ES2929725T3

ES2929725T3 - Métodos y composiciones relacionadas con exosomas

Info

Publication number: ES2929725T3
Application number: ES15796048T
Authority: ES
Inventors: S Alexander Mitsialis; Stella Kourembanas; Konstantinos Sdrimas
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 2014-05-18
Filing date: 2015-05-15
Publication date: 2022-12-01
Anticipated expiration: 2035-05-15
Also published as: CA2949083A1; JP2021020908A; CN106714781B; EP3145493A4; AU2015264519A1; CN106714781A; CN113817672A; US20200281983A1; CA2949083C; IL249011A0; US20170258840A1; WO2015179227A1; US11759481B2; EP3145493A1; JP6773563B2; AU2015264519B2; KR20170005854A; IL249011B; EP3145493B1; US10624929B2

Abstract

La descripción proporciona composiciones que comprenden subpoblaciones de exosomas y métodos para su uso en sujetos que tienen ciertos trastornos que incluyen trastornos pulmonares, trastornos cardiovasculares, trastornos renales y trastornos neurales isquémicos. La divulgación proporciona composiciones que comprenden exosomas y métodos de uso de las mismas en el tratamiento y/o prevención de diversas enfermedades o trastornos. 25 En consecuencia, un aspecto de la divulgación proporciona un exosoma aislado. En algunas realizaciones, el exosoma aislado comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105, y/o el exosoma aislado no comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo grupo formado por FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunas realizaciones, 30 el exosoma aislado comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3> SMAD5 y CD105. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones relacionadas con exosomas

SOLICITUD RELACIONADA

La presente solicitud reivindica el beneficio con arreglo a la sección 119(e) del título 35 del U.S.C. de la solicitud provisional de EE. UU. presentada el 18 de mayo 2014, titulada "METHo Ds AND COMPOSITIONS RELATING TO EXOSOMES", N.2 de serie 61/994.974.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los exosomas son vesículas derivadas de las células que están presentes en muchos y quizás en todos los líquidos biológicos, que incluyen la sangre, la orina y el medio acondicionado de cultivos celulares. El diámetro de los exosomas informado es normalmente entre 30 y 100 nm, que, para comparación, es mayor que el de LDL, pero significativamente más pequeño que el de los glóbulos rojos. Los exosomas son conocidos por ser liberados de las células cuando cuerpos multivesiculares se fusionan con la membrana plasmática o cuando son liberados directamente de la membrana plasmática. Cada vez está más claro que los exosomas tienen funciones especializadas y desempeñan una función clave en, por ejemplo, la coagulación, la señalización intercelular y la gestión de residuos. Por consiguiente, existe un interés cada vez mayor en las aplicaciones clínicas de los exosomas, que incluyen exosomas sintéticos que dan lugar a aspectos de los exosomas derivados de las células. Los exosomas se pueden usar posiblemente para pronóstico, terapia y biomarcadores para salud y enfermedad. Lai et al. (Stem Cell Res. 2010 May;4(3):214-22) describen exosomas secretados por MSC, para su uso en el tratamiento de isquemia miocárdica. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La divulgación proporciona composiciones que comprenden exosomas y métodos de uso de los mismos en el tratamiento y/o la prevención de diversas enfermedades o trastornos.

En un aspecto, la presente invención proporciona un exosoma aislado, en donde

(i) el exosoma aislado comprende marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105; y

(ii) en donde el exosoma aislado no comprende marcadores FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En un aspecto, la presente invención proporciona un exosoma aislado para su uso en el tratamiento de un trastorno pulmonar, un trastorno cardiovascular, un trastorno renal o un trastorno neural isquémico, en donde

(i) el exosoma aislado comprende marcadores que consisten en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SAMD5 y CD105; y

(ii) en donde el exosoma aislado no comprende marcadores FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En una realización, el trastorno pulmonar es enfermedad pulmonar inflamatoria, opcionalmente en donde la enfermedad pulmonar inflamatoria es inflamación pulmonar inducida por hipoxia, hipertensión pulmonar, asma, displasia broncopulmonar (DBP), alergia o fibrosis pulmonar idiopática; enfermedad vascular pulmonar; o lesión pulmonar aguda, opcionalmente en donde la lesión pulmonar aguda está asociada con septicemia o es síndrome disneico agudo (SDRA) inducido por el respirador, o alternativamente en donde el trastorno cardiovascular es infarto de miocardio, enfermedad cardiovascular, hipertensión, aterosclerosis o insuficiencia cardíaca, alternativamente en donde el trastorno renal es lesión renal isquémica, insuficiencia renal aguda o fibrosis renal, alternativamente en donde el trastorno neural isquémico es encefalopatía isquémica hipóxica o accidente cerebrovascular isquémico.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de un exosoma(s) que comprende cultivar una célula madre mesenquimatosa (MSC) para producir medio acondicionado, en donde el cultivo es cultivo tridimensional (3D), y/o en donde el cultivo comprende el uso de TGFp1; y

aislar el (los) exosoma(s) del medio acondicionado; en donde

(i) el (los) exosoma(s) aislado(s) comprende(n) marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105; y

(ii) en donde el (los) exosoma(s) aislado(s) no comprende(n) marcadores FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2.

En una realización, el cultivo 3D comprende cultivo en gota colgante, cultivo en matrices, cultivo en microvehículos, cultivo en andamiajes extracelulares sintéticos, cultivo en membranas de quitosano, cultivo en levitación magnética, cultivo en suspensión en biorreactores giratorios o cultivo en condiciones de inhibición sin contacto.

En una realización, el método potencia la producción de exosomas que comprenden marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, ^sM^aD3, SMAD5 y CD105 con respecto a exosomas que comprenden uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2, opcionalmente en donde la potenciación comprende un aumento de 1,5 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, o 5,0 veces, 6,0 veces, 7,0 veces, 8,0 veces, 9,0 veces o 10,0 veces o más en la producción de exosomas que comprenden marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD², SMAD3, SMAD5 y CD105 con respecto a exosomas que comprenden uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2.

En una realización, el exosoma aislado, el exosoma aislado para su uso, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el exosoma tiene un diámetro de aproximadamente 10-150 nm, opcionalmente en donde el exosoma tiene un diámetro de aproximadamente 30-100 nm.

En una realización, el exosoma aislado, el exosoma aislado para su uso, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el exosoma se aísla de una célula madre mesenquimatosa humana.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición o composición farmacéutica que comprende el exosoma aislado de la invención.

El término "caso" o "casos", como se usa en el presente documento, se refiere a información útil para el entendimiento de la presente invención y/o poner en práctica la presente invención, pero no entra dentro del alcance de la invención reivindicada.

La divulgación proporciona un exosoma aislado. En algunos casos, el exosoma aislado comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105, y/o el exosoma aislado no comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, ^cD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunos casos el exosoma aislado comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, ^sM^aD5 y CD105. En algunos casos, el exosoma aislado comprende los marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105. En algunos casos, el exosoma aislado no comprende 2, 3, 4, 5, 6 o 7 marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2.

En algunas realizaciones, el exosoma aislado tiene morfología esférica y aparece radiotransparente tras la tinción negativa en microscopía electrónica de transmisión, y/o el exosoma aislado no tiene una morfología en forma de copa en la microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa. El exosoma aislado puede tener un diámetro de aproximadamente 10-150 nm. En algunas realizaciones, el exosoma aislado tiene un diámetro de aproximadamente 30-100 nm. En algunas realizaciones, el exosoma aislado se aísla de una célula madre mesenquimatosa (MSC), fibroblasto o macrófago. En algunas realizaciones, la MSC, fibroblasto o macrófago es una MSC humana, fibroblasto humano o macrófago humano. En algunas realizaciones, la MSC se aísla de gelatina de Wharton, sangre del cordón umbilical, placenta, sangre periférica, médula ósea o tejido adiposo. En algunas realizaciones, el exosoma aislado está comprendido en una composición. En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica.

En algunos casos, el exosoma aislado comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2, y/o el exosoma aislado no comprende uno o marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105. En algunos casos, el exosoma aislado comprende 2, 3, 4, 5, 6 o 7 marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunos casos, el exosoma aislado comprende los marcadores FLOT 1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, y AKT1 y AKT2. En algunos casos, el exosoma aislado no comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SM^aD3, SMAD5 y CD105. En algunos casos, el exosoma aislado no comprende los marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105. En algunas realizaciones, el exosoma aislado tiene morfología en forma de copa en la microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa y/o no tiene una morfología esférica en la microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa. En algunos casos, el exosoma aislado tiene un diámetro de aproximadamente 10-250 nm. En algunos casos, el exosoma aislado tiene un diámetro de aproximadamente 30 200 nm.

Según otro caso, se proporciona un método de tratamiento de un trastorno pulmonar, un trastorno cardiovascular, un trastorno renal o un trastorno neural isquémico. En algunos casos, el método comprende administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un trastorno pulmonar, un trastorno cardiovascular, un trastorno renal o un trastorno neural isquémico una cantidad terapéuticamente eficaz de un exosoma aislado. En algunos casos, el exosoma aislado comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105, y/o el exosoma aislado no comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunos casos, el exosoma aislado comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105. En algunos casos, el exosoma aislado comprende los marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105. En algunos casos, el exosoma aislado no comprende 2, 3, 4, 5, 6 o 7 marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, c D9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunos casos, el exosoma aislado no comprende los marcadores FLOT1, CD9, CD81, CAVI, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunos casos, el exosoma aislado tiene morfología esférica y aparece radiotransparente tras la tinción negativa en microscopía electrónica de transmisión y/o el exosoma aislado no tiene una morfología en forma de copa en la microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa. En algunos casos, el exosoma aislado tiene un diámetro de aproximadamente 10-150 nm. En algunos casos, el exosoma aislado tiene un diámetro de aproximadamente 30 100 nm. En algunos casos, el exosoma aislado se aísla de una célula madre mesenquimatosa (MSC), fibroblasto o macrófago. En algunos casos, la MSC, fibroblasto o macrófago es una MSC humana, fibroblasto humano o macrófago humano. En algunos casos, la MSC se aísla de gelatina de Wharton, sangre del cordón umbilical, placenta, sangre periférica, médula ósea o tejido adiposo. En algunos casos, el trastorno pulmonar que está tratándose es enfermedad pulmonar inflamatoria, enfermedad vascular pulmonar o lesión pulmonar aguda. En algunos casos, la enfermedad pulmonar inflamatoria es inflamación pulmonar inducida por hipoxia, hipertensión pulmonar, asma, displasia broncopulmonar (DBP), alergia o fibrosis pulmonar idiopática. En algunos casos, la lesión pulmonar aguda está asociada con septicemia o es síndrome disneico agudo (SDRA) inducido por el respirador. En algunos casos, un trastorno cardiovascular que está tratándose según el método es infarto de miocardio, enfermedad cardiovascular, hipertensión, aterosclerosis o insuficiencia cardíaca. En algunos casos, que implican el tratamiento de trastornos renales, el trastorno renal es lesión renal isquémica, insuficiencia renal aguda o fibrosis renal. En casos del método que implican el tratamiento de trastornos neurales isquémicos, el trastorno es encefalopatía isquémica hipóxica o accidente cerebrovascular isquémico.

Según otro aspecto más de la divulgación, se proporciona el uso de un exosoma aislado para tratar un trastorno pulmonar, un trastorno cardiovascular, un trastorno renal o un trastorno neural isquémico. En algunos casos, el exosoma aislado comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD 105, y/o el exosoma aislado no comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunas realizaciones, el exosoma aislado comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105. En algunas realizaciones, el exosoma aislado comprende los marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105. En algunos casos, el exosoma aislado no comprende 2, 3, 4, 5, 6 o 7 marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2.

En algunas realizaciones, el exosoma aislado tiene morfología esférica y aparece radiotransparente tras la tinción negativa en microscopía electrónica de transmisión y/o el exosoma aislado no tiene una morfología en forma de copa en la microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa. En algunas realizaciones, el exosoma aislado tiene un diámetro de aproximadamente 10-150 nm. En algunas realizaciones, el exosoma aislado tiene un diámetro de aproximadamente 30-100 nm. En algunas realizaciones, el exosoma aislado se aísla de una célula madre mesenquimatosa (MSC), fibroblasto o macrófago. En algunas realizaciones, la MSC, fibroblasto o macrófago es una MSC humana, fibroblasto humano o macrófago humano. En algunas realizaciones, la MSC se aísla de gelatina de Wharton, sangre del cordón umbilical, placenta, sangre periférica, médula ósea o tejido adiposo. En algunas realizaciones, el trastorno pulmonar es enfermedad pulmonar inflamatoria, enfermedad vascular pulmonar o lesión pulmonar aguda. En algunas realizaciones, la enfermedad pulmonar inflamatoria es inflamación pulmonar inducida por hipoxia, hipertensión pulmonar, asma, displasia broncopulmonar (DBP), alergia o fibrosis pulmonar idiopática. En algunas realizaciones, la lesión pulmonar aguda está asociada con septicemia o es síndrome disneico agudo (SDRA) inducido por el respirador. En algunas realizaciones, el trastorno cardiovascular es infarto de miocardio, enfermedad cardiovascular, hipertensión, aterosclerosis o insuficiencia cardíaca. En algunas realizaciones, el trastorno renal es lesión renal isquémica, insuficiencia renal aguda o fibrosis renal. En algunas realizaciones, el trastorno neural isquémico es encefalopatía isquémica hipóxica o accidente cerebrovascular isquémico.

Según otro caso, se proporciona el uso de un exosoma aislado en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno pulmonar, un trastorno cardiovascular, un trastorno renal o un trastorno neural isquémico. En algunos casos, el exosoma aislado comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105, y/o el exosoma aislado no comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunos casos, el exosoma aislado comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, S^mA ^d3, SMAD5 y CD105. En algunos casos, el exosoma aislado comprende los marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105. En algunos casos, el exosoma aislado no comprende 2, 3, 4, 5, 6 o 7 marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunos casos, el exosoma aislado no comprende los marcadores FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunos casos, el exosoma aislado tiene morfología esférica y aparece radiotransparente tras la tinción negativa en microscopía electrónica de transmisión; y/o el exosoma aislado no tiene una morfología en forma de copa en la microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa. En algunos casos, el exosoma aislado tiene un diámetro de aproximadamente 10-150 nm. En algunos casos, el exosoma aislado tiene un diámetro de aproximadamente 30-100 nm. En algunos casos, el exosoma aislado se aísla de una célula madre mesenquimatosa (MSC), fibroblasto o macrófago. En algunos casos, la MSC, fibroblasto o macrófago es una MSC humana, fibroblasto humano o macrófago humano. En algunos casos, la MSC se aísla de gelatina de Wharton, sangre del cordón umbilical, placenta, sangre periférica, médula ósea o tejido adiposo. En algunos casos que implican el uso de exosomas para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos pulmonares, el trastorno es enfermedad pulmonar inflamatoria, enfermedad vascular pulmonar o lesión pulmonar aguda. En algunos casos, la enfermedad pulmonar inflamatoria es inflamación pulmonar inducida por hipoxia, hipertensión pulmonar, asma, displasia broncopulmonar (DBP), alergia o fibrosis pulmonar idiopática. En algunos casos, la lesión pulmonar aguda está asociada con septicemia o es síndrome disneico agudo (SDRA) inducido por el respirador. En algunos casos, se proporciona el uso del exosoma para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno cardiovascular, siendo el trastorno infarto de miocardio, enfermedad cardiovascular, hipertensión, aterosclerosis o insuficiencia cardíaca. En algunos casos que implican el uso de exosomas para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos renales, el trastorno renal es lesión renal isquémica, insuficiencia renal aguda o fibrosis renal. En algunos casos que implican el uso de exosomas para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos neurales isquémicos, el trastorno es encefalopatía isquémica hipóxica o accidente cerebrovascular isquémico.

Según otro caso más de la divulgación, se proporciona un método de producción de un exosoma(s). En algunos casos, el método comprende cultivar una célula para producir medio acondicionado y aislar el exosoma del medio acondicionado. En algunos casos, el exosoma aislado comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105, y/o el exosoma aislado no comprende uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunos casos, el exosoma aislado comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SmA d 3, s Ma D5 y CD105. En algunas realizaciones, el exosoma aislado los marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105. En algunos casos, el exosoma aislado no comprende 2, 3, 4, 5, 6 o 7 marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2.

En algunos casos, el exosoma aislado tiene morfología esférica y aparece radiotransparente tras la tinción negativa en microscopía electrónica de transmisión y/o el exosoma aislado no tiene una morfología en forma de copa en la microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa. En algunos casos, el exosoma aislado tiene un diámetro de aproximadamente 10-150 nm. En algunos casos, el exosoma aislado tiene un diámetro de aproximadamente 30 100 nm. En algunos casos, el exosoma aislado se aísla de una célula madre mesenquimatosa (MSC), fibroblasto o macrófago. En algunos casos, la MSC, fibroblasto o macrófago es una MSC humana, fibroblasto humano o macrófago humano. En algunos casos, la MSC se aísla de gelatina de Wharton, sangre del cordón umbilical, placenta, sangre periférica, médula ósea o tejido adiposo. En algunos casos, el cultivo implica cultivo bidimensional (2D) o tridimensional (3D). En algunos casos, el cultivo 3D comprende cultivo en gota colgante, cultivo en matrices, cultivo en microvehículos, cultivo en andamiajes extracelulares sintéticos, cultivo en membranas de quitosano, cultivo en levitación magnética, cultivo en suspensión en biorreactores giratorios o cultivo en condiciones de inhibición sin contacto. En algunos casos, el cultivo comprende el uso de uno o más factores de crecimiento seleccionados de la superfamilia de TGFp (TGFp1, activinas, BMP, GDF, GDNF, inhibinas, Nodal, Lefty, MIS) EGF, PDGF y FGF. En algunos casos, el método potencia la producción de exosomas que comprenden uno o más marcadores seleccionados de ALIX, TSG101, TGFBR², SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105 con respecto a exosomas que comprenden uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunos casos, la potenciación comprende un aumento de 1,5 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, o 5,0 veces, 6,0 veces, 7,0 veces, 8,0 veces, 9,0 veces o 10,0 veces o más en la producción de exosomas que comprenden uno o más marcadores seleccionados de ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105 con respecto a exosomas que comprenden uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AkT2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1. El tratamiento de ratones por inyección i.v. de preparaciones de exosomas de células madre mesenquimatosas (MEX) regula por disminución la activación hipóxica de la señalización asociada a la remodelación vascular e hipertensión pulmonar y mejora la inflamación pulmonar inducida por hipoxia. (A) Se inyectó a ratones FVB/n de edades equiparadas con MEX humanos (20 billones de partículas/ratón) y se expusieron a hipoxia durante 2,5 días. La fosforilación inducida por hipoxia de AKT y su diana aguas abajo mTOR se reducen por tratamiento con MEX. Los niveles de proteína pulmonar del inhibidor de la proteína de unión/diferenciación del ADN ID1, un gen directo dirigido a SMAD y señal aguas abajo de BMPR2, son suprimidos por la hipoxia, pero aumentaron con MEX. La alfa-tubulina sirve de control de normalización. (B) Los niveles de ARNm de CCL2, un marcador inflamatorio temprano, son suprimidos con el tratamiento con MEX. Los niveles de ARN se normalizaron a RPS9.

FIG. 2. Aislamiento de subpoblaciones de exosomas enriquecidas en a-MEX y f-MEX. Los medios acondicionados por cultivos en monocapa de WJ-MSC se concentraron y se ajustaron al 45 % de sacarosa. Esta preparación se dispuso en capas sobre un colchón de sacarosa del 60 % y se cubrió con un gradiente de etapa del 35 % - 5 % de sacarosa. Las preparaciones se centrifugaron durante 20 h a 180k x g. El gradiente se recogió en 14 fracciones x 1 ml. El número de partículas en cada fracción se midió por Nanosight. Se analizaron 20 microL de cada fracción por Western para la presencia de ALIX, FLOT1, CAV1 y SMAD 2/3. Se identificaron dos poblaciones distintas de vesículas con diferentes velocidades de sedimentación (f-MEX y a-MEX) y diferente composición de marcadores, basándose en los marcadores anteriores.

FIG. 3. Preparaciones de WJ-MSC que representan a-MEX y f-MEX se analizaron por transferencia Western. Los marcadores de biogénesis de exosomas, tales como Alix y Tsg101, se enriquecen preferentemente en a-MEX, mientras que las tetraspaninas CD9 y CD81 y los marcadores de balsas lipídicas, tales como flotilina 1 y caveolina 1, están enriquecidos en f-MEX. También son específicos de a-MEX TGFBR2, así como CD105, y miembros de la familia SMAD (no mostrada aquí). El receptor de EGF y los miembros de la familia AKT (no mostrada aquí) son específicos de f-MEX.

FIG. 4. La tinción negativa en la microscopía electrónica muestra diferencias en el tamaño, la forma y la radiotransparencia entre las subpoblaciones de exosomas a-MEX y f-MEX. Aumentos: 30.000X.

FIG. 5. Ratones FVB/n se expusieron a hipoxia como en la FIG. 1 y se trataron con preparaciones de exosomas de WJ-MSC enriquecidas en o a-MEX o f-MEX. Los pulmones se recogieron después de 2,5 días en hipoxia y los niveles de ARNm de marcadores inflamatorios inducidos por hipoxia se determinaron por RT-PCR, usando RPS9 como normalizador. El tratamiento con a-MEX pero no f-MEX da como resultado una disminución en los niveles de ARNm de CCL2, IL6 y ADM.

FIG. 6. Un esquema del proceso de formación de esferoides. La adición de TGFpb (10 ng/ml) a cultivos de monocapa acelera la formación de esferoides. El recuadro representa una sección de un esferoide de WJ-MSC teñido con azul de toluidina.

FIG. 7. Esferoides de WJ-MSC secretan predominantemente a-MEX. Se tripsinó WJ-MSC en cultivo en monocapa convencional y la suspensión de células individuales se dividió en dos partes iguales, que contenían 15 millones de células cada una. Una parte se propagó en medios convencional y recipiente como una monocapa (cultivo 2D). La otra parte se indujo a la formación de esferoides (cultivo 3D) por el método de gota colgante (30 esferoides que contienen 500.000 células cada uno). Se ensayó un volumen igual de medio acondicionado clarificado por los dos cultivos para la presencia de los marcadores indicados por transferencia Western. Los marcadores específicos de a-MEX (SMAD 2/3, ALIX) se enriquecen en medio acondicionado por esferoides, y FLOT1, específico de f-MEX se observa predominantemente en medio acondicionado por la monocapa.

FIG. 8. La relación entre f-MEX y a-MEX secretados por MSC de donantes independientes se correlaciona de forma inversa con la eficiencia de formación de esferoides. WJ-MSC aisladas de dos donantes diferentes (clon D y clon C) se cultivaron en condiciones no adherentes (técnica de gota colgante) durante 24 h. (A) Una cantidad igual de medio acondicionado por cultivos en monocapa de cada clon se ensayó para el marcador de a-MEX SMAD 2/3 y el marcador de f-MEX FLOT1 por transferencia Western. La relación entre SMAD y FLOT1 indicó que el clon D produce predominantemente f-MEX, mientras que la producción de exosomas del clon C incluye cantidades significativas de tanto a-MEX como f-MEX. (B) Suspensiones de células individuales del clon D no presentaron capacidad de formación de esferoides en condiciones donde suspensiones idénticamente tratadas de WJ-MSC del clon C fueron capaces de formar esferoides compactos después de 24 h como se examinó por microscopía óptica. La viabilidad estuvo por encima del 95 % después de 24 h como se evaluó por azul de tripano. El medio acondicionado se recogió de las gotas colgantes y se aislaron los exosomas (como se describe en Métodos). Los exosomas del clon A se enriquecieron en flotilina 1 mientras que los del clon B en Alix, lo que refleja el enriquecimiento diferencial de subpoblaciones de exosomas en CM.

FIG. 9. La adición de TGFp (10 ng/ml) a cultivos en monocapa de WJ-MSC acelera el proceso de formación de esferoides y da como resultado un aumento de la relación entre marcadores de a-MEX (tales como SMAD2/3) con respecto a marcadores de f-MEX (tales como FLOT 1), que indica un aumento de la proporción de a-MEX en la población secretada.

FIG. 10. a-MEX aloja módulos funcionales de señalización de TGF. (A) Se añadió PBS "C", TGFp, FGF o PDGF (10 ng/ml) a alícuotas iguales de preparaciones de a-MEX, seguido de incubación a 37 °C durante 30 min. Entonces se lisaron las preparaciones y se sometieron a análisis por transferencia Western. La elevada fosforilación de SMAD 2/3 asociada a los exosomas indica un complejo de receptor de TGFB2R funcional. El efecto no se observa mediante el tratamiento con FGF o PDGF, factores de crecimiento que no emplean la vía de SMAD en su señalización primaria. (B) Las preparaciones de a-MEX o f-MEX se trataron con TGFp (10 ng/ml) y se incubaron y analizaron como antes. La fosforilación de SMAD se observó específicamente en a-MEX.

FIG. 11. a-MEX pero no f-MEX inhibe la transición de fibroblastos a miofibroblastos inducida por TGFp y la activación de fibroblastos mediada por LPS. (A) Los fibroblastos de pulmón humano, después de 3 días de privación de suero (0,1 % de FBS), se estimularon con TGFp para someterse a la diferenciación de miofibroblastos, marcada por una elevada expresión de alfa-actina de músculo liso (SMA). El pretratamiento con hMEX (2 ug/ml) suprime el efecto de TGFp sobre los niveles de proteína alfa-SMA. (B) Fibroblastos de pulmón humano, después de 24 h de privación de suero, se estimularon con TGFp para inducir PAI1, un marcador de miofibroblastos. El tratamiento con a-MEX previno la regulación por incremento de PAI1, un efecto no observado con el tratamiento con f-MEX. (C) El tratamiento con a-MEX regula por disminución los niveles basales de ARNm de MCP-1 y IL1 p en fibroblastos de pulmón humano in vitro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La divulgación se basa, en parte, en el sorprendente hallazgo de que dos tipos de exosomas derivan de células tales como células madre mesenquimatosas, y los exosomas se pueden distinguir basándose en marcadores moleculares, tamaño, morfología y función. Por ejemplo, una de las dos subpoblaciones comprende marcadores distintos y tiene eficacia terapéutica en el tratamiento de ciertos trastornos, mientras que la otra subpoblación comprende un grupo separado y distinto de marcadores y carece de eficacia terapéutica en el tratamiento de ciertos trastornos.

La divulgación se refiere ampliamente a composiciones de exosomas aislados y métodos de su uso en el tratamiento y/o la prevención de ciertas enfermedades o trastornos que incluyen, pero no se limitan a, trastornos pulmonares, trastornos cardiovasculares, trastornos renales y trastornos neurales isquémicos.

Exosomas y preparación de exosomas

Los exosomas de la divulgación son vesículas de la membrana (por ejemplo, bicapa lipídica) que son liberadas de las células, tales como células madre mesenquimatosas (MSC), fibroblastos y macrófagos. Por microscopía electrónica, se ha descrito normalmente que los exosomas tienen una morfología en forma de copa. Sin embargo, aspectos de la presente divulgación se refieren al novedoso hallazgo de que algunos exosomas (por ejemplo, los que tienen eficacia terapéutica como se describe en el presente documento) dentro de una preparación dada muestran una morfología esférica a diferencia de la forma de copa, y también son radiotransparentes (por ejemplo, translúcidos), como se ha determinado por microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa. Los exosomas sedimentan a aproximadamente 100.000 x g y tienen una densidad de flotación en sacarosa de aproximadamente 1,10 a aproximadamente 1,21 g/ml. Los exosomas se pueden denominar microvesículas o nanovesículas.

En el presente documento se desvelan exosomas aislados. Como se usa en el presente documento, un exosoma aislado es uno que está separado físicamente de su entorno natural. Un exosoma aislado puede estar separado físicamente, por completo o en parte, del tejido o células con las que existe naturalmente, que incluye MSC, fibroblastos y macrófagos. En algunas realizaciones de la divulgación, una composición de exosomas aislados puede estar libre de células, tales como MSC, fibroblastos y macrófagos, o puede estar libre o sustancialmente libre de medio acondicionado. Normalmente, los exosomas aislados se proporcionan a una mayor concentración que los exosomas presentes en medio acondicionado no manipulado.

Los exosomas se pueden aislar de medio acondicionado de cultivos de células que incluyen, pero no se limitan a, MSC, fibroblastos y macrófagos. Un método de recogida de exosomas de MSC se proporciona en los ejemplos. Brevemente, dicho método implica cultivar en primer lugar MSC en condiciones habituales hasta que alcancen aproximadamente el 70 % confluencia, y luego cultivar las células en un medio sin suero durante 24 horas, tras lo cual el medio acondicionado se recoge y se somete a centrifugación diferencial a 400 xg durante 10 minutos y 12000 x g durante 10 minutos para retirar las células y el residuo celular. El medio acondicionado clarificado se concentra entonces por ultrafiltración usando un filtro de MWCO 100 kDa (Millipore) y luego se centrifuga otra vez a 12000 x g durante 10 minutos. Los exosomas se aíslan entonces usando cromatografía de exclusión por tamaño cargando el medio acondicionado concentrado en una columna Chroma S-200 equilibrada con PBS (Clontech), eluyendo con PBS y recogiendo fracciones de 350-550 microlitros. Las fracciones que contienen exosomas se identifican y se reúnen posiblemente. La concentración de proteína se mide usando un ensayo de Bradford habitual (Bio-Rad). Las alícuotas de las preparaciones de exosomas enriquecidas se pueden almacenar a -80 °C.

Los exosomas también se pueden purificar por ultracentrifugación del medio acondicionado clarificado a 100.000 x g. También se pueden purificar por ultracentrifugación en un colchón de sacarosa. Los métodos de GMP para la purificación de exosomas de células dendríticas se han descrito en J Immunol Methods. 2002;270:211 -226.

Los exosomas también se pueden purificar por filtración diferencial, a través de filtros de membrana de nailon de tamaño de poro definido. Una primera filtración a través de un tamaño de poro grande retendrá fragmentos celulares y residuos. Una filtración posterior a través de un tamaño de poro más pequeño retendrá los exosomas y los purificará de contaminantes de tamaño más pequeño.

En algunos casos, los exosomas se fraccionan en las dos subpoblaciones enriquecidas para ciertos marcadores descritos en el presente documento. Los métodos de fraccionamiento de las dos subpoblaciones se describen en los ejemplos, e incluyen, por ejemplo, velocidad ultracentrifugación en gradientes escalonados de sacarosa (5 %-60 %), iodixanol (OptiprepTM, 0 %-60 %) o medios de aislamiento similares.

En algunos casos, la divulgación proporciona dos tipos distintos de exosomas que se distinguen basándose en marcadores moleculares, tamaño, morfología y función. Los dos tipos distintos se denominan el "tipo a" y el "tipo f" en toda la divulgación, y cuando derivan de MSC se denominan indistintamente "a-MEX" (para el exosoma derivado de MSC de "tipo a") o "f-MEX" (para el exosoma derivado de MSC "de tipo f"). Sorprendentemente, son los exosomas de tipo a los que presentan eficacia terapéutica en el tratamiento de ciertos trastornos, por ejemplo trastornos pulmonares; mientras que los exosomas de tipo f no presentan eficacia terapéutica en los mismos paradigmas de tratamiento. Aunque no se pretende quedar ligado a mecanismo particular alguno, se cree que el distintivo molecular de cada tipo de exosoma especifica su efecto o función sobre células diana o tejidos.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, los exosomas aislados de tipo a comprenden uno o más marcadores (por ejemplo, proteínas) seleccionados del grupo que consiste en ALIX (también conocido como "proteína que interactúa con muerte celular programada 6" o PDCD6IP; HomoloGene:22614; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_001155901.1), TSG101 (gen de susceptibilidad a tumores 101; HomoloGene:4584; por ejemplo, secuencia de referencia de Nc BI: NP_006283.1), TGFBR2 (factor de crecimiento transformante, receptor beta II; HomoloGene:2435; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_001020018.1), SMAD1 (miembro 1 de la familia de SMAD; HomoloGene:21196; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_001003688.1), SMAD2 (miembro 2 de la familia SMAD; HomoloGene:21197; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_001003652.1), SMAD3 (miembro 3 de la familia SMAD; HomoloGene:55937; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_001138574.1), SMAD5 (miembro 5 de la familia SMAD; HomoloGene:4313; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_001001419.1) y CD105 (también conocido como endoglina o ENG; HomoloGene:92; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: ⁿP_000109.1; NP_001108225.1; NP_001265067.1). En algunas realizaciones, el tipo a comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de estos marcadores. En algunas realizaciones, cuando un exosoma "comprende" un marcador particular, se indica que el exosoma contiene niveles detectables (por ejemplo, como se ha determinado por transferencia Western) del marcador y/o niveles suficientes para provocar una cierta respuesta en una célula diana o tejido o provocar una cierta respuesta en un sujeto en el contexto de métodos de tratamiento como se describe en el presente documento. Algunos de estos marcadores (por ejemplo, proteínas) que se pueden encontrar en los exosomas de tipo a comprenden a parte de la superfamilia TGF/BMP de factores de crecimiento, que se cree que contribuyen a su función y efectos terapéuticos. En algunos casos, los exosomas aislados de tipo a no comprenden uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1 (flotilina 1; HomoloGene:31337; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_005794.1), CD9 (molécula CD9; HomoloGene:20420; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_001760.1), CD81 (molécula CD81; HomoloGene:20915; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_004347.1), CAV1 (caveolina 1; HomoloGene:1330; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_001166366.1), EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico; HomoloGene:74545; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_005219.2; NP_958439.1; NP_958440.1; NP_958441.1), A^kT1 (homólogo 1 del oncogén viral del timoma murino v-akt; HomoloGene:3785; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_001014431.1) y AKT2 (homólogo 2 del oncogén viral del timoma murino v-akt; HomoloGene:48773; por ejemplo, secuencia de referencia de NCBI: NP_001229956.1). En algunos casos, el tipo a no comprende 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de estos marcadores. En algunas realizaciones, cuando un exosoma "no comprende" un marcador particular, se indica que el exosoma no contiene ninguno de o solo cantidades insignificantes del marcador particular. Por ejemplo, una cantidad insignificante puede ser una cantidad que es indetectable, o una cantidad que es detectable en solo cantidades traza.

En algunas realizaciones, un exosoma de tipo a se puede distinguir de un exosoma de tipo f basándose en la morfología. Se ha descrito normalmente que los exosomas tienen una morfología en forma de copa. Sorprendentemente, la presente divulgación proporciona exosomas (el tipo a) que tienen una morfología esférica a diferencia de en forma de copa. Los métodos de evaluación de la morfología de los exosomas son conocidos en la técnica, e incluyen microscopía electrónica de transmisión y tinción negativa en microscopía electrónica de transmisión. Además, se encontró que los exosomas de tipo a eran radiotransparentes (por ejemplo, translúcidos) usando tinción negativa en microscopía electrónica de transmisión. En cambio, los exosomas de tipo f muestran morfología en forma de copa y no son radiotransparentes, como se ha determinado por tinción negativa en microscopía electrónica de transmisión.

En algunas realizaciones, los exosomas de tipo a se distinguen de los exosomas de tipo f basándose en el tamaño. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los exosomas de tipo a tienen un diámetro de aproximadamente 10-150 nm, aproximadamente 20- 120 nm o aproximadamente 30-100 nm.

En otros casos, la divulgación proporciona exosomas aislados de tipo f. En algunos casos, los exosomas aislados del tipo f comprenden uno o más marcadores (por ejemplo, proteínas) seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2. En algunos casos, los exosomas aislados de tipo f comprenden 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de estos marcadores. En algunos casos, cuando un exosoma "comprende" un marcador particular, se indica que el exosoma contiene niveles detectables (por ejemplo, como se ha determinado por transferencia Western) del marcador y/o niveles suficientes para provocar una cierta respuesta en una célula diana o tejido o provocar una cierta respuesta en un sujeto en el contexto de los métodos de tratamiento que se describen en el presente documento. Algunos de estos marcadores (por ejemplo, proteínas) que se pueden encontrar en los exosomas de tipo f comprenden parte de la superfamilia de FGF/PDGF de factores de crecimiento. La vía de señalización de FGF/PDGF participa en la angiogénesis. Por consiguiente, se cree que los exosomas de tipo f (por ejemplo, las composiciones de los mismos) son útiles para aumentar la angiogénesis. En algunos casos, los exosomas de tipo f aislados no comprenden uno o marcadores seleccionados del grupo que consiste en ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105. En algunos casos, los exosomas de tipo f no comprenden 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de estos marcadores. En algunos casos, cuando un exosoma "no comprende" un marcador particular, se indica que el exosoma no contiene ningún marcador particular o solo cantidades insignificantes. Por ejemplo, una cantidad insignificante puede ser una cantidad que es indetectable, o una cantidad que es detectable en solo cantidades traza.

Como se ha descrito anteriormente y en los ejemplos, los exosomas de tipo f muestran morfología en forma de copa como se ha determinado por tinción negativa en microscopía electrónica de transmisión. En algunos casos, los exosomas de tipo f tienen un diámetro de aproximadamente 10-250 nm, aproximadamente 20-230 nm, o aproximadamente 30-200 nm. En algunas realizaciones, los exosomas de tipo f tienen un diámetro no inferior a 100 nm.

Los exosomas, que incluyen tanto los exosomas de tipo a como de tipo f, se producen por varios tipos diferentes de células, que incluyen, pero no se limitan a, MSC, fibroblastos y macrófagos. Los métodos de obtención de dichas células son bien conocidos en la técnica. Las fuentes de MSC se describen con más detalle en el presente documento.

La divulgación también contempla el uso de exosomas sintéticos que tienen algunas o todas las características de los exosomas aislados descritos en el presente documento. Estos exosomas sintéticos se sintetizarían in vitro (en vez de derivados y aislados de células o medio acondicionado). Pueden ser liposomas sintéticos que tienen uno o más, que incluyen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más de las proteínas proporcionadas en el presente documento. Pueden o pueden no comprender ácidos nucleicos que codifican una o más, que incluyen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más de estas proteínas. La síntesis de liposomas se conoce en la técnica, y los liposomas se pueden comprar de fuentes comerciales. Se debe entender que las diversas composiciones, formulaciones, métodos y usos descritos en el presente documento que se refieren a exosomas derivados y aislados de células (o medio acondicionado de células), tal como MSC, fibroblastos o macrófagos, también se contemplan en el contexto de exosomas sintéticos.

La divulgación contempla el uso inmediato de los exosomas o alternativamente el almacenamiento a corto y/o largo plazo de los exosomas, por ejemplo, en un estado crioconservado antes de uso. Los inhibidores de la proteinasa se incluyen normalmente en el medio de congelación ya que proporciona integridad de los exosomas durante el almacenamiento a largo plazo. La congelación a -20 °C no es preferible, puesto que está asociada con una elevada pérdida de actividad de los exosomas. La ultracongelación a -80 °C es más preferida, ya que conserva la actividad (véase, por ejemplo, Kidney International (2006) 69, 1471-1476). Se pueden usar aditivos para el medio de congelación para potenciar la conservación de la actividad biológica de los exosomas. Dichos aditivos serán similares a los usados para la crioconservación de células intactas y pueden incluir, pero no se limitan, a DMSO, glicerol y polietilenglicol.

Células

Una célula madre mesenquimatosa (MSC) es una célula progenitora que tiene la capacidad de diferenciarse en células neuronales, adipocitos, condrocitos, osteoblastos, miocitos, tejido cardíaco y otras células endoteliales y epiteliales (véanse, por ejemplo, Wang, Stem Cells 2004;22(7);1330-7; McElreavey; 1991 Biochem Soc Trans (1);29s; Takechi, Placenta, marzo/abril de 1993; 14 (2); 235-45; Takechi, 1993; Kobayashi; Early Human Development; 10 de julio de 1998; 51 (3); 223-33; Yen; Stem Cells; 2005; 23 (1) 3-9). Estas células se pueden definir fenotípicamente por expresión génica o de proteínas. Estas células se han caracterizado por expresar (y así ser positivas para) uno o más de CD13, CD29, CD44, CD49a, b, c, e, f, CD51, CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD102, CD105, CD106, CDw119, CD120a, CD120b, CD123, CD124, CD126, CD127, CD140a, CD166, P75, TGF-bIR, TGF-bIIR, HLA-A, B, C, SSEA-3, SSEA-4, D7 y PD-L1. Estas células también se han caracterizado por no expresar (y así ser negativas para) CD3, CD5, CD6, CD9, CD10, CD11a, CD14, CD15, CD18, CD21, CD25, CD31, CD34, CD36, CD38, CD45, CD49d, CD50, CD62E, L, S, CD80, CD86, CD95, CD117, CD133, SSEA-1 y ABO. Por lo tanto, las MSC se pueden caracterizar fenotípicamente y/o funcionalmente según su potencial diferenciativo.

Las MSC se pueden recoger de varias fuentes que incluyen, pero no se limitan a, médula ósea, sangre, periostio, dermis, sangre del cordón umbilical y/o matriz (por ejemplo, gelatina de Wharton) y placenta. Los métodos de recogida de MSC se describen en mayor detalle en los ejemplos. También se puede hacer referencia a la patente de EE. UU. N.° 5486359 para otros métodos de recogida que se pueden usar en la presente divulgación.

Un fibroblasto es un tipo de célula que sintetiza matriz extracelular y colágeno, la trama estructural (por ejemplo, estroma) para tejidos animales y desempeña una función crítica en la cicatrización. Los fibroblastos son las células más comunes del tejido conjuntivo en animales. Los fibroblastos normalmente tienen un citoplasma ramificado que rodea a un núcleo elíptico moteado que tiene dos o más nucleolos. Los fibroblastos activos pueden ser reconocidos por su abundante retículo endoplásmico rugoso. Los fibroblastos inactivos, que también se denominan fibrocitos, son más pequeños y con forma de huso. Tienen un retículo endoplásmico rugoso reducido.

Las fuentes de fibroblastos incluyen tejidos conjuntivos, tales como tejido conjuntivo laxo, denso, elástico, reticular y adiposo. Además, existen tejidos conjuntivos embrionarios, así como tejidos conjuntivos especializados, que incluyen hueso, cartílago y sangre. Otras fuentes incluyen la piel. Los métodos de aislamiento y cultivo de fibroblastos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Weber et al., "Isolation and Culture of Fibroblasts, Vascular Smooth Muscle, and Endothelial Cells From the Fetal Rat Ductus Arteriosus". Pediatric Research. 2011; 70, 236-241; Huschtscha et al., "Enhanced isolation of fibroblasts from human skin explants." Biotechniques. 2012;53(4):239-44).

En algunas realizaciones, los fibroblastos, o el medio acondicionado de fibroblastos, se usan para la producción y el aislamiento de exosomas como se describe en el presente documento. Los métodos de producción y aislamiento de exosomas de fibroblastos se conocen en la técnica (véanse, por ejemplo, Luga et al., "Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration." Cell. 2012;151 (7):1542-56; Bang et al., "Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy." J Clin Invest. 2014;124(5):2136-46; Hoffman, "Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche." Breast Cancer Research, 2013; 15:310).

Un macrófago es una célula producida por la diferenciación de monocitos en tejidos. Los macrófagos funcionan tanto en la defensa específica (inmunidad innata), como ayudan a iniciar los mecanismo de defensa específicos (inmunidad adaptativa) de los animales vertebrados. Son células fagocíticas especializadas que atacan a las sustancias extrañas, microbios infecciosos y células cancerosas mediante destrucción e ingestión. Están presentes en todos los tejidos vivos y tienen una función en la regeneración. Los macrófagos se pueden identificar por expresión específica de varias proteínas que incluyen CD14, CD40, CD11b, CD64, F4/80 (ratones)/EMR1 (humano), lisozima M, MAC-1/MAC-3 y CD68 por citometría de flujo, tinción inmunohistoquímica, u otros métodos adecuados.

Las fuentes de macrófagos incluyen casi cualquier tejido, y se obtienen fácilmente de sangre y médula ósea. Los métodos de aislamiento y cultivo de macrófagos se conocen bien en la técnica (véanse, por ejemplo, Bennet, 'Isolation and cultivation in vitro of macrophages from various sources in the mouse." Am J Pathol. Jan 1966; 48(1): 165-181; Davies and Gordon, "Isolation and culture of murine macrophages." Methods Mol Biol. 2005;290:91 -103; Weischenfeldt and Porse, "Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications." CSH Protoc. 2008:pdb.prot5080. doi: 10.1101/pdb.prot5080).

En algunas realizaciones, los macrófagos, o el medio acondicionado de macrófagos, se usan para la producción y el aislamiento de exosomas como se describe en el presente documento. Los métodos de producción y aislamiento de exosomas de macrófagos se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Lee et al., "Exosomes derived from human macrophages suppress endothelial cell migration by controlling integrin trafficking." Eur J Immunol. 2014; 44(4):1156-69; Yang et al., "Microvesicles secreted by macrophages shuttle invasion-potentiating microRNAs into breast cancer cells." Mol Cancer. 2011; 10:117; Lee et al., "Exosome release of ADAM15 and the functional implications of human macrophage-derived ADAM15 exosomes." Fa SEB J. 2012;26(7):3084-95).

Las MSC, fibroblastos y/o macrófagos, y así los exosomas derivados de los mismos, contemplados para su uso en los métodos de la divulgación, pueden derivar del mismo sujeto que se va a tratar (y, por lo tanto, se denominarían autólogos al sujeto) o pueden derivar de un sujeto diferente, preferentemente de la misma especie (y, por lo tanto, se denominarían alógenos al sujeto).

Como se usa en el presente documento, se debe entender que los aspectos y las realizaciones de la divulgación se refieren a células, así como a poblaciones de células, a menos que se indique lo contrario. Por lo tanto, donde se cite una célula, se debe entender que también se contempla una población de células, a menos que se indique lo contrario.

Como se usa en el presente documento, una célula aislada (por ejemplo, MSC, fibroblasto y/o macrófago) es una célula que se ha separado físicamente de su entorno natural, que incluye separación física de uno o más componentes de su entorno natural. Por lo tanto, una célula aislada o población de células engloba una célula o una población de células que se ha manipulado in vitro o ex vivo. Como un ejemplo, las células aisladas (por ejemplo, MSC, fibroblastos y/o macrófagos) pueden ser células que se han separado físicamente de al menos 50 %, preferentemente al menos 60 %, más preferentemente al menos 70 %, e incluso más preferentemente al menos 80 % de las células en el tejido del que se recogen las células. En algunos casos, las células aisladas están presentes en una población que es al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % de células como se definen fenotípica y/o funcionalmente en el presente documento. Preferentemente, la relación entre MSC, fibroblastos y/o macrófagos y otras células es elevada en la preparación aislada en comparación con la población de células inicial.

Las MSC se pueden aislar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, de células mononucleares de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, tejido adiposo, tejido placentario, basándose en su adherencia al plástico de cultivo de tejido. Por ejemplo, las MSC se pueden aislar de aspirados de médula ósea comercialmente disponibles. El enriquecimiento de MSC dentro de una población de células se puede lograr usando métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, FACS.

Los medios comercialmente disponibles se pueden usar para el crecimiento, el cultivo y el mantenimiento de MSC, fibroblastos y macrófagos. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Los componentes en dichos medios que son útiles para el crecimiento, el cultivo y el mantenimiento de MSC, fibroblastos y macrófagos incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, vitaminas, una fuente de carbono (natural y no natural), sales, azúcares, hidrolizados derivados de planta, piruvato de sodio, tensioactivos, amoniaco, lípidos, hormonas o factores de crecimiento, tampones, aminoácidos no naturales, precursores de azúcar, indicadores, nucleósidos y/o nucleótidos, butirato o extractos orgánicos, DMSO, productos derivados de animales, inductores génicos, azúcares no naturales, reguladores del pH intracelular, betaína u osmoprotector, oligoelementos, minerales, vitaminas no naturales. Los componentes adicionales que se pueden usar para suplementar un medio de cultivo de tejido comercialmente disponible incluyen, por ejemplo, suero animal (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS), suero de ternero fetal (FCS), suero de caballo (HS)), antibióticos (por ejemplo, que incluyen, pero no se limitan a, penicilina, estreptomicina, neomicina sulfato, anfotericina B, blasticidina, cloranfenicol, amoxicilina, bacitracina, bleomicina, cefalosporina, clortetraciclina, zeocina y puromicina) y glutamina (por ejemplo, L-glutamina). La supervivencia y el crecimiento de las células madre mesenquimatosas también depende del mantenimiento de un entorno aerobio, pH y temperatura apropiados. Las MSC se pueden mantener usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Pittenger et al., Science, 284:143-147 (1999)).

Ciertos aspectos de la divulgación se refieren al inesperado hallazgo de que las condiciones de cultivo pueden favorecer la producción del tipo de exosoma. Por ejemplo, como se describe en los ejemplos, las condiciones de cultivo pueden favorecer la producción de exosomas de tipo a frente a exosomas de tipo f. En algunas realizaciones, el cultivo tridimensional (3D) potencia la producción de exosomas de tipo a con respecto a exosomas de tipo f, en comparación con el cultivo bidimensional tradicional (por ejemplo, monocapa). Los métodos para el cultivo 3D se conocen bien en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, cultivo de gota colgante, cultivo en matrices, cultivo en microvehículos, cultivo en andamiajes extracelulares sintéticos, cultivo en membranas de quitosano, cultivo en levitación magnética, cultivo en suspensión en biorreactores giratorios o cultivo en condiciones de inhibición sin contacto. Véanse, por ejemplo, Haycock JW. 2011). "3D cell culture: a review of current approaches and tehniques". Methods Mol Biol. 695: 1-15; Lee, J; Cuddihy MJ, Kotov NA. (14 de marzo de 2008). Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.. doi:10.1089/teb.2007.0150; Pampaloni, Francesco (octubre de 2007). "The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue''. Nature Reviews 8: 839-845; and Souza, Glauco (14 de marzo de 2010). "Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation". Nature Nanotechnology: 291-296. Además, también se descubrió inesperadamente que la adición de ciertos factores de crecimiento potenciaba la producción de exosomas de tipo a con respecto a exosomas de tipo f. Por ejemplo, la adición de más factores de crecimiento seleccionados de la superfamilia de TGFp (TGFp1, activinas, b Mp , g Df , GDNF, inhibinas, Nodal, Lefty, MIS) EGF, PDGF o FGF puede potenciar la producción de exosomas de tipo a con respecto a exosomas de tipo f.

En algunas realizaciones, la potenciación (por ejemplo, en el contexto de cultivo 3D y/o adición de factor de crecimiento) comprende un aumento de 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, 5,0 veces, 5,5 veces, 6,0 veces, 6,5 veces, 7,0 veces, 7,5 veces, 8,5 veces, 9,0 veces, 9,5 veces, 10,0 veces, 12,0 veces, 15,0 veces o 20,0 veces o más de exosomas de tipo a con respecto a exosomas de tipo f.

Sujetos

Los métodos de la divulgación se pueden realizar en cualquier sujeto susceptible de beneficiarse de ellos, que incluyen sujetos humanos, ganado agrícola (por ejemplo, vacas, cerdos, etc.), animales preciados (por ejemplo, caballos), animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos, etc.) y similares. En diversos casos de la divulgación, se prefieren sujetos humanos. En algunos casos, se usan sujetos humanos y exosomas de MSC humanas.

Los sujetos pueden ser aquellos que tienen una enfermedad (o afección) descrita en el presente documento tributarios de tratamiento usando los exosomas descritos en la presente divulgación, o pueden ser aquellos que están en riesgo de desarrollar dicha enfermedad (o afección). Dichos sujetos incluyen neonatos y particularmente neonatos nacidos en una baja edad gestacional. Como se usa en el presente documento, un neonato humano se refiere a un humano desde el momento del nacimiento hasta aproximadamente 4 semanas de edad. Como se usa en el presente documento, un lactante humano se refiere a un humano desde aproximadamente la edad de 4 semanas de edad hasta aproximadamente 3 años de edad. Como se usa en el presente documento, baja edad gestacional se refiere al nacimiento (o parto) que ocurre antes de un término gestacional normal para una especie dada. En los seres humanos, un término gestacional completo es aproximadamente 40 semanas y puede variar de 37 semanas a más de 40 semanas. Baja edad gestacional, en seres humanos, similar a un nacimiento prematuro, se define como la que se produce antes de las 37 semanas de gestación. Por lo tanto, la divulgación contempla la prevención y/o el tratamiento de sujetos nacidos antes de las 37 semanas de gestación, que incluye los nacidos incluso en términos gestacionales más cortos (por ejemplo, antes de 36, antes de 35, antes de 34, antes de 33, antes de 32, antes de 31, antes de 30, antes de 29, antes de 28, antes de 27, antes de 26 o antes de 25 semanas de gestación). Normalmente, dichos recién nacidos prematuros se tratarán como neonatos; sin embargo, la divulgación contempla su tratamiento incluso más allá del periodo de neonato y en la infancia y/o adultez. Ciertos sujetos pueden tener una predisposición genética a ciertas formas de las enfermedades (o afecciones) descritas en el presente documento, tales como, por ejemplo, hipertensión pulmonar, y los sujetos también se pueden tratar según la divulgación.

Métodos de prevención y tratamiento de enfermedades

La divulgación contempla la prevención y el tratamiento de ciertas enfermedades o trastornos. La prevención de una enfermedad significa la reducción de la probabilidad de que la enfermedad se manifieste en sí y/o el retraso de la aparición de la enfermedad. El tratamiento de una enfermedad significa la reducción o la eliminación de los síntomas de la enfermedad. Como se describe en el presente documento, los exosomas del tipo a comprenden componentes de señalización funcionales de la vía de TGF/BMP, y son terapéuticamente eficaces en el tratamiento de trastornos que implican a esta vía. Dichos trastornos incluyen ciertos trastornos pulmonares y vasculares, como se describen en el presente documento (véase, por ejemplo, Cai et al., "BMP signaling in vascular diseases" FEBS Lett. 2012 (14):1993-2002.; Davies et al., 'TGF-p/BMP Signaling in Pulmonary Vascular disease." Vascular Complications in Human Disease. Springer, 2008, pp 46-59; Alejandre-Alcázar et al., "Hyperoxia modulates TGF-beta/BMP signaling in a mouse model of bronchopulmonary dysplasia." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2007; 292(2):L537-49; Stumm et al., "Lung Remodeling in a Mouse Model of Asthma Involves a Balance between TGF-p1 and BmP-7." PLoS One.

2014; DOI: 10.1371/jornal.phone.0095959).

De hecho, como se demuestra en los ejemplos, el tratamiento de ratones por inyección i.v. de preparaciones de exosomas de tipo a reguló por disminución la activación hipóxica de la señalización asociada a remodelación vascular e hipertensión pulmonar y mejoró la inflamación pulmonar inducida por hipoxia.

Por consiguiente, la divulgación proporciona composiciones y métodos de prevención y/o tratamiento de varias enfermedades de los pulmones (o pulmonares). Estas enfermedades incluyen enfermedades pulmonares inflamatorias, tales como, pero no se limitan a, hipertensión pulmonar (HP) que también se denomina hipertensión de las arterias pulmonares (HAP), asma, displasia broncopulmonar (DBP), alergias, sarcoidosis y fibrosis pulmonar idiopática. Estas enfermedades también incluyen enfermedades vasculares de los pulmones que pueden no tener un componente inflamatorio. Todavía otras afecciones pulmonares que se pueden tratar según la divulgación incluyen lesión pulmonar aguda que se puede asociar a septicemia o a la ventilación. Un ejemplo de esta última afección es el síndrome disneico agudo que ocurre en niños mayores y adultos.

La hipertensión pulmonar es una enfermedad del pulmón caracterizada por tensión arterial en la arteria pulmonar que está muy por encima de los niveles normales. Los síntomas incluyen disnea, dolor torácico, particularmente durante la actividad física, debilidad, cansancio, desmayo, ligero aturdimiento, particularmente durante el ejercicio, mareos, ruidos cardíacos anormales y soplos, congestión de la vena yugular, retención de líquido en el abdomen, las piernas y los tobillos, y coloración azulada en el lecho ungueal.

La displasia broncopulmonar es una afección que afecta a los neonatos a los que se les ha puesto oxígeno o han estado conectados a respiradores, o a los neonatos que han nacido prematuramente, particularmente a los nacidos muy prematuramente (por ejemplo, los nacidos antes de las 32 semanas de gestación). También se denomina enfermedad pulmonar crónica neonatal. Las causas de la DBP incluyen lesión mecánica, por ejemplo, como resultado de ventilación, toxicidad del oxígeno, por ejemplo, como resultado de terapia con oxígeno, e infección. La enfermedad puede evolucionar de no inflamatoria a inflamatoria con el tiempo. Los síntomas incluyen piel azulada, tos crónica, taquipnea y disnea. Los sujetos que tienen DBP son más susceptibles a infecciones, tales como infección por el virus respiratorio sincitial. Los sujetos que tienen DBP pueden desarrollar hipertensión pulmonar.

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), también conocido como síndrome de dificultad respiratoria (SDR) o síndrome disneico del adulto, es una afección que surge como resultado de una lesión a los pulmones o enfermedades agudas. La lesión al pulmón puede ser el resultado de ventilación, traumatismo, quemaduras y/o aspiración. Las enfermedades agudas pueden ser neumonía infecciosa o septicemia. Se considera una forma grave de la lesión pulmonar aguda, y es frecuentemente mortal. Se caracteriza por inflamación del pulmón, alteración del intercambio de gases y liberación de mediadores inflamatorios, hipoxemia e insuficiencia multiorgánica. El SDRA también se puede definir como la relación de la presión parcial arterial del oxígeno (PaO²) como una fracción de oxígeno inspirado (FiO²) inferior a 200 mmHg en presencia de infiltrados bilaterales en la radiografía del tórax. Una relación PaO²/FiO²inferior a 300 mmHg con infiltrados bilaterales indica lesión pulmonar aguda, que es frecuentemente un precursor de la SDRA. Los síntomas de la SDRA incluyen disnea, taquipnea y confusión mental debida a bajo niveles de oxígeno.

La fibrosis pulmonar idiopática se caracteriza por cicatrización o engrosamiento de los pulmones sin una causa conocida. Ocurre casi siempre en personas de 50-70 años de edad. Sus síntomas incluyen disnea, tos regular (normalmente una tos seca), dolor torácico y disminución del nivel de actividad.

La alergia es un trastorno de hipersensibilidad del sistema inmunitario, con síntomas que incluyen ojos rojos, prurito y rinorrea, eccema, ronchas o un ataque de asma. Las alergias desempeñan una función importante en afecciones tales como el asma. Las graves alergias a alérgenos medioambientales o dietéticos o a la medicación pueden dar como resultado reacciones potencialmente mortales denominadas anafilaxia. Las reacciones alérgicas pueden ocurrir cuando el sistema inmunitario de una persona reacciona a lo que es frecuentemente una sustancia normalmente inocua en el entorno. La alergia es una de las cuatro formas de hipersensibilidad y se denomina algunas veces hipersensibilidad de tipo I (o inmediata). Las reacciones alérgicas son distintivas, debido a la excesiva activación de ciertos glóbulos blancos (mastocitos y basófilos) por la inmunoglobulina E (IgE). Esta reacción produce una respuesta inflamatoria que puede variar de molestia leve a peligrosa. Hay una variedad de pruebas para diagnosticar las afecciones alérgicas. Las pruebas incluyen poner posibles alérgenos sobre la piel y buscar una reacción, tal como hinchazón y análisis de sangre para buscar una IgE específica de alérgeno.

La inflamación pulmonar inducida por hipoxia es una afección frecuentemente resultante de la lesión pulmonar aguda y/o SDRA, por lo que una respuesta inflamatoria resulta de la exposición prolongada a afecciones hipóxicas. Dicha respuesta inflamatoria incluye macrófagos, neutrófilos y citocinas inflamatorias elevados, que incluyen IL-1 p, IL-6, IL-8 y TNF-a, en el líquido de lavado broncoalveolar de seres humanos expuestos a hipoxia hipobárica.

Otros trastornos que son tributarios de tratamiento usando los exosomas de tipo a, por ejemplo, aumentando la vía de TGF/BMP, incluyen trastornos cardiovasculares, por ejemplo, infarto de miocardio, enfermedad cardiovascular, hipertensión, aterosclerosis e insuficiencia cardíaca (véanse, por ejemplo, Pardali et al., "TGFp Signaling and Cardiovascular Diseases." Int J Biol Sci 2012; 8(2): 195-213; Garside et al., "Coordinating Notch, BMP, and TGF-p signaling during heart valve development." Cell Mol Life Sci. 2013; 70(16):2899-917; Wang et al., "Bmp Signaling in Congenital Heart Disease: New Developments and Future Directions." Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2011; 91(6): 441-448; Ruiz-Ortega et al., "TGF-beta signaling in vascular fibrosis." Cardiovasc Res. 2007; 1 ;74(2):196-206; Bujak et al., "The role of TGF-p Signaling in Myocardial Infarction and Cardiac Remodeling." Cardiovasc Res. 2007; 74(2): 184-195; Chang et al., "Impact of myocardial infarct proteins and oscillating pressure on the differentiation of mesenchymal stem cells: effect of acute myocardial infarction on stem cell differentiation." Stem Cells. 2008; 26(7): 1901 -12; Koitabashi et al., "Pivotal role of cardiomyocyte TGF-p signaling in the murine pathological response to sustained pressure overload." J Clin Invest. 2011 ;121 (6):2301 -2312; y Blann et al., "Serum levels of the TGF-beta receptor are increased in atherosclerosis." Atherosclerosis. 1995;120(1-2):221-6).

El infarto de miocardio es el término médico para un acontecimiento comúnmente conocido como un infarto de miocardio. El infarto de miocardio ocurre cuando la sangre deja de circular apropiadamente a parte del corazón y el músculo del corazón se lesiona debido a que no recibe oxígeno suficiente. Esto es normalmente causado cuando una de las arterias coronarias que suministra sangre al corazón desarrolla un bloqueo debido a una formación inestable de glóbulos blancos, colesterol y grasa. El acontecimiento se denomina "agudo" si es repentino y grave. Los síntomas de un infarto agudo de miocardio incluyen dolor torácico repentino, que se siente detrás del esternón y que algunas veces se desplaza al brazo izquierdo o al lado izquierdo del cuello. Además, el individuo puede tener disnea, sudoración, náuseas, vómitos, latidos cardíacos anormales y ansiedad. Las mujeres padecen menos de estos síntomas que los hombres, pero normalmente tienen disnea, debilidad, una sensación de indigestión y cansancio.

La enfermedad cardiovascular se refiere a cualquier enfermedad que afecte al sistema cardiovascular, principalmente a enfermedad cardíaca, enfermedades vasculares del cerebro y riñón, y enfermedad arterial periférica. Las causas de la enfermedad cardiovascular son diversas, pero la aterosclerosis y/o la hipertensión son las más comunes. Además, con el envejecimiento se producen varios cambios fisiológicos y morfológicos que alteran la función cardiovascular y conducen a un aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular, incluso en individuos asintomáticos sanos.

La aterosclerosis es una forma específica de la arteriosclerosis en la que se engrosa una pared de la arteria como resultado de invasión y acumulación de glóbulos blancos y que contiene tanto WBC activos vivos (inflamación) como remanentes de células muertas, que incluyen colesterol y triglicéridos, con el tiempo calcio y otros materiales cristalizados, dentro de la placa más externa y antigua. Estos cambios reducen la elasticidad de las paredes de las arterias, pero no afectan la circulación sanguínea durante décadas debido a que la pared muscular de la arteria se ensancha en las localizaciones de la placa. Sin embargo, la rigidización de la pared puede aumentar con el tiempo la tensión diferencial; siendo el aumento de la tensión diferencial un posible resultado de enfermedad avanzada dentro de las principales arterias. Los síntomas pueden resultar de un marcado estrechamiento de las arterias coronarias, que son responsables de llevar la sangre oxigenada al corazón, produciendo síntomas tales como el dolor torácico de la angina y disnea, sudoración, náuseas, mareos o un ligero aturdimiento, falta de aliento o palpitaciones. El considerable estrechamiento de las arterias carótidas también se puede presentar con síntomas tales como una sensación de debilidad, no siendo capaces de pensar con claridad, dificultad al hablar, mareos y dificultad al caminar o mantenerse erguido, visión borrosa, adormecimiento de la cara, los brazos y las piernas, fuerte dolor de cabeza y pérdida del conocimiento. Estos síntomas también están relacionados con accidente cerebrovascular, es decir, muerte de las células del cerebro. El accidente cerebrovascular es causado por un considerado estrechamiento/cierre de las arterias que van al cerebro; ausencia de riego sanguíneo adecuado que conduce a la muerte de las células del tejido afectado. Las arterias periféricas, que suministran sangre a las piernas, los brazos y la pelvis, también experimentan un marcado estrechamiento debido a la rotura de placas y coágulos. Los síntomas del considerado estrechamiento son entumecimiento dentro de los brazos o las piernas, así como dolor. Otra localización significativa para la formación de placas son las arterias renales, que suministran sangre a los riñones. La manifestación y acumulación de placas conduce a una reducción del flujo sanguíneo al riñón y a enfermedad renal crónica, que, al igual que otras áreas, normalmente son asintomáticas hasta estadios tardíos.

La hipertensión o la alta tensión arterial, algunas veces denominada hipertensión arterial, es una afección médica crónica en la que la tensión arterial en las arterias es elevada. La hipertensión se clasifica como hipertensión primaria (esencial) o hipertensión secundaria; aproximadamente el 90-95 % de los casos se clasifica como "hipertensión primaria", que significa hipertensión arterial sin causa médica subyacente. El 5-10 % de los casos restantes (hipertensión secundaria) es causada por otras afecciones que afectan a los riñones, las arterias, el corazón o el sistema endocrino. La hipertensión sobrecarga al corazón, que conduce a enfermedad cardíaca hipertensora y a enfermedad de las arterias coronarias si no se trata. La hipertensión también es un factor importante de riesgo para el accidente cerebrovascular, las aneurismas de las arterias (por ejemplo, aneurisma aórtica), la enfermedad arterial periférica y es una causa de la enfermedad renal crónica. La hipertensión va raramente acompañada de síntomas, y su identificación es normalmente mediante cribado, o cuando se busca asistencia sanitaria para un problema no relacionado. Una proporción de personas con hipertensión arterial notifican cefaleas (particularmente en la parte posterior de la cabeza y por las mañanas), así como mareo leve, vértigo, acúfenos (zumbido o silbido en los oídos), alteraciones visuales o episodios de desmayo.

La insuficiencia cardíaca, usada frecuentemente para significar la insuficiencia cardíaca crónica, ocurre cuando el corazón es incapaz de proporcionar acción de bombeo suficiente para mantener la circulación sanguínea para cumplir las necesidades del cuerpo. Cuando está presente edema además de lo anterior, se denomina insuficiencia congestiva del corazón (CHF) o insuficiencia cardíaca congestiva (CCF). La insuficiencia cardíaca puede causar varios síntomas que incluyen disnea, hinchazón de las piernas e intolerancia al ejercicio. Las causas comunes de la insuficiencia cardíaca incluyen infarto de miocardio (ataque al corazón) y otras formas de enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, enfermedad cardíaca valvular y cardiomiopatía. El término insuficiencia cardíaca se usa algunas veces incorrectamente para el infarto de miocardio (que puede causar insuficiencia cardíaca, pero no es insuficiencia cardíaca en sí) o para el paro cardíaco (en el que la circulación sanguínea se detiene eficazmente por completo).

Todavía otros trastornos que son tributarios de tratamiento usando los exosomas de tipo a, por ejemplo, por aumento de la vía de TGF/BMP, incluyen trastornos renales, por ejemplo, lesión renal isquémica, insuficiencia renal aguda y fibrosis renal (véanse, por ejemplo, Meng et al., "Role of the TGF-p/BMP-7/Smad pathways in renal diseases." Clin Sci (Lond). 2013;124(4):243-54; Zerisberg et al., "BMP-7 counteracts TGF-beta1-induced epithelial-to-mesenchymal transition and reverses chronic renal injury." Nat Med. 2003;9(7):964-8; y Yanagita, "Inhibitors/antagonists of TGF-p system in kidney fibrosis." Nephrol Dial Transplant. 2012; 27(10):3686-91).

La lesión renal isquémica o nefropatía isquémica ocurre cuando existe circulación sanguínea inadecuada (hipoperfusión) a los riñones. La hipoperfusión puede dar como resultado la pérdida de función renal y atrofia renal (encogimiento). La insuficiencia renal resulta cuando este proceso daña a ambos riñones. Una de las siguientes situaciones clínicas se presenta frecuentemente en la nefropatía isquémica: estenosis de las arterias renales bilaterales (RAS; un estrechamiento de las grandes arterias que suministran a ambos riñones); RAS unilateral en una persona que solo tiene un riñón funcional; o RAS unilateral con daño hipertensor (hipertensión arterial) al otro riñón. Los síntomas de la lesión renal isquémica incluyen uremia (altos niveles en sangre de subproductos de proteína, tales como urea); episodios agudos de disnea (respiración fatigosa o dificultad para respirar) causados por la acumulación súbita de líquido en los pulmones; y la hipertensión puede estar presente, dependiendo de la gravedad de la lesión. Los soplos periféricos (ruido o soplos escuchados con un estetoscopio) causados por la circulación sanguínea turbulenta dentro de las arterias se pueden detectar en el cuello (soplo de la arteria carótida), abdomen (que puede reflejar un estrechamiento de la arteria renal) e ingle (soplo de la arteria femoral).

La insuficiencia renal aguda o lesión renal aguda (LRA), es una pérdida brusca de la función renal que normalmente se desarrolla en 7 días. En general, ocurre como resultado de daño al tejido renal causado por una disminución de la circulación sanguínea renal (isquemia renal) de cualquier causa (por ejemplo, baja tensión arterial), exposición a sustancias perjudiciales para el riñón, un proceso inflamatorio en el riñón, o una obstrucción de las vías urinarias que impide el flujo de orina. La insuficiencia renal aguda se diagnostica basándose en datos característicos de laboratorio, tales como nitrógeno ureico en sangre y creatinina elevado, o incapacidad de los riñones para producir cantidades suficientes de orina. La insuficiencia renal aguda puede conducir a varias complicaciones, que incluyen acidosis metabólica, niveles elevados de potasio, uremia, cambios en el equilibrio de los líquidos corporales y efectos a otros sistemas de órganos. Los síntomas de la lesión renal aguda incluyen acumulación de urea y otras sustancias que contienen nitrógeno en la circulación sanguínea conducen a varios síntomas, tales como cansancio, pérdida de apetito, cefalea, náuseas y vómitos. El aumento en el nivel de potasio puede conducir a irregularidades en los latidos del corazón, que pueden ser graves y potencialmente mortales. El equilibrio de líquidos está afectado frecuentemente, aunque la hipertensión es rara. Se encuentra dolor en los flancos en algunas afecciones (por ejemplo, trombosis de los vasos sanguíneos renales o inflamación del riñón); este es el resultado del estrechamiento de la cápsula de tejido fibroso que rodea al riñón. Si la lesión al riñón es el resultado de deshidratación, puede haber sed, así como evidencia de agotamiento de líquidos en la exploración física. La exploración física también puede proporcionar otras claves en cuanto a la causa subyacente al problema renal, tal como una urticaria en la nefritis intersticial y una vejiga palpable. La reducción de la capacidad para eliminar líquido suficiente del cuerpo puede causar una acumulación de líquido en las extremidades (edema periférico) y los pulmones (edema pulmonar), así como taponamiento cardíaco como resultado de efusiones de líquido.

La fibrosis renal resulta de una excesiva acumulación de matriz extracelular que ocurre en prácticamente cada tipo de enfermedad renal crónica. La patogénesis de la fibrosis renal es un proceso progresivo que normalmente conduce a insuficiencia renal terminal. En algunos aspectos, la fibrosis renal representa un proceso de cicatrización fallido del tejido renal después de una lesión crónica sostenida. Se han identificado muchas vías celulares, por ejemplo, activación mesangial y de fibroblastos, así como la transición epitelial-mesenquimatosa tubular, como la principal causa de generación de células productoras de matriz en condiciones de enfermedad. Los factores fibrogénicos que regulan el proceso fibrótico renal, tales como el factor de crecimiento transformante (TGF), contribuyen a la afección. Descubrimientos recientes sobre los factores antifibróticos endógenos han desarrollado estrategias novedosas que pretenden antagonizar la acción fibrogénica de la señalización de TGF-/Smad.

Aún otros trastornos que son tributarios de tratamiento usando los exosomas de tipo a, por ejemplo, aumentando la vía de TGF/BMP, incluyen trastornos neurales isquémicos, tales como encefalopatía isquémica hipóxica o accidente cerebrovascular isquémico (véanse, por ejemplo, Harvey et al., "Stroke and TGF-beta proteins: glial cell line-derived neurotrophic factor and bone morphogenetic protein." Pharmacol Ther. 2005; 105(2): 113-25; Krampert et al., "Smad7 regulates the adult neural stem/progenitor cell pool in a transforming growth factor beta- and bone morphogenetic protein-independent manner." Mol Cell Biol. 2010; 30(14):3685-94; y Yin et al., "Effect of hyperbaric oxygen on neurological recovery of neonatal rats following hypoxicischemic brain damage and its underlying mechanism." Int J Clin Exp Pathol. 2013; 6(1): 66-75).

La encefalopatía isquémica hipóxica (EIH) o asfixia perinatal se caracteriza por evidencia clínica y de laboratorio de lesión cerebral aguda o subaguda debida a asfixia. Las causas principales de esta afección son hipoxemia sistémica y/o circulación sanguínea cerebral reducida. La asfixia perinatal provoca 840.000 o el 23 % de todas las muertes neonatales en todo el mundo. Los signos y síntomas de la encefalopatía hipóxica-isquémica leve incluyen: tono muscular que es ligeramente elevado; y se pueden observar anomalías conductuales transitorias (tales como mala alimentación, irritabilidad o llanto excesivo o insomnio). Los síntomas de la encefalopatía hipóxica-isquémica moderadamente intensa incluyen: el lactante está aletargado, con una significativa hipotonía y reducidos reflejos tendinosos profundos; el reflejo de prensión, de Moro y de succión pueden ser muy lentos o ausentes; el lactante puede experimentar periodos de apnea ocasionales; y las convulsiones pueden ocurrir en las primeras 24 horas después del parto. Los síntomas de la encefalopatía hipóxica-isquémica grave incluyen convulsiones que son retardadas e intensas y que pueden ser inicialmente resistentes a tratamientos convencionales. Las convulsiones son normalmente generalizadas, y su frecuencia puede aumentar durante las 24-48 horas después de la aparición, que se relaciona con una fase de lesión por reperfusión. Otros síntomas incluyen: estupor o coma (el lactante puede no responder a ningún estímulo físico, excepto a los más dañinos); respiración irregular; hipotonía generalizada y reflejos tendinosos profundos deprimidos; ausencia de reflejos neonatales (por ejemplo, de succión, de deglución, de prensión, de Moro); alteraciones del movimiento ocular (por ejemplo, una desviación distorsionada de los ojos, nistagmo, nistagmo vertical); pupilas dilatadas, fijas o poco reactivas a la luz; e irregularidades de la frecuencia cardíaca y tensión arterial.

El accidente cerebrovascular isquémico es la pérdida de función cerebral debido a una alteración en el riego sanguíneo al cerebro. La isquemia se provoca por o un bloqueo de un vaso sanguíneo por trombosis o embolia arterial, o por hipoperfusión cerebral. Como resultado, el área afectada del cerebro no puede funcionar normalmente, que podría dar como resultado una incapacidad para mover una o más extremidades en un lado del cuerpo, falta de comprensión o formulación de un discurso, o una alteración de la visión de un lado del campo visual.

La prevención y/o el tratamiento puede implicar en algunos casos el uso de los exosomas de tipo a solos o junto con uno o más agentes secundarios. Los sujetos también se pueden someter a intervenciones mecánicas, tales como ventilación con o sin administración exógena de oxígeno.

Con respecto a los neonatos y particularmente los neonatos de baja edad de gestación, la divulgación contempla la administración de exosomas de tipo a en 4 semanas, 3 semanas, 2 semanas, 1 semana, 6 días, 5 días, 4 días, 3 días, 2 días, 1 día, 12 horas, 6 horas, 3 horas o 1 hora desde el nacimiento. En algunos caos importantes, los exosomas de tipo a se administran en 1 hora desde el nacimiento.

La divulgación contempla además la administración de exosomas de tipo a incluso en ausencia de síntomas indicativos de una enfermedad o trastorno como se describe en el presente documento.

La divulgación también contempla la administración repetida de exosomas de tipo a, que incluye dos, tres, cuatro, cinco o más administraciones de exosomas de tipo a. En algunos casos, los exosomas de tipo a se pueden administrar continuamente. La administración repetida o continua puede ocurrir durante un periodo de varias horas (por ejemplo, 1-2, 1-3, 1-6, 1-12, 1-18 o 1-24 horas), varios días (por ejemplo, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6 días o 1-7 días) o varias semanas (por ejemplo, 1-2 semanas, 1-3 semanas o 1-4 semanas) dependiendo de la gravedad de la afección que está tratándose. Si la administración se repite pero no es continua, el tiempo entre las administraciones puede ser de horas (por ejemplo, 4 horas, 6 horas o 12 horas), días (por ejemplo, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días o 6 días) o semanas (por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas). El tiempo entre las administraciones puede ser el mismo o se puede diferenciar. Como un ejemplo, si los síntomas de la enfermedad parecen estar empeorando, los exosomas de tipo a se pueden administrar más frecuentemente, y entonces una vez los síntomas se han estabilizado o reducido, los exosomas de tipo a se pueden administrar menos frecuentemente.

En algunos casos importantes, los exosomas de tipo a se administran al menos una vez en las 24 horas desde el nacimiento y luego al menos una vez más en 1 semana desde el nacimiento. Incluso más preferentemente, los exosomas de tipo a se administran al menos una vez en 1 hora desde el nacimiento y luego al menos una vez más en 3-4 días desde el nacimiento.

En algunos casos, puede ocurrir la administración intravenosa repetida de bajas dosis de exosomas de tipo a. Por consiguiente, la divulgación contempla la administración repetida de formas de baja dosis de exosomas de tipo a, así como administraciones únicas de formas de alta dosis de exosomas de tipo a. Las formas de baja dosis pueden variar desde, sin limitación, 1 -50 microgramos por kilogramo, mientras que las formas de alta dosis pueden variar desde, sin limitación, 51 -1000 microgramos por kilogramo. Se entenderá que, dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la salud del sujeto y la vía de administración, entre otros, la divulgación contempla la administración única o repetida de exosomas de tipo a de baja o alta dosis.

Administración, composiciones farmacéuticas, cantidades eficaces

Los exosomas de tipo a se pueden usar (por ejemplo, administrar) en preparaciones farmacéuticamente aceptables (o composiciones farmacéuticamente aceptables), normalmente cuando se combinan con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas preparaciones pueden contener habitualmente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes de tamponamiento, conservantes, vehículos compatibles, y pueden comprender opcionalmente otros agentes terapéuticos (es decir, secundarios).

Un vehículo farmacéuticamente aceptable es un material farmacéuticamente aceptable, composición o vehículo, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, que participa en llevar o transportar un agente profilácticamente o terapéuticamente activo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación y no nocivo para el sujeto. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ásteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agentes de tamponamiento, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; agua sin pirógenos; solución salina isotónica; disolución de Ringer; alcohol etílico; disoluciones de tampón fosfato; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en las formulaciones farmacéuticas.

Agentes terapéuticos secundarios. Los exosomas se pueden administrar con uno o más agentes terapéuticos secundarios. Como se usa en el presente documento, un agente terapéutico se refiere a cualquier agente que se puede usar en la prevención, el tratamiento y/o el abordaje de una enfermedad de los pulmones, tales como las tratadas en el presente documento. Estos incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos, óxido nítrico inhalado, bismesilato de almitrina, inmunomoduladores y antioxidantes. Los ejemplos de inmunomoduladores incluyen esteroides y corticosteroides, tales como, pero no se limitan a, metilprednisolona. Los ejemplos de antioxidantes incluyen, pero no se limitan a, superóxido dismutasa.

Ciertos agentes terapéuticos secundarios usados en el tratamiento o el abordaje de ciertas enfermedades de los pulmones y vasculares que incluyen, pero no se limitan a, hipertensión pulmonar, incluyen oxígeno, anticoagulantes, tales como warfarina (Coumadin); diuréticos, tales como furosemida (Lasix®) o espironolactona (Aldactone®); bloqueantes de los canales de calcio; potasio, tal como K-dur®; agentes inotrópicos, tales como digoxina; vasodilatadores, tales como nifedipino (Procardia®) o diltiazem (Cardizem®); antagonistas de los receptores de la endotelina, tales como bosentán (Tracleer®) y ambrisentán (Letairis®); análogos de prostaciclina, tales como epoprostenol (Flolan®), treprostinil sodio (Remodulin®, Tyvaso®) e iloprost (Ventavis®); e inhibidores de PDE-5, tales como sildenafilo (Revatio®) y tadalafilo (Adcirca®).

Tensioactivos. Los exosomas de tipo a se pueden administrar con tensioactivos pulmonares. Un tensioactivo pulmonar es una mezcla de lipoproteínas útil en mantener abiertas las vías respiratorias pulmonares (por ejemplo, previniendo la adherencia de las paredes alveolares entre sí). Los tensioactivos pulmonares pueden estar comprendidos de fosfolípidos, tales como dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), fosfotidilcolina (PC), fosfotidilglicerol (PG); colesterol; y proteínas, tales como SP-A, B, C y D. Los tensioactivos pulmonares pueden derivar de fuentes que existen de forma natural, tales como tejido de pulmón bovino o porcino. Los ejemplos incluyen Alveofact™ (de lavado pulmonar de vaca), Curosurf™ (de pulmón de cerdo picado), Infasurf™ (de lavado de pulmón de ternera) y Survanta™ (de pulmón de vaca picado, con componentes adicionales que incluyen DPPC, ácido palmítico y tripalmitina). Los tensioactivos pulmonares también pueden ser sintéticos. Los ejemplos incluyen Exosurf™ (que comprende DPPC con hexadecanol y tiloxapol), Pumactant™ o compuesto artificial expansor de pulmones (ALEC) (que comprende DPPC y PG), KL-4 (que comprende DPPC, palmitoil-oleoil fosfatidilglicerol, ácido palmítico y péptido sintético que imita a SP-B), Venticute™ (que comprende DPPC, PG, ácido palmítico y SP-C recombinante). Los tensioactivos pulmonares pueden ser obtenidos de proveedores comerciales.

Cantidades eficaces. Las preparaciones de la divulgación se administran en cantidades eficaces. Una cantidad eficaz es aquella cantidad de un agente que sola estimula el resultado deseado. La cantidad absoluta dependerá de una variedad de factores, que incluyen el material seleccionado para la administración, si la administración es en dosis únicas o dosis múltiples, y los parámetros individuales del paciente que incluyen edad, estado físico, tamaño, peso y el estadio de la enfermedad. Estos factores son bien conocidos por los expertos habituales en la técnica y pueden ser tratados con no más de experimentación rutinaria.

Vía de administración. Los exosomas de tipo a se pueden administrar por cualquier vía que efectúe la administración a los pulmones u otros tejidos. Son adecuadas las vías de administración sistémicas, tales como inyección intravenosa en embolada o infusión continua. Vías más directas, tales como administración intranasal, administración intratraqueal (por ejemplo, por intubación) e inhalación (por ejemplo, por un aerosol a través de la boca o la nariz) también se contemplan por la divulgación y en algunos casos pueden ser más apropiadas particularmente donde sea necesaria una acción rápida. Como se usa en el presente documento, un aerosol es una suspensión de líquido dispersada como pequeñas partículas en un gas, e incluye una fina niebla o una pulverización que contiene dichas partículas. Como se usa en el presente documento, la aerosolización es el proceso de producción de un aerosol transformando una suspensión líquida en pequeñas partículas o gotitas. Esto se puede hacer usando un sistema de administración de aerosol, tal como un envase presurizado o un nebulizador. Los nebulizadores incluyen nebulizadores de chorro de aire (es decir, neumáticos), ultrasónicos y de malla vibratoria, por ejemplo con el uso de un propulsor apropiado, tal como, pero no se limita a, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. Además de los nebulizadores, otros dispositivos para administración pulmonar incluyen, pero no se limitan a, inhaladores de dosis medidas (MDI) e inhaladores de polvo seco (DPI). Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contiene exosomas liofilizados y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Los exosomas, cuando se desea administrarlos por vía sistémica, se pueden formular para administración parenteral por inyección, que incluye, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multi-dosis, con o sin un conservante añadido.

Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones solubles en agua, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores adecuados o agentes que aumentan la solubilidad. Alternativamente, los exosomas pueden estar en forma liofilizada u otra forma de polvo o sólida para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril, antes de uso.

Se debe entender que otros agentes a administrar a los sujetos que están tratándose según la divulgación se pueden administrar por cualquier vía adecuada, que incluye administración por vía oral, administración intranasal, administración intratraqueal, inhalación, administración intravenosa, etc. Los expertos habituales en la técnica conocerán las vías de administración habituales para dichos agentes secundarios.

Kits

La divulgación también engloba un producto farmacéutico envasado y etiquetado. Este artículo o kit de fabricación incluye la forma farmacéutica unitaria apropiada en un envase o recipiente apropiado, tal como un vial de vidrio o ampolla de plástico, u otro recipiente que está herméticamente cerrado. La forma farmacéutica unitaria debe ser adecuada para administración pulmonar, por ejemplo, por aerosol. Preferentemente, el artículo o kit de fabricación comprende además instrucciones sobre cómo usarlo, que incluye cómo administrar el producto farmacéutico. Las instrucciones pueden contener además material informativo que aconseja a un profesional médico, técnico o sujeto cómo prevenir o tratar apropiadamente la enfermedad o trastorno en cuestión. En otras palabras, el artículo de fabricación incluye instrucciones que indican o sugieren una pauta posológica para su uso, que incluye, pero no se limitan a, dosis reales, procedimientos de monitorización y otra información de monitorización.

Como con cualquier producto farmacéutico, el material de embalaje y el recipiente se diseñan para proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y el transporte.

Los kits pueden incluir exosomas en suspensiones acuosas estériles que se pueden usar directamente o se pueden diluir con solución salina normal para inyección intravenosa o uso en un nebulizador, o dilución o combinación con tensioactivo para administración intratraqueal. Los kits también pueden contener, por lo tanto, la disolución de diluyente o agente, tal como solución salina o tensioactivo. El kit también puede incluir un dispositivo de administración pulmonar, tal como un nebulizador o componentes desechables para el mismo, tales como una boquilla, pieza nasal o mascarilla.

EJEMPLOS

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento de MSC humanas de gelatina de Wharton del cordón umbilical humano. Se aislaron MSC derivadas de gelatina de Wharton del cordón umbilical humano (hUC-MSC) según los métodos publicados (Mitchell, K. E. et al., 2003, Stem Cells 21:50-60; y Penolazzi, L. et al., 2011, J Cell Physiol) con modificaciones menores. El cordón se aclaró dos veces con PBS estéril en frío, se cortó longitudinalmente y se retiraron las arterias y la vena. Se rasparon los tejidos del gel blando, se cortaron finamente (2 - 3 mm2) y se dispusieron directamente sobre placas de 100 mm (15 trozos por placa) con DMEM/F12 (1:1) (Invitrogen) complementado con 10 % de suero bovino fetal (Hyclone), L-glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina, y se incubaron durante 5 días a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO². Después de retirar el tejido y el medio, las placas se lavaron 3 veces con PBS, las células unidas se cultivaron y el medio recién preparado se sustituyó 3 veces por semana. Al 70-80 % de confluencia, las células se recogieron y se tiñeron con anticuerpos conjugados con PE para CD34 (Milteny Biotec) y CD45 (Milteny Biotec). La inmunorreducción se realizó usando las microperlas anti-PE (Milteny Biotec) y columna MSCS (Milteny Biotec) según las instrucciones del fabricante. Las poblaciones CD34 y CD45 negativas se propagaron adicionalmente y se seleccionaron para la expresión de marcadores de MSC (CD105, CD90, CD44 y CD73) y la ausencia de CD11 b, CD19 y HLA-DR usando un conjunto de anticuerpos marcados fluorescentemente específicos para la caracterización de MSC humanas (BD Biosciences) usando una citometría de flujo MoFlo (Beckman Coulter).

Preparación de medio acondicionado. Para excluir la contaminación de las microvesículas derivadas del suero, se clarificó el suero usado para la propagación de cultivos celulares y la recogida de medio acondicionado por ultracentrifugación a 100.000 x g durante 18 horas. Las MSC se cultivaron en medio a-MEM complementado con 10 % (v/v) de suero bovino fetal (FBS, Hyclone), 10 % (v/v) de suero de caballo (Hyclone) y L-glutamina 5 mM (Gibco). Los cultivos al 70 % de confluencia se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con medio libre de suero complementado con L-glutamina 2 mM durante 24 horas en condiciones habituales de cultivo. El medio acondicionado se recogió de cultivos casi confluentes de MSC humanas durante 24-48 horas o durante un periodo de 3-4 días (en cultivos de FBS reducidos en micropartículas) y las células y el residuo se retiraron por centrifugaciones diferenciales a 400 x g durante 5 min, a 2.000 x g durante 10 min y a 13.000 x g durante 30 min. El medio acondicionado clarificado se filtró posteriormente a través de una unidad de filtro de 0,2 gm y se concentró al menos 10 veces usando un sistema de filtración de flujo tangencial usando 100 kD o 300 kD o 500 kD de corte. Los niveles de proteína en el medio acondicionado se determinaron por el ensayo de Bradford (Bio-Rad).

Aislamiento de exosomas. Se aislaron exosomas de MSC del medio acondicionado concentrado por bandeado en un gradiente de etapas del 10 %-60 % de iodixanol por centrifugación a 100k x g durante 3,5 horas. Los exosomas se aislaron adicionalmente del medio acondicionado por centrifugación diferencial, ocasionalmente seguido por un colchón de sacarosa al 30 % o gradientes de velocidad de sacarosa. El número de partículas de las preparaciones de exosoma aislado se determinó por Nanosight.

Transferencia Western de exosomas. Se separaron las preparaciones de exosomas en 12 % de gel de poliacrilamida y luego se transfirieron a una membrana de PVDF de 0,45 gm (Millipore). Se usaron anticuerpo policlonal de cabra anti-CD63 (1:1.000; Santa Cruz), policlonal de conejo anti-CD81 (1:1.000, Santa Cruz) y monoclonal anti-Dicer (1:1.000, Abcam). Los anticuerpos primarios contra ALIX, FLOT-1, TSG101, TGFpR2, s Ma D, CD105, CD9, CD81, CAV1, EFGR y AKT también se usaron para identificar subpoblaciones de exosomas. Se usó anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa (Santa Cruz) en una dilución 1:20.000 para visualizar bandas inmunorreactivas tanto por el reactivo de quimioluminiscencia potenciada (Pierce) como por Lumi-LightPLUS (Roche). Se usó el programa ImageJ de NIH para la cuantificación mediante análisis densitométrico después de la resta apropiada del ruido de fondo.

Cuantificación de microARN. Se extrajo ARN de exosomas total por el método de Chomczynski & Sacchi (1987 Anal Biochem 162:156-159) y se usaron 750 ng como plantilla para la transcriptasa inversa con cebadores específicos para cada microARN diana (kit de transcripción inversa de TaqMan, Applied Biosystems, Foster City, CA). Cada reacción de transcripción inversa también incluyó el cebador para el ARN nuclear pequeño sno202, que se usó como control interno. Se usaron 37,5 ng de ADNc para cada reacción de qPCR de 20 gl con TaqMan universal master mix II sin UNG (Applied Biosystems) en presencia de sondas específicas para los microARN indicados y el control interno (ensayo de microARN TaqMan, Applied Biosystems). La amplificación se realizó a 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min, en una plataforma StepOne Plus (Applied Biosystems).

Animales y exposición hipóxica. Se obtuvieron ratones macho FVB de 8 semanas o de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) o se criaron en el animalario del Hospital infantil de Boston. Los ratones en cada grupo se expusieron a 8,5 % de oxígeno en una cámara de plexiglás (OxyCycler, BioSpherix, Redfield, NY) durante periodos experimentales variables. La ventilación se ajustó para retirar el CO²de manera que no superara 5.000 ppm (0,5 %) (intervalo promedio 1.000-3.000 ppm). El amoniaco se retiró por ventilación y filtración con carbón vegetal activado a través de un purificador de aire. Todos los protocolos animales fueron autorizados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del hospital infantil.

Ejemplo 1

Identificación y caracterización de dos poblaciones distintas de exosomas derivados de células madre mesenquimatosas

La evidencia acumulada soporta una función crítica de las MSC en la homeostasis pulmonar y la reparación. Se ha informado previamente que los exosomas de MSC (MEX) median en el efecto citoprotector de las células madre mesenquimatosas en hipertensión pulmonar inducida por hipoxia. La administración intravenosa de MEX de ratón suprimió la entrada pulmonar hipóxica de macrófagos y la inducción de mediadores proinflamatorios y proproliferativos y con el tiempo inhibió la remodelación vascular y la hipertensión pulmonar hipóxica en un modelo de PH murino.

El objetivo de este estudio era investigar si las MSC aisladas de estroma del cordón umbilical humano secretaban microvesículas que presentaran propiedades protectoras similares, y caracterizar las propiedades bioquímicas del exoma de MSC terapéutico y estudiar su efecto sobre los cambios fenotípicos de las células vasculares desencadenados por las señales que inician la remodelación vascular del pulmón.

Aislamiento de MEX

Se aislaron exosomas (MEX) de medio de cultivo de tejido acondicionado por células madre mesenquimatosas (MSC) humanas. Aquí, la fuente de las MSC humanas es la gelatina de Wharton (WJ), aunque otras posibles fuentes son sangre del cordón umbilical, médula ósea, tejido adiposo u otros. Las MSC se aislaron, se inmunoseleccionaron, se cultivaron y se evaluó su potencial de diferenciación. Selecciones negativas para WJ-MSC humanas incluyeron CD34 y CD45. Las MSC fueron positivas para CD90, CD73, CD105 y CD44.

Tratamiento de ratones con MEX

Se administró una dosis de MEX a animales mediante inyección en la vena de la cola y los ratones receptores se expusieron a hipoxia normobárica (8-10 % de O2) durante 2,5 días. Se usó una disminución en los marcadores inflamatorios inducidos por hipoxia (por ejemplo, CCL2, IL6) como un parámetro para la eficacia de la preparación. La dosis usada fue equivalente a aproximadamente 10-20 billones de partículas como se mide por NanoSight o aproximadamente equivalente a exosomas totales producidos por 10-20 millones de MSC en cultivos de monocapas con respecto a 24 horas.

Resultados

El tratamiento de ratones por inyección i.v. de preparaciones de MEX reguló por disminución la activación hipóxica de la señalización asociada a remodelación vascular e hipertensión pulmonar (FIG. 1A) y mejoró la inflamación pulmonar inducida por hipoxia (FIG. 1B). La FIG. 1A muestra que la fosforilación inducida por hipoxia de AKT y su diana aguas abajo mTOR se reducen por tratamiento con WJ-MEX. Como se demuestra en la FIG. 1B, los niveles de proteína pulmonar del inhibidor de la proteína de unión/diferenciación del ADN ID1, un gen directo dirigido a SMAD y señal aguas abajo de BMPR2, son suprimidos por la hipoxia, pero aumentaron con MEX. La alfa-tubulina sirve de control de normalización.

Se investigó la presencia de más de una población de subtipo MEX por ultracentrifugación de densidad y velocidad. El análisis de las preparaciones de MEX mediante ultracentrifugación de densidad y velocidad reveló que la población de microvesículas extracelulares producida por MSC está compuesta por dos tipos, basados en marcadores moleculares (FIG. 2 y FIG. 3). Los dos tipos se han denominado a-MEX y f-MEX. Los marcadores de biogénesis de exosomas, tales como ALIX y TSG101, se enriquecen preferentemente en las fracciones 12-14 (a-MEX), mientras que las tetraspaninas CD9 y CD81 y los marcadores de balsas lipídicas, tales como flotilina 1 (FLOT1) y caveolina 1 (CAV1), se enriquecen en las fracciones 5-8 (f-MEX). La Tabla 1 muestra los marcadores específicos de a-MEX y f-MEX:

TABLA 1

Las preparaciones de a-MEX o f-MEX revelan morfología distinta por EM (FIG. 4). f-MEX son de 30-200 nm de diámetro y presentan la morfología típica en forma de copa profunda de los exosomas, mientras que a-MEX son de 30-100 nm, con una morfología translúcida y esférica.

Para preparar subpoblaciones de exosomas altamente enriquecidas en a-MEX o f-MEX de preparaciones a granel de exosomas obtenidas de MSC cultivadas en cultivos de monocapa, las preparaciones de exosomas a granel se ajustaron al 45 % de sacarosa, se dispusieron en capas sobre un colchón de sacarosa al 60 % y se cubrieron encima con un gradiente escalonado del 35 % - 5 % de sacarosa. Las preparaciones se centrifugaron durante 20 horas a 180k x g para separar subpoblaciones de a-MEX y f-MEX. Las fracciones de gradiente que contenían a-MEX o f-MEX se concentraron mediante ultracentrifugación (100k x g, 3 horas) y se resuspendieron en PBS o mediante filtración de flujo tangencial.

La administración de a-MEX o f-MEX aislados a ratones expuestos a hipoxia reveló que las propiedades inmunosupresoras de MEX residen exclusivamente con el tipo de a-MEX (FIG. 5). El tratamiento con a-MEX causó una disminución significativa en los niveles de ARNm de marcadores inflamatorios inducidos por hipoxia, que incluyen CCL2, IL6 y ADM.

La producción de a-MEX aumenta en cultivos 3D

Las MSC y ciertos otros tipos de células pueden formar agregados de células denominados esferoides. La FIG. 6 presenta imágenes de microscopía que representan la formación de esferoides de MSC de tanto condiciones de cultivo 2D como 3D. Se supone que la formación de esferoides representa más condiciones fisiológicas que los cultivos en monocapa bidimensionales. Para MSC, se supone que el estado esferoide representa el estado similar a célula madre más indiferenciado. Están comercialmente disponibles sistemas de cultivo tridimensionales que potencian la tendencia para formar esferoides (membranas específicas). Las MSC formarán espontáneamente esferoides que crecen hacia afuera de los cultivos de monocapa a alta densidad, y se pueden inducir para formar esferoides si se suspenden en medios de cultivo (técnica de gota colgante).

La técnica de gota colgante es un método de cultivo bien conocido para muchos tipos de células. Brevemente, las MSC cultivadas en cultivo de monocapa se tripsinaron para producir una suspensión de células individuales. Se aplicaron 30 gl de esta suspensión que contenía 500.000 células a la superficie interior de una tapa de la placa de Petri y la tapa se colocó con respecto a una placa que contenía una pequeña cantidad de PBS para conservar la humedad. La placa con las gotitas colgantes se puso en una estufa de incubación de cultivo de tejido durante 1 -2 días, tiempo durante el cual las MSC se agregaron en esferoides. Una preparación de esferoides típicas consistió en 15 millones de células divididas en 30 gotitas.

Los datos indican que las MSC cultivadas en cultivo 3D (esferoides) producen significativamente más a-MEX en comparación con el mismo clon de MSC, en el mismo paso, cultivadas en cultivo 2D (monocapa) (FIG. 7). El aumento en la producción de a-MEX se evidencia por la fuerte inmunorreactividad de muestras con SMAD 2/3 y anticuerpos ALIX, pero no FLOT1, como se muestra en la FIG. 7.

También se encontró que la producción de a-MEX es variable entre diferentes clones de MSC, y las células productoras se pueden enriquecer a través de cultivo 3D y/o suplementación de factor de crecimiento. Diversos clones de MSC independientemente derivados se caracterizaron por su producción relativa de a-MEX (se determinó la relación de marcadores FLOT 1 frente a ALIX (o SMAD) en su medio acondicionado durante el cultivo 2D y se observó una variación sustancial) (Fig. 8A). Ciertos clones, tales como el clon D, no produjeron cantidades significativas de SMAD (marcador a-MEX en comparación con FLOT1 (marcador f-MEX)). Esta propiedad del clon D está asociada con una formación muy ineficiente de esferoides usando la técnica de gota colgante (FIG. 8B).

Significativamente, cuando esferoides raros formados por las células del clon D se expandieron en monocapa, el cultivo 2D resultante produjo a-MEX en una alta relación, y se formaron esferoides con alta eficiencia. Estas observaciones indican que la selección a través de la formación de esferoides se puede usar como una herramienta para enriquecer clones de MSC ineficientes para la subpoblación de células que retienen su estaminalidad y que producen a-MEX a altas relaciones. Con este objetivo se observó que la manipulación de las concentraciones de factores de crecimiento, tales como TGFp1, puede tanto acelerar la formación de esferoides como potenciar la producción de a-MEX (FIG. 9). La estimulación de TGFp1 se logró a una concentración de 10 ng/ml.

a-MEX y f-MEX llevan distintos módulos de transducción de señales para factores de crecimiento específicos.

a-MEX alojan el receptor de TGF y el factor de transcripción aguas abajo SMAD (FIG. 2 y FIG. 3). La adición de TGFp1 a preparaciones aisladas de a-MEX revela que el módulo de señalización es funcional, puesto que la molécula SMAD dentro de a-MEX se fosforila eficiente y específicamente in vitro (FIG. 10A). Esta propiedad es específica para a-MEX (FIG. 10B). f-MEX contienen el receptor de EGF y pueden fosforilar AKT endógeno in vitro (no mostrado).

Los datos indican que las MSC producen dos tipos diferentes de exosomas: el tipo a-MEX lleva módulos de señalización funcional para la superfamilia TGF/BMP de factores de crecimiento, mientras que f-MEX llevan los módulos correspondientes para la superfamilia FGF/PDGF. Estos exosomas transfieren los módulos a células diana y potencian la vía de señalización correspondiente, y su relación de secreción relativa depende de la programación de la población de MSC que las produce.

Además, se encontró que a-MEX pero no f-MEX son capaces de inhibir la transición de fibroblastos a miofibroblastos inducida por TGFp en células de pulmón humano, como se muestra en la FIG. 11. Los fibroblastos de pulmón humano, después de 3 días de privación de suero (0,1 % de FBS), se estimularon con TGFp para que se produjera la diferenciación de miofibroblastos, marcada por la elevada expresión de alfa-actina de músculo liso (SMA). La FIG. 11A demuestra que el pretratamiento con hMEX (2 ug/ml) suprime el efecto de TGFp sobre los niveles de proteína alfa-SMA. Para examinar más este resultado, los fibroblastos de pulmón humano, después de 24 h de privación de suero, se estimularon con TGFp para inducir PAI1, un marcador de miofibroblastos. El tratamiento con a-MEX previno la regulación por incremento de PAI1, un efecto no observado con el tratamiento con f-MEX (FIG. 11B). También se encontró que el tratamiento con a-MEX regula por disminución los niveles basales de ARNm de MCP-1 y IL1p en fibroblastos de pulmón humano in vitro (FIG. 11C).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un exosoma aislado, en donde

(ii) en donde el exosoma aislado no comprende marcadores FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2.

2. Un exosoma aislado para su uso en el tratamiento de un trastorno pulmonar, un trastorno cardiovascular, un trastorno renal o un trastorno neural isquémico, en donde

3. El exosoma aislado para su uso según la reivindicación 2, en donde el trastorno pulmonar es enfermedad pulmonar inflamatoria, opcionalmente en donde la enfermedad pulmonar inflamatoria es inflamación pulmonar inducida por hipoxia, hipertensión pulmonar, asma, displasia broncopulmonar (DBP), alergia o fibrosis pulmonar idiopática; enfermedad vascular pulmonar; o lesión pulmonar aguda, opcionalmente en donde la lesión pulmonar aguda está asociada con septicemia o es síndrome disneico agudo (SDRA) inducido por el respirador, o alternativamente en donde el trastorno cardiovascular es infarto de miocardio, enfermedad cardiovascular, hipertensión, aterosclerosis o insuficiencia cardíaca, alternativamente en donde el trastorno renal es lesión renal isquémica, insuficiencia renal aguda o fibrosis renal, alternativamente en donde el trastorno neural isquémico es encefalopatía isquémica hipóxica o accidente cerebrovascular isquémico.

4. Un método de producción de un exosoma(s) que comprende

cultivar una célula madre mesenquimatosa (MSC) para producir medio acondicionado, en donde el cultivo es cultivo tridimensional (3D), y/o en donde el cultivo comprende el uso de TGFp1; y

aislar el (los) exosoma(s) del medio acondicionado; en donde

5. El método de la reivindicación 4, en donde el cultivo 3D comprende cultivo en gota colgante, cultivo en matrices, cultivo en microvehículos, cultivo en andamiajes extracelulares sintéticos, cultivo en membranas de quitosano, cultivo en levitación magnética, cultivo en suspensión en biorreactores giratorios o cultivo en condiciones de inhibición sin contacto.

6. El método de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde el método potencia la producción de exosomas que comprenden marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105 con respecto a exosomas que comprenden uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AKT2, opcionalmente en donde la potenciación comprende un aumento de 1,5 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, o 5,0 veces, 6,0 veces, 7,0 veces, 8,0 veces, 9,0 veces o 10,0 veces o más en la producción de exosomas que comprenden marcadores ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y CD105 con respecto a exosomas que comprenden uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 y AkT2.

7. El exosoma aislado, el exosoma aislado para su uso, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el exosoma tiene un diámetro de aproximadamente 10-150 nm, opcionalmente en donde el exosoma tiene un diámetro de aproximadamente 30-100 nm.

8. El exosoma aislado, el exosoma aislado para su uso, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el exosoma se aísla de una MSC humana.

9. Una composición o composición farmacéutica que comprende el exosoma aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 7 u 8.