ES2927921T3 - Métodos que utilizan paneles de metabolitos para el diagnóstico y diferenciación de la encefalopatía neonatal - Google Patents

Abstract

La invención generalmente se refiere a la identificación de metabolitos y firmas (paneles) de metabolitos, que son aplicables como biomarcadores en el diagnóstico clínico, en particular para la encefalopatía neonatal. Son herramientas útiles en el diagnóstico clínico diferencial para la detección temprana de lesiones cerebrales, la determinación de las áreas cerebrales afectadas por las agresiones y la predicción de resultados neurológicos adversos y también se pueden aplicar para diagnosticar la progresión de la enfermedad y el efecto del tratamiento. La presente invención se refiere más particularmente a un método in vitro para predecir la probabilidad de encefalopatía neonatal de distintas áreas del cerebro, la identificación de las áreas del cerebro afectadas por la encefalopatía neonatal y el riesgo de daño cerebral y el pronóstico y resultado neurológico debido a la identificación del tipo y extensión del daño de distintos tejidos cerebrales, en particular del hipocampo y/o ganglios basales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos que utilizan paneles de metabolitos para el diagnóstico y diferenciación de la encefalopatía neonatal

La invención se refiere en general a los métodos que hacen uso de firmas (paneles) de metabolitos, que son aplicables como biomarcadores en el diagnóstico clínico de la encefalopatía neonatal. Son herramientas útiles en el diagnóstico clínico diferencial para la detección temprana de tejidos cerebrales afectados por daño cerebral y también pueden aplicarse en el diagnóstico de la progresión de la enfermedad y la determinación de las áreas cerebrales afectadas y la determinación del resultado neurológico adverso asociado. La presente invención se refiere más particularmente a un método in vitro para predecir la probabilidad de encefalopatía neonatal de distintas áreas del cerebro, la identificación del área o áreas del cerebro afectadas por la encefalopatía neonatal y el riesgo de daño cerebral y el pronóstico y resultado neurológico debido a la identificación del tipo y extensión del daño de distintos tejidos cerebrales del hipocampo y/o ganglios basales.

Antecedentes de la invención

La encefalopatía neonatal (NE) es una afección grave con consecuencias para toda la vida. La NE es la causa más importante de morbilidad y mortalidad en el recién nacido a término. Alrededor del 10% de los afectados muere y el 25% sufre una discapacidad grave debido a complicaciones a largo plazo, tales como parálisis cerebral, retraso mental con dificultades de aprendizaje, deficiencias visuales cerebrales y/o epilepsia. Sus consecuencias a largo plazo imponen una gran carga sobre el niño y la familia y sobre los presupuestos sanitarios de todo el mundo. El coste estimado del tratamiento de las secuelas de NE en los Estados Unidos es de alrededor de US $750,000 por paciente. Una de las principales razones de la NE es la asfixia pre, peri y posnatal, una afección en la que el feto o el recién nacido carecen de oxígeno. En el mundo occidental alrededor del 0.9% de los recién nacidos, alrededor de 130.000 en el mundo desarrollado y 30.000 en la Unión Europea sufren de una forma moderada a grave de asfixia perinatal. Sin embargo, la NE no siempre podía explicarse por una asfixia de moderada a grave y, a menudo, no podía identificarse la causa de la NE. Se ha demostrado que los fetos/recién nacidos con asfixia más bien leve, que inicialmente parecen recuperarse sin complicaciones, tendrán problemas de comportamiento en la infancia, que se remontan a la lesión perinatal.

Un estudio publicado en Lancet sugiere que la definición de NE no incluye a todos los pacientes con resultados neurológicos a largo plazo después de la resucitación (Odd DE, Lewis G, Whitelaw A, Gunnell D. Lancet. 9 de mayo de 2009; 373(9675): 1615-22). Sin embargo, los infantes reanimados asintomáticos de la encefalopatía "clásicamente definida" que experimentan daño cerebral real (o son propensos al daño cerebral real) podrían resultar en una mayor proporción de adultos con coeficiente intelectual bajo que aquellos que desarrollan síntomas neurológicos compatibles con la encefalopatía. Según esta publicación, el 40 % de los casos con resultados neurológicos adversos a largo plazo no se detectan con los medios de diagnóstico actuales y de última generación. Por lo tanto, en resumen, la encefalopatía neonatal y sus consecuencias a largo plazo es una carga enorme para el niño y para su familia. En consecuencia, hay una falta de marcadores tempranos que identifiquen a los recién nacidos con riesgo de NE.

Hasta la fecha, la terapia se limitaba a la atención de apoyo, incluida la oxigenación adecuada y la restauración de la circulación mediante una reanimación adecuada, rápida y eficaz. Es vital mantener una ventilación adecuada, la presión arterial sistémica, la perfusión tisular y la normoglucemia, controlar las convulsiones y corregir los trastornos electrolíticos y ácido-básicos. Sin embargo, en los últimos años se ha introducido la hipotermia (hipotermia de todo el cuerpo o enfriamiento selectivo de la cabeza) para reducir la morbilidad y la mortalidad después de la asfixia perinatal en los recién nacidos a término. En un metanálisis reciente que combinó los resultados de 1320 recién nacidos, se encontró que el efecto de la hipotermia moderada se asoció con una reducción moderada de la muerte y el deterioro neurológico a los 18 meses. Es de suma importancia que el beneficio terapéutico de la hipotermia dependa en gran medida del momento de su inicio. Cuanto antes se haga el diagnóstico y cuanto antes se pueda iniciar la terapia, más neuroprotección se podrá lograr. En consecuencia, la detección temprana de la encefalopatía neonatal y la evaluación de la gravedad son vitales para el éxito terapéutico.

Las pruebas de diagnóstico actuales para evaluar si un recién nacido está en riesgo de desarrollar secuelas neurológicas tienen limitaciones importantes con baja sensibilidad y especificidad. Los criterios diagnósticos de encefalopatía neonatal en recién nacidos a término requieren i) signos de asfixia perinatal y posnatal, valores anormales de gases en sangre (aumento del déficit de bases, valores de lactato en sangre, pH bajo del cordón en la arteria umbilical (UApH) y necesidad de reanimación, y ii) signos de afectación cerebral y neurología anormal caracterizada por puntuaciones neurológicas (puntuación de Sarnat o Thompson) y cualquier presencia de actividad convulsiva y iii) demostración de evidencia electroencefalográfica de función cerebral anormal mediante el EEG estándar de diez derivaciones o de amplitud integrada. Estas pruebas establecidas, sin embargo, tienen importantes limitaciones. Recientemente se ha demostrado que los llamados "valores anormales de gases en sangre" no se correlacionan con el grado de hipoxia. Esto se refleja en la baja sensibilidad y especificidad de NE [Groenendaal, de Vroes Semin Neonatol 2000, Vol 5, 17-32]. La prueba más precisa actualmente establecida es el uso de EEG de amplitud integrada (aEEG) con una sensibilidad y especificidad del 80 % en las primeras 6 horas de vida. El uso de aEEG es difícil por su disponibilidad, experiencia requerida y tiempo. No está disponible en todos los hospitales de niños y en ninguna de las unidades de parto. Por lo tanto, el diagnóstico por aEEG solo se puede hacer después de la transferencia a una clínica infantil en la que se disponga de la herramienta y la experiencia médica. Además el proceso de implementación del aEEG y la evaluación de la señal toma por lo menos de 30 a 45 minutos. Esto es de particular importancia ya que se sabe que el tratamiento es más eficaz cuanto antes se inicia. Las tecnologías de imagen tales como la MRT (tomografía por resonancia magnética), sin embargo, son aplicables desde el tercer día después del nacimiento y, por lo tanto, no son útiles para el diagnóstico temprano y la terapia oportuna.

Los métodos de diagnóstico usados actualmente requieren tiempo y equipo apropiado con altos costes, no reconocen las partes afectadas del cerebro junto con el pronóstico individual, brindan resultados demasiado tarde para una terapia apropiada y con sensibilidades frecuentemente insatisfactorias. Estos medios de diagnóstico disponibles, por lo tanto, tienen limitaciones importantes tales como área bajo la curva (AUC) reducida y/o retraso en el diagnóstico o aumento de costes debido al equipo requerido. En consecuencia, estos procedimientos tampoco permiten una evaluación oportuna de una enfermedad aguda y de rápida evolución ni una diferenciación de las áreas cerebrales afectadas por la hipoxia. En general, la situación está lejos de ser satisfactoria y de proporcionar un diagnóstico rápido, confiable y preciso del daño cerebral en los recién nacidos, y mucho menos una diferenciación de las áreas o tejidos cerebrales afectados, un requisito previo, sin embargo, para la selección e inicio de la terapia adecuada; aún existe una necesidad urgente de diferenciar la lesión cerebral de cualquier otro estado de salud para permitir un tratamiento oportuno y adecuado.

Debido a estas limitaciones, los grupos de investigación académicos han estado buscando posibles biomarcadores alternativos de NE tales como interleucina-1b, 6, 8, 9, 12, NSE, S100, CK-BB, cadena pesada de neurofilamento axonal fosforilado (proteína2 pNF-H) hidrolasa 1 del extremo terminal C de ubiquitina, (proteína UCHL1) (Ramaswamy et al. (2009) Pediatr Neurol, Vol 40, 215-226). Sin embargo, aunque estos marcadores se han publicado, ninguno de ellos se convirtió finalmente en un producto de diagnóstico debido a las principales limitaciones. Los estudios no son uniformes y muestran una cantidad significativa de heterogeneidad con una tremenda variación en la evaluación de los resultados y variación en los criterios de inclusión. Con mayor frecuencia, la inclusión de pacientes se basó en pruebas "establecidas". Por lo tanto, la mayoría de los estudios confirman el diagnóstico de las pruebas establecidas y fueron más precisos para los infantes con lesiones graves que ya son fácilmente identificables y no brindan ninguna información adicional. La mayoría de los estudios tenían un tamaño de muestra pequeño, por lo que no es posible calcular el verdadero valor predictivo para todos los biomarcadores mencionados y no se ha intentado correlacionar las concentraciones de estos marcadores candidatos con las áreas del cerebro afectadas por NE. Además, la correlación es más fuerte a veces mucho después de la fase latente, que es demasiado tarde para un tratamiento temprano y, por lo tanto, eficaz.

En resumen, no existe un único biomarcador preciso disponible para diagnosticar o predecir la encefalopatía neonatal en recién nacidos en una etapa temprana, por ejemplo, inmediatamente después del nacimiento o cualquier biomarcador que brinde información sobre las áreas del cerebro afectadas por condiciones dañinas. Sin embargo, las lesiones detectables solo a nivel bioquímico, como mediante el uso de metabolitos endógenos como biomarcadores y no controlables por medios alternativos, pueden usarse para evaluar el resultado neurológico, lo que es de gran valor para el diagnóstico clínico.

En la detección y diagnóstico de pacientes clásicos, el médico utiliza una serie de herramientas de diagnóstico para diagnosticar a un paciente que padece una determinada enfermedad. Entre estas herramientas, la medición de una serie de parámetros de rutina únicos, por ejemplo, en una muestra de sangre, es un enfoque común de laboratorio para diagnóstico. Estos parámetros individuales comprenden, por ejemplo, actividades enzimáticas y concentración de enzimas y/o detección de enzimas.

En lo que se refiere a tales enfermedades, que pueden correlacionarse fácil e inequívocamente con un solo parámetro o un número reducido de parámetros obtenidos por química clínica, estos parámetros han demostrado ser herramientas indispensables en la medicina y el diagnóstico de laboratorio modernos. Sin embargo, en condiciones fisiopatológicas complejas, para las que no se dispone de un único parámetro o marcador asignable sin ambigüedades, el diagnóstico diferencial a partir de muestras de sangre o tejido es actualmente difícil o imposible.

Solo recientemente se describieron análisis metabolómicos para enfoques de diagnóstico específicos en el estado de la técnica:

De acuerdo con el documento WO 2011/012553 A1, se proporciona un método para predecir la probabilidad de aparición de una insuficiencia orgánica asociada a la inflamación, que se basa en el análisis metabolómico cuantitativo de una muestra biológica de un sujeto mamífero in vitro. En particular, se determina la concentración de acilcarnitinas, esfingomielinas, hexosas y glicerofosfolípidos en plasma mediante FIA-MS/MS. Además, los aminoácidos y las aminas biogénicas se analizaron mediante LC-M^s /MS de fase inversa en plasma. Los prostanoides, un término que resume las prostaglandinas (PG), los tromboxanos (TX) y las prostaciclinas, y los metabolitos de ácidos grasos oxidados en extractos de plasma se analizaron mediante LC-ESI-MS/MS y en extractos de homogeneizados de cerebro mediante extracción en fase sólida en línea (SPE)-LC-MS/MS. Además, el metabolismo energético (ácidos orgánicos) se analizó mediante LC-MS/MS. Para el análisis cuantitativo de los compuestos intermedios del metabolismo energético (glucólisis, ciclo del citrato, ruta de la pentosa fosfato, ciclo de la urea) se aplicó el método de cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC)-ESI-MS/MS.

El documento WO 2010/128054 A1, correspondiente al documento EP 2 249 161 A1, describe un método de diagnóstico de asfixia. En particular, dicho documento se refiere a un método para el diagnóstico in vitro, por ejemplo, asfixia perinatal y trastornos relacionados con la hipoxia, caracterizado por detectar cuantitativamente en al menos una muestra biológica de al menos un tejido de un sujeto mamífero una pluralidad de compuestos específicos de asfixia que tienen un peso molecular inferior a 1500 Dalton, excepto el lactato, que comprende las etapas de:

a) seleccionar dichos compuestos;

b) medir al menos uno de los parámetros seleccionados del grupo que consiste en: concentración, nivel o cantidad de cada metabolito individual de dicha pluralidad de metabolitos en dicha muestra, patrón molecular cualitativo y/o cuantitativo y/o firma molecular; y utilizar y almacenar el conjunto de valores obtenido en una base de datos; c) calibrar dichos valores comparando parámetros de referencia positivos para asfixia y/o negativos para asfixia; d) comparar dichos valores medidos en la muestra con los valores calibrados, para evaluar si el paciente es positivo para asfixia o negativo para asfixia.

El método de acuerdo con el documento WO 2010/128054 A1 usa compuestos específicos de asfixia como biomarcadores que son compuestos endógenos que se seleccionan del grupo que consiste en: aminas biogénicas; compuestos derivados de carnitina; aminoácidos; ácidos biliares; ácidos carboxílicos; eicosanoides; lípidos; precursores de colesterol, metabolitos de colesterol, prostanoides; y azúcares. Además, el documento WO 2010/128054 A1 se relaciona con un método para estimar in vitro la duración de la hipoxia en un paciente, un método para monitorear in vitro condiciones normóxicas, hipóxicas e hiperóxicas y/o terapia con oxígeno normobárica e hiperbárica y un kit para llevar a cabo el métodos de la misma.

Sin embargo, ni la asignación de concentraciones de metabolitos al daño cerebral total o NE ni a distintas regiones cerebrales ni al resultado neurológico en recién nacidos se aborda con los estudios metabolómicos divulgados en los documentos WO 2011/012553 A1 y WO 2010/128054 A1.

Solberg R y sus colegas ("Metabolomic Analyses of Plasma Reveals New Insights into Asphyxia and Resuscitation in Pigs", PLoS ONE, 2010, 5(3)) también divulgan la detección de una serie de metabolitos en plasma tomados antes y después de la hipoxia así como tras la reanimación, en lechones asfixiados, con el fin de evaluar los mecanismos fisiopatológicos de la hipoxemia en los recién nacidos. Se indujo hipoxemia de diferentes duraciones en lechones recién nacidos antes de la aleatorización para reanimación con 21 % o 100 % de oxígeno durante 15 min para detectar marcadores de la duración/gravedad de la hipoxia y para detectar marcadores de respuesta al tratamiento debido a diferentes protocolos de reanimación. Los metabolitos del estudio de Solberg et al., incluye aminoácidos, particularmente aminoácidos de cadena ramificada, metabolitos del ciclo de Krebs, incluidos alfa-cetoglutarato, succinato y fumarato, aminas biogénicas, ácidos biliares, prostaglandinas, esfingolípidos, glicerofosfolípidos, oxiesteroles y acilcarnitinas. La evaluación de las lesiones cerebrales en sí mismas, o los biomarcadores para detectar lesiones cerebrales en sí, no están incluidos en el estudio de Solberg et al. (véase la página 9, columna izquierda, líneas 2-3), y no se aborda la identificación o diferenciación de áreas o tejidos cerebrales o la evaluación del resultado neurológico.

Beckstrom et al. (J ChromatogrA, 2011, Vol 1218, 1899-1906) evaluaron si el perfil metabolómico puede revelar cambios de metabolitos en plasma después de la asfixia en un modelo de Macaca nemestrina de asfixia perinatal. El perfil metabólico de las muestras después de la asfixia mostró una marcada variabilidad en comparación con las muestras antes de la asfixia. Este análisis metabolómico confirmó el lactato y la creatinina como marcadores de asfixia y descubrió nuevos metabolitos que incluyen ácido succínico y malato (compuestos intermedios en el ciclo de Krebs) y ácido araquidónico (un ácido graso cerebral y marcador inflamatorio). Aunque estos cambios de metabolitos reflejan los cambios de la asfixia (de manera similar a la publicación de Solberg et al.), los cambios de metabolitos no estaban relacionados con la lesión cerebral, con la identificación o diferenciación de áreas o tejidos cerebrales o la evaluación del resultado neurológico.

Chu, C.Y et al. (Clinical Biochemistry, 2006, Vol 39, 203-209) describen análisis metabolómicos y bioinformáticos en recién nacidos asfixiados. En particular, analizaron la orina de dichos recién nacidos y definieron ocho ácidos orgánicos urinarios que se asociaron significativamente con el pronóstico de discapacidad del desarrollo neurológico con alta sensibilidad y especificidad. Además, dividieron dichos ácidos en dos clases de ácidos, uno que constaba de ácidos que estaban asociados con un buen resultado neonatal (etilmalonato, 3-hidroxi-3-metilglutarato, 2-hidroxiglutarato, 2-oxogluturato) y el otro con mal resultado (glutarato, metilmalonato, 3-hidroxibutirato, orotato). No se analizaron muestras de sangre; ni dichos metabolitos urinarios o combinaciones de los mismos se correlacionaron con lesión cerebral, áreas lesionadas del cerebro o cualquier puntuación de comportamiento neurológico. Sin embargo, todos estos metabolitos se determinaron solo en muestras de orina y, además, no dentro de las primeras horas de vida.

Finalmente, Mueller et al. ("Mass Spectrometric Quantifications of Organic Acids and Acylcarnitines in Early Random Urine Specimens of Newborns with Perinatal Complications: Feasability Study for the Prediction of the Neuro-Developmental Outcome", The Internet Journal of Pediatrics and Neonatology, 20077(2)) describen el uso de cuantificaciones espectrométricas de masas de ácidos orgánicos y acilcarnitinas para la predicción del resultado del neurodesarrollo en recién nacidos con complicaciones perinatales. Este grupo investigó una cantidad de 65 metabolitos determinados cuantitativamente (42 ácidos orgánicos, 22 acilcarnitinas, carnitina libre y 15 relaciones) en la orina de los infantes dentro de las primeras 72 horas de vida de los infantes. Se demostró una predicción confiable para el desarrollo de NE causada por asfixia severa con el monitoreo de metabolitos de la relación ácido láctico/creatinina en la orina de recién nacidos asfixiados. Sin embargo, un resultado inesperado del estudio de Mueller et al., fue el hallazgo de que la cantidad total de acilcarnitinas urinarias no difería significativamente entre el grupo de comparación y el grupo de pacientes con defectos neurológicos graves. No se describieron los cambios en la concentración de metabolitos en sangre relacionados con la lesión cerebral, la identificación o diferenciación de áreas o tejidos cerebrales o la evaluación del resultado neurológico. Muller et al., observaron un número limitado de combinaciones de ácidos carboxílicos metabólicos para predecir el resultado neurológico de los recién nacidos prematuros y a término al final del primer año de vida. Dichas combinaciones de metabolitos comprenden ácido láctico en combinación con uno o más de ácido 3-hidroxibutírico, ácido 3-hidroxiisovalérico, ácido metilmalónico, ácido 4-hidroxifenilláctico y 5-oxoprolina. Nuevamente, todos estos metabolitos se determinaron solo en muestras de orina y, además, no dentro de las primeras horas de vida.

En resumen, hasta ahora no se han identificado marcadores metabólicos o firmas de marcadores para indicar y diagnosticar NE en un punto de tiempo lo más temprano posible (definido como dentro de las primeras 6 horas después del incidente) en infantes. No se encuentra enseñanza en el estado de la técnica que sugiera que puedan existir marcadores aplicables a la identificación de encefalopatía neonatal y/o diferenciación de tejidos cerebrales alterados por condiciones hipóxicas. Solo un par de compuestos intermedios, posiblemente involucrados en la patobioquímica, se han discutido en el contexto más amplio del daño cerebral y los mediadores químicos que pueden contribuir al daño de la materia gris.

Por lo tanto, el problema que subyace a la presente invención es proporcionar un enfoque de diagnóstico temprano para evaluar ⁿ E en infantes con altas sensibilidades y especificidades, capaz de determinar los tejidos cerebrales involucrados y/o tejidos cerebrales dañados y/o propensos a daño futuro posterior y/o predecir el resultado neurológico. El problema de la presente invención se resuelve mediante la provisión de los métodos definidos en las reivindicaciones.

Sumario de la invención

Dado el notable y rápido potencial de NE en infantes para progresar hacia una condición irreversible y/o potencialmente mortal, la situación actual es altamente problemática e insatisfactoria. Un diagnóstico temprano y confiable de múltiples parámetros en tamaños de muestra pequeños para la identificación de pacientes con N^e potencial, la identificación de los respectivos tejidos cerebrales afectados y/o el resultado neurológico adverso es muy valioso ya que el tratamiento (hipotermia terapéutica inducida) está disponible y su eficiencia aumenta cuanto antes se inicie la terapia. El diagnóstico temprano, tal como se define en el presente documento, incluye el diagnóstico dentro de las primeras 6 horas después del nacimiento y la ventana de tiempo terapéutica para comenzar la hipotermia es de 6 horas.

Los problemas mencionados anteriormente se resuelven mediante las realizaciones definidas en las reivindicaciones adjuntas.

Como se explicará con más detalle a continuación, la presente invención hace uso de paneles de marcadores de NE, de lesión cerebral y resultado de comportamiento neurológico en infantes, su gravedad y distribución (áreas cerebrales afectadas). En los métodos inventivos, la presente invención hace uso de paneles de metabolitos que están presentes de manera diferente en los infantes afectados por NE. La presente invención también hace uso de paneles de una serie de metabolitos (o firmas de metabolitos) que están presentes de manera diferencial en sujetos dependiendo de la gravedad de la lesión cerebral en los ganglios basales o el hipocampo y el resultado neurológico.

La presente invención proporciona así una solución a los problemas de diagnóstico antes mencionados basada en la aplicación de una nueva tecnología en este contexto y en listas de metabolitos endógenos previamente desconocidas como marcador de diagnóstico para la identificación de NE y de tejidos cerebrales afectados. Dado que las diferencias de concentración de metabolitos en fluidos biológicos y tejidos proporcionan vínculos con las diversas respuestas fenotípicas, los metabolitos son candidatos a biomarcadores adecuados.

La presente invención permite una predicción y un diagnóstico temprano, preciso, rápido y sensible de NE en infantes con una asignación de daño a distintos tejidos cerebrales y una evaluación del resultado neurológico, al hipocampo y los ganglios basales a través de una medición de una pluralidad (2 o más) de biomarcadores metabólicos endógenos (metabolitos) tomados de una muestra biológica en un solo momento.

Esto se logra obteniendo un panel de biomarcadores en un único punto en el tiempo de infantes que tienen una lesión cerebral, o que se sospecha que tienen una lesión cerebral, y comparando el perfil de biomarcadores del individuo con valores o puntuaciones de biomarcadores de referencia. Los valores de los biomarcadores de referencia pueden obtenerse de una población de individuos (una "población de referencia") que, por ejemplo, sufren una lesión cerebral asignada a los tejidos cerebrales afectados, en particular el hipocampo y los ganglios basales, o que sufren una lesión cerebral asignable a distintos tejidos cerebrales o a una etapa particular en la progresión de la lesión cerebral. Si los valores del panel de biomarcadores o la puntuación del individuo contienen rasgos característicos apropiados de los valores de los biomarcadores o las puntuaciones de la población de referencia, entonces se diagnostica que es probable que el individuo tenga o desarrolle una lesión cerebral asignable al daño del hipocampo y/o los tejidos cerebrales de ganglios basales, como afectados por una lesión cerebral atribuible al daño del hipocampo y/o los tejidos cerebrales de los ganglios basales, lo que permite también una evaluación del resultado neurológico.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1a ilustra las capacidades predictivas (es decir, la precisión) de la combinación de metabolitos en función de un metabolito principal que se correlaciona con la extensión del daño cerebral en el hipocampo. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones que comprenden un metabolito principal (eje x) y hasta 6 metabolitos del conjunto de datos inicial. La Figura 1b ilustra las capacidades predictivas (es decir, la precisión) de todas las combinaciones adecuadas de metabolitos que se correlacionan con la extensión del daño cerebral en el hipocampo. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones de 2 a 6 metabolitos (eje x).

La Figura 1c ilustra las probabilidades de que los metabolitos individuales entren en una combinación de metabolitos que se correlacionan con la extensión de la lesión cerebral en el hipocampo. Las probabilidades se calculan sobre todos los modelos presentados en la Figura 1b. Los metabolitos se clasifican de acuerdo con su probabilidad de ser incluidos en un modelo y se grafican de forma consecutiva de acuerdo con sus respectivas contribuciones (es decir, positivas o negativas) a los modelos de regresión. Izquierda: metabolitos que inducen menos daño en el hipocampo. Derecha: metabolitos que inducen más daño en el hipocampo.

La Figura 2a ilustra las capacidades predictivas (es decir, la precisión) de la combinación de metabolitos en función de un metabolito principal que se correlaciona con la extensión del daño cerebral en los ganglios basales. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones que comprenden un metabolito principal (eje x) y hasta 6 metabolitos del conjunto de datos inicial. La Figura 2b ilustra las capacidades predictivas (es decir, la precisión) de todas las combinaciones adecuadas de metabolitos que se correlacionan con la extensión del daño cerebral en los ganglios basales. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones de 2 a 7 metabolitos (eje x).

La Figura 2c ilustra las probabilidades de que los metabolitos individuales entren en una combinación de metabolitos que se correlacionan con la extensión de la lesión cerebral en los ganglios basales. Las probabilidades se calculan sobre todos los modelos presentados en la Figura 2b. Los metabolitos se clasifican de acuerdo con su probabilidad de ser incluidos en un modelo y se grafican de forma consecutiva de acuerdo con sus respectivas contribuciones (es decir, positivas o negativas) a los modelos de regresión. Izquierda: metabolitos que inducen menos daño en los ganglios basales. Derecha: metabolitos que inducen más daño en los ganglios basales.

La Figura 3a ilustra las capacidades predictivas (es decir, la precisión) de la combinación de metabolitos en función de un metabolito principal que se correlaciona con la extensión de la lesión cerebral de acuerdo con lo descrito por la puntuación neurológica a las 48 h. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones que comprenden un metabolito principal (eje x) y hasta 7 metabolitos del conjunto de datos inicial.

La Figura 3b ilustra las capacidades predictivas (es decir, la precisión) de todas las combinaciones adecuadas de metabolitos que se correlacionan con la extensión de la lesión cerebral de acuerdo con lo descrito por la puntuación neurológica a las 48 h. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones de 2 a 6 metabolitos (eje x).

La Figura 3c ilustra las probabilidades de que los metabolitos individuales entren en una combinación de metabolitos que se correlacionan con la extensión de la lesión cerebral de acuerdo con lo descrito por la puntuación neurológica a las 48 h. Las probabilidades se calculan sobre todos los modelos presentados en la Figura 3b. Los metabolitos se clasifican de acuerdo con su probabilidad de ser incluidos en un modelo y se grafican de forma consecutiva de acuerdo con sus respectivas contribuciones (es decir, positivas o negativas) a los modelos de regresión. Izquierda: metabolitos que empeoran el resultado neurológico. Derecha: metabolitos que mejoran el resultado neurológico.

Descripción detallada de la invención

a) Definiciones

La "encefalopatía neonatal" (o NE) en el contexto de la presente invención se define como una función neurológica alterada en los primeros días de vida del recién nacido que da como resultado un desenlace adverso neurológico, psicológico y neuroconductual adverso a largo plazo. La NE puede ser el resultado de una amplia variedad de condiciones y, a menudo, permanece sin explicación. Dado que la naturaleza subyacente de la lesión cerebral que causa el deterioro neurológico en un recién nacido a menudo no se comprende bien, la NE se ha convertido en la terminología preferida para describir la disfunción del sistema nervioso central en el período neonatal, ya que no implica una fisiopatología subyacente específica.

"Lesión cerebral" o "daño cerebral" en el contexto de la presente invención se define como la aparición de un aumento de la muerte celular por apoptosis y necrosis en cualquier área del cerebro de cualquier tipo de célula y función y red neuronal anormales en comparación con controles sanos. La lesión cerebral se evalúa con la aEEG tanto para el patrón de EEG como para la actividad epiléptica, con una puntuación neurológica clínica, por histología (tinción con hematoxilina y eosina) y por actividad de caspasa-3 en 4 áreas corticales.

A menos que se indique lo contrario, los nombres abreviados de los compuestos químicos utilizados en este documento tendrán los siguientes significados que se pueden tomar de la Tabla 1 siguiente:

Tabla 1: Nombres Abreviaturas de compuestos químicos (metabolitos o marcadores metabólicos) analizados en el n x l r n inv n i n

continuación

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Como se usa en el presente documento, el término "metabolito" o "marcador metabólico" o "marcador metabólico de bajo peso molecular" denota compuestos orgánicos endógenos de una célula, un organismo, un tejido o que están presentes en líquidos corporales, en particular sangre, y en extractos o fracciones obtenidos a partir de las fuentes antes mencionadas. Ejemplos típicos de metabolitos son carbohidratos, lípidos, fosfolípidos, esfingolípidos y esfingofosfolípidos, aminoácidos, colesterol, hormonas esteroides y esteroles oxidados y otros compuestos como los recolectados en la base de datos Human Metabolite [Wishart DS et al., HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. Enero de 2007; 35 (edición de la base de datos): D521-6 (véase http://www.hmdb.ca/)] y otras bases de datos y la literatura. Esto incluye cualquier sustancia producida por el metabolismo o por un proceso metabólico y cualquier sustancia involucrada en el metabolismo. En particular, los metabolitos adecuados se definen en la Tabla 1 anterior. Más particularmente, pueden tener un peso molecular típicamente de hasta 1500 Dalton, como por ejemplo en el intervalo de 50 a 1500 Dalton.

Los metabolitos "específicos del hipocampo" se enumeran en la Tabla 2 a continuación. Estos metabolitos, individualmente o combinaciones de varios de tales metabolitos, pueden aplicarse como marcadores de lesiones cerebrales que afectan al hipocampo de un bebé.

Tabla 2: Metabolitos "es ecíficos del hi ocam o"

continuación

Los metabolitos "específicos de los ganglios basales" se enumeran en la Tabla 3 a continuación. Estos metabolitos, individualmente o combinaciones de varios de tales metabolitos, pueden aplicarse como marcadores de lesiones cerebrales que afectan a los ganglios basales de un bebé.

T l : M li " ífi l n li l "

continuación

Los metabolitos "específicos de la puntuación del comportamiento neurológico" se enumeran en la Tabla 4 a continuación. Estos metabolitos, individualmente o combinaciones de varios de tales metabolitos, pueden aplicarse como marcadores para los déficits del comportamiento neurológico de un bebé.

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continuación

"Metabolómica", como se entiende dentro del alcance de la presente invención, designa la medición cualitativa integral, o en particular cuantitativa, de varios metabolitos como se define en el presente documento; en particular, pero sin limitarse a, métodos analíticos tales como espectrometría de masas, acoplamiento de cromatografía líquida, cromatografía de gases y otros métodos de separación, tales como cromatografía con espectrometría de masas.

El término "metabolismo" se refiere a los cambios químicos que ocurren dentro de los tejidos de un organismo, incluyendo "anabolismo" y "catabolismo". El anabolismo se refiere a la biosíntesis o la acumulación de moléculas y el catabolismo se refiere a la descomposición de las moléculas.

Un "biomarcador" en este contexto es una característica que comprende datos de concentración de al menos dos, como por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, metabolitos (también designados como un "panel" de metabolitos, "firma" de metabolitos, "modelo" o "perfil" usando datos cuantitativos o datos de concentración directamente o procesados por cualquier transformación matemática (por ejemplo, por un método de clasificación) y evaluados como un indicador de procesos biológicos, procesos patogénicos, o respuestas a una intervención terapéutica asociada a NE en infantes.

Una "puntuación" en el contexto de la invención denota un valor, en particular un valor cuantitativo, generado a partir de datos de metabolitos por medio de cualquier transformación matemática o sometiendo a cualquier ecuación matemática y comparando estos datos con datos o datos transformados o procesados matemáticamente de una población de referencia.

El "inicio de NE en infantes" se refiere a una etapa temprana de NE en infantes, es decir, antes de una etapa en la que las manifestaciones clínicas son suficientes para respaldar una sospecha clínica de lesión cerebral en infantes. El mecanismo exacto por el cual un paciente adquiere n E en infantes no es un aspecto crítico de la invención. Los métodos de la presente invención pueden detectar cambios en la puntuación de biomarcadores independientemente del origen de la lesión cerebral en infantes. Independientemente de cómo surja la NE en los infantes (por ejemplo, por asfixia, hipoxia y/o isquemia), los métodos de la presente invención permiten determinar el estado de un paciente que tiene, o se sospecha que tiene, NE, clasificado según los criterios utilizados anteriormente.

"Específico" en el contexto de "metabolitos específicos" como se usó anteriormente puede no necesariamente entenderse como si dicho metabolito se detectara exclusivamente en o asociado con una determinada enfermedad o daño. Sin embargo, los cambios en el nivel o concentración de dicho metabolito cuando surge una determinada enfermedad o daño pueden ser más significativos que en otro tipo de enfermedad o daño.

Como se usa en el presente documento, el término "metabolitos específicos de NE en infantes" se refiere a metabolitos que están presentes o concentrados de forma diferente en un infante que padece NE en comparación con un infante sano.

Un "metabolito específico" o "metabolito específico de NE en infantes" está preferiblemente presente diferencialmente a un nivel que es estadísticamente significativo (por ej., un valor p ajustado < a 0.05 como el determinado usando ya sea un modelo lineal que incluye análisis de varianza y prueba t de Welch o sus versiones equivalentes no paramétricas). En este documento se describen ejemplos de metabolitos específicos de NE en infantes.

Los metabolitos "específicos de NE en infantes" abarca los grupos de metabolitos "específicos del hipocampo" (o "específicos de daño del hipocampo"), "específicos de ganglios basales" (o "específicos de daño de ganglios basales") o "específicos de puntuación de comportamiento neurológico" (véanse las Tablas 2, 3 y 4).

El término "presente diferencialmente" o "concentrado diferencialmente" describe la situación en la que un metabolito está presente en un nivel o concentración mayor o menor en una muestra obtenida de un paciente con NE si se compara con el nivel o la concentración de dicho metabolito observado para uno o más individuos sanos, es decir, que no sufren de NE.

Una "muestra biológica" puede contener cualquier material biológico adecuado para detectar los biomarcadores deseados y puede comprender material celular y/o no celular de un sujeto. La muestra se puede aislar de cualquier tejido biológico o fluido corporal adecuado tal como, por ejemplo, tejido y, en particular, sangre. "Sangre", como se usa en el presente documento, abarca sangre entera, plasma sanguíneo y suero sanguíneo. La muestra, como las muestras de sangre, puede analizarse sin o después de un tratamiento previo. Ejemplos de muestras de sangre previamente tratadas son sangre previamente tratada, tal como sangre con EDTA, o plasma con EDTA, plasma con citrato, plasma con heparina. Las muestras (de sangre) obtenidas originalmente o fracciones de las mismas pueden modificarse adicionalmente mediante métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo mediante fraccionamiento o dilución. Se puede realizar el fraccionamiento para eliminar los constituyentes que podrían perturbar el análisis. La dilución se puede realizar mezclando la muestra o fracción original (sangre) con una muestra líquida adecuada, tal como un tampón adecuado, para ajustar la concentración de los constituyentes, como por ejemplo del analito. Tales muestras modificadas (de sangre) ejemplifican muestras "derivadas de" la muestra de fluido corporal original recogida o aislada del cuerpo del individuo.

Un "nivel de referencia" de un metabolito significa un nivel del metabolito que es indicativo de un estado de enfermedad particular, fenotipo o falta del mismo, así como combinaciones de estados de enfermedad, fenotipos o falta de los mismos. Un nivel de referencia "positivo" de un metabolito significa un nivel que es indicativo de un estado de enfermedad o fenotipo particular. Un nivel de referencia "negativo" de un metabolito significa un nivel que es indicativo de la falta de un estado de enfermedad o fenotipo particular. Por ejemplo, un "nivel de referencia positivo de NE en infantes" de un metabolito significa un nivel de un metabolito que es indicativo de un diagnóstico positivo de NE en infantes en un sujeto, y un "nivel de referencia negativo de NE en infantes" de un metabolito significa un nivel de un metabolito que es indicativo de un diagnóstico negativo de NE en infantes en un sujeto. Un "nivel de referencia" de un metabolito puede ser una cantidad o concentración absoluta o relativa del metabolito, una presencia o ausencia del metabolito, un intervalo de cantidad o concentración del metabolito, una cantidad o concentración mínima y/o máxima del metabolito, una cantidad o concentración media del metabolito y/o una cantidad o concentración media del metabolito; y, además, los "niveles de referencia" de combinaciones de metabolitos también pueden ser proporciones de cantidades o concentraciones absolutas o relativas de dos o más metabolitos entre sí o un valor/puntuación compuesto obtenido por un modelo estadístico.

Como se usa en este documento, el término "procesador" se refiere a un dispositivo que realiza un conjunto de etapas de acuerdo con un programa (por ejemplo, un ordenador digital). Los procesadores, por ejemplo, incluyen unidades centrales de procesamiento ("CPU"), dispositivos electrónicos o sistemas para recibir, transmitir, almacenar y/o manipular datos bajo control programado.

Como se usa en este documento, el término "dispositivo de memoria" o "memoria de ordenador" se refiere a cualquier dispositivo de almacenamiento de datos que pueda ser leído por un ordenador, que incluye, entre otros, memoria de acceso aleatorio, discos duros, disquetes magnéticos, discos compactos, DVD, cintas magnéticas, memorias ultrarrápidas y similares.

La "espectrometría de masas" (MS) es una técnica para medir y analizar moléculas que implica fragmentar una molécula objetivo y luego analizar los fragmentos, en función de sus proporciones de masa/carga, para producir un espectro de masas que sirve como una "huella digital molecular". La determinación de la relación masa/carga de un objeto se realiza mediante la determinación de las longitudes de onda a las que ese objeto absorbe energía electromagnética. Hay varios métodos comúnmente utilizados para determinar la relación masa-carga de un ion, algunos miden la interacción de la trayectoria del ion con las ondas electromagnéticas, otros miden el tiempo que tarda un ion en viajar una distancia determinada, o una combinación de ambos. Los datos de estas mediciones de masa de fragmentos se pueden buscar en bases de datos para obtener identificaciones definitivas de moléculas objetivo.

El término "separación" se refiere a separar una mezcla compleja en sus proteínas o metabolitos componentes. Las técnicas comunes de separación de laboratorio incluyen la electroforesis en gel y la cromatografía.

El término "electroforesis capilar" se refiere a una técnica analítica automatizada que separa moléculas en una solución aplicando voltaje a través de capilares llenos de tampón. La electroforesis capilar generalmente se usa para separar iones, que se mueven a diferentes velocidades cuando se aplica voltaje, según el tamaño y la carga de los iones. Los solutos (iones) se observan como picos cuando pasan por un detector y el área de cada pico es proporcional a la concentración de iones en el soluto, lo que permite determinaciones cuantitativas de los iones.

El término "cromatografía" se refiere a un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida. Los datos cromatográficos de salida pueden usarse para la manipulación por la presente invención.

Un "espectro de masas" es un gráfico de datos producido por un espectrómetro de masas, que normalmente contiene valores m/z en el eje x y valores de intensidad en el eje y.

Un "pico" es un punto en un espectro de masas con un valor y relativamente alto.

El término "m/z" se refiere a la cantidad adimensional formada al dividir el número de masa de un ion por su número de carga. Durante mucho tiempo se ha llamado la relación "masa a carga".

Como se usa en el presente documento, los términos "detectar", "que detecta" o "detección" pueden describir el acto general de descubrir o discernir o la observación específica de un compuesto o composición o metabolito o biomarcador detectable.

"Evaluar" o "evaluación" se pretende que incluya la determinación tanto cuantitativa como cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la cantidad o concentración del metabolito o metabolitos a analizar presente en la muestra, y también obtener un índice, relación, porcentaje u otro valor indicativo del nivel de metabolito en la muestra. La evaluación puede ser directa o indirecta y, por supuesto, no es necesario que la especie química realmente detectada sea el propio analito, sino que puede ser, por ejemplo, un derivado del mismo. El propósito de la evaluación dicho metabolito o metabolitos puede ser diferente. En particular, se puede realizar una evaluación para evaluar la probabilidad (o el riesgo) de que ocurra daño cerebral o encefalopatía en un paciente. El propósito de una evaluación también puede ser la determinación de la gravedad (evaluación de la gravedad) del daño cerebral o la encefalopatía (opcionalmente ya diagnosticada) y el resultado neurológico a largo plazo en un paciente. La evaluación también abarca el análisis de la progresión o regresión del daño cerebral o la encefalopatía. La evaluación en el contexto de la invención también abarca la identificación y/o diferenciación de áreas cerebrales (como, por ejemplo, hipocampo y ganglios basales) afectadas (opcionalmente en diferente medida) por dicho daño.

A menos que se indique lo contrario, la expresión "paciente" se refiere en particular a un paciente "neonatal", en particular nacido prematuro o nacido a término.

Como se usa en el presente documento, el término "fracaso clínico" se refiere a un resultado negativo después del tratamiento de NE en infantes.

"Precisión" o "capacidad de predicción" como se usa en este documento es, a menos que se indique lo contrario, como se define en la sección experimental, a continuación.

b) Realizaciones de la invención

La presente invención se refiere a las siguientes realizaciones:

1. Un método de diagnóstico para la diferenciación temprana de tipos de daño cerebral, seleccionado de daños de los compartimentos cerebrales, hipocampo y ganglios basales, en recién nacidos humanos, cuyo método comprende evaluar en una muestra de sangre, obtenida de un recién nacido en particular de 1 minuto a 6 horas, o de 2 a 180 o de 5 a 120 minutos después del nacimiento o después de iniciar la reanimación o sospecha de NE, al menos un panel de marcadores metabólicos tempranos de bajo peso molecular indicativos de la presencia de lesión cerebral en un compartimento cerebral, seleccionado de hipocampo y ganglios basales, seleccionados de paneles de paneles relacionados con daños en el hipocampo 1 a 25 de la Tabla 8; y los paneles 1 a 181 relacionados con el daño de los ganglios basales de la Tabla 9.

2. Un método de diagnóstico para la predicción temprana de una anomalía neurológica del comportamiento causada por encefalopatía neonatal en recién nacidos humanos, cuyo método comprende

evaluar en una muestra de fluido corporal, preferiblemente sangre o suero, obtenida de un recién nacido en particular de 1 minuto a 6 horas, o de 2 a 180 o de 5 a 120 minutos después del nacimiento o después de iniciar la reanimación 0 sospecha de NE, al menos un panel de marcadores metabólicos tempranos de bajo peso molecular indicativos de anormalidad neurológica del comportamiento relacionada con la encefalopatía neonatal, seleccionados de los paneles 1 a 163 de la Tabla 10.

3. El método de una de las definiciones 1 a 2, en el que evaluar dicha muestra de sangre comprende:

a) detectar dicho panel de metabolitos;

b) determinar un perfil de dichos metabolitos detectados; y

c) comparar el perfil de los metabolitos detectados con un perfil de metabolitos estándar, diagnosticando así dicha enfermedad o daño,

y/o en donde se observa un aumento o disminución de al menos uno de dichos metabolitos de dicho al menos un panel.

Los métodos analíticos reivindicados se realizan in vitro.

c) Otras divulgaciones que no forman parte de la invención

A continuación se describen otros aspectos.

c1) Aplicaciones de diagnóstico

A continuación se describen ejemplos de métodos de diagnóstico.

Por lo tanto, por ejemplo, un método para diagnosticar (o ayudar en el diagnóstico) si un sujeto tiene NE comprende detectar la presencia o ausencia o un nivel diferencial de una pluralidad de metabolitos que son específicos para la lesión cerebral en los ganglios basales o el hipocampo en infantes o específico para resultados neurológicos adversos en infantes y diagnóstico de lesiones cerebrales en los ganglios basales, el hipocampo u otros tejidos cerebrales distintos en infantes o resultados neurológicos adversos en infantes en función de la presencia, ausencia o niveles de concentración diferenciales de estos compuestos. Los cambios de presencia, ausencia o concentración de estos metabolitos endógenos se utilizan para la diferenciación de regiones cerebrales dañadas y tejidos cerebrales dañados. Dichos metabolitos específicos se seleccionan de las Tablas 2, 3 o 4.

Se usa un programa de análisis basado en ordenador para traducir los datos sin procesar generados por el ensayo de detección (p. ej., la presencia, ausencia o cantidad de un metabolito específico de NE) en datos de valor predictivo para un médico. El médico puede acceder a los datos predictivos utilizando cualquier medio adecuado. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona el beneficio adicional de que el médico, que probablemente no esté capacitado en el análisis de metabolitos, no necesita comprender los datos sin procesar. Los datos se presentan directamente al médico en su forma más útil. Entonces, el médico puede utilizar inmediatamente la información para optimizar la atención del sujeto.

La siguiente descripción, que no forma parte de la invención, contempla cualquier método capaz de recibir, procesar y transmitir la información hacia y desde los laboratorios que realizan los ensayos, proveedores de información, personal médico y sujetos. A continuación, los datos del perfil se preparan en un formato adecuado para que los interprete un médico tratante. Por ejemplo, en lugar de proporcionar datos sin procesar, el formato preparado puede representar un diagnóstico o una evaluación de riesgos (p. ej., la probabilidad de que esté presente NE en los infantes) para el sujeto, junto con recomendaciones para opciones de tratamiento particulares. Los datos pueden mostrarse al médico mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, el servicio de creación de perfiles genera un informe que puede imprimirse para el médico (p. ej., en el punto de atención) o mostrarse al médico en un monitor de ordenador.

En algunas realizaciones, la información se analiza primero en el punto de atención o en una instalación regional. Luego, los datos sin procesar se envían a una instalación de procesamiento central para su posterior análisis y/o para convertir los datos sin procesar en información útil para un médico o paciente. La instalación de procesamiento central brinda la ventaja de la privacidad (todos los datos se almacenan en una instalación central con protocolos de seguridad uniformes), la velocidad y la uniformidad del análisis de datos. La instalación de procesamiento central puede entonces controlar el destino de los datos después del tratamiento del sujeto. Por ejemplo, utilizando un sistema de comunicación electrónica, la instalación central puede proporcionar datos al médico, al sujeto o a los investigadores.

Cuando se determinan las cantidades o niveles de una pluralidad de metabolitos en la muestra, las cantidades o niveles pueden compararse con los niveles de referencia de metabolitos de NE, tal como los niveles de referencia positivos de NE y/o negativos de NE en infantes para ayudar en el diagnóstico o para diagnosticar si el sujeto tiene NE. Los niveles de la pluralidad de metabolitos en una muestra correspondiente a los niveles de referencia positivos para NE en infantes (por ejemplo, niveles que son iguales a los niveles de referencia, sustancialmente iguales a los niveles de referencia, por encima y/o por debajo del mínimo y/o máximo de los niveles de referencia, y/o dentro del intervalo de los niveles de referencia) son indicativos de un diagnóstico de NE en infantes en el sujeto.

Además, los niveles de una pluralidad de metabolitos que están presentes diferencialmente (especialmente a un nivel que es estadísticamente significativo) en la muestra en comparación con los niveles de referencia negativos para NE en infantes son indicativos de un diagnóstico de NE en el sujeto. Los niveles de los dos o más metabolitos que están presentes de manera diferencial (especialmente a un nivel que es estadísticamente significativo) en la muestra en comparación con la lesión cerebral respectivamente positiva para NE en niveles de referencia positivos para distinto tejido cerebral son indicativos de un diagnóstico de ausencia de lesión cerebral en infantes en el sujeto.

El nivel o niveles de una probabilidad de metabolitos se pueden compararse con una lesión cerebral respectivamente positiva para NE en infantes en niveles de referencia positivos para un tejido cerebral distinto y/o negativos para NE usando diversas técnicas incluida una comparación simple (por ejemplo una comparación manual) del nivel o niveles de uno o más metabolitos en la muestra biológica con los niveles de referencia positivos para NE y/o negativos para NE. El nivel o niveles de uno o más metabolitos en la muestra biológica puede también compararse con la lesion cerebral respectivamente positiva para NE en infantes en niveles de referencia positivos para distinto tejido cerebral y/o negativo para lesion cerebral en infantes usando uno o más análisis estadísticos (por ejemplo, modelos lineales, prueba t, regresión logística, prueba de suma de rangos de Wilcoxon, árbol de decisión, análisis discriminante lineal, k vecinos más cercanos, etc.).

c2) Otros aspectos particulares

La presente descripción divulga el uso de datos de metabolómica, generados por la cuantificación de metabolitos endógenos mediante, pero sin limitarse a, espectrometría de masas (MS), en particular tecnologías de MS tales como MALDI, ESI, ionización química a presión atmosférica (APCI) y otros métodos, determinación de concentraciones de metabolitos mediante el uso de tecnologías de MS o métodos alternativos acoplados a la separación (LC-MS, GC-MS, CE-MS), posterior selección de características y combinación de características para clasificadores que incluyen datos moleculares de al menos dos moléculas.

Las concentraciones de los marcadores individuales, analitos, metabolitos se miden y comparan con valores de referencia o datos combinados y procesados para puntuaciones y comparados con valores de referencia que indican estados patológicos, etc. con sensibilidades y especificidades superiores en comparación con procedimientos conocidos, parámetros clínicos y biomarcadores.

Los expertos en la técnica entenderán que para la cuantificación de ciertos metabolitos, también se pueden usar metabolitos modificados químicamente, ya que se puede obtener una mejor separación en el material de la columna usado antes de las tecnologías de MS.

Las muestras típicamente analizadas son, por ejemplo, una muestra de tejido (por ejemplo, una biopsia), una muestra de sangre, una muestra de suero de un sujeto.

El procedimiento analítico también se caracteriza porque se realiza una etapa de desproteinación y/o una etapa de separación antes de la medición de metabolitos, donde dicha etapa de separación se selecciona del grupo que consiste en cromatografía líquida (LC), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de gases, extracción líquido-líquido (LLE).

Preferiblemente, dicha etapa de desproteinación se realiza mezclando dicha muestra biológica con disolventes orgánicos tales como etanol, metanol o acetonitrilo.

Con el fin de mejorar la sensibilidad y/o la volatilidad, p. ej., para una mejor evaporación como se usa en espectrometría de masas, los compuestos se pueden derivatizar. Pueden convertirse, mediante la aplicación de métodos químicos conocidos en la técnica, en los correspondientes ésteres, aminas o amidas, en donde dicha derivatización incluye: 2-hidrazinopiridina (HP), 2-picolilamina (PA); derivatización de Girard; oximación con hidroxilamina primero y luego sililación con hexametildisilazano y ácido trifluoroacético.

Es una opción que dicha etapa de calibración sea realizada mediante

a) mediante procesamiento matemático de dichos valores para reducir los errores técnicos inherentes a los procedimientos de medición utilizados, tales como la espectrometría de masas.

b) selección de al menos un algoritmo supervisado adecuado del grupo que consiste en regresión logística, análisis discriminante lineal o cuadrático (diagonal) (LDA, QDA, DLDA, DQDA), perceptrón, análisis discriminante regularizado de centroides reducidos (RDA), bosques aleatorios (RF), redes neuronales (NN), redes bayesianas, modelos ocultos de Markov, máquinas de vectores de soporte (SVM), mínimos cuadrados parciales generalizados (GPLS), partición en torno a medoides (PAM), programación lógica inductiva (ILP), modelos aditivos generalizados, procesos gaussianos, regresión de mínimos cuadrados regularizados, mapas autoorganizados (SOM), particiones recursivas y árboles de regresión, clasificadores de vecinos más cercanos K (K-NN), y aplicación de dicho algoritmo supervisado seleccionado a dichos datos procesados previamente de la etapa a);

c) dicho algoritmo supervisado de la etapa b) se entrena en al menos un conjunto de datos de entrenamiento que contiene datos previamente procesados de sujetos que se dividen en clases de acuerdo con sus condiciones fisiopatológicas, fisiológicas, de pronóstico o de respuesta relacionadas con NE en infantes, con el fin de seleccionar una función clasificadora para mapear dichos datos previamente procesados a dichas condiciones;

d) aplicación de dicho algoritmo supervisado entrenado de la etapa c) a un conjunto de datos previamente procesados de un sujeto con condiciones fisiopatológicas, fisiológicas, de pronóstico o de respuesta relacionadas con NE en infantes, y usando los algoritmos de clasificación entrenados para predecir la etiqueta de clase de dicho conjunto de datos para predecir la probabilidad de aparición de NE en infantes del asunto.

La etapa de procesamiento matemático previo se puede llevar a cabo, por ejemplo, por medio de un método estadístico sobre datos sin procesar obtenidos, en particular datos de intensidad sin procesar obtenidos mediante un dispositivo de medición, en el que dicho método estadístico se selecciona del grupo que consiste en datos sin procesar obtenidos por espectrometría de masas o espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida o gaseosa o electroforesis capilar o por electroforesis bidimensional en gel, determinación cuantitativa con RIA o determinación de concentraciones/cantidades por cuantificación de inmunotransferencias; suavizado, corrección de línea de base, selección de picos, opcionalmente, transformación adicional de otros datos, tal como tomar el logaritmo para llevar a cabo una estabilización de las varianzas.

Además, por razones de una mejor precisión de los resultados del pronóstico, se inserta una etapa adicional de selección de características en dicha etapa de procesamiento previo, para encontrar un subconjunto de características de menor dimensión con el mayor poder discriminatorio entre clases;

y/o dicha selección de características se lleva a cabo mediante un enfoque de filtro y/o envoltura; y/o en el que dicho enfoque de filtro incluye clasificadores y/o métodos de evaluación de subconjuntos de características; y/o donde se aplica dicho enfoque de envoltura, donde se usa un clasificador para evaluar subconjuntos de atributos.

Normalmente, el método se caracteriza porque dicha etapa de medición se lleva a cabo mediante espectrometría de masas de alto rendimiento.

Se prefiere que dichos compuestos endógenos específicos de NE en infantes indiquen encefalopatía neonatal, NE del área o áreas del cerebro afectadas y pronóstico y resultado neurológico debido a la determinación del tipo y extensión del daño de distintos tejidos cerebrales del hipocampo y/o ganglios basales en los metabolitos endógenos específicos de los infantes.

Además, en el método típicamente, dicho sujeto mamífero es un recién nacido, y dicha muestra biológica es sangre en la que los datos sin procesar de las concentraciones de metabolitos se procesan previamente usando la transformación logarítmica; en el que se usan modelos lineales para identificar metabolitos que se correlacionan con la extensión de la NE presente; en el que se selecciona la regresión de mínimos cuadrados como algoritmo supervisado adecuado, y se entrena con concentraciones de metabolitos procesados previamente, aplicando la función de regresión entrenada obtenida a dicho conjunto de datos de concentración de metabolitos procesados previamente de un sujeto bajo sospecha de tener NE en infantes, y usando dicha función de regresión entrenada para diagnosticar o predecir la extensión de la lesión específica del tejido cerebral en los infantes.

Por lo tanto, se permite pronosticar el resultado neurológico relacionado con NE y la puntuación de comportamiento neurológico por metabolitos del sujeto con determinación del tipo y extensión del daño de distintos tejidos cerebrales, del hipocampo y/o ganglios basales en metabolitos endógenos específicos de infantes, en los que se usan modelos lineales para identificar metabolitos que están presentes de forma diferencial; en el que se selecciona la regresión lineal de mínimos cuadrados como algoritmo adecuado para delinear una relación entre el metabolito y la extensión del daño, y se entrena con concentraciones de metabolitos procesados, aplicando la función de regresión entrenada obtenida a dicho conjunto de datos de concentración de metabolitos procesados previamente de un sujeto bajo ^{sospecha de tener n}E ^{en infantes, y usar dicha regresión entrenada para diagnosticar o predecir la extensión de la} lesión específica del tejido cerebral en infantes.

En una realización adicional, la categorización de datos se basa en la aplicación de técnicas de aprendizaje (no) supervisadas. Los algoritmos de aprendizaje supervisado son típicamente funciones deterministas que asignan un vector multidimensional de mediciones biológicas a una variable de resultado binaria o no binaria o continua que codifica la ausencia o existencia de una clase clínicamente relevante, fenotipo, estado fisiológico distinto o estado de salud distinto, enfermedad o riesgo de desarrollar una enfermedad o adecuación del tratamiento de la enfermedad. Para lograr estos diversos métodos, tales como, pero sin limitarse a, regresión logística (LR), análisis discriminante lineal o cuadrático (diagonal) (LDA, QDA, DLDA, DQDA), perceptrón, análisis discriminante regularizado por centroides reducidos (RDA), bosques aleatorios (RF), redes neuronales (NN), máquina de vectores de soporte (SVM), regresión de mínimos cuadrados generalizados, modelos de efectos mixtos (no) lineales, modelos (no) lineales generalizados, modelos de Markov ocultos mixtos, regresión de mínimos cuadrados parciales generalizados (GPLS), regresión de componentes principales, regresión de mínimos cuadrados parciales junto con un algoritmo de clasificación (tal como ^{LDA, K-NN o} L^r), ^{proyección a estructuras latentes, partición alrededor de medoides (PAM), bayesiano sin modificar} (NB), programación lógica inductiva (ILP), modelos aditivos generalizados, procesos gaussianos, regresión de mínimos cuadrados regularizados, desviaciones mínimas absolutas, mapas autoorganizados (SOM), partición recursiva y árboles de regresión, clasificadores vecinos más cercanos K (K-NN), clasificadores difusos pueden usarse como un clasificador independiente o dentro del marco de una estrategia de conjunto, tal como votación, apilamiento, promediado del modelo bayesiano, embolsado o refuerzo.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones preferidas de la presente invención.

I. Material y métodos

1. Modelo animal

Cuando se comparan los brotes de crecimiento cerebral, el cerebro del cerdo se parece más al del bebé humano nacido a término (véase Dobbing J, Sands J. Comparative aspects of the Brain growth spurt. Early Hum Dev, Marzo de 1979; 3(1): 79-83).

En este estudio, se eligió el modelo de hipoxia por inhalación ya que imita la fisiopatología humana de un problema isquémico hipóxico global y produce convulsiones clínicas y subclínicas espontáneas, pero con una alta tasa de supervivencia (~80 %). La encefalopatía es clínica, electrofisiológica y neuropatológicamente similar a la del recién nacido a término asfixiado y es adecuada para examinar los mecanismos de daño y evaluar posibles terapias protectoras después de la asfixia del parto (vease Thoresen M, Haaland K, Loberg EM, Whitelaw A, Apricena F, Hanko E, et al. A piglet survival model of posthypoxic encephalopathy. Pediatr Res, Nov de 1996; 40(5): 738-48).

Los animales se criaron en una porqueriza en Brisbane. Después de la ventilación y la desentubación, los lechones permanecieron en una pequeña jaula para animales con libre acceso al agua. Los lechones fueron alimentados con biberón cada 3-4 horas con Survive Pig Milk Replacer (Think Pig-Country Vet Wholesaling Pty Ltd, VIC, Australia). Los animales fueron cuidados de acuerdo con las pautas de la institución para animales de experimentación. Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de protección animal de las autoridades locales.

Se usaron 9 lechones recién nacidos para este estudio. Los lechones se anestesiaron con isoflurano al 1-2 % a través de una máscara nasal y se colocaron en decúbito supino sobre una mesa calefactora para mantener la temperatura corporal en torno a los 38,5 °C. Se canuló una vena de la oreja y se administró una dosis de inducción de propofol (10 mg/mL, 0.5 mL/kg de Diprivan al 1%, AstraZeneca Pty Ltd, NSW, Australia). La infusión de propofol (9 mg/mL) y alfentanilo se mantuvo a razón de 10 mg/kg/h hasta la intubación. Se conectó un oxímetro de pulso y ECG (Marquette Tramscope 12C, Medical Systems, WI, EE. UU.), así como el EEG de amplitud integrada (BRM2; BrainZ Instruments, Auckland, NZ). Los lechones se intubaron con un tubo sin manguito y los cerdos se ventilaron con presión controlada con un SLE Newborn 250 (Surrey, RU). La anestesia se redujo a 10 mg/kg/h hasta el final de HI. Se insertó una línea venosa periférica adicional para infusión continua de dextrosa al 10 % a razón de 3 mL/kg/h y antibióticos (cefalotina 20 mg/kg y gentamicina 2.5 mg/kg). Se insertó una arteria umbilical para el control continuo de la presión arterial y el análisis de gases en sangre. Los gases en sangre se recogieron antes del HI, cada 10 minutos durante el HI hasta 60 minutos después del HI.

Se indujo hipoxia (4 % de O²) en lechones recién nacidos anestesiados durante 30 min con un período final de hipotensión de 10 min; los lechones se recuperaron y sobrevivieron hasta 48 h. Los animales fueron monitoreados diariamente para convulsiones tanto visualmente como con registros de electroencefalograma (EEG). Las convulsiones clínicas se trataron con fenobarbital (20 mg/kg i.v., Sigma, Croydan, VIC, Australia) y midazolam (0,2 mg/kg iv, Sandoz, Pyrmont, NSW, Australia). Cuando las convulsiones continuaron, los lechones fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital.

Para el análisis metabolómico, se tomaron muestras de sangre en los siguientes momentos: 30 min después de la asfixia y 21 horas después de la reanimación.

Medidas de los resultados:

La lesión cerebral se evaluó con el aEEG tanto para el patrón de EEG como para la actividad epiléptica, con una puntuación neurológica clínica, por histología (tinción con hematoxilina y eosina) usando un sistema de clasificación descrito previamente (véase Lorek A, Takei Y, Cady EB, Wyatt JS, Penrice J, Edwards AD, et al. Delayed ("secondary") cerebral energy failure after acute hypoxiaischemia in the newborn piglet: continuous 48-hour studies by phosphorus magnetic resonance spectroscopy. Pediatr. Res. Diciembre de 1994; 36(6): 699-706) y para la actividad de caspasa-3 en 4 áreas corticales, tálamo, ganglios basales e hipocampo. Por lo tanto, el hipocampo y los ganglios basales son de gran interés.

Actividad de caspasa-3:

La actividad de la caspasa 3 (en pmol/min/mg de proteína) se determinó a las 48 h después de HI en todas las demás regiones del cerebro, incluidas 4 áreas corticales, ganglios basales e hipocampo.

Histología:

La histología se realizó utilizando la puntuación descrita anteriormente en cada región del cerebro. También se calculó una puntuación histológica total para cada grupo de tratamiento, sumando todas las puntuaciones histológicas individuales.

Puntuación neuroconductual clínica:

Se evaluó una puntuación neuroconductual al menos en puntos de tiempo de 4 horas en las primeras 24 h y a las 48 h. Esta puntuación contiene 9 elementos de un máximo de 2 puntos, por lo que la puntuación máxima es de 18 puntos. Los nueve elementos neurológicos se calificaron como: 2, normal; 1, moderadamente anormal; o 0, definitivamente patológico. Los elementos neurológicos fueron: 1) Respiración normal, sin apneas, retracciones ni necesidad de oxígeno; 2) conciencia; 3) orientación. Mirando e investigando el entorno; 4) capacidad para caminar sobre las cuatro extremidades en una dirección sin caerse; 5) capacidad para controlar las extremidades anteriores usándolas para levantarse rápidamente desde una posición acostada; 6) habilidad para controlar las extremidades traseras usándolas para levantarse rápidamente desde una posición acostada y manteniéndolas juntas en posición erguida; 7) mantenimiento de un tono constante e igual en las extremidades anteriores y posteriores; 8) actividad casi continua cuando está despierto; 9) la ausencia de movimientos patológicos se puntuó como 2. Los movimientos clónicos sostenidos o las posturas tónicas persistentes se puntuaron como 0. Los movimientos de cíclicos o sacudidas ocasionales se puntuaron como 1.

2. Análisis metabolómico:

2.1 Generalidades

La preparación de muestras y los análisis metabolómicos se realizaron en Biocrates Life Sciences AG, Innsbruck, Austria. Se utilizó una plataforma metabolómica específica multiparamétrica, altamente robusta, sensible y de alto rendimiento que consta de métodos de análisis de inyección de flujo (FIA)-MS/MS y LC-MS/MS para la cuantificación simultánea de una amplia gama de compuestos intermedios endógenos, a saber acilcarnitinas, esfingomielinas, hexosas, glicerofosfolípidos, aminoácidos, aminas biogénicas, oxiesteroles y ácidos orgánicos pequeños, en plasma. En la Tabla 1 anterior se muestra una lista detallada de todos los metabolitos analizados. Todos los procedimientos (manejo de muestras, analítica) fueron realizados por compañeros de trabajo que desconocían los grupos experimentales.

2.2. Manipulación de muestras

2.2.1 Plasma

Las muestras de plasma se prepararon mediante procedimientos estándar y se almacenaron a (-75 °C). Para permitir el análisis de todas las muestras simultáneamente dentro de un lote, las muestras se descongelaron en hielo (1 h) el día del análisis y se centrifugaron a 18000 g a 2 °C durante 5 min. Todos los tubos se prepararon con BHT al 0.001 % (hidroxitolueno butilado; Sigma-Aldrich, Viena, Austria) para evitar la autooxidación.

2.2.2 Sistema de LC-MS/MS

El sistema de LC-MS/MS consistía en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo API 5000MC (AB Sciex) equipado con una fuente ESI Turbo VMC y un sistema de HPLC Agilent 1200 (Agilent Technologies). La separación cromatográfica se realizó con una columna Agilent Zorbax Eclipse XDB C18 (100 * 3.0 mm, 3.5 |jm) con precolumna (C18, 4 x 2 mm en cartucho Security Guard, Phenomenex). Se usó el software AnalystMC (versión 1.4.2, Applied Biosystems) para la adquisición y el procesamiento de datos. Para un análisis estadístico completo, se exportaron los datos.

2.2.3 Condiciones de LC-MS/MS

La fuente de ESI se opero en modo de iones negativos y se aplicó un voltaje de aspersión de iones de -3 kV. La temperatura del calentador se ajustó a 400 °C.

2.3. Espectroscopia de masas de diferentes analitos

2.3.1 Acilcarnitinas, esfingomielinas, hexosas, glicerofosfolípidos (FIA-MS/MS)

Para determinar la concentración de acilcarnitinas, esfingomielinas y glicerofosfolípidos en plasma, se preparó el equipo AbsoluteIDQ p150 (Biocrates Life Sciences AG, Innsbruck, Austria) como se describe en el protocolo del fabricante. En resumen, se añadieron 10 jL de plasma al centro del filtro en la placa superior del equipo de 96 pocillos y se secó usando un evaporador de nitrógeno (VLM Laboratories, Bielefeld, Alemania). Posteriormente, se añadieron 20 jL de una solución al 5% de isotiocianato de fenilo para la derivatización. Después de la incubación, las manchas del filtro se secaron nuevamente usando un evaporador. Los metabolitos se extrajeron usando 300 jL de una solución de acetato de amonio 5 mM en metanol. Los extractos se obtuvieron por centrifugación en la placa inferior de 96 pocillos profundos, seguido de una etapa de dilución con 600 jL de disolvente de operación del equipo de MS. El análisis de espectrometría de masas se realizó en un instrumento de espectrometría de masas en tándem API4000 Qtrap® (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies, Foster City, CA) equipado con una fuente de ionización por electroaspersión (ESI), utilizando el método de adquisición de análisis que se proporciona en el equipo AbsoluteIDQ. Se aplicó el método FIA-MS/MS estándar para todas las mediciones con dos inyecciones posteriores de 20 jL (una para el análisis de modo positivo y otra para el modo negativo). Para la cuantificación se utilizó la detección mediante monitorización de reacciones múltiples (MRM), aplicando el algoritmo de análisis de espectros integrado en ^{el software MetIQ (Biocrates Life Sciences} A^g , ^{Innsbruck, Austria). Las concentraciones de 148 metabolitos (todos} los analitos se determinaron con el equipo de metabolómica excepto los aminoácidos, que se determinaron mediante un método diferente) obtenidas mediante calibración interna se exportaron para un análisis estadístico completo.

2.3.2 Aminoácidos, Aminas biogénicas (LC-MS/MS)

Los aminoácidos y las aminas biogénicas se analizaron cuantitativamente mediante LC-MS/MS de fase inversa para obtener la separación cromatográfica de metabolitos isobáricos (mismos pares de iones de MRM) para la cuantificación individual realizada mediante calibración externa y mediante el uso de patrones internos. Se requiere un volumen de muestra de 10 jL para el análisis utilizando el siguiente procedimiento de preparación de muestras. Las muestras se añadieron en manchas del filtro colocados en una placa Solvinert de 96 pocillos (los patrones internos se colocaron y secaron antes bajo nitrógeno), fijados sobre una placa de 96 pocillos profundos (placa de captura). Se añadieron 20 jL de reactivo de derivatización de isotiocianato de fenilo al 5 %. Las muestras derivadas se extrajeron después de la incubación con metanol acuoso en la placa de captura. Los extractos de muestras se analizaron mediante LC-ESI-MS/MS en modo de detección de MRM positivo con un instrumento de espectrometría de masas en tándem API4000 Qtrap® (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies, Foster City, CA). Las concentraciones de metabolitos individuales analizadas (software Analyst 1.4.2, Applied Biosystems, Foster City, CA) se exportaron para un análisis estadístico completo.

2.3.3 Oxiesteroles (LC-MS/MS)

Los oxiesteroles se analizaron cuantitativamente mediante LC-ESI-MS/MS de fase inversa para realizar la separación por cromatografía líquida y, por lo tanto, la cuantificación individual de los oxiesteroles isobáricos. La detección más selectiva se realizó en el modo de detección de MRM positivo utilizando un instrumento de espectrometría de masas en tándem 4000 Qtrap® (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies, Foster City, CA). Los datos se cuantificaron con el software Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se aplicaron proporciones de estándares externos con respecto a internos para la cuantificación por medio de una calibración externa de 6 puntos. Para el análisis fue necesario un volumen de muestra de 20 jL (plasma). La preparación de la muestra incluyó: I) precipitación de proteínas colocando un volumen de muestra de 20 jL en la mancha del filtro y precipitación con 200 jL sin procesar; II) hidrólisis por 100 jL de KOH 0.35 M en etanol al 95 % durante 2 h; III) una etapa de lavado (3 x 200 |jL de H²O) para eliminar el reactivo de hidrólisis; y, finalmente, IV) extracción mediante 100 j L de metanol acuoso. Los extractos de muestra de 20 ^j L se analizaron mediante el método desarrollado de LC-ESI-MS/MS.

2.3.4 Metabolismo energético (Ácidos orgánicos) (LC-MS/MS)

Para el análisis cuantitativo de los compuestos intermedios del metabolismo energético (glucólisis, ciclo del citrato, ciclo de las pentosas fosfato, ciclo de la urea), se utilizó un método de cromatografía líquida de interacción hidrófila (HILIC)-ESI-MS/MS en un modo de detección de MRM negativo altamente selectivo. La detección de MRM se realizó utilizando un instrumento de espectrometría de masas en tándem API4000 QTrap® (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies, Foster City, CA). Se precipitó con proteínas un volumen de muestra de 20 j L (plasma) y se extrajo simultáneamente con metanol acuoso en un formato de placa de 96 pocillos. Se utilizaron estándares internos (proporción del estándar externo con respecto al interno) y calibración externa para una cuantificación altamente precisa. Los datos se cuantificaron con el software Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y finalmente se exportaron para análisis estadístico.

2.3.5 Eicosanoides

La determinación de eicosanoides (tales como prostaglandinas, tromboxanos) se realizó de acuerdo con un método previamente publicado (Unterwurzacher I., Koal T., Bonn G.K., Weinberger K.M., Ramsay S.L., Clin Chem Lab Med 2008, 46(11), 1589). En resumen, 20 ^j L de plasma fueron precipitados con proteínas y extraídos simultáneamente con acetonitrilo acuoso en una placa de filtro Solvinert de 96 pocillos. La proporción de estándar externo con respecto al interno y la calibración externa se usaron para una cuantificación de alta precisión. Los extractos de muestra se analizaron mediante LC-ESI-MS/MS de fase inversa en modo de detección de MRM de ionización negativa con un instrumento de espectrometría de masas en tándem 4000 QT rap® (Applied Biosystems/MDS Analytical T echnologies, Darmstadt, Alemania).

2.4. Análisis estadístico

Todos los cálculos estadísticos se han realizado utilizando el software estadístico R (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria, 2010, ISBN 3-900051-07-0 ).

Todos los analitos que se detectaron en al menos el 15% de las muestras se seleccionaron para análisis adicionales. Los datos metabólicos se dejan censurados debido al umbral de los datos del espectrómetro de masas, lo que da como resultado señales/picos no detectados. Mediante una combinación del dinamismo de la ruta metabólica, la interacción molecular compleja de la muestra y la eficiencia general del protocolo analítico, se prefiere el reemplazo de los datos faltantes por medio de un algoritmo multivariado a una imputación sin modificación por un valor previamente especificado como, por ejemplo, cero. Por lo tanto, las concentraciones de metabolitos faltantes se reemplazan por el valor promedio de las 6 muestras más cercanas a aquella en la que falta la medición (Kim H., Golub G.H. y Park, H. Missing value estimation for DNA microarray gene expression data: local less squares imputation Bioinformatics 200521(2): 187-198). Todos los análisis estadísticos se realizan en datos previamente procesados, es decir, transformados logarítmicamente. La transformación logarítmica se utiliza para estabilizar la varianza y transformar pera distribución gaussiana, al menos aproximadamente.

Se pueden usar paneles parsimoniosos de múltiples metabolitos para predecir cada resultado en lugar de un marcador de metabolito individual. El enfoque para buscar compuestos de marcadores se realiza mediante un algoritmo de aprendizaje incremental basado en la población que utiliza los 101 metabolitos. Para cada modelo, el coeficiente de regresión (es decir, los pesos de los marcadores en el modelo) se determinan de acuerdo con Zuber, V. y Strimmer, K. (High-Dimensional Regression and Variable Selection Using CAR Scores, Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 2011 10 (1), artículo 34). El poder predictivo del modelo se evalúa dejando uno fuera de la validación cruzada. A continuación, la precisión del modelo se define como el coeficiente de correlación entre los valores originales (o verdaderos) del predictando y sus valores pronosticados por nuevo muestreo. Luego, cada modelo se somete a eliminación hacia atrás y esto hasta que no se observa ninguna mejora en la precisión (más/menos 10%). En conjunto, estas condiciones satisfacen la parsimonia y el poder predictivo del modelo final y eliminan los problemas relacionados con la multicolinealidad entre los marcadores. Si bien los métodos descritos en el presente documento pueden comprender combinaciones con poder predictivo adecuado distintas de las que se muestran, la combinación de metabolitos de la invención presenta precisiones superiores al 80%.

II. Resultados experimentales

La asfixia inducida dio como resultado diferentes grados de lesión cerebral al inducir la muerte celular en los ganglios basales y el hipocampo, así como por un deterioro de la puntuación del comportamiento neurológico. La encefalopatía neonatal se asoció con cambios importantes en el metaboloma plasmático. Se descubrieron compuestos intermedios que se correlacionaban solos o en combinación con la extensión de la lesión cerebral en el hipocampo, los ganglios basales y la puntuación neurológica.

Estos resultados experimentales se explican con más detalle a continuación.

Ejemplo 1: Daño del hipocampo inducido por hipoxia

Como se mencionó anteriormente, la falta de oxígeno dio como resultado un aumento de la muerte celular apoptótica y/o necrótica evaluada en el cerebro de lechones recién nacidos 48 horas después de la falta de oxígeno. Se tomaron muestras de sangre 30 minutos después del período de falta de oxígeno y se analizaron las concentraciones de metabolitos como se describió anteriormente. Estas concentraciones de metabolitos se correlacionaron luego con la cantidad cuantitativa absoluta de células moribundas en el hipocampo. La Tabla 5 resume el resultado de las estadísticas de correlación univariante entre la concentración de metabolitos determinada en plasma 30 minutos después de la asfixia y la cantidad de células muertas en el hipocampo a las 48 horas después de la asfixia. Para cada metabolito, el coeficiente de correlación de Pearson (Cor) y su valor p correspondiente se presentan junto con el coeficiente de determinación (Rsq). Prob designa la probabilidad real (en %) de ingresar una combinación de metabolitos.

Tabla 5. Parámetro resultante: Daño cerebral en el hi ocam o

continuación

En la Figura 1a adjunta, se ilustra la distribución de precisiones que se pueden lograr con modelos formados con un metabolito principal.

La Figura 1a ilustra las capacidades predictivas de la combinación de metabolitos con base en un metabolito principal que se correlaciona con la extensión del daño cerebral en el hipocampo. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones que comprenden un metabolito principal (eje x) y hasta 6 metabolitos del conjunto de datos inicial.

En la Figura 1b adjunta, se ilustra la distribución de las precisiones que se pueden lograr a partir de modelos que comprenden hasta 6 metabolitos.

La Figura 1b ilustra las capacidades predictivas (es decir, la precisión) de todas las combinaciones adecuadas de metabolitos que se correlacionan con la extensión del daño cerebral en el hipocampo. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones de 2 a 6 metabolitos (eje x).

En la Figura 1c adjunta se ilustra la probabilidad de que un metabolito entre en un modelo con una precisión adecuada.

La Figura 1c ilustra las probabilidades de que los metabolitos individuales entren en una combinación de metabolitos que se correlacionan con la muerte celular en el hipocampo. Las probabilidades se calculan sobre todos los modelos presentados en la Figura 1b. Los metabolitos se clasifican de acuerdo con su probabilidad de ser incluidos en un modelo y se grafican de forma consecutiva de acuerdo con sus respectivas contribuciones (es decir, positivas o negativas) a los modelos de regresión. Izquierda: metabolitos que inducen menos daño en el hipocampo. Derecha: metabolitos que inducen más daño en el hipocampo.

Ejemplo 2: Daño de los ganglios basales inducido por hipoxia

Como se mencionó anteriormente, la falta de oxígeno dio como resultado un aumento de la apoptosis y/o muerte celular apoptótica evaluada en el cerebro de lechones recién nacidos 48 horas después de la falta de oxígeno. Se tomaron muestras de sangre 30 minutos después del período de falta de oxígeno y se analizaron las concentraciones de metabolitos como se describió anteriormente. Estas concentraciones de metabolitos se correlacionaron luego con la cantidad cuantitativa absoluta de células moribundas en los ganglios basales. La Tabla 6 resume el resultado de las estadísticas de correlación univariante entre la concentración de metabolitos determinada en plasma 30 minutos después de la asfixia y la cantidad de muerte celular en los ganglios basales a las 48 horas después de la asfixia. Para cada metabolito, el coeficiente de correlación de Pearson (Cor) y su valor p correspondiente se presentan junto con el coeficiente de determinación (Rsq). Prob designa la probabilidad real (en %) de ingresar una combinación de metabolitos.

T l : P r m r r l n : D ñ r r l n l n li l

continuación

En la Figura 2a adjunta, se ilustra la distribución de precisiones que se pueden lograr en modelos formados con un metabolito principal.

La Figura 2a ilustra las capacidades predictivas de combinaciones de metabolitos basadas en un metabolito principal que se correlaciona con la extensión del daño cerebral en los ganglios basales. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones que comprenden un metabolito principal (eje x) y hasta 7 metabolitos del conjunto de datos inicial.

En la Figura 2b adjunta, se ilustra la distribución de las precisiones que se pueden lograr en modelos que comprenden hasta 7 metabolitos.

La Figura 2b ilustra las capacidades predictivas (es decir, la precisión) de todas las combinaciones adecuadas de metabolitos que se correlacionan con la extensión del daño cerebral en los ganglios basales. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones de 2 a 7 metabolitos (eje x).

En la Figura 2c adjunta se ilustra la probabilidad de que un metabolito entre en un modelo con una precisión adecuada.

La Figura 2c ilustra las probabilidades de que los metabolitos individuales entren en una combinación de metabolitos que se correlacionan con la extensión del daño cerebral en los ganglios basales. Las probabilidades se calculan sobre todos los modelos presentados en la Figura 2b. Los metabolitos se clasifican según su probabilidad de ser incluidos en un modelo y se grafican de forma consecutiva según sus respectivas contribuciones (es decir, positivas o negativas) a los modelos de regresión. Izquierda: metabolitos que inducen menos daño en los ganglios basales. Derecha: metabolitos que inducen más daño en los ganglios basales.

Ejemplo 3: Efecto inducido por hipoxia en la puntuación neurológica

La falta de oxígeno dio como resultado la alteración de la puntuación neuroconductual en puntos de tiempo de 4 horas en las primeras 24 horas y a las 48 h. Esta puntuación contiene 9 elementos de un máximo de 2 puntos, por lo que la puntuación máxima es de 18 puntos y existe de los nueve elementos neurológicos como se describió anteriormente. Se tomaron muestras de sangre 30 minutos después del período de falta de oxígeno y se analizaron las concentraciones de metabolitos como se describió anteriormente. Estas concentraciones de metabolitos se correlacionaron luego con la puntuación neuroconductual. La Tabla 7 resume el resultado de las estadísticas de correlación univariante entre la concentración de metabolitos determinada en plasma 30 minutos después de la asfixia y la puntuación del comportamiento neurológico a las 48 horas después de la asfixia. Para cada metabolito, el coeficiente de correlación de Pearson (Cor) y su valor p correspondiente se presentan junto con el coeficiente de determinación (Rsq). Prob designa la probabilidad real (en %) de ingresar una combinación de metabolitos.

T l 7: P r m r r l n : D ñ r r l in i r l n m r mi n n r l i

continuación

En la Figura 3a adjunta, se ilustra la distribución de precisiones que se pueden lograr en modelos formados con un metabolito principal.

La Figura 3a ilustra las capacidades predictivas de la combinación de metabolitos con base en un metabolito principal que se correlaciona con la extensión de la lesión cerebral según lo descrito por la puntuación neurológica a las 48 h. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones que comprenden un metabolito principal (eje x) y hasta 6 metabolitos del conjunto de datos inicial.

En la Figura 3b adjunta, se ilustra la distribución de las precisiones que se pueden lograr en modelos que comprenden hasta 6 metabolitos.

La Figura 3b ilustra las capacidades predictivas (es decir, la precisión) de todas las combinaciones adecuadas de metabolitos que se correlacionan con la extensión de la lesión cerebral según lo descrito por la puntuación neurológica a las 48 h. Los diagramas de caja y bigotes representan la distribución del coeficiente de correlación con validación cruzada (eje y) para combinaciones de 2 a 6 metabolitos (eje x).

En la Figura 3c adjunta se ilustra la probabilidad de que un metabolito entre en un modelo con una precisión adecuada.

La Figura 3c ilustra las probabilidades de que los metabolitos individuales entren en una combinación de metabolitos que se correlacionan con la extensión de la lesión cerebral según lo descrito por la puntuación neurológica a las 48 h. Las probabilidades se calculan sobre todos los modelos presentados en la Figura 3b. Los metabolitos se clasifican según su probabilidad de ser incluidos en un modelo y se grafican de forma consecutiva según sus respectivas contribuciones (es decir, positivas o negativas) a los modelos de regresión. Izquierda: metabolitos que empeoran el resultado neurológico. Derecha: metabolitos que mejoran el resultado neurológico.

Explicación de las Tablas 8 a 10 adjuntas:

Los datos se generaron como se describió anteriormente en la sección Material y métodos.

Las Tablas adjuntas 8, 9 y 10 resumen las combinaciones obtenidas de metabolitos de la invención.

En particular, estas tablas están relacionadas con:

Tabla 8: Combinación de metabolitos, correlacionada con afección del tejido cerebral del hipocampo

Tabla 9: Combinación de metabolitos, correlacionada con afectación del tejido cerebral de los ganglios basales Tabla 10: Combinación de metabolitos, correlacionada con la puntuación de comportamiento neurológico

Los siguientes parámetros se muestran en las Tablas 8, 9 y 10:

Npar = número total de metabolitos en el modelo final

Precisión = definido como el coeficiente de correlación (dado en %) entre los valores verdaderos y predichos del predictando

Metabolito principal = metabolito principal del modelo

Metabolitos adicionales = lista de metabolitos que acompañan al metabolito principal en el modelo final

continuación

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Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Un método de diagnóstico para la diferenciación temprana de tipos de daño cerebral, seleccionado de daños de los compartimentos cerebrales, hipocampo y ganglios basales, en recién nacidos humanos, cuyo método comprende evaluar en una muestra de sangre, obtenida de un recién nacido en particular de 1 minuto a 6 horas, o de 2 a 180 o de 5 a 120 minutos después del nacimiento o después de iniciar la reanimación o sospecha de NE, al menos un panel de marcadores metabólicos tempranos de bajo peso molecular indicativos de la presencia de lesión cerebral en un compartimento cerebral, seleccionado de hipocampo y ganglios basales, seleccionados de paneles de paneles relacionados con daños en el hipocampo 1 a 25 de la Tabla 8; y los paneles 1 a 181 relacionados con el daño de los ganglios basales de la Tabla 9.

2. Un método de diagnóstico para la predicción temprana de una anomalía neurológica del comportamiento causada por encefalopatía neonatal en recién nacidos humanos, cuyo método comprende

evaluar en una muestra de fluido corporal, preferiblemente sangre o suero, obtenida de un recién nacido en particular de 1 minuto a 6 horas, o de 2 a 180 o de 5 a 120 minutos después del nacimiento o después de iniciar la reanimación 0 sospecha de NE, al menos un panel de marcadores metabólicos tempranos de bajo peso molecular indicativos de anormalidad neurológica del comportamiento relacionada con la encefalopatía neonatal, seleccionados de los paneles 1 a 163 de la Tabla 10.

3. El método de una de las reivindicaciones 1 a 2, donde evaluar dicha muestra de sangre comprende:

a) detectar dicho panel de metabolitos;

b) determinar un perfil de dichos metabolitos detectados; y

c) comparar el perfil de los metabolitos detectados con un perfil de metabolitos estándar, diagnosticando así dicha enfermedad o daño,

y/o donde se observa un aumento o disminución de al menos uno de dichos metabolitos de dicho al menos un panel.