JP4713514B2 - 改善された標識試薬 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸の検出、分析および定量化のために、標識オリゴヌクレオチドプローブの両末端ならびに内部の基礎単位として置換されたインドールヌクレオシドを再び述べる。該置換基にはリンカーおよび検出可能な基、またはリンカーおよび合成後標識のための反応性基が含まれる。これらの修飾されたヌクレオシドにより広い応用領域への参入が認められる。これら新規の置換されたインドールヌクレオシドは、例えば最適なハイブリダイゼーションプローブ、Taqmanプローブまたは分子ビーコンプローブの簡便な調製のための標識試薬として用いられ得る。
植物相および動物相由来の、解読されてマッピングされたゲノム配列の数の安定した増加は、DNA技術が現在どれほど重要であるかということを印象的に示す。しかしDNAの配列決定だけが重要ではない。ゲノミクスおよびプロテオミクスの分野の知識の増大と共に、例えば変異のような細胞または生物体の将来に特異的な効果の影響が科学者にはっきり見えるようになる。一方で、核酸はしばしば非常に低い濃度で存在し、もう一方でしばしば、例えば細胞溶解後に、他の多くの固形物および/または溶解された物質の存在下で発見されるので、核酸を単離または測定することは困難である。
を有し、
AおよびBは、互いから独立であり、RおよびXから独立であり、ここで、
AおよびBは、
(1)水素、
(2)保護基、
(3)リンカーを有する固相、
(4)ホスホロアミダイト、
(5)H−ホスホネート、
(6)三リン酸、
(7)リン酸、および
(8)ヌクレオチド残基の鎖
からなる群から選択され、
ただしAは三リン酸であり得るが、Bは三リン酸ではあり得ず、
ただし、AまたはBの1つがホスホロアミダイトまたはH−ホスホネートである場合、AおよびBのもう1つは保護基であり、RはOHではない、
ただし、AおよびBの1つのみがリンカーを有する固相であり、ここで、
R=H、OH、O−アルキル、O−アルケニル、O−アルキニル、O−保護基、またはFであり、
Xは、反応性基、または保護反応性基、または反応性基を有するリンカー、または保護反応性基を有するリンカー、またはシグナル実体、または保護シグナル実体、またはシグナル実体を有するリンカー、または保護シグナル実体を有するリンカーのいずれかである、ことによって特徴付けられる、化合物。
b)該反応性基にシグナル実体を結合させる工程、
を包含することによって特徴付けられる、前記[6]〜[9]いずれか記載のオリゴヌクレオチドを合成する方法。
このように、本発明は、核酸プローブ標識に関する、新しい、検出可能な化合物に関する。該化合物は、核酸塩基として修飾インドールを有するヌクレオシドを包含する。このヌクレオシドは改善された合成特性および検出特性を示す。
(式中
AおよびBは互いから独立であり、RおよびXから独立であり、
ここで、
AおよびBは、
(1)水素、
(2)保護基、
(3)リンカーを有する固相、
(4)ホスホロアミダイト、
(5)H-ホスホネート(phosphonate)、
(6)三リン酸、
(7)リン酸、および
(8)ヌクレオチド残基の鎖、
よりなる群より選択され、
ただしAは三リン酸であり得るが、Bは三リン酸ではあり得ず、
ただしAまたはBの一つがホスホロアミダイトまたはH-ホスホネートである場合、AおよびBの他方が保護基であり、RはOHではなく、
ただしAおよびBの一つのみがリンカーを有する固相であり、
ここで、
R = H、OH、O-アルキル、O-アルケニル、O-アルキニル、O-保護基、またはFであり、
Xが反応性基もしくは保護された反応性基、または反応性基を有するリンカーもしくは保護された反応性基を有するリンカー、またはシグナル実体もしくは保護されたシグナル実体、またはシグナル実体を有するリンカーもしくは保護されたシグナル実体を有するリンカーのいずれかである)
という特徴を有する化合物を包含する。
a)オリゴヌクレオチド合成の際に、本発明に従う標識化合物を取り込む工程であって、前記標識化合物が、シグナル実体の反応性基への連結のための反応性基を含有する工程、および
b)シグナル実体と前記反応性基の連結工程
を含む、式Iの化合物を含むオリゴヌクレオチドの合成方法である。
本発明は、核酸プローブのための新規の検出可能な化合物に関する。該化合物は、核酸塩基として、修飾された3-置換メタンスルホニルアミノインドールを有するヌクレオシドを包含する。このヌクレオシドは、改善された合成特性および検出特性を示す。
(式中、
AおよびBはお互いに独立して、RおよびXから独立し、
ここで、
AおよびBは、
(1)水素、
(2)保護基、
(3)リンカーを有する固相、
(4)ホスホロアミダイト、
(5)H-ホスホネート、
(6)三リン酸、
(7)リン酸、および
(8)ヌクレオチド残基の鎖、
よりなる群より選択され、
ただしAは三リン酸であり得るが、Bは三リン酸ではあり得ず、
ただしAまたはBの一つがホスホロアミダイトまたはH-ホスホネートである場合、AおよびBの他方が保護基であり、RはOHではない、
ただしAおよびBの一つのみがリンカーを有する固相であり、
ここで、
R = H、OH、O-アルキル、O-アルケニル、O-アルキニル、O-保護基、またはFであり、
Xが反応性基もしくは保護された反応性基、または反応性基を有するリンカーもしくは保護された反応性基を有するリンカー、またはシグナル実体もしくは保護されたシグナル実体、またはシグナル実体を有するリンカーもしくは保護されたシグナル実体を有するリンカーのいずれかである)。
a)標識基存在下でのオリゴヌクレオチドの合成
b)合成後修飾/標識のための反応性基存在下でのオリゴヌクレオチドの合成
が可能である。
(i)第一の工程において、配列特異的蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブがPCR混合物に添加される、
(ii)第二の工程は、PCRによるポリヌクレオチドの増幅を含む、および
(iii)第三の工程において、単鎖の標的ポリヌクレオチドとプローブとの間で形成されたヘテロ二重鎖はゆっくりと加熱され、蛍光の変化が、融解曲線の記録を生じる温度に依存して記録される。
配列番号1 末端標識されたプローブ
配列番号2 二重標識されたプローブ
配列番号3 実施例3の順方向プライマー
配列番号4 実施例3の逆方向プライマー
実施例1:a)反応性基を保持するオリゴヌクレオチド合成のためのホスホロアミダイトの合成
b)反応性標識の合成
c)オリゴヌクレオチド合成のための標識されたホスホロアミダイト
の合成
実施例2:オリゴヌクレオチド合成
実施例3:RT−PCRによるウイルス標的DNAの検出
他に述べない限り、全ての薬品は試薬等級であり、Sigma-Aldrichから購入した。薬品を、製造業者または供給者から受け取ったままで使用した。
インドールヌクレオシドの調製
a)3−ヨード−5−ニトロ−インドール
25.0 g (154.2 mmol) 5-ニトロインドール(Aldrich N1,760-2)および21.7 g (386.7mmol)水酸化カリウムを270 ml DMFに溶解した。この溶液に250 ml DMFに溶解した39.5 g (155.6 mmol)ヨウ素を1時間の間滴下した。その後、得られた混合物を室温で1時間攪拌した。その後、反応混合物を2.5lのスラッジ(sludge)に注いだ。形成された沈殿を濾過によって回収し、水で2回洗浄した。得られた残渣を真空下で乾燥した(収量:43.0g)。
45.0 g (335.5 mmol)の2-デオキシ-D-リボース(Fluka 31170)を540mlの無水メタノールに溶解した。この溶液に90mlメタノールおよび1.53ml(21.5 mmol)塩化アセチル(Aldrich 40,279-6)の混合物を室温で滴下した。得られた混合物を室温でさらに15分間攪拌した。18.0 g (214.3 mmol)の炭酸水素ナトリウムの添加の後、得られた懸濁物を15分間攪拌した。懸濁物の濾過の後、溶媒を蒸留によって除去した。油状茶色残渣に75mlの無水ピリジンを添加し、その後溶媒をロータリーエバポレータで真空中で除去した。この手順を3回繰り返した。残った残渣を270mlの無水ピリジンに溶解し0℃まで冷却した。この温度で99 ml (748.6 mmol)の塩化p−トルオイル(Aldrich 10,663-1)を90分間にわたって滴下した。その後、反応混合物を室温でさらに12時間攪拌した。懸濁物を1.5lのスラッジに注ぎ、水層を各々600mlのジクロロメタンで3回抽出した。合わせた有機層を各々600mlの水で2回、各々600mlの2M塩酸で3回、各々600mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で2回、および各々600mlの水で2回洗浄した。その後、分離された有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリーエバポレータで真空中で乾燥状態まで蒸発させた。油状残渣を180mlの氷酢酸に溶解し、228mlの氷酢酸、45.9ml(646mmol)の塩化アセチルおよび11.3mlの水の280mlの混合物を攪拌しながら氷上で冷却しながら添加した。パルプ(pulp)を濾過によって除去し、各々200mlの氷冷ジエチルエーテルで2回洗浄した。残渣を真空下において水酸化カリウム上で乾燥した。(収量:96.3g)。
15mlアセトニトリル中1.0 g (3.5 mmol)の3-ヨード-5-ニトロインドールの懸濁物に0.16 g (6.7 mmol)の水素化ナトリウム(Aldrich 223441-50G)を添加した。攪拌を継続し、懸濁物は赤に変わった。15分後、2.02 g (5.2 mmol)の5-クロロ-2-(4-メチル-ベンゾイルオキシメチル)-3-(4-メチル-ベンゾイルオキシ)-テトラヒドロ-フランを少しずつ添加し、攪拌を室温でさらに60分継続した。沈殿を濾過によって除去し、アセトニトリルで1回洗浄した。合わせた黄色の濾過物を生成物が沈殿するまで濃縮した。生成物の完全な沈殿のために50mlのエタノールを添加した。黄色の沈殿を濾過によって除去し、エタノールで洗浄した。残油を真空下において五酸化リンおよび水酸化カリウム上で乾燥した(収量:1.9g)。
600mlエタノール中12 g (18.7 mmol)のインドール誘導体5-(3-ヨード-5-ニトロ-インドール-1-イル)-2-(4-メチル-ベンゾイルオキシメチル)-3-(4-メチル-ベンゾイルオキシ)-テトラヒドロ-フランの懸濁物に4.2 g (37.5 mmol)のカリウムtert−ブチレートを添加した。懸濁物を室温で12時間攪拌した。得られた黄色の溶液を、100 % ジクロロメタンで開始し85 % ジクロロメタン:15 % メタノールまでのグラジエントを用いてシリカゲルカラム(Silica gel 60, Merck, 230 x 100 mm)上でクロマトグラフした(収量:6.6g)。
275ml無水メタノール中15 g (272.3 mmol)のプロパルギルアミンに36.6g(285.9mmol)のトリフルオロ酢酸メチルを冷却しながら添加した。得られた反応混合物を室温でさらに4時間攪拌した。その後、溶媒を減圧下で蒸留により除去した。残渣を300mlのトリクロロメタンに溶解し、4回、各々300mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で2回および各々300mlの水で2回抽出した。分離された有機層を、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸留によって除去した(収量:23.3g)。
19.8 g (48.99 mmol)の2-ヒドロキシメチル-5-(3-ヨード-5-ニトロ-インドール-1-イル)−テトラヒドロ−フラン−3−オールをアルゴン雰囲気下前もって加熱したフラスコに配置し、200mlの無水テトラヒドロフランに溶解した。27.2 ml (196.2 mmol)のトリエチルアミン(Merck, 8.08352.1000)、1.87 g (9.82 mmol)のヨウ化銅(I) (Merck, 8.18311.0100)および5.66 g (4.89 mmol)のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0) (Merck, 8.14761.005)を添加した。室温で5分後、19.8 mlの2,2,2-トリフルオロ-N-プロピル-2-イニル-アセトアミドを添加し、それをさらに45分間攪拌した。溶媒を蒸留によって除去した。残渣を100 %ジクロロメタンで開始し5 %メタノールを有する95 %ジクロロメタンまでのグラジエントを用いたシリカゲルカラム(Silica gel 60, Merck, 400 x 70 mm)でクロマトグラフした(収量:17.06g)。
4.0 g (9.3 mmol)の2,2,2-トリフルオロ-N-{3-[1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-5-ニトロ-1H-インドール-3-イル]-プロパ-2-イニル}-アセトアミドおよび650mg 5% (w/w)のパラジウム炭(Fluka No: 75992)を100mlの無水エタノール中に懸濁し、アルゴン雰囲気下フラスコ中に配置した。アルゴンを水素と置換した(Whatman hydrogen generator)。水素化をTLC(Silica Gel Merck F60、展開溶媒: トルエン/酢酸エチルエステル/メタノール 4:1:1 (v/v/v))によってモニターし、開始物質がもはや検出されなくなった時に停止した。触媒を濾過によって除去し、溶媒を真空中でロータリーエバポレータで乾燥状態まで蒸発した。生成物をさらなる精製をせずに使用した(収量:3.7g)。
3.7 g (9.2 mmol)のN-{3-[5-アミノ-1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-1H-インドール-3-イル]-プロピル}-2,2,2-トリフルオロ-アセトアミドを30mlの無水ピリジン中に溶解した。0.72 ml (9.2 mmol)のメチルスルホニルクロリド(methylsulfonylchloride)を添加した。反応をTLC(Silica Gel Merck F60、トルエン/酢酸エチルエステル/メタノール 3:2:1 (v/v/v))によってモニターした。攪拌しながら20分後、溶媒を真空下ロータリーエバポレータで除去した。残渣を酢酸エチル中に溶解し、各々100mlのクエン酸の10%(w/v)水性溶液で3回洗浄し、その後、100mlブライン(飽和塩化ナトリウム溶液)で1回洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。さらなる精製のために、残渣を移動相としてトルエン/酢酸エチルエステル/メタノール 3:2:1 (v/v/v)を用いるシリカゲルカラム(Silica gel 60, Merck, 185 x 85 mm)でクロマトグラフした。生成物を含む画分を合わせ、溶媒を真空中でロータリーエバポレータで除去した(収量:720mg)。
0.7 g (1.45 mmol)の2,2,2-トリフルオロ-N-{3-[1-(4-ヒドロキシ-5-ヒドロキシメチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル)-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル]-プロピル}-アセトアミドおよび540 mg (1.5 mmol)の4,4’-ジメトキシトリフェニルメチルクロリド(Aldrich No: 10,001−3)をアルゴン雰囲気下加炎乾燥された50mlのフラスコに配置した。物質を15mlの無水ピリジンに溶解して、湿気を排除しながら3時間攪拌した。0.5mlのメタノールを添加し、溶媒を真空中ロータリーエバポレータで除去した。残渣を0.1% (v/v)トリエチルアミンを追加されたトルエン/酢酸エチル/メタノール 4:1:1 (v/v/v)を用いてシリカゲルカラム(Silica gel 60, Merck, 280 x 50 mm)でクロマトグラフした。画分をTLC(silica gel, トルエン/酢酸エチル/メタノール 4:1:1 (v/v/v))によってモニターした。所望の画分を合わせ、溶媒を38℃の温度の水浴槽を伴ったロータリーエバポレータで真空下で除去した(収量:660mg)。
610 mg (0.77 mmol)のN-[3-(1-{5-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)- フェニル-メトキシメトキシメチル]-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-フラン-2-イル}-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル)-プロピル]-2,2,2-トリフルオロ-アセトアミド、0.44 ml (2.55 mmol)のN-エチル-ジイソプロピルアミン(Fluka No: 03440)および0.19 ml (0.85 mmol)のクロロ−2−シアノエトキシジイソプロピルアミノホスファン(phosphan)−モノクロリドを、アルゴン雰囲気下乾燥した反応フラスコ中の15mlの無水ジクロロメタン中に連続的に溶解した。密封した反応容器を50分間攪拌した。反応を0.1mlメタノールの添加で停止し、次いで、混合物を0.1 % (v/v)トリエチルアミンを有するジクロロメタンから0.1 % (v/v)トリエチルアミンを有するジクロロメタン:アセトン 95:5 (v/v)までのグラジエントを用いるシリカゲルカラム(silica gel 60, Merck, 120 x 30 mm)で直接クロマトグラフした。生成物含有画分を合わせ、溶媒を真空中ロータリーエバポレータで除去した(浴槽温度28〜30℃)。得られた油を、15mlのジクロロメタン中に溶解し、溶媒を蒸発した。残った残渣を20mlのジクロロメタン中に溶解し、ABI DNA合成機と適合するガラス瓶に配分した。溶媒を、窒素の流れの中で除去した(収量:410mg)。
NMR、溶媒: d6-DMSO、モデル: Bruker DPX 300, 300 MHz, 31P-NMR: 148.79 (d), 1H: 9.45(t) [1H], 9.33(s) [1H], 7.58(d) [1H], 7.17-7.56 (m) [11H], 7.02 (d)[1H], 6.80 (m) [4H] 6.36 (dd) [1H], 4.75 (m) [1H], 4.05 (d)[1H], 3.54-3.73 (m)[5H], 3.71(s) [6H], 3.16 (s,br) [4H] 2.86(s) [3H], 2.49-2.79 (m,s,DMSO), 1.74 (m) [2H], 1.15 -0.99 (m) [12 H]
I)反応性標識の合成−クマリン343アミノヘキサン酸−NHSエステルの合成
a)クマリン343-アミノヘキサン酸
クマリン343(5 mmol, Aldrich No. 393029) ならびに各々5.5 mmolの4-アミノヘキサン酸メチルエステルおよびHBTU (O-ベンゾトリアゾール-N,N,N’,N’-テトラメチル-ウロニウム-ヘキサフルオロ-リン酸)ならびに11 mmolのトリエチルアミンを100mlのDMFに溶解し、室温で1.5時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレータで蒸発によって除去し、残油をトリクロロメタン中に溶解する。残余のHBTUを0.5 mol/lの塩酸を有する水を用いた抽出によって除去する。有機溶媒を分離し、ロータリーエバポレータで乾燥状態まで蒸発する。粗生成物(2.37g)をトリクロロメタン:酢酸エチル 2:1 (v/v)からなる移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー(silica gel 60, Merck, No: 11452134001)によって精製する(収量:1.03g)。
クマリン343-アミノヘキサン酸メチルエステル(0.1 mmol)を、200mlのリン酸バッファ(10 mM, pH 7.0)中に溶解し、20mgのエステラーゼを添加した(EC 3.1.1.1.; Sigma No: E-3019)。周囲条件(室温)での3日間の攪拌の後、メチルエステルを定量的に切断した。生成物をトリクロロメタンを有する水層の抽出によって単離した。分離された有機層を、H2Oおよびブライン(NaClで飽和したH2O)で洗浄した。硫酸マグネシウム上での乾燥および真空下ロータリーエバポレータでの溶媒の除去の後、残油をジオキサン中に溶解し、凍結乾燥する。
0.1 mmolのクマリン343−アミノヘキサン酸を20mlのDMF中に溶解し、20%モル過剰のN−ヒドロキシスクシンイミドおよびモルホリノエチルイソシアニド(0.12 mmol)を添加した。NHS-エステルは、直接的かつ定量的に形成した。トリクロロメタンの添加ならびに50mlの飽和NaHCO3溶液での2回の有機層の洗浄およびNaCl飽和H2Oでの1回の洗浄によって、単離を達成した。合わせた層の溶媒を真空中ロータリーエバポレータで除去し、残渣をジオキサンに溶解後凍結乾燥した。
a)クマリン343-アミノプロピオン酸-tert-ブチルエステル
285 mgのクマリン343 (1 mmol)、262 mgのアミノプロピオン酸 tert-ブチルエステル(1.2mmol)および343 mgのHBTU (1.2 mmol)を5mlの乾燥DMFに溶解した。280μlのトリエチルアミンを添加し、溶液を室温で2時間攪拌した。溶媒を真空中でロータリーエバポレータで蒸発させ、生成物をカラムクロマトグラフィー(Silica gel60, Merck、移動相:酢酸エチル/メタノール2:1 (v/v))によって精製した。
工程a)のクロマトグラフされた生成物を20mlのトリフルオロ酢酸に溶解し、室温で15分間攪拌した。その後、液体成分を真空中でロータリーエバポレータで蒸発させた。アセトンを添加し、純粋生成物を沈殿として得る(収量:138mg(2工程))。
58.8mg(0.165 mmol)のクマリン343−アミノプロピオン酸を50mlのトリクロロメタンに溶解した。その後、0.165 mmolのモルホリノエチルイソシアニドおよび0.165mmolのN-ヒドロキシスクシンイミドを添加した。溶液を室温で2時間攪拌し、その後、150mlのトリクロロメタンを添加した。有機層を80 mlの5% (w/v) NaHCO3溶液、80 mlの1 M HClおよび80 mlのH2Oで連続的に洗浄した。Na2SO4を用いた有機層の乾燥後、溶媒をロータリーエバポレータで真空中で除去した(収量:35mg)。
クマリン343−EDA-DSSの合成のために、1 mmolの開始物質クマリン343−EDA(例えば、Webb, R.およびCorrie, J.E.T., Biophysical Journal 81 (2001) 1562-1569を参照)を5mlの乾燥DMFに溶解し、10mlの乾燥DMF中の4 mmolのDSS(ジスクシンイミドスベレート(disuccinimido suberate))および2mmolのトリエチルアミンのDMF溶液にゆっくりと添加する。混合物を室温で1時間攪拌し、その後、溶媒を真空中で除去する。生成物をカラムクロマトグラフィー(Silica gel、溶出液: 1%(v/v)酢酸を有するトリクロロメタン:酢酸エチルエステル1:1(v/v))によって精製する(収量:230mg)。
オリゴヌクレオチド合成のための標識されたホスホロアミダイトの合成
a) N-(3-(3-アミノ-プロピル)-1-{5-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)- フェニル-エトキシメチル]-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-フラン-2-イル}-1H-インドール-5-イル)-メタンスルホンアミド
490 mg (0.64 mmol)のN-[3-(1-{5-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)-フェニル-メトキシメトキシメチル]-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-フラン-2-イル}-5-メタンスルホニルアミノ-1H-インドール-3-イル)-プロピル]-2,2,2-トリフルオロ-アセトアミドをメタノール中20mlの7Nのアンモニア溶液に溶解した。溶媒を真空中ロータリーエバポレータで除去した。残渣(420 mg)をさらなる精製をせずに使用した。
実施例1b III部からの350 mgのNHSエステルクマリン343-EDA-DSS (0.60 mmol)および0.67 ml (5 mmol)トリエチルアミンを20mlジクロロメタン中420 mg (0.61mmol)のN-(3-(3-アミノ-プロピル)-1-{5-[ビス-(4-メトキシ-フェニル)-フェニル-エトキシメチル]-4-ヒドロキシ-テトラヒドロ-フラン-2-イル}-1H-インドール-5-イル)-メタンスルホンアミドの溶液に添加した。室温での15時間の攪拌の後、溶媒を真空中ロータリーエバポレータで除去した。生成物をカラムクロマトグラフィー (silica gel 60, Merck、移動相: 0.2% (v/v)トリエチルアミンを含むトルエン:酢酸エチル:メタノール 4:5:1 (v/v/v))によって精製した(収量: 290 mg)。
アルゴン雰囲気下で、65.8 mg (62μl, 0.27 mmol)のクロロ-2-シアノエトキシジイソプロピルアミノホスファンを20mlのジクロロメタン中290 mg (0.25 mmol)の工程b)の生成物および98 mg (130μl, 0.76 mmol) N-エチルジイソプロピルアミンの混合物に室温で攪拌しながら添加した。60分後、溶媒を真空中でロータリーエバポレータで除去し、生成物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60, Merck、移動相: 0.2% (v/v)トリエチルアミンを含むジクロロメタン:アセトン 1:1 (v/v))によって精製した(収量: 205 mg) 。
オリゴヌクレオチド合成
a)二重標識加水分解プローブの合成のための一般的方法
オリゴヌクレオチド合成を、ABI 394 Synthesizer上で1μmolの幅で実施した。Proligoから市販される標準tac保護ホスホロアミダイトを使用し、標準的合成のための薬品をGlen Researchから得た。
a)の方法に従って合成されたオリゴヌクレオチドの、固相支持体からの除去および脱保護を、水性33%(w/v)アンモニア溶液を用いて室温で2時間実施した。溶媒を真空中で除去した。残油をバッファA(水性、pH7.0に調製された0.1M酢酸トリエチルアンモニウム溶液)中に溶解した。(標識された)オリゴヌクレオチドを、バッファA:水性、0.1M酢酸トリエチルアンモニウム溶液pH7.0およびバッファB: 水性0.1M酢酸トリエチルアンモニウム溶液pH7.0:アセトニトリル1:1 (v/v)を使用することによってOligo R3カラム(4.6 x 50 mm)を使用する逆相クロマトグラフィーによって精製した。グラジエントは、2分間の0%Bおよび次いで45分間の100%Bまでの1ml/分の直線流を含む。各2分の大きさの得られた画分をダイオードアレイ検出器を備えるHPLCによって分析した。90%以上の純度ならびに260、450および579nmに吸収帯を有する画分を合わせた。溶媒を真空中で真空遠心分離を使用することによって除去した。残油を再蒸留水中に溶解し、次いで溶媒を真空遠心分離中で再度除去した。この手順を3回繰り返した。最終ペレットを水中に溶解し、凍結乾燥した。
a)の方法に従って合成されたオリゴヌクレオチドの、固相支持体からの除去および脱保護を、水性、33%(w/v)アンモニア溶液を用いて室温で2時間実施した。溶媒を真空中で除去した。残油を600μlの再蒸留水中に溶解し、微小遠心管に移した。60μlの酢酸ナトリウムバッファ(3M, pH 8.5)を添加した。1.8mlの冷(4℃)エタノールの添加の後、混合物を−15℃で3時間保存した。得られた溶液を10000×gで15分間遠心分離した。上清をデカンテーションにより除去した。ペレットを200μlの冷エタノール(4℃)を用いて洗浄した。遠心分離の後、上清をデカンテーションにより除去した。ペレットを400μlのホウ酸ナトリウムバッファ(0.1M、pH8.5)に溶解し、当業者に公知の手順に従って標識した。従って、DMF(1ml)中1mgの実施例1bに従うクマリン色素NHSエステルの溶液を添加し、混合物を室温で15時間振盪した。溶媒をロータリーエバポレータを使用して高真空(1mbar)中で除去した。精製を上記のように実施した。この方法を用いて以下のオリゴヌクレオチドを合成した:
および
。
MALDI-MS: M.W. [g/mol] 計算値 8670.2; M.W. 実測値 8669.65。
実施例2からの加水分解プローブを使用するリアルタイムPCRによるウイルス標的DNAの検出
PCRを、通常の備品と共にLightCycler(登録商標) 480装置を使用して実施した。PCRミックスを一般的なPCRキット: LightCycler(登録商標) 480 Probes Masterに挿入されている製造業者の推奨に従って調製した。
試薬:
−LightCycler(登録商標) 480 Probes Master
−オリゴヌクレオチド
プライマーの最終濃度:0.3μM、プローブ:0.05μM
−精製された標的DNA
標的DNAの増幅を、消光されない(dequenched)シアン500(450nmで励起、500nmで放出検出)(図2)の蛍光測定によってモニターする。
Claims (3)
- 以下の式:
を有し、
AおよびBは、互いに独立であり、RおよびXから独立であり、
AおよびBは、
(1)水素、
(2)三リン酸、
(3)リン酸、および
(4)ヌクレオチド残基の鎖
からなる群から選択され、
ただしAは三リン酸であり得るが、Bは三リン酸ではあり得ず、
R=H、OH、O−アルキル、O−アルケニル、またはO−アルキニルであり、
Xは、蛍光実体を有するリンカーであり、該リンカーは4〜20原子長を有する、
ことを特徴とする、化合物。 - R=Hであることを特徴とする請求項1記載の化合物。
- ハイブリダイゼーションプローブとしての請求項1または2記載の化合物の使用であって、AまたはBがヌクレオチド残基の鎖であることを特徴とする、使用。
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