorno natural, por ejemplo en una bacteria recombinante heteróloga o in vitro o célula hospedante vegetal. Una molécula de ácido nucleico recombinante o aislada, o una porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Un ácido nucleico aislado o recombinante está libre de secuencias (en el mejor de los casos, secuencias que codifican proteínas) que flanquean de forma natural al ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de alrededor de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de secuencias nucleotídicas que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico. Las secuencias del elemento regulador de EVCV de la descripción pueden aislarse de la región 5’ no traducida que flanquea sus respectivos sitios de iniciación de la transcripción.

La presente descripción también abarca fragmentos y variantes de las secuencias nucleotídicas del promotor descritas. En particular, los fragmentos y variantes de la secuencia del elemento regulador de EVCV de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, pueden usarse en las constructos de ADN de la descripción. Como se usa aquí, el término “fragmento” se refiere a una parte de la secuencia de ácido nucleico. Los fragmentos de una secuencia de elementos reguladores de EVCV pueden retener la actividad biológica de iniciación de la transcripción, más particularmente de comando de la transcripción de manera constitutiva. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia nucleotídica que son útiles como sondas de hibridación pueden no retener necesariamente la actividad biológica. Los fragmentos de una secuencia nucleotídica para la región reguladora de EVCV pueden oscilar desde al menos alrededor de 20 nucleótidos, alrededor de 50 nucleótidos, alrededor de 100 nucleótidos, y hasta la secuencia nucleotídica de longitud completa de la descripción para la región promotora del gen.

Una porción biológicamente activa de un elemento regulador de EVCV se puede preparar aislando una porción de la secuencia del elemento regulador de EVCV de la descripción, y evaluando la actividad promotora de la porción. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia nucleotídica del elemento regulador de EVCV comprenden al menos alrededor de 16, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800 , 900 o 1000 nucleótidos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia del elemento regulador de EVCV de longitud completa descrita aquí (por ejemplo, 821 nucleótidos para SEQ ID NO: 2).

Para secuencias nucleotídicas, una variante comprende una deleción y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro del polinucleótido nativo, y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Como se usa aquí, una secuencia nucleotídica “nativa” o “genómica” comprende una secuencia nucleotídica de origen natural. Para las secuencias nucleotídicas, las variantes de origen natural pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se describe a continuación. Las secuencias nucleotídicas variantes también incluyen secuencias nucleotídicas derivadas sintéticamente, tales como las generadas, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio. En general, las variantes de una secuencia nucleotídica particular de la descripción tendrán al menos alrededor de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con esa secuencia nucleotídica en particular según lo determinado por los programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descritos en otra parte aquí. Una variante biológicamente activa de una secuencia nucleotídica de la descripción puede diferir de esa secuencia en tan pocos como 1-15 restos de ácido nucleico, tan pocos como 1-10, tan pocos como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o incluso 1 resto de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica la región reguladora es una “secuencia de ácido nucleico no genómica”. Como se usa aquí, una “secuencia de ácido nucleico no genómica” se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene uno o más cambios en la secuencia de ácido nucleico en comparación con la secuencia de ácido nucleico genómica o nativa.

Las secuencias nucleotídicas variantes también abarcan secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como la transposición aleatoria de ADN. Con dicho procedimiento, las secuencias nucleotídicas del elemento regulador de EVCV pueden manipularse para crear nuevos elementos reguladores de EVCV. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse de forma homóloga in vitro o in vivo. Las estrategias para dicha transposición aleatoria de ADN se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y patentes U.S. n.° 5.605.793 y 5.837.458.

Las secuencias nucleotídicas de la descripción se pueden usar para aislar las secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras plantas, más particularmente otras monocotiledóneas. De esta manera, pueden usarse métodos, tales como PCR e hibridación, para identificar tales secuencias basándose en su homología de secuencia con las secuencias expuestas aquí. Las secuencias aisladas en base a su identidad de secuencia con la secuencia completa del elemento regulador de EVCV expuesta aquí, o con fragmentos de la misma, están abarcadas por la presente descripción.

En un enfoque de PCR, los cebadores oligonucleotídicos pueden diseñarse para su uso en reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes del ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y para la clonación por PCR son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York)), en adelante Sambrook. Véase también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no se limitan a, métodos que usan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos únicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, y cebadores parcialmente desapareados.

En las técnicas de hibridación, la totalidad o parte de una secuencia nucleotídica conocida se usa como sonda que se hibrida selectivamente con otras secuencias nucleotídicas correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado de un organismo escogido. Las sondas de hibridación se pueden marcar con un grupo detectable, tal como P-32, o con cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo, pueden obtenerse sondas para hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos basándose en la secuencia del elemento regulador de EVCV de la descripción. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación y para la construcción de bibliotecas genómicas son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook.

Por ejemplo, la secuencia completa del elemento regulador de EVCV descrita aquí, o una o más partes de la misma, puede usarse como una sonda capaz de hibridarse específicamente con las secuencias de elementos reguladores de EVCV y los ARN mensajeros correspondientes. Para lograr una hibridación específica en una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de elementos reguladores de EVCV y tienen al menos alrededor de 10 nucleótidos de longitud o al menos alrededor de 20 nucleótidos de longitud. Dichas sondas pueden usarse para amplificar mediante PCR secuencias de elementos reguladores de EVCV correspondientes de una planta escogida. Esta técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado, o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen la selección de hibridación de bibliotecas de ADN en placas (ya sean placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook.

La hibridación de dichas secuencias se puede llevar a cabo en condiciones rigurosas. Las expresiones “condiciones rigurosas” o “condiciones de hibridación rigurosas” pretenden significar condiciones en las que una sonda se hibridará con su secuencia diana en un grado detectable mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces con respecto al fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia, y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o de lavado, se pueden identificar secuencias diana que son 100% complementarias a la sonda (sondaje homólogo). Alternativamente, las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para permitir algunos errores de emparejamiento en las secuencias para que se detecten grados más bajos de similitud (sondaje heterólogo). Generalmente, una sonda tiene menos de alrededor de 1000 nucleótidos de longitud, óptimamente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Por lo general, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es menor que alrededor de 1,5 M de iones de Na, generalmente alrededor de 0,01 a 1,0 M de concentración de iones de Na (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3, y la temperatura es al menos alrededor de 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos alrededor de 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayores que 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores tal como formamida. Las condiciones ejemplares de baja rigurosidad incluyen la hibridación con una disolución amortiguador de al 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 1% a 37°C, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a una temperatura de 50 a 55°C. Las condiciones de rigurosidad moderada ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 40% a 45%, NaCl 1,0 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0,5X a 1X SSC a 55 a 60°C. Las condiciones ejemplares de alta rigurosidad incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado final en 0,1X SSC a 60 a 65°C durante al menos 30 minutos. La duración de la hibridación es generalmente menor que alrededor de 24 horas, normalmente alrededor de 4 a alrededor de 12 horas. La duración del tiempo de lavado será al menos un tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio.

La especificidad es típicamente la función de los lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la disolución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm (punto de fusión térmica) se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C 16,6 (log M) 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/l; en la que M es la molaridad de los cationes monovalentes,%GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la disolución de hibridación, y l es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50% de una secuencia diana complementaria se hibrida con una sonda perfectamente compatible. Tm se reduce en alrededor de 1°C por cada 1% de error de emparejamiento; por tanto, la Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm puede disminuirse 10°C. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean alrededor de 5°C menor que la Tm para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1,2, 3, o 4°C por debajo de la Tm; condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10°C por debajo de la Tm; las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20°C por debajo de la Tm. Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos en la técnica comprenderán que las variaciones en la rigurosidad de las disoluciones de hibridación y/o lavado están inherentemente descritas. Si el grado deseado de error de emparejamiento da como resultado una Tm de menos de 45°C (disolución acuosa) o 32°C (disolución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC para poder usar una temperatura más alta. En Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, Nueva York) se encuentra una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos. Véase también Sambrook.

Por lo tanto, las secuencias aisladas que tienen actividad promotora constitutiva y que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias del elemento regulador de EVCV descritas aquí, o con fragmentos de las mismas, están abarcadas por la presente descripción.

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) “secuencia de referencia”, (b) “ventana de comparación”, (c) “identidad de secuencia”, (d) “porcentaje de secuencia identidad”, y (e) “identidad sustancial”.

(a) Como se usa aquí, “secuencia de referencia” es una secuencia definida que se usa como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, como un segmento de una secuencia génica o de ADNc de longitud completa, o la secuencia génica o de ADNc completa.

(b) Como se usa aquí, “ventana de comparación” hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia polinucleotídica, en el que la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos contiguos, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50, 100, o más. Los expertos en la técnica entienden que para evitar una gran similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia polinucleotídica, normalmente se introduce una penalización por huecos y se resta del número de coincidencias.

Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Por lo tanto, la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias cualesquiera se puede lograr usando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitativos de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineación local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda de alineación local de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Las implementaciones informáticas de estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y g A p , BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de software GCG Wisconsin Genetics, versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA). Las alineaciones que usan estos programas se pueden realizar usando los parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; and Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988), más arriba. Se puede usar una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12, y una penalización de espacio de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), más arriba. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias nucleotídicas homólogas a una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de la descripción. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una proteína o polipéptido de la descripción. Para obtener con fines comparativos alineaciones con espacios, se puede usar Gapped BLAST (en BLAST 2.0), como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, para realizar una búsqueda iterativa que detecta relaciones distantes entre moléculas, se puede usar PSI-BLAST (en BLAST 2.0). Véase Altschul et al. (1997), más arriba. Al utilizar BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN para secuencias nucleotídicas, BLASTX para proteínas). Véase el sitio web del National Center for Biotechnology Information. La alineación también se puede realizar manualmente mediante inspección.

A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados aquí se refieren al valor obtenido usando GAP Versión 10 usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia nucleotídica usando un peso GPA de espacio de 50 y un peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando un peso GPAde espacio de 8 y un peso de longitud de 2, y la matriz de puntuación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente del mismo. Un “programa equivalente” se refiere a cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene coincidencias idénticas de nucleótidos o de restos de aminoácidos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia cuando se compara con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10.

GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de emparejamientos y minimiza el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones y posiciones de espacios posibles, y crea la alineación con la mayor cantidad de bases emparejadas y la menor cantidad de espacios. Permite la provisión de una penalización por creación de espacios y una penalización por extensión de espacios en unidades de bases emparejadas. GAP debe obtener una ganancia de número de penalización por creación de espacios de emparejamientos por cada espacio que inserta. Si se escoge una penalización de extensión de espacio mayor que cero, GAP debe, además, obtener una ganancia por cada espacio insertado de la longitud de la espacio multiplicada por la penalización de extensión de espacio. Los valores predeterminados de penalización por creación de espacios y los valores de penalización por extensión de espacios en la versión 10 del paquete de software de GCG Wisconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias nucleotídicas, la penalización por creación de espacios por defecto es 50, mientras que la penalización por extensión de espacios por defecto es 3. Las penalizaciones por creación de espacios y extensión de espacios pueden expresarse como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consiste en 0 a 200. Así, por ejemplo, las penalizaciones por creación y extensión de espacios pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayor.

GAP presenta a un miembro de la familia de las mejores alineaciones. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP muestra cuatro cifras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad, y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada para alinear las secuencias. La Relación es la calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. El Porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que realmente coinciden. El Porcentaje de Similitud es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que se encuentran a lo largo de los espacios se ignoran. Se puntúa una similitud cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor o igual a 0,50, el umbral de similitud. La matriz de puntuación usada en la versión 10 del paquete de software de GCG Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

(c) Como se usa aquí, “identidad de secuencia” o “identidad”, en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipeptídicas, hace referencia a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia en una ventana de comparación especificada. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de los restos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos, en las que los restos de aminoácidos se sustituyen por otros restos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia), y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por tales sustituciones conservativas tienen “similitud de secuencia” o “similitud”. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por lo general, esto implica puntuar una sustitución conservativa como un error de emparejamiento parcial en lugar de total, aumentando así el porcentaje de identidad de la secuencia. Así, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una puntuación de 1 y una sustitución no conservativa recibe una puntuación de cero, una sustitución conservativa recibe una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, tal como se implementó en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).

(d) Como se usa aquí, “porcentaje de identidad de secuencia” significa el valor determinado comparando dos secuencias alineadas de forma óptima en una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) según se compara con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico o el resto de aminoácido idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

(e) La expresión “identidad sustancial” de las secuencias polinucleotídicas significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 70% de identidad de secuencia, al menos 80%, al menos 90%, y al menos 95%, en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descritos usando parámetros estándar.

Otra indicación de que las secuencias nucleotídicas son sustancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean alrededor de 5°C menores que que la Tm para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones rigurosas abarcan temperaturas en el intervalo de alrededor de 1°C a alrededor de 20°C menores que la Tm, dependiendo del grado de rigurosidad deseado, como se califica aquí de otro modo.

Como se usa aquí, el término planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos de células vegetales a partir de los cuales se pueden regenerar plantas, callos de plantas, agrupaciones de plantas, y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíces, y anteras. Se entiende por grano la semilla madura producida por cultivadores comerciales con fines distintos al cultivo o la reproducción de la especie. La progenie, las variantes, y los mutantes de las plantas regeneradas también se incluyen dentro del alcance de la descripción, siempre que estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos.

La presente descripción puede usarse para la transformación de cualquier especie vegetal, incluyendo, pero no limitadas a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de especies vegetales incluyen maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorra (Setaria italica), mijo africano (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuete (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), boniato (Ipomoea batatus), yuca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), aceituna (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, hortalizas, plantas ornamentales, y coníferas.

Las verduras incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), habas (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumism tales como el pepino (C. sativus), melón (C. cantalupensis), y melón almizclero (C. melo). Los plantas ornamentales incluyen azaleas (Rhododendron spp.), hortensias (Macrophylla hydrangea), hibiscos (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), Eupatoriums (Eupatorium hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia pulcherrima), y crisantemo.

Las coníferas que pueden emplearse en la práctica de la presente descripción incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino taeda (Pinus taeda), pino elliotii (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino torcido (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus radiada); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); cicuta occidental (Tsuga canadensis); pícea blanca (Picea glauca); secuoya (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como el abeto plateado (Abies amabilis) y el abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros tales como el cedro rojo occidental (Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). En realizaciones específicas, las plantas de la presente descripción son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). En otras realizaciones, las plantas de maíz y soja son óptimas, y aún en otras realizaciones, las plantas de maíz son óptimas.

Otras plantas de interés incluyen gramíneas que proporcionan semillas de interés, plantas oleaginosas, y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de cereales, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas oleaginosas incluyen algodón, soja, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Las plantas leguminosas incluir judías y guisantes. Las judías incluyen guar, algarrobo, fenogreco, soja, alubias, caupí, judía mungo, garrofón, haba, lentejas, garbanzos, etc.

Como se usa aquí, la expresión “molécula polinucleotídica transcribible” se refiere a cualquier molécula de ADN capaz de transcribirse en una molécula de ARN, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas que tienen secuencias codificantes de proteínas y aquellas que tienen secuencias útiles para la supresión génica. Un “transgén” se refiere a una molécula polinucleotídica transcribible heteróloga para una célula hospedante y/o a una molécula polinucleotídica transcribible incorporada artificialmente en el genoma de una célula hospedante.

Un elemento regulador de la presente invención puede ligarse operativamente a una molécula polinucleotídica transcribible que es heteróloga con respecto a la molécula reguladora. Como se usa aquí, el término “heterólogo” se refiere a la combinación de dos o más moléculas polinucleotídicas cuando tal combinación normalmente no se encontraría en la naturaleza. Por ejemplo, las dos moléculas pueden derivar de especies diferentes, y/o las dos moléculas pueden derivar de genes diferentes, por ejemplo diferentes genes de la misma especie o los mismos genes de diferentes especies. Por lo tanto, un elemento regulador es heterólogo con respecto a una molécula polinucleotídica transcribible ligada operativamente si tal combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza, es decir, esa molécula polinucleotídica transcribible no se encuentra ligada operativamente de forma natural en combinación con esa molécula del elemento regulador.

La molécula polinucleotídica transcribible puede ser generalmente cualquier molécula de ADN para la que se desee la expresión de un transcrito de ARN. Tal expresión de un transcrito de ARN puede dar como resultado la traducción de la molécula de ARNm resultante, y por lo tanto, la expresión de proteínas. Alternativamente, una molécula polinucleotídica transcribible se puede diseñar para finalmente provocar una disminución de la expresión de un gen o proteína específicos. Esto se puede lograr usando una molécula polinucleotídica transcribible que está orientada en la dirección antisentido. Un experto normal en la técnica está familiarizado con el uso de tal tecnología antisentido. Brevemente, a medida que se transcribe la molécula polinucleotídica transcribible antisentido, el producto de ARN se hibrida a y secuestra una molécula de ARN complementaria dentro de la célula. Esta molécula de ARN dúplex no puede traducirse en una proteína mediante la maquinaria de traducción de la célula, y se degrada en la célula. Cualquier gen puede regularse negativamente de esta manera.

Por lo tanto, una realización de la invención es un elemento regulador de la presente invención, tales como los que se proporcionan como SEQ ID NO: 1-5, ligado operativamente a una molécula polinucleotídica transcribible para modular la transcripción de la molécula polinucleotídica transcribible a un nivel deseado o en un patrón deseado tras la introducción de dicho constructo en una célula vegetal. En una realización, la molécula polinucleotídica transcribible comprende una región codificante de proteína de un gen, y el promotor afecta la transcripción de una molécula de ARN que se traduce y expresa como un producto proteico. En otra realización, la molécula polinucleotídica transcribible comprende una región antisentido de un gen, y el promotor afecta la transcripción de una molécula de ARN antisentido u otra molécula de ARN inhibidora similar para inhibir la expresión de una molécula de ARN específica de interés en una célula hospedante diana.

Las moléculas polinucleotídicas transcribibles expresadas por los elementos reguladores de EVCV de la descripción pueden usarse para variar el fenotipo de una planta. Diversos cambios en el fenotipo son de interés, incluyendo la modificación de la expresión de un gen, la alteración del mecanismo de defensa de una planta frente a insectos o patógenos, el aumento de la tolerancia de las plantas a los herbicidas en una planta, la alteración del desarrollo de la raíz para responder al estrés ambiental, la modulación de la respuesta de la planta a la sal, la temperatura (frío y calor), y sequía. Estos resultados pueden lograrse mediante la expresión de una secuencia nucleotídica heteróloga de interés que comprende un producto génico apropiado. En realizaciones específicas, la secuencia nucleotídica heteróloga de interés es una secuencia vegetal endógena cuyo nivel de expresión aumenta en la planta o parte de la planta. Alternativamente, los resultados pueden lograrse proporcionando una reducción de la expresión de uno o más productos génicos endógenos, particularmente enzimas, transportadores o cofactores, o afectando la absorción de nutrientes en la planta. Estos cambios dan como resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

Genes de interés agronómico

Las moléculas polinucleotídicas transcribibles pueden ser genes de interés agronómico. Como se usa aquí, la expresión “gen de interés agronómico” se refiere a una molécula polinucleotídica transcribible que, cuando se expresa en un tejido, célula o tipo de célula de una planta particular, proporciona una característica deseable asociada con la morfología, fisiología, crecimiento, desarrollo, rendimiento, producto, perfil nutricional, resistencia a enfermedades o plagas, y/o tolerancia ambiental o química. Los genes de interés agronómico incluyen, pero no se limitan a, aquellos que codifican una proteína de rendimiento, una proteína de resistencia al estrés, una proteína de control del desarrollo, una proteína de diferenciación de tejidos, una proteína de meristema, una proteína sensible al medio ambiente, una proteína de senescencia, una proteína sensible a hormonas, una proteína de abscisión, una proteína fuente, una proteína sumidero, una proteína de control de flores, una proteína de semilla, una proteína de resistencia a herbicidas, una proteína de resistencia a enfermedades, una enzima biosintética de ácidos grasos, una enzima biosintética de tocoferoles, una enzima biosintética de aminoácidos, una proteína plaguicida, o cualquier otro agente, tal como una molécula antisentido o ARNi dirigida contra un gen particular para su supresión. El producto de un gen de interés agronómico puede actuar dentro de la planta para causar un efecto sobre la fisiología o el metabolismo de la planta, o puede actuar como un agente plaguicida en la dieta de una plaga que se alimenta de la planta.

En una realización, un elemento regulador de la presente descripción se incorpora a un constructo de manera que el regulador se liga operativamente a una molécula polinucleotídica transcribible que es un gen de interés agronómico. La expresión del gen de interés agronómico es deseable para conferir un carácter agronómicamente beneficioso. Un rasgo agronómico beneficioso puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse a, tolerancia a herbicidas, control de insectos, rendimiento modificado, resistencia a enfermedades fúngicas, resistencia a virus, resistencia a nematodos, resistencia a enfermedades bacterianas, crecimiento y desarrollo vegetal, producción de almidón, producción de aceites modificados, alta producción de aceite, contenido de ácidos grasos modificados, alta producción de proteínas, maduración de la fruta, nutrición animal y humana mejorada, biopolímeros, resistencia al estrés ambiental, péptidos farmacéuticos y péptidos segregables, rasgos de procesamiento mejorados, digestibilidad mejorada, producción de enzimas, sabor, fijación de nitrógeno, producción de semillas híbridas, producción de fibras, y producción de biocombustibles.

Los genes de resistencia a insectos pueden codificar la resistencia a las plagas que dañan y reducen el rendimiento, tales como el gusano de la raíz, el gusano cortador, y el barrenador europeo del maíz. Dichos genes incluyen, por ejemplo, genes de proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (patentes U.S. n.° 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; y Geiser et al. (1986) Gen 48:109).

Los genes que codifican rasgos de resistencia a enfermedades incluyen genes de desintoxicación, tales como los que desintoxican la fumonisina (patente U.S. n.° 5.792.931); y genes de avirulencia (avr) y de resistencia a enfermedades (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089).

Los rasgos de resistencia a herbicidas pueden incluir genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de la acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a tal resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tales como la fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), el glifosato (por ejemplo, el gen EPSPS y el gen GAT; véase, por ejemplo, la Publicación U.S. n.° 20040082770 y el documento WO 03/092360) u otros genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica la resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina, y los mutantes del gen ALS codifican la resistencia al herbicida clorsulfurón.

La resistencia al glifosato es impartida por genes mutantes de 5-enolpiruvil-3-fosfikimato sintasa (EPSP) y aroA. Véase, por ejemplo, la patente U.S. n.° 4.940.835 de Shah et al., que describe la secuencia nucleotídica de una forma de EPSPS que puede conferir resistencia al glifosato. La patente U.S. n.° 5.627.061 de Barry et al. también describe genes que codifican enzimas EPSPS. Véanse también las patentes U.S. n.° 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E; y 5.491.288; y publicaciones internacionales WO 97/04103; WO 97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 y WO 00/66748. La resistencia al glifosato también se imparte a las plantas que expresan un gen que codifica una enzima glifosato oxidorreductasa, como se describe más detalladamente en las patentes U.S. n.° 5.776.760 y 5.463.175. Además, la resistencia al glifosato se puede impartir a las plantas mediante la sobreexpresión de genes que codifican la glifosato N-acetiltransferasa. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. 7.714.188 y 7.462.481.

Los genes de interés agronómico con aprobación regulatoria son bien conocidos por los expertos en la técnica, y se pueden encontrar en el Center for Environmental Risk Assessment (cera-gmc.org/?action=gm_crop_database, al que se puede acceder usando el prefijo www) y en el International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp, al que se puede acceder utilizando el prefijo www).

Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales, así como los de otras fuentes, incluyendo las procariotas y otras eucariotas. Dichos productos incluyen enzimas, cofactores y hormonas.

Los ejemplos de otros genes aplicables y su fenotipo asociado incluyen el gen que codifica la proteína de cubierta viral y/o el ARN, u otros genes virales o vegetales que confieren resistencia viral; genes que confieren resistencia a hongos; genes que promueven la mejora del rendimiento; y genes que proporcionan resistencia al estrés, tal como el frío, la deshidratación resultante de la sequía, el calor y la salinidad, o metales tóxicos o elementos en trazas.

Como se ha señalado, la secuencia nucleotídica heteróloga ligada operativamente al elemento regulador de EVCV descrito aquí puede ser una secuencia antisentido para un gen diana. Por tanto, las secuencias promotoras descritas aquí pueden ligarse operativamente a secuencias de ADN antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en la raíz de la planta.

“ARNi” se refiere a una serie de técnicas relacionadas para reducir la expresión de genes (Véase, por ejemplo, la patente U.S. n.° 6.506.559). Ahora se cree que las técnicas más antiguas a las que se hace referencia con otros nombres se basan en el mismo mecanismo, pero se les da diferentes nombres en la bibliografía. Estas incluyen “inhibición antisentido”, la producción de transcritos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana, y “cosupresión” o “supresión de sentido”, que se refiere a la producción de transcritos de ARN sentido capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (patente U.S. n.° 5.231.020). Dichas técnicas se basan en el uso de constructos que dan como resultado la acumulación de ARN bicatenario con una cadena complementaria al gen diana que se va a silenciar. El elemento regulador de EVCV de las realizaciones se puede usar para dirigir la expresión de constructos que darán como resultado una interferencia de ARN que incluye los microARN y ARNip.

Las secuencias de elementos reguladores de la presente descripción, o variantes o fragmentos de las mismas, cuando se ligan operativamente a una secuencia nucleotídica heteróloga de interés, pueden dirigir la expresión constitutiva de la secuencia nucleotídica heteróloga en la planta que expresa este constructo. Una “secuencia nucleotídica heteróloga” es una secuencia que no se produce de forma natural con la secuencia del elemento regulador de la descripción. Si bien esta secuencia nucleotídica es heteróloga a la secuencia del elemento regulador, puede ser homóloga, nativa, heteróloga, o extraña al hospedante vegetal.

Las secuencias de elementos reguladores aislados de la presente descripción pueden modificarse para proporcionar un intervalo de niveles de expresión de la secuencia nucleotídica heteróloga. Por lo tanto, se puede utilizar menos de la región completa del elemento regulador, y se puede conservar la capacidad para dirigir la expresión de la secuencia nucleotídica de interés. Se reconoce que los niveles de expresión del ARNm pueden alterarse de diferentes formas con deleciones de porciones de las secuencias del elemento regulador. Los niveles de expresión de ARNm pueden disminuir o, alternativamente, la expresión puede aumentar como resultado de deleciones de elementos reguladores si, por ejemplo, hay un elemento regulador negativo (para un represor) que se elimina durante el proceso de truncamiento. Generalmente, para dirigir la expresión de una secuencia nucleotídica se usarán al menos alrededor de 20 nucleótidos de una secuencia del elemento regulador aislada.

Se reconoce que para aumentar los niveles de transcripción, se pueden utilizar potenciadores en combinación con las regiones de elementos reguladores de la descripción. Los potenciadores son secuencias nucleotídicas que actúan para aumentar la expresión de una región de elementos reguladores. Los potenciadores son conocidos en la técnica, e incluyen la región potenciadora SV40 y el elemento potenciador 35S. También se sabe que algunos potenciadores alteran los patrones de expresión de elementos reguladores normales, por ejemplo haciendo que un elemento regulador dirija la expresión de manera constitutiva cuando, sin el potenciador, el mismo elemento regulador dirige la expresión solo en un tejido específico o en unos pocos tejidos específicos.

Las modificaciones de las secuencias de elementos reguladores aisladas de la presente descripción pueden proporcionar un intervalo de expresión de la secuencia nucleotídica heteróloga. Por lo tanto, pueden modificarse para que sean promotores débiles o promotores fuertes. Generalmente, un “promotor débil” significa un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Un “nivel bajo” de expresión pretende significar expresión a niveles de alrededor de 1/10.000 transcritos hasta alrededor de 1/100.000 transcritos hasta alrededor de 1/500.000 transcritos. Por el contrario, un promotor fuerte dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel alto, o a alrededor de 1/10 transcritos hasta alrededor de 1/100 transcritos hasta alrededor de 1/1.000 transcritos.

Se reconoce que los elementos reguladores de EVCV de la descripción se pueden usar para aumentar o disminuir la expresión, lo que da como resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada. Este cambio fenotípico podría afectar aún más un aumento o disminución en los niveles de iones metálicos en los tejidos de la planta transformada.

Las secuencias nucleotídicas descritas en la presente descripción, así como sus variantes y fragmentos, son útiles en la manipulación genética de una planta. La secuencia del elemento regulador de EVCV es útil en este aspecto cuando se liga operativamente con una secuencia nucleotídica heteróloga cuya expresión se va a controlar para lograr una respuesta fenotípica deseada. La expresión “ligado operativamente” significa que la transcripción o traducción de la secuencia nucleotídica heteróloga está bajo la influencia de la secuencia del elemento regulador. De esta manera, las secuencias nucleotídicas para los elementos reguladores de la descripción pueden proporcionarse en casetes de expresión junto con secuencias nucleotídicas heterólogas de interés para la expresión en la planta de interés, más particularmente para la expresión en la raíz de la planta.

Las secuencias reguladoras de las realizaciones se proporcionan en constructos de ADN para la expresión en el organismo de interés. Un “casete de expresión”, como se usa aquí, significa un constructo de ADN que comprende una secuencia reguladora de las realizaciones ligada operativamente a un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido de interés. Dichos casetes de expresión comprenderán una región de iniciación de la transcripción que comprende una de las secuencias nucleotídicas del elemento regulador de la presente descripción, o variantes o fragmentos de las mismas, ligadas operativamente a la secuencia nucleotídica heteróloga. Dicho casete de expresión puede estar provisto de una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia nucleotídica esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresión puede contener adicionalmente genes marcadores seleccionables, así como regiones de terminación 3’.

El casete de expresión puede incluir, en la dirección 5’-3’ de la transcripción, una región de inicio de la transcripción (es decir, un promotor, o una variante o un fragmento del mismo, de la descripción), una región de inicio de la traducción, una secuencia nucleotídica heteróloga de interés, una región de terminación de la traducción y, opcionalmente, una región de terminación de la transcripción funcional en el organismo hospedante. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras de la transcripción, y regiones de terminación de la traducción) y/o el polinucleótido de las realizaciones pueden ser nativos/análogos a la célula hospedante o entre sí. Alternativamente, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de las realizaciones pueden ser heterólogos con respecto a la célula hospedante o entre sí. Como se usa aquí, “heterólogo”, en referencia a una secuencia, es una secuencia que se origina a partir de una especie foránea, o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente a partir de su forma nativa en composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor ligado operativamente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la que derivó el polinucleótido, o, si es de la misma especie/especie análoga, uno o ambos están sustancialmente modificados a partir de su forma original y/o locus genómico, o el promotor no es el promotor nativo del polinucleótido ligado operativamente.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN ligada operativamente de interés, puede ser nativa con la planta hospedante, o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, a la secuencia de ADN que se expresa, a la planta hospedante, o a cualquier combinación de los mismos). Las regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véanse también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al.

(1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gen 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.

El casete de expresión que comprende las secuencias de la presente descripción también puede contener al menos una secuencia nucleotídica adicional para que un gen se cotransforme en el organismo. Alternativamente, la o las secuencias adicionales pueden proporcionarse en otro casete de expresión.

Cuando sea apropiado, las secuencias nucleotídicas cuya expresión va a estar bajo el control de la secuencia promotora constitutiva de la presente descripción, y cualquier secuencia o secuencias nucleotídicas adicionales, pueden optimizarse para aumentar la expresión en la planta transformada. Es decir, estas secuencias nucleotídicas se pueden sintetizar usando codones preferidos de plantas para mejorar la expresión. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión sobre el uso de codones preferidos por el hospedante. Hay métodos disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de plantas. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. n.25.380.831,5.436.391, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

Se sabe que modificaciones de secuencia adicionales potencian la expresión génica en un hospedante celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitios de empalme de exón-intrón, repeticiones de tipo transposón, y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia nucleotídica heteróloga puede ajustarse a los niveles promedio para un hospedante celular dado, según se calcula con referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedante. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar las estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas.

Los casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias líder en 5’. Tales secuencias líder pueden actuar para mejorar la traducción. Los líderes de traducción son conocidos en la técnica, e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo líder de EMCV (región no codificante 5’ de encefalomiocarditis) (Elroy Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:61266130); líderes de potyvirus, por ejemplo líder de TEV (virus del grabado del tabaco) (Allison et al. (1986) Virology 154:920); líder MDMV (virus del mosaico del enanismo del maíz); proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90 94); líder no traducido del ARNm de la proteína de cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622 625); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Galli et al. (1989) Molecular Biology of Rⁿ A, páginas 237256); y líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382 385). Véase también Della Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965968. También se pueden utilizar métodos que se sabe que mejoran la estabilidad del ARNm, por ejemplo intrones, tales como el intrón de ubiquitina de maíz (Christensen y Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218; Christensen et al. (1992) Plant Molecular Biology 18:675-689), o el intrón Adhl de maíz (Kyozuka et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 228:40-48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357).

Al preparar el casete de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación adecuada y, según corresponda, en el marco de lectura adecuado. Con este fin, pueden emplearse adaptadores o enlazadores, para unir los fragmentos de ADN, o pueden estar involucradas otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, o eliminación de sitios de restricción. Para este fin, pueden estar involucradas la mutagénesis in vitro, la reparación de cebadores, la restricción, la hibridación, las resustituciones, por ejemplo transiciones y transversiones.

En los casetes de expresión pueden incluirse genes informadores o genes marcadores seleccionables. Los ejemplos de genes informadores adecuados conocidos en la técnica se pueden encontrar, por ejemplo, en Jefferson et al. (1991) en Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), págs. 1-33; De Wet et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain et al. (1995) BioTechniques 19:650-655; y Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325-330.

Los genes marcadores seleccionables para la selección de células o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican resistencia al cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); a metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303: 209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); a higromicina (Waldron et al. (1985) Planta Mol. Biol. 5:103-108; y Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219-227); a estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); a espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Tansgenic Res. 5:131-137); a bleomicina (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); a sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); a bromoxinilo (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); a glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481; y las Solicitudes U.S. Series n.° 10/004.357; y 10/427.692); a fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518).

Otros genes que podrían tener utilidad en la recuperación de eventos transgénicos pero que podrían no ser necesarios en el producto final incluirían, pero no se limitan a, ejemplos tales como GUS (beta-glucuronidasa; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína de fluorescencia verde; Chalfie et al. (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15(19):8115 y Luehrsen et al. (1992) Methods Enzymol. 216:397-414), y los genes del maíz que codifican la producción de antocianinas (Luis et al. (1990) Science 247:449).

El casete de expresión que comprende los elementos reguladores de EVCV de la presente descripción ligados operativamente a una secuencia nucleotídica de interés puede usarse para transformar cualquier planta. De esta manera, pueden obtenerse plantas, células vegetales, tejido vegetal, semillas y raíces modificados genéticamente.

Los métodos de la descripción implican introducir un polipéptido o polinucleótido en una planta. “Introducir” pretende significar presentar a la planta el polinucleótido o polipéptido, de tal manera que la secuencia obtenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la descripción no dependen de un método particular para introducir una secuencia en una planta, solo de que el polinucleótido o polipéptidos obtengan acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos o polipéptidos en plantas son conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria, y métodos mediados por virus.

“Transformación estable” pretende significar que el constructo nucleotídico introducido en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredado por la progenie de la misma. “Transformación transitoria” pretende significar que un polinucleótido se introduce en la planta y no se integra en el genoma de la planta, o se introduce un polipéptido en una planta.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias nucleotídicas en plantas, pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, diana de la transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias nucleotídicas en células vegetales, y la posterior inserción en el genoma de la planta, incluyen la microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320 334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:56025606), transformación mediada por Agrobacterium (Townsend et al., patentes U.S. n.° 5.563.055 y Zhao et al., 5.981.840), transferencia directa de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717 2722), y aceleración de partículas balísticas (véanse, por ejemplo, las patentes U.S. n.° 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes et al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Orgen Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlín); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923926); y transformación Lec1 (documento WO 00/28058). Véanse también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:2737 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671 674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:43054309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559563 (maíz); patentes U.S. n.° 5.240.855; 5.322.783 y 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763-764; patente U.S. n.° 5.736.369 (cereales); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliáceas); De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nueva York), págs. 197­ 209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por triquitos); D’Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz vía Agrobacterium tumefaciens).

En realizaciones específicas, las constructos de ADN que comprenden las secuencias de elementos reguladores de la descripción se pueden proporcionar a una planta usando una variedad de métodos de transformación transitoria. Dichos métodos de transformación transitoria incluyen, pero no se limitan a, sistemas de vectores virales y la precipitación del polinucleótido de una manera que impide la liberación posterior del ADN. Por lo tanto, la transcripción del ADN unido a partículas puede ocurrir, pero la frecuencia con la que se libera para integrarse en el genoma se reduce considerablemente. Dichos métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEI; Sigma-Aldrich™ #P3143).

En otras realizaciones, el polinucleótido de la descripción puede introducirse en plantas poniendo en contacto plantas con un virus o con ácidos nucleicos virales. Generalmente, dichos métodos implican la incorporación de un constructo nucleotídico de la descripción dentro de una molécula de ADN o ARN viral. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas y expresar una proteína codificada en ellas, que implican moléculas de ADN o ARN viral, son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. n.° 5.889.191.5.889.190. 5.866.785. 5.589.367. 5.316.931, y Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221.

En la técnica se conocen métodos para la inserción dirigida de un polinucleótido en una ubicación específica en el genoma de la planta. En una realización, la inserción del polinucleótido en una ubicación genómica deseada se logra usando un sistema de recombinación específico del sitio. Véanse, por ejemplo, los documentos WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855, y WO99/25853. Brevemente, el polinucleótido de la descripción puede estar contenido en un casete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos. El casete de transferencia se introduce en una planta que tiene incorporado de manera estable en su genoma un sitio diana que está flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios del casete de transferencia. Se proporciona una recombinasa adecuada, y el casete de transferencia se integra en el sitio diana. El polinucleótido de interés se integra así en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta.

Las células que se han transformado se pueden cultivar en plantas según formas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81 -84. A continuación, estas plantas pueden cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, y se puede identificar el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga y se herede de manera estable, y entonces las semillas se pueden cosechar para garantizar que se haya logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente descripción proporciona semillas transformadas (también denominadas “semillas transgénicas”) que tienen un constructor nucleotídico de la descripción, por ejemplo un casete de expresión de la descripción, incorporado de forma estable en su genoma.

En una realización, las secuencias del elemento regulador de EVCV pueden editarse o insertarse mediante la edición del genoma usando un sistema CRISPR/Cas9.

Los loci CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente Interespaciadas) (también conocidas como Repeticiones Directas Interespaciadas SPIDRs--SPacer) constituyen una familia de loci de ADN descritos recientemente. Los loci CRISPR consisten en repeticiones de ADN cortas y altamente conservadas (típicamente de 24 a 40 pb, repetidas de 1 a 140 veces, también denominadas repeticiones CRISPR) que son parcialmente palindrómicas. Las secuencias repetidas (generalmente específicas de una especie) están intercaladas por secuencias variables de longitud constante (típicamente de 20 a 58, dependiendo del locus CRISPR (documento WO2007/025097, publicado el 1 de marzo de 2007).

Los loci CRISPR se reconocieron por primera vez en E. coli (Ishino et al. (1987) J. Bacterial. 169:5429-5433; Nakata et al. (1989) J. Bacterial. 171:3553-3556). Se han identificado repeticiones de secuencia cortas intercaladas similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena, y Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol. 10:1057-1065; Hoe et al. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5:254-263; Masepohl et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30; Mojica et al. (1995) Mol. Microbiol. 17:85-93). Los loci CRISPR se diferencian de otras SSR por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones cortas regularmente espaciadas (SRSR) (Jansen et al. (2002) OMICS J. Integ. Biol. 6:23-33; Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244-246). Las repeticiones son elementos cortos que ocurren en agrupamientos, que siempre están regularmente espaciadas por secuencias variables de longitud constante (Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244-246).

El gen Cas se refiere a un gen que generalmente está acoplado, asociado o cerca o en la vecindad de los loci CRISPR flanqueantes. Las expresiones “gen Cas”, “gen asociado a CRISPR (Cas)” se usan aquí indistintamente. Una revisión completa de la familia de proteínas Cas se presenta en Haft et al. (2005) Computational Biology, PLoS Comput Biol 1(6): e60. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060. Como se describe allí, se describen 41 familias de genes asociados a CRISPR (Cas), además de las cuatro familias de genes conocidas anteriormente. Muestra que los sistemas CRISPR pertenecen a diferentes clases, con diferentes patrones de repetición, conjuntos de genes, e intervalos de especies. El número de genes Cas en un locus CRISPR dado puede variar entre especies.

La endonucleasa Cas se refiere a una proteína Cas codificada por un gen Cas, en el que dicha proteína Cas es capaz de introducir una rotura de doble cadena en una secuencia diana de ADN. La endonucleasa Cas está guiada por un polinucleótido guía para reconocer, y opcionalmente introducir, una ruptura de doble cadena en un sitio diana específico en el genoma de una célula (Solicitud Provisional U.S. n.° 62/023239, presentada el 11 de julio de 2014). El sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas incluye un complejo de una endonucleasa Cas y un polinucleótido guía que es capaz de introducir una rotura de doble cadena en una secuencia diana de ADN. La endonucleasa Cas desenrolla el dúplex de ADN muy cerca del sitio diana genómico, y escinde ambas hebras de ADN tras el reconocimiento de una secuencia diana por un ARN guía si un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) correcto se orienta aproximadamente en el extremo 3’ del secuencia diana.

El gen de la endonucleasa Cas puede ser la endonucleasa Cas9, o un fragmento funcional de la misma, tal como, pero sin limitarse a, los genes Cas9 enumerados en SEQ ID NO: 462, 474, 489, 494, 499, 505 y 518 del documento WO2007/025097 publicado el 1 de marzo de 2007. El gen de la endonucleasa Cas puede ser una endonucleasa Cas9 optimizada para plantas, maíz o soja, tal como, pero sin limitarse a, un gen Cas9 de Streptococcus pyogenes optimizado para codones de la planta, que puede reconocer cualquier secuencia genómica de la forma N(12-30)NGG. La endonucleasa Cas puede introducirse directamente en una célula mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, métodos de introducción transitoria, transfección y/o aplicación tópica.

Como se usa aquí, la expresión “ARN guía” se refiere a una fusión sintética de dos moléculas de ARN, un ARNcr (ARN CRISPR) que comprende un dominio de direccionamiento variable, y un ARNtracr. El ARN guía puede comprender un dominio de direccionamiento variable de 12 a 30 secuencias nucleotídicas, y un fragmento de ARN que puede interactuar con una endonucleasa Cas.

Como se usa aquí, la expresión “polinucleótido guía” se refiere a una secuencia polinucleotídica que puede formar un complejo con una endonucleasa Cas y permite que la endonucleasa Cas reconozca y opcionalmente escinda un sitio diana de ADN (Solicitud Provisional U.S. n.° 62/023239, presentada el 11 de julio de 2014). El polinucleótido guía puede ser una molécula única o una molécula doble. La secuencia del polinucleótido guía puede ser una secuencia de ARN, una secuencia de ADN, o una combinación de las mismas (una secuencia de combinación de ARN-ADN). Opcionalmente, el polinucleótido guía puede comprender al menos un nucleótido, un enlace de fosfodiéster, o una modificación de enlace, tal como, pero sin limitarse a, ácido nucleico bloqueado (LNA), 5-metil dC, 2,6-diaminopurina, 2’-fluoro A, 2’-fluoro U, 2’-O-metil ARN, enlace de fosforotioato, enlace a una molécula de colesterol, enlace a una molécula de polietilenglicol, enlace a una molécula espaciadora 18 (cadena de hexaetilenglicol), o enlace covalente 5’ a 3’ que da como resultado circularización. Un polinucleótido guía que comprende únicamente ácidos ribonucleicos también se denomina “ARN guía”.

El polinucleótido guía puede ser una molécula doble (también denominada polinucleótido guía dúplex) que comprende un primer dominio de secuencia nucleotídica (denominado dominio de direccionamiento variable o dominio VT), que es complementario a una secuencia nucleotídica en un ADN diana, y un segundo dominio de secuencia nucleotídica (denominado dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o dominio CER), que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. El dominio CER del polinucleótido guía de molécula doble comprende dos moléculas separadas que se hibridan a lo largo de una región de complementariedad. Las dos moléculas separadas pueden ser secuencias de ARN, ADN, y/o de combinación de ARN-ADN. En algunos aspectos, la primera molécula del polinucleótido guía dúplex que comprende un dominio VT unido a un dominio CER se denomina “ADNcr” (cuando se compone de un tramo contiguo de nucleótidos de ADN) o “ARNcr” (cuando se compone de un tramo contiguo de nucleótidos de ARN), o “ADN-ARNcr” (cuando se compone de una combinación de nucleótidos de ADN y ARN). El Nucleótido cr puede comprender un fragmento del ARNc que se encuentra de forma natural en bacterias y arqueas. En un aspecto, el tamaño del fragmento del ARNc de origen natural en bacterias y arqueas que está presente en un Nucleótido cr descrito aquí puede oscilar de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos. En algunos aspectos, la segunda molécula del polinucleótido guía dúplex que comprende un dominio CER se denomina “ARNtracr” (cuando se compone de un tramo contiguo de nucleótidos de ARN) o “ADNtracr” (cuando se compone de un tramo contiguo de nucleótidos de ADN) o “ADN-ARNtracr” (cuando se compone de una combinación de nucleótidos de ADN y ARN. En un aspecto, el RNA que guía el complejo de ARN/endonucleasa Cas9 es un ARN dúplex que comprende un dúplex ARNcr-ARNtracr.

El polinucleótido guía también puede ser una sola molécula que comprende un primer dominio de secuencia nucleotídica (denominado dominio de direccionamiento variable o dominio VT), que es complementario a una secuencia nucleotídica en un ADN diana, y un segundo dominio nucleotídico (denominado dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o dominio CER), que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. Por “dominio” se entiende un tramo contiguo de nucleótidos que puede ser una secuencia de ARN, ADN, y/o de combinación de ARN-ADN. El dominio VT y/o el dominio CER de un polinucleótido guía único pueden comprender una secuencia de ARN, una secuencia de a Dn , o una secuencia de combinación de ARN-ADN. En algunos aspectos, el polinucleótido guía único comprende un nucleótido cr (que comprende un dominio VT ligado a un dominio CER) ligado a un nucleótido tracr (que comprende un dominio CER), en el que el enlace es una secuencia nucleotídica que comprende una secuencia de ARN, una secuencia de ADN, o una secuencia de combinación de ARN-ADN. El polinucleótido guía único que comprende secuencias del nucleótido cr y del nucleótido tracr puede denominarse “ARN guía único” (cuando se compone de un tramo contiguo de nucleótidos de ARN) o “ADN guía único” (cuando se compone de un tramo contiguo de nucleótidos de ADN), o “ARN-ADN guía único” (cuando se compone de una combinación de nucleótidos de ARN y ADN). En un aspecto de la descripción, el ARN guía único comprende un ARNc o un fragmento de ARNc y un ARNtracr o un fragmento de ARNtracr del sistema CRISPR/Cas tipo II que puede formar un complejo con una endonucleasa Cas tipo II, en el que dicho complejo de ARN guía/endonucleasa Cas puede dirigir la endonucleasa Cas a un sitio diana genómico de la planta, permitiendo que la endonucleasa Cas introduzca una ruptura de doble cadena en el sitio diana genómico. Un aspecto del uso de un polinucleótido guía único frente a un polinucleótido guía dúplex es que solo se necesita obtener un casete de expresión para expresar el polinucleótido guía único.

La expresión “dominio de direccionamiento variable” o “dominio VT” se usa aquí indistintamente, e incluye una secuencia nucleotídica que es complementaria a una hebra (secuencia nucleotídica) de un sitio diana de ADN de doble hebra. El % de complementación entre el primer dominio de secuencia nucleotídica (dominio VT) y la secuencia diana puede ser al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% , 60%, 61%, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. El dominio diana variable puede tener al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. En algunos aspectos, el dominio de direccionamiento variable comprende un tramo contiguo de 12 a 30 nucleótidos. El dominio de direccionamiento variable puede estar compuesto por una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una secuencia de ADN modificada, una secuencia de ARN modificada, o cualquier combinación de las mismas.

La expresión “dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas” o “dominio CER” de un polinucleótido guía se usa aquí indistintamente, e incluye una secuencia nucleotídica (tal como un segundo dominio de secuencia nucleotídica de un polinucleótido guía), que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. El dominio CER puede estar compuesto por una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una secuencia de ADN modificada, una secuencia de ARN modificada (véanse, por ejemplo, las modificaciones descritas aquí), o cualquier combinación de las mismas.

La secuencia nucleotídica que une el nucleótido cr y el nucleótido tracr de un polinucleótido guía único puede comprender una secuencia de ARN, una secuencia de ADN, o una secuencia de combinación de ARN-ADN. En un aspecto, la secuencia nucleotídica que une el nucleótido cr y el nucleótido tracr de un polinucleótido guía único puede tener al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la secuencia nucleotídica que une el nucleótido cr y el nucleótido tracr de un polinucleótido guía único puede comprender una secuencia de tetrabucle, tal como, pero sin limitarse a, una secuencia de tetrabucle GAAA.

La modificación de la secuencia nucleotídica del polinucleótido guía, el dominio VT y/o el dominio CER se pueden seleccionar, pero sin limitarse a, del grupo que consiste en una caperuza en 5’, una cola poliadenilada en 3’, una secuencia ribointerruptora, una secuencia de control de estabilidad, una secuencia que forma un dúplex de ARNbc, una modificación o secuencia que dirige el polinucleótido guía hacia una ubicación subcelular, una modificación o secuencia que proporciona un seguimiento, una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas, un ácido nucleico bloqueado (LNA), un nucleótido de 5-metil dC, un nucleótido de 2,6-diaminopurina, un nucleótido de 2’-fluoro A, un nucleótido 2’-fluoro U; un nucleótido de 2’-O-metil ARN, un enlace de fosforotioato, un enlace a una molécula de colesterol, un enlace a una molécula de polietilenglicol, un enlace a una molécula espaciadora 18, un enlace covalente de 5’ a 3’, o cualquier combinación de los mismos. Estas modificaciones pueden dar como resultado al menos una característica beneficiosa adicional, en las que la característica beneficiosa adicional se selecciona del grupo de una estabilidad modificada o regulada, un direccionamiento subcelular, seguimiento, una marcador fluorescente, un sitio de unión para una proteína o un complejo proteico, afinidad de unión modificada para la secuencia diana complementaria, resistencia modificada a la degradación celular, y aumento de la permeabilidad celular.

Los artículos “un” y “una” se usan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos a uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa uno o más elementos.

A lo largo de la memoria descriptiva, se entenderá que la palabra “que comprende”, o variaciones como “comprende” o “comprender”, implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa expuestos, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los expertos en la técnica a la que se refiere esta descripción.

Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.), pero se deben permitir algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso; el peso molecular es el peso molecular medio; la temperatura está en grados centígrados; y la presión es igual o cercana a la atmosférica.

PARTE EXPERIMENTAL

Ejemplo 1: Secuencias del elemento regulador del virus del aclaramiento de las nervaduras de Eupatorium

El elemento regulador de SEQ ID NO: 1 se obtuvo a través de una búsqueda en GenBank Genomes de genomas virales que se habían secuenciado y pertenecían a la familia de los virus Caulimoviridae. La búsqueda se inició con base en el conocido promotor del virus 35S del mosaico de la coliflor (CaMV35S). Impulsa la expresión constitutiva de genes heterólogos en la mayoría de los tejidos de la mayoría de las plantas. Otros elementos reguladores de esta familia de virus, tal como el promotor del virus 34S del mosaico de la escrofularia, también dirigen la expresión de tipo constitutivo en las plantas. Por lo tanto, los elementos reguladores adicionales derivados de la familia de virus Caulimoviridae también pueden impulsar la expresión constitutiva en las plantas. La región del genoma, que se encuentra en lo que se denomina Gran Región Intergénica (LIR), generalmente contiene las secuencias reguladoras necesarias para la función promotora en las plantas.

El genoma del virus del aclaramiento de las nervaduras de Eupatorium (EVCV) tiene una LIR, por lo que esta región fue la diana del análisis funcional de los elementos reguladores. Se seleccionó una secuencia de longitud completa para probarla en plantas. La secuencia consiste en 1104 pb (expuesta en SEQ ID NO: 1), y tiene una caja TATA putativa que comienza aproximadamente en 88 pb en dirección del extremo 3’ de la secuencia. La secuencia completa de 1104 pb se denomina elemento regulador de EVCV FL (longitud completa) o EVCV FL. La eliminación de segmentos del extremo 5’ del elemento regulador de longitud completa puede alterar el patrón de expresión y proporcionar información sobre marcadores de secuencia importantes en la región reguladora. Las secuencias segunda, tercera, cuarta, quinta y sexta son una versión truncada del elemento regulador de longitud completa (véase la Figura 2; SEQ ID NO: 1). Los elementos reguladores EVCV TR1, EVCV TR2, EVCV TR3, EVCV TR4 y EVCV TR5 consisten respectivamente en 821 pb, 514 pb, 431 pb, 283 pb, y 116 pb, y contienen el extremo 3’ del promotor de longitud completa (SEQ ID NO: 2-6).

Ejemplo 2: Análisis de la expresión y eliminación del elemento regulador de EVCV

EVCV FL se ligó operativamente al primer intrón del gen 1 de la alcohol deshidrogenasa de maíz (intrón 1 de ADH1) y al gen de la p-glucuronidasa (GUS), en un vector de expresión, para evaluar si el fragmento de ADN sintetizado dirigiría la expresión (SEQ ID NO: 1). El intrón 1 de ADH1 se incluyó con el fin de aumentar la expresión, ya que se ha demostrado que en las células de las plantas de cereales, la expresión de los transgenes se ve reforzada por la presencia de algunos intrones proximales en 5’ (véase Calis et al. (1987) Genes and Development 1:1183-1200; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357).

El promotor Ubi-1 e intrón de Zea mays se ligaron operativamente al gen GUS para que pudiera usarse para comparar el patrón de expresión y los niveles de expresión de los elementos reguladores de EVCV. El promotor Ubi-1 es un promotor constitutivo fuerte en la mayoría de los tejidos de Zea mays.

Los elementos reguladores son una colección de motivos de secuencia que trabajan juntos para unir factores de transcripción que dan como resultado las características de expresión espacial, temporal y cuantitativa de un promotor. Comprender la arquitectura y el posicionamiento de estos motivos mejora el conocimiento relacionado con el elemento regulador. El análisis de deleción segmentaria es una herramienta importante que puede usarse para comenzar a identificar regiones de un elemento regulador que contienen motivos funcionalmente importantes. La eliminación de segmentos del extremo 5’ puede cambiar los patrones de expresión espacial, temporal y/o cuantitativa dirigidos por el elemento regulador. Las regiones que dan como resultado un cambio pueden estudiarse entonces más de cerca para evaluar las secuencias y su interacción con los factores cis y trans. Los truncamientos también pueden identificar una secuencia funcional mínima.

Los sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción, Spel, Pvull, SnaBI, HindlII y Dral, se usaron para eliminar cinco regiones de secuencia en EVCV FL que varían en tamaño desde alrededor de 307 a 83 pb. EVCV TR1, EVCV TR2, EVCV TR3, EVCV TR4, EVCV TR5 se ligaron operativamente al intrón 1 de ADH1 y al gen GUS en un vector de expresión para evaluar el potencial de expresión de los fragmentos de ADN sintetizados (SEQ ID NO: 2-6).

Se crearon plantas transformadas estables usando protocolos de Agrobacterium (detallados en el Ejemplo 3), para permitir la caracterización de la actividad promotora, incluyendo la expresión espacial y cuantitativa dirigida por los diferentes elementos reguladores. Se tomaron muestras de plantas que crecieron hasta la etapa V5/6 en condiciones de invernadero en busca de material de hojas y raíces para evaluar los cambios de expresión mediante análisis histoquímicos de tinción GUS y ensayos fluorométricos cuantitativos. Las etapas de crecimiento vegetativo están determinadas por el número de hojas con collar en la planta. Por lo tanto, una planta en la etapa V5 tiene 5 hojas con cuello completo. Entonces, se permitió que las plantas crecieran hasta la etapa R1-R2, un punto en el que la seda emerge de la cáscara (R1 y comienzan a secarse (R2). Los tejidos, que incluían tejidos reproductivos, se recolectaron y analizaron para determinar su expresión (Tabla 1).

Tabla 1: Resultados de la expresión vegetal para el promotor del EVCV (con intrón 1 de ADH1, y GUS)

Datos expresados en una escala de 0-6 con la expresión dirigida por promotor Ubi-1 del maíz como comparador.

El elemento regulador de EVCV FL (SEQ ID NO: 1) se ligó operativamente al intrón 1 de ADH1 y a un gen insecticida (abreviado IG2), para evaluar la expresión. El promotor Ubi-1 y el intrón que dirigen la expresión del gen insecticida IG2 se usaron para la comparación en el análisis. Se crearon plantas transformadas estables usando los protocolos de Agrobacterium (detallados en el Ejemplo 3), y se les permitió crecer hasta una etapa de desarrollo de V5/6, momento en el que se tomaron muestras de las hojas. Entonces, se permitió que las plantas crecieran hasta la etapa R1-R2, cuando se tomaron muestras de tallo y polen. Los granos se muestrearon cuando alcanzaron la madurez.

Los resultados de los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) contra IG2 mostraron la expresión dirigida del elemento regulador de EVCV FL (SEQ ID NO: 1) en tejidos de hojas, tallos, y granos (Tabla 2). Los niveles de expresión fueron comparables a los promotor Ubi-1 y su intrón en tejidos de hojas y tallos. En los granos, la expresión dirigida de EVCV FL (SEQ ID NO: 1) fue menor que Ubi-1, y en polen, la expresión fue esencialmente muy baja.

Los datos de expresión fueron respaldados por resultados de ensayos de consumo de insectos. Alimentar a los insectos con tejidos de plantas disecados proporciona una evaluación rápida de la expresión de proteínas, ya que se necesitan niveles suficientes para proteger el tejido de los insectos. La expresión insuficiente dará como resultado daño por alimentación. Tanto EVCV FL (SEQ ID NO: 1) como Ubi-1 las plantas demostraron niveles de expresión que protegían el tejido de las hojas y la seda contra el daño por los insectos. Se consumieron tejidos de plantas de control negativo que no tenían el gen IG2.

Tabla 2: Resultados de la expresión vegetal para el elemento regulador de EVCV (con intrón 1 de ADH1, e IG2)

Datos expresados en una escala de 0-6, representando el promotor Ubi-1 del maíz un valor mediano.

Ejemplo 3: Transformación del maíz mediada por Agrobacterium, y regeneración de plantas transgénicas

Para la transformación de maíz mediada por Agrobacterium con una secuencia del elemento regulador de la descripción, se empleó el método de Zhao (patente U.S. n.° 5.981.840, y publicación de patente PCT WO98/32326). Brevemente, los embriones inmaduros se aislaron del maíz, y los embriones se pusieron en contacto con una suspensión de Agrobacterium en condiciones en las que las bacterias fueran capaces de transferir la secuencia del elemento regulador de la descripción a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa, los embriones inmaduros se sumergieron en una suspensión de Agrobacterium para el inicio de la inoculación. Los embriones se co-cultivaron durante un tiempo con la Agrobacterium (etapa 2: el etapa de co-cultivo). Los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido después de la etapa de infección. Después del período de cocultivo, se llevó a cabo una etapa de “reposo” opcional. En esta etapa de reposo, los embriones se incubaron en presencia de al menos un antibiótico conocido por inhibir el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para transformantes vegetales (etapa 3: etapa de reposo). A continuación, los embriones inoculados se cultivaron en un medio que contenía un agente selectivo, y se recuperaron los callos transformados en crecimiento (etapa 4: la etapa de selección). Las plántulas se regeneraron a partir de los callos (etapa 5: la etapa de regeneración) antes de transferirlas al invernadero.

Ejemplo 4: Análisis de la expresión del elemento regulador del EVCV en cánola

El promotor de EVCV FL (SEQ ID NO: 1) se ensayó en cánola usando el gen GUS como indicador. Se usaron ensayos transitorios de bombardeo biolístico para proporcionar una evaluación inicial del rendimiento. El número de focos de tinción de GUS y la intensidad de la tinción se compararon con el promotor de la ubiqutina-10 de Arabidopsis (AtUBQ10), un promotor fuerte en los tejidos de cánola. El rendimiento del promotor de EVCV FL (SEQ ID NO: 1) fue comparable al de AtUBQ10 en el número de focos y la intensidad de la tinción de GUS.

Se generaron plantas de cánola transgénicas tanto con los vectores EVCV FL:GUS como con AtUBQ10:GUS. La tinción histoquímica de eventos EVCV FL:GUS mostró una alta expresión en hojas y órganos florales. También se observó expresión dirigida de EVCV FL en polen y silicuas. Cuando se comparó con tejido teñido histoquímicamente de plantas AtUBQ10:GUS, EVCV FL fue comparable en hojas y órganos florales. En el polen, la expresión dirigida de EVCV FL fue más débil que AtUBQ10, con alrededor de 10-15% de tinción de los granos de polen. Casi todos los granos de AtUBQ10 se tiñeron de oscuro.

Tabla 3: Resultados de la expresión para el promotor de EVCV FL en cánola

Datos expresados en una escala de 0 a 3, indicando tres una expresión fuerte.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Una construcción de ADN; que comprende:

(a) un elemento regulador seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un polinucleótido con al menos 90 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 y 5, en el que dicho polinucleótido impulsa la expresión de un polinucleótido transcribible ligado operativamente en una planta,

(ii) un polinucleótido con al menos 95 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 y 5, en el que dicho polinucleótido impulsa la expresión de un polinucleótido transcribible ligado operativamente en una planta, y

(iii) el polinucleótido de una cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 y 5; y

(b) una molécula polinucleotídica transcribible heteróloga ligada operativamente al elemento regulador.

2. El constructo de ADN de la reivindicación 1, en el que la molécula polinucleotídica transcribible heteróloga es un gen de interés agronómico.

3. El constructo de ADN de la reivindicación 2, en el que la molécula polinucleotídica transcribible heteróloga es un gen capaz de proporcionar:

(a) resistencia a herbicidas en las plantas; o

(b) control de plagas en las plantas.

4. Una planta o célula vegetal transgénica transformada de manera estable con el constructo de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. La planta o célula vegetal transgénica de la reivindicación 4, en la que la planta o célula vegetal transgénica es:

(a) una planta o célula vegetal monocotiledónea; o

(b) una planta o célula vegetal dicotiledónea.

6. Una parte de la planta transgénica de la reivindicación 4 o 5, en la que la parte de la planta comprende el constructo de ADN.

7. Una semilla de la planta transgénica de la reivindicación 4 o 5, en la que la semilla comprende el constructo de ADN.