ES2933999T3 - Un producto combinado para la profilaxis y el tratamiento del síndrome del intestino irritable - Google Patents
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Abstract
Un producto combinado que comprende una cepa aislada de Bifidobacterium NCIMB 41003 y otra cepa que no interactúa negativamente con Bifidobacterium NCIMB 41003 mejora los síntomas gastrointestinales asociados con el SII y mejora uno o más del estado de ánimo, el estrés, la ansiedad, la calidad del sueño y la depresión asociados con el SII. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Un producto combinado para la profilaxis y el tratamiento del síndrome del intestino irritable
Introducción
El síndrome del intestino irritable (SII) se caracteriza por dolor abdominal crónico, malestar, hinchazón y alteración de los hábitos intestinales y afecta entre el 10 y el 15 % de la población general (Hungin et al., 2003). Para muchos, esta afección puede ser debilitante. Los factores subyacentes que contribuyen al SII son heterogéneos y no se comprenden completamente, pero se considera que la activación inmunitaria alterada de la mucosa intestinal (O'Malley, 2015), la función cognitiva (Kennedy et al., 2014), el estrés psicológico, la interacción entre el cerebro y el intestino así como los cambios en la microbiota intestinal contribuyen de manera significativa a la afección (Drossman y Hasler, 2016).
El tubo gastrointestinal contiene una amplia gama de microorganismos (aproximadamente el 95 % de todas las células del cuerpo humano son bacterias intestinales) que son muy importantes para la salud humana al brindar protección contra las infecciones intestinales, aportando valor nutricional adicional de los alimentos mediante fermentación y contribuyendo al desarrollo del sistema inmunitario. La evidencia acumulada sugiere que los pacientes con SII tienen una composición de la microbiota intestinal diferente en comparación con los controles sanos (Jeffery et al., 2012, Tap et al., 2017), y esta microbiota alterada también se puede ver alterada por el estrés psicológico (Blanchard et al., 2008, Chitkara et al., 2008). En efecto, la microbiota intestinal ha recibido atención como un posible actor central en el desarrollo y la persistencia del SII ya que interactúa con el eje intestino-cerebro. Las bacterias probióticas son microorganismos que se cree que proporcionan beneficios para la salud cuando se consumen y se definen como "microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio para la salud del hospedador" (FAO/OMS, 2001). Estudios recientes han demostrado efectos prometedores de los probióticos en el eje intestino-cerebro tanto en estudios preclínicos como clínicos (Dinan y Cryan, 2017).
Para el SII, se ha demostrado que determinadas cepas de probióticos reducen algunos o todos los síntomas gastrointestinales del síndrome del intestino irritable (Ford et al., 2014, O'Mahony et al., 2005, Whorwell et al., 2006). La cepa 35624® es el único probiótico que se ha demostrado que afecta los síntomas intestinales cardinales asociados con el SII (Whorwell et al., 2006). Sin embargo, poco se ha hecho para abordar los síntomas concomitantes del estrés, la ansiedad y la depresión y se sabe poco acerca de los efectos de los probióticos en el eje intestino-cerebro en el SII y no existe una cepa probiótica o combinación de cepas disponible que haya demostrado el manejo de los síntomas gastrointestinales y los síntomas de estrés, ansiedad y depresión asociados al SII.
El documento US 2015/0209392A describe artículos absorbentes desechables tales como almohadillas higiénicas fabricadas a partir de filamentos que comprenden un microorganismo.
Declaraciones de la invención
Sorprendentemente, se ha descubierto que un producto combinado que incorpora las cepas bacterianas de B. longum 35624® (NCIMB 41003) y de B. longum 1714™ (NCIMB 41676) conduce a un sorprendente efecto positivo sostenido incluso después de que se detenga la alimentación. La invención se define solamente por las reivindicaciones adjuntas.
El SII tiene muchos elementos implicados en su fisiopatología. Tanto los síntomas gastrointestinales como los depresivos/de ansiedad son concomitantes junto con una inflamación subyacente de bajo grado que se sabe que afecta a ambos síntomas (Enck et al. 2016). Tratar todos estos elementos abordaría de manera beneficiosa todos los aspectos del SII, ya que ninguna técnica anterior aborda de manera adecuada estas otras concomitancias por completo.
La creación de un producto combinado que contenga la cepa 35624 no es sencillo. 35624 es una cepa sensible y no crece fácilmente ni tolera la presencia de otras cepas. El perfil de citocinas de 15 B. longums diferentes se evaluó en un ensayo de PBMC que incluía la cepa 1714™ y DPC6315 (ejemplo 6). Las cepas 1714 y DPC6315 se eligieron para seguir trabajando ya que
• DPC6315 tenía la proporción IL-10/IL-12 antiinflamatoria más alta y los cambios en el estado de ánimo, incluida la depresión y la ansiedad, pueden estar relacionados con la inflamación.
• 1714 había demostrado un perfil de citocinas antiinflamatorias in vitro y efectos positivos sobre el estado de ánimo tanto en ensayos con animales como con seres humanos.
Se demostró que 35624 tolera tanto 1714 como DPC6315 en experimentos de crecimiento (ejemplo 5).
Cuando la combinación de 35624 y 1714 fue consumida por una cohorte humana con el SII, hubo un efecto sorprendente ya que la combinación no solo abordó los síntomas gastrointestinales del SII, sino que también abordó los aspectos intestino-cerebro del SII, y se observaron nuevos efectos sinérgicos que fueron inesperados (ejemplos 1 a 4). Los síntomas del SII mejoraron y la respuesta del cortisol al despertar (CAR, del inglés "Cortisol Awakening Response") desregulada se normalizó durante el período de alimentación, pero estos efectos se perdieron después de la alimentación. Sorprendentemente, la persistencia de un efecto antiansiolítico y la mejora de la depresión, la calidad de sueño, así como una reducción en la citocina proinflamatoria TNF-a también se observó incluso después de que se hubiera detenido la alimentación. No se ha observado persistencia después de la alimentación de reducciones en el TNF-a (tono antiinflamatorio mejorado) cuando se alimenta con la cepa 35624 sola (Figura 11). Además, se evaluó la combinación de DPC6315 y 35624 de B. longum in vitro (ejemplo 6). Esta combinación mantiene su elevada señal de IL-10, de manera similar a 35624 y 1714. Se investigó la combinación de DPC6315 y 35624 en un modelo animal bien establecido utilizado en condiciones normales para la detección de sustancias antiinflamatorias (ejemplo 7). No se observaron efectos sinérgicos con la combinación y muy inesperadamente la presencia de 6315 anuló el efecto de 35624 y la combinación fue peor que la cepa única 35624 sola. Por lo tanto, no es obvio que todas las combinaciones de cepas de B. longum funcionen juntas ni siquiera a partir de las pruebas de perfiles inmunitarios in vitro establecidas y, por lo tanto, no habría sido posible predecir de antemano el resultado del ensayo de la combinación de 35624/1714.
La invención proporciona una formulación que comprende una cepa aislada de Bifidobacterium NCIMB 41676 y una cepa aislada de Bifidobacterium NCIMB 41003. La formulación está en forma de un caldo bacteriano, o en forma de un polvo secado por congelación. La formulación comprende además un vehículo ingerible.
Al menos una de las cepas de Bifidobacterium puede estar en forma de células viables.
Al menos una de las cepas de Bifidobacterium puede estar en forma de células no viables.
En algunos casos, la cepa de Bifidobacterium NCIMB 41676 está presente en la formulación en una cantidad de más de 106 ufc. La cepa de Bifidobacterium NCIMB 41676 puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente 5 * 108 ufc.
En algunos casos, la cepa de Bifidobacterium NCIMB 41003 está presente en la formulación en una cantidad de más de 106 ufc. La cepa de Bifidobacterium NCIMB 41003 puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente 5 * 108 ufc.
La viabilidad bacteriana refleja la cantidad de bacterias cultivables dentro de una muestra, es decir, el número de bacterias que conservan la capacidad de reproducirse cuando se cultivan en condiciones óptimas (células viables). Dicho de otra manera, la viabilidad refleja el número de células bacterianas individuales que conservan la capacidad de replicarse en colonias bacterianas más grandes (unidades formadoras de colonias (UFC)).
La viabilidad se determina habitualmente mediante métodos de recuento en placa, mediante los cuales se diluye una muestra bacteriana y después se incuba en una placa de agar que contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento. A continuación, se calcula la viabilidad a partir del número de colonias bacterianas identificadas en una placa. Dichos métodos se resumen en Modern Food Biology 2005 7.a edición, James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden, Springer Science, Nueva York.
Si bien el recuento de placas da una buena indicación de la viabilidad, no abarca todas las células bacterianas vivas de la muestra. (Kell, Douglas B., et al. 1998).
Las muestras también contendrán células "viables pero no cultivables" (VPNC) que permanecen metabólicamente activas pero han perdido la capacidad de replicarse en el momento del análisis mediante recuento en placa y, por tanto, a pesar de estar vivas, no formarán UFC. Finalmente, las muestras también contendrán células muertas. Estos dos grupos se pueden agrupar como "células no viables". Por lo tanto, las células no viables son lo contrario de las células viables, es decir, todas aquellas células que han perdido la capacidad de replicarse cuando se prueban.
Todas las muestras que contienen células viables también contendrán células no viables, por lo tanto, la definición de cultivo celular viable se aclara mediante mediciones de UFC.
Todas las muestras no viables contendrán al menos VPNC y posiblemente pequeñas cantidades de células viables. Los límites de detección de nivel inferior estándar de la industria de 103 UFC/g de células viables permiten la variabilidad inevitable del proceso causada por la presencia de un determinado número de células VPNC/viables en muestras no viables.
En algunas realizaciones, tales como, aunque no de forma limitativa, en productos alimenticios o medicamentos estériles especiales, puede ser preferible una forma no replicable de una cepa probiótica. Por ejemplo, al menos un 95 %, preferentemente al menos un 97 %, más preferentemente al menos un 99 % de la cepa de Bifidobacterium puede ser no replicable en la composición.
En algunos casos, la formulación comprende además un material prebiótico.
El vehículo ingerible puede ser un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una cápsula, comprimido o polvo. El vehículo ingerible puede ser un producto alimenticio, tal como leche acidificada, yogur, yogur helado, leche en polvo, concentrado de leche, queso para untar, helado, aderezos o bebidas.
En algunos casos, la formulación está en forma de un producto alimenticio fermentado o un producto lácteo fermentado.
En algunos casos, el vehículo no se encuentra en la naturaleza.
La formulación puede comprender una proteína y/o péptido, en particular proteínas y/o péptidos que son ricos en glutamina/glutamato, un lípido, un hidrato de carbono, una vitamina, mineral y/u oligoelemento.
La formulación puede comprender un adyuvante.
La formulación puede comprender un componente bacteriano.
La formulación puede comprender una entidad farmacológica.
La formulación puede comprender un compuesto biológico.
También se proporciona un producto alimenticio que comprende una formulación de la invención.
También se proporciona un medicamento que comprende una formulación de la invención.
También se describe el uso de la cepa aislada de Bifidobacterium NCIMB 41676 en combinación con la cepa aislada de Bifidobacterium NCIMB 41003 en la profilaxis o el tratamiento del síndrome del intestino irritable (SII).
La combinación puede:
alterar los síntomas intestinales asociados con el SII;
mejorar el estado de ánimo asociado con el SII;
reducir el estrés asociado con el SII;
reducir la ansiedad asociada con el SII;
mejorar la calidad del sueño asociada con el SII;
tratar la depresión asociada con el SII; y/o
normalizar la respuesta del cortisol al despertar desregulada asociada con el SII.
El uso puede comprender administrar una formulación de la invención.
También se proporciona un producto de combinación que comprende la cepa aislada de Bifidobacterium NCIMB 41676 y la cepa aislada de Bifidobacterium NCIMB 41003 para uso en la profilaxis o el tratamiento del síndrome del intestino irritable (SII). El producto de combinación se describe en el presente documento.
El efecto sobre el sueño es particularmente importante. Las alteraciones del sueño se observan en cualquier etapa de la vida. Estas alteraciones se caracterizan normalmente por una disminución en la capacidad para iniciar y mantener el sueño, y por una proporción reducida del sueño más profundo y reparador. La calidad de vida se ve sustancialmente afectada en las personas que padecen esas alteraciones.
El sueño del bebé cambia normalmente a lo largo de los primeros meses de vida para seguir un ritmo diurno en el que el sueño dura un largo período ininterrumpido por la noche y, de manera similar, los estados de sueño cambian de estar distribuidos equitativamente entre el sueño REM (activo) y el NREM (tranquilo) al nacer a un tercio de REM y dos tercios de NREM a los 8 meses de edad. Cualquier fallo en la negociación de estos cambios en la infancia también puede tener efectos duraderos en los patrones de sueño del niño.
Las alteraciones del sueño más comunes en bebés y niños son las relacionadas con la vigilia (es decir, las dificultades para acostarse a la hora de acostarse o la imposibilidad de dormir durante la noche sin interrupciones). Se ha estimado que estas alteraciones afectan del 15 al 35 % de los lactantes menores de 24 meses. Las alteraciones del sueño de bebés y niños conducen de manera inevitable a alteraciones del sueño y estrés de los
padres, lo que puede dar como resultado una interacción inadecuada entre los padres y el niño, lo que a su vez agrava los síntomas del bebé y el niño y conduce a un círculo vicioso.
En el otro extremo de la vida, el envejecimiento normal también va acompañado de cambios en la calidad, cantidad y arquitectura del sueño. Específicamente, parece haber una disminución apreciable en la capacidad de los ancianos sanos para iniciar y mantener el sueño, acompañado de una disminución en la proporción del sueño más profundo y más reparador del NREM.
El sueño es particularmente importante en las personas mayores. Junto con los cambios físicos que ocurren a medida que envejecemos, los cambios en los patrones de sueño son parte del proceso normal de envejecimiento. A medida que las personas envejecen, tienden a tener más dificultades para conciliar el sueño y más problemas para permanecer dormidos que cuando eran más jóvenes. Es un error común pensar que las necesidades de sueño disminuyen con la edad. De hecho, la investigación demuestra que las necesidades de sueño permanecen constantes durante la edad adulta. Los cambios en los patrones de sueño, la "arquitectura del sueño", ocurren a medida que se envejece y esto puede contribuir a los problemas de sueño. El sueño ocurre en múltiples etapas, incluidos períodos sin sueños de sueño ligero y profundo sin sueños, y períodos ocasionales de sueño activo (sueño REM). El ciclo del sueño se repite varias veces durante la noche y aunque el tiempo total de sueño tiende a permanecer constante, las personas mayores pasan más tiempo en las etapas de sueño más ligeras que en el sueño profundo.
Muchos adultos mayores, aunque ciertamente no todos, también informan estar menos satisfechos con el sueño y más cansados durante el día. Los estudios sobre los hábitos de sueño de los estadounidenses mayores muestran un aumento en el tiempo que se tarda en conciliar el sueño (latencia del sueño), una disminución general del sueño REM y un aumento de la fragmentación del sueño (despertarse durante la noche) con la edad. La prevalencia de los trastornos del sueño también tiende a aumentar con la edad. Las investigaciones sugieren que la alteración del sueño entre los ancianos puede atribuirse en parte a enfermedades físicas y psiquiátricas y a los medicamentos que se utilizan para tratarlas.
Además de los cambios en la arquitectura del sueño que ocurren a medida que se envejece, otros factores que afectan el sueño son los ritmos circadianos que coordinan la sincronización de las funciones corporales, incluido el sueño. Por ejemplo, las personas mayores tienden a tener más sueño en las primeras horas de la noche y se despiertan más temprano en la mañana en comparación con los adultos más jóvenes. Este patrón se llama síndrome de fase avanzada del sueño. El ritmo del sueño se desplaza hacia adelante para que aún se obtengan 7 u 8 horas de sueño, pero los individuos se despertarán muy temprano porque se han ido a dormir bastante temprano. La razón de estos cambios en el sueño y los ritmos circadianos a medida que se envejece no se comprende claramente.
Los factores de estrés ambiental también pueden ser un problema. La exposición al estrés afecta de manera negativa el sueño y el ciclo de sueño/vigilia. Por ejemplo, experimentar factores estresantes relacionados con el trabajo, tener poco apoyo social o estar expuesto a traumas/combates puede interrumpir el sueño y el ciclo de sueño/vigilia.
Los ensayos clínicos en la medicina del sueño abarcan una amplia gama de problemas de sueño y vigilia y, en consecuencia, la selección de medidas de resultado en los ensayos clínicos de la medicina del sueño debe adaptarse al trastorno específico que se esté examinando. El investigador debe considerar los méritos relativos de elegir un cuestionario de autoinforme frente a una prueba fisiológica. Sorprendentemente, las medidas de autoinforme suelen ser más sensibles a los efectos del tratamiento en comparación con las pruebas fisiológicas más caras.
En algunos casos, el producto de combinación puede usarse en una formulación adecuada para su ingestión por un animal de compañía, tal como un perro o un gato. Una de estas formulaciones es un alimento seco para mascotas que puede incluir una cualquiera o más fuentes de hidratos de carbono, una fuente de proteínas y una fuente de lípidos.
Breve descripción de las figuras
La invención se entenderá más claramente a partir de la siguiente descripción de la misma, dada solo a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas en las que:-La figura 1 es un diagrama esquemático de un esquema de estudio sin enmascaramiento de Combo del SII; La figura 2 es un gráfico de la escala de intensidad de los síntomas del SII (EIS del SII) para los pacientes con el SII antes y después del tratamiento Combo;
Las figuras 3 (a) a (e) son un conjunto de gráficos de síntomas individuales de la EIS del SII (dolor abdominal (a) malestar y (b) frecuencia, (c) distensión abdominal, (d) satisfacción intestinal y (e) calidad de vida con el SII) para
los pacientes con el SII antes y después del tratamiento Combo;
Las figuras 4 (a) a (c) son un conjunto de gráficos de la escala de intensidad de los síntomas del SII (EIS del SII) para los pacientes con el SII (estreñimiento (a), mixto (b) y diarrea (c)) antes y después del tratamiento Combo; Las figuras 5 (a) a (c) son un conjunto de gráficos de la escala de intensidad de los síntomas del SII (EIS del SII) para los pacientes con el SII (a) de moderado a intenso, (b) moderado y (c) intenso) antes y después del tratamiento Combo;
Las figuras 6 (a) y (b) son gráficos de las puntuaciones de (a) HADS para la depresión y (b) HADS para la ansiedad para los pacientes con el SII antes y después del tratamiento Combo;
Las figuras 7 (a) y (b) son gráficos de la correlación entre (a) la escala de intensidad de los síntomas del SII frente a la HADS para la depresión y (b) la escala de intensidad de los síntomas del SII frente a la HADS para la ansiedad;
Las figuras 8 (a) y (b) son gráficos de barras del % de disminución en la HADS para la depresión para los pacientes con el SII antes y después de Bif35624 solo en comparación con antes y después del tratamiento Combo;
Las figuras 9 (a) y (b) son gráficos de barras del porcentaje de disminución en las puntuaciones de la HADS para la ansiedad y la depresión para los pacientes con el SII antes y después de Bif35624 solo en comparación con antes y después del tratamiento Combo;
Las figuras 10 (a) y (b) son gráficos de los niveles del TNF en plasma para los pacientes sanos frente a los pacientes con el SII y los pacientes con el SII antes y después del tratamiento Combo;
La figura 11 es un gráfico de los niveles del TNF en plasma para los pacientes con el SII antes y después del tratamiento con Bif35624;
La figura 12 es un gráfico de la puntuación de PSQI global para los pacientes con el SII (a) y los pacientes con el SII (PSQI superior a 5) (b) antes y después del tratamiento Combo;
La figura 13 es un gráfico de la latencia subjetiva del sueño para los pacientes con el SII (a) y pacientes con el SII (PSQI superior a 5) (b) antes y después del tratamiento Combo;
La figura 14 es un gráfico (a) y una tabla (b) de la calidad subjetiva del sueño para los pacientes con el SII antes y después del tratamiento Combo;
La figura 15 es un gráfico (a) y una tabla (b) de la calidad subjetiva del sueño para los pacientes con el SII (PSQI superior a 5) antes y después del tratamiento Combo;
La figura 16 es un gráfico de barras del cortisol en saliva (ABCi) para los controles sanos frente a los pacientes con el SII
La figura 17 es un gráfico de cortisol en saliva (ABCi) para los pacientes con el SII (de moderado a grave) antes y después del tratamiento Combo;
Las figuras 18 (a) y (b) son gráficos de cultivos nocturnos de 35624 solo o en combinación con 1714 o DPC6315; La figura 19 es un gráfico de las proporciones de IL-10/IL-12 de PBMC estimuladas con Bif35624, AH1714 y DPC6315 in vitro;
La figura 20 es un gráfico de barras de los niveles de IL-10 de PBMC estimuladas con Bif35624 o DPC6315 o una combinación de ambos in vitro;
Las figuras 21 (a) y (b) son gráficos de la puntuación de artritis clínica: todas las patas (puntuación de 0 a 5) después de la alimentación con Bif35624, DPC6315 o una combinación de ambos; y
La figura 22 es un gráfico del porcentaje de incidencia a lo largo del tiempo después de la alimentación con Bif35624, DPC6315 o una combinación de ambos.
Descripción detallada
Se realizó un depósito de la cepa UCC35624 de Bifidobacterium longum en National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia,
Reino Unido el 13 de enero de 1999 y se acordó el número de registro NCIMB 41003.
La cepa UCC35624 de Bifidobacterium longum se aisló del tubo gastrointestinal humano resecado y lavado. La cepa se describe en el documento WO00/42168A.
La cepa 35624® de B. longum ha sido ampliamente estudiada y se ha demostrado que regula las respuestas inflamatorias (Groeger et al., 2013, Konieczna et al., 2012) y reduce el dolor abdominal, hinchazón, gases y los hábitos intestinales impredecibles en sujetos con el SII en dos estudios clínicos bien controlados (O'Mahony et al., 2005, Whorwell et al., 2006).
Se realizó un depósito de la cepa AH1714 de Bifidobacterium longum en National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia, Reino Unido el 5 de noviembre de 2009 y se acordó el número de registro NCIMB 41676.
La cepa AH1714 de Bifidobacterium longum se aisló de tejido de biopsia de colon de sujetos humanos sanos. La cepa se describe en el documento WO2011/058535A.
Se ha demostrado que la cepa 1714™ de B. longum atenúa la ansiedad y el estrés y mejora la cognición en estudios preclínicos y clínicos (Allen et al., 2016, Savignac et al., 2014, Savignac et al., 2015).
Ejemplos
Los ejemplos siguientes además describen y demuestran realizaciones dentro del alcance de la presente invención. Formulación
Las cepas se pueden administrar en una única formulación que se prefiere para asegurar el cumplimiento del paciente. Sin embargo, en algunos casos, las cepas pueden administrarse al mismo tiempo o en diferentes momentos y utilizando la misma o diferentes vías de administración.
Las cepas pueden administrarse en cualquier cantidad adecuada para lograr el resultado deseado. En algunos casos, se administran las mismas cantidades de la cepa.
Preferentemente, las cepas se administran cada una a una dosis de al menos 106 ufc por día por cepa, preferentemente a una dosis diana de 5 * 108 ufc a 1 * 109 ufc por día por cepa.
Las cepas están en forma de polvo liofilizado que se mezcla con un excipiente de calidad alimentaria y se rellena en un formato tal como un sobre o cápsula.
Se preparó un polvo liofilizado que comprende 5 * 108 UFC de 35624 de B. longum y 1 * 109 UFC de 1714 de B. longum. Las cepas se fermentaron en medio De Man, Rogosa y Sharpe (desde el principio). Las partículas recogidas después de la centrifugación de cada cepa se lavaron y posteriormente se liofilizaron.
Ejemplo 1 - Un estudio sin enmascaramiento del síndrome del intestino irritable (SII): Un producto combinado de B. longum muestra una reducción de los síntomas del SII en adultos (Combo)
Se realizó un ensayo en seres humanos de la siguiente manera para investigar el efecto de una combinación de 35624 de B. longum y 1714 de B. longum en los síntomas intestinales en adultos con el síndrome del intestino irritable (SII). El trabajo consistió en un estudio sin enmascaramiento. Los síntomas intestinales se midieron con medidas autoinformadas tal como la escala de intensidad de los síntomas del SII (EIS del SII) que incorpora el dolor, la distensión, la disfunción intestinal y la calidad de vida (bienestar global). La EIS del SII es reconocida por su capacidad para calificar de manera fiable a los pacientes previamente clasificados como leves, moderados o intensos. La puntuación máxima alcanzable fue 500. El reclutamiento de grupos más homogéneos de pacientes (casos leves, moderados e intensos) se indicó mediante puntuaciones de 75 a 175, de 175 a 300 y más de 300, respectivamente. Los controles puntuados por debajo de 75 y los pacientes que puntúan en este intervalo también pueden estar en remisión. La EIS del SII de >50 se ha definido como un cambio clínicamente significativo en la intensidad de los síntomas (Francis et al., 1997). Esta escala proporciona un instrumento valioso para ayudar a enfrentar los muchos desafíos que ofrece el SII.
El protocolo clínico para este ensayo fue el siguiente:
Se reclutaron cuarenta mujeres de 18 a 55 años de edad con el SII, diagnosticadas según los criterios de Roma III, y con ansiedad y/o depresión de leve a moderada según lo determinado por la escala hospitalaria de ansiedad y depresión (HADS, del inglés "Hospital Anxiety and Depression scale"). Los sujetos que tenían un diagnóstico psiquiátrico distinto de ansiedad o depresión, un trastorno inflamatorio importante o estaban tomando antidepresivos, ansiolíticos o antipsicóticos en los últimos 6 meses se excluyeron.
Resultados del ensayo Combo de los síntomas del SII medidos por la escala EIS del SII
Los síntomas del SII se evaluaron mediante la escala de intensidad de los síntomas del SII (EIS del SII). Este fue un estudio sin enmascaramiento con un polvo liofilizado que comprendía 5 * 108 UFC de 35624 de B. longum y 5 * 109 UFC de 1714 de B. longum (Combo) durante 8 semanas, seguido de un período de reposo farmacológico de 8 semanas (Figura 1). La EIS del SII se midió a las 0, 4, 8, 12 y 16 semanas.
Las puntuaciones de la EIS del SII mejoraron significativamente desde el inicio hasta el final de la intervención (8 semanas) en una media ± DE de 100 ± 112,5 en el grupo Combo. Sin embargo, una vez que se detuvo la alimentación, la EIS del SII volvió a mejorar y en la semana 16 (8 semanas después de la alimentación) con solo una mejora de 35 ± 97 con respecto al valor inicial. Se ha descrito una diferencia clínicamente importante como un cambio en la EIS del SII de >50 (Figura 2). Cuando se analizaron todos los síntomas individuales que componen la puntuación de la EIS del SII, el tratamiento Combo mejoró todos los síntomas, incluidos el dolor abdominal, el malestar, la frecuencia del dolor abdominal, la distensión abdominal, la satisfacción intestinal y la calidad de vida con el SII, un resultado que no es el mismo para todos los probióticos (Figuras 3 (a) a (e)). El producto Combo beneficia a todos los subtipos de pacientes con el SII, incluidos aquellos con estreñimiento, diarrea y pacientes mixtos (Figuras 4 (a) a (c)). El producto Combo afecta incluso a los pacientes más graves durante la alimentación, pero los síntomas comienzan a reaparecer una vez que la combinación ya no se consume (Figuras 5 (a) a (c)).
Los estudios normalmente aleatorizados, con ocultación doble y controlados con placebo son lo último en medicina clínica, pero utilizando el estudio sin enmascaramiento se pudo proporcionar información valiosa para estimar el efecto de arrastre, determinar el período de reposo farmacológico, proporcionar datos fiables sobre las características del sujeto y la variación de los parámetros medidos, además de mostrar el potencial terapéutico de este producto combinado.
Resultados del ensayo Combo en los síntomas del SII medidos por la escala HADS
En el ensayo Combo, se midió la ansiedad y la depresión mediante un cuestionario validado llamado Escala hospitalaria de ansiedad y depresión (HADS) a las 0, 4, 8, 12 y 16 semanas. Se encontró que 35624 de B. longum en combinación con 1714 de B. longum fue muy eficaz en el SII para reducir los síntomas de depresión y ansiedad en sujetos con el SII. La puntuación de la HADS para la depresión mejoró significativamente desde el inicio hasta el final de la intervención (8 semanas) en una media ± DE de - 1,6 ± 3,122 en el grupo Combo. Sorprendentemente, una vez que se detuvo la alimentación, la puntuación de la HADS para la depresión mejoró aún más en la semana 12 (-2,0 ± 2,63; media ± DE) y se mantuvo esta mejora en la semana 16 (-1,75± 3,386; media ± DE) (8 semanas después de la alimentación) (Figura 6(a)). La puntuación de la HADS para la ansiedad mejoró significativamente desde el inicio hasta el final de la intervención (8 semanas) en una media ± DE de -1,375 ± 3,012 en el grupo Combo. Sorprendentemente, una vez que se detuvo la alimentación, la puntuación de la HADS también mejoró aún más en la semana 12 (-2,275 ± 3,637; media ± DE) y se mantuvo esta mejoría en la semana 16 (-2,3 ± 2,98; media ± DE) que fue 8 semanas después de que los participantes dejaron de tomar el producto Combo. (Figura 6(b)). Se ha descrito una diferencia clínicamente importante como una mejora en la HADS de >2.
Sin correlación al inicio del estudio entre las puntuaciones de la HADS y la puntuación de la intensidad de los síntomas en pacientes con el SII en el estudio Combo
El SII es un trastorno cerebral-intestinal. Es bien sabido que la ansiedad y la depresión son concomitantes comunes entre quienes padecen el SII. Sin embargo, poco se sabe de la naturaleza precisa de estas concomitancias y su asociación en el SII. El objetivo fue caracterizar la relación entre el SII y estas concomitancias psiquiátricas en el grupo con el SII con ansiedad y depresión elevadas para ver si eran cofactores dependientes o independientes. Esto se evaluó utilizando los resultados de referencia del estudio de combinación, como se describe en el ejemplo 1. La mediana de la puntuación de la EIS del SII fue 250 (IQR: 190 a 315) mientras que la puntuación de la HADS para la ansiedad y la puntuación de la HADS para la depresión fueron 10,43 ± 2,3 y 5,48 ± 3,69 respectivamente. De los 40 sujetos, el 95 % y el 45 % tenían una puntuación de la HADS para la ansiedad o de la HADS para la depresión de >8 respectivamente, mientras que el 38 % tenía una puntuación de la HADS para la ansiedad y de la HADS para la depresión de >8. El análisis de correlación de la EIS del SII con las puntuaciones de la HADS para la depresión y de la HADS para la ansiedad mostró una correlación débil para la puntuación de la HADS para la depresión (R2 = 0,3246; P = 0,001) pero sin correlación para la puntuación de la HADS para la ansiedad (R2 = 0,3647; P = 0,2378) (Figuras 7 (a) a (b)). Para el grupo de sujetos con el SII con niveles leves a moderados de ansiedad y depresión, se observó una correlación débil o nula entre la intensidad del SII y los niveles de ansiedad y depresión. Estos resultados sugieren que el SII y la ansiedad/depresión concomitante son factores independientes y pueden requerir enfoques de manejo separados como se usa en el producto combinado 35624/1714. Para cuestionar aún más esta hipótesis, los resultados del ensayo de combinación se evaluaron con referencia a los datos recopilados utilizando solo la cepa 35624.
Comparación del efecto que tiene el Combo o el 35624 solo en las puntuaciones de la HADS de los pacientes con el SII
El producto Combo tuvo un efecto clínicamente significativo en la mejora del estado de ánimo (reduciendo la ansiedad y la depresión) y sorprendentemente, los efectos sobre la ansiedad y la depresión se mantuvieron durante el período de 8 semanas en el que los participantes no tomaron el producto Combo. Por lo tanto, fue de interés comparar estos resultados con un estudio previo realizado en pacientes con el SII que fueron tratados con 35624 de B. longum solo (Whorwell et al., 2006). Este estudio fue un ensayo aleatorizado, con ocultación doble, controlado con placebo y multicéntrico en el que todos los tipos de pacientes con el SII, si tenían ansiedad/depresión concomitante, fueron aceptados en el ensayo. No hubo ningún efecto en las puntuaciones de la HADS sobre el efecto placebo con la cepa 35624 de B. longum sola. Los sujetos tuvieron una disminución transitoria en la intensidad de las puntuaciones de la HADS que desaparecieron una vez que se detuvo la alimentación (Figuras 8(a) y 9(a)). Esto difiere del producto Combo en el que se observó un efecto significativo en las puntuaciones de la HADS después de potenciar la alimentación y los efectos se mantuvieron 8 semanas después del cese de la alimentación (Figuras 8(b) y 9(b)).
Ejemplo 2 - El efecto de la alimentación con la cepa 35624® sola o en combinación con la cepa 1714™ sobre los niveles de TNF-a en plasma en pacientes con el SII
Después de administrar el producto Combo a los pacientes con el SII, se encontró que hubo una reducción en la ansiedad y la depresión con el SII y estos efectos se mantuvieron después del cese de la alimentación. Para determinar si también hubo un cambio en el tono inflamatorio de los participantes del estudio, se midió el biomarcador en plasma del factor de necrosis tumoral (TNF)-a. En un estudio reciente, los niveles en suero del TNF-a se correlacionaron con el malestar y la intensidad de los síntomas en pacientes con el SII (Choghakhori et al., 2017). Varios otros estudios han establecido que los pacientes con el SII tenían niveles más elevados del TNF-a en suero en comparación con los controles sanos (Rana et al., 2012; Seyedmirzaee et al., 2016; Schmulson et al., 2012). Además, en un ensayo de casos y controles, los autores demostraron que los niveles anómalos de citocinas, incluido el factor de necrosis tumoral a, se correlacionaron significativamente con los síntomas del SII y con la intensidad de los síntomas del estado de ánimo depresivo y de ansiedad (Zhen et al., 2018).
Se investigó el efecto de la combinación de 35624 de B. longum y 1714 de B. longum sobre el marcador inflamatorio del TNF-a en adultos con el SII a las 0, 4, 8, 12 y 16 semanas.
Los resultados se compararon con otro ensayo clínico realizado para estudiar el efecto de 35624 de B. longum sola en pacientes con el SII que eran concomitantes con ansiedad y depresión y que habían consumido de manera similar el producto durante 8 semanas. Para este estudio, hubo un período de reposo farmacológico de 4 semanas. Los grupos de ensayo fueron: Placebo (n = 31) y 35624 de Bifidobacterium longum (1 * 1010 ufc) (n = 39).
Se recolectaron muestras de plasma de sangre periférica y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. El TNF-a en el plasma se analizó con un kit de ensayo de 96 pocillos de Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD; catálogo K15008B-1), y se cuantificó y notificó como cambio desde el valor inicial en picogramos por mililitro. Cada muestra se ensayó por duplicado.
De acuerdo con informes anteriores, también se encontró un aumento significativo del TNF-a en plasma en los pacientes con el SII en comparación con los controles sanos (Figura 10(a)). El producto Combo disminuyó significativamente el TNF-a en plasma a lo largo del tiempo en la cohorte con el SII. De nuevo, de manera similar a lo que se vio con las puntuaciones de la HADS, hubo una mejora prolongada (8 semanas) después de la alimentación, es decir, una disminución en el TNF-a incluso después de que se detuvo la alimentación (Figura 10(b)). En un estudio anterior en el que se alimentó a pacientes con el SII con 35624 de B. longum sola hubo una disminución significativa en el TNF-a en plasma en comparación con el placebo durante el período de alimentación de 8 semanas, pero 4 semanas después del final de la alimentación, los niveles del TNF-a en plasma aumentaron y volvieron a los niveles iniciales (Figura 11). Esto nuevamente destaca una sinergia entre la combinación de 35624 de B. longum y 1714 de B. longum donde se obtuvo una mejora prolongada después de que se detuviera la alimentación. En comparación, 35624 de B. longum pierde su efecto antiinflamatorio una vez que se detiene la alimentación.
Ejemplo 3 - Resultados del ensayo sobre la calidad del sueño medidos por el índice de calidad del sueño de Pittsburgh
La calidad del sueño de los pacientes con el SII se evaluó mediante el índice de calidad del sueño de Pittsburgh (PSQI, del inglés "Pittsburgh Sleep Quality Index"). Este fue un estudio sin enmascaramiento con el formato 'COMBO' (5 * 108 UFC/día de 35624 de B. longum + 1 * 109 UFC/día de 1714 de B. longum), de sobres con maltodextrina y un agente de fluidez tal como el dióxido de silicio durante 8 semanas, seguido de un período de reposo farmacológico de 8 semanas (Figura 1). El PSQI se midió a las 0, 4, 8, 12 y 16 semanas. La calidad del sueño se evaluó a través de un PSQI modificado diseñado para medir la calidad del sueño y las alteraciones durante el último mes en poblaciones clínicas, ya que tiene una fiabilidad y validez aceptables (Buysse et al., 1989). El PSQI es una medida de autoinforme de 19 elementos que evalúa la calidad del sueño en siete dominios: 1) duración del sueño, (2) alteración del sueño, (3) latencia del sueño, (4) disfunción diurna debido a la somnolencia, (5) eficacia del sueño, (6) calidad general del sueño y (7) uso de medicación para dormir. Cada uno de los componentes del sueño
produce una puntuación que varía de 0 a 3, donde 3 indica la mayor disfunción. Las puntuaciones de los componentes del sueño se suman para obtener una puntuación total que varía de 0 a 21, y la puntuación total más elevada (denominada puntuación global) indica una peor calidad del sueño. Para distinguir entre buenos y malos durmientes, una puntuación del PSQI global >5 produce una sensibilidad del 89,6 % y una especificidad del 86,5 %.1 (Buysse et al., 1991; Herman et al., 2002; Fillingim et al.; 2011, Porto et al., 2011). Se utilizó este límite del PSQI global >5 para observar una subpoblación de los pacientes con el SII que tenían mala calidad de sueño. La calidad subjetiva del sueño se puntúa de la siguiente manera 'muy buena' (0,) 'bastante buena' (1), 'bastante mala' (2) y 'muy mala' (3).
La ingestión diaria del producto Combo disminuyó significativamente las puntuaciones globales del PSQI en la semana 4 y la semana 8 (Figura 12(a)). Una disminución en la puntuación global del PSQI indica una mejora en la calidad del sueño. Al observar un subgrupo de pacientes con el SII que tenían una mala calidad del sueño (PSQI global >5), el Combo redujo significativamente las puntuaciones globales del PSQI en todos los puntos temporales, incluso después de la alimentación (Figura 12(b)). La puntuación global del PSQI es la suma de las puntuaciones de siete componentes (alteración del sueño, calidad general del sueño, latencia del sueño (tiempo para conciliar el sueño), duración del sueño, disfunción diurna debido a la somnolencia, eficacia del sueño y necesidad de medicamentos para dormir). Entre estos, el Combo disminuyó significativamente la puntuación de la latencia del sueño del PSQI en la semana 4 y la semana 8 y 8 semanas después de la alimentación (Figura 13(a)). De nuevo, cuando se observó una subpoblación de "malos durmientes", se vio una disminución en la latencia del sueño del PSQI a las 8 semanas después de la alimentación (Figura 13(b)). Otro resultado destacable fue que cuando se les preguntó a los sujetos 'durante el mes pasado, ¿cómo calificaría la calidad de su sueño en general?', los resultados mostraron que la administración del producto Combo mejoró significativamente la calidad del sueño de acuerdo con la puntuación global del PSQI. Las puntuaciones subjetivas de la calidad del sueño mejoraron desde el inicio hasta el final de la intervención (8 semanas), en el grupo Combo y se mantuvo su efecto después de que se detuvo la alimentación (16 semanas) (Figura 14(a)). Al observar el porcentaje de las diferentes categorías de durmientes, el tratamiento Combo aumentó el número de pacientes que describieron su sueño como 'bueno' y disminuyó el número de sujetos que tuvieron sueño 'bastante malo', y esto se mantiene incluso después de que se detuviera la alimentación (Figura 14(b)). También se analizó un subgrupo de pacientes con el SII que habían informado que habían tenido sueño 'malo' al inicio del estudio, y esto se reflejó en una puntuación global del PSQI superior a 5. Las puntuaciones subjetivas de la calidad del sueño mejoraron desde el inicio hasta el final de la intervención (8 semanas) en este grupo (puntuación global del PSQI superior a 5) y se mantuvo su efecto después de que se detuvo la alimentación (16 semanas) (Figura 15(a)). Al observar el porcentaje de las diferentes categorías de durmientes, el tratamiento Combo aumentó el número de pacientes que describieron su sueño como 'bastante bueno' y disminuyó el número de sujetos que tuvieron sueño 'bastante malo' y esto se mantuvo incluso después de que se detuviera la alimentación (Figura 15(b)). El efecto beneficioso del producto Combo sobre la calidad del sueño es indicativo de los posibles beneficios de esta combinación de cepas para la promoción de la salud.
En este estudio del SII, 33 de los 40 pacientes tenían una puntuación global del PSQI de 5 o más y, por lo tanto, se han caracterizado como personas que duermen mal, lo que concuerda con la bibliografía que muestra que los pacientes con SII tienen una mala calidad del sueño. Después de la administración de Combo, hubo una reducción significativa en la mala calidad del sueño medida por el PSQI en estos pacientes con el SII y este efecto se mantiene 8 semanas después de la administración de Combo. Estos resultados concuerdan con lo que se ha visto con las puntuaciones de la HADS donde los efectos se mantuvieron 8 semanas después de la interrupción de la alimentación, ya que existe una interacción entre los síntomas del SII y la mala calidad del sueño.
Ejemplo 4 - El efecto de la alimentación con la cepa 35624 en combinación con la cepa 1714 sobre el cortisol en saliva en pacientes con el SII.
Como parte del ensayo sin enmascaramiento (como se describe en el ejemplo 1), se investigó el efecto de una combinación de las cepas 35624 y 1714 de B. longum en la hormona del estrés cortisol en adultos con el SII a las 0, 4, 8, 12 y 16 semanas. El cortisol en saliva y la respuesta del cortisol al despertar es un método no invasivo, fácil de realizar y bien validado para evaluar el funcionamiento del eje HPA. Como el cortisol en la saliva es circadiano, se midió el cortisol al despertar en 4 puntos temporales diferentes (15 minutos, 30 minutos, 45 minutos y 60 minutos). El aumento dinámico del cortisol matutino suele producirse entre 30 y 45 minutos después de despertar antes de descender progresivamente durante el resto del día. Esto se conoce como respuesta del cortisol al despertar (CAR). Una respuesta CAR normal se caracteriza por un máximo de corta duración a los 30 minutos. En los pacientes con el SII, esta respuesta dinámica se atenúa con poco o ningún cambio en los niveles de cortisol al despertar. Se plantea la hipótesis de que esto se debe a factores estresantes crónicos, asociados con la afección del SII, lo que induce un "agotamiento" o bucle de retroalimentación negativa en la respuesta CAR. Una normalización de la respuesta CAR podría indicar una reducción beneficiosa en el impacto del SII en el funcionamiento normal del eje cerebro-intestino del sujeto.
Para la recogida higiénica de muestras de saliva se utilizan hisopos de Salivette, después las muestras se mantienen congeladas a -80 °C hasta el ensayo. El dispositivo de muestreo de Salivette consiste en hisopos de algodón que los pacientes mastican durante 2 minutos y, a continuación, se transfieren al tubo de plástico del dispositivo. Se indica al paciente que se abstenga de comer, fumar, beber té o café, o cepillarse los dientes 15
minutos antes de la toma de muestras y no se permiten trabajos dentales en las 24 horas anteriores a la toma de muestras. Las muestras de saliva se pueden almacenar a temperatura ambiente o en el frigorífico o congelador de la casa de los participantes hasta que se entreguen al laboratorio. Las concentraciones de cortisol se determinaron con el kit de inmunoensayo enzimático de cortisol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Enzo Life Sciences, Reino Unido). El límite de detección del ensayo fue de 0,16 nmol/1. Los coeficientes de variación (CV) interensayo e intraensayo fueron del 11,24 % y del 8,2 %, respectivamente.
Según la bibliografía, los sujetos con el SII presentan niveles elevados de cortisol al despertar y una CAR atenuada, es decir, un aumento mínimo o nulo de cortisol a los 30 minutos después del despertar y, por lo tanto, ninguna disminución posterior a los 60 minutos. Para visualizar mejor el efecto de una intervención en la CAR, el aumento en el "área bajo la curva" (ABCi) se representa gráficamente y se calcula. El ABCi es el área que se puede medir por debajo de la curva de respuesta desde el tiempo cero hasta el tiempo 60 minutos. Se calcula con referencia al primer valor lo que pone en relieve los cambios a lo largo del tiempo.
Los pacientes con el SII tienen un aumento reducido en la producción de cortisol al despertarse por la mañana, lo que da como resultado un ABCi más bajo para los niveles de cortisol en la saliva matutinos iniciales en sujetos con el SII en comparación con los controles sanos (Figura 16). Este gráfico fue recreado a partir de datos proporcionados en la publicación de Suarez-Hitz et al. 2012.
El uso de la combinación de 35624 de B. longum y 1714 de B. longum (Combo) tuvo un efecto normalizador en la producción de cortisol al despertar, que conduce a un aumento temporal a los 30 minutos después del despertar en adultos con síntomas moderados e intensos del SII. Cuando se midió el ABCi (n = 33) en la semana 0, semana 4, semana 8, semana 12 y semana 16, el ABCi aumentó, lo que indica una inversión de la atenuación de la respuesta CAR en sujetos con el SII durante la alimentación. Este efecto se perdió durante las siguientes 8 semanas después de la alimentación (semana 9 a 16) (Figura 17). Por lo tanto, la alimentación con el Combo normaliza la respuesta del cortisol al despertar desregulada. Este efecto, a diferencia del efecto sobre la calidad del sueño, la ansiedad y la depresión, no se mantuvo después de la alimentación. Hasta donde se sabe, no se ha observado que ningún probiótico o combinación de probióticos altere la CAR en sujetos con el SII de esta manera beneficiosa.
Ejemplo 5 - Demostración de compatibilidad de cepas in vitro : Cultivos nocturnos de 35624 ya sea sola o en combinación con la cepa 1714™, o la cepa DPC6315
Antes de llevar a cabo el ensayo en seres humanos, se realizaron dos experimentos de cultivo conjunto para investigar el efecto de una combinación de 35624 B. longum con otra cepa de B. longum DPC6315 o 1714 en experimentos de crecimiento. Toda la experiencia pasada con el cultivo de la cepa 35624 ha indicado que es una cepa sensible que requiere un manejo cuidadoso. DPC6315 de B. longum, se eligió por su tono antiinflamatorio en experimentos in vitro (ejemplo 6).
AH1714/35624 y DPC6315/35624 se cultivaron de manera conjunta a escala de 100 ml, utilizando exactamente el mismo número de células para inocular todos los cultivos de 100 ml. Se añadieron inóculos estandarizados por DO a 100 ml de medio sin alérgenos, sacarosa al 4,5 %, cisteína al 0,05 % que se utilizó para todas las cepas. La incubación de las cepas solas frente a las cepas combinadas se realizó a 37 °C durante 24 horas. Los resultados de este experimento dieron una mejor indicación de las capacidades de cultivo conjunto de estas cepas. Se utilizaron variantes de 35624 resistentes a la rifampicina para permitir la detección de la cepa en la cosecha. Esta variación consiste en una mutación puntual en el gen de resistencia al antibiótico rifampicina. Se cultivó 35624 y se realizó un recuento viable en medio de agar que contenía rifampicina para obtener un recuento de células exacto de 35624 en los experimentos de cultivo.
Experimento de cultivo conjunto AH1714/35624: no hubo inhibición importante de ninguna de las cepas y las UFC/ml o el crecimiento de cada una fue similar al crecimiento en el cultivo conjunto de ambas cepas juntas (7,9 x 108 UFC/ml de 35624 rif y 7,2 * 108 UFC/ml de AH1714) (Figura 18(a)).
Experimento de cultivo conjunto DPC6315/35624: no hubo una inhibición importante de ninguna de las cepas y las UFC/ml para cada una fue similar a las del cultivo conjunto de ambas cepas juntas (9,4 * 10 ^UFC/ml de 35624 rif y 8,5 * 108 UFC/ml de AH1714) (Figura 18(b)).
Este resultado mostró que no hubo interacción perjudicial entre 35624 y 1714.
Ejemplo 6 - Perfiles antiinflamatorios de PBMC (proporciones IL-10/IL-12) de 35624, AH1714 y DPC6315
Anteriormente se había demostrado que 35624 de B. longum tiene un perfil antiinflamatorio in vitro y que este tipo de perfil puede tener relevancia en el SII. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue determinar si se podían encontrar cepas similares de Bifidubaterium longum antiinflamatorias que se pudieran asociar con 35624 de B. longum para hacer una combinación antiinflamatoria mejorada. Se seleccionaron 15 B. longum diferentes que incluían tanto DPC6315 de B. longum como 1714 de B. longum por su perfil de cepa antiinflamatoria. Para determinar esto, se midió tanto la IL-10 como la IL-12 de PBMC estimuladas in vitro con estas cepas bacterianas.
La interleucina-10 (IL-10) es una citocina antiinflamatoria que se produce por muchos tipos de células, incluidos los monocitos, macrófagos, células dendríticas, mastocitos y linfocitos (linfocitos T reguladores). La IL-10 disminuye la expresión de citocinas Th1 proinflamatorias, antígenos del MHC de clase II y moléculas coestimuladoras en células presentadoras de antígeno. También mejora la supervivencia y proliferación de los linfocitos B y la producción de anticuerpos. Esta citocina puede bloquear la actividad de NF-kB y está implicada en la regulación de la vía de señalización JAK-STAT. Los estudios de desactivación génica murina han demostrado el papel esencial de la IL-10 en la inmunorregulación cuando los ratones con la IL-10 desactivada desarrollan colitis intensa. Además, se ha demostrado que las bacterias que son potentes inductores de IL-10 promueven la diferenciación de linfocitos T reguladores en vivo lo que contribuye a la homeostasis inmunológica (O'Mahony et al., AJP 2006; O'Mahony et al., PLoS Pathogens 2008).
La interleucina-12 (IL-12) es una citocina proinflamatoria asociada con la polarización de las respuestas de los linfocitos T efectores Th1 y estimula la producción de otras citocinas Th1 proinflamatorias, tales como el interferón-Y (IFN-y) y el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), de linfocitos T y linfocitos citolíticos naturales (NK). Los niveles elevados de expresión de la IL-12 se asocian con la autoinmunidad. Se demostró que la administración de IL-12 a personas que padecen enfermedades autoinmunitarias empeora los síntomas de la enfermedad. Por el contrario, los ratones con la IL-12 desacitivada o el tratamiento de ratones con anticuerpos neutralizantes de la IL-12 mejoraron la enfermedad.
Las cascadas y redes de citocinas controlan la respuesta inflamatoria, en lugar de la acción de una citocina en un tipo de célula. Los niveles relativos de expresión, o equilibrio, de dos citocinas (tales como la IL-10 y la IL-12) son más informativos que la expresión de una sola citocina. En estos estudios, se estimularon PBMC humanas con una variedad de diferentes cepas bacterianas. Todas las cepas indujeron IL-10 y todas las cepas indujeron IL-12. Sin embargo, el examen de la proporción entre la inducción de la IL-10 y la IL-12 reveló que algunas cepas bacterianas inducían una proporción más elevada (es decir, más IL-10 con menos IL-12) en comparación con otras cepas. Esta es una observación significativa, ya que es el equilibrio entre cada una de estas señales opuestas lo que finalmente determina el resultado inmunológico. Se prevé que una proporción elevada de IL-10:IL-12 promovería una respuesta antiinflamatoria asociada con una actividad inmunorreguladora adecuada, mientras que una proporción baja de IL-10:IL-12 contribuiría a la polarización Th1 de la respuesta inmunitaria. Por tanto, la proporción IL-10:IL-12 en las PBMC es un criterio de selección importante para la identificación de cepas bacterianas con propiedades inmunorreguladoras.
El ensayo se realizó como se describe a continuación:
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC, del inglés "peripheral blood mononuclear cells") de sangre periférica humana sana fresca utilizando tubos BD Vacutainer CPT (catálogo BD 362761), según las instrucciones del fabricante. Las PBMC se lavaron y se resuspendieron en medio Eagle modificado de Dulbecco-Glutamax TM (Glutamax (sustituto de glutamina) piruvato 4,5 g/l de glucosa (catálogo de Gibco 10569-010) suero bovino fetal al 10 % (catálogo Sigma F4135), y penicilina/estreptomicina al 1 % (catálogo Sigma P0781). Se añadieron 200 pl de PBMC a una concentración de 1 * 106 células/ml (es decir, 2 * 105 células) a una placa de 96 pocillos de fondo plano y se añadieron 20 pl de bacterias (a una concentración de 1 * 107 UFC/ml) a los pocillos necesarios, es decir, 20 pl de estimulante/200 ml de células. Se incubaron las placas según fue necesario a 37 °C/CO2 al 5 % en una incubadora.
Las bacterias se generaron de la siguiente manera: Para los caldos frescos, las bacterias se cultivaron en medio Difco MRS y se recogieron justo después de entrar en la fase estacionaria. Todas las células se cultivaron en condiciones anaerobias a 37 °C. Para los productos liofilizados, las bacterias se cultivaron en medio Difco MRS y se recogieron justo después de entrar en la fase estacionaria. Las células se cultivaron en condiciones anaerobias a 37 °C. A continuación, se generaron los polvos liofilizados para cada una de estas bacterias y se almacenaron a -80 °C en frascos de 100 mg en alícuotas previas hasta justo antes de su uso. Una vez que se sacaron del congelador, se descongeló un solo frasco a temperatura ambiente y se lavó 3 veces en 10 ml de solución de Ringer seguido de centrifugación. En cada ocasión se utilizó un frasco nuevo. Los recuentos bacterianos totales se formaron como se describe a continuación. Las alícuotas bacterianas liofilizadas en tubos estériles deben diluirse en 10 ml de medio de cultivo (RPMI o DMEM). Se toma 1 ml de este tubo y se añade a 4,5 ml de medio de cultivo (RPMI o DMEM). Esta será la dosis máxima a una concentración de 1,0 * 109, y, a continuación, se diluirá 1:1 (dosis media) o 1:9 (para la dosis más baja). Se añaden 20 pl de la solución bacteriana a 200 pl de suspensiones de PBMC (2 * 105 células) o 50 pl de la solución bacteriana a 500 pl de suspensiones de PBMC (5 * 105 células) o 100 pl. La dilución habitual seleccionada fue 1,0 * 108, correspondiente a 100:1 (bacterias:PBMC). El control negativo es solo el crioprotector que debe añadirse a las células no estimuladas, pero debe diluirse de la misma forma que las alícuotas bacterianas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Después de una incubación de 1 día a 37 °C,
las placas se centrifugaron a 300 xg y los sobrenadantes se retiraron y se almacenaron congelados a -80 °C hasta el análisis. Las citocinas en los sobrenadantes del cultivo se ensayaron usando un kit de ensayo de 96 pocillos de Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD; catálogo K15008B-1), La interleucina 10 (IL-10) y la interleucina 12p70 (Il12p70) se cuantificaron y notificaron como picogramos por mililitro. Cada muestra se ensayó por duplicado. Las figuras muestran los resultados de un experimento representativo.
De las 15 cepas probadas, tres cepas de Bifidobacterium longum ensayadas, 35624 de B. longum y 1714 de B. longum inducen una proporción de IL-10/IL-12 muy similar y deseada. DPC6315 de B. longum dio una proporción más elevada que 35624 o 1714, que era igualmente un rasgo deseable (Figura 19).
Además, y para tratar de determinar si había efectos negativos de combinar las cepas, se evaluó la producción de IL-10 de las PBMC estimuladas con 35624 y DPC6315 y como una combinación de las 2 cepas. No se observaron efectos negativos del uso de ambas cepas en combinación in vitro y se logró una producción de IL-10 similar a la de las cepas utilizadas individualmente (Figura 20). Se obtiene un resultado similar cuando se utiliza 35624 en combinación con 1714. Por lo tanto, fue la presente hipótesis de toda la información disponible en la bibliografía y de estos resultados que DPC6315 de B. longum combinada con 35624 de B. longum también debería ser un gran producto antiinflamatorio combinado.
Ejemplo 7 - Comparación de cepas en un modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) antiinflamatorio Para probar más la combinación 35624/DPC6315, las cepas se combinaron en un modelo de inflamación de ratón. Se ha demostrado previamente que el consumo de cepas bacterianas probióticas específicas puede modular la enfermedad inflamatoria de las mucosas. El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de la administración oral de las cepas de Bifidobacterium longum probióticas en un modelo de artritis murina utilizadas solas o en combinación en un modelo de selección de cepas antiinflamatorias bien establecido. El SII está asociado con niveles más elevados de inflamación. Los modelos de ratón para el SII que evalúan los efectos antiinflamatorios no están bien establecidos, por lo que se utilizó un modelo antiinflamatorio bien validado. Estas cepas de Bifidobacterium nuevas se identificaron con perfiles antiinflamatorios in vitro.
De la presente selección de PBMC (ejemplo 5) se eligió DPC6315 de B. longum para determinar si el conocido efecto terapéutico del probiótico 35624 de B. longum era capaz de mejorar cuando se utilizó junto con la DPC6315 de B. longum antiinflamatoria. Estas cepas no inhibieron el crecimiento entre sí en experimentos de cultivo conjunto. Los ratones se alimentaron por vía oral con 35624 de B. longum, DPC6315 de B. longum o una combinación de ambas. El inicio de la artritis y la intensidad de la enfermedad en el modelo CIA de artritis fueron los principales parámetros medidos utilizando los criterios de valoración tales como los signos clínicos de la enfermedad y la hinchazón de las patas.
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmunitaria crónica que afecta entre el 1 y el 2 % de la población caucásica. La AR se caracteriza por la inflamación de la membrana sinovial articular, la degradación del cartílago y la erosión ósea. El daño articular ocurre temprano durante la AR y una vez presente es en gran parte irreversible. Se ha informado de la expresión desregulada de las citocinas proinflamatorias TNF, IL-6 e IFN-y y de la IL-10 antiinflamatoria (Fieldman et al., 1996, Annu Rev Immunol 14;397-440) así como de los niveles elevados de IL-15 (McInnes I. B. et al., Nat Med 1996, 2:175-182) e IL-17 (McInnes I. B. et al., Arthritis Res 2000, 2:374-378). La relevancia del TNF-a y la IL-1p para la patogenia de la enfermedad se ha destacado por el éxito clínico de las estrategias terapéuticas que neutralizan el TNF-a o la IL-1p [Elliott M. J. et al., Lancet 1994, 344:1105-1110. Moreland L. W. et al., N Engl J Med 1997, 337:141-147. Feldmann M.: Nat Rev Immunol 2002, 2:364-371]. La artritis inducida por colágeno es un modelo murino bien conocido de AR humana y tiene muchas características de mecanismos inmunitarios humorales y celulares como los que se encuentran en la AR (Durie F. H. et al., Clin Immunol Immunopathol 1994;73:11-18). El infiltrado inflamatorio en ratones y ratas con artritis por colágeno de tipo II consiste en neutrófilos y macrófagos con menor número de linfocitos cuando las lesiones se encuentran en la fase aguda a subaguda. El edema tisular y los exudados de neutrófilos dentro del espacio articular son frecuentes en la fase aguda a subaguda. A medida que la inflamación progresa a crónica, predominan las células inflamatorias mononucleares (monocitos y linfocitos) y la proliferación de fibroblastos, a menudo con deposición de matriz metacromática, que ocurre en la membrana sinovial y el tejido periarticular. El exudado es menos común en el espacio articular.
A menos que se indique en el área de comentarios, el tipo de inflamación es de aguda a subaguda.
El ensayo se realizó como se describe a continuación.
Diseño experimental
Los animales (15 ratones DBA/1/grupo para artritis) se anestesiaron con isoflurano, se afeitaron en la base de la cola y se les inyectaron por vía intradérmica 150 pl de adyuvante completo de Freund (Difco) que contenía colágeno bovino de tipo II (Bolder BioPATH, lote n.° 5) (1 mg/ml) en la base de la cola el día 0 y nuevamente el día 21. El día
de estudio -14, los ratones se asignaron al azar por peso corporal en grupos de tratamiento. El tratamiento se inició después del enrolamiento y continuó diariamente (cada día a intervalos de 24 h) como se indicó hasta el día 34 del estudio (el tratamiento con control positivo de dexametasona se inició el día 18). En los días de estudio 24 a 35, se produjo el inicio de la artritis. Los ratones fueron dados de baja el día 35 del estudio. Se dieron puntuaciones clínicas para cada una de las patas (delantera derecha, delantera izquierda, trasera derecha, trasera izquierda) en los días 18 a 35.
Observaciones, medidas y especímenes
Una vez que se induce la enfermedad, se observan los ratones en busca de signos clínicos de la enfermedad. Se dieron puntuaciones clínicas diarias para cada una de las patas (delantera derecha, delantera izquierda, trasera derecha, trasera izquierda) en los días de estudio 18 a 35 utilizando los siguientes criterios:
0 = Normal.
1 = Una articulación de la pata trasera o delantera afectada o eritema difuso mínimo e hinchazón.
2 = Dos articulaciones de la pata trasera o delantera afectadas o eritema difuso leve e hinchazón.
3 = Tres articulaciones de la pata trasera o delantera afectada o eritema difuso moderado e hinchazón.
4 = Cuatro articulaciones de la pata trasera o delantera afectada o eritema difuso marcado e hinchazón.
5 = Toda la pata afectada, eritema difuso intenso e hinchazón intenso, incapacidad de flexión
Puntuación de inflamación
0 = Normal.
0,5 = Muy mínima, afecta solo a 1 articulación o una mínima infiltración periarticular multifocal de células inflamatorias.
1 = Infiltración mínima de células inflamatorias en la membrana sinovial y el tejido periarticular de las articulaciones afectadas.
2 = Infiltración leve de células inflamatorias. Si se refiere a las patas, generalmente se limita a las articulaciones afectadas (1 a 3 afectadas).
3 = Infiltración moderada con edema moderado. Si se refiere a las patas, se limita a las articulaciones afectadas, generalmente 3 a 4 articulaciones y la muñeca o el tobillo.
4 = Infiltración marcada que afecta a la mayoría de las áreas con edema marcado, puede haber 1 o 2 articulaciones no afectadas.
5 = Infiltración difusa intensa con edema intenso que afecta a todas las articulaciones (hasta cierto punto) y a tejidos periarticulares.
Los datos clínicos para las puntuaciones de las patas (medias para el animal) se analizaron mediante la determinación del área bajo la curva (ABC) de dosificación durante los días 18 a 35. Para el cálculo del ABC, las puntuaciones medias diarias para cada ratón se introdujeron en Microsoft Excel y se calculó el área entre los días de tratamiento y el último día. Se determinaron las medias para cada grupo y se calculó el% de inhibición de los controles de artritis mediante la comparación de los valores de los animales tratados y normales. Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA de 1 vía) o la prueba de Kruskal-Wallis (no paramétrica), junto con la prueba posterior de comparación múltiple adecuada. El modelo se validó mediante la comparación de los controles normales con los controles de la enfermedad utilizando una prueba t de Student de dos colas. Las pruebas estadísticas hacen determinadas suposiciones con respecto a la normalidad de los datos y la homogeneidad de la varianza, y es posible que se requieran más análisis si las pruebas dieron como resultado incumplimiento de estas suposiciones. La significación para todas las pruebas se estableció en p <0,05.
La alimentación con 35624 de B. longum dio como resultado una reducción de la inflamación y los signos clínicos de la enfermedad en comparación con el grupo de control de la enfermedad (*p <0,05) (Figura 21(a)) o con la combinación del grupo de alimentación DPC6315 y 35624 (Figura 21(b)). De acuerdo con esto, el consumo de 35624 de B. longum retrasó el inicio y la intensidad de la enfermedad, medido por el porcentaje de incidencia de la enfermedad, mientras que la combinación de los dos Bifidobacterium longum o DPC6315 solo no lo hizo, aunque DPC 6315 mostró una tendencia similar a 35624 (Figura 22). En conclusión, una administración oral del probiótico 35624 de B. longum fue manifiestamente mejor que el producto combinado para reducir la inflamación a través de las puntuaciones de las articulaciones y la incidencia, y dio como resultado una mejora significativa en la evaluación visual de la artritis en el modelo de artritis inducida por colágeno. Este fue un resultado inesperado ya que estas eran las dos mejores cepas candidatas de las pruebas de PBMC in vitro y donde no hubo inhibición del crecimiento en los experimentos de cultivo conjunto. DPC6315 de B. longum inhibió el efecto antiinflamatorio de 35624 en un modelo de artritis (CIA) de ratón cuando se combinó y la combinación fue peor que cualquiera de las cepas solas. Este estudio demuestra que el efecto de combinaciones de cepas de Bifidobacterium longum puede ser impredecible in vivo.
Las cepas de la invención pueden administrarse a animales (incluidos seres humanos) en una forma ingerible por vía oral en una preparación convencional, tal como cápsulas, microcápsulas, comprimidos, gránulos, polvo, trociscos, píldoras, supositorios, suspensiones y jarabes. Las formulaciones adecuadas pueden prepararse por
métodos de uso habitual usando aditivos orgánicos e inorgánicos convencionales. La cantidad de principio activo en la composición médica puede estar a un nivel que ejerza el efecto terapéutico deseado.
La formulación también puede incluir un componente bacteriano, una entidad farmacológica o un compuesto biológico.
Además, una vacuna que comprende las cepas de la invención puede prepararse utilizando cualquier método conocido adecuado y puede incluir un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La introducción de organismos probióticos se logra mediante la ingestión del microorganismo en un vehículo adecuado. Sería ventajoso proporcionar un medio que promueva el crecimiento de estas cepas probióticas en el intestino grueso. La adición de uno o más oligosacáridos, polisacáridos u otros prebióticos aumentan el crecimiento de bacterias del ácido láctico en el tubo gastrointestinal. Los prebióticos se refieren a cualquier componente alimenticio no viable que es fermentado específicamente en el colon por bacterias endógenas que se consideran de valor positivo, por ejemplo, bifidobacterias, lactobacilos. Los tipos de prebióticos pueden incluir aquellos que contienen fructosa, xilosa, soja, galactosa, glucosa y manosa. La administración combinada de una cepa probiótica con uno o más compuestos prebióticos puede mejorar el crecimiento del probiótico administrado in vivo dando como resultado un beneficio para la salud más pronunciado, y se denomina simbiótico.
Se apreciará que las cepas probióticas se puedan administrar de manera profiláctica o como un método de tratamiento solo o con otros materiales probióticos y/o prebióticos como se ha descrito anteriormente. Además, las bacterias pueden usarse como parte de un régimen profiláctico o de tratamiento usando otros materiales activos como los que se usan para tratar la inflamación u otros trastornos, especialmente aquellos con compromiso inmunológico. Dichas combinaciones pueden administrarse en una formulación única o como formulaciones separadas administradas en el mismo o diferentes momentos y usando las mismas o diferentes vías de administración.
Las cepas de la invención pueden formularse para facilitar la liberación controlada, tal como una liberación retardada de la cepa. Por ejemplo, la formulación puede adaptarse para liberar la cepa en una ubicación particular en el tubo gastrointestinal, tal como el intestino delgado o el colon. Para lograr tal liberación controlada, la cepa puede formularse en una cápsula que tiene un recubrimiento que está adaptado para liberar la cepa en un lugar particular. Hay disponible una gama de recubrimientos para facilitar dicha liberación controlada. Una de tales familias de recubrimientos son los disponibles bajo la marca comercial Eudragit.
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Claims (14)
1. Una formulación que comprende una cepa aislada de Bifidobacterium cepa NCIMB 41003 y una cepa aislada de Bifidobacterium cepa NCIMB 41676 en donde la formulación es un polvo liofilizado o un caldo bacteriano y en donde la formulación comprende además un vehículo ingerible.
2. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, en donde al menos una de las cepas de Bifidobacterium está en forma de células viables y/o en forma de células no viables.
3. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, en donde la cepa de Bifidobacterium NCIMB 41676 está presente en la formulación en una cantidad de más de 106 ufc.
4. Una formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde la cepa de Bifidobacterium NCIMB 41676 está presente en la formulación en una cantidad de 107 a 1010 ufc.
5. Una formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde la cepa de Bifidobacterium NCIMB 41676 está presente en la formulación en una cantidad de 108 a 109 ufc o en una cantidad de aproximadamente 5 * 108 ufc.
6. Una formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde la cepa de Bifidobacterium NCIMB 41003 está presente en la formulación en una cantidad de más de 106 ufc.
7. Una formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde la cepa de Bifidobacterium NCIMB 41003 está presente en la formulación en una cantidad de 107 a 1010 ufc.
8. Una formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde la cepa de Bifidobacterium NCIMB 41003 está presente en la formulación en una cantidad de 108 a 109 ufc, o en una cantidad de aproximadamente 5 * 108 ufc.
9. Una formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende además un material prebiótico.
10. Una formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde el vehículo ingerible es un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una cápsula, comprimido o polvo.
11. Una formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde el vehículo ingerible es un producto alimenticio, tal como una leche acidificada, un yogur, un alimento congelado tal como yogur helado o helado, un chicle, un caramelo, una leche en polvo, un concentrado de leche, un queso para untar, una composición nutricional, un suplemento nutritivo, una barra de cereales, un aderezo o una bebida.
12. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1 en donde la formulación es un alimento infantil.
13. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 11 en donde la formulación es un producto alimenticio fermentado tal como un producto de leche fermentada.
14. Una formulación como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que comprende además una proteína y/o péptido, en particular proteínas y/o péptidos que son ricos en glutamina/glutamato, un lípido, un hidrato de carbono, una vitamina, mineral y/u oligoelemento.
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