ES2924108T3 - Cepas de levadura mejoradas para la producción de etanol - Google Patents

Abstract

Esta invención se relaciona con una célula recombinante, preferiblemente una célula de levadura recombinante que comprende: a) un gen que codifica una enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, donde dicha enzima tiene una dependencia de cofactor para al menos NADP+ y/o para NADPH; b) un gen que codifica una enzima que tiene al menos actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ (EC 1.2.1.10); yc) una mutación o alteración en al menos un gen seleccionado del grupo de GPD1 y GPD2. Dicha celda es adecuada para la producción de etanol, tiene una producción de glicerol reducida a un alto rendimiento de etanol. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Cepas de levadura mejoradas para la producción de etanol

Campo

La invención se refiere a una célula recombinante adecuada para la producción de etanol, al uso de esta célula para la producción de etanol, butanol, ácido láctico, ácido succínico, un plástico, un ácido orgánico, un disolvente, un suplemento alimenticio para animales, un producto farmacéutico, una vitamina, un aminoácido, una enzima o una materia prima química, y a un proceso para preparar un producto de fermentación utilizando dicha célula recombinante.

Antecedentes

Al reemplazar funcionalmente los compuestos derivados de combustibles fósiles, la producción microbiana de productos químicos y combustibles para el transporte puede contribuir a la transición hacia una economía global sostenible y con bajos niveles de carbono. La producción industrial total de etanol combustible, que alcanzó aproximadamente 100 mil millones de litros en 2015, se prevé que aumente aún más. La levadura Saccharomyces cerevisiae es la fábrica celular microbiana establecida para la conversión de unidades de hexosa derivadas de almidón y sacarosa en etanol, ya que combina un alto rendimiento y una alta productividad de etanol con robustez en las condiciones del proceso. Los esfuerzos para mejorar cepas de levadura y la optimización del proceso de producción de bioetanol basada en almidón de maíz y azúcar de caña han mejorado aún más los rendimientos del producto y la productividad. Además, estudios intensivos de ingeniería metabólica y evolutiva han producido cepas de levadura capaces de fermentar eficazmente los azúcares pentosas xilosa y arabinosa, allanando así el camino para la producción de bioetanol de "segunda generación" basada en levadura a partir de hidrolizados lignocelulósicos.

En la producción industrial de bioetanol, la materia prima de carbohidratos representa el factor de coste individual más importante. Por lo tanto, maximizar el rendimiento de etanol con respecto al azúcar es un requisito clave, especialmente en los procesos de segunda generación, cuyos rendimientos y productividad de etanol son generalmente aún más bajos que los de los procesos de primera generación. El rendimiento adecuado de la levadura en hidrolizados lignocelulósicos también requiere tolerancia a los inhibidores que se liberan durante el pretratamiento y la hidrólisis de la biomasa. En condiciones anaerobias, las cepas de S. cerevisiae de tipo silvestre requieren la formación de glicerol para reoxidar el NADH formado durante la biosíntesis o durante la producción de metabolitos que están más oxidados que la glucosa. Como principal soluto compatible en S. cerevisiae, el glicerol también desempeña un papel clave en la osmotolerancia.

Gombert et al., en su artículo titulado "Improving conversion yield of fermentable sugars into fuel ethanol in 1 st generation yeast-based production processes", publicado en Current Opinion in Biotechnology, 2015, Vol, 33, páginas 81-86, entre otras cosas describen un enfoque de disminución de la formación de glicerol como subproducto para aumentar el rendimiento de etanol. Se indica que en las fermentaciones de levadura anaerobias, la formación de glicerol es esencial para reoxidar el exceso de NADH resultante del crecimiento sobre azúcares. Se explica además que el glicerol es el principal soluto compatible en la levadura, producido en respuesta a la alta presión osmótica que puede tener lugar en algunas configuraciones de proceso.

Gombert et al. consideran que pueden utilizarse modificaciones genéticas para intervenir directamente en la formación de glicerol. Se menciona que la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa es una enzima clave para la producción de glicerol y la levadura contiene dos isoenzimas codificadas por GPD1 y GPD2. Gombert et al. mencionan que la eliminación de ambos genes impide la formación de glicerol, pero también da como resultado una cepa de levadura incapaz de crecer en condiciones anaerobias.

Parambil et al., "In Silico Analysis of Bioethanol Overproduction by Genetically Modified Micro-organisms in Coculture Fermentation", Biotechnology Research International, volumen 2015, artículo ID 238082, páginas 1-11, describen un estudio con el objetivo de realizar un análisis in silico del efecto de varias estrategias de ingeniería genética sobre la cepa de E. coli selectiva para xilosa ZSC113 para potenciar la producción de etanol a partir de mezclas de glucosa/xilosa en fermentación de cocultivo por lotes con S. cerevisiae de tipo silvestre, mencionando además pares de cepa de E.coli modificada genéticamente y S. cerevisiae que se determinan por medio de simulaciones de modelos a escala del genoma, que potencian significativamente la producción de etanol. De paso, se hace referencia a la inserción de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP.

Es un objeto de la invención proporcionar una célula recombinante novedosa que sea adecuada para la producción fermentativa anaerobia de etanol a partir de un carbohidrato, que tenga una producción de glicerol reducida en comparación con su correspondiente organismo de tipo silvestre o que carezca de producción de glicerol si la célula se utiliza para la preparación fermentativa de etanol.

Otro objeto es proporcionar un procedimiento novedoso para preparar etanol por fermentación en cultivos de levadura anaerobios, procedimiento en el que no se forme glicerol o al menos en el que se forme menos glicerol que en un procedimiento que utiliza cepas conocidas de S. cerevisiae.

Uno o más objetos adicionales que pueden cumplirse son evidentes a partir de la descripción y/o las reivindicaciones.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Cálculo del rendimiento de glicerol con respecto a glucosa. El gráfico muestra la concentración de glicerol frente a la de glucosa. Rombos: IMX884-I. Cuadrados: IMX884-II.

Figura 2: Cálculo de la relación de consumo de acetato con respecto a biomasa. El gráfico muestra la concentración de acetato frente a la de biomasa. Rombos: IMX884-I. Cuadrados: IMX884-II.

Fig. 3: Cálculo del rendimiento de glicerol con respecto a biomasa. El gráfico muestra la concentración de glicerol frente a la de biomasa. Rombos: IMX884-I. Cuadrados: IMX884-II.

Figura 4: Cálculo de la relación de consumo de acetato con respecto glucosa. El gráfico muestra la concentración de acetato frente a la de glucosa. Rombos: IMX884-I. Cuadrados: IMX884-II.

Figura 5: Tasas específicas de reducción dependiente de EutE de acetil-CoA por extractos celulares de cultivos en matraz en agitación en medio sintético (20 g/l) de glucosa. De izquierda a derecha: Cepas de S. cerevisiae IMX992 (GPD1 GPD2 sga1::eutE), IMX884 (GPD1 gpd2::eutE) e IMX776 (gpd1::gpsA gpd2::eutE). Los datos representan promedios ± desviaciones medias de ensayos en cultivos por duplicado independientes.

Figura 6: Crecimiento, consumo de glucosa y formación de producto en cultivos por lotes en biorreactores anaerobios de cepas de S. cerevisiae con diferentes modificaciones genéticas en el metabolismo de glicerol y de acetato. Los cultivos se cultivaron en medio sintético que contenía 180 g/l de glucosa y 3 g/l de ácido acético (pH 5). A, cepa IMX776 (gpd1::gpsA gpd2::eutE); B, cepa IMX901 (gpd1::gpsA gpd2::eutEald6A). Símbolos: •, glucosa;

■, biomasa; □, glicerol; °, etanol; A, acetato. En el caso de IMX776, se añadió ácido acético de forma externa inmediatamente después de finalizar la fase de crecimiento exponencial. En el caso de IMX901, se añadió ácido acético de forma externa después de 20 h en fase estacionaria.

Figura 7: Cálculo del rendimiento de etanol con respecto a glucosa. El gráfico muestra la concentración de etanol frente a la de glucosa. Rombos: IMX884-I. Cuadrados: IMX884-II. Los valores para IMX884-I se superponen en su mayor parte con IMX884-II.

Figura 8: Cálculo del rendimiento de biomasa con respecto a glucosa. El gráfico muestra la concentración de biomasa frente a la de glucosa. Rombos: IMX884-I. Cuadrados: IMX884-II. Los valores para IMX884-I se superponen parcialmente con IMX884-II.

Figura 9: Crecimiento, consumo de glucosa y formación de producto en cultivos por lotes en biorreactores anaerobios de cepas de S. cerevisiae con diferentes modificaciones genéticas en el metabolismo de glicerol y de acetato. Los cultivos se cultivaron en medio sintético que contenía 20 g/l de glucosa y 3 g/l de ácido acético (pH 5). A, cepa IME324 (GPD1 GPD2); B, cepa IMX992 (GPD1 GPD2 sga1::eutE); C, cepa IMX884 (GPD1 gpd2::eutE); D, cepa IMX776 (gpd1::gpsA gpd2::eutE); E, cepa IMX901 (gpd1::gpsA gpd2::eutE ald6A); F, cepa IMX888 (gpd1A gpd2::eutE). Símbolos: •, glucosa; ■, biomasa; □, glicerol; °, etanol; A, acetato. Los paneles A-F muestran cultivos representativos individuales de un conjunto de dos cultivos por duplicado independientes para cada cepa. Los datos sobre la cepa IMX888 se tomaron de (Papapetridis et al., 2016).

Figura 10: Rendimientos de biomasa y producto en cultivos por lotes en biorreactores anaerobios de cepas de S. cerevisiae con diferentes modificaciones genéticas en el metabolismo de glicerol y de acetato. Los cultivos se cultivaron en medio sintético que contenía 20 g/l de glucosa y 3 g/l de ácido acético (pH 5). Las barras se refieren a las cepas de S. cerevisiae siguientes: IME324 (GPD1 GPD2); IMX992 (GPD1 GPD2 sga1::eutE); IMX884 (GPD1 gpd2::eutE); IMX776 (gpd1::gpsA gpd2::eutE); IMX901 (gpd1::gpsA gpd2::eutEald6A); IMX888 (gpd1A gpd2::eutE). A, rendimiento de biomasa con respecto a glucosa; B, rendimiento de etanol con respecto a glucosa (corregido por la evaporación de etanol); C, rendimiento de glicerol con respecto a glucosa. Los datos representan los promedios ± desviaciones medias de mediciones en cultivos por duplicado independientes para cada cepa. Los datos sobre la cepa IMX888 se tomaron de (Papapetridis et al., 2016).

Figura 11: Tasas específicas de reducción de fosfato de dihidroxiacetona dependiente de NADH (barras blancas) y dependiente de NADPH (barras grises) por extractos celulares de cultivos en matraz en agitación en medio sintético (20 g/l de glucosa) de cepas de S. cerevisiae IMX992 (GPD1 GPD2), IMX884 (GPD1 gpd2::eutE) e IMX776 (gpd1::gpsA gpd2::eutE). Los datos representan promedios ± desviaciones medias de ensayos en cultivos por duplicado independientes.

Figura 12: Crecimiento, consumo de glucosa y formación de producto en cultivos por lotes en biorreactores anaerobios de cepas de S. cerevisiae con diferentes modificaciones genéticas en el metabolismo de glicerol y de acetato. Los cultivos se cultivaron en medio sintético que contenía 180 g/l de glucosa y 3 g/l de ácido acético (pH 5). A, cepa IMX992 (GPD1 GPD2 sga1::eutE); B, cepa IMX884 (GPD1 gpd2::eutE); C, cepa IMX776 (gpd1::gpsA gpd2::eutE); D, cepa IMX901 (gpd1::gpsA gpd2::eutE alddú). Símbolos: •, glucosa; ■, biomasa; □, glicerol; °, etanol; A, acetato. Los paneles A-C muestran cultivos representativos individuales de un conjunto de dos cultivos por duplicado independientes para cada cepa. En el caso de IMX901, el ácido acético se añadió de forma externa inmediatamente después de finalizar la fase de crecimiento exponencial.

Figura 13: Ciclo citosólico potencial de transhidrogenasa, intercambiando NADH por NADPH, catalizado por EutE, Acs1/2 y Ald6. El NADPH formado se puede usar para la reducción de DHAP a glicerol por GpsA.

Descripción detallada

El término "un" o "una", tal como se utiliza en el presente documento, se define como "al menos uno" o "al menos una" a menos que se especifique lo contrario.

Cuando se hace referencia a un sustantivo (por ejemplo, un compuesto, un aditivo, etc.) en singular, se entiende que incluye el plural. Por lo tanto, cuando se hace referencia a un resto específico, por ejemplo "gen", se entiende que significa "al menos uno" de ese gen, por ejemplo "al menos un gen", a menos que se especifique lo contrario. El término "o", tal como se utiliza en el presente documento, debe entenderse como "y/o".

Cuando se hace referencia a un compuesto del que existen varios isómeros (por ejemplo, un enantiómero D y un L), el compuesto en principio incluye todos los enantiómeros, diastereómeros e isómeros cis/trans de ese compuesto que pueden usarse en el procedimiento particular de la invención; en particular, cuando se hace referencia a dicho compuesto, se incluyen los isómeros naturales.

El término "fermentación", "fermentativo" y similares se utilizan en el presente documento en un sentido clásico, es decir, para indicar que un proceso se lleva a cabo o se ha llevado a cabo en condiciones anaerobias. Las condiciones anaerobias se definen en el presente documento como condiciones sin oxígeno o en las que la célula de levadura, en particular una célula de levadura, esencialmente no consume oxígeno, y generalmente corresponde a un consumo de oxígeno inferior a 5 mmol/l.h, en particular a un consumo de oxígeno inferior a 2,5 mmol/l.h, o inferior a 1 mmol/l.h. De forma más preferida se consume 0 mmol/l/h (es decir, el consumo de oxígeno no es detectable. Esto normalmente corresponde a una concentración de oxígeno disuelto en el caldo de cultivo inferior al 5% de saturación de aire, en particular a una concentración de oxígeno disuelto inferior al 1% de saturación de aire, o inferior al 0,2% de saturación de aire.

El término "célula" se refiere a un organismo eucariota o procariota, que se presenta preferentemente como una célula individual. La célula puede seleccionarse del grupo de hongos, levaduras, euglenoides, arqueas y bacterias.

La célula se puede seleccionar en particular del grupo de géneros que consiste en levadura.

El término "levadura" o "célula de levadura" se refiere a un grupo filogenéticamente diverso de hongos unicelulares, la mayor parte de los cuales se encuentran en la división de Ascomycota y Basidiomycota. Las levaduras en gemación ("levaduras verdaderas") se clasifican en el orden Saccharomycetales, siendo Saccharomyces cerevisiae la especie más conocida.

El término "(célula) recombinante" o "microorganismo recombinante", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una cepa (célula) que contiene ácido nucleico que es el resultado de una o más modificaciones genéticas utilizando una o varias técnicas de ADN recombinante y/u otra u otras técnicas mutagénicas. En particular, una célula recombinante puede comprender un ácido nucleico que no está presente en una célula de tipo silvestre correspondiente, ácido nucleico que se ha introducido en esa cepa (célula) utilizando técnicas de ADN recombinante (una célula transgénica), o el ácido nucleico que no está presente en dicho tipo silvestre es el resultado de una o más mutaciones, por ejemplo utilizando técnicas de ADN recombinante u otra técnica mutagénica tal como radiación UV, en una secuencia de ácido nucleico presente en dicho tipo silvestre (tal como un gen que codifica un polipéptido de tipo silvestre) o en el que la secuencia de ácido nucleico de un gen se ha modificado para dirigir el producto polipeptídico (que lo codifica) hacia otro compartimento celular. Además, el término "(célula) recombinante" en particular se refiere a una cepa (célula) de la que se han eliminado secuencias de ADN utilizando técnicas de ADN recombinante.

El término "célula (de levadura) transgénica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una cepa (célula) que contiene ácido nucleico que no se encuentra de forma natural en esa cepa (célula) y que se ha introducido en esa cepa (célula) utilizando técnicas de ADN recombinante, es decir, una célula recombinante.

El término "mutado", tal como se utiliza en el presente documento con respecto a proteínas o polipéptidos, significa que al menos un aminoácido en la secuencia de proteína o polipéptido de tipo silvestre o natural se ha reemplazado por un aminoácido diferente, se ha insertado o se ha eliminado de la secuencia mediante mutagénesis de ácidos nucleicos que codifican estos aminoácidos. La mutagénesis es un procedimiento bien conocido en la técnica e incluye, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio por medio de PCR o mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3 (1989). El término "mutado", tal como se utiliza en el presente documento con respecto a genes, significa que al menos un nucleótido en la secuencia de ácido nucleico de ese gen o una secuencia reguladora del mismo se ha reemplazado por un nucleótido diferente, o se ha eliminado de la secuencia mediante mutagénesis, lo que da como resultado la transcripción de una secuencia de proteína con una función cualitativamente o cuantitativamente alterada o la inactivación de ese gen.

En el contexto de la presente invención, un "gen alterado" tiene el mismo significado que un gen mutado.

El término "gen", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contiene una plantilla para una ácido nucleico polimerasa, en eucariotas, la ARN polimerasa II. Los genes se transcriben en ARNm que después se traducen en proteínas.

El término "ácido nucleico", tal como se utiliza en el presente documento, incluye la referencia a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, es decir, un polinucleótido, ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria y, a menos que se indique lo contrario, abarca análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos de origen natural en el sentido de que se hibridan con ácidos nucleicos monocatenarios de forma similar a los nucleótidos de origen natural (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos). Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen regulador o estructural nativo o heterólogo. A menos que se indique lo contrario, el término incluye la referencia a la secuencia especificada así como a la secuencia complementaria de la misma. Por lo tanto, los ADN o ARN con esqueletos modificados para lograr estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" en el sentido en que se entiende este término en el presente documento. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por citar solo dos ejemplos, son polinucleótidos tal como se utiliza el término en el presente documento. Se apreciará que se han realizado una gran diversidad de modificaciones en el ADN y el ARN que sirven para muchos propósitos útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término polinucleótido, tal como se emplea en el presente documento, abarca dichas formas de polinucleótidos modificadas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluidas, entre otras, células simples y complejas.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. La naturaleza esencial de dichos análogos de aminoácidos de origen natural es que, cuando se incorporan a una proteína, esa proteína es específicamente reactiva frente a anticuerpos dirigidos contra la misma proteína pero que consiste completamente en aminoácidos de origen natural. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" también incluyen modificaciones que incluyen, pero sin limitación, glicosilación, unión lipídica, sulfatación, gammacarboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación.

Cuando se menciona una enzima en referencia a una clase de enzima (EC), la clase de enzima es una clase en la que la enzima se clasifica o puede clasificarse, sobre la base de la nomenclatura de enzimas proporcionada por el Comité de Nomenclatura de la Unión internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB), nomenclatura que se puede encontrar en http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/. Se pretende que se incluyan otras enzimas adecuadas que (todavía) no se han clasificado en una clase específica pero que pueden clasificarse como tales.

Si en el presente documento se hace referencia a una secuencia de proteína o de ácido nucleico, tal como un gen, mediante referencia a un número de acceso, este número en particular se utiliza para referirse a secuencia de proteína o de ácido nucleico (gen) que tiene una secuencia que se puede encontrar en www.ncbi.nlm.nih.gov/, (tal como está disponible el 14 de junio de 2016) a menos que se especifique lo contrario.

Cada secuencia de ácido nucleico en el presente documento que codifica un polipéptido también, mediante referencia al código genético, describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. El término "variantes modificadas de forma conservadora" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o modificadas de forma conservadora de las secuencias de aminoácidos debido a la degeneración del código genético. El término "degeneración del código genético" se refiere al hecho de que un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican alguna proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en la que una alanina está especificada por un codón, el codón puede alterarse por cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación modificada de forma conservadora.

El término "homólogo funcional" (o, de forma abreviada, "homólogo") de un polipéptido que tiene una secuencia específica (por ejemplo, SEQ ID NO: X), tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende dicha secuencia específica con la condición de que uno o más aminoácidos estén sustituidos, eliminados, añadidos y/o insertados, y que dicho polipéptido tenga (cualitativamente) la misma funcionalidad enzimática para la conversión de sustrato. Esta funcionalidad puede someterse a ensayo mediante el uso de un sistema de ensayo que comprenda una célula de levadura recombinante que comprende un vector de expresión para la expresión del homólogo en levadura, en el que dicho vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga unida operativamente a un promotor funcional en la levadura y en el que dicha secuencia de ácido nucleico heterólogo codifica el polipéptido homólogo cuya actividad enzimática para convertir acetil-coenzima A en acetaldehído en la célula de levadura se va a someter a ensayo, y evaluando si dicha conversión se produce en dichas células. Los homólogos candidatos pueden identificarse utilizando análisis de similitud in silico. Un ejemplo detallado de dicho análisis se describe en el ejemplo 2 del documento WO2009/013159. El experto en la técnica podrá deducir a partir del mismo cómo se pueden encontrar homólogos candidatos adecuados y, opcionalmente tras la optimización de (pares de) codones, podrá someter a ensayo la funcionalidad requerida de dichos homólogos candidatos utilizando un sistema de ensayo adecuado tal como se ha descrito anteriormente. Un homólogo adecuado representa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos similar a un polipéptido específico de más del 50%, preferentemente del 60% o más, en particular de al menos el 70%, más en particular de al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% y que tiene la funcionalidad enzimática requerida. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos, se pretende que el término homólogo funcional incluya secuencias de ácidos nucleicos que difieren de otra secuencia de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético y codifican la misma secuencia polipeptídica.

La identidad de secuencia se define en el presente documento como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácido nucleico (polinucleótido), determinada mediante comparación de las secuencias. Normalmente, las identidades o similitudes de las secuencias se comparan a lo largo de toda la longitud de las secuencias comparadas. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, según sea el caso, determinado mediante la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias.

Se dice que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son homólogas cuando muestran un determinado nivel de similitud. Dos secuencias homólogas indican un origen evolutivo común. El que dos secuencias homólogas estén relacionadas estrechamente o de forma más distante se indica mediante el "porcentaje de identidad" o el "porcentaje de similitud", que es alto o bajo respectivamente. Aunque se cuestiona, para indicar "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", "nivel de homología" o "porcentaje de homología" se usan con frecuencia de forma intercambiable. Se puede lograr una comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias utilizando un algoritmo matemático. El experto en la técnica será consciente del hecho de que están disponibles varios programas informáticos diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homología entre dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, páginas 1-44 Addison Wesley). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para el alineamiento de dos secuencias. (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). El algoritmo alinea secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa informático NEEDLE. Para los fines de la presente invención se utilizó el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, L. y Blasby, A. Trends in Genetics 16, (6) páginas 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para secuencias de proteínas se utiliza EBLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para secuencias de nucleótidos se utiliza EDNAFULL. Se pueden especificar otras matrices. Los parámetros opcionales utilizados para el alineamiento de las secuencias de aminoácidos son una penalización por apertura de hueco de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,5. El experto en la técnica apreciará que todos estos parámetros diferentes producirán resultados ligeramente diferentes pero que el porcentaje global de identidad de dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan algoritmos diferentes.

La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias completas a lo largo de la región alineada total, incluidos los huecos o las extensiones. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula de la forma siguiente: número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total del alineamiento, incluidos los huecos. La identidad definida en este caso se puede obtener de NEEDLE y se indica en el resultado del programa como "IDENTIDAD".

La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula de la forma siguiente: número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total del alineamiento después de restar el número total de huecos presentes en el alineamiento. La identidad definida como en este caso se puede obtener de NEEDLE usando la opción NOBRIEF y se indica en el resultado del programa como "identidad más larga".

Una variante de una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos divulgada en el presente documento también puede definirse como una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o eliminaciones en comparación con la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos divulgada específicamente en el presente documento (por ejemplo en el listado de secuencias).

Opcionalmente, al determinar el grado de similitud de aminoácidos, el experto en la técnica también puede tener en cuenta las denominadas sustituciones de aminoácidos "conservadoras", como será evidente para el experto. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. En una forma de realización, los grupos de sustitución conservadora de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Las variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos divulgada en el presente documento son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo de las secuencias descritas y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Preferentemente, el cambio de aminoácido es conservador. Las sustituciones conservadoras para cada uno de los aminoácidos naturales pueden ser las siguientes: Ala por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln o His; Asp por Glu; Cys por Ser o Ala; Gln por Asn; Glu por Asp; Gly por Pro; His por Asn o Gln; Ile por Leu o Val; Leu por Ile o Val; Lys por Arg; Gln o Glu; Met por Leu o Ile; Phe por Met, Leu o Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp o Phe; y, Val por Ile o Leu.

Las secuencias de nucleótidos de la invención también pueden definirse por su capacidad para hibridarse con partes de secuencias de nucleótidos específicas divulgadas en el presente documento, respectivamente, en condiciones de hibridación moderadas o, preferentemente, estrictas. Las condiciones de hibridación estrictas se definen en el presente documento como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 25, preferentemente aproximadamente 50 nucleótidos, 75 o 100 y de la forma más preferida aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de aproximadamente 65 °C en un solución que comprende sal aproximadamente 1 M, preferentemente 6 x SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable, y lavado a 65 °C en una solución que comprenda sal aproximadamente 0,1 M, o menos, preferentemente 0,2 x SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable. Preferentemente, la hibridación se realiza durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas, y preferentemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solución de lavado. Estas condiciones normalmente permitirán la hibridación específica de secuencias que tengan aproximadamente el 90% o más de identidad de secuencia.

Las condiciones moderadas se definen en el presente documento como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de aproximadamente 45 °C en una solución que comprende sal aproximadamente 1 M, preferentemente 6 x SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable, y lavado a temperatura ambiente en una solución que comprenda sal aproximadamente 1 M, preferentemente 6 x SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable. Preferentemente, la hibridación se realiza durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas, y preferentemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solución de lavado. Estas condiciones normalmente permitirán la hibridación específica de secuencias que tengan hasta el 50% de identidad de secuencia. El experto en la técnica será capaz de modificar estas condiciones de hibridación para identificar específicamente secuencias cuya identidad varía entre el 50% y el 90%.

"Expresión" se refiere a la transcripción de un gen en ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARN mensajero (ARNm) con la subsiguiente traducción en una proteína.

Tal como se usa en el presente documento, "heterólogo" en referencia a un ácido nucleico o una proteína es un ácido nucleico o una proteína que se origina en una especie extraña o, si es de la misma especie, se ha modificado sustancialmente a partir de su forma nativa en composición y/o locus genómico mediante la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor ligado operativamente a un gen estructural heterólogo es de una especie diferente de la que se ha derivado el gen estructural o, si es de la misma especie, uno o ambos están sustancialmente modificados a partir de su forma original. Una proteína heteróloga puede tener su origen en una especie extraña o, si es de la misma especie, se ha modificado sustancialmente a partir de su forma original mediante la intervención humana deliberada.

El término "expresión heteróloga" se refiere a la expresión de ácidos nucleicos heterólogos en una célula huésped. La expresión de proteínas heterólogas en sistemas de células huésped eucarióticas tales como levaduras es bien conocida por los expertos en la técnica. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico de un gen que codifica una enzima con una actividad específica puede expresarse en dicho sistema eucariótico. En algunas formas de realización, pueden emplearse células de levadura transformadas/transfectadas como sistemas de expresión para la expresión de las enzimas. La expresión de proteínas heterólogas en levadura es bien conocida. Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) es un trabajo bien reconocido que describe los diversos procedimientos disponibles para expresar proteínas en levadura. Dos levaduras ampliamente utilizadas son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Los vectores, cepas y protocolos para la expresión en Saccharomyces y Pichia son conocidos en la técnica y están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Invitrogen). Los vectores adecuados normalmente tienen secuencias de control de la expresión, tales como promotores, que incluyen 3-fosfoglicerato quinasa o alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee.

Tal como se utiliza en el presente documento, "promotor" es una secuencia de ADN que dirige la transcripción de un gen (estructural). Normalmente, un promotor está ubicado en la región 5' de un gen, de forma proximal al sitio de inicio de la transcripción de un gen (estructural). Las secuencias promotoras pueden ser constitutivas, inducibles o reprimibles. En una forma de realización no se necesita un inductor (externo).

El término "vector", tal como se utiliza en el presente documento, incluye la referencia a un vector de expresión autosómico y a un vector de integración usado para la integración en el cromosoma.

El término "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés bajo el control de (es decir, unido operativamente a) segmentos de ácido nucleico adicionales que permiten su transcripción. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión generalmente se derivan de ADN de plásmido o vírico, o pueden contener elementos de ambos. En particular, un vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3' y unida operativamente: (a) una región de iniciación de transcripción y traducción reconocida por la levadura, (b) una secuencia codificante para un polipéptido de interés, y (c) una región de terminación de transcripción y traducción reconocida por levadura. "Plásmido" se refiere a ADN extracromosómico de replicación autónoma que no está integrado en el genoma de un microorganismo y normalmente es de naturaleza circular.

Un "vector de integración" se refiere a una molécula de ADN, lineal o circular, que se puede incorporar en el genoma de un microorganismo y proporciona una herencia estable de un gen que codifica un polipéptido de interés. El vector de integración generalmente comprende uno o más segmentos que comprenden una secuencia génica que codifica un polipéptido de interés bajo el control de (es decir, unido operativamente a) segmentos de ácido nucleico adicionales que permiten su transcripción. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y uno o más segmentos que dirigen la incorporación del gen de interés en el genoma de la célula diana, normalmente mediante el proceso de recombinación homóloga. Normalmente, el vector de integración será uno que pueda transferirse a la célula diana, pero que tenga un replicón que no sea funcional en ese organismo. La integración del segmento que comprende el gen de interés puede seleccionarse si se incluye un marcador apropiado dentro de ese segmento.

Por “célula huésped” se entiende una célula que contiene un vector y que apoya la replicación y/o expresión del vector.

"Transformación" y "transformar", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento usado para la inserción, por ejemplo, captación directa, transducción, apareamiento f o electroporación. El polinucleótido exógeno se puede mantener como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o alternativamente, se puede integrar en el genoma de la célula huésped.

Por "disrupción" se entiende (o incluye) todas las modificaciones de ácidos nucleicos, tales como eliminaciones o sustituciones de nucleótidos, inactivaciones de genes, (otras) que afectan a la traducción o la transcripción del polipéptido correspondiente y/o que afectan a la actividad enzimática (específica), su especificidad de sustrato y/o estabilidad. Dichas modificaciones pueden estar dirigidas a la secuencia codificante o al promotor del gen.

En un primer aspecto la invención proporciona una célula de levadura Saccharomyces cerevisiae recombinante, preferentemente adecuada para la producción de etanol, comprendiendo dicha célula:

a) un gen que codifica una enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, en el que dicha enzima tiene una dependencia de cofactor por al menos NADP+ y/o por NADPH;

b) un gen que codifica una enzima que tiene al menos actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ (EC 1.2.1.10); y

c) una mutación o alteración en al menos un gen seleccionado del grupo de GPD1 y GPD2.

El gen que codifica una enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, tal como se define en a), confiere a la célula la capacidad de convertir el fosfato de dihidroxiacetona en glicerol-3-fosfato. S. cerevisiae alberga al menos dos genes que codifican una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, GPD1 y GPD2. El gen GPD1 es una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa inducida por estrés que es importante para el crecimiento bajo estrés osmótico, como puede suceder en condiciones de fermentación industrial, por ejemplo a altas concentraciones de glucosa, tales como aproximadamente 180 g/l. La expresión de GPD1 está, entre otras cosas, regulada por la vía de respuesta a glicerol a alta osmolaridad. En una forma de realización, por lo tanto, GPD2, pero no GDP1, está mutado o alterado. No obstante, los inventores han descubierto que mediante el uso de una enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, en el que dicha enzima tiene una dependencia de cofactor por al menos NADP+ y/o por NADPH, tanto GPD1 como GPD2 pueden estar mutados o alterados, mientras que la célula es capaz de crecer a altas concentraciones de glucosa y produce poco o nada de glicerol. Por lo tanto, en una forma de realización, tanto GPD1 como GPD2 están mutados o alterados.

En una forma de realización, la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa tiene una constante de Michaelis más baja (Km, expresada como M) por NADPH que por NADH. La Km(NADPH) de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa puede ser como máximo la mitad del Km(NADH), siendo preferentemente la Km(NADPH) de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa como máximo una cuarta parte en comparación con la Km(NADH), de forma más preferida como máximo una décima parte, de forma incluso más preferida como máximo 1/20, como máximo 1/50, de forma incluso más preferida como máximo 1/100, como máximo 1/500, de forma incluso más preferida como máximo 1/000 en comparación con la Km(NADH).

En otra forma de realización, la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa tiene una actividad específica máxima más alta (Vmax, expresada como pmol mg/proteína/min) por NADPH que por NADH.

La Vmax de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa con NADPH puede ser al menos el doble que con NADH, preferentemente la Vmax(NADPH) de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa es al menos cuatro veces, de forma más preferida al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, de forma más preferida al menos 500 veces, de forma incluso más preferida al menos 1000 veces en comparación con su Vmax(NADH).

La Vmax de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa puede referirse a la enzima propiamente dicha, por ejemplo en forma aislada o pura o purificada. El experto en la técnica sabe cómo purificar o aislar la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa. Alternativamente, la Vmax de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa puede estar relacionada con la cantidad total de proteína en la célula, o con la cantidad total de proteína en un extracto libre de la célula. Es decir, la Vmax de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa se puede determinar usando células completas o un extracto desprovisto de células.

En otra forma de realización, la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa tiene una constante de Michaelis más baja y una Vmax más alta por NADPH que por NADH.

En otra forma de realización más, la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa tiene una mayor afinidad (Vmax/Km) por NADPH que por NADH. La Vmax/Km(NADPH) de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa puede ser al menos el doble en comparación con su Vmax/Km(NADH), preferentemente la Vmax/Km(NADH) de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa es al menos cuatro veces, de forma más preferida al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, de forma más preferida al menos 500 veces, de forma incluso más preferida al menos 1000 veces en comparación con su Vmax/Km(NADH). La afinidad de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa puede referirse a la enzima propiamente dicha, por ejemplo la enzima en forma aislada o pura o purificada. El experto en la técnica sabe cómo purificar o aislar la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa. Alternativamente, la afinidad de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa puede estar relacionada con la cantidad total de proteína de la célula, o con la cantidad total de proteína en un extracto libre de la célula. Es decir, la afinidad de la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa se puede determinar usando células completas o un extracto desprovisto de células.

En una forma de realización, la célula según la invención está libre, o esencialmente libre, o tiene una actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADH reducida en comparación con su correspondiente célula de tipo silvestre. Preferentemente, la célula carece, o carece esencialmente, o ha reducido su actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADH nativa (endógena) en comparación con su célula de tipo silvestre correspondiente. Para comparar la actividad de la célula de la invención y la célula de tipo silvestre, se prefiere que estas actividades se midan en las mismas condiciones.

En una forma de realización, el gen que codifica una enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa comprende al menos un gen exógeno, gen exógeno que puede codificar una enzima con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50%, preferentemente al menos el 60%, al menos el 70%, de forma más preferida al menos el 80%, al menos el 90 %, de forma incluso más preferida al menos el 95%. Un gen preferido de este tipo es gpsA, por ejemplo de Archaeoglobus fulgidus.

La célula según la invención puede comprender un gen endógeno alterado que codifica una enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, en la que dicha alteración confiere a la enzima una mayor afinidad y/o una menor constante de Michaelis y/o una mayor actividad máxima por NADPH por NADPH.

El gen que codifica una enzima que tiene al menos actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ puede codificar una enzima con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 o un homólogo funcional de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50%, preferentemente al menos el 60%, al menos el 70%, de forma más preferida al menos el 80%, al menos el 90%, de forma incluso más preferida al menos el 95%.

Un gen preferido de este tipo es EutE, por ejemplo de E. coli.

La célula según la invención puede carecer (esencialmente) de actividad de aldehído reductasa dependiente de NADPH o tener una actividad reducida (EC 1.2.1.4) en comparación con su correspondiente célula de tipo silvestre.

El genoma de la célula según la invención puede comprender una mutación en ALD6 o un homólogo funcional del mismo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50%, preferentemente al menos el 60%, al menos el 70%, de forma más preferida al menos el 80%, al menos el 90%, de forma incluso más preferida al menos el 95%. Una mutación en ALD6 o un homólogo funcional puede prevenir o reducir una fase de latencia en el crecimiento.

En una forma de realización, la enzima que tiene al menos actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ cataliza la conversión reversible de acetil-coenzima A en acetaldehído y la subsiguiente conversión reversible de acetaldehído en etanol, comprendiendo la enzima preferentemente tanto actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ (EC 1.2.1.10) como actividad de alcohol deshidrogenasa dependiente de NAD+ (EC 1.1.1.1).

En una forma de realización, el gen que codifica una enzima que tiene al menos actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ codifica una enzima con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 3 o un homólogo funcional de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50%, preferentemente al menos el 60%, al menos el 70%, de forma más preferida al menos el 80%, al menos el 90%, de forma incluso más preferida al menos el 95%. Un gen preferido de este tipo es adhE, por ejemplo de E. coli.

En una forma de realización, la célula no comprende un gen que codifica una enzima que tiene actividad de piruvatoformato liasa (EC 2.3.1.54). Como en el presente documento, una piruvato-formiato liasa cataliza al menos la siguiente reacción (I):

(I) piruvato coenzima A <-> formiato acetil-coenzima A

La invención también proporciona el uso de una célula según la invención para la preparación de etanol, butanol, ácido láctico, ácido succínico, un plástico, un ácido orgánico, un disolvente, un suplemento alimenticio para animales, un producto farmacéutico, una vitamina, un aminoácido, una enzima o una materia prima química, preferentemente etanol.

La invención proporciona además un proceso para preparar un producto de fermentación, que comprende preparar un producto de fermentación a partir de un carbohidrato fermentable, en particular seleccionado del grupo de glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, xilosa, arabinosa, galactosa y manosa cuya preparación se lleva a cabo en condiciones anaerobias utilizando una célula según la invención. Dicho carbohidrato fermentable se obtiene preferentemente a partir de almidón, celulosa, hemicelulosa, lignocelulosa y/o pectina. Se entiende que el carbohidrato fermentable es una lechada, una suspensión o un líquido.

El almidón, la lignocelulosa y/o la pectina pueden ponerse en contacto con una composición enzimática, en la que se producen uno o más azúcares, y en la que el azúcar producido se fermenta para obtener un producto de fermentación, y en la que la fermentación se lleva a cabo con una célula según la invención.

En una forma de realización, el carbohidrato fermentable es, o está compuesto por, un hidrolizado de biomasa, tal como un hidrolizado de rastrojo de maíz o de fibra de maíz. En otra forma de realización, dicho hidrolizado de biomasa comprende o se deriva de rastrojo de maíz y/o de fibra de maíz.

Por "hidrolizado" se entiende un material que contiene polisacáridos (tal como rastrojo de maíz, almidón de maíz, fibra de maíz o material lignocelulósico), cuyos polisacáridos se han despolimerizado mediante la adición de agua para formar azúcares monosacáridos y oligosacáridos. Los hidrolizados se pueden producir mediante hidrólisis enzimática o ácida del material que contiene polisacáridos.

Un hidrolizado de biomasa puede ser un hidrolizado de biomasa lignocelulósica. La lignocelulosa en este caso incluye hemicelulosa y partes de hemicelulosa de biomasa. También la lignocelulosa incluye fracciones lignocelulósicas de biomasa. Se pueden encontrar materiales lignocelulósicos adecuados en la lista siguiente: materiales de huertos de árboles frutales, chaparrales, desechos de molienda, desechos de madera urbanos, desechos municipales, desechos forestales, residuos de aclareos de bosques, cultivos leñosos de ciclo corto, desechos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cascarilla de soja, cascarilla de arroz, paja de arroz, pienso de gluten de maíz, cascarilla de avena, caña de azúcar, rastrojo de maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, cascarilla de maíz, pasto varilla, miscanthus, sorgo dulce, tallos de canola, tallos de soja, pasto de pradera, pasto gama, cola de zorra; pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítricos, cáscaras de semillas, desechos animales celulósicos, recortes de césped, algodón, algas marinas, árboles, madera blanda, madera dura, álamos, pinos, arbustos, hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cáscaras de maíz, mazorcas de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y subproductos de la molienda en húmedo o en seco de granos, desechos sólidos municipales, desechos de papel, desechos de jardín, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, desechos sólidos municipales, desechos de papel, pulpa, residuos de la industria papelera, ramas, arbustos, cañas, maíz, hojas de maíz, un cultivo energético, un bosque, una fruta, una flor, un grano, una hierba, un cultivo herbáceo, una hoja, una corteza, una aguja, un tronco, una raíz, un retoño, un matorral, pasto varilla, un árbol, una verdura, piel de fruta, una vid, pulpa de remolacha azucarera, harinilla de trigo, cáscaras de avena, madera dura o blanda, material de desecho orgánico generado a partir de un proceso agrícola, desechos de madera forestal, o una combinación de dos o más de los mismos. La lignocelulosa, que puede considerarse una materia prima renovable potencial, comprende generalmente los polisacáridos celulosa (glucanos) y hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos). Además, algo de hemicelulosa puede estar presente como glucomananos, por ejemplo, en materias primas derivadas de la madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos a azúcares solubles, incluidos monómeros y multímeros, por ejemplo, glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, manosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas se produce bajo la acción de diferentes enzimas que actúan de forma concertada. Además, las pectinas y otras sustancias pectínicas tales como arabinanos pueden constituir una proporción considerable de la masa seca de las paredes celulares típicas de los tejidos vegetales no leñosos (aproximadamente de un cuarto a la mitad de la masa seca pueden ser pectinas). El material lignocelulósico puede pretratarse. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico a un ácido, una base, un disolvente, calor, un peróxido, ozono, fragmentación mecánica, trituración, molienda o despresurización rápida, o una combinación de cualesquiera dos o más de las mismas. Este pretratamiento químico a menudo se combina con un pretratamiento térmico, por ejemplo de entre 150-220 °C durante 1 a 30 minutos.

El producto de fermentación en el proceso de la invención puede ser uno o más de etanol, butanol, ácido láctico, ácido succínico, un plástico, un ácido orgánico, un disolvente, un suplemento alimenticio para animales, un producto farmacéutico, una vitamina, un aminoácido, una enzima o una materia prima química.

En una forma de realización, la concentración de glucosa es de 80 g/l o más con respecto al volumen del carbohidrato fermentable. Es decir que la concentración inicial de glucosa, es decir al inicio de la fermentación, es preferentemente de 80 g/l o más, preferentemente de 90 g/l o más, de 100 g/l o más, de 110 g/l o más, de 120 g/l o más, de 130 g/l o más, de 140 g/l o más, de 150 g/l o más, de 160 g/l o más, de 170 g/l o más, 180 g/l o más. El inicio de la fermentación puede ser el momento en que el carbohidrato fermentable se pone en contacto con la célula recombinante de la invención.

Ejemplos

Ejemplos de metodología

Técnicas generales de biología molecular

A menos que se indique lo contrario, los procedimientos utilizados son técnicas bioquímicas estándar. Los ejemplos de manuales de metodología general adecuados incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.

Propagación y mantenimiento de cepas

Todas las cepas de S. cerevisiae utilizadas en este ejemplo pertenecen al linaje CEN.PK (Entian y Kotter, 2007) (Tabla 1). Los cultivos de S. cerevisiae se propagaron en medio sintético (Verduyn et al., 1992) que contenía 20 g/l de glucosa. Los cultivos de E. coli DH5a para la clonación de plásmidos se propagaron en medio LB (10 g/l de triptona Bacto, 5 g/l de extracto de levadura Bacto, 5 g/l de NaCl) que contenía 100 mg/l de ampicilina. Todas las cepas se almacenaron a -80 °C, después de la adición de glicerol estéril (30% v/v) a los cultivos en crecimiento.

Tabla 1. Cepas de S. cerevisiae

Tabla 2. Plásmidos

Construcción de casetes de expresión y plásmidos

Los plásmidos utilizados en este ejemplo se enumeran en la tabla 2. Los plásmidos que expresan ARNg quiméricos se utilizaron para la edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 (Mans et al., 2015). Se seleccionaron secuencias únicas de reconocimiento de Cas9 en GPD1, GPD2, SGA1 y ALD6tal como se ha descrito anteriormente (Papapetridis et al., 2016). Se realizaron PCR para la construcción de casetes de expresión y PCR de diagnóstico con ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion Hot Start II y polimerasa Dreamtaq (Thermo Scientific, Waltham, MA), respectivamente, según las directrices del fabricante. Para la construcción de pUDR240, el esqueleto del plásmido se amplificó por PCR utilizando el cebador de doble unión 5793 (tabla 3) y pROS10 como plantilla. El fragmento de inserto que expresa los casetes de ARNg dirigidos a GPD1 y dirigidos a GPD2 se amplificó utilizando los cebadores 6965­ 6966 y pROS10 como plantilla. Para la construcción de pUDR103, el esqueleto del plásmido de pMEL10 se amplificó por PCR utilizando los cebadores 5792-5980. El casete de expresión de ARNg dirigido a SGA1 se amplificó por PCR utilizando los cebadores 5979-7023 y pMEL10 como plantilla. Para la construcción de pUDR264, el esqueleto del plásmido de pMEL11 se amplificó por PCR utilizando los cebadores 5792-5980. El casete de expresión de ARNg dirigido a ALD6 se amplificó por PCR utilizando los cebadores 5979-7610 y pMEL11 como plantilla. Los plásmidos se ensamblaron con el kit Gibson Assembly Cloning (New England Biolabs, Ipswich, MA), después de disminuir en escala el protocolo del proveedor a volúmenes de reacción de 10 pl. Los plásmidos pUDR240 y pUDR264 se clonaron en células de E. coli DH5a después de la transformación por electroporación y reaislamiento del plásmido con un kit miniprep (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los clones correctos se verificaron por digestión de restricción o por PCR de diagnóstico. Para la eliminación individual de GPD2, se amplificó por PCR un esqueleto de plásmido con el cebador de doble unión 5793 y pROS10 como plantilla. El fragmento de inserto, que expresa dos casetes de ARNg dirigidos a GPD2 idénticos, se amplificó con el cebador 6966 y pROS10 como plantilla. Para la eliminación individual de GPD2, los dos fragmentos de plásmido se transformaron directamente en células de levadura y se ensamblaron in vivo.

Se sintetizó una versión optimizada en codones de S. cerevisiae de gpsA de Archaeglobus fulgidus (SEQ ID NO: 4), basándose en la preferencia de codones de genes glicolíticos de levadura altamente expresados (Wiedemann y Boles, 2008), por GeneArt GmbH (Regensburg, Alemania). Un casete de integración para reemplazar la región codificante de GPD1 por la secuencia de gpsA optimizada en codones se amplificó por PCR con los cebadores 7862-7863 y pMK-RQ-gpsA como plantilla. Los casetes de expresión optimizados en codones para el gen de acetaldehído deshidrogenasa acetilante de E. coli EutE (TDH3p-eutE-CYC1f), dirigidos a la integración en el locus GPD2 o SGA1, se amplificaron con los cebadores 7991-7992 o 7211-7025, respectivamente, utilizando pUDI076 (Papapetridis et al., 2016) como plantilla. Los casetes de integración estaban flanqueados por secuencias de 60 pb que permitían la integración por recombinación homóloga después de la introducción mediada por CRISPR/Cas9 de roturas bicatenarias en locus genómicos de S. cerevisiae seleccionados.

Construcción de cepas

Para la transformación de la levadura se utilizó el procedimiento de acetato de litio/polietilenglicol (Gietz y Woods, 2002). Después de la transformación con los plásmidos pUDR103, pUDR240 y después de la eliminación individual de GPD2, se seleccionaron transformantes en placas de agar de medio sintético (Verduyn et al., 1992) que contenían 20 g/l de glucosa. Después de la transformación con los plásmidos pUDR119 y pUDR264, se realizaron la selección y la contraselección tal como se describe (Solis-Escalante et al., 2013). La contraselección de plásmidos portadores de URA3 se realizó en placas de agar YP (10 g/l de extracto de levadura Bacto, 20 g/l de peptona Bacto) suplementado con glucosa (20 g/l de concentración final) y ácido 5-fluoroorótico (1 g/l de concentración final). Se utilizó PCR de colonias de diagnóstico para el análisis genotípico de colonias seleccionadas.

La cotransformación de pUDR119 y el casete TDH3p-eutE-CYC1t flanqueado por SGA1 en la cepa IMX581 produjo la cepa IMX992, en la que eutE se sobreexpresó en presencia de genes GPD1 y GPD2 funcionales.

La cotransformación de los dos fragmentos del plásmido de ARNg dirigido a GPD2 y el casete TDH3p-eutE-CYC1t flanqueado por GPD2 en la cepa IMX581 produjo la cepa IMX884, en la que GPD2 se eliminó y eutE se sobreexpresó.

La cotransformación de pUDR240, la secuencia codificante de gpsA flanqueada por GPD1 y el casete TDH3p-eutE-CYC1t flanqueado por GPD2 en la cepa IMX581 produjo la cepa IMX776, en la que gpsA se expresó a partir del promotor y terminador de GPD1 nativo, GPD2 se eliminó y eutE se sobreexpresó.

La cotransformación de pUDR264 y los oligonucleótidos de reparación 7608-7609, seguida de la contraselección de pUDR264, en cepas IMX776 produjo la cepa IMX901, en la que ALD6 se eliminó.

La cepa de referencia con vector vacío IME324 se obtuvo mediante la transformación de IMX581 con p426-TEF.

Cultivo por lotes en biorreactor

Los cultivos por lotes anaerobios se cultivaron en biorreactores de 2 l (Applikon, Schiedam, Países Bajos) en medio sintético (Verduyn et al., 1992) suplementado con ácido acético (3 g/l de concentración final). En cultivos a alta osmolaridad de las cepas que consumen acetato IMX776 e IMX901, la concentración de ácido acético se reajustó a 3 g/l cuando alcanzó un valor inferior a 1,5 g/l mediante la adición de ácido acético glacial, para evitar la limitación de ácido acético. Después de esterilizar en autoclave los componentes de sal mineral del medio sintético y ácido acético a 120 °C durante 20 min, los medios de cultivo anaerobio se suplementaron con antiespumante estéril C (0,2 g/l) (Sigma-Aldrich), ergosterol (10 mg/l), Tween 80 (420 mg/l) y solución de vitamina esterilizada por filtración (Verduyn et al; 1992). Las soluciones de glucosa se esterilizaron en autoclave por separado a 110 °C durante 20 min y se añadieron a medios de baja y alta osmolaridad en concentraciones finales de 20 g/l y 180 g/l (1 M), respectivamente. Los cultivos en matraz en agitación (100 ml) se inocularon con cultivos madre de glicerol congelados (1 ml) y se cultivaron en medio sintético suplementado con glucosa (20 g/l de concentración final). Estos cultivos se utilizaron como inóculos para precultivos en matraz en agitación de 100 ml en el mismo medio, los cuales, tras alcanzar la fase exponencial media (OD⁶⁶⁰4-6), se usaron para inocular cultivos en biorreactores anaerobios, produciendo una OD⁶⁶⁰ inicial de 0,15-0,2. Las condiciones anaerobias se mantuvieron mediante el borboteo continuo de gas nitrógeno (< 10 ppm de oxígeno) a una velocidad de 0,5 l/min. Se utilizaron entubados de norpreno y juntas tóricas de Viton para minimizar la difusión de oxígeno en los reactores. En cultivos a baja osmolaridad, el pH del cultivo se controló automáticamente a 5,0 mediante la adición de KOH 2 M. En cultivos a alta osmolaridad, se utilizó solución de NH⁴OH al 12,5% v/v como valorante para evitar la limitación de nitrógeno. La velocidad del agitador se ajustó a 800 rpm y la temperatura se controló a 30 °C. La evaporación se minimizó mediante enfriamiento del gas de salida a 4 °C en un condensador.

Ensayos de actividad enzimática

Los extractos celulares se prepararon mediante sonicación (Postma et al., 1989), a partir de cultivos en matraz en agitación en crecimiento exponencial (OD⁶⁶⁰5-6) en medio sintético que contenía 20 g/l de glucosa. Los ensayos de actividad enzimática se realizaron a 30 °C mediante supervisión espectrofotométrica continua de la conversión de NAD(P)H a NAD(P)+ a 340 nm. Para la determinación de la actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante, las células se sometieron a sonicación en tampón de fosfato de potasio 100 mM (KPB, pH 7,5) con MgCl²2 mM y ditiotreitol 1 mM. La mezcla de reacción de 1 ml contenía KPB 50 mM (pH 7,5), NADH 0,15 mM y 50 o 70 pl de extracto celular. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de acetil-CoA hasta una concentración final de 0,5 mM. Para los ensayos de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, se usó tampón Tris-HCl 20 mM (pH 8,2) suplementado con EDTA 10 mM para recolectar y almacenar las células, y se realizó una sonicación en tampón Tris-HCl 20 mM (pH 8,2) con tampón de EDTA 2 mM. La mezcla de reacción de 1 ml contenía Tris-HCl 50 mM (pH 6,6), EDTA 2 mM, NADH o NADPH 0,15 mM y 50 o 70 pl de extracto celular. La reacción se inició mediante la adición de fosfato de dihidroxiacetona hasta una concentración final de 4 mM. Todos los ensayos se realizaron en muestras de dos cultivos independientes y las actividades enzimáticas fueron proporcionales al volumen de extracto celular añadido al ensayo.

Determinación de glicerol intracelular

Se inocularon precultivos en matraz en agitación en medio sintético (20 g/l de glucosa) a partir de soluciones madre congeladas. Después de alcanzar la fase exponencial media, las células se lavaron con agua desmineralizada estéril y se usaron como inóculo para cultivos anaerobios en matraces en agitación en el mismo medio que los cultivos por lotes en biorreactor a alta osmolaridad. Se cultivaron cultivos anaerobios en matraces en agitación en una cámara anaerobia Bactron (Sheldon Manufacturing, Cornelius, OR) a 30 °C. Los cultivos en fase exponencial media se recolectaron y se centrifugaron a 4000 x g durante 5 min. Se descartó el sobrenadante, las células se resuspendieron en 0,005 mol/l de H²SO⁴ y se incubaron a 100 °C durante 5 min. La suspensión celular se centrifugó a 4000 x g durante 5 min y el sobrenadante se usó para análisis por HPLC. Para el cálculo del volumen del sedimento, se utilizó una densidad promedio del sedimento de 1,1 g/ml (Bryan et al; PNAS. 2010;107:999-1004). Para la conversión de la concentración de glicerol intracelular de g/g de peso seco a g/l, se utilizó un volumen intracelular de 2,6 ml (g/peso seco) (Albertyn et al., 1994).

Procedimientos analíticos

La determinación del peso seco de la biomasa, el análisis por HPLC de los metabolitos extracelulares y la corrección por evaporación de etanol se realizaron tal como se ha descrito anteriormente (Guadalupe-Medina et al., 2010). La composición de los gases de escape del cultivo se analizó tal como se ha descrito anteriormente (Guadalupe-Medina et al., 2010), excepto para los cultivos por lotes cultivados en condiciones de alta osmolaridad con las cepas IMX992, IMX884, IMX776 e IMX901, en los que la producción de CO² se calculó a partir de la producción de etanol, asumiendo la formación de 1 mol de CO² por mol de etanol producido. Antes de las mediciones de concentración de glucosa y etanol en fermentaciones a alta osmolaridad, el sobrenadante de cultivo se diluyó 1:1 con agua desmineralizada. Los rendimientos y proporciones de productos en cultivos por lotes se calcularon a partir de un mínimo de cinco muestras tomadas durante la fase de crecimiento exponencial media (Papapetridis et al., 2016). Se calcularon concentraciones de biomasa correspondientes a muestras tomadas antes de la fase de crecimiento exponencial media (OD⁶⁶⁰ < 1) basándose en mediciones de OD⁶⁶⁰, utilizando curvas de calibración basadas en un mínimo de cinco muestras tomadas en la fase exponencial media para las cuales se midieron el peso seco de la biomasa y la OD⁶⁶⁰ (Papapetridis et al., 2016). Se pueden encontrar ejemplos de cálculos en las figuras 1 -4 y 7-8.

Tabla 3. Cebadores de oligonucleótidos utilizados para la construcción de cepas

Ejemplo 1

Efecto limitado de la expresión de una vía de reducción de acetato en GPD1 GPD2 de S. cerevisiae

Para investigar el efecto de la coexpresión de una vía de reducción de acetato con una vía de glicerol completamente funcional, el crecimiento y la formación de productos de la cepa IMX992 (GPD1 GPD2 sga1::eutE) se analizaron en cultivos por lotes en biorreactores cultivados en glucosa anaerobios en 20 g/l de glucosa, suplementados con 3 g/l de ácido acético (figura 9, tabla 4) y se compararon con la cepa de referencia no reductora de acetato IME324. En estas condiciones IME324 (GPD1 GPD2) mostró un consumo de acetato de 2,43 mmol/(g de biomasa) (tabla 4). La cepa IMX992 (GPD1 GPD2 sga1::eutE) mostró un consumo de acetato de 3,35 mmol/(g de biomasa), que fue solo 0,92 mmol/(g de biomasa) superior al consumo de acetato por parte de la cepa de referencia de GPD1 GPD2 IME324. En consonancia con su consumo de acetato ligeramente superior, la producción de glicerol por la cepa IMX992 disminuyó solo levemente, de 9,19 a 8,28 mmol de glicerol/(g de biomasa), con respecto a la cepa IME324 (tabla 4). Claramente, en cepas de S. cerevisiae, la reducción de acetato basada en EutE no pudo competir eficazmente por el NADH con una vía de glicerol nativa completamente funcional.

Ejemplo 2

La eliminación de GPD2 mejora la reducción de acetato por una cepa que expresa eutE

En cultivos anaerobios suplementados con acetato de la cepa IMX884 (GPD1 gpd2::eutE), la expresión de eutE compensó completamente la ausencia de una enzima Gpd2 funcional, tanto en términos de tasa de crecimiento específico como en términos de producción de biomasa en glucosa (tabla 4, figuras 9 y 10). En comparación con la cepa IMX992 (GPD1 GPD2 sga1::eutE), la cepa IMX884 mostró una producción de glicerol 4 veces inferior (1,92 y 8,28 mmol de glicerol/(g de biomasa), respectivamente) y un consumo correspondientemente superior de acetato basado en EutE (3,34 y 0,92 mmol de acetato/(g de biomasa), respectivamente, corregido por el consumo de acetato por la cepa de referencia no reductora de acetato IME324), dando como resultado un rendimiento de etanol con respecto a glucosa de 0,46 g/g (figura 10). Estos resultados indican que, al menos en medios de baja osmolaridad, la inactivación de GPD2 permite que la vía de reducción de acetato basada en EutE compita eficazmente por los equivalentes rédox con la vía del glicerol. Esta estrategia de ingeniería no solo dio como resultado un mayor consumo de acetato, sino también un mayor rendimiento de etanol con respecto a glucosa que el observado en la cepa de referencia no reductora de acetato IME324 (tabla 4, figura 10).

Ejemplo 3

Expresión funcional de una G3PDH que prefiere NADPH en S. cerevisiae

Tal como se ha indicado anteriormente, la expresión del G3PDH que prefiere NADP+ codificada por gpsA de A. fulgidus podría permitir estrategias para desacoplar los papeles del metabolismo del glicerol en la osmotolerancia y el equilibrio rédox de la levadura. Para investigar si gpsA puede expresarse funcionalmente en S. cerevisiae, su secuencia codificante se optimizó en codones para la expresión en levadura (SEQ ID NO: 4) y se integró en el locus GPD1 de la cepa IMX581 (junto con la integración de eutE en el locus GPD2), produciendo la cepa IMX776 (gpd1::gpsA gpd2::eutE). Esta inserción se diseñó para disponer gpsA bajo el control del promotor y terminador GPD1, para permitir la regulación al alza de su expresión a alta osmolaridad (Albertyn et al., 1994; Ansell et al., 1997).

Los ensayos de actividad enzimática en extractos celulares mostraron que, en la cepa IMX776, el reemplazo de los genes nativos GPD1 y GPD2 por gpsA dio como resultado un cambio en la preferencia del cofactor de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH, figura 11). La cepa que expresa gpsA mostró actividades in vitro de 0,103 ± 0,004 pmol/mg proteína/min y 0,006 pmol/mg proteína/min con NADPH y NADH, respectivamente. Como resultado, la relación de tasas de reducción de fosfato de dihidroxiacetona vinculadas a NADPH y NADH fue aproximadamente 500 veces mayor en la cepa IMX776 que en la cepa de referencia IMX992, que expresa los genes GPD1 y GPD2 nativos.

Ejemplo 4

Aumento de la reducción de acetato y disminución de la producción de glicerol en una cepa de levadura que expresa gpsA

Se eliminó ALD6en la cepa reductora de acetato que expresa gpsA IMX776 (gpd1::gpsA gpd2::eutE), produciendo la cepa IMX901. En cultivos por lotes en biorreactores anaerobios suplementados con acetato, la tasa de crecimiento específico de la cepa IMX776 (gpd1::gpsA gpd2::eutE) fue de 0,24/h, que fue aproximadamente el 20% inferior a la de la cepa de referencia IME324 (GPD1 GPD2). La fisiología de la cepa IMX776 en estos cultivos anaerobios a baja osmolaridad, incluida la estequiometría de la formación de biomasa y el consumo de acetato, se parecía mucho a la de la cepa IMX888 (gpd1A gpd2::eutE) (tabla 4, figuras 9 y 10). Prácticamente no se formó glicerol extracelular en la cepa IMX776, lo que indica que, en estas condiciones, la actividad de producción de glicerol dependiente de NADPH in vivo en esta cepa fue mínima. De forma coherente con esta noción, el crecimiento y la formación de productos en cultivos anaerobios de la cepa IMX901 (gpd1::gpsA gpd2::eutE ald6A) fue similar al rendimiento observado de las cepas IMX776 o IMX888 en estas condiciones.

Ejemplo 5

El cultivo a alta osmolaridad afecta negativamente a la reducción de acetato por una cepa gpd2A

Para evaluar el efecto de la alta osmolaridad en la reducción de acetato observada en la cepa de GPD1 gpd2::eutE IMX884, se comparó su rendimiento con el de la cepa IMX992 (GPD1 GPD2 sga1::eutE) en cultivos por lotes en biorreactores anaerobios cultivados en 1 mol/l (180 g/l) de glucosa. A diferencia de los cultivos a baja osmolaridad, en los que las cepas continuaron creciendo exponencialmente hasta que se agotó la glucosa (figura 9), las condiciones de alta osmolaridad mostraron un perfil de crecimiento bifásico, en el que la fase exponencial vino seguida de una segunda fase de crecimiento más lenta (figura 12).

La tasa de crecimiento específico inicial de la cepa IMX992 (GPD1 GPD2 sga1::eutE) no se vio afectada al aumentar la concentración de glucosa en el medio a 1 mol/l (tablas 4 y 5, figura 12). El consumo de acetato en los cultivos a alta osmolaridad de esta cepa fue inferior al observado durante el cultivo en 20 g/l de glucosa (2,67 y 3,35 mmol/(g de biomasa), respectivamente). Esta observación indica que, también en condiciones de alta osmolaridad, la reducción de acetato mediada por EutE no podría competir eficazmente por NADH con una vía de glicerol completamente funcional.

La cepa IMX884 (GPD1 gpd2::eutE) mostró una tasa de crecimiento específico el 10% inferior en medio de alta osmolaridad que en cultivos cultivados en una baja concentración de glucosa (tablas 4 y 5). Con respecto al rendimiento en cultivos a baja osmolaridad, el cultivo en 1 mol/l de glucosa dio lugar a un aumento de tres veces en la producción de glicerol extracelular (6,34 mmol/(g de biomasa) frente a 1,92 mmol/(g de biomasa)) y una disminución correspondiente en consumo de acetato (2,98 mmol/gX frente a 5,77 mmol/gX) (tablas 4 y 5). Estos cambios eliminaron en gran medida la diferencia de cuatro veces en la producción de glicerol entre las cepas IMX992 e IMX884 que se observó en cultivos a baja osmolaridad (tablas 4 y 5). Después del consumo completo de glucosa, las concentraciones de ácido acético, glicerol y etanol alcanzaron concentraciones similares en cultivos a alta osmolaridad de las dos cepas (figura 12). Estos resultados indican que, incluso cuando se elimina GPD2, las condiciones de alta osmolaridad impidieron la competencia de la vía de reducción de acetato basada en EutE por NADH con la vía de glicerol, posiblemente debido a la regulación al alza inducida por estrés osmótico de GPD1.

Ejemplo 6

El reemplazo de GPD1 y GPD2 por gpsA desacopla los papeles de la formación de glicerol en el metabolismo rédox y la osmorregulación

Para evaluar si el reemplazo de isoenzimas Gpd dependientes de NAD+ de levadura por una G3PDH que prefiere NADP+ puede desacoplar los papeles de la formación de glicerol en la osmorregulación y el metabolismo rédox, se investigó el crecimiento y la formación de productos de la cepa IMX776 (gpd1::gpsA gpd2::eutE) en cultivos a alta osmolaridad. A diferencia de las cepas IMX992 e IMX884, la cepa IMX776 mostró una fase de latencia de aproximadamente 50 h en estas condiciones (figura 12) y su tasa de crecimiento específico fue el 60% inferior que en cultivos a baja osmolaridad (tablas 4 y 5). Si bien en condiciones de baja osmolaridad esta cepa no produjo glicerol extracelular, los cultivos por lotes a alta osmolaridad mostraron una producción de glicerol de 3,29 mmol/(g de biomasa) (tabla 5). Después del agotamiento de la glucosa, la concentración de glicerol en cultivos a alta osmolaridad de la cepa IMX776 fue el 44% inferior que la observada para la cepa IMX992 (GPD1 GPD2 sga1::eutE) (figura 12).

La cepa IMX776 mostró un consumo de acetato mucho menor en los cultivos con alto contenido de glucosa que en los cultivos a baja osmolaridad (tablas 4 y 5). Esta diferencia podría deberse a un aumento del flujo a través de la acetaldehído deshidrogenasa dependiente de NADP+ Ald6 citosólica, junto con la mayor demanda de NADPH en la reacción de GpsA citosólica. La generación de NADPH a través de la oxidación de acetaldehído a acetato, que posteriormente se puede reducir a etanol por medio de la acetil-CoA sintetasa, EutE y alcohol deshidrogenasa dependiente de NAD+, daría como resultado que se consuma menos acetato extracelular para la reoxidación de NADH (figura 13). La eliminación de ALD6 tuvo un fuerte impacto sobre la fisiología de cultivos anaerobios de S. cerevisiae que expresa gpsA reductora de acetato. Aunque las tasas de crecimiento específico de la cepa IMX776 (gpd1::gpsA gpd2:eutE) y la cepa IMX901 (gpd1::gpsA gpd2:eutE ald6Á) en cultivos a alta osmolaridad fueron similares (tabla 5), la ausencia completa de una fase de latencia redujo el tiempo total de fermentación de la última cepa en aproximadamente 35 h (figura 12). Además, la cepa IMX901 dependía totalmente del suministro de ácido acético exógeno para su equilibrio rédox. Cuando, una vez finalizado el crecimiento exponencial, no se proporcionó acetato adicional, el crecimiento y el consumo de glucosa se ralentizaron considerablemente (figura 6). Una adición similar de acetato a un cultivo por lotes a alta osmolaridad de la cepa IMX776 no afectó a su crecimiento (figura 6).

En contraste con las cepas IMX884 e IMX776, la cepa IMX901 retuvo un fenotipo no productor de glicerol durante el crecimiento en cultivos en biorreactor en medio de alta osmolaridad, lo que dio como resultado un rendimiento de etanol el 13% superior en glucosa en comparación con la cepa IMX992 (GPD1 GPD2 sga1::eutE; tabla 5). Esto, en combinación con una concentración de glicerol intracelular medida de 5,3 ± 0,04 g/l en cultivos anaerobios en matraz en agitación de la cepa IMX901 en medio de alta osmolaridad, indicó una retención intracelular completa del glicerol formado a través de GpsA en esta cepa. Cuando se añadió acetato adicional a cultivos en biorreactor a alta osmolaridad de la cepa IMX901 inmediatamente después de la fase exponencial, no se detectó glicerol extracelular (figura 12). Sin embargo, cuando se añadió acetato a las 20 h en la fase estacionaria (figura 6), se detectaron bajas concentraciones de glicerol (< 1 g/l de concentración final).

Tabla 4. Tasa de crecimiento específico (g) y relaciones estequiométricas entre la producción de glicerol y la formación de biomasa, el consumo de acetato y el consumo de glucosa, y el consumo de acetato y la formación de biomasa en cultivos por lotes en biorreactores anaerobios de cepas de S. cerevisiae con diferentes modificaciones genéticas en el metabolismo del glicerol y del acetato. Los cultivos se cultivaron en medio sintético que contenía 20 g/l de glucosa y 3 g/l de ácido acético (pH 5). Las tasas de crecimiento específico y las estequiometrías se calcularon a partir de la fase de crecimiento exponencial medio y representan promedios ± desviaciones medias de las mediciones en cultivos por duplicado independientes. En todos los cultivos, las recuperaciones de carbono se encontraron entre el 95 y el 100%. Las actividades enzimáticas de acetaldehído deshidrogenasa acetilante en extractos celulares de cepas que expresan eutE fueron similares (figura 5). *Los datos de la cepa IMX888 se tomaron de (Papapetridis et al., 2016).

Tabla 5. Tasa de crecimiento específico (g), rendimientos (R) de biomasa, etanol y glicerol en glucosa y relaciones estequiométricas entre la producción de glicerol y la formación de biomasa, el consumo de acetato y el consumo de glucosa, y el consumo de acetato y la formación de biomasa en cultivos por lotes en biorreactores anaerobios de cepas de S. cerevisiae con diferentes modificaciones genéticas en el metabolismo del glicerol y del acetato. Los cultivos se cultivaron en medio sintético que contenía 180 g/l de glucosa y 3 g/l de ácido acético (pH 5). Las tasas de crecimiento específico y las estequiometrías se calcularon a partir de la fase de crecimiento exponencial medio y representan promedios ± desviaciones medias de las mediciones en cultivos por duplicado independientes.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una célula de levadura Saccharomyces cerevisiae recombinante que comprende:

a) un gen que codifica una enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, en el que dicha enzima tiene una dependencia de cofactor por al menos NADP+ y/o por NADPH;

b) un gen que codifica una enzima que tiene al menos actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ (EC 1.2.1.10); y

c) una mutación o alteración en al menos un gen seleccionado del grupo de GPD1 y GPD2.

2. Célula según la reivindicación anterior en la que la enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa tiene mayor afinidad y/o menor constante de Michaelis y/o mayor actividad máxima por NADPH que por NADH.

3. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el gen que codifica una enzima que tiene actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa comprende al menos un gen exógeno.

4. Célula según la reivindicación anterior, en la que dicho gen codifica una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50%.

5. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el gen que codifica una enzima que tiene al menos actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ codifica una enzima con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 o un homólogo funcional de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50%.

6. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que carece de, o tiene una actividad reducida de aldehído reductasa dependiente de NADPH (EC 1.2.1.4) en comparación con su célula de tipo silvestre correspondiente.

7. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que el genoma de dicha célula comprende una mutación en ALD6.

8. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima que tiene al menos actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ cataliza la conversión reversible de acetil-coenzima A en acetaldehído y la posterior conversión reversible de acetaldehído en etanol.

9. Célula según la reivindicación anterior en la que la enzima comprende tanto actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ (EC 1.2.1.10) como actividad de alcohol deshidrogenasa dependiente de NAD+ (EC 1.1.1.1).

10. Célula según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el gen que codifica una enzima que tiene al menos actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ codifica una enzima con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 3 o un homólogo funcional de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50%.

11. Uso de una célula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la preparación de etanol, butanol, ácido láctico, ácido succínico, un plástico, un suplemento alimenticio para animales, un producto farmacéutico, una vitamina, un aminoácido, una enzima o una materia prima química.

12. Proceso para preparar un producto de fermentación, que comprende preparar un producto de fermentación a partir de un carbohidrato fermentable seleccionado del grupo de glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, xilosa, arabinosa, galactosa, celobiosa y manosa cuya preparación se lleva a cabo en condiciones anaerobias utilizando una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Procedimiento según la reivindicación anterior en el que se obtiene carbohidrato fermentable a partir de almidón, lignocelulosa y/o pectina.