ES2938089T3

ES2938089T3 - Tubos de extracción de sangre al vacío que contienen inhibidores de proteasa para la evaluación de la activación del sistema de contacto

Info

Publication number: ES2938089T3
Application number: ES16757774T
Authority: ES
Inventors: Daniel Sexton; Ryan Faucette
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-08-13
Filing date: 2016-08-12
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2036-08-12
Also published as: NZ739623A; MX2018001786A; MX2022014713A; CA2995457A1; BR112018002742B1; JP6907188B2; EP3909509A1; HK1255461A1; US20210322972A1; BR112018002742A2; IL257209B; US11458477B2; US10870115B2; JP2021164678A; JP7242765B2; AU2021215261B2; JP2023078232A; EA201890478A1; CO2018002531A2; IL257209A

Abstract

En el presente documento se describen tubos de extracción de sangre al vacío que comprenden cócteles de inhibidores de proteasa en forma líquida y usos de los mismos para evaluar características asociadas con el sistema de contacto en un sujeto, incluido el nivel endógeno de activación del sistema de contacto, el nivel endógeno de un fármaco que se dirige a un componente de contacto sistema durante el tratamiento, y/o la inmunogenicidad de dicho fármaco. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tubos de extracción de sangre al vacío que contienen inhibidores de proteasa para la evaluación de la activación del sistema de contacto

REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud Provisional de EE. UU. No. 62/204,644 presentada el 13 de agosto de 2015 y la Solicitud Provisional de EE. UU. No. 62/214,308, presentada el 4 de septiembre de 2015.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La medición precisa del nivel in vivo de activación del sistema de contacto utilizando plasma del paciente es un desafío debido a la propensión a la activación ex vivo durante la extracción de sangre. La sangre de pacientes con ciertas enfermedades asociadas con el sistema de contacto, por ejemplo, angioedema hereditario, es especialmente propensa a la activación del sistema de contacto ex vivo ya que es deficiente en inhibidor de C1, el inhibidor natural de la vía. En consecuencia, las mediciones de biomarcadores específicos de la vía (p. ej., cininógeno de alto peso molecular de dos cadenas) pueden sobrestimar el grado de activación del sistema de contacto que está presente en el paciente, a menos que la sangre se recolecte y procese con cuidado.

El documento WO 98/19161 describe soportes sólidos para inmunoensayos en fase sólida que comprenden materiales poliméricos cargados negativamente revestidos con polietilenimina.

Konings y col. (2013 PLoS One. 2013 agosto 27;8(8):e74043) planteó la hipótesis de que la activación por contacto conduce preferentemente a la formación de calicreína y menos a la activación de la cascada de la coagulación en pacientes con HAE-C1INH.

Cugno y col. (Tromb Haemost. 1999 Nov;82(5): 1428-32) evaluaron cuantitativamente HK y LK mediante un inmunoensayo de fluorescencia de concentración de partículas (PCFIA) recientemente descrito y cualitativamente mediante SDS PAGE y análisis de inmunotransferencia en plasma de 33 pacientes con cirrosis que presentaban diversos grados de deterioro de la función hepática.

Galbusera y col. (Am J Kidney Dis. 2000 Oct;36(4):695-702) describen una interpretación novedosa del papel del factor de von Willebrand en las microangiopatías trombóticas basada en estudios de adhesión de plaquetas con flujo de alta velocidad de corte.

Motellon y col. (Clin Chim Acta. 2000 Ene. 5;290(2): 189-97) realizaron un estudio de casos y controles para evaluar la relación de la PTHrP, la PTH y la 1,25(OH)2D3 plasmáticas con la hipercalcemia en pacientes de cáncer con diversos tumores.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un tubo de extracción de sangre al vacío, que comprende una formulación líquida que comprende una mezcla de inhibidores de proteasa, citrato trisódico, ácido cítrico y dextrosa; donde la mezcla de inhibidores de proteasa consiste en benzamidina, inhibidor de tripsina de soja, leupeptina, clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil) bencenosulfonilo (AEBSF), polibreno y EDTA.

La invención proporciona además un procedimiento para evaluar el nivel endógeno de activación del sistema de contacto en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar sangre extraída de un sujeto en el tubo de extracción de sangre al vacío de la invención;

(ii) procesar la sangre para producir una muestra de plasma; y

(iii) medir el nivel de activación del sistema de contacto en la muestra de plasma.

La invención proporciona además un procedimiento para evaluar el nivel de un fármaco dirigido al sistema de contacto en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar sangre extraída de un sujeto en el tubo de extracción de sangre al vacío de la invención, habiéndose administrado al sujeto un fármaco que se dirige a un componente del sistema de contacto;

(ii) procesar la sangre para producir una muestra de plasma; y

(iii) medir el nivel del fármaco en la muestra de plasma.

La invención proporciona además un procedimiento para evaluar la inmunogenicidad de un fármaco dirigido al sistema de contacto, comprendiendo el procedimiento:

(ii) procesar la sangre para producir una muestra de plasma; y

(iii) medir el nivel de anticuerpos que se unen al fármaco en la muestra de plasma.

La presente descripción se basa, al menos en parte, en el desarrollo de tubos de extracción de sangre al vacío que no son de vidrio y que contienen mezclas de inhibidores de proteasa (cócteles) en formulación líquida como se define en las reivindicaciones, que evita la activación ex vivo del sistema de contacto durante la extracción de sangre. Como tales, los tubos de extracción de sangre al vacío descritos en esta invención permiten una medición precisa del nivel endógeno de activación del sistema de contacto de los pacientes, particularmente aquellos que tienen deficiencia de un inhibidor natural (p. ej., inhibidor de C1) de esta vía.

En consecuencia, un aspecto de la presente descripción presenta un tubo de extracción de sangre al vacío, que comprende una formulación líquida que comprende una mezcla de inhibidores de proteasa como se define en las reivindicaciones, que puede estar sustancialmente libre de inhibidores de proteasa que son inestables en una solución acuosa. El tubo puede ser un tubo que no sea de vidrio. En algunas realizaciones, el tubo es de plástico. En algunas realizaciones, el tubo de extracción de sangre al vacío contiene 0,5 ml de cualquiera de las formulaciones líquidas descritas en esta invención, que se pueden diluir 10 veces durante el uso.

La mezcla de inhibidores de proteasa en el tubo de extracción de sangre al vacío descrito en esta invención comprende al menos un inhibidor de serina proteasa (p. ej., un inhibidor de calicreína plasmática) y al menos un inhibidor de cisteína proteasa. En un ejemplo, la mezcla de inhibidores de proteasa comprende EPI-KAL2, que puede estar biotinilado, y leupeptina. La cantidad de EPI-KAL2 puede oscilar entre 5 y 15 pM en la formulación líquida que lo contiene. Como alternativa o además, la cantidad de leupeptina puede oscilar entre 200 y 300 pM en la formulación líquida.

La mezcla de inhibidores de proteasa descrita en esta invención comprende al menos dos inhibidores de serina proteasa, al menos uno de los cuales es el inhibidor de tripsina, el inhibidor de tripsina de soja. La mezcla de inhibidores de proteasa comprende benzamidina, inhibidor de tripsina de soja, leupeptina y AEBSF, como se define en las reivindicaciones. En algunos ejemplos, la formulación líquida en el tubo de extracción de sangre al vacío puede comprender 80-120 mM de benzamidina, 1-3 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja, leupeptina 200-300 pM, y/o AEBSF 10-30 mM.

La formulación líquida en los tubos de extracción de sangre al vacío de la invención comprende además polibreno y EDTA. En algunas realizaciones, cualquiera de las formulaciones líquidas descritas en esta invención puede tener un pH de 4-6 (p. ej., 4,5).

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para evaluar el nivel endógeno de activación del sistema de contacto en un sujeto. El procedimiento comprende: (i) suministrar sangre de un sujeto a cualquiera de los tubos de extracción de sangre al vacío de la invención; (ii) procesar la sangre para producir una muestra de plasma; y (iii) medir el nivel de activación del sistema de contacto en la muestra de plasma. En algunas realizaciones, la etapa de medición (etapa (iii)) puede llevarse a cabo midiendo el nivel de uno o más biomarcadores indicativos de la activación del sistema de contacto. Dichos biomarcadores pueden comprender precalicreína, calicreína plasmática activa (pKal), complejo a2M-pKal, factor activo XII, factor activo XI, cininógeno de alto peso molecular (HMWK), y/o un metabolito de bradicinina. En un ejemplo, uno o más biomarcadores comprenden HMWK escindido y/o HMWK intacto.

En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un procedimiento para evaluar el nivel de un sistema de contacto de direccionamiento de fármacos en un sujeto. El procedimiento comprende: (i) proporcionar sangre de un sujeto a un tubo de extracción de sangre al vacío de la invención, donde al sujeto se le administra un fármaco que se dirige a un componente del sistema de contacto; (ii) procesar la sangre para producir una muestra de plasma; y (iii) medir el nivel del fármaco en la muestra de plasma.

Además, la presente descripción proporciona un procedimiento para evaluar la inmunogenicidad de un sistema de contacto dirigido a fármacos, comprendiendo el procedimiento: (i) proporcionar sangre de un sujeto a un tubo de extracción de sangre al vacío de la invención, donde se administra al sujeto un fármaco que apunta a un componente del sistema de contacto; (ii) procesar la sangre para producir una muestra de plasma; y (iii) medir el nivel de anticuerpos que se unen al fármaco en la muestra de plasma. Dicho procedimiento puede comprender además, antes de la etapa (iii), aislar anticuerpos que se unen al fármaco de la muestra de plasma. En algunos ejemplos, los anticuerpos antifármacos (ADA) pueden aislarse mediante un ensayo de extracción en fase sólida y disociación ácida (SPEAD).

En cualquiera de los procedimientos descritos en esta invención, el sujeto puede ser un paciente humano que, en algunos casos, puede ser tratado con un fármaco dirigido a un componente (p. ej., calicreína plasmática) del sistema de contacto, por ejemplo, un fármaco (p. ej., un anticuerpo) dirigido específicamente a la calicreína plasmática (p. ej., la forma activa de la calicreína plasmática). En algunos ejemplos, la sangre procede de un paciente humano que tiene una enfermedad asociada con el sistema de contacto, por ejemplo, angioedema hereditario (HAE) o angioedema idiopático. En algunos casos, el paciente humano tiene HAE con inhibidor de C1 normal (C1 -INH).

En cualquiera de los procedimientos descritos en esta invención, el tubo de extracción de sangre al vacío puede no ser el primer tubo que se llene con sangre del sujeto. Alternativamente o además, la etapa del procedimiento [etapa (ii)] se puede realizar dentro de una hora después de la etapa de extracción de sangre [etapa (i)] .

Los detalles de una o más realizaciones se presentan en la descripción que sigue a continuación. Otras características y ventajas resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias realizaciones, así como de las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar aún más ciertos aspectos de la presente descripción, que pueden entenderse mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en esta invención.

La Figura 1 es una fotografía que muestra que los tubos SCAT169 y SCAT153 impidieron la activación por contacto según lo medido en un ensayo de transferencia Western de 2 cadenas. Cuando se agrega ácido elágico al 10 % al plasma, se activa el sistema de contacto que lleva a la conversión de HMWK de 1 cadena a HMWK de 2 cadenas (consulte el plasma con citrato de sodio). Por el contrario, el plasma SCAT169 y SCAT153 contiene la misma cantidad de HMWK de 1 cadena antes y después de la adición del ácido elágico.

La Figura 2 es un gráfico que muestra la variación de la escisión del cininógeno (porcentaje 2-HMWK/cHMWK) basado en procedimientos de extracción de muestras en plasma de sujetos sanos. Se indica el sitio clínico de extracción, así como los tipos de tubos utilizados para la extracción, incluidos K2EDTA (EDTA), citrato de sodio, SCAT169 o P100. Las agrupaciones de puntos de datos corresponden, de izquierda a derecha, al sitio 1: EDTA, sitio 2: citrato; sitio 3: citrato, sitio 4: citrato, sitio 1: SCAT169, sitio 2: SCAT169, sitio 4: SCAT169, sitio 5: SCAT169, y sitio 4: P100.

La Figura 3 es un gráfico que muestra la escisión del cininógeno (porcentaje 2-HMWK/cHMWK) en plasma recolectado en tubos SCAT169 de sujetos sanos de diferentes centros clínicos. Las agrupaciones de puntos de datos corresponden, de izquierda a derecha, al sitio 1: proveedor comercial, sitio 4, sitio 5 y sitios 4 y 5.

La Figura 4 es un gráfico que muestra la escisión de kinongen (porcentaje 2-HMWK/cHMWK) en sujetos sanos en comparación con sujetos que tenían HAE tipo I o II, HAE nC1-INH y angioedema idiopático (EA). Las agrupaciones de puntos de datos corresponden, de izquierda a derecha, a sujetos sanos, HAE I/II basal, ataque de HAE I/II, HAE (nC1-INH) basal, ataque de HAE (nC1-INH), AE idiopático basal y ataque de AE idiopático.

La Figura 5 es un gráfico que muestra los niveles de HMWK de dos cadenas en plasma de sujetos sanos y pacientes con HAE. A: muestra el porcentaje de niveles de HMWK de cadena 2 en plasma de sujetos sanos. Como se indica en el gráfico, el sitio clínico C no usó un tubo de desecho inicial antes de la extracción de plasma SCAT169. B: muestra el porcentaje de niveles plasmáticos de HMWK de dos cadenas de pacientes con HAE.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente descripción se basa, al menos en parte, en el desarrollo de tubos de extracción de sangre al vacío que comprenden cócteles de inhibidores de proteasa que impiden la activación del sistema de contacto. Para evaluar con precisión el nivel endógeno de activación del sistema de contacto en un paciente o un voluntario sano, es fundamental que la sangre se recoja y procese cuidadosamente. Se pueden tomar una o más de las siguientes precauciones para asegurar una evaluación precisa de las características asociadas con el sistema de contacto como se describe en esta invención:

(i) Se prefiere que los tubos de extracción de sangre al vacío descritos en esta invención no sean el primer tubo lleno de sangre, que puede mostrar una activación elevada del sistema de contacto debido al traumatismo local que sigue a la punción del vaso por la aguja;

(ii) La sangre no puede entrar en contacto con vidrio (utilice tubos o catéteres de plástico);

(iii) La sangre puede ser procesada a plasma dentro de un corto período de tiempo (porejemplo, ~ 1 hora) después de la extracción; y/o

(iv) El uso de inhibidores de proteasa (como se define en las reivindicaciones) en el tubo de extracción puede estabilizar el plasma frente a la activación por contacto ex vivo que enmascara la determinación precisa del estado endógeno del paciente.

Las ventajas de los tubos de extracción de sangre al vacío descritos en esta invención incluyen, al menos: (1) el uso de tubos de vacío que no son de vidrio (por ejemplo, plástico) para la extracción de sangre estandarizada y simplificada; (2) el uso de una formulación líquida que comprende los cócteles de inhibidores de proteasa para minimizar la hidrólisis, como se define en las reivindicaciones; (3) omisión opcional de inhibidores de proteasa que son inestables en soluciones acuosas (p. ej., PPACK II, también conocido como H-D-Phe-Phe-Arg-clorometilcetona); y (4) inclusión, en algunas realizaciones, de un inhibidor de calicreína plasmática como EPI-KAL2 (puede estar biotinilado), que ofrece la capacidad de que los tubos contengan un reactivo que permite la detección de calicreína plasmática activada mediante un inmunoensayo. Véase, por ejemplo, WO95/21601.

Una observación inesperada de este estudio fue que el uso del cóctel de inhibidores de proteasa en forma líquida evitó o redujo la hemolización. Cuando la sangre se recogió en tubos de vacío que contenían una preparación liofilizada de inhibidores de la proteasa, se hemolizó en gran medida, lo que puede interferir con ciertas mediciones de analitos. Sin embargo, cuando la sangre se recoge en un tubo de vacío que contiene una solución de la misma mezcla de inhibidores de proteasa, no se hemoliza.

En consecuencia, las mediciones dirigidas a evaluar el grado de activación del sistema de contacto en muestras de plasma procesadas a partir de muestras de sangre recolectadas en los tubos de vacío descritos en esta invención brindan niveles de evaluación más precisos de pacientes con diferentes enfermedades. La obtención de una estimación precisa de la activación por contacto puede permitir la identificación de enfermedades o subconjuntos de pacientes con diferentes enfermedades que están potencialmente mediadas por esta vía y, por lo tanto, susceptibles de tratamiento con un inhibidor del sistema de contacto.

Además, el uso de los tubos de extracción de sangre al vacío descritos en esta invención puede facilitar la determinación precisa de los niveles de fármaco y/o evaluación de inmunogenicidad para una molécula terapéutica dirigida contra formas activadas de proteínas en el sistema de contacto (p. ej., calicreína plasmática, FXIIa y cininógeno de 2 cadenas). Los tubos pueden ofrecer una ventaja similar para moléculas terapéuticas dirigidas a proteínas activadas aguas abajo de la activación del sistema de contacto que no requieren calcio para la generación de la diana activada (p. ej., FXIa y FIXa). La ventaja de estos tubos se aplica principalmente a las moléculas terapéuticas biológicas, ya que los ensayos de farmacocinética y de inmunogenicidad utilizados suelen ser inmunoensayos que reconocen el sitio de unión (p. ej., el idiotipo, en el caso de un anticuerpo terapéutico). Si la diana terapéutica se activa ex vivo, puede unirse a la diana biológica presente en el plasma y, por lo tanto, enmascarar la detección en los inmunoensayos de PK e inmunogenicidad. Los inhibidores de la proteasa en los tubos pueden impedir la activación de la diana. El uso de la formulación líquida previene la hemólisis, que puede interferir en ciertos ensayos de laboratorio.

Tubos de extracción de sangre al vacío que contienen cócteles de inhibidores de proteasa en formulación líquida

Los tubos de extracción de sangre al vacío se usan comúnmente en prácticas médicas para recolectar muestras de sangre para diversos usos. Los tubos descritos en esta invención pueden ser tubos que no sean de vidrio que comprendan una formulación líquida que comprenda una mezcla de inhibidores de proteasa (un cóctel de inhibidores de proteasa), como se define en las reivindicaciones. El cóctel de inhibidores de proteasa comprende al menos un inhibidor de serina proteasa y al menos un inhibidor de cisteína proteasa. Al menos un inhibidor de serina proteasa puede ser un inhibidor de calicreína plasmática. Dichos cócteles de inhibidores de proteasa pueden comprender múltiples (porejemplo, 2, 3, 4 ó 5) inhibidores de serina proteasa, al menos uno de los cuales es un inhibidor de tripsina o plasmina humana. Preferiblemente, los cócteles de inhibidores de proteasa descritos en esta invención están sustancialmente libres de un inhibidor de proteasa que es inestable en una solución acuosa, es decir, la actividad del inhibidor de proteasa que es inestable en una solución acuosa es insustancial en relación con la actividad inhibidora total del cóctel de proteasa. En algunos casos, la cantidad de inhibidor de proteasa que es inestable en una solución acuosa puede ser inferior a 5 % (w/w) de los inhibidores de proteasa totales en el cóctel, por ejemplo, menos de 2 %, menos de 1 %, o menos de 0,5 %. En algunos casos, el cóctel de inhibidores de proteasa está completamente libre de un inhibidor de proteasa que sea inestable en una solución acuosa (p. ej., una solución acuosa que tenga un pH de 4-6). Un ejemplo de inhibidor de proteasa que no es estable en solución acuosa es PPACK II, también conocido como H-D-Phe-Phe-Arg-clorometilcetona.

La Tabla 1 a continuación enumera ejemplos de inhibidores de serina proteasa, inhibidores de cisteína proteasa e inhibidores de tripsina proteasa, que pueden usarse para preparar cócteles de inhibidores de proteasa.

El cóctel de inhibidores de proteasa para uso en la fabricación de tubos de extracción de sangre al vacío comprende al menos un inhibidor de proteasa de serina (por ejemplo, 1, 2 o 3), que incluye al menos un inhibidor de 4 tripsina/plasmina (p. e j, 1,2 o 3), y al menos un inhibidor de cisteína proteasa (p. e j, 1, 2 o 3), como se define en las reivindicaciones. Dicho cóctel de inhibidores de proteasa comprende tres inhibidores de serina proteasa (inhibición de benzamidina, AEBSF y tripsina de soja) y un inhibidor de cisteína proteasa (leupeptina).

En otros ejemplos, un cóctel de inhibidores de proteasa puede comprender al menos un inhibidor de serina proteasa (p. ej., un inhibidor de calicreína plasmática) y al menos un inhibidor de cisteína proteasa (p. ej., leupeptina). El inhibidor de la kalikreína plasmática puede ser EPI-KAL2 (Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp; SEQ ID NO: 1), que es un inhibidor de la proteasa recombinante específico de la calicreína plasmática que ofrece la capacidad de que los tubos contengan un reactivo que permita la detección de calicreína plasmática activada usando, por ejemplo, inmunoensayos.

Los cócteles de inhibidores de proteasa se disuelven en una solución adecuada para formar una formulación líquida. La solución adecuada es una solución de ácido-citrato-dextrosa, que comprende citrato trisódico, ácido cítrico y dextrosa. La solución puede tener un valor de pH de aproximadamente 4-6, 4-5, 4,5-5,0 o 4,2-4,7, por ejemplo, 4,5. En algunas realizaciones, la solución tiene un valor de pH de aproximadamente 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1,5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0. En algunas realizaciones, la solución tiene un valor de pH de aproximadamente 4,5. La formulación líquida puede comprender además un polímero catiónico como la molécula de bromuro de hexadimetrina (polybrene®), que puede reducir la activación del sistema de contacto por interacción con superficies cargadas negativamente y un agente quelante (p. ej., EDTA), que puede inhibir las metaloproteasas.

La concentración de cada uno de los inhibidores de proteasa en el cóctel puede ser 5X o 10X mayor que la concentración final de tal inhibidor para usar en la inhibición de la proteasa correspondiente, dependiendo del número de diluciones en la práctica. La concentración final de un inhibidor de proteasa comercial específico se conocía en la técnica y se puede obtener del protocolo del fabricante. En algunos ejemplos, la concentración de EPI-KAL2 puede variar de 5 a 15 pM (p. ej., de 5 a 10, de 7 a 12 pM o de 10 a 15 pM). En algunas realizaciones, la concentración de EPI-KAL2 es de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o aproximadamente 15 pM. En algunos ejemplos, la concentración de leupeptina puede oscilar entre 200 y 300 pM (p. ej., 200-250, 240-270 o 250-300 pM). En algunas realizaciones, la concentración de leupeptina es de aproximadamente 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o aproximadamente 300 pM. En algunos ejemplos, la concentración de inhibidor de tripsina de soja puede oscilar entre 1 y 3 mg/ml (por ejemplo, 1-2 o 2-3 mg/ml). En algunas realizaciones, la concentración de inhibidor de tripsina de soja es de aproximadamente 1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, o alrededor de 3,0 mg/mL. En algunos ejemplos, la concentración de benzamidina puede oscilar entre 80 y 120 mM (por ejemplo, entre 80 y 100 o entre 100 y 120 mM). En algunas realizaciones, la concentración de benzamidina es de aproximadamente 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 o aproximadamente 120 mM. En algunos ejemplos, la concentración de AEBSF puede oscilar entre 10 y 30 mM (p. ej., 10-20 o 20-30 mM). En algunas realizaciones, la concentración de AEBSF es de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o alrededor de 30 mM.

Cuando se usa un inhibidor de proteasa basado en péptidos (p. ej., EPI-KAL2), se puede biotinilar siguiendo la metodología convencional. Por ejemplo, el inhibidor peptídico se puede biotinilar como sigue. Brevemente, el inhibidor peptídico se puede disolver en una solución adecuada, como solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se puede agregar Sulfo-NHS-LC-Biotin recién preparado a la solución de inhibidor peptídico e incubarlo en hielo durante un período de tiempo adecuado. El exceso de biotina hidrolizada y sin reaccionar se puede eliminar utilizando una columna de desalinización por rotación. El marcaje del inhibidor peptídico puede confirmarse mediante ELISA y la concentración de proteína puede determinarse, por ejemplo, mediante el ensayo de Bradford.

Cualquiera de las formulaciones líquidas descritas en esta invención se puede preparar mediante procedimientos de rutina, por ejemplo, disolviendo los componentes adecuados en una solución adecuada y colocándolos en tubos de extracción de sangre al vacío, que preferiblemente no son de vidrio. Los tubos se pueden almacenar a -20 °C y se pueden descongelar en hielo o a temperaturas refrigeradas (p. ej., aproximadamente 4 °C), como en un refrigerador dentro de un período de tiempo adecuado antes de su uso.

Utilidades de los tubos de extracción de sangre al vacío que comprenden cócteles de inhibidores de proteasa en forma líquida

Cualquiera de los tubos de extracción de sangre al vacío descritos en esta invención se puede usar para recolectar muestras de sangre de sujetos para su uso en el análisis de características endógenas asociadas con el sistema de contacto, incluido, entre otros, el nivel de activación del sistema de contacto, el nivel sérico de un fármaco que apunta a un componente del sistema de contacto, y/o la inmunogenicidad de tal fármaco. Para reducir la activación ex vivo del sistema de contacto (p. ej., por traumatismo local tras la punción del vaso con la aguja), los tubos de extracción de sangre al vacío descritos en esta invención pueden no ser los primeros tubos que se llenan de sangre cuando se extrae sangre de un sujeto. Por ejemplo, la sangre inicial del sujeto se puede recoger en un primer tubo, que se puede desechar, y luego los tubos de extracción de sangre al vacío se utilizan para recoger las muestras de sangre posteriores, que se pueden utilizar para el análisis. El primer tubo puede ser un tubo de extracción de sangre habitual utilizado en la práctica habitual.

Después de la extracción de sangre, las muestras de sangre pueden procesarse para producir muestras de plasma dentro de un período de tiempo adecuado (por ejemplo, que no exceda una hora). Las muestras de plasma pueden someterse a análisis adicionales para evaluar las características asociadas con el sistema de contacto del sujeto del que se obtiene la muestra de sangre inicial.

Las muestras de sangre se pueden recolectar de un sujeto que necesite el análisis como se describe en esta invención. En algunos casos, el sujeto es un paciente humano, que puede tener, sospecharse que tiene o estar en riesgo de tener una enfermedad asociada con el sistema de contacto. Por ejemplo, el paciente humano puede tener una aparición previa de HAE o puede estar en riesgo de HAE. El paciente humano puede tener HAE tipo I o tipo II, que tiene deficiencia de C1 -INH o produce un C1 -INH atípico. Alternativamente, el paciente humano puede tener HAE de tipo III, que no está relacionado con la deficiencia de C1-INH. En otros ejemplos, el paciente humano puede tener una aparición previa de angioedema idiopático o puede estar en riesgo de angioedema idiopático. Tal paciente humano puede haber sido tratado previamente o estar en tratamiento con un fármaco que se dirige a un componente del sistema de contacto (p. ej., pKal o FXIIa o cininógeno de alto peso molecular).

i. Evaluación del nivel endógeno de activación del sistema de contacto

En un aspecto, las muestras de plasma mencionadas en esta invención pueden analizarse para evaluar el nivel endógeno de activación del sistema de contacto de un sujeto, que puede ser un paciente humano que tenga, se sospeche que tenga o esté en riesgo de padecer una enfermedad asociada con el sistema de contacto ( ej., HAE o angioedema idiopático). Tal paciente humano puede estar en tratamiento de la enfermedad, por ejemplo, un tratamiento que implica un inhibidor de pKal (por ejemplo, un anticuerpo anti-pKal). En otros casos, tal paciente humano puede estar libre de dicho tratamiento. Alternativamente, el sujeto humano puede ser un sujeto sano que no tenga dichas enfermedades.

El nivel de activación del sistema de contacto de la muestra de plasma se puede determinar midiendo uno o más biomarcadores indicativos de la activación del sistema de contacto.

La calicreína plasmática (pKal) es la principal enzima generadora de bradicinina en la circulación. La activación de pKal puede ocurrir a través del sistema de contacto o a través del Factor XIIa, los cuales se han relacionado con la patología de la enfermedad asociada con el angioedema hereditario (HAE). La calicreína plasmática circula como un zimógeno inactivo llamado precalicreína que se une principalmente a su sustrato cininógeno de alto peso molecular (HMWK). En respuesta a un estímulo, la precalicreína se escinde para formar calicreína plasmática activa. Esta activación de calicreína puede estar mediada, por ejemplo, por el Factor XIIa después de la activación de FXII a FXIIa, o por un efector de la cascada de contacto. Aproximadamente el 75-90 % de la precalicreína circulante se une a HMWK a través de una interacción de sitio no activo con el dominio 6 de HMWK que hidrolizará moléculas adicionales de HMWK para generar HMWK escindida y bradicinina. La calicreína plasmática activa escinde HMWK en dos sitios, lo que da como resultado la liberación de bradicinina, un mediador clave del dolor, la inflamación, el edema y la angiogénesis. El otro producto de escisión, el cininógeno escindido, se compone de cadenas de aminoácidos que se mantienen unidas por un enlace disulfuro. Cugno y col., Blood (1997) 89:3213-3218.

Biomarcadores ejemplares que se pueden usar para evaluar el nivel de activación del sistema de contacto en una muestra de sangre del paciente (determinando así si el paciente tiene un nivel y/o actividad elevada del sistema de contacto, por ejemplo, un nivel elevado o actividad de pKal), se proporcionan en la Tabla 2 a continuación:

Tabla 2. Biomarcadores del sistema de contacto

Uno o más de los biomarcadores indicativos de la activación del sistema de contacto pueden analizarse utilizando procedimientos convencionales. Un tipo de ensayo particularmente adecuado para la detección, ya sea cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa, son los inmunoensayos. Un inmunoensayo es cualquier ensayo donde se detecta una molécula diana (p. ej., una molécula biomarcadora asociada con la activación del sistema de contacto). y/o cuantificada mediante el uso de un agente de unión como se describe en esta invención que se une específicamente a la molécula diana. El agente de unión puede ser un anticuerpo, que puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El inmunoensayo puede ser un inmunoensayo competitivo o no competitivo, y puede ser un inmunoensayo homogéneo o heterogéneo. Por ejemplo, el inmunoensayo para detectar un biomarcador del sistema de contacto puede ser un inmunoensayo enzimático (EIA), un radioinmunoensayo (RIA), un fluoroinmunoensayo (FIA), un inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA), un inmunoensayo de recuento (CIA), un ensayo inmunoenzimométrico (IEMA), un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA), un inmunoensayo de flujo lateral, un inmunoensayo de sándwich, un ensayo de inmuno-PCR, un ensayo de ligadura de proximidad, un ensayo de transferencia Western o un ensayo de inmunoprecipitación. Inmunoensayos adecuados adicionales para detectar un biomarcador proporcionado en esta invención serán evidentes para los expertos en la técnica. Sin embargo, será evidente para los expertos en la técnica que esta descripción no se limita a los inmunoensayos y que los ensayos de detección que no se basan en un anticuerpo o en un fragmento de anticuerpo que se une a un antígeno, como la espectrometría de masas, también son útiles para la detección y/o cuantificación de biomarcadores del sistema de contacto como se proporciona en esta invención.

El tipo de ensayo de detección utilizado para la detección y/o la cuantificación de un biomarcador del sistema de contacto como los proporcionados en esta invención dependerá de la situación particular en la que se vaya a utilizar el ensayo (p. ej., aplicaciones clínicas o de investigación), y del tipo y número de biomarcadores que se detectarán, y del tipo y el número de muestras de pacientes que se ejecutarán en paralelo, por nombrar algunos parámetros. Por ejemplo, se pueden detectar niveles elevados de cininógeno escindido (cininógeno de 2 cadenas) en muestras de plasma recolectadas de pacientes con HAE o sujetos sanos durante un episodio agudo de HAE mediante un ensayo de transferencia Western. Si bien los ensayos de transferencia Western permiten el análisis simultáneo de biomarcadores del sistema de contacto en una pluralidad de muestras, están limitados en el número de biomarcadores que se pueden evaluar en paralelo. En consecuencia, en algunas realizaciones, cuando se analiza una pluralidad de biomarcadores del sistema de contacto proporcionados en esta invención en una sola muestra, o en múltiples muestras, se prefieren los ensayos adecuados para dicho análisis múltiplex. Ejemplos de dichos ensayos incluyen, entre otros, micromatrices de péptidos y ensayos de laboratorio en un chip, que se han diseñado para ofrecer una alternativa de alto rendimiento y lista para multiplexar a los inmunoensayos menos escalables, como las transferencias Western.

En algunos ejemplos, se puede colocar una muestra de plasma en una microplaca de múltiples pocillos en presencia o ausencia de un inhibidor de pKal. y/o un activador del sistema de contacto. La mezcla se puede incubar en hielo en presencia de un sustrato peptídico marcado de pKal durante un período de tiempo adecuado (porejemplo, 2 minutos) y se puede agregar inhibidor de tripsina de maíz (CTI) a la mezcla para detener la reacción de activación. La mezcla se puede diluir si es necesario y la actividad proteolítica se puede determinar midiendo el nivel de un sustrato peptídico fluorescente. Se puede confiar en los resultados obtenidos de dicho ensayo para determinar el nivel endógeno de activación del sistema de contacto del sujeto del que se obtiene la muestra de plasma. También se puede confiar en ellos para determinar la actividad inhibitoria del inhibidor de pKal, si se usa.

ii. Evaluación de los niveles endógenos de fármacos dirigidos al sistema de contacto

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere al uso de los tubos de extracción de sangre al vacío descritos en esta invención para la determinación de los niveles de un fármaco dirigido a un componente del sistema de contacto, como se define en las reivindicaciones. Los niveles del fármaco son necesarios para evaluar los parámetros farmacocinéticos. Por ejemplo, si el sistema de contacto se activa ex vivo en muestras de plasma recolectadas para la determinación de la cantidad de un inhibidor de la calicreína plasmática (p. ej., DX-2930) en plasma, entonces el exceso de calicreína plasmática activada podría unirse al fármaco y, por lo tanto, enmascarar su detección en un ensayo. Cualquiera de los tubos de extracción de sangre al vacío descritos en esta invención puede utilizarse para estimar con mayor precisión los niveles de fármaco, por ejemplo, en una muestra extraída de un sujeto.

Para practicar este procedimiento, las muestras de plasma derivadas de un sujeto (p. ej., un paciente humano) tratado con un fármaco que se dirige a un componente del sistema de contacto (p. ej., pKal) se pueden preparar a partir de muestras de sangre extraídas en los tubos de extracción de sangre al vacío descritos en esta invención. siguiendo los procedimientos también descritos en esta invención. El nivel del fármaco en la muestra de plasma se puede medir siguiendo la práctica habitual. En algunos casos, el nivel de fármaco se puede medir mediante un inmunoensayo, por ejemplo, los descritos en esta invención.

iii. Evaluación de la inmunogenicidad de fármacos dirigidos al sistema de contacto

Otro aspecto de la presente descripción se refiere al uso de tubos de extracción de sangre al vacío para la determinación de la inmunogenicidad de un inhibidor biológico contra un componente del sistema de contacto (por ejemplo, pKal), como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, es una práctica común desarrollar ensayos de inmunogenicidad que puedan medir anticuerpos contra el fármaco ("ADA") en presencia de un exceso de fármaco en el plasma de la circulación. Este requisito de un ensayo de inmunogenicidad que pueda medir los ADA es ciertamente el caso de los anticuerpos monoclonales terapéuticos, que pueden tener vidas medias de varias semanas y altos niveles de fármaco en la circulación. Para superar la interferencia debida al exceso de fármaco en la muestra, se realizan técnicas para separar los anticuerpos antifármaco del fármaco. Dichos anticuerpos antifármacos pueden aislarse mediante extracción en fase sólida y disociación ácida (SPEAD), que implica la incubación de una forma biotinilada del fármaco con la muestra de plasma durante un período prolongado (generalmente durante la noche), seguido del aislamiento del fármaco biotinilado que se pueden unir a los anticuerpos antifármacos utilizando una placa recubierta de estreptavidina. Luego, la placa se trata con ácido para liberar los anticuerpos antifármacos. Los anticuerpos liberados se pueden recubrir directamente en otra placa de ensayo para su detección. En ausencia de inhibidores de proteasa en los tubos de extracción, el sistema de contacto puede activarse ex vivo, lo que conduce a la producción de calicreína plasmática activa. Después de las etapas de liberación de ácido y recubrimiento mencionadas anteriormente, tanto el pKal activo como los anticuerpos antifármaco se unirían a la superficie de la placa. El anticuerpo antifármacos normalmente se detecta usando un fármaco marcado, que también podría unirse a la pKal activa, si está presente, lo que daría como resultado una señal positiva falsa en el ensayo de ADA.

El uso de tubos de extracción de sangre al vacío que comprenden los cócteles de inhibidores de proteasa descritos en esta invención puede impedir esta señal de falso positivo.

Técnicas generales

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se encuentran dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura, como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook, y col., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzimology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Inmunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, y col., eds., 1987); ^pCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, y col., eds., 1994); Current Protocols in Inmunology (J.E. Coligan y col., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Inmunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: a practival approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The antibodies (M. Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Sin elaboración adicional, se cree que un experto en la técnica puede, en función de la descripción anterior, utilizar la presente invención en la mayor medida posible. Por lo tanto, los siguientes ejemplos se interpretarán como ilustrativos meramente, y no limitan el resto de la descripción en cualquier forma.

Ejemplo 1: Preparación de Cócteles de Inhibidores de Proteasa que Impiden la Activación del Sistema de Contacto

Se desarrollaron cócteles de inhibidores de proteasa que impedían la activación del sistema de contacto. Se utilizaron tubos de plástico al vacío para la extracción de sangre estandarizada y simplificada.

Los siguientes dos cócteles de inhibidores de proteasa se utilizaron en una formulación líquida para impedir la hidrólisis:

1) Cóctel inhibidor de proteasa 10X A: SCAT169

Tubos de plástico de volumen total de 5 mL al vacío que contienen (0,5 ml): benzamidina 100 mM, 400 pg/mL polibreno, 2 mg/mL inhibidor de tripsina de soja, EDTA 20 mM, leupeptina 263 pM y AEBSF 20 mM (clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil) bencenosulfonilo) disueltos en ácido-citrato-dextrosa (citrato trisódico 100 mM, ácido cítrico 67 mM y 2 % dextrosa, pH 4,5.).

2) Cóctel inhibidor de proteasa 10X B: SCAT153

Tubos de plástico de 5 ml de volumen total al vacío que contienen (0,5 ml): EPI-KAL2 biotinilado 10 pM, 400 pg/mL polibreno, EDTA 20 mM y leupeptina 263 pM, disueltos en ácido-citrato-dextrosa (citrato trisódico 100 mM, ácido cítrico 67 mM y 2 % dextrosa, pH 4,5.).

EPI-KAL2 biotinilado se incluyó en el cóctel inhibidor de proteasa B (SCAT153). Los tubos SCAT169 (Specialized Coagulation Assay Tubes, formulación 169) y SCAT153 (Specialized Coagulation Assay Tubes, formulación 153) se almacenaron a 2-8 °C.

Ejemplo 2: Tubos SCAT169 y SCAT153 impiden la activación del sistema de contacto como se muestra en el ensayo de transferencia Western de 2 cadenas

El plasma recolectado en los tubos SCAT169 o SCAT153 bloqueó la activación del sistema de contacto inducida por la adición ex vivo de ácido elágico (Figura 1), un activador del sistema de contacto bien conocido, medido por la conversión de HMWK de 1 cadena a 2 cadenas por Análisis de Transferencia Western.

La activación del sistema de contacto inducida por ácido elágico observada se comparó entre muestras de plasma recolectadas en 3 tubos de extracción de sangre diferentes: tubos de citrato de sodio (tubos estándar utilizados en laboratorios de química clínica para mediciones de coagulación), tubos SCAT 169 y tubos SCAT 153.

La HWMK de 1 cadena se consumió esencialmente por completo en muestras activadas con ácido elágico en tubos de citrato de sodio, y se detectó la aparición de HMWK de 2 cadenas.

Por el contrario, HMWK de cadena 1 se conservó en plasma activado con ácido elágico de tubos SCAT169 y SCAT153.

Estos resultados proporcionaron evidencia de que los tubos SCAT169 y SCAT153 son efectivos para impedir la activación del sistema de contacto ex vivo que puede ocurrir durante la extracción y el procesamiento de muestras de plasma.

Ejemplo 3: Cócteles de inhibidores de proteasa SCAT169 y SCAT153 aumentaron los tiempos de coagulación del plasma

Los tiempos de coagulación del plasma se midieron en muestras tratadas en 3 tubos de extracción de sangre diferentes: tubos de citrato de sodio, tubos SCAT169 y tubos SCAT153, para tres muestras de donantes individuales (Tabla 1).

Como se muestra a través de la protrombina y la tromboplastina parcial activada, el tiempo de coagulación aumentó en las muestras con SCAT159 y SCAT153 en comparación con el citrato de sodio. Los resultados se proporcionan en la Tabla 3 que se encuentra a continuación.

T l . Ef l inhi i r r n l i m l i n l l m

Ejemplo 4: Uso de tubos de extracción de sangre al vacío para evaluar los niveles endógenos de activación del sistema de contacto en sujetos humanos

El examen de biomarcadores plasmáticos de activación del sistema de contacto es un desafío debido a la activación involuntaria durante la extracción y el procesamiento de la sangre. En este estudio, la utilidad de los tubos de extracción de sangre especializados (SCAT159 y SCAT153) para evaluar los niveles de cininógeno de alto peso molecular (cHMWK) escindido en plasma de sujetos sanos y aquellos con angioedema hereditario tipo VII (HAE), angioedema idiopático o HAE con C1 -INH normal (HAEnC1, también denominado nC1 -INH) se investigó de la siguiente manera.

Para impedir la activación artificial de la vía de contacto durante el muestreo de sangre, el estudio utilizó técnicas estandarizadas de extracción de sangre y tubos personalizados que contenían inhibidores de proteasa. Se recogieron muestras de sangre de sujetos sanos y de sujetos con enfermedad mencionados anteriormente (durante los períodos de inactividad y exacerbación de la enfermedad) para evaluar el porcentaje de cHMWK utilizando un ensayo de transferencia Western. Las muestras de sangre se colocaron en tubos SCAT159 o SCAT153 (5 mL de volumen total, 0,5 mL de cóctel inhibidor de proteasa 10X) utilizando un catéter con un sistema de aguja tipo mariposa. A continuación, las muestras de sangre se procesaron para producir muestras de plasma en el plazo de 1 hora después de la extracción de sangre.

Las muestras de plasma de tubos SCAT se analizaron mediante Western Simple (SBHD) y Transferencia Western (TGA) para determinar el nivel de cininógeno escindido (cininógeno de 2 cadenas) en las muestras de plasma siguiendo los procedimientos descritos, por ejemplo, en el documento WO 2015/061183.

El plasma se recogió de sujetos sanos en los centros clínicos 1-5 en tubos de extracción de plástico que contenían diversos anticoagulantes, inhibidores de proteasa o estabilizadores de proteínas antes de procesarse en plasma. En concreto, los tipos de tubos fueron K2EDTA, citrato de sodio, SCAT169 o P100 (BD Biosciences). Como se muestra en la Figura 2, los tubos que se encontró que minimizaban la activación del sistema de contacto ex vivo contenían inhibidores de proteasa y eran tubos P100 o tubos SCAT169, que eran tubos de extracción de sangre al vacío de plástico de 5 mL de volumen que contenían 0,5 mL de una mezcla concentrada 10X de benzamidina 100 mM, 400 pg/mL de polibreno, 2 mg/mL de inhibidor de tripsina de soja, EDTA 20 mM, leupeptina 263 pM y AEBSF 20 mM disueltos en ácido-citrato-dextrosa (citrato trisódico 100 mM, ácido cítrico 67 mM y 2 % dextrosa, pH 4,5). Los procedimientos de extracción que utilizaron tubos que contenían cócteles de inhibidores de proteasa impidieron la elevación de cHMWK cuando se analizó el plasma de voluntarios sanos.

Los resultados obtenidos de este estudio mostraron que, en sujetos sanos, los niveles de cHMWK eran estables (< 5 %) a temperatura ambiente (TA) durante al menos 24 horas después de la extracción de sangre en tubos personalizados, pero los niveles de cHMWK estaban elevados (12 %) en muestras de plasma obtenidas de un proveedor comercial, lo que demuestra la importancia de optimizar las técnicas de extracción de sangre al examinar la proteasa de activación de la vía de contacto.

También se evaluaron los efectos de la división del cininógeno en el plasma recogido en tubos SCAT169 de sujetos sanos de dos sitios clínicos diferentes (sitios 4 y 5) y de un proveedor comercial (sitio 1) (Figura 3). El proveedor comercial recolectó muestras de sangre directamente en los tubos SCAT169 sin un tubo de desecho inicial.

La división del cininógeno también se evaluó en muestras de sangre recolectadas en tubos SCAT169 de sujetos que tenían tipos de angioedema (tipo I/II HAE, HAE nC1-INH y EA idiopático). Se recogió plasma de sujetos sanos o sujetos que tenían varios tipos de angioedema tanto en el estado de reposo (basal) como durante un ataque (ataque) para medir la cantidad de cHMWK en varios estados de la enfermedad. Los porcentajes de cHMWK estaban claramente elevados al inicio en sujetos con HAE (n=21) en comparación con controles sanos (n=26) pero no en plasma de sujetos con angioedema idiopático (n=4) o HAEnC1 (n=5) (Figura 4), lo que sugiere una actividad limitada de calicreína plasmática, aunque no excluye el papel de la activación de la vía de contacto durante los ataques agudos en esos trastornos.

El plasma evaluado para la detección de cHMWK es vulnerable a la activación del sistema de contacto estimulada por los procedimientos y tubos de extracción. En resumen, este estudio proporciona un procedimiento refinado para la extracción de muestras de plasma para la evaluación de la activación del sistema de contacto, lo que evita la escisión de HMWK ex vivo.

Ejemplo 5: Uso de tubos de extracción de sangre al vacío para evaluar los niveles endógenos de activación del sistema de contacto en sujetos humanos

Se evaluó la utilidad de los tubos de extracción de sangre especializados (SCAT159 y SCAT153) para evaluar los niveles de cininógeno de alto peso molecular (cHMWK) escindido en plasma de sujetos sanos y aquellos con angioedema hereditario (HAE) de tipos I/II.

Brevemente, se recogieron muestras de sangre de sujetos sanos y de pacientes con HAE, durante los períodos de inactividad (basal) y brote (ataque) de la enfermedad. El porcentaje de HMWK de 2 cadenas en el plasma se detectó usando un ensayo de transferencia Western. Las muestras de plasma se recolectaron de un estudio doble ciego, multicéntrico de fase 1b de pacientes aleatorizados con HAE tipo I/II que recibieron 2 dosis subcutáneas de anticuerpo anti-pKal (DX-2930) los días 0 y 15 en grupos cerrados de 30, 100, 300 o 400 mg o placebo. Se obtuvieron muestras de sangre antes y después del anticuerpo anti-pKal (DX-2930) los días 1,8, 22, 64, 92 y 120.

Como se muestra en la Figura 5A, el porcentaje de niveles de HMWK de cadena 2 en plasma en muestras de sujetos sanos recolectadas de tres sitios clínicos diferentes (A, B y C) varió con el procedimiento de extracción y el tipo de tubo utilizado. Las muestras que usaron tubos con citrato de sodio tenían niveles más altos de HMWK de 2 cadenas, en relación con las muestras en tubos SCAT169. En particular, las muestras recolectadas en el sitio clínico C, que se recolectaron directamente en los tubos SCAT169 y no usaron un tubo de desecho antes del tubo que contenía el cóctel de inhibidores de proteasa, tenían niveles más altos de HMWK de 2 cadenas en comparación con las muestras que usaban un tubo de desecho.

De manera similar, como se muestra en la Figura 5B, el porcentaje de niveles de HMWK de cadena 2 en plasma en muestras de HAE fue mayor en los tubos con citrato de sodio en comparación con el plasma recolectado en tubos SCAT169, probablemente debido a la activación exógena del sistema de contacto asociado con la extracción y procesamiento del plasma.

Este estudio demuestra las ventajas de usar los tubos de extracción de sangre que contienen los cócteles de inhibidores de proteasa, como se describe en esta invención, y proporciona un procedimiento refinado para la extracción de muestras de plasma para la evaluación de la activación del sistema de contacto, que previene la activación aberrante del sistema de contacto (p. ej., mostrado por la escisión de HMWK) ex vivo.

Ejemplo 6: Uso de tubos de extracción de sangre al vacío para evaluar los niveles de fármacos en plasma

Se extrae sangre de pacientes con HAE tratados con DX-2930 y controles sanos mediante la práctica habitual y se coloca en tubos de extracción. Después de colocar las muestras de sangre iniciales en uno o varios tubos de extracción, se colocan 5 ml de la siguiente muestra de sangre en tubos SCAT159 o SCAT153. Luego, las muestras de sangre se procesan para producir muestras de plasma dentro de 1 hora después de la extracción de sangre.

La cantidad de DX-2930 en las muestras de plasma SCAT se mide mediante inmunoensayos estándar, por ejemplo, ELISA. Brevemente, una versión Fab de un anticuerpo monoclonal antiidiotípico contra DX-2930 se recubre sobre la superficie de una placa de 96 pocillos durante la noche y las moléculas Fab antiidiotípicas no unidas se eliminan lavando la placa varias veces. A continuación, las muestras de plasma SCAT se añaden a la placa, que se incuba a temperatura ambiente durante 2-3 horas. La placa se lava varias veces y se añade a la placa una versión IgG biotinilada de un anticuerpo monoclonal antiidiotípico contra DX-2930 seguido de una etapa de incubación y una etapa de lavado. A continuación, se añade a la placa estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Después de una incubación de 30 minutos, la placa se lava de nuevo y se examina en busca de una señal liberada por el tinte. La intensidad de la señal corresponde a la cantidad de DX-2930 en la muestra de plasma.

Ejemplo 7: Uso de tubos de extracción de sangre al vacío para evaluar la inmunogenicidad de fármacos

Muestras de plasma de pacientes con HAE tratados con DX-2930 se preparan a partir de muestras de sangre recolectadas en tubos SCAT159 o SCAT153, como se describió anteriormente. Los anticuerpos anti-DX-2930 en la muestra de plasma se aíslan mediante extracción en fase sólida y disociación ácida (SPEAD).

Brevemente, las muestras de plasma se incuban con DX-2930 biotinilado y se incuban durante la noche. Luego, la mezcla se coloca en una placa recubierta con estreptavidina para capturar DX-2930 biotinilado, que se une a los anticuerpos anti-DX-2930 en la muestra de plasma, si los hay. Los anticuerpos anti-DX-2930 luego se liberan mediante tratamiento con ácido y se recubren directamente en una placa Meso Scale Discovery (MSD). Se añade DX-2930 marcado con rutenio a la placa MSD y se mide una señal electroquimioluminiscente para detectar la presencia de anticuerpos anti-DX-2930.

OTRAS REALIZACIONES

Todas las características divulgadas en esta especificación pueden combinarse en cualquier combinación. Cada característica divulgada en esta especificación puede ser reemplazada por una característica alternativa que tenga el mismo propósito, equivalente o similar. Por ende, a menos que se establezca expresamente lo contrario, cada característica descrita solo es un ejemplo de una serie genérica de características equivalentes o similares.

EQUIVALENTES Y ALCANCE

Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar sin utilizar nada más que los experimentos de rutina muchos equivalentes de realizaciones específicas de la descripción de esta invención. No se pretende limitar el alcance de la presente invención a la descripción que antecede, sino que se establece en las reivindicaciones adjuntas.

En las reivindicaciones, los artículos tales como «un», «uno/a» y «el/la» pueden significar uno o más a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen «o» entre uno o más miembros de un grupo se consideran cumplidas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, se utilizan para un producto o procedimiento dado, o son pertinentes de otro modo, a menos que se indique lo contrario o que sea evidente de otra forma a partir del contexto. La invención incluye realizaciones donde está presente exactamente un miembro del grupo en un producto o procedimiento dado, se utiliza o es pertinente de otro modo para este. La invención incluye realizaciones donde más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en un producto o procedimiento dado, se utilizan en este, o son pertinentes de otro modo para este.

Además, debe entenderse que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones enumeradas se introduce en otra reivindicación. Por ejemplo, cualquier reivindicación que depende de otra reivindicación puede ser modificada para incluir una o más limitaciones que se encuentran en cualquier otra reivindicación que depende de la misma reivindicación base. En los casos en que los elementos se presentan como listas, por ejemplo, en formato de grupo Markush se debe entender que también se describe cada subgrupo de los elementos y cualquier elemento se puede retirar del grupo. Se debe entender que, en general, en los casos en que se hace referencia a la invención o aspectos de la invención como que comprende/n elementos, rasgos particulares, etc., determinadas realizaciones de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente en, estos elementos, rasgos, etc. Por razones de simplicidad, esas realizaciones no se establecieron específicamente en cada caso con tanto detalle en la presente invención. Se destaca que el término "que comprende" pretende ser abierto y permite la inclusión de elementos o etapas adicionales. Cuando se proporcionan intervalos, se incluyen criterios de valoración. Además, se debe entender que, a menos que se indique lo contrario, o sea evidente de otro modo mediante el contexto y la comprensión de un experto en la técnica, los valores que se expresan como intervalos pueden adoptar cualquier valor o subintervalo específico dentro de los intervalos establecidos en las diferentes realizaciones de la invención, hasta una décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Además, debe entenderse que cualquier realización particular de la presente invención que quede comprendida dentro de la técnica previa puede ser excluida explícitamente de cualquiera de las reivindicaciones. Dado que dichas realizaciones se consideran conocidas para un experto en la técnica, pueden excluirse, aunque la exclusión no se establezca explícitamente en la presente. Cualquier realización particular de las composiciones de la invención puede ser excluida de cualquiera de las reivindicaciones, por cualquier motivo, ya sea o no que esté relacionado con la existencia de la técnica previa.

Los expertos en la técnica reconocerán o podrán determinar usando solamente experimentación habitual, diversos equivalentes de las realizaciones y los procedimientos específicos descritos en esta invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un tubo de extracción de sangre al vacío, que comprende una formulación líquida que comprende una mezcla de inhibidores de proteasa, citrato trisódico, ácido cítrico y dextrosa; donde la mezcla de inhibidores de proteasa consiste en benzamidina, inhibidor de tripsina de soja, leupeptina, clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil) bencenosulfonilo (AEBSF), polibreno y EDTA.

2. El tubo de extracción de sangre al vacío de la reivindicación 1, donde el tubo es un tubo que no es de vidrio, opcionalmente donde el tubo es un tubo de plástico.

3. El tubo de extracción de sangre al vacío de la reivindicación 1 o 2, donde la benzamidina está en una concentración de 80-120 mM de benzamidina, el inhibidor de tripsina de soja está en una concentración de 1 -3 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja, la leupeptina está en una concentración de 200-300 pM de leupeptina, y el AEBSF está en una concentración de 10-30 mM de AEBSF.

4. El tubo de extracción de sangre al vacío de la reivindicación 3, donde la concentración de benzamidina es 100 mM, la concentración de inhibidor de tripsina de soja es 2 mg/mL, la concentración de leupeptina es de 263 pM de leupeptina y la concentración de AEBSF es de 20 mM de AEBSF.

5. El tubo de extracción de sangre al vacío de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, donde:

(a) el polibreno está en una concentración de 400 pg/mL y el EDTA está en una concentración de 20 mM, el citrato trisódico está en una concentración de 100 mM, y el ácido cítrico está en una concentración de 67 mM, y la dextrosa es 2 %;

(b) la formulación líquida tiene un pH de 4-6, donde opcionalmente la formulación líquida tiene un pH de 4,5; (c) donde el tubo contiene 0,5 ml de la formulación líquida; y/o

(d) la mezcla de inhibidores de proteasa está sustancialmente libre de inhibidores de proteasa que son inestables en una solución acuosa.

6. Un procedimiento para evaluar el nivel endógeno de activación del sistema de contacto en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar sangre extraída de un sujeto en el tubo de extracción de sangre al vacío de cualquiera de las reivindicaciones 1-5;

(ii) procesar la sangre para producir una muestra de plasma; y

7. El procedimiento de la reivindicación 6, donde en la etapa (i), el tubo de extracción de sangre al vacío no es el primer tubo lleno de sangre del sujeto y/o la etapa (ii) se realiza en el plazo de una hora después de que se recogiera la sangre del sujeto.

8. El procedimiento cualquiera de las reivindicaciones 6-7, donde el sujeto es un sujeto humano, opcionalmente donde el sujeto humano:

(a) es un paciente humano que tiene una enfermedad asociada con el sistema de contacto, opcionalmente donde la enfermedad es HAE o angioedema idiopático, por ejemplo, donde el paciente humano tiene HAE con C1-INH normal;

(b) ha sido tratado con un fármaco dirigido a un componente del sistema de contacto, opcionalmente donde el componente del sistema de contacto es calicreína plasmática, por ejemplo, donde el fármaco inhibe la calicreína plasmática activa, opcionalmente donde el fármaco es un anticuerpo que se une a la calicreína del plasma activo.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, donde la etapa (iii) se realiza midiendo el nivel de uno o más biomarcadores indicativos de la activación del sistema de contacto,

opcionalmente, donde uno o más biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en precalicreína, calicreína plasmática activa (pKal), complejo a2M-pKal, factor activo XII, factor activo XI, cininógeno de alto peso molecular (HMWK) y un metabolito de bradicinina,

por ejemplo, en el que uno o más biomarcadores comprenden HMWK escindido y/o HMWK intacto.

10. Un procedimiento para evaluar el nivel de un fármaco dirigido al sistema de contacto en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar sangre recogida de un sujeto en el tubo de recogida de sangre al vacío de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, habiéndose administrado al sujeto un fármaco que se dirige a un componente del sistema de contacto;

(ii) procesar la sangre para producir una muestra de plasma; y

(iii) medir el nivel del fármaco en la muestra de plasma.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, donde:

(a) en la etapa (i), el tubo de extracción de sangre al vacío no es el primer tubo que se llena con sangre del sujeto; (b) la etapa (ii) se realiza dentro de la hora siguiente a la extracción de sangre del sujeto;

(c) el sujeto es un sujeto humano, opcionalmente donde el sujeto humano es un paciente humano que tiene una enfermedad asociada con el sistema de contacto, por ejemplo, donde la enfermedad es HAE; y/o

(d) el fármaco inhibe la calicreína plasmática activa, opcionalmente donde el fármaco es un anticuerpo que se une a la calicreína plasmática activa.

12. Un procedimiento para evaluar la inmunogenicidad de un fármaco dirigido al sistema de contacto, comprendiendo el procedimiento:

(ii) procesar la sangre para producir una muestra de plasma; y

13. El procedimiento de la reivindicación 12, donde:

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde el procedimiento comprende además, antes de la etapa (iii), aislar anticuerpos que se unen al fármaco de la muestra de plasma.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, donde los anticuerpos se aíslan mediante un ensayo de extracción en fase sólida y disociación ácida (SPEAD).