ES2908749T3 - Método de detección del virus de Schmallenberg (SBV) y kit - Google Patents

Método de detección del virus de Schmallenberg (SBV) y kit Download PDF

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Abstract

Un péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en las secuencias VAFIGKYGQQLNFGVA, IGKYGQQLNFGVARVF, FFLNQKKAKMVLHKTA, GGVKFTVVNNHFPQYV, KFTVVNNHFPQYVSNP, WIADTCKASVLKLAEA, RVLKDNMDVNFMKKVL, KDNMDVNFMKKVLRQR, MDVNFMKKVLRQRYGT, NFMKKVLRQRYGTMTA, LRQRYGTMTAEEWMTQ, RYGTMTAEEWMTQKIT, AEEWMTQKITEIKAAF, AKSGFSPAARTFLQQF, GFSPAARTFLQQFGIN.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de detección del virus de Schmallenberg (SBV) y kit
CAMPO TÉCNICO
La presente descripción se refiere a la clonación y expresión de proteínas del virus de Schmallenberg (SBV) o proteínas truncadas, péptidos del virus SBV, y su uso en pruebas de diagnóstico para identificar un Orthobunyavirus y en particular una infección por SBV en una muestra, y kits para su detección.
ANTECEDENTES DE LA DESCRIPCIÓN
En 2011, los rebaños bovinos de varios países europeos mostraron un brote de una enfermedad cuyo origen y causa no pudo relacionarse en un principio con una causa o enfermedad conocida.
El brote de esta enfermedad en los rumiantes europeos se caracteriza por fiebre, diarrea y disminución de la producción de leche en el ganado bovino, así como abortos, fetos momificados, partos prematuros o muertos, y nacimiento de corderos y terneros (cabras, ovejas) débiles o con malformaciones.
Los investigadores del Instituto Friedrich-Loeffler (FLI) lograron aislar un nuevo virus desconocido hasta ahora en Europa. El aislamiento se identificó en muestras de un rebaño de ganado de Schmallenberg, un pequeño pueblo de Hochsauerland-Kreis en Renania del Norte-Westfalia, Alemania. En consecuencia, el virus se denominó virus de Schmallenberg (SBV). Se secuenció el SBV, y se puede acceder a los datos de la secuencia a través del Archivo Europeo de Nucleótidos (https://www.ebi.ac.uk/ena/) con los números de acceso HE649912, HE649913 y HE649914 (Hoffmann et al., 2012).
El virus es un virus de ARN monocatenario, segmentado, de sentido negativo, con envoltura y compuesto por un segmento S, M y L.
Bernd Hofmann et al., Emerging Infectious Diseases, vol. 18, N° 3, 1 de marzo de 2012, páginas 469 - 472, describe un nuevo Orthobunyavirus (virus de Schmallenberg) en el ganado.
Mutien-Marie Garigliany et al., Emerging Infectious Diseases, vol. 18, N° 9, 1 de enero de 2012, páginas 469 -472, describe la determinación de la prevalencia de anticuerpos contra el virus de Schmallenberg en vacas adultas y la proporción de infección transmitida a los fetos, analizada en muestras de suero.
M. F. Saeed et al., Journal of Clinical Microbiology, vol. 39, N° 7, 1 de julio de 2001, páginas 2445-2452, describe el diagnóstico de la infección por el virus Oropouche usando un inmunoensayo enzimático basado en una proteína recombinante de la nucleocápside.
Emmanuel Bréard et al., Plos One, vol. 8, N° 1, 15 de enero de 2013, página e53446 describe la validación de un ELISA indirecto comercialmente disponible que usa una proteína recombinante de la nucleocápside para la detección de anticuerpos contra el virus de Schmallenberg.
El documento WO2013/083847 A2 describe un inmunoensayo que conduce a la detección rápida y simultánea de anticuerpos contra una amplia gama de patógenos infecciosos.
Los documentos anteriores de la técnica anterior no revelan ni sugieren el tema reivindicado en este documento. Otros institutos aislaron virus del tejido cerebral de corderos abortados en Francia y los Países Bajos.
El SBV pertenece al género Orthobunyavirus y a la familia Bunyaviridae, y está relacionado con los virus del serogrupo Simbu (virus de Shamonda, Akabane, Aino) (Hoffmann et al., 2012; Goller et al., 2012).
Los orthobunyavirus son patógenos bien conocidos para rumiantes y humanos en otras áreas del mundo como Asia, Australia, África y Sudamérica. Se transmiten por artrópodos (enfermedad transmitida por vectores).
Lo más probable es que el SBV se transfiera por insectos, p. ej. jejenes (género Culicoides).
Las instalaciones infectadas se encuentran en toda Europa (Alemania, Francia, Bélgica, Países Bajos, Reino Unido, Italia, Luxemburgo, Suiza y España). Los casos identificados son probablemente el resultado de infecciones que tuvieron lugar hace varios meses (el tiempo de gestación para el ganado bovino es de aprox. 300 días, ovino y caprino aprox. 150 días). La enfermedad se propaga dependiendo de las condiciones climáticas y la actividad del vector.
El SBV se puede detectar en una muestra mediante RT-PCT. Sin embargo, la fase virémica después de la infección por el virus es muy corta. Por lo tanto, las secuencias del genoma viral solo pueden detectarse en la sangre periférica durante un par de días. Además, la RT-PCT consume mucho tiempo y requiere un laboratorio especial y personal capacitado para realizar el análisis. Por lo tanto, esta prueba no puede considerarse una prueba de diagnóstico fácil de usar. Otra desventaja es que la RT-PCT tampoco puede proporcionar un análisis de alto rendimiento. Por lo tanto, solo se puede realizar una prueba de alto rendimiento de un rebaño completo con una gran inversión en recursos financieros y, además, requiere mucho tiempo. Por lo tanto, no puede servir como herramienta de detección en el contexto del análisis de SBV y grandes rebaños de animales.
La detección de anticuerpos dirigidos contra las proteínas del SBV en lugar de los ácidos nucleicos virales tiene la ventaja de utilizar la memoria inmunológica del animal infectado. Los anticuerpos se generan contra las proteínas virales en los 10 días posteriores a la infección y se pueden detectar durante un largo período de tiempo. La existencia de anticuerpos anti-SBV específicos es una prueba indirecta de una infección por SBV.
Recientemente, ID-Vet (167, rue Mehdi Barka, F-34070 Montpellier) ha puesto en el mercado un ELISA indirecto que utiliza como antígeno la nucleoproteína del SBV recombinante bajo el nombre de "ID Screen® Schmallenberg Virus Indirect". La prueba se describe para ganado bovino, ovino y caprino. Esta prueba utiliza un formato de prueba indirecta y reconoce solo el SBV para las especies acusadas.
Todavía existe la necesidad de proporcionar una prueba rápida y fiable para la detección de infecciones por SBV en todo el mundo como alternativa y posiblemente con características y aplicaciones mejoradas.
Además, existe la necesidad de proporcionar una prueba de diagnóstico para los virus del serogrupo Simbu y una prueba del grupo pan-Simbu para poder realizar una detección rápida y sencilla de estas infecciones en los rebaños. En vista del transporte mundial de animales, se necesita una prueba de detección rápida y fiable para garantizar que los animales infectados no se transfieran a rebaños no infectados. Por otro lado, en el curso de la compra de animales, el comprador tiene interés en comprar animales sanos y no descubrir después de haber recibido los animales de que están infectados con SBV u otro virus del serogrupo Simbu. Tal infección tendrá un impacto en los terneros y corderos recién nacidos y en el beneficio final.
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una prueba de SBV fiable y, alternativamente, mejorar cualquier prueba de SBV conocida para proporcionar una prueba de diagnóstico de SBV mejorada y fiable, preferiblemente con alta sensibilidad y alta selectividad.
Otro objetivo más de la invención es proporcionar una prueba de diagnóstico validada para la detección de SBV. Otro objetivo más de la descripción es proporcionar una prueba para el virus del serogrupo Simbu y/o una prueba transespecie.
SUMARIO DE LA DESCRIPCIÓN
Esta invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
I. En un aspecto, la descripción se refiere a la propagación y purificación de proteínas estructurales y no estructurales de SBV y versiones truncadas de estas proteínas, en particular la nucleocápside (proteína N) de SBV.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un método para identificar si un animal no humano está infectado con un virus del serogrupo Simbu y particularmente con SBV.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un kit para la detección de un virus del serogrupo Simbu y particularmente una infección por SBV en una muestra.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un formato de prueba de una sola etapa para identificar el SBV en una muestra, preferiblemente o alternativamente para proporcionar una prueba del serogrupo Simbu, preferiblemente en un formato de prueba de una sola etapa como una prueba del serogrupo Simbu.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un ELISA para la detección del virus del serogrupo Simbu y, preferiblemente, la infección por SBV en una muestra.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a una prueba de diagnóstico validada para la detección del virus del serogrupo Simbu y, preferiblemente, la infección por SBV en una muestra.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un ensayo para la detección de Bunyavirus de importancia veterinaria, en particular un ensayo del serogrupo Simbu.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un kit para la detección de Bunyavirus de importancia veterinaria, en particular de SBV y preferiblemente de un virus del serogrupo Simbu. II. En un aspecto, la descripción se refiere a péptidos aislados de la nucleocápside del SBV (proteína N; Np) que comprenden al menos uno o más epítopos útiles para la detección de una infección específica por el serogrupo Simbu o SBV.
En otro aspecto, la descripción se refiere a un método para identificar si un animal no humano está infectado con un virus del serogrupo Simbu y particularmente con SBV.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un péptido pan-especie que comprende un epítopo útil para un método y kit para la detección de SBV y preferiblemente del serogrupo Simbu.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un kit para la detección de un virus del serogrupo Simbu y particularmente una infección por SBV en una muestra.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un formato de prueba de una sola etapa para identificar el SBV en una muestra, preferiblemente o alternativamente para proporcionar un formato de prueba de una sola etapa para identificar la infección por el virus del serogrupo Simbu.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un ELISA para la detección del virus del serogrupo Simbu y preferiblemente la infección por SBV en una muestra, siendo preferiblemente la muestra de origen bovino y/u ovino. En otro aspecto más, la descripción se refiere a una prueba de diagnóstico validada para la detección del virus del serogrupo Simbu, y preferiblemente la infección por SBV en una muestra, siendo preferiblemente la muestra de origen bovino y/u ovino.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un ensayo para la detección de Bunyavirus de importancia veterinaria, en particular un ensayo de virus del serogrupo Simbu.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un kit para la detección de Bunyavirus de importancia veterinaria, en particular de SBV y preferiblemente de un virus del serogrupo Simbu.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
I. A continuación se describe un aspecto de la descripción.
La FIGURA 1 representa el antígeno directo (proteína de la nucleocápside o nucleoproteína o proteína N del SBV purificada) recubierto en placas Maxisorp y la titulación del antígeno en tres tampones de recubrimiento diferentes probados con una muestra positiva, una negativa y sin muestra.
La FIGURA 2 representa placas recubiertas previamente con estreptavidina incubadas con proteína N biotinilada con cantidades decrecientes de proteína analizadas con tres muestras positivas y una muestra positiva.
La FIGURA 3 representa la secuencia de la proteína de la nucleocápside (proteína N) de SBV (SEQ ID N° 1). La FIGURA 4 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína de la nucleocápside (proteína HisN) de SBV (SEQ ID N° 2) que incluye una etiqueta C-terminal de His, preferiblemente utilizada en un sistema de expresión de baculovirus.
La FIGURA 5 representa la proteína de la nucleocápside con una secuencia de aminoácidos etiquetada con 6x His según la Figura 4, en la que los aminoácidos (aa) en negrita indican los aminoácidos importantes para la proteína N viral del grupo Simbu.
La FIGURA 6 representa la proteína de la nucleocápside del SBV de longitud completa con la secuencia de ADN de la etiqueta 6xHis en un vector pET28a (SEQ ID N° 3).
La FIGURA 7 representa la secuencia de ADN de la proteína de la nucleocápside con codones de consenso (SEQ ID N24).
La FIGURA 8 representa la nucleocápside truncada (dominio int. proteína-proteína delecionado): 182 aa etiqueta His C-terminal (SEQ ID N° 5).
La FIGURA 9 representa un formato de ELISA indirecto según la descripción.
La FIGURA 10 representa dos formatos de ELISA de una sola etapa según la descripción; en el panel superior, el anticuerpo presente en una muestra positiva se captura con una de las proteínas del virus SBV como se describió anteriormente. Esta proteína está recubierta en un soporte sólido. Para la detección, se aplica un segundo anticuerpo específico anti-especie o útil de otro modo. Este anticuerpo de detección está acoplado con un medio de detección o puede visualizarse de otro modo. En la figura particular, la proteína de captura de SBV es una proteína de la nucleocápside como se representa en la lista de secuencias.
El panel inferior muestra una configuración diferente de la prueba en la que se usa una proteína de SBV para capturar el anticuerpo anti-SBV en la muestra infectada; esta proteína recubre la fase sólida; la detección se realiza mediante un segundo antígeno de SBV que se une al segundo brazo del anticuerpo anti-SBV en la muestra.
En esta segunda variación de la descripción de un ELISA de una sola etapa, un conjugado anti-IgG de rumiante-HRPO se reemplaza por una proteína de la nucleocápside de SBV acoplada a HRPO en una realización preferida. Así, un anticuerpo anti-SBV de la muestra del animal infectado puede unirse con un brazo a una y con su otro brazo del anticuerpo a la otra proteína SBV, y así puede detectarse.
II. Otro aspecto de la descripción se describe a continuación.
La FIGURA 1B representa la secuencia de aminoácidos de la proteína de la nucleocápside de SBV (proteína N; Np) de SBV (SEQ ID N2: 1).
La FIGURA 2B representa la reactividad de sueros bovinos con péptidos Np según la descripción
La FIGURA 3B representa la reactividad de sueros bovinos con péptidos Np según la descripción
La FIGURA 4B representa la reactividad de sueros ovinos con péptidos Np según la descripción
La FIGURA 5B representa la reactividad de sueros ovinos con péptidos Np según la descripción
La FIGURA 6B representa esquemáticamente la secuencia de aminoácidos de Np y los tramos alineados de consenso (Cons), los epítopos de vaca de la descripción (Ep Vaca) y los epítopos de oveja de la descripción (Ep Oveja). La secuencia de aminoácidos de la nucleoproteína (Np) del SBV se representa en la primera línea de la figura con las regiones altamente conservadas del serogrupo Simbu denominadas "Cons" representadas en la segunda línea (adaptado de Savji et al., 2011, basado en la información proporcionada por Saeed et al. al., 2001). Las regiones que contienen los epítopos bovinos preferidos útiles para las pruebas de diagnóstico se muestran en la tercera línea y se indican como "Ep Vaca". Las regiones que contienen epítopos ovinos preferidos útiles para las pruebas de diagnóstico se representan en la cuarta línea y se indican como "Ep Oveja".
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se dirige a los siguientes aspectos:
La invención se refiere a un péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en las secuencias VAFIGKYGQQLNFGVA, IGKYGQQLNFGVARVF, FFLNQKKAKMVLHKTA, GGVKFTVVNNHFPQYV, KFTVVNNHFPQYVSNP, WIADTCKASVLKLAEA, RVLKDNMDVNFMKKVL, KDNMDVNFMKKVLRQR, MDVNFMKKVLRQRYGT, NFMKKVLRQRYGTMTA, LRQRYGTMTAEEWMTQ, RYGTMTAEEWMTQKIT, AEEWMTQKITEIKAAF, AKSGFSPAARTFLQQF, GFSPAARTFLQQFGIN.
La invención se dirige además a una mezcla de péptidos aislada que comprende al menos dos péptidos como se ha descrito anteriormente.
La invención se dirige además a un método in vitro para identificar un animal no humano infectado con SBV que comprende las etapas de:
i. poner en contacto una muestra con un péptido como se describió anteriormente en condiciones en las que se puede formar un complejo de un anticuerpo específico contra el SBV de la muestra y el péptido;
ii. detectar el complejo así formado con un anticuerpo específico contra el anticuerpo del complejo o un péptido marcado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la detección del complejo es indicativa de una infección por SBV, preferiblemente
en el que el método es un ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), preferiblemente un método de varias etapas o de una sola etapa.
La invención se dirige además a un uso in vitro de uno o más péptidos como se describió anteriormente en un método para la detección de la infección por SBV.
La invención se dirige además a un kit para la detección de una infección por SBV en una muestra que comprende:
i. uno o más péptidos como se describió anteriormente; y
ii. un medio para la detección de un complejo formado entre el péptido y un anticuerpo específico contra el SBV.
La invención se dirige además a un péptido aislado como se describió anteriormente que comprende un epítopo útil para la identificación específica de anticuerpos contra el SBV en una muestra, en el que el epítopo comprende al menos 5 aminoácidos.
La invención se dirige además a un método in vitro para identificar un animal no humano infectado con SBV que comprende las etapas de: i. poner en contacto una muestra con un péptido de SBV como se describió anteriormente en condiciones en las que se puede formar un complejo de un anticuerpo específico contra SBV de la muestra y el péptido; ii. detectar el complejo así formado con un anticuerpo específico contra el anticuerpo del complejo donde la detección del complejo es indicativa de una infección con SBV, preferiblemente donde el método es un ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), preferiblemente un método de varias etapas o un método de una sola etapa.
I. Un aspecto de la descripción se describe con detalle a continuación.
Los diversos aspectos de la descripción se describirán a continuación con más detalle.
Las siguientes definiciones de términos importantes de la descripción se aplicarán a lo largo de la memoria descriptiva, las figuras, los ejemplos y las reivindicaciones. La persona experta entenderá los términos adicionales de acuerdo con el conocimiento general en el campo.
Como se usan en la presente memoria, las formas singulares "un(a)", "uno" y "el/la" incluyen las referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
"SBV", como se usa en la presente memoria, se refiere al virus de Schmallenberg aislado por el FLI (Instituto Friedrich-Loeffler) y que tiene las secuencias descritas anteriormente. Se secuenció el SBV, y se puede acceder a los datos de la secuencia a través del Archivo Europeo de Nucleótidos con los números de acceso HE649912, HE649913 y HE649914 (Hoffmann et al., 2012). El virus es un virus de ARN monocatenario, segmentado, de sentido negativo, con envoltura y compuesto por un segmento S, M, L.
El SBV pertenece al género Orthobunyavirus y a la familia Bunyaviridae, y está relacionado con los virus del serogrupo Simbu.
Los "virus del grupo Simbu" o "virus del serogrupo Simbu" o "virus del grupo pan-Simbu", como se usan en la presente memoria, comprenden un grupo de Orthobunyavirus que están relacionados serológicamente basándose en el análisis de la reactividad cruzada (fijación del complemento, hemaglutinación y neutralización del virus). Las actividades de fijación del complemento están mediadas por la proteína de la nucleocápside viral (proteína N), mientras que las glicoproteínas virales son responsables de inducir anticuerpos neutralizantes y hemaglutinantes. Por lo tanto, un alto grado de homología de secuencias de aminoácidos en la proteína N es una de las características de los miembros del serogrupo Simbu. Algunos de los virus del serogrupo Simbu son de importancia veterinaria y se pueden encontrar en Asia, Australia, África, América del Sur y ahora también en Europa. Aunque la demarcación de los virus del serogrupo Orthobunyavirus y Simbu ha resultado difícil, se identifican al menos dieciocho miembros del serogrupo, incluido el SBV, que pertenecen a diferentes especies de virus, p. ej. el virus Simbu, el virus Sathuperi, el virus Douglas, el virus Shamonda, el virus Peaton, el virus Sango, el virus Akabane, el virus Sabo, el virus Tinaroo, el virus Yaba-7, el virus Aino, el virus Kaikalur, el virus Shuni, el virus Facey's Paddock, el virus Oropuche, virus Utinga y virus Utive (Nichol et al., 2005).
"Aminoácido" se refiere a los aminoácidos naturales y sintéticos. Los residuos de aminoácidos se abrevian como sigue: ^Alanina es A o Ala; Arginina es R o Arg; Asparagina es N o Asn; Ácido aspártico es D o Asp; Cisteína es C o Cys; Ácido glutámico es E o Glu; Glutamina es Q o Gln; Glicina es G o Gly; Histidina es H o His; Isoleucina es I o Ile; Leucina es L o Leu; Lisina es K o Lys; Metionina es M o Met; Fenilalanina es F o Phe; Prolina es P o Pro; Serina es S o Ser; Treonina es T o Thr; Triptófano es W o Trp; Tirosina es Y o Tyr; y Valina es V o Val. Excepto donde se defina lo contrario en la presente memoria, X o Xaa representa cualquier aminoácido. Otros aminoácidos relevantes incluyen, entre otros, 4-hidroxiprolina y 5-hidroxilisina. En todos los casos, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido descrito o al que se hace referencia de otro modo en la presente memoria se presenta de forma convencional, en la que el residuo de aminoácido más a la izquierda, o primero, de la secuencia es el residuo N-terminal y el residuo de aminoácido más a la derecha, o último, de la secuencia es el residuo C-terminal.
Una "variante conservativa" de cualquier secuencia de ácido nucleico en particular incluye cualquier secuencia que tenga una o más sustituciones de codones degenerados en esa secuencia de ácido nucleico particular, cualquier secuencia que tenga una o más sustituciones, inserciones y deleciones de nucleótidos en esa secuencia de ácido nucleico particular, y la secuencia complementaria de ese ácido nucleico particular y las variantes conservativas de esa secuencia complementaria. Las variantes conservativas de una secuencia de ácido nucleico particular tienen preferiblemente al menos aproximadamente un 78 % de identidad, más preferiblemente tienen al menos aproximadamente un 90 % de identidad e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 95-99 % de identidad con esa secuencia de ácido nucleico particular. Las variantes conservativas de una secuencia de ácido nucleico particular pueden sintetizarse artificialmente o pueden aislarse en su forma natural a partir de un organismo.
Una "variante conservativa" de cualquier secuencia polipeptídica particular es cualquier polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que varía de la secuencia de aminoácidos de ese polipéptido particular pero aún conserva las propiedades de unión específicas de ese polipéptido particular, de modo que un anticuerpo de la presente descripción que se genera contra el polipéptido particular es capaz de unirse específicamente al polipéptido variante. Por lo tanto, por ejemplo, una variante conservativa de un polipéptido particular puede tener una o más sustituciones, deleciones, adiciones e inserciones de aminoácidos en ese polipéptido particular. Por ejemplo, una variante conservada de un polipéptido particular puede tener 30 o menos, 25 o menos, 20 o menos, 15 o menos, 10 o menos, o 5 o menos, sustituciones de aminoácidos conservadas para ese polipéptido particular. Las variantes conservativas de un polipéptido particular preferiblemente, pero no esencialmente, tienen al menos aproximadamente un 78 % de identidad, más preferiblemente tienen al menos aproximadamente un 90 % de identidad, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 91-99 % de identidad, con ese polipéptido particular. Un porcentaje de identidad para cualquier secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de interés (p. ej., cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria) respecto de otra secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos "diana" puede determinarse como sigue. En primer lugar, una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos diana de la descripción se puede comparar y alinear con una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos de interés, usando el programa BLAST 2 Sequences (B12seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene BLASTN y BLASTP (p. ej., versión 2.0.14). La versión independiente de BLASTZ se puede obtener en www.ncbi.nlm.nih.gov. Las instrucciones que explican cómo usar BLASTZ, y específicamente el programa B12seq, se pueden encontrar en el archivo “léame” que acompaña a BLASTZ. Los programas también se describen con detalle en Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2264; Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
90:5873;y Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389.
Como se usa en la presente memoria, el término "polipéptido" se refiere a un compuesto de una sola cadena de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. La cadena puede ser de cualquier longitud. Una proteína es un polipéptido, y los términos se usan como sinónimos. El polipéptido es capaz de unirse a uno o más anticuerpos específicos para diferentes epítopos de los polipéptidos de SBV y, preferiblemente, reconocer el virus del grupo Simbu, más preferiblemente diferenciar entre los miembros individuales de dicho grupo de virus.
Como se usa en la presente memoria, el término "péptido" u "oligopéptido" se refiere a una sola cadena de aminoácidos que consta de entre 3 y 25 aminoácidos, preferiblemente de 5 a 12 aminoácidos.
Las proteínas de la presente descripción son capaces de provocar una respuesta inmunitaria en un animal huésped, y/o son capaces de unirse a un anticuerpo presente en una muestra de un animal infectado debido a una respuesta inmunitaria tras la infección.
Además, como parte de la descripción, "anticuerpo" o "anticuerpos" se refiere a los anticuerpos y antisueros monoclonales y/o policlonales que se pueden aplicar en los métodos, ensayos y kits de prueba de la descripción. Estos anticuerpos funcionan como anticuerpos de detección primarios o secundarios. Estos anticuerpos se pueden marcar para visualizar el resultado de la prueba. Los anticuerpos se aplican a concentraciones conocidas por el experto en el contexto de los métodos de detección. Preferiblemente, los anticuerpos se aplican a una concentración de 0,1 pg/ml -5,0 pg/ml
Los anticuerpos aplicados en la presente descripción pueden pertenecer a cualquier clase de anticuerpos, incluidos, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y pueden prepararse mediante cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por el experto. (Véase, por ejemplo, Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol.
32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn et al. Alethods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al., Crit. Rev. Immunol. 12: 125-68 (1992); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Laboratorio Cold Spring Harbor (1988); y Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, Howard y Kaser, eds., CRC Press (2006), cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.)
Un "epítopo" es el determinante antigénico de un polipéptido de SBV o el virus del grupo Simbu o un virus de este grupo que es reconocido por unirse mediante un parátopo a los anticuerpos específicos para dicho polipéptido de SBV. Los anticuerpos, en el contexto de la descripción, reconocen epítopos particulares que tienen una secuencia de 3 a 11, preferiblemente de 5 a 7 aminoácidos. El anticuerpo puede caracterizarse además por su afinidad de unión a la proteína, polipéptido o péptido aplicado en los métodos y kits de la descripción, y la afinidad de unión está en el rango de 10-9 a 10-10 nM. Los anticuerpos particulares usados en la descripción son anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra anticuerpos y aplicados como anticuerpos de detección.
El término "marcador", como se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto, composición o soporte sólido detectable, que se puede conjugar directa o indirectamente (por ejemplo, a través de medios covalentes o no covalentes, solo o encapsulado) a un anticuerpo monoclonal. El marcador puede ser detectable por sí mismo (p. ej., marcadores de radioisótopos, colorantes quimioluminiscentes, marcadores electroquímicos, quelatos metálicos, partículas de látex o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable (por ejemplo, enzimas tales como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y similares). El marcador empleado en la descripción actual podría ser, pero sin limitación, fosfatasa alcalina; glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ("G6PDH"); peroxidasa de rábano (HRP); agentes quimioluminiscentes como isoluminol, agentes fluorescentes como fluoresceína y compuestos de rodamina; ribozimas; y tintes. El marcador también puede ser una molécula de unión específica que en sí misma puede ser detectable (por ejemplo, biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina, maltosa, oligohistidina, 2,4-dinitrobenceno, fenilarsenato, ssADN, dsADN y similares). La utilización de una etiqueta produce una señal que puede ser detectada por medios tales como detección de radiación electromagnética o visualización directa, y que opcionalmente se puede medir.
Un anticuerpo monoclonal se puede unir a un marcador usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. P.ej., Immunochemical Protocols; Methods in Molecular Biology, vol. 295, editado por R. Bums (2005)). El conjugado de anticuerpo monoclonal detectable puede usarse en cualquier formato de prueba de diagnóstico conocido, como ELISA o un formato de ensayo competitivo para generar una señal relacionada con la presencia o cantidad de un anticuerpo específico de SBV en una muestra de prueba.
"Unión sustancial" o "unirse sustancialmente" se refiere a una cantidad de unión específica o reconocimiento entre moléculas en una mezcla de ensayo en condiciones de ensayo particulares. En su aspecto más amplio, la unión sustancial se relaciona con la diferencia entre la incapacidad de una primera molécula de unirse o reconocer una segunda molécula, y la capacidad de la primera molécula de unirse o reconocer una tercera molécula, de modo que la diferencia sea suficiente para permitir que se realice un ensayo significativo para distinguir la unión específica en un conjunto particular de condiciones de ensayo, que incluyen las concentraciones relativas de las moléculas y el tiempo y la temperatura de una incubación. En otro aspecto, una molécula es sustancialmente incapaz de unirse o reconocer otra molécula en el sentido de reactividad cruzada cuando la primera molécula exhibe una reactividad hacia una segunda molécula que es inferior al 25 %, preferentemente inferior al 10 %, más preferentemente inferior al 5 % de la reactividad exhibida hacia una tercera molécula en un conjunto particular de condiciones de ensayo, que incluyen la concentración relativa y la incubación de las moléculas. La unión específica se puede probar utilizando una serie de métodos ampliamente conocidos, por ejemplo, un ensayo inmunohistoquímico, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de transferencia de Western. Una "muestra biológica" se refiere a una muestra de un sujeto animal que incluye saliva, sangre completa, suero, plasma, leche u otra muestra que se sabe que contiene anticuerpos anti-SBV. Una muestra biológica se puede recolectar y almacenar por cualquier medio conveniente que no afecte a la capacidad de la muestra de ser analizada en el método de la descripción. Las muestras para el uso en el método de la descripción pueden requerir preparación antes de su uso en el método. Por ejemplo, es posible que sea necesario precipitar, diluir, filtrar o centrifugar las muestras para eliminar los componentes indeseados, o se pueden añadir componentes a la muestra, como sales, detergentes o proteínas adicionales.
El término "soporte sólido" o "fase sólida" se refiere a una matriz no acuosa a la que se puede adherir un polipéptido de SBV o de un virus del grupo Simbu mediante una unión covalente o no covalente. Los ejemplos de soporte sólido incluyen los soportes formados total o parcialmente por vidrio (p. ej., vidrio de poro controlado), polímeros sintéticos y naturales, polisacáridos (p. ej., agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, poli(alcoholes vinílicos) y siliconas, partículas magnéticas, partículas de látex, tiras cromatográficas, placas de poliestireno de microtitulación, o cualquier otra sustancia que permita lavar o separar los antígenos unidos de los materiales sin unir. En ciertas realizaciones, dependiendo de la aplicación, el soporte sólido puede ser el pocillo de una placa de ensayo o puede ser una columna de purificación (p. ej., una columna de cromatografía de afinidad).
Como se usa en la presente memoria, el término "kit" o "kits de ensayo" (p. ej., artículos de fabricación) se refiere a un conjunto de compuestos útiles y otros medios como placas de soporte sólida o tiras reactivas para detectar la infección por SBV o un virus del grupo Simbu en una muestra de mamífero, preferiblemente rumiantes. Por lo tanto, un kit puede incluir uno o más dispositivos y/o composiciones de la presente descripción. En un ejemplo particular, dicho kit incluye el dispositivo que tiene una proteína SBV inmovilizada, un fragmento de la misma o un péptido, y que comprende uno o más anticuerpos de captura y otros reactivos útiles como un reactivo de lavado, así como un reactivo detector y reactivos de controles positivos y negativos, si se desea o es apropiado. En dichos kits de prueba pueden incluirse otros componentes tales como tampones, controles y similares, conocidos por los expertos en la técnica. Las cantidades relativas de los diversos reactivos se pueden variar para proporcionar concentraciones en disolución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, generalmente liofilizados, que al disolverse proporcionarán una disolución de reactivos que tendrán las concentraciones apropiadas para combinarlos con una muestra. El presente kit puede incluir además instrucciones para llevar a cabo uno o más métodos de la presente descripción, incluidas instrucciones para usar cualquier dispositivo y/o composición de la presente descripción que se incluye con el kit. A continuación se describirán con más detalle los aspectos particulares de la descripción.
En un aspecto de la descripción, se expresaron y purificaron proteínas y polipéptidos individuales de SBV. La versión de longitud completa y varias versiones truncadas de la nucleocápside (N) se clonaron según procedimientos estándar conocidos por los expertos, y se produjeron en diferentes sistemas de expresión. Uno de tales sistemas de expresión usó E. coli, como conocen bien los expertos en la técnica. Por lo tanto, no es necesario describir en la presente memoria los detalles, y son muy conocidos a partir de la bibliografía. Un sistema de expresión alternativo que puede usarse es el sistema de baculovirus también conocido en la técnica (Sambrook y Russell, 2001).
Los detalles particulares también son evidentes a partir de la sección de Ejemplos.
En un aspecto, la descripción es una proteína de SBV aislada que comprende o consiste en una proteína de la nucleocápside (proteína N) que tiene 233 aa; una proteína NS no estructural (segmento S) que tiene 91 aa; una glicoproteína (proteína Gc) que tiene 846 aa, preferiblemente según SEQ ID N° 138 a 144 (Figuras 3 a 8), o un fragmento de la misma, o una proteína que tiene un 95 % de identidad con la misma para el uso en la detección de SBV o un virus del serogrupo Simbu.
En una realización preferida, la proteína aislada es un péptido de SBV aislado que consiste en SEQ ID N° 139 a 144 o un péptido que tiene una identidad del 95% con respecto a la misma.
Preferiblemente, el péptido aislado consta de un epítopo útil para la identificación específica de una infección por SBV en una muestra en la que el epítopo comprende o consiste en al menos 3 aminoácidos, preferiblemente al menos 5 aminoácidos, más preferiblemente al menos 7 aminoácidos e incluso más preferiblemente 12 aminoácidos, incluso más preferiblemente entre 5 y 25 aminoácidos de SEQ ID N° 139 a 144 (Figuras 3 a 8).
En otro aspecto, la descripción se refiere a un método para producir una proteína o un polipéptido como se describió anteriormente.
Las proteínas y los polipéptidos de la descripción se pueden clonar, expresar y purificar según métodos bien conocidos en la técnica.
El uso de diferentes sistemas de expresión tiene ventajas en cuanto a la sencillez del método y el rendimiento que se puede conseguir, así como aspectos secundarios como el control de posibles contaminaciones. Si las proteínas o los péptidos se aplican en métodos para usos de diagnóstico, el método de producción también puede tener implicaciones por su utilidad en aplicaciones particulares. En la presente descripción, la proteína de la nucleocápside (N) de SBV expresada en el sistema de expresión de E. coli se prefiere para las aplicaciones de diagnóstico. Aunque las proteínas expresadas en baculovirus se pueden aplicar bien en las aplicaciones de diagnóstico de la descripción, se prefieren las proteínas expresadas en E. coli.
La descripción puede usar una proteína N de SBV de longitud completa o versiones truncadas, así como proteínas que exhiben modificaciones de secuencia que incluyen, entre otras, modificaciones, sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de secuencias de aminoácidos. Las realizaciones preferidas se representan en las figuras y la lista de secuencias. En una realización preferida, la proteína N como proteína de longitud completa o que incluye modificaciones de secuencia contiene una etiqueta de His C-terminal. En una realización preferida, la proteína N tiene una deleción del dominio de interacción proteína-proteína y tiene más preferiblemente una longitud de aminoácidos de 180 a 200 aminoácidos, preferiblemente la secuencia truncada de N tiene 182 aminoácidos. Las secuencias particulares se representan en la lista de secuencias y son evidentes a partir de las Figuras.
Las proteínas y polipéptidos de SBV particulares pueden expresarse de forma recombinante y aplicarse en formatos de prueba de diagnóstico estándar bien conocidos para los expertos. En la presente descripción, se prefiere particularmente un formato de ELISA indirecto, y se prefiere adicionalmente un formato de ELISA de una sola etapa. Podría demostrarse que las proteínas de SBV, como se describió anteriormente, son particularmente útiles en pruebas y métodos según la descripción para detectar la infección por SBV y, en una realización más preferida, los virus del serogrupo Simbu.
Particularmente útil es la proteína N de SBV de longitud completa de SEQ ID N° 139. Se prefiere adicionalmente una proteína N truncada como se representa en SEQ ID N° 144.
Se pudo demostrar que la aplicación de dicha proteína está dando resultados particularmente buenos en cuanto a especificidad y selectividad. Si bien todos los formatos de detección conocidos pueden aplicarse en principio a la prueba, se preferirán ciertos formatos de prueba en vista de aspectos prácticos como la facilidad para realizarlos y el suministro de kits de prueba. En una realización preferida, se lograron ventajosamente buenos resultados en un formato de ELISA indirecto como se representa en las Figuras. Más preferido es un ELISA de una sola etapa, que tiene la ventaja de que todos los reactivos y la muestra se pueden mezclar en un proceso de una sola etapa. Se representan varias realizaciones preferidas en la Figura 10.
Se representan más detalles en cuanto a la secuencia y producción de las proteínas en las Figuras y el listado de secuencias.
En una realización preferida, la descripción se refiere a un método in vitro para identificar un animal no humano infectado con SBV o un virus del serogrupo Simbu que comprende las etapas de: i. poner en contacto una muestra con una proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido de SBV en condiciones en las que se puede formar un complejo de un anticuerpo específico contra SBV de la muestra y la proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido de SBV; ii. detectar el complejo así formado con un anticuerpo específico contra el anticuerpo del complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de una infección por SBV.
En una realización preferida, el método de identificación es un ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), preferiblemente un método de múltiples etapas y más preferiblemente un método de una sola etapa. En tal método, se puede aplicar una proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido de SBV, y preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 139 a 144 (Figuras 3 a 8), o un fragmento del mismo.
En otro aspecto, la descripción se refiere a un kit para la detección de una infección por un virus del serogrupo Simbu o SBV en una muestra que comprende: i. una o más proteínas, polipéptidos, oligopéptidos o péptidos de SBV como se describe en las Figuras y el listado de secuencias; y ii. un medio para la detección de un complejo formado entre una o más proteínas, polipéptidos, oligopéptidos o péptidos de SBV y un anticuerpo específico contra SBV. La proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido de SBV se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en SEQ ID N2139 a 144 (Figuras 3 a 8).
En otro aspecto, la descripción es un método para detectar anticuerpos contra SBV en una muestra biológica, y el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un polipéptido de SBV de SEQ ID N° 139 a 144, y detectar si los anticuerpos de la muestra compiten con el anticuerpo monoclonal por unirse a SEQ ID N° 139 a 144, determinando así que la muestra contiene anticuerpos contra SBV, en donde los anticuerpos contra SBV de una muestra de animales que han sido infectados naturalmente competirán con el anticuerpo monoclonal por unirse a SEQ ID N° 139 a 144, pero los anticuerpos de una muestra de animales que no han sido infectados o de animales que han sido vacunados contra el SBV más de 4 semanas antes de que se obtenga la muestra no competirán con el anticuerpo monoclonal por unirse a SEQ ID N° 139 a 144. En una realización preferida, el método puede usarse para la detección de virus del grupo Simbu.
La descripción logra una sensibilidad de más del 95%, preferiblemente más del 96%, incluso más preferiblemente más del 97%, y una especificidad de más del 97%, preferiblemente más del 98%, e incluso más preferiblemente más del 99% con la proteína N truncada según SEQ ID N° 139 a 144.
Las muestras que se pueden usar en los métodos, ensayos y kits de prueba de la descripción son de suero, plasma o leche preferiblemente de rumiantes, y son particularmente útiles para detectar infecciones en ganado bovino, ovino o caprino.
El kit puede contener reactivos listos para usar y los resultados de la prueba se obtienen ventajosamente en varias horas, preferiblemente en menos de 6 horas, preferiblemente en menos de 5, más preferiblemente en menos de 4 horas.
El factor de dilución de la muestra es preferiblemente inferior o igual a 50x, preferiblemente 30x, preferiblemente 20x, preferiblemente 10x, lo que evita ventajosamente más etapas de dilución.
El kit contiene preferiblemente todos los reactivos listos para usar, incluidas placas recubiertas, controles negativos y positivos, disolución de lavado, diluyente de muestra, conjugado, TMB y disoluciones de parada.
El antígeno aplicado es preferiblemente un antígeno que se conserva entre los virus del grupo Simbu y, por lo tanto, permite ventajosamente la detección de una infección del grupo pan-Simbu en una muestra.
En realizaciones preferidas, la fase sólida de la prueba se recubre con un antígeno como se describió anteriormente. El antígeno se puede expresar en E. coli. Se prefiere particularmente un antígeno expresado en un sistema de expresión de Baculovirus. En el método y kit de ensayo se puede usar cualquier fase sólida conocida y útil, preferiblemente se usa MaxiSorp o PolySorp (Thermo Fisher Scientific) y se recubre aplicando un tampón de revestimiento que tiene preferiblemente un pH de 5, 7 o 9,5. El antígeno se aplica en una cantidad de 1, 2, 3 ó 4 pg/ml. Puede ser útil aplicar una disolución de bloqueo conocida en la técnica, pero se prefiere evitar una disolución de bloqueo.
Como diluyente de muestra se puede utilizar NaCl 0,14 M, KCl 2,7 mM, Kathon 0,03 %, Tween20 0,1 %. Otro diluyente útil según la descripción es MgCl2 al 2%, Tween20 al 6% y AO al 6%, sal sódica de caseína al 0,5%.
El anticuerpo de detección se diluye 1:10000, preferiblemente 1:20000.
Las etapas del método se aplicarán según sea necesario y pueden variar según los reactivos particulares aplicados. En una realización preferida, las condiciones y las etapas del método son las siguientes:
Muestra (1:10) en diluyente de muestra (MgCl22 %, AO 6 %, Tween206 %, Caseína 0,5 %), 100 pl/pocillo Incubar 1 h, temperatura ambiente en cámara húmeda
3x lavado (solución salina tamponada con fosfato con Tween20 al 0,1 %)
Conjugado listo para usar, 100 pl/pocillo
Incubar 1 h, temperatura ambiente en cámara húmeda
3x lavado (solución salina tamponada con fosfato con Tween20 al 0,1 %)
TMB 100ul/pozo, incubar 10 min, temperatura ambiente
Añadir disolución de parada (100 pl/pocillo) y
Lectura a 450nm
En realizaciones particularmente preferidas, el diluyente de muestra contiene sal sódica de caseína en una concentración de entre 0,1 y 0,55 %, preferiblemente 0,1 %, más preferiblemente 0,55 %. En realizaciones preferidas, el diluyente de la muestra contiene un 0,5 % de sal sódica de caseína y MgCl2, preferiblemente el MgCl2 tiene una concentración del 2 %.
En una realización preferida, el método de detección, y preferiblemente también el kit, se caracteriza por la inclusión de compuestos específicos, el uso de diluciones particulares del antígeno de captura y/o una cantidad y calidad particular de antígeno de captura recubierto sobre el soporte sólido utilizado en el método de detección y el kit de la descripción.
Se pudo demostrar que por medio de la combinación particular de preferiblemente las condiciones de purificación y/o las condiciones de dilución y/o los componentes particulares incluidos en el método de detección y el kit, se pudo conseguir un rendimiento mejorado del método de detección de SBV y preferiblemente de los virus del serogrupo Simbu.
Todos los miembros de este grupo podrían detectarse con el método de la descripción. Se detectan preferentemente ciertos virus: virus Schmallenberg, virus Shamonda, virus Douglas, virus Peaton, virus Akabane, virus Aino, virus Oropouche, virus Tinaroo, virus Shuni. Se lograron resultados particularmente preferidos y particularmente buenos con las siguientes especies: Peaton, Acabane, Aino, Tinaroo. En una realización particularmente preferida, se detectan los virus del serogrupo Simbu de Bovidae, Cervidae y Camelidae.
En una realización particularmente preferida, la dilución de la proteína SBV, preferiblemente la proteína de la nucleocápside, se eligió para estar en la disolución de recubrimiento en una concentración de 0,5 a 5 pg/ml, preferiblemente de 1 a 3 pg/ml. El soporte sólido al que se recubre la proteína SBV contiene antígeno de 0,25 a 1 pg/pocillo, preferiblemente de 0,5 a 1 pg/pocillo. La preparación de nucleocápside inventiva en su dilución particular demostró ser ventajosa.
Por consiguiente, se logró tener la proteína de recubrimiento de SBV sustancialmente en disolución y se pudo evitar la formación o presencia de agregados de la proteína de recubrimiento, preferiblemente la proteína de nucleocápside como se describió anteriormente y en SEQ ID N° 139 a 144. Por lo tanto, la especificidad de la prueba podría incrementarse y no era evidente que este aspecto de la prueba pudiera conducir a una especificidad y/o sensibilidad ventajosas. Los resultados positivos son evidentes al realizar la prueba con muestras positivas y negativas confirmadas con respecto a la infección por SBV como tal.
Además, la ventaja de la prueba y el kit según la descripción que se describe en la presente memoria no solo es evidente a partir de los resultados positivos de la prueba que se pueden lograr con la prueba como tal. Es más evidente en comparación con los kits de prueba del mercado hoy en día, es decir, en septiembre de 2012. En particular, la descripción actual y el método de detección de las realizaciones preferidas son superiores a las pruebas de SBV del estado de la técnica, como la prueba y el kit IDvet descrito anteriormente en la sección de antecedentes.
Otra realización preferida que se utiliza en el método de detección y preferentemente en el kit es la caseína. Cualquier caseína disponible en el mercado se puede aplicar a una concentración que se puede adaptar según las necesidades de los otros compuestos y para lograr buenos resultados de detección en la prueba. Preferiblemente, la concentración en una disolución de la prueba es del 0,1 al 1 %, preferiblemente del 0,25 al 0,75 %, más preferiblemente del 0,5 %. En una realización preferida, la caseína está presente en la disolución de lavado de la etapa de recubrimiento en la que el antígeno se recubre en el dispositivo de soporte sólido.
La etapa de recubrimiento se realiza preferentemente a un pH de 5 a 10, preferentemente de aproximadamente 5, 7 o 9,5.
La proteína de recubrimiento, es decir, el antígeno que puede ser preferiblemente la proteína de la nucleocápside del SBV como se describe en la memoria descriptiva y los ejemplos, se usa en cantidades de 1, 2 o 4 pg/ml, preferiblemente 1 pg/ml.
Otra realización preferida usa solo o además Aminoxid (AO). Preferiblemente, la concentración utilizada está en una disolución del método en una cantidad de 3 a 10 %, preferiblemente de 5 a 8 %, más preferiblemente de 6 %.
Otra realización preferida del método de detección y kit contiene Tween, preferiblemente Tween20, o una sustancia comparable, preferiblemente un detergente con características comparables. Esta sustancia está contenida en una cantidad de 0,05 a 0,5%, preferiblemente de 0,1 a 0,2%.
En una realización particularmente preferida, la disolución de lavado de la etapa de recubrimiento contiene preferiblemente NaCl 0,14 M, KCl 2,7 mM; Kathon 0,03 %, Tween20 0,1 %, el diluyente de muestra comprende MgCl22 %, Aminoxid (AO) 6 %, Tween206 % y 0,5 % de caseína.
En una realización preferida, el conjugado anti-rumiante se usa a una dilución de 1:10.000 a 1:30.000, preferiblemente 1:20.000 en un tampón estabilizador de conjugado en un formato listo para usar (RTU).
En otra realización preferida, los compuestos descritos anteriormente se pueden combinar y conducirán a resultados de prueba particularmente buenos. En tal realización, los diversos compuestos están contenidos en cualquiera de las disoluciones utilizadas para la preparación de los compuestos del kit o durante la realización de la prueba y pueden estar contenidos en el kit según la descripción.
Los inventores lograron sorprendentemente con una realización o una combinación de las realizaciones preferidas descritas anteriormente muy buenos resultados con respecto a la especificidad y la selectividad. No era previsible que pudieran obtenerse resultados tan buenos usando la preparación de antígeno particular en su dilución particular, lo que es particularmente ventajoso. Más ventajosa es la dilución del antígeno en relación con otros aditivos como caseína, Aminoxid y/o Tween, preferiblemente a las concentraciones descritas anteriormente.
La prueba detecta preferentemente los virus del serogrupo Simbu, puede detectar preferentemente el SBV en muestras bovinas, caprinas y ovinas.
El punto de corte se puede elegir de acuerdo con las necesidades de sensibilidad y especificidad. Se considera que la distribución se adapta a la idoneidad para el propósito. Esto dependerá de las necesidades de la prueba. Se utiliza ROC para el análisis. El punto de corte se elige de acuerdo con los procedimientos estándar con respecto a los controles positivo y negativo y los respectivos cálculos conocidos por el experto en la técnica y la bibliografía para el desarrollo de pruebas de diagnóstico.
Con el fin de optimizar la especificidad, el corte se elige preferiblemente al 30% o más, 40% o más, 50% o más, o 60% o más.
Para optimizar la sensibilidad, el corte se elige preferiblemente al 10% o más, 20% o más, 30% o más, o 40% o más. Un corte óptimo para la prueba según la descripción es preferentemente del 40 %, más preferentemente entre el 30 y el 40 %.
La ventaja de las pruebas de la descripción es que, en realizaciones preferidas, se puede lograr una especificidad de más del 97 %, preferiblemente del 98 % y más preferiblemente de más del 99 %, y una sensibilidad de más del 94 %, más preferiblemente de más del 95 % y más preferiblemente más del 96%. Las realizaciones particulares logran una especificidad de alrededor del 99,8% y una sensibilidad de alrededor del 95,8%. Con respecto a especies particulares, se pueden lograr las siguientes especificidades y sensibilidades, respectivamente: bovino: 99,5% y 95,7%; ovino: 100% y 99%; caprino: 100% y 99%.
En consecuencia, el método y el kit de prueba serán particularmente fiables para cabras, ovejas y bovinos para la detección de SBV. En una realización preferida, los buenos resultados también se aplicarán al serogrupo Simbu. En particular, se pueden lograr buenos resultados para detectar los virus Akabane, Peaton, Aino y Tinaroo.
II. Otro aspecto de la descripción se describe con detalle a continuación.
Los diversos aspectos de la descripción se describirán a continuación con más detalle.
Las siguientes definiciones de términos importantes de la descripción se aplicarán a lo largo de la memoria descriptiva, figuras, ejemplos y reivindicaciones. Los términos adicionales, si corresponde, serán entendidos por el experto de acuerdo con el conocimiento general en el campo.
Como se usan en la presente memoria, las formas singulares "un", "uno/una" y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
"SBV", como se usa en la presente memoria, se refiere al virus de Schmallenberg aislado por el FLI (Instituto Friedrich-Loeffler) y que tiene las secuencias descritas anteriormente. Se secuenció el SBV y se puede acceder a los datos de la secuencia a través del Archivo Europeo de Nucleótidos con los números de acceso HE649912, HE649913 y HE649914 (Hoffmann et al., 2012). El virus es un virus de ARN monocatenario, segmentado, de sentido negativo, envuelto y compuesto por un segmento S, M y L.
El SBV pertenece al género Orthobunyavirus y a la familia Bunyaviridae y está relacionado con los virus del serogrupo Simbu.
Los "virus del grupo Simbu" o "virus del serogrupo Simbu" o "virus del grupo pan-Simbu", como se usan en la presente memoria, comprenden un grupo de Orthobunyavirus que están relacionados serológicamente sobre la base del análisis de la reactividad cruzada (fijación del complemento, hemaglutinación y neutralización del virus). Las actividades de fijación del complemento están mediadas por la proteína de la nucleocápside viral (proteína N), mientras que las glicoproteínas virales son responsables de inducir anticuerpos neutralizantes y hemaglutinantes. Por lo tanto, un alto grado de homología de secuencias de aminoácidos en la proteína N es una de las características de los miembros del serogrupo Simbu. Algunos de los virus del serogrupo Simbu son de importancia veterinaria y se pueden encontrar en Asia, Australia, África, América del Sur y ahora también en Europa. Aunque la demarcación de los virus del serogrupo Orthobunyavirus y Simbu ha resultado difícil, se identifican al menos dieciocho miembros del serogrupo, incluido el SBV, que pertenecen a diferentes especies de virus, p. ej. el virus Simbu, el virus Sathuperi, el virus Douglas, el virus Shamonda, el virus Peaton, el virus Sango, el virus Akabane, el virus Sabo, el virus Tinaroo, el virus Yaba-7, el virus Aino, el virus Kaikalur, el virus Shuni, el virus Facey's Paddock, el virus Oropuche, el virus Utinga y el virus Utive (Nichol et al., 2005).
"Aminoácido" se refiere a los aminoácidos naturales y sintéticos. Los residuos de aminoácidos se abrevian como sigue: âlanina es A o Ala; Arginina es R o Arg; Asparagina es N o Asn; Ácido aspártico es D o Asp; Cisteína es C o Cys; Ácido glutámico es E o Glu; Glutamina es Q o Gln; Glicina es G o Gly; Histidina es H o His; Isoleucina es I o Ile; Leucina es L o Leu; Lisina es K o Lys; Metionina es M o Met; Fenilalanina es F o Phe; Prolina es P o Pro; Serina es S o Ser; Treonina es T o Thr; Triptófano es W o Trp; Tirosina es Y o Tyr; y Valina es V o Val. Excepto donde se defina lo contrario en la presente memoria, X o Xaa representan cualquier aminoácido. Otros aminoácidos relevantes incluyen, entre otros, 4-hidroxiprolina y 5-hidroxilisina. En todos los casos, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido descrito o al que se hace referencia de otro modo en la presente memoria se presenta en forma convencional, en la que el primer residuo de aminoácido de la secuencia, o que se encuentra más a la izquierda, es el residuo N-terminal y el último residuo de aminoácido de la secuencia, o que se encuentra más a la derecha, es el residuo C-terminal.
Una "variante conservativa" de cualquier secuencia de ácido nucleico en particular incluye cualquier secuencia que tenga una o más sustituciones de codones degenerados en esa secuencia de ácido nucleico en particular, cualquier secuencia que tenga una o más sustituciones, inserciones y deleciones de nucleótidos en esa secuencia de ácido nucleico en particular, y la secuencia complementaria de ese ácido nucleico particular y las variantes conservativas de esa secuencia complementaria. Las variantes conservativas de una secuencia de ácido nucleico particular tienen preferiblemente al menos aproximadamente un 78 % de identidad, más preferiblemente tienen al menos aproximadamente un 90 % de identidad e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 95-99 % de identidad con esa secuencia de ácido nucleico particular. Las variantes conservativas de una secuencia de ácido nucleico particular pueden sintetizarse artificialmente o pueden aislarse en su forma natural a partir de un organismo.
Una "variante conservativa" de cualquier secuencia polipeptídica en particular es cualquier polipéptido (péptido) que tiene una secuencia de aminoácidos que varía de la secuencia de aminoácidos de ese polipéptido en particular, pero aún conserva las propiedades de unión específicas de ese polipéptido en particular, de modo que un anticuerpo de la presente descripción que se genera contra el polipéptido particular es capaz de unirse específicamente al polipéptido variante. Por lo tanto, por ejemplo, una variante conservativa de un polipéptido particular puede tener una o más sustituciones, deleciones, adiciones e inserciones de aminoácidos en ese polipéptido particular. Por ejemplo, una variante conservada de un polipéptido particular puede tener 30 o menos, 25 o menos, 20 o menos, 15 o menos, 10 o menos, o 5 o menos, sustituciones de aminoácidos conservadas para ese polipéptido particular. Las variantes conservativas de un polipéptido particular preferiblemente, pero no esencialmente, tienen al menos aproximadamente un 78 % de identidad, más preferiblemente tienen al menos aproximadamente un 90 % de identidad, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 91-99 % de identidad, con ese polipéptido particular. Un porcentaje de identidad para cualquier secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de interés (p. ej., cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria) en relación con otra secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos "diana" puede determinarse como sigue. En primer lugar, una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos diana de la descripción se puede comparar y alinear con una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos de interés, usando el programa BLAST 2 Sequences (B12seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene BLASTN y BLASTP (p. ej., la versión 2.0.14). La versión independiente de BLASTZ se puede obtener en www.ncbi.nlm.nih.gov. Las instrucciones que explican cómo usar BLASTZ, y específicamente el programa B12seq, se pueden encontrar en el archivo “léame” que acompaña a BLASTZ. Los programas también se describen con detalle en Karlon et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2264; Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873; y Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389.
Como se usa en la presente memoria, el término "péptido" se refiere a una sola cadena de aminoácidos que consta de entre 5 y 50 aminoácidos, preferiblemente de 5 a 40, más preferiblemente de 5 a 20 aminoácidos, más preferiblemente de 12 a 16 aminoácidos y más preferiblemente 5 a 7 aminoácidos.
Los péptidos de la presente descripción preferiblemente son capaces de provocar una respuesta inmunitaria en un animal huésped y/o son capaces de unirse a un anticuerpo presente en una muestra de un animal infectado debido a una respuesta inmunitaria después de la infección.
Además, como parte de la descripción, "anticuerpo" o "anticuerpos" se refiere a anticuerpos y antisueros monoclonales y/o policlonales que se pueden aplicar en los métodos, ensayos y kits de prueba de la descripción. Estos anticuerpos funcionan como anticuerpos de detección primarios o secundarios. Estos anticuerpos se pueden marcar para visualizar el resultado de la prueba. Los anticuerpos se aplican a concentraciones conocidas por el experto en el contexto de los métodos de detección. Preferiblemente, los anticuerpos se aplican a una concentración de 0,1 pg/ml -5,0 pg/ml
Los anticuerpos aplicados en la presente descripción pueden pertenecer a cualquier clase de anticuerpos, incluidos, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y pueden prepararse mediante cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por el experto. (Véase, por ejemplo, Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol.
32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn et al., Alethods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12: 125-68 (1992); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Laboratorio Cold Spring Harbor (1988); y Making and Using Antibodies: A Practica1Handbook, Howard y Kaser, eds., CRC Press (2006), cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.)
Un "epítopo" es el determinante antigénico de un péptido que comprende una secuencia de SBV o del virus del grupo Simbu o un virus de este grupo que se reconoce por unirse mediante un paratopo a anticuerpos específicos de dicho polipéptido de SBV. Los anticuerpos en el contexto de la descripción reconocen epítopos particulares que tienen una secuencia de 3 a 11, preferiblemente de 5 a 7 aminoácidos. El anticuerpo puede caracterizarse además por su afinidad de unión al péptido aplicado en los métodos y kits de la descripción, y la afinidad de unión está en el rango de 10-9 a 10-10 mM. Los anticuerpos particulares usados en la descripción son anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra anticuerpos y aplicados como anticuerpos de detección. "Epítopo" también puede denominarse región inmunodominante (IDR). En la presente descripción, un "epítopo" se localiza en un péptido según la descripción.
El término "marcador", como se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto, composición o soporte sólido detectable, que se puede conjugar directa o indirectamente (por ejemplo, a través de medios covalentes o no covalentes, solo o encapsulado) a un anticuerpo monoclonal. El marcador puede ser detectable por sí mismo (p. ej., marcadores de radioisótopos, colorantes quimioluminiscentes, marcadores electroquímicos, quelatos metálicos, partículas de látex o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable (por ejemplo, enzimas tales como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y similares). El marcador empleado en la descripción actual podría ser, pero sin limitación, fosfatasa alcalina; glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ("G6PDH"); peroxidasa de rábano (HRP); agentes quimioluminiscentes como isoluminol, agentes fluorescentes como fluoresceína y compuestos de rodamina; ribozimas; y tintes. El marcador también puede ser una molécula de unión específica que en sí misma puede ser detectable (por ejemplo, biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina, maltosa, oligohistidina, 2,4-dinitrobenceno, fenilarsenato, ssADN, dsADN y similares). La utilización de una etiqueta produce una señal que se puede detectar por medios tales como detección de radiación electromagnética o visualización directa, y que opcionalmente se puede medir.
Un anticuerpo monoclonal se puede unir a un marcador usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. P.ej., Immunochemical Protocols; Methods in Molecular Biology, vol. 295, editado por R. Bums (2005). El conjugado de anticuerpo monoclonal detectable puede usarse en cualquier formato de prueba de diagnóstico conocido como ELISA o un formato de ensayo competitivo para generar una señal relacionada con la presencia o cantidad de un anticuerpo específico de SBV en una muestra de prueba.
"Unión sustancial" o " unirse sustancialmente" se refiere a una cantidad de unión específica o reconocimiento entre moléculas de una mezcla de ensayo bajo condiciones de ensayo particulares. En su aspecto más amplio, la unión sustancial se relaciona con la diferencia entre la incapacidad de una primera molécula de unirse o reconocer una segunda molécula, y la capacidad de la primera molécula de unirse o reconocer una tercera molécula, de modo que la diferencia sea suficiente para permitir que se lleve a cabo un ensayo significativo para distinguir la unión específica bajo un conjunto particular de condiciones de ensayo, que incluye las concentraciones relativas de las moléculas y el tiempo y la temperatura de una incubación. En otro aspecto, una molécula es sustancialmente incapaz de unirse o reconocer otra molécula en un sentido de reactividad cruzada cuando la primera molécula exhibe una reactividad hacia una segunda molécula que es inferior al 25 %, preferentemente inferior al 10 %, más preferentemente inferior al 5 % de la reactividad exhibida hacia una tercera molécula bajo un conjunto particular de condiciones de ensayo, que incluye la concentración relativa y la incubación de las moléculas. La unión específica se puede probar utilizando una serie de métodos ampliamente conocidos, por ejemplo, un ensayo inmunohistoquímico, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de transferencia de Western.
Una "muestra biológica" se refiere a una muestra de un sujeto animal que incluye saliva, sangre completa, suero, plasma, leche u otra muestra que se sabe que contiene anticuerpos anti-SBV. Una muestra biológica se puede recolectar y almacenar mediante cualquier medio conveniente que no afecte a la capacidad de la muestra de ser analizada en el método de la descripción. Las muestras para el uso en el método de la descripción pueden requerir la preparación antes de su uso en el método. Por ejemplo, es posible que sea necesario precipitar, diluir, filtrar o centrifugar las muestras para eliminar los componentes indeseados, o se pueden añadir componentes a la muestra, como sales, detergentes o proteínas adicionales.
El término "soporte sólido" o "fase sólida" se refiere a una matriz no acuosa a la que se puede adherir un polipéptido de SBV o de un virus del grupo Simbu mediante unión covalente o no covalente. Los ejemplos de soporte sólido incluyen los soportes formados total o parcialmente por vidrio (p. ej., vidrio de poro controlado), polímeros sintéticos y naturales, polisacáridos (p. ej., agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, poli(alcoholes vinílicos) y siliconas, partículas magnéticas, partículas de látex, tiras cromatográficas, placas de poliestireno de microtitulación, o cualquier otra sustancia que permita lavar o separar los antígenos unidos de los materiales sin unir. En ciertas realizaciones, dependiendo de la aplicación, el soporte sólido puede ser el pocillo de una placa de ensayo o puede ser una columna de purificación (p. ej., una columna de cromatografía de afinidad).
Como se usa en la presente memoria, el término "kit" o "kits de ensayo" (p. ej., artículos de fabricación) se refiere a un conjunto de compuestos útiles y otros medios como placas de soporte sólido o tiras reactivas para detectar la infección por SBV o un virus del grupo Simbu en una muestra de mamífero, preferiblemente rumiantes. Por lo tanto, un kit puede incluir uno o más dispositivos y/o composiciones de la presente descripción. En un ejemplo particular, dicho kit incluye el dispositivo que tiene una proteína de SBV inmovilizada, un fragmento de la misma o un péptido, y que comprende uno o más anticuerpos de captura y otros reactivos útiles como el reactivo de lavado, así como el reactivo detector y los reactivos de control positivo y negativo, si se desea o es apropiado. En dichos kits de prueba pueden incluirse otros componentes tales como tampones, controles y similares, conocidos por los expertos en la técnica. Las cantidades relativas de los diversos reactivos se pueden variar para proporcionar concentraciones en disolución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, generalmente liofilizados, que al disolverse proporcionarán una disolución de reactivo que tendrá las concentraciones apropiadas para combinarla con una muestra. El presente kit puede incluir además instrucciones para llevar a cabo uno o más métodos de la presente descripción, incluidas instrucciones para usar cualquier dispositivo y/o composición de la presente descripción que se incluye con el kit. A continuación, se describirán con más detalle los aspectos particulares de la descripción.
En un aspecto, la descripción es un péptido aislado que comprende o consiste en 5 a 50 aminoácidos de la proteína de la nucleocápside del SBV, preferiblemente de 5 a 40, más preferiblemente de 5 a 20 aminoácidos, aún más preferiblemente de 12 a 16 aminoácidos, incluso más preferiblemente de 5 a 7 aminoácidos, preferiblemente según SEQ ID N° 2 a 138 (Tabla 1), o un fragmento del mismo o que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con una de SEQ ID N° 2 - 138, preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 98% de identidad de secuencia.
En una realización preferida de la descripción, el péptido aislado cubre la posición de aminoácidos 16 a 58 de la Figura 1 (SEQ ID N2: 1), preferiblemente 16 a 32, 16 a 24, 18 a 35, 20 a 36, 35 a 50, 61 a 85, o 170 a 205, preferiblemente 170 a 190 de la proteína N de la nucleocápside (Np) de SBV, más preferiblemente 25 a 50, 61 a 85, 103 a 118 o 166 a 232, preferiblemente 166 a 205 o 170 a 190 de la proteína N de la nucleocápside (Np) de SBV. Los péptidos aislados preferidos adicionales de la descripción se describen en los Ejemplos, Figuras y/o listado de secuencias. Dichos péptidos se pueden aplicar en un formato de prueba adecuado como péptidos individuales o en una combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis o múltiples péptidos. Cualquier combinación de péptidos de este tipo está dentro de la esencia de la descripción y dará como resultado resultados positivos con respecto a la selectividad y la especificidad.
Además, los péptidos pueden variar debido a las variaciones entre especies. En una realización preferida, los péptidos tendrán al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 % e incluso más preferiblemente al menos un 98 % de identidad de secuencia con los péptidos como se describe en los Ejemplos, Figuras, Tablas y listado de secuencias.
En otra realización preferida, la descripción es una mezcla de péptidos que comprende al menos dos péptidos según la descripción.
Los péptidos de la descripción se caracterizan porque el péptido comprende o consiste en un epítopo que se une específicamente a un anticuerpo producido por un animal infectado con SBV o un virus del serogrupo Simbu.
En una realización preferida, los péptidos aislados según la descripción se unen específicamente a anticuerpos de origen bovino y ovino.
Los péptidos de la descripción, solos o en combinación, se pueden usar ventajosamente para un ensayo de péptidos para identificar la infección por SBV. Los péptidos mostrarán resultados superiores con respecto a la especificidad y selectividad.
Se pueden lograr resultados particularmente buenos con un péptido según SEQ ID N°: 2 a 138.
Los péptidos particularmente preferidos de la descripción son los siguientes péptidos de SEQ ID N°: 1: NPEVGYVAFIGKYGQQLNFGVA, NPEVGYVAFIGKYGQQ, VGYVAFIGKYGQQLNF, VAFIGKYGQQLNFGVA, NPEVGYV, EVGYVAF, VAFIGKY, FIGKYGQ, GKYGQQL, YGQQLNF, QQLNFGV, QLNFVA, LLNGNF, GVQLNFGQ , YGQQL, KYGQQ, GKYGQ, IGKYG, FIGKY, AFIGK, VAFIG, YVAFI, GYVAF, VGYVA, EVGYV, PEVGY, NPEVG, LRQRYGTMTAEEWMTQKIT, GFSPAARTFLQQFGIN, LRQRYGT, QRYGTMT, YGTMTAE, TMTAEEW, TAEEWMT, EEWMTQK, GFSPAARTQKIT, SPAQ , RTFLQQF y LQQFGIN. Se pueden usar uno o más péptidos en una prueba de diagnóstico, o pueden estar comprendidos en una secuencia más larga, y se prefieren al menos dos péptidos, dos, tres o cuatro péptidos de esta lista.
Una realización preferida adicional de la descripción se refiere a un péptido aislado que comprende de 5 a 50 aminoácidos, preferiblemente de 5 a 40, más preferiblemente de 5 a 30, 35 o 40 y que tiene al menos una de las SEQ ID N°: 2 a 138 contenida en él.
Las realizaciones de la descripción se relacionan con uno o más péptidos aislados como se describe en la presente memoria, en los que el péptido comprende o consiste en un epítopo que se une específicamente a un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo policlonal o monoclonal, producido por un animal infectado con SBV o un virus del serogrupo Simbu. El péptido aislado preferentemente se une específicamente a anticuerpos de origen bovino y ovino.
Si bien todos los formatos de detección conocidos pueden aplicarse en principio a la prueba, se preferirán ciertos formatos de prueba en vista de aspectos prácticos como la facilidad para realizarlos y el suministro de kits de prueba. En una realización preferida, ventajosamente se pueden lograr buenos resultados en un formato de ELISA indirecto conocido por el experto, por lo que no es necesario describirlo en detalle en la presente memoria. Más preferido es un ELISA de una sola etapa que tiene la ventaja de que todos los reactivos y la muestra se pueden mezclar en un proceso de una sola etapa. En las Figura 3B y 4B se representan varios péptidos preferidos útiles en las pruebas según la descripción y los formatos descritos. Se resumen detalles adicionales en cuanto a la secuencia y producción de los péptidos en los Ejemplos, Tablas, Figuras y/o las secuencias como se representan en la presente memoria y se resumen en una lista de secuencias.
En otro aspecto, la descripción se relaciona con un método para producir uno o más péptidos como se describió anteriormente.
En una realización preferida, la descripción se refiere a un método in vitro para identificar un animal no humano infectado con SBV o un virus del serogrupo Simbu que comprende las etapas de: i. poner en contacto una muestra con uno o más péptidos de la descripción de SBV en condiciones en las que se puede formar un complejo de un anticuerpo específico contra SBV o contra un virus del serogrupo Simbu de la muestra y el péptido; ii. detectar el complejo así formado con un anticuerpo específico contra el anticuerpo del complejo o un péptido marcado según la descripción en donde la detección del complejo es indicativa de una infección por SBV o un virus del serogrupo Simbu.
En una realización preferida, el método de identificación es un ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), preferiblemente un método de múltiples etapas y más preferiblemente un método de una sola etapa. La descripción logra una sensibilidad de más del 95 %, preferiblemente más del 96 %, incluso más preferiblemente más del 97 % y una especificidad de más del 97 %, preferiblemente más del 98 %, e incluso más preferiblemente más del 99 % con los péptidos según la descripción, preferiblemente los de SEQ ID N° 2 a 138, más preferiblemente los de SEQ ID N2: 2 a 75.
Las muestras que se pueden usar en los métodos, ensayos y kits de prueba de la descripción son de suero, plasma o leche, preferiblemente de rumiantes, y son particularmente útiles para detectar infecciones en ganado bovino, ovino o caprino.
En otro aspecto, la descripción se refiere a un kit para la detección de una infección por SBV o un virus del serogrupo Simbu en una muestra que comprende
i. uno o más péptidos de la descripción como se describió anteriormente; y
ii. un medio para la detección de un complejo formado entre el péptido y un anticuerpo específico contra el SBV o un virus del serogrupo Simbu
El kit puede contener reactivos listos para usar y los resultados de la prueba se obtienen ventajosamente en varias horas, preferiblemente en menos de 6 horas, preferiblemente en menos de 5, más preferiblemente en menos de 4 horas.
El factor de dilución de la muestra es preferiblemente inferior o igual a 50x, preferiblemente 30x, preferiblemente 20x, preferiblemente 10x, lo que evita ventajosamente más etapas de dilución.
El kit contiene preferiblemente todos los reactivos listos para usar, incluidas placas recubiertas, controles negativos y positivos, disolución de lavado, diluyente de muestra, conjugado, TMB y disoluciones de parada.
El antígeno peptídico aplicado es preferiblemente un antígeno que se conserva entre los virus del grupo Simbu y, por lo tanto, permite ventajosamente la detección de una infección del grupo pan-Simbu en una muestra.
En realizaciones preferidas, la fase sólida de la prueba se recubre con antígeno peptídico como se describió anteriormente. El antígeno peptídico puede sintetizarse químicamente o expresarse en E. coli. En el método y kit de prueba se puede usar cualquier fase sólida conocida y útil, preferiblemente se usa MaxiSorp o PolySorp (Thermo Fisher Scientific) y se recubre aplicando un tampón de recubrimiento que tiene preferiblemente un pH de 5, 7 o 9,5. El antígeno se aplica en una cantidad de 0,1, 0,5, 1, 2, 3 ó 4 pg/ml. Puede ser útil aplicar una disolución de bloqueo conocida en la técnica pero se prefiere evitar una disolución de bloqueo.
Como diluyente de la muestra se puede utilizar NaCl 0,14 M, KCl 2,7 mM, Kathon 0,03 %, Tween20 0,1 %. Otro diluyente útil según la descripción es MgCl2 al 2%, Tween20 al 6% y AO al 6%, sal sódica de caseína al 0,5%.
El anticuerpo de detección se diluye 1:10000, preferiblemente 1:20000.
Las etapas del método se aplicarán según sean necesarias, y pueden variar según los reactivos particulares aplicados. En una realización preferida, las condiciones y las etapas del método son las siguientes:
Muestra (1:10) en diluyente de muestra (MgCl22 %, AO 6 %, Tween206 %, Caseína 0,5 %), 100 pl/pocillo Incubar 1 h, temperatura ambiente en cámara húmeda
3x lavado (solución salina tamponada con fosfato con Tween20 al 0,1 %)
Conjugado listo para usar, 100 pl/pocillo
Incubar 1 h, temperatura ambiente en cámara húmeda
3x lavado (solución salina tamponada con fosfato con Tween20 al 0,1 %)
TMB 100 pl/pocillo, incubar 10 min, temperatura ambiente
Añadir disolución de parada (100 pl/pocillo) y
Lectura a 450 nm
En realizaciones particularmente preferidas, el diluyente de la muestra contiene sal sódica de caseína a una concentración de entre 0,1 y 0,55 %, preferiblemente 0,1 %, más preferiblemente 0,55 %. En realizaciones preferidas, el diluyente de la muestra contiene un 0,5 % de sal sódica de caseína y MgCl2, preferiblemente el MgCl2 tiene una concentración del 2 %.
En una realización preferida, el método de detección, y preferiblemente también el kit, se caracteriza por la inclusión de compuestos específicos, el uso de diluciones particulares del antígeno de captura y/o una cantidad y calidad particular del antígeno de captura recubierto sobre el soporte sólido utilizado en el método de detección y el kit de la descripción.
Se pudo demostrar que por medio de la combinación particular de preferiblemente las condiciones de purificación y/o las condiciones de dilución y/o los componentes particulares incluidos en el método de detección y el kit, se pudo conseguir un rendimiento mejorado del método de detección de SBV y preferiblemente de virus del serogrupo Simbu.
Todos los miembros de este grupo podrían detectarse con el método de la descripción. Se detectan preferentemente ciertos virus: virus Schmallenberg, virus Shamonda, virus Douglas, virus Peaton, virus Akabane, virus Aino, virus Oropouche, virus Tinaroo, virus Shuni. Se lograron resultados particularmente preferidos y particularmente buenos con las siguientes especies: Peaton, Akabane, Aino, Tinaroo. En una realización particularmente preferida, se detectan los virus del serogrupo Simbu de Bovidae, Cervidae y Camelidae.
En una realización particularmente preferida, la dilución del péptido de la descripción se eligió para que estuviera en la disolución de recubrimiento a una concentración de 0,25 a 5 pg/ml, preferiblemente 0,5 a 1 pg/ml. La preparación de péptido inventiva a su dilución particular demostró ser ventajosa.
Además, la ventaja de la prueba y el kit según la descripción que se describe en la presente memoria no solo es evidente a partir de los resultados positivos de la prueba que se pueden lograr con la prueba como tal. Es más evidente en comparación con los kits de prueba del mercado a día de hoy, es decir, agosto de 2013. En particular, la descripción actual y el método de detección en las realizaciones preferidas es superior a las pruebas de SBV del estado de la técnica, como la prueba ID-Vet. y el kit descritos anteriormente en la sección de antecedentes.
Otra realización preferida utiliza caseína en el método de detección y preferiblemente en el kit. Cualquier caseína disponible en el mercado se puede aplicar a una concentración que se puede adaptar según las necesidades de los otros compuestos y para lograr buenos resultados de detección en la prueba. Preferiblemente, la concentración en una disolución de la prueba es del 0,1 al 1 %, preferiblemente del 0,25 al 0,75 %, más preferiblemente del 0,5 %. En una realización preferida, la caseína está presente en los diluyentes de la muestra.
La etapa de recubrimiento se realiza preferentemente a un pH de 5 a 10, preferentemente de aproximadamente 5, 7 o 9,5.
El péptido de recubrimiento como se describe en la memoria descriptiva y los Ejemplos, se usa en cantidades de 0. 1.0.5, 1, 2 ó 4 pg/ml, preferiblemente 1 pg/ml.
Otra realización preferida usa solo o además Aminoxid (AO). Preferiblemente, la concentración utilizada en una disolución del método está en una cantidad de 3 a 10 %, preferiblemente de 5 a 8 %, más preferiblemente de 6 %. Otra realización preferida del método de detección y kit contiene Tween, preferiblemente Tween20, o una sustancia comparable, preferiblemente un detergente con características comparables. Esta sustancia está contenida en una cantidad de 0,05 a 0,5%, preferiblemente de 0,1 a 0,2%.
En una realización particularmente preferida, la disolución de lavado de la etapa de recubrimiento contiene preferiblemente NaCl 0,14 M, KCl 2,7 mM; Kathon 0,03 %, Tween20 0,1 %, el diluyente de muestra comprende MgCl2 al 2 %, Aminoxid (AO) al 6 %, Tween20 al 6 % y 0,5 % de caseína.
En una realización preferida, el conjugado anti-rumiante se usa en una dilución de 1:10.000 a 1:30.000, preferiblemente 1:20.000 en un tampón estabilizador de conjugado como un formato listo para usar (RTU).
En otra realización preferida, los compuestos descritos anteriormente pueden combinarse y conducirán a resultados de prueba particularmente buenos. En tal realización, los diversos compuestos están contenidos en cualquiera de las disoluciones utilizadas para la preparación de los compuestos del kit o durante la realización de la prueba, y pueden estar contenidos en el kit según la descripción.
Los inventores lograron sorprendentemente con una realización o una combinación de las realizaciones preferidas descritas anteriormente muy buenos resultados con respecto a la especificidad y la selectividad. No era previsible que pudieran obtenerse resultados tan buenos usando la preparación de antígeno particular a su dilución particular, lo que es particularmente ventajoso. Más ventajosa es la dilución del antígeno peptídico en relación con otros aditivos como caseína, Aminoxid y/o Tween, preferiblemente a las concentraciones descritas anteriormente.
La prueba detecta preferentemente los virus del serogrupo Simbu, puede detectar preferentemente el SBV en muestras bovinas, caprinas y ovinas.
El punto de corte se puede elegir de acuerdo con las necesidades de sensibilidad y especificidad. Se considera que la distribución se adapta a la idoneidad para el propósito. Esto dependerá de las necesidades de la prueba. Se utiliza ROC para el análisis. El punto de corte se elige de acuerdo con procedimientos estándar con respecto a un control positivo y negativo y los respectivos cálculos conocidos por el experto en la técnica y la bibliografía para el desarrollo de pruebas de diagnóstico.
Con el fin de optimizar la especificidad, el corte se elige preferiblemente en el 30% o más, 40% o más, 50% o más, o 60% o más.
Para optimizar la sensibilidad, el corte se elige preferiblemente en el 10% o más, 20% o más, 30% o más, o 40% o más.
Un corte óptimo para la prueba según la descripción es preferentemente del 40 %, más preferentemente entre el 30 y el 40 %.
La ventaja de las pruebas de la descripción es que en las realizaciones preferidas se puede lograr una especificidad de más del 97%, preferiblemente 98% y más preferiblemente más del 99%, y una sensibilidad de más del 94%, más preferiblemente más del 95% y más preferiblemente más del 96%. Las realizaciones particulares logran una especificidad de alrededor del 99,8% y una sensibilidad de alrededor del 95,8%. Con respecto a especies particulares, se pueden lograr las siguientes especificidades y sensibilidades, respectivamente: bovino: 99,5% y 95,7%; ovino: 100% y 99%; caprino: 100% y 99%.
En consecuencia, el método y el kit de prueba serán particularmente fiables para cabras, ovejas y ganado bovino para la detección de SBV. En una realización preferida, los buenos resultados también se aplicarán al serogrupo Simbu. En particular, se pueden lograr buenos resultados para detectar los virus Akabane, Peaton, Aino y Tinaroo. A continuación, la descripción se ilustrará por medio de ejemplos preferidos que no pretenden ser restrictivos en ningún sentido.
1. Un aspecto de la descripción se describe en los ejemplos a continuación.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Desarrollo de una prueba de cribado de primera generación para la detección de anticuerpos dirigidos contra el virus de Schmallenberg (ELISA del serogrupo Simbu)
En una primera etapa, se compararon las secuencias de varios Bunyavirus, lo que se desprende de la Tabla 1 a continuación. Los miembros del serogrupo Simbu mostraron una similitud de secuencia con la proteína N del SBV de al menos un 78 %.
Tabla1: Comparación de diferentes Bunyavirus que incluye las similitudes de secuencia para la
proteína de la nucleocápside
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La secuencia del clon de proteína N es idéntica a la secuencia SBV/1-846 presentada en la Tabla 2 a continuación. El clon contiene una etiqueta His adicional.
Expresión, purificación y biotinilación
El ADN del plásmido se usó para transformar células huésped bacterianas y expresar la proteína viral N (nucleocápside). Se estableció un sistema estándar de purificación por afinidad utilizando columnas de Ni (proteína N marcada con His). La proteína N muestra una fuerte tendencia a precipitar en disoluciones tamponadas, pero solo se usó la fracción soluble en tampón para una mayor purificación. Los tampones de unión y lavado contenían imidazol 10 mM para evitar la unión inespecífica de las proteínas contaminantes de E. coli a la columna de Ni. La proteína N se liberó de la columna aumentando la concentración de imidazol a 0,5 M en el tampón de elución. Las proteínas eluidas se usaron para experimentos de recubrimiento directo después de la eliminación de imidazol por diálisis frente a tampón carbonato de pH 9.
La biotinilación de la proteína N se realizó en tampón de carbonato alcalino. Se añadió biotina activada y se unió a la proteína N. El proceso de biotinilación se detuvo añadiendo tampón Tris y la biotina libre se eliminó mediante diálisis frente a tampón carbonato sin biotina. Este material se usó para experimentos de recubrimiento utilizando placas recubiertas previamente con estreptavidina (placas de IDEXX CoE en Westbrook, ME, EE. UU.).
Recubrimiento directo de la proteína en las placas:
La proteína N purificada (no biotinilada) se revistió sobre placas Maxisorp usando procedimientos estándar (tampón fosfato, incubación durante la noche a 4°C). Las placas se secaron y se analizaron muestras positivas y negativas de anticuerpos.
Protocolo de recubrimiento:
• Dilución de proteína N purificada en tampón fosfato de pH 7
• Adición de detergente a una concentración final de 15 pg/ml
• Incubación a temperatura ambiente durante 20 min con agitación
• Dilución adicional del antígeno tratado con detergente a una concentración final de 1 — 4 pg/ml en tampón fosfato
• Recubrimiento de placas Maxisorp con 100 pl/ pocillo
• Incubación durante la noche a 4 °C en cámara húmeda
• Aspiración de la disolución de recubrimiento y secado de las placas.
La FIGURA 1 muestra los resultados de la experimentación y es un ejemplo de titulación del antígeno (proteína N purificada no biotinilada) en tres tampones de recubrimiento diferentes (PBS pH 5; PBS pH 7; tampón carbonato de sodio pH 9,3) probados con un positivo (FLI Bov Pos.), uno negativo (Muestra Bov. NEG) y sin muestra/blanco. Ejemplo 2
Placas pre-recubiertas con estreptavidina y acoplamiento de la proteína N biotinilada a las placas
Las placas se recubrieron previamente con estreptavidina. Las placas de estreptavidina se incubaron con proteína N biotinilada durante la noche, se lavaron tres veces y no se secaron antes de ejecutar el protocolo de ELISA. La FIGURA 6 muestra un ejemplo de proteína N biotinilada utilizando una relación molar de 2:1 (biotina:proteína). Se analizaron tres muestras positivas y una muestra negativa. La muestra negativa (ID 792) también se usó en los experimentos de recubrimiento directo (cf. Ejemplo 1). Las muestras positivas son diferentes de las del ejemplo 1. El protocolo de ELISA es idéntico al protocolo descrito para el recubrimiento directo anterior del ejemplo 1.
La FIGURA 2 muestra que en ambos casos hay una buena diferenciación entre las muestras positivas y negativas en un rango de varias concentraciones de antígeno.
Ejemplo 3
Formato I de ELISA
En este formato se utiliza un recubrimiento directo de la proteína de la nucleocápside (N) de SBV recombinante. La proteína de recubrimiento puede ser una proteína de la nucleocápside de longitud completa o una versión truncada según SEQ ID N° 139 a 144. También se pueden aplicar en la prueba otras proteínas de SBV como se muestra en la lista de secuencias.
El formato es indirecto y monofásico, y el tipo de muestra puede ser suero, plasma o leche.
Las placas recubiertas se incuban con suero, plasma o leche a temperatura ambiente. Las muestras se pueden aplicar como muestras individuales en pocillos individuales, en una serie de diluciones y preferiblemente como duplicados o triplicados. La dilución de la muestra es preferiblemente 1:10 o 1:20. Después de la incubación durante alrededor de 10 a 90 minutos, preferiblemente alrededor de 30 a 60 minutos, las placas se lavan tres veces, preferiblemente con PBS. Para la detección, se aplica a la placa un anticuerpo conjugado con HRP anti-rumiante y se incuba durante alrededor de 10 a 90 minutos, preferiblemente alrededor de 30 a 60 minutos. Después se añade un sustrato de lavado 3x, preferiblemente TMB, durante aproximadamente 5 a 15 minutos, preferiblemente 10 minutos, y el resultado se lee a 450 nm. La placa está configurada para incluir pocilios para muestras y también para controles positivos y negativos.
La proteína de la nucleocápside recombinante se puede producir en E. coli o en un sistema de baculovirus. Los detalles en cuanto a la proteína de la nucleocápside utilizada según la descripción se representan en la lista de secuencias. Cualquiera de las proteínas de la nucleocápside enumeradas allí se puede aplicar en la prueba.
El recubrimiento se realiza a un pH de aproximadamente 5, 7 o 9,5 con o sin bloqueo, preferiblemente a pH 7. La proteína de recubrimiento se aplica en cantidades de 0, 1,2 o 4 gg/ml, preferiblemente 1 gg/ml.
La disolución de lavado contiene preferentemente NaCl 0,14 M, KCl 2,7 mM; Kathon 0,03 %, Tween20 0,1 %, el diluyente de la muestra comprende MgCl22 %, Aminoxid (AO) 6 %, Tween206 % y 0,5 % de caseína.
El conjugado anti-rumiante se usa a una dilución de 1:10.000 a 1:30.000, preferiblemente 1:20.000 en un tampón estabilizador de conjugado como formato listo para usar (RTU).
La prueba puede detectar SBV en muestras de bovinas, caprinas y ovinas.
Ejemplo 4
Formato II de ELISA — ELISA de una sola etapa
La proteína de SBV recombinante, preferiblemente la proteína de la nucleocápside como se describe en el formato I de ELISA, se acopla al soporte sólido a través de estreptavidina - biotina. Preferiblemente, la estreptavidina se acopla al soporte sólido y la proteína de SBV se acopla con biotina, lo que permite recubrir el soporte sólido a través del complejo estreptavidina-biotina que se forma.
El soporte sólido, p. ej. una placa multipocillo, está recubierto con estreptavidina. Las placas recubiertas con estreptavidina se incuban en una sola etapa con la proteína de SBV biotinilada (como se describió anteriormente; se hace referencia a la lista de secuencias de las proteínas de SBV en la presente memoria), la muestra (preferiblemente diluida como se describió anteriormente) y el anticuerpo monoclonal anti-rumiante conjugado con HRP. El anticuerpo HRP es preferiblemente una IgG. Después de la incubación durante aproximadamente 30 a 90 minutos, preferiblemente 1 hora, la placa se lava como se describió anteriormente y la lectura se realiza a 450 nm. Las placas de microtitulación se suministran recubiertas con estreptavidina. El tampón todo en uno contiene la proteína de la nucleocápside biotinilada y el conjugado anti-IgG. Las diluciones de las muestras a analizar se incuban en el tampón todo en uno en los pocillos de estas placas. Cualquier anticuerpo específico para SBV se une al antígeno en el tampón todo en uno y forma un complejo conjugado de antígeno/anticuerpo/anti-IgG en la superficie del pocillo de la placa de estreptavidina. El material sin unir se elimina de los pocillos mediante lavado. El sustrato que contiene TMB se añade a los pocillos. El grado de color que se desarrolla (densidad óptica medida a 450 nm) es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo específico para SBV presente en la muestra. Los resultados del ELISA de una sola etapa según la descripción en comparación con la prueba IDvet de la técnica anterior se ilustran en la Tabla 5
Ejemplo 5
Reconocimiento del serogrupo Simbu mediante ELISA (ELISA del grupo pan-Simbu)
Los formatos de prueba preferidos según la descripción son capaces de reconocer los anticuerpos formados después de la infección con diferentes miembros del serogrupo Simbu, es decir, la prueba es una prueba del grupo pan-Simbu. Véase también la Tabla 6.
Tabla 3: relación de los serogrupos de Orthobunyavirus
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En una realización preferida, la prueba es capaz de detectar los virus del serogrupo Simbu, en otra realización preferida Simbu y Bunyamwera, en otra realización preferida además del serogrupo California, alternativamente el serogrupo Simbu y California en una configuración de prueba.
Tabla 5: Resultados del ELISA de una etapa
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La Tabla 5 describe una comparación de muestras validadas en la prueba según la descripción con respecto a la prueba comercializada por IDvet.
Los resultados de la prueba muestran el rendimiento superior de la prueba y el método según la descripción.
Tabla 6
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NEG D B T POS
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La Tabla 6 muestra muestras bovinas validadas utilizadas en la prueba según la descripción. Confirma la detección de varios virus del serogrupo Simbu y, por lo tanto, confirma su utilidad como prueba de serogrupo pan Simbu. II. Otro aspecto de la descripción se describe en los ejemplos siguientes.
Ejemplo 1
identificación de péptidos que comprenden epítopos útiles para el establecimiento de una prueba de diagnóstico de péptidos
Mapeo PepScan de regiones epitópicas en proteínas virales Np de SBV.
Objetivo
Se realizó un estudio de mapeo de epítopos en las proteínas Np de SBV. El objetivo era identificar las regiones más inmunogénicas de estas proteínas virales para las 3 especies animales relevantes para el SBV: vaca, oveja y cabra. Protocolo
Se utilizó un enfoque PepScan, en el que se sintetizaron péptidos superpuestos a lo largo de las secuencias de proteínas. La síntesis de péptidos biotinilados fue realizada por NEP (New England Peptide, EE. UU.). Los péptidos biotinilados tenían una longitud de 16 aminoácidos con un solapamiento de 12 y 13 aminoácidos para Np, respectivamente (véanse las Tablas 1 a 4 para obtener información sobre la secuencia). La síntesis fue exitosa para todos los péptidos solicitados excepto para los péptidos número B10, D08, G05, H06 y H07 que fueron excluidos del análisis.
Los péptidos biotinilados se revistieron sobre placas de estreptavidina usando un protocolo estándar. Se analizó la reactividad de cada péptido en muestras de suero positivas y negativas para SBV caracterizadas de las tres especies animales relevantes para SBV. Además, se evaluó la reactividad de control con Np recombinante de longitud completa (rNP) en la misma placa para cada muestra. Los estudios de optimización preliminares condujeron a la identificación de las condiciones experimentales que permiten una buena diferenciación entre muestras positivas y negativas con un fondo limitado: dilución de muestra, diluyente de muestra y dilución de conjugado. El formato ELISA utilizado fue el clásico formato ELISA indirecto. Brevemente, después del recubrimiento con péptido durante 1 h a temperatura ambiente (TA), se lavaron las placas con estreptavidina. El suero bovino, ovino o caprino a analizar se añadió posteriormente a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron y se añadió un anticuerpo anti-rumiante conjugado con HRP y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron de nuevo antes de añadir el sustrato TMB. El desarrollo del color se detuvo después de 10 minutos y las densidades ópticas (DO) se midieron a 450 nm usando un espectrofotómetro.
Los sueros utilizados como muestras negativas se originaron en los EE. UU. Resultó claramente negativo en la prueba de anticuerpos IDEXX Schmallenberg (comercializada en 2013) y también mostró una reactividad muy baja en placas de estreptavidina recubiertas con rNP de longitud completa.
Tabla 1. Secuencia de péptidos sintetizados para la proteína Np de SBV.
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Resultados obtenidos con muestras bovinas
El primer enfoque se centró en los sueros bovinos. En los primeros experimentos de detección, se analizaron un total de 4 sueros bovinos positivos para SBV (líneas de colores) y 5 negativos para SBV (líneas negras) en todos los péptidos, así como en la nucleoproteína de longitud completa (rNP). Los resultados se resumen en la Figura 1. Todas las muestras positivas muestran una fuerte reactividad en el control de longitud completa de rNP, mientras que las muestras negativas muestran una reactividad muy baja, como se esperaba. Se pudieron identificar varios péptidos Np o regiones epitópicas donde un subconjunto de muestras positivas se une mucho más intensamente que todas las muestras negativas (por ejemplo, A09, A10, B03, B11, B12, C11, E10, E11, F04). No se identificaron epítopos individuales que mostraran reactividad con todas las muestras bovinas.
Luego, los péptidos seleccionados se probaron nuevamente con más sueros usando una concentración de conjugado más fuerte como confirmación (Figura 3B).
Resultados obtenidos con muestras ovinas
A continuación, los sueros ovinos se analizaron con todos los péptidos Np, siguiendo el mismo procedimiento (Figura 4). Primero se seleccionó un total de n = 6 sueros de oveja positivos para SBV y 6 negativos para determinar la reactividad con todos los péptidos. En este primer cribado se identificaron varios aciertos potenciales. Aunque ningún resultado único pudo ajustarse a todas las muestras positivas, algunos resultados mostraron una fuerte reactividad para varios sueros positivos en comparación con los sueros negativos (p. ej., E09). La región C-terminal (a partir de E07) mostró una mayor concentración de aciertos potenciales.
Los péptidos de la región C-terminal de Np a partir de E07 se analizaron de nuevo con más sueros (Figura 4B, n=7 negativos y n=9 sueros positivos para SBV). Varios sueros positivos mostraron una fuerte reactividad confirmada en los péptidos E08-E09, E11, F01-F02 F04 y F12-G01 en comparación con los sueros negativos.
Resumen de los epítopos identificados
Se identificaron varios péptidos útiles con epítopos potenciales de Np que presentaban utilidad diagnóstica, en particular para vacas y ovejas (véanse las Tablas 2 y 3, justo debajo). Las regiones epitópicas identificadas también se resumen en la Figura 6B.
En particular, son útiles los péptidos A09 a A11 y B03. Esto indica que un péptido con una posición de aminoácido en la proteína Np de la posición 25 a 58 será particularmente útil en una prueba de diagnóstico según la descripción. Se prefiere un péptido o una mezcla de péptidos que comprende varios péptidos con una longitud de entre 7 y 20 aminoácidos que cubren, preferiblemente que comprenden la posición de aminoácidos 16 - 32, 25 - 45, 30 - 50, 35 -55 o 38 - 58 o fragmentos de los mismos que contienen 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos.
Las secuencias que se muestran en la Tabla 1 representan péptidos que tienen potencial de utilidad en una prueba de diagnóstico para identificar la infección por SBV en ungulados, preferiblemente en vacas y ovejas, más preferiblemente tales péptidos pueden usarse para procesar e identificar de manera similar muestras de vacas y ovejas. En otra realización preferida, se puede usar una prueba que aplica dichos péptidos para identificar un animal infectado con un virus del serogrupo Simbu.
Los péptidos y fragmentos de los mismos particularmente preferidos son los péptidos A06 a A11, más preferiblemente los péptidos A07, A08, A09. Los péptidos que muestran resultados particularmente buenos en una prueba son las secuencias completas o fragmentos de las secuencias que se muestran en la Tabla 1 , en particular las de los péptidos A07 y A08. Otros péptidos preferidos son F01 a F12 y G01 a G02, más preferiblemente F01, F03 y G01 de la Tabla 1.
El experto apreciará que el péptido que se muestra en la Tabla 1 muestra 16 aminoácidos, sin embargo, será suficiente usar péptidos más cortos siempre que esté contenido un tramo de al menos 5 a 7 aminoácidos que representa un epítopo o una parte significativa de un el epítopo, p. ej. de A07 o A08, que muestra una característica de unión positiva y específica hacia un anticuerpo formado en un animal después, p. ej., de la infección por un virus del serogrupo Simbu o SBV.
Los péptidos particularmente preferidos y útiles en una prueba peptídica de diagnóstico como se describe en este documento son péptidos que comprenden o consisten en la secuencia NPEVGYVAFIGKYGQQLNFGVA, preferiblemente NPEVGYVAFIGKYGQQ (SEQ ID N2: 76), VGYVAFIGKYGQQLNF (SEQ ID N2: 77) o VAFIGKYGQQLNFGVA (SEQ ID N2: 78). ), más preferiblemente NPEVGYV (SEC ID N2: 79), EVGYVAF (SEC ID N2: 80), VAFIGKY (SEC ID N2: 81), FIGKYGQ (SEC ID N2: 82), GKYGQQL (SEC ID N2: 83), YGQQLNF (SEQ ID N2: 84), QQLNFGV (SEQ ID N2: 85), o QLNFGVA (SEQ ID N2: 86), e incluso más preferiblemente NFGVA (SEQ ID N2: 87), LNFGV (SEQ ID N2: 88), QLNFG (SEC ID N2: 89), QQLNF (SEC ID N2: 90), GQQLN (SEC ID N2: 91), YGQQL (SEC ID N2: 92), KYGQQ (SEC ID N2: 93), GKYGQ (SEC ID N2: 94), IGKYG (SEC ID N2: 95), FIGKY (SEC ID N2: 96), AFIGK (SEC ID N2: 97), VAFIG (SEC ID N2: 98), YVAFI (SEC ID N2: 99), GYVAF ( SEC ID N2: 100), VGYVA (SEC ID N2: 101), EVGYV (SEC ID N2: 102), PEVGY (SEC ID N2: 103) o NPEVG (SEC ID N2: 104).
Los péptidos particularmente preferidos y útiles en una prueba peptídica de diagnóstico como se describe en la presente memoria son péptidos que comprenden o consisten en la secuencia LRQRYGTMTAEEWMTQKIT y GFSPAARTFLQQFGIN, preferiblemente fragmentos de los mismos, p. ej. LRQRYGT (SEC ID N°: 105), QRYGTmT (SEC ID N2: 106), YGTMTAE (SEC ID N2: 107), TMTAEEW (SEC ID N2: 108), TAEEWMT (SEC ID N2: 109), EEWMTQK (SEC ID N2 : 110), WMTQKIT (SEC ID N2: 111), GFSPAAR (SEC ID N2: 112), SPAARTF (SEC ID N2: 113), AARTFLQ (SEC ID N2: 114) o RTFLQQF (SEC ID N2: 115), LQQFGIN (SEC ID N2: 116).
Además, los inventores pudieron identificar algunos motivos centrales de la proteína Np que representan secuencias de aminoácidos útiles para la identificación de una infección por virus en el sentido de la solicitud, p. ej., una infección por VSB.
Dichos motivos de secuencia son preferiblemente FFLN (Bov 43-46) (SEQ ID N°: 117) o VFFLN (Bov 42-46) (SEQ ID N2: 118) o FFLNQ (Bov 43-47) (SEQ ID N2: 119), MDVNPMKKVLRQR (Bov/Ov 172-184) (SEQ ID N2: 120), MKKVLRQR (Bov/Ov 177-184) (SEQ ID N2: 121), LRQR (Bov/Ov 181-184) (SEQ ID N2: 122) o LRQRYGTMTA (Bov/Ov 181-190) (SEQ ID N2: 123).
Los péptidos que comprenden o consisten en los motivos de secuencia anteriores o las secuencias de aminoácidos que comprenden dichos motivos de secuencia con menos de 50 aminoácidos, preferiblemente entre 4 y 40, preferiblemente con 4 a 25, preferiblemente con 4 a 16 aminoácidos serán útiles en la identificación de la detección de una infección por SBV en una muestra. Se pueden aplicar pruebas habituales para mostrar la utilidad ventajosa para la detección de una infección por SBV u otra infección por virus del grupo Simbu, la detección de SBV más preferida.
En otra realización preferida, la descripción se relaciona con un péptido aislado que comprende de 5 a 50 aminoácidos y que contiene al menos una de las SEQ ID N° 2 a 138.
Otras secuencias de aminoácidos y epítopos preferidos o/y secuencias de aminoácidos que comprenden epítopos útiles se representan en las Tablas 2 y 3 a continuación.
Tabla 2. Regiones de epítopos de vaca preferidas útiles para una prueba de diagnóstico
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Tabla 3. Regiones de epítopos de oveja preferidas útiles para una prueba de diagnóstico
Figure imgf000029_0002
Además de las Tablas, la Figura 6B resume las regiones consenso epitópicas identificadas de tramos de aminoácidos útiles de la descripción.
A continuación se representan secuencias útiles adicionales que son realizaciones preferidas adicionales útiles para la detección de SBV en un ELISA peptídico o formatos de prueba comparables, o en una realización preferida estos péptidos son útiles en una prueba del grupo pan-Simbu.
Secuencias de la proteína de la nucleocápside reconocidas por sueros bovinos y ovinos de animales infectados con SBV (realizaciones preferidas de la descripción):
Bov 25-85 (SEQ ID N2: 124)
VAFIGKYGQQLNFGVARVFFLNQKKAKMVLHKTAQPSVDLTFGGVKFTWNNHFPQY VSNP
Bov 25-58 (SEQ ID N2: 125)
VAFIGKYGQQLNFGVARVFFLNQKKAKMVLHKTA
Bov 25-46 (SEQ ID N2: 126)
VAFIGKYGQQLNFGVARVFFLN
Bov 43-58 (SEQ ID N2: 127)
FFLNQKKAKMVLHKTA
Bov 61-85 (SEQ ID N2: 128)
SVDLTFGGVKFTVVNNHFPQYVSNP
Bov 103-118 (SEQ ID N2: 129)
WIADTCKASVLKLAEA
Bov+ Ov 166-232 (SEQ ID N2: 130)
RVLKDNMDVNFMKKVLRQRYGTMTAEEWMTQKITEIKAAFNSVGQLAWAKSGFS PAARTFLQQFGIN
Bov Ov 166-205 (SEQ ID N2: 131)
RVLKDNMDVNFMKKVLRQRYGTMTAEEWMTQKITEIKAAF
Bov Ov 166-184 (SEQ ID N2: 132)
RVLKDNMDVNFMKKVLRQR
Bov Ov 172-205 (SEQ ID N2: 133)
MDVNFMKKVLRQRYGTMTAEEWMTQKITEIKAAF
Bov Ov 172-190 (SEQ ID N2: 134)
MDVNFMKKVLRQRYGTMTA
Bov Ov 175-190 (SEQ ID N2: 135)
NFMKKVLRQRYGTMTA
Bov Ov 181-199 (SEQ ID N2: 136)
LRQRYGTMTAEEWMTQKIT
Bov Ov 190-205 (SEQ ID N2: 137)
EEWMTQKITEIKAAF
Ov 214-232 (SEQ ID N2: 138)
KSGFSPAARTFLQQFGIN
Los péptidos anteriores representan realizaciones preferidas de la descripción, y cuyas secuencias mostrarán resultados ventajosos cuando se apliquen solos o en combinación en un formato de prueba como se describe en la presente memoria. En particular, se prefieren los siguientes péptidos y muestran buenos resultados de ensayo cuando se aplican en un inmunoensayo.
Ejemplo 2
Prueba de cribado para la detección de anticuerpos dirigidos contra el virus de Schmallenberg (ELISA del serogrupo Simbu )
Recubrimiento directo de péptidos en las placas:
Los péptidos purificados de la descripción (sin biotinilar) se recubrieron en placas Maxisorp usando procedimientos estándar (tampón fosfato, incubación durante la noche a 4 °C). Las placas se secaron y se analizaron muestras positivas y negativas de anticuerpos.
Protocolo de recubrimiento:
• Dilución de péptido(s) purificado(s) en tampón fosfato de pH 7
• Adición de detergente hasta una concentración final de 15 pg/ml
• Incubación a temperatura ambiente durante 20 min con agitación
• Dilución adicional del antígeno tratado con detergente a una concentración final de 1 — 4 pg/ml en tampón fosfato
• Recubrimiento de placas Maxisorp con 100 pl/pocillo
• Incubación durante la noche a 4 °C en cámara húmeda
• Aspiración de la disolución de recubrimiento y secado de las placas.
Placas precubiertas con estreptavidina y acoplamiento de péptido(s) biotinilado(s) a las placas
Las placas se recubrieron previamente con estreptavidina. Las placas con estreptavidina se incubaron con péptido(s) biotinilado(s) de la descripción durante la noche, se lavaron tres veces y no se secaron antes de ejecutar el protocolo de ELISA. Se analizaron tres muestras positivas y una muestra negativa. La muestra negativa (ID 792) también se usó en los experimentos de recubrimiento directo.
Ejemplo 3
Formato I de ELISA
En este formato se usa un recubrimiento directo de péptido(s) de la descripción. El péptido de recubrimiento puede ser un solo péptido o una combinación de péptidos según la descripción. Los péptidos se representan en la Tabla 1 y se representan en la lista de secuencias.
El formato es indirecto y monofásico, y el tipo de muestra puede ser suero, plasma o leche.
Las placas recubiertas se incuban con suero, plasma o leche a temperatura ambiente. Las muestras se pueden aplicar como muestras individuales en pocillos individuales, en una serie de diluciones y preferiblemente como duplicados o triplicados. La dilución de la muestra es preferiblemente 1:10 o 1:20. Después de la incubación durante alrededor de 10 a 90 minutos, preferiblemente alrededor de 30 a 60 minutos, las placas se lavan tres veces, preferiblemente con PBS. Para la detección, se aplica a la placa un anticuerpo anti-rumiante conjugado con HRP y se incuba durante alrededor de 10 a 90 minutos, preferiblemente alrededor de 30 a 60 minutos. Después se añade un sustrato de lavado 3x, preferiblemente TMB, durante aproximadamente 5 a 15 minutos, preferiblemente 10 minutos, y el resultado se lee a 450 nm. La placa está configurada para incluir pocillos para muestras y también para controles positivos y negativos.
El recubrimiento se realiza a un pH de aproximadamente 5, 7 o 9,5 con o sin bloqueo, preferiblemente a pH 7. La proteína de recubrimiento se aplica en cantidades de 0, 1,2 o 4 gg/ml, preferiblemente 1 gg/ml.
La disolución de lavado contiene preferentemente NaCl 0,14 M, KCl 2,7 mM; Kathon 0,03 %, Tween20 0,1 %, el diluyente de la muestra comprende MgCl22 %, Aminoxid (AO) 6 %, Tween206 % y 0,5 % de caseína.
El conjugado anti-rumiantes se usa en una dilución de 1:10.000 a 1:30.000, preferiblemente 1:20.000 en un tampón estabilizador de conjugado como formato listo para usar (RTU).
La prueba puede detectar SBV en muestras bovinas y ovinas.
Ejemplo 4
Formato II de ELISA — ELISA de una sola etapa
El/los péptido(s) de la descripción tal como se describe en el formato I de ELISA se acopla(n) al soporte sólido a través de estreptavidina-biotina. Preferiblemente, la estreptavidina se acopla al soporte sólido y el/los péptido(s) se acopla(n) con biotina, lo que permite recubrir el soporte sólido a través del complejo de estreptavidina-biotina que se forma.
El soporte sólido, p. ej. una placa multipocillo, está recubierta con estreptavidina. Las placas recubiertas con estreptavidina se incuban en una sola etapa con los péptidos biotinilados (como se describió anteriormente; se hace referencia a la lista de secuencias de péptidos de la presente memoria), la muestra (preferiblemente diluida como se describió anteriormente) y el anticuerpo monoclonal anti-rumiante conjugado con HRP. El anticuerpo HRP es preferiblemente una IgG. Después de la incubación durante aproximadamente 30 a 90 minutos, preferiblemente 1 hora, la placa se lava como se describió anteriormente y la lectura se realiza a 450 nm.
Las placas de microtitulación se suministran recubiertas con estreptavidina. El tampón todo en uno contiene los péptidos biotinilados y el conjugado anti-IgG. Las diluciones de las muestras a analizar se incuban en el tampón todo en uno en los pocillos de estas placas. Cualquier anticuerpo específico hacia SBV se une al antígeno en el tampón todo en uno y forma un complejo conjugado antígeno/anticuerpo/anti-IgG en la superficie del pocillo de la placa de estreptavidina. El material sin unir se elimina de los pocillos mediante lavado. El sustrato que contiene TMB se añade a los pocillos. El grado de color que se desarrolla (densidad óptica medida a 450 nm) es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo específico para SBV presente en la muestra.
Ejemplo 5
Reconocimiento del serogrupo Simbu mediante ELISA (ELISA del grupo pan-Simbu)
Los formatos de prueba preferidos según la descripción son capaces de reconocer los anticuerpos formados después de la infección con diferentes miembros del serogrupo Simbu, es decir, la prueba es una prueba del grupo pan-Simbu.
Tabla 4: relación de los serogrupos de Orthobunyavirus
Figure imgf000032_0001
En una realización preferida, la prueba es capaz de detectar los virus del serogrupo Simbu, en otra realización preferida Simbu y Bunyamwera, en otra realización preferida además del serogrupo California, alternativamente el serogrupo Simbu y California en una configuración de prueba.
Ejemplo 6
Formato alternativo ELISA de péptidos
Kit de prueba y prueba de anticuerpos mediante ELISA de SBV de doble reconocimiento
Se puede usar un formato alternativo de prueba ELISA de la siguiente manera: La prueba de anticuerpos de doble reconocimiento de SBV se puede aplicar para medir el nivel de anticuerpos hacia SBV. La prueba utiliza un péptido sintético de SBV según la descripción, preferiblemente un péptido que comprende las secuencias del motivo central como se describió anteriormente o los otros péptidos señalados como realizaciones preferidas de la descripción, que imita una proteína Np de SBV según la descripción como antígeno de diagnóstico.
Se puede idear un formato de microtitulación en el que el péptido SBV se recubre en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Las muestras de prueba prediluidas se incuban en los pocillos de microtitulación revestidos.
Los anticuerpos específicos del péptido SBV (si está presente) se unirán a los pocillos recubiertos. Los componentes no unidos se eliminan mediante lavado y un segundo péptido SBV que se acopla a la peroxidasa de rábano se incuba en los pocillos de microtitulación. El conjugado de péptido de SBV se unirá al segundo sitio de unión de los anticuerpos que se habían unido previamente al péptido de SBV, formando así inmunocomplejos específicos. Los componentes sin unir se eliminan mediante lavado y se añade un sustrato enzimático (H2O2)/disolución de cromógeno (tetrametilbencidina, TMB). El desarrollo posterior del color es proporcional a la cantidad de anticuerpo específico presente en la muestra.
El experto apreciará que pueden ser necesarias modificaciones menores en la configuración de la prueba dependiendo del péptido SBV aplicado en la prueba. Estas modificaciones están dentro de la experiencia ordinaria del experto aplicable.
Tabla 5. Secuencias de aminoácidos/péptidos preferidas según la descripción
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Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en las secuencias VAFIGKYGQQLNFGVA, IGKYGQQLNFGVARVF, FFLNQKKAKMVLHKTA, GGVKFTVVNNHFPQYV, KFTVVNNHFPQYVSNP, WIADTCKASVLKLAEA, RVLKDNMDVNFMKKVL, KDNMDVNFMKKVLRQR, MDVNFMKKVLRQRYGT, NFMKKVLRQRYGTMTA, LRQRYGTMTAEEWMTQ, RYGTMTAEEWMTQKIT, AEEWMTQKITEIKAAF, AKSGFSPAARTFLQQF, GFSPAARTFLQQFGIN.
2. Una mezcla de péptidos aislados que comprende al menos dos péptidos según la reivindicación 1.
3. Un método in vitro para identificar un animal no humano infectado con el virus de Schmallenberg (SBV) que comprende las etapas de:
i. poner en contacto una muestra con un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en condiciones en las que se puede formar un complejo de un anticuerpo específico contra el SBV de la muestra y el péptido;
ii. detectar el complejo así formado con un anticuerpo específico contra el anticuerpo del complejo o un péptido marcado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde la detección del complejo es indicativa de una infección por SBV, preferiblemente donde el método es un ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), preferiblemente un método de varias etapas o de una sola etapa.
4. El uso in vitro de uno o más péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en un método para la detección de una infección por SBV.
5. Un kit para la detección de una infección por SBV en una muestra que comprende:
i. uno o más péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 ; y
ii. un medio para la detección de un complejo formado entre el péptido y un anticuerpo específico contra SBV.
6. Un péptido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2 que comprende un epítopo útil para la identificación específica de anticuerpos hacia SBV en una muestra, en el que el epítopo comprende al menos 5 aminoácidos.
7. Un método in vitro para identificar un animal no humano infectado por SBV que comprende las etapas de: i. poner en contacto una muestra con un péptido de SBV según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2 en condiciones en las que se puede formar un complejo de un anticuerpo específico hacia SBV de la muestra y el péptido; ii. detectar el complejo así formado con un anticuerpo específico hacia el anticuerpo del complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de una infección por SBV, preferiblemente
en el que el método es un ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), preferiblemente un método de varias etapas o de una sola etapa.
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