CN104204798A - 膀胱癌的生物标志物和使用所述生物标志物的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了鉴定和评价用作膀胱癌的生物标志物的生物化学实体、靶标鉴定/验证及监测药物功效的方法。还提供了多套作为膀胱癌的生物标志物的小分子实体。

Description

膀胱癌的生物标志物和使用所述生物标志物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年11月11日提交的美国临时专利申请号61/558,688和2012年8月24日提交的美国临时专利申请号61/692,738的权益，这两个申请的全部内容通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明总的来说涉及膀胱癌的生物标志物和基于所述生物标志物的方法。
发明背景
在美国，超过90%的膀胱癌(BCA)病例是移行细胞癌(TCC)，亦称为尿路上皮癌(UC)。大约70%新诊断的TCC/UC患者患有非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)肿瘤(即T0a、T1和CIS)。NMIBC患者的管理包括通过经尿道***切除术(TURB-T)摘除可视肿瘤以及主动监测肿瘤复发以使癌症进展的风险降到最小。
膀胱镜检查被视为诊断膀胱癌和监测非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)患者的金标准。这种技术的主要局限是无法使尿路上皮的某些区域显像以及难以使原位癌(CIS)肿瘤显像。在两种情况下，由于上尿路中的肿瘤位置所致或因为在可见光膀胱镜检查中肿瘤外表相对正常而发现不了肿瘤的存在。CIS检测最近获益于在膀胱镜检查前膀胱内注射的荧光染料的引入。虽然检测速率提高，但是仍需要较长的过程(在膀胱内注射后染料的温育)，并且在美国尚未在常规基础上使用。
通常进行细胞学检查，这可有助于检查通过膀胱镜检查不可视或可视性差的膀胱瘤。细胞学已用于常规临床实践60多年。然而，细胞学是一种复杂的方法，具有高的操作者间变化性。值得注意的是，细胞学不是一项实验室试验，而是一种会诊(consultation)；由各病理学家对脱落的尿路上皮细胞的形态特征的解释进行评价。尽管如此，细胞学仍享有对高级别肿瘤(即TaG3、T1/G3和CIS)具有极高特异性和高灵敏度的声誉。
然而，有证据表明，对于低级别肿瘤(即TaG1/G2)细胞学表现不佳，而且高级别肿瘤中细胞学的高性能的观点最近受到挑战。例如，Mayo Clinic (n=75)的一项研究表明，细胞学的总体灵敏度对于所有肿瘤类型为58%，对于Ta为47%，对于CIS仅为78%，对于pT1-pT4为60%。相比之下，对完全相同的Mayo Clinic样本集的荧光原位杂交(FISH)分析，总体灵敏度为81%，对于Ta为65%，对于CIS为100%，对于T1-T4肿瘤为95% (Halling K.等(2000) A comparison of cytology and fluorescence in situ hybridization for the detection of urothelial carcinoma (尿路上皮癌检测的细胞学和荧光原位杂交的比较). J. Urol. 164; 1768)。
在另一个实例中，一项不同的研究(n=668)关注FDA批准的NMP22试验作为膀胱镜检查的辅助以评价不同机构的一系列有膀胱癌史的连续患者的复发(Grossman H.B.等(2006) Surveillance for recurrent bladder cancer using a point-of-care proteomic assay (使用现场即时检测蛋白质组学测定对复发性膀胱癌的监护). JAMA 295；299-305)。此外，该研究强调细胞学表现得不如之前所认为的在高级别肿瘤中的一样好。尽管与细胞学(12.2%)的相比更好的NMP22灵敏度(49.5%)，但两个试验的阳性预测值(PPV)基本相同为41.5%，突出显示了就特异性而言细胞学具有显著优势(细胞学为99%，NMP22为87%)。另外，已发表的评价细胞学的灵敏度/特异性的若干研究综述重申细胞学的高特异性(0.99，其95% CI为[0.83-0.997])和其相对差的灵敏度0.34 (95% CI为[0.20-0.53]) (Lotan Y.和Roehrborn C.G. (2003) Sensitivity and specificity of commonly available bladder tumor markers versus cytology: results of a comprehensive literature review and meta-analysis (通常可获得的膀胱瘤标志物与细胞学的灵敏度和特异性：全面文献综述与荟萃分析的结果). Urology 61; 109-118)。
尽管如此，使用或不使用尿液细胞学的膀胱镜检查是诊断血尿/排尿困难患者的膀胱癌和评价NMIBC患者的复发的现行护理标准。然而，细胞学评价通常可能是不确定的，并且不能实现其辅助***诊断的预期目标。此外，考虑细胞学评价的低灵敏度，阴性细胞学结果不排除肿瘤的存在(尤其低分期(low stage)/低级别肿瘤)。此外，尽管其灵敏度低，但是细胞学已成为所有新的试验与之比较的参比试验。
由于细胞学的局限和膀胱镜检查的侵入性质，仍寻找生物标志物以提供在降低与监护NMIBC患者有关的成本的同时检测膀胱瘤的临床上有用的非侵入性工具。存在对辅助用于膀胱癌初期诊断的膀胱镜检查和细胞学以及辅助检测NMIBC患者的复发性膀胱癌肿瘤的新的非侵入性诊断试验的临床需要。
可获得几种FDA批准的基于尿液的标志物例如膀胱瘤抗原、ImmunoCyt、核基质蛋白-22和荧光原位杂交用于该目的。这些试验无一依赖代谢物或生物化学生物标志物。这些试验的许多种具有良好的灵敏度，但是特异性不足，如果用于在常规临床实践，这将导致太多的假阳性结果。迄今为止，美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)指南不推荐在实验方案设置以外采用这些试验。
特异性相当于细胞学的特异性和灵敏度显著优于细胞学的灵敏度的一项基于尿液的试验当与膀胱镜检查和/或细胞学联用时，将通过改进膀胱瘤检测的速率同时使假阳性结果的数目最小化来显著影响临床实践。可使用这类生物标志物以辅助在没有膀胱癌史的有症状的患者中的膀胱癌的初期诊断以及辅助膀胱癌复发的评价。生物标志物可用于例如定量测量一组生物标志物代谢物的尿液试验，所述生物标志物代谢物当与特定算法使用时，其水平表明患者中膀胱内膀胱瘤存在与否，并有助于与膀胱癌的症状(即血尿/排尿困难)一致的患者群中膀胱癌的初期诊断和有NMIBC史的患者群中膀胱瘤复发的检测。另外，所述生物标志物可与特定算法联用以构成表明肿瘤级别和分期的诊断试验。
发明概述
一方面，本发明提供诊断受试者是否患有膀胱癌的方法，所述方法包括分析受试者的生物样品以测定样品中膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物选自表1、5、7、9、11和/或13，并且将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较以诊断受试者是否患有膀胱癌。
另一方面，本发明还提供测定受试者是否易发生膀胱癌的方法，所述方法包括分析受试者的生物样品以测定样品中膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物选自表1、5、7、9、11和/或13；并且将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较以确定受试者是否易发生膀胱癌。
又一方面，本发明提供监测受试者的膀胱癌的进展/消退的方法，所述方法包括分析受试者的第一生物样品以测定样品中膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物选自表1、5、7、9、11和/或13，且第一样品在第一时间点获自受试者；分析受试者的第二生物样品以确定一种或多种生物标志物的水平，其中第二样品在第二时间点获自受试者；并且将第一样品中一种或多种生物标志物的水平与第二样品中一种或多种生物标志物的水平进行比较以监测受试者的膀胱癌的进展/消退。
又一方面，本发明提供区分膀胱癌与其它泌尿科癌症(例如肾癌、***癌)的方法，所述方法包括分析受试者的生物样品以测定样品中膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物选自表1、5、7、9、11和/或13，并且将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较以区分膀胱癌与其它泌尿科癌症。
另一方面，本发明提供确定受试者是否具有复发膀胱癌的方法，所述方法包括分析有膀胱癌史的受试者的生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平；并且将样品中的一种或多种生物标志物的水平与以下进行比较：(a)一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性参比水平，和/或(b)一种或多种生物标志物的膀胱癌阴性参比水平。
另一方面，本发明还提供确定膀胱癌的分期的方法，所述方法包括分析受试者的生物样品以测定样品中用于膀胱癌分期的一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物选自表5和/或9；并且将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的高分期膀胱癌和/或低分期膀胱癌参比水平进行比较以确定受试者的膀胱癌的分期。
另一方面，本发明提供评价用于治疗膀胱癌的组合物的功效的方法，所述方法包括分析患有膀胱癌并且目前或之前用组合物治疗的受试者的生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平；并且将样品中的一种或多种生物标志物的水平与以下进行比较：(a)受试者的之前采集的生物样品的一种或多种生物标志物的水平，其中在用组合物治疗之前从受试者获得所述之前采集的生物样品，(b)一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性参比水平，和/或(c)一种或多种生物标志物的膀胱癌阴性参比水平。
另一方面，本发明提供用于评价组合物在治疗膀胱癌中的功效的方法，所述方法包括分析受试者的第一生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，所述第一样品在第一时间点获自受试者；将组合物给予受试者；分析受试者的第二生物样品以测定一种或多种生物标志物的水平，所述第二样品在给予组合物后的第二时间点获自受试者；将第一样品中一种或多种生物标志物的水平与第二样品中一种或多种生物标志物的水平进行比较以评价用于治疗膀胱癌的组合物的功效。
再一方面，本发明提供评价用于治疗膀胱癌的两种或更多种组合物的相对功效的方法，所述方法包括分析患有膀胱癌且目前或之前用第一组合物治疗的第一受试者的第一生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物的水平；分析患有膀胱癌且目前或之前用第二组合物治疗的第二受试者的第二生物样品以测定所述一种或多种生物标志物的水平；并且将第一样品中一种或多种生物标志物的水平与第二样品中一种或多种生物标志物的水平进行比较以评价用于治疗膀胱癌的第一和第二组合物的相对功效。
另一方面，本发明提供针对在调节膀胱癌的一种或多种生物标志物中的活性筛选组合物的方法，所述方法包括将一种或多种细胞与组合物接触；分析所述一种或多种细胞的至少一部分或与细胞有关的生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平；并将所述一种或多种生物标志物的水平与所述生物标志物的预定标准水平进行比较以确定组合物是否调节所述一种或多种生物标志物的水平。
又一方面，本发明提供用于鉴定膀胱癌的潜在药物靶标的方法，所述方法包括鉴定与选自表1、5、7、9、11和/或13的膀胱癌的一种或多种生物标志物有关的一个或多个生物化学途径；并鉴定影响一个或多个已鉴定的生物化学途径的至少一个的蛋白质，所述蛋白质是膀胱癌的潜在药物靶标。
再一方面，本发明提供用于治疗患有膀胱癌的受试者的方法，所述方法包括给予受试者有效量的在患有膀胱癌的受试者中降低的选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物。
附图简述
图1显示膀胱癌患者(TCC)和病例对照受试者间示例性代谢物的重量摩尔渗透压浓度归一化丰度比。
图2是在该研究中使用重量摩尔渗透压浓度归一化数据划分的受试者的特征选定的主成分分析(PCA)的示图。画出任意截止线以说明这些代谢丰度分布可将患者分在具有高阴性预测值(NPV) (PC1 < -1)和高阳性预测值(PPV) (PC1 > 1)的两个组中。采用该计算方法无法对具有中间值(-1 < PC1 < 1)的个体分类。
图3是在该研究中使用重量摩尔渗透压浓度归一化值划分的受试者的特征选定的分级群聚(皮尔逊相关性(Pearson’s correlation))的示图。鉴定出3个截然不同的代谢类别，一个含100%对照(无TCC)个体，一个含100%膀胱癌(TCC)病例，中间病例含33%对照和67% TCC病例。
图4是如实施例7中所述使用膀胱癌的5种示例性生物标志物的接受者工作特征(ROC)曲线的示图。
图5是如实施例7中所述使用7种示例性生物标志物区分膀胱癌与非癌症所产生的ROC曲线的示图。
图6说明如实施例7中所述使用用多种生物标志物区分BCA与非癌症的岭模型(ridge model)得到的AUC结果的比较。
图7是如实施例7中所述使用岭逻辑斯谛回归分析(ridge logistic regression)区分膀胱癌与血尿所产生的ROC曲线的示图。
图8说明如实施例7中所述使用用多种生物标志物区分BCA与血尿的岭模型获得的AUC结果的比较。
图9是三羧酸循环(TCA)的示图和在对照个体(左)和膀胱癌患者(右)中测量的生物标志物代谢物水平的箱形图。y轴值表明生物标志物的标度强度。阴影框的顶部和底部分别表示第75和第25百分位数。顶部和底部线条(“须线”)表示各化合物和组的数据点的完整范围，不包括“极端”点，其用圆圈表示。“+”表明平均值，实线表明中位值。
图10是生物化学途径的示图和表明糖酵解活性、支链氨基酸分解代谢和脂肪酸氧化的代谢物的箱形图。左边的箱形图是在对照个体中测量的水平，右边的箱形图是在膀胱癌(TCC)患者中测量的水平。y轴值表明生物标志物的标度强度。阴影框的顶部和底部分别表示第75和第25百分位数。顶部和底部线条(“须线”)表示各化合物和组的数据点的整个范围，不包括“极端”点，其用圆圈表示。“+”表明平均值，实线表示中位值。
发明详述
目前可获得的经FDA批准的试验以蛋白质或DNA技术为基础。一般认为在个体间和个体内尿液中的生物化学组分随时间推移经历显著变化。对于所述组分的诊断能力，这种变化性将成为其检查的障碍。许多尿液代谢物将患有膀胱癌的受试者与未患膀胱癌的受试者区分开的研究结果是新的，一些是明显产生的而其它是自尿液中消耗的事实使对这些数据的外部正规化子的需要降到最小。根据已发表的其它癌症(尤其肾癌)数据，膀胱癌患者尿液中鉴定出的特定代谢物大部分是意料不到的。同样地，采用类似方法，在膀胱癌患者的组织样品中已鉴定出新的生物标志物。
本发明涉及膀胱癌的生物标志物、用于诊断或辅助诊断膀胱癌的方法、区分膀胱癌与其它泌尿科癌症(例如***癌、肾癌)的方法、测定或辅助测定对膀胱癌的易感性的方法、监测膀胱癌的进展/消退的方法、确定膀胱癌复发的方法、对膀胱癌分期的方法、评价用于治疗膀胱癌的组合物的功效的方法、针对在调节膀胱癌的生物标志物中的活性筛选组合物的方法、鉴定膀胱癌的潜在药物靶标的方法、治疗膀胱癌的方法以及基于膀胱癌的生物标志物的其它方法。然而，在进一步详细描述本发明之前，首先要定义下列术语。
定义：
“生物标志物”意指与具有第二表型(例如未患疾病)的受试者或受试者组的生物样品相比，差异性地存在于(即增加或降低)具有第一表型(例如患有所述疾病)的受试者或受试者组的生物样品中的化合物，优选代谢物。生物标志物可以任何水平差异性地存在，但一般以这样的水平存在，即增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%或更高；或一般以这样的水平存在，即降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100% (即不存在)。生物标志物优选以统计显著的水平差异性地存在(即，如应用Welch T检验或Wilcoxon秩和检验测定，p值小于0.05和/或q值小于0.10)。
一种或多种生物标志物的“水平”意指样品中生物标志物的绝对或相对的量或浓度。
“样品”或“生物样品”意指自受试者分离的生物材料。生物样品可含有适于检测所需生物标志物的任何生物材料，并且可包含受试者的细胞和/或非细胞材料。样品可自任何合适的生物组织或流体例如膀胱组织、血液、血浆、尿液或脑脊液(CSF)分离。
“受试者”意指任何动物，但优选哺乳动物，例如人、猴、小鼠、兔或大鼠。
生物标志物的“参比水平”意指表明特定疾病状态、表型或其缺乏以及疾病状态、表型或其缺乏的组合的生物标志物的水平。生物标志物的“阳性”参比水平意指表明特定疾病状态或表型的水平。生物标志物的“阴性”参比水平意指表明缺乏特定疾病状态或表型的水平。例如，生物标志物的“膀胱癌阳性参比水平”意指表明受试者膀胱癌的阳性诊断的生物标志物水平，生物标志物的“膀胱癌阴性参比水平”意指表明受试者膀胱癌的阴性诊断的生物标志物水平。生物标志物的“参比水平”可以是生物标志物的绝对或相对的量或浓度、生物标志物的存在或不存在、生物标志物的量或浓度的范围、生物标志物的最小和/或最大的量或浓度、生物标志物的平均量或平均浓度和/或生物标志物的量或浓度中位数；另外，生物标志物的组合的“参比水平”也可以是两种或更多种生物标志物彼此之间的绝对或相对的量或浓度的比率。特定疾病状态、表型或其缺乏的生物标志物的合适的阳性和阴性参比水平可通过测量一个或多个合适的受试者的所需生物标志物的水平来确定，并且可使所述参比水平适应特殊群体的受试者(例如，参比水平可以是年龄匹配的，使得可将某一年龄受试者的样品的生物标志物水平与某一年龄组的特定疾病状态、表型或其缺乏的参比水平之间进行比较)。还可使所述参比水平适应于用于测量生物样品中的生物标志物水平的特定技术(例如LC-MS、GC-MS等)，其中生物标志物的水平可根据所采用的特定技术而不同。
“非生物标志物化合物”意指与具有第二表型(例如未患第一种疾病)的受试者或受试者组的生物样品相比，无差异性地存在于具有第一表型(例如患有第一种疾病)的受试者或受试者组的生物样品中的化合物。然而，与第一表型(例如患有第一种疾病)或第二表型(例如未患第一种疾病)相比，所述非生物标志物化合物可以是具有第三表型(例如患有第二种疾病)的受试者或受试者组的生物样品中的生物标志物。
“代谢物”或“小分子”意指存在于细胞中的有机和无机分子。该术语不包括大的高分子，例如大的蛋白质(例如分子量超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的蛋白质)、大的核酸(例如分子量超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的核酸)或大的多糖(例如分子量超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的多糖)。细胞的小分子一般游离存在于胞质或其它细胞器(例如线粒体)的溶液中，它们在其中形成可进一步代谢或用于产生大分子(称为高分子)的中间产物库。术语“小分子”包括信号转导分子和把来源于食物的能量转化成可用形式的化学反应的中间产物。小分子的实例包括糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、细胞过程中形成的中间产物和存在于细胞内的其它小分子。
“代谢概况(Metabolic profile)”或“小分子概况(small molecule profile)”意指靶细胞、组织、器官、生物体或其部分(例如细胞区室)内小分子的全部或部分库存。库存可包括存在的小分子的量和/或类型。“小分子概况”可采用单一技术或多种不同的技术测定。
“代谢物组”意指给定生物体中存在的全部小分子。
“膀胱癌” (BCA)或“移行细胞癌” (TCC)是指其中癌症发生在膀胱中的疾病。如本文所用，BCA和TCC两者可互换使用以表示膀胱癌。
膀胱癌的“分期”是指膀胱瘤扩散到多远的指征。肿瘤分期用来选择治疗选择，并估计患者的预后。膀胱瘤分期范围从T0 (无原发性肿瘤证据，最早期)至T4 (肿瘤已扩散到膀胱周围脂肪组织以外进入附近器官，最晚期)。膀胱癌的早期还可表征为原位癌(CIS)，意味着细胞不正常地增殖，但仍包含在膀胱内。“低分期”或“较低分期”膀胱癌是指膀胱癌肿瘤，包括具有较低复发、进展、侵袭和/或转移潜力的恶性肿瘤(即被视为较少侵略性的膀胱癌)。限于膀胱的癌症肿瘤(即非肌肉浸润性膀胱癌，NMIBC)被视为较少侵略性的膀胱癌。“高分期”或“较高分期”膀胱癌是指在受试者中较可能复发和/或进展和/或变成浸润性的膀胱癌肿瘤，包括具有较高转移潜力的恶性肿瘤(被视为较高侵略性的膀胱癌)。不限于膀胱的癌症肿瘤(即肌肉浸润性膀胱癌)被视为较高侵略性的膀胱癌。
“膀胱癌史”是指之前患有膀胱癌的患者。
“***癌” (PCA)是指其中癌症发生在***中的疾病。
“肾癌”或“肾细胞癌” (RCC)是指其中癌症发生在肾脏中的疾病。
“泌尿科癌症” (UCA)是指其中癌症发生在膀胱、肾脏和/或***中的疾病。
“血尿”是指其中尿液中存在血的病况。
“细胞学”是指FDA批准的程序，其是护理标准的一部分，并且与膀胱镜检查一起使用或作为膀胱镜检查的反映，以检测膀胱癌复发或诊断。它基于形态学特性识别肿瘤细胞。它本身不是试验而是基于尿样的病理会诊。该程序是复杂的，在样品采集中需要专门技能和小心以提供正确的评价。历史上，对于高级别肿瘤，细胞学的性能被描述为极好，但最新研究挑战这种看法。另一方面，就低级别低分期肿瘤(大部分NMIBC肿瘤)中细胞学灵敏度低而言，所有研究总的来说都一致。其两个主要优点是在临床实践中的长期应用历史(根深蒂固)和极高特异性(经评价介于90和100%之间，许多研究将其定为99%)。这就为细胞学会诊提供非常积极的预测价值。这个方法是所有其它试验目前都针对其进行评价的方法，或出于替代或出于辅助细胞学评价的目的。
“BCA评分”是膀胱癌严重程度的度量或指示物，它以本文所述膀胱癌生物标志物和算法为基础。BCA评分使医生能够将患者置于自正常(即无膀胱癌)到高(例如高分期或较高侵略性的膀胱癌)的膀胱癌严重程度范围中。本领域普通技术人员应了解，BCA评分在膀胱癌诊断和治疗中可具有多种用途。例如，BCA评分还可用来区分低分期膀胱癌与高分期膀胱癌，并监测膀胱癌的进展和/或消退。
I. 生物标志物
使用代谢物组概况分析(metabolomic profiling)技术，发现了本文所述的膀胱癌生物标志物。所述代谢物组概况分析技术的更多详情描述于下文的实施例以及美国专利号7,005,255、7,329,489、7,550,258、7,550,260、7,553,616、7,635,556、7,682,783、7,682,784、7,910,301、6,947,453、7,433,787、7,561,975、7,884,318，所述专利的全部内容通过引用结合到本文中。
一般对膀胱癌是阳性的人类受试者的生物样品或是膀胱癌阴性(对照病例)的人类受试者的样品测定代谢概况。示例性的对照包括癌症阴性的健康受试者、癌症阴性的血尿受试者、膀胱癌阴性的癌症受试者。将患有膀胱癌的受试者的生物样品的代谢概况与一个或多个其它受试者组的生物样品的代谢概况进行比较。与另一组(例如膀胱癌阴性样品)相比，在膀胱癌阳性样品的代谢概况中差异性存在的那些分子，包括以统计显著性水平差异性存在的那些分子，被鉴定为区分这些组别的生物标志物。
本文将更详细地论述生物标志物。所发现的生物标志物与区分患有膀胱癌的受试者与未诊断为膀胱癌的对照受试者的生物标志物一致(参见表1、5、7、9、11和/或13)。
还测定了诊断有高分期膀胱癌的人类受试者或诊断有低分期膀胱癌的人类受试者的生物样品的代谢概况。将患有高分期膀胱癌的受试者的生物样品的代谢概况与患有低分期膀胱癌的受试者的生物样品的代谢概况进行比较。与另一组(例如未诊断有高分期膀胱癌的受试者)相比，在患有高分期膀胱癌的受试者的样品的代谢概况中，差异性存在的那些小分子，包括以统计显著性水平差异性存在的那些小分子，被鉴定为区分这些组别的生物标志物。
本文更详细地论述了生物标志物。所发现的生物标志物与区分患有高分期膀胱癌的受试者与患有低分期膀胱癌的受试者的生物标志物一致(参见表5和9)。
II. 方法
A. 膀胱癌的诊断
膀胱癌的生物标志物的鉴定允许呈现有与膀胱癌存在一致的一种或多种症状的受试者中的膀胱癌的诊断(或辅助诊断)，包括之前未鉴定为患有膀胱癌的受试者中膀胱癌的初期诊断和之前曾治疗膀胱癌的受试者中膀胱癌复发的诊断。诊断(或辅助诊断)受试者是否患有膀胱癌的方法包括：(1)分析受试者的生物样品以测定样品中膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，和(2)将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较以诊断(或辅助诊断)受试者是否患有膀胱癌。所使用的一种或多种生物标志物选自表1、5、7、9、11和/或13及其组合。当采用所述方法以辅助诊断膀胱癌时，该方法的结果可与可用于临床确定受试者是否患有膀胱癌的其它方法(或其结果)一起使用。
任何合适的方法都可用来分析生物样品以测定样品中的一种或多种生物标志物的水平。合适的方法包括色谱法(例如HPLC、气相色谱法、液相色谱法)、质谱法(例如MS、MS-MS)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、其它免疫化学技术及其组合。另外，可通过例如使用测量与需要测量的生物标志物的水平相关联的一种化合物(或多种化合物)的水平的测定法，来间接测量一种或多种生物标志物的水平。
可在受试者是否患有膀胱癌的诊断方法和辅助诊断方法中测定表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物的水平。例如，下列生物标志物的一种或多种可单独或组合使用以诊断或辅助诊断膀胱癌：乳酸(lactate)、棕榈酰鞘磷脂、磷酸胆碱、琥珀酸(succinate)、腺苷、1,2-丙二醇、己二酸(adipate)、鹅肌肽、3-羟基丁酸(BHBA)、吡哆酸(pyridoxate)、乙酰肉碱、2-羟基丁酸(AHB)、犬尿氨酸、酪胺、腺苷5’-单磷酸(AMP)、3-羟基苯乙酸(3-hydroxyphenylacetate)、2-羟基马尿酸(水杨基尿酸)、3-羟基吲哚硫酸(3-indoxyl-sulfate)、苯乙酰谷氨酰胺、对甲酚硫酸(p-cresol-sulfate)、3-羟基马尿酸、衣康酸(itaconate)亚甲基琥珀酸(methylenesuccinate)、皮质醇、异丁酰基甘氨酸、葡萄糖酸(gluconate)、黄尿酸(xanthurenate)、古洛糖酸1,4-内酯、肉桂酰基甘氨酸、2-羟吲哚-3-乙酸(2-oxindole-3-acetate)、α-CEHC-葡糖苷酸、儿茶酚硫酸(catechol-sulfate)、γ-谷氨酰基苯丙氨酸、2-异丙基苹果酸(2-isopropylmalate)、4-羟基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetate)、异戊酰基甘氨酸、肉碱、酒石酸(tartarate)、6-磷酸葡糖酸(6-phosphogluconate)、硬脂酰基鞘磷脂、肌醇、葡萄糖、3-(4-羟基苯基)乳酸(3-(4-hydroxyphenyl)lactate)、1-亚油酰基甘油(1-单亚油精)、pro-羟基-pro、γ-谷氨酰基谷氨酸(gamma-glutamylglutamate)、肌酸、5,6-二氢尿嘧啶、二十二碳二烯酸(docosadienoate) (22:2n6)、苯基乳酸(phenyllactate) (PLA)、丙酰肉碱、异亮氨酰基脯氨酸、N2-甲基鸟苷、二十碳五烯酸(eicosapentanenoate) (EPA 20:5n3)、5-甲硫腺苷(MTA)、α-谷氨酰基赖氨酸、3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate)、6-酮***素F1α、二十二碳三烯酸(docosatrienoate) (22:3n3)、2-棕榈油酰基甘油磷酸胆碱、1-硬脂酰基甘油磷酸肌醇、1-棕榈酰基甘油磷酸肌醇、鲨-肌醇、双高-亚油酸(dihomo-linoleate) (20:2n6)、3-磷酸丝氨酸、二十二碳五烯酸(docosapentaenoate) (n6 DPA 22:5n6)、1-棕榈酰甘油和(1-甘油单棕榈酸酯)。另外，可测定例如一种生物标志物、两种或更多种生物标志物、三种或更多种生物标志物、四种或更多种生物标志物、五种或更多种生物标志物、六种或更多种生物标志物、七种或更多种生物标志物、八种或更多种生物标志物、九种或更多种生物标志物、十种或更多种生物标志物等(包括表1、5、7、9、11和/或13中所有生物标志物的组合及其任何部分)的水平，并用于所述方法。测定生物标志物的组合的水平可允许在诊断膀胱癌和辅助诊断膀胱癌中有更大的灵敏度和特异性。例如，生物样品中某些生物标志物(及非生物标志物化合物)的水平的比率可允许在诊断膀胱癌和辅助诊断膀胱癌中有更大的灵敏度和特异性。
还可以使用在某种类型的样品中(例如尿液样品或组织浆样品)对诊断膀胱癌(或辅助诊断膀胱癌)有特异性的一种或多种生物标志物。例如，当生物样品是尿液时，表1、5、11和/或13中所列的一种或多种生物标志物或其任何组合可用来诊断(或辅助诊断)受试者是否患有膀胱癌。当样品是膀胱组织时，选自表7和/或9的一种或多种生物标志物可用来诊断(或辅助诊断)受试者是否患有膀胱癌。
在测定样品中的一种或多种生物标志物的水平后，将所述水平与膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较以辅助诊断或诊断受试者是否患有膀胱癌。样品中匹配膀胱癌阳性参比水平的一种或多种生物标志物的水平(例如与参比水平相同、与参比水平基本相同、高于和/或低于参比水平的最小值和/或最大值和/或在参比水平的范围内的水平)表明受试者诊断为膀胱癌。样品中匹配膀胱癌阴性参比水平的一种或多种生物标志物的水平(例如与参比水平相同、与参比水平基本相同、高于和/或低于参比水平的最小值和/或最大值和/或在参比水平的范围内的水平)表明受试者诊断为无膀胱癌。另外，与膀胱癌阴性参比水平相比，差异性存在于(尤其以统计显著性水平)样品中的一种或多种生物标志物的水平表明受试者诊断为膀胱癌。与膀胱癌阳性参比水平相比，差异性存在于(尤其以统计显著性水平)样品中的一种或多种生物标志物的水平表明受试者中诊断为无膀胱癌。
可采用各种技术将一种或多种生物标志物的水平与膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较，所述技术包括生物样品中一种或多种生物标志物的水平与膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平的简单比较(例如手工比较)。还可应用一种或多种统计分析(例如t检验、Welch T检验、Wilcoxon秩和检验、随机森林(Random forest)、T评分、Z评分)或应用数学模型(例如算法、统计模型)，将生物样品中一种或多种生物标志物的水平与膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较。
例如，包括单一算法或多重算法的数学模型可用来确定受试者是否患有膀胱癌。数学模型还可用来区分膀胱癌分期。采用基于所测生物标志物水平间的数学关系的算法或一系列算法，示例性的数学模型可利用自受试者所测的任何数量的生物标志物(例如2、3、5、7、9种等)的水平来确定受试者是否患有膀胱癌、受试者的膀胱癌是否进展或消退、受试者是否具有高分期或低分期膀胱癌等。
该方法的结果可与可用于诊断受试者的膀胱癌的其它方法(或其结果)一起使用。
一方面，本文提供的生物标志物可用来为医生提供表明受试者膀胱癌的存在和/或严重程度的BCA评分。评分以生物标志物和/或生物标志物组合的临床显著性变化的参比水平为基础。参比水平可自算法推导。BCA评分可用于将受试者置于自正常(即无膀胱癌)至高的膀胱癌严重程度范围内。BCA评分可以多种方式使用：例如，可通过定期测定和监测BCA评分监测疾病进展、消退或缓解；可通过监测BCA评分确定对治疗干预的反应；可采用BCA评分评价药物功效。
测定受试者的BCA评分的方法可利用生物样品中的表1、5、7、9、11和/或13所鉴定的膀胱癌生物标志物的一种或多种进行。该方法可包括将样品中一种或多种膀胱癌生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌参比水平进行比较以确定受试者的BCA评分。该方法可利用选自表1、5、7、9、11和/或13所列的任何数量的标志物，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种标志物。可通过任何方法，包括统计方法例如回归分析，使多种生物标志物与膀胱癌关联。
在测定一种或多种生物标志物的水平后，可将所述水平与膀胱癌参比水平或一种或多种生物标志物的参比曲线进行比较以确定样品中一种或多种生物标志物每一种的评级。可应用任何算法使评级归总以得到受试者的评分，例如BCA评分。算法可考虑与膀胱癌有关的任何因素包括生物标志物的数目、生物标志物与膀胱癌的相关性等。
另外，在一个实施方案中，本文提供的诊断或辅助诊断膀胱癌的生物标志物可用来区分膀胱癌与出现血尿的受试者中的血尿。区分受试者的膀胱癌与血尿的方法包括(1)分析受试者的生物样品以测定样品中膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，和(2)将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较以区分膀胱癌与血尿。所使用的一种或多种生物标志物选自表1、5、7、9、11和/或13。例如，下列生物标志物的一种或多种可单独或以任何组合使用以区分膀胱癌与血尿：黄尿酸、异戊酰基甘氨酸、2-羟基丁酸(AHB)、4-羟基马尿酸、葡萄糖酸、古洛糖酸1,4-内酯、3-羟基马尿酸、酒石酸、2-羟吲哚-3-乙酸、异丁酰基甘氨酸、儿茶酚硫酸、苯乙酰谷氨酰胺、琥珀酸、3-羟基丁酸(BHBA)、肉桂酰基甘氨酸、异丁酰基肉碱、3-羟基苯乙酸、3-羟基吲哚硫酸、山梨糖、2-5-呋喃二甲酸、甲基-4-羟基苯甲酸(methyl-4-hydroxybenzoate)、2-异丙基苹果酸、腺苷5’-单磷酸(AMP)、2-甲基丁酰基甘氨酸、棕榈酰基鞘磷脂、苯基丙酰基甘氨酸、β-羟基丙酮酸、酪胺、3-甲基巴豆酰基甘氨酸、肌肽、果糖、乳酸、磷酸胆碱、腺苷、1,2-丙二醇、己二酸、鹅肌肽、吡哆酸、乙酰肉碱和犬尿氨酸。当所述方法用来区分膀胱癌与血尿时，该方法的结果可与可用于区分膀胱癌与血尿的临床测定的其它方法(或其结果)一起使用。
在另一个实施方案中，本文提供的诊断或辅助诊断膀胱癌的生物标志物可用来区分膀胱癌与其它泌尿科癌症。区分受试者的膀胱癌与其它泌尿科癌症的方法包括(1)分析受试者的生物样品以测定样品中膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，和(2)将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较以区分膀胱癌与其它泌尿科癌症。所使用的一种或多种生物标志物选自表1和/或表11。例如，下列生物标志物的一种或多种可单独或以任何组合使用以区分膀胱癌与其它泌尿科癌症：咪唑-丙酸(imidazole-propionate)、3-羟基吲哚硫酸、苯乙酰基甘氨酸、乳酸、胆碱、甲基-吲哚-3-乙酸、β-丙氨酸、棕榈酰基鞘磷脂、2-羟基异丁酸、琥珀酸、4-雄甾烯-3β-17β-二醇-二硫酸-2 (4-androsten-3beta-17beta-diol-disulfate-2)、4-羟基苯乙酸、甘油、尿嘧啶、古洛糖酸1,4-内酯、苯酚硫酸、二甲基精氨酸(ADMA + SDMA)、环-gly-pro、蔗糖、腺苷、丝氨酸、壬二酸(壬烷二酸)、苏氨酸、孕二醇-3-葡糖苷酸、乙醇胺、葡萄糖酸、N6-甲基腺苷、N-甲基-脯氨酸、甘氨酸和葡萄糖6-磷酸(G6P)、磷酸胆碱、1,2-丙二醇、己二酸、鹅肌肽、3-羟基丁酸(BHBA)、吡哆酸、乙酰肉碱、2-羟基丁酸、犬尿氨酸、酪胺和黄尿酸。当所述方法用来区分膀胱癌与其它泌尿科癌症时，该方法的结果可与可用于区分膀胱癌与其它泌尿科癌症的临床测定的其它方法(或其结果)一起使用。
B. 测定对膀胱癌易感性的方法
膀胱癌的生物标志物的鉴定还允许测定没有膀胱癌症状的受试者是否易发生膀胱癌。测定没有膀胱癌症状的受试者是否易发生膀胱癌的方法包括(1)分析受试者的生物样品以确定样品中的表1、5、7、9、11和/或13所列的一种或多种生物标志物的水平，和(2)将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较以确定受试者是否易发生膀胱癌。所述方法的结果可与可用于临床测定受试者是否易发生膀胱癌的其它方法(或其结果)一起使用。
如上所述与诊断(或辅助诊断)膀胱癌的方法联合，任何合适的方法都可用来分析生物样品以测定样品中的一种或多种生物标志物的水平。
就上述诊断(或辅助诊断)膀胱癌的方法而言，可以测定一种生物标志物、两种或更多种生物标志物、三种或更多种生物标志物、四种或更多种生物标志物、五种或更多种生物标志物、六种或更多种生物标志物、七种或更多种生物标志物、八种或更多种生物标志物、九种或更多种生物标志物、十种或更多种生物标志物等(包括表1、5、7、9、11和/或13中所有生物标志物的组合或其任何部分)的水平，并用于确定没有膀胱癌症状的受试者是否易发生膀胱癌的方法。
在测定样品中的一种或多种生物标志物的水平后，将所述水平与膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较以预测受试者是否易发生膀胱癌。样品中匹配膀胱癌阳性参比水平的一种或多种生物标志物的水平(例如与参比水平相同、与参比水平基本相同、高于和/或低于参比水平的最小值和/或最大值和/或在参比水平的范围内的水平)表明受试者易发生膀胱癌。样品中匹配膀胱癌阴性参比水平的一种或多种生物标志物的水平(例如与参比水平相同、与参比水平基本相同、高于和/或低于参比水平的最小值和/或最大值和/或在参比水平的范围内的水平)表明受试者不易发生膀胱癌。另外，与膀胱癌阴性参比水平相比，差异性存在于(尤其以统计显著性水平)样品中的一种或多种生物标志物的水平表明受试者易发生膀胱癌。与膀胱癌阳性参比水平相比，差异性存在于(尤其以统计显著性水平)样品中的一种或多种生物标志物的水平表明受试者不易发生膀胱癌。
此外，还可确定对评价未患膀胱癌的受试者是否易发生膀胱癌有特异性的参比水平。例如，可确定用于评价发生膀胱癌的受试者的不同风险程度(例如低、中、高)的生物标志物的参比水平。所述参比水平可用于与受试者生物样品中的一种或多种生物标志物的水平比较。
就上述方法而言，可采用各种技术，包括简单比较、一种或多种统计分析及其组合，将一种或多种生物标志物的水平与膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较。
就诊断(或辅助诊断)受试者是否患有膀胱癌的方法而言，确定没有膀胱癌症状的受试者是否易发生膀胱癌的方法还可包括分析生物样品以测定一种或多种非生物标志物化合物的水平。
C. 监测膀胱癌的进展/消退的方法
膀胱癌的生物标志物的鉴定还允许监测受试者的膀胱癌的进展/消退。监测受试者的膀胱癌的进展/消退的方法包括(1)分析受试者的第一生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，所述第一样品在第一时间点获自受试者，(2)分析受试者的第二生物样品以测定所述一种或多种生物标志物的水平，所述第二样品在第二时间点获自受试者，和(3)将第一样品中一种或多种生物标志物的水平与第二样品中一种或多种生物标志物的水平进行比较以监测受试者的膀胱癌的进展/消退。例如，下列生物标志物的一种或多种可单独和组合使用以监测膀胱癌的进展/消退：3-羟基苯乙酸、3-羟基马尿酸、3-羟基丁酸(BHBA)、异戊酰基甘氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、吡哆酸、2-5-呋喃二甲酸、尿囊素、庚二酸(庚烷二酸)、乳酸、腺苷5’-单磷酸(AMP)、儿茶酚硫酸、2-羟基丁酸(AHB)、异丁酰基甘氨酸、2-羟基马尿酸(水杨基尿酸)、葡萄糖酸、咪唑-丙酸、琥珀酸、α-CEHC-葡糖苷酸、3-羟基吲哚硫酸、4-羟基苯乙酸、乙酰肉碱、黄嘌呤、对甲酚硫酸、酒石酸、4-羟基马尿酸、2-异丙基苹果酸、棕榈酰基鞘磷脂、己二酸和N(2)-糠酰基-甘氨酸、磷酸胆碱、腺苷、1,2-丙二醇、鹅肌肽、酪胺、黄尿酸和犬尿氨酸。所述方法的结果表明受试者的膀胱癌的进程(即进展或消退，如有任何改变的话)。
一种或多种生物标志物的水平随时间的变化(如有的话)可表明受试者的膀胱癌的进展或消退。为了表征受试者的膀胱癌的进程，可将第一样品中一种或多种生物标志物的水平、第二样品中一种或多种生物标志物的水平和/或第一和第二样品中生物标志物水平的比较结果与膀胱癌阳性和膀胱癌阴性参比水平进行比较。如果比较表明一种或多种生物标志物的水平随时间(例如在与第一样品相比的第二样品中)提高或降低而变得更类似于膀胱癌阳性参比水平(或更不类似于膀胱癌阴性参比水平)，则结果表明膀胱癌进展。如果比较表明一种或多种生物标志物的水平随时间提高或降低而变得更类似于膀胱癌阴性参比水平(或更不类似于膀胱癌阳性参比水平)，则结果表明膀胱癌消退。
在一个实施方案中，评价可基于表明受试者的膀胱癌并且可随时间监测的BCA评分。通过比较来自第一时间点的样品的BCA评分与来自至少第二时间点的样品的BCA评分，可确定膀胱癌的进展或消退。监测受试者的膀胱癌的进展/消退的这类方法包括(1)分析受试者的第一生物样品以确定在第一时间点获自受试者的所述第一样品的BCA评分，(2)分析受试者的第二生物样品以确定第二BCA评分，所述第二样品在第二时间点获自受试者，和(3)将第一样品的BCA评分与第二样品的BCA评分进行比较以监测受试者的膀胱癌的进展/消退。
本文所述生物标志物和算法可指导或帮助医生决定治疗路径，例如是否实施例如外科手术程序(例如经尿道切除术、根治性膀胱切除术、节段性膀胱切除术)等程序、是否用药物疗法治疗或是否采用观察等待方法。
就本文所述其它方法而言，在监测受试者的膀胱癌的进展/消退的方法中所进行的比较可采用各种技术进行，包括简单比较、一种或多种统计分析、数学模型(算法)及其组合。
该方法的结果可与可用于受试者的膀胱癌的进展/消退的临床监测的其它方法(或其结果)一起使用。
如上所述与诊断(或辅助诊断)膀胱癌的方法联合，任何合适的方法都可用来分析生物样品以测定样品中的一种或多种生物标志物的水平。另外，可测定一种或多种生物标志物(包括表1、5、7、9、11和/或13中所有生物标志物的组合或其任何部分)的水平，并且用于监测受试者的膀胱癌的进展/消退的方法。
可进行所述方法以监测患有膀胱癌的受试者的膀胱癌的进程，或所述方法可用于未患膀胱癌的受试者(例如疑似易发生膀胱癌的受试者)以监测对膀胱癌的易感性水平。
D. 对膀胱癌分期的方法
膀胱癌的生物标志物的鉴定还允许确定受试者的膀胱癌分期。确定膀胱癌的分期的方法包括(1)分析受试者的生物样品以测定样品中表5和/或表9所列的一种或多种生物标志物的水平，和(2)将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的高分期膀胱癌和/或低分期膀胱癌参比水平进行比较以确定受试者的膀胱癌的分期。所述方法的结果可与可用于受试者的膀胱癌分期的临床测定的其它方法(或其结果)一起使用。
如上所述与诊断(或辅助诊断)膀胱癌的方法联合，任何合适的方法都可用来分析生物样品以测定样品中的一种或多种生物标志物的水平。
可在测定受试者的膀胱癌分期的方法中测定表5和表9所列一种或多种生物标志物及其组合的水平。例如，下列生物标志物的一种或多种可单独或组合使用以确定膀胱癌的分期：棕榈酰基乙醇酰胺、棕榈酰鞘磷脂、血栓烷B2、胆红素(Z,Z)、肾上腺酸(adrenate) (22:4n6)、C-糖基色氨酸、甲基-α-吡喃葡糖苷、甲基磷酸、3-羟基癸酸、3-羟基辛酸、4-羟基苯基丙酮酸、N-乙酰基苏氨酸、1-花生四烯酰基甘油磷酸肌醇(arachidonoylglycerophosphoinositol)、5,6-二氢胸腺嘧啶、2-羟基棕榈酸、辅酶A、N-乙酰基丝氨酸(acetylserione)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、二十二碳三烯酸(22:3n3)、还原型谷胱甘肽(GSH)、***素A2、谷氨酰胺、谷氨酸γ-甲基酯、二十二碳五烯酸(n6 DPA 22:5n6)、甘氨鹅脱氧胆酸、己酰基肉碱、花生四烯酸(20:4n6)、pro-羟基-pro、二十二碳六烯酸(DHA 22:6n3)、月桂基肉碱、乳酸、磷酸胆碱、琥珀酸、腺苷、1,2-丙二醇、己二酸、鹅肌肽、3-羟基丁酸(BHBA)、吡哆酸、乙酰肉碱、2-羟基丁酸(AHB)、犬尿氨酸、酪胺和黄尿酸。另外，可测定例如一种生物标志物、两种或更多种生物标志物、三种或更多种生物标志物、四种或更多种生物标志物、五种或更多种生物标志物、六种或更多种生物标志物、七种或更多种生物标志物、八种或更多种生物标志物、九种或更多种生物标志物、十种或更多种生物标志物等(包括表5和/或表9所列全部生物标志物的组合或其任何部分)的水平，并可用于确定受试者的膀胱癌分期的方法。
在测定样品中的一种或多种生物标志物的水平后，将所述水平与低分期膀胱癌和/或高分期膀胱癌参比水平进行比较以确定受试者的膀胱癌的分期。样品中匹配高分期膀胱癌参比水平的一种或多种生物标志物的水平(例如与参比水平相同、与参比水平基本相同、高于和/或低于参比水平的最小值和/或最大值和/或在参比水平的范围内的水平)表明受试者患有高分期膀胱癌。样品中匹配低分期膀胱癌参比水平的一种或多种生物标志物的水平(例如与参比水平相同、与参比水平基本相同、高于和/或低于参比水平的最小值和/或最大值和/或在参比水平的范围内的水平)表明受试者患有低分期膀胱癌。另外，与低分期膀胱癌参比水平相比，差异性存在于(尤其以统计显著性水平)样品中的一种或多种生物标志物的水平表明受试者未患低分期膀胱癌。与高分期膀胱癌参比水平相比，差异性存在于(尤其以统计显著性水平)样品中的一种或多种生物标志物的水平表明受试者未患高分期膀胱癌。
进行了研究以鉴定一套可用于确定受试者的膀胱癌分期的生物标志物。在另一个实施方案中，本文提供的生物标志物可用来为医生提供表示受试者的膀胱癌分期的BCA评分。评分基于生物标志物和/或生物标志物的组合的临床显著性变化的参比水平。参比水平可自算法推导。可利用BCA评分以确定从正常(即无膀胱癌)到高分期膀胱癌的受试者的膀胱癌分期。
本文所述生物标志物和算法可指导或帮助医生决定治疗路径，例如是否实施例如外科手术程序(例如经尿道切除术、根治性膀胱切除术、节段性膀胱切除术)等程序、是否用药物疗法治疗或是否采用观察等待方法。
就上述方法而言，可采用各种技术，包括简单比较、一种或多种统计分析、数学模型(算法)及其组合，将一种或多种生物标志物的水平与高分期膀胱癌和/或低分期膀胱癌参比水平进行比较。
就诊断(或辅助诊断)受试者是否患有膀胱癌的方法而言，确定受试者的膀胱癌分期的方法还可包括分析生物样品以测定一种或多种非生物标志物化合物的水平。
E. 评价用于治疗膀胱癌的组合物的功效的方法
膀胱癌的生物标志物的鉴定还允许评价治疗膀胱癌的组合物的功效以及评价治疗膀胱癌的两种或更多种组合物的相对功效。所述评价可用于例如功效研究以及治疗膀胱癌的组合物的前导选择。
评价用于治疗膀胱癌的组合物的功效的方法包括(1)分析患有膀胱癌并且目前或之前用组合物治疗的受试者的生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物的水平，和(2)将样品中的一种或多种生物标志物的水平与以下进行比较：(a)受试者的之前采集的生物样品的一种或多种生物标志物的水平，其中在用组合物治疗之前从受试者获得所述之前采集的生物样品，(b)一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性参比水平，和(c)一种或多种生物标志物的膀胱癌阴性参比水平。比较结果表明用于治疗膀胱癌的组合物的功效。
因此，为了表征用于治疗膀胱癌的组合物的功效，将生物样品中一种或多种生物标志物的水平与以下进行比较：(1)膀胱癌阳性参比水平，(2)膀胱癌阴性参比水平，和(3)在用组合物治疗之前受试者的一种或多种生物标志物的在先水平。
当将生物样品(来自患有膀胱癌并且目前或之前用组合物治疗的受试者)中一种或多种生物标志物的水平与膀胱癌阳性参比水平和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较时，样品中匹配膀胱癌阴性参比水平的水平(例如与参比水平相同、与参比水平基本相同、高于和/或低于参比水平的最小值和/或最大值和/或在参比水平的范围内的水平)表明组合物具有治疗膀胱癌的功效。样品中匹配膀胱癌阳性参比水平的一种或多种生物标志物的水平(例如与参比水平相同、与参比水平基本相同、高于和/或低于参比水平的最小值和/或最大值和/或在参比水平的范围内的水平)表明组合物没有治疗膀胱癌的功效。根据一种或多种生物标志物的水平，比较还可表明治疗膀胱癌的功效的程度。
当将生物样品(来自患有膀胱癌并且目前或之前用组合物治疗的受试者)中一种或多种生物标志物的水平与在用组合物治疗前来自受试者的之前采集的生物样品的一种或多种生物标志物的水平进行比较时，一种或多种生物标志物的水平的任何变化都表明治疗膀胱癌的组合物的功效。也就是说，如果比较表明一种或多种生物标志物的水平在用组合物治疗后提高或降低以变得更类似于膀胱癌阴性参比水平(或更不类似于膀胱癌阳性参比水平)，则结果表明组合物具有治疗膀胱癌的功效。如果比较表明一种或多种生物标志物的水平在用组合物治疗后没有提高或降低以变得更类似于膀胱癌阴性参比水平(或更不类似于膀胱癌阳性参比水平)，则结果表明组合物没有治疗膀胱癌的功效。根据治疗后在一种或多种生物标志物的水平中所观察到的变化的量，比较还可表明治疗膀胱癌的功效的程度。为了有助于表征这类比较，可将一种或多种生物标志物的水平的变化、治疗前一种或多种生物标志物的水平和/或目前或之前用组合物治疗的受试者的一种或多种生物标志物的水平与膀胱癌阳性参比水平和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较。
用于评价组合物在治疗膀胱癌中的功效的另一种方法包括(1)分析受试者的第一生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物的水平，所述第一样品在第一时间点获自受试者，(2)将组合物给予受试者，(3)分析受试者的第二生物样品以测定一种或多种生物标志物的水平，所述第二样品在给予组合物后的第二时间点获自受试者，和(4)将第一样品中一种或多种生物标志物的水平与第二样品中一种或多种生物标志物的水平进行比较以评价用于治疗膀胱癌的组合物的功效。如上所述，如果样品的比较表明一种或多种生物标志物的水平在给予组合物后提高或降低以变得更类似于膀胱癌阴性参比水平，则结果表明组合物具有治疗膀胱癌的功效。如果比较表明一种或多种生物标志物的水平在用组合物治疗后没有提高或降低以变得更类似于膀胱癌阴性参比水平(或更不类似于膀胱癌阳性参比水平)，则结果表明组合物没有治疗膀胱癌的功效。根据如上所述给予组合物后在一种或多种生物标志物的水平中观察到的变化的量，比较还可表明治疗膀胱癌的功效的程度。
评价用于治疗膀胱癌的两种或更多种组合物的相对功效的方法包括(1)分析来自患有膀胱癌且目前或之前用第一组合物治疗的第一受试者的第一生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物的水平，(2)分析来自患有膀胱癌且目前或之前用第二组合物治疗的第二受试者的第二生物样品以测定所述一种或多种生物标志物的水平，和(3)将第一样品中一种或多种生物标志物的水平与第二样品中一种或多种生物标志物的水平进行比较以评价用于治疗膀胱癌的第一和第二组合物的相对功效。结果表明两种组合物的相对功效，并且可将所述结果(或第一样品中一种或多种生物标志物的水平和/或第二样品中一种或多种生物标志物的水平)与膀胱癌阳性参比水平、膀胱癌阴性参比水平进行比较以辅助表征相对功效。
可对一个或多个受试者或一组或多组受试者(例如第一组用第一组合物治疗，第二组用第二组合物治疗)进行评价功效的各种方法。
就本文所述其它方法而言，可采用各种技术，包括简单比较、一种或多种统计分析及其组合，来进行在评价治疗膀胱癌的组合物的功效(或相对功效)的方法中所进行的比较。可采用的技术的实例是确定受试者的BCA评分。任何合适的方法都可用来分析生物样品以测定样品中的一种或多种生物标志物的水平。另外，可以测定一种或多种生物标志物包括表1、5、7、9、11和/或13中所有生物标志物的组合或其任何部分的水平，并且用于评价治疗膀胱癌的组合物的功效(或相对功效)的方法。
最后，评价一种或多种用于治疗膀胱癌的组合物的功效(或相对功效)的方法还可包括分析生物样品以测定一种或多种非生物标志物化合物的水平。然后可将非生物标志物化合物与患有(或未患)膀胱癌的受试者的非生物标志物化合物的参比水平进行比较。
F. 针对在调节与膀胱癌有关的生物标志物中的活性筛选组合物的方法
膀胱癌的生物标志物的鉴定还允许针对在调节与膀胱癌有关的生物标志物中的活性筛选组合物，所述组合物可用于治疗膀胱癌。筛选可用于治疗膀胱癌的组合物的方法包括针对在调节表1、5、7、9、11和/或13中的一种或多种生物标志物的水平中的活性测定试验组合物。这类筛选测定可在体外和/或体内进行，并且可以是用于在试验组合物存在下测定所述生物标志物调节的本领域已知的任何形式，例如细胞培养测定、器官培养测定和体内测定(例如涉及动物模型的测定)。
在一个实施方案中，针对在调节膀胱癌的一种或多种生物标志物中的活性筛选组合物的方法包括(1)使一种或多种细胞与组合物接触，(2)分析一种或多种细胞的至少一部分或与细胞有关的生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平；和(3)将一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的预定标准水平进行比较以确定组合物是否调节一种或多种生物标志物的水平。如上所述，可使细胞与组合物在体外和/或体内接触。一种或多种生物标志物的预定标准水平可以是在组合物不存在时一种或多种细胞中的一种或多种生物标志物的水平。一种或多种生物标志物的预定标准水平还可以是未与组合物接触的对照细胞中一种或多种生物标志物的水平。
另外，所述方法还可包括分析一种或多种细胞的至少一部分或与细胞有关的生物样品以测定膀胱癌的一种或多种非生物标志物化合物的水平。然后可将非生物标志物化合物的水平与一种或多种非生物标志物化合物的预定标准水平进行比较。
可采用任何合适的方法以分析一种或多种细胞的至少一部分或与细胞有关的生物样品以测定一种或多种生物标志物的水平(或非生物标志物化合物的水平)。合适的方法包括色谱法(例如HPLC、气相色谱法、液相色谱法)、质谱法(例如MS、MS-MS)、ELISA、抗体连接、其它免疫化学技术及其组合。另外，可通过例如采用测量与需要测量的生物标志物(或非生物标志物化合物)的水平相关的一种化合物(多种或化合物)的水平的测定法，间接测量一种或多种生物标志物的水平(或非生物标志物化合物的水平)。
G. 鉴定潜在药物靶标的方法
膀胱癌的生物标志物的鉴定还允许鉴定膀胱癌的潜在药物靶标。用于鉴定膀胱癌的潜在药物靶标的方法包括(1)鉴定与选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种膀胱癌的生物标志物有关的一个或多个生物化学途径，和(2)鉴定影响一个或多个已鉴定的生物化学途径的至少一个的蛋白质(例如酶)，所述蛋白质是膀胱癌的潜在药物靶标。
鉴定膀胱癌的潜在药物靶标的另一种方法包括(1)鉴定与选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种膀胱癌的生物标志物和一种或多种膀胱癌的非生物标志物化合物有关的一个或多个生物化学途径，和(2)鉴定影响一个或多个已鉴定的生物化学途径的至少一个的蛋白质，所述蛋白质是膀胱癌的潜在药物靶标。
鉴定与一种或多种生物标志物(或非生物标志物化合物)有关的一个或多个生物化学途径(例如生物合成和/或代谢(分解代谢)途径)。在鉴定出生物化学途径后，鉴定影响至少一个途径的一种或多种蛋白质。优选鉴定出影响一个以上途径的那些蛋白质。
一种代谢物(例如途径中间产物)的堆积可能表明“阻断”代谢物下游的存在，并且所述阻断可导致下游代谢物(例如生物合成途径的产物)水平低下/不存在。以类似方式，缺乏代谢物可表明代谢物上游途径存在“阻断”，其因酶无活性或无功能或因其为产生产物的必需底物的生物化学中间产物的不可利用性造成。或者，代谢物水平的提高可表明产生异常蛋白质的遗传突变，这导致代谢物超量产生和/或累积，这继而导致其它相关生物化学途径改变，并导致通过该途径的正常流量调节异常；另外，生物化学中间代谢物的堆积可能是有毒的，或者可能损害相关途径必需中间产物的产生。有可能途径间的关系目前是未知的，而该数据可揭示这种关系。
例如，数据表明，膀胱癌受试者中富含涉及氮***、氨基酸代谢、能量代谢、氧化应激、嘌呤代谢和胆汁酸代谢的生物化学途径中的代谢物。另外，在癌症受试者中多胺水平较高，这表明了酶鸟氨酸脱羧酶的水平和/或活性提高。已知多胺可起有丝***剂的作用，并且与自由基损害有关。这些观察结果表明导致多胺(或任何异常生物标志物)产生的途径将提供多种可用于药物发现的潜在靶标。
在另一个实例中，数据表明，膀胱癌受试者中富含涉及脂质膜代谢、能量代谢、I期和II期肝解毒和腺苷代谢的生物化学途径中的代谢物。另外，在癌症受试者中磷酸胆碱水平较高，这表明了鞘磷脂酶的水平和/或活性提高。这些观察结果表明导致磷酸胆碱(或任何异常生物标志物)产生的途径将提供多种可用于药物发现的潜在靶标。
鉴定为潜在药物靶标的蛋白质然后可用来鉴定可能是治疗膀胱癌的潜在候选物的组合物，包括基因疗法的组合物。
H. 治疗膀胱癌的方法
膀胱癌的生物标志物的鉴定还允许治疗膀胱癌。例如，为了治疗患有膀胱癌的受试者，可将与未患膀胱癌的健康受试者相比在膀胱癌中降低的有效量的一种或多种膀胱癌生物标志物给予受试者。可给予的生物标志物可包含表1、5、7、9、11和/或13所列的在膀胱癌中降低的一种或多种生物标志物。在一些实施方案中，给予的生物标志物是表1、5、7、9、11和/或13中所列的在膀胱癌中降低且p值小于0.10的一种或多种生物标志物。在其它实施方案中，给予的生物标志物是表1、5、7、9、11和/或13中所列的在膀胱癌中降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100% (即不存在)的一种或多种生物标志物。
在一个实例中，存在于尿液中的鞘磷脂酶切割鞘磷脂形成磷酸胆碱和神经酰胺。可提高膀胱癌受试者中的鞘磷脂酶活性以处理大量的鞘磷脂。当酶(例如鞘磷脂酶)的活性提高与膀胱癌有关时，给予鞘磷脂酶活性的抑制剂代表了治疗膀胱癌的一种可能方法。
III. 其它方法
还预期使用本文所述生物标志物的其它方法。例如，可采用包含一种或多种本文公开的生物标志物的小分子概况，进行描述于美国专利号7,005,255、美国专利号7,329,489、美国专利号7,553,616、美国专利号7,550,260、美国专利号7,550,258、美国专利号7,635,556、美国专利申请号11/728,826、美国专利申请号12/463,690和美国专利申请号12/182,828的方法。
在本文所列的任何方法中，所使用的生物标志物可选自表1、5、7、9、11和/或13中p值小于0.05的生物标志物。用于本文所述任何方法的生物标志物还可选自表1、5、7、9、11和/或13中在膀胱癌中降低(与对照相比)或在泌尿科癌症中降低(与对照相比)至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100% (即不存在)的生物标志物；和/或表1、5、7、9、11和/或13中在膀胱癌中增加(与对照或缓解相比)或在缓解中增加(与对照相比或膀胱癌)至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%或更高的生物标志物。
实施例
将通过下列欲为非限制性的说明性实施例进一步解释本发明。
I. 通用方法
A. 鉴定膀胱癌的代谢概况
分析各样品以测定几百种代谢物的浓度。采用分析技术例如GC-MS (气相色谱法-质谱法)和LC-MS (液相色谱法-质谱法)分析代谢物。在适当的质量控制(QC)后，对多个等分试样进行同时平行地分析，将来自各分析的信息重组。按照几千个特性，其最终相当于几百种化学物类，来表征每个样品。所用技术能够鉴定新的和化学上未命名的化合物。
B. 统计分析
应用T检验分析数据以鉴定以差异性水平存在于可用于区分可定义群体(例如膀胱癌和对照)的可定义群体或亚群(例如与对照生物样品相比或与膀胱癌缓解的患者相比的膀胱癌生物样品的生物标志物)中的分子(已知已命名的代谢物或未命名的代谢物)。亦鉴定了可定义群体或亚群中的其它分子(已知已命名的代谢物或未命名的代谢物)。
还采用单向变量分析(ANOVA)对比分析了数据以鉴定以差异性水平存在于可用于区分可定义群体(例如膀胱癌和对照)的可定义群体或亚群(例如与对照生物样品相比或与膀胱癌缓解的患者相比的膀胱癌生物样品的生物标志物)中的分子(已知已命名的代谢物或未命名的代谢物)。ANOVA是用于检验多组(≥ 2)的均值是相等的统计模型。各组可以是单一变量(称为单向ANOVA)或2、3或更多个变量的组合(双向ANOVA、三向ANOVA等)的水平。通过主效应和交互项接近总的变量效应。然后可使用检验组平均值的线性组合等于0的对比来检验更具体的假设。与两样本T检验不一样，ANOVA可处理重复测量/相关观测。还鉴定了可定义群体或亚群中的其它分子(已知已命名的代谢物或未命名的代谢物)。
还应用随机森林分析对数据进行了分析。随机森林给出个体在新的数据集中可如何好地归类到既有组的估计。随机森林分析根据实验单位和化合物的连续采样建立一套分类树。然后根据来自所有分类树的多数投票对各观察结果分类。在统计学上，分类树根据变量的组合(在本实例下变量为代谢物或化合物)将观察结果分成组。用于建立分类树的算法有许多变化。树算法搜索在两组间提供最大分割(split)的代谢物(化合物)。这产生了节点。然后在各个节点，使用提供最佳分割的代谢物等等。如果该节点无法提高，则在该节点停止，并且该节点的任何观察结果被归类为多数组(majority group)。
随机森林根据大量的(例如数千)树进行分类。使用化合物的子集和观察结果的子集结果来建立各树。用于建立树的观察结果称为袋内样本(in-bag sample)，剩余样本称为袋外样本(out-of-bag sample)。分类树自袋内样本建立，而袋外样本自该树预测。为了得到观察结果的最终分类，根据它是袋外样本的次数，对各组的“投票”进行计数。例如，假设观察结果1由2,000个树被归类为“对照”，但由3,000个树归类为“疾病”。使用“多数获胜”作为标准，该样品被归类为“疾病”。
随机森林的结果概括于混乱矩阵(confusion matrix)中。各行对应于真实归类(true grouping)，各列对应于随机森林的分类。因此，对角元素表明正确分类。对于2个组，可能随机出现50%差错，对于3个组，可能随机出现66.67%差错等。“袋外” (OOB)差错率给出应用随机森林模型如何可正确地预测新的观察结果的估计(例如样品是来自患病受试者还是对照受试者)。
引人关注的还有观察哪个变量在最终分类中更“重要”。“重要性制图(importance plot)”显示根据其重要性排列的最上面的化合物。准确度测量中的平均降低用来测定重要性。如下计算平均降低准确性(Mean Decrease Accuracy)：对于随机森林中的各树，计算基于袋外样本的分类差错。然后置换各变量(代谢物)，并计算各树的所得差错。然后计算两个差错间的差异的平均值。然后通过除以这些差异的标准差换算该平均值。变量越重要，平均降低准确性越高。
回归分析应用岭逻辑斯谛回归模型进行。逻辑斯谛回归的岭回归形式对平方系数之和设定限制，即如果b1、b2、b3等是各代谢物的系数，则岭回归对这些的平方之和设定限制(即b1^2 + b2^2 + b3^2 + … + bp^2 < c)。这个界限迫使许多系数下降为零，因此该方法也进行变量选择。
C. 生物标志物鉴定
对在分析(例如GC-MS、LC-MS、LC-MS-MS)中鉴定的各个峰值(包括鉴定为统计显著性的峰值)进行基于质谱法的化学鉴定方法。
实施例1：膀胱癌的生物标志物
通过以下方面发现生物标志物：(1)分析不同组的人类受试者的尿液样品以测定样品中代谢物的水平，然后(2)对结果进行统计分析以确定差异性存在于2个组中的代谢物。
进行了两项研究以鉴定膀胱癌的生物标志物。在研究1中，将自未患膀胱癌的受试者收集的10个对照尿液样品和来自患有膀胱癌(尿路上皮移行细胞癌)的受试者的10个尿液样品用于分析。年龄、种族和性别全都受严格控制以使混淆人口统计学影响的变量的作用降到最小。所有受试者均为高加索人男性。膀胱癌组群的平均年龄为71.1，对照组群的平均年龄为67.7。对于年龄，配对t检验分析p值为0.2，这表明在2个组间年龄不是显著差异。
在测定代谢物的水平之后，应用单变量T检验(即Welch T检验)分析了数据。如下表1中所列，已命名化合物的分析导致鉴定出与对照受试者相比在膀胱癌患者的尿液中升高的生物标志物和与对照受试者相比在膀胱癌患者的尿液中降低的生物标志物。
鉴定出在膀胱癌患者和没有膀胱癌的对照患者的尿液样品中差异性存在的生物标志物。表1第1-3列列出已鉴定的生物标志物，对于各个列出的生物标志物，包括生物标志物的生物化学名称、与非癌症受试者(TCC/对照)相比在癌症中的生物标志物的倍数变化(FC) (其是在癌症样品中生物标志物的平均水平与对照平均水平的比率)和在有关生物标志物的数据的统计分析中确定的p值(表1第1-3列)。表1第10列列出了可靠标准品(authentic standards)内部化学库中的所述生物标志物化合物的内部标识符(CompID)。带有(*)的代谢物表示在TCC/对照比较(研究1)和下述较大研究(研究2)两者中的统计显著性(p<0.1)。粗体值表示p值≤0.1的倍数变化。表1包括其它数据，将在下文中进行全面解释。
表1. 尿液中的膀胱癌生物标志物
显示支持其用作诊断膀胱癌的生物标志物的丰度概况的生物标志物代谢物的实例包括在其它癌症中观察到的肿瘤代谢物(oncometabolite)的组合(甘油-2-磷酸、异柠檬酸、甘油磷酸胆碱(GPC)、异丁酰基肉碱/甘氨酸、黄尿酸)和对膀胱癌是新的代谢物(α-羟基丁酸、N-乙酰基谷氨酸)。图1提供对于所选定的示例性生物标志物代谢物在TCC和病例对照之间的重量摩尔渗透压浓度归一化丰度比的倍数变化概况的示图。可绘制表1所列任何生物标志物代谢物的类似示图。
在研究2中，通过(1)分析自以下受试者中收集的尿液样品：89名未患膀胱癌的对照受试者(正常)、66名患有膀胱癌的受试者(BCA)、58名患有血尿的受试者(Hem)、48名患有肾细胞癌的受试者(RCC)和58名患有***癌的受试者(PCA)，以测定样品中代谢物的水平，然后(2)对结果进行统计分析以确定在组间差异性存在的代谢物，发现生物标志物。
在测定代谢物的水平之后，应用单向ANOVA对比对数据进行了分析。三个比较被用来鉴定膀胱癌的生物标志物：膀胱癌与正常、膀胱癌与血尿及膀胱癌与肾细胞癌和***癌。如表1中所列，已命名化合物的分析导致鉴定出在a)膀胱癌和正常(第4-5栏)、b)膀胱癌和血尿(第6-7栏)和/或c)膀胱癌和肾细胞癌+***癌(第8-9栏)之间差异性地存在的生物标志物。
对于各生物标志物，表1包括生物标志物的生物化学名称；与非膀胱癌受试者相比膀胱癌中生物标志物的倍数变化(FC) (BCA/正常、BCA/血尿和BCA/RCC+PCA)，其是膀胱癌样品中生物标志物的平均水平与非膀胱癌平均水平相比较的比率；和在有关生物标志物的数据的统计分析中测定的p值。表1第10栏列出了可靠标准品内部化学库中的所述生物标志物化合物的内部标识符(CompID)。带(*)的代谢物表示在上述两项研究中的统计显著性。粗体值表示p值≤0.1的变化倍数。
实施例2. 根据统计模型中的尿液生物标志物对受试者的分类
A. BCA与非癌症
许多分析方法可用来评价已鉴定的生物标志物用于诊断患者病况(例如患者是否患有膀胱癌)的实用性。下面采用两个简单方法：主成分分析和利用皮尔逊相关性的分级群聚。
在一种分析方法中，进行主成分分析以建立将受试者归类为对照(非癌症)或膀胱癌(TCC)的模型。用于主成分分析模型的数据获自实施例1的研究1的尿液样品的重量摩尔渗透压浓度归一化数据(即自未患膀胱癌的受试者收集的10个对照尿液样品和来自患有膀胱癌的受试者(尿路上皮移行细胞癌)的10个尿液样品)。
使用主成分分析推导的模型，发现根据所测的生物标志物水平，10个对照受试者样品中有7个被正确归类为对照，而10个膀胱癌受试者样品中有7个被正确归类为膀胱癌。模型测定出一些个体的中间值。具有中间值的个体不会被分到两组之一。中间组由6名受试者组成，其中3名为对照，另3名为膀胱癌患者。图2中提供了PCA结果的图解。
在另一个统计分析中，利用自实施例1的研究1获得的重量摩尔渗透压浓度归一化生物标志物值(即自未患膀胱癌的受试者收集的10个对照尿液样品和来自患有膀胱癌的受试者(尿路上皮移行细胞癌)的10个尿液样品)，采用分级群聚(皮尔逊相关性)对BCA和非癌症对照受试者进行分类。该分析导致受试者被分成3个不同的组。一组由100%对照个体组成，一组由100%膀胱癌患者组成，一组由33%对照和67%膀胱癌患者组成。图3提供分级群聚结果的图解。
PCA和分级群聚模型的结果提供了使用尿液生物标志物代谢物水平可区分的膀胱疾病和/或膀胱癌的多种代谢类型的存在的证据。例如，中间组中鉴定的癌症患者可能具有较小侵略性形式的膀胱癌，或可能是癌症的较早分期。区分癌症类型(例如较小侵略性与较大侵略性)和癌症分期对医生确定疗程可能是有价值的信息。
在另一项分析中，采用随机森林分析评价实施例1中鉴定的生物标志物以将受试者归类为正常或患有BCA。来自66名BCA受试者和89名正常受试者(未诊断患有BCA或其它泌尿科癌症的受试者)的尿液样品被用于该分析。
随机森林结果显示样品以84%预测准确度进行分类。表2提供的混乱矩阵显示针对各分类所预测的样品数和各组(BCA或正常)的实际数。“袋外” (OOB)差错率给出应用随机森林模型如何准确地预测新的观察结果的估计(例如样品是来自患病受试者还是对照受试者)。该随机森林的OOB差错约为16%，且该模型估计，当用于新的一组受试者时，87%的时间可准确地预测正常受试者的特性，而80%的时间可预测膀胱癌受试者。
表2. 随机森林的结果：膀胱癌与正常
根据16%的OOB差错率，根据在受试者样品中所测的生物标志物水平，所建立的随机森林模型以约84%准确度预测了样品是否来自患膀胱癌的个体。区分各组的示例性生物标志物为腺苷5’-单磷酸(AMP)、3-羟基苯乙酸、2-羟基马尿酸(水杨基尿酸)、3-羟基吲哚硫酸、苯乙酰谷氨酰胺、对甲酚硫酸、3-羟基马尿酸、乳酸、衣康酸亚甲基琥珀酸、皮质醇、异丁酰基甘氨酸、葡萄糖酸、黄尿酸、古洛糖酸1,4-内酯、3-羟基丁酸(BHBA)、肉桂酰基甘氨酸、2-羟吲哚-3-乙酸、2-羟基丁酸(AHB)、1-2-丙二醇、α-CEHC-葡糖苷酸、棕榈酰基鞘磷脂、儿茶酚硫酸、γ-谷氨酰基苯丙氨酸、2-异丙基苹果酸、琥珀酸、4-羟基苯乙酸、吡哆酸、异戊酰基甘氨酸、肉碱和酒石酸。
随机森林分析证实，通过使用生物标志物，以80%灵敏度、87%特异性、82% PPV和86% NPV，将BCA受试者与正常受试者区分开来。
B. BCA与其它泌尿科癌症
利用表1中的生物标志物来建立统计模型以将受试者归类为患有BCA或其它泌尿科癌症。应用随机森林分析，将生物标志物用于数学模型以将受试者归类为患有BCA或患有PCA或RCC。将来自66名BCA受试者和106名PCA或RCC受试者的尿液样品用于该分析。
随机森林结果显示，以83%预测准确度将样品分类。表3提供的混乱矩阵显示对于各分类所预测的样品数和各组(BCA或PCA+RCC)的实际数。“袋外” (OOB)差错率给出应用随机森林模型可如何准确地预测新的观察结果的估计(例如样品是来自膀胱癌受试者还是患有PCA或RCC的受试者)。随机森林的OOB差错约为17%，且该模型估计，当用于新的一组受试者时，85%的时间可准确地预测BCA受试者的特性，而82%的时间可预测出PCA+RCC受试者。
表3. 随机森林的结果：膀胱癌与PCA+RCC
根据17%的OOB差错率，根据在受试者样品中所测的生物标志物水平，所建立的随机森林模型以约83%准确度预测了样品是否来自患膀胱癌的个体。区分各组的示例性生物标志物为咪唑-丙酸、3-羟基吲哚硫酸、苯乙酰基甘氨酸、乳酸、胆碱、甲基-吲哚-3-乙酸、β-丙氨酸、棕榈酰基鞘磷脂、2-羟基异丁酸、琥珀酸、4-雄甾烯-3β-17β-二醇-二硫酸-2、4-羟基苯乙酸、甘油、尿嘧啶、古洛糖酸1,4-内酯、苯酚硫酸、二甲基精氨酸(ADMA + SDMA)、环-gly-pro、蔗糖、腺苷、丝氨酸、壬二酸(壬烷二酸)、苏氨酸、孕二醇-3-葡糖苷酸、乙醇胺、葡萄糖酸、N6-甲基腺苷、N-甲基脯氨酸、甘氨酸、葡萄糖6-磷酸(G6P)。
随机森林结果表明通过使用生物标志物，以85%灵敏度、82%特异性、75% PPV和90% NPV将BCA受试者与PCA+RCC受试者区分开来。
C. BCA与血尿
利用表1中的生物标志物来建立统计模型以将受试者归类为患有BCA或血尿。应用随机森林分析，生物标志物被用于数学模型以将受试者归类为患有BCA或血尿。将来自66名BCA和58名血尿患者的尿液样品用于分析。
随机森林结果显示，样品以74%预测准确度被分类。表4中提供的混乱矩阵显示针对各分类所预测的样品数和各组(BCA或血尿)的实际数。“袋外” (OOB)差错率给出应用随机森林模型可如何准确地预测新的观察结果的估计(例如样品是来自膀胱癌受试者还是患有血尿的受试者)。随机森林的OOB差错约为26%，且该模型估计，当用于新的一组受试者时，70%的时间可准确地预测BCA受试者的特性，而79%的时间可预测出血尿受试者。
表4. 随机森林的结果：膀胱癌与血尿
根据26%的OOB差错率，根据对受试者样品中所测的生物标志物水平的分析，所建立的随机森林模型以约74%准确度预测了样品是否来自患膀胱癌的个体。用于区分各组的示例性生物标志物为异戊酰基甘氨酸、2-羟基丁酸(AHB)、4-羟基马尿酸、葡萄糖酸、古洛糖酸1,4-内酯、3-羟基马尿酸、酒石酸、2-羟吲哚-3-乙酸、异丁酰基甘氨酸、儿茶酚硫酸、苯乙酰谷氨酰胺、琥珀酸、3-羟基丁酸(BHBA)、肉桂酰基甘氨酸、异丁酰基肉碱、3-羟基苯乙酸、3-羟基吲哚硫酸、山梨糖、2-5-呋喃二甲酸、甲基-4-羟基苯甲酸、2-异丙基苹果酸、腺苷5’-单磷酸(AMP)、2-甲基丁酰基甘氨酸、棕榈酰基鞘磷脂、苯基丙酰基甘氨酸、β-羟基丙酮酸、酪胺、3-甲基巴豆酰基甘氨酸、肌肽、果糖。
随机森林结果表明通过使用生物标志物，以70%灵敏度、79%特异性、79% PPV和70% NPV将BCA受试者与血尿受试者区分开来。
实施例3. 用于膀胱癌分期的生物标志物
膀胱癌分期提供***扩散程度的指征。肿瘤分期用来选择治疗选择和估计患者的预后。膀胱瘤分期范围从T0 (无原发性肿瘤证据，最早期)到T4 (肿瘤已扩散到膀胱周围脂肪组织以外进入附近器官，最晚期)。膀胱癌的早期还可被表征为原位癌(CIS)，这意味着细胞增殖异常，但仍包含在膀胱内。
为了鉴定疾病分期和/或进展的生物标志物，对来自21名低分期BCA (CIS、T0、T1)受试者、42名高分期BCA (T2-T4)受试者和89名正常受试者的尿液样品进行了代谢物组分析。在测定代谢物的水平之后，应用单向ANOVA对比对数据进行了分析以鉴定在以下方面不同的生物标志物：1)低分期膀胱癌较之于正常，2)高分期膀胱癌较之于正常，和/或3)低分期膀胱癌较之于高分期膀胱癌。鉴定出的生物标志物列于表5中。
对于各生物标志物，表5包括生物标志物的生物化学名称、以下方面的生物标志物的倍数变化：1)低分期BCA较之于正常，2)高分期BCA较之于正常，3)低分期BCA较之于高分期BCA，和4)膀胱癌较之于有膀胱癌史的受试者(实施例4)及在有关生物标志物的数据的统计分析中测定的p值。表5第10列包括可靠标准品的内部化学库中的生物标志物化合物的内部标识符(CompID)。粗体值表示p值≤0.1的变化倍数。
表5. 用于膀胱癌分期和监测的生物标志物
实施例4. 用于监测膀胱癌的生物标志物
为了鉴定用于监测膀胱癌的生物标志物，尿液样品自119名有膀胱癌史但在尿液采集时没有膀胱癌指征的受试者(HX)和66名膀胱癌受试者收集。进行了代谢物组分析。在测定代谢物的水平之后，应用单向ANOVA对比对数据进行了分析以鉴定在有膀胱癌史的患者和正常受试者之间不同的生物标志物。生物标志物列于表5第1、8、9列。
利用表5中的生物标志物来建立统计模型以将受试者归类为BCA或HX组。随机森林分析用来将受试者归类为患有膀胱癌或有膀胱癌史。
随机森林结果显示，样品以83%预测准确度被分类。表6中提供的混乱矩阵显示针对各分类所预测的样品数和各组(BCA或HX)的实际数。“袋外” (OOB)差错率给出应用随机森林模型可如何准确地预测新的观察结果的估计(例如样品是来自膀胱癌受试者还是有膀胱癌史的受试者)。随机森林的OOB差错约为17%，且该模型估计，当用于新的一组受试者时，76%的时间可准确地预测膀胱癌受试者的特性，87%的时间可预测出有膀胱癌史的受试者。
表6. 随机森林的结果：膀胱癌与膀胱癌史
根据17%的OOB差错率，根据对受试者样品中所测的生物标志物水平的分析，所建立的随机森林模型以约83%准确度预测了样品是否来自患膀胱癌的个体。用于区分各组的示例性生物标志物为3-羟基苯乙酸、3-羟基马尿酸、3-羟基丁酸(BHBA)、异戊酰基甘氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、吡哆酸、2-5-呋喃二甲酸、尿囊素、庚二酸(庚烷二酸)、乳酸、腺苷5’-单磷酸(AMP)、儿茶酚硫酸、2-羟基丁酸(AHB)、异丁酰基甘氨酸、2-羟基马尿酸(水杨基尿酸)、葡萄糖酸、咪唑-丙酸、琥珀酸、α-CEHC-葡糖酐酸(glucoronide)、3-羟基吲哚硫酸、4-羟基苯乙酸、乙酰肉碱、黄嘌呤、对甲酚硫酸、酒石酸、4-羟基马尿酸、2-异丙基苹果酸、棕榈酰基鞘磷脂、己二酸和N(2)-糠酰基-甘氨酸。
随机森林结果表明通过使用生物标志物，以76%灵敏度、87%特异性、77% PPV和87% NPV将BCA受试者与HX受试者区分开来。
实施例5. 膀胱癌的组织生物标志物。
通过(1)分析来自不同组的人类受试者的组织样品以测定样品中代谢物的水平，然后(2)对结果进行统计分析以确定各组中差异性存在的代谢物，发现生物标志物。
用于分析的样品为：31个对照(良性)样品和98个膀胱癌(肿瘤)。
在测定代谢物的水平之后，应用Welch二样本t检验分析了数据。为了鉴定膀胱癌的生物标志物，将良性样品与膀胱癌样品进行了比较。如下表7中所列，已命名化合物的分析导致鉴定出差异性存在于膀胱癌和对照组织间的生物标志物。
对于各生物标志物，表7包括生物标志物的生物化学名称、膀胱癌中较之于对照样品的生物标志物的倍数变化(BCA/对照) (其为膀胱癌样品中生物标志物的平均水平与非膀胱癌平均水平相比较的比率)和在有关生物标志物的数据的统计分析中测定的p值。表7第4-6列列出以下方面：可靠标准品内部化学库中的生物标志物化合物的内部标识符(CompID)；京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)中的生物标志物化合物的标识符，如可获得的话；和人类代谢物组数据库(Human Metabolome Database, HMDB)中的生物标志物化合物的标识符，如可获得的话。
表7. 膀胱癌的组织生物标志物
使用生物标志物建立统计模型以将受试者分类。应用随机森林分析对生物标志物进行了评价以将样品归类为膀胱癌或对照。随机森林结果显示，以84%预测准确度将样品分类。表8中提供的混乱矩阵显示针对各分类所预测的样品数和各组(BCA或对照)的实际数。“袋外” (OOB)差错率给出应用随机森林模型可如何准确地预测新的观察结果的估计(例如样品是BCA还是对照样品)。OOB差错约为15%，且该模型估计，当用于新的一组受试者时，87%的时间可预测出膀胱癌受试者的特性，77%的时间可准确地预测对照受试者，见表8。
表8. 随机森林的结果：膀胱癌与对照
根据16%的OOB差错率，通过测量受试者样品中的生物标志物水平，所建立的随机森林模型以约85%准确度预测了样品是否来自患有癌症的个体。用于区分各组的示例性生物标志物为葡萄糖酸、6-磷酸葡糖酸、硬脂酰基鞘磷脂、肌醇、葡萄糖、3-(4-羟基苯基)乳酸(HPLA)、1-亚油酰基甘油(1-单亚油精)、pro-羟基-pro、γ-谷氨酰基谷氨酸、肌酸、5,6-二氢尿嘧啶、二十二碳二烯酸(22:2n6)、苯基乳酸(PLA)、丙酰基肉碱、异亮氨酰基脯氨酸、N2-甲基鸟苷、二十碳五烯酸(EPA 20:5n3)、5-甲硫腺苷(MTA)、α-谷氨酰基赖氨酸、3-磷酸甘油酸、6-酮***素F1α、二十二碳三烯酸(22:3n3)、2-棕榈油酰基甘油磷酸胆碱、1-硬脂酰基甘油磷酸肌醇、1-棕榈酰基甘油磷酸肌醇、鲨-肌醇、双高-亚油酸(20:2n6)、3-磷酸丝氨酸、二十二碳五烯酸(n6 DPA 22:5n6)和1-棕榈酰甘油(1-甘油单棕榈酸酯)。
随机森林结果表明通过使用生物标志物，以87%灵敏度、77%特异性、92% PPV和65% NPV将膀胱癌样品与对照样品区分开来。
实施例6. 用于膀胱癌分期的组织生物标志物。
膀胱癌分期提供了膀胱癌扩散到多远的指征。肿瘤分期用来选择治疗选择和估计患者的预后。膀胱瘤分期范围从T0 (无原发性肿瘤证据，最早期)到T4 (肿瘤已扩散到膀胱周围脂肪组织以外进入附近器官，最晚期)。
为了鉴定疾病分期和/或进展的生物标志物，在来自17名低分期BCA (T0a，T1)的受试者、31名高分期BCA (T2-T4)的受试者的组织样品和44个良性(对照)组织样品中进行了代谢物组分析。在测定代谢物的水平之后，应用Welch二样本t检验分析了数据以鉴定在以下方面不同的生物标志物：1)低分期膀胱癌较之于高分期膀胱癌，2)低分期膀胱癌较之于对照，和3)高分期膀胱癌较之于对照。生物标志物列于表9中。
对于各生物标志物，表9包括生物标志物的生物化学名称；以下中生物标志物的倍数变化(FC)：1)高分期膀胱癌较之于低分期膀胱癌(T2-T4/Toa-T1)，2)低分期膀胱癌较之于良性(T0a-T1/良性)，3)高分期膀胱癌较之于良性(T2-T4/良性)；以及在有关生物标志物的数据的统计分析中测定的p值。表9第8-10列列出：可靠标准品内部化学库中的生物标志物化合物的内部标识符(CompID)；京都基因和基因组百科全书(KEGG)的生物标志物化合物的标识符，如可获得的话；和人类代谢物组数据库(HMDB)中的生物标志物化合物的标识符，如可获得的话。粗体值表明p值≤0.1的倍数变化。
表9. 用于膀胱癌分期的组织生物标志物
使用生物标志物建立统计模型以将受试者分类。应用随机森林分析评价了表9中的生物标志物以将样品归类为低分期膀胱癌或高分期膀胱癌。随机森林结果显示，样品以83%预测准确度被归类。表10中提供的混乱矩阵显示针对各分类预测的受试者数和各组的实际数(BCA高或BCA低)。“袋外” (OOB)差错率给出应用随机森林模型可如何准确地预测新的观察结果的估计(例如样品是来自患有低分期膀胱癌的受试者还是来自患有高分期膀胱癌的受试者)。OOB差错约为17%，且该模型估计，当用于新的一组受试者时，84%的时间可预测出高分期膀胱癌受试者的特性，82%的时间可准确地预测低分期膀胱癌受试者，见表10。
表10. 随机森林的结果：低分期BCA与高分期BCA
根据17%的OOB差错率，通过测量受试者样品中的生物标志物水平，所建立的随机森林模型以约83%的准确度预测了样品是否来自患RCC的个体。用于区分各组的示例性生物标志物为棕榈酰基乙醇酰胺、棕榈酰鞘磷脂、血栓烷B2、胆红素(Z,Z)、肾上腺酸(22:4n6)、C-糖基色氨酸、甲基-α-吡喃葡糖苷、甲基磷酸、3-羟基癸酸、3-羟基辛酸、4-羟基苯基丙酮酸、N-乙酰基苏氨酸、1-花生四烯酰基甘油磷酸肌醇(20:4)、5 6-二氢胸腺嘧啶、2-羟基棕榈酸、辅酶A、N-乙酰基丝氨酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、二十二碳三烯酸(22:3n3)、还原型谷胱甘肽(GSH)、***素A2、谷氨酰胺、谷氨酸γ-甲基酯、二十二碳五烯酸(n6 DPA 22:5n6)、甘氨鹅脱氧胆酸、己酰基肉碱、花生四烯酸(20:4n6)、pro-羟基-pro、二十二碳六烯酸(DHA 22:6n3)和月桂基肉碱。
随机森林结果表明通过使用生物标志物，以84%灵敏度、82%特异性、90% PPV和74% NPV将RCC受试者与正常受试者区分开来。
实施例7. 用于鉴定膀胱癌的生物标志物组和数学模型。
在另一个实例中，选择5个示例性生物标志物的组以鉴定膀胱癌，所述组选自表1和/或表5鉴定的生物标志物。所鉴定的生物标志物以在BCA和每个个体比较组(即BCA较之于正常、HX、血尿、RCC和PCA)之间不同的水平存在。例如，对于将膀胱癌受试者与正常、HX、血尿、RCC和PCA受试者区分开来，乳酸、棕榈酰鞘磷脂、磷酸胆碱、琥珀酸和腺苷是重要的生物标志物。用于这些分析的所有生物标志物化合物是统计显著性的(p<0.05)。对于各所列出的生物标志物，表11包括生物标志物的生物化学名称；以下方面生物标志物的倍数变化：1)膀胱癌受试者较之于正常受试者(BCA/NORM)，2)膀胱癌受试者较之于有膀胱癌史的受试者(BCA/HX)，3)膀胱癌受试者较之于患有血尿的受试者(BCA/HEM)，4)膀胱癌受试者较之于肾癌受试者(BCA/RCC)，5)膀胱癌受试者较之于***癌受试者(BCA/PCA)；以及在有关BCA较之于正常的生物标志物的数据统计分析中测定的p值。
表11. 鉴定膀胱癌的生物标志物
接下来，根据岭逻辑斯谛回归分析，将表11中的生物标志物用于数学模型中。岭回归方法建立了统计模型，其可用于评价与疾病有关的生物标志物化合物和评价可用于将个体归类为例如患有BCA或未患BCA、患有BCA或正常(没有癌症)、患有BCA或患有血尿、患有BCA或有BCA史的生物标志物化合物。应用岭逻辑斯谛回归分析，测定了表11鉴定的5种生物标志物的预测性能(例如，数学模型正确地将样品归类为癌症或非癌症的能力)。表12显示与置换的AUC (permuted AUC) (也就是说，虚假设的AUC)相比，5种膀胱癌的生物标志物的AUC。置换的AUC的平均值表示仅可偶然获得的AUC的预期值。对于所有比较，表11中列出的5种生物标志物以比用对于比较没有真实相关性的5种代谢物(即随机选择的5种代谢物)获得的更高准确度预测了膀胱癌。所得接受者工作特征(ROC)曲线的示图见图4。
表12. 膀胱癌的生物标志物的预测性能
比较 置换的平均AUC岭 5种生物标志物岭
BCA与HX 0.711 0.821
BCA与NORM 0.724 0.823
BCA与所有其它组 0.674 0.799
BCA与HEM 0.75 0.791
在另一个实例中，选择7个示例性生物标志物的组以鉴定膀胱癌，该组选自表1和/或表5鉴定的生物标志物。所鉴定的生物标志物以如表13所示在BCA和每个个体比较组(即BCA较之于正常、HX、血尿)之间不同的水平存在。例如对于将膀胱癌受试者与正常、HX和血尿受试者区分开来，1,2丙二醇、己二酸、鹅肌肽、3-羟基丁酸(BHBA)、吡哆酸、乙酰肉碱和2-羟基丁酸(AHB)是显著性的(p<0.05)生物标志物。用于这些分析的所有生物标志物化合物是统计显著性的(p<0.05)。对于各所列出的生物标志物，表13包括生物标志物的生物化学名称；以下方面生物标志物的倍数变化：1)膀胱癌受试者较之于正常受试者(BCA/NORM)，2)膀胱癌受试者较之于有膀胱癌史的受试者(BCA/HX)，和3)膀胱癌受试者较之于患有血尿的受试者(BCA/HEM)。
表13. 区分BCA与非癌症(血尿、HX、正常)的生物标志物
生物标志物 BCA/正常 BCA/HX BCA/血尿
1,2-丙二醇 5.37 3.11 5.95
己二酸 4.53 5.02 4
鹅肌肽 0.23 0.14 0.23
3-羟基丁酸(BHBA) 18.95 24.27 19.58
吡哆酸 0.33 0.3 0.5
乙酰肉碱 2.39 2.63 2.45
2-羟基丁酸(AHB) 2.96 3.29 2.04
接下来，根据岭逻辑斯谛回归分析，将表13中的生物标志物用于数学模型。岭回归方法建立了统计模型，该模型可用于评价与疾病有关的生物标志物化合物和评价可用于将个体归类为例如患有BCA或为正常(未患癌症)、患有BCA或患有血尿、患有BCA或有BCA史的生物标志物化合物。应用岭逻辑斯谛回归分析，测定了表13中鉴定的7种生物标志物的预测性能(例如，数学模型正确地将样品归类为癌症或非癌症的能力)。7种膀胱癌生物标志物的AUC为0.849 [95% CI，0.794-0.905]。ROC曲线的示图见图5。对于所有比较，表13中所列的7种生物标志物以比用对于比较没有真实相关性的5种代谢物获得的更高准确度预测了膀胱癌。
在另一个实例中，使用表11中所列5种生物标志物和表13中所列7种生物标志物与表1和/或表5鉴定的一种或多种示例性生物标志物的组合的子集，选择一组示例性生物标志物以鉴定膀胱癌受试者和非膀胱癌受试者。在该实例中，犬尿氨酸被选为表1和/或表5的一种示例性生物标志物(犬尿氨酸在表1和表5两表中)。因此，所得的标志物组包括13种所列代谢物：乳酸、棕榈酰鞘磷脂、磷酸胆碱、琥珀酸、腺苷、1,2丙二醇、己二酸、鹅肌肽、3-羟基丁酸、吡哆酸、乙酰肉碱、AHB和犬尿氨酸。
接下来，根据岭逻辑斯谛回归分析，将13种生物标志物用于数学模型。采用岭回归方法建立可用于评价与疾病有关的生物标志物化合物和评价可用于将个体归类为例如患有BCA或未患癌症(即正常、血尿或BCA史)的生物标志物化合物的统计模型。应用岭逻辑斯谛回归分析，测定了由选自以下两种或更多种生物标志物组成的13种生物标志物的各种组合的预测性能：乳酸、棕榈酰鞘磷脂、磷酸胆碱、琥珀酸、腺苷、1,2丙二醇、己二酸、鹅肌肽、3-羟基丁酸、吡哆酸、乙酰肉碱、AHB或犬尿氨酸。膀胱癌的生物标志物各组的AUC的范围为0.85 (对于两种生物标志物模型)至0.9 (对于由10-12种生物标志物组成的模型)。由具有岭模型的各组获得的AUC的示图见图6。
在另一个实例中，选择一组11种示例性生物标志物以鉴定受试者的膀胱癌或血尿。在该实例中，生物标志物组包括酪胺、棕榈酰鞘磷脂、磷酸胆碱、腺苷、1,2丙二醇、己二酸、BHBA、乙酰肉碱、AHB、黄尿酸和琥珀酸。应用岭逻辑斯谛回归分析，测定了11种生物标志物的预测性能(也就是说，数学模型将样品正确地归类为癌症或血尿的能力)。11种生物标志物的AUC为0.886 [95% CI，0.831-0.941]。ROC曲线的示图见图7。对于所有比较，11种生物标志物以比用对于比较没有真实相关性的代谢物获得的更高准确度预测了膀胱癌。
接下来，根据岭逻辑斯谛回归分析，将11生物标志物用于数学模型。岭回归方法建立了可用于评价与疾病有关的生物标志物化合物和评价可用于将个体归类为例如患有BCA或血尿的生物标志物化合物的统计模型。应用岭逻辑斯谛回归分析，测定了由选自以下两种或更多种生物标志物组成的11种生物标志物的各种组合的预测性能(也就是说，数学模型将样品正确地归类为癌症或血尿的能力)：酪胺、棕榈酰鞘磷脂、磷酸胆碱、腺苷、1,2丙二醇、己二酸、BHBA、乙酰肉碱、AHB、黄尿酸和琥珀酸。膀胱癌的生物标志物各组的AUC的范围为0.82 (对于两种生物标志物模型)至0.886 (由8-12种生物标志物组成的模型)。对用岭模型的各组获得的AUC的示图见图8。
实施例8. 监测膀胱癌进展/消退的算法
使用膀胱癌的生物标志物，可开发出监测受试者的膀胱癌进展/消退的算法。根据来自表1、5、7、9、11和/或13的一组代谢物生物标志物，算法当用于新的一组患者时，可评价和监测患者膀胱癌的进展/消退。利用该生物标志物算法的结果，医学肿瘤学家可评价手术的风险-收益(例如经尿道切除术、根治性膀胱切除术或节段性膀胱切除术)、药物治疗或观察等待法。
生物标志物算法可用来监测表1、5、7、9、11和/或13中鉴定的一组膀胱癌生物标志物的水平。
实施例9. 药物靶标的鉴定和使用所述靶标的药物筛选。
为了鉴定膀胱癌的药物靶标，分析了自未患膀胱癌的受试者收集的10个对照尿液样品和来自患有膀胱癌(尿路上皮移行细胞癌)的受试者的10个尿液样品以测定样品中代谢物的水平，然后应用单变量T检验(即Welch检验)对结果进行了统计分析以确定差异性存在于2个组中的代谢物，然后在生物学环境下分析了差异性存在的代谢物的代谢途径以鉴定有关的代谢物、酶和/或蛋白质。
与差异性存在的代谢物有关的代谢物、酶和/或蛋白质代表膀胱癌的药物靶标。可调节相对于对照(非BCA)受试者在膀胱癌受试者中为异常(较高或较低)的代谢物水平以使之处于正常范围，这可以是治疗性的。参与有关代谢途径的这类代谢物或酶和参与在细胞内和细胞间转运的蛋白质可提供治疗剂的靶标。
例如，膀胱癌与三羧酸循环(TCA)中生物化学中间产物以及与所有主要的产ATP的途径有关的生化物质的水平改变有关。在该实例中，发现膀胱癌受试者的TCA循环中间产物改变，对异柠檬酸及其中间下游代谢物有显著作用。发现异柠檬酸水平在膀胱癌受试者的尿液中统计显著性地较高。因此，可调节尿液中的异柠檬酸水平的作用剂可以是治疗剂。例如，所述作用剂可通过降低异柠檬酸的生物合成来调节异柠檬酸尿液水平。膀胱癌还对柠檬酸和琥珀酰基辅酶A间的TCA循环中间产物具有显著作用，尤其异柠檬酸、α-酮戊二酸和2个TCA α-酮戊二酸衍生的代谢物2-羟基戊二酸和谷氨酸。这些结果的图示见图9，其说明了TCA循环。在自对照个体和膀胱癌患者收集的尿液中测量的生化物质的水平见箱形图。
除TCA循环以外，膀胱癌病例的尿液代谢物概况表明，所有主要的产ATP的途径在膀胱癌中改变。乳酸/丙酮酸比提高表明膀胱癌患者中有葡萄糖的瓦尔堡样利用(Warburg-like utilization)。酮体产生增加表明这些患者中脂肪酸β-氧化提高。最后，支链酰基肉碱和酰基甘氨酸丰度的降低表明该途径在膀胱癌患者中差异性地参与。报告糖酵解、支链氨基酸分解代谢和脂肪酸氧化的活性的代谢物与对照群相比在膀胱癌病例中全都改变。支链酰基肉碱显示为支链酰基CoA化合物的替代物。图10提供的箱形图中说明了这些变化。
膀胱癌的生物标志物的鉴定可用于筛选治疗性化合物。例如异柠檬酸、α-酮戊二酸或表1、5、7、9、11和13中鉴定的在患有膀胱癌的受试者中异常的任何生物标志物都可用于各种药物筛选技术。
药物筛选的一种示例性方法利用真核或原核宿主细胞例如膀胱癌细胞。在该预示性实例中，将细胞接种到96孔板中。在50 μM终浓度的来自NIH临床采集库(NIH Clinical Collection Library)的试验化合物(可获自BioFocus DPI)存在下温育试验孔。阴性对照孔不接受添加或与以相当于在一些试验化合物溶液中存在浓度的浓度的溶媒化合物(例如DMSO)一起温育。在温育24小时后，除去试验化合物溶液，从细胞中提取代谢物，按通用方法部分中所述，测量异柠檬酸水平。降低细胞中的异柠檬酸水平的作用剂被视为治疗剂。
虽然详细地并参照其具体实施方案对本发明进行了描述，但是对本领域技术人员显然的是，可进行各种改变和修改而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (36)

1.一种确定或辅助确定受试者是否患有膀胱癌的方法，所述方法包括：
分析受试者的生物样品以测定样品中膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，其中所述一种或多种生物标志物选自表1、5、7、9、11和/或13，和
将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较以确定受试者是否患有膀胱癌。
2.权利要求1的方法，其中所述样品采用选自质谱法、ELISA和抗体连接的一种或多种技术进行分析。
3.权利要求2的方法，其中所述方法包括应用包括选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物或测量的数学模型，分析受试者和来自受试者的生物样品。
4.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自鹅肌肽、吡哆酸、己二酸、黄尿酸、1,2-丙二醇、磷酸胆碱、乙酰肉碱、3-羟基丁酸(BHBA)、棕榈酰鞘磷脂、酪胺、乳酸、琥珀酸、腺苷、2-羟基丁酸(AHB)、犬尿氨酸、腺苷5’-单磷酸(AMP)、3-羟基苯乙酸、2-羟基马尿酸(水杨基尿酸)、3-羟基吲哚硫酸、苯乙酰谷氨酰胺、对甲酚硫酸、3-羟基马尿酸、衣康酸亚甲基琥珀酸、皮质醇、异丁酰基甘氨酸、葡萄糖酸、黄尿酸、古洛糖酸1,4-内酯、肉桂酰基甘氨酸、2-羟吲哚-3-乙酸、α-CEHC-葡糖苷酸、儿茶酚硫酸、γ-谷氨酰基苯丙氨酸、2-异丙基苹果酸、4-羟基苯乙酸、异戊酰基甘氨酸、肉碱、酒石酸、6-磷酸葡糖酸、硬脂酰基鞘磷脂、肌醇、葡萄糖、3-(4-羟基苯基)乳酸、1-亚油酰基甘油(1-单亚油精)、pro-羟基-pro、γ-谷氨酰基谷氨酸、肌酸、5,6-二氢尿嘧啶、二十二碳二烯酸(22:2n6)、苯基乳酸(PLA)、丙酰肉碱、异亮氨酰基脯氨酸、N2-甲基鸟苷、二十碳五烯酸(EPA 20:5n3)、5-甲硫腺苷(MTA)、α-谷氨酰基赖氨酸、3-磷酸甘油酸、6-酮***素F1α、二十二碳三烯酸(22:3n3)、2-棕榈油酰基甘油磷酸胆碱、1-硬脂酰基甘油磷酸肌醇、1-棕榈酰基甘油磷酸肌醇、鲨-肌醇、双高-亚油酸(20:2n6)、3-磷酸丝氨酸、二十二碳五烯酸(n6 DPA 22:5n6)、1-棕榈酰甘油和(1-甘油单棕榈酸酯)。
5.权利要求1的方法，其中所述受试者患有血尿，且所述一种或多种生物标志物选自表1、7、11和/或13。
6.权利要求5的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自鹅肌肽、吡哆酸、己二酸、黄尿酸、1,2-丙二醇、磷酸胆碱、乙酰肉碱、3-羟基丁酸(BHBA)、棕榈酰鞘磷脂、酪胺、乳酸、异戊酰基甘氨酸、2-羟基丁酸(AHB)、4-羟基马尿酸、葡萄糖酸、古洛糖酸1,4-内酯、3-羟基马尿酸、酒石酸、2-羟吲哚-3-乙酸、异丁酰基甘氨酸、儿茶酚硫酸、苯乙酰谷氨酰胺、琥珀酸、肉桂酰基甘氨酸、异丁酰基肉碱、3-羟基苯乙酸、3-羟基吲哚硫酸、山梨糖、2,5-呋喃二甲酸、甲基-4-羟基苯甲酸、2-异丙基苹果酸、腺苷5’-单磷酸(AMP)、2-甲基丁酰基甘氨酸、苯基丙酰基甘氨酸、β-羟基丙酮酸、3-甲基巴豆酰基甘氨酸、肌肽、果糖、腺苷和犬尿氨酸。
7.权利要求1的方法，其中所述受试者有膀胱癌史，且所述一种或多种生物标志物选自表1、7、11和/或13。
8.权利要求7的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自鹅肌肽、吡哆酸、己二酸、黄尿酸、1,2-丙二醇、磷酸胆碱、乙酰肉碱、3-羟基丁酸(BHBA)、棕榈酰鞘磷脂、酪胺、乳酸、3-羟基苯乙酸、3-羟基马尿酸、异戊酰基甘氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、2,5-呋喃二甲酸、尿囊素、庚二酸(庚烷二酸)、腺苷5’-单磷酸(AMP)、儿茶酚硫酸、2-羟基丁酸(AHB)、异丁酰基甘氨酸、2-羟基马尿酸(水杨基尿酸)、葡萄糖酸、咪唑-丙酸、琥珀酸、α-CEHC-葡糖苷酸、3-羟基吲哚硫酸、4-羟基苯乙酸、黄嘌呤、对甲酚硫酸、酒石酸、4-羟基马尿酸、2-异丙基苹果酸、N(2)-糠酰基-甘氨酸、腺苷和犬尿氨酸。
9.权利要求1的方法，其中所述受试者患有泌尿科癌症，且所述生物标志物选自表1、7、11和/或13。
10.权利要求9的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自鹅肌肽、吡哆酸、己二酸、黄尿酸、1,2-丙二醇、磷酸胆碱、乙酰肉碱、3-羟基丁酸(BHBA)、棕榈酰鞘磷脂、酪胺、乳酸、咪唑-丙酸、3-羟基吲哚硫酸、苯乙酰基甘氨酸、胆碱、甲基-吲哚-3-乙酸、β-丙氨酸、2-羟基异丁酸、琥珀酸、4-雄甾烯-3β,17β-二醇二硫酸2、4-羟基苯乙酸、甘油、尿嘧啶、古洛糖酸1,4-内酯、苯酚硫酸、二甲基精氨酸(ADMA + SDMA)、环-gly-pro、蔗糖、腺苷、丝氨酸、壬二酸(壬烷二酸)、苏氨酸、孕二醇-3-葡糖苷酸、乙醇胺、葡萄糖酸、N6-甲基腺苷、N-甲基-脯氨酸、甘氨酸和葡萄糖6-磷酸(G6P)、2-羟基丁酸和犬尿氨酸。
11.权利要求5、7和9中任一项的方法，其中所述方法包括应用包括选自表1、7、11和/或13的一种或多种生物标志物或测量的数学模型，分析受试者和来自受试者的生物样品。
12.一种测量患有膀胱癌的受试者的膀胱癌分期的方法，所述方法包括：
分析受试者的生物样品以测定样品中膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，其中所述一种或多种生物标志物选自表5和/或表9，和
将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的高分期膀胱癌和/或低分期膀胱癌参比水平进行比较以确定膀胱癌的分期。
13.权利要求12的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自鹅肌肽、吡哆酸、己二酸、黄尿酸、1,2-丙二醇、磷酸胆碱、乙酰肉碱、3-羟基丁酸(BHBA)、棕榈酰鞘磷脂、酪胺、乳酸、棕榈酰基乙醇酰胺、血栓烷B2、胆红素(Z,Z)、肾上腺酸(22:4n6)、C-糖基色氨酸、甲基-α-吡喃葡糖苷、甲基磷酸、3-羟基癸酸、3-羟基辛酸、4-羟基苯基丙酮酸、N-乙酰基苏氨酸、1-花生四烯酰基甘油磷酸肌醇、5,6-二氢胸腺嘧啶、2-羟基棕榈酸、辅酶A、N-乙酰基丝氨酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、二十二碳三烯酸(22:3n3)、还原型谷胱甘肽(GSH)、***素A2、谷氨酰胺、谷氨酸γ-甲基酯、二十二碳五烯酸(n6 DPA 22:5n6)、甘氨鹅脱氧胆酸、己酰基肉碱、花生四烯酸(20:4n6)、pro-羟基-pro、二十二碳六烯酸(DHA 22:6n3)、月桂基肉碱、琥珀酸、腺苷、2-羟基丁酸(AHB)和犬尿氨酸。
14.权利要求12的方法，其中利用数学模型以确定患有膀胱癌的受试者的膀胱癌分期。
15.一种在已诊断患有泌尿科癌症的受试者中辅助区分膀胱癌与***癌的方法，所述方法包括
分析受试者的生物样品以测定样品中膀胱癌与***癌的一种或多种生物标志物的水平，其中所述一种或多种生物标志物选自表1和/或表11，和
将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌与***癌参比水平进行比较以区分受试者的膀胱癌和***癌。
16.权利要求15的方法，其中利用数学模型以在已诊断患有泌尿科癌症的受试者中辅助区分膀胱癌与***癌。
17.一种在已诊断患有泌尿科癌症的受试者中辅助区分膀胱癌与肾癌的方法，所述方法包括
分析受试者的生物样品以测定样品中膀胱癌与肾癌的一种或多种生物标志物的水平，其中所述一种或多种生物标志物选自表1和/或表11，和
将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌与肾癌参比水平进行比较以区分受试者的膀胱癌和肾癌。
18.权利要求17的方法，其中利用数学模型以在已诊断患有泌尿科癌症的受试者中辅助区分膀胱癌与肾癌。
19.一种确定或辅助确定受试者是否易发生膀胱癌的方法，所述方法包括：
分析受试者的生物样品以测定样品中膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，其中所述一种或多种生物标志物选自表1、5、7、9、11和/或13；和
将样品中的一种或多种生物标志物的水平与一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较以确定受试者是否易发生膀胱癌。
20.一种监测受试者的膀胱癌的进展/消退的方法，所述方法包括：
分析受试者的第一生物样品以测定样品中膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，其中所述一种或多种生物标志物选自表1、5、7、9、11和/或13，且所述第一样品在第一时间点获自受试者；
分析受试者的第二生物样品以测定所述一种或多种生物标志物的水平，其中所述第二样品在第二时间点获自受试者；和
将第一样品中一种或多种生物标志物的水平与第二样品中一种或多种生物标志物的水平进行比较以监测受试者的膀胱癌的进展/消退。
21.权利要求20的方法，其中所述方法还包括将第一样品中一种或多种生物标志物的水平、第二样品中一种或多种生物标志物的水平和/或第一和第二样品中一种或多种生物标志物的水平的比较结果与一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性和/或膀胱癌阴性参比水平进行比较。
22.权利要求21的方法，其中所述方法包括应用包括选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物或测量的数学模型，分析受试者和来自受试者的生物样品。
23.任何前述权利要求中的方法，其中测定BCA评分有助于所述方法。
24.一种评价用于治疗膀胱癌的组合物的功效的方法，所述方法包括：
分析患有膀胱癌且目前或之前用组合物治疗的受试者的生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平；和
将样品中的一种或多种生物标志物的水平与以下进行比较：(a)受试者的之前采集的生物样品的一种或多种生物标志物的水平，其中在用组合物治疗之前从受试者获得所述之前采集的生物样品，(b)一种或多种生物标志物的膀胱癌阳性参比水平，和/或(c)一种或多种生物标志物的膀胱癌阴性参比水平。
25.权利要求24的方法，其中所述方法包括应用包括选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物或测量的数学模型，分析受试者和来自受试者的生物样品。
26.一种用于评价组合物在治疗膀胱癌中的功效的方法，所述方法包括：
分析受试者的第一生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平，所述第一样品在第一时间点获自受试者；
将组合物给予受试者；
分析受试者的第二生物样品以测定一种或多种生物标志物的水平，所述第二样品在给予组合物后的第二时间点获自受试者；
将第一样品中一种或多种生物标志物的水平与第二样品中一种或多种生物标志物的水平进行比较以评价用于治疗膀胱癌的组合物的功效。
27.权利要求26的方法，其中所述方法包括应用包括选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物或测量的数学模型，分析受试者和来自受试者的生物样品。
28.一种评价用于治疗膀胱癌的两种或更多种组合物的相对功效的方法，所述方法包括：
分析患有膀胱癌且目前或之前用第一组合物治疗的第一受试者的第一生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物的水平；
分析患有膀胱癌且目前或之前用第二组合物治疗的第二受试者的第二生物样品以测定一种或多种生物标志物的水平；和
将第一样品中一种或多种生物标志物的水平与第二样品中一种或多种生物标志物的水平进行比较以评价用于治疗膀胱癌的第一和第二组合物的相对功效。
29.权利要求28的方法，其中所述方法包括应用包括选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物或测量的数学模型，分析受试者和来自受试者的生物样品。
30.一种针对在调节膀胱癌的一种或多种生物标志物中的活性筛选组合物的方法，所述方法包括：
使一种或多种细胞与组合物接触；
分析一种或多种细胞的至少一部分或与细胞有关的生物样品以测定选自表1、5、7、9、11和/或13的膀胱癌的一种或多种生物标志物的水平；和
将一种或多种生物标志物的水平与生物标志物的预定标准水平进行比较以确定组合物是否调节一种或多种生物标志物的水平。
31.权利要求30的方法，其中所述生物标志物的预定标准水平是在组合物不存在时一种或多种细胞中的一种或多种生物标志物的水平。
32.权利要求30的方法，其中所述生物标志物的预定标准水平是在不与组合物接触的一种或多种对照细胞中的一种或多种生物标志物的水平。
33.权利要求30的方法，其中所述方法在体内进行。
34.权利要求30的方法，其中所述方法在体外进行。
35.一种用于鉴定膀胱癌的潜在药物靶标的方法，所述方法包括：
鉴定与选自表1、5、7、9、11和/或13的膀胱癌的一种或多种生物标志物有关的一个或多个生物化学途径；和
鉴定影响一个或多个已鉴定的生物化学途径的至少一个的蛋白质，所述蛋白质是膀胱癌的潜在药物靶标。
36.一种用于治疗患有膀胱癌的受试者的方法，所述方法包括给予受试者有效量的在患有膀胱癌的受试者中降低的选自表1、5、7、9、11和/或13的一种或多种生物标志物。
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