CN107771218B - 植物调节元件及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本披露提供了用于调节异源核苷酸序列在植物中的表达的组合物和方法。组合物包含来自泽兰属脉明病毒的用作调节元件的新颖核苷酸序列。提供了使用本文披露的调节元件序列在植物中表达异源核苷酸序列的方法。所述方法包括用有效地连接至本披露的调节元件之一的核苷酸序列转化植物或植物细胞。

Description

植物调节元件及其使用方法

以电子方式提交的序列表的引用

与本说明书一起以计算机可读形式提交的序列表，其文件名为“5971USPSP2_SequenceListing.TXT”，创建于2014年5月22日，并且大小为5.6千字节。该序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用结合在此。

技术领域

本披露涉及植物分子生物学领域，更具体地，涉及植物中基因表达的调节。

背景技术

异源DNA序列在植物宿主中的表达取决于该植物宿主中存在有功能的有效地连接的调节元件。选择的调节元件序列将决定异源DNA序列在生物体内表达的时间和位置。如果期望在特定的组织或器官中表达，则可使用组织偏好的调节元件。如果期望基因响应于刺激而表达，则诱导型调节元件是首选的调节元件。相比之下，如果期望在植物细胞中各处连续表达，则采用组成型启动子。可以在转化载体的表达构建体中包含位于核心调节元件序列上游和/或下游的附加调节序列，以便引起异源核苷酸序列在转基因植物中以不同水平表达。

本领域时常期望在植物中以组成型方式表达DNA序列。例如，可通过遗传操纵植物基因组，使其包含有效地连接至异源病原体抗性基因的组成型调节元件，使得所需的植物组织中产生病原体抗性蛋白，从而使植物对土源和空气源病原体感染的抗性增强。

可替代地，可能需要抑制植物组织内天然DNA序列的表达以实现所需的表型。在这种情况下，可采用下述方式实现这种抑制：转化植物，使植物包含有效地连接至反义核苷酸序列的组成型启动子，使得反义序列表达，产生干扰天然DNA序列的mRNA翻译的RNA转录物。

通过使用基因工程技术遗传地改变植物并且因此产生具有有用性状的植物，这些过程需要可获得多种启动子。在掌握大量启动子的基础上，研究人员可设计出能在细胞中期望的位置以所需水平表达的重组DNA分子。因此，组成型启动子集合在一起，便可使新性状以所需水平在期望的组织中表达。要实现这一点，需分离组成型调节元件并加以表征，用于对植物进行遗传操纵，其中这些组成型调节元件可充当以实测组成型方式表达目的异源核苷酸序列的调节区。

发明内容

提供了用于调节目的异源核苷酸序列在植物或植物细胞中表达的组合物和方法。提供了包含引发转录的调节元件的新型核苷酸序列的DNA分子。在一些实施例中，这种调节元件具有在植物细胞中引发转录的启动子活性。本披露的实施例包含如下序列：在SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6中示出的核酸序列或其互补序列；包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录；以及包含与在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6中示出的序列具有至少85％序列同一性的序列的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录。

提供了一种用于在植物或植物细胞中表达异源核苷酸序列的方法。该方法包括将表达盒引入植物或植物细胞，该表达盒包含有效地连接至本披露的调节元件之一的目的异源核苷酸序列。以此方式，调节元件序列可用于控制有效地连接的异源核苷酸序列的表达。

还提供了一种在植物中以组成型方式表达目的核苷酸序列的方法。该方法包括将表达盒引入植物细胞，该表达盒包含本披露的、有效地连接至目的异源核苷酸序列的调节元件。

目的核苷酸序列的表达可以提供对植物表型的修饰。这种修饰包括调控内源产物的生成(数量、相对分布等方面)或者外源表达产物的生成，以在植物中提供新功能或者产物。在特定的方法和组合物中，目的异源核苷酸序列包含的基因产物赋予除草剂抗性、病原体抗性、昆虫抗性、和/或对盐、寒冷或干旱改变的耐受性。

提供了表达盒，所述表达盒包含本披露的、有效地连接至目的异源核苷酸序列的启动子序列。还另外提供了转化的植物细胞、植物组织、种子和植物。

附图说明

图1示出了泽兰属脉明病毒(Eupatorium Vein Clearing Virus，EVCV)的调节区的结构和调节区的截短。这1104个碱基对的EVCV调节区(FL)由短ORF上游的长基因间区(LIR)的一部分和茎环结构组成。序列从EVCV基因组的最后一个ORF的5’端延伸到3′端。该调节区从5′端被截断(TR)，成为由821bp、514bp、431bp、283bp、和116bp组成的片段。推定的TATA框的位置通过箭头描绘。

图2示出了含1104个碱基对的全长EVCV调节元件的核酸序列(SEQ ID NO：1)。推定的TATA框加了下划线。***的箭头还表示截短的EVCV调节元件的5′端，该截短的EVCV调节元件由以下序列表示：821个碱基对、截短的调节元件EVCV TR1的核酸序列(SEQ ID NO：2)；514个碱基对、截短的调节元件EVCV TR2的核酸序列(SEQ ID NO：3)；431个碱基对、截短的调节元件EVCV TR3的核酸序列(SEQ ID NO：4)；283个碱基对、截短的调节元件EVCV TR4的核酸序列(SEQ ID NO：5)；和116个碱基对、截短的调节元件EVCV TR5的核酸序列(SEQ IDNO：6)。

具体实施方式

本披露涉及针对植物启动子的组合物和方法以及它们的使用方法。这些组合物包含泽兰属脉明病毒(EVCV)调节区的核苷酸序列。这些组合物还包含DNA构建体，这些DNA构建体包含的EVCV调节区的核苷酸序列有效地连接至目的异源核苷酸序列。具体地，本披露提供了分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含在SEQ ID NO：1中示出的核苷酸序列及其片段、变体和互补序列。

本披露的EVCV调节元件序列包含可以在植物中引发转录的核苷酸构建体。在特定实施例中，EVCV调节元件序列允许以组成型方式引发转录。本披露的这类构建体包括与植物发育调节相关的受调节的转录起始区。因此，本披露的组合物包含DNA构建体，这些DNA构建体包含的目的核苷酸序列有效地连接至EVCV调节元件序列。EVCV调节区序列的一个来源在SEO ID NO：1中示出。

本披露的组合物包含EVCV调节元件的核苷酸序列及其片段和变体。在特定实施例中，本披露的调节元件序列可用于以组成型方式表达目的序列。本披露的核苷酸序列还可用于构建表达载体，这些表达载体后续用于在目的植物中表达异源核苷酸序列，或用作探针，来分离其他EVCV样调节元件。

调节元件

调节元件是具有基因调节活性的核酸分子，也就是能够影响有效地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译的核酸分子。因此，术语“基因调节活性”是指通过影响有效地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译，从而影响这种有效地连接的可转录多核苷酸分子表达的能力。基因调节活性可为正性和/或负性，并且所述影响可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应等，还可通过定量指示或定性指示来表征。

调节元件(如启动子、前导序列、内含子和转录终止区)是具有基因调节活性的核酸分子，也是活细胞中基因整体表达不可缺少的一部分。术语“调节元件”是指具有基因调节活性的核酸分子，也就是能够影响有效地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译的核酸分子。因此，可通过基因工程方法，使用在植物中起作用的分离的调节元件(如启动子和前导序列)来改变植物表型。

调节元件可通过其表达模式来表征，即，被表征为组成型，并且/或者通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达模式以及这些特性的任意组合，还可通过定量指示或定性指示来表征。启动子可用作调节元件，用来调控有效地连接的可转录多核苷酸分子的表达。

如本文所用，“基因表达模式”为有效地连接的核酸分子转录成转录的RNA分子的任何模式。表达可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应等，还可通过定量指示或定性指示来表征。转录的RNA分子可被翻译生成蛋白质分子，或可形成反义RNA分子或其他调节RNA分子，如dsRNA、tRNA、rRNA、miRNA等。

如本文所用，术语“蛋白质表达”为转录的RNA分子翻译成蛋白质分子的任何模式。蛋白质表达可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育或形态等，还可通过定量指示或定性指示来表征。

如本文所用，术语“启动子”一般是指参与识别并结合RNA聚合酶II和其他蛋白质(反式作用转录因子)以引发转录的核酸分子。启动子最初可从基因的基因组拷贝的5′非翻译区(5′UTR)分离。可替代地，启动子可为人工合成的DNA分子或受操纵DNA分子。启动子也可为嵌合启动子，也就是通过融合两个或两个以上异源DNA分子而产生的启动子。

在一个实施例中，提供了本文披露的启动子序列的片段。启动子片段可表现启动子活性，并且可单独用于、或与其他启动子和启动子片段结合用于(如)构建嵌合启动子。在特定实施例中，提供了启动子的多个片段，这些片段包含本文披露的具有启动子活性的多核苷酸分子中的至少约50、95、150、250、500或750个连续核苷酸。当将这些片段与参考序列进行最佳比对时，可与参考序列具有至少约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或更高的同一性。

也可分析启动子或启动子片段中是否存在已知的启动子元件，也就是DNA序列特性，诸如TATA框和其他已知的转录因子结合位点基序。本领域技术人员可使用鉴定出的这些已知的启动子元件，来设计与原始启动子具有相似表达模式的启动子变体。

如本文所用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用转录调节元件，亦称顺式元件，其赋予整体表达模式的一个方面，但单靠其通常不足以驱动有效地连接的多核苷酸序列转录。增强子元件与启动子不同，通常不包含转录起始位点(TSS)或TATA框。天然的启动子可包含一个或多个增强子元件，这些增强子元件影响有效地连接的多核苷酸序列转录。分离的增强子元件还可与启动子融合，以产生嵌合启动子顺式元件，该元件赋予整体调控基因表达的一个方面。启动子或启动子片段可包含一个或多个增强子元件，这些增强子元件影响有效地连接的基因转录。据信，许多启动子增强子元件结合DNA结合蛋白并/或影响DNA拓扑结构，从而产生局部构象，选择性地允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板，或有利于在转录起始位点处选择性打开双螺旋。增强子元件可结合调节转录的转录因子。有些增强子元件不止结合一种转录因子，而且转录因子可以不同的亲和力与不止一个增强子结构域相互作用。可采用多种技术鉴定增强子元件，这些技术包括：缺失分析，也就是从启动子5′端或内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNase I足印法、甲基化干扰、电泳迁移率改变测定、通过连接介导PCR执行的体内基因组足印法和其他常规测定进行DNA结合蛋白分析；或者使用已知的顺式元件基序或增强子元件作为靶序列或靶基序，采用常规DNA序列比较方法(如BLAST)进行DNA序列相似性分析。增强子结构域的精细结构可通过一个或多个核苷酸的诱变(或取代)或通过其他常规方法进一步研究。增强子元件可通过化学合成获得，或从包含这种元件的调节元件中分离获得；并且增强子元件可与另外的含有可用限制性酶切位点的侧翼核苷酸一起合成，以便后续操纵。因此，本披露涵盖根据本文所披露的方法设计、构建和使用增强子元件，用于调控有效地连接的可转录多核苷酸分子的表达。

如本文所用，术语“5′非翻译侧翼区”是指从基因的基因组拷贝的5′非翻译区(5′UTR)分离的DNA分子，并且通常被定义为位于转录起始位点(TSS)和蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸区段。这些序列或前导序列可为人工合成的DNA元件或受操纵DNA元件。前导序列可用作5′调节元件，用来调控有效地连接的可转录多核苷酸分子的表达。前导序列分子可与异源启动子或其天然启动子一同使用。因此，本披露的启动子分子能够有效地连接至其天然前导序列，或能够有效地连接至异源前导序列。

如本文所用，术语“嵌合”是指通过将第一个DNA分子与第二个DNA分子融合而生成的单个DNA分子，其中，第一个DNA分子和第二个DNA分子通常都不会以该构型(也就是与另一个DNA分子融合的构型)存在。因此，嵌合DNA分子为通常原本不会天然存在的全新DNA分子。如本文所用，术语“嵌合启动子”是指将DNA分子这样操纵而产生的启动子。嵌合启动子可结合两个或两个以上DNA片段；示例为由启动子与增强子元件融合而成的嵌合启动子。因此，本披露涵盖根据本文所披露的方法设计、构建和使用嵌合启动子，用于调控有效地连接的可转录多核苷酸分子的表达。

应理解，位于编码区序列的内含子内或编码区序列3′的核苷酸序列也可有助于调节目的编码区的表达。合适的内含子的示例包括但不限于玉蜀黍IVS6内含子，或玉蜀黍肌动蛋白内含子。调节元件还可包括那些位于转录起始位点的下游(3′)的元件，或者位于被转录的区域内的元件，或者同时以上两种情况。在本披露的上下文中，转录后调节元件可包括在转录起始之后有活性的元件，例如翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏子以及mRNA稳定性决定子。

可将本披露的调节元件或其变体或片段与异源调节元件或启动子可操作地关联，以便调控异源调节元件的活性。这种调控包括增强或抑制异源调节元件的转录活性、调控转录后事件、或者增强或抑制异源调节元件的转录活性并调控转录后事件。例如，可将本披露的一个或多个调节元件或其片段与组成型、诱导型或组织特异性启动子或其片段可操作地关联，以调控这种启动子在植物细胞中的所需组织内的活性。

本披露涵盖分离的或重组的核酸组合物。“分离的”或“重组的”核酸分子(或DNA)在本文用来指不再处于其天然环境中，例如处于体外的或异源重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。分离的或重组的核酸分子或其生物活性部分，当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或者当用化学法合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。分离的或重组的核酸不含在衍生该核酸的生物体的基因组DNA中天然处于该核酸旁侧的序列(也就是位于该核酸5′和3′端的序列)(最典型地是蛋白质编码序列)。例如，在多个实施例中，分离的核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，该核苷酸序列在衍生出该核酸的细胞的基因组DNA中天然地位于该核酸分子的侧翼。本披露的EVCV调节元件序列可从处于它们各自的转录起始位点旁侧的5′非翻译区分离。

本披露还涵盖所披露的启动子核苷酸序列的片段和变体。具体地，可在本披露的DNA构建体中使用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6的EVCV调节元件序列的片段和变体。如本文所用，术语“片段”是指核酸序列的一部分。EVCV调节元件序列的片段可保留引发转录的生物活性，更具体地，以组成型方式驱动转录的生物活性。可替代地，可用作杂交探针的核苷酸序列片段可以不必保留生物活性。EVCV调节区核苷酸序列的片段范围可从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，最多至本披露的基因启动子区的全长核苷酸序列。

EVCV调节元件的生物活性部分可通过分离本披露的EVCV调节元件序列的一部分，随后评估该部分的启动子活性来制备。作为EVCV调节元件核苷酸序列的片段的核酸分子，包含至少约16、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900或1000个核苷酸，或者最多至本文所披露全长EVCV调节元件序列中存在的核苷酸数(例如，SEQ ID NO：2中的821个核苷酸)。

对于核苷酸序列，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所用，“天然”或“基因组”核苷酸序列包括天然存在的核苷酸序列。就核苷酸序列来说，可使用本领域熟知的分子生物学技术来鉴定天然存在的变体，例如，用下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。核苷酸序列变体还包括人工合成的核苷酸序列，比如那些采用定点诱变技术产生的核苷酸序列。通常，如通过本文别处所描述的序列比对程序和参数确定的，本披露的具体核苷酸序列的变体将与该具体的核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。本披露的核苷酸序列的生物活性变体与该序列不同的核酸残基数可能只有1至15个，只有1至10个，只有6至10个，只有5个，只有4、3、2个，或甚至只有1个。

在一些实施例中，编码调节区的核酸分子是“非基因组核酸序列”。如本文所用，“非基因组核酸序列”是指与天然或基因组核酸序列相比，在核酸序列中具有一个或多个改变的核酸分子。

核苷酸序列变体还涵盖由诱变和引起重组的工序(如DNA改组)产生的序列。采用这种工序时，可操纵EVCV调节元件核苷酸序列，以生成新的EVCV调节元件。以此方式，由一群相关的序列多核苷酸产生重组多核苷酸文库，这些多核苷酸包含具有基本序列同一性并且能够在体外或体内同源重组的序列区域。这种DNA改组的策略在本领域中是已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature[自然]370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.[自然生物技术]15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature[自然]391：288-291；和美国专利号5,605,793和5,837,458。

本披露的核苷酸序列可用于分离来自其他生物，尤其其他植物，更具体地，其他单子叶植物的相应序列。以这种方式，可以使用如PCR、杂交等方法来识别这样的序列(基于其与本文所述序列的序列同源性)。因此，本披露涵盖以与本文所示的完整EVCV调节元件序列或其片段的序列同一性为基础分离的序列。

在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以便从提取自任何目的植物的基因组DNA中扩增出相应DNA序列。用于设计PCR引物以及PCR克隆的方法是本领域通常已知的并且披露于Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版，冷泉港实验室出版社，普莱恩维尤，纽约州)中，下文称“Sambrook”。还参见Innis等人编辑，(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications[PCR方案：方法与应用指南](学术出版社，纽约)；Innis和Gelfand编辑，(1995)PCR Strategies[PCR策略](学术出版社，纽约)；以及Innis和Gelfand编辑，(1999)PCR Methods Manual[PCR方法手册](学术出版社，纽约)。已知的PCR方法包括但不限于：使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，将已知核苷酸序列的全部或一部分用作探针，所述探针与来自所选生物体的一组克隆的基因组DNA片段中存在的其他相应核苷酸序列选择性杂交。杂交探针可以用可检测基团(如P-32)或任何其他可检测标记物进行标记。因此，例如，杂交用探针可通过在本披露的EVCV调节元件序列基础上，对合成的寡核苷酸进行标记来制备。制备用于杂交的探针和用于构建基因组文库的方法通常是本领域已知的，并且披露在Sambrook中。

例如，本文所披露的完整EVCV调节元件序列或其一个或多个部分，可用作能够与相应的EVCV调节元件序列和信使RNA特异性杂交的探针。要在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包含的序列是EVCV调节元件序列中独一无二的，并且其长度为至少约10个核苷酸或者其长度为至少约20个核苷酸。可采用PCR，用此类探针由选择的植物扩增相应的EVCV调节元件序列。这项技术可以用于来从所需生物体分离另外的编码序列，或者用作诊断测定法以确定编码序列在生物体中的存在。杂交技术包括铺板的DNA文库的杂交筛选(斑块或群落；参见例如，Sambrook)。

这样的序列的杂交可以在严格条件下进行。术语“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶序列杂交的程度比其与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以识别与该探针100％互补的靶序列(同源探测)。可替代地，也能够调节严格条件以允许序列中的某些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。探针长度通常小于约1000个核苷酸，最佳地，其长度小于500个核苷酸。

典型地，严格条件将是以下条件，在这些条件下该盐浓度在pH 7.0至8.3下是小于约1.5M Na离子、典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐类)，并且温度对于短探针(例如，10至50个核苷酸)为至少约30℃，而对于长探针(例如，超过50个核苷酸)为至少约60℃。通过添加去稳定试剂(例如，甲酰胺)也可以实现严格的条件。示例性低严格条件包括在37℃下用30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并且在50℃至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCI/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，并且在55℃至60℃下在0.5X至1.0X SSC中洗涤。示例性高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在60℃至65℃下在0.1X SSC中最后洗涤至少约30分钟的持续时间。杂交持续时间通常小于约24小时，通常为约4至约12小时。洗涤的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。

特异性典型地取决于杂交后洗涤的功能，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。就DNA-DNA杂交体来说，可根据Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.[分析生物化学]138：267-284中提出的方程Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L来计算Tm(热解链温度)；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L为杂合体的碱基对长度。Tm是温度(在定义的离子强度以及pH下)，在该温度下50％的互补靶序列杂交到完全配对的探针上。对于每1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以与所期需同一性的序列杂交。例如，如果查找具有＞90％同一性的序列，该Tm可以降低10℃。通常情况下，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。然而，极严格条件可以利用比Tm低1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比Tm低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比Tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的杂交和/或洗涤。使用方程式、杂交和洗涤组合物以及所需的Tm，本领域普通技术人员将理解，本质上描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果所希望的错配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高温度。对核酸杂交的全面指导见于以下文献：Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes[生物化学与分子生物学技术-与核酸探针的杂交]，第I部分，第2章(Elsevier[爱思唯尔]，纽约)；以及Ausubel等人编辑，(1995)Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学当前方案]，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience[格林出版与威利交叉科学出版社]，纽约)。还可参见Sambrook。

因此，本披露涵盖具有组成型启动子活性的分离序列，这种分离序列在严格条件下与本文所披露的EVCV调节元件序列或其片段杂交。

下列术语用来描述两种或更多种核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参比序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”，和(e)“实质同一性”。

(a)如在此使用，“参考序列”是用作序列比较的基础的所定义的序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段、或完整的cDNA或基因序列。

(b)如在此使用，“比较窗口”参考了多核苷酸序列的连续并指定的区段，其中与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列可能包括添加或缺失(即空位)。通常，比较窗口的长度为至少20个连续核苷酸，并且任选地可以是30、40、50、100个或更长。本领域技术人员应当理解，由于多核苷酸序列中含有缺口，为了避免与参比序列的高相似性，典型地引入缺口罚分，并且将其从匹配数中减去。

用于比较的序列比对的方法是本领域熟知的。因此，任意两个序列之间的百分序列同一性的测定能够用一种数学算法进行。此类数学算法的非限制性实例是Myers和Miller(1988)在CABIOS 4：11-17中的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2：482中的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：443-453中的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.[国家科学院院刊]85：2444-2448中的搜索局部比对方法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]872264中的算法；如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90：5873-5877中修改的。

这些数学算法的计算机实现可以用于序列比较，来确定序列同一性。此类执行包括但不限于：PC/Gene程序(可从智能遗传学公司(Intelligenetics)，山景城，加利福尼亚州购买)中的CLUSTAL；ALIGN程序(版本2.0)以及GCG威斯康辛遗传软件包版本10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、以及TFASTA(可从材料科学软件公司(Accelrys Inc.)，9685斯克兰顿路，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国获得)。使用这些程序的比对可以使用默认参数进行。以下各项充分描述了CLUSTAL程序：Higgins等人(1988)Gene[基因]73：237-244(1988)；Higgins等人(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.[核酸研究]16：10881-90；Huang等人(1992)CABIOS 8：155-65；以及Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.[分子生物学方法]24：307-331。ALIGN程序基于Myers与Miller(1988)同上的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可以使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12、缺口罚分为4。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403中提出的BLAST程序基于上文Karlin和Altschul(1990)中的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序，得分＝100，字长＝12来进行，以获得与编码本披露蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以使用BLASTX程序，得分＝50，字长＝3来进行，以获得与本披露的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为获得空位比对结果进行比较，可按Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25：3389中所述，利用空位BLAST(在BLAST 2.0中)可替代地，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可以用于进行检测分子之间远缘关系的迭代搜索。参见Altschul等人(1997)，同上。当使用BLAST、缺口BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各自程序的默认参数(例如，用于核苷酸序列的BLASTN、用于蛋白质的BLASTX)。参见美国国家生物技术信息中心的网站。比对也可以通过检查手动进行。

除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用采用以下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：核苷酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵。“等效的程序”意在是任何序列比较程序，该程序对于任何两个所讨论的序列产生一个比对，当与GAP版本10所产生的对应的比对相比较时，该比对具有相同的核苷酸或氨基酸残基配对以及相同的百分比序列同一性。

GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：443-453中的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大、空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许以匹配碱基单位提供空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP必须为它***的每个空位获取空位产生罚分匹配数目的收益。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP必须另外地为每个所***空位获取空位长度乘以空位延伸罚分的收益。在GCG威斯康辛遗传软件包的版本10中，蛋白质序列默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生和空位延伸罚分可以表示为选自下组的整数，该组由0至200组成。因此，例如，空位产生和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP代表最佳比对家族的一个成员。可以存在这个家族的许多成员，但是其他成员没有更好的品质。GAP展现出四个比对优值：质量、比率、同一性、和相似性。为了比对序列，质量是是最大化的度量。比率是质量除以更短区段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。空位对面的符号被忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于相似性阈值0.50时，相似性得分。GCG Wisconsin GeneticsSoftware Package[GCG威斯康辛州遗传学软件包]的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89：10915)。

(c)如本文所用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指，当在指定比较窗口上比对最大对应性时，两个序列中的相同残基。当使用关于蛋白质的序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置通常相差保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，并且因此不改变分子的功能性质。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调节序列同一性百分比，以校正该取代的保守性质。相差这些保守取代的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调节的方法是本领域技术人员熟知的。典型地，这涉及作为部分而不是完全错配对保守取代打分，从而提高百分比序列同一性。因此，例如，当相同的氨基酸得分为1，并且非保守取代的得分为零时，保守取代的得分在零和1之间。计算保守取代的评分，例如，如在程序PC/GENE(智能遗传学公司(Intelligenetics)，山景城，加利福尼亚州)中实现的。

(d)如本文所用，“序列同一性百分比”意指在比较窗口上比较两个最佳比对序列所确定的值，其中与参比序列(其不包含添加或缺失)相比，该比较窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即空位)，以进行这两个序列的最佳比对。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将该结果乘以100以产生序列同一性百分比。

(e)术语多核苷酸序列的“实质同一性”意指，使用所描述的比对程序之一使用标准参数与参比序列比较时，多核苷酸包含具有至少70％、至少80％、至少90％、和至少95％序列同一性的序列。

核苷酸序列实质相同的另一个指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。通常，严格条件被选择为在定义的离子强度和pH下比指定序列的Tm低约5℃。然而，严格条件涵盖比Tm低约1℃至约20℃范围的温度，这取决于如本文其他部分确定的所需的严格程度。

如本文所使用的，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、可再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分(如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果、核、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等)中完好的植物细胞。谷物意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本披露的范围内，前提条件是这些部分包含引入的多核苷酸。

本披露可用于任何植物物种(包括但不限于单子叶植物和双子叶植物)的转化。植物物种的实例包括玉米(玉蜀黍)，芸苔属(例如，甘蓝型油菜、芜菁、芥菜)(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))，稻(rice，Oryzasativa)，黑麦(rye，Secale cereale)，高粱(甜高粱(Sorghum bicolor)，高粱(Sorghumvulgare))，粟(例如，珍珠粟(御谷(Pennisetum glaucum))，黍(粟米(Panicummiliaceum))，粟(谷子(Setaria italica))，穇子(龙爪稷(Eleusine coracana))，向日葵(sunflower，Helianthus annuus)，红花(safflower，Carthamus tinctorius)，小麦(wheat，Triticum aestivum)，大豆(soybean，Glycine max)，烟草(tobacco，Nicotianatabacum)，马铃薯(potato，Solanum tuberosum)，花生(peanut，Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)，陆地棉(Gossypium hirsutum))，甘薯(番薯(Ipomoeabatatas))，木薯(cassava，Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属(Coffea spp.))，椰子(coconut，Cocos nucifera)，菠萝(pineapple，Ananas comosus)，柑橘树(柑橘属(Citrusspp.))，可可(cocoa，Theobroma cacao)，茶树(tea，Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉属(Musa spp.))，鳄梨(avocado，Persea americana)，无花果(fig(Ficus casica))，番石榴(guava，Psidium guajava)，芒果(mango，Mangifera indica)，橄榄(olive，Oleaeuropaea)，木瓜(番木瓜(Carica papaya))，腰果(cashew，Anacardium occidentale)，澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)，巴旦杏(almond，Prunus amygdalus)，甜菜(sugar beets，Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属(Saccharum spp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣(Lactucasativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(lima bean，Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus spp.))和黄瓜属的成员诸如黄瓜(cucumber，C.sativus)、香瓜(cantaloupe，C.cantalupensis)和甜瓜(musk melon，C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属(Rhododendron spp.))、绣球花(hydrangea，Macrophylla hydrangea)、木槿(hibiscus，Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属(Tulipa spp.))、水仙(水仙属(Narcissus spp.))、泽兰属(Eupatorium hybrida)、康乃馨(carnation，Dianthus caryophyllus)、一品红(poinsettia，Euphorbia pulcherrima)和菊花。

可以用于实施本披露的针叶树包括，例如，松树如火炬松(火炬松(Pinustaeda))、湿地松(湿地松(Pinus elliotii))、杰克松(西黄松(Pinus ponderosa))、美国黑松(扭叶松(Pinus contorta))和辐射松(辐射松(Pinus radiata)；黄杉(黄杉(Pseudotsuga menziesii))；西部铁杉(加拿大铁杉(Tsuga canadensis))；西加云杉(白云杉(Picea glauca))；红木树(北美红杉(Sequoia sempervirens))；冷杉如银杉(胶冷杉(Abies amabilis))和胶枞(香脂冷杉(Abies balsamea))；和香柏如美国西部侧柏(北美乔柏(Thuja plicata))和阿拉斯加黄杉(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。在特定实施例中，本披露的植物是作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，并且在仍然其他的实施例中，玉米植物是最佳的。

其他目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、滨豆、鹰嘴豆、等等。

如本文所用，术语“可转录多核苷酸分子”是指任何能够被转录为RNA分子的DNA分子，包括但不限于那些具有蛋白质编码序列的DNA分子，和那些具有可用于抑制基因的序列的DNA分子。“转基因”是指与宿主细胞异源的可转录多核苷酸分子和/或被人工掺入宿主细胞基因组的可转录多核苷酸分子。

本发明的调节元件能够有效地连接至相对调节分子为异源的可转录多核苷酸分子。如本文所用，术语“异源”是指两个或两个以上多核苷酸分子的组合，这种组合通常不存在于自然界中。举例来说，这两个分子可源自不同物种，并且/或者这两个分子可源自不同基因(例如，源自相同物种的不同基因，或源自不同物种的相同基因)。因此，如果这种组合通常不存在于自然界中，则调节元件相对于有效地连接的可转录多核苷酸分子是异源的，即，所述可转录多核苷酸分子不会天然与所述调节元件分子以有效地连接方式组合在一起。

可转录多核苷酸分子通常可为表达RNA转录物所需的任何DNA分子。RNA转录物的这种表达可导致得到的mRNA分子翻译，因而导致蛋白质表达。可替代地，可将可转录多核苷酸分子设计成最终导致特定基因或蛋白质的表达降低。这一点可通过使用以反义方向取向的可转录多核苷酸分子来实现。本领域的普通技术人员很熟悉这种反义技术的步骤。简言之，在转录可转录的反义多核苷酸分子时，RNA产物在细胞内与互补RNA分子杂交，并将互补RNA分子隔离。这种双螺旋RNA分子不能通过细胞的翻译机制翻译为蛋白质，随后在细胞内降解。可采用这种方式负调节任一种基因。

因此，本发明的一个实施例是本发明的调节元件，诸如SEQ ID NO：1-6示出的那些调节元件，这些调节元件有效地连接至可转录多核苷酸分子，这样一来，一旦所述构建体被引入植物细胞，这些调节元件便可按期望水平或按期望模式调控可转录多核苷酸分子的转录。在一个实施例中，可转录多核苷酸分子包含基因的蛋白质编码区，并且启动子影响RNA分子转录，继而影响RNA分子被翻译和表达为蛋白质产物。在另一个实施例中，可转录多核苷酸分子包含基因的反义区域，并且启动子影响反义RNA分子或其他相似的抑制性RNA分子的转录，从而抑制靶宿主细胞中目的特定RNA分子的表达。

由本披露的EVCV调节元件表达的可转录多核苷酸分子可用于改变植物的表型。表型的各种变化值得关注，包括更改基因的表达、改变植物对病原体或昆虫的防御机制、提高植物在植物中对除草剂的耐受性、改变根发育以应对环境胁迫、调控植物对盐、温度(热和寒冷)、干旱的响应等等。这些结果可通过表达包含适当基因产物的目的异源核苷酸序列来获得。在特定实施例中，目的异源核苷酸序列是在植物或植物部分中表达水平提升的植物内源序列。可替代地，这些结果可以通过引起植物中一种或多种内源基因产物，尤其酶、转运蛋白或辅因子的表达降低或者通过影响植物中营养物摄取来实现。这些改变导致转化的植物表型上的变化。

农学目的基因

可转录多核苷酸分子可以是农学目的基因。如本文所用，术语“农学目的基因”是指当在特定的植物组织、细胞或细胞类型中表达时，提供与植物形态、生理、生长、发育、产量、产物、营养分布、疾病或有害生物抗性和/或环境或化学耐受性相关的所需特征的可转录多核苷酸分子。农学目的基因包括但不限于：编码产量蛋白、应激抗性蛋白、发育控制蛋白、组织分化蛋白、分生组织蛋白、环境响应蛋白、衰老蛋白、激素响应蛋白、脱落蛋白、来源蛋白、SINK蛋白、花控制蛋白、种子蛋白、除草剂抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、杀有害生物蛋白或任何其他试剂(如靶向抑制特定基因的反义或RNAi分子)的那些基因。农学目的基因的产物可在植物体内起作用，影响植物的生理或代谢；或可充当杀有害生物剂，杀灭以植物为食的有害生物。

在一个实施例中，将本披露的调节元件掺入构建体，使该调节元件有效地连接至作为农学目的基因的可转录多核苷酸分子。为赋予植物农学有益性状，期望农学目的基因表达。有益农学性状可以例如是但不限于：除草剂耐受性、昆虫防治、产量改良、真菌疾病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌疾病抗性、植物生长和发育、产生淀粉、油产量改良、高油产量、脂肪酸含量改良、高蛋白质产量、果实成熟、动物和人类营养提高、产生生物聚合物、环境压力抗性、产生药用肽类和可分泌肽类、加工性状改良、可消化性改良、产生酶、产生香气、固氮性、杂交制种、产生纤维、产生生物燃料。

昆虫抗性基因可以编码针对会破坏和导致产量降低的有害生物的抗性，所述有害生物诸如是根虫、切根虫、欧洲玉米螟等。此类基因包括，例如，苏云金芽孢杆菌毒性蛋白基因(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene[基因]48：109)；等。

编码疾病抗性性状的基因包括解毒基因，例如对伏马菌素解毒的那些基因(美国专利号5,792,931)；无毒力(avr)基因和疾病抗性(R)基因(Jones等人(1994)Science[科学]266：789；Martin等人(1993)Science[科学]262：1432；和Mindrinos等人(1994)Cell[细胞]78：1089)；等。

除草剂抗性性状可以包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)之作用的除草剂的抗性的基因，特别是磺酰脲型除草剂(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)；编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的抗性的基因，诸如草胺膦或basta(例如bar基因)；草甘磷(如，EPSPS基因和GAT基因；参见例如美国专利公开号20040082770和WO03/092360)或本领域已知的其他此类基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，以及ALS-基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。

草甘磷抗性由突变的5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP)基因和aroA基因赋予。参见，例如Shah等人的美国专利号4,940,835，其披露了EPSPS形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。Barry等人的美国专利号5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。还可参见美国专利号6,248,876 B1、6,040,497、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、5,312,910、5,188,642、4,940,835、5,866,775、6,225，114 B1、6,130,366、5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,448、5,510,471、Re.36,449、RE 37,287 E和5,491,288；以及国际公布WO 97/04103、WO 97/04114、WO 00/66746、WO 01/66704、WO 00/66747和WO 00/66748，出于此目的将这些专利以引用方式结合于本文。还给予植物草甘磷抗性，使该植物表达编码草甘磷氧化还原酶的基因，这在美国专利号5,776,760和5,463,175中进行了更全面地描述，为此目的将这两份专利以引用方式并入本文。另外，可通过过量表达编码草甘磷N-乙酰转移酶的基因，来给予植物草甘磷抗性。参见，例如美国专利7,714,188和7,462,481。

监管部门批准的农学目的基因是本领域技术人员所熟知的，并且可以在环境风险评估中心(cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database，可以使用www前缀进行访问)和国际农业生物工程应用技术采购管理局(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，可以使用www前缀进行访问)中找到。

外源产物包括植物酶和植物产物，以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些产物。此类产物包括酶、辅因子、激素等。

其他适用基因及其相关表型的示例包括编码病毒外壳蛋白和/或RNA的基因或者赋予病毒抗性的其他病毒基因或者植物基因；赋予真菌抗性的基因；促进产量提高的基因；以及提供针对胁迫的抗性的基因，所述胁迫诸如为寒冷、因干旱、热和盐度引起的脱水、有毒金属或者痕量元素等。

如上所述，与本文披露的EVCV调节元件有效地连接的异源核苷酸序列可以是靶向基因的反义序列。因此，本文披露的启动子序列可以有效地连接至反义DNA序列，以降低或抑制植物根中天然蛋白的表达。

“RNAi”是指用于降低基因表达的一系列相关技术(参见例如美国专利号6,506,559)。由其他名称所指的较老技术现在据认为基于相同的机制，不过在文献中被赋予不同的名称。这些名称包括“反义抑制”，即产生能够抑制目标蛋白质的表达的反义RNA转录物，以及“共抑制”或“正义抑制”，指产生能够抑制相同的或者实质上相似的外来基因或者内源基因的表达的正义RNA转录物(美国专利号5,231,020，以引用方式结合至本文)。这种技术依赖于使用能导致积累这样的双链RNA的构建体，该双链RNA中的一条链与要沉默的靶基因互补。各实施例的EVCV调节元件可用来驱动将会导致RNA干扰的构建体(包括微RNA和siRNA)表达。

本披露的调节元件序列或其变体或片段有效地连接至目的异源核苷酸序列时，可驱动该异源核苷酸序列在表达该构建体的植物中以组成型方式表达。“异源核苷酸序列”是不与本披露的调节元件序列一同天然存在的序列。虽然这种核苷酸序列对调节元件序列来说是异源的，但相对植物宿主可以是同源的或者说是天然的，也可以是异源的或者说是外来的。

可对本披露的分离的调节元件序列进行修饰，使所述异源核苷酸序列以一系列水平表达。因此，可利用完整调节元件区域的一部分，且驱动目的核苷酸序列表达的能力得到保持。应认识到，可采用不同方式缺失掉调节元件序列的一部分，来改变mRNA的表达水平。如果(例如)在截短过程中移除(阻遏蛋白的)负调节元件，则因调节元件缺失，mRNA表达水平可能降低，或者可替代地，其表达可能增加。通常，使用至少约20个核苷酸的分离的调节元件序列来驱动核苷酸序列表达。

应认识到，为提高转录水平，可将增强子与本披露的调节元件区域结合使用。增强子是起增加调节元件区域表达的作用的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，包括SV40增强子区、35S增强子元件等。我们还知道，有些增强子可改变调节元件正常的表达模式，例如通过引起调节元件驱动组成型方式表达，没有该增强子时，同一调节元件只在一个特定组织或一些特定组织中驱动表达。

对本披露的分离的调节元件序列进行修饰，可使异源核苷酸序列以一系列水平表达。因此，可将这些调节元件序列修饰为弱启动子或强启动子。通常，“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。“低水平”表达意指以约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平表达。相反地，强启动子以高水平或者说以约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物的水平驱动编码序列的表达。

已经认识到，本披露的EVCV调节元件可用来增加或减少表达，从而导致转化植物的表型改变。这种表型变化可能进一步影响已转化植物的组织中金属离子水平的增加或减少。

本披露的核苷酸序列以及其变体和片段可用于对植物进行遗传操纵。EVCV调节元件序列在与待控制其表达以实现所需表型响应的异源核苷酸序列有效地连接时，可用于这个方面。术语“有效地连接的”，意指异源核苷酸序列的转录或翻译受调节元件序列的影响。以此方式，可将本披露的调节元件的核苷酸序列与目的异源核苷酸序列一同在表达盒中提供，以便在目的植物中，更具体地，在植物的根中表达。

在DNA构建体中提供实施例的调节序列，用于在目的生物体中表达。如本文所用，“表达盒”意指包含本披露实施例的调节元件序列的DNA构建体，其中该调节元件序列有效地连接至编码目的多肽的异源多核苷酸。这种表达盒包含转录起始区，该转录起始区包含有效地连接至异源核苷酸序列的本披露的调节元件核苷酸序列之一或其变体或片段。这种表达盒可具有多个限制位点，用于使***该核苷酸序列的过程受调节区的转录调节。表达盒可另外含有选择性标记基因以及3′终止区。

表达盒在转录的5′-3′方向上可包含转录起始区(即本披露的启动子或其变体或片段)、翻译起始区、目的异源核苷酸序列、翻译终止区，并且任选地包含在宿主生物中有功能的转录终止区。实施例的调节区(即启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是天然的/类似的。可替代地，实施例的调节区和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是异源的。如本文所使用的，关于序列的“异源的”是指该序列源于外来物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，有效地连接至异源多核苷酸的启动子来自与从其衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方基本上由它们的原来形式和/或基因组基因座修饰得到，或者该启动子不是被有效地连接的多核苷酸的天然启动子。

终止区对于转录起始区可以是天然的，对于有效地连接的目的DNA序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可能源自另一种来源(即，对于启动子、被表达的DNA序列、植物宿主或其任何组合来说为外源的或异源的)。方便的终止区可获得自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]262：141-144；Proudfoot(1991)Cell[细胞]64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.[基因与发育]5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene[基因]91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：7891-7903；以及Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.[核酸研究]15：9627-9639。

包含本披露的序列的表达盒还可含有要共转化到该生物体中的基因的至少一条另外的核苷酸序列。可替代地，所述一条或多条另外的核苷酸序列可以在另一表达盒中提供。

在适当的情况下，可以优化其表达待处于本披露的组成型启动子序列控制下的核苷酸序列和任何另外的一条或多条核苷酸序列，以便在转化的植物中增加表达。也就是说，可使用植物偏好的密码子来合成这些核苷酸序列，从而改进表达。有关宿主偏好密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.[植物生理学]92：1-11。本领域中可获得用于合成植物偏好基因的方法。参见例如，美国专利号5,380,831，5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498，这些文献通过引用结合在此。

已知另外的序列修饰以增强细胞宿主中的基因表达。这些包括：消除编码假的聚腺苷酸化信号和外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列、及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可以将异源核苷酸序列的G-C含量调整至给定细胞宿主的平均水平，所述平均水平通过参考该宿主细胞中表达的已知基因来计算。当可能时，修饰序列以避免出现预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒可以另外包含5′前导序列。这些前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区；Elroy Stein等人(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86：6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒；Allison等人(1986)Virology[病毒学]154：9 20)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)、人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature[自然]353：90-94)；来自苜蓿花叶病病毒的外壳多肽mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA4)(Jobling等人(1987)Nature[自然]325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)，Molecular Biology of RNA[RNA的分子生物学]，第237-256页)；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人(1991)Virology[病毒学]81：382-385)。还可参见Della Cioppa等人(1987)PlantPhysiology[植物生理学]84：965-968。也可采用已知的用来提高mRNA稳定性的方法，例如内含子，诸如玉蜀黍泛素内含子(Christensen和Quail(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5：213-218；Christensen等人(1992)Plant Molecular Biology[植物分子生物学]18：675-689)或者玉蜀黍AdhI内含子(Kyozuka等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]228：40-48；Kyozuka等人(1990)Maydica[美迪卡杂志]35：353-357)等等。

在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当方向以及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制位点、移除多余的DNA、移除限制位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。

可以在表达盒中包含报道基因或者选择性标记基因。本领域已知的合适报道基因的实例可以见于(例如)以下文献：Jefferson等人(1991)，Plant Molecular BiologyManual[植物分子生物手册]，Gelvin等人编辑(Kluwer Academic Publishers[克吕韦尔学术出版集团])，第1-33页；DeWet等人(1987)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]7：725-737；Goff等人(1990)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]9：2517-2522；Kain等人(1995)BioTechniques[生物技术]19：650-655；和Chiu等人(1996)Current Biology[当代生物学]6：325-330。

用于选择转化细胞或者组织的选择性标记基因可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的选择性标记基因的实例包括但不限于：编码针对以下各项具有抗性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等人(1983)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]2：987-992)；甲氨喋呤(Herrera Estrella等人(1983)Nature[自然]303：209-213；Meijer等人(1991)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]16：807-820)；潮霉素(Waldron等人(1985)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]5：103-108；和Zhijian等人(1995)Plant Science[植物科学]108：219-227)；链霉素(Jones等人(1987)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5：131-137)；博来霉素(Hille等人(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]7：171-176)；磺酰胺(Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15：127-136)；溴苯腈(Stalker等人(1988)Science[科学]242：419-423)；草甘膦(Shaw等人(1986)Science[科学]233：478-481；以及美国申请序列号10/004,357和10/427,692)；草胺膦(DeBlock等人(1987)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]6：2513-2518)。

可以在回收转基因事件中发挥作用但在最终产物中可能不需要的其他基因将包括但不限于诸如以下示例：GUS(β-葡糖醛酸酶；Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.[植物分子生物学导报]5：387)，GFP(绿色荧光蛋白；Chalfie等人(1994)Science[科学]263：802)，荧光素酶(Riggs等人(1987)Nucleic Acids Res.[核酸研究]15(19)：8115以及Luehrsen等人(1992)Methods Enzymol.[酶学方法]216：397-414)，以及编码花青素生产的玉蜀黍基因(Ludwig等人(1990)Science[科学]247：449)。

包含本披露的有效地连接至目的核苷酸序列的EVCV调节元件的表达盒可用于转化任何植物。以此方式，可以获得基因修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子、根等。

本披露的方法涉及将多肽或者多核苷酸引入到植物中。“引入”旨在意指以这样一种方式将多核苷酸或多肽提供于植物中以致于该序列得以进入该植物的细胞内部。本披露的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，该方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

“稳定转化”旨在意指被引入植物中的核苷酸构建体整合到该植物的基因组中并且能够由其子代继承。“瞬时转化”旨在意指将多核苷酸引入植物中并且不整合到植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。

转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可根据要靶向转化的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)而变化。将核苷酸序列引入植物细胞中并随后***植物基因组中的合适方法包括：显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques[生物技术]4：320 334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]83：5602 5606)、农杆菌介导的转化(Townsend等人，美国专利号5,563,055和Zhao等人，美国专利号5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717 2722)、和弹道粒子加速法(参见例如美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes等人(1995)在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基础方法]中，Gamborg和Phillips编辑(施普林格出版公司(Springer-Verlag)，柏林)；McCabe等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：923 926)；和Lec1转化法(WO 00/28058)。也参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22：421 477；Sanford等人(1987)Particulate Science andTechnology[微粒科学与技术]5：27 37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87：671 674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology[生物学/技术]6：923 926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞与发育生物学]27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：736 740(水稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85：4305 4309(玉蜀黍)；Klein等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：559 563(玉蜀黍)；美国专利号5,240,855、5,322,783、和5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440 444(玉蜀黍)；Fromm等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：833 839(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)在The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[卵巢组织的实验操作]中Chapman等人编辑(纽约朗文出版社(Longman，New York))第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports[植物细胞报告]12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany[植物学年鉴]75：407-413(水稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(maize via Agrobacterium tumefaciens[经由根癌农杆菌的玉蜀黍])；所有这些文献通过引用结合在此。

在特定实施例中，可使用多种瞬时转化方法将包含本披露的调节元件序列的DNA构建体提供给植物。这类瞬时转化方法包括但不限于病毒载体***，和以阻止DNA后续释放的方式沉淀多核苷酸。因此，虽然从粒子结合的DNA进行转录仍可能发生，但这种DNA释出继而整合到基因组中的频率会大大降低。此类方法包括使用涂覆有聚乙烯亚胺的粒子(PEI；Sigma-Aldrich^TM#P3143)。

在其他实施例中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触，来将本披露的多核苷酸引入植物。通常，这类方法涉及将本披露的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内。涉及病毒DNA或RNA分子、用于将多核苷酸引入植物并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta等人(1996)Molecular Biotechnology[分子生物技术]5：209-221；这些文献通过引用结合在此。

用于在植物基因组中特定位置处靶向***多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，使用位点特异性重组***实现多核苷酸在希望的基因组位置的***。参见例如WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855和WO 99/25853，以上各项均通过引用并入本文。简言之，可以在转移盒中包含本披露的多核苷酸，所述转移盒侧接两个不相同的重组位点。将转移盒引入植物中，该植物已经稳定地将靶位点并入其基因组，该靶位点侧接对应转移盒位点的两个不相同重组位点。提供了适当的重组酶，并且将该转移盒整合至靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中特定的染色***置。

已经转化的细胞可以按照常规方法生长为植物。参见例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报告]5：81-84。然后可以培育这些植株，用相同的转化株系或者不同的株系授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得杂交体。可以培育两代或更多代植株，确保所希望的表型特征的表达得到稳定保持和遗传，并且然后收获种子，确保已实现所希望的表型特征的表达。以此方式，本披露提供了基因组中稳定掺入了本披露的核苷酸构建体(例如本披露的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。

在一个实施例中，可以使用CRISPR/Cas9***通过基因组编辑来编辑或***EVCV调节元件序列。

CRISPR基因座(规律间隔成簇短回文重复序列)(又称SPIDR--间隔区散在同向重复序列)构成最近描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由部分回文的短而高度保守的DNA重复序列(通常为24至40bp，重复从1至140次，也称为CRISPR重复序列)组成。重复序列(通常具有物种特异性)由恒定长度的可变序列(通常为20至58，依赖于CRISPR基因座(WO2007/025097，2007年3月1日公布))间隔。

CRISPR基因座首次在大肠杆菌中被识别(Ishino等人(1987)J.Bacterial.[细菌学杂志]169：5429-5433；Nakata等人(1989)J.Bacterial.[细菌学杂志]171：3553-3556)。相似的间隔短序列重复序列已经在地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鱼腥藻属(Annabaena)、和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)中被鉴定出(Groenen等人(1993)Mol.Microbiol.[分子微生物学]10：1057-1065；Hoe等人(1999)Emerg.Infect.Dis.[新兴传染病]5：254-263；Masepohl等人(1996)Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]1307：26-30；Mojica等人(1995)Mol.Microbiol.[分子微生物学]17：85-93)。该CRISPR基因座与其他SSR的不同之处在于重复序列的结构，该结构已经称为短规律间隔重复序列(SRSR)(Janssen等人(2002)OMICSJ.Integ.Biol.[组学：整合生物学杂志]6：23-33；Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.[分子微生物学]36：244-246)。重复序列是以成簇形式发生的短元件，这些短元件总是由以恒定长度的可变序列规律地间隔开(Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.[分子微生物学]36：244-246)。

Cas基因涉及通常与侧翼CRISPR基因座偶合、相关或相近或相邻的基因。术语“Cas基因”、“CRISPR相关(Cas)基因”在本文中可互换使用。对Cas蛋白家族的全面综述呈现于以下文献中：Haft等人，(2005)Computational Biology[计算生物学]，PLoS Comput Biol[PLoS计算生物学]1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060。如其中所述，除了四个先前已知的基因家族之外，还描述了41个CRISPR相关(Cas)基因家族。它表明CRISPR***属于不同类别，具有不同的重复模式、基因组和种类范围。在给定的CRISPR基因座处的Cas基因数目在物种之间可以不同。

Cas内切核酸酶涉及由Cas基因编码的Cas蛋白质，其中所述Cas蛋白质能够将双链断裂引入DNA靶序列中。Cas内切核酸酶由指导多核苷酸指导以识别并任选地在特定靶位点向细胞基因组中引入双链断裂(参见2014年7月11日提交的美国临时申请号62/023239)。指导多核苷酸/Cas内切核酸酶***包括能够将双链断裂引入DNA靶序列的Cas核酸内切酶和指导多核苷酸的复合物。Cas内切核酸酶在基因组靶位点附近解开DNA双链体，并且如果正确的前间区序列邻近基序(PAM)大致定向在靶序列的3’端，则当通过指导RNA识别靶序列时，切割两条DNA链。

Cas内切核酸酶基因可以是Cas9内切核酸酶或其功能片段，例如但不限于在2007年3月1日公开的WO 2007/025097中的SEQ ID NO：462、474、489、494、499、505、和518列出的Cas9基因。Cas内切核酸酶基因可以是植物、玉蜀黍或大豆优化的Cas9内切核酸酶，例如但不限于可以识别N(12-30)NGG形式的任何基因组序列的植物密码子优化的酿脓链球菌Cas9基因。可以通过在本领域已知的任何方法将该Cas内切核酸酶直接引入细胞，这些方法例如但不限于，瞬时引入方法、转染、和/或局部施用。

如在此所用，术语“指导RNA”涉及两个RNA分子、包含可变靶向结构域的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA的合成性融合。在一个实施例中，该指导RNA包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域和可以与Cas内切核酸酶相互作用的RNA片段。

如在此使用，术语“指导多核苷酸”涉及可以与Cas内切核酸酶形成复合物，并且使得Cas内切核酸酶能够识别并任选地切割DNA靶位点的多核苷酸序列(2014年6月11日提交的美国临时申请号62/023239)。指导多核苷酸可以是单分子或双分子。指导多核苷酸序列可以是RNA序列、DNA序列或其组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，指导多核苷酸可以包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，例如但不限于锁核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2′-氟代A、2’-氟代U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5′至3′共价连接。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指导RNA”。

指导多核苷酸可以是双分子(也称为双链体指导多核苷酸)，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。双分子指导多核苷酸的CER结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独的分子。两个单独的分子可以是RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。在一些实施例中，包含连接到CER结构域的VT结构域的双链体指导多核苷酸的第一个分子被称为“crDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时)。cr核苷酸可以包括在细菌和古细菌中天然存在的cRNA的片段。在一个实施例中，存在于在此披露的cr核苷酸中的细菌和古细菌中天然存在的cRNA的片段的大小范围可以是，但并不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施例中，包含CER结构域的双链体指导多核苷酸的第二个分子被称为“tracrRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时)。在一个实施例中，指导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA是包含双链体crRNA-tracrRNA的双链体的RNA。

指导多核苷酸还可以是单分子，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。“结构域”意指可以为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列的核苷酸的连续延伸。单指导多核苷酸的VT结构域和/或CER结构域可以包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一些实施例中，单指导多核苷酸包含连接到tracr核苷酸(包含CER结构域)的cr核苷酸(包含与CER结构域连接的VT结构域)，其中该连接是包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列的核苷酸序列。由来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列构成的单指导多核苷酸可以被称为“单指导RNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“单指导DNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“单指导RNA-DNA”(当由RNA和DNA核苷酸的组合构成时)。在本披露的一个实施例中，单指导RNA包含可以与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas***的cRNA或cRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述指导RNA/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。使用单指导多核苷酸对比双链体指导多核苷酸的一个方面是，为了表达单指导多核苷酸，仅需要制造一个表达盒。

术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在此可互换地使用，并且包括与双链DNA靶位点的一个链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一个核苷酸序列结构域(VT结构域)与靶序列之间的互补％可以为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变目标结构域可以是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。在一些实施例中，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续延伸。可变靶向结构域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列或其任何组合构成。

术语指导多核苷酸的“Cas内切核酸酶识别结构域”或“CER结构域”在此可互换地使用，并且包括与Cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(例如指导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。CER结构域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如在此所述的修饰)或其任何组合构成。

连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一个实施例中，连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸的长度。在另一个实施例中，连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含四核苷酸环序列，例如但不限于GAAA四核苷酸环序列。

指导多核苷酸、VT结构域和/或CER结构域的核苷酸序列修饰可以选自(但不限于)由以下各项组成的组：5’帽、3’多腺苷酸化尾巴、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、将指导多核苷酸靶向亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸；2’-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的键合、与聚乙二醇分子的键合、与间隔子18分子的键合、5’至3’共价键、或其任何组合。这些修饰可以产生至少一个另外的有益特征，其中该另外的有益特征选自由以下各项组成的组：修饰的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、用于蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、对互补靶序列的修饰的结合亲和力、修饰的细胞降解抗性和增加的细胞通透性。

本文所用的冠词“一个”和“一种”指一个(种)或多于一个(种)(即，指至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意指一个或多个要素。

贯穿本说明书，词语“包括(comprising)”或变体例如“包括”(comprises或comprising)将被理解成暗示含有一种阐明的要素、整体或步骤，或者多个要素、整体或步骤的组，但是不排除任何其他的要素、整体或步骤，或者多个要素、整体或步骤的组。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请指示了本披露所属领域技术人员的水平。将所有出版物、专利和专利申请通过引用结合在此，其程度就像明确且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请通过引用结合一样。

对本披露的不同所示实施例的上述描述并不旨在是详尽的或者限制范围于所披露的精确形式。虽然为了说明目的而在此描述了具体实施例和实例，但是在本披露范围内，如相关领域的技术人员将认识到的，不同的等效修饰是可能的。本文提供的教导可以应用于除了上述实例之外的其他目的。根据上述教导，许多修改和变化是可能的，因此它们在所附权利要求书的范围内。

可以根据上述详细描述进行这些改变和其他改变。通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应被解释为将范围限制于说明书和权利要求书中披露的具体实施例。

就使用的数字(例如量、温度、浓度等)而言，已努力确保其准确性，但仍应允许有一些实验误差和偏差。除非另有说明，份为重量份；分子量为平均分子量；温度是摄氏度；并且压力为大气压或接近大气压。

以下实例以举例说明的方式而不是以限定的方式提供。

实验

实例1：泽兰属脉明病毒调节元件序列

SEQ ID NO：1的调节元件是通过在GenBank Genomes中检索已测序并归属于花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)病毒家族的病毒基因组获得的。该检索基于公知的花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子而开始。所述启动子驱动异源基因在大多数植物的大多数组织中的组成型表达。来自该病毒家族的其他调节元件(如玄参花叶病毒(Figwort MosaicVirus)34S启动子)也在植物中引导组成型样表达。因此，源自花椰菜花叶病毒科病毒家族的另外的调节元件也可以在植物中驱动组成型表达。该基因组的存在于所谓大基因间区(LIR)中的区域通常含有为使启动子在植物中起作用而必需的调节序列。

泽兰属脉明病毒(EVCV)基因组具有LIR，因此以该区域为靶标进行调节元件的功能分析。选择一个全长序列在植物中进行测试。序列由1104bp组成(在SEQ ID NO：1中示出)，并在该序列的3′端上游大约88bp处具有推定的TATA起始框。整个1104bp序列被称为EVCV FL(全长)调节元件或EVCV FL。缺失全长调节元件的5′端的片段可能会改变表达模式，并提供了对调节区中重要序列标记的认识。第二、第三、第四、第五和第六序列是全长调节元件的截短形式(参见图2，SEQ ID NO：1)。EVCV TR1、EVCV TR2、EVCV TR3、EVCV TR4和EVCV TR5调节元件分别由821bp、514bp、431bp、283bp和116bp组成，并含有全长启动子(SEQID NO：2-6)的3′端。

实例2：EVCV调节元件的表达和缺失分析

EVCV FL在表达载体中与玉蜀黍醇去氢酶基因1(ADH1内含子1)和β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的第一内含子有效地连接，以测试合成的DNA片段是否可以指导表达(SEQ IDNO：1)。将ADH1内含子1包括在内的目的是提高表达，因为已证实在谷类植物细胞中，存在一些5′近端内含子可增强转基因表达(参见Callis等人(1987)Genes and Development[基因与发育]1：1183-1200；Kyozuka等人(1990)Maydica[美迪卡杂志]35：353-357)。

来自玉蜀黍的Ubi-1启动子和内含子与GUS基因有效地连接，使得其可用于比较EVCV调节元件的表达模式和表达水平。Ubi-1启动子在玉蜀黍的大多数组织中是强组成型启动子。

调节元件是序列基序的集合，其一起工作以结合产生了启动子的空间、时间和定量表达特征的转录因子。了解这些基序的构造和位置，扩大了与调节元件有关的知识。片段缺失分析是可用于开始识别含有功能性重要基序的调节元件的区域的重要工具。从5′端去除片段可以改变由调节元件指导的空间、时间和/或定量表达模式。然后可以更仔细地研究导致变化的区域，以评估该序列及其与顺式和反式因子的相互作用。截短还可以识别最小的功能序列。

使用限制性内切核酸酶识别位点(SpeI、PvuII、SnaBI、HindIII和DraI)去除EVCVFL中的5个序列区域，这些序列区域的大小范围为约307bp至83bp。将EVCV TR1、EVCV TR2、EVCV TR3、EVCV TR4、EVCV TR5与表达载体中的ADH1内含子1和GUS基因有效地连接以测试合成的DNA片段(SEQ ID NO：2-6)的表达潜力。

使用农杆菌方案(在实例3中详述)产生稳定转化的植物，以允许启动子活性(包括由不同调节元件指导的空间和定量表达)的表征。在温室条件下，对生长到V5/6期的植物的叶和根材料进行取样，以通过组织化学GUS染色分析和定量荧光测定来评估表达的变化。由植株上的围绕叶(collared leaves)数目确定营养生长期。因此，V5期的植株有5片完全围绕的叶子。然后允许植物生长至R1-R2期，在这一时间点上穗丝出现在外壳之外(R1，并且刚刚开始干透(R2))。收集包括生殖组织在内的组织并且进行表达分析(表1)。

表1：EVCV启动子(具有ADH1内含子1和GUS)的植物表达结果

以玉蜀黍Ubi-1启动子指导表达作为比较器，按0到6的标度来表达的数据。

将EVCV FL(SEQ ID NO：1)调节元件与ADH1内含子1和杀昆虫基因(缩写为IG2)有效地连接以测试表达。在分析中使用Ubi-1启动子和驱动IG2杀昆虫基因表达的内含子进行比较。使用农杆菌方案(在实例3中详述)产生稳定的转化植物，并且当对叶采样时允许稳定的转化植物生长至V5/6的发育期。然后，当取完茎和花粉样本时，允许植物生长至R1-R2期。取样达到成熟时的核。

针对IG2的酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果显示EVCV FL调节元件(SEQ ID NO：1)指导在叶、茎和核组织中的表达(表2)。在叶和茎组织中，Ubi-1启动子及其内含子的表达水平相当。在核中，EVCV FL(SEQ ID NO：1)指导的表达低于Ubi-1，并且EVCV FL(SEQ IDNO：1)指导的在花粉中的表达基本上是非常低的。

表达数据由昆虫消耗测定的结果支持。取食性昆虫解剖的植物组织提供了蛋白质表达的快速评估，因为需要足够的水平来保护这些组织免遭昆虫的伤害。不充分的表达将导致取食损伤。EVCV FL(SEQ ID NO：1)和Ubi-1植物都表现出了保护了叶和穗丝组织不遭受昆虫损伤的表达水平。来自不具有IG2基因的阴性对照植物的组织被消耗。

表2：EVCV调节元件(具有ADH1内含子1和IG2)的植物表达结果

以玉蜀黍Ubi-1启动子代表中值，按0-6的标度来表达的数据。

实例3：农杆菌介导的玉蜀黍转化和转基因植物的再生

为了用本披露的调节元件序列进行农杆菌介导的玉蜀黍转化，采用了Zhao提出的方法(参见美国专利号5,981,840和PCT专利公开WO 98/32326；这两份专利的内容据此以引用方式结合至本文)。简而言之，从玉蜀黍中分离未成熟的胚，并且在特定条件下将胚与农杆菌悬浮液接触，借此该细菌能够将本披露的调节元件序列转移到至少一个未成熟的胚的至少一个细胞中(步骤1：侵染步骤)。在该步骤中，将未成熟的胚浸泡在农杆菌悬液中，引发接种。使这些胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在侵染步骤后，可以在固体培养基上培养未成熟的胚。在该共培养期之后，进行任选的“静置步骤”步骤。在该静置步骤中，将这些胚在已知抑制农杆菌生长的至少一种抗生素的存在下孵育，而不添加植物转化子的选择剂(步骤3：静置步骤)。接着，在含有选择剂的培养基上培养经接种的胚，并且回收生长的经转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在转移到温室之前，从愈伤组织中再生小植株(步骤5：再生步骤)。

实例4：油菜(Canola)中EVCV调节元件的表达分析

使用GUS基因作为报道基因，在油菜中测试EVCV FL启动子(SEQ ID NO：1)。使用生物射弹轰击瞬时测定来提供性能的初步评估。将GUS染色灶的数量和染色强度与拟南芥(Arabidopsis)泛素-10启动子(AtUBQ10)(在油菜组织中的强启动子)进行比较。EVCV FL(SEQ ID NO：1)启动子的性能在GUS染色中灶的数量和强度方面与AtUBQ10相当。

用EVCV FL：GUS和AtUBQ10：GUS载体产生了转基因油菜籽植物。EVCV FL：GUS事件的组织化学染色在叶和花器官中表现出了高表达。在花粉和长角果中也观察到EVCV FL指导的表达。当与来自AtUBQ10：GUS植物的组织化学染色组织比较时，EVCV FL在叶和花器官中是相当的。在花粉中，EVCV FL指导的表达弱于AtUBQ10，具有约10％-15％的花粉粒染色。几乎全部的AtUBQ10颗粒都被染成深色。

表3：EVCV FL启动子在油菜中的表达结果

按0-3的标度来表达的数据，3表示强表达。

序列表

<110> 先锋良种国际有限公司

E.I.内穆尔杜邦公司

Diehn, Scott

Lu, Albert L.

Van Allen, Michelle

<120> 植物调节元件及其使用方法

<130> 5971WOPCT

<150> 62/231155

<151> 2015-06-17

<160> 6

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1104

<212> DNA

<213> 泽兰属叶脉明病毒（Eupatorium Leaf Vein Clearing Virus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1104)

<223> EVCV FL

<400> 1

tgctaacgca ttaaaacctt cttatgccga tgtagcatct aaaaagatca acgacatcaa 60

caagaagaaa gtattgggat cgctccctca gaaaaaggtc gaagaaccaa aagacgatca 120

gtctgttcaa ggttttgaag ctactctcga gatgcaagat ttcatctatc tcagagatat 180

ggcacgtagt gctaacaaaa agtctatcct tgaaggcaag ttcttcacca cagacaaaaa 240

ggacatcagc atgttcaatt ttgttccagg agcaaaccca gaactagtct aggaagcatt 300

ctgttatggc ttggtatctc aaatctaccc agcagagaat cttctagaac ttcgcagttt 360

ccccaatgac ttggtgaaag cagtgaagca gtttaggaag aaaatcactt ccaaaccaaa 420

tgctctgatc tacctcaaga tcaccagcag catcccgacc tgggacgagt cttatcaact 480

cctctcactt ccagtcagga taattgaaat tggcctctgc aagaaagcca attatcatga 540

tagcattcag cagaaagatg atggagaaaa tgatcttcac aaattagcag ctgaccgcta 600

cagcaaagtc ttggacaaag ctcatagctt ctaccaggaa agcaaagtct tcgtaaattt 660

tacggacgaa tacgtactca tgtattcaaa gacgaacaag gtcataccag aagaccatgc 720

tatcaagata cggaaatacc aagacggtat tacgaaatct acattcctcg gattccattc 780

ggagaccgta gtagggcccg ggccctagcc ccactcagaa aagcttgtgc caactgcaaa 840

gcaaatgagg ctggtccctc cactaactcc accagctaga aagagataaa gcaagagctg 900

gcatccacaa ttattggacc cccaccacgt gaagatattg cgggaaaata attaaaggaa 960

tctttagaaa cgtcatccat gacgttttaa atctatccag atccttccta tgtatctata 1020

aataggaagt tacatttcat tggagaggga ggcgccttgg agagagcagg cgaattaaga 1080

atcaaggttt ttaataaccg tcgt 1104

<210> 2

<211> 821

<212> DNA

<213> 泽兰属叶脉明病毒

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(821)

<223> EVCV TR1

<400> 2

ctagtctagg aagcattctg ttatggcttg gtatctcaaa tctacccagc agagaatctt 60

ctagaacttc gcagtttccc caatgacttg gtgaaagcag tgaagcagtt taggaagaaa 120

atcacttcca aaccaaatgc tctgatctac ctcaagatca ccagcagcat cccgacctgg 180

gacgagtctt atcaactcct ctcacttcca gtcaggataa ttgaaattgg cctctgcaag 240

aaagccaatt atcatgatag cattcagcag aaagatgatg gagaaaatga tcttcacaaa 300

ttagcagctg accgctacag caaagtcttg gacaaagctc atagcttcta ccaggaaagc 360

aaagtcttcg taaattttac ggacgaatac gtactcatgt attcaaagac gaacaaggtc 420

ataccagaag accatgctat caagatacgg aaataccaag acggtattac gaaatctaca 480

ttcctcggat tccattcgga gaccgtagta gggcccgggc cctagcccca ctcagaaaag 540

cttgtgccaa ctgcaaagca aatgaggctg gtccctccac taactccacc agctagaaag 600

agataaagca agagctggca tccacaatta ttggaccccc accacgtgaa gatattgcgg 660

gaaaataatt aaaggaatct ttagaaacgt catccatgac gttttaaatc tatccagatc 720

cttcctatgt atctataaat aggaagttac atttcattgg agagggaggc gccttggaga 780

gagcaggcga attaagaatc aaggttttta ataaccgtcg t 821

<210> 3

<211> 514

<212> DNA

<213> 泽兰属叶脉明病毒

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(514)

<223> EVCV TR2

<400> 3

ctgaccgcta cagcaaagtc ttggacaaag ctcatagctt ctaccaggaa agcaaagtct 60

tcgtaaattt tacggacgaa tacgtactca tgtattcaaa gacgaacaag gtcataccag 120

aagaccatgc tatcaagata cggaaatacc aagacggtat tacgaaatct acattcctcg 180

gattccattc ggagaccgta gtagggcccg ggccctagcc ccactcagaa aagcttgtgc 240

caactgcaaa gcaaatgagg ctggtccctc cactaactcc accagctaga aagagataaa 300

gcaagagctg gcatccacaa ttattggacc cccaccacgt gaagatattg cgggaaaata 360

attaaaggaa tctttagaaa cgtcatccat gacgttttaa atctatccag atccttccta 420

tgtatctata aataggaagt tacatttcat tggagaggga ggcgccttgg agagagcagg 480

cgaattaaga atcaaggttt ttaataaccg tcgt 514

<210> 4

<211> 431

<212> DNA

<213> 泽兰属叶脉明病毒

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(431)

<223> EVCV TR3

<400> 4

gtactcatgt attcaaagac gaacaaggtc ataccagaag accatgctat caagatacgg 60

aaataccaag acggtattac gaaatctaca ttcctcggat tccattcgga gaccgtagta 120

gggcccgggc cctagcccca ctcagaaaag cttgtgccaa ctgcaaagca aatgaggctg 180

gtccctccac taactccacc agctagaaag agataaagca agagctggca tccacaatta 240

ttggaccccc accacgtgaa gatattgcgg gaaaataatt aaaggaatct ttagaaacgt 300

catccatgac gttttaaatc tatccagatc cttcctatgt atctataaat aggaagttac 360

atttcattgg agagggaggc gccttggaga gagcaggcga attaagaatc aaggttttta 420

ataaccgtcg t 431

<210> 5

<211> 283

<212> DNA

<213> 泽兰属叶脉明病毒

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(283)

<223> EVCV TR4

<400> 5

agcttgtgcc aactgcaaag caaatgaggc tggtccctcc actaactcca ccagctagaa 60

agagataaag caagagctgg catccacaat tattggaccc ccaccacgtg aagatattgc 120

gggaaaataa ttaaaggaat ctttagaaac gtcatccatg acgttttaaa tctatccaga 180

tccttcctat gtatctataa ataggaagtt acatttcatt ggagagggag gcgccttgga 240

gagagcaggc gaattaagaa tcaaggtttt taataaccgt cgt 283

<210> 6

<211> 116

<212> DNA

<213> 泽兰属叶脉明病毒

<400> 6

aaatctatcc agatccttcc tatgtatcta taaataggaa gttacatttc attggagagg 60

gaggcgcctt ggagagagca ggcgaattaa gaatcaaggt ttttaataac cgtcgt 116

Claims (11)

1.一种重组多核苷酸，其选自SEQ ID NO: 1-5。

2.一种DNA构建体，其包含

(a) 选自以下的调节元件：

(i) 根据权利要求1所述的重组多核苷酸，和

(b) 异源的可转录多核苷酸分子，所述异源的可转录多核苷酸分子可操作地连接至所述调节元件。

3.权利要求2的DNA构建体，其中所述异源的可转录多核苷酸分子是农学目的基因。

4.权利要求3的DNA构建体，其中所述异源的可转录多核苷酸分子是能够在植物中提供除草剂抗性的基因。

5.权利要求3的DNA构建体，其中所述异源的可转录多核苷酸分子是能够在植物中提供植物有害生物防治的基因。

6.一种用于产生用权利要求2的DNA构建体稳定转化的转基因植物或植物细胞的方法。

7.权利要求6的方法，其中所述转基因植物为单子叶植物细胞。

8.权利要求6的方法，其中所述转基因植物为双子叶植物细胞。

9.一种用于产生用权利要求2至5中任一项的DNA构建体稳定转化的转基因植物或植物细胞的方法。

10.权利要求8的方法，其中所述植物部分包含所述DNA构建体。

11.一种用于产生权利要求7的转基因植物的种子的方法，其中所述种子包含所述DNA构建体。

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