ES2931081T3 - Compuestos a base de cumarina y métodos relacionados - Google Patents

Compuestos a base de cumarina y métodos relacionados Download PDF

Info

Publication number
ES2931081T3
ES2931081T3 ES16740489T ES16740489T ES2931081T3 ES 2931081 T3 ES2931081 T3 ES 2931081T3 ES 16740489 T ES16740489 T ES 16740489T ES 16740489 T ES16740489 T ES 16740489T ES 2931081 T3 ES2931081 T3 ES 2931081T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
compound
coumarin
alkyl
mmol
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16740489T
Other languages
English (en)
Inventor
Anthony De Jesus Sanchez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biosearch Technologies Inc
Original Assignee
Biosearch Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biosearch Technologies Inc filed Critical Biosearch Technologies Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2931081T3 publication Critical patent/ES2931081T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/06—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2
    • C07D311/08—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring
    • C07D311/12—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring substituted in position 3 and unsubstituted in position 7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C07D491/044—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring
    • C07D491/052—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring the oxygen-containing ring being six-membered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D491/16—Peri-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

La presente invención generalmente se refiere a compuestos basados en cumarina que se pueden usar para el marcaje de moléculas biológicas, así como a métodos sintéticos y de prueba relacionados. Los compuestos basados en cumarina típicamente sobreviven a las condiciones necesarias para la síntesis automatizada de ácidos nucleicos sin sufrir ningún grado sustancial de degradación o alteración. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos a base de cumarina y métodos relacionados
Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a compuestos a base de cumarina que pueden ser utilizados para el etiquetado de moléculas biológicas, así como a métodos sintéticos y de ensayo relacionados.
Antecedentes de la invención
Los investigadores han investigado el uso de cumarinas para el etiquetado de oligonucleótidos. Estos han observado las dificultades inherentes asociadas a la manipulación sintética de dichos compuestos: "Los tintes de cumarina representan fluoróforos orgánicos de emisión brillante que no son estables en las condiciones básicas normalmente fuertes durante la escisión y desprotección del ADN. Por consiguiente, estas etiquetas no pueden incorporarse a los oligonucleótidos utilizando la química convencional de fosforamidita". Berndl, S. etal. "Comparison of a Nucleosidic vs Non-Nucleosidic Postsynthetic 'Click' Modification of DNA with Base-Labile Fluorescent Probes" Bioconjugate Chem.
2009, 20, 558-564.
Las cumarinas se han conjugado con oligonucleótidos de forma postsintética utilizando químicas de "clic" y de ésteres activados. Hay pocos ejemplos de incorporación de cumarinas a oligonucleótidos utilizando las correspondientes fosforamiditas de cumarina. El documento US2004191796, por ejemplo, analiza una fosforamidita de cumarina única (Estructura 1) como se muestra a continuación:
Figure imgf000002_0001
El documento WO1996028438 analiza unas cuantas fosforamiditas de cumarina (Estructuras 2-5). En todos los casos, la porción de fosforamidita se une al anillo aromático de la cumarina. Se utilizó amoniaco caliente para desproteger los oligonucleótidos correspondientes.
Figure imgf000002_0002
Figure imgf000003_0001
Estructura 5
El documento EP1842923 hace referencia a derivados de nucleótidos marcados con tintes. La referencia analiza una cumarina unida a través de un metanosulfonilaminoindol a una fosforamidita. Los oligonucleótidos preparados a partir de este reactivo se desprotegieron utilizando amoniaco a temperatura ambiente durante 2 horas. Este compuesto, Estructura 6, es vendido como Cyan 500 por Roche.
Figure imgf000004_0001
Kobertz etal. informan de una fosforamidita de ribosa a base de psoraleno (Estructura 7) J. Am. Chem. Soc., 1997, 119 (25), pág. 5960-5961. La referencia analiza la preparación de oligonucleótidos utilizando tales compuestos junto con fosforamiditas protegidas por PAC. Los productos se escindieron y desprotegieron con DBU al 10 % en EtOH a temperatura ambiente durante 24 horas.
Figure imgf000004_0002
Brauns et al. informan de una fosforamidita de cumarina y C-ribosida (Estructura 8) J. Am. Chem. Soc., 1999, 121 (50), pág. 11644-11649. La escisión de un oligonucleótido correspondiente de un soporte y la desprotección se realizaron mediante un tratamiento con NH4OH concentrado durante 16 horas a 25 °C.
Figure imgf000005_0001
Ivana etal. informan de una fosforamidita de cumarina única (Estructura 9) Collect. Czech. Chem. Commun. 2007, 72, 996-1004. La referencia no analiza ningún ejemplo de síntesis de ADN.
Figure imgf000005_0002
Goguen et al. informan de la preparación de una fosforamidita de cumarina como producto intermedio en la preparación de fosfoaminoácidos (Estructura 10) J. Am. Chem. Soc., 2011, 133 (29), pág. 11038-11041.
Figure imgf000006_0001
Menge et al. informan de la preparación de una cumarina unida a una fosforamidita nucleotídica a través de la nucleobase (Estructura 11) Org. Lett., 2011, 13 (17), pág. 4620-4623. El correspondiente oligonucleótido sintetizado utilizando la fosforamidita fue escindido y desprotegido con amoniaco a temperatura ambiente.
Figure imgf000006_0002
Sun et al. informan del uso de una fosforamidita de cumarina modificada con alquino en la conjugación por clic (Estructura 12) Bioconj. Chem. 2013, 24(7): 1226-34.
Figure imgf000007_0001
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un compuesto de Estructura 15:
Figure imgf000007_0002
donde
m es 1, 2 o 3;
n es 1 o 2 ;
o es 1 o 2 ;
p es 0, 1, 2 o 3;
R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ;
X es -OH, -NH2 , -SH, -OR11, -NHR12, -NR13R14, -OC(O)R15, -NHC(O)R16, -SC(O)R17, -C(O)OH, -C(O)OR18, -C(O)NHR19, -C(O)NR20R21, -N3;
R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan independientemente entre alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido, -CH2CH(OH)CH2(OH), -CH(CH2OH)2, -CH2CCH, -(CH2CH2O)a-CH2CH2OH donde a es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10, -P(NR22R23)OCH2CH2-EWG, -P(O)(O-)-Oligonucleótido, -(CH2)bCC-Nucleósido, -(CH2)bCC-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNH-Nucleósido, -(c^)bN H -[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], donde b es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
Rx y Ry son independientemente H o CH3;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 , -CH2CH3 , -CH(CH3)2 o R22 y R23 juntos forman un heterociclo.
El compuesto mencionado anteriormente, en donde X es -OH, -OR11 u -OC(O)R15
El compuesto mencionado anteriormente, en donde X es -NH2 , -NHR12, -NR13R14, -NHC(O)R16
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de estructura 16:
Figure imgf000008_0001
donde
m es 1, 2 o 3;
n es 1 o 2;
o es 1 o 2;
p es 0, 1, 2 o 3;
R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ;
R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquilo (C-i-Cs), alquilo (C-i-Ca) sustituido o R7 y R8 juntos forman un heterociclo de cinco, seis o siete miembros;
X es -OH, -NH2 , -SH, -OR11, -NHR12, -NR13R14, -OC(O)R15, -NHC(O)R16, -SC(O)R17, -C(O)OH, -C(O)OR18, -C(O)NHR19, -C(O)NR20R21, -N3;
R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan independientemente entre alquilo (C1-Cs), alquilo (C1-C8) sustituido, -CH2CH(OH)CH2(OH), -CH(CH2OH)2, -CH2CCH, -(CH2CH2O)a-CH2CH2OH donde a es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, -P(NR22R23)OCH2CH2-EWG, -P(O)(O-)-Oligonucleótido, -(CH2)bCC-Nucleósido, -(CH2)bCC-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNH-Nucleósido, -(CH2)bNH-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], donde b es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 , -CH2CH3 , -CH(CH3)2 o R22 y R23 juntos forman un heterociclo.
El compuesto mencionado anteriormente, en donde R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H o alquilo (C1-C8).
El compuesto mencionado anteriormente, en donde X es -OH, -OR11 u -OC(O)R15
El compuesto mencionado anteriormente, en donde X es -NH2 , -NHR12, -NR13R14, -NHC(O)R16
En un aspecto adicional, la invención proporciona un compuesto de estructura 17:
Figure imgf000008_0002
donde
m es 1, 2 o 3;
n es 1 o 2;
o es 1 o 2;
p es 0, 1, 2 o 3;
R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ; la línea discontinua representa un doble enlace opcional;
X es -OH, -NH2 , -SH, -OR11, -NHR12, -NR13R14, -OC(O)R15, -NHC(O)R16, -SC(O)R17, -C(O)OH, -C(O)OR18, -C(O)NHR19, -C(O)NR20R21, -N3;
R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan independientemente entre alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido, -CH2CH(OH)CH2(OH), -CH(CH2OH)2, -CH2CCH, -(CH2CH2O)a-CH2CH2OH donde a es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, -P(NR22R23)OCH2CH2-EWG, -P(O)(O-)-Oligonucleótido, -(CH2)bCC-Nucleósido, -(CH2)bCC-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNH-Nucleósido, -(c^)bN H -[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], donde b es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 , -CH2CH3 , -CH(CH3)2 o R22 y R23 juntos forman un heterociclo; R24 es alquilo (C1-C8) o alquilo (C1-C8) sustituido;
R25 es alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido o CH2SO3H.
El compuesto mencionado anteriormente, en donde X es -OH, -OR11 u -OC(O)R15
El compuesto mencionado anteriormente, en donde R24 y R25 son alquilo (C1-C8).
En un aspecto adicional, se proporciona un método para fabricar una sonda de oligonucleótidos que comprende un resto de cumarina, en donde el método comprende las etapas de:
1) sintetizar un oligonucleótido usando un método de síntesis en fase sólida para proporcionar un oligonucleótido unido a un soporte sólido;
2) hacer reaccionar el oligonucleótido unido a un soporte sólido con un compuesto de cumarina dentro del alcance de las estructuras 15-17 como se define anteriormente o en las reivindicaciones que comprende un resto de fosforamidita para proporcionar una sonda de oligonucleótido unido a un soporte sólido que comprende un resto de cumarina;
3) retirar la sonda del soporte sólido a una temperatura entre 50 °C y 70 °C, en amoniaco concentrado, durante un período de 2 h a 8 h;
4) aislar la sonda en el que el resto de cumarina de la sonda aislada se degrada en una medida inferior al 5,0 por ciento.
El método enumerado anteriormente, en el que el resto de cumarina de la sonda aislada se degrada en una medida inferior al 2,5 por ciento.
El método mencionado anteriormente, en donde el compuesto de cumarina que comprende un resto de fosforamidita tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000009_0001
n es 1 o 2;
o es 1 o 2;
p es 0, 1, 2 o 3;
R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ;
R3 es H;
R4 es H o R4 junto con R5 forman un anillo carbocíclico o heterocíclico de cinco o seis miembros (por ejemplo, piperidinilo);
R5 es -NR7R8 donde R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquilo (C-i-Cs), o R7 y R8 juntos forman un heterociclo de cuatro, cinco, seis o siete miembros, o R4, R5 y R6juntos forman sistemas de anillos condensados que tienen anillos de cinco o seis miembros;
R6 es H o R4, R5 y R6 juntos forman sistemas de anillos carbocíclicos o heterocíclicos condensados que tienen anillos de cinco o seis miembros;
X es -O-P(NR22W23)OCH2CH2-EWG o (CH2CH2O)a-CH2CH2OP(NR22R23)OCH2CH2-EWG, en donde a es 0, 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 ,
Figure imgf000010_0001
R22 y heterociclo.
El método mencionado anteriormente, en donde el compuesto de cumarina que comprende un resto de fosforamidita tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000010_0002
en donde
Figure imgf000010_0003
n es 1 o 2;
o es 1 o 2;
p es 0, 1, 2 o 3;
R2 es -H o -CH3 ;
X es -O-P(NR22R23)OCH2CH2-EWG o (CH2CH2O)a-CH2CH2OP(NR22R23)OCH2CH2-EWG, en donde a es 0, 1,2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
Rx y Ry son independientemente H o CH3;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 , -CH2CH3 , -CH(CH3)2 o R22 y R23 juntos forman un heterociclo.
El método mencionado anteriormente, en donde el compuesto de cumarina que comprende un resto de fosforamidita tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000011_0001
en donde
Figure imgf000011_0002
n es 1 o 2;
o es 1 o 2;
p es 0, 1, 2 o 3;
R2 es -H o -CH3 ;
X es -O-P(NR22R23)OCH2CH2-EWG o (CH2CH2O)a-CH2CH2OP(NR22R23)OCH2CH2-EWG, en donde a es 0, 1,2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquilo (C-i-Ca), alquilo (C-i-Ca) sustituido o R7 y R8 juntos forman un heterociclo de cinco, seis o siete miembros;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 ,
Figure imgf000011_0003
R22 y heterociclo.
El método mencionado anteriormente, en donde el compuesto de cumarina que comprende un resto de fosforamidita tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000011_0004
en donde
Figure imgf000011_0005
n es 1 o 2;
o es 1 o 2;
p es 0, 1, 2 o 3;
R2 es -H o -CH3 ;
X es -O-P(NR22R23)OCH2CH2-EWG o (CH2CH2O)a-CH2CH2OP(NR22R23)OCH2CH2-EWG, en donde a es 0, 1,2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 , -CH2CH3 , -CH(CH3)2 o R22 y R23 juntos forman un heterociclo;
R24 es alquilo (C1-C8) o alquilo (C1-C8) sustituido;
R25 es alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido o CH2SO3H.
Descripción detallada de la invención
Salvo que se indique lo contrario, los siguientes términos usados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones tienen los significados proporcionados más adelante:
Definiciones
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento, por lo general, tienen el mismo significado que el que comúnmente entendería una persona normalmente versada en la materia a la que pertenece esta invención. Generalmente, la nomenclatura que se utiliza en el presente documento y los procedimientos de laboratorio, en cultivo celular, genético molecular, química orgánica y química e hibridación de ácidos nucleicos que se describen a continuación son bien conocidos y habitualmente empleados en la técnica. Para la síntesis de ácidos nucleicos y péptidos se utilizan técnicas estándar. Generalmente, las reacciones enzimáticas y las etapas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales de la técnica y varias referencias generales (véase, en general, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), que se proporcionan a lo largo de este documento. La nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio en química analítica y química orgánica sintética descritos a continuación son bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Las técnicas estándar, o modificaciones de las mismas, se utilizan para las síntesis químicas y los análisis químicos.
"Analito", como se utiliza en el presente documento, significa cualquier compuesto o molécula de interés para el que se realiza una prueba de diagnóstico. Un analito puede ser, por ejemplo, una proteína, péptido, hidrato de carbono, polisacárido, glucoproteína, hormona, receptor, antígeno, anticuerpo, virus, sustrato, metabolito, análogo de estado de transición, cofactor, inhibidor, fármaco, tinte, nutriente, factor de crecimiento, etc., sin limitación.
Tal como se usa en el presente documento, "transferencia de energía" se refiere al proceso por el cual un grupo modificador altera la energía de estado excitado de un grupo excitado, tal como un desactivador. Si el grupo modificador de la energía de estado excitado es un grupo de desactivación, entonces la emisión de fluorescencia del grupo fluorescente se atenúa (se desactiva). La transferencia de energía puede ocurrir a través de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, o a través de la transferencia directa de energía. Los mecanismos exactos de transferencia de energía en estos dos casos son diferentes. Debe entenderse que cualquier referencia a la transferencia de energía en la presente solicitud abarca todos estos fenómenos distintos en cuanto a mecanismo.
Tal como se usa en el presente documento, "par de transferencia de energía" se refiere a dos moléculas cualquiera que participan en la transferencia de energía. Típicamente, una de las moléculas actúa como un grupo fluorescente, y la otra actúa como un grupo modificador de la fluorescencia. El par de transferencia de energía preferente de la presente invención comprende un grupo fluorescente y un grupo de desactivación de la invención. En esta aplicación no hay ninguna limitación en la identidad de los miembros individuales del par de transferencia de energía. Todo lo que se requiere es que, si la distancia entre los miembros individuales se altera en alguna cantidad crítica, las propiedades espectroscópicas del par de transferencia de energía en su conjunto cambien de alguna manera medible. La expresión "par de transferencia de energía" se utiliza para referirse a un grupo de moléculas que forman un complejo dentro del cual ocurre la transferencia de energía. Dichos complejos pueden incluir, por ejemplo, dos grupos fluorescentes, que pueden ser diferentes entre sí y un grupo de desactivación, dos grupos de desactivación y un grupo fluorescente, o múltiples grupos fluorescentes y múltiples grupos de desactivación. En los casos en que hay múltiples grupos fluorescentes y/o múltiples grupos de desactivación, los grupos individuales pueden ser diferentes entre sí.
Tal como se usa en el presente documento, "grupo modificador de la fluorescencia" se refiere a una molécula de la invención que puede alterar de alguna manera la emisión de fluorescencia de un grupo fluorescente. Un grupo modificador de la fluorescencia generalmente logra esto a través de un mecanismo de transferencia de energía. Dependiendo de la identidad del grupo modificador de la fluorescencia, la emisión de fluorescencia puede sufrir una serie de alteraciones, incluyendo, aunque no de forma limitativa, atenuación, desactivación completa, mejora, un cambio en la longitud de onda, un cambio en la polaridad, y un cambio en el tiempo de vida de la fluorescencia. Un ejemplo de un grupo modificador de la fluorescencia es un grupo de desactivación.
Tal como se usa en el presente documento, "grupo de desactivación" se refiere a cualquier grupo modificador de la fluorescencia de la invención que pueda atenuar, al menos parcialmente, la luz emitida por un grupo fluorescente. Esta atenuación se menciona en el presente documento como "desactivación". Por consiguiente, la iluminación del grupo fluorescente en presencia del grupo de desactivación conduce a una señal de emisión menos intensa de lo esperado, o incluso completamente ausente. La desactivación ocurre normalmente a través de la transferencia de energía entre el grupo fluorescente y el grupo de desactivación.
Tal como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" significa ADN, ARN, monocatenario, bicatenario o motivos de hibridación con alto grado de agregación, y cualquier modificación química de los mismos. Las modificaciones incluyen, aunque sin limitación, las que proporcionan grupos químicos que incorporan carga adicional, polarizabilidad, enlaces de hidrógeno, interacción electrostática y fluxionalidad con las bases de ligando de ácido nucleico o con el ligando de ácido nucleico en su conjunto. Dichas modificaciones incluyen, aunque sin limitación, ácidos peptidonucleicos (PNA, por sus siglas en inglés), modificaciones de grupo fosfodiéster (por ejemplo, fosforotioatos, metilfosfonatos), modificaciones del azúcar en posición 2', modificaciones de pirimidina en posición 5, modificaciones de purina en posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o de 5-yodo-uracilo; modificaciones de la cadena principal, metilaciones, combinaciones inusuales de emparejamiento de bases tales como isobases, isocitidina e isoguanidina y similares. Los ácidos nucleicos también pueden incluir bases no naturales, tales como, por ejemplo, nitroindol. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones 3' y 5' tales como el encapuchado con BHQ, un fluoróforo u otro resto.
"Péptido" se refiere a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y se unen mediante enlaces amida, denominado, como alternativa, polipéptido. Cuando los aminoácidos son a-aminoácidos, puede utilizarse el isómero L-óptico o el isómero D-óptico. Adicionalmente, aminoácidos no naturales, por ejemplo, p-alanina, fenilglicina y homoarginina también se incluyen. Los aminoácidos más frecuentes que no están codificados por genes también pueden utilizarse en la presente invención. Todos los aminoácidos utilizados en la presente invención pueden ser bien el isómero D o bien el isómero L. Generalmente, se prefieren los isómeros L. De manera adicional, otros peptidomiméticos también son útiles en la presente invención. Para una revisión general, véase, Spatola, A. F., en CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, pág. 267 (1983).
"Especies bioactivas", se refiere a moléculas que, cuando se administran a un organismo, afectan a ese organismo. Las especies bioactivas ilustrativas incluyen productos farmacéuticos, plaguicidas, herbicidas, reguladores del crecimiento y similares. Las especies bioactivas abarcan moléculas pequeñas (es decir, aproximadamente <1000 daltons), oligómeros, polímeros y similares. También se incluyen ácidos nucleicos y sus análogos, péptidos y sus análogos y similares.
El término "alquilo" se usa en el presente documento para referirse a un radical hidrocarburo ramificado o no ramificado, saturado o insaturado, monovalente y divalente, generalmente que tiene de aproximadamente 1-30 carbonos y preferentemente, de 4-20 carbonos y más preferentemente de 6-18 carbonos. Cuando el grupo alquilo tiene de 1 a 6 átomos de carbono, se le denomina "alquilo inferior". Radicales alquilo adecuados incluyen, por ejemplo, estructuras que contienen uno o más grupos metileno, metino y/o metino. Las estructuras ramificadas tienen un motivo de ramificación similar al /-propilo, t-butilo, /-butilo, 2-etilpropilo, etc. Como se usa en el presente documento, la expresión abarca "alquilos sustituidos", y "alquilo cíclico". la expresión alquilo (C-i-Cs) se refiere a un alquilo que tiene entre uno y ocho átomos de carbono.
"Alquilo sustituido" se refiere a alquilo como se acaba de describir que incluye uno o más sustituyentes tales como, por ejemplo, alquilo inferior, arilo, acilo, halógeno (es decir, alquilhalos, por ejemplo, CF3), hidroxi, amino, alcoxi, alquilamino, acilamino, tioamido, aciloxi, ariloxi, ariloxialquilo, mercapto, tia, aza, oxo, hidrocarburos cíclicos tanto saturados como insaturados, heterociclos y similares. Estos grupos pueden estar unidos a cualquier carbono o sustituyente del resto alquilo. Adicionalmente, estos grupos pueden ser colgantes o integrales a la cadena de alquilo.
El término "arilo" se usa en el presente documento para referirse a un sustituyente aromático, que puede ser un solo anillo aromático o múltiples anillos aromáticos que se fusionan, se unen covalentemente o se unen a un grupo común como un resto diazo, metileno o etileno. El grupo de enlace común también puede ser un carbonilo como en la benzofenona. El(los) anillo(s) aromático(s) puede(n) incluir fenilo, naftilo, bifenilo, difenilmetilo y benzofenona entre otros. El término "arilo" abarca "arilalquilo" y "arilo sustituido".
"Arilo sustituido" se refiere a arilo como se acaba de describir que incluye uno o más grupos funcionales como alquilo inferior, acilo, halógeno, alquilhalos (por ejemplo, CF3), hidroxi, amino, alcoxi, alquilamino, acilamino, aciloxi, fenoxi, mercapto e hidrocarburos cíclicos tanto saturados como insaturados que están fusionados con el(los) anillo(s) aromático(s), enlazados covalentemente o enlazados a un grupo común tal como un resto diazo, metileno o etileno. El grupo de enlace también puede ser un carbonilo tal como en ciclohexil fenil cetona. El término "arilo sustituido" abarca "arilalquilo sustituido".
El término "arilalquilo" se usa en el presente documento para referirse a un subconjunto de "arilo" en el que el grupo arilo está unido a otro grupo por un grupo alquilo como se define en el presente documento.
"Arilalquilo sustituido" define un subconjunto de "arilo sustituido" en donde el grupo arilo sustituido está unido a otro grupo por un grupo alquilo como se define en el presente documento.
El término "acilo" se usa para describir un sustituyente de cetona, C(O)R, donde R es alquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido como se define en el presente documento.
El término "halógeno" se usa en el presente documento para referirse a átomos de flúor, bromo, cloro y yodo.
El término "hidroxi" se usa en el presente documento para referirse al grupo --OH.
El término "amino" se usa para --NRR', donde R y R' son independientemente H, alquilo, arilo o análogos sustituidos de los mismos. "Amino" abarca "alquilamino" que denota aminas secundarias y terciarias y "acilamino" que describe el grupo RC(O)NR'.
El término "alcoxi" se usa en el presente documento para referirse al grupo -OR, donde R es alquilo, o un análogo sustituido del mismo. Los radicales alcoxi adecuados incluyen, por ejemplo, metoxi, etoxi, t-butoxi, etc.
Como se usa en el presente documento, el término "ariloxi" denota grupos aromáticos que están unidos a otro grupo directamente a través de un átomo de oxígeno. Este término abarca restos de "ariloxi sustituido" en los que el grupo aromático está sustituido como se describe anteriormente por "arilo sustituido". Los restos ariloxi ejemplares incluyen fenoxi, fenoxi sustituido, benciloxi, fenetiloxi, etc.
Como se usa en el presente documento "ariloxialquilo" define grupos aromáticos unidos, a través de un átomo de oxígeno, a un grupo alquilo, como se define en el presente documento. El término "ariloxialquilo" abarca restos de "ariloxialquilo sustituido" en los que el grupo aromático está sustituido como se describe para "arilo sustituido". Como se usa en el presente documento, el término "mercapto" define fracciones de la estructura general --S--R en donde R es H, alquilo, arilo o heterocíclico como se describe en el presente documento.
La expresión "hidrocarburo cíclico saturado" denota grupos, tales como el ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, etc. y análogos sustituidos de estas estructuras. Estos hidrocarburos cíclicos pueden ser estructuras de uno o varios anillos. La expresión "hidrocarburo cíclico insaturado" se usa para describir un grupo no aromático monovalente con al menos un doble enlace, como ciclopenteno, ciclohexeno, etc. y análogos sustituidos de los mismos. Estos hidrocarburos cíclicos pueden ser estructuras de uno o varios anillos.
El término "heteroarilo", como se usa en el presente documento, se refiere a anillos aromáticos en los que uno o más átomos de carbono del(de los) anillo(s) aromático(s) se reemplazan por un heteroátomo tal como nitrógeno, oxígeno o azufre. Heteroarilo se refiere a estructuras que pueden ser un solo anillo aromático, anillo(s) aromático(s) múltiple(s) o uno o más anillos aromáticos acoplados a uno o más anillos no aromáticos. En estructuras que tienen múltiples anillos, los anillos se pueden fusionar entre sí, enlazarse covalentemente o enlazarse a un grupo común tal como un resto diazo, metileno o etileno. El grupo de unión común también puede ser un carbonilo como en la fenilpiridilcetona. Como se usa en el presente documento, anillos como el tiofeno, piridina, isoxazol, ftalimida, pirazol, indol, furano, etc. o análogos benzocondensados de estos anillos se definen mediante el término "heteroarilo".
"Heteroarilalquilo" define un subconjunto de "heteroarilo" en el que un grupo alquilo, como se define en el presente documento, une el grupo heteroarilo a otro grupo.
"Heteroarilo sustituido" se refiere a heteroarilo como se acaba de describir, en donde el núcleo de heteroarilo está sustituido con uno o más grupos funcionales tales como alquilo inferior, acilo, halógeno, alquilhalos (por ejemplo, CF3), hidroxi, amino, alcoxi, alquilamino, acilamino, aciloxi, mercapto, etc. Por lo tanto, análogos sustituidos de anillos heteroaromáticos tales como tiofeno, piridina, isoxazol, ftalimida, pirazol, indol, furano, etc. o análogos benzocondensados de estos anillos se definen mediante la expresión "heteroarilo sustituido".
"Heteroarilalquilo sustituido" se refiere a un subconjunto de "heteroarilo sustituido" como se describe anteriormente en el que un grupo alquilo, como se define en el presente documento, une el grupo heteroarilo a otro grupo.
El término "heterocíclico" se usa en el presente documento para describir un grupo no aromático monovalente saturado o insaturado que tiene un solo anillo o múltiples anillos condensados de 1 a 12 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, azufre u oxígeno dentro del anillo. Tales heterociclos son, por ejemplo, tetrahidrofurano, morfolina, piperidina, pirrolidina, etc.
El término "heterocíclico sustituido" tal como se usa en el presente documento, describe un subconjunto de "heterocíclico" en donde el núcleo del heterociclo está sustituido con uno o más grupos funcionales como alquilo inferior, acilo, halógeno, alquilhalos (por ejemplo, CF3), hidroxi, amino, alcoxi, alquilamino, acilamino, aciloxi, mercapto, etc.
El término "heterocicloalquilo" define un subconjunto de "heterocíclico" en donde un grupo alquilo, como se define en el presente documento, une el grupo heterocíclico a otro grupo
Compuestos
En un aspecto, la presente invención se refiere a compuestos. Un conjunto de compuestos está representado por la Estructura 15, a continuación:
Figure imgf000015_0001
donde
m es 1, 2 o 3;
n es 1 o 2;
o es 1 o 2;
p es 0, 1, 2 o 3;
R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ;
X es -OH, -NH2 , -SH, -OR11, -NHR12, -NR13R14, -OC(O)R15, -NHC(O)R16, -SC(O)R17, -C(O)OH, -C(O)OR18, -C(O)NHR19, -C(O)NR20R21, -N3;
R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan independientemente entre alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido, -CH2CH(OH)CH2(OH), -CH(CH2OH)2, -CH2CCH, -(CH2CH2O)a-CH2CH2OH donde a es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, -P(NR22R23)OCH2CH2-EWG, -P(O)(O-)-Oligonucleótido, -(CH2)bCC-Nucleósido, -(CH2)bCC-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNH-Nucleósido, -(c^)bN H -[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], donde b es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 , -CH2CH3 , -CH(CH3)2 o R22 y R23 juntos forman un heterociclo;
Rx y Ry son independientemente H o CH3.
Otro conjunto de compuestos está representado por la Estructura 16, a continuación:
Figure imgf000015_0002
donde
m es 1, 2 o 3;
n es 1 o 2;
o es 1 o 2;
p es 0, 1, 2 o 3;
R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ;
R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido o R7 y R8 juntos forman un heterociclo de cinco, seis o siete miembros;
X es -OH, -NH2 , -SH, -OR11, -NHR12, -NR13R14, -OC(O)R15, -NHC(O)R16, -SC(O)R17, -C(O)OH, -C(O)OR18, -C(O)NHR19, -C(O)NR20R21, -N3;
R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan independientemente entre alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido, -CH2CH(OH)CH2(OH), -CH(CH2OH)2, -CH2CCH, -(CH2CH2O)a-CH2CH2OH donde a es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, -P(NR22R23)OCH2CH2-EWG, -P(O)(O-)-Oligonucleótido, -(CH2)bCC-Nucleósido, -(CH2)bCC-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNH-Nucleósido, -(c^)bN H -[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], donde b es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 , -CH2CH3 , -CH(CH3)2 o R22 y R23 juntos forman un heterociclo.
Otro conjunto de compuestos está representado por la Estructura 17, a continuación:
Figure imgf000016_0001
donde
m es 1, 2 o 3;
n es 1 o 2;
o es 1 o 2;
p es 0, 1, 2 o 3;
R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ; la línea discontinua representa un doble enlace opcional;
X es -OH, -NH2 , -SH, -OR11, -NHR12, -NR13R14, -OC(O)R15, -NHC(O)R16, -SC(O)R17, -C(O)OH, -C(O)OR18, -C(O)NHR19, -C(O)NR20R21, -N3;
R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan independientemente entre alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido, -CH2CH(OH)CH2(OH), -CH(CH2OH)2, -CH2CCH, -(CH2CH2O)a-CH2CH2OH donde a es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, -P(NR22R23)OCH2CH2-EWG, -P(O)(O-)-Oligonucleótido, -(CH2)bCC-Nucleósido, -(CH2)bCC-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNH-Nucleósido, -(cH 2)bNH-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], donde b es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 , -CH2CH3 , -CH(CH3)2 o R22 y R23 juntos forman un heterociclo;
R24 es alquilo (C1-C8) o alquilo (C1-C8) sustituido;
R25 es alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido o CH2SO3H.
Otro conjunto de compuestos está representado por la Estructura 32, a continuación:
Figure imgf000017_0001
donde
m es 1, 2 o 3;
R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ;
X es -OH, -NH2 , -SH, -OR11, -NHR12, -NR13R14, -OC(O)R15, -NHC(O)R16, -SC(O)R17, -C(O)OH, -C(O)OR18, -C(O)NHR19, -C(O)NR20R21, -N3;
R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan independientemente entre alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido, -CH2CH(OH)CH2(OH), -CH(CH2OH)2, -CH2CCH, -(CH2CH2O)a-CH2CH2OH donde a es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, -P(NR22R23)OCH2CH2-EWG, -P(O)(O-)-Oligonucleótido, -(CH2)bCC-Nucleósido, -(CH2)bCC-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNH-Nucleósido, -(cH 2)bNH-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], donde b es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
Rx y Ry son independientemente H o CH3;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 , -CH2CH3 , -CH(CH3)2 o R22 y R23 juntos forman un heterociclo.
Otro conjunto de compuestos está representado por la Estructura 33, a continuación:
Figure imgf000017_0002
donde
m es 1, 2 o 3;
R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ;
R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido o R7 y R8 juntos forman un heterociclo de cinco, seis o siete miembros;
X es -OH, -NH2 , -SH, -OR11, -NHR12, -NR13R14, -OC(O)R15, -NHC(O)R16, -SC(O)R17, -C(O)OH, -C(O)OR18, -C(O)NHR19, -C(O)NR20R21, -N3;
R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan independientemente entre alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido, -CH2CH(OH)CH2(OH), -CH(CH2OH)2, -CH2CCH, -(CH2CH2O)a-CH2CH2OH donde a es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, -P(NR22R23)OCH2CH2-EWG, -P(O)(O-)-Oligonudeótido, -(CH2)bCC-Nucleósido, -(CH2)bCC-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNH-Nucleósido, -(c^)bN H -[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], donde b es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 , -CH2CH3 , -CH(CH3)2 o R22 y R23 juntos forman un heterociclo.
Otro conjunto de compuestos está representado por la Estructura 34, a continuación:
Figure imgf000018_0001
donde
m es 1, 2 o 3;
R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ;
X es -OH, -NH2 , -SH, -OR11, -NHR12, -NR13R14, -OC(O)R15, -NHC(O)R16, -SC(O)R17, -C(O)OH, -C(O)OR18, -C(O)NHR19, -C(O)NR20R21, -N3;
la línea discontinua representa un doble enlace opcional;
R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan independientemente entre alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido, -CH2CH(OH)CH2(OH), -CH(CH2OH)2, -CH2CCH, -(CH2CH2O)a-CH2CH2OH donde a es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, -P(NR22R23)OCH2CH2-EWG, -P(O)(O-)-Oligonucleótido, -(CH2)bCC-Nucleósido, -(CH2)bCC-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNH-Nucleósido, -(cH 2)bNH-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], donde b es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 , -CH2CH3 , -CH(CH3)2 o R22 y R23 juntos forman un heterociclo;
R24 es alquilo (C1-C8) o alquilo (C1-C8) sustituido;
R25 es alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido o CH2SO3H.
Síntesis de compuestos
A .3-Carboxamidas de cumarina
Las 3-carboxamidas de cumarina de fórmula 107 se preparan por reacción de un 4-amino-2-hidroxibenzaldehído 102 adecuadamente sustituido con un malonato de dialquilo 104 y un aminoalcohol 106 adecuadamente sustituido en presencia de un catalizador tal como piperidina.
Esquema de reacción 1
Preparación de 3-Carboxamidas de cumarina
Figure imgf000019_0001
B. 3-Acetamidas de cumarma
La reacción de un 3-aminofenol 108 adecuadamente sustituido con un succinato de acetildialquilo 109 en presencia de un catalizador adecuado como ZnCl2 , H2SO4 o TFA produce ásteres 3-acéticos de cumarina 110 y ácidos 3-acéticos de cumarina 111. Los ásteres 3-acéticos de cumarina 110 se convierten en ácidos 3-acéticos de cumarina 111 mediante hidrólisis.
Esquema de reacción 2
Preparación de ásteres y ácidos cumarin 3-acéticos
Figure imgf000019_0002
Las 3-acetamidas de cumarina se pueden preparar por múltiples métodos a partir de los ésteres cumarin 3-acéticos 110 o los ácidos cumarin 3-acéticos 111. En el método A, el éster 3-acético de cumarina 110 se hace reaccionar directamente con un aminoalcohol 106 adecuadamente sustituido que contiene un resto carbocíclico para producir la 3-acetamida de cumarina 113.
Esquema de reacción 3
Preparación de 3-Acetamidas de cumarina: Método A
Figure imgf000019_0003
En el método B, el ácido cumarin 3-acético 111 se convierte en el éster NHS 114 a través de NHS y un agente de acoplamiento, tal como DCC, EDCI, BOP o con un reactivo para introducir directamente un resto NHS como DSC (carbonato de disuccinimdilo). El éster NHS 114 se hace reaccionar con un aminoalcohol 106 adecuadamente sustituido que contiene un resto carbocíclico para producir la 3-acetamida de cumarina 113.
Esquema de reacción 4
Preparación de 3-acetamidas de cumarina: Método B
Figure imgf000020_0001
En el método C, el ácido cumarin 3-acético 111 se acopla directamente con un aminoalcohol 106 adecuadamente sustituido que contiene un resto carbocíclico mediante el uso de un agente de acoplamiento, tal como DCC, EDCI o BOP para producir la 3-acetamida de cumarina 113.
Esquema de reacción 5
Preparación de 3-acetamidas de cumarina: Método C
Figure imgf000020_0002
Los derivados de cumarina 107 o 113 se convierten en fosforamiditas de cumarina por reacción con 3-((bis(diisopropilamino)fosfino)oxi)propanonitrilo en presencia de un activador como 1H-tetrazol o etiltiotetrazol. Esquema de reacción 7
Preparación de fosforamiditas de cumarina a partir de derivados de 3-carboxamida de cumarina y 3-acetamida de cumarina
Figure imgf000021_0001
Otro conjunto de compuestos proporcionados por la presente invención se encuentra en las sondas. Las sondas incluyen fluoróforos a base de cumarina - Estructuras 15, 16, 17, 32, 33 y 34 anteriores - que se conjugan, por ejemplo, con especies diana (por ejemplo, receptor, enzima, etc.) un ligando para una especie diana (por ejemplo, ácido nucleico, péptido, etc.), una molécula pequeña (por ejemplo, fármaco, pesticida, etc.) y similares. Las sondas pueden utilizarse para aplicaciones in vitro e in vivo.
Los fluoróforos de la presente invención son robustos en una variedad de condiciones sintéticas utilizadas para unirlos a una molécula portadora. Por ejemplo, muchos de los fluoróforos derivados de cumarina sobreviven a las condiciones necesarias para la síntesis automatizada de ácidos nucleicos sin sufrir ningún grado sustancial de degradación o alteración. En cambio, muchos de los derivados de cumarina reconocidos en la técnica requieren condiciones especiales para ensamblar la molécula portadora a la que están unidos, o tienen que ser unidos después de la finalización de la síntesis de la molécula portadora. La complejidad adicional de la síntesis de una sonda aumenta tanto la duración de la síntesis como su coste.
En ciertos casos, cuando los fluoróforos de la presente invención se incluyen en la síntesis automatizada de ácidos nucleicos, los fluoróforos se degradan o alteran en menos del 10,0 por ciento de los ácidos nucleicos del producto. En otros casos, los fluoróforos se degradan o alteran en menos del 5,0 por ciento, 2,5 por ciento, 1,0 por ciento o 0,5 por ciento de los ácidos nucleicos del producto.
Otro conjunto de compuestos proporcionados por la presente invención se encuentra en las sondas de molécula pequeña. Los fluoróforos a base de cumarina de la presente invención pueden utilizarse como componentes de sondas de molécula pequeña. En un diseño preferido, una sonda de molécula pequeña incluye un fluoróforo de acuerdo con la presente invención, o un precursor de dicha molécula, y un desactivador. En una realización a modo de ejemplo, un agente, tal como una enzima, escinde el desactivador, el fluoróforo o ambos de la molécula pequeña que genera fluorescencia en el sistema objeto de investigación (véase, por ejemplo, Zlokarnik etal., Science 279: 84-88 (1998)).
Otro conjunto de compuestos proporcionados por la presente invención se encuentra en las sondas de ácido nucleico. Los fluoróforos a base de cumarina de la presente invención son útiles junto con las sondas de ácidos nucleicos, y pueden utilizarse como componentes de agentes de detección en una variedad de estrategias de amplificación/cuantificación de ADN que incluyen, por ejemplo, ensayo de 5'-nucleasa, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA, por sus siglas en inglés), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, por sus siglas en inglés), amplificación por círculo rodante (RCA, por sus siglas en inglés), así como para la detección directa de dianas en ensayos en fase de solución o en fase sólida (por ejemplo, matriz). Es más, los ácidos nucleicos derivados de fluoróforos pueden utilizarse en sondas de prácticamente cualquier formato, incluyendo, por ejemplo, sondas con formato seleccionado de balizas moleculares, Scorpion Probes™, Sunrise Probes™, sondas asistidas conformacionalmente, sondas Light up, sondas de detección Invader y sondas TaqMan™. Véanse, por ejemplo, Cardullo, R., etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8790-8794 (1988); Dexter, D. L., J. Chem. Physics, 21:836-850 (1953); Hochstrasser, R. A., et al., Biophysical Chemistry, 45:133-141 (1992); Selvin, P., Methods in Enzymology, 246:300-334 (1995); Steinberg, I., Ann. Rev. Biochem., 40:83-114 (1971); Stryer, L., Ann. Rev. Biochem., 47:819-846 (1978); Wang, G., et al., Tetrahedron Letters, 31:6493-6496 (1990); Wang, Y., et al., Anal. Chem., 67:1197-1203 (1995); Debouck, C., et al., en el suplemento de Nature Genetics, 21:48-50 (1999); Rehman, F. N., et al., Nucleic Acids Research, 27:649-655 (1999); Cooper, J. P., et al., Biochemistry, 29:9261-9268 (1990); Gibson, E. M., et al., Genome Methods, 6:995-1001 (1996); Hochstrasser, R. A., et al., Biophysical Chemistry, 45:133-141 (1992); Holland, P. M., et al., Proc Natl. Acad. Sci. EE. UU., 88:7276-7289 (1991); Lee, L. G., et al., Nucleic Acids Rsch., 21:3761-3766 (1993); Livak, K. J., et al., PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Press (1995); Vamosi, G., et al., Biophysical Journal, 71:972-994 (1996); Wittwer, C. T., et al., Biotechniques, 22:176-181 (1997); Wittwer, C. T., et al., Biotechniques, 22:130-38 (1997); Giesendorf, B. A. J., et al., Clinical Chemistry, 44:482-486 (1998); Kostrikis, L. G., et al., Science, 279:1228-1229 (1998); Matsuo, T., Biochemica et Biophysica Acta, 1379:178-184 (1998); Piatek, A. S., et al., Nature Biotechnology, 16:359-363 (1998); Schofield, P., et al., Appl. Environ. Microbiology, 63:1143-1147 (1997); Tyagi S., et al., Nature Biotechnology, 16:49-53 (1998); Tyagi, S., et al., Nature Biotechnology, 14:303-308 (1996); Nazarenko, I. A., et al., Nucleic Acids Research, 25:2516-2521 (1997); Uehara, H., et al., Biotechniques, 26:552-558 (1999); D. Whitcombe, et al., Nature Biotechnology, 17:804-807 (1999); Lyamichev, V., et al., Nature Biotechnology, 17:292 (1999); Daubendiek, et al., Nature Biotechnology, 15:273-277 (1997); Lizardi, P. M., et al., Nature Genetics, 19:225-232 (1998); Walker, G., et al., Nucleic Acids Res., 20:1691-1696 (1992); Walker, G. T., et al., Clinical Chemistry, 42:9-13 (1996); y Compton, J., Nature, 350:91-92 (1991).
Puede utilizarse una sonda que lleve tanto un desactivador como un fluoróforo a base de cumarina de acuerdo con la presente invención o, como alternativa, uno o más de los ácidos nucleicos pueden ser marcados individualmente con un desactivador o fluoróforo. Cuando un ácido nucleico marcado individualmente con un fluoróforo de acuerdo con la presente invención es la sonda, la interacción entre los ácidos nucleicos primero y segundo puede detectarse observando la interacción entre el fluoróforo y el ácido nucleico o, más preferentemente, la desactivación de la fluorescencia del fluoróforo por el desactivador unido al segundo ácido nucleico.
Además de su utilidad general en las sondas diseñadas para investigar la amplificación, detección y cuantificación del ácido nucleico, los presentes fluoróforos pueden utilizarse en prácticamente cualquier formato de sonda de ácido nucleico conocido en la actualidad o descubierto posteriormente. Por ejemplo, los fluoróforos a base de cumarina de la invención pueden incorporarse a motivos de sonda, tales como sondas Taqman™ (Held et al., Genome Res. 6: 986­ 994 (1996), Holland et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280 (1991), Lee et al., Nucleic Acids Res. 21: 3761­ 3766 (1993)), balizas moleculares (Tyagi et al., Nature Biotechnology 14:303-308 (1996), Jayasena et al., patente de EE.u U. N.° 5.989.823, publicada el 23 de noviembre de 1999)), sondas Scorpion (Whitcomb et al., Nature Biotechnology 17: 804-807 (1999)), sondas Sunrise (Nazarenko et al., Nucleic Acids Res. 25: 2516-2521 (1997)), sondas asistidas conformacionalmente (Cook, R., solicitud provisional de EE.UU. 60/138.376, presentada el 9 de junio de 1999), sondas Light up basadas en ácidos peptidonucleicos (PNA) (Kubista et al., documento WO 97/45539, diciembre de 1997), tintes de ADN específicos bicatenarios (Higuchi et al, Bio/Technology 10: 413-417 (1992), Wittwer et al, BioTechniques 22: 130-138 (1997)) y similares. Estos y otros motivos de sonda con los que se pueden utilizar los presentes desactivadores se revisan en NONISOTOPIC DnA PROBE TECHNIQUES, Academic Press, Inc. 1992.
Los ácidos nucleicos para su uso en las sondas de la invención pueden ser de cualquier tamaño adecuado, y están preferentemente en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleótidos, más preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nucleótidos y más preferentemente aún, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos. La secuencia y la longitud precisas de una sonda de ácido nucleico de la invención dependen, en parte, de la naturaleza del polinucleótido diana al que se une. El lugar de unión y la longitud se pueden variar para conseguir las propiedades de recocido y fusión adecuadas para una realización particular. En muchas referencias reconocidas en la técnica se puede encontrar una guía para realizar tales elecciones de diseño.
Preferentemente, el nucleótido 3'-terminal de la sonda de ácido nucleico se bloquea o no puede extenderse por una polimerasa de ácido nucleico. Dicho bloqueo se lleva a cabo de manera conveniente mediante la unión de un resto donante o aceptor a la posición 3' terminal de la sonda de ácido nucleico, directamente o mediante un resto de unión.
El ácido nucleico puede comprender ADN, ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos. Tanto la sonda como el ácido nucleico diana pueden estar presentes como una sola hebra, dúplex, tríplex, etc. Asimismo, el ácido nucleico puede modificarse en el resto base, resto de azúcar o la cadena principal de fosfato con otros grupos, tales como etiquetas radiactivas, aglutinantes del surco menor, agentes intercalantes, restos donantes y/o aceptores y similares.
Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender al menos un resto de base modificado que se selecciona entre el grupo que incluye, pero no se limita a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-mannosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N.sup.2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, nitroindol y 2,6-diaminopurina.
En otra realización, el ácido nucleico comprende al menos un resto de azúcar modificado seleccionado entre el grupo que incluye, pero no se limita a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa.
En otra realización más, el ácido nucleico comprende al menos un esqueleto de fosfato modificado seleccionado entre el grupo que incluye, pero no se limita a, un híbrido de ácido nucleico peptídico, un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforoamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un alquilfosfotriéster y un formacetal o análogo del mismo.
Los ácidos nucleicos unidos a fosfodiéster de la invención se pueden sintetizar mediante métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tal como los disponibles comercialmente de P.E. Biosystems, etc.) usando químicas de amidita disponibles comercialmente. Los ácidos nucleicos que llevan grupos de enlace fosfodiéster modificados pueden sintetizarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de fosforotioato pueden sintetizarse mediante el método de Stein et al. (Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)), los ácidos nucleicos de metilfosfonato se pueden preparar mediante el uso de soportes de polímero de vidrio de poro controlado (Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988)). Otros métodos para sintetizar ácidos nucleicos unidos tanto a fosfodiéster como a fosfodiéster modificado serán evidentes para los expertos en la materia.
Las sondas de ácido nucleico de la invención se pueden sintetizar mediante una serie de enfoques, por ejemplo, Ozaki et al., Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214 (1992); Agrawal et al., Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423 (1990); o similares. Las sondas de ácido nucleico de la invención se sintetizan convenientemente en un sintetizador de ADN automatizado, por ejemplo, un sintetizador de ADN/ARN modelo 392 o 394 de P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif ), usando químicas estándar, tal como la química de fosforamidita (véase, por ejemplo, desvelado en las siguientes referencias, Beaucage et al., Tetrahedron, 48: 2223-2311 (1992); Molko et al., Pat. de Estados Unidos n.° 4.980.460; Koster et al., Pat. de Estados Unidos n.° 4.725.677; Caruthers et al., las Patentes de EE.UU. n.° 4.415.732; 4.458.066 y 4.973.679. También pueden emplearse químicas alternativas que den como resultado grupos principales no naturales, tales como fosforotioato, fosforamidato y similares.
Cuando los ácidos nucleicos se sintetizan usando un sintetizador de ácidos nucleicos automatizado, los restos donador y aceptor se introducen preferentemente durante la síntesis automatizada. Alternativamente, uno o más de estos restos pueden introducirse antes o después de que haya comenzado el procedimiento de síntesis automatizado. Por ejemplo, se pueden introducir grupos donantes y/o aceptores en el extremo 3' usando un soporte sólido modificado con el(los) grupo(s) deseado(s). Adicionalmente, los grupos donantes y/o aceptores se pueden introducir en el extremo 5', por ejemplo, mediante un derivado del grupo que incluye una fosforamidita. En otra realización ilustrativa, uno o más de los grupos donantes y/o aceptores se introducen después de que se complete la síntesis automatizada.
En las sondas doblemente marcadas, el fluoróforo está preferentemente separado del extintor por al menos aproximadamente 10 nucleótidos, y más preferentemente por al menos aproximadamente 15 nucleótidos. El resto donante se une preferentemente a los nucleótidos terminales 3' o 5' de la sonda. El fluoróforo también se une preferentemente a los nucleótidos terminales 3' o 5' de la sonda. Más preferentemente, los restos donante y aceptor se unen a los nucleótidos terminales 3' y 5' o 5' y 3' de la sonda, respectivamente, aunque también es útil la colocación interna.
Una vez que se sintetiza el ácido nucleico deseado, se escinde preferiblemente del soporte sólido sobre el que se sintetizó y se trató, mediante métodos conocidos en la técnica, para retirar cualquier grupo protector presente (por ejemplo, 60 °C, 5 h, amoníaco concentrado). En aquellas realizaciones en las que se une un grupo sensible a bases a los ácidos nucleicos (por ejemplo, TAMRA), la desprotección usará preferentemente condiciones más suaves (por ejemplo, terc-butilamina/agua 1:3, 8 horas, 70 °C). La desprotección en estas condiciones se ve facilitada por el uso de amiditas de desprotección rápida (por ejemplo, dC-acetilo, dG-dmf).
Después de la escisión del soporte y la desprotección, el ácido nucleico se purifica mediante cualquier método conocido en la técnica, incluidas la cromatografía, la extracción y la purificación en gel. En una realización preferida, el ácido nucleico se purifica mediante HPLC. La concentración y pureza del ácido nucleico aislado se determina preferentemente midiendo la densidad óptica a 260 nm en un espectrofotómetro.
Otro conjunto de compuestos proporcionado por la presente invención son las sondas peptídicas. Los péptidos, proteínas y ácidos nucleicos peptídicos que están marcados con un fluoróforo de la presente invención y un inhibidor pueden usarse en ensayos enzimáticos tanto in vivo como in vitro.
Un conjunto de materiales proporcionados por la presente invención son fluoróforos a base de cumarina inmovilizados en un soporte sólido. Los fluoróforos de la presente invención se pueden inmovilizar sustancialmente en cualquier polímero, biomolécula y material sólido o semisólido que tenga cualquier configuración útil. Asimismo, cualquier conjugado que comprenda uno o más fluoróforos puede inmovilizarse de manera similar. Cuando el soporte es sólido o semisólido, los ejemplos de tipos preferidos de soportes para la inmovilización de la sonda de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan, vidrio de poro controlado, placas de vidrio, poliestireno, perlas de poliestireno recubiertas de avidina, celulosa, nailon, gel de acrilamida y dextrano activado. Estos soportes sólidos son los preferidos debido a su estabilidad química, facilidad de funcionalización y área superficial bien definida. Los soportes sólidos tales como vidrio de poro controlado (CPG, 500 angstroms, 1000 angstroms) y poliestireno altamente reticulado que no se hincha (1000 angstroms) son particularmente preferidos.
De acuerdo con la presente invención, la superficie de un soporte sólido se funcionaliza con un fluoróforo de la invención o una especie que incluye un fluoróforo de la invención. Para mayor claridad de ilustración, la siguiente discusión se centra en unir un fluoróforo reactivo a un soporte sólido. La siguiente discusión también es ampliamente relevante para unir una especie que incluye dentro de su estructura un fluoróforo reactivo a un soporte sólido, y la unión de tales especies y fluoróforos reactivos a otras moléculas y estructuras.
Los fluoróforos se unen preferentemente a un soporte sólido formando un enlace entre un grupo reactivo en el fluoróforo y un grupo reactivo en la superficie del soporte sólido o un conector unido al soporte sólido, derivatizando así el soporte sólido con uno o más fluoróforos. Los ejemplos no limitantes de grupos reactivos incluyen: aminas, grupos hidroxilo, ácidos carboxílicos, derivados de ácidos carboxílicos, alquenos, sulfhidrilos, siloxanos, etc.
Un conjunto de compuestos proporcionados por la presente invención son las sondas de captura de ácidos nucleicos. En una realización, un ácido nucleico inmovilizado que comprende un fluoróforo basado en cumarina de acuerdo con la presente invención se usa como sonda de captura. La sonda de ácido nucleico se puede unir directamente a un soporte sólido, por ejemplo mediante la unión del nucleótido terminal 3' o 5' de la sonda al soporte sólido. Más preferentemente, sin embargo, la sonda está unida al soporte sólido por un conector. El conector sirve para distanciar la sonda del soporte sólido. El conector es más preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 átomos de longitud, más preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 átomos de longitud.
En otra realización preferida más, el soporte sólido también se usa como soporte de síntesis en la preparación de la sonda. La longitud y la estabilidad química del conector entre el soporte sólido y la primera unidad 3' del ácido nucleico juegan un papel importante en la síntesis e hibridación eficientes de los ácidos nucleicos unidos al soporte. El brazo conector debe ser lo suficientemente largo para que se pueda lograr un alto rendimiento (>97 %) durante la síntesis automatizada. La longitud requerida del conector dependerá del soporte sólido particular usado. Por ejemplo, un conector de seis átomos suele ser suficiente para lograr un rendimiento >97 % durante la síntesis automatizada de ácidos nucleicos cuando se usa poliestireno altamente reticulado como soporte sólido. El brazo conector tiene preferentemente una longitud de al menos 20 átomos para lograr un alto rendimiento (>97 %) durante la síntesis automatizada cuando se usa CPG como soporte sólido.
La hibridación de una sonda inmovilizada en un soporte sólido generalmente requiere que la sonda esté separada del soporte sólido por al menos 30 átomos, más preferentemente al menos 50 átomos. Para lograr esta separación, el conector generalmente incluye un espaciador colocado entre el conector y el extremo 3'. Para la síntesis de ácidos nucleicos, el brazo conector generalmente se une al 3'-OH del extremo 3' mediante un enlace éster que se puede escindir con reactivos básicos para liberar el ácido nucleico del soporte sólido.
En la técnica se conoce una amplia variedad de conectores, que se pueden usar para unir la sonda de ácido nucleico al soporte sólido. El conector puede estar formado por cualquier compuesto que no interfiera significativamente con la hibridación de la secuencia diana con la sonda unida al soporte sólido. El conector puede estar formado, por ejemplo, por un ácido nucleico homopolimérico, que se puede añadir fácilmente al conector mediante síntesis automatizada. Alternativamente, se pueden usar como conector polímeros tales como polietilenglicol funcionalizado. Tales polímeros se prefieren actualmente a los ácidos nucleicos homopoliméricos porque no interfieren significativamente con la hibridación de la sonda con el ácido nucleico diana. Se prefiere particularmente el polietilenglicol porque está disponible comercialmente, es soluble en medios tanto orgánicos como acuosos, es fácil de funcionalizar y es completamente estable en las condiciones de síntesis y post-síntesis de ácidos nucleicos.
Los enlaces entre el soporte sólido, el conector y la sonda preferiblemente no se escinden durante la síntesis o eliminación de los grupos protectores de bases en condiciones básicas a alta temperatura. Sin embargo, estos enlaces se pueden seleccionar de grupos que se pueden escindir en una variedad de condiciones. Los ejemplos de enlaces actualmente preferidos incluyen enlaces carbamato, éster y amida.
Un conjunto de materiales proporcionados por la presente invención son sondas inmovilizadas con acrilamida. En otra realización preferida, una especie está dentro de una matriz, tal como una matriz de acrilamida y la especie lleva un fluoróforo a base de cumarina de acuerdo con la presente invención, o la presencia de la especie inmovilizada se determina utilizando una sonda que lleva un fluoróforo. En una realización preferida, la inmovilización se lleva a cabo junto con el proceso "Acrydite" inventado y comercializado por Mosaic Technologies (Cambridge, Mass., véase, Reliman et al., Nucleic Acids Research, 27: 649-655 (1999)). El método Acrydite permite la inmovilización de sondas de captura marcadas con alqueno dentro de una red de poliacrilamida polimerizada. Cuando las mezclas diana pasan por la banda de sonda inmovilizada en condiciones de electroforesis, el ácido nucleico diana es capturado sustancialmente de forma cuantitativa. No obstante, la detección de este evento requiere actualmente una segunda sonda. En una realización, las sondas que llevan un fluoróforo, y/o un desactivador, se inmovilizan en una matriz de acrilamida y posteriormente se ponen en contacto con la mezcla diana. Utilizando sondas fluorescentes como sondas de captura, las señales de las mezclas diana pueden detectarse directamente en tiempo real.
Una colección de compuestos proporcionados por la presente invención es una micromatriz. Las micromatrices incluyen fluoróforos y compuestos a base de cumarina inmovilizados (por ejemplo, péptidos, ácidos nucleicos, agentes bioactivos, etc.) funcionalizados con fluoróforos a base de cumarina. Asimismo, la invención proporciona métodos de interrogación de micromatrices utilizando sondas funcionalizadas con fluoróforos. Las especies inmovilizadas y las sondas se seleccionan entre sustancialmente cualquier tipo de molécula, incluyendo, aunque no de forma limitativa, moléculas pequeñas, péptidos, enzimas, ácidos nucleicos y similares.
Las micromatrices de ácidos nucleicos que consisten en una multitud de ácidos nucleicos inmovilizados son herramientas importantes para la generación de información genómica, véase, Debouck et al., en el suplemento de Nature Genetics, 21:48-50 (1999). El análisis que figura a continuación se centra en el uso de fluoróforos de acuerdo con la presente invención junto con micromatrices de ácidos nucleicos. Este enfoque tiene como objeto ser ilustrativo y no limita el alcance de los materiales con los que se puede poner en práctica este aspecto de la presente invención.
En otra realización preferida, los compuestos de la presente invención se utilizan en un formato de micromatriz. Los fluoróforos, o las especies que llevan fluoróforos, pueden ser componentes de una micromatriz o, como alternativa, pueden ser utilizados como una herramienta para identificar selectivamente los componentes de una micromatriz.
Un método para realizar matrices ordenadas de sondas a base de cumarina en un sustrato es el enfoque de transferencia en mancha. En este método, un colector de vacío transfiere una pluralidad, p. ej., 96, muestras acuosas de sondas de pocillos de 3 milímetros de diámetro a un sustrato. La sonda se inmoviliza en la membrana porosa horneando la membrana o exponiéndola a la radiación UV. Una variante común de este procedimiento es el método de transferencia por ranuras, en el que los pocillos tienen formas ovaladas muy alargadas.
Otra técnica empleada para realizar matrices ordenadas de sondas utiliza una matriz de pines sumergidos en los pocillos, p. ej., los 96 pocillos de una placa de microtitulación, para transferir una matriz de muestras a un sustrato, tal como una membrana porosa. Una matriz incluye pines que están diseñados para marcar una membrana de forma escalonada, para crear un conjunto de 9216 puntos en un área de 22 x 22 cm. Véanse, Lehrach, et al., HYBRIDIZATION FINGERPRINTING IN GENOME MAPPING AND SEQUENCING, GENOME ANALYSIS, Vol. 1, Davies et al, Eds., Cold Springs Harbor Press, págs. 39-81 (1990).
Un método alternativo para crear matrices ordenadas de sondas es análogo al descrito por Pirrung et al. (patente de EE. UU. N.° 5.143.854, publicada en 1992), y también por Fodor et al., (Science, 251: 767-773 (1991)). Este método consiste en sintetizar diferentes sondas en diferentes regiones discretas de una partícula u otro sustrato. Este método se utiliza preferentemente con moléculas de sonda relativamente cortas, p. ej., menos de 20 bases. Un método relacionado ha sido descrito por Southern et al. (Genomics, 13: 1008-1017 (1992)).
Khrapko, et al., DNA Sequence, 1: 375-388 (1991) describen un método para realizar una matriz de ácido nucleico depositando ADN en una fina capa de poliacrilamida. La deposición se realiza manualmente con una micropipeta.
El sustrato también puede ser modelado utilizando técnicas tales como fotolitografía (Kleinfield et al., J. Neurosci.
8:4098-120 (1998)), fotograbado, grabado químico e impresión por microcontacto (Kumar et al., Langmuir 10:1498-511 (1994)). Otras técnicas para formar patrones en un sustrato serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia.
El tamaño y la complejidad del patrón en el sustrato están limitados únicamente por la resolución de la técnica utilizada y el fin para el que se pretende el patrón. Por ejemplo, utilizando impresión por microcontacto, elementos tan pequeños como 200 nm se forman en capas en un sustrato. Véase, Xia, Y., J. Am. Chem. Soc. 117:3274-75 (1995). De forma similar, utilizando fotolitografía, se producen patrones con elementos tan pequeños como 1 pm. Véase, Hickman et al., J. Vac. Sci. Technol. 12:607-16 (1994). Los patrones que son útiles en la presente invención incluyen aquellos que incluyen elementos tales como pocillos, cerramientos, separaciones, rebajes, entradas, salidas, canales, canalizaciones, rejillas de difracción y similares.
En una realización preferente actual, la formación de patrones se utiliza para producir un sustrato que tiene una pluralidad de pocillos adyacentes, indentaciones u orificios para contener las sondas. En general, cada uno de estos elementos del sustrato está aislado de los otros pocillos por una pared elevada o separación y los pocillos no se comunican fácilmente de forma fluida. Así, una partícula, reactivo u otra sustancia, colocado en un pocilio particular permanece sustancialmente confinado en ese pocillo. En otra realización preferida, la formación de patrones permite la creación de canales a través del dispositivo mediante los cuales un analito u otra sustancia puede entrar y/o salir del dispositivo.
En otra realización, las sondas se inmovilizan "imprimiéndose" directamente sobre un sustrato o, como alternativa, se puede utilizar una técnica de "despegue". En la técnica de despegue, se coloca una capa protectora con patrones sobre el sustrato, y se coloca una sonda en las áreas no cubiertas por la capa protectora y la capa protectora se retira posteriormente. Las capas protectoras apropiadas para su uso con los sustratos de la presente invención son conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Kleinfield etal., J. Neurosci. 8:4098-120 (1998). Después de la retirada de la fotocapa protectora, una segunda sonda, que tiene una estructura diferente de la primera sonda, puede adherirse al sustrato en las áreas inicialmente cubiertas por la capa protectora. Utilizando esta técnica, se pueden producir sustratos con patrones de sondas que tienen diferentes características. Se puede acceder a configuraciones de sustrato similares mediante la microimpresión de una capa con las características deseadas directamente sobre el sustrato. Véase, Mrkish et al. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25:55-78 (1996).
Métodos
En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, un método para realizar una sonda que incluye un resto de cumarina. El método implica: 1) sintetizar la sonda que contiene un resto de cumarina utilizando un método de síntesis en fase sólida; 2) retirar la sonda del soporte sólido a una temperatura entre 50 °C y 70 °C, en amoniaco concentrado, durante un periodo de 2 h a 8 h; 3) aislar la sonda. El resto de cumarina aislado se degrada en un grado inferior al 10,0 por ciento como resultado de la retirada de la sonda. Normalmente, el resto de cumarina se degrada en un grado inferior al 5,0 por ciento, 2,5 por ciento o 1,0 por ciento.
En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, un método para realizar una sonda que incluye un resto de cumarina. El método implica: 1) sintetizar la sonda que contiene un resto de cumarina utilizando un método de síntesis en fase sólida; 2) retirar la sonda del soporte sólido a una temperatura entre 50 °C y 70 °C, en amoniaco concentrado, durante un periodo de 2 h a 8 h; 3) aislar la sonda. El resto de cumarina aislado se degrada en un grado inferior al 10,0 por ciento como resultado de la retirada de la sonda. Normalmente, el resto de cumarina se degrada en un grado inferior al 5,0 por ciento, 2,5 por ciento o 1,0 por ciento.
En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, un método para realizar una sonda que incluye un resto de cumarina. El método implica: 1) sintetizar la sonda que contiene un resto de cumarina utilizando un método de síntesis en fase sólida; 2) retirar la sonda del soporte sólido a una temperatura entre 60 °C y 80 °C, en 1:3 de terc-butilamina/agua, durante un periodo de 4 h a 12 h; 3) aislar la sonda. El resto de cumarina aislado se degrada en un grado inferior al 10,0 por ciento como resultado de la retirada de la sonda. Normalmente, el resto de cumarina se degrada en un grado inferior al 5,0 por ciento, 2,5 por ciento o 1,0 por ciento.
En un aspecto del método, la presente invención proporciona un método para determinar si una muestra contiene una enzima. El método incluye: (a) poner en contacto la muestra con una construcción peptídica que incluye un fluoróforo a base de cumarina de la presente invención; (b) excitar dicho fluoróforo; y (c) determinar una propiedad de fluorescencia de dicha muestra, en donde la presencia de dicha enzima en dicha muestra da lugar a un cambio en dicha propiedad de fluorescencia.
Las construcciones peptídicas preferidas incluyen: i) un fluoróforo, donde el fluoróforo es un fluoróforo a base de cumarina de la presente invención; ii) un desactivador; y iii) un sitio de reconocimiento de escisión para la enzima. Asimismo, el péptido se encuentra preferentemente en una conformación que permite la transferencia de energía donante-aceptor entre el fluoróforo y el desactivador cuando se excita el fluoróforo.
En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, un método para determinar si un compuesto altera la actividad de una enzima. Las realizaciones preferidas de este aspecto incluyen las etapas citadas en relación con el aspecto de la invención anteriormente citado y además incluyen una etapa (c) que determina una propiedad de fluorescencia de la muestra, en donde dicha actividad de dicha enzima en dicha muestra da lugar a un cambio en la propiedad de fluorescencia.
En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, un método para detectar una secuencia diana de ácido nucleico. El método incluye: (a) poner en contacto la secuencia diana con un ácido nucleico detector; (b) hibridar la secuencia de unión con la secuencia diana, alterando así la conformación del ácido nucleico detector, provocando un cambio en un parámetro de fluorescencia; y (c) detectar el cambio en el parámetro de fluorescencia, detectando así la secuencia diana del ácido nucleico.
En los métodos descritos en el presente documento, salvo que se indique lo contrario, un ácido nucleico detector preferido incluye una secuencia de unión a la diana monocatenaria. La secuencia de unión tiene unida a la misma: i) un fluoróforo a base de cumarina de la presente invención; y ii) un desactivador.
En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, un método para detectar la amplificación de una secuencia diana. El método incluye el uso de una reacción de amplificación que incluye las siguientes etapas: (a) hibridar la secuencia diana y un ácido nucleico detector. El ácido nucleico detector incluye una secuencia de unión a la diana monocatenaria y una estructura secundaria asociada intramolecularmente 5' a la secuencia de unión a la diana. Al menos una parte de la secuencia detectora forma una cola monocatenaria que está disponible para la hibridación con la secuencia diana; (b) extender el ácido nucleico detector hibridado en la secuencia diana con una polimerasa para producir un producto de extensión de ácido nucleico detector y separar el producto de extensión del ácido nucleico detector de la secuencia diana; (c) hibridar un cebador con el producto de extensión del ácido nucleico detector y extender el cebador con la polimerasa, linealizando así la estructura secundaria asociada intramolecularmente y produciendo un cambio en un parámetro de fluorescencia; y (d) detectar el cambio en el parámetro de fluorescencia, detectando así la secuencia diana.
En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, un método para determinar si una muestra contiene una enzima. El método comprende: (a) poner en contacto la muestra con una construcción peptídica; (b) excitar el fluoróforo a base de cumarina; y (c) determinar una propiedad de fluorescencia de la muestra, en donde la presencia de la enzima en la muestra da lugar a un cambio en la propiedad de fluorescencia.
Las construcciones peptídicas útiles para la práctica de la invención incluyen aquellas con las siguientes características: i) un fluoróforo, donde el fluoróforo es un fluoróforo a base de cumarina de la presente invención; ii) un desactivador; y iii) un sitio de reconocimiento de escisión para la enzima.
En otro aspecto del método, la invención proporciona un método para conjugar una primera molécula con una segunda molécula utilizando la química de clic (adición de azida a alquino, normalmente mediada por un catalizador metálico) para obtener una sonda que contenga al menos un fluoróforo a base de cumarina de la presente invención. La primera o la segunda molécula incluye un resto de azida; la molécula primera o segunda que no incluye un resto de azida incluye un resto de alquino. El al menos un fluoróforo a base de cumarina de la presente invención surge originalmente de la primera molécula y/o de la segunda molécula.
Los ejemplos no limitantes de azidas usadas en el método Click Chemistry discutido anteriormente incluyen la Estructura 165.
Figure imgf000027_0001
Los sustituyentes y las variables para las Estructuras 165 se definen a continuación: m es 1,2 o 3; n es 1 o 2; o es 1 o 2; p es 0, 1,2 o 3; R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ;
R3 es H;
R4 es H o R4 junto con R5 forman un anillo carbocíclico o heterocíclico de cinco o seis miembros (por ejemplo, piperidinilo);
R5 es -NR7R8 donde R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquilo (C1-C8), o R7 y R8 juntos forman un heterociclo de cuatro, cinco, seis o siete miembros, ; o R4, R5 y R6 juntos forman sistemas de anillos carbocíclicos o heterocíclicos condensados que tienen anillos de cinco o seis miembros;
R6 es H, o R4, R5 y R6 juntos forman sistemas de anillos carbocíclicos o heterocíclicos condensados que tienen anillos de cinco o seis miembros.
En el presente documento se divulga, pero no forman parte de la presente invención, son métodos para determinar la cantidad de actividad de una enzima en una muestra de un organismo. El método incluye: (a) poner en contacto una muestra que comprende la enzima y el compuesto con una construcción peptídica que comprende (b) excitar el fluoróforo; y (c) determinar una propiedad de fluorescencia de la muestra, en donde la actividad de la enzima en la muestra da como resultado un cambio en la propiedad de fluorescencia. Las construcciones peptídicas útiles en este aspecto de la invención son sustancialmente similares a las descritas inmediatamente antes.
Ejemplos
Ejemplo 1
Preparación del compuesto 201
Figure imgf000028_0001
2-(7-(Dimetilamino)-4-metil-2-oxo-2H-cromen-3-il)acetato de metilo
Un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético se cargó con 3-dimetilaminofenol (66,3 g, 483 mmol), 2-acetilsuccinato de dimetilo (86,2 g, 531 mmol) y cloruro de cinc (92,2 g, 676 mmol). La mezcla se calentó a 120 °C durante 24 horas y se enfrió. La masa de reacción se repartió entre DCM (1,5 l) y agua (4 l) más HCl concentrado (70 ml). Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo con DCM (2 x 1 l). Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron con agua (2 x 4 l). La fase orgánica se extrajo con KOH 0,5 N (1 l, 2 x 500 ml) estos lavados se guardaron para la extracción del ácido cumarínico siguiente. La fase orgánica se lavó con salmuera (4 l), se secó con MgSO4 y se concentraron para dar 31,0 gramos de un semisólido de color rojo. La recristalización en IPA (150 ml) dio el compuesto 21 en forma de color rosa (14,6 g, rendimiento del 11 %). p.f. 130-132 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 1,18 (3H, t, J=7,0 Hz), 3,00 (6 H, s), 3,88 (2H, s), 4,10 (2H, c, J=7,1 Hz), 6,05 (1H, s), 6,56 (1H, d, J=2,8 Hz), 6,73 (1H, dd, J = 2,8, 9,2 Hz), 7,43 (1H, d, J = 9,2 Hz). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C15H17NO4: 276,12; encontrado: 276,12. Anál. calc. para C15H17NO4 : C, 65,44; H, 6,22; N, 5,09; Encontrado: C, 65,49; H, 6,18; N, 5,08.
Ejemplo 2
Preparación del Compuesto 202
Figure imgf000028_0002
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1 usando 2-acetilsuccinato de dietilo en lugar de 2-acetilsuccinato de dimetilo para producir el compuesto 202 en forma de un sólido de color púrpura claro con un rendimiento del 24 %. p.f. 125­ 127 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 1,18 (3H, t, J=7,0 Hz), 3,00 (6 H, s), 3,88 (2H, s), 4,10 (2H, c, J=7,1 Hz), 6,05 (1H, s), 6,56 (1H, d, J=2,8 Hz), 6,73 (1H, dd, J = 2,8, 9,2 Hz), 7,43 (1H, d, J = 9,2 Hz). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C16H19NO4 : 290,14; encontrado: 290,14. Anál. calc. para C16H19NO4 : C, 66,42; H, 6,62; N, 4,84; Encontrado: C, 66,25; H, 6,57; N, 5,00.
Ejemplo 3
Preparación del compuesto 203
Figure imgf000029_0001
ácido 2-(7-(dimetilamino)-4-metil-2-oxo-2H-cromen-3-il)acético
Procedimiento A: Los lavados alcalinos del Ejemplo 1 se acidificaron con AcOH. Los sólidos se filtraron y secaron para producir el compuesto 203 en forma de un sólido de color rosa (25,2 g, rendimiento del 20 %). De forma similar, los lavados alcalinos del Ejemplo 2 se acidificaron con AcOH para dar 203 con un rendimiento del 11 %.
Procedimiento B: El compuesto 202 (4 g) se disolvió en MeOH (25 ml) en un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético. Se añadió KOH al 10 %/MeOH (25 ml) y la reacción se agitó a TA durante 18 horas. La mezcla se acidificó con AcOH y los sólidos se retiraron por filtración y se secaron para producir el compuesto 203 en forma de un sólido de color rosa (3,43 g, rendimiento del 95 %). p.f. 206-208 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8 2,31 (3H, s), 3,01 (6 H, s), 3,52 (2H, s), 6,55 (1H, d, J=2,4 Hz), 6,74 (1H, dd, J = 2,4, 9,2 Hz), 7,58 (1H, d, J=9,2 Hz), 12,34 (1H, s). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C14H15NO4: 262,11, encontrado: 262,11.
Ejemplo 4
Preparación del compuesto 204
Figure imgf000029_0002
2-(9-Metil-11-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-il)acetato de metilo
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1 usando 8 -hidroxi-julolidina en lugar de 3-dimetilaminofenol para producir el compuesto 204 en forma de un sólido de color canela claro (rendimiento del 28 %). p.f. 117-119 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 1,88 (4H, m, J=5,6 Hz), 2,25 (3H, s), 2,71 (4H, c, J=6 , 8 Hz), 3,21 (4H, c, J=6,3 Hz), 3,58 (2H, s), 3,59 (3H, s), 7,15 (1H, s). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C19H21NO4: 327,15, encontrado: 327,15. Anál. calc. para C19H21NO4: C, 69,71; H, 6,47; N, 4,28; Encontrado: C, 69,55; H, 6,38; N, 4,20.
Ejemplo 5
Preparación del compuesto 205
Figure imgf000030_0001
ácido 2-(9-metil-11-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-il)acético
Los lavados alcalinos del Ejemplo 4 se acidificaron con AcOH. Los sólidos se retiraron por filtración y se secaron para producir el compuesto 205 en forma de un sólido de color amarillo pálido (rendimiento del 27 %). p.f. 182-186 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8 1,89 (4H, m), 2,25 (3H, s), 2,73 (4H, c, J=6,1 Hz), 3,22 (4H, c, J=5,9 Hz), 3,47 (2H, s), 7,16 (1H, s), 12,45 (1H, s muy a). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C18H19NO4: 314,14, encontrado: 314,14.
Ejemplo 6
Preparación del compuesto 206
Figure imgf000030_0002
2-(9-Etil-4,6,8,8-tetrametil-2-oxo-8,9-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-3-il)acetato de metilo
Un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético se cargó con bromhidrato de 1-etil-2,2,4-trimetil-1,2-dihidroquinolin-7-ol (14,9 g, 50 mmol), 2-acetilsuccinato de dimetilo (18,8 g, 100mmol) y cloruro de cinc (19,1 g, 140 mmol). La mezcla se calentó a 125 °C durante 20 horas y después se enfrió. La masa de reacción se repartió entre DCM (400 ml) y agua (600 ml) más HCl concentrado (10 ml). Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo con DCM (2 x 300 ml). Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron con agua (2 x 600 ml) y salmuera (800 ml), se secaron con MgSO4 y se concentraron para dar un jarabe de color verde oscuro (13,7 g, rendimiento del 77 %). Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con MeOH del 0 % al 2 %/DCM para dar un sólido de color verdoso (7,0 g, rendimiento del 39 %). La recristalización en IPA (50 ml) dio el compuesto 206 en forma de un sólido de color amarillo (3,54 g, rendimiento del 20 %). p.f. 107-109 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 1,13 (3H, t, J=5,6 Hz), 1,34 (6 H, s), 1,98 (3H, d, J=0,8 Hz), 2,31 (3H, s), 3,40 (2H, c, J=5,6 Hz), 3,60 (2H, s), 3,61 (3H, s), 5,40 (1H, s), 6,34 (1H, s), 7,21 (1H, s). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C21H25NO4: 356,19, encontrado: 356,19
Ejemplo 7
Preparación del compuesto 207
Figure imgf000031_0001
Ácido 2-(9-etil-4,6,8,8-tetrametil-2-oxo-8,9-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-3-il)acético
Se disolvió éster cumarínico 206 (3 g, 8,44 mmol) en MeOH (20 ml) y se añadió KOH al 10 %/MeOH (20 ml). Después de 14 horas agitándose a TA, se añadió ácido acético (1,2 ml) y la mezcla se concentró. El residuo se disolvió y se añadió ácido acético adicional (1,5 ml) para formar una suspensión que se mantuvo a 4 °C durante una noche. Al día siguiente se decantó el sobrenadante de la masa gomosa de color oscuro. La goma se disolvió en DCM (100 ml) y se lavó con agua (50 ml) y salmuera (50 ml). La fase orgánica se secó con MgSO4 y se concentró para dar el compuesto 207 en forma de un sólido de color parduzco amarillo (2,44 g, rendimiento del 85 %). P.f. 223-227 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 51,14 (3H, t, J=5,6 Hz), 1,34 (6 H, s), 1,99 (3H, d, J=0,8 Hz), 2,31 (3H, s), 3,40 (2H, c, J=5,6 Hz), 3,51 (2H, s), 5,40 (1H, d, J=1,2 Hz), 6,39 (1H, s), 7,21 (1H, s), 12,31 (1H, s). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C20H23NO4: 342,17, encontrado: 342,17.
Ejemplo 8
Preparación del compuesto 208
Figure imgf000031_0002
(3-(2-Etoxi-2-oxoetil)-9-etil-4,8,8-trimetil-2-oxo-8,9-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-6-il)metanosulfonato sódico
Se hizo reaccionar (1-etil-7-hidroxi-2,2-dimetil-1,2-dihidroquinolin-4-il)metanosulfonato sódico (2,14 g, 6,70 mmol) con acetilsuccinato de dietilo (2,90 g, 13,4 mmol) y cloruro de cinc (2,56 g, 18,8 mmol) a 125 °C durante 2 0 horas. La mezcla se enfrió y se trituró con EtOH (3 x 40 ml). Los lavados de EtOH se concentraron para dar un residuo de color negro (5,35 g). Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con MeOH al 0­ 15 %/DCM. La concentración de las fracciones de producto, produjo el compuesto 208 en forma de una goma de color oscuro (482 mg, rendimiento del 15 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 51,15 (3H, t, J=6,4 Hz), 1,18 (3H, t, J=6,4 Hz), 1,34 (6 H, s), 2,31 (3H, s), 3,17 (3H, d, J=3,2 Hz), 3,40 (2H, c, J=5,2 Hz), 3,58 (2H, s), 3,61 (3H, s), 4,08 (4H, superpuesto m), 5,48 (1H, s), 6,30 (1H, s), 7,77 (1H, s). EM (ES+) m/z: [m H]+ calc. para C22H27NO7S (forma ácida): 450,16, encontrado: 450,16.
Ejemplo 9
Preparación del compuesto 209
Figure imgf000032_0001
2-(7-(dimetilamino)-4-metil-2-oxo-2H-cromen-3-il)acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo
Se disolvieron el compuesto 203 (20 g, 76,5 mmol) y NHS (10,6 g, 91,8 mmol) en DMF (800 ml) en un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético. Se añadió diciclohexil carbodiimida (20,5 g, 99,5 mmol) y la reacción se agitó a TA durante 48 horas. La suspensión se filtró y el filtrado se vertió en agua enfriada con hielo (3 l) con agitación. El precipitado se retiró por filtración, se lavó con agua y se secó para producir el compuesto 206 en forma de un sólido de color amarillo pálido (31,9 g, rendimiento del 121 %). La r Mn indicó que este material contenía 18% molar de DCU que no afectó a la reacción subsiguiente. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 52,37 (3H, s), 2,79 (4 H, s a), 3,03 (6 H, s), 4,01 (2H, s), 6,57 (1H, d, J=2,4 Hz), 6,75 (1H, dd, J = 2,4, 8 , 8 Hz), 7,63 (1H, d, J = 9,2 Hz).
Ejemplo 10
Preparación del compuesto 210
Figure imgf000032_0002
2-(9-metil-11-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-il)acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 9 usando el compuesto 205 en lugar del compuesto 203 para producir el compuesto 210 en forma de un sólido de color amarillo con un rendimiento del 116 %. La RMN indicó que este material contenía 25 % molar de DCU. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 1,88 (4H, m, J=6,0 Hz), 2,32 (3H, s), 2,73 (4H, m, J=4,4 Hz), 2,79 (4H, s a), 3,24 (4H, c, J=5,9 Hz), 3,98 (2H, s), 7,22 (1H, s).
Ejemplo 11
Preparación del compuesto 211
Figure imgf000033_0001
2-(9-etil-4,6,8,8-tetrametil-2-oxo-8,9-dihidro-2H-pirano [3,2-g] quinolin-3-il)acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo
Se hizo reaccionar ácido cumarínico 207 (2,0 g, 5,86 mmol) con carbonato de N,N'-disuccinimidilo (1,95 g, 7,62 mmol) y DIEA (909 mg, 7,03 mmol) en DMF (30 ml). Después de 4 horas de agitación a TA, la mezcla se vertió en agua fría (400 ml) para dar una suspensión de color amarillo que se mantuvo a 4 °C durante una noche. La filtración por succión dio un sólido de color amarillo que se disolvió en d Cm (40 ml) y se lavó con agua (20 ml) y salmuera (20 ml). La fase orgánica se secó con MgSO4 y se concentró para dar el compuesto 211 en forma de una espuma de color ámbar (2,32 g, rendimiento del 90 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8 1,15 (3H, t, J=6,4 Hz), 1,35 (6 H, s), 2,00 (3H, d, J=0,4 Hz), 2,38 (3H, s), 2,80 (4H, s a), 3,42 (2H, c, J=6,4 Hz), 4,00 (2H, s), 5,42 (1H, s), 6,34 (1H, s), 7,24 (1H, s).
Ejemplo 12
Preparación del compuesto 212
Figure imgf000033_0002
7-(dimetilamino)-3-(2-(4-hidroxipiperidin-1-il)-2-oxoetil)-4-metil-2H-cromen-2-ona
Se disolvieron el compuesto 211 (15 g, 34,6 mmol) y 4-hidroxi-piperidina (4,55 g, 45 mmol) en DMF (200 ml) en un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético. Después de agitar durante 4 horas a TA, el matraz se mantuvo a 4 °C durante una noche. El precipitado se retiró por filtración, se lavó con DMF (2 x 25 ml), DCM (2 x 25 ml) y se secó para producir el compuesto 212 en forma de un sólido de color blanco con un rendimiento del 125 %. La RMN indicó la presencia de 26 % en moles de DCU. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 1,24 (3H, m), 1,39 (1H, m), 1,69 (3H, m), 2,23 (3H, s), 2,90 (1H, m), 3,01 (6 H, s), 3,25 (1H, m), 3,48 (1H, m), 3,60 (2H, d, J=2,8 Hz), 3,70 (1H, m), 3,87 (2H, m), 6,54 (1H, d, J=2,4 Hz), 6,69 (1H, dd, J = 2,4, 8 , 8 Hz), 7,43 (1H, d, J = 8 , 8 Hz). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C19H24N2O4 : 345,18, encontrado: 345,18.
Ejemplo de referencia 13
Preparación del compuesto 213
Figure imgf000034_0001
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 12 usando aminohexanol en lugar de 4-hidroxipiperidina para producir el compuesto 213 en forma de un sólido de color blanco crema con un rendimiento del 100 %. La RMN indicó que este material contenía 16 % molar de DCU. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 51,24 (4H, m), 1,37 (3H, m), 2,28 (3H, s), 3,01 (6 H, s), 3,37 (2H, m), 4,33 (1H, t, J=5,2 Hz), 6,54 (1H, d, J=2,4 Hz), 6,73 (1H, dd, J = 2,4, 8 , 8 Hz), 7,56 (1H, d, J=8 , 8 Hz), 7,83 (1H, t, J = 5,7 Hz). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C20H28N2O4 : 361,21, encontrado: 361,21. Ejemplo 14
Preparación del compuesto 214
Figure imgf000034_0002
10-(2-(4-hidroxipiperidin-1 -il)-2-oxoetil)-9-metil-2,3,6,7-tetrahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-11(5H)-ona
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 12 usando el compuesto 210 en lugar del compuesto 209 para producir el compuesto 214 en forma de un sólido de color amarillo pálido con un rendimiento del 116 %. La RMN indicó que este material contenía 25 % molar de DCU. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 1,23 (2H, m), 1,68 (2H, m), 1,88 (4H, m, J=5,9 Hz), 2,19 (3H, s), 2,74 (4H, c, J=6,4 Hz), 3,22 (4H, c, J=6,4 Hz), 3,57 (2H, d, J=3,2 Hz), 3,57 (1H, m), 3,70 (1H, m), 3,86 (2H, m), 7,14 (1H, s). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C23H28N2O4 : 397,21, encontrado: 397,21.
Ejemplo de referencia 15
Preparación del compuesto 215
Figure imgf000035_0001
N-(6-hidroxihexil)-2-(9-metil-11-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-il)acetamida
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 13 usando aminohexanol en lugar de 4-hidroxi-piperidina para producir el compuesto 215 en forma de un sólido de color amarillo pálido con un rendimiento del 98 %. RMN 1H (400 MHz, DMSO-de) 51,24 (4H, m), 1,38 (4H, c, J=6,9 Hz), 1,88 (4H, c, J=5,9 Hz), 2,73 (4H, c, J=6,3 Hz), 3,00 (2H, c, J=6 , 6 Hz), 3,22 (2H, c, J=5,9 Hz), 3,37 (4H, m), 4,32 (1H, t, J=5,2 Hz) 7,14 (1H, s), 7,76 (1H, t, J = 5,6 Hz). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C24H32N2O4 : 413,24, encontrado: 413,24.
Ejemplo 16
Preparación del compuesto 216
Figure imgf000035_0002
9-etil-3-(2-(4-hidroxipiperidin-1-il)-2-oxoetil)-4,6,8,8-tetrametil-8,9-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-2-ona Se hizo reaccionar el compuesto 211 (2,00 g, 4,56 mmol) con HO-piperidina (554 mg, 5,47 mmol) en DMF (10 ml) a TA. Después de 2 horas la reacción se mantuvo a 4 °C durante una noche. La filtración por succión dio el compuesto 216 en forma de un polvo de color amarillo pálido (872 mg, rendimiento del 45 %). Se añadió agua (20 ml) al filtrado para precipitar más producto. La filtración por succión dio 216 adicional (1,00 g, rendimiento del 52%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 51,14 (3H, t, J=5,6 Hz), 1,22 (2H, m), 1,34 (6 H, s), 1,68 (2H, m), 1,79 (1H, m), 1,99 (3H, s), 2,24 (3H, s), 2,44 (2H, m), 2,54 (3H, s), 2,89 (1H, m), 2,99 (1H, m), 3,26 (1H, m), 3,40 (2H, c, J= 6 Hz), 3,45 (1H, m), 3,60 (2H, d, J = 3,6), 3,71 (1H, m, J=3,2 Hz), 3,86 (2H, m), 5,39 (1H, d, J = 0,4 Hz), 6,33 (1H, s), 7,19 (1H, s). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C25H32N2O4 425,24, encontrado: 425,24.
Ejemplo de referencia 17
Preparación del compuesto 217
Figure imgf000036_0001
7-(dietilamino)-3-(4-hidroxipiperidin-1-carbonil)-2H-cromen-2-ona
Se añadieron 4-(dietilamino)-2-hidroxibenzaldehído (10 g, 51,7 mmol), malonato de dietilo (9,95 g, 62,1 mmol), 4-hidroxipiperidina (26,2 g, 259 mmol), piperidina (5 gotas) y ácido acético (5 gotas) a un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético. La reacción se calentó a 100 °C durante 4 horas. Después de enfriar, el jarabe se vertió en agua (400 ml) y se extrajo con DCM (3 x 200 ml). La fase orgánica se lavó con agua (2 x 300 ml), ácido cítrico 1 M acuoso (3 x 300 ml) y salmuera (500 ml), después se secó con MgSO4 y se concentró para dar 13,0 gramos de una espuma de color amarillo. Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con MeOH del 0% al 5 %/DCM para dar el compuesto 217 en forma de una espuma de color amarillo (12,2 g, rendimiento del 6 8 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8 1,12 (6 H, t, J=7,2 Hz), 1,35 (2H, m), 1,73 (2H, m), 3,12 (2H, m), 3,44 (4H, c, J=7,1 Hz), 3,71 (1H, m, J=4,1 Hz), 3,97 (1H, m), 4,78 (1H, d, J=4,0 Hz), 6,54 (1H, d, J=2,8 Hz), 6,73 (1H, dd, J = 2,4, 8 , 8 Hz), 7,48 (1H, d, J=9,2 Hz), 7,92 (1H, s). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C19H24N2O4: 345,81, encontrado: 345,81.
Ejemplo de referencia 18
Preparación del compuesto 218
Figure imgf000036_0002
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 17 usando aminoetoxietanol en lugar de 4-hidroxi piperidina para dar el compuesto 218 en forma de un sólido de color amarillo pálido con un rendimiento del 65 %. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 1,14 (6 H, t, J=7,0 Hz), 3,49 (12H, m), 4,60 (1H, t, J=5,6 Hz), 6,61 (1H, d, J=2,0 Hz), 6,80 (1H, dd, J = 2,4, 6 , 8 Hz), 7,68 (1H, d, J=8 , 8 Hz), 8,67 (1 H, s), 8,77 (1H, t, J=5,4 Hz) EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C18H24N2O5: 349,18, encontrado: 349,18.
Ejemplo de referencia 19
Preparación del compuesto 219
Figure imgf000037_0001
N-(2-(2-(2-(2-Azidoetoxi)etoxi)etoxi)etM)-2-(9-metiM1-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pÍ N do[3,2,1-ij]quinolin-10-il)acetamida
Se hicieron reaccionar el compuesto 211 (2,05 g, 5 mmol) y 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)-etanamina (1,42 g, 6,5 mmol) en DMF (15 ml) en un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético. Después de agitar durante 18 horas a TA, la mezcla de reacción se concentró. El residuo se disolvió en DCM (75 ml), se lavó con HCl 1 N (2 x 50 ml) y salmuera (75 ml). La fase orgánica se secó con MgSO4 y se concentró para dar un residuo de color ámbar (2,59 g). Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con MeOH del 0 % al 2 %/DCM para dar el compuesto 219 en forma de un semisólido de color naranja pálido (1,84, rendimiento del 85 %). RMN 1H (400 MHz, CDCls) 8 1,55-1,90 (2H, m), 1,97 (4H, quint., J=6,0 Hz), 2,44 (3H, s), 2,79 (2H, t, J=6,2 Hz), 2,88 (2H, t, J=6 , 6 Hz), 3,25 (4H, c, J=6,4 Hz), 3,39 (4H, quint., J=5,1 Hz), 3,53 (2H, t, J=5,2 Hz), 3,53 (2H, s), 3,55-3,80 (8 H, m), 6,72 (1H, t a), 7,01 (1H, s). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C26H35N5O6 : 514,27, encontrado: 514,27.
Ejemplo de referencia 20
Preparación del compuesto 220
Figure imgf000037_0002
8-Hidroxi-1,2,3,5,6,7-hexahidropirido[3,2,1-ij]quinolin-9-carbaldehído, (8-hidroxi-julolidin-9-carbaldehído)
Un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético se cargó con DMF (100 ml) y se enfrió en un baño de hielo a 0-5 °C. Se añadió gota a gota oxicloruro de fósforo (39,5 g, 257 mmol) y la mezcla se agitó durante 30 minutos. Se añadió gota a gota 8-hidroxi-julolidina (34 g, 180 mmol) disuelta en DMF (75 ml) y la mezcla se dejó calentar gradualmente a TA. La mezcla se calentó a 85 °C en un baño de aceite durante 1 hora. Después de enfriar a TA, la reacción se vertió en hielo (400 g) con agitación. Después de mantenerse a 4 °C durante una noche los sólidos se filtraron por succión y se lavaron con agua (4 x 50 ml). La torta de filtro se disolvió en DCM (500 ml) y la solución se lavó con bicarbonato sódico saturado (100 ml). El lavado acuoso se extrajo con DCM (50 ml). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron con MgSO4 y se concentraron para dar el compuesto 220 en forma de un sólido cristalino de color verde pálido (36,0 g, rendimiento del 92 %). p.f. 72-73 °C. RMN 1H 400 MHz, CDCla) 81,93 (4H, m, J=5,6 Hz), 2,68 (4H, t, J=6,4 Hz), 3,27 (4H, c, J=6,4 Hz), 6,84 (1H, s), 9,37 (1H, s), 11,81 (1H, s). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C13H15NO2 : 218,12, encontrado: 218,12.
Ejemplo de referencia 21
Preparación del compuesto 221
Figure imgf000038_0001
10-(4-hidroxipiperidin-1-carbonil)-2,3,6,7-tetrahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-11(5H)-ona
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 17 usando el compuesto 220 en lugar de 4-(dietilamino)-2-hidroxibenzaldehído para dar el compuesto 221 en forma de un sólido de color amarillo con un rendimiento del 82 %. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8 1,60 (2H, s a), 1,92 (2H, s a), 1,97 (4H, t, J=4,4 Hz), 2,75 (2H, t, J=5,0 Hz), 2,87 (2H, t, J=5 Hz), 3,22 (1H, m), 3,30 (4H, t, J=4,8 Hz), 3,36 (1H, m), 3,60 (1H, m), 3,95 (1H, m), 4,17 (1H, m), 6 , 8 8 (1H, s), 7,73, (1H, s). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C21H24N2O4: 369,18, encontrado: 369,18.
Ejemplo de referencia 22
Preparación del compuesto 222
Figure imgf000038_0002
7-(Dimetilamino)-3-(2-hidroxietil)-4-metil-2H-cromen-2-ona
Un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético y un condensador de reflujo se cargó con 3-dimetilaminofenol (10 g, 72,9 mmol), a-acetil-butirolactona (10,3 g, 80,2 mmol), cloruro de cinc (13,9 g, 102 mmol) y etanol absoluto (100 ml). La reacción se calentó a reflujo durante 2 horas. Después de enfriar la reacción se concentró y se vertió en agua (600 ml) más HCl 1 N (120 ml). La mezcla se extrajo con DCM (3 x 200 ml). La fase orgánica se lavó con agua (2 x 500 ml) y salmuera (500 ml), se secó con MgSO4 y se concentró para dar 9,40 gramos de un sólido de color castaño rojizo. Este sólido se recristalizó en IPA (25 ml) para dar el compuesto 222 en forma de un sólido de color castaño claro (3,96 g, rendimiento del 22 %). p.f. 141-145 °C RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 2,34 (3H, s), 2,68 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,99 (6 H, s), 3,47 (2H, c, J=6,5 Hz), 4,65 (1H, t, J=5,8 Hz), 6,51 (1H, d, J=2,4 Hz), 6,71 (1H, dd, J = 2,8, 9,2 Hz), 7,53 (1H, d, J = 8 , 8 Hz). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C14H17NO3 : 248,13, encontrado: 248,13. Anál. calc. para C14H17NO3: C, 68,00; H, 6,93; N, 5,66; Encontrado: C, 67,73, H, 6,74; N, 5,82.
Ejemplo de referencia 23
Preparación del compuesto 223
Figure imgf000039_0001
10-(2-hidroxietil)-9-metil-2,3,6,7-tetrahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-11(5H)-ona
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 21 usando 8 -hidroxi julolidina en lugar de 3-dimetil-aminofenol para dar el compuesto 223 en forma de un sólido de color castaño con un rendimiento del 34 %. p.f. 146-148 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5 1,87 (4H, c, J=6,0 Hz), 2,29 (3H, s), 2,66 (3H, t, J=7,2 Hz), 2,71 (3H, c, J=6 , 8 Hz), 3,20 (4H, c, J=6,0 Hz), 3,44 (1H, c, J=6,0 Hz), 4,62 (1H, t, J=5,6 Hz), 7,11 (1H, s). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C18H21NO3 : 300,16, encontrado: 300,16. Anál. calc. para C18H21NO3 : C, 72,22; H, 7,07; N, 4,68; Encontrado: C, 71,82; H, 7,07; N, 4,75.
Ejemplo 24
Preparación del compuesto 224
Figure imgf000039_0002
(1-(2-(7-(dimetilamino)-4-metil-2-oxo-2H-cromen-3-il)acetil)piperidin-4-il) diisopropilfosforamidita de 2-cianoetilo
Un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético se cargó con el compuesto 212 ( 6 g, 14,0 mmol, 80 % puro) y DMF (50 ml). Se añadió 1H-tetrazol (294 mg, 4,2 mmol) se añadió a la suspensión, seguido de una solución de 3-((bis(diisopropilamino)fosfino)oxi)-propanonitrilo (5,05 g, 16,8 mmol) en DMF (15 ml). Después de agitar durante 15 horas a t A, se añadió 3-((bis(diisopropilamino)fosfino)oxi)propanonitrilo adicional (2,52 g, 8,4 mmol). Después de un adicional de 15 horas, la solución se vertió en una solución saturada de bicarbonato sódico (700 ml) y se extrajo con DCM (3 x 200 ml). La fase orgánica se lavó con una solución saturada de bicarbonato sódico (2 x 400 ml) y salmuera (400 ml). El secado con MgSO4, seguido de la concentración dio 11,7 gramos de jarabe de color verde pálido. Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna en alúmina con DCM del 50 % al 100 %/éter de petróleo más TEA al 1 % para dar el compuesto 224 en forma de un sólido de color amarillo pálido (4,58 g, rendimiento del 60%). RMN 1H (400 MHz, CDCU) 51,19 (12H, m), 1,25 (6 H, m), 1,41 (3H, d, J=6,4 Hz), 1,6 1,9 (5H, m), 2,40 (3H, m), 2,64 (2H, m), 3,04 (6 H, s), 3,5-3,9 (10H, m), 4,11 (2H, m) 6,50 (1H, d, J=2,8 Hz), 6,62 (1H, dd, J = 2,4, 8 , 8 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8 , 8 Hz). RMN 31P (162 MHz, CDCI3) 5146,209, 146,397. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C28H41N4O5P: 545,29, encontrado: 545,29.
Ejemplo 25
Preparación del compuesto 225
Figure imgf000040_0001
(1 -(2-(9-metil-11 -oxo-2,3,5,6,7,11 -hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1 -ij]quinolin-10-il)acetil)piperidin-4-il) diisopropilfosforamidita de 2-cianoetilo
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 24 usando el compuesto 214 en lugar del compuesto 212 para dar el compuesto 225 en forma de un semisólido de color amarillo con un rendimiento del 38 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 51,17-1,25 (12H, m), 1,30 (2H, d, J=6 , 8 Hz), 1,16-2,0 (4H, m), 1,97 (4H, m), 2,36 (3H, d, J=2,8 Hz), 2,64 (2H, dt, J=2,4 Hz), 2,78 (2H, t, J=6,2 Hz), 2,88 (2H, m), 3,23 (4H, m), 3,4-3,9 (10H, m), 7,02 (1H, s). RMN 31P (162 MHz, CDCh) 5 146,159, 146,329. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C32H45N4O5P: 597,32, encontrado: 496,20 (M-i-Pr2N).
Ejemplo de referencia 26
Preparación del compuesto 226
Figure imgf000040_0002
Un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético se cargó con el compuesto 217 ( 8 g, 23,2 mmol) y DCM (75 ml). Se añadió 1H-tetrazol (488 mg, 7,0 mmol), seguido de una solución de 3-((bis(diisopropilamino)fosfino)oxi)propanonitrilo (8,40 g, 27,9 mmol) en DCM (25 ml). Después de agitar durante 15 horas a TA, la solución se lavó con una solución saturada de bicarbonato sódico (2 x 250 ml), se secó con MgSO4 y se concentró para dar 12,7 gramos de espuma de color dorado. Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna en alúmina con DCM del 50 % al 100 %/éter de petróleo más TEA al 1 % para dar el compuesto 226 en forma de un jarabe de color dorado (10,3 g, rendimiento del 81 %). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 51,1-1,3 (18H, m), 1,77 (2H, m), 1,92 (2H, m), 2,63 (2H, c, J=6 , 8 Hz), 3,35 (1H, m), 3,43 (4H, c, J=7,1 Hz), 3,62 (3H, m), 3,76 (2H, m), 3,83 (2H, m), 4,13 (1H, m), 6,47 (1H, d, J=2,4 Hz), 6,59 (1H, dd, J = 2,8, 5,0 Hz), 7,29 (1H, m), 7,81 (1H, s). RMN 31P (162 MHz, CDCh) 5146,208, 146,384. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C28H41N4O5P: 545,29, encontrado: 545,29.
Ejemplo de referencia 27
Preparación del compuesto 227
Figure imgf000041_0001
(1-(11-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-carbonil)piperidin-4-M)dMsopropMfosforamidita de 2-cianoetilo
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 26 usando el compuesto 221 en lugar del compuesto 217 para dar el compuesto 227 en forma de una espuma de color amarillo con un rendimiento del 40 %. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 50,97 (2H, s a), 1,14 (12H, m), 1,55 (2H, m), 1,76 (2H, m), 1,97 (4H, m), 2,73 (5H, m), 3,26 (4H, m), 3,43 (1H, m), 3,57 (1H, m), 3,71 (1H, m), 4,06 (1H, m), 7,06 (1H, s), 7,84 (1H, s). RMN 31P (162 MHz, DMSO-d6) 5145,985. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C30H41N4O5P: 569,29; encontrado: 569,29.
Ejemplo de referencia 28
Preparación del compuesto 228
Figure imgf000041_0002
(2-(9-metil-11-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-flpirido[3,2,1-ij]quinolin-10-il)etil) diisopropilfosforamidita de 2-cianoetilo
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 18 usando el compuesto 223 en lugar del compuesto 217 para dar el compuesto 228 en forma de un vidrio de color amarillo pálido con un rendimiento del 72 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 5 1,15 (12H, t, J=7,2 Hz), 1,98 (4H, m), 2,37 (3H, s), 2,60 (2H, t, J=6 , 8 Hz), 2,79 (2H, t, J=6,2 Hz), 2,88 (2H, t, J=6,4 Hz), 3,23 (4H, m), 3,56 (2H, m), 3,77 (4H, m) 7,01 (1H, s). RMN 31P (162 MHz, CDCI3) 5147,581. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C27H38N3O4P: 500,27, encontrado: 399,15 (M-/'-Pr2N).
Ejemplo 29
Síntesis en fase sólida de oligonucleótidos marcados con reactivos de síntesis de fosforamidita de cumarina Para los reactivos de cumarina estables a amoniaco (224, 225 o 228), los grupos protectores de los grupos amino exocíclico de A, C y G eran benzoil, acetilo y dimetilformamidina, respectivamente. En el caso de las cumarinas inestables a amoniaco (226 o 227) A, C y G se protegieron con fenoxiacetilo, acetilo y 4-isopropilfenoxacetilo.
Procedimiento general: Los oligonucleótidos marcados con los reactivos de síntesis de fosforamida de cumarina se hicieron a una escala de 200 nm en CPGs de 3'-glicolato (van der Laan, et. Al, Tetrahedron Lett. 38: 2252 (1997)) con monómeros de cianoetil fosforamidita en un sintetizador de ADN automatizado Biosearch 8700 o Expedite NAS 8900. Una vez completada la síntesis, se eliminó el grupo 5' DMT (con ácido dicloroacético al 3 % en diclorometano) y se lavó la columna de síntesis con acetonitrilo seco.
Para acoplar la cumarina al oligonucleótido, se disolvieron 100 mg de fosforamiditas de cumarina en acetonitrilo o DCM (1500 ul). Una porción (500 ul) de la solución se aplicó a la columna con una jeringa de 1 ml. En el otro extremo de la columna se colocó una jeringa complementaria que contenía etil tiotetrazol 0,25 M o 1H-tetrazol 0,45 M en acetonitrilo (500 ul). Las soluciones se mezclaron sobre la CPG con las jeringas y se dejaron reposar durante 10 minutos. Este proceso se repitió dos veces más con el resto de la solución de fosforamidita. Las columnas se volvieron a colocar en el sintetizador de ADN y se lavaron con acetonitrilo seguido de una solución oxidante (yodo 0,02 M en una mezcla de THF (70 %):piridina (20 %):agua (10%)). Después de 30 segundos, esta solución se lavó con acetonitrilo y el contenido de cada columna se arrojó en frascos de 2 ml.
Ejemplo 30
Corte y desprotección de oligonucleótidos en CPG
Procedimiento A (para oligonucleótidos estables a amoniaco preparados a partir de fosforamiditas de cumarina 224, 225 o
228): Los oligonucleótidos en CPG se sometieron a una desprotección estándar con amoniaco (1 ml de NH4OH concentrado, 60 °C, 1-2 horas). La CPG se separó por filtración y el filtrado se concentró al vacío para dar el oligonucleótido marcado con cumarina bruto. Las muestras se disolvieron en agua desionizada (1 ml) para el análisis de HPLC y LCMS. Las muestras se disolvieron en tampón qPCR para el análisis espectral.
Procedimiento B (para oligonucleótidos inestables a amoniaco preparados a partir de fosforamiditas de cumarina 226 o 227): Los oligonucleótidos en CPG se trataron con 1 ml de K2CO3/MeOH 50 mM durante la noche. La mezcla se acidificó con AcOH, la CPG se separó por filtración y el filtrado se concentró al vacío para dar el oligonucleótido marcado con cumarina bruto. Las muestras se disolvieron en agua desionizada (1 ml) para el análisis de HPLC y LCMS. Las muestras se disolvieron en tampón qPCR para el análisis espectral.
Ejemplo 31
Purificación de oligonucleótidos brutos
Los oligonucleótidos modificados se purificaron por HPLC en una columna preparativa RP-C18 (10 x 100 mm, 5 uM, 130 A, Xbridge) utilizando las siguientes condiciones: A) tampón trietilamina/ácido acético (50 mM); B) acetonitrilo; gradiente B al 0-95 % durante 10 min, caudal 10 ml/min, detección UV/vis a 260 y 400 nm.
Ejemplo 32
Preparación del oligonucleótido 232
Figure imgf000043_0001
Se preparó un fragmento de ADN 3’-TTCGATAAGTCTAGC-5’ marcado en el hidroxilo 5' con el compuesto 224 como se describe en el ejemplo 29. El producto 232 se escindió del soporte y se desprotegió como se describe en el Procedimiento A del ejemplo 30. MS (ESI): calc. 4973,4, encontrado: 4974,0. Abs/Em = 380/488 nm en tampón qPCR. Ejemplo 33
Preparación del oligonucleótido 233
Figure imgf000043_0002
Se preparó un fragmento de ADN 3’-TTCGATAAGTCTAGC-5’ marcado en el hidroxilo 5' con el compuesto 225 como se describe en el ejemplo 29. El producto 233 se escindió del soporte y se desprotegió como se describe en el Procedimiento A del ejemplo 30. MS (ESI): calc. 5026,5, encontrado: 5025,0. Abs/Em = 398/498 nm en tampón qPCR. Ejemplo 34
Preparación del oligonucleótido 234
Figure imgf000044_0001
Se preparó un fragmento de ADN 3’-TTCGATAAGTCTAGC-5’ marcado en el hidroxilo 5' con el compuesto 226 como se describe en el ejemplo 29. El producto 234 se escindió del soporte y se desprotegió como se describe en el Procedimiento B del ejemplo 30. m S (ESI): calc. 4974,4, encontrado: 4974,0. Abs/Em = 418/490 nm en tampón qPCR. Ejemplo 35
Preparación del oligonucleótido 235
Figure imgf000044_0002
Se preparó un fragmento de ADN 3’-TTCGATAAGTCTAGC-5’ marcado en el hidroxilo 5' con 227 como se describe en el ejemplo 29. El producto 235 se escindió del soporte y se desprotegió como se describe en el Procedimiento B del ejemplo 30. MS (ESI): calc. 4997,4, encontrado: 4998,0 Abs/Em = 435/501 nm en tampón qPCR.
Ejemplo de referencia 36
Preparación del oligonucleótido 236
Figure imgf000044_0003
Se preparó un fragmento de ADN 3-TTTTTTTTTT-5' marcado en el hidroxilo 5' con el compuesto 228 como se describe en el ejemplo 29. El producto 236 se escindió del soporte y se desprotegió como se describe en el Procedimiento A del ejemplo 30. MS (ESI): calc. 3341,1, encontrado: 3341,0.
RESULTADOS
Tabla 1
Figure imgf000045_0002
Ejemplo de referencia 37
Preparación del compuesto 237
Figure imgf000045_0001
N-(1-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-3-hidroxipropan-2-il)-2-(9-metil-11-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-il)acetamida
Se añadió el compuesto 210 (5 g, 12,2 mmol) a una solución de serinol ODMT (6,00 g, 15,2 mmol) y trietilamina (10 ml, 71,7 mmol) en d Mf (200 ml) en un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético. Después de agitar durante 72 horas a TA, la reacción se concentró al vacío para dar un residuo que se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con piridina al 2 %/EtOAc para dar el compuesto 237 (7,2 g, rendimiento del 8 6 %). Ejemplo de referencia 38
Preparación del Compuesto 238
Figure imgf000046_0001
Ácido 2-(2-(3-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-2-(2-(9-metil-11-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-il)acetamido)propoxi)-2-oxoetoxi)acético
Se secó el compuesto 237 (5 g, 7,26 mmol) disolviéndolo en piridina en un matraz de fondo redondo y se concentró al vacío. Se añadieron piridina (200 ml) y anhídrido diglicólico (5,00 g, 43,1 moles). Después de agitar durante 72 horas, se añadió anhídrido diglicólico adicional (5,00 g, 43,1 moles). La mezcla se agitó durante un adicional de 24 horas y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en DCM (200 ml), se lavó con una solución saturada de KH2PO4 (200 ml), se secó (NaSO4) y se concentró al vacío. El residuo se purificó por cromatografía en columna en alúmina con MeOH al 5-30 %/DCM que contenía TEA al 2 % y piridina al 2 % para dar el compuesto 238 (6,00 g, rendimiento del 91 % ) en forma de la sal de TEA.
Ejemplo de referencia 39
Preparación del Compuesto 239
Figure imgf000046_0002
2-(2-oxo-2-((3-CPG-propil)amino)etoxi)acetato de 3-(bis(4-metoxifeml)(feml)metoxi)-2-(2-(9-metiM1-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-il)acetamido)propilo
Se disolvió el compuesto 238 (3 g, 3,31 mmol) en DMF (75 ml). Se añadieron BOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfanio, 3 g, 6,78 mmol), piridina (10 ml) y aminopropil CPG (10 g, 500 A, 130 ^mol/g carga). Después de la mezcla sat. a TA durante 18 horas, se enjuagó el CPG con MeCN (3 x 100 ml). Se añadieron N-metilimidazol (239 M en THF, 50 ml) y anhídrido acético (50 ml). Después de reposar a temperatura ambiente durante 10 min, la CPG se enjuagó con MeCN (2 x 100 ml), MeOH (2 x 100 ml) y DCM (2 x 100 ml) y se secó al vacío para el CPG derivatizado final 239. La destritilación y la cuantificación colorométrica de una muestra indicaron una carga de 35 ^mol/g de CPG.
Ejemplo 40
Preparación del Compuesto 240
Figure imgf000047_0001
(1-(2-(9-Etil-4,6,8,8-tetrametil-2-oxo-8,9-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-3-il)acetil)piperidin-4-M)dMsopropMfosforamidita de 2-cianoetilo
Un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético se cargó con el compuesto 216 (2,12 g, 5,0 mmol) y DCM (30 ml). Se añadió 1H-tetrazol (195 mg, 1,5 mmol) a la suspensión, seguido de una solución de 3-((bis(diisopropilamino)fosfino)oxi)-propanonitrilo (3,32 g, 11 mmol) en DCM (5 ml). Después de agitar durante 3,5 horas a TA, se añadió 3-((bis(diisopropilamino)fosfino)oxi)propanonitrilo adicional (2,00 g, 6 , 6 mmol). Después de un adicional de 15 horas, la solución se vertió en una solución saturada de bicarbonato sódico (250 ml) y se extrajo con DCM (3 x 100 ml). La fase orgánica se lavó con una solución saturada de bicarbonato sódico (2 x 200 ml) y salmuera (300 ml). El secado con Na2SO4, seguido de la concentración dio 6,20 gramos de jarabe de color amarillo pálido. Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna en alúmina con DCM del 50 % al 100 %/éter de petróleo más TEA al 1 % para dar el compuesto 240 en forma de un jarabe de color amarillo pálido (1,74 g, rendimiento del 56 %). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C34H49N4O5P: 624,34, encontrado: 523,22 (M-i-Pr2N).
Ejemplo de referencia 41
Preparación del Compuesto 241
Figure imgf000048_0001
1-Etil-7-hidroxi-2,2,4-trimetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-carbaldehído
Se disolvió 1-etil-2,2,4-trimetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-7-ol (21,9 g, 100mmol) en anhídrido acético (70 ml) y se calentó a 100 °C en una atmósfera de N2 durante 2 horas. Esta solución se concentró. Se añadieron agua (150 ml) y DCM (100 ml) al residuo y la mezcla se agitó durante 30 minutos. Las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo adicionalmente con DCM (2 x 150 ml). Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con agua (2 x 500 ml), se lavó con salmuera (500 ml), se secaron (MgSO4) y se concentraron para dar un jarabe. Se añadió POCl3 lentamente a DMF (60 ml), se enfrió en un baño de hielo y la mezcla se agitó durante 30 min. El jarabe anterior se disolvió en DMF (25 ml) y se añadió durante 10 minutos a la mezcla de POCl3/DMF. El baño de hielo se retiró y la reacción se agitó a TA durante 2 horas y después se calentó a 100 °C durante 1 hora. La reacción se enfrió y se vertió en hielo (250 g) con agitación. La mezcla se extrajo con DCM (2 x 250 ml). Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con agua (500 ml), se lavaron con salmuera (500 ml), se secaron (MgSO4) y se concentraron para dar un jarabe de color verde oscuro (28,2 g). Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con MeOH del 0 al 1 %/DCM para dar el compuesto 241 en forma de un jarabe de color ámbar (22,7 g, rendimiento del 92 %). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C15H21NO2: 247,16, encontrado: 247,16.
Ejemplo de referencia 42
Preparación del Compuesto 242
Figure imgf000048_0002
9-Etil-3-(4-hidroxipiperidin-1-carbonil)-6,8,8-trimetil-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-2-ona
Se añadieron el compuesto 241 (6,18 g, 25 mmol), malonato de dietilo (4,81 g, 30 mmol), 4-hidroxipiperidina (9,10 g, 90 mmol), piperidina (4 gotas) y ácido acético (4 gotas) a un vial equipado con una barra magnética. La reacción se calentó a 100 °C durante 3,5 horas. Después de enfriar, el jarabe se vertió en agua (300 ml) y se extrajo con DCM (3 x 150 ml). La fase orgánica se lavó con agua (2 x 200 ml), ácido cítrico acuoso 1 M (3 x 200 ml) y salmuera (350 ml), después se secó con MgSO4 y se concentró para dar 8,14 g de una espuma de color ámbar oscuro. Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con MeOH del 0 % al 5 %/DCM para dar el compuesto 242 en forma de una espuma de color dorada (6,57 g, rendimiento del 6 6 %). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C23H30N2O4: 398,22, encontrado: 398,22.
Ejemplo de referencia 43
Preparación del Compuesto 243
Figure imgf000049_0001
(1-(9-Etil-6,8,8-trimetil-2-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-3-carbonil)piperidin-4-M)dMsopropMfosforamidito de 2-cianoetilo
Un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético se cargó con el compuesto 242 (5,98 g, 15 mmol) y MeCN (100 ml). Se añadió 1H-tetrazol (315 mg, 4,5 mmol), seguido de una solución de 3-((bis(diisopropilamino)fosfino)oxi)propanonitrilo (5,43 g, 18 mmol) en MeCN (10 ml). Después de agitar durante 15 horas a TA, la solución se vertió en una solución saturada de bicarbonato sódico (100 ml) y se extrajo con DCM (2 x 100 ml). La fase orgánica se lavó con una solución saturada de bicarbonato sódico (200 ml) y salmuera (200 ml). El secado con Na2SO4 , seguido de la concentración dio 8 , 6 6 gramos de espuma de color dorado. Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna en alúmina con DCM del 50 % al 100 %/éter de petróleo más TEA al 1 % para dar el compuesto 243 en forma de una espuma pegajosa de color amarillo (6,90 g, rendimiento del 77 %). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C32H47N4O5P: 598,33, encontrado: 598,33.
Ejemplo 44
Preparación del Compuesto 244
Figure imgf000049_0002
2-(1,1,7,7,9-Pentametil-11 -oxo-2,3,5,6,7,11 -hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1 -ij]quinolin-10-il)acetato de metilo
Un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético se cargó con 3-1,1,7,7-tetrametil-1,2,3,5,6,7-hexahidropirido[3,2,1-ij]quinolin-8-ol (24,5 g, 100 mmol), 2-acetilsuccinato de dimetilo (37,6 g, 200 mmol) y cloruro de cinc (38,2 g, 280 mmol). La mezcla se calentó a 120 °C durante 48 horas y se enfrió. La masa de reacción se repartió entre DCM (500 ml) y agua (1 l) más HCl concentrado (30 ml). Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo con DCM (3 x 400 ml). Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron con agua (1 l) más HCl concentrado (30 ml), con agua corriente (1 l) y con salmuera (1 l). La fase orgánica se secó con MgSO4 y se concentró para dar 36,0 gramos de un jarabe de color verde oscuro. Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con MeOH del 0 al 2 %/DCM para dar un jarabe de color pardo oscuro que se disolvió en éter (400 ml), se lavó con KOH 0,5 N (2 x 200 ml, 100 ml), se lavó con salmuera (400 ml), se secó (MgSO4) y se concentró para dar una espuma de color pardo oscuro (19,4 g). La recristalización en IPA (30 ml) dio el compuesto 244 en forma de una espuma pegajosa de color amarillo (9,33 g, rendimiento del 24%). EM (Es +) m/z: [M H]+ calc. para C23H29NO4: 383,21, encontrado: 383,21.
Ejemplo 45
Preparación del Compuesto 245
Figure imgf000050_0001
Ácido 2-(1,1,7,7,9-pentametil-11-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-il)acético
La elución adicional de la purificación en columna de gel de sílice del ejemplo 44 anterior con MeOH al 10 %/DCM más AcOH al 1 % dio el compuesto 245 (5,00 g, rendimiento del 14 %) en forma de un sólido de color verde oscuro. La acidificación de los extractos básicos del Ejemplo 44 anterior produjo 3,20 gramos adicionales del compuesto 245 (3,20 g, rendimiento del 9 %). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C22H27n O4: 369,19, encontrado: 369,19 Ejemplo 46
Preparación del Compuesto 246
Figure imgf000050_0002
2-(1,1,7,7,9-Pentametil-11-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-il)acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1 -ilo
El compuesto 245 (8,10 g, 21,9 mmol) se hizo reaccionar con carbonato de N,N'-disuccinimidilo (6,74 g, 26,3 mmol) y DIEA (3,26 g, 25,2 mmol) en DMF (100 ml). Después de 15 horas de agitación a TA, la mezcla se vertió en HCl 40 mM frío (1,3 l). La filtración por succión dio un sólido de color amarillo que se lavó con agua (2 x 50 ml) y se secó para dar el compuesto 246 en forma de un sólido de color ámbar (8,70 g, rendimiento del 85 %).
Ejemplo 47
Preparación del Compuesto 247
Figure imgf000051_0001
10-(2-(4-Hidroxipiperidin-1-il)-2-oxoetil)-1,1,7,7,9-pentametil-2,3,6,7-tetrahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-11(5H)-ona
Se disolvieron el compuesto 246 (7,00 g, 15 mmol) y 4-hidroxi-piperidina (1,82 g, 18 mmol) en DMF (40 ml) en un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético. Después de agitar durante 2,5 horas a TA, el matraz se mantuvo a -20 °C durante una noche. El precipitado se retiró por filtración y el filtrado se vertió en agua (800 ml). La mezcla se extrajo con DCM (4 x 100 ml), se lavó con agua (400 ml), se lavó con salmuera (400 ml), se secó (MgSO4) y se concentró para dar una espuma de color negro (6,56 g). Este material en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con MeOH del 0 al 5 %/DCM para dar el compuesto 247 en forma de una espuma de color pardo oscuro (3,94 g, rendimiento del 58 %). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C27H36N2O4 : 452,27, encontrado: 452,27.
Ejemplo 48
Preparación del Compuesto 248
Figure imgf000052_0001
(1-(2-(1,1,7,7,9-Pentametil-11-oxo-2,3,5,6,7,11-hexahidro-1H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]qumolm-10-il)acetil)piperidin-4-il) d iisopropilfosforam idita de 2-cianoetilo
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 40 con el compuesto 247 (3,50 g, 7,73 mmol) en lugar del compuesto 216 y MeCN en lugar de DCM dio el compuesto 248 (4,75 g, rendimiento del 94 %) en forma de un jarabe de color ámbar. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C36H53N4O5P: 652,38, encontrado: 551,26 (M-/-Pr2N).
Ejemplo 49
Preparación del Compuesto 249
Figure imgf000052_0002
2-(4,6,8,8,9-Pentametil-2-oxo-8,9-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-3-il)acetato de metilo
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 6 usando 1,2,2,4-tetrametil-1,2-dihidroquinolin-7-ol (43,2 g, 228 mmol) en lugar de bromhidrato de 1-etil-2,2,4-trimetil-1,2-dihidroquinolin-7-ol para dar el compuesto 249 en forma de un sólido de color amarillo (26,2 g, rendimiento del 34 %). EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C20H23NO4 : 341,16, encontrado: 341,16. Ejemplo 50
Preparación del Compuesto 250
Figure imgf000053_0001
2-(4,6,8,8,9-Pentametil-2-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-3-il)acetato de metilo
Se disolvió el compuesto 249 (8,55 g, 25 mmol) en DCM (200 ml). Se añadieron trietilsilano (29,1 g, 250 mmol) y ácido trifluoracético (57,0 g, 500 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo durante 13 horas. La mezcla se enfrió y se lavó con NaOH 1 N (500 ml), agua (500 ml) y salmuera (500 ml). El secado (MgSO4) y la concentración dio el compuesto 250 (8,59 g, rendimiento del 100 %) en forma de un sólido de color castaño pálido. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C20H25NO4: 343,18, encontrado: 343,18
Ejemplo 51
Preparación del Compuesto 251
Figure imgf000053_0002
Ácido 2-(4,6,8,8,9-pentametil-2-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-3-il)acético
Se siguió el procedimiento B del Ejemplo 3 usando el compuesto 250 (6,87 g, 20 mmol) en lugar del compuesto 202 para dar el compuesto 251 (5,09 g, rendimiento del 77 %) en forma de un sólido de color amarillo. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C19H23NO4: 329,16, encontrado: 329,16.
Ejemplo 52
Preparación del Compuesto 252
Figure imgf000054_0001
2-(4,6,8,8,9-Pentametil-2-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano[3,2-g] quinolin-3-il)acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo
Se siguió el procedimiento del Ejemplo 46 usando el compuesto 251 (3,95 g, 12 mmol) en lugar del compuesto 245 para dar el compuesto 252 (4,56 g, rendimiento del 89 %) en forma de un sólido de color amarillo.
Ejemplo 53
Preparación del Compuesto 253
Figure imgf000054_0002
3-(2-(4-Hidroxipiperidin-1-il)-2-oxoetil)-4,6,8,8,9-pentametil-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-2-ona Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 16 con el compuesto 252 (4,00 g, 9,38 mmol) en lugar del compuesto 211 dio el compuesto 253 (3,90 g, rendimiento del 100 %) en forma de un sólido de color castaño. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C24H32N2O4 : 412,24, encontrado: 412,24.
Ejemplo 54
Preparación del Compuesto 254
Figure imgf000055_0001
(1-(2-(4,6,8,8,9-Pentametil-2-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-3-il)acetil)piperidin-4-M)dMsopropMfosforamidita de 2-cianoetilo
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 40 con el compuesto 253 (3,50 g, 8,48 mmol) en lugar del compuesto 216 y MeCN en lugar de DCM dio el compuesto 254 (3,90 g, rendimiento del 75 %) en forma de una espuma de color dorado. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C33H49N4O5P: 612,34, encontrado: 612,34.
Ejemplo de referencia 55
Preparación del Compuesto 255
Figure imgf000055_0002
1-Etil-7-hidroxi-2,2,4-trimetil-1,2-dihidroquinolin-6-carbaldehído
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 41 con el compuesto 1-etil-2,2,4-trimetil-1,2-dihidroquinolin-7-ol (21,7 g, 100 mmol) en lugar de 1-etil-2,2,4-trimetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-7-ol dio el compuesto 255 (12,1 g, rendimiento del 50 %) en forma de un jarabe de color negro. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C15H19NO2 : 245,14, encontrado: 245,14. Ejemplo de referencia 56
Preparación del Compuesto 256
Figure imgf000056_0001
9-Etil-3-(4-hidroxipiperidin-1-carbonil)-6,8,8-trimetil-8,9-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-2-ona
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 42 con el compuesto 255 (8,52 g, 29,7 mmol) en lugar del compuesto 241 dio el compuesto 256 (9,52 g, rendimiento del 51 %) en forma de una espuma de color ámbar oscura. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C23H28N2O4: 396,20, encontrado: 396,20.
Ejemplo de referencia 57
Preparación del Compuesto 257
Figure imgf000056_0002
(1-(9-Etil-6,8,8-trimetil-2-oxo-8,9-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-3-carbonil)piperidin-4-il)diisopropilfosforamidita de 2-cianoetilo
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 43 con el compuesto 256 (2,97, 7,5 mmol) en lugar del compuesto 242 dio el compuesto 257 (3,62 g, rendimiento del 80 %) en forma de una espuma naranja. EM (ES+) m/z: [M H]+ calc. para C32H45N4O5P: 596,31, encontrado: 596,31.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de estructura 15, 16 o 17:
Figure imgf000057_0001
Donde
m es 1, 2 o 3;
n es 1 o 2 ;
o es 1 o 2 ;
p es 0, 1, 2 o 3;
R2 se selecciona entre un grupo que consiste en -H o -CH3 ;
X es -OH, -NH2 , -SH, -OR11, -NHR12, -NR13R14, -OC(O)R15, -NHC(O)R16, -SC(O)R17, -C(O)OH, -C(O)OR18, -C(O)NHR19, -C(O)NR20R21, -N3;
R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20 y R21 se seleccionan independientemente entre alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido, -CH2CH(OH)CH2(OH), -CH(CH2OH)2, -CH2CCH, -(CH2CH2O)a-CH2CH2OH donde a es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, -P(NR22R23)OCH2CH2-EWG, -P(O)(O-)-ONgonudeótido, -(CH2)bCC-Nucleósido, -(CH2)bCC-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNH-Nucleósido, -(c^)bN H -[Nucleósido Trifosfato], -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-Nucleósido, -(CH2)bNHC(O)(CH2)b-[Nucleósido Trifosfato], donde b es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
EWG es un grupo aceptor de electrones;
R22 y R23 se seleccionan independientemente entre -CH3 ,
Figure imgf000058_0001
R22 y heterociclo; y
en el compuesto de estructura 15, Rx y Ry son independientemente H o CH3 ;
en el compuesto de estructura 16, R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquilo (C-i-Ca), alquilo (C1-Ca) sustituido o R7 y R8 juntos forman un heterociclo de cinco, seis o siete miembros; y
en el compuesto de estructura 17, R24 es alquilo (C1-C8) o alquilo (C1-C8) sustituido;
R25 es alquilo (C1-C8), alquilo (C1-C8) sustituido o CH2SO3H; y
la línea discontinua representa un doble enlace opcional.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es de estructura 15.
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es de estructura 16.
4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es de estructura 17.
5. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde X es -OH, -OR11 u -OC(O)R15
6. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde, en el compuesto de estructura
15 o 16, X es -NH2, -NHR12, -NR13R14, -NHC(O)R16.
7. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 5 y 6, en donde, en el compuesto de estructura 16, R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H o alquilo (C1-C8).
8. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 7, en donde en el compuesto de estructura 17, R24 y R25 son alquilo (C1-C8).
9. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el grupo atractor de electrones es -CN.
ES16740489T 2015-01-20 2016-01-19 Compuestos a base de cumarina y métodos relacionados Active ES2931081T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562125431P 2015-01-20 2015-01-20
PCT/US2016/000010 WO2016118305A1 (en) 2015-01-20 2016-01-19 Coumarin-based compounds and related methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2931081T3 true ES2931081T3 (es) 2022-12-23

Family

ID=56417579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16740489T Active ES2931081T3 (es) 2015-01-20 2016-01-19 Compuestos a base de cumarina y métodos relacionados

Country Status (15)

Country Link
US (1) US11034677B2 (es)
EP (1) EP3247710B1 (es)
JP (2) JP6814139B2 (es)
CN (1) CN107207480B (es)
AU (1) AU2016209680B2 (es)
BR (1) BR112017013027A2 (es)
CA (1) CA2970353C (es)
CL (1) CL2017001433A1 (es)
DK (1) DK3247710T3 (es)
ES (1) ES2931081T3 (es)
MY (1) MY186450A (es)
PL (1) PL3247710T3 (es)
SG (1) SG11201705411SA (es)
WO (1) WO2016118305A1 (es)
ZA (1) ZA201704200B (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108148574B (zh) * 2018-02-06 2020-06-16 中国刑事警察学院 可视化检验射击残留物的荧光探针及其制备方法和用途
US11834714B2 (en) 2021-12-20 2023-12-05 Enumerix, Inc. Detection and digital quantitation of multiple targets

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994002644A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Aprogenex, Inc. In situ detection of nucleic acids using 3sr amplification
CN1084219A (zh) * 1992-07-17 1994-03-23 阿普罗精内斯有限公司 核酸的检测
US6495676B1 (en) 1993-04-13 2002-12-17 Naxcor Nucleic acid sequence detection employing probes comprising non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents
WO1996028438A1 (en) 1995-03-09 1996-09-19 Naxcor Non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-cross-linking agents
US6727356B1 (en) * 1999-12-08 2004-04-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
DE10329860A1 (de) 2003-07-02 2005-01-20 Atto-Tec Gmbh Sulfonamidderivate polycyclischer Farbstoffe für analytische Anwendungen
US7705150B2 (en) * 2004-02-04 2010-04-27 Biosearch Technologies, Inc. Cyanine dyes
JP4713514B2 (ja) 2006-02-20 2011-06-29 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 改善された標識試薬
US20090156421A1 (en) * 2007-11-06 2009-06-18 Wyeth Assays and methods for evaluating multimeric complexes
US20090197254A1 (en) * 2007-12-14 2009-08-06 Ming-Chou Lee Variant scorpion primers for nucleic acid amplification and detection
US20100029017A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-04 Becton, Dickinson And Company Mono-chlorinated hydroxycoumarin conjugates
US20120016128A1 (en) * 2010-07-16 2012-01-19 Zhenjun Diwu Rhodamine lactone phosphoramidites and polymers
FR3026698B1 (fr) * 2014-10-01 2018-05-04 U-Shin France Antivol pour colonne de direction de vehicule automobile

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018505141A (ja) 2018-02-22
EP3247710A1 (en) 2017-11-29
PL3247710T3 (pl) 2023-03-06
AU2016209680A1 (en) 2017-06-08
CA2970353A1 (en) 2016-07-28
WO2016118305A1 (en) 2016-07-28
CA2970353C (en) 2021-07-06
BR112017013027A2 (pt) 2018-01-09
CL2017001433A1 (es) 2017-12-15
JP6814139B2 (ja) 2021-01-13
SG11201705411SA (en) 2017-08-30
US20170015652A1 (en) 2017-01-19
JP2021020903A (ja) 2021-02-18
AU2016209680B2 (en) 2020-09-03
EP3247710B1 (en) 2022-10-19
MY186450A (en) 2021-07-22
DK3247710T3 (en) 2022-11-14
EP3247710A4 (en) 2018-10-10
CN107207480A (zh) 2017-09-26
CN107207480B (zh) 2021-06-25
US11034677B2 (en) 2021-06-15
ZA201704200B (en) 2021-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2511991T5 (es) Inhibidores de fluorescencia oscuros para transferencia de energía donador-aceptor
US8436153B2 (en) Cyanine dyes
US9228225B2 (en) Xanthene dyes
JP2021020903A (ja) クマリン系化合物及び関連する方法
DK1740100T3 (en) xanthene