CN101890050B

CN101890050B - 脐带间质干细胞来源膜性囊泡及其应用

Info

Publication number: CN101890050B
Application number: CN2010102260490A
Authority: CN
Inventors: 许文荣; 钱晖; 朱伟; 严永敏; 毛飞; 黄玲; 沈俐
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu Aoyang Biomedical Research Institute Co ltd
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2010-07-14
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-07-14
Also published as: CN101890050A

Abstract

本发明涉及脐带间质干细胞中活性成分膜性囊泡(exosome)的提取及其在制备治疗肝肾损伤及皮肤疾病药物中应用。所说的脐带间质干细胞来源膜性囊泡，是通过以下方法制得：(1)培养人脐带间质干细胞；(2)间质干细胞条件培养基制备；(3)膜性囊泡分离纯化。本发明所述的人脐带间质干细胞膜性囊泡作为药物输注小鼠急性肝损伤、大鼠肾损伤及大鼠皮肤烫伤模型的实验证明，该药物能够改善肝、肾功能及皮肤状态，促进肝、肾及皮肤病理恢复，，降低死亡率，达到阻滞和逆转肝肾损伤的发展目的，为临床治疗肝肾损伤开辟新途径。

Description

脐带间质干细胞来源膜性囊泡及其应用

技术领域

本发明属于药物研发，细胞生物学、分子生物学领域。涉及脐带间质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cell，hucMSC)中活性成分膜性囊泡(exosome)的提取及其在制备治疗肝肾损伤及皮肤疾病药物中应用。

背景技术

hucMSC移植治疗肝、肾及皮肤损伤疾病越来越引起人们的重视，但由于MSC存在移植存活率低及长期临床应用可能存在致瘤隐患等不足使得其临床应用受到限制，因此，寻找一种操作简单、安全有效的基于MSC的非细胞疗法显得十分重要。研究表明MSC主要通过旁分泌效应来改善心肌功能，而MSC分泌的膜性囊泡是旁分泌中最有效的活性成分，在细胞信息传递中起着重要作用，具有组织损伤修复潜能。

膜性囊泡(exosome)含有其来源细胞的胞膜和胞质蛋白成分，因此它较易与邻近细胞的胞膜发生融合，进而将一个细胞的胞膜及胞质蛋白传递给另一个细胞，在不同细胞间进行信息传递。此外，许多细胞包括MSC分泌的膜性囊泡还包含着能够在细胞间进行转移的RNA(mRNA及microRNAs)，通过在细胞间水平转移方式激活靶细胞产生一些列生物学效应。因此，膜性囊泡在细胞微环境中具有十分重要的作用。Bruno等研究发现MSC可分泌一种直径80nm-1μm大小的非可溶性微泡，它对急性肾损伤具有修复作用。这些从MSC上清中分离出来的微泡在体外能够促进肾小管上皮细胞的增殖及抗凋亡，将其标记后注射到急性肾损伤动物模型体内，可发现微泡在6h内即在肾损伤部位发生了聚集。2008年Timmers等首次报道人胚胎干细胞来源的MSC培养上清液经25倍浓缩后在猪心肌缺血再灌注损伤模型中能减小心肌梗死面积，有效的保护心脏功能，同时，他们还将MSC-CM按直径大小分级过滤后通过静脉或冠状动脉分别注入小鼠心肌缺血再灌注模型体内，结果发现仅分子量大于1000KDa和直径在50-100nm的大的复合物对小鼠心肌缺血再灌注损伤有修复和保护作用，而MSC-CM中的其他成分没有修复作用，进一步的研究发现这种复合物可能就是胚胎干细胞来源的MSC分泌的膜性囊泡。这些研究表明，MSC可通过旁分泌膜性囊泡在细胞间进行信息传递进而通过某种机制对受损组织进行修复，这一旁分泌机制为基于脐带MSC的非细胞治疗奠定了重要基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种脐带间质干细胞来源的膜性囊泡(hucMSC-exosome)，并提供该膜性囊泡在制备治疗肝、肾及皮肤损伤疾病药物中的应用。

本发明的目的是通过以下方式实现的：脐带间质干细胞来源的膜性囊泡，是通过下述方法提取，包括(1)分离培养人脐带间质干细胞；(2)间质干细胞条件培养基制备；(3)膜性囊泡分离纯化；

其中，步骤(1)人脐带间质干细胞的分离培养包括：取无菌新生儿新鲜脐带，经磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗后，剪成直径约1～2mm大小的组织块；含10％胎牛血清L-DMEM营养液，5％CO2、37℃饱和湿度培养；去除非贴壁细胞，贴壁细胞80％融合后0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养。

步骤(2)间质干细胞条件培养基制备包括：取3～5代的间质干细胞无血清培养48h；收集培养上清液，2000g，10min离心除去细胞碎片；0.22μm无菌滤膜过滤得到间质干细胞条件培养基。

步骤(3)膜性囊泡分离纯化包括：间质干细胞条件培养基4℃，1000g离心10min，收集上清；100KDaMWCO超滤离心管中，4℃，1000g离心30min，得到含膜性囊泡浓缩液；浓缩液移至30％的蔗糖/D2O密度垫上(1.210g/cm³)，4℃，100000g离心60min，收集底部2ml的缓冲垫；PBS稀释缓冲垫，100kDa MWCO超滤离心管中，1000g离心30min，收集的膜性囊泡浓缩液，0.22μm滤膜过滤除菌，得到脐带间质干细胞来源膜性囊泡。

将本发明所述的脐带间质干细胞来源的膜性囊泡用于治疗肝肾损伤模型的效果评价：(1)一般情况：精神状态和活动状态、进食和大小便情况；(2)肝肾功能与血清生化指标；(3)肝肾胶原分泌；(4)肝肾病理组织结构与形态；(5)肝肾免疫组织化学；(6)上皮组织病理组织结构与形态。

所述的肝、肾及皮肤损伤疾病模型包括：四氯化碳所致小鼠急性肝损伤模型、顺铂所致大鼠肾损伤模型、大鼠急性肾缺血再灌注损伤模型及大鼠皮肤烫伤模型。

上述利用本发明所述的人脐带间质干细胞膜性囊泡作为药物输注小鼠急性肝损伤、大鼠肾损伤及大鼠皮肤烫伤模型的实验证明，该药物能够改善肝、肾功能及皮肤状态，促进肝、肾及皮肤病理恢复，，降低死亡率，达到阻滞和逆转肝肾损伤的发展目的，为临床治疗肝肾损伤开辟新途径。

本发明的优点在于：

1.本发明人脐带间质干细胞膜性囊泡的制备技术方案简便、易操作、保存方便。

2.本发明所利用人脐带间质干细胞膜性囊泡可-80℃保存，避免了MSC冻存复苏的不便，融解后即可使用，使用时间易于掌握。

3.人脐带间质干细胞膜性囊泡用于肝、肾及皮肤损伤疾病的治疗，其使用浓度、剂量及途径更易控制，技术可推广程度高，安全性好。

4.为临床治疗肝、肾及皮肤损伤开辟间质干细胞活性成分疗法的新途径。

附图说明

图1hucMSC-exosome电镜下形态，40～100nm的膜性微囊结构，圆形或椭圆形(×9700)。

图2SDS-PAGE电泳及Western-blot分析膜性囊泡(exosome)蛋白含量及特异标志：A人脐带MSCs来源的膜性囊泡SDS-PAGE凝胶电泳图像；B Westem-b1ot检测人脐带MSCs来源的膜性囊泡表达CD9分子。

图3hucMSC-exosome表面标志CD9、CD44流式分析：A前向散射、侧向散射散点图；B未标记膜性囊泡对照；C膜性囊泡CD29标记；D膜性囊泡CD44标记。

图4hucMSC-exosome治疗20％深II度SD大鼠烫伤模型疗效观察(治疗后24小时)。

图5hucMSC-exosome治疗20％深II度SD大鼠烫伤模型疗效观察(治疗后4天)。

图6TUNEL染色检测hucMSC-exosome抑制缺氧肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡，肾小管上皮细胞细胞缺氧/复氧或顺铂作用后，细胞核皱缩，TUNEL深染，细胞形态较大，且不规则。加入膜性囊泡后，细胞形态较好，随膜性囊泡浓度增高TUNEL阳性细胞逐渐减少。A对照组(损伤未治疗组)；B低浓度组；C中浓度组；D高浓度组。

图7hucMSC-exosome对顺铂作用肾小管上皮细胞的体外保护，结果表明肾小管上皮细胞细胞在缺氧4小时，复氧48小时后，细胞增殖缓慢，加入膜性囊泡后细胞增殖有所恢复，且呈现出浓度依赖关系。

图8hucMSC-exosome修复四氯化碳(CCL₄)诱导小鼠急性肝损伤，正常小鼠肝组织表面光滑、质软，无结节和囊肿，色泽粉红，未见淤血、脂肪变性，无明显肿大或萎缩；CCL₄损伤组小鼠肝脏被膜光泽差，粗糙，呈暗红色；脐带间质干细胞移植组小鼠肝脏表面颗粒化降低，无灰白色结节；膜性囊泡治疗组小鼠肝组织表面与脐带间质干细胞治疗组相似，肝表面光滑度增加，颗粒化降低。

图9hucMSC-exosome修复四氯化碳(CCL₄)诱导小鼠急性肝损伤后，肝组织切片HE染色显示与CCL₄组相比，细胞结构更加完整，炎症细胞降低。TUNEL染色结果表明exosome治疗后组织凋亡比例明显降低。

具体实施方式

实施例一：脐带间质干细胞来源膜性囊泡(hucMSC-exosome)的制备

1、分离培养人脐带间质干细胞

按本课题组先前建立的人脐带MSC分离培养及鉴定方法体外培养扩增人脐带MSC(Chun Qiao，et al.Cell Biology International，2008，32：8-15)。具体是：取无菌新生儿新鲜脐带，经磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗后，剪成直径约1～2mm大小的组织块；含10％胎牛血清L-DMEM营养液，5％CO2、37℃饱和湿度培养；去除非贴壁细胞，贴壁细胞80％融合后0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养。

2.人脐带间质干细胞条件培养基(MSC-CM)的制备

选择增殖能力强，状态好的健康人脐带MSC，无血清培养48h后收集培养上清液，2000g，10min离心除去细胞碎片等，再经0.22μm无菌滤膜过滤后即为MSC-CM，用于exosome的分离。

3.hucMSC-exosome的分离鉴定

(1)hucMSC-exosome的分离将收集的人脐带MSC-CM于4℃条件下，分别采用滤膜分级过滤浓缩、浓缩超滤及梯度超速离心法、HPLC法分离并纯化hucMSC-CM来源的exosome，将收集的exosome浓缩液定量，0.22μm滤膜过滤除菌，分装，于-80℃冷藏备用。

(2)hucMSC-exosome的鉴定①透射电镜观察exosome一般形态，取悬置均匀的exosome溶液，3％磷钨酸溶液负染后电镜下观察exosome形态，并拍摄电镜照片(图1)，随机选取20个exosome，根据标尺记录其直径。②SDS-PAGE分离蛋白及凝胶图象分析，将提取的exosome经10％SDS-PGAE电泳分离蛋白，取出分离胶并用0.05％考马斯亮蓝R-250染色，脱色后采用影像分析仪扫描图像并分析(如图2A)。③western-blot检测CD9、CD81、Alix及hsp70等蛋白分子，检测exosome相关蛋白在hucMSC-exosome中的表达(如图2B)。④流式细胞术检测hucMSC-exosome表面标志，将分离纯化后的exosome与FITC或PE标记的鼠抗人CD29、CD44、HLA-DR等作用后，经流式细胞仪检测，并与其来源MSC进行比较(如图3)。

实施例二：hucMSC-exosome对小鼠20％深II度SD大鼠烫伤模型的疗效观察

(1)实验动物分组与20％深II度烫伤模型制备洁级SD大鼠，体重约120～130g，数量共6只，雌雄各半，分为对照组、脐带间质干细胞治疗组，脐带间质干细胞exosome治疗组，每组2只，雌雄各一只。将麻醉好的大鼠放置于操作台上，根据Rubner公式计算出20％的大鼠体表面积。剪去背部毛发，硫代硫化钠脱毛后，将其置于82℃水中，8秒钟后，迅速取出，用纱布擦干(避免进一步加重创面损伤)，补给生理盐水6ml，用无菌纱布包扎。

(2)治疗方法烫伤后3h，在烫伤面外周取3个点进行皮下定点注射。对照组、脐带间质干细胞治疗组，脐带间质干细胞exosome治疗组动物分别注射500μl 0.1M/L PBS、500μl 3.0×10²/μl脐带间质干细胞悬液，500ul蛋白浓度为29.14μg/μl脐带间质干细胞来源的exosome。治疗后外以敷料适度包扎固定，单笼饲养。

(3)疗效观察在治疗后24h(如图4)、96h(如图5)发现损伤后皮肤创面颜色变红，质地***、结痂，无渗出液、感染、溃破、脱痂。HE染色观察表明损伤皮肤组织的上皮细胞增殖增加，炎症细胞浸润降低。

实施例三：hucMSC-exosome对大鼠肾小管上皮细胞(NRK)缺氧模型的修复作用

NRK细胞缺氧模型的建立：NRK细胞5％CO2，2％O2，37℃，饱和湿度的条件下缺氧4小时，后加入exosome48小时后，检测各项指标。

加入剂量：

低剂量组(0.5mg/5×10⁵cells)

中剂量组(1mg/5×10⁵cells)

高剂量组(2mg/5×10⁵cells)

利用流式细胞术，TUNEL，免疫组织化学评价hucMSCs分泌的exosome在体外对NRK细胞缺氧模型的修复作用。应用定量PCR，Westem blot等技术初步探讨损伤修复的主要机制。NRK细胞缺氧/复氧或顺铂作用后，细胞核皱缩，TUNEL深染，细胞形态较大，且不规则。加入exosome后，细胞形态较好，随exosome浓度增高TUNEL阳性细胞逐渐减少(如图6)。NRK细胞在缺氧4h，复氧48h后，细胞增殖缓慢，加入exosome后细胞增殖有所恢复，且呈现出浓度依赖关系。NRK细胞缺氧/复氧后，细胞G2期为0.0％，而低浓度exosome治疗后，G2开始有恢复，中浓度和高浓度exosome治疗后，G2期基本恢复正常(如图7)。

实施例三：hucMSC-exosome对小鼠CCL₄急性肝损伤模型治疗作用

(1)小鼠肝损伤模型的建立

肝损伤动物模型：体重20～23g BALB/c小鼠30只，分为3组(hucMSCs处理组，exosome处理组，空白对照组)，雌雄各半，禁水24h后腹腔注射10％四氯化碳0.3ml/kg.bw。腹腔注射四氯化碳后72h分别放血处死各组SD大鼠数只，取肝脏将其固定于4％甲醛中，经常规脱水，石蜡包埋，切5μm厚切片，常规HE染色、Masson染色和Retculin染色，光镜下观察。肝小叶中央区中央静脉周围出现较多坏死细胞，坏死细胞范围达高倍视野的10％，坏死细胞类型包括凝固性坏死和溶解性坏死，坏死区有少量炎细胞浸润，局部网状纤维支架尚存；除明显坏死外，肝小叶中央区有少量细胞气球样变和脂肪变性。肝损伤模型建立。

(2)exosome治疗肝损伤模型研究

①在(1)基础上，各处理组小鼠腹腔注射10％四氯化碳72h后，分别经尾静脉或肝局部定点输注hucMSCs和exosome，每只小鼠输注的细胞量为3×10⁶，exosome为500μg，体积为200μl，空白对照组尾静脉输注等体积的PBS。②实验组和对照组在输注细胞后的第2d、4d、8d采尾静脉血，检测血清ALB、AST等指标；③各组在输注细胞或exosome后的第2d、4d、8d，分别处死1只小鼠取肾脏、心脏、肝脏、肺、脑等制备组织切片，荧光显微镜下观察细胞及exosome定位情况。免疫组化观察细白蛋白(Albumin，ALB)、核增殖抗原(PCNA)等指标，TUNNEL检测细胞凋亡，同时通过病理组织切片观察肝脏组织的修复情况；④采用RT-PCR、Real-time PCR等方法分析测定各处理组和对照组的肝细胞功能相关基因的表达水平；⑤在输注细胞或exosome后的第2d、4d、8d，收集肝组织提取mRNA和总蛋白，检测增殖、凋亡相关通路活化；⑥长期观察各处理组小鼠的生存时间，制作KM生存曲线。

正常小鼠肝组织表面光滑、质软，无结节和囊肿，色泽粉红，未见淤血、脂肪变性，无明显肿大或萎缩；CCL₄损伤组小鼠肝脏被膜光泽差，粗糙，呈暗红色；脐带间质干细胞移植组小鼠肝脏表面颗粒化降低，无灰白色结节；膜性囊泡治疗组小鼠肝组织表面与脐带间质干细胞治疗组相似，肝表面光滑度增加，颗粒化降低(如图8)。免疫组化检测发现exosome治疗后肝组织增殖增加、凋亡降低(如图9)。

Claims

1.一种脐带间质干细胞来源膜性囊泡，其特征在于通过以下方法制得：

（1）培养人脐带间质干细胞：取无菌新生儿新鲜脐带，经磷酸盐缓冲液反复冲洗后，剪成直径约1～2 mm 大小的组织块；含10%胎牛血清L-DMEM营养液，5％ CO2、37℃饱和湿度培养；去除非贴壁细胞，贴壁细胞80％融合后0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养；

（2）间质干细胞条件培养基制备：3~5代的间质干细胞无血清培养48h；收集培养上清液，2000g,10min离心除去细胞碎片；0.22μm无菌滤膜过滤得到间质干细胞条件培养基；

（3）膜性囊泡分离纯化：间质干细胞条件培养基4℃，1000g离心10min，收集上清；100KDa MWCO超滤离心管中，4℃，1000g离心30min，得到含膜性囊泡浓缩液；浓缩液移至30%的蔗糖/D2O密度垫上, 4℃，100 000g离心60min，收集底部2ml的缓冲垫； PBS稀释缓冲垫，100kDa MWCO超滤离心管中，1000g离心30min，收集的膜性囊泡浓缩液，0.22μm滤膜过滤除菌，得到脐带间质干细胞来源膜性囊泡。

2.权利要求1所述的脐带间质干细胞来源膜性囊泡在制备治疗肝、肾或皮肤损伤疾病药物中的应用。