ES2934669T3 - Uso de campos eléctricos alternos para aumentar la permeabilidad de la membrana celular - Google Patents
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Abstract
Ciertas sustancias (p. ej., moléculas grandes) que normalmente no pueden atravesar la membrana celular de las células pueden introducirse en las células aplicando un campo eléctrico alterno a la célula durante un período de tiempo, en el que la frecuencia del campo eléctrico alterno se selecciona de modo que la aplicación del campo eléctrico alterno aumenta la permeabilidad de la membrana celular. Una vez aumentada la permeabilidad de la membrana celular, la sustancia es capaz de atravesar la membrana celular. Este enfoque es particularmente útil en el contexto de las células cancerosas (p. ej., glioblastoma). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Uso de campos eléctricos alternos para aumentar la permeabilidad de la membrana celular
ANTECEDENTES
[0001] El tratamiento del glioblastoma (GBM) usando campos eléctricos alternos es una terapia novedosa y validada que se ha convertido en una modalidad adicional (quimiorradiación y quimioterapia después de la cirugía) para los tratamientos contra el cáncer. Los campos eléctricos alternos de frecuencia intermedia (100-500 kHz) se han estudiado en detalle. Más recientemente, se ha demostrado que TTFields prolonga la mediana de supervivencia (en 5 meses) de los pacientes con glioblastoma que reciben quimioterapia de mantenimiento con temozolomida. En el contexto del tratamiento de tumores, los campos eléctricos alternos a estas frecuencias a menudo se denominan "campos de tratamiento de tumores" o "TTFields".
[0002] Existen muchas hipótesis sobre el mecanismo de TTFields, pero el mecanismo más ampliamente propuesto ("estándar") de acción anticancerígena por TTFields se centra en la propiedad de que las subunidades de tubulina tienen momentos dipolares intrínsecos. Al obligar a las estructuras de microtúbulos a alinearse a lo largo de líneas de campo eléctrico alternas a través de la imposición exógena de campos TTF de 200 kHz, la funcionalidad de las células que se dividen activamente se interrumpe a través de la interferencia con el citoesqueleto que soporta los husos mitóticos. Tal estrés finalmente promueve la proliferación celular deteriorada. Se han producido experimentos de prueba de concepto y desarrollos tecnológicos relevantes en los últimos diez años, que culminaron con la aprobación por parte de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de un dispositivo TTFields clínico comercial (Optune®, Novocure Ltd.) para el tratamiento de la recurrencia y glioblastoma recién diagnosticado.
[0003] Durante los últimos años, se han informado detalles adicionales sobre los mecanismos de acción. Por ejemplo, se ha demostrado que TTFields interrumpe la localización de septinas (proteínas intracelulares responsables de anclar los husos mitóticos durante la división celular) y, por lo tanto, perturba la mitosis. Algunos equipos han informado de la prolongación del daño en el ADN por la quimioterapia o la radioterapia junto con TTFields, mientras que otros han mostrado efectos sobre la función mitocondrial a través de la inflamación de las matrices mitocondriales. Otros equipos exploraron la combinación de quimioterapias (p. ej., temozolomida) con TTFields en pacientes con GBM. Dicha investigación sobre intervenciones combinadas ha descubierto otros efectos prometedores contra el glioblastoma. El documento WO2015175570 describe un tratamiento selectivo de células que implica aplicar pulsos eléctricos con un retraso entre pulsos sucesivos a un tejido en el que la duración de cada pulso y el retraso entre pulsos sucesivos se optimizan para producir zonas de tratamiento.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0004] Un aspecto de la invención se refiere a un primer aparato para tratar un tumor en el cuerpo de un sujeto y facilitar la administración de una sustancia a través de las membranas celulares en el cuerpo del sujeto. El primer aparato comprende un generador de voltaje CA capaz de operar a una primera frecuencia entre 50 y 500 kHz y una segunda frecuencia entre 50 y 500 kHz. Donde la segunda frecuencia es diferente de la primera frecuencia. El generador de voltaje de CA tiene una entrada de control, y el generador de voltaje de CA está configurado para generar la primera frecuencia cuando la entrada de control está en un primer estado y para generar la segunda frecuencia cuando la entrada de control está en un segundo estado. El primer aparato también comprende un controlador programado para (a) colocar la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje de CA emita la segunda frecuencia, (b) aceptar una solicitud para cambiar a la primera frecuencia, (c) al recibir la solicitud, coloque la entrada de control en el primer estado para que el generador de voltaje de CA emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo, y (d) después de que haya transcurrido el intervalo de tiempo, coloque la entrada de control en el segundo estado para que el El generador de voltaje de CA emite la segunda frecuencia. El campo eléctrico alterno tiene una intensidad de campo de entre 1 V/cm RMS y 4 V/cm RMS.
[0005] Algunas formas de realización del primer aparato comprenden además un conjunto de electrodos configurados para fijarse al cuerpo del sujeto; y cableado que conecta una salida del generador de tensión CA al conjunto de electrodos.
[0006] En algunas formas de realización del primer aparato, la primera frecuencia está entre 250 kHz y 350 kHz, y la segunda frecuencia está entre 150 kHz y 250 kHz. En algunas formas de realización del primer aparato, la primera frecuencia está entre 125 kHz y 175 kHz, y la segunda frecuencia está entre 75 kHz y 125 kHz. En algunas formas de realización del primer aparato, la primera frecuencia está entre 75 kHz y 175 kHz, y la segunda frecuencia está entre 100 kHz y 300 kHz. En algunas formas de realización del primer aparato, el intervalo de tiempo es de al menos 12 horas. En algunas formas de realización del primer aparato, el intervalo de tiempo está entre 12 y 72 horas. En algunas formas de realización del primer aparato, el controlador está además programado para, después de la recepción de la solicitud, conmutar la entrada de control de un lado a otro entre el primer estado y el segundo estado.
[0007] En algunas formas de realización del primer aparato, el generador de voltaje de CA es capaz de operar al menos una frecuencia adicional entre 50 y 500 kHz, y el
[0008] generador de voltaje de CA está configurado para generar al menos una frecuencia adicional cuando el la entrada de control está en al menos un estado adicional, y el controlador está programado para hacer circular la entrada de control a través del segundo estado y al menos un estado adicional antes de recibir la solicitud, y para hacer circular la entrada de control a través del segundo estado y el estado adicional. al menos un estado adicional después de que haya transcurrido el intervalo de tiempo.
[0009] Algunas formas de realización del primer aparato comprenden además una interfaz de usuario, y la solicitud se acepta a través de la interfaz de usuario. En algunas formas de realización del primer aparato, la solicitud se acepta a través de RF.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0010]
FIG. 1 es una ilustración esquemática que muestra un efecto alternativo de TTFields sobre la modulación de la integridad y, por lo tanto, la permeabilidad de las membranas celulares.
FIG. 2A representa efectos ejemplares de TTFields sobre la bioluminiscencia de células U87-MG/eGFP-fLuc a partir de exploraciones de imágenes bioluminiscentes en función del tiempo en TTFields frente a condiciones sin TTFields.
FIG. 2B representa los efectos ejemplares de TTFields en la fluorescencia de eGFP para células U87-MG/eGFP-fLuc en función del tiempo en TTFields frente a condiciones sin TTFields.
FIG. 2C representa el efecto de TTFields en la bioluminiscencia de fLuc (fLuc-BLI) sobre la proporción de fluorescencia de eGFP (eGFP-FL) para células U87-MG/eGFP-fLuc en función de la duración de la exposición de TTFields.
FIG. 2D representa el efecto de la exposición a TTFields frente a la no exposición en la relación fLuc-BLI/eGFP-FL en función del tiempo de exposición de TTFields.
FIG. 3A representa los efectos ejemplares de TTFields sobre la captación dependiente del tiempo de etidio D en células U87-MG/eGFP-fLuc entre ningún TTFields y TTFields (200 kHz).
FIGS. 3B-3D representan el impacto ejemplar de TTFields frente a condiciones sin TTFields en el curso temporal de la captación de dextrano-FITC para dextrano-FITC de 4 kDa, dextrano-FITC de 20 kDa y dextrano-FITC de 50 kDa, respectivamente.
FIG. 4A representa el efecto ejemplar de TTFields (200 kHz) sobre la captación de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) como se muestra mediante la fluorescencia representativa de protoporfirina IX (PpIX) para TTFields frente a células U87-MG no expuestas a TTFields a las 6 y 24 horas.
FIG. 4B muestra cómo cambió la fluorescencia de PpIX con el tiempo en células de glioblastoma frente a fibroblastos en las plataformas de cocultivo que se sometieron a TTFields.
FIG. 5 proporciona la cuantificación del número y el tamaño de los orificios a partir de una comparación SEM de los orificios de la membrana plasmática en células U87-MG/eGFP-fLuc expuestas y no expuestas a TTFields durante 3 días.
FIG. 6 proporciona la cuantificación del número y el tamaño de los orificios a partir de una comparación SEM de los orificios de la membrana plasmática en células PCS-201 humanas normales expuestas y no expuestas a TTFields durante 3 días.
FIG. 7A-7C representan los resultados de experimentos que muestran cómo los campos eléctricos alternos aumentan de forma reversible la captación en células U87-MG de D-Luciferina, 5-ALA y Dextrano-FITC (4 kDa), respectivamente.
FIG. 7D representa los resultados de un experimento que muestra las características de tiempo de la permeabilidad inducida por la aplicación de TTFields a las células U87-MG.
FIG. 8A representa los resultados de un experimento que muestra cómo los campos eléctricos alternos afectan la permeabilidad de las membranas celulares MDA-MB-435 a 7-AAD.
FIG. 8B representa los resultados de un experimento que muestra cómo los campos eléctricos alternos afectan la permeabilidad de las membranas celulares resistentes a la doxiciclina MDA-MB-435 y MDA-MB-435 a la doxorrubicina.
FIG. 8C representa los resultados de un experimento que muestra cómo los campos eléctricos alternos afectan la permeabilidad de las membranas celulares resistentes a la mitoxantrona MCF-7 y MCF-7.
FIGS. 9A-9G representan el efecto de TTFields sobre la sensibilidad a siete combinaciones diferentes de sustancias y tipos de células correspondientes.
FIGS. 10A y 10B representan cada una una relación temporal adecuada entre la aplicación del campo eléctrico alterno y la introducción de la sustancia en las inmediaciones de la célula cancerosa.
FIG. 11A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células U-87 MG.
FIG. 11B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células U-87 MG.
FIG. 12A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células MES-SA.
FIG. 12B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA.
FIG. 12C representa los resultados de un experimento para determinar cómo los campos eléctricos alternos de 150 kHz afectan la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA a la doxorrubicina. FIG. 13A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células MCF-7.
FIG. 13B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de células MCF-7.
FIG. 14 representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células GBM39/Luc.
FIG. 15 es un diagrama de bloques de un aparato de doble frecuencia que genera una primera frecuencia para inducir la permeabilidad celular y una segunda frecuencia para inducir la citotoxicidad.
[0011] A continuación, se describen en detalle diversas formas de realización con referencia a los dibujos adjuntos, en los que los mismos números de referencia representan elementos similares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS
[0012] Como se usa aquí, el término "reducir la viabilidad" de una célula se refiere a reducir el crecimiento, proliferación o supervivencia de la célula, o aumentar la citotoxicidad de la célula.
[0013] Esta solicitud describe un enfoque novedoso para aumentar temporalmente la permeabilidad de las membranas de las células plasmáticas de las células cancerosas utilizando campos eléctricos alternos para que las sustancias que normalmente están bloqueadas por la membrana celular puedan cruzar la membrana celular, o para que las sustancias que normalmente son impedidas por la membrana celular podrán atravesar la membrana celular más fácilmente. En algunos de los ejemplos descritos en el presente documento, este enfoque se utiliza para aumentar temporalmente la permeabilidad de las membranas de células plasmáticas de glioblastoma utilizando campos eléctricos alternos, de modo que las sustancias que normalmente se ven obstaculizadas por la membrana celular de glioblastoma puedan cruzar la membrana celular de glioblastoma más fácilmente.
[0014] Los inventores han demostrado que el tratamiento con TTFields, junto con un nuevo compuesto anticancerígeno Withaferin A, inhibía sinérgicamente el crecimiento de células de glioblastoma humano. Los inventores plantearon la hipótesis de que tal efecto sinérgico se debe a la mayor accesibilidad de Withaferin A a las células de glioblastoma a través de la capacidad de TTFields para aumentar transitoriamente la permeabilidad de la membrana de la célula tumoral, como se representa esquemáticamente en la FIG. 1. En esta figura, 5-ALA = ácido 5-aminolevulínico; etidio D = bromuro de etidio; y FITC = isotiocianato de fluoresceína.
[0015] Luego se realizaron estudios que validan la hipótesis. En particular, se encontró evidencia que muestra que la exposición a TTFields indujo una mayor bioluminiscencia en células de glioblastoma humano que han sido modificadas para expresar luciferasa (renilla y luciérnaga), y que esta inducción se debe a una mayor permeación de los sustratos (D-luciferina y coelenterazina, respectivamente), a través de la membrana plasmática. También se demostró el aumento de la permeabilidad de la membrana causado por la exposición a TTFields con otros reactivos que penetran la membrana, como Dextrano-FITC y Etidio D.
[0016] También se demostró el uso de TTFields para aumentar la permeabilidad de la membrana en células de glioblastoma usando ácido 5-aminolevulínico (5-ALA). El 5-ALA es un precursor de la hemoglobina que se convierte en protoporfirina IX fluorescente (PpIX) en todas las células de los mamíferos. Sin embargo, muchas células malignas, incluidos los gliomas de alto grado, tienen una biosíntesis de hemoglobina elevada, lo que se refleja en una mayor acumulación de PpIX dentro de las células y tejidos transformados (en comparación con las células no cancerosas). Esta propiedad ha llevado a muchas investigaciones médicas a utilizar la captación de 5-ALA (y, en consecuencia, su conversión enzimática a PpIX) como biomarcador fluorescente para células tumorales. Sin embargo, con el nivel actual de tecnología, puede ser difícil distinguir el margen celular preciso entre tejido tumoral y no tumoral intraoperatoriamente. Los experimentos descritos en este documento muestran que TTFields mejora significativamente la proporción de células tumorales a células normales para la fluorescencia de PpIX (provocada por la exposición y captación de 5-ALA) y, de esta manera, se puede usar para delinear mejor los márgenes tumorales en entornos intraoperatorios.
[0017] Experimentos adicionales que utilizan datos de microscopía electrónica de barrido (SEM) demuestran un aumento en el número y el tamaño de los orificios en las membranas celulares de glioblastoma causados por la exposición a TTFields, y que la morfología de la membrana celular de glioblastoma se altera cuando se aplican TTFields. A través de todas las modalidades estudiadas (bioluminiscencia, fluorescencia y SEM), se encontró que los efectos de TTFields en la permeabilidad de la membrana celular de GBM eran reversibles después del cese de la exposición a TTFields.
RESULTADOS
La inducción de TTFields aumenta la bioluminiscencia (BLI) en glioblastomas que expresan luciferasa.
[0018] Se sembraron células U87-MG/eGFP-fLuc en cubreobjetos de vidrio Thermanox, se dejaron sedimentar y crecer, y luego se sometieron a TTFields o a ningún TTFields. En este experimento, el uso de TTFields (4 V/cm, 200 kHz, 0,5-24 h de duración) aumentó significativamente la intensidad de bioluminiscencia (BLI) de las células U87-MG/eGFP-fLuc en comparación con las condiciones no expuestas. Este aumento en BLI ocurrió tan pronto como 30 minutos después del comienzo de TTFields y continuó hasta las 24 h de exposición a TTFields. Cuando se realizó la cuantificación del ROI, el curso temporal de la intensidad de BLI para las muestras expuestas a TTFields fue significativamente mayor en comparación con las muestras no expuestas a TTFields (p < 0,0001, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields). Los datos que representan la cuantificación temporal de los resultados de BLI de estos experimentos se resumen en la FIG. 2A. Sin estar vinculado por esta teoría, se cree que la elevación de la bioluminiscencia no se debió a un efecto directo de TTFields en la actividad de la luciferasa de luciérnaga porque la exposición de la luciferasa de luciérnaga purificada a TTFields de 200 kHz condujo a una pérdida de más de 1000 veces en la actividad enzimática 60 minutos después del inicio de TTFields.
[0019] La FIG. 2B representa el efecto de TTFields en fluorescencia eGFP en células U87-MG/eGFP-fLuc observada a partir del transcurso del tiempo de imágenes representativas (no mostradas) para U87-MG/eGFP-fLuc expuesto frente a TTFields no expuesto. La presencia de TTFields no aumentó significativamente la fluorescencia de eGFP (eGFP-FL) en el transcurso de los experimentos. Cuando se compararon las proporciones de BLI sobre eGFP-FL entre muestras con TTFields frente a muestras sin TTFields, hubo una proporción significativamente mayor con respecto al tiempo de incubación con TTFields para las muestras con TTFields, como se representa en las FIGS. 2C, 2D (p < 0,0001, ANOVA bidireccional, TTFields frente a sin TTFields). Más específicamente, la FIG. 2C representa el efecto de TTFields en la proporción de bioluminiscencia fLuc (fLuc-BLI) sobre fluorescencia eGFP (eGFP-FL) para células U87-MG/eGFP-fLuc en función de la duración de la exposición a TTFields; y la figura. 2D representa el efecto de la exposición a TTFields frente a la no exposición en la relación fLuc-BLI/eGFP-FL en función del tiempo de exposición de TTFields (horas). TTFields disminuyó significativamente la actividad de la luciferasa de luciérnaga purificada en comparación con ningún TTFields (p < 0,01, ANOVA bidireccional, TTFields frente a ningún TTFields).
[0020] La aplicación de TTFields a lo largo del tiempo en otra línea celular de glioblastoma derivada de un paciente, GBM2/GFP-fLuc, también indujo un aumento dependiente del tiempo en la bioluminiscencia en células GBM2/GFP-fLuc expuestas a TTFields en comparación con controles sin TTFields (p < 0,0001, ANOVA bidireccional, TTFields frente a ningún TTFields). Este mismo efecto se observó en una línea celular de astrocitoma murino (KR158B) que se modificó genéticamente para expresar la proteína de fusión de proteína fluorescente tratada con luciferasa de Renilla (p < 0,0001, ANOVA bidireccional, TTFields frente a ningún TTFields). La actividad de la luciferasa de renilla no depende del ATP y el magnesio (a diferencia de la luciferasa de luciérnaga). Por lo tanto, se cree que la inducción de bioluminiscencia por parte de TTFields no se debió a alteraciones en las reservas endógenas de ATP.
Efecto de TTFields sobre la captación de reactivos de asociación de membrana.
[0021] Para probar si la imposición de TTFields afecta las propiedades de la membrana celular y, por lo tanto, la permeabilidad de la membrana, se determinó el efecto de los TTFields sobre el comportamiento de los reactivos marcados con fluorescencia que se unen a la membrana celular. Inicialmente, se midió el impacto de TTFields en la unión de Anexina-V-APC a la membrana de las células U87-MG/eGFP-fLuc. La unión de Anexina-V-APC es una firma de apoptosis temprana que se caracteriza por el encrespamiento de la membrana. Se usó un control positivo para la apoptosis (adición de Withaferin A 21 mM a células U87-MG/eGFP-fLuc) para evaluar la visibilidad de la unión de Anexina-V-APC a células U87-MG/eGFP-fLuc, y mostró que dicha unión podría visualizarse mediante microscopía de fluorescencia sobre muestras
no expuestas a TTFields. Sin embargo, cuando se aplicaron TTFields a células U87-MG/eGFP-fLuc, no se observó la unión de Anexina-V-APC en ningún momento de exposición a TTFields. Por lo tanto, parece que TTFields no indujo ningún grado significativo de apoptosis en las células U87-MG.
[0022] En particular, la captación de etidio D aumentó significativamente cuando las células U87-MG/eGFP-fLuc se sometieron a campos TTFields de 200 kHz. como se representa en la FIG. 3A (p < 0,0001, ANOVA de dos vías, TTFields frente a ningún TTFields). El etidio D penetra tanto a través de la membrana plasmática como de la membrana nuclear y se intercala en el ADN genómico. Por lo tanto, estos resultados sugieren que TTFields puede tener un efecto sobre la permeabilidad de las membranas plasmáticas en las células U87-MG/eGFP-fLuc.
[0023] Otra consecuencia de la permeabilidad de membrana mejorada por TTFields son las alteraciones en la unión de dextrano-FITC en la membrana celular. Se sabe que Dextrano-FITC se une e intercala en la membrana plasmática. Cuando las células U87-MG se sometieron a 1 h de TTFields de 200 kHz, hubo una captación significativa de Dextrano-FITC de pesos moleculares de 4 kDa y 20 kDa, en comparación con la exposición sin TTFields, como se muestra en las FIGS. 3B y 3C. Pero no hubo una diferencia significativa en la absorción de 50 kDa Dextran-FITC, como se muestra en la FIG. 3D. Más específicamente, se examinó la unión de Dextran-FITC en presencia de TTFields durante un período de 0,5 a 24 h de exposición, se encontró un aumento significativo en la captación de 4 kDa Dextran-FITC en comparación con las muestras no expuestas a TTFields (p < 0,0001, bidireccional). ANOVA, TTFields vs. no TTFields), un aumento significativo en la absorción de 20 kDa Dextran-FITC bajo exposición a TTFields (p < 0.01, TTFields vs. no TTFields) y ninguna diferencia significativa en la absorción de 50 kDa Dextran-FITC bajo exposición a TTFields (p= 0,26, no significativo, TTFields frente a ningún TTFields). Estos datos sugieren que el tamaño máximo de Dextrano-FITC que se unió y entró en la membrana plasmática bajo la exposición de TTFields en este experimento fue de aproximadamente 20 a 50 kDa. En todas las comparaciones estadísticas descritas en este párrafo, cada punto de datos representa n = 3 experimentos. En las FIGS. 3A-3D, APC = aloficocianina; etidio D = bromuro de etidio; y FITC = isotiocianato de fluoresceína.
Efecto de TTFields en la absorción de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA): cultivo único de U87-MG.
[0024] Se realizaron experimentos para determinar los efectos de TTFields sobre la captación de 5-ALA (medida por la acumulación de PpIX y su fluorescencia resultante) en células de glioblastoma. Debido a que es difícil distinguir el margen entre las células tumorales y las células normales utilizando el presente bioensayo de 5-ALA, se utilizó la medición de la fluorescencia de PpIX para solucionar este problema. Se llevaron a cabo investigaciones para determinar si la penetración de 5-ALA a través de la membrana celular y hacia las células de glioblastoma podría aumentar con la exposición a TTFields. Las células U87-MG se expusieron o no se expusieron a TTFields, cada una durante 6-24 h. Los resultados, que se resumen en la FIG. 4A, fueron los siguientes: la exposición a TTFields resultó en un aumento significativo de la captación de 5-ALA en células U87-MG/eGFP-fLuc tan pronto como 6 h de exposición a TTFields (p = 0,047, prueba t de Student, TTFields frente a sin TTFields) y este aumento se mantuvo con la exposición prolongada a TTFields de 24 h (p = 0,011).
[0025] Para generar los datos representados en la FIG. 4A, se obtuvieron paneles de fluorescencia de protoporfirina IX (PpIX) para células U87-MG no expuestas a TTFields frente a expuestas a TTFields después de 6 y 24 h de exposición. La cuantificación de esas imágenes en a mostró un aumento significativo en las señales de PpIX en las células expuestas a TTFields en comparación con las células sin TTFields, tanto a las 6 h (p = 0,047) como a las 24 h (p = 0,01) en los puntos temporales. Todas las comparaciones estadísticas monovariantes entre muestras sin TTFields y TTFields realizadas mediante la prueba t de Student para n = 3 experimentos por punto de tiempo.
Efecto de TTFields en la captación de ácido 5-aminolevulínico: U87-MG GBM en cocultivos de fibroblastos PCS-201.
[0026] Durante la resección de glioblastoma en pacientes, se usa 5-ALA para ayudar a los neurocirujanos a delimitar entre los tumores y el tejido cerebral normal circundante. Del mismo modo, para distinguir las diferencias en la captación de 5-ALA entre las células de glioblastoma y las normales, se desarrolló un cocultivo en el que se sembraron células U87-MG en el centro de un lecho de fibroblastos PCS-201 y se sometieron a TTFields o a ningún TTFields. Las fotomicrografías fluorescentes y de campo claro confirmaron la presencia de regiones discretas de células de glioblastoma frente a fibroblastos en la configuración de cocultivo. Cuando los cocultivos se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E), las microfotografías revelaron un número reducido de células GBM que se infiltraban en la periferia de los fibroblastos para las muestras expuestas a TTFields.
[0027] En particular, sin exposición a TTFields, las células GBM formaron muchas bolsas de neuroesferas adherentes como se informó anteriormente. Las imágenes de fluorescencia mostraron un aumento de la fluorescencia de PpIX en células de glioblastoma frente a fibroblastos en las plataformas de cocultivo que se sometieron a TTFields durante 6 h. Los resultados, que se resumen en la FIG. 4B, fueron los siguientes: la fluorescencia de PpIX se acumuló a lo largo del tiempo, pero la tasa de aumento de la intensidad de la fluorescencia aumentó significativamente (p < 0,001, ANOVA bidireccional, TTFields frente a sin TTFields) para cocultivos expuestos a TTFields en comparación con cocultivos no expuestos a TTFields. culturas Para generar los datos representados en las FIGS.4B, se obtuvieron paneles fluorescentes de captación de 5-ALA (y fluorescencia PpIX posterior, Ex = 558 nm, Em = 583 nm) sin TTFields y TTFields. La duración
de las exposiciones es de 2, 6 y 24 h. Cuantificación del curso temporal de la acumulación de PpIX (y, por lo tanto, la acumulación de flujo fluorescente expresado como fotones/s) en la plataforma de cultivo conjunto de glioblastomafibroblastos en condiciones TTFields expuestas frente a no expuestas (p < 0,001). Los análisis estadísticos consistieron en ANOVA de dos vías para condiciones sin TTFields vs. TTFields, y n = 3 experimentos por punto de tiempo.
[0028] En un conjunto separado de experimentos, a las 24 h de la aplicación de TTFields, la proporción de intensidad de fluorescencia de PpIX en las células de glioblastoma U87-MG sobre las células de fibroblastos PCS-201 circundantes aumentó significativamente en comparación con la proporción de intensidad de fluorescencia para células co-cultivadas en condiciones sin TTFields (p = 0,043, ANOVA de dos vías, TTFields frente a sin TTFields).
La micrografía electrónica de barrido (SEM) muestra que TTFields altera la morfología de la membrana de las células U87-MG/eGFP-fLuc.
[0029] Se obtuvieron imágenes SEM de células U87-MG/eGFP-fLuc de baja densidad (5000 células/cubreobjetos) que no se expusieron a TTFields o se expusieron a TTFields durante 3 días con aumentos de 2000X, 20.000X y 60.000X. Los datos obtenidos mediante la revisión de estas imágenes SEM se resumen en la FIG. 5. Hubo un número significativamente mayor de orificios de tamaño superior a 51,8 nm2 (equivalente a 9 píxeles2 con un aumento de 60.000X) dentro del ROI de las células expuestas a TTFields (53,5 ± 19,1) en comparación con las células no expuestas a TTFields (23,9 ± 11,0), (p = 0,0002, prueba univariada de Mann-Whitney). El tamaño promedio de los agujeros dentro del ROI también fue significativamente mayor en las células expuestas a TTFields (240,6 ± 91,7 nm2) en comparación con las células no expuestas a TTFields (129,8 ± 31,9 nm2), (p = 0,0005 (prueba univariada de Mann-Whitney)). Para obtener los datos representados en la FIG. 5, la cuantificación y la comparación entre células expuestas y no expuestas de TTFields del número y tamaño de los orificios se realizó dentro de una región circular de interés de 500 nm de radio. El corte del tamaño mínimo del orificio se basó en los radios de Stokes de 3,3 y 5,0 nm de 20 kDa y 50 kDa de dextrano-FITC, respectivamente. Se usaron cubreobjetos de tres experimentos por condición, y se analizaron al menos 5 células por cubreobjetos para el recuento y el tamaño de los orificios, de manera doble ciego.
[0030] También se observaron visualmente los efectos de una exposición de 24 h a TTFields sobre las membranas plasmáticas de células U87-MG sembradas a alta densidad. Para las muestras sin TTFields, la superficie celular parecía estar cubierta de extensiones de membrana densamente apelmazadas, alargadas y aplanadas, similares a volantes de membrana y contiguas a la membrana celular. Por el contrario, después de 24 horas de exposición a TTFields, las estructuras densamente enmarañadas y alargadas fueron reemplazadas por estructuras cortas, bulbosas y similares a vesículas.
[0031] Para comparación, también se obtuvieron y analizaron imágenes SEM de células PCS-201 humanas normales. Se sembraron células PCS-201 a baja densidad (5000 células por cubreobjetos de vidrio de 13 mm). Las células se cultivaron en condiciones estándar de cultivo de tejidos (37 °C, 95 % O2 , 5 % CO2). Las células no expuestas a TTFields se dejaron en esas condiciones durante la duración del estudio. Otras células se expusieron a TTFields durante 72 h. Después de 72 horas, las imágenes SEM se obtuvieron con aumentos de 2000X, 20000X y 60000X. Cuantificación y comparación entre células expuestas y no expuestas de TTFields del número y tamaño de agujeros con área > 51,8 nm2 (equivalente a un círculo de radio de 4 nm, o 9 píxeles2 en las imágenes de 60.0003 aumentos) dentro de una región circular de interés de 500 nm de radio. El corte del tamaño mínimo del orificio se basó en los radios de Stokes de 3,3 nm y 5,0 nm de 20 kDa y 50 kDa de dextrano-FITC, respectivamente. Los resultados, que se representan en la FIG. 6, fueron los siguientes: No hubo una diferencia significativa en el número o el tamaño de los orificios entre las células TTFields humanas normales expuestas y no expuestas PCS-201 (análisis de suma de rangos de Wilcoxon). Se usaron cubreobjetos de tres experimentos por condición, y se analizaron al menos 5 células por cubreobjetos para el recuento y el tamaño de los orificios, de manera doble ciego.
[0032] También se observaron visualmente 201 células. A diferencia de la situación descrita anteriormente para las células U87-MG, TTFields no pareció alterar la morfología de la membrana de las células PCS-201.
El efecto de TTFields sobre la permeabilidad de la membrana es reversible.
[0033] Para evaluar la reversibilidad del efecto de TTFields en las células cancerosas, las células U87-MG/eGFP-fLuc se sometieron a tres condiciones: (1) Sin exposición a TTFields, condiciones de cultivo celular estándar (37 °C, 95 % O2 , 5 % de CO2), (2) exposición a TTFields durante 24 h y (3) exposición a TTFields durante 24 h seguida de ninguna exposición a TTFields durante 24 h. Se adquirieron las lecturas de BLI, fluorescencia PpIX (producto 5-ALA) y fluorescencia Dextrano-FITC (4 kDa). Todas las condiciones experimentales se realizaron por triplicado. FIG. 7A resume los datos de BLI: La presencia de TTFields durante 24 h (barra central) aumentó significativamente el flujo de BLI en comparación con la exposición sin TTFields (barra izquierda) (p < 0,0005, ANOVA bidireccional, TTFields frente a no TTFields), pero este aumento se atenuó significativamente cuando las células se volvieron a introducir en la condición sin TTFields durante 24 h (barra derecha) (ANOVA bidireccional, p < 0,005, TTFields durante 24 h frente a TTFields durante 24 h seguido de sin TTFields durante 24 h). FIG. 7B muestra que se produjo un patrón similar de lecturas reversibles con fluorescencia PpIX (p < 0,0005, ANOVA de dos vías, TTFields (barra central) frente a ningún TTFields (barra izquierda) y p < 0,0004, TTFields frente a TTFields seguido de ningún TTFields (barra derecha)). Y la FIG. 7C muestra que se produjo un patrón similar de lecturas reversibles para la fluorescencia de dextrano-FITC de 4 kDa (p < 0,05, ANOVA bidireccional, TTFields (barra
central) frente a ningún TTFields (barra izquierda); y p < 0,05, TTFields frente a TTFields seguido de ningún TTFields (barra derecha)). Para cada conjunto experimental, la fluorescencia de eGFP no cambió significativamente. Las investigaciones SEM también revelaron que el aumento significativo tanto en el número de agujeros (p = 0,007, ANOVA de dos vías, TTFields vs. No TTFields) como en el tamaño de los agujeros (p = 0,0007, ANOVA de dos vías, TTFields vs. No TTFields) de TTFields también fueron reversibles, después de 24 h sin exposición. Aquí, NS = no significativo; BLI = imágenes bioluminiscentes; eGFP = proteína de fluorescencia verde mejorada; fLuc = luciferasa de luciérnaga; 5-ALA = ácido 5 aminolevulínico; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PpIX = protoporfirina IX; y FL = fluorescencia.
[0034] Para resumir, la absorción de los compuestos relevantes aumentó cuando se aplicaron campos eléctricos alternos (en comparación con cuando no se aplicaron campos eléctricos alternos). Cada una de estas figuras también muestra que la captación disminuyó sustancialmente después del cese de los campos eléctricos alternos durante 24 horas. De esto, podemos inferir que el aumento de la permeabilidad de las membranas celulares que fue inducido por los campos eléctricos alternos no es un efecto permanente, y que la permeabilidad vuelve a caer después del cese de los campos eléctricos alternos.
[0035] La FIG. 7D representa los resultados de un experimento para probar la rapidez con la que la permeabilidad vuelve a caer después del cese de los campos eléctricos alternos. Más específicamente, la 7-aminoactinomicina D (7-AAD) es un compuesto químico fluorescente con una fuerte afinidad por el ADN. La 7-AAD es una molécula relativamente grande (1270,43 g/mol, es decir, 1,27 kDa) que normalmente no atraviesa fácilmente las membranas celulares intactas. FIG. 7D muestra las características de tiempo de la permeabilidad a 7-AAD que es inducida por la aplicación de TTFields para células U87-MG. En este experimento, las células se trataron con un campo eléctrico alterno a 300 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS durante 24 horas, a una temperatura ambiente de 18 °C. Se introdujo 7-AAD en las muestras en cinco momentos diferentes: 15 minutos antes del cese del campo eléctrico alterno; inmediatamente después del cese del campo eléctrico alterno; y 15, 30 y 60 minutos después del cese del campo eléctrico alterno. En cada caso, las células se incubaron con 7-AAD durante 30 minutos después de la introducción de 7-AAD, seguido de un análisis de citometría de flujo del porcentaje de células con mayor acumulación de 7-AAD fluorescente para cada uno de los diferentes tiempos. Como se ve en la FIG. 7D, se observó un aumento significativo en la acumulación de 7-AAD solo en la muestra que se incubó con 7-AAD mientras se sometía a un campo eléctrico alterno.
Resultados adicionales para diferentes medicamentos y diferentes tipos de células cancerosas.
[0036] Los métodos descritos en el presente documento no se limitan al contexto del glioblastoma. Por el contrario, son aplicables a otros tipos de células cancerosas. Más específicamente, se puede administrar una sustancia a través de la membrana celular de una célula (a) aplicando un campo eléctrico alterno a la célula durante un período de tiempo, donde la aplicación del campo eléctrico alterno aumenta la permeabilidad de la membrana celular; y (b) introducir la sustancia en las inmediaciones de la célula. El aumento de la permeabilidad de la membrana celular permite que la sustancia atraviese la membrana celular. En particular, los métodos descritos en este documento pueden usarse para administrar moléculas grandes (que normalmente no pasarían a través de la membrana celular relevante) a través de una membrana celular de diferentes tipos de células (es decir, células distintas del glioblastoma), incluidos, entre otros, otros tipos de células cancerosas (p. ej., células MdA-MB-435 y MCF-7).
[0037] FIG. 8A representa los resultados de un experimento realizado para determinar cómo afectan los campos eléctricos alternos a la permeabilidad de las membranas celulares de células de la línea celular de melanoma humano MDA-MB-435. En este experimento, las células MDA-MB-435 se trataron con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 24 horas, a una temperatura ambiente de 18 °C y una temperatura de plato de 37 °C. (La temperatura del plato en este y otros ejemplos es más alta que la temperatura ambiente debido al calentamiento causado por los campos eléctricos alternos). Después de las primeras 23,75 horas, se añadió 7-AAD al cultivo y se incubó durante 15 minutos, tiempo durante el cual se continuaron los campos eléctricos alternos (para completar el período de 24 horas). Después de este período de 15 minutos, se terminó la aplicación de campo eléctrico alterno y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos adicionales. El porcentaje de células con mayor acumulación de 7-AAD fluorescente se determinó mediante análisis de citometría de flujo. ~66 % de las células mostró una mayor acumulación de 7-AAD (barra 2 en la FIG. 8A), en comparación con menos del 5 % de las células en el control (barra 1), que se sometió a las mismas condiciones, excepto que no se aplicaron los campos eléctricos alternos. Estos resultados indican que los campos eléctricos alternos provocan un aumento muy significativo de la permeabilidad de las membranas celulares.
[0038] En una variación de este experimento, se trataron células de la línea celular de melanoma humano MDA-MB-435 con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 24 horas, a una temperatura ambiente de 18°C y una temperatura del plato de 37°C. Después de este período de 24 horas, los campos eléctricos alternos se apagaron durante 15 minutos, después de lo cual se añadió el 7-AAD. Después de esperar 15 minutos adicionales, se determinó el porcentaje de células con mayor acumulación de 7-AAD fluorescente mediante citometría de flujo. Esta vez, sólo el -20% de las células exhibieron una mayor acumulación de 7-AAD (barra 3 en la FIG. 8A). Estos resultados indican que el aumento de la permeabilidad de las membranas celulares que es inducido por campos eléctricos alternos es relativamente breve, y que la permeabilidad declina rápida y dramáticamente después del cese de los campos eléctricos alternos.
[0039] FIG. 8B representa los resultados de otro experimento realizado para determinar cómo afectan los campos eléctricos alternos a la permeabilidad de las membranas celulares de las células de la línea celular de melanoma humano MDA-MB-435 a la doxorrubicina (543,52 g/mol). En este experimento, se trataron variantes de células MDA-MB-435 de tipo salvaje y resistentes a la doxorrubicina con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 23 horas. Después de este período de 23 horas, se añadió doxorrubicina a una concentración de 10 mM y se incubó durante una hora, tiempo durante el cual se continuaron los campos eléctricos alternos. Luego se midió la acumulación intracelular de doxorrubicina. La acumulación intracelular de doxorrubicina aumentó tanto para las células de tipo salvaje (comparar la barra 1 con la barra 3) como para las células resistentes a la doxorrubicina (comparar la barra 2 con la barra 4).
[0040] FIG. 8C representa los resultados de un experimento similar utilizando células de la línea celular de adenocarcinoma de mama humano MCF-7 y mitoxantrona (444,481 g/mol). En este experimento, se trataron variantes de células MCF-7 de tipo salvaje y resistentes a la mitoxantrona con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 23 horas. Después de este período de 23 horas, se añadió mitoxantrona a una concentración de 2 pM y se incubó durante una hora, tiempo durante el cual se continuaron los campos eléctricos alternos. Luego se midió la acumulación intracelular de mitoxantrona. La acumulación intracelular de mitoxantrona aumentó tanto para las células de tipo salvaje (compare la barra 1 con la barra 3) como para las células resistentes a la mitoxantrona (compare la barra 2 con la barra 4).
[0041] Los resultados descritos anteriormente en relación con las FIGS. 8B y 8C indican que los campos eléctricos alternos mejoran la acumulación intracelular de moléculas de quimioterapia tanto en células de tipo salvaje como resistentes a los medicamentos, y que los campos eléctricos alternos pueden restaurar ventajosamente la acumulación intracelular de productos químicos quimioterapéuticos en células cancerosas después de que esas células hayan desarrollado resistencia de múltiples fármacos a esos químicos.
[0042] Se realizaron experimentos adicionales para determinar si existe sinergia entre TTFields y varios fármacos para varias líneas de células cancerosas, y las FIGS. 9A-9G representan el resultado de algunos de estos experimentos. Más específicamente, la FIG. 9A muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células U87-MG/GFP-Luc a varias concentraciones de Lomustine (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). FIG. 9B muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células pcGBM2/GFP-Luc a varias concentraciones de Lomustine (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). FIG. 9C muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células GBM39 a varias concentraciones de Lomustine (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). FIG. 9D muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células GBM39 a diversas concentraciones de temozolomida (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). FIG. 9E muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células GBM39/Luc a diversas concentraciones de irinotecán (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). FIG. 9F muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células MDA-MB-235 a diversas concentraciones de doxorrubicina (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). Y FIG. 9G muestra cómo la aplicación de TTFields durante 4 días mejora la sensibilidad de las células U87-MG/eGFP-Luc a diversas concentraciones de manosa (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields).
[0043] Hasta la fecha, se encontró sinergia para la combinación de TTFields más Withaferin A para GBM39/Luc, U87-MG/GFP-Luc y pcGBM2/GFP-Luc; se encontró sinergia para la combinación de TTFields más Lomustine para GBM39/Luc, U87-MG/GFP-Luc y pcGBM2/GFP-Luc; se encontró sinergia para la combinación de TTFields más Irinotecan para GBM39/Luc; y se encontró sinergia para la combinación de TTFields más Mannose para U87-MG/GFP-Luc. También se encontró evidencia de sinergia para la combinación de TTFields más doxorrubicina para MDAMB-235.
DISCUSIÓN
[0044] Los estudios previos se han centrado en los efectos de TTFields en el núcleo (p. ej., microtúbulos), septina, mitocondria y autofagia. Pero se cree que los experimentos descritos en este documento son los primeros en informar los efectos de TTFields en la integridad de la membrana celular del cáncer y demuestran una mayor permeabilidad de la membrana celular para las células cancerosas (p. ej., múltiples líneas celulares de GBM humana) en presencia de TTFields utilizando diversas técnicas de evaluación. (p. ej., formación de imágenes por bioluminiscencia, formación de imágenes por fluorescencia y microscopía electrónica de barrido).
[0045] Las observaciones revelaron un aumento de la permeabilidad de la membrana celular para los glioblastomas en presencia de TTFields en múltiples líneas celulares de GBM humana. Los enfoques empleados para validar la hipótesis incluyeron imágenes de bioluminiscencia, imágenes de fluorescencia y microscopía electrónica de barrido. Las observaciones también revelaron una mayor permeabilidad de la membrana celular para otros tipos de células cancerosas en presencia de TTFields. Los estudios de TTFields en combinación con quimioterapias han demostrado tanto aditividad terapéutica como sinergia. Para este estudio, postulamos que TTFields media una mejor accesibilidad a las células cancerosas. Varios experimentos mostraron la reversibilidad del efecto TTFields en las membranas, demostrando así una relación causal entre los TTFields y el aumento de la permeabilidad de la membrana. Tales observaciones también sugieren que TTFields podría usarse para ajustar la accesibilidad de los medicamentos a las células cancerosas.
[0046] La investigación sobre la hipótesis de la permeabilidad celular de la acción de TTFields se inició en parte debido a las observaciones de bioluminiscencia aumentada en células GBM que expresan luciferasa por parte de TTFields. Si bien no está sujeto a esta teoría, se cree que TTFields indujo una mayor permeabilidad en las membranas celulares de las células GBM. Se cree que el aumento de la permeabilidad de las células GBM a la D-luciferina según lo medido por BLI no se debió a los efectos de TTFields en la luciferasa en sí, sino a una mayor entrada de su sustrato D-luciferina en las células diseñadas para expresar la luciferasa de luciérnaga.. Además, este hallazgo fue válido tanto para la luciferasa dependiente de ATP (FLuc) como para la luciferasa independiente de ATP (RLuc). Por lo tanto, a pesar de un informe preliminar que sugiere que el ATP intracelular aumentó en células de carcinoma colorrectal CT26 expuestas a TTFields, la observación de una mayor permeabilidad de la membrana celular de glioblastoma en el contexto de la exposición a TTFields sugiere un fenómeno independiente. Una mayor expresión o activación de luciferasa debido a la exposición a TTFields no podría haber explicado el aumento de la señal de BLI porque en estas células la enzima luciferasa estaba controlada por el mismo promotor que eGFP, y no se observó un aumento en la señal de fluorescencia en las mismas células. Sin embargo, la exposición a TTFields puede afectar el metabolismo celular que se manifestaría por cambios en los niveles de ATP, alteraciones en la morfología de la membrana y cambios en el consumo de oxígeno.
[0047] Algunos resultados clave que respaldan la hipótesis de la permeabilidad provienen de los experimentos de validación de Dextrano-FITC descritos anteriormente en relación con las FIGS. 3B-D. La accesibilidad de la membrana celular a sondas pequeñas en el marco de TTFields se probó con dextranos marcados con FITC, lo que dio como resultado un aumento en la entrada de 4 kDa (radio de Stokes ~1,4 nm) y 20 kDa (radio de Stokes ~3,3 nm) pero no dextranos de 50 kDa (radio de Stokes -5 nm). Esto sugiere que los campos TTF hacen que las células GBM se vuelvan más permeables a sustancias de hasta 20 kDa, pero no mayores de 50 kDa. Como referencia, los sustratos de luciferina y coelenterazina tienen un peso molecular lo suficientemente pequeño como para ser accesibles a través de la membrana con exposición a TTFields. La D-luciferina (sustrato para la luciferasa de Firefly) tiene un peso molecular de 280,3 g/mol (~280 Da), la coelenterazina H (sustrato para la luciferasa de Renilla) tiene un peso molecular de 407,5 g/mol (~408 Da) y 5- ALA tiene un peso molecular de 167,6 g/mol (169 Da), de acuerdo con los resultados de Dextrano-FITC.
[0048] Los resultados de SEM descritos en el presente documento revelan que, a una baja densidad de siembra, 3 días de exposición a TTFields causaron un aumento significativo en el número y el tamaño de los orificios con un área superior a 51,8 nm2, en comparación con la condición sin TTFields, como se describe anteriormente en relación con con la FIG. 5. Este límite del tamaño del orificio representa un círculo de radio de 4,1 nm, que es el radio de Stokes de una molécula de FITC-dextrano con un tamaño de 20-40 kDa. Por lo tanto, la diferencia en la interrupción de la membrana celular visualizada por SEM confirma las observaciones indirectas de los estudios de FITC-dextrano descritos en este documento.
[0049] Curiosamente, la exposición de fibroblastos humanos normales (PCS-201) a TTFields no provocó un aumento significativo en el número o tamaño de los orificios de la membrana celular, lo que sugiere que el efecto de permeabilidad puede tener cierta especificidad para las células cancerosas. Cualitativamente, para las células U87-MG, hubo una clara aparición de estructuras bulbosas similares a vesículas debido a una exposición de 24 h a TTFields con alta densidad de siembra. La apariencia de estas estructuras es consistente con una mayor permeabilidad en la membrana externa y la inducción de apoptosis y parece haber poca evidencia de un fenotipo apoptótico con una exposición a TTFields de 24 horas. Además, las células PCS-201 de alta densidad no mostraron tales cambios con la exposición a TTFields (datos no mostrados), lo que sugiere nuevamente la especificidad del efecto TTFields para las células cancerosas.
[0050] Aunque el ciclo celular no se sincronizó para los experimentos, el tiempo de duplicación de las células U87-MG es -48 h y dado que los TTFields ejercen su máximo efecto antiproliferativo en las células en división, esto podría explicar la falta de apoptosis abundante observada después una exposición de TTFields de 24 horas. Una interpretación alternativa puede residir en los informes de que la formación de vesículas celulares puede conferir resistencia a la lisis celular. Un informe anterior en células de glioblastoma no sincronizadas demostró que 72 h de exposición a TTFields indujeron la muerte celular con una marcada proporción de células positivas para anexina V. Usando microscopía electrónica de transmisión, estos informes describieron signos de autofagia, incluidos autofagosomas, mitocondrias inflamadas y un retículo endoplasmático dilatado. Por el contrario, los resultados del presente documento utilizan SEM para visualizar mejor los efectos de TTFields específicamente en la membrana de la célula plasmática.
[0051] El aumento de la permeabilidad de la membrana por TTFields tiene implicaciones clínicas significativas. Usando la plataforma de cocultivo de células GBM humanas en capas sobre fibroblastos humanos normales, se estudió el impacto de TTFields en la captación de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) en células GBM. La exposición a TTFields resultó en un aumento significativo de la captación de 5-ALA en las células GBM en comparación con las células de fibroblastos. En junio de 2017, la Administración de Alimentos y Medicamentos aprobó el 5-ALA para uso clínico en los Estados Unidos para ayudar a los neurocirujanos a delinear el borde cerebral normal del tumor durante la resección del glioma. Por lo tanto, será útil tratar previamente a los pacientes con glioma con TTFields antes de la administración de 5-ALA para mejorar la delimitación del margen del tumor infiltrante durante la resección del tumor.
[0052] Con respecto a la detección y medición de los efectos de TTFields en células cancerosas, la mayoría de los estudios basados en cultivos celulares hasta la fecha se han centrado en el recuento/viabilidad celular como lectura principal. Esto se basa en el entendimiento predominante de que TTFields interfiere con la mitosis de las células tumorales que se dividen rápidamente, lo que resulta en la muerte de las células cancerosas. Además, los estudios de modelado
computacional de TTFields en cultivo celular actualmente se basan en el recuento de células como resultado principal del modelo.
[0053] La recurrencia de GBM es inevitable y la mediana de tiempo hasta la primera recurrencia a pesar de la terapia estándar es de aproximadamente 7 meses. En aplicaciones clínicas de TTFields a pacientes con GBM, los datos sugieren que un mayor cumplimiento y duración del uso de TTFields se correlaciona con una mejor supervivencia. El cumplimiento de TTFields (>75 % frente a <75 %) fue un predictor independiente de la supervivencia general en el análisis retrospectivo del conjunto completo de datos del ensayo EF-14 y también se encontró que la duración del uso de TTFields afecta la supervivencia general. En conjunto, estos datos pueden servir como correlatos clínicos de los efectos observados en el entorno experimental de TTFields basado en cultivos celulares. Es decir, se observó una correlación entre la duración de la exposición a TTFields y la duración de su efecto sobre la permeabilidad de la membrana celular después de la suspensión de TTFields. En longitudes de exposición TTFields de 0,5-3 h, la duración en el aumento de BLI (en comparación con las condiciones sin TTFields) duró aproximadamente 5 min. Sin embargo, en exposiciones TTFields de 12-25 h, esta diferencia en BLI entre las condiciones TTFields y sin TTFields duró más de 20 minutos. Asimismo, un nuevo análisis de los datos informados por Ram et al. muestra que el porcentaje de aumento en la supervivencia general (en pacientes tratados con TTFields más temozolomida frente a temozolomida sola) saltó del 32 % después de 1 año de exposición a TTFields al 551 % después de 5 años de exposición a TTFields, respectivamente.
[0054] Los resultados descritos en el presente documento, es decir, que los campos eléctricos alternos aumentan la permeabilidad de la membrana celular, son distintos de los efectos de los TTFields informados anteriormente. Esto debería tener un impacto significativo en las prácticas clínicas y quirúrgicas actuales en el tratamiento de glioblastomas, así como otros tipos de cáncer.
[0055] En los experimentos in vitro descritos anteriormente, la frecuencia de los campos eléctricos alternos fue de 200 kHz. Pero en formas de realización alternativas, la frecuencia de los campos eléctricos alternos podría ser otra frecuencia, por ejemplo, alrededor de 200 kHz, entre 50 y 500 kHz, entre 25 kHz y 1 MHz, entre 50 y 190 kHz, entre 25 y 190 kHz, o entre 210 y 400 kHz.
[0056] En los experimentos in vitro descritos anteriormente, la intensidad de campo de los campos eléctricos alternos estaba entre 1 y 4 V/cm RMS. Pero en formas de realización alternativas, se pueden usar diferentes intensidades de campo (p. ej., entre 0,1 y 10 V/cm).
[0057] En los experimentos in vitro descritos anteriormente, los campos eléctricos alternos se aplicaron durante una variedad de intervalos diferentes que oscilaban entre 0,5 horas y 72 horas. Pero en formas de realización alternativas, se puede usar una duración diferente (p. ej., entre 0,5 horas y 14 días). En algunas formas de realización, la aplicación de campos eléctricos alternos puede repetirse periódicamente. Por ejemplo, los campos eléctricos alternos pueden aplicarse todos los días durante dos horas.
[0058] En los experimentos in vitro usando el sistema Inovitro™ descrito en el presente documento, la dirección de los campos eléctricos alternos se cambió a intervalos de un segundo entre dos direcciones perpendiculares. Pero en formas de realización alternativas, la dirección de los campos eléctricos alternos se puede cambiar a una velocidad más rápida (p. ej., a intervalos entre 1 y 1000 ms) o a una velocidad más lenta (p. ej., a intervalos entre 1 y 100 segundos).
[0059] En los experimentos in vitro que utilizan el sistema Inovitro™ descrito en el presente documento, la dirección de los campos eléctricos alternos se cambió entre dos direcciones perpendiculares mediante la aplicación de un voltaje de CA a dos pares de electrodos que están dispuestos a 90° uno del otro en el espacio 2D en una secuencia alterna. Pero en formas de realización alternativas, la dirección de los campos eléctricos alternos se puede cambiar entre dos direcciones que no son perpendiculares reposicionando los pares de electrodos, o entre tres o más direcciones (suponiendo que se proporcionen pares de electrodos adicionales). Por ejemplo, la dirección de los campos eléctricos alternos puede cambiarse entre tres direcciones, cada una de las cuales está determinada por la colocación de su propio par de electrodos. Opcionalmente, estos tres pares de electrodos pueden colocarse de modo que los campos resultantes estén dispuestos a 90° entre sí en el espacio 3D. En otras formas de realización alternativas, los electrodos no necesitan estar dispuestos en pares. Véase, por ejemplo, la colocación de electrodos descrita en la patente estadounidense 7.565.205, que se incorpora aquí como referencia. En otras formas de realización alternativas, la dirección del campo permanece constante.
[0060] En los experimentos in vitro que utilizan el sistema Inovitro™ descrito en el presente documento, el campo eléctrico se acopló capacitivamente al cultivo porque el sistema Inovitro™ utiliza electrodos conductores dispuestos en la superficie exterior de las paredes laterales del plato, y el material cerámico de las paredes laterales actúa como un dieléctrico. Pero en formas de realización alternativas, el campo eléctrico podría aplicarse directamente a las células sin acoplamiento capacitivo (p. ej., modificando la configuración del sistema Inovitro™ para que los electrodos conductores estén dispuestos en la superficie interior de la pared lateral en lugar de en la superficie exterior de la pared lateral).
[0061] Los métodos descritos en este documento también se pueden aplicar en el contexto in vivo mediante la aplicación de campos eléctricos alternos a una región objetivo del cuerpo de un sujeto vivo, tanto para células de glioblastoma como para otros tipos de células cancerosas. La imposición del campo eléctrico en la región objetivo aumentará la permeabilidad de las membranas celulares en la región objetivo, lo que permitirá que las moléculas que normalmente están bloqueadas
o impedidas por la membrana celular pasen a través de la membrana celular. Esto se puede lograr, por ejemplo, colocando electrodos sobre o debajo de la piel del sujeto de modo que la aplicación de un voltaje de CA entre subconjuntos seleccionados de esos electrodos imponga los campos eléctricos alternos en la región objetivo del cuerpo del sujeto.
[0062] Por ejemplo, en situaciones donde las células relevantes están ubicadas en los pulmones del sujeto, un par de electrodos podría colocarse en la parte delantera y trasera del tórax del sujeto, y un segundo par de electrodos podría colocarse en los lados derecho y izquierdo del tórax del sujeto. En algunas formas de realización, los electrodos se acoplan capacitivamente al cuerpo del sujeto (p. ej., usando electrodos que incluyen una placa conductora y también tienen una capa dieléctrica dispuesta entre la placa conductora y el cuerpo del sujeto). Pero en formas de realización alternativas, se puede omitir la capa dieléctrica, en cuyo caso las placas conductoras harían contacto directo con el cuerpo del sujeto. En otra forma de realización, los electrodos podrían insertarse por vía subcutánea debajo de la piel de un paciente. Un generador de voltaje de CA aplica un voltaje de CA a una frecuencia seleccionada (por ejemplo, entre 100 y 200 kHz) entre los electrodos derecho e izquierdo durante un primer período de tiempo (por ejemplo, 1 segundo), lo que induce campos eléctricos alternos donde los componentes más significativos de las líneas de campo son paralelas al eje transversal del cuerpo del sujeto. Luego, el generador de voltaje de CA aplica un voltaje de CA a la misma frecuencia (o una frecuencia diferente) entre los electrodos delantero y trasero durante un segundo período de tiempo (por ejemplo, 1 segundo), lo que induce campos eléctricos alternos donde los componentes más significativos del las líneas de campo son paralelas al eje sagital del cuerpo del sujeto. Esta secuencia de dos pasos se repite luego durante la duración del tratamiento. Opcionalmente, se pueden incluir sensores térmicos en los electrodos, y el generador de voltaje de CA se puede configurar para disminuir la amplitud de los voltajes de CA que se aplican a los electrodos si la temperatura detectada en los electrodos es demasiado alta. En algunas formas de realización, se pueden agregar e incluir en la secuencia uno o más pares de electrodos adicionales. En formas de realización alternativas, solo se utiliza un único par de electrodos, en cuyo caso no se cambia la dirección de las líneas de campo. Tenga en cuenta que cualquiera de los parámetros para esta realización in vivo (p. ej., frecuencia, intensidad de campo, duración, velocidad de cambio de dirección y colocación de los electrodos) puede variar como se describe anteriormente en relación con las formas de realización in vitro. Pero se debe tener cuidado en el contexto in vivo para garantizar que el campo eléctrico permanezca seguro para el sujeto en todo momento.
[0063] Se puede prever fácilmente una amplia variedad de aplicaciones para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares en el contexto in vivo. En un ejemplo, se puede inducir un aumento localizado de la absorción del fármaco por parte de las células tumorales aplicando campos eléctricos alternos a la parte del cuerpo correspondiente durante un período de tiempo (p. ej., 12 o 24 horas) antes y durante la administración de quimioterapias u otros agentes antineoplásicos. En otro ejemplo, la absorción del fármaco por células tumorales multirresistentes se puede restaurar aplicando campos eléctricos alternos a la parte del cuerpo correspondiente durante un período de tiempo (p. ej., 12 o 24 horas) antes y durante la administración de quimioterapias u otros agentes antineoplásicos. En otro ejemplo, el desarrollo de metástasis multirresistentes se puede prevenir aplicando campos eléctricos alternos a las regiones que son propensas a metástasis durante un período de tiempo (p. ej., 12 o 24 horas) antes y durante la administración de un fármaco apropiado (independientemente de si el sujeto tiene un tumor primario que está siendo tratado con campos eléctricos alternos).
[0064] La FIG. 10A representa una primera relación adecuada en el tiempo entre la aplicación del campo eléctrico alterno y la introducción de la sustancia en las inmediaciones de la célula cancerosa en el contexto in vitro; o entre la aplicación del campo eléctrico alterno y la administración de la sustancia a un paciente vivo. Basándose en los datos descritos anteriormente en relación con las FIGS. 7A-7D y 8A, y suponiendo que la sustancia se introduce o administra en un momento dado t=0, el campo eléctrico alterno puede comenzar después del tiempo dado y continuar durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, 12 horas) mientras la sustancia es aún disponible en las inmediaciones de la célula. En esta situación, la permeabilidad comenzará a aumentar después de que comience el campo eléctrico alterno, y este aumento de permeabilidad permitirá que la sustancia ingrese a las células correspondientes. En el contexto de la quimioterapia, esto correspondería a la administración de un agente quimioterapéutico a un paciente, seguido de la aplicación de campos eléctricos alternos durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, durante 12 horas).
[0065] Alternativamente, como se representa en la FIG. 10B, el campo eléctrico alterno puede comenzar antes del tiempo dado (p. ej., 1 hora antes de t=0) y continuar durante un intervalo de tiempo (p. ej., hasta 12 horas después de t=0) mientras la sustancia todavía está disponible en las cercanías. de la célula En esta situación, la permeabilidad de las células relevantes comenzará a aumentar antes de que la sustancia llegue a las proximidades de la célula (o antes de que la sustancia se administre a un paciente vivo). Esto permitirá que la sustancia atraviese la membrana celular inmediatamente después de su llegada a las proximidades de la célula. En el contexto de la quimioterapia, esto correspondería a la aplicación inicial de los campos eléctricos alternos, seguida de la administración del agente quimioterapéutico mientras los campos eléctricos alternos todavía se están aplicando, seguido de la aplicación continua de los campos eléctricos alternos durante un intervalo adicional de tiempo (por ejemplo, hasta 12 horas después del momento en que se administró el agente quimioterapéutico).
[0066] Obsérvese que los intervalos de tiempo discutidos anteriormente en relación con las FIGS. 10A y 10B pueden ser ininterrumpidos o pueden incluir descansos que son preferiblemente cortos. Por ejemplo, suponiendo que el intervalo de tiempo es 12 horas, podría satisfacerse con un solo bloque ininterrumpido de 12 horas. Alternativamente, el intervalo de 12 horas podría cumplirse aplicando campos eléctricos alternos durante 6 horas, seguido de un descanso de 1 hora,
seguido de la aplicación de campos eléctricos alternos durante 6 horas adicionales (mientras la sustancia todavía está disponible en las proximidades del célula). Nótese también que en el contexto de las FIGS. 10A y 10B, cuando la sustancia se administra a un paciente vivo, la administración de la sustancia se puede realizar utilizando cualquiera de una variedad de enfoques que incluyen, entre otros, por vía intravenosa, oral, subcutánea, intratecal, intraventricular e intraperitoneal.
[0067] Las características óptimas de frecuencia, intensidad de campo y conmutación pueden determinarse experimentalmente para cada combinación de un tipo dado de célula huésped y un tipo dado de sustancia que se va a administrar a través de la membrana celular. En algunas formas de realización preferidas, la frecuencia es inferior a 190 kHz (p. ej., entre 50 y 190 kHz o entre 25 y 190 kHz). En otras formas de realización preferidas, la frecuencia está entre 210 y 400 kHz.
[0068] Un enfoque existente para tratar tumores (p. ej., glioblastoma) es mediante la aplicación de campos eléctricos alternos a frecuencias entre 50 y 500 kHz, preferiblemente entre 100 y 300 kHz al tumor. Para el glioblastoma, 200 kHz es la frecuencia más preferida. Los campos eléctricos alternos a estas frecuencias se denominan TTFields, y se describen en las patentes estadounidenses 6,868,289 y 7,565,205, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Brevemente, esas dos aplicaciones describen la interrupción de las células en división durante la mitosis. La eficacia de TTFields mejora cuando la dirección del campo eléctrico es cambia periódicamente, cuando la fuerza del campo en al menos una parte del tumor es de al menos 1 V/cm, y cuando los campos se aplican durante largos períodos de tiempo (p. ej., semanas o meses) con la menor cantidad de descansos posible.
[0069] Pueden surgir situaciones en las que sea deseable tratar el tumor con TTFields y también administrar una sustancia a través de las membranas celulares de las células tumorales (p. ej., para ayudar a obtener una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco de quimioterapia a través de las membranas celulares para proporcionar una línea adicional de ataque contra el tumor). En algunas situaciones, puede ser posible usar una sola frecuencia de un campo eléctrico alterno para tratar el tumor y aumentar la permeabilidad de las membranas celulares. En otras situaciones, puede ser deseable utilizar campos eléctricos alternos con diferentes frecuencias: una primera frecuencia que se selecciona para proporcionar mejores resultados para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares, y una segunda frecuencia que se selecciona para proporcionar mejores resultados para la acción anti-tumoral de los TTFields.
[0070] Las FIG. 11A y 11B representan los resultados de dos experimentos in vitro en células de glioblastoma U-87 MG. Más específicamente, la FIG. 11A representa los resultados de un primer experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células U-87 MG; y la FIG. 11B representa los resultados de un segundo experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células U-87 MG.
[0071] En el primer experimento, las células U-87 MG se sometieron a campos eléctricos alternos con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS a diferentes frecuencias durante un período de 72 horas a una temperatura ambiente de 18 °C. Durante un período de 72 horas, se midió el número de células que estaban presentes en la muestra para cada una de las diferentes frecuencias usando citometría de flujo. Como se ve en la fig. 11A, se observó el número más bajo de células (lo que indica el nivel más alto de citotoxicidad) para la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 200 kHz.
[0072] En el segundo experimento, se midió la permeabilidad a 7-AAD (una sustancia química fluorescente con un peso molecular de 1270,43 g/mol que normalmente no atraviesa fácilmente las membranas celulares intactas). En este experimento, las células se trataron con un campo eléctrico alterno a diferentes frecuencias con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS durante un total de 24 horas, a una temperatura ambiente de 18 °C y una temperatura de plato de 37 °C. Después de las primeras 23,75 horas, se añadió 7-AAD al cultivo y se incubó durante 15 minutos, tiempo durante el cual se continuaron los campos eléctricos alternos (para completar el período de 24 horas). Después de este período de 15 minutos, se terminó la aplicación de campos eléctricos alternos y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos más, seguido de un análisis de citometría de flujo del porcentaje de células con mayor acumulación de 7-AAD fluorescente para cada uno de los diferentes frecuencias Como se ve en la FIG. 11B, se observó el porcentaje más alto de células con mayor acumulación de 7-AAD (que indica el nivel más alto de permeabilidad) para la muestra que se sometió a un campo eléctrico alterno a 300 kHz.
[0073] Las FIG. 12A y 12B representan los resultados de dos experimentos in vitro similares a los descritos anteriormente en relación con las FIGS. 11A/B, excepto que se usaron células de sarcoma uterino MES-SA. Más específicamente, la FIG. 12A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células MES-SA. Se observó el número más bajo de células MES-SA (lo que indica el nivel más alto de citotoxicidad) para la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 100 kHz. FIG. 12B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA. El porcentaje más alto de células MES-SA con mayor acumulación de 7-AAD (que indica el nivel más alto de permeabilidad) se observó en la muestra que se sometió a un campo eléctrico alterno a 150 kHz.
[0074] La FIG. 12C representa los resultados de otro experimento realizado para determinar cómo los campos eléctricos alternos de 150 kHz afectan la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA a la doxorrubicina
(543,52 g/mol). En este experimento, las células MES-SA se trataron con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS durante 24 horas. Después de las primeras 23 horas, se añadió doxorrubicina a una concentración de 10 mM y se incubó durante una hora, tiempo durante el cual se continuaron los campos eléctricos alternos (para completar el período de 24 horas). Luego se midió la acumulación intracelular de doxorrubicina. La acumulación intracelular de doxorrubicina aumentó más de 2 veces para la muestra que se trató con el campo eléctrico alterno de 150 kHz.
[0075] Las FIGS. 13A y 13B representan los resultados de dos experimentos in vitro similares a los descritos anteriormente en relación con las FIGS. 11A/B, excepto que se usaron células de adenocarcinoma de mama MCF-7. Más específicamente, la FIG. 13A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células MCF-7. El número más bajo de células MCF-7 (que indica el nivel más alto de citotoxicidad) se observó en la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 200 kHz. FIG. 13B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células MCF-7. El porcentaje más alto de células MCF-7 con mayor acumulación de 7-AAD (que indica el nivel más alto de permeabilidad) se observó en la muestra que se sometió a un campo eléctrico alterno a 150 kHz.
[0076] Los experimentos descritos anteriormente en relación con las FIGS. 11-13 revelan que la frecuencia óptima para inducir permeabilidad celular es diferente de la frecuencia óptima para inducir citotoxicidad. Más específicamente, para el glioblastoma, la primera frecuencia óptima (para inducir la permeabilidad celular) está entre 250 kHz y 350 kHz; y la segunda frecuencia óptima (para inducir citotoxicidad) está entre 150 kHz y 250 kHz. Para el sarcoma uterino, la primera frecuencia óptima (para inducir la permeabilidad celular) está entre 125 kHz y 175 kHz; y la segunda frecuencia óptima (para inducir citotoxicidad) está entre 75 kHz y 125 kHz. Y para el adenocarcinoma de mama, la primera frecuencia óptima (para inducir la permeabilidad celular) está entre 75 kHz y 175 kHz; y la segunda frecuencia óptima (para inducir citotoxicidad) está entre 100 kHz y 300 kHz. Los pares de rangos de frecuencia para otros tipos de cáncer se pueden determinar experimentalmente.
[0077] Cuando se utilizan diferentes frecuencias para inducir la permeabilidad celular y la inducción de la citotoxicidad, la frecuencia de la citotoxicidad se aplica preferentemente durante la máxima cantidad de tiempo que el paciente puede tolerar cómodamente. Preferiblemente, la frecuencia de citotoxicidad se aplica durante al menos una semana. Más preferiblemente, la frecuencia de citotoxicidad se aplica durante muchos meses. Opcionalmente, el intervalo de tiempo durante el cual se aplica la frecuencia de citotoxicidad puede dividirse en una pluralidad de intervalos de tiempo no contiguos que están separados por descansos, donde la pluralidad de intervalos de tiempo no contiguos suma colectivamente al menos una semana. Por el contrario, la frecuencia para inducir la permeabilidad se aplica preferiblemente de manera que la permeabilidad sea alta cuando la sustancia relevante se encuentre cerca de las células diana (p. ej., como se describe anteriormente en relación con las FIGS. 10A-10B). La aplicación de estas dos frecuencias diferentes se puede lograr utilizando un solo generador de voltaje de CA que se puede controlar para generar una primera frecuencia para inducir la permeabilidad celular en ciertos momentos y una segunda frecuencia para inducir la citotoxicidad en otros momentos. Puede usarse el mismo conjunto de conjuntos de transductores (es decir, electrodos) para aplicar los campos eléctricos alternos a estas dos frecuencias (dependiendo de qué frecuencia aplique el generador de voltaje de CA).
[0078] La FIG. 15 es un diagrama de bloques de un aparato que genera una primera frecuencia para inducir permeabilidad celular y una segunda frecuencia para inducir citotoxicidad. El aparato incluye un generador de voltaje CA 44 que es similar a la unidad generadora de campo Optune® convencional, pero tiene la capacidad de operar a dos frecuencias diferentes. Cada una de esas frecuencias está entre 50 y 500 kHz. Esta capacidad se puede implementar, por ejemplo, utilizando relés para cambiar un primer conjunto de componentes o un segundo conjunto de componentes en el circuito convencional que genera el voltaje de CA y ajustando la frecuencia operativa de un oscilador. El generador de tensión CA 44 está configurado para emitir la primera frecuencia o la segunda frecuencia dependiendo del estado de una entrada de control. Cuando la entrada de control está en un primer estado, el generador 44 de tensión CA emite la primera frecuencia, y cuando la entrada de control está en un segundo estado, el generador 44 de tensión CA emite la segunda frecuencia. Un controlador 42 está programado para colocar la entrada de control en el segundo estado de modo que el generador 44 de tensión CA emita la segunda frecuencia. El controlador 42 también está programado para aceptar una solicitud para cambiar a la primera frecuencia. En la forma de realización representada en la FIG. 15, la solicitud llega a través de una interfaz de usuario 40 que puede implementarse utilizando cualquiera de una variedad de enfoques convencionales que incluyen, entre otros, un botón pulsador, una pantalla táctil, etc. En formas de realización alternativas, la solicitud puede llegar a través de RF (por ejemplo, Bluetooth, WiFi, etc.) desde una tableta, teléfono inteligente, etc.
[0079] Al recibir la solicitud, el controlador 42 colocará la entrada de control en el primer estado para que el generador de voltaje de CA 44 emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, al menos 1 hora, al menos 12 horas o al menos 24 horas). Después de que haya transcurrido el intervalo de tiempo, el controlador 42 colocará la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje CA 44 vuelva a emitir la segunda frecuencia.
[0080] Opcionalmente, el generador de voltaje CA 44 puede configurarse para dar salida a una o más frecuencias adicionales (por ejemplo, una tercera frecuencia, una cuarta frecuencia, etc.), dependiendo del estado de la entrada de control. Preferiblemente, cada una de estas frecuencias adicionales se selecciona para inducir citotoxicidad. En estas
formas de realización, el controlador 42 está programado para hacer circular la entrada de control a través de los estados que hacen que el generador de voltaje CA 44 emita la segunda frecuencia y una o más frecuencias adicionales antes de que llegue la solicitud. El controlador 42 también está programado para aceptar una solicitud para cambiar a la primera frecuencia. Al recibir la solicitud, el controlador 42 colocará la entrada de control en el primer estado para que el generador de tensión CA 44 emitirá la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, al menos 1 hora, al menos 12 horas o al menos 24 horas). Después de que haya transcurrido el intervalo de tiempo, el controlador 42 volverá a alternar la entrada de control a través de los estados que hacen que el generador de voltaje CA 44 emita la segunda frecuencia y una o más frecuencias adicionales.
[0081] El sistema representado en la FIG. 15 es particularmente útil cuando una persona tiene un tumor que está siendo tratado con una terapia combinada que incluye TTFields y quimioterapia. En esta situación, el sistema opera la mayor parte del tiempo en la segunda frecuencia para proporcionar el máximo efecto de citotoxicidad. Pero cuando una persona visita una clínica de quimioterapia para recibir una dosis de quimioterapia, el personal sanitario (o el usuario) activa la interfaz de usuario 40 para cambiar el sistema a la primera frecuencia que promueve la permeabilidad. En esta situación, la activación de la interfaz de usuario podría realizarse, por ejemplo, una hora antes del inicio esperado de la quimioterapia, o poco tiempo después del inicio real de la quimioterapia.
[0082] Alternativamente, al recibir la solicitud (por ejemplo, desde la interfaz de usuario 40), el controlador 42 puede controlar la entrada de control para que el generador de voltaje de CA 44 emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, 1 hora), luego alternar entre la segunda frecuencia y la primera frecuencia (por ejemplo, cambiar cada hora). Eventualmente (por ejemplo, cuando la sustancia relevante ha sido agotada del torrente sanguíneo del paciente), el controlador 42 controla la entrada de control para que el generador de voltaje CA 44 vuelva a emitir la segunda frecuencia.
[0083] Un conjunto de electrodos (no mostrados) que son similares a los electrodos convencionales usados con Optune® están conectados a la salida del generador de voltaje CA 44.
[0084] La FIG. 14 representa los resultados de otro experimento más para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células GBM39/Luc. En este experimento, las células se trataron con un campo eléctrico alterno a diferentes frecuencias en presencia de Dextrano FITC de 4 kDa (que normalmente no pasa fácilmente a través de las membranas celulares intactas) durante 2 días. Como se ve en la FIG. 14, se observó el nivel más alto de fluorescencia de Dextrano-FITC (que indica el nivel más alto de permeabilidad) para la muestra que se sometió a un campo eléctrico alterno a 100 kHz.
[0085] Los datos experimentales analizados en relación con las FIGS. 11-14 contienen información que es útil para inducir la permeabilidad celular en la mayor medida posible (para permitir que una mayor cantidad de la sustancia relevante atraviese la membrana celular) sin tener en cuenta ninguna citotoxicidad que pueda estar ocurriendo como efecto secundario. En estas situaciones, el campo eléctrico alterno se aplica preferiblemente a una sola frecuencia, seleccionada para inducir el nivel más alto de permeabilidad celular. En algunas situaciones (p. ej., GBM39/Luc, sarcoma uterino y adenocarcinoma de mama), esta frecuencia estará entre 50 y 190 kHz; y en otras situaciones (por ejemplo, glioblastoma U-87 MG), esta frecuencia estará entre 210 y 400 kHz.
[0086] Para aquellas sustancias que normalmente pueden atravesar la membrana celular en una medida significativa, las técnicas descritas en el presente documento para aumentar la permeabilidad de la membrana celular pueden usarse para aumentar la cantidad de sustancia que entrará en la célula. Esto puede mejorar el resultado terapéutico proporcionado por dichas sustancias. Los ejemplos de esta clase de sustancias analizadas anteriormente incluyen bromuro de etidio (tamaño = 394 Da), doxorrubicina (tamaño = 544 Da), mitoxantrona (tamaño = 445 Da), etc.
[0087] Y, en particular, las técnicas descritas en este documento también se pueden usar para permitir que sustancias que normalmente no podrían atravesar la membrana celular en una medida significativa entren en la célula. Los ejemplos de esta clase de sustancias discutidas anteriormente incluyen (a) compuestos que tienen al menos 1,2 kDa (p. ej., 7-AAD, cuyo tamaño es 1,27 kDa), (b) compuestos que tienen al menos 4 kDa (p. ej., 4kDa Dextrano-FITC, y (c) compuestos de al menos 20 kDa (p. ej., 20 kDa de dextrano-FITC), (d) material genético que incluye, entre otros, construcciones de ADN plasmídico superenrollado, ARNpi y ARNhc, (e) sistema de edición del genoma que incluye, entre otros, no restringido a meganucleasas, nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas basadas en efectores similares a activadores de la transcripción (TALEN) y repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR/Cas9), (f) cualquier forma de un anticuerpo que incluye, entre otros, IgG, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, di-scFv, sdAb. Dicho anticuerpo puede ser no conjugado o conjugado con un agente citotóxico, toxina, fluoróforo, puntos cuánticos y enzimas, (g) moléculas cargadas y (h) moléculas pequeñas, entidades terapéuticas, péptidos y proteínas que normalmente no atraviesan la membrana celular. o están siendo destruidos durante la endocitosis. Proporcionar la capacidad de hacer que estas sustancias atraviesen la membrana celular significa que los compuestos que anteriormente pueden haber sido rechazados como ineficaces en un proceso de selección de compuestos (debido a su incapacidad para atravesar la membrana celular) pueden repentinamente volverse utilizables con fines terapéuticos cuando se usan en combinación con un campo eléctrico alterno que mejora la permeabilidad celular.
[0088] Los métodos descritos en el presente documento también pueden ser útiles más allá del contexto de las células
cancerosas. Más específicamente, los métodos descritos en este documento pueden ser útiles para administrar moléculas grandes (que normalmente no pasarían a través de la membrana celular relevante) a través de una membrana celular de ciertas otras células no cancerosas (p. ej., células renales, células pulmonares, células hepáticas, células cardíacas, células cerebrales, células musculares, células de la médula ósea, etc.). La administración de dichos fármacos se puede mejorar aplicando campos eléctricos alternos a la parte del cuerpo correspondiente durante un período de tiempo (por ejemplo, 24 horas) antes y durante la administración de dichos fármacos. Los candidatos para dichos fármacos incluyen, entre otros, fármacos antiepilépticos y fármacos psicotrópicos (p. ej., olanzapina, 9-OH risperidona y otras variedades de risperidona, etc.).
[0089] En otro ejemplo más, puede ser posible lograr una mejora localizada de la absorción del fármaco en bacterias mediante la aplicación de campos eléctricos alternos a la parte del cuerpo correspondiente durante un período de tiempo (por ejemplo, 24 horas) antes y durante la administración de un antibiótico adecuado. En situaciones donde una bacteria en particular ha evolucionado para ser resistente a los medicamentos o multirresistente (p. ej., en base a un mecanismo de acción que involucra la membrana celular), la aplicación de campos eléctricos alternos puede aumentar la permeabilidad de la célula bacteriana membrana hasta el punto en que se pueda vencer la resistencia. Se pueden usar enfoques similares para mejorar la captación de fármacos para combatir la meningitis, la neumonía, la endocarditis infecciosa, etc. Tenga en cuenta que en el contexto in vivo, los campos eléctricos alternos se pueden aplicar a una región objetivo (p. ej., los pulmones) que no tiene tumores. Alternativamente, los campos eléctricos alternos se pueden aplicar a una región objetivo que contiene un tumor (p. ej., un cerebro que incluye un glioblastoma).
[0090] Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a ciertas formas de realización, son posibles numerosas modificaciones, alteraciones y cambios a las formas de realización descritas sin apartarse de la esfera y el alcance de la presente invención, como se define en las reivindicaciones adjuntas. En consecuencia, se pretende que la presente invención no se limite a las formas de realización descritas, sino que tenga el alcance total definido por el lenguaje de las reivindicaciones enumeradas a continuación y sus equivalentes.
MATERIAL Y MÉTODOS
[0091] Estudios de cultivo celular: dos líneas de GBM derivadas de pacientes (GBM2, GBM39), una línea celular de GBM humano disponible comercialmente (U87-MG de ATCC, Manassas, VA, EE. UU.), así como una línea celular de astrocitoma murino, (KR158B; obsequio del Dr. Duane Mitchell del Departamento de Neurocirugía de la Facultad de Medicina de la Universidad de Florida). Las líneas celulares de glioblastoma U87-MG humano, PCS-201 humano y KR158B murino se cultivaron en DMEM (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.). GBM2 y GBM39 se cultivaron en un medio definido sin suero cuya composición se ha descrito anteriormente.
[0092] Siembra de células en cubreobjetos de vidrio para experimentos TTFields: Brevemente, las células en cultivo se tripsinizaron a través de protocolos estándar y 10,000-50,000 células individuales se suspendieron en 200 o 75 pL de DMEM/10% FBS/13 antibiótico-antimicótico y luego se sembraron en el centro de un cubreobjetos de vidrio Thermanox™ de 22 mm o 12 mm de diámetro, respectivamente (ThermoFisher Scientific, Waltham, m A, EE. UU.). Las células se incubaron durante la noche en una incubadora humidificada con aire al 95 %/CO2 al 5 % a 37 °C. Una vez que las células se adhirieron a cubreobjetos, se agregaron 2 mL o 1 mL de DMEM/10% FBS/1X antibiótico-antimicótico por pocillo de placas de 6 o 12 pocillos, respectivamente. A menos que se indique lo contrario en la sección Resultados, las células se dejaron crecer en el cubreobjetos durante dos o tres días (para garantizar que las células estuvieran en la fase de crecimiento) antes de transferirlas a platos de cerámica de un aparato in vitro TTFields inovitro™ (Novocure Inc., Haifa, Israel). Las condiciones de crecimiento (es decir, el tiempo que se permitió que las células crecieran en condiciones expuestas a TTFields frente a las no expuestas) se especifican en la sección Resultados o en las leyendas de las figuras correspondientes.
[0093] Aparato de campo para el tratamiento de tumores in vitro: los cubreobjetos se transfirieron a una placa de cerámica del sistema inovitro™, que a su vez se montó sobre placas de base inovitro™ (Novocure Ltd., Haifa, Israel). Se aplicaron campos de tratamiento de tumores a 200 kHz (1-4 V/cm) a través de un generador de energía inovitro™. La temperatura ambiente de la incubadora osciló entre 20 y 27 °C con una temperatura objetivo de 37 °C en las placas de cerámica tras la aplicación de TTFields. La duración de la exposición a TTFields duró entre 0,5 y 72 h, después de lo cual se retiraron los cubreobjetos y se procesaron para los bioensayos apropiados (ver más abajo). Para los experimentos de reversibilidad, los cubreobjetos expuestos a TTFields se transfirieron a una incubadora normal sin exposición a TTFields durante 24 h (período fuera de TTFields para evaluar la reversibilidad del efecto de TTFields sobre la permeabilidad de la membrana celular) antes del procesamiento para los bioensayos apropiados. Los medios de cultivo se cambiaron manualmente cada 24 h durante los experimentos para tener en cuenta la evaporación. Los experimentos de control correspondientes (sin TTFields) se realizaron colocando cubreobjetos equivalentes dentro de placas de 6 pocillos o de 12 pocillos en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada convencional (37 °C, 95 % de aire/5 % de CO2) y las células se cultivaron en paralelo con los TTFields - cubreobjetos expuestos. A menos que se indique lo contrario, todos los experimentos se realizaron en al menos muestras por triplicado por condición y por punto de tiempo.
[0094] Ensayo de recuento de células mediante hemocitómetro: la preparación de células para el recuento se logró mediante protocolos establecidos y se visualizó en un microscopio de sobremesa Zeiss PrimoVert (Dublín, CA, EE. UU.). A menos que se indique lo contrario, los recuentos de células se realizaron en suspensiones de células individuales
tripsinizadas con un hemocitómetro y se calculó la media de las cuatro mediciones de recuento de células y se redondeó al número entero más cercano.
[0095] Imágenes de bioluminiscencia: para todo el trabajo de bioluminiscencia, utilizamos GBM2, GBM39 y U87-MG modificados genéticamente, por lo que las células de glioblastoma se transfectaron con vectores lentivirales que expresaban luciferasa de luciérnaga (fLuc para GBM39) o una proteína de fusión de GFP y luciérnaga de luciérnaga. luciferasa (GFP/fLuc para GBM2 y eGFP-fLuc para U87-MG) o una fusión de proteína de fluorescencia roja-luciferasa de Renilla (RLuc-RL8 para KR158B). Las células se transdujeron usando sobrenadantes virales y la expresión de luciferasas se confirmó midiendo la actividad de luciferasa celular (IVIS Spectrum; Perkin Elmer, Waltman, MA) en presencia de D-Luciferina (concentración final de 0,3 mg/ml) para fLuc y coelenterazina (1 pg/mL) para rLuc.
[0096] Microscopía electrónica de barrido (SEM): 5000 (condiciones de siembra baja) a 50.000 (condiciones de siembra alta) Se depositaron células U87-MG/eGFP-fLuc o fibroblastos PCS-201 en cubreobjetos de vidrio de 13 mm y luego se prepararon para experimentos TTFields. Las células se cultivaron en condiciones estándar de incubadora de cultivo de tejidos (37 °C, 95 % de O2 , 5 % de CO2). Al final de los experimentos con exposición de TTFields y sin exposición de TTFields (1 día para condiciones de siembra alta y 3 días para condiciones de siembra baja), los cubreobjetos se procesaron para SEM. Todos los análisis de ROI se realizaron de manera ciega en la que ni el individuo responsable de la adquisición de imágenes SEM ni el que realizaba los análisis de datos conocían las condiciones experimentales de las muestras. Un tercer individuo tenía posesión de las identidades de la muestra.
[0097] Reactivos químicos: a menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos se adquirieron de Selleckchem Inc. (Houston, TX, EE. UU.), Thermo-Fisher Scientific (Waltham, m A, EE. UU.) o Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). La luciferina de luciérnaga purificada o la luciferasa de luciérnaga (SRE0045-2MG), así como el kit de apoptosis Etidio D (11835246001) se adquirieron de Sigma Aldrich Inc (St. Louis, MO). El dextrano-FITC de pesos moleculares 4, 20 y 50 kDa (FD4, FD20 y FD50) también se adquirió de Sigma Aldrich Inc. El ácido 5-aminolevulínico (5-ALA, AAA16942ME) y el kit AnnexinV-ApC (50712549) se adquirieron de Thermo-Fisher Scientific Inc (Waltham, MA).
[0098] Análisis estadístico: se usó el software PRISM 7.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.) para determinar si los datos estaban distribuidos normalmente. Los datos distribuidos normalmente se analizaron con la prueba t de Student bidireccional o análisis de varianza (ANOVA) comparaciones de medias, mientras que los datos con distribución no normal se analizaron con análisis no paramétricos (p. ej., comparación de medianas con la prueba U de MannWhitney). El nivel de significación estadística se fijó en alfa = 0,05. Se emplearon correcciones post-hoc de Bonferroni o Dunnet para ajustar alfa para comparaciones múltiples. Todos los datos se presentan como rango, media ± desviación estándar, mediana (rango intercuartílico) o porcentaje. En todas las figuras, los niveles de diferencias estadísticamente significativas están representados por: * p < 0,05, ** p < 0,01 y *** p < 0,001.
Claims (15)
1. Un aparato para tratar un tumor en el cuerpo de un sujeto y facilitar la administración de una sustancia a través de las membranas celulares en el cuerpo del sujeto, comprendiendo el aparato:
un generador de voltaje CA (44) capaz de generar un campo eléctrico alterno en una primera frecuencia entre
50 kHz y 500 kHz y una segunda frecuencia entre 50 kHz y 500 kHz, y que tiene una entrada de control, siendo la segunda frecuencia diferente de la primera frecuencia, donde el generador de voltaje de CA (44) está configurado para generar el campo eléctrico alterno en el primera frecuencia cuando la entrada de control está en un primer estado y en la segunda frecuencia cuando la entrada de control está en un segundo estado; y
un controlador (42) programado para (a) colocar la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje de CA (44) emita el campo eléctrico alterno a la segunda frecuencia, (b) aceptar una solicitud para cambiar el campo eléctrico alterno a la primera frecuencia, (c) al recibir la solicitud, coloque la entrada de control en el primer estado para que el generador de voltaje de CA (44) emita el campo eléctrico alterno a la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo, y (d) una vez transcurrido el intervalo de tiempo, coloque la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje de CA (44) emita el campo eléctrico alterno en la segunda frecuencia;
caracterizado porque el campo eléctrico alterno tiene una intensidad de campo de entre 1 V/cm RMS y 4 V/cm
RMS.
2. El aparato de la reivindicación 1, que comprende, además:
un conjunto de electrodos configurados para fijarse al cuerpo del sujeto; y
cableado que conecta una salida del generador de tensión CA (44) al conjunto de electrodos.
3. El aparato de la reivindicación 1, en el que la primera frecuencia está entre 250 kHz y 350 kHz, y la segunda frecuencia está entre 150 kHz y 250 kHz.
4. El aparato de la reivindicación 1, en el que la primera frecuencia está entre 125 kHz y 175 kHz, y la segunda frecuencia está entre 75 kHz y 125 kHz.
5. El aparato de la reivindicación 1, en el que la primera frecuencia está entre 75 kHz y 175 kHz, y la segunda frecuencia está entre 100 kHz y 300 kHz.
6. El aparato de la reivindicación 1, en el que la primera frecuencia está entre 50 kHz y 190 kHz.
7. El aparato de la reivindicación 1, en el que la segunda frecuencia está entre 210 kHz y 400 kHz.
8. El aparato de la reivindicación 1, en el que el campo eléctrico alterno tiene una intensidad de campo de al menos 1
V/cm RMS.
9. El aparato de la reivindicación 1, en el que la célula es una célula cancerosa, opcionalmente una célula de glioblastoma, una célula de sarcoma uterino o una célula de adenocarcinoma de mama.
10. El aparato de 
la reivindicación 1, 
l que la célula es una bacteria y la sustancia comprende un antibiótico.
11. El aparato de la reivindicación 1, en el que el intervalo de tiempo es de al menos 12 horas.
12. El aparato de la reivindicación 1, en el que el controlador (42) está además programado para, después de la recepción de la solicitud, conmutar la entrada de control de un lado a otro entre el primer estado y el segundo estado.
13. El aparato de la reivindicación 1, en el que el generador de voltaje CA (44) es capaz de generar el campo eléctrico alterno en al menos una frecuencia adicional entre 50 kHz y 500 kHz y está configurado para generar al menos una frecuencia adicional cuando la entrada de control está en al menos un estado adicional, y el controlador (42) está programado para hacer circular la entrada de control a través del segundo estado y el al menos un estado adicional antes de recibir la solicitud, y hacer un ciclo de la entrada de control a través del segundo estado y el al menos un estado adicional después de que haya transcurrido el intervalo de tiempo.
14. El aparato de la reivindicación 1, que comprende, además: una interfaz de usuario (40), en el que la solicitud se acepta a través de la interfaz de usuario (40); o en el que la solicitud se acepta a través de RF.
15. El aparato de la reivindicación 1, en el que la sustancia tiene un peso molecular de al menos 1,2 kDa, opcionalmen al menos 4 kDa, opcionalmente al menos 20 kDa.
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