ES2907250T3 - Oligonucleótidos de modulación de ARN con características mejoradas para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne y de Becker - Google Patents

Oligonucleótidos de modulación de ARN con características mejoradas para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne y de Becker Download PDF

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Abstract

Un oligonucleótido que comprende un monómero de ARN 2'-O-metil y una cadena principal de fosforotioato y que comprende una base de 5-metilcitosina o una composición que comprende dicho oligonucleótido, donde dicho oligonucleótido tiene una distribución mejorada y/o una actividad de omisión de exón cuando se compara con un oligonucleótido correspondiente que comprende un monómero de ARN 2'-O-metil y una cadena principal de fosforotioato sin una 5-metilcitosina.

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótidos de modulación de ARN con características mejoradas para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne y de Becker
Campo
La invención se define en las reivindicaciones 1-12 y se refiere al campo de la genética humana, más específicamente, a los trastornos neuromusculares. La invención en particular se refiere al uso de un oligonucleótido con características mejoradas que aumentan la aplicabilidad clínica como se define adicionalmente en esta invención.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades neuromusculares se caracterizan por un funcionamiento deficiente de los músculos debido a una patología muscular o nerviosa (miopatías y neuropatías). Las miopatías incluyen distrofias musculares genéticas que se caracterizan por debilidad progresiva y degeneración del esqueleto, corazón y/o músculo liso. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la distrofia muscular de Becker (DMB) son las formas más comunes de distrofia muscular en la niñez. La DMD es un trastorno neuromuscular letal y severo que resulta en una dependencia de un soporte de silla de ruedas antes de los 12 años y los pacientes a menudo mueren antes de los treinta debido a insuficiencia respiratoria o cardíaca. Es causada por deleciones de cambio de marco de lectura (~67 %) o duplicaciones (~7 %) de uno o más exones, o por mutaciones puntuales (~25 %) en el gen DMD de 2,24 Mb, lo que da como resultado ausencia de distrofina funcional. La DMB también es causada por mutaciones en el gen DMD, pero estas mantienen el marco de lectura abierto, producen proteínas distrofinas semifuncionales y dan como resultado un fenotipo típicamente mucho más leve y una vida útil más larga. Durante la última década, la modificación específica del splicing para restaurar el marco de lectura degradado de la transcripción ha surgido como una terapia prometedora para la d Md (van Ommen y col., 2008; Yokota y col., 2007; van Deutekom y col., 2007; Goemans y col., 2011; Cirak y col., 2011). Utilizando oligonucleótidos antisentido (AON, por sus siglas en inglés) altamente específicos de secuencia que se unen al exón que flanquea o contiene la mutación y que interfieren con sus señales de splicing, la omisión de ese exón puede inducirse durante el procesamiento del pre-ARNm de DMD. A pesar del transcrito truncado resultante, se restaura el marco de lectura abierto y se introduce una proteína que es similar a las encontradas en pacientes con DMB. La omisión de exón inducida por AON proporciona una estrategia terapéutica específica de la mutación y, por lo tanto, personalizada para los pacientes con DMD. Actualmente se están desarrollando varios oligonucleótidos para omitir los exones más relevantes del pre-ARNm de la distrofina, tales como los exones 2, 8, 9, 17, 29, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60-63, 71-78 como se describe en los documentos WO 02/024906, WO2004/083446, WO2006/112705, WO2007/135105, WO 2009/139630, WO 2010/050801 o WO 2010/050802.
Como la mayoría de las mutaciones se agrupan alrededor de los exones 45 a 55, la omisión de un exón específico puede ser terapéutica para muchos pacientes con diferentes mutaciones. La omisión del exón 51 se aplica al subconjunto más grande de pacientes (~13 %), incluidos aquellos con deleciones de los exones 45 a 50, 48 a 50, 50 o 52. Los AON aplicados se modifican químicamente para resistir endonucleasas, exonucleasas y RNasaH, y para promover la unión del ARN y la estabilidad del dúplex. Actualmente se están desarrollando dos químicas diferentes de AON para la omisión del exón 51 en DMD: AON de ARN 2'-0-metil fosforotioato (2OMePS,GSK2402968/PRO051) y oligómeros de fosforodiamidato morfolino (PMO, AVI-4658) (Goemans y col., 2011; Cirak y col., 2011). En dos estudios independientes en fase I/II, se demostró que ambos inducen específicamente la omisión del exón 51 y restauran al menos parcialmente la expresión de distrofina en las membranas de las fibras musculares después de una administración sistémica. Aunque los AON generalmente no son absorbidos bien por las fibras musculares sanas, la deficiencia de distrofina en la DMD, que da como resultado membranas de fibras dañadas y, por lo tanto, más permeables, en realidad promueve la captación. En estudios en el modelo de ratón mdx deficiente en distrofina, los oligonucleótidos de ARN 2'-0-metil fosforotioato han demostrado una captación hasta 10 veces mayor en diferentes grupos de músculos en comparación con la de ratones de tipo salvaje (Heemskerk y col., 2010). Aunque los recientes resultados de la fase I/II con AON de ARN 2'-0-metil fosforotioato y fosforodiamidato morfolino en pacientes con DMD confirman esta captación mejorada en el músculo distrófico, las diferentes modificaciones químicas parecían dar como resultado una captación diferencial y distribución a través del músculo. Los niveles de distrofina nueva en ambos estudios después de 3 meses de tratamiento fueron prometedores pero aún moderados y desafían el campo para investigar la oligoquímica de próxima generación.
Las características particulares de una química elegida afectan al menos en parte a la administración de un AON al transcrito diana: vía de administración, bioestabilidad, biodistribución, distribución intratisular y captación y tráfico celular. Además, se concibe una mayor optimización de la química de los oligonucleótidos para incrementar la afinidad y la estabilidad de unión, incrementar la actividad, mejorar la seguridad, y/o para reducir el costo de los bienes reduciendo la longitud o mejorando la síntesis y/o procedimientos de purificación. Múltiples modificaciones químicas se han puesto a disposición de la comunidad investigadora de forma general y/o comercial (tales como ARN 2'-0-metil y pirimidinas sustituidas en 5 y 2,6-diaminopurinas), mientras que la mayoría de las otras siguen presentando un esfuerzo sintético importante para su obtención. Se han obtenido resultados preliminares especialmente alentadores usando ARN 2'-O-metil fosforotioato que contiene modificaciones en las bases de pirimidina y purina como se identifica en esta invención.
En conclusión, para realzar la aplicabilidad terapéutica de los AON para la DMD, existe la necesidad de AON con características mejoradas adicionales.
Descripción de la invención
Oligonucleótido
En un primer aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido que comprende un monómero de ARN 2'-O-metil y una cadena principal de fosforotioato o que consiste en monómeros de ARN 2'-O-metil unidos por cadenas principales de fosforotioato, y que comprende una base de 5-metilcitosina, preferiblemente para su uso como medicamento para tratar la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker.
Por lo tanto, la invención proporciona un oligonucleótido que comprende un monómero de ARN 2'-O-metil, una cadena principal de fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, preferiblemente para su uso como medicamento para tratar la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker.
Por consiguiente, la invención también proporciona un oligonucleótido que consiste en monómeros de ARN 2'-O-metil y una cadena principal de fosforotioato y que comprende una base de 5-metilcitosina, preferiblemente para su uso como medicamento para tratar la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker.
Es evidente para el experto en la materia que "un monómero de ARN" tal como está presente en un oligonucleótido de la invención también puede identificarse como "un residuo de nucleótido de ARN". Ambas expresiones pueden usarse de manera intercambiable a lo largo de la solicitud. Dentro del contexto de la invención, "uno/a, un" en cada una de las siguientes expresiones significa "al menos uno/a": un monómero de ARN 2'-O-metil, un residuo de nucleótido de ARN 2'-O-metil, un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato, una base de 5-metilpirimidina, una base de 2,6-diaminopurina.
Dentro del contexto de la invención, es evidente para el experto en la materia que "un oligonucleótido que comprende un monómero de ARN 2'-O-metilo, una cadena principal de fosforotioato" podría reemplazarse por "un oligonucleótido que comprende un monómero de ARN 2'-O-metilo unido por cadenas principales de fosforotioato". Lo mismo puede decirse para "un oligonucleótido que consiste en monómeros de ARN 2'-O-metil y una cadena principal de fosforotioato" que podría ser reemplazado por "un oligonucleótido que consiste en un monómero de ARN 2'-O-metil unido por cadenas principales de fosforotioato".
En el contexto de la invención, la expresión "para su uso como medicamento para tratar la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker" podría sustituirse por la expresión "para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker".
Preferiblemente, un oligonucleótido es un oligonucleótido con menos de 34 nucleótidos. Dicho oligonucleótido puede tener 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos. Dicho oligonucleótido también puede identificarse como un oligonucleótido que tiene de 10 a 33 nucleótidos.
Por consiguiente, un oligonucleótido de la invención comprende un monómero de ARN 2'-Ometil y una cadena principal de fosforotioato, y comprende menos de 34 nucleótidos (es decir, comprende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos).
Por consiguiente, un oligonucleótido de la invención consiste en monómeros de ARN 2'-O-metil unidos por una cadena principal de fosforotioato, y comprende menos de 34 nucleótidos (es decir, comprende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos).
Por consiguiente, un oligonucleótido de la invención comprende un monómero de ARN 2'-O-metil, una cadena principal de fosforotioato, menos de 34 nucleótidos (es decir, comprende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos) y una base de 5-metilcitosina.
Por consiguiente, un oligonucleótido de la invención consiste en monómeros de ARN 2'-O-metil unidos por una cadena principal de fosforotioato, y comprende menos de 34 nucleótidos (es decir, comprende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos) y una base de 5-metilcitosina.
Cada uno de estos oligonucleótidos se utiliza o puede utilizarse como medicamento para tratar la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker.
Un oligonucleótido de la invención comprende o consiste en un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato. Dicho oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil conectado a través o unido por una cadena principal de fosforotioato o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato. Preferiblemente, tal oligonucleótido consiste en un ARN 2'-0-metil fosforotioato. El experto en la materia conoce esta química. A lo largo de la solicitud, un oligonucleótido que comprende un monómero de ARN 2'-0--metil y una cadena principal de fosforotioato puede ser reemplazado por un oligonucleótido que comprende un ARN 2'-0-metil fosforotioato. A lo largo de la solicitud, un oligonucleótido que consiste en monómeros de ARN 2'-0-metil unidos por o conectados a través de cadenas principales de fosforotioato pueden ser reemplazado por un oligonucleótido que consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato.
En el contexto de la invención, "cadena principal" se usa para identificar el enlace entre dos unidades de azúcar o versiones modificadas de una unidad o resto de azúcar como se define más adelante en esta invención (es decir, enlace internucleosídico). A lo largo de la descripción, las palabras "estructura", "enlace internucleosídico" y "enlace" pueden usarse indistintamente. Por tanto, un oligonucleótido que tiene 10 nucleótidos contiene 9 cadenas principales, que unen las 10 unidades de azúcar o versiones modificadas de una unidad o resto de azúcar como se define más adelante en esta invención. Al menos una de las cadenas principales del oligonucleótido de acuerdo con la invención consiste en un resto fosforotioato, que une dos unidades de azúcar o versiones modificadas de una unidad o resto de azúcar como se define más adelante en esta invención. Por tanto, al menos una cadena principal de fosfodiéster presente en el ARN se reemplaza por un resto de fosforotioato. Un enlace internucleosídico de origen natural o cadena principal es el enlace fosfodiéster 3' a 5'.
Además, un oligonucleótido de la invención comprende una modificación de base que mejora la biodistribución y/o la distribución intratejido, y/o actividad de omisión de exón. Un oligonucleótido de la invención comprende una base de 5-metilcitosina y opcionalmente una base de 5-metilpirimidina y/o de 2,6-diaminopurina adicional. Una base de 5-metilpirimidina se selecciona entre una 5-metilcitosina y/o un 5-metiluracilo y/o una timina, en la que la timina es idéntica al 5-metiluracilo.
En consecuencia, la expresión "comprende una base de 5-metilcitosina y/o 5-metiluracilo y/o una 2,6-diaminopurina "en el contexto del oligonucleótido modificado de la invención puede ser reemplazada por" comprende una modificación de base seleccionada entre el grupo que consiste en: una base de 5-metilcitosina, 5-metiluracilo y 2,6-diaminopurina".
Cuando un oligonucleótido de la invención tiene dos o más de tales modificaciones de base, dichas modificaciones de base pueden ser idénticas, por ejemplo, todas estas bases modificadas en el oligonucleótido son 5-metilcitosina, o dichas modificaciones de base pueden ser combinaciones de diferentes modificaciones de base, por ejemplo, el oligonucleótido puede tener una o más 5-metilcitosinas y uno o más 5-metiluracilos.
"Timina" y "5-metiluracilo" pueden intercambiarse a lo largo del documento. Por analogía, 2,6-diaminopurina es idéntica a 2-aminoadenina y estos términos pueden intercambiarse a lo largo del documento. El uso de 2,6-diaminopurina se ha descrito en otro contexto en el documento US 7.745.420.
La expresión "modificación de base" o "base modificada" como se identifica en esta invención se refiere a la modificación de una base existente (es decir, base de pirimidina o purina) o a la síntesis de novo de una base. Esta base sintetizada de novo podría calificarse como "modificada" en comparación con una base existente. Un oligonucleótido de la invención que comprende una base de 5-metilcitosina y opcionalmente 5-metiluracilo y/o 2,6-diaminopurina significa que al menos una de las nucleobases de citosina de dicho oligonucleótido se ha modificado mediante la sustitución del protón en la posición 5 del anillo de pirimidina con un grupo metilo, es decir, una citosina sustituida en 5, y opcionalmente que al menos una de las nucleobases de uracilo de dicho oligonucleótido se ha modificado mediante la sustitución del protón en la posición 5 del anillo de pirimidina con un grupo metilo (es decir, un 5-metiluracilo), y/u opcionalmente, que al menos una de las nucleobases de adenina de dicho oligonucleótido se ha modificado mediante la sustitución del protón en la posición 2 con un grupo amino (es decir, una 2,6-diaminopurina), respectivamente. En el contexto de la invención, la expresión "la sustitución de un protón con un grupo metilo en la posición 5 del anillo de pirimidina" puede ser reemplazada por la expresión "la sustitución de una pirimidina con una 5-metilpirimidina", con pirimidina refiriéndose a solo uracilo, solo citosina o ambos. Asimismo, en el contexto de la invención, la expresión "la sustitución de un protón con un grupo amino en la posición 2 de adenina" puede sustituirse por la expresión "la sustitución de una adenina por una 2,6-diaminopurina". Si dicho oligonucleótido comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más citosinas, uracilos, y/o adeninas, al menos una, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más citosinas, uracilos y/o adeninas, respectivamente, se han modificado de esta manera. Preferiblemente todas las citosinas, uracilos y/o adeninas se han modificado de esta manera o se han sustituido por 5-metilcitosina, 5-metiluracilo y/o 2,6-diaminopurina, respectivamente. No es necesario decir que este aspecto de la invención solo podría aplicarse a oligonucleótidos que comprenden al menos una citosina, uracilo o adenina, respectivamente, en su secuencia. Un oligonucleótido que comprende al menos una 5-metilcitosina, 5-metiluracilo y/o 2,6-diaminopurina puede denominarse oligonucleótido modificado por referencia a su homólogo no modificado que no comprende 5-metilcitosina, ni 5-metiluracilo ni 2,6-diaminopurina. Un homólogo no modificado también puede identificarse como un olionucleótido que comprende citosinas no modificadas, uracilos no modificados y adeninas no modificadas. Las secuencias no modificadas preferidas están representadas por una de las siguientes secuencias de bases o de nucleótidos que comprenden o consisten en SEQ ID NO: 91, 93-170.
Se descubre que la presencia de una 5-metilcitosina y, opcionalmente, un 5-metiluracilo y/o una 2,6-diaminopurina en un oligonucleótido de la invención tiene un efecto positivo sobre al menos uno de los parámetros de dicho oligonucleótido. En este contexto, los parámetros pueden incluir: actividad de omisión de exón y/o distribución (intratejido) de dicho oligonucleótido, como se explica a continuación. Dicho efecto positivo puede correlacionarse con el número o porcentaje de modificaciones de base incorporadas. Para el parámetro de la actividad de omisión de exón, se descubre para algunos oligonucleótidos que la modificación de nucleobases no es necesaria per se para obtener niveles relativamente altos de omisión de exón. Esto puede estar relacionado con el papel específico (y fuerza) de la secuencia específicamente dirigida en el exón en su procedimiento de splicing.
La afinidad de unión y cinética dependen de las propiedades termodinámicas del AON. Estas están, al menos en parte, determinadas, por la temperatura de fusión de dicho oligonucleótido (Tm; calculada, por ejemplo, con la calculadora de propiedades de oligonucleótidos (http://www.unc.edu/~call/biotool/oligo/index.html o http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) para ARN monocatenario usando la Tm básica y el modelo vecino más cercano), y/o la energía libre del complejo oligonucleótido-exón diana (usando el RNA structure versión 4.5 o el mfold para ARN versión 3.5). Si se aumenta una Tm, la actividad de omisión de exón normalmente aumenta, pero cuando una Tm es demasiado alta, se espera que el AON se vuelva menos específico de secuencia. Una Tm y una energía libre aceptables dependen de la secuencia del oligonucleótido. Por lo tanto, es difícil proporcionar intervalos preferidos para cada uno de estos parámetros.
La actividad de omisión de exón se mide preferiblemente analizando el ARN total aislado de cultivos de células musculares o tejido muscular tratados con AON mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) utilizando cebadores específicos del gen de DMD que flanquean el exón dirigido como se describe (Aartsma-Rus y col., 2003). Los productos de RT-PCR se analizan en geles de agarosa al 1-2 % o con el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Países Bajos). Se evalúa la relación de fragmentos de transcripto más cortos, que representan transcriptos en los que se omite el exón dirigido, al total de productos de transcripto (calculado como porcentaje de omisión de exón inducida por un AON). También se pueden secuenciar fragmentos más cortos para determinar la exactitud y especificidad de la omisión de exón dirigido. Se puede detectar un aumento en el porcentaje de omisión de exón para un oligonucleótido modificado de la invención (es decir, un oligonucleótido que comprende un monómero de ARN 2'-0-metil, una cadena principal de fosforotioato y una base de 5-metilcitosina y opcionalmente otra base de 5-metilpirimidina y/o 2,6-diaminopurina) en comparación con su homólogo no modificado (es decir, un oligonucleótido que comprende un monómero de ARN 2'-0-metilo, una cadena principal de fosforotioato y que no comprende ninguna base de 5-metilpirimidina y ninguna base de 2,6-diaminopurina). Dicho aumento es preferiblemente un aumento detectable evaluado como se explicó anteriormente usando RT-PCR. Dicho aumento es preferiblemente un aumento de al menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 210 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 %, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor, o incluso 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces mayor o más.
La biodistribución y bioestabilidad se determinan preferiblemente al menos en parte mediante un ensayo de ligación e hibridación validado adaptado de Yu y col., 2002. En una realización, las muestras de tejido homogeneizado o plasma se incuban con una sonda oligonucleotídica de captura específica. Después de la separación, un oligonucleótido marcado con DIG se liga al complejo y se procede a la detección usando una peroxidasa unida a un anticuerpo anti-DIG. El análisis farmacocinético no compartimental se realiza utilizando el paquete de software WINNONLIN (modelo 200, versión 5.2, Pharsight, Mountainview, CA). Los niveles de AON (ug) por ml de plasma o mg de tejido se controlan con el tiempo para evaluar el área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés), la concentración máxima (Cmáx), el tiempo hasta la concentración máxima (Tmáx), la vida media terminal y el tiempo de retraso de absorción (tret). Un ensayo preferido de este tipo se ha divulgado en la parte experimental.
Los AON pueden estimular una respuesta inmunitaria innata activando los receptores tipo Toll (TLR), incluidos TLR9 y TLR7 (Krieg y col., 1995). La activación de TLR9 ocurre típicamente debido a la presencia de secuencias CG no metiladas presentes en oligodesoxinucleótidos (ODN), al imitar el ADN bacteriano que activa el sistema inmunitario innato a través de la liberación de citocinas mediada por TLR9. Sin embargo, se sugiere que la modificación de 2'-0-metilo reduce notablemente tal posible efecto. Se ha descrito que TLR7 reconoce las repeticiones de uracilo en ARN (Diebold y col., 2006). La activación de TLR9 y TLR7 da como resultado un conjunto de respuestas inmunitarias coordinadas que incluyen inmunidad innata (macrófagos, células dendríticas (CD) y células NK) (Krieg y col., 1995; Krieg, 2000). Varias quimio- y citocinas, tales como IP-10, TNFa, IL-6, MCP-1 e IFNa (Wagner, 1999; Popovic y col., 2006) han estado implicadas en este proceso. Las citocinas inflamatorias atraen células defensivas adicionales de la sangre, tales como las células T y B. Los niveles de estas citocinas pueden investigarse mediante ensayos in vitro. En resumen, la sangre entera humana se incuba con concentraciones crecientes de AON, después de lo cual se determinan los niveles de citocinas mediante kits de ELISA estándar disponibles comercialmente. Un ensayo preferido de este tipo se ha descrito en la parte experimental. Una disminución de la inmunogenicidad corresponde preferiblemente a una disminución detectable de la concentración de al menos una de las citocinas mencionadas anteriormente en comparación con la concentración de la citocina correspondiente en un ensayo en una célula tratada con un oligonucleótido que comprende al menos una 5-metilcitosina en comparación con una célula tratada con un oligonucleótido correspondiente que no tiene 5-metilcitosinas.
Por consiguiente, un oligonucleótido preferido de la invención tiene un parámetro mejorado, tal como una mejor biodistribución y/o actividad de omisión de exón en comparación con un oligonucleótido correspondiente que consiste en un ARN 2'-0-metil fosforotioato sin una 5-metilcitosina, un 5-metiluracilo y una 2,6-diaminopurina (es decir, el llamado oligonucleótido no modificado). Dicho olionucleótido no modificado también puede identificarse como un olionucleótido que comprende citosinas no modificadas, uracilos no modificados y adeninas no modificadas. Cada uno de estos parámetros podría evaluarse usando ensayos conocidos por el experto en la materia o preferiblemente como se describe en esta invención.
A continuación se definen otras químicas y modificaciones del oligonucleótido de la invención. Estas químicas y modificaciones adicionales pueden estar presentes en combinación con la química ya definida para dicho oligonucleótido, es decir, la presencia de una 5-metilcitosina y opcionalmente un 5-metiluracilo y/o una 2,6-diaminopurina, y el oligonucleótido que comprende o consiste en un a Rn 2'-0-metil fosforotioato.
Un oligonucleótido preferido de la invención comprende o consiste en una molécula de ARN o una molécula de ARN modificada. En una realización preferida de la invención, un polinucleótido es monocatenario. El experto en la materia comprenderá que, sin embargo, es posible que un oligonucleótido monocatenario pueda formar una estructura bicatenaria interna. Sin embargo, este oligonucleótido todavía se denomina oligonucleótido monocatenario en el contexto de esta invención.
Además de las modificaciones descritas anteriormente, el oligonucleótido de la invención puede comprender modificaciones adicionales tales como diferentes tipos de monómeros de ácido nucleico o nucleótidos como se describe a continuación. Pueden usarse diferentes tipos de monómeros de ácido nucleico para generar un oligonucleótido de la invención. Dicho oligonucleótido puede tener al menos una cadena principal, y/o modificación de azúcar y/o al menos una modificación de base en comparación con un oligonucleótido basado en ARN.
Una modificación de base incluye una versión modificada de las bases naturales de purina y pirimidina (p. ej., adenina, uracilo, guanina, citosina y timina), tal como hipoxantina, ácido orótico, agmatidina, lisidina, 2-tiopirimidina (p. ej., 2-tiouracilo, 2-tiotimina), anclaje a G y sus derivados, pirimidina sustituida en 5 (p. ej., 5-halouracilo, 5-propiniluracilo, 5-propinilcitosina, 5-aminometiluracilo, 5-hidroximetiluracilo, 5-aminometilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, Super T), 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, 7-aza-2,6-diaminopurina, 8-aza-7-deazaguanina, 8-aza-7-deazaadenina, 8-aza-7-deaza-2,6-diaminopurina, Super G, Super A y N 4-etilcitosina, o derivados de los mismos; N2-ciclopentilguanina (cPent-G), N2-ciclopentil-2-aminopurina (cPent-AP), y N2-propil-2-aminopurina (Pr-AP), pseudouracilo o derivados de los mismos; y bases degeneradas o universales, como 2,6-difluorotolueno o bases ausentes como sitios abásicos (p. ej., 1-desoxirribosa, 1,2-didesoxirribosa, 1-desoxi-2-0-metilribosa; o derivados de pirrolidina en los que el oxígeno en el anillo ha sido reemplazado con nitrógeno (azaribosa)). Se pueden encontrar ejemplos de derivados de Super A, Super G y Super T en la patente de EE.UU. N.° 6.683.173 (Epoch Biosciences), que se incorpora aquí en su totalidad por referencia. Se demostró que cPent-G, cPent-AP y Pr-AP reducen los efectos inmunoestimuladores cuando se incorporan en ARNip (Peacock H. y col. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9200).
Un pseudouracilo es una versión isomerizada de origen natural de uracilo, con un C-glucósido en lugar del N-glucósido regular como en uridina. El ARNm sintético que contiene pseudouridina puede tener un perfil de seguridad mejorado en comparación con el ARNm que contiene uridina (documento WO 2009127230).
En una realización, un oligonucleótido de la invención comprende un sitio abásico o un monómero abásico. En el contexto de la invención, tal monómero puede denominarse sitio abásico o monómero abásico. Un monómero abásico o sitio abásico es un monómero o unidad estructural que carece de una nucleobase en comparación con un monómero correspondiente que comprende una nucleobase. Dentro de la invención, un monómero abásico es, por tanto, una unidad estructural que forma parte de un oligonucleótido pero que carece de una nucleobase. Tal monómero abásico puede estar presente o ligado o unido o conjugado a un extremo libre de un oligonucleótido. En una realización más preferida, un oligonucleótido de la invención comprende 1-20 o más monómeros abásicos. Por lo tanto, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más monómeros abásicos pueden estar presentes en un oligonucleótido de la invención.
Un monómero abásico puede ser de cualquier tipo conocido y concebible por el experto en la materia, cuyos ejemplos no limitantes se representan a continuación:
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En esta invención, Ri y R2 son independientemente H, un oligonucleótido u otro(s) sitio(s) abásico(s), siempre que Ri y R2 no sean ambos H y Ri y R2 no sean ambos un oligonucleótido. Se puede unir un monómero o monómeros abásicos a uno o ambos extremos del oligonucleótido como se especificó anteriormente. Cabe señalar que un oligonucleótido unido a uno o dos sitios abásicos o monómeros abásicos puede comprender menos de 10 nucleótidos. A este respecto, el oligonucleótido según la invención puede comprender al menos 10 nucleótidos, incluyendo opcionalmente uno o más sitios abásicos o monómeros abásicos en uno o ambos extremos.
Dependiendo de su longitud, un oligonucleótido de la invención puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32 o 33 modificaciones de base. También está abarcado por la invención introducir más de una modificación de base distinta en dicho oligonucleótido.
Una modificación de azúcar incluye una versión modificada del resto ribosil, tal como ARN modificado con 2'-0-, tal como 2'-O-alquilo o 2'-0-(sustituido)alquilo p. ej., 2'-O-metilo, 2'-0-(2-cianoetilo), 2'-0-(2-metoxi)etilo (2'-MOE), 2'-0-(2-tiometil)etilo, 2'-0--butirilo, 2'-O-propargilo, 2'-O-alilo, 2'-0-(3-amino)propilo, 2'-0-(3-(dimetilamino)propilo), 2'-0-(2-amino)etilo, 2'-0-(2-(dimetilamino)etilo); 2'-desoxi (ADN); 2'-0-(haloalcoxi)metilo (Arai K. y col. Bioorg. Med. Chem.
2011,21,6285) p. ej., 2'-0-(2-cloroetoxi)metilo (MCEM), 2'-0-(2,2-dicloroetoxi)metilo (DCEM); 2'-O-alcoxicarbonilo, p. ej., 2'-0-[2-(metoxicarbonil)etilo] (MOc E), 2'-0-[2-(N-metilcarbamoil)etilo] (m Ce), 2'-0-[2-(N,N-dimetilcarbamoil)etilo] (Dc ME); 2'-halo, p. ej., 2'-F, FANA (ácido nucleico de 2'-F arabinosilo); modificaciones de carbaazúcar, sulfa y sulfoazúcar y azaazúcar; 3'-0-alquilo p. ej., 3'-0-metilo, 3'-0-butirilo, 3'-O-propargilo; 4'-carboxi p. ej., 4'-carboxitimidina (Hari y col.); y sus derivados.
Otras modificaciones de azúcar incluyen ácido nucleico "con puente" o "bicíclico" (BNA, por sus siglas en inglés), p. ej., ácido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en inglés), xilo-LNA, a-L-LNA, p-D-LNA, cET (etilo limitado en 2'-0,4'-C) LNA, cMOEt (metoxietilo limitado en 2'-0,4'-C) LNA, ácido nucleico con puente de etileno (ENA), ADN triciclo (tcDNA, tc-PS-DNA p. ej., solicitud de patente de EE. UU. 2012/0149756); ADN de 3'-S-fosforotiolato (p. ej., Org. Biol. Chem. 2013, 11, 966); ácido nucleico doblemente limitado (tri-NA, p. ej., Hanessian y col.); ácido nucleico desbloqueado (UNA, por sus siglas en inglés); ácido nucleico de ciclohexenilo (CeNA, por sus siglas en inglés), ácido nucleico de altriol (a Na , por sus siglas en inglés), ácido nucleico de hexitol (HNA, por sus siglas en inglés), HNA fluorado (F-HNA), piranosil-ARN (p-RNA, por sus siglas en inglés), 3'-desoxipiranosil-ADN (p-DNA, por sus siglas en inglés); morfolino (como, p. ej. en PMO, PPMO, PMOPlus, PMO-X); y sus derivados. Dependiendo de su longitud, un oligonucleótido de la invención puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 modificaciones de azúcar. También está abarcado por la invención introducir más de una modificación de azúcar distinta en dicho oligonucleótido. En una realización, un oligonucleótido como se define en esta invención comprende o consiste en un LNA o un derivado del mismo. Los derivados de BNA se describen, por ejemplo, en el documento WO 2011/097641, que se incorpora en su totalidad por referencia. En una realización más preferida, un oligonucleótido de la invención está totalmente modificado con 2'-0-metilo. Ejemplos de PMO-X se describen en el documento WO2011/150408, que se incorpora aquí en su totalidad por referencia.
Una modificación de cadena principal incluye una versión modificada del fosfodiéster presente en el ARN, tal como fosforotioato (PS), fosforotioato quiralmente puro, fosforoditioato (PS2), fosfonoacetato (PACE), fosfonoacetamida (PACA), tiofosfonoacetato, tiofosfonoacetamida, profármaco de fosforotioato, H-fosfonato, fosfonato de metilo, fosfonotioato de metilo, fosfato de metilo, fosforotioato de metilo, fosfato de etilo, fosforotioato de etilo, boranofosfato, boranofosforotioato, boranofosfato de metilo, boranofosforotioato de metilo, boranofosfonato de metilo, boranofosfonotioato de metilo, y sus derivados. Otra modificación incluye fosforamidita, fosforamidato, fosforamidato N 3 '^ P5', fosfordiamidato, fosforotiodiamidato, sulfamato, dimetilenosulfóxido, sulfonato, triazol, oxalilo, carbamato, metilenimino (MMI), 3'-S-fosforotiolato (Org. Biol. Chem. 2013, 11, 966) y ácido nucleico de tioacetamido (TANA); y sus derivados. Dependiendo de su longitud, un oligonucleótido de la invención puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 modificaciones de cadena principal. También está abarcado por la invención introducir más de una modificación de cadena principal distinta en dicho oligonucleótido.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido de la invención comprende al menos una modificación de fosforotioato. En una realización más preferida, un oligonucleótido de la invención está completamente modificado con fosforotioato.
Otras modificaciones químicas de un oligonucleótido de la invención incluyen ácido nucleico de base peptídica (PNA, por sus siglas en inglés), PNA modificado con grupo de boro, ácido nucleico oxipeptídico a base de pirrolidina (POPNA, por sus siglas en inglés), ácido nucleico a base de glicol o glicerol (GNA, por sus siglas en inglés), ácido nucleico a base de treosa (TNA, por sus siglas en inglés), ácido nucleico a base de treoninol acíclico (aTNA, por sus siglas en inglés), oligonucleótido a base de morfolino (PMO, PPMO, PMO-X), oligómeros catiónicos a base de morfolino (PMOPlus), oligonucleótidos con bases integradas y cadenas principales (ONIBs, por sus siglas en inglés), oligonucleótidos de pirrolidina-amida (POMs); y sus derivados.
En otra realización, un oligonucleótido comprende un ácido nucleico peptídico y/o un fosforodiamidato de morfolino o un derivado del mismo.
En otra realización, un oligonucleótido comprende un resto monotiofosfato en la posición 5' del residuo terminal 5' y/o un resto monotiofosfato en la posición 3' del residuo terminal 3'. Se ha demostrado que estos grupos monotiofosfato mejoran la estabilidad de los oligonucleótidos (p. ej., solicitud de patente de EE. UU. 2012/0148664 - miRagen).
Con la llegada de la tecnología de imitación de ácidos nucleicos, se ha hecho posible generar moléculas que tienen características de hibridación similares, preferiblemente las mismas, del mismo modo no necesariamente en cantidad como el propio ácido nucleico. Por supuesto, tales equivalentes funcionales también son adecuados para su uso en la invención.
El experto en la materia comprenderá que no todos los azúcares, bases, y/o cadenas principales se pueden modificar de la misma manera. Varios azúcares, bases y/o cadenas principales modificados de formas distintas se pueden combinar en un solo oligonucleótido de la invención.
Un experto en la materia también reconocerá que hay muchos derivados sintéticos de oligonucleótidos. Una modificación de cadena principal incluye una versión modificada del fosfodiéster presente en el ARN, tal como fosforotioato (PS), fosforotioato quiralmente puro, fosforoditioato (PS2), fosfonoacetato (PACE), fosfonoacetamida (PACA), tiofosfonoacetato, tiofosfonoacetamida, profármaco de fosforotioato, H-fosfonato, fosfonato de metilo, fosfonotioato de metilo, fosfato de metilo, fosforotioato de metilo, fosfato de etilo, fosforotioato de etilo, boranofosfato, boranofosforotioato, boranofosfato de metilo, boranofosforotioato de metilo, boranofosfonato de metilo, boranofosfonotioato de metilo, y sus derivados. Otra modificación incluye fosforamidita, fosforamidato, fosforamidato N3'^- P5', fosfordiamidato, fosforotiodiamidato, sulfamato, dimetilenosulfóxido, sulfonato y ácido nucleico de tioacetamido (TANA); y sus derivados.
Preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende ARN, ya que los dúplex de ARN/ARN son muy estables. Se prefiere que un oligonucleótido de ARN comprenda una modificación que proporcione al ARN una propiedad adicional, por ejemplo, resistencia a endonucleasas, exonucleasas y ARNasaH, fuerza de hibridación adicional, mayor estabilidad (por ejemplo, en un fluido corporal), mayor o menor flexibilidad, mayor actividad, toxicidad reducida, transporte intracelular incrementado, especificidad de tejido, etc. Además, el ARNm complejado con el oligonucleótido de la invención preferiblemente no es susceptible de escisión por RNasaH. Las modificaciones preferidas se han identificado anteriormente.
Por consiguiente, la invención proporciona un oligonucleótido que comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato o que consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y que comprende una base de 5-metilcitosina y, opcionalmente, una base de 5-metilpirimidina y/o de 2,6-diaminopurina. Lo más preferiblemente, este oligonucleótido consiste en monómeros de ARN 2'0-metilo conectados a través de una cadena principal de fosforotioato y todas sus citosinas y/o todos sus uracilos y/o todas sus adeninas, independientemente, han sido sustituidos por 5-metilcitosina, 5-metiluracilo y/o 2,6-diaminopurina, respectivamente. Los oligonucleótidos modificados y no modificados preferidos descritos en esta invención comprenden o consisten en una secuencia de bases o nucleótidos seleccionada de entre una de SEQ ID NO: 14-90 como se identifica en la tabla 1. La expresión "oligonucleótido representado por un nucleótido o secuencia de bases seleccionada de entre SEQ ID NO: 14-90" podría reemplazarse por la expresión "oligonucleótido representado por un nucleótido o secuencia de bases seleccionada de entre una de SEQ ID NO: 14­ 90" o por la expresión "oligonucleótido representado por un nucleótido o secuencia de bases seleccionada de entre la lista de SEQ iD NO: 14-90". Lo mismo sucede con otros grupos de SEQ ID NO referidos en esta invención.
Los oligonucleótidos no modificados preferidos se derivan de una de SEQ ID NO: 14-90 y comprenden o consisten en una secuencia de bases o de nucleótidos seleccionada de entre SEQ ID NO: 91, 93-170.
Los oligonucleótidos modificados se derivan preferiblemente de una de SEQ ID NO: 14-90 y están abarcados por la presente invención y se describen en esta invención y comprenden o consisten en una de una secuencia de bases o de nucleótidos seleccionada de entre SEQ ID NO: 92, 171-213, 215. Tenga en cuenta que dos SEQ ID NO presentes en el listado de secuencias son idénticas: SEQ ID NO: 91 es idéntica a SEQ ID NO: 132. SEQ ID NO: 92 es idéntica a SEQ ID NO: 199.
La secuencia que representa cada uno de estos oligonucleótidos se describe en las Tablas 1-3 y en el listado de secuencias. Más adelante en la descripción, los oligonucleótidos más preferidos se describen con más detalle.
Por tanto, un oligonucleótido de la invención puede tener:
Al menos una y preferiblemente todas las citosinas sustituidas con 5-metilcitosinas.
Al menos una y preferiblemente todas las citosinas sustituidas con 5-metilcitosinas y al menos uno y preferiblemente todos los uracilos sustituidos con 5-metiluracilos.
Al menos una y preferiblemente todas las citosinas sustituidas con 5-metilcitosinas y al menos una y preferiblemente todas las adeninas sustituidas con 2,6-diaminopurinas.
Al menos una y preferiblemente todas las citosinas sustituidas con 5-metilcitosinas y al menos uno y preferiblemente todos los uracilos sustituidos con 5-metiluracilos y al menos una y preferiblemente todas las adeninas sustituidas con 2,6-diaminopurinas.
Sin embargo, un oligonucleótido también puede tener al menos una o al menos dos o al menos la mitad o todas sus citosinas sustituidas con 5-metilcitosinas. Si un oligonucleótido no modificado preferiblemente basado en SEQ ID NO: 14-90 tiene x citosinas, siendo x un número entero que varía de 1 a 33, un oligonucleótido modificado correspondiente de la invención puede tener 1, 2, 3, ... (x-2), (x-1), x 5-metilcitosinas. Si x es 3 en tal oligonucleótido no modificado, el número de 5-metilcitosinas en un oligonucleótido modificado correspondiente es 1, 2 o 3.
Si x es 4 en tal oligonucleótido no modificado, el número de 5-metilcitosinas en un oligonucleótido modificado correspondiente es 1, 2, 3 o 4.
Si x es 5 en tal oligonucleótido no modificado, el número de 5-metilcitosinas en un oligonucleótido modificado correspondiente es 1, 2, 3, 4 o 5.
Si x es 6 en tal oligonucleótido no modificado, el número de 5-metilcitosinas en un oligonucleótido modificado correspondiente es 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Si x es 7 en tal oligonucleótido no modificado; el número de 5-metilcitosinas en un oligonucleótido modificado correspondiente es 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7.
Si x es 8 en tal oligonucleótido no modificado, el número de 5-metilcitosinas en un oligonucleótido modificado correspondiente es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8.
Lo mismo ocurre con los uracilos sustituidos con 5-metiluracilos y las adeninas sustituidas con 2,6-diaminopurinas.
Preferiblemente, un oligonucleótido de la invención es para su uso como medicamento para DMD, más preferiblemente dicho oligonucleótido es para su uso en modulación de ARN terapéutico. Por lo tanto, un oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido (AON). Un oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido que es inversamente complementario a una secuencia específica del pre-ARNm de DMD o distrofina derivado de la hebra sentido codificante de un ADN de un individuo. Este oligonucleótido se une a y/o se dirige a y/o se hibrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con dicha secuencia de dicho pre-ARNm. El objetivo de la modulación de ARN para DMD es omitir uno o más exones específicos en el pre-ARNm de DMD o distrofina con el fin de restaurar el marco de lectura abierto del transcripto e inducir la expresión de una proteína distrofina más corta pero (más) funcional, con el objetivo final de poder interferir en la progresión de la enfermedad.
En una realización preferida, un oligonucleótido de la invención se usa de este modo para inducir la omisión de exón en el pre-ARNm de DMD o distrofina en una célula, en un órgano, en un tejido y/o en un individuo. La omisión de exón da como resultado un ARNm de DMD o distrofina maduro que no contiene un exón omitido y, por lo tanto, cuando dicho exón codifica aminoácidos, puede conducir a la expresión de un producto proteico más corto. La omisión de un exón se induce preferiblemente mediante la unión de un AON a secuencias internas de exón específicas que comprenden elementos reguladores de splicing, los sitios de splicing y/o secuencias de punto de ramificación intrónicas.
Como se define en esta invención, un pre-ARNm de DMD preferiblemente significa un pre-ARNm de un gen de DMD que codifica una proteína distrofina. Un pre-ARNm de DMD mutado corresponde a un pre-ARNm de un paciente con BMD o DMD con una mutación en comparación con un pre-ARNm de DMD de tipo salvaje de una persona no afectada, lo que da como resultado (niveles reducidos de) una proteína aberrante (BMD), o la ausencia de distrofina funcional (DMD). Un pre-ARNm de DMD también se denomina pre-ARNm de distrofina. Un gen de DMD también puede denominarse gen de distrofina. La distrofina y DMD se pueden usar indistintamente a lo largo de la solicitud.
Un paciente preferiblemente pretende significar un paciente que tiene DMD o BMD como se define más adelante en esta invención o un paciente susceptible de desarrollar DMD o BMD debido a sus antecedentes genéticos. En el caso de un paciente con DMD, un oligonucleótido usado preferiblemente corregirá una mutación tal como está presente en el gen de DMD de dicho paciente y creará una proteína que se será semejante a una proteína de BMD: dicha proteína será preferiblemente una distrofina funcional o semifuncional como se define más adelante en esta invención. En el caso de un paciente con BMD, un oligonucleótido tal como se usa preferiblemente corregirá una mutación presente en el gen de BMD de dicho paciente y creará una distrofina que será más funcional que la distrofina que estaba presente originalmente en dicho paciente con BMD. Como se define en esta invención, una distrofina funcional es preferiblemente una distrofina de tipo salvaje correspondiente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos identificada en SEQ ID NO: 1. Como se define en esta invención, una distrofina semifuncional es preferiblemente una distrofina similar a la BMD que corresponde a una proteína que tiene un dominio de unión a actina en su parte N-terminal (primeros 240 aminoácidos en el extremo N-terminal), un dominio rico en cisteína (aminoácidos 3361 a 3685) y un dominio C-terminal (últimos 325 aminoácidos en el extremo C-terminal), cada uno de estos dominios estando presentes en una distrofina de tipo salvaje conocida por el experto en la materia. Los aminoácidos indicados en esta invención corresponden a aminoácidos de la distrofina de tipo salvaje representados por SEQ ID NO: 1. En otras palabras, una distrofina funcional o semifuncional es una distrofina que presenta al menos hasta cierto punto una actividad de una distrofina de tipo salvaje. "Al menos hasta cierto punto" significa preferiblemente al menos l0 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de una actividad correspondiente de una distrofina funcional de tipo salvaje. En este contexto, una actividad de una distrofina funcional se une preferiblemente a actina y al complejo de glicoproteína asociada a distrofina (DGC o DAPC) (Ehmsen J y col., 2002).
La unión de la distrofina a la actina y al complejo DGC o DAPC puede visualizarse por coinmunoprecipitación usando extractos de proteínas totales o análisis de inmunofluorescencia de secciones transversales usando varios anticuerpos que reaccionan con los diferentes miembros del complejo, de una biopsia de control (sin DMD) de entre uno de un músculo sospechoso de ser distrófico, pre- y/o postratamiento, como es conocido por el experto en la materia.
Los individuos o pacientes que padecen distrofia muscular de Duchenne típicamente tienen una mutación en el gen que codifica la distrofina (el gen de DMD o de distrofina) que impide la síntesis de la proteína completa, es decir, un codón de parada prematuro impide la síntesis del extremo C-terminal. En la distrofia muscular de Becker, el gen de la distrofina también comprende una mutación en comparación con el tipo salvaje, pero la mutación típicamente no da como resultado un codón de parada prematuro y el extremo C-terminal se sintetiza típicamente. Como resultado, se sintetiza una proteína distrofina funcional o semifuncional que tiene al menos la misma actividad del mismo modo que la proteína de tipo salvaje, aunque no necesariamente la misma cantidad de actividad. El genoma de un paciente con BMD típicamente codifica una proteína distrofina que comprende la parte de extremo N-terminal (primeros 240 aminoácidos en el extremo N-terminal), un dominio rico en cisteína (aminoácidos 3361 hasta 3685) y un dominio C-terminal (últimos 325 aminoácidos en el extremo C-terminal) pero en la mayoría de los casos su dominio en forma de varilla central es más corto que el de una distrofina de tipo salvaje (Monaco y col., 1988). La omisión de exón inducida por oligonucleótidos antisentido para el tratamiento de la DMD se dirige típicamente a superar una parada prematura en el pre-ARNm omitiendo un exón, preferiblemente en el dominio en forma de varilla central, para corregir el marco de lectura abierto y permitir la síntesis del resto de la proteína distrofina, incluyendo el extremo C-terminal, aunque la proteína es algo más pequeña como resultado de un dominio de varilla más pequeño. En una realización preferida, a un individuo que tenga DMD y esté siendo tratado por un oligonucleótido como se define en esta invención se le proporcionará una distrofina que presenta al menos hasta cierto punto una actividad de una distrofina de tipo salvaje. Más preferiblemente, si dicho individuo es un paciente con Duchenne o se sospecha que es un paciente con Duchenne, una distrofina funcional o semifuncional es una distrofina de un individuo que tiene BMD, típicamente dicha distrofina es capaz de interactuar tanto con la actina como con DGC o DAPC, pero su dominio en forma de varilla central puede ser más corto que el de una distrofina de tipo salvaje (Monaco y col., 1988). El dominio de varilla central de la distrofina de tipo salvaje comprende 24 repeticiones de tipo espectrina. Por ejemplo, un dominio en forma de varilla central de una distrofina como se proporciona en esta invención puede comprender de 5 a 23, de 10 a 22 o de 12 a 18 repeticiones de tipo espectrina siempre que pueda unirse a la actina y a DGC.
El alivio de uno o más síntomas de la distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker en un individuo que usa un oligonucleótido de la invención puede evaluarse mediante cualquiera de los siguientes ensayos: prolongación del tiempo hasta la pérdida de la marcha, mejora de la fuerza muscular, mejora de la capacidad para levantar peso, mejora del tiempo necesario para levantarse del suelo, mejora del tiempo de marcha de nueve metros, mejora del tiempo necesario para subir cuatro escalones, mejora del grado de función de la pierna, mejora de la función pulmonar, mejora de la función cardíaca, mejora de la calidad de vida. El experto en la materia conoce cada uno de estos ensayos. Como ejemplo, la publicación de Manzur y col. (2008) da una explicación extensa de cada uno de estos ensayos. Para cada uno de estos ensayos, tan pronto como se haya encontrado una mejora o prolongación detectable de un parámetro medido en un ensayo, significará preferiblemente que uno o más síntomas de la distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker se han aliviado en un individuo usando un oligonucleótido de la invención. La mejora o prolongación detectable es preferiblemente una mejora o prolongación estadísticamente significativa como se describe en Hodgetts y col. (2006). Alternativamente, el alivio de uno o más síntomas de distrofia muscular de Duchenne o distrofia muscular de Becker puede evaluarse midiendo una mejora de la función, integridad y/o supervivencia de una fibra muscular. En un procedimiento preferido, uno o más síntomas de un paciente con DMD o con BMD se alivian y/o una o más características de una o más células musculares de un paciente con DMD o con BMD se mejoran. Dichos síntomas o características pueden evaluarse a nivel celular, tisular o en el propio paciente.
El alivio de una o más características de una célula muscular de un paciente puede evaluarse mediante cualquiera de los siguientes ensayos en una célula miogénica o una célula muscular de un paciente: reducción de la captación de calcio por las células musculares, disminución de la síntesis de colágeno, alteración de la morfología, alteración de la biosíntesis de lípidos, disminución del estrés oxidativo, y/o mejora de la función, integridad y/o supervivencia de una fibra muscular. Estos parámetros generalmente se evalúan mediante inmunofluorescencia y/o análisis histoquímicos de secciones transversales de biopsias musculares.
La mejora de la función, integridad y/o supervivencia de una fibra muscular se puede evaluar utilizando al menos uno de los siguientes ensayos: una disminución detectable de la creatina quinasa en sangre, una disminución detectable de la necrosis de las fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo que se sospecha que es distrófico y/o un aumento detectable de la homogeneidad del diámetro de las fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo que se sospecha que es distrófico. El experto en la materia conoce cada uno de estos ensayos.
La creatina quinasa puede detectarse en sangre como se describe en Hodgetts y col. (2006). Una disminución detectable en la creatina quinasa puede significar una disminución de 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en comparación con la concentración de creatina quinasa en un mismo paciente con DMD o BMD antes del tratamiento.
Una disminución detectable de la necrosis de las fibras musculares se evalúa preferiblemente en una biopsia muscular, más preferiblemente como se describe en Hodgetts y col. (2006), utilizando secciones transversales de biopsia. Una disminución detectable de necrosis puede ser una disminución de 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más del área donde se ha identificado necrosis usando secciones transversales de biopsia. La disminución se mide por comparación con la necrosis evaluada en un mismo paciente con DMD o BMD antes del tratamiento.
Un aumento detectable de la homogeneidad del diámetro de una fibra muscular se evalúa preferiblemente en una sección transversal de biopsia muscular, más preferiblemente como se describe en Hodgetts y col. (2006). El aumento se mide por comparación con la homogeneidad del diámetro de una fibra muscular en un mismo paciente con DMD o BMD antes del tratamiento.
Preferiblemente, un oligonucleótido de la invención proporciona a dicho individuo una proteína distrofina funcional o semifuncional (típicamente en el caso de DMD) y es capaz de, al menos en parte, disminuir la producción de una proteína distrofina aberrante en dicho individuo (típicamente en el caso de la b Md ).
Disminuir la producción de un ARNm de distrofina aberrante, o una proteína distrofina aberrante, preferiblemente significa que un 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o menos de la cantidad inicial de ARNm de distrofina aberrante, o proteína distrofina aberrante, todavía es detectable por análisis por RT PCR (ARNm) o inmunofluorescencia o inmunoelectrotransferencia (proteína). Un ARNm o proteína de distrofina aberrante también se denomina en esta invención como una proteína distrofina menos funcional (en comparación con una proteína distrofina funcional de tipo salvaje como se definió anteriormente en esta invención) o un ARNm o proteína de distrofina no funcional. Una proteína distrofina no funcional es preferiblemente una proteína distrofina que no puede unirse a la actina y/o miembros del complejo proteico DGC. Una proteína distrofina o ARNm de distrofina no funcional típicamente no tiene, o no codifica, una proteína distrofina con un extremo C-terminal intacto de la proteína. La detección de un ARNm o proteína de distrofina funcional o semifuncional puede realizarse como para un ARNm o proteína de distrofina aberrante.
Una vez que un paciente con DMD recibe una proteína distrofina funcional o semifuncional, se elimina al menos parte de la causa de la DMD. Por lo tanto, sería de esperar que los síntomas de la DMD se alivien al menos en parte. La frecuencia de omisión mejorada también aumenta el nivel de proteína distrofina funcional o semifuncional que se produce en una célula muscular de un individuo con DMD o BMD.
Los exones contienen una o más secuencias específicas que comprenden elementos reguladores de splicing que han demostrado ser dianas efectivas para oligonucleótidos antisentido (Aartsma-Rus y col., 2010). Por tanto, una realización proporciona un oligonucleótido como se define en las reivindicaciones 1-12 para proporcionar a dicho individuo una proteína distrofina funcional o semifuncional donde dicho oligonucleótido comprende una secuencia que se une a y/o se hibrida con y/o bloquea específicamente estos elementos reguladores de splicing en un exón de pre-ARNm de distrofina. Tal oligonucleótido también puede unirse a y/o dirigirse a y/o se hibrida con y/o bloquea estos elementos reguladores de splicing en un pre-ARNm de distrofina. Además, dado que un exón solo se incluirá en el ARNm resultante cuando ambos sitios de splicing sean reconocidos por el complejo de espliceosoma, los sitios de splicing son otras dianas para un oligonucleótido de la invención. Por tanto, una realización proporciona un oligonucleótido para proporcionar a dicho individuo una proteína distrofina funcional o semifuncional donde dicho oligonucleótido comprende una secuencia que se une a y/o se dirige a y/o se hibrida con y/o bloquea específicamente uno o ambos sitios de splicing de un exón de un pre-ARNm de distrofina. Tal oligonucleótido también puede unirse a y/o dirigirse a, hibridarse con y/o bloquear uno o ambos de estos sitios de splicing de un exón de un pre-ARNm de distrofina. Normalmente, un sitio de splicing de un exón comprende 1,2, 3 o más nucleótidos presentes en dicho exón y 1, 2, 3 o más nucleótidos presentes en un intrón adyacente o vecino. En una realización, se usa un oligonucleótido que se une únicamente a y/o se dirige a y/o se hibrida con una región de intrón de un pre-ARNm de distrofina. Tal oligonucleótido es capaz de unirse a y/o capaz de dirigirse a y/o capaz de hibridarse con dicha región de intrón. Sin embargo, esto no es necesario: también es posible utilizar un oligonucleótido que se dirija a y/o se una a y/o se hibride con y/o sea capaz de dirigirse a y/o sea capaz de unirse a y/o sea capaz de hibridarse con una secuencia específica de intrones así como con una secuencia específica de exones. Por supuesto, un oligonucleótido no se une necesariamente a y/o se dirige a y/o se hibrida con la secuencia completa de un exón o intrón de distrofina. Tal oligonucleótido tampoco es necesariamente capaz de unirse a y/o capaz de dirigirse a y/o capaz de hibridarse con la secuencia completa de un exón o intrón de distrofina. Se prefieren oligonucleótidos que específicamente se unan, se dirijan a y/o se hibriden con y/o que específicamente sean capaces de unirse a y/o capaces de dirigirse a y/o capaces de hibridar parte de dicho exón o intrón. Se usa un oligonucleótido, dicho oligonucleótido es preferiblemente inversamente complementario a, y/o se une a, y/o se dirige a y/o se hibrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con al menos parte de un exón y/o intrón de distrofina, teniendo dicha parte al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
El splicing de un pre-ARNm de distrofina se produce a través de dos reacciones de transesterificación secuenciales que involucran un punto de ramificación intrónica y un sitio de splicing de un intrón adyacente. Por tanto, se utiliza un oligonucleótido para la omisión de un exón, donde dicho oligonucleótido comprende una secuencia que se une a y/o se dirige a y/o se hibrida con o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con tal punto de ramificación y/o sitio de splicing. Preferiblemente dicho sitio de splicing y/o punto de ramificación está presente en un pre-ARNm de distrofina.
Dado que los sitios de splicing contienen secuencias consenso, el uso de una parte de oligonucleótido o un equivalente funcional del mismo que comprende una secuencia que puede unirse a y/o capaz de unirse a y/o capaz de dirigirse a y/o capaz de hibridarse con y/o se une a y/o se dirige a y/o se hibrida con un sitio de splicing implica el riesgo de hibridación promiscua. La hibridación de dicho oligonucleótido en otros sitios de splicing distintos de los sitios del exón que se va a omitir podría interferir fácilmente con la precisión del procedimiento de splicing. Para superar estos y otros problemas potenciales relacionados con el uso de un oligonucleótido que se une a y/o se hibrida con y/o se dirige a y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con un sitio de corte y empalme, la realización más preferida proporciona un oligonucleótido para proporcionar a dicho individuo una proteína distrofina funcional o semifuncional, donde dicho oligonucleótido o un equivalente funcional del mismo, se une a y/o se hibrida con y/o se dirige a y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de hibridarse con y/o es capaz de dirigirse a una parte específica de un exón de pre-ARNm de distrofina. Los exones contienen secuencias codificantes que son típicamente más específicas que las secuencias de intrón no codificantes. Preferiblemente, dicho oligonucleótido que se une a y/o se hibrida con y/o se dirige a y/o es capaz de unirse a y/o capaz de hibridarse con y/o capaz de dirigirse a una parte específica de un exón de pre-ARNm de distrofina es capaz de bloquear, interferir y/o inhibir específicamente una secuencia reguladora de splicing y/o una estructura del(de los) exón(es) anticipado(s) en dicho pre-ARNm de distrofina. La interferencia con tal secuencia reguladora de splicing y/o la estructura tiene la ventaja de que dichos elementos se encuentran dentro del exón. Por tanto, el riesgo de efectos inespecíficos relacionados con la secuencia es limitado. Al proporcionar un oligonucleótido para el interior del exón a omitir, es posible ocultar el exón del aparato de splicing. El hecho de que el aparato de splicing no reconozca el exón que se va a omitir conduce, por tanto, a la exclusión del exón del ARNm final. Esta realización no interfiere directamente con el procedimiento enzimático de la maquinaria de splicing (la unión de los exones). Se piensa que esto permite que el procedimiento sea más específico y/o fiable. Se ha descubierto que un oligonucleótido que puede unirse a y/o capaz de unirse a y/o capaz de dirigirse a y/o capaz de hibridarse con y/o unirse a y/o hibridarse con y/o dirigirse a un exón en cualquier punto puede inducir la omisión de dicho exón.
En el contexto de la invención, un oligonucleótido de la invención puede comprender un equivalente funcional o un equivalente de un oligonucleótido. Un equivalente funcional o un equivalente de un oligonucleótido preferiblemente significa un oligonucleótido como se define en esta invención donde uno o más nucleótidos han sido sustituidos y donde una actividad de dicho equivalente funcional o equivalente se conserva al menos en cierta medida. Preferiblemente, una actividad de dicho oligonucleótido que comprende un equivalente funcional o equivalente de un oligonucleótido es proporcionar una proteína distrofina funcional o semifuncional. Por tanto, dicha actividad de dicho oligonucleótido que comprende un equivalente funcional o un equivalente de un oligonucleótido se evalúa preferiblemente cuantificando la cantidad de una proteína distrofina funcional o semifuncional. Una distrofina funcional o semifuncional se define en esta invención preferiblemente como una distrofina capaz de unirse a actina y miembros del complejo proteico DGC (o DAPC). La evaluación de dicha actividad de dicho equivalente funcional de un oligonucleótido se realiza preferiblemente mediante analísis por RT-PCR y secuenciación (a nivel de ARN; para detección de omisión de exón específico), o mediante inmunofluorescencia e inmunoelectrotransferencia (a nivel de proteína: para detección de restauración de proteínas). Preferiblemente, dicha actividad se conserva al menos en cierta medida cuando representa al menos 50 %, o al menos 60 %, o al menos 70 %, o al menos 80 %, o al menos 90 %, o al menos 95 % o más de la actividad correspondiente de dicho oligonucleótido del que deriva el equivalente funcional o equivalente. A lo largo de esta solicitud, cuando se usa la palabra oligonucleótido, se puede reemplazar por un equivalente funcional del mismo o un equivalente del mismo como se define en esta invención. En una realización, un equivalente o un equivalente funcional de un oligonucleótido de la invención comprende una modificación. A lo largo de esta solicitud, cuando se usa la palabra oligonucleótido, ésta puede ser reemplazada por un oligonucleótido antisentido como se define en esta invención a menos que se indique lo contrario.
Por lo tanto, el uso de un oligonucleótido o un equivalente funcional del mismo, o un equivalente del mismo que comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato o que consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y que comprende una base de 5-metilcitosina y opcionalmente otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina y que se representa por una secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en una secuencia que es inversamente complementaria a, y/o se une a y/o se dirige a y/o se hibrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con un exón de pre-ARNm de distrofina se supone que tiene un efecto positivo en al menos uno de los parámetros de dicho oligonucleótido, como ya se ha definido en esta invención, en comparación con sus homólogos que no comprenden 5-metilcitosina, 5-metiluracilo y 2,6-diaminopurina (es decir, el llamado oligonucleótido no modificado) como se indicó anteriormente en esta invención y, por lo tanto, se supone que presenta un resultado terapéutico mejorado en una célula de DMD o de BMD de un paciente y/o en un paciente con DMD o BMD. Tal resultado terapéutico puede caracterizarse por:
- aliviar uno o más síntomas de DMD o BMD y/o
- aliviar una o más características de una célula muscular de un paciente y/o
- proporcionar a dicho individuo una proteína distrofina funcional o semifuncional y/o
- disminuir al menos en parte la producción de una proteína distrofina aberrante en dicho individuo.
Cada una de estas características ya se ha definido en esta invención.
Preferiblemente, un oligonucleótido está representado por una secuencia de nucleótidos que comprende o consiste en una secuencia que se une a y/o se dirige a y/o es inversamente complementaria a y/o se hibrida con y/o que es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con y/o es inversamente complementaria a al menos una parte de los exones 44 a 55 de pre-ARNm de distrofina, teniendo dicho oligonucleótido una longitud de al menos 10 nucleótidos. Sin embargo, la longitud de dicho oligonucleótido puede ser de al menos 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32 o 33 nucleótidos. A lo largo de la invención, dicha secuencia que representa el oligonucleótido también puede denominarse una base o una secuencia de nucleótidos.
Preferiblemente, un oligonucleótido de la invención está representado por una secuencia de nucleótidos o una secuencia de bases que comprende o consiste en una secuencia que es capaz de unirse a, y/o dirigirse a y/o que es inversamente complementaria a y/o se hibrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de hibridarse con y/o es capaz de dirigirse a una parte de un exón de pre-ARNm de distrofina. Dicha parte de unión o dirigida puede ser al menos el 50 % de la longitud del oligonucleótido de la invención, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 95 %, o un 98 % y hasta un 100 %. Un oligonucleótido puede estar representado por un nucleótido o una secuencia de bases, comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos o de bases una secuencia que se une a y/o se dirige a y/o es inversamente complementaria a y/o se hibrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de hibridarse con y/o es capaz de dirigirse a al menos una parte de un exón seleccionado de entre el grupo que consiste en los exones 44 a 55 del pre-ARNm de distrofina como se define en esta invención y secuencias flanqueantes adicionales. En una realización más preferida, la longitud de dicha parte de unión o dirigida de dicho oligonucleótido es de al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Pueden usarse varios tipos de secuencias flanqueantes. Preferiblemente, las secuencias flanqueantes se usan para modificar la unión de una proteína a dicho oligonucleótido, o para modificar una propiedad termodinámica de dicho oligonucleótido, más preferiblemente para modificar la afinidad de unión del ARN diana. En otra realización preferida, las secuencias flanqueantes adicionales son inversamente complementarias a las secuencias del pre-ARNm de distrofina que no están presentes en dicho exón. Tales secuencias flanqueantes son preferiblemente capaces de unirse a y/o dirigirse a secuencias que comprenden o consisten en secuencias consenso donantes o aceptoras de punto de ramificación y/o del sitio de splicing de dicho exón. En una realización preferida de la invención, tales secuencias flanqueantes son capaces de unirse a y/o dirigirse a secuencias que comprenden o consisten en secuencias de un intrón del pre-ARNm de distrofina que es adyacente a dicho exón.
Una realización preferida proporciona un oligonucleótido para proporcionar a dicho individuo una proteína distrofina funcional o semifuncional, dicho oligonucleótido o un equivalente funcional del mismo o un equivalente del mismo, estando representado por una secuencia o una secuencia de bases que comprende:
- una secuencia que se une, es capaz de unirse, se dirige a, se hibrida con o es inversamente complementaria a una región de un exón de pre-ARNm de distrofina que se hibrida con otra parte de un exón de pre-ARNm de distrofina (estructura cerrada), y
- una secuencia que se une a y/o se dirige a y/o se hibrida con y/o es inversamente complementaria a y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con una región de un exón de pre-ARNm de distrofina que no está hibridado en dicho pre-ARNm de distrofina (estructura abierta).
Para esta realización, se hace referencia a la solicitud de patente WO 2004/083446. Las moléculas de ARN presentan fuertes estructuras secundarias, principalmente debido al apareamiento de bases de tramos complementarios o parcialmente complementarios dentro del mismo ARN. Hace mucho tiempo que se pensaba que las estructuras del ARN desempeñan un papel en la función del ARN. Sin quedar ligado por la teoría, se cree que la estructura secundaria del ARN de un exón desempeña un papel en la estructuración del procedimiento de splicing. A través de su estructura, un exón es reconocido como una parte que debe incluirse en el ARNm. En una realización, un oligonucleótido es capaz de interferir con la estructura del exón y, por tanto, puede interferir con el aparato de splicing de dicho exón, ocultando el exón del aparato de splicing e induciendo así la omisión de dicho exón. Se ha comprobado que muchos oligonucleótidos comprenden de hecho esta capacidad, algunos más eficaces que otros. Sin quedar ligado por la teoría, se cree que la superposición con una estructura abierta mejora la eficacia de invasión del oligonucleótido (es decir, aumenta la eficacia con la que el oligonucleótido puede entrar en la estructura), mientras que la superposición con la estructura cerrada aumenta posteriormente la eficacia de la interferencia con la estructura secundaria del ARN del exón. Se comprueba que la longitud de la complementariedad inversa parcial tanto de la estructura cerrada como de la abierta no está extremadamente restringida. Se ha observado altas eficiencias con compuestos que comprenden oligonucleótidos con longitudes variables de complementariedad inversa en cualquier estructura. El término complementariedad (inversa) se usa en esta invención para referirse a un tramo de ácidos nucleicos que puede hibridarse con otro tramo de ácidos nucleicos en condiciones fisiológicas. Las condiciones de hibridación se definen más adelante en esta invención. Por tanto, no es absolutamente necesario que todas las bases en la región de complementariedad sean capaces de aparearse con bases en la hebra opuesta. Por ejemplo, cuando se diseña un oligonucleótido antisentido, se puede querer incorporar, por ejemplo, un residuo que no se aparea con la base de la hebra complementaria. Los apareamientos erróneos pueden permitirse hasta cierto punto si, en las circunstancias de la célula, el tramo de nucleótidos es capaz de hibridarse con la parte complementaria.
En una realización preferida de la invención, una parte inversamente complementaria de un oligonucleótido antisentido (ya sea para dicha estructura abierta o dicha estructura cerrada) comprende al menos 3, y más preferiblemente al menos 4 nucleótidos consecutivos. Las regiones complementarias inversas se diseñan preferiblemente de modo que, cuando se combinan, sean específicas para un exón en un pre-ARNm. Tal especificidad puede crearse con varias longitudes de regiones complementarias inversas ya que esto depende de las secuencias reales en otro (pre-)ARNm en el sistema. El riesgo de que también uno o más pre-ARNm puedan hibridarse con un oligonucleótido disminuye al aumentar el tamaño de dicho oligonucleótido. Queda claro que un oligonucleótido antisentido que comprende apareamientos erróneos en la región de complementariedad inversa pero que conserva la capacidad de hibridarse con la región o regiones dirigidas en el pre-ARNm, puede usarse en la presente invención. Sin embargo, preferiblemente, al menos las partes complementarias inversas no comprenden tales apareamientos erróneos, ya que típicamente tienen una mayor eficacia y una mayor especificidad que el oligonucleótido que tiene tales apareamientos erróneos en una o más regiones complementarias inversas. Se cree que las fuerzas de hibridación más altas (es decir, un número creciente de interacciones con la hebra opuesta) son favorables para aumentar la eficacia del procedimiento de interferencia con la maquinaria de splicing del sistema. Preferiblemente, la complementariedad inversa es de 90 a 100 %. En general, esto permite 1 o 2 apareamientos erróneos en un oligonucleótido de 20 nucleótidos o de 1 a 4 apareamientos erróneos en un oligonucleótido de 40 nucleótidos. Por lo tanto, se puede tener 1, 2, 3, 4, 5 apareamientos erróneos en un oligonucleótido de 10 a 50 nucleótidos. Preferiblemente, están presentes 0, 1 o 2 apareamientos erróneos en un oligonucleótido de 10 a 50 nucleótidos.
La estructura (es decir, estructuras abiertas y cerradas) se analiza mejor en el contexto del pre-ARNm donde reside el exón. Tal estructura se puede analizar en el ARN real. Sin embargo, actualmente es posible predecir bastante bien la estructura secundaria de una molécula de ARN (con un consumo energético reducido) utilizando programas de modelado de estructuras. Ejemplos no limitantes de un programa adecuado son RNA structure versión 4.5 o RNA mfold versión 3.5 (Zuker y col., 2003). Un experto en la técnica podrá predecir, con una reproducibilidad adecuada, una estructura probable de un exón, dada una secuencia de nucleótidos. Las mejores predicciones se obtienen cuando se proporcionan tales programas de modelado con dichas secuencias de exón e intrón flanqueantes. Por lo general, no es necesario modelar la estructura de todo el pre-ARNm.
La estructura abierta y cerrada a la que se dirige el oligonucleótido de un oligonucleótido son preferiblemente adyacentes entre sí. Se cree que de esta manera la hibridación del oligonucleótido con la estructura abierta induce la apertura de la estructura cerrada, tras lo cual la hibridación progresa en esta estructura cerrada. Mediante esta acción, la estructura previamente cerrada asume una conformación diferente. Sin embargo, cuando están presentes secuencias potenciales (crípticas) aceptadoras y/o donantes de splicing dentro del exón dirigido, ocasionalmente se genera una nueva señal de inclusión de exón o una secuencia, elemento, estructura o señal reguladora de splicing que define un (neo)exón diferente, es decir, con un extremo 5' diferente, un extremo 3' diferente, o ambos. Este tipo de actividad está dentro del alcance de la presente invención ya que el exón dirigido está excluido del ARNm. La presencia de un nuevo exón, que contiene parte del exón dirigido, en el ARNm no altera el hecho de que el exón dirigido, como tal, está excluido. La inclusión de un neoexón puede verse como un efecto secundario que se produce solo ocasionalmente. Hay dos posibilidades cuando se usa la omisión de exón para restaurar (parte de) un marco de lectura abierto de distrofina que se altera como resultado de una mutación. Una es que el neoexón es funcional en la restauración del marco de lectura, mientras que en el otro caso no se restaura el marco de lectura. Cuando se selecciona un compuesto que comprende un oligonucleótido para restaurar los marcos de lectura de distrofina mediante omisión de exón, por supuesto, queda claro que en estas condiciones solo se seleccionan aquellos compuestos que comprenden esos oligonucleótidos que de hecho dan como resultado una omisión de exón que restaura el marco de lectura abierto de distrofina, con o sin un neoexón.
Además se proporciona un oligonucleótido para proporcionar a dicho individuo una proteína funcional o semifuncional de distrofina, donde dicho oligonucleótido o un equivalente funcional del mismo o un equivalente del mismo comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una base de 5-metilcitosina y opcionalmente otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina y se representa por un nucleótido o secuencia de bases que comprende una secuencia que es inversamente complementaria a y/o se une a y/o se dirige a y/o se híbrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con un sitio de unión para una proteína serina arginina (SR) en el ARN de un exón de un pre-ARNm de distrofina. En la solicitud de patente WO 2006/112705 se ha divulgado la presencia de una correlación entre la efectividad de un oligonucleótido antisentido interno de exón para inducir la omisión de exones y la presencia de un sitio de unión de SR predicho (por ejemplo por ESEfinder) en el sitio de pre-ARNm diana de dicho AON. Por lo tanto, en una realización se genera un oligonucleótido que comprende determinar un sitio de unión (putativo) para una proteína SR (Ser-Arg) en el ARN de un exón de distrofina y producir un compuesto correspondiente que comprende un oligonucleótido que es inversamente complementario a y/o se une a y/o se dirige a y/o se hibrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con dicho ARN y que se superpone al menos parcialmente con dicho sitio de unión (putativo).
El término "se superpone al menos parcialmente" se define en esta invención como que comprende una superposición de un solo nucleótido de un sitio de unión a SR así como múltiples nucleótidos de dicho sitio de unión así como una superposición completa de dicho sitio de unión. Esta realización comprende preferiblemente además determinar a partir de una estructura secundaria de dicho ARN, una región que se hibrida con otra parte de dicho ARN (estructura cerrada) y una región que no se hibrida en dicha estructura (estructura abierta), y posteriormente generar un oligonucleótido que se superpone al menos parcialmente a dicho sitio de unión (putativo) y se superpone al menos en parte a dicha estructura cerrada y se superpone al menos en parte a dicha estructura abierta. De esta manera, se aumenta la posibilidad de obtener un oligonucleótido que sea capaz de interferir con la inclusión del exón del pre-ARNm en ARNm. Es posible que una primera región de unión a SR seleccionada no tenga la estructura abierta-cerrada solicitada, en cuyo caso se selecciona otro (segundo) sitio de unión a proteína SR que a continuación se somete posteriormente a ensayo para determinar la presencia de una estructura abierta-cerrada. Este procedimiento continúa hasta que se identifica una secuencia que contiene un sitio de unión a la proteína SR, así como una estructura abiertacerrada (parcialmente superpuesta). Esta secuencia se usa a continuación para diseñar un oligonucleótido que sea inversamente complementario a dicha secuencia.
Dicho procedimiento para generar un oligonucleótido antisentido también se realiza invirtiendo el orden descrito, es decir, generando primero un oligonucleótido que comprende determinar, a partir de una estructura secundaria de ARN a partir de un exón de distrofina, una región que asume una estructura que se hibrida con otra parte de dicho ARN (estructura cerrada) y una región que no se hibrida en dicha estructura (estructura abierta), y generar posteriormente un oligonucleótido, del cual al menos una parte de dicho oligonucleótido es inversamente complementaria a dicha estructura cerrada y del cual al menos otra parte de dicho oligonucleótido es inversamente complementaria a dicha estructura abierta. A continuación, se determina si un sitio de unión a la proteína SR se superpone al menos con dicha estructura abierta/cerrada. De esta forma, se mejora el procedimiento del documento WO 2004/083446. En otra realización más, las selecciones se realizan simultáneamente.
Sin desear quedar ligado a teoría alguna, actualmente se piensa que el uso de un oligonucleótido dirigido o dirigido selectivamente a un sitio de unión de la proteína SR da como resultado (al menos parcialmente) al deterioro de la unión de una proteína SR al sitio de unión de una proteína SR, lo que da como resultado a un splicing alterado o deteriorado.
Preferiblemente, una estructura abierta/cerrada y un sitio de unión a la proteína SR se superponen parcialmente y aún más preferido una estructura abierta/cerrada se superpone completamente a un sitio de unión a la proteína SR o un sitio de unión a la proteína SR se superpone completamente a una estructura abierta/cerrada. Esto permite una mejor alteración de la inclusión de exones.
Además de las secuencias de sitio de splicing y de punto de ramificación intrónicas consenso, muchos (si no todos) exones contienen secuencias reguladoras de splicing tales como, pero no se limitan a, secuencias potenciadoras exónicas de splicing (ESE, por sus siglas en inglés) para facilitar el reconocimiento de sitios de splicing genuinos por parte del espliceosoma (Cartegni y col., 2002; y Cartegni y col., 2003). Un subgrupo de factores de splicing, llamado proteínas SR, puede unirse a estas ESE y reclutar otros factores de splicing, tales como U1 y U2AF, a sitios de splicing (débilmente definidos). Los sitios de unión de las cuatro proteínas SR más abundantes (SF2/ASF, SC35, SRp40 y SRp55) se han analizado en detalle y estos resultados se implementan en ESEfinder, una fuente web que predice sitios de unión potenciales para estas proteínas SR (Cartegni y col., 2002; y Cartegni y col., 2003). Existe una correlación entre la eficacia de un oligonucleótido y la presencia/ausencia de un sitio de unión a SF2/ASF, SC35 y SRp40 en el sitio dirigido por dicho oligonucleótido. En una realización preferida de la invención, la invención proporciona un oligonucleótido como se describió anteriormente, que es inversamente complementario a y/o se dirige a y/o se une a y/o se hibrida con y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de hibridarse con un sitio de unión para una proteína SR. Preferiblemente, dicha proteína SR es SF2/ASF o SC35 o SRp40.
En una realización, a un paciente con DMD se le proporciona una proteína distrofina funcional o semifuncional mediante el uso de un oligonucleótido o un equivalente funcional del mismo o un equivalente del mismo que comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato o que consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y que comprende una base de 5-metilcitosina y opcionalmente otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina y es capaz de unirse o dirigirse específicamente a y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con una secuencia de ARN reguladora que se requiere para el splicing correcto de un exón de distrofina en un transcripto. Se requieren varias secuencias de ARN que actúan en cis para el splicing correcto de exones en un transcripto. En particular, elementos como un potenciador de splicing exónico (ESE), una secuencia de reconocimiento de exones (ERS, por sus siglas en inglés), y/o un silenciador de splicing exónico (ESS, por sus siglas en inglés) son identificados para regular el splicing específico y eficiente de exones constitutivos y alternativos. Usar un oligonucleótido antisentido específico de secuencia o un oligonucleótido (AON) antisentido específico de base que se une a y/o se dirige a y/o es inversamente complementario a y/o se hibrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de hibridarse con y/o es capaz de dirigirse a los elementos, su función reguladora se altera de modo que se omite el exón, como se muestra en el caso de la DMD. Por tanto, en una realización preferida de la invención, se usa un oligonucleótido o un equivalente funcional del mismo o un equivalente del mismo que es inversamente complementario a y/o se une a y/o se dirige a y/o se hibrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con un potenciador de splicing exónico (ESE), una secuencia de reconocimiento de exones (ERS), y/o un silenciador de splicing exónico (ESS).
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido de la invención comprende o consiste en una secuencia o una secuencia de bases que es inversamente complementaria a y/o se une a y/o se dirige a y/o se hibrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con al menos una parte del exón 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 o 55 de pre-ARNm de distrofina, teniendo dicha parte al menos 10 nucleótidos. Sin embargo, dicha parte también puede tener al menos 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Para los exones de distrofina identificados anteriormente, se proporciona el tramo de nucleótidos (SEQ ID NO: 2 a 13 identificadas a continuación) de dicho exón al que un oligonucleótido se une y/o es inversamente complementario y/o se dirige a y/o se hibrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con.
5'-GCGAUUUGACAGAUCUGUUGAGAAAUGGCGGCGUUUUCAUUAUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUA
ACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAAUACAAAUGGU
AUCUUAAG-3' (SEQ ID NO: 2) para omisión del exón 44;
5'-
GAACUCCAGGAUGGCAUUGGGCAGCGGCAAACUGUUGUCAGAACAUUGAAUGCAACUGGGGAAGAAAUA
AUUCAGCAAUCCUCAAAAACAGAUGCCAGUAUUCUACAGGAAAAAUUGGGAAGCCUGAAUCUGCGGUGGC AGGAGGUC UGCAAACAGCUGUCAGACAGAAAAAAGAG-3' (SEQ ID NO: 3) para omisión del exón 45:
5'-
GCUAGAAGAACAAAAGAAUAUCUUGUCAGAAUUUCAAAGAGAUUUAAAUGAAUUUGUUUUAUGGUUGGAG
GAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGCUUGAGC
AAGUCAAG-3' (SEQ ID NO: 4) para omisión del exón 46;
5'-
UUACUGGUGGAAGAGUUGCCCCUGCGCCAGGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUG
CUUGUAAGUGCUCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCA GUGGAUAAAG-3' (SEQ ID NO: 5) para omisión del exón 47
5'-GUUUCCAGAGCUUUACCUGAGAAACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGGCAGCUUGAAA AAAAGCUUGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCAUCUGCUGCUGUGGUUAUCUCCUAUUAGGAAUCAGUU GGAAAUUUAUAACCAACCAAACCAAGAAGGACCAUUUGACGUUCAG-3' (SEQ ID NO: 6) para omisión del exón 48
5'-GAAACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAGAUUUUGUCUAAAGGGCAGCAUUUGU ACAAGGAAAAACCAGCCACUCAGCCAGUGAAG-3' (SEQ ID NO: 7) para omisión del exón 49
5'-
AGGAAGUUAGAAGAUCUGAGCUCUGAGUGGAAGGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAG
CAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGGAGCCU-3' (SEQ ID NO: 8) para omisión del exón 50;
5'-CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGA
AAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUACCUGCUCUGGCAGAUUUCAACCGGGCUUGGACAGAACUUAC
CGACUGGCUUUCUCUGCUUGAUCAAGUUAUAAAAUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAUAU CAACGAGAUGAUCAUCAAGCAGAAG-3' (SEQ ID NO: 9) para omisión del exón 51;
5'-GCAACAAUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGA AAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCUAGAACAAUCAUUACGGAUCGAA-3' (SEQ ID NO: 10) para omisión del exón 52;
5'-UUGAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGA AAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGA GCCAAGCUUGAGUCAUGGAAGGAGGGUCCCUAUACAGUAGAUGCAAUCCAAAAGAAAAUCACAGAAACCA AG-3' (SEQ ID NO: 11) para omisión del exón 53;
5'-
CAGUUGGCCAAAGACCUCCGCCAGUGGCAGACAAAUGUAGAUGUGGCAAAUGACUUGGCCCUGAAACUU
CUCCGGGAUUAUUCUGCAGAUGAUACCAGAAAAGUCCACAUGAUAACAGAGAAUAUCAAUGCCUCUUGGA GAAGCAUUCAUAAAAG-3'(SEQ ID NO: 12) para omisión del exón 54;
5'-GGUGAGUGAGCGAGAGGCUGCUUUGGAAGAAACUCAUAGAUUACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGA AAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGAA AGGCUCCUAGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAACAAUGGCAA-3' (SEQ ID NO: 13) para omisión del exón 55.
Por lo tanto, un oligonucleótido preferido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y más preferiblemente comprende otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina y se une a y/o es inversamente complementario a y/o se dirige a y/o se hibrida con y/o es capaz de unirse a y/o es capaz de dirigirse a y/o es capaz de hibridarse con un tramo continuo de al menos 10 y hasta 33 nucleótidos dentro de una de las siguientes secuencias de nucleótidos de exón seleccionadas de entre SEQ ID NO: 2 a 13.
Los oligonucleótidos preferidos también se definen como sigue:
- comprenden un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprenden una 5-metilcitosina, y
- se unen a y/o son inversamente complementarios a y/o se dirigen a y/o se hibridan con y/o son capaces de unirse a y/o son capaces de dirigirse a y/o son capaces de hibridarse con un tramo continuo de al menos 10 y hasta 33 nucleótidos dentro de una de las siguientes secuencias de nucleótidos de exón seleccionadas de entre SEQ ID NO: 2 a 13 como se identificó anteriormente.
Más preferiblemente, tales oligonucleótidos comprenden otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención.
Los oligonucleótidos más preferidos comprenden un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprenden una base de 5-metilcitosina, y comprenden más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, y están representados por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 14-90 o por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 14­ 90. Las SEQ ID NO: 14-90 se identifican en la Tabla 1. En este contexto, "una 5-metilpirimidina" significa al menos una 5-metilpirimidina. En consecuencia, "al menos una 5-metilpirimidina" significa al menos una 5-metilcitosina y/o al menos un 5-metiluracilo.
En consecuencia, los oligonucleótidos no modificados preferidos se derivan preferiblemente de una de las secuencias de nucleótidos o de bases SEQ ID NO: 14-90 con X = C, Y = U, Z = A), y/o están representados por SEQ ID NO: 91, 93, 94-170. Cada uno de estos oligonucleótidos no modificados no comprende ni 5-metilpirimidina (es decir, una 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) ni 2,6-diaminopurina. Tenga en cuenta que la SEQ ID NO: 91 es idéntica a la SEQ ID NO: 132.
En consecuencia, los oligonucleótidos modificados preferidos se derivan de una de las secuencias de nucleótidos o de bases SEQ ID NO: 14-90 y comprenden al menos una 5-metilcitosina y opcionalmente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina (es decir, al menos una X es m5C = X1 y opcionalmente al menos una Y es m5U = Y1 y/u opcionalmente al menos una Z es a2A =Z1). Tenga en cuenta que SEQ ID NO: 92 es idéntica a SEQ ID NO: 199. Los oligonucleótidos modificados más preferidos están representados por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 92, 171-213, 215, 217, 218, 219. Los oligonucleótidos modificados incluso más preferidos (todas las X = m5C = X1 y/o todas las Y = m5U = Y1 y/o todas las Z = a2A =Z1) se derivan de las secuencias de nucleótidos o de bases más preferidas (SEQ ID NO: 15, 21, 31, 40, 52 y 57) y se representan por SEQ ID NO: 92, 171-174, 185-188, 199, 200, 202-215, 217, 218, 219. Los oligonucleótidos modificados más preferidos se describen en la Tabla 3.
Dentro del contexto de la invención, un fragmento de SEQ ID NO: 14-90, o un fragmento de SEQ ID NO: 91-219, preferiblemente significa un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos de dicha SEQ. ID NO: 14-90 o de dicha SEQ ID NO: 91-219.
Tales oligonucleótidos más preferidos también se definen como sigue:
- comprenden un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprenden una 5-metilcitosina, y
- están representados por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 14-90, 91, 93-170 o por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 14-90, 91, 93-170.
Más preferiblemente, tales oligonucleótidos comprenden otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención.
Los oligonucleótidos incluso más preferidos comprenden un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprenden una 5-metilcitosina, y comprenden más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, y están representados por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 14-90, 92, 171-215, 217, 218, 219, o por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 14-90, 92, 171-215, 217, 218, 219 y que tienen una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Las secuencias preferidas (es decir, las secuencias de nucleótidos o de bases preferidas) entre las SEQ ID NO: 14-90, 92 y 171-215, 217, 218, 219 incluyen las SEQ ID NO: 15, 21, 31,40, 43, 52, 57, 59, 171-174, 185-188, 199, 200, 202-213, 215, 217, 218, 219, más preferiblemente las SEQ ID NO: 40, 43, 52, 57, 59, 208, 207, 200, 210, 206, 171, 173, 199, 213, 185, 187.
Tales oligonucleótidos incluso más preferidos también se definen como sigue:
- comprenden un monómero de ARN 2'-0 -metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0 -metil fosforotioato y comprenden una 5-metilcitosina, y
- están representados por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 14-90, 91, 93-170, 216 o por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 14­ 90, 91, 93-170 y tienen una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24,25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, tales oligonucleótidos comprenden otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención.
Incluso más preferiblemente, tales oligonucleótidos modificados están representados por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 92, 171-213, 215217, 218, 219 o por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 92, 171-213, 215, 217, 218, 219 y tienen una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Los oligonucleótidos modificados incluso más preferidos se derivan de las secuencias de nucleótidos o de bases más preferidas (SEQ ID NO: 15, 21, 31, 40, 52 y 57) y están representados por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 92, 171-174, 185-188, 199, 200, 202-213, 215, 217, 218, 219 o por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 92, 171-174, 185-188, 199, 200, 202-213, 215, 217, 218, 219 y que tienen una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Los oligonucleótidos preferidos para inducir la omisión del exón 44 del pre-ARNm de distrofina son como se indica a continuación.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y más preferiblemente comprende otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende SEQ ID NO: 14 y tiene una longitud de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 14 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 14.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de SEQ ID NO: 14 está representado por SEQ ID NO: 94 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 94 está representado por SEQ ID NO: 143.
En consecuencia, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende SEQ ID NO: 94 y tiene una longitud de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 94 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 94.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos. Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 14 comprende SEQ ID NO: 63 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 94 comprende SEQ ID NO: 143, y cada uno de dichos fragmentos preferidos tiene una longitud de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 15 y tiene una longitud de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 15 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 15.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de SEQ ID NO: 15 está representado por SEQ ID NO: 95.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 95 y tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 95 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 95.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos. Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 15 comprende SEQ ID NO: 64 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 95 comprende s Eq ID NO: 144, y cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Tal oligonucleótido preferido también se define como sigue:
- comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y
- está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 15 o 95 o 64 o 144 y tiene una longitud de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 15 o 95 o 64 o 144, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 15 o 95 o 64 o 144.
Más preferiblemente, tal oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 15 y tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ iD NO: 15 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 15. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0 -metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende SEQ ID NO: 204 y tiene una longitud de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ iD NO: 204 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 204. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende SEQ ID NO: 208 y tiene una longitud de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ iD NO: 208 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 208. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos y todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende SEQ ID NO: 205 y tiene una longitud de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ iD NO: 205 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 205. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende SEQ ID NO: 207 y tiene una longitud de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ iD NO: 207 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 207. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2.6- diaminopurina, está representado por una secuencia de nucleótidos o de bases que comprende la SEQ ID NO: 16 y tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 16 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 16.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 16 está representado por la SEQ ID NO: 96.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 96 y tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 96 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 96.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2.6- diaminopurina, está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 17 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 17 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 17.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 17 está representado por la SEQ ID NO: 97 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 97 está representado por la SEQ ID NO: 145.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 97 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 97 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 97.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos. Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 17 comprende SEQ ID NO: 65 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 97 comprende SEQ ID NO: 145, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 18 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 18 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 18.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 18 está representado por la SEQ ID NO: 98 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 98 está representado por la SEQ ID NO: 146.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 18 comprende SEQ ID NO: 66 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 98 comprende SEQ ID NO: 146, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 98 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 98 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 98. En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 19 y tiene una longitud de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 19 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 19.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 19 está representado por la SEQ ID NO: 99.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 99 y tiene una longitud de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID No : 99 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 99.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 20 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 20 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 20.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 20 está representado por la SEQ ID NO: 100 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 100 está representado por la SEQ ID NO: 147, 148 o 149.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 100 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 100 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 100.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos. Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 20 comprende SEQ ID NO: 67 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 100 comprende SEQ ID NO: 147, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 20 comprende SEQ ID NO: 68 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 100 comprende SEQ ID NO: 148, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 20 comprende SEQ ID NO: 69 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 100 comprende SEQ ID NO: 149, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Los oligonucleótidos preferidos para inducir la omisión del exón 45 del pre-ARNm de distrofina son como se indica a continuación.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 21 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 21 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 21.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 21 está representado por la SEQ ID NO: 101 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 101 está representado por la SEQ ID NO: 150, 151 o 152.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 101 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 101 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 101.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos. Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 21 comprende SEQ ID NO: 70 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 101 comprende SEQ ID NO: 150, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 21 comprende SEQ ID NO: 71 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 101 comprende SEQ ID NO: 151, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 21 comprende SEQ ID NO: 72 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 101 comprende SEQ ID NO: 152, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Tal oligonucleótido preferido también se define como sigue:
- comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y
- está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 21 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un nucleótido o secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 21, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o bases contiguos de la SEQ ID NO: 21.
Más preferiblemente, tal oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 21 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 21 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 21.
Por consiguiente, dicho oligonucleótido está particularmente representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 200 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 200 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 200.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos y todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 209 en particular, y tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 21 o 209 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 21 o 209. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 210 en particular, y tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 21 o 210 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 21 o 210. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 22 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 22 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 22.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 22 está representado por la SEQ ID NO: 102.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 102 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 102 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 102.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidas o modificadas.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 23 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 23 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 23.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 23 está representado por la SEQ ID NO: 103.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por una secuencia de nucleótidos o de bases que comprende la SEQ ID NO: 103 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 103 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 103.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 24 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 24 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 24.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 24 está representado por la SEQ ID NO: 104.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por una secuencia de nucleótidos o de bases que comprende la SEQ ID NO: 104 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 104 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 104.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 25 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 25 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 25.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 25 está representado por la SEQ ID NO: 105.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 105 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 105 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 105.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 26 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 26.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 26 está representado por la SEQ ID NO: 106.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 106 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 106 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 106.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 27 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 27 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 27.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 27 está representado por la SEQ ID NO: 107.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 107 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 107 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 107.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 28 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 28 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 28.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 28 está representado por la SEQ ID NO: 108. Cada una de la SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 108 identificadas en la tabla 1 comprende una base de hipoxantina en la posición 7.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 108 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 108 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 108.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 29 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 29 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 29.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 29 está representado por la SEQ ID NO: 109.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 109 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 109 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 109.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 30 y tiene una longitud de 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 30 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 30.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 30 está representado por la SEQ ID NO: 110.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 110 y tiene una longitud de 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 110 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 110.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Los oligonucleótidos preferidos para inducir la omisión del exón 51 del pre-ARNm de distrofina son como se indica a continuación.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 31 y tiene una longitud de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 31 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 31. Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 31 está representado por la SEQ ID NO: 111 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 111 está representado por la SEQ ID NO: 153 o 154.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 111 y tiene una longitud de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ iD NO: 111 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 111.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 31 comprende SEQ ID NO: 73 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 111 comprende SEQ ID NO: 153, y cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 31 comprende SEQ ID NO: 74 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 111 comprende SEQ ID NO: 154, y cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Tal oligonucleótido preferido también se define como sigue:
- comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y
- está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 31 y tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 31, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o bases contiguos de la SEQ ID NO: 31.
Más preferiblemente, tal oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 31 o la SEQ ID NO: 215 y tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 31 o la SEQ ID NO: 215 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 31 o de SEQ ID NO: 215. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 202 y tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 202 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 202. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 203 y tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 203 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 203. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 206 y tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 206 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 206. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 32 y tiene una longitud de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 32 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de Se Q ID NO: 32.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 32 está representado por la SEQ ID NO: 112.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 112 y tiene una longitud de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 112 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 112.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 33 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 33 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 33.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 33 está representado por la SEQ ID NO: 113.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 113 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 113 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 113.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En otra realización, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 34 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 34 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de Se Q ID NO: 34.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 34 está representado por la SEQ ID NO: 114.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 114 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 114 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 114.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 34 comprende o consiste en SEQ ID NO: 93 (PS 1116: 5'-CAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCU-3').
Tal oligonucleótido preferido también se define como sigue:
- comprende un monómero de ARN 2'-0 -metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0 -metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y
- está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 34 o 93 o 114 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 34 o 93 o 114, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o bases contiguos de la SEQ ID NO: 34 o 93 o 114.
Más preferiblemente, tal oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 34 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 34 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 34. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 34 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 34 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 34. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 35 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 35 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 35.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 35 está representado por la SEQ ID NO: 115.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 115 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 115 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 115.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 36 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 36 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 36.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 36 está representado por la SEQ ID NO: 116 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 116 está representado por la SEQ ID NO: 155 o 156 o 157.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 116 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 116 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 116.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 36 comprende SEQ ID NO: 75 o un fragmento preferido de SEQ ID NO: 116 comprende SEQ ID NO: 155, y cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 36 comprende SEQ ID NO: 76 u otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 116 comprende SEQ ID NO: 156, y cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 36 comprende SEQ ID NO: 77 u otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 116 comprende Se Q ID NO: 157, y cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 37 y tiene una longitud de 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 37 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 37.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 37 está representado por la SEQ ID NO: 117.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2-O-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 117 y tiene una longitud de 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 117 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 117.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 38 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 38 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 38.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 38 está representado por la SEQ ID NO: 118.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 118 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 118 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 118.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Los oligonucleótidos preferidos para inducir la omisión del exón 52 del pre-ARNm de distrofina son como se indica a continuación.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 39 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 39 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 39.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 39 está representado por la SEQ ID NO: 119.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 119 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 119 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 119.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 201 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 201 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 201. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32 o 33 nucleótidos.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 40 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 40 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 40. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 40 está representado por la SEQ ID NO: 120 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 120 está representado por la SEQ ID NO: 158 o 159 o 160.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 120 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 120 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 120.
Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 40 comprende SEQ ID NO: 78 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 120 comprende SEQ ID NO: 158, y cada fragmento tiene una longitud de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 40 comprende SEQ ID NO: 79 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 120 comprende SEQ ID NO: 159, y cada fragmento tiene una longitud de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 40 comprende SEQ ID NO: 80 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 120 comprende SEQ ID NO: 160, y cada fragmento tiene una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Tal oligonucleótido preferido también se define como sigue:
- comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y
- está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 40 o 120 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 40 o 120, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o bases contiguos de la SEQ ID NO: 40 o 120.
Más preferiblemente, tal oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 40 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 40 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 40. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 171 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 171 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 171. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 4 citosinas de SEQ ID NO: 40 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 171. Se abarca que 1, 2 o 3 de estas citosinas estén modificadas.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 172 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 172 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 172. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todos los 7 uracilos de la SEQ ID NO: 40 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 172. Se abarca que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 173 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 173 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 173. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31,32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 5 adeninas de la SEQ ID NO: 40 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 173. Se abarca que 1, 2, 3 o 4 de estas adeninas estén modificadas.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 174 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 174 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 174. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 174 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 174 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 174. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 4 citosinas y no todos los 7 uracilos de la SEQ ID NO: 40 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 174. Se abarca que 1, 2, o 3 de estas citosinas y/o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 175 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 175 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 175. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 175 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 175 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 175. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 4 citosinas y no todas las 5 adeninas de la SEQ ID NO: 40 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 175. Se abarca que 1, 2, o 3 de estas citosinas y/o 1, 2, 3 o 4 de estas adeninas estén modificadas.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0 -metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 176 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 176 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 176. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 5 adeninas y no todos los 7 uracilos de la SEQ ID NO: 40 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 176. Se abarca que 1, 2, 3 o 4 de estas adeninas y/o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas, todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 177 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 177 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 177. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 4 citosinas y no todos los 7 uracilos y no todas las 5 adeninas de la SEQ ID NO: 40 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 177. Se abarca que 1, 2, o 3 de estas citosinas y/o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de estos uracilos y/o 1, 2, 3 o 4 de estas adeninas estén modificados.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 41 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 41 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 41.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 41 está representado por la SEQ ID NO: 121.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 121 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 121 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 121.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consiste en ARN i2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 42 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 42 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 42.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 42 está representado por la SEQ ID NO: 122.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 122 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 122 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 122.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 43 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 43 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 43.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Tal oligonucleótido preferido también se define como sigue:
- comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y
- está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 43 o 123 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 43 o 123, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 43 o 123. Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 43 está representado por la SEQ ID NO: 123 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 123 está representado por la SEQ ID NO: 161.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 123 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 123 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 123.
Más preferiblemente, tal oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención. Incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0 -metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 43 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 43 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 43. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32 o 33 nucleótidos. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 178 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 178 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 178. También se abarca que no todas las 6 citosinas de la SEQ ID NO: 43 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 178. Se abarca que 1, 2, 3, 4 o 5 de estas citosinas estén modificadas.
Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 43 comprende SEQ ID NO: 81 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 123 comprende SEQ ID NO: 161, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 179 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 179 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 179. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todos los 11 uracilos de la SEQ ID NO: 43 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 179. Se abarca que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 180 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 180 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 180. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 2 adeninas de la SEQ ID NO: 43 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 180. Se abarca que o 1 de estas adeninas esté modificada.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 181 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 181 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 181. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 181 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 181 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 181. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 6 citosinas y no todos los 11 uracilos de la SEQ ID NO: 43 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 181. Se abarca que 1, 2, 3, 4 o 5 de estas citosinas y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 182 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 182 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 182. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 182 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 182 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 182. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 6 citosinas y no todas las 2 adeninas de la SEQ ID NO: 43 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 182. Se abarca que 1, 2, 3, 4 o 5 de estas citosinas y/o 1 de estas adeninas estén modificadas.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 183 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 183 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 183. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 2 adeninas y no todos los 11 uracilos de la SEQ ID NO: 43 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 183. Se abarca que 1 de estas adeninas y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas, todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 184 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 184 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 184. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 6 citosinas y no todos los 11 uracilos y no todas las 2 adeninas de la SEQ ID NO: 43 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 184. Se abarca que 1, 2, 3, 4 o 5 de estas citosinas y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de estos uracilos y/o 1 de estas adeninas estén modificados.
Los oligonucleótidos preferidos para inducir la omisión del exón 53 del pre-ARNm de distrofina son como se indica a continuación.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 44 y tiene una longitud de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 44 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de Se Q ID NO: 44.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 44 está representado por la SEQ ID NO: 124.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 124 y tiene una longitud de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 124 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 124.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 45 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 45 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 45.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 45 está representado por la SEQ ID NO: 125.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 125 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 125 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 125.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 46 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 46 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 46.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 46 está representado por la SEQ ID NO: 126.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 126 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 126 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 126.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 47 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 47 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 47.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 47 está representado por la SEQ ID NO: 127.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 127 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 127 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 127.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 48 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25,26, 27, 28,29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 48 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 48.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 48 está representado por la SEQ ID NO: 128.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 128 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 128 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 128.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 49 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 49 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 49.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 49 está representado por la SEQ ID NO: 129.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 129 y tiene una longitud de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 129 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 129.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 50 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 50 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 50.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 50 está representado por la SEQ ID NO: 130.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 130 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 130 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 130.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 51 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 51 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 51.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 51 está representado por la SEQ ID NO: 131.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 131 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 131 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 131.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 52 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 52 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 52.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 52 está representado por la SEQ ID NO: 91 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 91 está representado por la SEQ ID NO: 162, 163 o 164. SEQ ID NO: 91 es idéntica a SEQ iD NO: 132.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 91 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 91 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 91.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Tal oligonucleótido preferido también se define como sigue:
- comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y
- está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 52 o 91 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 52 o 91, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o bases contiguos de la SEQ ID NO: 52 o 91.
Más preferiblemente, tal oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o secuencia de bases que comprende SEQ ID NO: 52 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 52 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 52. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos.
Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 52 comprende SEQ ID NO: 82 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 91 comprende SEQ ID NO: 162, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 52 comprende SEQ ID NO: 83 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 91 comprende SEQ ID NO: 163, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 52 comprende SEQ ID NO: 84 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 91 comprende SEQ ID NO: 164, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Un fragmento más preferido de SEQ ID NO: 52 comprende o consiste en SEQ ID NO: 91 (PS229L: 5'-GUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUC-3'). Otro fragmento más preferido de SEQ ID NO: 52 comprende o consiste en SEQ ID NO: 92 (PS524: 5'-GUUGXXUXXGGUUXUGAAGGUGUUX-3'; donde X es 5-metilcitosina).
Tal oligonucleótido preferido también se define como sigue:
- comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y
- está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 82, 83, 84, 91, 92, 162, 163 o 164 y tiene una longitud de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 82, 83, 84, 91, 92, 162, 163 o 164, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o bases contiguos de la SEQ ID NO: 82, 83, 84, 91, 92, 162, 163 o 164.
Más preferiblemente, tal oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 82, 83, 84 o 92 y tiene una longitud de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 82, 83, 84 o 92 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 82, 83, 84 o 92. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32 o 33 nucleótidos. SEQ ID NO: 92 es idéntica a SEQ ID NO: 199. También se abarca que no todas las 6 citosinas de la SEQ ID NO: 52 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 92. Se abarca que 1, 2, 3, 4 o 5 de estas citosinas estén modificadas.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- dos de sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 218 y tiene una longitud de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 218 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 218. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- tres de sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 219 y tiene una longitud de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 219 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 219. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- cuatro de sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 217 y tiene una longitud de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 217 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 217. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 211 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 211 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 211. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 211 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 211 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 211. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todos los 9 uracilos de la SEQ ID NO: 52 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 211. Se abarca que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 212 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 212 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 212. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 212 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 212 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 212. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 6 citosinas y no todos los 9 uracilos de la SEQ ID NO: 52 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 212. Se abarca que 1, 2, 3, 4 o 5 de estas citosinas y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 213 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 213 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 213. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 2 adeninas de la SEQ ID NO: 52 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 213. Se abarca que o 1 de estas adeninas esté modificada.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 53 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 53 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 53.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 53 está representado por la SEQ ID NO: 133.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 133 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 133 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 133.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-O-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-O-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 54 y tiene una longitud de 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 54 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 54.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 54 está representado por la SEQ ID NO: 134.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 134 y tiene una longitud de 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 134 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 134.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 55 y tiene una longitud de 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 55 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 55.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 55 está representado por la SEQ ID NO: 135.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 135 y tiene una longitud de 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 135 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 135.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 56 y tiene una longitud de 33, 34 o 35 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 56 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 56.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 56 está representado por la SEQ ID NO: 136.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 136 y tiene una longitud de 33, 34 o 35 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 136 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 136.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Los oligonucleótidos preferidos para inducir la omisión del exón 55 del pre-ARNm de distrofina son como se indica a continuación.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 57 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 57 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 57. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32 o 33 nucleótidos.
Tal oligonucleótido preferido también se define como sigue:
- comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y
- está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 57 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 57, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o bases contiguos de la SEQ ID NO: 57.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 57 está representado por la SEQ ID NO: 137 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 137 está representado por la SEQ ID NO: 165 o 166.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 137 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 137 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 137.
Más preferiblemente, tal oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención. Incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención. Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0 -metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 57 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 57 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 57.
Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 185 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 185 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 185. También se abarca que no todas las 8 citosinas de la SEQ ID NO: 57 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 185. Se abarca que 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de estas citosinas estén modificadas.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 57 comprende SEQ ID NO: 85 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 137 comprende SEQ ID NO: 165, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 57 comprende SEQ ID NO: 86 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 137 comprende SEQ ID NO: 166, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 186 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 186 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 186. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todos los 7 uracilos de la SEQ ID NO: 57 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 186. Se abarca que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 187 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 187 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 187. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 5 adeninas de la SEQ ID NO: 57 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 187. Se abarca que 1, 2, 3 o 4 de estas adeninas estén modificadas.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 188 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 188 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 188. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 188 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 188 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 188. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 8 citosinas y no todos los 7 uracilos de la SEQ ID NO: 57 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 188. Se abarca que 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de estas citosinas y/o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 189 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 189 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 189. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 189 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 189 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 189. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 8 citosinas y no todas las 5 adeninas de la SEQ ID NO: 57 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 189. Se abarca que 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de estas citosinas y/o 1, 2, 3 o 4 de estas adeninas estén modificadas.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 190 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 190 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 190. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 5 adeninas y no todos los 7 uracilos de la SEQ ID NO: 57 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 190. Se abarca que 1, 2, 3 o 4 de estas adeninas y/o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas, todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 191 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 191 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 191. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 8 citosinas y no todos los 7 uracilos y no todas las 5 adeninas de la SEQ ID NO: 57 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 191. Se abarca que 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de estas citosinas y/o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de estos uracilos y/o 1, 2, 3 o 4 de estas adeninas estén modificados.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 58 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 58 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 58.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 58 está representado por la SEQ ID NO: 138.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 138 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 138 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 138.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Tal oligonucleótido preferido también se define como sigue:
- comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y
- está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 58 o 138 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 58 o 138, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o bases contiguos de la SEQ ID NO: 58 o 138.
Más preferiblemente, tal oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 58 y tiene una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 58 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 58. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 59 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 59 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 59. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Tal oligonucleótido preferido también se define como sigue:
- comprende un monómero de ARN 2'-0 -metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0 -metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y
- está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 59 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de SEQ ID NO: 59, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o bases contiguos de la SEQ ID NO: 59.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 59 está representado por la SEQ ID NO: 139 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 139 está representado por la SEQ ID NO: 167 o 168 o 169 o 170.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonudeótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 139 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 139 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 139.
Más preferiblemente, tal oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina como se definió anteriormente en esta invención. Incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 59 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 59 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 59.
Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 192 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 192 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 192. También se abarca que no todas las 5 citosinas de la SEQ ID NO: 59 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 192. Se abarca que 1, 2, 3 o 4 de estas citosinas estén modificadas.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Un fragmento preferido de SEQ ID NO: 59 comprende SEQ ID NO: 87 y un fragmento preferido de SEQ ID NO: 139 comprende SEQ ID NO: 167, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 59 comprende SEQ ID NO: 88 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 139 comprende SEQ ID NO: 168, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 59 comprende SEQ ID NO: 89 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 139 comprende SEQ ID NO: 169, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. Otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 59 comprende SEQ ID NO: 90 y otro fragmento preferido de SEQ ID NO: 139 comprende SEQ ID NO: 170, cada uno de dichos fragmentos tiene una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 193 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 193 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 193. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todos los 6 uracilos de la SEQ ID NO: 59 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 193. Se abarca que 1, 2, 3, 4 o 5 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 194 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 194 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 194. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 6 adeninas de la SEQ ID NO: 59 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 194. Se abarca que 1, 2, 3, 4 o 5 de estas adeninas estén modificadas.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 195 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 195 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 195. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 195 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 195 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 195. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 5 citosinas y no todos los 6 uracilos de la SEQ ID NO: 59 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 195. Se abarca que 1, 2, 3 o 4 de estás citosinas y/o 1, 2, 3, 4, o 5 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 196 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 196 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 196. Por consiguiente, dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 196 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 196 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 196. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 5 citosinas y no todas las 6 adeninas de la SEQ ID NO: 59 estén modificadas como se representa en la SEQ ID NO: 196. Se abarca que 1, 2, 3 o 4 de estas citosinas y/o 1, 2, 3, 4 o 5 de estas adeninas estén modificadas.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 197 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 197 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 197. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 6 adeninas y no todos los 6 uracilos de la SEQ ID NO: 59 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 197. Se abarca que 1, 2, 3, 4 o 5 de estas adeninas y/o 1, 2, 3, 4 o 5 de estos uracilos estén modificados.
Más preferiblemente, un oligonucleótido:
- consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato,
- todas sus adeninas han sido reemplazadas por 2,6-diaminopurinas, todas sus citosinas han sido reemplazadas por 5-metilcitosinas y todos sus uracilos han sido reemplazados por 5-metiluracilos,
- tal oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 198 y tiene una longitud de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 198 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 198. Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos. También se abarca que no todas las 5 citosinas y no todos los 6 uracilos y no todas las 6 adeninas de la SEQ ID NO: 59 estén modificados como se representa en la SEQ ID NO: 198. Se abarca que 1, 2, 3 o 4 de estas citosinas y/o 1,2, 3, 4 o 5 de estos uracilos y/o 1,2, 3, 4 o 5 de estas adeninas estén modificados.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 60 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 60 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 60.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 60 está representado por la SEQ ID NO: 140.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 140 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 140 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 140.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 61 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 61 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 61.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 61 está representado por la SEQ ID NO: 141.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 141 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 141 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 141.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
En una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una base de 5-metilcitosina, o consisten en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, y comprende más preferiblemente otra 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 62 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 62 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 62.
Por consiguiente, un oligonucleótido no modificado derivado de la SEQ ID NO: 62 está representado por la SEQ ID NO: 142.
Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, un oligonucleótido comprende un monómero de ARN 2'-0-metil fosforotioato y una 5-metilcitosina, o consiste en ARN 2'-0-metil fosforotioato y comprende una 5-metilcitosina, está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende la SEQ ID NO: 142 y tiene una longitud de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 nucleótidos o por un fragmento de SEQ ID NO: 142 que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de s Eq ID NO: 142.
Tal fragmento tiene preferiblemente una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
En consecuencia, más preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende otra base de 5-metilpirimidina (es decir, otra 5-metilcitosina, y/o un 5-metiluracilo) y/o una 2,6-diaminopurina. En consecuencia, incluso más preferiblemente, dicho oligonucleótido tiene todas sus citosinas y opcionalmente todos sus uracilos y/o todas sus adeninas sustituidos o modificados como se define en esta invención.
Composición
En un segundo aspecto, se proporciona una composición que comprende un oligonucleótido como se describe en la sección anterior titulada "Oligonucleótido". Esta composición preferiblemente comprende o consiste en un oligonucleótido como se describió anteriormente.
En una realización preferida de la invención, dicha composición es para su uso como medicamento. Dicha composición es por lo tanto una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica comprende habitualmente un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida de la invención, una composición de la presente invención comprende un compuesto como se define en esta invención y opcionalmente comprende además una formulación, carga, conservante, solubilizante, vehículo, diluyente, excipiente, sal, adyuvante y/o disolvente farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo, carga, conservante, solubilizante, diluyente, sal, adyuvante, disolvente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable se puede encontrar, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edición. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000. El compuesto descrito en la invención puede poseer al menos un grupo ionizable. Un grupo ionizable puede ser una base o un ácido y puede estar cargado o ser neutro. Un grupo ionizable puede estar presente como un par de iones con un contraión apropiado que lleva carga(s) opuesta(s). Ejemplos de contraiones catiónicos son sodio, potasio, cesio, T ris, litio, calcio, magnesio, trialquilamonio, trietilamonio y tetraalquilamonio. Ejemplos de contraiones aniónicos son cloruro, bromuro, yoduro, lactato, mesilato, acetato, trifluoroacetato, dicloroacetato y citrato. Se han descrito ejemplos de contraiones. [p.ej., Kumar, 2008].
En una realización preferida de la invención, una composición comprende el oligonucleótido de la invención y sodio como contraión. Dicho oligonucleótido presente en dicha composición también puede denominarse oligonucleótido en su forma sódica.
En otra realización preferida, una composición comprende el oligonucleótido de la invención y calcio y/o magnesio como contraión. Dicho oligonucleótido presente en dicha composición también puede denominarse oligonucleótido en su forma de calcio o magnesio o calcio/magnesio mezclado.
Tal tipo de composición que comprende un oligonucleótido de la invención y un contraión se puede obtener formulando la sal de contraión del oligonucleótido o añadiendo cantidades apropiadas de dicha sal a un oligonucleótido. Se ha descrito un efecto positivo de las sales de calcio presentes en una composición que comprende un oligonucleótido con respecto a los efectos inmunoestimuladores de dichos oligonucleótidos (p. ej., solicitud de patente WO 2012/021985 (Replicor)).
Una composición farmacéutica puede comprender una ayuda para mejorar la estabilidad, solubilidad, absorción, biodisponibilidad, actividad, farmacocinética, farmacodinámica y captación celular de dicho compuesto, en particular un excipiente capaz de formar complejos, nanopartículas, micropartículas, nanotubos, nanogeles, hidrogeles, poloxámeros o plurónicos, polimerosomas, coloides, microburbujas, vesículas, micelas, lipoplexos, y/o liposomas. Los ejemplos de nanopartículas incluyen nanopartículas poliméricas, nanopartículas de oro, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de sílice, nanopartículas de lípidos, partículas de azúcar, nanopartículas de proteínas y nanopartículas de péptidos.
Una composición preferida comprende al menos un excipiente que puede ayudar además a mejorar el direccionamiento y/o administración de dicha composición y/o dicho oligonucleótido a un tejido y/o una célula y/o en un tejido y/o una célula. Un tejido o célula preferido es un tejido o célula muscular.
Muchos de estos excipientes se conocen en la técnica (p. ej., véase Bruno, 2011) y pueden clasificarse como un primer tipo de excipiente. Ejemplos de un primer tipo de excipientes incluyen polímeros (p. ej., polietilenimina (PEI), poli-2-hidroxipropilenimina (pHP), polipropilenimina (PPI), derivados de dextrano, butilcianoacrilato (PBCA), hexilcianoacrilato (PHCA), ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), poliaminas (p .ej., espermina, espermidina, putrescina, cadaverina), quitosano, poli(amido aminas) (PAMAM), poli(éster amina), éter polivinílico, polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG), ciclodextrinas, ácido hialurónico, ácido colomínico y derivados de los mismos), dendrímeros (p. ej., poli(amidoamina)), lípidos (p. ej., 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio propano (DODAP), cloruro de dioleoildimetilamonio (DODAC), derivados de fosfatidilcolina [p. ej., 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)], derivados de liso-fosfatidilcolina [p. ej., 1-estearoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina (S-LysoPC)], esfingomielina, 2-{3-[Bis-(3-amino-propil)-amino]-propilamino}-W-ditetracedil carbamoil metilacetamida (RPR209120), derivados de fosfoglicerol [p. ej., 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol, sal de sodio (DPPG-Na), derivados del ácido fosfatídico [ácido 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatídico, sal de sodio (DSPA), derivados de fosfatidiletanolamina [p. ej., dioleoil-L-R-fosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), 2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPhyPE),], W-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-W,W,W—trimetilamonio (d OtAP), W-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-W,W,W—trimetilamonio (Do TMA), 1,3-di-oleoiloxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamida (DOSPER), (1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetilhidroxietilamonio (DMRIE), (N1-colesteriloxicarbonil-3,7-diazanonano-1,9-diamina (CDAN), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC), triclorhidrato del ácido b-L-arginil-2,3-L-diaminopropiónico-W-palmitil-W-oleil-amida (AtuFECT01), derivados de 1-W,W-dimetil-3-aminopropano [p. ej., 1,2-diestearoiloxi-W,W-dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleiloxi-W,W-dimetil-3-aminopropano (DoDMA), 1,2-dilinoleiloxi-W,W-3-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil [1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), derivados de fosfatidilserina [1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina, sal de sodio (DOPS)], colesterol, proteínas (p. ej., albúmina, gelatinas, atelocolágeno) y péptidos (p. ej., protamina, PepFects, NickFects, poliarginina, polilisina, CADY, MPG).
Otra composición preferida puede comprender al menos un excipiente clasificado como un segundo tipo de excipiente. Un segundo tipo de excipiente puede comprender o contener un grupo de conjugados como se describe en esta invención para mejorar el direccionamiento y/o administración de la composición y/o del oligonucleótido de la invención a un tejido y/o célula y/o en un tejido y/o célula, como por ejemplo tejido o célula muscular. Ambos tipos de excipientes se pueden combinar juntos en una sola composición como se identifica en esta invención.
El experto en la materia puede seleccionar, combinar y/o adaptar uno o más de los anteriores u otros excipientes y sistemas de administración alternativos para formular y administrar un compuesto para su uso en la presente invención.
Tal composición farmacéutica de la invención puede administrarse en una concentración efectiva en momentos establecidos a un animal, preferiblemente un mamífero. El mamífero más preferido es un ser humano. Un oligonucleótido o una composición como se define en esta invención para su uso de acuerdo con la invención puede ser adecuado para la administración directa a una célula, tejido y/o un órgano in vivo de individuos afectados por o en riesgo de desarrollar una enfermedad o afección como se identifica en esta invención, y puede administrarse directamente in vivo, ex vivo o in vitro. La administración puede ser a través de vías tópica, sistémica y/o parenteral, por ejemplo intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, ocular, nasal, urogenital, intradérmica, dérmica, enteral, intravítrea, intracavernosa, intracerebral, intratecal, epidural o vía oral.
Preferiblemente, dicha composición farmacéutica de la invención puede encapsularse en forma de emulsión, suspensión, píldora, comprimido, cápsula o gel blando para administración oral, o en forma de aerosol o polvo seco para administración al tracto respiratorio y pulmones.
En una realización, se puede usar un oligonucleótido de la invención junto con otro compuesto que ya se sabe que se usa para el tratamiento de dicha enfermedad. Dichos otros compuestos pueden usarse para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación del tejido muscular, y/o un compuesto auxiliar para mejorar la función, integridad y/o supervivencia de las fibras musculares, y/o mejorar, aumentar o restaurar la función cardíaca. Los ejemplos son, pero no se limitan a, un esteroide, preferiblemente un (gluco)corticosteroide, un inhibidor de ACE (preferiblemente perindopril), un bloqueador del receptor de angiotensina II tipo 1 (preferiblemente losartán), un inhibidor del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), un inhibidor de TGFp (preferiblemente decorina), biglicano recombinante humano, una fuente de mIGF-1, un inhibidor de miostatina, manosa-6-fosfato, un antioxidante, un inhibidor de canales iónicos, un inhibidor de la proteasa, un inhibidor de la fosfodiesterasa (preferiblemente un inhibidor de PDE5, tal como sildenafil o tadalafil), un inhibidor de la histona desacetilasa (inhibidor de HDAC), modulador del receptor de andrógenos, creatina, fosfato de creatina, y/o L-arginina. Dicho uso combinado puede ser un uso secuencial: cada componente se administra en una composición distinta. Alternativamente, cada compuesto puede usarse junto en una sola composición.
Uso
En un aspecto adicional, se proporciona el uso de una composición o un oligonucleótido como se describe en las secciones anteriores para su uso como medicamento o parte de una terapia, o aplicaciones en las que dicho oligonucleótido ejerce su actividad intracelularmente.
Preferiblemente, un oligonucleótido o composición de la invención se usa como medicamento o parte de una terapia para prevenir, retrasar, curar, mejorar y/o tratar DMD o BMD.
Procedimiento
Se divulga un procedimiento para impedir, tratar, curar, mejorar y/o retrasar una afección o enfermedad como se define en la sección anterior en un individuo, en una célula, tejido u órgano de dicho individuo. El procedimiento comprende administrar un oligonucleótido o una composición de la invención a dicho individuo o sujeto que lo necesite.
Un oligonucleótido o una composición como se define en esta invención puede ser adecuado para la administración a una célula, tejido y/o un órgano in vivo de individuos afectados por cualquiera de las enfermedades definidas en esta invención, y puede administrarse in vivo, ex vivo o in vitro. Un individuo o un sujeto que lo necesite es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano.
Se divulga un procedimiento para el diagnóstico donde el oligonucleótido de la invención se proporciona con una etiqueta radiactivo o una etiqueta fluorescente.
En una realización, la concentración de un oligonucleótido o composición varía de 0,01 nM a 1 pM. Más preferiblemente, la concentración utilizada es de 0,05 a 500 nM, o de 0,1 a 500 nM, o de 0,02 a 500 nM, o de 0,05 a 500 nM, incluso más preferiblemente de 1 a 200 nM.
Los intervalos de dosis de un oligonucleótido o composición de acuerdo con la invención se diseñan preferiblemente sobre la base de estudios de dosis crecientes en ensayos clínicos (uso in vivo) para los que existen requisitos de protocolo rigurosos. Un oligonucleótido como se define en esta invención puede usarse en una dosis que varía de 0,01 a 200 mg/kg o de 0,05 a 100 mg/kg o de 0,1 a 50 mg/kg o de 0,1 a 20 mg/kg, preferiblemente de 0,5 a 10 mg/kg.
Los intervalos de concentración o dosis de oligonucleótido o composición como se indica anteriormente son concentraciones o dosis preferidas para usos in vitro o ex vivo El experto en la materia entenderá que dependiendo de la identidad del oligonucleótido usado, la célula diana a tratar, el gen diana y sus niveles de expresión, el medio usado y las condiciones de transfección e incubación, la concentración o dosis de oligonucleótido usado puede variar aún más y es posible que deba optimizarse aún más.
En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usa en su sentido no limitativo para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos que no se mencionan específicamente no están excluidos. Además, el verbo "consistir" puede reemplazarse por "consistir esencialmente en", lo que significa que un oligonucleótido o una composición como se define en esta invención puede comprender componentes adicionales a los identificados específicamente, dichos componentes adicionales no alteran la característica única de la invención. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto claramente requiera que haya uno y solo uno de los elementos. Por tanto, el artículo indefinido "un" o "una" normalmente significa "al menos uno/a".
Cada realización tal como se identifica en esta invención puede combinarse a menos que se indique lo contrario.
Definiciones
A lo largo de la solicitud, la palabra "se une", "se dirige", "se hibrida" podría usarse indistintamente cuando se usa en el contexto de un oligonucleótido antisentido que es inversamente complementario a una parte de un pre-ARNm como se identifica en esta invención.
Además, a lo largo de la solicitud, la expresión "capaz de unirse", "capaz de dirigirse", "capaz de hibridarse" podría usarse indistintamente cuando se usa en el contexto de un oligonucleótido antisentido que es inversamente complementario a una parte de un ARNm como se identifica en esta invención y para el que se podrían encontrar condiciones en las que dicho oligonucleótido podría unirse, dirigirse o hibridarse con dicha parte de dicho pre-ARNm.
Como se usa en esta invención, "hibridación" se refiere al apareamiento de compuestos oligoméricos complementarios (p. ej., un compuesto antisentido y su ácido nucleico diana). Sin ánimo de limitarse a ningún mecanismo en particular, el mecanismo de apareamiento más común implica formación de puentes de hidrógeno, que puede ser formación de puentes de hidrógeno de tipo Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso, entre bases de nucleósidos o nucleótidos complementarios (nucleobases). Por ejemplo, la base natural adenina se complementa con las nucleobases naturales timina y uracilo que se aparean a través de la formación de puentes de hidrógeno. La base natural guanina se complementa con las bases naturales citosina y 5-metilcitosina. La hibridación puede producirse en circunstancias variables.
Como se usa en esta invención, "se hibrida específicamente" se refiere a la capacidad de un compuesto oligomérico para hibridarse con un sitio de ácido nucleico con mayor afinidad de lo que se hibrida con otro sitio de ácido nucleico. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido antisentido se hibrida específicamente a más de un sitio diana.
En el contexto de la invención, "se hibrida" se usa en condiciones fisiológicas en una célula, preferiblemente una célula muscular a menos que se indique lo contrario.
Como se usa en esta invención, "nucleósido" se refiere a un compuesto que comprende un resto de base heterocíclica y un resto de azúcar. Los nucleósidos incluyen, de modo no taxativo, nucleósidos de origen natural (como los que se encuentran en el ADN y ARN), nucleósidos abásicos, nucleósidos modificados y nucleósidos modificados con azúcar. Los nucleósidos pueden ser modificados con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
Como se usa en esta invención, "resto de azúcar" significa un resto de azúcar natural (furanosilo) modificado o un sustituto de azúcar.
Como se usa en esta invención, "resto de azúcar modificado" significa un azúcar de furanosilo modificado químicamente o un resto de azúcar sin furanosilo. Además, este término abarca análogos y derivados de azúcares furanosilo que incluyen azúcares tricíclicos, azúcares bicíclicos, tetrahidropiranos, morfolinos, azúcares modificados en 2', azúcares modificados en 4', azúcares modificados en 5' y azúcares sustituidos en 4'.
Como se usa en esta invención, "nucleósido modificado con azúcar" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar modificado.
Como se usa en esta invención, el término "sustituto de azúcar" se refiere a una estructura que es capaz de reemplazar el anillo de furanosa de un nucleósido de origen natural. En determinadas realizaciones, los sustitutos de azúcar son anillos o sistemas de anillos o sistemas abiertos sin furanosa (o furanosa sustituida en 4'). Dichas estructuras incluyen cambios simples con respecto al anillo de furanosa natural, como un anillo de seis miembros o pueden ser más complicados como es el caso del sistema sin anillo utilizado en el ácido nucleico peptídico. Los sustitutos de azúcar incluyen, de modo no taxativo, morfolinos, ciclohexenilos y ciclohexitoles. En la mayoría de los nucleósidos que tienen un grupo sustituto de azúcar, el resto de base heterocíclica se mantiene generalmente para permitir la hibridación.
Como se usa en esta invención, "nucleótido" se refiere a un nucleósido que comprende además un grupo de enlace fosfato modificado o no modificado o un enlace internucleósido sin fosfato.
Como se usa en esta invención, los "nucleósidos unidos" pueden o no estar unidos mediante enlaces fosfato y, por lo tanto, incluyen "nucleótidos unidos".
Como se usa en esta invención, "nucleobase" se refiere a la porción de base heterocíclica de un nucleósido. Las nucleobases pueden ser de origen natural o pueden modificarse y por lo tanto incluyen, pero no se limitan a, adenina, citosina, guanina, uracilo, timina y análogos de los mismos tales como 5-metilcitosina. En determinadas realizaciones, una nucleobase puede comprender cualquier átomo o grupo de átomos que permitan la unión de hidrógeno con una nucleobase de otro ácido nucleico.
Como se usa en esta invención, "nucleósido modificado" se refiere a un nucleósido que comprende al menos una modificación en comparación con nucleósidos de ARN o ADN de origen natural. Dicha modificación puede encontrarse en el resto azúcar y/o en las nucleobases.
Como se usa en esta invención, "Tm" significa temperatura de fusión que es la temperatura a la que se separan las dos hebras de un ácido nucleico dúplex. Tm se utiliza a menudo como una medida de la estabilidad del dúplex o la afinidad de unión de un compuesto antisentido hacia una molécula de ARN complementario.
Como se usa en esta invención, "modificado en 2'" o "sustituido en 2'" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. Los nucleósidos modificados en 2' incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos bicíclicos donde el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono en 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2' que no forman puentes, como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(Ch 2)2-O-N(Rm)(Rn), u O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos modificados en 2' pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en esta invención, cada uno de "2'-OMe" o "2-OCH3" o "2'-O-metilo" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar. Como se usa en esta invención, "MOE" o "2'-MOE" o "2-OCH2CH2OCH3" o "2'-O-metoxietilo" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en esta invención, el término "análogo de adenina" significa una nucleobase de purina modificada químicamente que, cuando se incorpora a un oligómero, es capaz de formar un par de bases Watson-Crick con una timina o uracilo de una hebra complementaria de ARN o ADN.
Como se usa en esta invención, el término "análogo de uracilo" significa una nucleobase de pirimidina modificada químicamente que, cuando se incorpora a un oligómero, es capaz de formar un par de bases Watson-Crick con una adenina de una hebra de ARN o ADN.
Como se usa en esta invención, el término "análogo de timina" significa una nucleobase de pirimidina modificada químicamente que, cuando se incorpora a un oligómero, es capaz de formar un par de bases Watson-Crick con una adenina de una hebra complementaria de ARN o ADN.
Como se usa en esta invención, el término "análogo de citosina" significa una nucleobase de pirimidina modificada químicamente que, cuando se incorpora a un oligómero, es capaz de formar un par de bases Watson-Crick con una guanina de una hebra complementaria de ARN o ADN. Por ejemplo, el análogo de citosina puede ser una 5-metilcitosina.
Como se usa en esta invención, el término "análogo de guanina" significa una nucleobase de purina modificada químicamente que, cuando se incorpora a un oligómero, es capaz de formar un par de bases Watson-Crick con una citosina de una hebra complementaria de ARN o ADN. Como se usa en esta invención, el término "guanosina" se refiere a un nucleósido o nucleósido modificado con azúcar que comprende una guanina o una nucleobase análoga de guanina.
Como se usa en esta invención, el término "uridina" se refiere a un nucleósido o nucleósido modificado con azúcar que comprende un uracilo o nucleobase análoga de uracilo.
Como se usa en esta invención, el término "timidina" se refiere a un nucleósido o nucleósido modificado con azúcar que comprende una timina o una nucleobase análoga de timina.
Como se usa en esta invención, el término "citidina" se refiere a un nucleósido o nucleósido modificado con azúcar que comprende una citosina o una nucleobase análoga de citosina.
Como se usa en esta invención, el término "adenosina" se refiere a un nucleósido o nucleósido modificado con azúcar que comprende una adenina o una nucleobase análoga de adenina.
Como se usa en esta invención, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos unidos. En determinadas realizaciones, uno o más de la pluralidad de nucleósidos está modificado. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
Como se usa en esta invención, "oligonucleósido" significa un oligonucleótido en el cual ninguno de los enlaces internucleósidos contiene un átomo de fósforo. Como se usa en esta invención, los oligonucleótidos incluyen oligonucleósidos.
Como se usa en esta invención, "oligonucleótido modificado" u oligonucleótido químicamente modificado" se refiere a un oligonucleótido que comprende al menos un azúcar modificado, una nucleobase modificada y/o un enlace internucleósido modificado o cadena principal.
Como se usa en esta invención, "enlace internucleósido" o "cadena principal" se refiere a un enlace covalente entre nucleósidos adyacentes.
Como se usa en esta invención, "enlace internucleosído de origen natural" se refiere a un enlace fosfodiéster 3' a 5'.
Como se usa en esta invención, "enlace internucleósido modificado" se refiere a cualquier enlace internucleósido diferente a un enlace internucleósido de origen natural.
Como se usa en esta invención, "compuesto oligomérico" se refiere a una estructura polimérica que comprende dos o más subestructuras. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico es un oligonucleótido. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico es un oligonucleótido monocatenario. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico es un dúplex bicatenario que comprende dos oligonucleótidos. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico es un oligonucleótido monocatenario o bicatenario que comprende uno o más grupos conjugados y/o grupos terminales.
Como se usa en esta invención, "conjugado" se refiere a un átomo o grupo de átomos unido a un oligonucleótido o compuesto oligomérico. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto al que están unidos, incluyendo, de modo no taxativo, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, de captación, de distribución celular, de captación celular, de carga y/o de depuración. Los grupos conjugados se utilizan de manera rutinaria en la técnica química y se unen directamente o mediante un resto de unión o grupo de unión opcional al compuesto parental tal como un compuesto oligomérico. En determinadas realizaciones, los grupos conjugados incluyen, de modo no taxativo, intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, tioéteres, poliéteres, colesteroles, tiocolesteroles, restos de ácido cólico, folato, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. En determinadas realizaciones, los conjugados son grupos terminales. En determinadas realizaciones, los conjugados se unen a un nucleósido terminal 3' o 5' o a un nucleósido interno de un oligonucleótido.
Como se usa en esta invención, "grupo de unión a conjugado" se refiere a cualquier átomo o grupo de átomos usado para unir un conjugado a un oligonucleótido o compuesto oligomérico. Los grupos de enlace o restos de enlace bifuncionales tales como los conocidos en la técnica son adecuados para la presente invención.
Como se usa en esta invención, "compuesto antisentido" se refiere a un compuesto oligomérico, al menos una porción del cual es al menos parcialmente complementario a un ácido nucleico diana con el que hibrida y modula la actividad, procesamiento o expresión de dicho ácido nucleico diana.
Como se usa en esta invención, "expresión" se refiere al procedimiento por el cual un gen finalmente genera una proteína. La expresión incluye, de modo no taxativo, transcripción, splicing, modificación postranscripcional y traducción.
Como se usa en esta invención, "oligonucleótido antisentido" se refiere a un compuesto antisentido que es un oligonucleótido.
Como se usa en esta invención, "actividad antisentido" se refiere a cualquier actividad detectable o medible que se pueda atribuir a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, dicha actividad antisentido es un aumento o una disminución en una cantidad de un ácido nucleico o proteína. En determinadas realizaciones, dicha actividad puede ser un cambio en la relación de variantes de splicing de un ácido nucleico o proteína. La detección y/o medición de la actividad antisentido puede ser directa o indirecta. En determinadas realizaciones, la actividad antisentido se detecta mediante la observación de un cambio fenotípico en una célula o animal.
Como se usa en esta invención, "ácido nucleico diana" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico cuya expresión, cantidad o actividad puede modularse mediante un compuesto antisentido. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico diana es ADN o ARN. En determinadas realizaciones, el ARN diana es ARNm, pre-ARNm, ARN no codificante, pri-microARN, pre-microARN, microARN maduro, ARN dirigido por promotores o transcritos antisentido naturales. El ácido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresión está asociada a un trastorno o estado de enfermedad particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico viral o bacteriano.
Como se identifica en esta invención, "ARNm diana" se refiere a una molécula de ARN previamente seleccionado que codifica una proteína.
Como se usa en esta invención, "direccionamiento" o "dirigido a" se refiere a la asociación de un compuesto antisentido a una molécula de ácido nucleico diana particular o a una región particular de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana. Un compuesto antisentido se dirige a un ácido nucleico diana si este es suficientemente complementario al ácido nucleico diana para permitir la hibridación bajo condiciones fisiológicas.
Como se usa en esta invención, "sitio diana" se refiere a una región de un ácido nucleico diana que está unido por un compuesto antisentido. En determinadas realizaciones, un sitio diana está al menos parcialmente dentro de la región 3' no traducida de una molécula de ARN. En determinadas realizaciones, un sitio diana está al menos parcialmente dentro de la región 5' no traducida de una molécula de ARN. En determinadas realizaciones, un sitio diana está al menos parcialmente dentro de la región codificante de una molécula de ARN. En determinadas realizaciones, un sitio diana está al menos parcialmente dentro de un exón de una molécula de ARN. En determinadas realizaciones, un sitio diana está al menos parcialmente dentro de un intrón de una molécula de ARN. En determinadas realizaciones, un sitio diana está al menos parcialmente dentro de un sitio diana de un microARN de una molécula de ARN. En determinadas realizaciones, un sitio diana está al menos parcialmente dentro de una región de repetición de una molécula de ARN.
Como se usa en esta invención, "proteína diana" se refiere a una proteína cuya expresión está modulada por un compuesto antisentido. En determinadas realizaciones, una proteína diana está codificada por un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la expresión de una proteína diana está influenciada por otro lado por un ácido nucleico diana.
Como se usa en esta invención, "complementariedad" en referencia a nucleobases se refiere a una nucleobase que puede realizar el apareamiento de bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En determinadas realizaciones, la nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que puede realizar el emparejamiento de bases con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, entonces la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera complementaria en ese par de nucleobases. Las nucleobases que comprenden ciertas modificaciones pueden mantener la capacidad de aparearse con una nucleobase homóloga y, por lo tanto, todavía son capaces de complementariedad de nucleobases.
Como se usa en esta invención, "no complementario" en referencia a nucleobases se refiere a un par de nucleobases que no forman puentes hidrógeno entre sí o admiten de otro modo la hibridación.
Como se usa en esta invención, "complementario" en referencia a nucleósidos, oligonucleótidos o ácidos nucleicos unidos se refiere a la capacidad de un compuesto oligomérico para hibridarse con otro compuesto oligomérico o ácido nucleico a través de complementariedad de nucleobases. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido y su diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupadas por nucleobases que pueden unirse entre sí para permitir una asociación estable entre el compuesto antisentido y la diana. Un experto en la materia reconoce que la inclusión de apareamientos erróneos es posible sin eliminar la actividad de los compuestos oligoméricos de permanecer en asociación. Por lo tanto, en esta invención se describen compuestos antisentido que pueden comprender hasta aproximadamente un 20 % de nucleótidos que están incorrectamente apareados (es decir, que no son nucleobases complementarias a los nucleótidos correspondientes de la diana). Preferiblemente, los compuestos antisentido contienen no más de 15 %, más preferiblemente no más de aproximadamente 10 %, lo más preferiblemente no más de 5 % de apareamientos erróneos o ningún apareamiento erróneo. Los nucleótidos restantes sin nucleobases complementarias o no alteran la hibridación (p. ej., bases universales). Un experto en la materia reconocería que los compuestos proporcionados en esta invención son al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % complementarios a un ácido nucleico diana.
Como se usa en esta invención, "modulación" se refiere a una perturbación de la cantidad o calidad de una función o actividad cuando se compara con la función o actividad antes de la modulación. Por ejemplo, la modulación incluye cambios, ya sea aumento (estimulación o inducción) o una disminución (inhibición o reducción) de la expresión génica. Como ejemplo adicional, la modulación de la expresión puede incluir la perturbación en la selección del sitio de splicing del procesamiento de pre-ARNm, lo cual da como resultado un cambio en la cantidad de una variante de splicing particular en comparación con las condiciones que no fueron perturbadas. Como ejemplo adicional, la modulación incluye la traducción perturbadora de una proteína.
Como se usa en esta invención, "motivo" se refiere a un patrón de modificaciones en un compuesto oligomérico o una región de este. Los motivos se pueden definir mediante modificaciones en determinados nucleósidos y/o en determinados grupos de unión de un compuesto oligomérico.
Como se usa en esta invención, "motivo de nucleósido" se refiere a un patrón de modificaciones de nucleósido en un compuesto oligomérico o una región de este. Los enlaces de dicho compuesto oligomérico pueden estar modificados o no modificados. A menos que se indique lo contrario, se pretende que los motivos en esta invención que describen únicamente nucleósidos sean motivos de nucleósidos. Por lo tanto, en dichos ejemplos, los enlaces no están limitados.
Como se usa en esta invención, "motivo de enlace" se refiere a un patrón de modificaciones de enlace en un compuesto oligomérico o una región de este. Los nucleósidos de dicho compuesto oligomérico pueden estar modificados o no modificados. A menos que se indique lo contrario, se pretende que los motivos en esta invención que describen únicamente enlaces sean motivos de enlace. Por lo tanto, en dichos aspectos, los nucleósidos no están limitados.
Como se usa en esta invención, "las mismas modificaciones" se refieren a modificaciones con respecto a moléculas de origen natural que son iguales entre sí, incluida la ausencia de modificaciones. Por lo tanto, por ejemplo, dos nucleósidos de ADN no modificados tienen la "misma modificación", a pesar de que el nucleósido de ADN no esté modificado.
Como se usa en esta invención, "tipo de modificación" en referencia a un nucleósido o a un nucleósido de un "tipo" se refiere a la modificación de un nucleósido e incluye nucleósidos modificados y no modificados. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, un "nucleósido que tiene una modificación de un primer tipo" puede ser un nucleósido no modificado.
Como se usa en esta invención, "regiones separadas" se refiere a una porción de un compuesto oligomérico donde los nucleósidos y enlaces internucleósidos dentro de la región comprenden las mismas modificaciones; y los nucleósidos y/o enlaces internucleósidos de cualquier porción vecina incluyen al menos una modificación diferente.
Como se usa en esta invención, "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a compuestos activos que conservan la actividad biológica deseada del compuesto activo y no confieren efectos toxicológicos no deseados al mismo.
Como se usa en esta invención, "estructura del casquete" o "resto de casquete terminal" se refiere a modificaciones químicas que se incorporaron en cada extremo terminal de un compuesto antisentido.
Como se usa en esta invención, el término "independientemente" significa que cada aparición de una variable repetitiva dentro de un oligonucleótido reivindicado se selecciona independientemente entre sí. Por ejemplo, cada variable repetitiva se puede seleccionar de modo que (i) cada una de las variables repetitivas sea la misma, (ii) dos o más sean iguales, o (iii) cada una de las variables repetitivas pueda ser diferente.
Definiciones de química general
Como se usa en esta invención, "alquilo" se refiere a un sustituyente o radical de hidrocarburo, ramificado o recto, que contiene normalmente hasta veinticuatro átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, de modo no taxativo, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, isobutilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Los grupos alquilo incluyen normalmente de 1 a 24 átomos de carbono, más normalmente de 1 a 12 átomos de carbono (alquilo C1-C12) con de 1 a 6 átomos de carbono (alquilo C1-C6) siendo más preferido. El término "alquilo inferior'' como se usa en esta invención incluye de 1 a 6 átomos de carbono (alquilo C1-C6). Los grupos alquilo como se usa en esta invención pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en esta invención, "alquenilo" se refiere a un radical o sustituyente de cadena de hidrocarburos ramificada o recta, que contiene normalmente hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, de modo no taxativo, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-il, dienos tales como 1,3 -butadieno y similares. Los grupos alquenilo incluyen normalmente de 2 a 24 átomos de carbono, más normalmente de 2 a 12 átomos de carbono con de 2 a 6 átomos de carbono siendo más preferido. Los grupos alquilo como se usa en esta invención pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en esta invención, "alquinilo" se refiere a un radical o sustituyente de hidrocarburos ramificado o recto que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, de modo no taxativo, etinilo, 1-propinilo, 1-butinilo y similares. Los grupos alquinilo incluyen normalmente de 2 a 24 átomos de carbono, más normalmente de 2 a 12 átomos de carbono con de 2 a 6 átomos de carbono siendo más preferido. Los grupos alquinilo como se usa en esta invención pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en esta invención, "aminoalquilo" se refiere a un radical o sustituyente de alquilo sustituido con amino. Este término se entiende que incluye grupos alquilo C1-C12 que tienen un sustituyente amino en cualquier posición y donde el grupo aminoalquilo está unido a la molécula primaria a través de su resto alquilo. Las porciones de alquilo y/o amino del grupo aminoalquilo se pueden sustituir adicionalmente con grupos sustituyentes.
Como se usa en esta invención, "alifático" se refiere a un radical o sustituyente de hidrocarburos ramificado o recto que contiene normalmente hasta veinticuatro átomos de carbono, donde la saturación entre dos átomos de carbono cualesquiera es un único, doble o triple enlace. Un grupo alifático contiene preferiblemente de 1 a 24 átomos de carbono, más normalmente de 1 a 12 átomos de carbono con de 1 a 6 átomos de carbono siendo más preferido. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático se puede interrumpir con uno o más heteroátomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Dichos grupos alifáticos interrumpidos por heteroátomos incluyen, sin limitación, polialcoxis, tales como polialquilenglicoles, poliaminas y poliiminas. Los grupos alifáticos como se usa en esta invención pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en esta invención, "alicíclico" o "aliciclilo" se refiere a un radical o sustituyente cíclico, donde el sistema de anillos es alifático. El sistema de anillos puede comprender uno o más anillos donde al menos un anillo es alifático. Los restos alicíclicos preferidos incluyen anillos que tienen de 5 a 9 átomos de carbono en el anillo. Los grupos alicíclicos como se usa en esta invención pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en esta invención, "alcoxi" se refiere a un radical o sustituyente que comprende un grupo alquilo y un átomo de oxígeno, donde el grupo alcoxi se une a una molécula primaria a través de su átomo de oxígeno. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen, de modo no taxativo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, tercbutoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi como se usa en esta invención pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en esta invención, "halo", "haluro" y "halógeno" se refiere a un átomo, radical o sustituyente seleccionado de entre flúor, cloro, bromo y yodo.
Como se usa en esta invención, "arilo" y "aromático" se refiere a un radical o sustituyente que comprende un sistema de anillo carbocíclico mono- o policíclico que tiene uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, de modo no taxativo, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo y similares. Los sistemas de anillos arilo preferidos tienen de 5 a 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Los grupos arilo como se usa en esta invención pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en esta invención, "aralquilo" y "arilalquilo" se refieren a un radical o sustituyente que comprende un grupo alquilo y un grupo arilo, donde el grupo aralquilo o arilalquilo está unido a una molécula primaria a través de su resto alquilo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, bencilo, fenetilo y similares. Los grupos aralquilo como se usa en esta invención pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales unidos al alquilo, al arilo o ambos grupos que forman el radical o sustituyente.
Como se usa en esta invención, "heterociclilo" se refiere a un radical o sustituyente que comprende un sistema de anillos mono- o policíclico que incluye al menos un heteroátomo y está insaturado, parcialmente saturado o completamente saturado, por lo que incluye grupos heteroarilo. También se pretende que heterociclilo incluya restos del sistema de anillos condensados donde uno o más de los anillos condensados contienen al menos un heteroátomo y los otros anillos pueden contener uno o más heteroátomos u opcionalmente no contener heteroátomos. Un grupo heteroarilo típicamente incluye al menos un átomo seleccionado de entre azufre, nitrógeno u oxígeno. Los ejemplos de grupos heterocíclicos incluyen [1,3]dioxolano, pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, piridazinonilo, tetrahidrofurilo y similares. Los grupos heterocíclicos como se usa en esta invención pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en esta invención, "heteroarilo" y "heteroaromático" se refieren a un radical que comprende un anillo aromático mono- o policíclico, sistema de anillos o sistema de anillos condensados, donde al menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. Se pretende que heteroarilo también incluya sistemas de anillos condensados que incluyen sistemas donde uno o más de los anillos condensados no contienen heteroátomos. Los grupos heteroarilo típicamente incluyen un átomo en el anillo que se selecciona de entre azufre, nitrógeno u oxígeno. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, de modo no taxativo, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzooxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales o sustituyentes heteroarilo pueden unirse a una molécula primaria directamente o mediante un resto de unión, tal como un grupo alifático o heteroátomo. Los grupos heteroarilo como se usa en esta invención pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en esta invención, "heteroarilalquilo" se refiere a un radical o sustituyente que comprende un grupo heteroarilo como se definió previamente y un resto alquilo, donde el grupo heteroarilalquilo está unido a una molécula primaria a través de su resto alquilo. Los ejemplos incluyen, de modo no taxativo, piridinilmetilo, pirimidiniiletilo, naptiridinilpropilo y similares. Los grupos heteroarilalquilo como se usa en esta invención pueden incluir grupos sustituyentes adicionales en una o ambas de las porciones de heteroarilo o alquilo.
Como se usa en esta invención "mono o policíclico" se refiere a cualquier sistema de anillos, tal como un anillo único o un sistema policíclico que tiene anillos que están condensados o enlazados y se entiende que son inclusivos de sistemas de anillo único y mezclado individualmente seleccionados de entre alifático, alicíclico, heteroarilo, aralquilo, arilalquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroaromático y heteroarilalquilo. Dichas estructuras mono y policíclicas pueden contener anillos que tienen un grado de saturación uniforme o variable, incluidos anillos completamente saturados, parcialmente saturados o completamente insaturados. Cada anillo puede comprender átomos en el anillo seleccionados de entre C, N, O y S para dar lugar a anillos heterocíclicos así como anillos que comprenden solo átomos de anillo de C. Pueden estar presentes anillos heterocíclicos y todos los de carbono en un motivo mixto, como por ejemplo bencimidazol, donde un anillo del sistema de anillos condensados tiene solo átomos de carbono en el anillo y el otro anillo tiene dos átomos de nitrógeno. Las estructuras mono o policíclicas se pueden sustituir además con grupos sustituyentes como, por ejemplo, ftalimida que tiene dos grupos oxo. (=O) unidos a uno de los anillos. En otro aspecto, las estructuras mono o policíclicas se pueden unir a una molécula primaria directamente a través de un átomo en el anillo, a través de un grupo sustituyente o un resto de unión bifuncional.
Como se usa en esta invención, "acilo" se refiere a un radical o sustituyente que comprende un resto carbonilo (C=O o -C (O)-) y un sustituyente X adicional, donde el grupo acilo está unido a una molécula primaria a través de su resto carbonilo. Como tal, un grupo acilo se obtiene formalmente por una eliminación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la fórmula general -C(O)-X, donde X es típicamente alifático, alicíclico o aromático. El término "acilo" también significa que incluye radicales o sustituyentes heteroacilo con la fórmula general -Y(O)n-X, donde X es como se definió anteriormente e Y(O)n es típicamente sulfonilo, sulfinilo o fosfato. Los ejemplos de grupos acilo incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo como se usa en esta invención pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en esta invención, "sustituyente" y "grupo sustituyente" incluyen grupos que se añaden típicamente a otros sustituyentes o compuestos primarios para mejorar las propiedades deseadas o dar los efectos deseados. Los grupos sustituyentes pueden protegerse o desprotegerse y pueden unirse a un sitio disponible o a muchos sitios disponibles en un compuesto primario. Los sustituyentes también pueden sustituirse además con otros grupos sustituyentes y pueden unirse directamente o mediante un grupo de unión, tal como un grupo alquilo o hidrocarbilo a un compuesto primario. En esta invención, "hidrocarbilo" se refiere a cualquier grupo que comprende C, O y H. Se incluyen grupos lineales, ramificados y cíclicos que tienen cualquier grado de saturación. Dichos grupos hidrocarbilo pueden incluir uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O y S y pueden estar además sustituidos con uno o más grupos sustituyentes.
A menos que se indique lo contrario, el término sustituido u "opcionalmente sustituido" se refiere a la presencia opcional de cualquiera de los siguientes sustituyentes: halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (-C(O)Raa), carboxilo (-C(O)O-Raa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, oxo sustituido (-O-Raa), arilo, aralquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (-NRbbRcc), imino (=NRbb), amido (-C(O)NRbbRcc o -N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)NRbbRcc o -N(Rbb)C(O)ORaa), ureido (-N(Rbb)C(O)NRbbRcc), tioureido (-N(Rbb)C(S)NRbbRcc), guanidinilo (-N(Rbb)C(=NRbb)NRbbRcc), amidinilo (-C(=NRbb)NRbbRcc o -N(Rbb)C(NRbb)Raa), tiol (-SRbb), sulfinilo (-S(O)Rbb), sulfonilo (-S(O)2Rbb), sulfonamidilo (-S(O)2NRbbRcc o -N(Rbb)S(O)2Rbb) y grupos conjugados. En esta invención, cada Raa, Rbb y Rcc es independientemente H, un grupo funcional químico opcionalmente enlazado o un grupo sustituyente adicional, preferiblemente sin limitación seleccionada de entre el grupo que consiste en H, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo. Los sustituyentes seleccionados dentro de los compuestos descritos en esta invención están presentes en un grado recursivo.
En este contexto, "sustituyente recursivo" significa que un sustituyente puede citar otro aspecto de sí mismo. Debido a la naturaleza recursiva de tales sustituyentes, teóricamente, puede estar presente un gran número en cualquier reivindicación dada. Un experto en la materia de la química medicinal y de la química orgánica entiende que la cantidad total de dichos sustituyentes se encuentra limitada considerablemente por las propiedades deseadas del compuesto previsto. Tales propiedades incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, propiedades físicas tales como peso molecular, solubilidad o log P, propiedades de aplicación tales como actividad contra la diana pretendida y propiedades prácticas tales como facilidad de síntesis. Los sustituyentes recursivos son un aspecto pretendido de la invención. Un experto en la materia de la química orgánica y medicinal comprenderá la versatilidad de tales sustituyentes. En la medida en que estén presentes sustituyentes recursivos en una reivindicación de la invención, el número total se determinará como se ha establecido anteriormente.
Los términos "compuesto estable" y "estructura estable" como se usa en esta invención pretenden indicar un compuesto que es lo suficientemente fuerte para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción, y formulación en un agente terapéutico eficaz. En esta invención solo se contemplan compuestos estables.
Como se usa en esta invención, un cero (0) en un intervalo que indica el número de una unidad en particular significa que la unidad puede estar ausente. Por ejemplo, un compuesto oligomérico que comprende 0-2 regiones de un motivo particular significa que el compuesto oligomérico puede comprender una o dos de tales regiones que tienen el motivo particular, o el compuesto oligomérico puede no tener ninguna región que tenga el motivo particular. En los aspectos donde está ausente una porción interna de una molécula, las porciones que flanquean la porción ausente se unen directamente entre sí. Asimismo, el término "ninguno" como se usa en esta invención, indica que una determinada característica no está presente.
Como se usa en esta invención, "análogo" o "derivado" significa un compuesto o resto similar en estructura pero diferente con respecto a la composición elemental del compuesto primario independientemente de cómo se prepare el compuesto. Por ejemplo, no es necesario preparar un compuesto análogo o derivado a partir del compuesto primario como material de partida químico.
Los siguientes ejemplos se proporcionan solamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de forma alguna.
Leyendas de la figura
Figura 1.
Comparación de AON con o sin citosina con sustitución de 5-metilcitosina en células musculares sanas diferenciadas in vitro después de la transfección con (A) PS229L/PS524, SEQ ID NO:52 (correspondiente a SEQ ID NO: 91 para la secuencia no modificada, correspondiente a SEQ ID NO: 92 donde todas las citosinas están modificadas) o (B) PS220/PS339 (SEQ ID NO:21, correspondiente a SEQ ID NO:101 para la secuencia no modificada, correspondiente a SEQ ID NO:200 donde todas las citosinas están modificadas) o (C) PS524/PS1317/PS1318/PS1319, SEQ ID NO:52 (correspondiente a SEQ ID NO: 92 (PS524) donde las 6 citosinas están modificadas, a SEQ ID NO: 217 (PS1317) donde 4 de las 6 citosinas están modificadas, a SEQ ID NO: 218 (PS1318) donde 2 de las 6 las citosinas están modificadas y a SEQ ID NO:219 (PS1319) donde 3 de las 6 citosinas están modificadas (SEQ ID NO:217). Los porcentajes de omisión promedio se calcularon a partir de transfecciones triples (n=3) (A, B) o dobles (n=2) (C) por concentración. Las líneas continuas se refieren a AON con 5-metilcitosinas, las líneas de puntos a AON con citosinas no sustituidas (A, B).
Figura 2.
Resumen del estudio farmacocinético en ratones de tipo salvaje (control) y mdx, comparando perfiles de tejido muscular y plasmático de AON con 5-metilcitosinas (PS524, SEQ ID NO:52 (es decir, correspondiente a SEQ ID NO: 92 donde todas las citosinas están modificadas) y PS652, SEQ ID NO:57 (es decir, correspondiente a SEQ ID NO: 185 donde todas las citosinas están modificadas) y AON con citosinas no modificadas (no metiladas) (PS229L, SEQ ID NO:52 correspondiente a SEQ ID NO: 91 para la secuencia no modificada, y PS531, SEQ ID NO:57 correspondiente a SEQ ID NO: 137 para la secuencia no modificada). (A) Análisis de tejido farmacocinético de: 1) la relación entre los niveles promedio de AON en el músculo en ratones mdx frente a los ratones de control después de una única inyección sc; 2) los niveles de AON (pg/g) en varios músculos de mdx (dia = diafragma, gastroc = gastrocnemio, cuadr = cuádriceps, tric = tríceps) a los 14 días; 3) los niveles relativos de músculo/riñón y músculo/hígado en el día 14, y 4) la vida media estimada de los diferentes AON en el tríceps. B) Análisis plasmático farmacocinético de 1) T máx (tiempo en el que se alcanzó la Cmáx, solo se incluyeron dos puntos de tiempo de análisis (15 o 60 min), 2) Cmáx (concentración plasmática más alta alcanzada), 3) AUC (área bajo la curva; indicativo para biodisponibilidad) y 4) Cl (aclaramiento plasmático a las 24 h.
Figura 3.
Análisis de los niveles de citocinas en sangre entera humana tras la incubación con 0, 10, 25 o 50 pg/ml de AON con citosinas no modificadas PS232 (SEQ ID NO: 39, correspondiente a SEQ ID NO: 119 para la secuencia no modificada) y PS534 (SEQ ID NO:59, correspondiente a SEQ ID NO: 139 para la secuencia no modificada) (barras negras) o AON con 5-metilcitosinas PS648 (SEQ ID NO: 39, correspondiente a SEQ ID NO: 201 donde todas las citosinas están modificadas) y PS653 (SEQ ID NO:59, a SEQ ID NO: 192 donde todas las citosinas están modificadas) (barras grises). Los niveles de TNFa (A, B), MCP-1 (D, E), IP-10 (E, F), y IL6 (G, H) se determinaron usando kits de e L iSA disponibles comercialmente. Cada experimento se repitió cuatro veces (n=4). Se muestran datos para la respuesta más pronunciada de cada citocina.
Figura 4.
Comparaciones de actividad de AON con 5-metilcitosinas y/o 5-metiluracilos con AON correspondientes sin estas modificaciones de base, (A) Transfección de 200 nM, por duplicado, en células musculares sanas diferenciadas in vitro. La actividad se expresó como porcentaje promedio del exón 51 (PS43, secuencia no modificada representada por SEQ ID NO: 111, PS559 correspondiente a Se Q ID NO: 202, donde todos los uracilos están modificados, PS1106 correspondiente a SEQ ID NO:203, donde se modifican todas las citosinas y todos los uracilos. Todas las secuencias se derivan de SEQ ID NO: 31), exón 44 (PS188, secuencia no modificada representada por SEQ ID NO: 95, PS785, correspondiente a SEQ ID NO: 204, donde todos los uracilos están modificados, PS 1107: correspondiente a SEQ ID NO:205, donde todas las citosinas y todos los uracilos están modificados. Todas las secuencias se derivan de SEQ ID NO 15); o exón 52 (PS235, secuencia no modificada representada por SEQ ID NO: 120, PS786: correspondiente a SEQ ID NO: 172, donde todos los uracilos están modificados. Todas las secuencias se derivan de omisión SEQ ID NO 40) (n=2). Las secuencias de AON (5' a 3') y las modificaciones de bases (nucleótidos subrayados en negrita) se muestran en la tabla siguiente . (B) Inyección intramuscular de 20 |jg de PS49 (secuencia no modificada, SEQ ID NO: 216) o PS959 (secuencia modificada donde todos los uracilos están modificados, SEQ ID NO:214) en los músculos del gastrocnemio de ratones mdx. La actividad se expresó como porcentaje promedio de omisión del exón 23 murino (n=4). Las secuencias de AON (5' a 3') y las modificaciones de bases (nucleótidos subrayados en negrita) se muestran en la tabla siguiente.
Figura 5.
Comparaciones de actividad de AON con 2,6-diaminopurinas con AON correspondientes sin esta modificación de base. (A), Transfección de 200 nM, por duplicado, en células musculares sanas diferenciadas in vitro. La actividad se expresó como porcentaje promedio del exón 51 (PS43, secuencia no modificada representada por SEQ ID NO: 111, PS403, correspondiente a SEQ ID NO: 206, donde todas las adeninas se han modificado. Todas las secuencias se derivan de SEQ ID NO: 31), exón 52 (PS235, secuencia no modificada representada por SEQ ID NO: 120, PS897: correspondiente a SEQ ID NO: 173, donde todas las adeninas han sido modificadas. Todas las secuencias se derivan de SEQ ID NO: 40), o exón 44 (PS188, secuencia no modificada representada por SEQ ID NO: 95, PS733: correspondiente a SEQ ID NO: 207, donde todas las adeninas han sido modificadas. Todas las secuencias se derivan de omisión SEQ ID NO: 15) (n=2). Las secuencias de AON (5' a 3') y las modificaciones de bases (nucleótidos subrayados en negrita) se muestran en la tabla siguiente. (B) y (C) El efecto de sustituir todas las adeninas no modificadas (PS188; SEQ ID NO: 95) con 2,6-diaminopurinas (PS733; SEQ ID NO:207) en seguridad in vitro. Como marcadores para la activación de la vía alternativa del complemento, se midieron los factores de división C3a (B) y Bb (C) en plasma de mono.
Ejemplos
TABLA 1. Estructuras generales de AON. X = C o m5C, Y = U o m5U, Z = A o a2A; I = inosina (base de hipoxantina), X1 = m5C, Y1 = m5U, Z1 = a2A
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TABLA 2. Estructuras generales de AON. X = C o m5C, Y = U o m5U, Z = A o a2A; I = inosina (base de hipoxantina), Xi = m5C, Y1 = m5U, Z1 = a2A
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TABLA 3. AON más preferidos Estructuras generales de AON. X = C o m5C, Y = U o m5U, Z = A o a2A; I = inosina (base de hipoxantina), X1 = m5C, Y1 = m5U, Z1 = a2A
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Los oligonucleótidos no modificados preferidos (X = C, Y = U, Z = A) se derivan más preferiblemente de cada una de las secuencias de base de oligonucleótidos (SEQ ID NO: 14-90) y se representan por una secuencia de nucleótidos o de bases SEQ ID NO:91, 93-170
Los oligonucleótidos modificados preferidos derivados de una de las secuencias de nucleótidos o de bases SEQ ID NO: 14-90 y que comprenden al menos una X es m5C y/o al menos una Y es m5U y/o al menos una Z es a2A están representados por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en SEQ ID NO: 92, 171-213,215, 217, 218, 219. Los oligonucleótidos modificados incluso más preferidos (todas las X = m5C = X1 y/o todas las Y = m5U = Y1 y/o todas las Z = a2A =Z1) se derivan de las secuencias de nucleótidos o de bases más preferidas (SEQ ID NO: 15, 21, 31, 40, 52 y 57) y están representados por SEQ ID NO: 92, 171-174, 185-188, 199, 200, 202-213, 215, 217, 218, 219. Los oligonucleótidos modificados más preferidos se describen en la Tabla 3.
EJEMPLO 1.
Materiales y procedimientos
AONs
Todos los oligonucleótidos (PS220/PS399, basado en SEQ ID NO:21 correspondiente a SEQ ID NO:101 para la secuencia no modificada (PS220) y a SEQ ID NO:200 donde todas las citosinas están modificadas (PS399); PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319, basado en SEQ ID NO:52 correspondiente a SEQ ID NO:91 para la secuencia no modificada (PS229L), a SEQ ID NO:92 (PS524) donde todas las 6 citosinas están modificadas, a SEQ ID NO: 217 (PS1317) donde 4 de las 6 citosinas están modificadas, a SEQ ID NO: 218 (PS1318) donde 2 de las 6 citosinas están modificadas y a la SEQ ID NO:219 (PS1319) donde 3 de las 6 citosinas están modificadas; PS232/PS648, basado en Se Q ID NO: 39 correspondiente a SEQ ID NO:119 para la secuencia no modificada (PS232) y a SEQ ID NO:201 donde todas las citosinas están modificadas (PS648); PS531/PS652, basado en SEQ iD NO:57 correspondiente a SEQ ID NO:137 para la secuencia no modificada (PS531) y a SEQ ID NO:185 donde todas las citosinas están modificadas (PS652); PS534/PS653, basado en SEQ ID NO:59 correspondiente a SEQ ID NO:139 para la secuencia no modificada (PS534) y a SEQ ID NO:192 donde todas las citosinas están modificadas (PS653)) fueron ARN 2'-0-metil fosforotioato, y se sintetizaron usando un sintetizador OP-10 (GE/ÁKTA Oligopilot), a través de protocolos estándar de fosforamidita, u obtenidos de proveedores comerciales, en una escala de síntesis de 40 nmol-4,5 mmol. Los oligonucleótidos sintetizados con Prosensa se escindieron y desprotegieron en una secuencia de dos etapas (DIEA seguido de tratamiento de NH4OH conc.), se purificaron por HPLC y se disolvieron en agua y se añadió un exceso de NaCI para intercambiar iones. Después de la evaporación, los compuestos se volvieron a disolver en agua, se desalaron mediante FPLC o ultrafiltración y se liofilizaron. La espectrometría de masas confirmó la identidad de todos los compuestos, y la pureza (determinada por UPLC) se consideró aceptable para todos los compuestos (>75-80 %); los compuestos obtenidos de fuentes comerciales se utilizaron tal como se recibieron: PS399 (chemGenes, escala de síntesis de 1 pmol, utilizado tal como se recibió), PS1317, PS1318 y PS1319 (ChemGenes, escala de síntesis de 200 nmol, utilizado tal como se recibió), PS229L, PS232, PS524 y Ps 648 (EuroGentec, escala de síntesis de 40 nmol, utilizado tal como se recibió), PS229L (Prosensa, 5,9 g de material obtenido, pureza del 81 %), PS524 (Avecia, escala de síntesis de 4,5 mmol, pureza del 93 %), PS534 (Prosensa, escala de síntesis de 2 pmol, pureza del 86 %), PS653 (Prosensa, escala de síntesis de 40 nmol, pureza del 77 %), PS531 (Avecia, 4,6 g de material obtenido, pureza del 85 %), PS652 (Avecia, 2,4 g de material obtenido, pureza del 84 % y 3,8 g de material obtenido, pureza del 82 %). Para los experimentos de transfección in vitro descritos en esta invención, se prepararon soluciones de trabajo 50 pM de los AON en tampón fosfato 20 mM (pH 7,0). Para los ensayos de liberación de citocinas en sangre entera en este ejemplo, las concentraciones de las soluciones madre (preparadas en agua destilada libre de DNasa/RNasa (Invitrogen)) variaron: PS232 (8,75 mg/ml), PS534 (7,02 mg/ml), PS648 (8,55 mg/ml), PS653 (8,12 mg/ml).
Análisis de transfección y RT-PCR
Se transfectaron células musculares de control sanas humanas diferenciadas (miotubos) en placas de 6 pocillos con una serie de concentraciones de AON triples de 0-100-200-400 nM (Fig. 1a, PS229L/PS524, SEQ ID NO:91/92) o 0­ 50-100-200-400-800 nM (Fig. 1b, PS220/PS399, SEQ ID NO: 101/200) o con una concentración por duplicado de 400 nM (Fig. 1c, PS524/PS1317/PS1318/PS1319, SEQ ID NO:92/217/218/219), de acuerdo con los procedimientos operativos estándar sin GLP. Para la transfección se utilizó polietilenimina (ExGen500, Fermentas) (2 pl por pg de AON, en NaCl 0,15 M). Los procedimientos de transfección mencionados anteriormente fueron adaptados de materiales y procedimientos previamente notificados (Aartsma-Rus y col., 2003). A las 24 horas después de la transfección, se aisló el ARN y se analizó mediante RT-PCR. Brevemente, para generar ADNc específico de distrofina, un cebador inverso específico del gen de DMD en el exón 47 (PS220/PS399) o exón 55 (PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319) se utilizó en la reacción de transcriptasa inversa (RT, por sus siglas en ingles) en 1000 ng de ARN de entrada. El análisis de PCR se realizó posteriormente en 3 pl de ADNc de distrofina para cada muestra, e incluyó una PCR inicial y anidada utilizando cebadores específicos del gen de DMD en los exones que flanquean el exón 45 (PS220/PS399) o 53 (PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319). El aislamiento de ARN y el análisis de RT-PCR se realizaron de acuerdo con los procedimientos operativos estándar sin GLP descritos (Aartsma-Rus y col., 2003). Los productos de RT-PCR se analizaron mediante electroforesis en gel (geles de agarosa al 2 %). Los fragmentos de RT-PCR resultantes se cuantificaron mediante análisis Lab-on-a-Chip de ADN (Agilent). Los datos fueron procesados por el software "Agilent 2100 Bioanalyzer" y Excel 2007. Se evaluó la relación del producto de transcripto más pequeño (que contiene la omisión del exón 45(PS220/PS399) o 53 (PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319)) a la cantidad total de productos de transcripto (que representan las eficiencias de omisión del exón 45 o 53 en porcentajes) y se comparó directamente con la de las células no transfectadas.
Estudio farmacocinético en ratones de tipo salvaje y mdx
Los ratones mdx (C57Bl/10ScSn-Dmdmdx/J) y de tipo salvaje (C57Bl/10ScSnJ) de 5 semanas de edad se obtuvieron de Jackson Laboratory (Maine, EE. UU.). Los AON (PS229L/PS524 correspondiente a SEQ ID NO: 91/92, PS531/PS652 correspondiente a SEQ ID NO: 137/185) se administraron en solución salina fisiológica a una dosis de 100 mg/kg mediante inyecciones subcutáneas tres veces por semana durante dos semanas. Para determinar el perfil plasmático de los AON, se tomaron muestras de plasma de 2 animales por punto de tiempo (por grupo de AON) en los siguientes momentos para los animales: 15 min, 1 h, 2 h, 6 h y 24 horas después de la dosificación. Para obtener plasma, se recogió sangre entera venosa en tubos de heparina de litio, se centrifugó y se mantuvo a -80 °C hasta el análisis. Para el análisis de distribución, se recogieron 7 órganos (corazón, corteza renal, hígado, diafragma, gastrocnemio, cuádriceps y tríceps) tras el sacrificio de los animales. Los tejidos se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis.
Ensayo de hibridación de AON
Para determinar la concentración de AON (PS229L/PS524 correspondiente a SEQ ID NO: 91/92, PS531/PS652 correspondiente a SEQ ID NO: 137/185) en plasma y tejido, se utilizó un ensayo de hibridación de AON, que se basa en el ensayo descrito por Yu y col., 2002. Para el análisis de distribución de tejidos, los tejidos se homogeneizaron, utilizando un MagNaLyzer (Roche) a una concentración de 60 mg/ml en tampón protK (100 mmol/l de Tris-HCl pH 8,5, 200 mmol/l de NaCl, 5 mmol/l de EDTA, SDS al 0,2 %) que contiene 2 mg/ml de proteinasa K, seguido de una incubación de 2 horas (hígado) o una incubación de 4 horas (todos los demás órganos) en un horno de hibridación giratorio a 55 °C y a continuación se almacenó a -20 °C hasta su uso. Todos los homogeneizados de tejido y las curvas de calibración se diluyeron (ajustados a los criterios del ensayo) en un homogeneizado de tejido de control de mdx agrupado diluido 60 veces (riñón, hígado, varios grupos de músculos). En el ensayo de hibridación se utilizaron una sonda molde específica para cada AON (5' gaatagacg-anti-AON-biotina 3', oligonucleótido de fosfato de ADN) y una sonda de ligación (oligonucleótido de fosfato de ADN p-cgtctattc-DIG). Los homogeneizados se incubaron durante 1 h a 37 °C con sonda molde (50 nmol/l) y las muestras hibridadas se transfirieron a placas de 96 pocilios recubiertas con estreptavidina y se incubaron durante 30 min a 37 °C. Posteriormente, la placa se lavó 4 veces y el ligamiento marcado con digoxigenina (2 nmol/l) se añadió y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. La etiqueta DIG se detectó usando un anti-DIG-POD (1:7,500 - 1:30,000; Roche Diagnostics), que se visualizó con un sustrato de 3,3', 5,5'-tetrametilbencidina (Sigma Aldrich, Países Bajos), y la reacción se detuvo utilizando una solución ácida (Sigma Aldrich). La absorción se midió a 450 nm usando un lector de placas BioTek Synergy HT (Beun de Ronde, Abcoude, Países Bajos). Las muestras de plasma se analizaron de acuerdo con el mismo protocolo, utilizando plasma de mdx agrupado diluido 100 veces.
Ensayo de liberación de citocinas en sangre entera
Para la detección de una posible estimulación de citocinas inducida por AON seleccionados (PS232/PS648 correspondiente a SEQ ID NO: 119/201 y PS534/PS653 correspondiente a SEQ ID NO: 139/192), se utilizó sangre entera (CPD anticoagulante) de voluntarios humanos sanos. Concentraciones variables de AON (que van de 0 a 50 |jg/ml, en una dilución de aproximadamente 1:0.01 (v/v)) se agregaron a la sangre y las muestras se incubaron durante 4 horas a 37 °C bajo atmósfera de CO2. al 5 %. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 3200 xg durante 15 minutos a 4 °C y los sobrenadantes de plasma se recogieron y almacenaron a -20 °C hasta la cuantificación de citocinas. Las concentraciones de MCP-1, IL-6, TNF-a e IP-10 se determinaron mediante ELISA tipo sándwich (kits de ELISA para MCP-1, IL-6, TNF-a, IP-10 humanos (R&D Systems). Los experimentos con sangre entera humana se repitieron de tres a cuatro veces. La Figura 3 se basa en un solo experimento, pero se considera representativa.
Resultados
El efecto sobre la actividad AON (es decir, inducir la eficiencia de omisión de exón) de la sustitución de todas las citosinas con 5-metilcitosinas (m5C) se probó en células musculares sanas, diferenciadas y cultivadas in vitro. En la figura 1a y 1b se muestran dos ejemplos. Al comparar PS229L y PS524 (=PS229L-m5C) (es decir, secuencia no modificada SEQ ID NO: 91 en comparación con la secuencia modificada SEQ ID NO: 92 donde se han modificado todas las citosinas) en un experimento de transfección de respuesta a la dosis utilizando 0-100-200-400 nM, PS524 fue claramente más eficiente que PS229L a 200 y 400 nM (niveles de omisión del exón 531,9 veces más altos) (Figura 1a). Del mismo modo, al comparar PS220 y PS399 (=PS220-m5C) (es decir, secuencia no modificada SEQ ID NO: 101 en comparación con la secuencia modificada SEQ ID NO: 200 donde se han modificado todas las citosinas) en un experimento de transfección de respuesta a la dosis usando 0-50-100-200-400-800 nM, PS399 fue claramente más eficiente que PS220, especialmente a concentraciones más bajas (hasta niveles de omisión del exón 4510 veces más altos a 50 nM) (Figura 1b). Estos resultados demuestran que la presencia de 5-metilcitosinas tiene un efecto positivo sobre la actividad de los AON. En PS524 (SEQ ID NO:92) todas las 6 citosinas están sustituidas con 5-metilcitosinas (m5C) que tuvieron un efecto positivo en la actividad de omisión del exón en comparación con el oligonucleótido homólogo no modificado PS229L (SEQ ID NO:91) (Figura 1a). Para probar si dicho efecto positivo puede estar correlacionado con el número o porcentaje de modificaciones de base incorporadas, se probaron PS1317, PS1318 y PS1319, con 4, 2 y 3 de las 6 citosinas sustituidas con 5-metilcitosinas (m5C), respectivamente, y directamente comparando con PS524 en células musculares sanas, diferenciadas y cultivadas in vitro. PS1317, PS1318 y PS1319 fueron efectivos para inducir la omisión del exón 53 (47 %, 37 %, y 45 % respectivamente) (Figura 1c). Sin embargo, en comparación con los niveles obtenidos con PS524 (64 %), estos resultados de hecho sugieren que la reducción del número de 5-metilcitosinas (m5C), de 6 a 4, 3 o 25-metilcitosinas, conduce a un efecto positivo reducido sobre la actividad de omisión de exón del AON.
Para investigar si las 5-metilcitosinas afectan la bioestabilidad, biodistribución, y/o biodisponibilidad, se realizó un estudio farmacocinético tanto en ratones de tipo salvaje (control) como en ratones mdx. El modelo de ratón mdx para DMD tiene una mutación finalizadora natural en el exón 23 y, por lo tanto, es deficiente en distrofina. La falta de distrofina en las membranas aumenta la permeabilidad de las fibras musculares para moléculas relativamente pequeñas como AON y, de hecho, se ha demostrado que aumenta la captación de AON de ARN 2'-0-metil fosforotioato por el músculo hasta 10 veces (Heemskerk y col., 2010). A los ratones se les inyectó por vía subcutánea 100 mg/kg de AON que contienen 5-metilcitosina (PS524, PS652 correspondiente a SEQ ID NO: 92, 185) o sus homólogos con citosinas no modificadas (PS229L, PS531 correspondiente a SEQ ID NO: 91, 137), tres veces por semana durante dos semanas. En diferentes momentos (día 1, 7, 14) después de la última inyección, los ratones fueron sacrificados y se aislaron diferentes grupos de músculos (corazón, diafragma, gastrocnemio, cuádriceps y tríceps) e hígado y riñón para determinar las concentraciones de AON en ellos (Figura 2A). Como se anticipó, para todos los compuestos, las concentraciones en los músculos de mdx (promedio de todas las muestras) fueron más altas que las de los ratones de control. La relación de los niveles de AON de mdx a control pareció relativamente más alta para los AON con 5-metilcitosinas. Más específicamente, en los ratones mdx, los niveles de PS524 y PS652 fueron de 2 a 3 veces más altos que los de PS229L y PS531. (Figura 2A). Al monitorear los niveles de AON en riñón e hígado (órganos de toxicidad conocida), las relaciones entre tejido muscular y tejidos de toxicidad permanecieron similares, o incluso fueron favorables para PS524. Estos resultados sugieren que los AON con 5-metilcitosina se absorben mejor o son más estables en el músculo que los AON con citosinas no modificadas. De hecho, la vida media en el músculo fue más larga para PS524 (>20 días) y PS652 (25 días) en comparación con PS229L (7 días) y PS531 (10 días). En plasma, los valores de Cmáx de AON inyectados fueron similares, lo que confirma que los ratones recibieron dosis iguales (Figura 2B). Sorprendentemente, los valores de AUC (como indicador de biodisponibilidad) fueron de 1,5 a 2,3 veces más altos para los AON que contienen 5-metilcitosina. Esto se asoció con un menor aclaramiento que apoya sus niveles más altos de tejido muscular. Los resultados de este estudio farmacocinético demuestran, por tanto, que la presencia de 5-metilcitosinas tiene un efecto positivo sobre la bioestabilidad, biodistribución, y/o biodisponibilidad de los AON, mientras que las relaciones de órgano muscular/de toxicidad fueron similares a las de los AON con citosinas no modificadas.
El perfil de seguridad in vitro de los AON con 5-metilcitosinas (PS648, PS653 correspondientes a SEQ ID NO: 201, 192) se comparó con el de los AON con citosinas no modificadas (PS232, PS534, correspondiente a SEQ ID NO: 119, 139). Los AON pueden estimular una respuesta inmunitaria innata activando los receptores tipo Toll (incluidos TLR7, TLR8, TLR9), lo que da como resultado un conjunto de respuestas inmunitarias coordinadas que incluyen la inmunidad innata. Varias quimiocitocinas y citocinas, como IP-10, TNFa, IL-6 y MCP-1, desempeñan un papel en este procedimiento y, por lo tanto, se monitorearon en sangre entera humana incubada con 0 a 50 pg/ml de cada AON (utilizando kits de ELISA disponibles comercialmente). PS232 y PS534 tienen citosinas no modificadas e inducen la liberación de TNF-a (Figura 3A, B), MCP-1 (Figura 3C, D), IP-10 (Figura 3E, F) e IL-6 (Figura 3G, H) en dosis crecientes. Por el contrario, tanto PS648 como PS653 (con 5-metilcitosinas) no tuvieron ningún efecto sobre TNF-a, IP-10 e IL-6. PS653, no PS648, pareció inducir una liberación menor de MCP-1 solamente. En conclusión, la presencia de 5-metilcitosinas mejoró el perfil de seguridad de estos AON in vitro.
EJEMPLO 2.
Materiales y procedimientos
AONs
Todos los oligonucleótidos (PS43/PS559/PS1106, todos basados en SEQ ID NO:31, y correspondientes a SEQ ID NO: 111 para la secuencia no modificada (PS43), SEQ ID NO: 202 (PS559) donde se han modificado todos los uracilos, y SEQ ID NO: 203 (PS1106) donde se han modificado todos los uracilos y todas las citosinas; PS188/PS785/PS1107, todos basados en SEQ ID NO:15, y correspondientes a SEQ ID NO: 95 para la secuencia no modificada (PS 188), SEQ ID NO: 204 (PS785) donde todos los uracilos han sido modificados, y SEQ ID NO: 205 (PS 1107) donde todos los uracilos y todas las citosinas han sido modificados; PS235/PS786, ambos basados en SEQ ID NO:40, y correspondiente a SEQ ID NO: 120 para secuencia no modificada (PS235) y SEQ ID NO: 172 (PS786) donde todos los uracilos han sido modificados), y PS49 (SEQ ID NO:216) para secuencia no modificada y Ps 959 (SEQ ID NO:214) donde todas las citosinas han sido modificadas, eran ARN 2'-0-metil fosforotioato, y sintetizados usando un sintetizador OP-10 (GE/ÁKTA Oligopilot) a través de protocolos estándar de fosforamidita, u obtenidos de proveedores comerciales, en una escala de 200 nmol-286,1 g. Los oligonucleótidos sintetizados con Prosensa se escindieron y desprotegieron en una secuencia de dos etapas (DIEA seguido de tratamiento de NH4OH conc.), se purificaron por HPLC y se disolvieron en agua y se añadió un exceso de NaCl para intercambiar iones. Después de la evaporación, los compuestos se volvieron a disolver en agua, se desalaron mediante FPLC o ultrafiltración y se liofilizaron. La espectrometría de masas confirmó la identidad de todos los compuestos, y la pureza (determinada por UPLC) se consideró aceptable para todos los compuestos (>75-80 %); los compuestos obtenidos de fuentes comerciales se utilizaron tal como se recibieron: PS188 (Girindus, 286,1 g de producto obtenido, pureza del 93 %), PS785, PS786, PS 1106 y PS1107 (ChemGenes, escala de síntesis de 200 nmol, utilizados tal como se recibieron), PS43 (Prosensa, escala de síntesis de 1 pmol, pureza del 90 %), PS559 (ChemGenes, escala de síntesis de 1 pmol, utilizado tal como se recibió), PS235 (Prosensa, escala de síntesis de 1,92 mmol, pureza del 91 %). Para los experimentos de transfección in vitro descritos en esta invención, se prepararon soluciones de trabajo 50 pM de los AON en tampón fosfato 20 mM (pH 7,0).
Análisis de transfección y RT-PCR
Se transfectaron células musculares de control sanas humanas diferenciadas (miotubos) en placas de 6 pocillos con una concentración fija de AON de 200 nM, de acuerdo con procedimientos operativos estándar sin GLP. Para la transfección se utilizó polietilenimina (ExGen500, Fermentas) (2 pl por pg de AON, en NaCl 0,15 M). Los procedimientos de transfección mencionados anteriormente fueron adaptados de materiales y procedimientos previamente notificados (Aartsma-Rus y col., 2003). A las 24 horas después de la transfección, se aisló el ARN y se analizó mediante RT-PCR. Brevemente, para generar ADNc específico de distrofina, se utilizó un cebador inverso específico del gen de DMD en el exón 53 (PS43/PS559/PS1106, SEQ ID NO: 111, 202, 203), exón 46 (PS188/PS785/PS1107 SEQ ID NO: 95, 204, 205) o exón 54 (PS235/PS786, SEQ ID NO: 120, 172) en la reacción de transcriptasa inversa (RT) en 1000 ng de ARN de entrada. El análisis de PCR se realizó posteriormente en 3 pl de ADNc de distrofina para cada muestra, e incluyó una PCR inicial y anidada utilizando cebadores específicos del gen de DMD en los exones que flanquean el exón 51 (PS43/PS559/PS1106), exón 44 (PS188/PS785/PS1107) o exón 52 (PS235/PS786). El aislamiento de ARN y el análisis de RT-PCR se realizaron de acuerdo con los procedimientos operativos estándar sin GLP descritos [Aartsma-Rus y col., Hum Mol Genet 2003;12(8):907-14]. Los productos de RT-PCR se analizaron mediante electroforesis en gel (geles de agarosa al 2 %). Los fragmentos de RT-PCR resultantes se cuantificaron mediante análisis Lab-on-a-Chip de ADN (Agilent). Los datos fueron procesados por el software "Agilent 2100 Bioanalyzer" y Excel 2007. Se evaluó la relación del producto de transcripto más pequeño (que contiene la omisión del exón 51 (PS43/PS559/PS1106), exón 44 (PS188/PS785/PS1107), o exón 52 (PS235/PS786) a la cantidad total de productos de transcripto (que representan las eficiencias de omisión del exón 51, 44 o 52 en porcentajes) y se comparó directamente con la de las células no transfectadas.
Administración in vivo y RT-PCR
Los experimentos con el modelo de ratón mdx (C57Bl/10ScSn-mdx/J; Charles River Laboratories) fueron aprobados por el Comité de Ética Animal local de LUMC (número de DEC 11145). Se anestesiaron dos ratones mdx por grupo usando isoflurano y a continuación se les inyectó por vía intramuscular en ambos músculos gastrocnemios 20 ug de PS49 (SEQ ID NO: 216) o PS959 (SEQ ID No . NO:214), diluido en solución salina estéril hasta un volumen total de 50 |jl por inyección, durante dos días consecutivos. Los animales se sacrificaron 1 semana después de la última inyección mediante luxación cervical y los músculos se aislaron y congelaron rápidamente en tubos magnalyzer greenbead (Roche). Se añadieron seiscientos j l de Tripure (Roche) a los tubos y se homogeneizaron los músculos utilizando la máquina bulletblender, 3 x 1 min a velocidad 10. El lisado se transfirió a un tubo limpio al que se le añadieron 120 j l de cloroformo. Las muestras se agitaron vigorosamente y se incubaron en hielo durante 5 minutos, a continuación se centrifugaron durante 15 minutos a velocidad máxima a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a otro tubo y se añadió 1 volumen de isopropanol. Las muestras se mezclaron y se incubaron a 4 grados durante al menos 30 minutos. A continuación, las muestras se centrifugaron durante 15 minutos a velocidad máxima a 4 °C, se lavaron con etanol al 70 % seguido de una segunda etapa de centrifugación de 10 minutos a velocidad máxima a 4 °C. Los sedimentos de ARN se secaron al aire y se disolvieron en agua tratada con DEPC. Se generó ADNc usando 400 ng de ARN total con cebadores hexámeros aleatorios usando transcriptasa inversa T ranscriptor (RT) (Roche Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las PCR se realizaron mediante 30 ciclos de 94 grados durante 30 s, 60 grados durante 30 s y 72 grados durante 30 s en una reacción de 50 j l utilizando 1,5 j l de ADNc como molde utilizando cebadores específicos para el exón 22 y el exón 24 de ratón. Los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa al 2 %, se cuantificaron en el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.).
Resultados
El efecto sobre la actividad de AON (es decir, inducir la eficiencia de omisión de exón) de sustituir todas las citosinas no modificadas con 5-metilcitosinas y sustituir todos los uracilos no modificados con 5-metiluracilos (como en PS1106, PS1107, SEQ ID NO: 203, 205), y de solo sustituir todos los uracilos no modificados con 5-metiluracilos (como en PS559, PS785, PS786, SEQ ID n O: 202, 204, 172), se probó primero a una concentración fija de 200 nM de AON en células musculares sanas, diferenciadas y cultivadas in vitro (Figura 4A). Los AON con 5-metiluracilos (PS559, PS785 y PS786) aumentaron las eficiencias de omisión de exón de 1,3 a 3 veces en comparación con sus homólogos con uracilos no modificados. Al reemplazar también las citosinas no modificadas por 5-metilcitosinas, los niveles de omisión aumentaron aún más (PS1106 versus PS559, SEQ ID NO: 203 versus 202) o similar (PS1107 versus PS785, SEQ ID NO: 205 versus 204). El efecto sobre la actividad de AON (es decir, inducir la eficiencia de omisión de exón) de la sustitución de todos los uracilos no modificados (como en PS49; SEQ ID NO:216) con 5-metiluracilos (como en PS959; SEQ ID NO:214) también se probó a continuación en el músculo del modelo de ratón mdx. PS959 con todos los 5-metiluracilos aumentó la eficiencia de omisión del exón 23 aproximadamente 3 veces en comparación con PS49 con uracilos no modificados (n=4 por AON) (Figura 4B). Estos resultados demuestran que no solo las 5-metilcitosinas pueden tener un efecto positivo sobre la actividad de omisión de exón (como también se muestra en la Figura 1), sino también en los 5-metiluracilos, tanto in vitro como in vivo. Además, el uso combinado de estas 5-metilpirimidinas puede aumentar aún más la actividad.
EJEMPLO 3.
Materiales y procedimientos
AONs
Todos los oligonucleótidos (PS43/PS403, basados en SEQ ID NO:31, y correspondiente a SEQ ID NO: 111 (PS43) para la secuencia no modificada y SEQ ID NO: 206 (PS403) para la secuencia donde todas las adeninas han sido modificadas; PS188/PS733, basado en SEQ ID NO:15, y correspondiente a SEQ ID NO: 95 (PS188) para la secuencia no modificada y SEQ ID NO: 207 (PS733) para la secuencia donde se han modificado todas las adeninas; PS235/PS897, basado en SEQ ID NO:40, y correspondiente a SEQ ID NO: 120 (PS235) para la secuencia no modificada y SEQ ID NO: 173 (PS897) para la secuencia donde todas las adeninas han sido modificadas) fueron ARN 2'-0-metil fosforotioato, y se sintetizaron usando un sintetizador OP-10 (GE/ÁKTA Oligopilot) a través de protocolos estándar de fosforamidita, u obtenidos de proveedores comerciales, en una escala de 200 nmol-151 g. Los oligonucleótidos sintetizados con Prosensa se escindieron y desprotegieron en una secuencia de dos etapas (DIEA seguido de tratamiento de NH4OH conc.), se purificaron por HPLC y se disolvieron en agua y se añadió un exceso de NaCl para intercambiar iones. Después de la evaporación, los compuestos se volvieron a disolver en agua, se desalaron mediante FPLC o ultrafiltración y se liofilizaron. La espectrometría de masas confirmó la identidad de todos los compuestos, y la pureza (determinada por UPLC) se consideró aceptable para todos los compuestos (>75-80 %); los compuestos obtenidos de fuentes comerciales se utilizaron tal como se recibieron: PS188 (Girindus, 151 g obtenidos, pureza del 92 %), PS733 (TriLink o ChemGenes, escala de síntesis de 200 nmol/1 mg, utilizado como se recibió, PS43 (Prosensa, escala de síntesis de 10 jmol, pureza del 86 %), PS403 (ChemGenes, escala de síntesis de 1 |jmol, utilizado como se recibió), PS235 (Prosensa, escala de síntesis de 1,92 mmol, pureza del 91 %), PS897 (ChemGenes, escala de síntesis de 200 nmol, utilizado tal como se recibió). Para los experimentos de transfección in vitro descritos en esta invención, se prepararon soluciones de trabajo 50 jM de los AON en tampón fosfato 20 mM (pH 7,0). Para los ensayos de activación del complemento in vitro descritos en esta invención, se prepararon 3 mg/ml de soluciones madre de PS188 y PS733 en tampón fosfato 20 mM (pH 7,0).
Análisis de transfección y RT-PCR
Se transfectaron células musculares de control sanas humanas diferenciadas (miotubos) en placas de 6 pocillos con una concentración fija de AON de 200 nM, de acuerdo con procedimientos operativos estándar sin GLP. Para la transfección se utilizó polietilenimina (ExGen500, Fermentas) (2 j l por jg de AON, en NaCl 0,15 M). Los procedimientos de transfección mencionados anteriormente fueron adaptados de materiales y procedimientos previamente notificados (Aartsma-Rus y col., 2003). A las 24 horas después de la transfección, se aisló el ARN y se analizó mediante RT-PCR. Brevemente, para generar ADNc específico de distrofina, se utilizó un cebador inverso específico del gen de DMD en el exón 53 (PS43/PS403, SEQ ID NO: 111/ 206), exón 46 (PS188/PS733, SEQ ID NO: 95/207) o exón 54 (PS235/PS897, SEQ iD NO: 120/173) en la reacción de transcriptasa inversa (RT) en 1000 ng de ARN de entrada. El análisis de PCR se realizó posteriormente en 3 j l de ADNc de distrofina para cada muestra, e incluyó una PCR inicial y anidada utilizando cebadores específicos del gen de DMD en los exones que flanquean el exón 51 (PS43/PS403), exón 44 (PS188/PS733) o exón 52 (PS235/PS897). El aislamiento de ARN y el análisis de RT-PCR se realizaron de acuerdo con los procedimientos operativos estándar sin GLP descritos [Aartsma-Rus y col., Hum Mol Genet 2003;12(8):907-14]. Los productos de RT-PCR se analizaron mediante electroforesis en gel (geles de agarosa al 2 %). Los fragmentos de RT-PCR resultantes se cuantificaron mediante análisis Lab-on-a-Chip de ADN (Agilent). Los datos fueron procesados por el software "Agilent 2100 Bioanalyzer" y Excel 2007. Se evaluó la relación del producto de transcripto más pequeño (que contiene la omisión del exón 51 (PS43/PS403), exón 44 (PS188/PS733), o exón 52 (PS235/PS897) a la cantidad total de productos de transcripto (que representan las eficiencias de omisión del exón 51, 44 o 52 en porcentajes) y se comparó directamente con la de las células no transfectadas.
Ensayo de activación del complemento:
Los oligonucleótidos antisentido pueden activar la vía alternativa del complemento, que contiene varios factores de división, como C3a y factor Bb (este último es exclusivo de la vía alternativa). La capacidad de los AON para activar posiblemente la vía del complemento se evaluó en plasma de monos Cynomolgus (plasma LiHe, CIT, Francia). Concentraciones crecientes (de 0 a 300 jg/m l) de PS188 (SEQ ID NO: 95) y PS733 (Ps 207), en una dilución de 1:10 (v/v)), se añadieron al plasma y se incubaron a 37 °C durante 30 min. La reacción se terminó transfiriendo las muestras a hielo y preparando diluciones en diluyente enfriado con hielo. Las concentraciones de Bb y C3a se determinaron mediante ELISA (Quidel, San Diego, c A).
Resultados
El efecto sobre la actividad AON (es decir, inducir la eficiencia de omisión de exón) de la sustitución de todas las adeninas no modificadas con 2,6-diaminopurinas se probó en una concentración de AON fija (200 nM) en células musculares sanas, diferenciadas y cultivadas in vitro. En la Figura 5A se muestran ejemplos de tres secuencias AON diferentes. Los AON con 2,6-diaminopurinas (PS403, PS897 y PS733, SEQ ID NO: 206, 207, 173) aumentaron las eficiencias de omisión de exón de 2 a 4 veces en comparación con sus homólogos con adeninas no modificadas (en comparación con SEQ ID NO: 111, 95, 120). Parecía haber una correlación con el número de 2,6-diaminopurinas en cada AON.
El efecto de sustituir todas las adeninas no modificadas (como en PS188; SEQ ID NO: 95) con 2,6-diaminopurinas (como en PS733; SEQ ID NO:207) en seguridad in vitro, es decir, la posible activación de la vía alternativa del complemento, se probó en plasma de mono. Mientras que PS188 indujo niveles relativamente altos de ambos factores de división Bb y C3a, las 2,6-diaminopurinas en PS733 abolieron completamente el efecto sobre la vía alternativa, sin mostrar ningún aumento en los niveles de Bb o C3a (Figura 5B). Por tanto, la presencia de 2,6-diaminopurinas pareció mejorar el perfil de seguridad de PS188 in vitro.
Estos resultados demuestran el efecto positivo de las 2,6-diaminopurinas sobre la actividad de omisión del exón y la seguridad de los AON.
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Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un oligonucleótido que comprende un monómero de ARN 2'-O-metil y una cadena principal de fosforotioato y que comprende una base de 5-metilcitosina o una composición que comprende dicho oligonucleótido, donde dicho oligonucleótido tiene una distribución mejorada y/o una actividad de omisión de exón cuando se compara con un oligonucleótido correspondiente que comprende un monómero de ARN 2-O-metil y una cadena principal de fosforotioato sin una 5-metilcitosina.
2. Un oligonucleótido o una composición según la reivindicación 1, donde dicho oligonucleótido comprende una base de 5-metiluracilo.
3. Un oligonucleótido o una composición según la reivindicación 1 o 2, donde dicho oligonucleótido comprende una base de 2,6-diaminopurina.
4. Un oligonucleótido o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la longitud de dicho oligonucleótido es menos de 34 nucleótidos.
5. Un oligonucleótido o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho oligonucleótido es inversamente complementario a y/o se une a y/o se dirige y/o se hibrida con al menos una parte de una región de exón y/o sin exón de distrofina.
6. Un oligonucleótido o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho oligonucleótido comprende o consiste en una secuencia que es inversamente complementaria a y/o se une a y/o se dirige a y/o se hibrida a al menos una parte de los exones 44 a 55 de pre-ARNm de distrofina, teniendo dicha parte oligonucleotídica de 10 a 33 nucleótidos.
7. Un oligonucleótido o una composición según la reivindicación 6, donde dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en una de SEQ ID NO: 52, 14­ 51, 53-90, o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de una de SEQ ID NO: 52, 14-51, 53-90.
8. Un oligonucleótido o una composición según la reivindicación 7, donde dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en una de SEQ ID NO: 52, 15, 21, 31, 40, 57, o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de una de SEQ ID NO: 52, 15, 21, 31, 40, 57.
9. Un oligonucleótido o una composición según la reivindicación 7 u 8, donde dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en una de SEQ ID NO: 92, 171­ 215, 217, 218, 219, o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de una de SEQ ID NO: 92, 171-215, 217, 218, 219.
10. Un oligonucleótido o una composición según la reivindicación 9, donde dicho oligonucleótido está representado por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en una de SEQ ID NO: 92, 171, 173, 185, 187, 200, 206, 207, 208, 210, 213, 217, 218 o 219 o por un nucleótido o una secuencia de bases que comprende o consiste en un fragmento de una de SEQ ID NO: 92, 171, 173, 185, 187, 200, 206, 207, 208, 210, 213, 217, 218 o 219, dicho fragmento comprendiendo o consistiendo en al menos 10 nucleótidos o bases contiguos de SEQ ID NO: 92, 171, 173, 185, 187, 200, 206, 207, 208, 210, 213, 217, 218 o 219 y teniendo tal fragmento una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 nucleótidos.
11. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde comprende al menos un excipiente que puede ayudar aún más a mejorar el direccionamiento y/o la administración de dicha composición y/o dicho oligonucleótido a un tejido y/o una célula y/o en un tejido y/o una célula.
12. Un oligonucleótido o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento y/o el retraso de la distrofia muscular de Duchenne o de la distrofia muscular de Becker.
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