ES2928393T3 - Inhibidores de moléculas pequeñas para el tratamiento contra el cáncer - Google Patents
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Abstract
Se describen compuestos, que incluyen derivados de quinoxalina de fórmula (I), para uso en el tratamiento del cáncer. En general, los compuestos inhiben la importación de proteínas y factores de transcripción tales como Kpnα, AP-1, P65, NFAT al núcleo de una célula mediante la inhibición de la proteína de importación nuclear, Kpnβ1. Las células cancerosas tienen niveles elevados de Kpnβ1 y la inhibición de su actividad de importación nuclear induce la apoptosis celular. La administración de una cantidad eficaz de cualquiera de los compuestos da como resultado la apoptosis celular en las células cancerosas, mientras que las células no cancerosas no se ven afectadas sustancialmente por la inhibición de la actividad de importación nuclear de Kpnβ1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Inhibidores de moléculas pequeñas para el tratamiento contra el cáncer
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente de los Estados Unidos número 62/034.331, depositada el 7 de agosto de 2014.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a inhibidores de moléculas pequeñas para la terapia contra el cáncer. En particular, se refiere al uso de moléculas pequeñas para destruir células cancerosas mediante la inhibición del transporte de proteínas al núcleo de las células.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El transporte nuclear es la importación o exportación de proteínas a través del complejo de poros nucleares (NPC). Las proteínas de transporte nuclear participan en el procedimiento de transporte y determinan la capacidad de transporte nuclear de una célula determinada. La capacidad de transporte puede tener un impacto directo en la expresión génica, la transducción de señales y tanto el crecimiento como el desarrollo de las células.
La carioferina beta (p) 1 (Kpnpl) es una proteína de transporte nuclear involucrada en la importación de proteínas de carga y ARN a través del NPC, desde el citoplasma hacia el núcleo. La Kpnpl es un miembro de la superfamilia de proteínas carioferina p de transporte nuclear. Hay más de veinte miembros de la familia de proteínas carioferina p, que pueden funcionar como receptores de importación o exportación, mediando la entrada o salida nuclear de proteínas. La Kpnpl, también conocida como Importina p, es un receptor de importación nuclear importante en la célula que transporta proteínas que contienen una señal de localización nuclear (NLS) a través del NPC en el núcleo. La importación nuclear dependiente de Kpnp 1 se caracteriza típicamente por el reconocimiento de la NLS en la proteína de carga por parte de la proteína adaptadora Kpn31, carioferina a (Kpna), también conocida como Importina a. Después del reconocimiento de carga, Kpna se une a Kpnp1 y el complejo trimérico se transloca en el núcleo.
El inhibidor de Crm1 Leptomicina B (LMB) es el único compuesto aceptado y comercialmente disponible conocido por inhibir el transporte nuclear. Recientemente, se identificaron inhibidores peptidomiméticos de molécula pequeña de transporte mediado por Kpna/p en una evaluación in vitro. Sin embargo, estos inhibidores tienen baja potencia y no son permeables a las células y, por lo tanto, no se pudo observar ninguna inhibición de la importación nuclear mediada por Kpn a/p in vivo (Ambrus G., Whitby L. R., Singer E. L., Trott O., Choi E., Olson A. J., y col. Small molecule peptidomimetic inhibitors of importin alpha/beta mediated nuclear transport. Bioorg Med Chem, 1 de noviembre de 2010;18(21):7611-20).
También se han descrito inhibidores peptídicos que se unen a Kpna con una fuerte afinidad, sin embargo, estos no inhiben Kpnp1 directamente (Kosugi S., Hasebe M., Entani T., Takayama S., Tomita M., Yanagawa H., Design of peptide inhibitors for the importin alpha/beta nuclear import pathway by activity-based profiling. Chem Biol, 22 de septiembre de 2008;15(9):940-9). La ivermectina es un antiparasitario de amplio espectro que inhibe el complejo Kpna/p, pero no parece bloquear la importación mediada por Kpnp1 solo (Wagstaff K. M., Sivakumaran H., Heaton S. M., Harrich D., Jans D. A., Ivermectin is a specific inhibitor of importin alpha/beta-mediated nuclear import able to inhibit replication of HIV-1 and dengue virus. Biochem J, 1 de mayo de 2012;443(3):851-6). Carioestatina 1A (Hintersteiner M., Ambrus G., Bednenko J., Schmied M., Knox A. J., Meisner N. C., y col., Identification of a small molecule inhibitor of importin beta mediated nuclear import by confocal on-bead screening of tagged one-bead one-compound libraries. ACS Chem Biol, 15 de octubre de 2010;5(10):967-79) e Importazol (Soderholm J. F., Bird S. L., Kalab P., Sampathkumar Y., Hasegawa K., Uehara-Bingen M., y col., Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-beta. ACS Chem Biol 2011 Jul 15;6(7):700-8) son los primeros inhibidores de moléculas pequeñas de Kpnp1 que se identificaron, sin embargo, sus efectos fuera del objetivo aún no se han examinado. Además, todavía no se ha probado ningún inhibidor de la importación de material nuclear en cuanto a sus efectos anticancerígenos. Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de identificar inhibidores de Kpnp1 novedosos y efectivos y de analizar los inhibidores para determinar sus actividades contra el cáncer.
La solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2009/163545 A1 describe compuestos, incluidos compuestos de quinaxolina, para su uso en un procedimiento destinado a alterar la vida útil de un organismo eucariota. Los compuestos se identificaron usando el ensayo DeaD.
El documento de Kozychenko, A. P. y col., Synthesis of 2-amino-3-(benzimidazol-2-yl)pyrrolo[2,3,b]-quinoxalines. Ukrainskii Khim- icheskii Zhurnal (Edición Rusa), 55(7), 737-42 describe vías sintéticas para la preparación de 2-amino-3-(benzimidazol-2il)pirrolo(2,3,b]-quinoxalinas.
Reker, Daniel y col. El documento Deorphaning Pyrrolopyrazines as Potent Multi-Target Antimalarial Agents,
Angewandte Chemie, Edición internacional, 53(27), 7079-7084 describe una pirroloquinoxalina (1)
como agente antipalúdico.
La solicitud de patente de los Estados Unidos No. US2013/225611 A1 se refiere al uso de un compuesto de 2,4-diaminoquinazolina para reducir la proliferación de células cancerosas y modular la función de importina-beta en células eucariotas.
El análisis anterior de los antecedentes de la invención pretende solamente facilitar una comprensión de la presente invención. Debe apreciarse que la discusión no es un reconocimiento o admisión de que cualquiera de los materiales a los que se hace referencia era parte del conocimiento general común en la técnica en la fecha de prioridad de la solicitud.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto de la fórmula I o una sal del mismo para su uso en el tratamiento de cáncer,
donde R1 es un grupo alquilo C2-C5, ramificado o no ramificado, opcionalmente funcionalizado con un sustituyente seleccionado de entre el grupo que consiste en una amina, un imidazol, un alcohol o una morfolina; y donde R2 es un hidrógeno o un grupo metilo.
Una característica adicional indica que R1 se selecciona de entre:
un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo butilo, un grupo isobutilo, un grupo isopentilo, un grupo propanol e
Incluso otra característica adicional indica que el compuesto de la fórmula I se selecciona de entre:
Incluso otra característica adicional indica que el cáncer se selecciona de entre cáncer cervical, esofágico, ovárico, de mama y otras formas de cáncer.
Una característica adicional indica que el compuesto de la fórmula I es
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de la fórmula II o una sal del mismo para su uso en el tratamiento de cáncer,
De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de la fórmula III o un estereoisómero o sal del mismo para su uso en el tratamiento de cáncer,
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La presente invención ahora se describirá, solo a modo de ejemplo, con referencia a las representaciones adjuntas, en las que:
La Figura 1 es un gráfico de barras que muestra la proliferación celular relativa de líneas celulares de cáncer de cuello uterino (HeLa, SiHa, CaSki, Ms751, C33A), cáncer de esófago (WHCO5), transformado (SVWI38) y no cancerosas (WI38, CCD-1068SK, FGO) transfectadas con ARNip de control 20 nM (ARNip de Ctl) o ARNip de KpnB1, donde la proliferación celular se monitoreó 5 días después de la transfección usando un ensayo MTT (**p < 0,05);
La Figura 2 es un análisis de transferencia Western que muestra la inactivación efectiva de Kpnpl después de la transfección de ARNip de Kpnpl, donde la p-tubulina sirve como un control para la carga de proteínas;
La Figura 3 es un gráfico de la viabilidad celular de células cancerosas HeLa tratadas con concentraciones crecientes de quinoxalina (A) y un gráfico de viabilidad celular de células HeLa tratadas con concentraciones crecientes de
benzimidazol (B);
La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de p65 nuclear y citoplasmático en una muestra no tratada de células y muestras tratadas con PMA, Compuesto A, Compuesto III y Compuesto II, respectivamente; La Figura 5 es un análisis de transferencia Western que muestra que el tratamiento con el Compuesto A, el Compuesto III y el Compuesto II en IC50 y el doble de las concentraciones de IC50 da como resultado la escisión de PARP como un indicador de apoptosis;
La Figura 6 es un par de gráficos de proliferación celular monitoreada mediante el uso del ensayo MTT de células cancerosas HeLa (A) así como células no cancerosas FGO (B) cuando se tratan con concentraciones crecientes del Compuesto II;
La Figura 7 es un par de gráficos de proliferación celular monitoreada mediante el uso del ensayo MTT de células cancerosas HeLa (A) así como de células no cancerosas FGO (B) cuando se tratan con concentraciones crecientes del Compuesto III;
La Figura 8 es un análisis de transferencia Western que muestra la expresión de GFP-Kpna2 en células CaSki transfectadas de forma estable con pEGFP- Kpna2, donde se indican los niveles de Kpna2 endógenos y la p-tubulina sirve como un control para la carga de proteínas;
La Figura 9 es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de células con fluorescencia citoplasmática de GFP-Kpna2 en una muestra no tratada de células y una muestra de células tratadas con 10 pM del Compuesto A (*p < 0,05);
La Figura 10 es un gráfico de barras de la fluorescencia nuclear GFP-Kpna2 en una muestra no tratada de células y una muestra de células tratadas con 10 pM del Compuesto A (*p < 0,05);
La Figura 11 es una transferencia Western que muestra la localización citoplasmática y nuclear de Kpna2 y NFY en lisados de proteínas de células no tratadas y células tratadas con el Compuesto A, donde se utilizó p-tubulina como un control de carga citoplasmática y proteína de unión a la caja antiTATA de conejo (TBP) como un control de carga nuclear;
La Figura 12 es un gráfico de barras que muestra los niveles de proteína nuclear Kpna2 y NFY en células no tratadas y células tratadas con
Compuesto A con respecto a TBP en el mismo extracto, donde los experimentos se realizaron por triplicado y se muestra la media y el error estándar de la media (*p < 0,05);
La Figura 13 es un Western Blot que muestra la inhibición de la expresión de Kpnp1 usando ARNip;
La Figura 14 es un análisis de transferencia Western que muestra que la inactivación de ARNip de la expresión de Kpnp1 produce una disminución similar en la localización nuclear de Kpna2 y NFY que la observada mediante el tratamiento con el Compuesto A;
La Figura 15 es un gráfico de barras que muestra una disminución dependiente de la dosis en el API y la actividad transcripcional de p65 ° NFkB en células CaSki después del tratamiento con la concentración de IC50 y 15 pM del Compuesto A (*p < 0,05);
La Figura 16 es un gráfico de barras de la actividad transcripcional de NFAT de células HeLa transfectadas con NFAT transfectadas con un plásmido indicador de NFAT, incubadas en presencia de TPA y lonomicina (+TPA/lonomicina) o sin TPA y lonomicina (-TPA/lonomicina) y en presencia de diferentes concentraciones del Compuesto A (*p < 0,05); La Figura 17 es un gráfico de barras de la actividad transcripcional de NFAT de células HeLa transfectadas con NFAT transfectadas con un plásmido indicador de NFAT, incubadas en presencia de TPA y lonomicina (+TPA/lonomicina) o sin TPA y lonomicina (-TPA/lonomicina) y en presencia de diferentes concentraciones del Compuesto II (*p < 0,05); La Figura 18 es un gráfico de barras de la actividad transcripcional de NFAT de células HeLa transfectadas con NFAT transfectadas con un plásmido indicador de NFAT, incubadas en presencia de TPA y lonomicina (+TPA/lonomicina) o sin TPA y lonomicina (-TPA/lonomicina) y en presencia de diferentes concentraciones del Compuesto III (*p < 0,05); La Figura 19 es un gráfico de barras de la actividad transcripcional de NFAT de células HeLa transfectadas con NFAT transfectadas con un plásmido indicador de NFAT, incubadas en presencia de TPA y lonomicina (+TPA/lonomicina) o sin TPA y lonomicina (-TPA/lonomicina) y en presencia de diferentes concentraciones de Ivermectina, que es un inhibidor conocido del transporte nuclear mediado por KpnpVKpna2 y sirve como un control positivo;
La Figura 20 es un gráfico de barras de la actividad transcripcional de NFAT de células HeLa transfectadas con NFAT transfectadas con un plásmido indicador de NFAT, incubadas en presencia de TPA y lonomicina (+TPA/lonomicina) o sin TPA y lonomicina (-TPA/lonomicina) y en presencia de diferentes concentraciones del inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R), AG1478, que sirve como un control negativo;
La Figura 21 es una colección de gráficos de proliferación celular monitoreada mediante el uso del ensayo MTT de células cancerosas CaSki (A), HeLa (B), KYSE30 (C) y WHCO6 (D), así como DMB (E) y células no cancerosas FGO (F) cuando se tratan con concentraciones crecientes del Compuesto A;
La Figura 22 es un gráfico de barras de la proliferación celular de células cancerosas (Caski, HeLa, KYSE30 y WHCO6) y células no cancerosas (FGO y DMB) en presencia del Compuesto A 10 pM o ausencia del Compuesto A;
La Figura 23 son fotografías de la formación de colonias independientes del anclaje de células HeLa y KYSE30 cultivadas en presencia o ausencia del Compuesto A 10 pM;
La Figura 24 es un análisis del ciclo celular de células CaSki (A) o células CaSki no tratadas con 10 pM del Compuesto A (B) o 20 pM del Compuesto A (C);
La Figura 25 es un gráfico de barras del porcentaje de células en las diversas fases del ciclo celular basado en análisis de ciclo celular realizados en presencia de DMSO, la concentración de IC50 del Compuesto A y el Compuesto A 20 pM (*p < 0,05);
La Figura 26 es un análisis de transferencia Western que muestra que el tratamiento con el Compuesto A da como resultado la escisión de PARP como un indicador de apoptosis, donde se utilizó p-tubulina como un control de carga
de proteínas;
La Figura 27 es un análisis de transferencia Western que muestra un aumento en la liberación del citocromo C en el citoplasma con una disminución concomitante en los niveles del citocromo C mitocondrial, lo que sugiere la activación de la vía apoptótica intrínseca, donde se utilizaron p-tubulina y peroxiredoxina 3 (Prdx3) como controles de carga para proteínas citoplasmáticas y mitocondriales, respectivamente, y para confirmar la pureza de las fracciones;
La figura 28 es un gráfico del volumen tumoral normalizado en ratones con tumor WHCO6 que se dejaron sin tratar, se trataron con vehículo (DMSO) o con el Compuesto A cada 2-3 días durante 3 semanas; y
La Figura 29 es un gráfico de la masa corporal de los ratones con tumores medido todos los días durante el curso del tratamiento descrito con referencia a la Figura 28.
DESCRIPCIÓN DETALLADA CON REFERENCIA A LOS DIBUJOS
La estrategia de detección in silico reveló la identidad de moléculas pequeñas que tienen el potencial de unirse e inhibir la proteína de transporte Kpnpl. Se seleccionó una región adecuada dentro de la estructura de proteína Kpnpl como una región diana. Se examinaron los datos de la estructura cristalina de Kpnpl y se identificaron los residuos de aminoácidos 331-364 de Kpnpl como una región común requerida para que se una a RanGTP, SREBP-2 y Kpna2 para el transporte de cargas clásicas que contienen NLS. Se llevó a cabo un tamizaje computacional para moléculas pequeñas que podrían unirse a esta región de Kpnpl y potencialmente interferir con su función de importación nuclear. La detección se llevó a cabo utilizando una biblioteca que consta de 14 millones de compuestos químicos. Las moléculas sometidas a la detección se puntuaron según su afinidad de unión predicha. Las moléculas se clasificaron según su forma complementaria y polaridad con respecto al sitio de unión anterior y los residuos circundantes. Los compuestos de la fórmula I a la III descritos adicionalmente en esta invención se identificaron todos como inhibidores potenciales de Kpnpl. Todos estos compuestos tienen al menos dos regiones aromáticas por molécula y participan en Van der Waals e interacciones electrostáticas con regiones complementarias en el sitio de unión y sus residuos circundantes. Los compuestos de la fórmula I a la III incluyen además donantes de enlace de hidrógeno, en particular restos de amina secundarios y primarios, y aceptores de enlace de hidrógeno tales como átomos de carbonilo o éter de oxígeno o aminas terciarias, que se colocan adecuadamente en las moléculas respectivas para participar en interacciones de enlace de hidrógeno con donantes y aceptores de enlace de hidrógeno complementarios que forman parte del sitio de unión y sus residuos circundantes en Kpnpl. Se ha demostrado que los compuestos I a III tienen propiedades contra el cáncer, por lo que se puedan usar en el tratamiento contra el cáncer.
Entre los compuestos identificados por la estrategia de detección y que posteriormente se demostró que inhiben Kpnpl se encuentran los derivados de quinoxalina. Los derivados de la quinoxalina son una clase importante de compuestos heterocíclicos y la estructura de la quinoxalina es un precursor para el ensamblaje de un gran número de compuestos derivados para diversas aplicaciones. La mayoría de los derivados de la quinoxalina son sintéticos y solo unos pocos ocurren de forma natural. Se sabe que algunos derivados de la quinoxalina tienen actividad biológica y se utilizan como agentes antimicrobianos, antivirales o antifúngicos.
Ahora, se ha descubierto que los derivados de la quinoxalina de la fórmula general I o sus sales,
donde Ri es un grupo alquilo C2-C5, ramificado o no ramificado, opcionalmente funcionalizado con un sustituyente seleccionado de entre el grupo que consiste en una amina, un imidazol, un alcohol o una morfolina; y donde R2 es un hidrógeno o un grupo metilo, tienen propiedades anticancerosas, por lo que pueden usarse para el tratamiento contra el cáncer.
Los compuestos de la fórmula general I o las sales de los mismos inhiben la importación de proteínas y factores de transcripción tales como Kpna, AP-1, P65, NFAT en el núcleo de una célula, que son dianas conocidas de la proteína de transporte Kpnpl.
El compuesto de la fórmula II, 9-[(1-metilpiperidin-3-il)metoxi]-4-[(6-metilpiridin-2-il)metil]-7-(5-metil-tiofen-2-il)-3,5-dihidro-2H-1,4-benzoxazepina o una de sus sales, en lo sucesivo denominado Compuesto II, y el compuesto de la fórmula III, (2S,4S)-1-bencil-4-{[(4-metoxinaftalen-1-il)metil]amino}-N-metilpirrolidin-2-carbox-amida o uno de sus estereoisómeros o sales, en lo sucesivo denominado Compuesto III, inhiben de manera similar la importación de factores de proteína y transcripción, tales como NFAT y P65/NFKB en el núcleo de una célula. También se descubrió que estos compuestos tienen efectos contra el cáncer, por lo que se pueden usar para el tratamiento contra el cáncer.
A continuación, se describirán más detalladamente las propiedades anticancerígenas de los compuestos de las fórmulas I a III y su modo de acción. Como se mencionó anteriormente, todos los compuestos se identificaron a partir de un análisis in silico para determinar la afinidad de unión a Kpn£1, una proteína de transporte nuclear.
La importación nuclear dependiente de Kpnp 1 se caracteriza por el reconocimiento de la NLS en la proteína de carga por la proteína adaptadora Kpn£1, carioferina a (Kpna), también conocida como Importina a. Después del reconocimiento de la carga, Kpna se une a Kpnpi y el complejo trimérico se transloca en el núcleo, a través de interacciones de Kpnp 1 con las nucleoporinas (Nups) que comprenden el NPC. Una vez en el lado nucleoplasmático del NPC, el complejo se disocia por la unión de RanGTP a Kpn£1. RanGTP y Kpna comparten un sitio de unión superpuesto en la proteína Kpn£1, sin embargo, RanGTP tiene una mayor afinidad con el sitio y, por consiguiente, desplaza a Kpna, lo que provoca la liberación de la proteína de carga (Moroianu J., Blobel G., Radu A., Nuclear protein import: Ran-GTP dissociates the karyopherin alphabeta heterodimer by displacing alpha from an overlapping binding site on beta. Proc Natl Acad Sci U S A, 9 de julio de 1996;93(14):7059-62). Tras la liberación de la carga, RanGTP-Kpnpi se transloca de nuevo en el citoplasma donde RanGTP se hidroliza en RanGDP y Kpnpi se libera para otra ronda de transporte nuclear. Si bien Kpnpi transporta sus proteínas de carga en conjunto con un adaptador, puede funcionar por sí solo, por ejemplo, en el transporte de la proteína de unión al elemento regulador del esterol 2 (SREBP-2) (Nagoshi E., Imamoto N., Sato R., Yoneda Y., Nuclear import of sterol regulatory element-binding protein-2, a basic helix-loop-helix-leucine zipper (bHLH-Zip)-con- taining transcription factor, occurs through the direct interaction of importin beta with HLH-Zip. Mol Biol Cell, julio de 1999;10(7):2221-33J.
Se sabe que el ARNm y la proteína de Kpnpi se expresan a niveles elevados en tumores cervicales y líneas celulares (Van der Watt P. J., Maske C. P., Hendricks D. T., Parker M. I., Denny L., Govender D. y col. The Karyopherin proteins, Crm1 and Karyopherin betal, are overexpressed in cervical cancer and are critical for cancer cell survival and proliferation. Int J Cancer, 15 de abril de 2009;124(8):1829-4). El promotor es más activo en las células de cáncer cervical debido a su activación por el regulador del ciclo celular, E2F (Van der Watt P. J., Ngarande E., Leaner V. D., Overexpression of Kpnbetal and Kpnalpha2 Importin Proteins in Cancer Derives from Deregulated E2F Activity. PLoS One 2011;6(11):e27723). Smith y col. (2010) encontraron que el ARNm de Kpnpi estaba elevado en las líneas celulares de cáncer de ovario y transformaba las células ováricas y Kuusisto y col. (2012) también describieron niveles elevados de Kpn£1 en varias líneas celulares transformadas (Smith E. R., Cai K. Q., Smedberg J. L., Ribeiro M. M., Rula M. E., Slater C. y col., Nuclear entry of activated MAPK is restricted in primary ovarian and mammary epithelial cells. PLoS One 2010;5(2):e9295; Kuusisto H. V., Wagstaff K. M., Alvisi G., Roth D. M., Jans D.A., Global enhancement of nuclear localization-dependent nuclear transport in transformed cells. FASEB J., marzo de 2012;26(3):1181-93).
Los niveles elevados de Kpn£1 pueden sugerir que la proteína Kpn£1 está asociada con la transformación celular y el cáncer. De hecho, la inhibición de la expresión de la proteína Kpn£1 en células cancerosas conduce a la apoptosis (Van der Watt y col., 2009; Angus y col., 2014), enfatizando el papel de esta proteína en el desarrollo del cáncer. La inhibición de la expresión de la proteína Kpn£1 en células no cancerosas, sin embargo, tiene solo un efecto menor sobre la viabilidad celular (Van der Watt y col., 2009; Angus L., Van der Watt P. J., Leaner V. D., Inhibition of the nuclear transporter, Kpnbeta1, results in prolonged mitotic arrest and activation of the intrinsic apoptotic pathway in cervical cancer cells. Carcinogenesis, 7 de enero de 2014), apuntando a un uso potencial de Kpn£1 como diana de tratamiento contra el cáncer (Van der Watt P. J., Stowell C. L., Leaner V. D., The nuclear import receptor Kpnbeta1 and its potential as an anti-cancer therapeutic target. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 2013;23(1):1-10J.
Los compuestos de la fórmula general I, el Compuesto II y el Compuesto III inhiben la importación nuclear de proteínas de carga Kpn£1 tales como p65/NFBK, inducen la muerte celular en células cancerosas mediante apoptosis e inhiben la proliferación de células cancerosas.
Durante los estudios contra el cáncer de los compuestos de las líneas celulares de la fórmula I a III y los cultivos de tejidos se utilizaron:
Líneas celulares y cultivo de tejidos
Se generó un plásmido de expresión de GFP-Kpna2 (pEGFP-C1-Kpna2) mediante la inserción de un fragmento de
ADNc Kpna2 humano escindido de Xhol/BamHl en pEGFP-C1 (Clontech, Mountain View, C. A., EE. UU.). La construcción se transfectó de forma estable en células de cáncer de cuello uterino CaSki (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, M. D., EE. UU.) y un grupo de células que expresan niveles moderados de GFP-Kpna2 se seleccionó mediante análisis FACS y se mantuvo en
Eagle 's Medium (DMEM), que contiene un 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Gibco, Paisley, Escocia), 100 U/ml de pencillina, 100 mg/ml de estreptomicina y 200 mg/ml de G418 (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.). Todas las demás líneas celulares se mantuvieron en DMEM que contenía un 10 % de FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina, excepto por las células epiteliales esofágicas humanas inmortalizadas con hTERT normal, EPC2-hTERT, (obtenidas del Prof. A. K. Rustgi (Universidad de Pennysylvania, Filadelfia, EE. UU.)), que se cultivaron en medios libres de suero de queratinocitos (KSFM), complementados con 50 mg/ml de extracto de hipófisis bovina (BPE), 1 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF) y 100 U/ml de pencillina y 100 mg/ml de estreptomicina, y células de cáncer de mama benignas MCF12A (obtenidas de la ATCC), que se mantuvieron en un 50 % de JAMONES F12 y un 50 % de DMEM, complementados con un 5 % de FBS, 100 U/ml de pencillina, 100 mg/ml de estreptomicina 20 ng/ml de EGF (Gibco), 100 ng/ml de toxina del cólera (Sigma), 10 mg/ml de insulina (Gibco) y 500 ng/ml de hidrotisona (Sigma). Las células KYSE30 y KYSE150 se obtuvieron de DSMZ (Berlín, Alemania) y las líneas celulares de carcinoma esofágico WHCO1, WHCO5 y WHCO6 se adquirieron del Dr. R. Veale (Jones G. J., Heiss N. S., Veale R. B., Thornley A. L., Amplification and expression of the TGF-alpha, EGF receptor and c-myc genes in four human oesophageal squamous cell carcinoma lines. Biosci Rep, octubre de 1993; 13(5):303-12). Los fibroblastos cutáneos normales FGO y DMB se obtuvieron del Departamento de Medicina, UCT. A menos que se especifique anteriormente, todas las demás líneas celulares se obtuvieron del ATCC.
Las determinaciones de IC50 se llevaron a cabo de la siguiente manera:
Se colocaron las células en placas de 96 pocillos y se trataron con concentraciones variables de un compuesto de prueba durante 48 horas, después de lo cual se añadió colorante MTT, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (Sigma), y se solubilizaron los cristales 4 horas, a continuación, usando reactivo de solubilización (SLS al 10 % en HCl 0,01 M). Las absorbencias se midieron a 595 nm al día siguiente usando un espectrofotómetro de microplacas BioTek (Winooski, V. T., EE. UU.) y las curvas IC50 se generaron usando GraphPad Prism.
La inhibición de la expresión de Kpnp1 en células cancerosas usando ARNip da como resultado la muerte celular a través de apoptosis, mientras que la inhibición en células normales tiene solo un efecto menor en la biología celular. Para verificar esto, se transfectó un panel de líneas celulares con ARNip de Kpnp1 y se monitoreó la viabilidad celular 5 días después de la transfección. La Figura 1 muestra una reducción significativa en el número celular después de la inhibición de Kpnp1 en el cáncer cervical, el cáncer esofágico y las líneas celulares transformadas, mientras que las células no cancerosas no se vieron relativamente afectadas. La inactivación de Kpnp1 en las células cancerosas y no cancerosas se confirmó mediante el análisis de Western Blot (Figura 2).
La destrucción selectiva de células cancerosas después de la inhibición de Kpnp1 con ARNip sugiere que un inhibidor de molécula pequeña de Kpnp1 puede tener el mismo efecto. Especialmente si el inhibidor se une a la región de unión a Ran y Kpna2 superpuesta de Kpnp1 correspondiente a los aminoácidos 331-363. Esta región de Kpnp1 se identificó previamente como crítica para su función, ya que su eliminación resultó en una incapacidad de Kpnp1 para transportar una carga de NLS-HSA al núcleo (Moroianu y col., 1996).
Se analizaron los posibles compuestos inhibidores para determinar su efecto sobre la viabilidad celular del cáncer, utilizando líneas celulares de cáncer esofágico (WHCO5 y KYSE180) y líneas celulares de cáncer cervical (HeLa y CaSki). Un ensayo MTT para la viabilidad celular reveló que los Compuestos A a K mostraron valores de IC50 de menos de 50 pM (Tabla 1).
Tabla 1. Valores de IC50 para derivados de quinoxalina en líneas celulares de cáncer de esófago (WHCO5 y KYSE180) y líneas celulares de cáncer de cuello uterino (HeLa y CaSki).
(continuación)
La estructura molecular de los Compuestos A a K incluye un resto quinoxalina y un resto benzimidazol. Se probó el efecto de la quinoxalina y el benzimidazol sobre la viabilidad celular de las células HeLA para determinar si las moléculas respectivas de quinoxalina y benzimidazol pueden tener propiedades contra el cáncer (Figura 3). No se observó ningún efecto de destrucción celular en un intervalo de concentración de hasta 6,5 pM de quinoxalina. El
benzimidazol tiene un efecto de destrucción celular a una concentración de IC50 muy alta de 2,078 pM. Sin embargo, el benzimidazol también puede considerarse inactivo ya que su IC50 está muy por encima del intervalo de las IC50 obtenidas usando los Compuestos A a K y los fármacos quimioterapéuticos actuales.
Los compuestos II y III se evaluaron para determinar su efecto sobre la viabilidad celular del cáncer utilizando las líneas celulares de cáncer cervical, CaSki y HeLa. Se determinaron los valores de IC50 en estas líneas celulares cancerosas, así como una línea celular no cancerosa, FGO. Un ensayo MTT para la viabilidad celular reveló que ambos compuestos mostraron efectos de destrucción celular de cáncer con valores de IC50 de menos de 50 pM (Tablas 2 y 3).
Tabla 2. Valores de IC50 para células CaSki, HeLa y FGO tratadas con el Compuesto II Intervalo de confianza del
Tipo de célula Línea celular IC50 (pM 95 %
Cáncer/ con transformación CaSki 11,4 10,47 -12,41
HeLa 14,36 10,2 - 20,2
Sin cáncer documen
Tabla 3. Valores de IC50 para células CaSki, HeLa y FGO tratadas con el Compuesto III Intervalo de confianza del
Tipo de célula Línea celular IC50 (pM 95 %
Cáncer/ con transformación CaSki 34,1 30,97 -37,56
HeLa 19,9 16,3-24,3
Sin cáncer documen 35,4 - 57,1
De manera similar al Compuesto A, los Compuestos II y III inhiben la importación nuclear de la proteína de carga Kpnp1 tal como se ilustra en la Figura 4, en la que se muestra el porcentaje de p65 nuclear con respecto al porcentaje de p65 citoplasmático cuando las células se dejan sin tratar, se tratan con PMA, el Compuesto A, el Compuesto III o el Compuesto II.
El Compuesto A y los Compuestos II y III inducen la muerte celular por cáncer mediante apoptosis como se observa mediante la escisión de PARP mostrada en la Figura 5. Los Compuestos II y II inhiben la proliferación celular como se ilustra en las Figuras 6 y 7, que muestran la proliferación celular monitoreada mediante el uso del ensayo MTT de células cancerosas HeLa (A), así como células no cancerosas FGO (B) cuando se tratan con concentraciones crecientes de los Compuestos II y III.
Con el fin de demostrar las propiedades anticancerosas de los compuestos de la fórmula general I, se describirán a continuación con más detalle la 3-(1H-benzimidazol-2-il)-1-(3-dimetilaminopropil)pirrolo[5,4-b]quinoxalin-2-amina (en lo sucesivo denominado "Compuesto A") y su acción inhibidora sobre las proteínas de importación.
Se utilizaron los siguientes procedimientos para estudiar la acción inhibidora del Compuesto A:
Microscopía de fluorescencia
Las células CaSki que expresan de forma estable GFP-Kpna2 se cultivaron en cubreobjetos de vidrio y se trataron con IC50 o 20 pM del Compuesto A durante 24 horas. Para los controles, se utilizaron volúmenes equivalentes de DMSO. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % antes de la microscopía de fluorescencia y los núcleos celulares se tiñeron con DAPI 0,5 mg/ml. Debido a la fluorescencia emitida por el Compuesto A en el canal de GFP, la señal del Compuesto A tuvo que excluirse de la señal de GFP al separar los espectros de emisión. Se utilizó un microscopio confocal Zeiss LSM 510 Meta y se capturaron imágenes utilizando la cámara ZEN 2009 con el software AxioVision asociado (versión 4.7). Las imágenes fueron editadas usando el navegador de imágenes Zeiss. Para la cuantificación, se analizaron 100 células de cada condición usando la Imagen J.
Extracción de proteínas nucleares y citoplasmáticas
El fraccionamiento de proteínas nucleares y citoplasmáticas se realizó utilizando el kit de extracción de proteínas nucleares NE-PER (ThermoScientific, Rockford, IL, EE. UU.), según las instrucciones del fabricante. Las células CaSki se trataron con IC50 del Compuesto A durante 48 horas o se transfectaron con ARNip de control 20 nM (sc-37007, Santa Cruz Biotechnology) o ARNip Kpnpl (sc-35736, Santa Cruz Biotechnology) durante 96 horas, antes de la extracción de proteínas. El análisis de Western Blot se realizó utilizando un anticuerpo anti-carioferina a2 (C-20) de
cabra (sc-6917, Santa Cruz Biotechnology) y un anticuerpo anti-NFYA de conejo (H-209) (sc-10779, Santa Cruz Biotechnology). Se utilizó un anticuerpo anti-p -tubulina (H-235) (sc-9104, Santa Cruz Biotechnology) para controlar la carga de proteína citoplasmática y un anticuerpo de proteína de unión a la caja anti-TATA (TBP) (N-12) de conejo (sc-204, Santa Cruz Biotechnology) para controlar la carga de proteína nuclear. La densitometría se realizó utilizando la imagen J.
Ensayos de luciferasa
Para evaluar las actividades de luciferasa AP-1 y p65, se colocaron 40 000 células CaSki en placas de 24 pocillos y se transfectaron con 50 ng de un indicador de luciferasa AP1 (que contiene cuatro copias del sitio de unión a AP-1) o 50 ng de un indicador de luciferasa p65 (que contiene cinco copias del sitio de unión a p65, Clontech, CA, EE. UU.) y 5 ng de pRL-TK (que codifica luciferasa de Renilla, Promega), usando 0,16 ml de reactivo lipídico TransFectinTM (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Al día siguiente, las células se trataron con 10 o 15 pM de Compuesto A. La actividad de luciferasa se midió 24 horas después del tratamiento con Compuesto A usando el sistema de ensayo Dual-LuciferaseR Reporter (Promega, Madison, WI, EE. UU.), según las instrucciones del fabricante. Las lecturas de luciferasa se midieron utilizando el luminómetro de microplaca VeritasTM (Promega) y las lecturas de luciferasa se normalizaron a luciferasa de Renilla en el mismo extracto.
Para evaluar la actividad de la luciferasa NFAT, se colocaron 30.000 células HeLa en placas por pocillo en placas de 24 pocillos y se transfectaron con 50 ng de plásmido GFP-NFAT (plásmido Addgene No. 24219, Gift de Jerry Crabtree (Beals C. R., Clipstone N. A., Ho S. N., Crabtree G. R., Nuclear localization of NF-ATc by a calcineurin-dependent, cyclosporin-sensitive intramolecular interaction. Genes Dev, 1 de abril de 1997;11(7): 824-34)), 50 ng de NFAT-luciferasa (plásmido Addgene No. 10959, donado por Toren Finkel (Ichida M., Finkel T., Ras regulates NFAT3 activity in cardiac myocytes. J Biol Chem, 2 de febrero de 2001;276(5): 3524-30)), y 5 ng de pRL-TK, utilizando 0,4 ml de reactivo de transfección GenecellinTM (Celtic Molecular Diagnostics, Sudáfrica). El plásmido indicador de luciferasa de NFAT contiene tres repeticiones en tándem de un fragmento de 30 pb del promotor de IL-2 que se sabe que se une a NFAT. Al día siguiente, las células se trataron con 10 o 15 pM del Compuesto A y después de una incubación durante la noche, se estimularon con 100 nM de TPA (Sigma) y 1,3 pM de lonomicina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.) durante 5 horas, después de lo cual se midió la actividad de la luciferasa.
Ensayos de proliferación celular
Para evaluar la proliferación celular después del tratamiento con el Compuesto A, se colocaron 5000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron con 5, 10 o 15 pM de Compuesto A, después de lo cual se monitoreó la proliferación celular cada 24 horas durante cuatro días, utilizando MTT.
Análisis del ciclo celular
Las células CaSki se colocaron en placas en placas de 60 mm y se trataron con la concentración adecuada del Compuesto A. Las células se recolectaron 24 horas después del tratamiento y se fijaron en etanol al 100 %, después de lo cual se tiñeron con yoduro de propidio y los perfiles de ciclo celular se analizaron usando un citómetro de flujo BD (BD Biosciences, NJ, EE. UU.). El análisis de datos se realizó utilizando el software ModFit 3.3.
Análisis de escisión de Parp
Las células CaSki se trataron con concentraciones variables del Compuesto A durante 12 horas, después de lo cual se cosecharon células y flotadores de células usando amortiguador RIPA (Tris-CI en 10 pM, pH de 7,4, NaCl en 150 pM, desoxicolato de sodio al 1 %, SDS al 0,1 %, Triton X-100 al 1 %, cóctel inhibidor de proteasa completo 13 (Roche, Mannheim, Alemania)) y se realizó un análisis de Western Blot, usando un anticuerpo anti-Parp1/2 (H-250) de conejo (sc-7150).
Extracciones de proteínas mitocondriales y citoplasmáticas
Las células se cultivaron en placas de 10 cm y se trataron con concentraciones variables del Compuesto A durante 24 horas. Las células se lisaron en amortiguador de fraccionamiento subcelular (250 pM de sacarosa, 20 pM de HEPES, 10 pM de KCI, 1,5 pM de MgCb, 1 pM de EDTA, 1 pM de EGTA, 1 pM de DTT y 13 de cóctel inhibidor de proteasa completo (Roche)), se pasaron a través de una aguja de 25 G y se incubaron en hielo durante 20 minutos. El sedimento nuclear se obtuvo después de la centrifugación a 720 g durante 5 minutos. El sobrenantante se centrifugó adicionalmente a 10.000 g y el sobrenadante resultante se utilizó como la fracción citoplasmática. El sedimento que contenía la fracción mitocondrial se lavó en amortiguador de fraccionamiento subcelular y se pasó a través de una aguja de 25 G. La fracción mitocondrial se sedimentó a 10.000 g y se resuspendió en amortiguador RIPA. El análisis de Western Blot se realizó utilizando un anticuerpo anti-Citocromo C de ratón (BD Pharmingen, San Diego, CA) y se utilizaron anticuerpos anti-p -tubulina (H235) (sc-9104, Santa Cruz) y anti-Pereroxiredoxina-3 (PRDX-3) (P1247, Sigma) como controles de carga de proteínas para fracciones citoplasmáticas y mitocondriales, respectivamente.
Modelos de tumores de xenoinjerto
Las células WHCO6 se cosecharon y resuspendieron en PBS. Para la inoculación del tumor, se implantaron células cancerosas (5 3 106 por ratón) s.c. en los flancos traseros de ratones desnudos hembra. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño palpable, se inició el tratamiento con fármaco, donde los ratones con tumores se aleatorizaron y se dosificaron i.p. con vehículo (DMSO) o Compuesto A (50 mg/kg), cada 2-3 días durante 3 semanas. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces por semana, utilizando calibradores, y el volumen tumoral se estimó utilizando la siguiente fórmula: volumen = (largo 3 ancho 3 ancho)/2. Los ratones se sacrificaron 3 semanas después del inicio del tratamiento farmacológico.
Análisis estadístico
Para todas las comparaciones de datos, la prueba t de Student se realizó utilizando Microsoft Excel, excepto para el estudio in vivo, en cuyo caso la prueba ANOVA de dos vías se realizó utilizando GraphPad Prism 5. Un valor de p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
El Compuesto A es un derivado de quinoxalina con fórmula molecular C22H23N7 y un peso molecular de 385,465 g/mol. El compuesto se obtiene en forma de polvo y es soluble en dimetilsulfóxido (DMSO).
Compuesto A
Un experto en la técnica apreciará que los compuestos de la fórmula general I y sus sales, donde R1 es un grupo alquilo C2-C5, ramificado o no ramificado, opcionalmente funcionalizado con un sustituyente seleccionado de entre el grupo que consiste en una amina, un imidazol, un alcohol o una morfolina; y donde R2 es un grupo hidrógeno o metilo tendrá los mismos o muy similares efectos de acción y eliminación celular del cáncer que los del Compuesto A.
El mecanismo de acción y el efecto de eliminación de células cancerosas del Compuesto A se describen adicionalmente en la siguiente sección de resultados. Un experto en la materia apreciará que los Compuestos B a K, que son estructuralmente similares al Compuesto A, tienen la misma actividad de inhibición o muy similar y efectos de destrucción celular de cáncer que el Compuesto A. Los Compuestos A a K tienen una forma y polaridad sustancialmente similares que es complementaria al sitio de unión en Kpnp1 y sus residuos circundantes. Un experto en la materia apreciará que los Compuestos A a K participan sustancialmente en las mismas interacciones de van der Waals e interacciones de enlace de hidrógeno con el sitio de unión y sus residuos circundantes para asociarse o unirse a este e inhibir la actividad de Kpnpl, induciendo así la apoptosis en células cancerosas.
Resultados
Prevención de la translocación nuclear GFP-Kpna2
El Compuesto A con capacidad de destrucción celular se evaluó para determinar su capacidad de bloquear la importación nuclear mediante el uso de un ensayo de detección basado en fluorescencia. El ensayo se basó en el hecho de que Kpna entra en el núcleo en un complejo con Kpnpl. Se etiquetó Kpna2 (Impal o Rch1) con GFP (Figura 8) y se monitoreó su localización después del tratamiento con los diversos compuestos, mediante microscopía de fluorescencia. Se anticipó que la localización de GFP-Kpna2 sería predominantemente nuclear; y que, después del tratamiento de células con compuestos que son efectivos para bloquear la importación nuclear mediada por Kpnp 1, GFP-Kpna2 sería incapaz de entrar en el núcleo y se acumularía en el citoplasma. El tratamiento con este compuesto dio como resultado la deslocalización de GFP-Kpna2 del núcleo al citoplasma. El Compuesto A inhibe la importación nuclear. Se observó que el Compuesto A fluorescía en sí mismo y, por consiguiente, la señal de fluorescencia del compuesto tuvo que excluirse de la señal GFP-Kpna2 al separar los espectros de emisión. Se contó la cantidad de células que contenían GFP-Kpna2 citoplasmático (se contaron más de 100 células por afección) y se observó un aumento significativo después del tratamiento con el Compuesto A (Figura 9), así como una disminución significativa en la señal de fluorescencia nuclear de GFP-Kpna2 (Figura 10).
Reducción de la importación nuclear de Kpna2 y NFY endógenos
Con el fin de confirmar que el Compuesto A bloquea la importación nuclear, se llevó a cabo un ensayo independiente
donde se aislaron fracciones de proteína citoplasmática y nuclear después del tratamiento de células con el Compuesto A. Se llevó a cabo un análisis de transferencia Western para determinar la localización de Kpna2 endógeno, ya que se esperaba que el tratamiento con un inhibidor efectivo de la importación nuclear evitaría que Kpna2 endógeno ingresara al núcleo. El tratamiento con el Compuesto A dio como resultado una disminución en la cantidad de Kpna2 en el núcleo (Figura 11). Sin embargo, la cantidad de Kpna2 en el citoplasma no aumentó como se esperaba, posiblemente debido a la degradación mejorada de Kpna2 cuando no pudo ingresar al núcleo, o alternativamente, debido a que se unió a la envoltura nuclear y, por consiguiente, no se contabilizó en las fracciones de proteína nuclear o citoplasma.
La localización de una carga Kpnp1 independiente, NFY-A (Kahle J., Baake M., Doenecke D., Albig W., Subunits of the heterotrimeric transcription factor NF-Y are imported into the nucleus by distinct pathways involving importin beta and importin 13. Mol Cell Biol, julio de 2005;25(13): 5339-54) también se investigó, y se descubrió de manera similar que disminuyó la fracción nuclear después del tratamiento con el Compuesto A, lo que respalda el hallazgo de que el Compuesto A probablemente bloqueaba la importación nuclear (Figura 11). La cuantificación densitométrica de los niveles de Kpna2 y NFY en experimentos repetidos confirmó una reducción significativa en los niveles de proteína nuclear después del tratamiento con el Compuesto A (Figura 12). Para verificar que el patrón de bandas observado después del tratamiento con el Compuesto A fue el esperado después de la inhibición de Kpnp1, se silenció Kpnp1 usando ARNip y fracciones de proteína nuclear y citoplasmática aisladas para el análisis de transferencia Western. La cantidad de Kpna2 fue menor en el núcleo después de la inhibición de Kpnp1 usando ARNip que respalda los resultados con el Compuesto A. De manera similar, la cantidad de NFY fue menor en la fracción nuclear después de la transfección de Kpnp1 ARNip (Figuras 13 y 14).
Prevención del acceso del factor de transcripción al núcleo
Dado que un inhibidor de la importación nuclear mediada por Kpnp-1 probablemente afectaría la importación de factores de transcripción en el núcleo, se realizaron ensayos de luciferasa para evaluar las actividades nucleares de AP-1 y p65, después del tratamiento con el Compuesto A, ya que se ha demostrado que los factores de transcripción dependen de Kpnp1 para la importación nuclear (Forwood J. K., Lam M. H., Jans D. A., Nuclear import of Creb and AP-1 transcription factors requires importin-beta 1 and Ran but is independent of importin-alpha. Biochemistry, 1 de mayo de 2001;40(17):5208-17; Liang P., Zhang H., Wang G., Li S., Cong S., Luo Y. y col. KPNB1, XPO7 and IPO8 Mediate the Translocation of NF-kappaB/p65 into the Nucleus. Traffic, noviembre de 2013;14(11):1132-43). Las actividades de AP-1 y p65-luciferasa se midieron después del tratamiento con el Compuesto A de células CaSki y, como se anticipó, ambas disminuyeron de manera dependiente de la dosis después del tratamiento (Figura 15).
El factor de transcripción NFAT también se desplaza entre el núcleo y el citoplasma de una manera dependiente de Kpnp 1 (Ishiguro K., Ando T., Maeda O., Ohmiya N., Niwa Y., Goto H. Acetate inhibits NFAT activation in T cells via importin beta1 interference. Eur J Immunol, agosto de 2007;37(8): 2309-16) y de manera dependiente de Crm1 (Kehlenbach R. H., Dickmanns A., Gerace L., Nucleocytoplasmic shuttling factors including Ran and CRM1 mediate nuclear export of NFAT In vitro. J Cell Biol, 18 de mayo de 1998;141(4):863-74). Sin embargo, su transporte nuclearcitoplasmático es único ya que se regula a través de la exposición al calcio (Shibasaki F., Price E. R., Milan D., McKeon F., Role of kinases and the phosphatase calcineurin in the nuclear shuttling of transcription factor NF-AT4. Nature, 25 de julio de 1996;382(6589):370-3), por lo que es predominantemente citoplasmático. Sin embargo, un aumento en los niveles de calcio intracelular conduce a su acumulación nuclear. Soderholm y col. (2011) mostraron por microscopía de fluorescencia que la inhibición de la importación nuclear a través de Kpnp1 impidió la acumulación nuclear de NFAT-GFP en respuesta a la estimulación con el ionóforo de calcio, ionomicina.
Se llevó a cabo un ensayo de NFAT nuclear después del tratamiento con ionomicina y Compuesto A, utilizando un indicador de luciferasa NFAT que se activa mediante NFAT nuclear. El éster de forbol TPA se utilizó para coestimular NFAT, como se ha demostrado previamente que el TPA y la ionomicina provocan la estimulación sinérgica de la actividad de la luciferasa NFAT ("Northrop J. P., Ullman K. S., Crabtree G. R., Characterization of the nuclear and cytoplasmic components of the lymphoid-specific nuclear factor of activated T cells (NF-AT) complex. J Biol Chem, 5 de febrero de 1993;268(4):2917-23). Mientras que los ensayos de luciferasa AP1 y p65 representados en la Figura 15 revelaron actividades de AP1 y p65 endógenas en respuesta al tratamiento con el Compuesto A, NFAT se expresó de forma ectópica en células HeLa.
Los resultados mostraron que la estimulación de células HeLa transfectadas con NFAT con TPA e ionomicina resultó en un aumento significativo en la activación del informante de NFAT, debido a la importación nuclear de NFAT (Figura 16). El tratamiento con el Compuesto A, el Compuesto II y el Compuesto III disminuyó significativamente la activación de NFAT, de una manera dependiente de la dosis, presumiblemente debido a su inhibición de la importación nuclear de NFAT (Figuras 16, 17 y 18). Como control positivo, las células se trataron con Ivermectina, un antiparasitario de amplio espectro que recientemente se descubrió que inhibe el transporte nuclear mediado por Karyopherin a/p (Wagstraff y col., 2012; Wagstaff K. M., Rawlinson S. M., Hearps A. C., Jans D. A., An AlphaScreen(R)-based assay for high- throughput screening for specific inhibitors of nuclear import. J Biomol Screen, febrero de 2011;16(2):192-200). Se realizó un ensayo de NFAT utilizando Ivermectina y, de manera similar al resultado obtenido con el Compuesto A, la inducción de la actividad de NFAT disminuyó significativamente tras el tratamiento con Ivermectina (Figura 19). Finalmente, la activación de NFAT se midió después del tratamiento de células con AG1478, un inhibidor
de EGF-R, y no se observó ningún cambio en la activación de NFAT (Figura 20).
Muerte de células cancerosas a través de la detención del ciclo celular y la inducción de la apoptosis
Para identificar un inhibidor de importación nuclear con actividad contra el cáncer, se evaluó el efecto de destrucción celular del Compuesto A mediante el uso de un panel de líneas celulares de diversos orígenes. Entre las líneas celulares analizadas, el Compuesto A no mostró preferencia por un tipo de cáncer particular y se descubrió que destruye las líneas celulares de cáncer de cuello uterino (HeLa, CaSki), esofágico (WHCO1, WHCO5, WHCO6), ovárico (A2780, CP70 y OVCAR3) y de origen mamario (MDA-MB-231, m Cf 7) con una IC50 de aproximadamente 10 |jM (Tabla 4).
Tabla 4. Valores de IC50 para células cancerosas, células transformadas y células no cancerosas tratadas con el
a del 95
Es importante destacar que el Compuesto A mostró toxicidad elevada en las líneas celulares transformadas o cancerosas con respecto a las líneas de fibroblastos no cancerosas. Mostró alrededor de 2 a 3 veces la selectividad hacia el cáncer o líneas celulares transformadas sobre células de fibroblastos no cancerosas.
Para confirmar que el Compuesto A fue más efectiva para destruir células cancerosas en comparación con las células no cancerosas, se cultivaron líneas celulares representativas de cáncer (cervical y esofágico) y no cancerosas en presencia del Compuesto A, y la proliferación celular se midió diariamente durante cinco días, usando ensayos MTT. La Figura 21 muestra que las células cancerosas eran altamente sensibles al Compuesto A, ya que dentro de las 24 horas se observó la muerte celular completa a concentraciones de 10 y 15 jM del Compuesto A (Figura 21 A-D). Este efecto se mantuvo durante todo el periodo de tiempo de 5 días, lo que confirma que no hubo una población de células que se recuperaron del tratamiento.
Sin embargo, las células de fibroblastos no cancerosas proliferaron con relativa normalidad en presencia del Compuesto A en 10 jM , pero a 15 jM la muerte celular del Compuesto A ocurrió dentro de las 24-48 horas (Figura 21 E y F). El resultado apunta a la sensibilidad diferencial de las células cancerosas y no cancerosas al Compuesto A, donde al tratamiento con 10 jM del Compuesto A, las células cancerosas sufrieron muerte celular al 100 %, mientras que las células no cancerosas no se vieron relativamente afectadas (Figura 22). Si bien anteriormente se demostró que la IC50 para las células no cancerosas estaba en el intervalo de 20-30 jM , las células murieron a 15 jM debido a que se colocaron menos células en la placa en el ensayo de proliferación celular.
La proliferación independiente del anclaje de las células cancerosas se midió en respuesta al tratamiento con el Compuesto A, ya que las células cultivadas de esta manera son más representativas de las células tumorales in vivo. Las células se cultivaron en placas recubiertas con poliheme y la proliferación celular se monitoreó 9 días después del tratamiento, utilizando ensayos MTT. Se observó que tanto las células cancerosas cervicales como las esofágicas no
pudieron formar colonias cuando se cultivaron en presencia del Compuesto A 10 j M, a diferencia de sus contrapartes no tratadas (Figura 23), lo que confirma la capacidad del Compuesto A de bloquear la proliferación de células cancerosas dependiente del anclaje e independiente del anclaje.
Se investigó el mecanismo de muerte celular inducida por el Compuesto A. Se realizó un análisis del ciclo celular y se descubrió que el tratamiento con el Compuesto A dio como resultado un aumento en el porcentaje de células en la etapa G1 del ciclo celular y una disminución correspondiente en el porcentaje de células en las etapas S y G2/M (Figuras 24 y 25). La inducción de un bloque de ciclo celular sugirió que la apoptosis podría activarse; por tanto, la escisión de poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP-1) se midió mediante análisis de transferencia Western como un indicador de apoptosis. PARP-1 se escinde en fragmentos de 89 y 24 kDa durante la apoptosis (Duriez P. J., Shah G. M., Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: a sensitive parameter to study cell death. Biochem Cell Biol 1997;75(4):337-49). El tratamiento con el Compuesto A dio como resultado un aumento en los niveles del PARP escindido de 89 kDa, asociado con una disminución en la presencia de Parp sin escindir (de 113 kDa) (Figura 26). La banda de 24 kDa no era visible.
Para confirmar de forma independiente la inducción de la apoptosis, se investigó la localización subcelular del citocromo C, ya que su liberación en el citoplasma es una característica de la apoptosis mediada por la vía mitocondrial intrínseca. Las células se trataron con el Compuesto A y fracciones de proteína mitocondrial y citoplasmática recolectadas para el análisis de transferencia Western. Curiosamente, el tratamiento con el Compuesto A dio como resultado la liberación del citocromo C de las mitocondrias en el citoplasma, de una manera dependiente de la dosis (Figura 27), lo que sugiere que la vía mitocondrial intrínseca se activa tras el tratamiento con el Compuesto A y es responsable de la muerte de las células cancerosas.
Inhibición del crecimiento tumoral en modelos de xenoinjertos de cáncer
El Compuesto A muestra citotoxicidad in vitro y se descubrió adicionalmente que tiene actividad antitumoral in vivo como se demostró con modelos de xenoinjerto de ratón. Los ratones se inocularon con células cancerosas WHCO6 y, una vez que los tumores habían alcanzado un tamaño palpable, los ratones se trataron con vehículo (dimetilsulfóxido (DMSO)) o Compuesto A cada tres días y se monitoreó el tamaño del tumor durante tres semanas. El tratamiento con el Compuesto A inhibe significativamente el crecimiento tumoral (Figura 28). La masa corporal de los ratones no cambió durante el curso del tratamiento con el Compuesto A y los ratones parecían sanos, lo que sugiere que no se experimentaron efectos secundarios adversos (Figura 29).
Para confirmar la capacidad del Compuesto A para bloquear la importación nuclear, las células se trataron con el Compuesto A y se monitoreó la localización de Kpna2, una proteína accesoria que forma un heterodímero con Kpnp1 en la vía de importación nuclear. Por consiguiente, Kpna2 depende en gran medida de Kpnp1 para su importación nuclear. Además, el rápido transporte de Kpna2 en el núcleo lo convierte en una herramienta particularmente útil para la identificación de inhibidores de importación nuclear. Tanto Kpna2 de tipo exógeno como endógeno se examinaron después del tratamiento con el Compuesto A y se descubrió que su localización nuclear se redujo en presencia del Compuesto A, lo que implica el Compuesto A como un inhibidor del transporte nuclear de Kpnp 1. Sin embargo, al analizar GFP-Kpna2 después del tratamiento con el Compuesto A, se descubrió que hubo variación en la extensión de la deslocalización de GFP-Kpna2 al citoplasma, por ejemplo, algunas células exhibieron únicamente GFP-Kpna2 citoplasmático después del tratamiento con el Compuesto A, mientras que otras exhibieron GFP-Kpna2 nuclear y citoplasmático. Se informa que la naturaleza de la interacción Kpna 2-Kpnp1 cambia en diferentes fases del ciclo celular (Yasuhara N., Takeda E., Inoue H., Kotera I., Yoneda Y. Importin alpha/beta-mediated nuclear protein import is regulated in a cell cycle-dependent manner. Exp Cell Res, 1 de julio de 2004;297(1):285-93). Por lo tanto, el uso de células asíncronas en el experimento, podría haber resultado en diferentes localizaciones de Kpna2 en diferentes células.
Además, se ha demostrado que Kpna2 puede ingresar al núcleo de una manera independiente de Kpnp 1, posiblemente para realizar sus otras funciones de transporte no nucleares, tal como su regulación de la progresión mitótica (Mliyamoto Y., Hieda M., Harreman M. T., Fukumoto M., Saiwaki T., Hodel A. E. y col., Importin alpha can migrate into the nucleus in an importin beta- and Ran-independent manner. EMBO J, 1 de noviembre de 2002;21(21):5833-42). Por consiguiente, es posible que, en ausencia de la función Kpnp1, algunos Kpna2 todavía puedan entrar en el núcleo.
La localización de otras proteínas de carga dependientes de Kpnp 1 también se analizó después del tratamiento con el Compuesto A, incluidos los factores de transcripción, NFY, AP-1, p65 y NFAT, todos los cuales mostraron una disminución de la importación nuclear tras el tratamiento con el Compuesto A. Todos estos factores de transcripción han demostrado depender de Kpnp1 para la importación nuclear en estudios previos, y la inhibición de su importación nuclear después de la inhibición de Kpnp1 destaca la medida en que la inhibición de la importación nuclear puede afectar los procedimientos celulares cruciales para la supervivencia de las células cancerosas.
Dado que se descubrió que el Compuesto A inhibía la importación nuclear, se analizó su efecto de destrucción celular y se descubrió que las células cancerosas eran más sensibles al tratamiento con el Compuesto A que las células no cancerosas. Hay evidencia sustancial en la literatura de que los inhibidores de exportación nuclear dirigidos a Crm1
exhiben una actividad anticancerosa potente, pero solo efectos mínimos en células normales (Etchin J., Sun Q., Kentsis A., Farmer A., Zhang Z. C., Sanda T. y col., Antileukemic activity of nuclear export inhibitors that spare normal hematopoietic cells. Leukemia, enero de 2013;27(1):66-74; Mutka S. C., Yang W. Q., Dong S. D., Ward S. L., Craig D. A., Timmermans P. B. y col., Identification of nuclear export inhibitors with potent anti-cancer activity in vivo. Cancer Res, 15 de enero de 2009;69(2):510-7; Pathria G., Wagner C., Wagner S. N., Inhibition of CRM1-mediated nucleocytoplasmic transport: triggering human melanoma cell apoptosis by perturbing multiple cellular pathways. J Invest Dermatol, diciembre de 2012;132(12):2780-90).
Además, la inhibición de Kpnpl usando ARNip también resulta en la destrucción selectiva de células cancerosas, por lo que la apoptosis se induce después del silenciamiento de Kpnpl en células cancerosas, mientras que la inhibición de Kpnpl en células no cancerosas tiene solo un efecto menor en la biología celular (Van der Watt y col., 2009). Como el objetivo de la terapia contra el cáncer es promover la muerte de las células cancerosas sin causar demasiado daño a las células normales, esta selectividad es ventajosa para el desarrollo de fármacos antinucleares de importación con potencial terapéutico. La selectividad puede derivar del aumento de las tasas de transporte nuclear en las células cancerosas en comparación con las células normales y, por consiguiente, una mayor dependencia de la maquinaria de transporte nuclear (Kuusisto y col., 2012). De manera alternativa, también es posible que la selectividad hacia las células cancerosas se deba a que las células cancerosas se "preparan" para someterse a apoptosis (más cerca del umbral apoptótico) en comparación con las células normales (Ni Chonghaile T., Sarosiek K. A., Vo T. T., Ryan J. A., Tammareddi A., Moore V. G., y col., Pretreatment mitochondrial priming correlates with clinical response to cytotoxic chemotherapy. Science, 25 de noviembre de 2011;334(6059):1l29-33).
La inhibición de la importación nuclear está asociada con un aumento en múltiples marcadores de apoptosis en células cancerosas. Estos incluyen una detención del ciclo celular G1, la escisión de Parp y la liberación del citocromo C de las mitocondrias en el citoplasma. La liberación del citocromo C es una característica de la vía de apoptosis intrínseca mediada por las mitocondrias, lo que sugiere que el tratamiento con el Compuesto A da como resultado la activación de la vía apoptótica intrínseca. La vía de apoptosis intrínseca se induce de manera similar después de la inhibición de Crm1 en células leucémicas (Etchin y col., 2013) y la inhibición de Kpnpl en células de cáncer cervical usando ARNip (Angus y col., 2014). La apoptosis es probablemente inducida por la mala localización de proteínas clave después de la inhibición de la importación nuclear y, por consiguiente, la interrupción de la homeostasis celular. Los compuestos A a K son, por consiguiente, nuevos inhibidores de la importación nuclear y presentan actividad contra el cáncer in vitro. El Compuesto A muestra actividad contra el cáncer in vitro e in vivo.
Los nuevos inhibidores de la importación nuclear tienen efectos anticancerígenos. En particular, se ha encontrado que los compuestos de la fórmula I a III descritos anteriormente muestran efectos contra el cáncer. Se ha demostrado que el Compuesto A muestra actividad contra el cáncer al inhibir la importación nuclear e inducir la apoptosis celular. Un experto en la materia apreciará que los Compuestos B a K inducen la apoptosis celular mediante el mismo mecanismo de acción o uno similar al del Compuesto A. Se ha demostrado que el Compuesto II y el Compuesto III tienen actividad contra el cáncer asociada con la inhibición de la importación nuclear.
En consecuencia, los compuestos de la fórmula general I (incluidos los Compuestos A a K) y los Compuestos II y III, su estereoisómero o sales pueden utilizarse en el tratamiento contra el cáncer. Más específicamente, se proporciona para que los Compuestos A a K y los Compuestos II y III encuentren uso en el tratamiento contra el cáncer, en particular, pero no limitado a, cáncer cervical, esofágico, ovárico y de mama.
Más específicamente, se prevé que los Compuestos de la fórmula general I, donde Ri es un grupo alquilo C2-C5, ramificado o no ramificado, opcionalmente funcionalizado con un sustituyente seleccionado de entre el grupo que consiste en una amina, un imidazol, un alcohol o una morfolina; y donde R2 es un hidrógeno o un grupo metilo y los Compuestos II y III, sus estereoisómeros o sales pueden usarse para tratar crecimiento o neoplasia anormal.
Los compuestos de la fórmula general I, donde Ri es un grupo alquilo C2-C5, ramificado o no ramificado, opcionalmente funcionalizado con un sustituyente seleccionado de entre el grupo que consiste en una amina, un imidazol, un alcohol o una morfolina; y donde R2 es un grupo hidrógeno o metilo y los Compuestos II y III, sus estereoisómeros o sales pueden usarse para tratar una neoplasia maligna o cáncer seleccionado de entre el grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, melanoma, enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin, leucemia linfocítica aguda o crónica, mieloma múltiple, neuroblastoma, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón, tumor de Wilms, carcinoma cervical, carcinoma testicular, sarcoma de tejido blando, macroglobulinemia primaria, carcinoma de vejiga, leucemia granulocítica crónica, carcinoma cerebral primario, melanoma maligno, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de estómago, carcinoma de colon, insulinoma pancreático maligno, carcinoma carcinoide maligno, melanoma maligno, carcinoma de corio, micosis fungoide, carcinoma de cabeza o cuello, sarcoma osteogénico, carcinoma pancreático, leucemia granulocítica aguda, leucemia de células pilosas, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi, carcinoma genitourinario, carcinoma tiroideo, carcinoma esofágico, hipercalcemia maligna, hiperplasia cervical, carcinoma de células renales, carcinoma endometrial, policitemia vera, trombocitosis esencial, carcinoma de la corteza suprarrenal, cáncer de piel, carcinoma prostático, cáncer de laringe, cáncer vulvar o cáncer testicular.
Dicho uso en el tratamiento contra el cáncer implica la actividad inhibidora de los Compuestos A a K de una proteína
de transporte nuclear, Kpnpl, mediante la unión a Kpnpl en células en un sitio de unión superpuesto en Kpnpl que se une a la carioferina a (Kpna) y la proteína nuclear de unión a GTP Ran. Para encontrar uso en el tratamiento contra el cáncer, los Compuestos A a K, el Compuesto II y el Compuesto III inhiben la importación de proteínas y factores de transcripción Kpna, AP-1, P65, NFAT en el núcleo de una célula e induce apoptosis celular, de forma selectiva en células cancerosas.
Una concentración terapéuticamente efectiva de cualquiera de los Compuestos A a K y los Compuestos II y III, sus estereoisómeros o sales, o una combinación de cualesquiera dos o más de los Compuestos A a K y los Compuestos II y III, sus estereoisómeros o sales oscilan dependiendo del compuesto, pero es inferior a 100 j M, preferentemente inferior a 50 j M, más preferentemente menor a alrededor de 10 j M.
Los compuestos de la fórmula I a III, sus estereoisómeros o sales farmacéuticamente aceptables se pueden administrar a un paciente que lo necesita de cualquier manera adecuada y pueden formar el ingrediente activo de un medicamento. Dicho medicamento puede incluir otros ingredientes que incluyen adyuvantes y vehículos.
Cualquiera de los compuestos de la fórmula I a III, sus estereoisómeros o sales o una combinación de cualquiera de dos o más de los compuestos de la fórmula I a III sus estereoisómeros o sales, se puede utilizar como un medicamento para tratar el cáncer y también se pueden usar en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento contra el cáncer. Dichos medicamentos pueden tener cualquier forma adecuada.
Se considera que los compuestos de la fórmula I a III, sus estereoisómeros y/o sales farmacéuticamente aceptables se pueden usar para tratar el cáncer cervical, esofágico, ovárico y de mama, en particular, pero se contempla que otras formas de cáncer, tal como se enumeraron anteriormente, también se pueden tratar con estos compuestos.
A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, a menos que el contenido requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros establecido, pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros.
Claims (7)
1. Un compuesto de la fórmula I o una sal del mismo para su uso en el tratamiento contra el cáncer,
donde R1 es un grupo alquilo C2-C5, ramificado o no ramificado, opcionalmente funcionalizado con un sustituyente seleccionado de entre el grupo que consiste en una amina, un imidazol, un alcohol o una morfolina; y donde R2 es un hidrógeno o un grupo metilo.
2. El compuesto para uso según la reivindicación 1, donde R1 se selecciona de entre:
3. El compuesto para uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el compuesto de la fórmula I se selecciona de:
4. El compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el cáncer se selecciona de entre cáncer cervical, esofágico, ovárico, de mama y otras formas de cáncer.
5. El compuesto para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el compuesto de
la fórmula I es
6. Un compuesto de la fórmula II o una sal del mismo para su uso en el tratamiento contra el cáncer.
7. Un compuesto de la fórmula III, un estereoisómero o una sal del mismo para su uso en el tratamiento contra el cáncer.
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