ES2906462T3

ES2906462T3 - Ratones de cadena pesada de inmunoglobulina restringida

Info

Publication number: ES2906462T3
Application number: ES17163115T
Authority: ES
Inventors: Lynn Macdonald; John Mcwhirter; Cagan Gurer; Karolina A Meagher; Andrew J Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-10-17
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2022-04-18
Anticipated expiration: 2032-10-17
Also published as: PT3216871T; IL261242A; KR20200047786A; AU2016204127A1; CN108207807A; HRP20171357T1; LT2627773T; JP2016039820A; US20130323791A1; US20220177572A1; EP4074833A1; IL265967A; DK3216871T3; EP3216871A1; RU2743589C2; SI3216871T1; WO2013059230A1; AU2016204127B2; IL292030B1; MX355062B

Abstract

Un roedor cuyo locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena está restringido de forma que comprende un segmento génico VH humano único, uno o más segmentos génicos DH humanos, y uno o más segmentos génicos JH humanos y que no comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena funcional; en el que el segmento génico VH humano único, uno o más segmentos génicos DH humanos y uno o más segmentos génicos JH están enlazados operativamente a un gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, en el que el segmento génico VH humano único es un segmento génico VH polimórfico asociado con un alto número de copias en poblaciones humanas; en el que el roedor además comprende uno o más segmentos génicos VL de inmunoglobulina humana enlazados operativamente a uno o más segmentos génicos JL humanos; y en el que el segmento génico VH humano único es un miembro de la familia del segmento VH3, o una variante polimórfica del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Ratones de cadena pesada de inmunoglobulina restringida

Ámbito

Animales no humanos modificados genéticamente en un locus de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V) (o en un transgén) para producir anticuerpos a partir de un número restringido de segmentos variables de cadena pesada de inmunoglobulina (V^h) (o un segmento V^húnico) y/o variantes de la misma. Animales no humanos que tienen un dominio variable de cadena pesada humana derivado de un segmento génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina único, p. ej., el segmento génico V^h1-69 de inmunoglobulina humana o el segmento génico V^h1-2 humano. Procedimientos para producir secuencias de anticuerpos en animales no humanos que son útiles para enlazar patógenos, incluidos patógenos humanos. Antecedentes

Los animales no humanos, p. ej., ratones, han sido modificados genéticamente para ser herramientas útiles en procedimientos de producción de secuencias de anticuerpos para utilizar en terapéutica humana basada en anticuerpos. Los ratones con loci de la región variable humanizada (p. ej., los genes V^h, D^hy J^hy los genes V^ly J^l) se utilizan para generar dominios variables de cadena ligera y pesada análogas para utilizar en terapéutica de anticuerpos. También hay otros ratones que generan anticuerpos totalmente humanos con cadenas ligeras y pesadas análogas.

La terapéutica de los anticuerpos humanos se diseña en función de las características deseadas con respecto a ciertos antígenos preseleccionados. Los ratones humanizados se inmunizan con los antígenos preseleccionados y los ratones inmunizados se utilizan para generar poblaciones de anticuerpos a partir de las cuales identificar dominios variables ligeros y pesados análogos de gran afinidad con las características de enlace deseadas. Algunos ratones humanizados, como los que tienen una humanización solo de regiones variables en loci de ratón endógenos, generan poblaciones de linfocitos B que son similares en carácter y en número a las poblaciones de linfocitos B de ratón de tipo natural. Como resultado, hay una población extremadamente amplia y diversa de linfocitos B en los ratones en los que se investigan los anticuerpos, lo que refleja un gran número de reorganizaciones de inmunoglobulina diferentes, para identificar los dominios variables ligeros y pesados con las características más deseables.

Pero no todos los antígenos provocan una respuesta inmunitaria que muestre un número muy grande de reorganizaciones a partir de una amplia selección de segmentos variables (V). Es decir, la respuesta inmunitaria humoral humana a ciertos antígenos está aparentemente restringida. La restricción se refleja en la selección clónica de linfocitos B que muestra solo ciertos segmentos V que se enlazan a ese antígeno concreto con una especificidad y una afinidad suficientemente alta. Algunos de esos antígenos son clínicamente significativos, es decir, algunos son patógenos humanos bien conocidos. Surge la presunción de que el segmento V mostrado en la respuesta inmunitaria humana es un segmento V que, combinado con un segmento D humano y un segmento J humano, es más probable que genere un anticuerpo útil de elevada afinidad que un segmento V seleccionado aleatoriamente que no se haya observado en la respuesta de un anticuerpo humano a ese antígeno.

Existe la hipótesis de que la selección natural, durante milenios, ha seleccionado la base o los cimientos más eficientes con los que diseñar un arma más eficaz para neutralizar los patógenos humanos, un segmento V seleccionado clónicamente. En la tecnología se necesitan más y mejores anticuerpos que enlacen y/o neutralicen antígenos como los patógenos antes indicados. Es necesario generar de forma más rápida secuencias útiles a partir de segmentos V seleccionados, incluidos segmentos V seleccionados mutados de forma somática y/o polimórficos y para generar de forma más rápida poblaciones útiles de linfocitos B que tengan reorganizaciones de los segmentos V con distintos segmentos D y J, incluidas versiones mutadas de forma somática de los mismos y, en particular, reorganizaciones con CDR3 útiles y únicas. Se necesitan sistemas biológicos, p. ej., animales no humanos (tales como, p. ej., ratones, ratas, conejos, etc.) que puedan generar secuencias de región variable de anticuerpo terapéuticamente útiles a partir de los segmentos V pre-seleccionados con más diversidad y en mayor número que, p. ej., los que se pueden lograr en los animales modificados existentes. Se necesitan sistemas biológicos modificados para tener un sistema inmunitario humoral dedicado para seleccionar clónicamente secuencias variables de anticuerpos derivadas de segmentos V restringidos y preseleccionados, incluidos, aunque no de forma limitativa, los dominios variables de cadena ligera y pesada humanas análogas, útiles en la producción de terapéuticas basadas en anticuerpos humanos contra antígenos seleccionados, incluidos ciertos patógenos humanos.

En la tecnología se necesitan anticuerpos terapéuticos que sean capaces de neutralizar antígenos virales, p. ej., VIH y VHC, incluidos anticuerpos específicos de antígenos que contienen cadenas pesadas derivadas de un segmento variable humano único, y para un sistema que produce una fuente distinta de anticuerpos a partir de los cuales seleccionar secuencias de anticuerpo terapéuticas. También se necesitan más procedimientos y animales no humanos que formen anticuerpos útiles, incluidos los anticuerpos que comprenden un repertorio de cadenas pesadas derivadas de un segmento Vh humano único y que tengan un conjunto variado de secuencias CDR, y que incluyan dichas cadenas pesadas que muestren dominios variables de cadena ligera humana análoga. Se necesitan procedimientos para seleccionar CDR para las proteínas de enlace basadas en inmunoglobulina que proporcionen una diversidad mejorada de proteínas de enlace entre las que elegir, y una diversidad mejorada de dominios variables de inmunoglobulina, incluidos los procedimientos y las composiciones para generar dominios variables de inmunoglobulina seleccionados clónicamente o mutados de forma somática para utilizar, p. ej., para crear terapéuticas humanas.

Sumario

En un primer aspecto, la invención proporciona un roedor cuyo locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena está restringido de forma que comprende un segmento génico V^hhumano único, uno o más segmentos génicos Dh humanos y uno o más segmentos génicos Jh humanos y que no comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena funcional, en el que el segmento génico V^hhumano único, uno o más segmentos génicos D^hhumanos y uno o más segmentos génicos J^hestán enlazados operativamente a un gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, en el que el segmento génico V^hhumano único es un segmento génico V^hpolimórfico asociado con un alto número de copias en poblaciones humanas; en el que el roedor comprende además uno o más segmentos génicos V^lde inmunoglobulina humana enlazados operativamente a uno o más segmentos génicos J^lhumanos; y en el que el segmento génico V^hhumano único es un miembro de la familia del segmento V^h3, o una variante polimórfica del mismo.

En un segundo aspecto, la invención proporciona una célula o un tejido derivado del ratón del primer aspecto de la invención.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio V^hhumano que comprende las etapas de: (a) inmunizar a un roedor del primer aspecto de la invención con un antígeno de interés; (b) permitir que dicho roedor desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno de interés; y (c) obtener una secuencia de ácido nucleico de la región V^hde inmunoglobulina que codifica un dominio de VH humano de dicho roedor.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona el uso de un roedor según el primer aspecto de la invención en un procedimiento de producción de una secuencia de un ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada humana.

Se proporcionan loci de inmunoglobulina genéticamente modificada que comprenden un número restringido de segmentos génicos de región variable de cadena pesada diferentes (es decir, genes V, genes V^h, segmentos génicos Vh o segmentos génicos V), p. ej., no más de uno, dos o tres genes V diferentes; o no más de un miembro de la familia del segmento génico V presente, p. ej., en múltiples copias o en una única copia y/o que comprende uno o más polimorfismos.

Se describen loci que son capaces de reorganizar y formar un gen que codifica un dominio variable de cadena pesada derivado a partir de un repertorio genético Vh que está restringido, p. ej., que es un segmento génico Vho único que está seleccionado de una pluralidad de variantes polimórficas del segmento génico V^húnico. Se proporcionan loci de inmunoglobulina modificada que incluyen loci que comprenden secuencias de inmunoglobulina humana, p. ej., un segmento V humano enlazado operativamente a una secuencia constante de inmunoglobulina humana o (quimérica humana/no humana) no humana (y unida de forma operativa con, p. ej., D y/o J). Se proporcionan loci modificados que comprenden múltiples copias de un segmento génico V^húnico, en el que una o más de las copias comprenden una variante polimórfica. Se proporcionan loci modificados que comprenden múltiples copias de un segmento Vh único, enlazado operativamente a uno o más segmentos D y a uno o más segmentos J, enlazados operativamente a una secuencia constante de inmunoglobulina no humana, p. ej., una secuencia de rata o ratón. También se proporcionan animales no humanos que comprenden dichos loci humanizados.

Se proporcionan animales no humanos que tienen una complejidad reducida de segmento génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina (es decir, un número limitado de segmentos génicos variables de cadena pesada, o un repertorio genético limitado variable de cadena pesada), en el que la complejidad reducida del segmento génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina se caracteriza por la presencia de no más de uno o no más de dos segmentos génicos variables de cadena pesada, y en el que los genes variables de cadena pesada presentes están enlazados operativamente a una secuencia de región constante humana o no humana. Se proporcionan animales no humanos que tienen una complejidad reducida del segmento génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina (p. ej., un segmento génico Vh único o un número limitado de segmentos génicos Vh que son variantes polimórficas de un segmento génico Vh único), en el que la complejidad reducida del segmento génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina se caracteriza por la presencia de un segmento génico V^húnico o de una pluralidad de segmentos génicos V^hque son formas polimórficas de un segmento génico V^húnico (p. ej., segmentos génicos V^hasociados con número de copia alto y/o polimorfismo en humanos), y en el que los genes variables de cadena pesada presentes están enlazados operativamente a una secuencia de región constante humana o no humana. Los genes variables de cadena pesada presentes están enlazados operativamente a uno o más segmentos génicos D y/o a uno o más segmentos génicos J en la línea germinal del animal no humano.

Se proporcionan animales no humanos que comprenden un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina (p. ej., en un transgén o como una inserción o sustitución en un locus variable de cadena pesada animal endógena no humana) que comprende un segmento VH único enlazado operativamente a un segmento génico D y/o J. El segmento génico V^húnico puede estar enlazado operativamente a uno o más segmentos génicos D y/o a uno o más segmentos génicos J en el locus génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena del animal no humano.

Se proporcionan animales no humanos modificados en sus loci de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina para eliminar todos o sustancialmente todos (p. ej., todos los segmentos funcionales o casi todos los segmentos funcionales) los segmentos VH de inmunoglobulina endógena y que comprenden un segmento V^h1-69 humano (o un segmento V^h1-2 humano) enlazado operativamente a un segmento D y J o a un segmento J en el locus de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena del animal no humano.

Se describe también que los animales no humanos tienen modificados los loci de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina para hacer que los loci de la región variable endógena sean incapaces de reorganizarse para formar una cadena pesada funcional que comprenda segmentos génicos de la región variable endógena; en el que los animales no humanos comprenden un segmento génico variable humano único (un segmento génico V^h1-2 humano o un segmento génico V^h1-69 humano) enlazado operativamente a un segmento D y J o a un segmento J en el locus de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena del animal no humano.

Se proporcionan animales no humanos que comprenden un número restringido (p. ej., no más de uno o no más de dos) de segmentos génicos de cadena pesada enlazados operativamente a una secuencia de región constante humana o no humana. En un caso, los no más de uno o no más de dos segmentos génicos de cadena pesada unidos a la secuencia de la región constante están en un transgén, p. ej., están en una posición distinta de la de un locus de cadena pesada endógena.

Se describen procedimientos para producir secuencias de inmunoglobulina humana en animales no humanos. En varios casos, las secuencias de inmunoglobulina humana se derivan de un repertorio de secuencias V de inmunoglobulina que consisten fundamentalmente en un segmento V humano único, p. ej., V^h1-69 o V^h1-2, y uno o más segmentos D y J o uno o más segmentos J. Se proporcionan procedimientos para producir secuencias de inmunoglobulina humana en células, tejidos y animales no humanos, en el que las secuencias de inmunoglobulina humana enlazan un patógeno.

Se describen los procedimientos para producir ratones caracterizados por un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringida, en el que la restricción es con respecto al número de segmentos genéricos VH de inmunoglobulina. En varios casos, la restricción es para uno o no más de dos, o un miembro de la familia genética V^húnica (p. ej., uno o más alelos V^h, variantes o variantes polimórficas de los mismos). En varios casos, el locus de cadena pesada además comprende uno o más segmentos génicos DH y uno o más segmentos génicos J^h. En diversos casos, los segmentos génicos V^h, D^hy J^hson humanos. En diversos casos, los segmentos génicos V^h, D^hy J^hestán enlazados operativamente a una región constante no humana (p. ej., una IgM y/o una IgG). En diversos casos, la región constante es una región constante de una rata o un ratón. En un caso, se proporciona un procedimiento para producir un ratón que tenga un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringida, que comprende la introducción de un constructo de ácido nucleico como se describe en la presente memoria en una célula madre embrionaria (ES) de ratón y la separación o identificación de una célula ES de ratón que comprende el constructo de ácido nucleico.

En un caso, el constructo de ácido nucleico comprende un segmento génico V^hhumano único, uno o más segmentos génicos D^hhumanos y uno o más segmentos génicos J^hhumanos. En un caso, el constructo de ácido nucleico comprende uno o más puntos de recombinación específicos del lugar (p. ej., un sitio loxP o un sitio Frt).

En un caso, se proporciona un ratón producido utilizando un vector objetivo, una secuencia de ácido nucleico o una célula como los descritos en la presente memoria. En varios casos, el vector objetivo, la secuencia de ácido nucleico o la célula comprenden una secuencia de ADN que contiene un segmento génico V^hhumano único (o variantes polimórficas del mismo), uno o más segmentos génicos D^hhumanos, y uno o más segmentos génicos J^hhumanos enlazados operativamente a un gen constante no humano.

En un caso, se proporciona un procedimiento para producir un ratón que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringida, que comprende la sustitución de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina del ratón por una secuencia genómica humana que comprende un segmento génico V^hhumano único (o variantes polimórficas del mismo), uno o más segmentos génicos D^hhumanos, y uno o más segmentos génicos J^hhumanos, en el que los segmentos génicos V^h, D^hy J^hhumanos son capaces de reorganizarse para formar una cadena pesada quimérica que contenga un dominio variable humano enlazado operativamente a una región constante no humana. En un caso, la región constante no humana es una región constante de una rata o un ratón.

En varios casos, los animales no humanos son roedores. En varios casos, los roedores son ratones y/o ratas. En un caso, se proporciona un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificada que comprende un repertorio del segmento V de cadena pesada que está restringido con respecto a la identidad del segmento V, y que comprende uno o varios segmentos D y uno o varios segmentos J o uno o varios segmentos J. En un caso, el segmento V de la cadena pesada es un segmento humano. En un caso, el uno o varios segmentos D son segmentos D humanos. En un caso, el uno o varios segmentos J son segmentos J humanos. En un caso, el uno o varios segmentos D y uno o más segmentos J son segmentos humanos D y J.

En un caso, el locus modificado es un locus no humano. En un caso, el locus no humano se modifica con al menos una secuencia de inmunoglobulina humana.

En un caso, la restricción es para un miembro de la familia del segmento V. En un caso, el miembro de la familia del segmento V se encuentra presente en dos o más copias. En un caso, el miembro de la familia del segmento V se encuentra presente como dos o más variantes (p. ej., dos o más formas polimórficas del miembro de la familia del segmento V). En un caso, el segmento V es un miembro de la familia del segmento V humano. En un caso, el miembro de la familia del segmento V está presente en un número de variantes que se observan en la población humana con respecto a esa variante. En un caso, el miembro de la familia del segmento V se selecciona de la Tabla 1. En un caso, el miembro de la familia del segmento V está presente en diversas variantes mostradas, para cada segmento V, en un número de alelos de 1 alelo para el número de alelos mostrado en la columna de la derecha de la Tabla 1.

En un caso, la restricción es para un segmento génico V^h1-69 humano. En un caso, el segmento génico V^h1-69 humano se encuentra presente en dos o más copias. En un caso, el segmento génico V^h1-69 se encuentra presente como dos o más variantes (p. ej., dos o más formas polimórficas del gen V^h1-69 humano). En un caso, el segmento génico V^h1-69 humano está presente en un número de variantes que se observan en la población humana con respecto al segmento génico V^h1-69 humano. En un caso, el segmento génico V^h1-69 humano se selecciona de la Tabla 2. En un caso, el segmento génico V^h1-69 humano está presente en diversas variantes mostradas, para cada segmento génico V^h1-69, en un número de alelos de un alelo para el número de alelos mostrado en la Tabla 2.

En un caso, la restricción es para un segmento génico V^h1-2 humano. En un caso, el segmento génico V^h1-2 humano se encuentra presente en dos o más copias. En un caso, el segmento génico V^h1-2 se encuentra presente como dos o más variantes (p. ej., dos o más formas polimórficas del gen V^h1-2 humano). En un caso, el segmento génico V^h1-2 humano está presente en un número de variantes que se observan en la población humana con respecto al segmento génico V^h1-2 humano. En un caso, el segmento génico V^h1-2 humano se selecciona de la Tabla 3. En un caso, el segmento génico V^h1-2 humano está presente en diversas variantes mostradas, para cada segmento génico V^h1-2, en un número de alelos de un alelo para el número de alelos mostrado en la Tabla 3.

En un caso, se describe un locus de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende un segmento V humano funcional único. En un caso, el segmento V humano funcional único se selecciona de los segmentos V^h1-2, V^h1-3, V^h1-8, V^h1-18, V^h1-24, V^h1-45, V^h1-46, V^h1-58, V^h1-69, V^h2-5, V^h2-26, V^h2-70, V^h3-7, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-16, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-30-3, V^h3-30-5, V^h3-33, V^h3-35, V^h3-38, V^h3-43, V^h3-48, V^h3-49, V^h3-53, V^h3-64, V^h3-66, V^h3-72, V^h3-73, V^h3-74, V^h4-4, V^h4-28, V^h4-30-1, V^h4-30-2, V^h4-30-4, V^h4-31, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59, V^h4-61, V^h5-51, V^h6-1, V^h7-4-1 y V^h7-81. En un caso, el segmento V humano funcional único es un segmento V^h1-69; en un caso específico, el segmento V humano funcional único está presente en las formas polimórficas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 que se encuentran en la población humana. En un caso, el segmento V humano funcional único es un segmento V^h1-2; en un caso específico, el segmento V humano funcional único está presente en las formas polimórficas 1, 2, 3, 4 o 5 que se encuentran en la población humana.

En un caso, el locus de inmunoglobulina de cadena pesada es un locus modificado de un animal no humano. En un caso, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana modificada está presente en el animal no humano en la posición del genoma en la que se encuentra el locus no humano no modificado correspondiente en el animal no humano de tipo natural. En un caso, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana modificada está presente en un transgén en un animal no humano.

En un caso, el segmento génico V humano funcional único es un segmento génico V^h1-69; En un caso, el segmento génico V^h1-69 comprende el Id. de sec. n.°: 34. En un caso, el segmento génico V^h1-69 se deriva del Id. de sec. n.°: 34. En un caso, el segmento génico V^h1-69 es idéntico en al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % al Id. de sec. n.°: 34.

En un caso, el segmento génico V humano funcional único se codifica mediante la secuencia de nucleótido de Id. de sec. n.°: 34.

En un caso, el segmento génico V humano funcional único es un segmento génico V^h1-2; En un caso, el segmento génico V^h1-2 comprende el Id. de sec. n.°: 60. En un caso, el segmento génico V^h1-2 se deriva del Id. de sec. n.°: 60. En un caso, el segmento génico V^h1-2 es idéntico en al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % al Id. de sec. n.°: 60.

En un caso, el segmento génico V humano funcional único se codifica mediante la secuencia de nucleótido de Id. de sec. n.°: 60.

En un caso, el segmento V humano funcional único está operativamente unido a uno o más segmentos D y a uno o más segmentos J o a uno o más segmentos J. En un caso, el segmento V y uno o más segmentos D y/o J están operativamente unidos a una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En un caso, la secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona de una C^h1, una bisagra, una secuencia C^h2, una secuencia C^h3, y una combinación de las mismas. En un caso, C^h1, la bisagra, CH2, CH3, o la combinación de las mismas son secuencias constantes endógenas no humanas. En un caso, al menos una de C^h1, la bisagra, C^h2, C^h3, o la combinación de las mismas son una secuencia humana. En un caso específico, C^h1 y/o la bisagra son secuencias humanas.

En un caso, se proporciona un locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógena modificada, que comprende una sustitución de todos los segmentos génicos V funcionales con un segmento génico V humano único (o un segmento génico V humano único presente en múltiples formas polimórficas o número de copia), en el que el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana es incapaz de reorganizarse para formar un gen variable de cadena pesada derivado de un segmento génico V distinto del segmento génico V humano único (o una de las copias o formas polimórficas).

En un caso, el segmento génico V humano único es V^h1-69. En un caso, el segmento génico V humano único es V^h1-2.

En un caso, el locus comprende al menos un segmento génico D^hhumano o no humano y un segmento génico J^hhumano o no humano. En un caso específico, el locus comprende un segmento génico D^hhumano y un segmento génico J^hhumano. En un caso específico, el locus comprende un segmento génico J^hhumano. En otro caso específico, el locus comprende un segmento génico V^h1-69 humano (presente como una copia única o como múltiples copias de distintas variantes polimórficas), todos los segmentos génicos D^hhumanos funcionales y todos los segmentos génicos J^hhumanos funcionales. En otro caso específico, el locus comprende un segmento génico V^h1-2 humano (presente como una copia única o como múltiples copias de distintas formas polimórficas), todos los segmentos génicos DH humanos funcionales y todos los segmentos génicos JH humanos funcionales. En un caso, los segmentos génicos V, D y J humanos (o los segmentos génicos V y J) están enlazados operativamente a un gen de región constante de ratón en el locus de cadena pesada de ratón endógena. En un caso específico, el locus de cadena pesada de ratón comprende un repertorio de tipo natural de secuencias de región constante de inmunoglobulina de ratón.

En un caso, se proporciona un animal no humano modificado genéticamente, en el que el segmento génico V de cadena pesada de inmunoglobulina funcional del animal no humano se selecciona de los segmentos génicos humanos V^h1-2, V^h1-3, V^h1-8, V^h1-18, V^h1-24, V^h1-45, V^h1-46, V^h1-58, V^h1-69, V^h2-5, V^h2-26, V^h2-70, V^h3-7, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-16, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-30-3, V^h3-30-5, V^h3-33, V^h3-35, V^h3-38, V^h3-43, V^h3-48, V^h3-49, V^h3-53, V^h3-64, V^h3-66, V^h3-72, V^h3-73, V^h3-74, V^h4-4, V^h4-28, V^h4-30-1, V^h4-30-2, V^h4-30-4, V^h4-31, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59, V^h4-61, V^h5-51, V^h6-1, V^h7-4-1 y V^h7-81. En un caso, el segmento génico V de la cadena pesada es un segmento génico V^h1-69 humano. En un caso, el segmento génico V de la cadena pesada es un segmento génico V^h1-2 humano.

En un caso, se proporciona un animal no humano genéticamente modificado, en el que el animal no humano comprende un segmento génico V^hhumano funcional único (presente como una copia única o como múltiples copias de distintas formas polimórficas), y en el que el animal no humano es sustancialmente incapaz de formar un gen de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizado que carece del segmento génico V^hhumano funcional único (o de una de las copias o formas polimórficas).

En un caso, se describe un animal no humano modificado genéticamente, en el que la única región variable de cadena pesada de inmunoglobulina mostrada en el animal no humano se deriva de uno de los segmentos seleccionados de los segmentos génicos humanos V^h1-2, V^h1-3, V^h1-8, V^h1-18, V^h1-24, V^h1-45, V^h1-46, V^h1-58, V^h1-69, V^h2-5, V^h2-26, V^h2-70, V^h3-7, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-16, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-30-3, V^h3-30-5, V^h3-33, V^h3-35, V^h3-38, V^h3-43, V^h3-48, V^h3-49, V^h3-53, V^h3-64, V^h3-66, V^h3-72, V^h3-73, V^h3-74, V^h4-4, V^h4-28, V^h4-30-1, V^h4-30-2, V^h4-30-4, V^h4-31, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59, V^h4-61, V^h5-51, V^h6-1, V^h7-4-1 y V^h7-81. En un caso, el segmento humano es un segmento V^h1-69; En un caso, el segmento humano es un segmento V^h1-2; En un caso, la única región variable de cadena pesada de inmunoglobulina mostrada por el ratón deriva de un miembro de la familia del segmento V único y, en un caso, la única región variable de cadena pesada de inmunoglobulina deriva de una variante polimórfica de un miembro de la familia del segmento V único.

En un caso, se proporciona un animal no humano que comprende un repertorio de segmento génico V de cadena pesada de inmunoglobulina restringida, en el que el animal no humano además comprende uno o más segmentos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina humana (Vk). En un caso, el uno o más segmentos Vk están enlazados operativamente a uno o más segmentos J humanos. En un caso específico, los segmentos J son segmentos Jk humanos. En otro caso específico, el animal no humano no muestra una cadena ligera A de inmunoglobulina. En otro caso específico, el animal no humano no comprende un locus variable de cadena ligera A de inmunoglobulina endógena funcional o humana funcional.

En un caso, el animal no humano es un roedor. En un caso, el roedor es un ratón.

En un caso, el animal no humano comprende una sustitución en el locus V^kde inmunoglobulina no humana endógena de todos o sustancialmente todos los segmentos V^kendógenos funcionales por uno o más segmentos V^khumanos funcionales. En otro caso más específico, se realiza la sustitución por todos o sustancialmente todos los segmentos Vk de inmunoglobulina humana funcional.

En un caso, el animal no humano comprende una sustitución en el locus V^kde inmunoglobulina no humana endógena de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^kendógenos funcionales por segmentos génicos Vk humanos seleccionados de Vk4-1, Vk5-2, Vk7-3, Vk2-4, Vk1-5, Vk1-6, Vk3-7, Vk1-8, Vk1-9, Vk2-10, Vk3-11, Vk1-12, Vk1-13, Vk2-14, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk2-18, Vk2-19, Vk3-20, Vk6-21, Vk1-22, Vk1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2-29, Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33, Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36, Vk1-37, Vk2-38, Vk1-39, Vk2-40 y una combinación de los mismos.

En un caso, el animal no humano comprende una sustitución en el locus Jk de inmunoglobulina no humana endógena de todos o sustancialmente todos los segmentos Jk de inmunoglobulina no humana endógena funcional por uno o más segmentos Jk de inmunoglobulina humanos funcionales. En otro caso más específico, se realiza la sustitución por todos o sustancialmente todos los segmentos Jk de inmunoglobulina humana funcional.

En un caso, el animal no humano comprende una sustitución en el locus Jk de inmunoglobulina no humana endógena de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos J^kde inmunoglobulina no humana endógena funcional por los segmentos génicos Jk humanos seleccionados de Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5 y una combinación de los mismos.

En un caso específico, el animal no humano comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un repertorio de segmentos V que consisten esencialmente en un segmento V único y/o variantes polimórficas de los mismos. En un caso, el segmento V de cadena pesada de inmunoglobulina único es un segmento VH1-69 humano y, además, el animal no humano comprende una sustitución de todos los segmentos D^hno humanos funcionales por todos los segmentos D^hhumanos funcionales y además comprende una sustitución de todos los segmentos JH no humanos funcionales por todos los segmentos JH humanos funcionales, y en el que el locus de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina está unida operativamente a una secuencia génica de región constante humana o no humana. En un caso específico, la secuencia génica de región constante es una secuencia génica de región constante no humana endógena. En un caso específico, el animal no humano reorganiza los segmentos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana para formar un gen que codifique una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia V^h1-69 humana, una secuencia D^hhumana, una secuencia J^hhumana y una secuencia de región constante del ratón.

En un caso específico, el animal no humano comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un repertorio de segmentos V que consisten esencialmente en un segmento V único y/o variantes polimórficas de los mismos. En un caso, el segmento V de cadena pesada de inmunoglobulina único es un segmento V^h1-2 humano y, además, el animal no humano comprende una sustitución de todos los segmentos D^hno humanos funcionales por todos los segmentos D^hhumanos funcionales y además comprende una sustitución de todos los segmentos J^hno humanos funcionales por todos los segmentos J^hhumanos funcionales y en el que el locus de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina está unida operativamente a una secuencia génica de región constante humana o no humana. En un caso específico, la secuencia génica de región constante es una secuencia génica de región constante no humana endógena. En un caso específico, el animal no humano reorganiza los segmentos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana para formar un gen que codifique una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia V^h1-2 humana, una secuencia D^hhumana, una secuencia J^hhumana y una secuencia de región constante del ratón.

En un caso, se proporciona un linfocito B que comprende el gen reorganizado. En un caso específico, el linfocito B es, como se describe, de un ratón que se ha inmunizado con un antígeno de interés y el linfocito B codifica un anticuerpo que enlaza específicamente el antígeno de interés. En un caso, el antígeno de interés es un patógeno. En un caso específico, el patógeno se selecciona de un virus de gripe, un virus de hepatitis (p. ej., el virus de la hepatitis B o la hepatitis C), y un virus de inmunodeficiencia humana. En un caso específico, el linfocito B codifica un anticuerpo de gran afinidad (p. ej., aproximadamente 10-9 K^do menor) mutado de forma somática que comprende una región variable de cadena ligera humana (p. ej., una región variable de cadena ligera k humana) que enlaza específicamente el antígeno de interés.

En un caso, se describe un animal no humano que comprende un repertorio de segmento V de cadena pesada de inmunoglobulina restringida, en el que el animal no humano comprende uno o más segmentos variables de cadena ligera A humana (VA). En un caso, el uno o más segmentos VA humanos están enlazados operativamente a uno o más segmentos J humanos. En un caso específico, los segmentos J son segmentos JA humanos. En otro caso específico, el animal no humano no muestra una cadena ligera k. En otro caso específico, el animal no humano no comprende un locus variable de cadena ligera k no humana o humana funcional.

En un caso, el animal no humano comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos VA de inmunoglobulina no humana funcional por uno o más segmentos VA de inmunoglobulina humana funcional. En otro caso más específico, se realiza la sustitución por todos o sustancialmente todos los segmentos VA de inmunoglobulina humana funcional.

En un caso, el animal no humano comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos VA no humanos funcionales por un fragmento del grupo A del locus de cadena ligera A humana. En un caso específico, el fragmento del grupo A del locus de cadena ligera A humana comprende los segmentos génicos VA humanos VA3-27 a YA3-1.

En un caso, el animal no humano comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos VA no humanos funcionales por un fragmento del grupo B del locus de cadena ligera A humana. En un caso específico, el fragmento del grupo B del locus de cadena ligera A humana comprende los segmentos génicos VA humanos VA5-52 a VA1-40.

En un caso, el animal no humano comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos VA no humanos funcionales por un fragmento del grupo A y un fragmento del grupo B del locus de cadena ligera A humana, en el que el resultado de la sustitución comprende los segmentos génicos VA humanos VA5-52 a VA3-1.

En un caso, el animal no humano comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos VA no humanos funcionales por al menos 12 segmentos génicos VA humanos, al menos 28 segmentos génicos VA humanos o al menos 40 segmentos génicos VA humanos.

En un caso, el animal no humano comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos JA de inmunoglobulina no humana funcional por uno o más segmentos génicos JA de inmunoglobulina humana funcional. En otro caso más específico, se realiza la sustitución por todos o sustancialmente todos los segmentos génicos JA de inmunoglobulina humana funcional. En varios casos, los segmentos génicos JA humanos funcionales incluyen JA1, JA2, JA3 y JA7.

En un caso específico, el animal no humano comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V^h) que comprende solo un segmento V^húnico, en el que el segmento V^húnico es un segmento V^h1-69 humano o un segmento V^h1-2 humano, además comprende una sustitución de todos los segmentos DH no humanos funcionales por todos los segmentos DH humanos funcionales y además comprende una sustitución de todos los segmentos JH no humanos funcionales por todos los segmentos JH humanos funcionales y en el que el locus de la región V^hestá enlazado operativamente a una secuencia génica de región constante humana o no humana. En un caso específico, la secuencia génica de región constante es una secuencia génica de región constante no humana, p. ej., una secuencia génica constante no humana endógena.

En un caso específico, el animal no humano reorganiza los segmentos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana para formar un gen que codifique una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia V^h1-69 humana (o una secuencia V^h1-2 humana), una secuencia D^hhumana, una secuencia J^hhumana y una secuencia de región constante no humana endógena.

En un caso, se proporciona un linfocito B que comprende el gen reorganizado. En un caso específico, el linfocito B es, como se describe, de un animal no humano que se ha inmunizado con un antígeno de interés y el linfocito B codifica un anticuerpo que enlaza específicamente el antígeno de interés. En un caso, el antígeno es una proteína humana seleccionada de un ligando, un receptor de superficie celular y una proteína intracelular. En un caso, el antígeno de interés es un patógeno. En un caso específico, el patógeno se selecciona de un virus de gripe, un virus de hepatitis (p. ej., el virus de la hepatitis B o la hepatitis C) y un virus de inmunodeficiencia humana. En un caso específico, el linfocito B codifica un anticuerpo de gran afinidad (p. ej., aproximadamente 10 9 K^do menor) mutado de forma somática que comprende una región variable de cadena ligera humana (p. ej., una región variable de cadena ligera A humana) que enlaza específicamente el antígeno de interés.

En un caso, se describe un animal no humano que comprende un repertorio de segmento V^hde inmunoglobulina restringida, en el que el animal no humano comprende un segmento V^h1-69 humano (o un segmento V^h1-2 humano) en un transgén, en el que el segmento V^h1-69 humano está operativamente unido en el transgén a un segmento D^hhumano o no humano y/o un segmento J humano o no humano, y el transgén además comprende un gen de la región constante humana o no humana o una región constante humana/no humana quimérica (p. ej., una C^h1, bisagra, C^h2, C^h3 o una combinación de los mismos en el que al menos una secuencia es no humana, p. ej., seleccionada de bisagra, C^h2 y C^h3 y/o bisagra). En un caso, el animal no humano es un ratón o una rata y el D, J y/o gen de la región constante no humano es un gen de rata o ratón o una rata o ratón/humano quimérico.

En un caso, el animal no humano comprende un transgén que comprende un locus de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende uno o más segmentos génicos VA de inmunoglobulina humana y segmentos génicos JA, o uno o más segmentos génicos V^kde inmunoglobulina humana y segmentos génicos J^k, y un gen de la región constante de cadena ligera k o A de inmunoglobulina humana, de tal forma que el transgén se reorganiza en el animal no humano para formar un gen de cadena ligera k o A de inmunoglobulina reorganizada. En varios casos, los segmentos génicos V^ky J^khumanos son los descritos en la presente memoria. En varios casos, los segmentos génicos VA y JA humanos son los descritos en la presente memoria.

En un caso específico, el animal no humano comprende un transgén que tiene un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un segmento V único que es un segmento V^h1-69 humano (o un segmento V^h1-2 humano), uno o más segmentos D humanos, uno o más segmentos J humanos y un gen constante humano enlazado operativamente al locus variable de cadena pesada, como el que muestra el ratón del transgén un anticuerpo plenamente humano derivado del segmento V^h1-69 (o del segmento V^h1-2). En un caso, el animal no humano no comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena funcional. En un caso específico, el animal no humano comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena no funcional que comprende una eliminación de un segmento JH no humano endógeno y/o un segmento D^hno humano endógeno, de forma que el animal no humano es incapaz de reorganizar el locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena para formar un gen de anticuerpo no humano reorganizado. En un caso específico, el animal no humano comprende una eliminación de una secuencia de cambio unida operativamente a una región constante de cadena pesada de ratón endógeno. En un caso específico, la secuencia de cambio es una secuencia de cambio p no humana (p. ej., un ratón). En otro caso, el animal no humano además comprende la falta de un locus variable de cadena ligera endógena funcional seleccionado de un locus k de inmunoglobulina y un locus A de inmunoglobulina. En un caso específico, el animal no humano comprende una eliminación de una secuencia J^ky/o JA, de forma que el animal no humano es incapaz de reorganizar una región variable de cadena ligera A de inmunoglobulina no humana endógena y/o de cadena ligera k de inmunoglobulina no humana endógena para formar un gen de cadena ligera A de inmunoglobulina no humana endógena reorganizada y/o de cadena ligera de inmunoglobulina no humana endógena reorganizada.

En un caso, el animal no humano comprende una eliminación de una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina no humana endógena que da lugar a una inactivación funcional de cadena ligera ^kde inmunoglobulina no humana endógena. En un caso, el animal no humano comprende una eliminación de una secuencia de cadena ligera A de inmunoglobulina no humana endógena que da lugar a una que da lugar a una inactivación funcional de cadena ligera A de inmunoglobulina no humana endógena.

En un caso, el animal no humano comprende un locus génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena funcionalmente silenciada y comprende un repertorio restringido de segmentos génicos variables de cadena pesada humana (p. ej., no más de uno o no más de dos). En un caso, el silenciamiento funcional comprende una modificación de un locus génico variable de cadena pesada no humana endógena seleccionado de una eliminación, una inserción, una inversión y una combinación de las mismas.

En un caso, se proporciona un roedor que comprende un repertorio V^hde inmunoglobulina derivada de no más de un segmento V^hhumano o uno o más polimorfismos de los mismos, de un segmento D seleccionado de un repertorio de uno o más segmentos D y de un segmento J derivado de un repertorio de uno o más segmentos J. En un caso, el roedor reorganiza el segmento V^hhumano, un segmento D humano y un segmento J humano y forma una secuencia de cadena pesada humana reorganizada que está operativamente unida a una secuencia de región constante de un roedor o de un humano. En un caso, la secuencia de región constante de roedor y/o humano se selecciona de una C^h1, una bisagra, una C^h2, una C^h3 y una combinación de las mismas. En un caso, el roedor muestra una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio variable humano, en el que la cadena ligera es análoga a un dominio de cadena pesada humana derivado de la secuencia de cadena pesada humana reorganizada. En un caso, el roedor no muestra una secuencia de polipéptido seleccionada de un dominio variable de cadena pesada no humana, un dominio variable de cadena ligera no humana y una combinación de los mismos.

En un caso, el segmento V^hhumano está presente en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 o más variantes polimórficas, en el que cada una de las variantes polimórficas está operativamente unida a un segmento D y/o J de forma que cada una de las variantes polimórficas es capaz de reorganizar y formar un dominio variable de cadena pesada reorganizada con cualquiera del uno o más segmentos D y cualquiera del uno o más segmentos J. En un caso, el roedor es un ratón o una rata. En un caso, el repertorio de segmentos D comprende dos o más segmentos D. En un caso, el repertorio de segmentos J dos o más segmentos J. En un caso, los segmentos J y/o D son segmentos humanos.

En un caso, se proporciona un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un segmento V^hde inmunoglobulina humana único y/o variantes polimórficas de la misma y una o más secuencias D^hy una o más secuencias J, en el que el constructo comprende al menos una sección homóloga a un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina no humana o un punto de reconocimiento de recombinasa (p. ej., un punto lox). En un caso, el segmento V es un segmento V^h1-69 o un segmento V^h1-2.

En un caso, se proporciona un constructo de ácido nucleico; que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento V de cadena pesada de inmunoglobulina humana única, en el que el segmento V^húnico es un segmento V^h1-69 (o V^h1-2). En un caso, el constructo comprende un punto de reconocimiento de recombinasa específica del punto. En un caso, el constructo comprende una primera sección homóloga del ratón aguas arriba del segmento V^h1-69 (o V^h1-2) y una segunda sección homóloga del ratón aguas abajo del segmento V^h1-69 (o V^h1-2), y en el que la primera sección homóloga del ratón es homóloga a la región de un cromosoma de ratón inmediatamente aguas arriba de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, pero no incluye un segmento variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón funcional. En un caso, el constructo comprende el Id. de sec. n.°: 3. En un caso, el constructo comprende el Id. de sec. n.°: 70. En un caso, el segmento VH único restringido está en un animal no humano, o el segmento VH restringido está en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana (p. ej., in situ o en un transgén), y el animal no humano o el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana se selecciona de un animal o un locus de ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (p. ej., vaca, toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, hurón, primate (p. ej., tití, mono rhesus). En un caso específico, el locus o animal no humano es un locus de rata o de ratón. En un caso, se proporciona un tejido o célula, en el que el tejido o la célula derivan de un animal no humano como se describe en la presente memoria, y comprende un repertorio de segmento V^hrestringido. En un caso, el repertorio del segmento V^hestá restringido a un miembro de la familia del segmento V^húnico y/o a variantes polimórficas del mismo. En un caso específico, el segmento V único es un segmento V^h1-69 humano o un segmento V^h1-2 humano. En un caso, la célula o el tejido derivan del bazo, de un ganglio linfático o de la médula ósea del animal no humano.

En un caso, la célula es una célula ES. En un caso, la célula es un linfocito B. En un caso, la célula es una célula germinal.

En un caso, el tejido se selecciona del tejido epitelial, nervioso, muscular y conectivo. En un caso específico, el tejido es tejido reproductivo.

En un caso, el tejido y/o la célula derivados de un ratón como se describe en la presente memoria se aíslan para utilizarlos en uno o más ensayos ex vivo. En varios casos, el uno o más ensayos ex vivo incluyen medidas de las propiedades ópticas, mecánicas, eléctricas, térmicas o físicas, un procedimiento quirúrgico, medidas de las interacciones de distintos tipos de tejidos, desarrollo de técnicas de imagen o una combinación de los mismos. En un caso, el animal no humano es un ratón.

En un caso, se proporciona un embrión no humano que comprende segmentos V^hde cadena pesada restringida como se describen en la presente memoria. En un caso, el embrión comprende una célula ES donante que comprende el segmento V^hrestringido y células del embrión hospedador.

En un caso, el animal no humano es un ratón.

En un caso, una célula no humana comprende un cromosoma o un fragmento del mismo de un animal no humano como se describe en la presente memoria. En un caso, la célula no humana comprende un núcleo de un animal no humano como se describe en la presente memoria. En un caso, la célula no humana comprende el cromosoma o fragmento del mismo como resultado de una transferencia nuclear.

En un caso, se proporciona un núcleo derivado de un animal no humano como se describe en la presente memoria. En un caso, el núcleo es de una célula diploide que no es un linfocito B.

En un caso, se proporciona una célula totipotente, una célula pluripotente inducida o una célula pluripotente derivada de un animal no humano como se describe en la presente memoria. En un caso específico, la célula es una célula madre embrionaria (ES) de ratón.

En un caso, se proporciona una célula pluripotente inducida no humana que comprende un repertorio del segmento V^hrestringido. En un caso, la célula pluripotente inducida se deriva de un animal no humano como se describe en la presente memoria.

En un caso, se proporciona un hibridoma o cuadroma, derivado de una célula de un animal no humano como se describe en la presente memoria. En un caso, el animal no humano es una rata o un ratón.

En un caso, se proporciona un linfocito de un animal no humano como se describe en la presente memoria. En un caso, el linfocito es un linfocito B.

En un caso, se proporcionan células de ratón y embriones de ratón, incluidos, aunque no de forma limitativa, las células ES, las células pluripotentes, y las células pluripotentes inducidas, que comprenden modificaciones genéticas como se describen en la presente memoria. Se proporcionan células que son XX y células que son XY. También se proporcionan células que comprenden un núcleo que contiene una modificación como se describe en la presente memoria, p. ej., una modificación introducida en una célula mediante inyección pronuclear.

En un caso, se describe una secuencia de dominio variable de anticuerpo creado en un animal no humano como se describe en la presente memoria.

En un caso, se describe una terapéutica humana que comprende un dominio variable de anticuerpo que comprende una secuencia derivada de un animal no humano como se describe en la presente memoria.

En un caso, se describe un procedimiento para obtener una secuencia de región variable de anticuerpo de un animal no humano, en el que la secuencia de la región variable del anticuerpo deriva de un segmento V^h1-69 humano o de un segmento V^h1-2, en el que el procedimiento comprende (a) inmunizar un animal no humano con un antígeno de interés, en el que el animal no humano comprende una sustitución del locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena de todos o sustancialmente todos los segmentos variables no humanos por un segmento variable humano único, en el que el segmento variable humano único es un segmento V^h1-69 o un segmento V^h1-2 y en el que el animal no humano es sustancialmente incapaz de formar una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que no derive de un segmento V^h1-69 humano o de un segmento V^h1-2; (b) permitir que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria con respecto al antígeno de interés; e (c) identificar o aislar una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano, en el que el anticuerpo enlaza el antígeno de interés.

En un caso, el segmento variable humano único es un segmento V^h1-69;

En un caso, la secuencia de región variable del anticuerpo se deriva del Id. de sec. n.°: 34. En un caso, la secuencia de región variable del anticuerpo es idéntica en al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % al Id. de sec. n.°: 34. En un caso, la secuencia de región variable del anticuerpo comprende el Id. de sec. n.°: 34.

En un caso, el segmento variable humano único es un segmento V^h1-2;

En un caso, la secuencia de región variable del anticuerpo se deriva del Id. de sec. n.°: 60. En un caso, la secuencia de región variable del anticuerpo es idéntica en al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % al Id. de sec. n.°: 60. En un caso, la secuencia de región variable del anticuerpo comprende el Id. de sec. n.°: 60.

En un caso, la respuesta inmunitaria al antígeno se caracteriza por un título de anticuerpo que es aproximadamente 6x104 a aproximadamente 5x105 veces superior a dos veces el fondo tal y como se determina en un ensayo ELISA. En un caso específico, el título de anticuerpo es aproximadamente 1x105 a aproximadamente 2x105 veces superior a dos veces el fondo tal y como se determina en un ensayo ELISA. En un caso específico, el título de anticuerpo es aproximadamente 1,5x105 veces superior a dos veces el fondo tal y como se determina en un ensayo ELISA. En un caso, el antígeno es un receptor de superficie de célula humana. En un caso, se describe un procedimiento para generar un repertorio de regiones variables de anticuerpo humano en un animal no humano, en el que las regiones variables de cadena pesada humana del repertorio derivan del mismo miembro de familia genética V^hy uno de una pluralidad de segmentos D^hy uno de una pluralidad de segmentos J^h, en el que el repertorio se caracteriza por tener secuencias FR1 (marco 1), CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de inmunoglobulina de cadena pesada de un miembro de familia genética V^húnico. En un caso, el repertorio se caracteriza también por tener una pluralidad de secuencias CDR3 FR4 diferentes.

En un caso, la familia genética V^húnica se selecciona de la familia V^h1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7. En un caso específico, la familia genética VH única es la familia VH 1. En un caso, el miembro de la familia genética VH única se selecciona de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 y V^h3-23. En un caso específico, el miembro de la familia genética V^húnica es V^h1-69. En un caso específico, el miembro de la familia genética V^húnica es V^h1-2.

En un caso, el repertorio comprende secuencias FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de cadena pesada derivadas de un segmento V^h1-69. En un caso específico, el repertorio comprende secuencias FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de cadena pesada derivadas de Id. de sec. n.°: 35. En un caso específico, el repertorio comprende secuencias FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de cadena pesada de Id. de sec. n.°: 35.

En un caso, el repertorio comprende secuencias FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de cadena pesada derivadas de un segmento V^h1-2. En un caso específico, el repertorio comprende secuencias FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de cadena pesada derivadas deSEQ ID NO: 61. En un caso específico, el repertorio comprende secuencias FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de cadena pesada de Id. de sec. n.°: 61.

En un caso, se describe un sistema biológico (es decir, in vivo) para generar una pluralidad de secuencias CDR3 humanas diferentes que reflejen una pluralidad de reorganizaciones de un segmento génico V^hhumano único con una pluralidad de segmentos D y J humanos, en el que el sistema genera dominios variables de cadena pesada humana caracterizados por tener secuencias FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 humanas que son idénticas, pero con hipermutaciones somáticas, en el que los dominios variables de cadena pesada se caracterizan por tener hipermutaciones somáticas y derivar de un segmento génico V^hhumano único y de una pluralidad de segmentos D y J humanos; en el que el sistema comprende un animal no humano modificado genéticamente (p. ej., un roedor, p. ej., un ratón o una rata) como se describe en la presente memoria.

En un caso, el segmento génico V^hhumano único se selecciona de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 y V^h3-23. En un caso, el segmento génico V^hhumano único es V^h1-69. En un caso, el segmento génico V^hhumano único es V^h1-2. En un caso, el segmento génico V^hhumano único se identifica en la Tabla 1. En un caso, el segmento génico VH humano único se identifica en la Tabla 2. En un caso, el segmento génico VH humano único se identifica en la Tabla 3.

En un caso, se describe un procedimiento in vivo para generar una pluralidad de secuencias CDR de cadena pesada derivadas de reorganizaciones de un segmento génico VH humano único con una pluralidad de segmentos D y J humanos, en el que el procedimiento genera dominios variables de cadena pesada humana caracterizados por tener secuencias FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 humanas que son idénticas pero con hipermutaciones somáticas, en el que los dominios variables de cadena pesada se caracterizan por tener hipermutaciones somáticas y derivar de un segmento génico VH humano único y de una pluralidad de segmentos D y J humanos; en el que el sistema comprende un animal no humano modificado genéticamente (p. ej., un roedor, p. ej., un ratón o una rata) como se describe en la presente memoria.

En un caso, el procedimiento comprende la exposición de un animal no humano como se describe en la presente memoria a un antígeno de interés, lo que permite que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno, en el que la respuesta inmunitaria genera una pluralidad de secuencias CDR de cadena pesada derivadas de las reorganizaciones del segmento génico V^hhumano único con uno de los segmentos D humanos y uno de los segmentos J humanos, y la identificación de un conjunto de CDR de cadena pesada que se enlazan al antígeno. En un caso, el procedimiento comprende el aislamiento de una secuencia de ácido nucleico del animal que codifica un dominio V^hhumano que comprende CDR de cadena pesada.

En un caso, las secuencias CDR de cadena pesada derivan de una reorganización de un segmento génico V^h1-69 humano. En un caso, las secuencias CDR de cadena pesada derivan de una reorganización de un segmento génico V^h1-2 humano.

En un caso, se describe un procedimiento para generar una pluralidad de secuencias CDR3 y FR4 diferentes en un animal no humano, lo que comprende exponer un animal no humano que comprende un locus génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina con un repertorio de segmento V^hrestringido a un miembro de la familia del segmento V^húnico para un antígeno de interés, lo que permite que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno, en el que la respuesta inmunitaria genera un repertorio de linfocito B cuyos dominios variables de cadena pesada derivan de un miembro de la familia del segmento V^húnico y que comprende una pluralidad de secuencias CDR3 y FR4 diferentes.

En un caso, el miembro de la familia del segmento V^húnico es humano. En un caso, el animal no humano se selecciona de un ratón, una rata, y un conejo. En un caso, el antígeno de interés se selecciona de un ligando, un receptor, una proteína intracelular y una proteína secretada. En un caso, el antígeno de interés es un patógeno humano como se describe en la presente memoria.

En un caso, el miembro de la familia genética V^hhumana única se selecciona de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 y V^h3-23. En un caso, el miembro de la familia genética V^hhumano único es V^h1-69. En un caso, el miembro de la familia genética V^hhumano único es V^h1-2. En un caso, el miembro de la familia genética V^hhumano único se identifica en la Tabla 1. En un caso, el miembro de la familia genética V^hhumano único se identifica en la Tabla 2. En un caso, el miembro de la familia genética VH humano único se identifica en la Tabla 3.

En un caso, se describe una secuencia de nucleótido que codifica una región variable de inmunoglobulina creada en un animal no humano como se describe en la presente memoria.

En un caso, se describe una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina o de cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo creado en un animal no humano como se describe en la presente memoria.

En un caso, se describe una secuencia de nucleótido de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina o de cadena pesada de inmunoglobulina que codifica una región variable de un anticuerpo creado en un no humano como se describe en la presente memoria.

En un caso, se describe un anticuerpo o un fragmento que se enlaza al antígeno del mismo (p. ej., Fab, F(ab)2, scFv) creado en un animal no humano como se describe en la presente memoria.

En un caso, se describe un ratón que tiene un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringida caracterizado por la presencia de un segmento génico V^hhumano único, uno o más segmentos génicos D^hhumanos y uno o más segmentos génicos J^hhumanos, en el que el segmento génico V^hhumano único es un locus de ratón endógeno y el segmento génico V^hestá enlazado operativamente al uno o más segmentos génicos D^hhumanos, el uno o más segmentos génicos J^hhumanos y a un gen constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógena.

En un caso, el ratón además comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humanizada que comprende uno o más segmentos génicos VLhumanos y uno o más segmentos génicos J^lhumanos, en el que los segmentos génicos humanos V^ly J^lestán enlazados operativamente a un gen de la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina no humana. En un caso específico, los segmentos génicos V^ly J^lhumanos están en un locus de cadena ligera de ratón endógeno, y en el que el gen de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana es un gen de ratón.

En un caso, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina humanizada está en un transgén, y el gen de región constante se selecciona de un ratón, una rata y un humano.

En un caso, los segmentos génicos V^ly JLson segmentos génicos Vk y Jk. En un caso, los segmentos génicos V^ly J^llson segmentos génicos VA y JA.

En un caso, se describe un animal no humano con un repertorio de linfocitos B que expresa dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulina derivados de un miembro de la familia del segmento V único. En un caso, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % del repertorio de linfocitos B del animal no humano con el dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina expresado en el repertorio de linfocitos B se deriva del mismo miembro de la familia del segmento V. En un caso específico, el porcentaje es al menos 90 %. En un caso, el repertorio de linfocitos B consta esencialmente de linfocitos B (sanguíneos) periféricos. En un caso, el repertorio de linfocitos B consiste fundamentalmente en linfocitos B esplénicos. En un caso, el repertorio de linfocitos B consiste fundamentalmente en linfocitos B de médula ósea. En un caso, el repertorio de linfocitos B consiste fundamentalmente en linfocitos B periféricos, linfocitos B esplénicos y linfocitos B de médula ósea. En un caso, se describe un animal no humano genéticamente modificado, en el que más del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o más del 90 % de los linfocitos B del animal no humano que expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina, expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina derivado de un miembro de la familia del segmento génico V^húnico. En un caso, al menos 75 % de los linfocitos B del animal no humano que expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina, expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina derivado de un miembro de la familia del segmento génico V^húnico. En un caso específico, el porcentaje es al menos 90 %. En un caso, todos los linfocitos B expresan un dominio de cadena pesada derivado de un miembro de la familia genética V^húnico.

En un caso, se describe un ratón genéticamente modificado que genera una población de linfocitos B específicos de antígeno en respuesta a la inmunización con un antígeno de interés, en el que al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o más del 90 % de dicha población de linfocitos B específicos de antígeno expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina derivadas, todas ellas, del mismo segmento génico V^h. En un caso, al menos 75 % de la población de linfocitos B específicos de antígeno expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina derivadas del mismo segmento génico V^h. En un caso, todos los linfocitos B específicos de antígeno expresan una cadena pesada derivada del mismo segmento génico V^h.

En un caso, se describe un animal no humano que comprende un repertorio restringido del segmento génico V^h, en el que la restricción es a un segmento génico humano V^h1-69 o a un segmento génico V^h1-69 idéntico en al menos aproximadamente 75,5 %, 76,5 %, 86,7 %, 87,8 %, 94,9 %, 96,9 %, 98 % o 99 % a un segmento génico V^h1-69*01. En un caso específico, el repertorio restringido se selecciona de una o más de las variantes de V^h1-69 de la FIG. 15.

En un caso, se describe un animal no humano que comprende un repertorio restringido del segmentosgénico VH, en el que la restricción es a un segmento génico humano V^h1-2 o a un segmento génico V^h1-2 idéntico al menos 94,9%, 95,9%, 96,9%, 98% o 99% a un segmento génico V^h1-2. En un caso específico, el repertorio restringido se selecciona de una o más de las variantes de V^h1-2 de la FIG. 18.

En un caso, el animal no humano es un ratón.

En un caso, el ratón muestra un inmunofenotipo que tiene como característica una mayor proporción de linfocitos B maduros a inmaduros, en comparación con un ratón de tipo natural. En un caso específico, la relación se calcula a partir de los linfocitos B recolectados del bazo. En un caso, el ratón muestra una población de linfocitos B maduros de aproximadamente 1x107. En un caso, el ratón muestra una población de linfocitos B inmaduros de aproximadamente 0,5x107. En un caso, el ratón muestra una relación de linfocitos B maduros a inmaduros en el bazo que es aproximadamente de 1,5 a aproximadamente 2 veces mayor que la que muestra un ratón de tipo natural.

En un caso, la relación se calcula a partir de los linfocitos B recolectados de la médula ósea. En un caso específico, el ratón muestra una población de linfocitos B maduros de aproximadamente 3x105. En un caso, el ratón muestra una población de linfocitos B inmaduros de aproximadamente 7x105. En un caso, el ratón muestra una relación de linfocitos B maduros a inmaduros en la médula ósea que es aproximadamente de 3 o aproximadamente 3,3 veces mayor que la que muestra un ratón de tipo natural.

En un caso, el ratón muestra un inmunofenotipo que tiene como característica un mayor número de prolinfocitos B en la médula ósea, en comparación con un ratón de tipo natural. En un caso específico, el ratón muestra una población de prolinfocitos B en la médula ósea que es aproximadamente de 2,5 a aproximadamente 3 veces mayor que la que muestra en la médula ósea un ratón de tipo natural. En un caso específico, el ratón muestra una población de prolinfocitos B en la médula ósea que es aproximadamente 2,75 veces mayor que la que muestra en la médula ósea un ratón de tipo natural.

En un caso, el ratón muestra un inmunofenotipo con una característica seleccionada del grupo formado por una población de linfocitos B esplénicos CD19+ con aproximadamente un 80% por linfocitos B de tipo natural, una población de linfocitos T esplénicos CD3+ aproximadamente igual a la del ratón de tipo natural, y una combinación de las mismas.

En un caso, el ratón comprende una población de linfocitos en la que el porcentaje de linfocitos B CD19+ B en el bazo es aproximadamente igual a la del ratón de tipo natural. En un caso, el número de linfocitos B CD19+ B por bazo del ratón es al menos aproximadamente 50 % del número de linfocitos B CD19+ B por bazo de un ratón de tipo natural.

En un caso, el animal no humano comprende al menos aproximadamente 75 % a aproximadamente 80 % de linfocitos B CD19+ B en la médula ósea, en comparación con un ratón de tipo natural.

En un caso, el número total de células óseas CD19+ por fémur del ratón no es inferior a aproximadamente 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o 75 % del número total de las células de médula ósea CD19+ en un ratón de tipo natural.

En un caso, el ratón expresa IgD e IgM a aproximadamente el mismo nivel observado en un ratón de tipo natural. En un caso, se describe un ratón que comprende un repertorio restringido de segmento V^hhumano y un locus de segmento variable de cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, en el que la relación entre las cadenas ligeras A a ^kexpresada en el ratón es aproximadamente igual que en el ratón de tipo natural.

En un caso, se describe un ratón que comprende un locus restringido de cadena pesada de inmunoglobulina, caracterizado por la presencia de un segmento génico V^húnico, uno o más segmentos génicos D^h, y uno o más segmentos génicos J^h, en el que el segmento génico V^húnico es un segmento génico V^hpolimórfico.

En un caso, el segmento génico V^hpolimórfico es un segmento génico V^hhumano asociado a un elevado número de copias en las poblaciones humanas. En un caso, el segmento génico V^hhumano se selecciona de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70, V^h3-23 o una variante polimórfica de los mismos. En un caso específico, el segmento génico V^hhumano es un segmento génico V^h1-69. En otro caso específico, el segmento génico V^hhumano es un segmento génico V^h1-2.

En un caso, el segmento génico V^húnico está enlazado operativamente a un gen de región constante de inmunoglobulina humana/de ratón quimérica, de ratón, humana. En un caso específico, el gen de región constante de inmunoglobulina es un gen de región constante de ratón. En un caso, el gen constante de inmunoglobulina comprende una secuencia humana seleccionada de una C^h1 humana, una bisagra humana, una CH2 humana, una CH3 humana y una combinación de las mismas. En un caso, el gen constante del ratón está en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena.

En un caso, el ratón también además comprende un segmento génico V^lde inmunoglobulina humana enlazado operativamente a un segmento génico J y a un gen constante de la cadena ligera. En un caso específico, el segmento génico V^ly/o el segmento génico J se seleccionan de un segmento génico k humano y un segmento génico A humano. En un caso, los segmentos génicos J y/o V^lson segmentos génicos k humanos.

En varios casos, el ratón comprende una eliminación de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH endógenos.

En varios casos, el animal no humano comprende un locus génico variable de cadena pesada endógena inactivada. En varios casos, el locus génico variable de la cadena pesada endógena inactivada no está enlazado operativamente a un gen endógeno de la región constante de la cadena pesada.

En un caso, se describe un ratón caracterizado por la expresión de inmunoglobulina sérica formada, en más de un 80 %, por un dominio variable de cadena pesada humana y un dominio variable de cadena ligera humana análoga, en el que el dominio variable de cadena pesada humana se deriva de un repertorio de segmento génico V^hcompuesto esencialmente por un segmento génico V^hhumano único y/o variantes polimórficas del mismo. En un caso, el segmento génico V^hhumano único es un segmento génico V^h1-69 humano y/o una variante polimórfica del mismo. En un caso, el segmento génico V^hhumano único es un segmento génico V^h1-2 humano y/o una variante polimórfica del mismo.

En un caso, se describe un ratón que comprende, en su línea germinal, una sustitución en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V^hendógenos por un segmento génico V^hhumano único y/o variantes polimórficas del mismo. En un caso, el segmento génico V^hhumano único es un segmento génico V^h1-69 humano y/o una variante polimórfica del mismo. En un caso, el segmento génico V^hhumano único es un segmento génico V^h1-2 humano y/o una variante polimórfica del mismo.

En un caso, el ratón además comprende una sustitución en un locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH endógenos por uno o más segmentos génicos VH humanos. En un caso específico, el ratón además comprende uno o más segmentos génicos JL humanos enlazados operativamente a los segmentos génicos VL humanos.

En un caso, se describe el uso de un ratón en la presente memoria para crear una secuencia de nucleótido de región variable de inmunoglobulina. En un caso, la secuencia comprende un segmento génico V^h1-69 reorganizado. En un caso, la secuencia comprende un segmento génico V^h1-2 reorganizado.

En un caso, la secuencia de nucleótido de región variable de inmunoglobulina es idéntica en al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % al segmento génico V^h1-69 humano. En un caso específico, la secuencia de nucleótido de región variable de inmunoglobulina es idéntica en al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % al Id. de sec. n.°: 34. En varios casos, el segmento génico V^h1-69 humano se identifica en la Tabla 2.

En un caso, la secuencia de nucleótido de región variable de inmunoglobulina codifica una secuencia de aminoácido que es idéntica en al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % al Id. de sec. n.°: 35.

En un caso, la secuencia de nucleótido de región variable de inmunoglobulina es idéntica en al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % al segmento génico Vh1-2 humano. En un caso específico, la secuencia de nucleótido de región variable de inmunoglobulina es idéntica en al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % al Id. de sec. n.°: 60. En varios casos, el segmento génico Vh1-2 humano se identifica en la Tabla 3.

En un caso, la secuencia de nucleótido de región variable de inmunoglobulina codifica una secuencia de aminoácido que es idéntica en al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % al Id. de sec. n.°: 61.

En un caso, se describe el uso de un ratón para crear un fragmento Fab totalmente humano o un fragmento F(ab)2 totalmente humano como se describe en la presente memoria. En un caso, los fragmentos Fab o F(ab)2 totalmente humanos comprenden una región variable de cadena pesada que comprende un segmento génico Vh1-69 humano reorganizado. En un caso, los fragmentos Fab o F(ab)2 totalmente humanos comprenden una región variable de cadena pesada que comprende un segmento génico Vh1-2 humano reorganizado.

En un caso, se describe el uso de un ratón para crear una línea celular inmortalizada como se describe en la presente memoria.

En un caso, se describe el uso de un ratón para crear un hibridoma o un cuadroma como se describe en la presente memoria.

En un caso, se describe el uso de un ratón para crear una biblioteca de fagos que contiene las regiones variables de cadena pesada humana y de cadena ligera humana como se describe en la presente memoria.

En un caso, las regiones variables de cadena pesada humana se derivan de un segmento génico Vh1-69 humano que comprende una secuencia seleccionada del Id. de sec. n.°: 34, Id. de sec. n.°: 36, Id. de sec. n.°: 38, Id. de sec. n.°: 40, Id. de sec. n.°: 42, Id. de sec. n.°: 44, Id. de sec. n.°: 46, Id. de sec. n.°: 48, Id. de sec. n.°: 50, Id. de sec. n.°: 52, Id. de sec. n.°: 54, Id. de sec. n.°: 56 e Id. de sec. n.°: 58.

En un caso, las regiones variables de cadena pesada humana se derivan de un segmento génico Vh1-69 humano que comprende una secuencia seleccionada del Id. de sec. n.°: 35, Id. de sec. n.°: 37, Id. de sec. n.°: 39, Id. de sec. n.°: 41, Id. de sec. n.°: 43, Id. de sec. n.°: 45, Id. de sec. n.°: 47, Id. de sec. n.°: 49, Id. de sec. n.°: 51, Id. de sec. n.°: 53, Id. de sec. n.°: 55, Id. de sec. n.°: 57 e Id. de sec. n.°: 59.

En un caso, todas regiones variables de cadena pesada humana se derivan de un segmento génico Vh1-2 humano que comprende una secuencia seleccionada del Id. de sec. n.°: 60, Id. de sec. n.°: 62, Id. de sec. n.°: 64, Id. de sec. n.°: 66 e Id. de sec. n.°: 68.

En un caso, las regiones variables de cadena pesada humana se derivan de un segmento génico Vh1-2 humano que comprende una secuencia seleccionada del Id. de sec. n.°: 61, Id. de sec. n.°: 63, Id. de sec. n.°: 65, Id. de sec. n.°: 67 e Id. de sec. n.°: 69.

En un caso, se describe el uso de un ratón para generar una secuencia de región variable para crear un anticuerpo humano como se describe en la presente memoria, que comprende: (a) inmunizar a un ratón como se describe en la presente memoria, con un antígeno de interés, (b) aislar un linfocito del ratón inmunizado en (a), (c) exponer al linfocito a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar a un linfocito que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable, del linfocito, y generar así una secuencia de la región variable.

En un caso, el linfocito se obtiene o se aísla del bazo del ratón. En un caso, el linfocito se obtiene o se aísla de un ganglio linfático del ratón. En un caso, el linfocito se obtiene o se aísla de la médula ósea del ratón. En un caso, el linfocito se obtiene o se aísla de la sangre del ratón.

En un caso, el anticuerpo marcado es un anticuerpo conjugado con un fluoróforo. En un caso, se seleccionan el uno o más anticuerpos conjugados con un fluoróforo de IgM, IgG y/o una combinación de las mismas.

En un caso, el linfocito es un linfocito B.

En un caso, la una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable comprende una secuencia de la región variable de cadena pesada. En un caso, la una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable comprende una secuencia de la región variable de cadena ligera. En un caso específico, la secuencia de la región variable de la cadena ligera es una secuencia de la región variable de la cadena ligera k de inmunoglobulina. En un caso, la una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera k y una cadena pesada.

En un caso, se describe el uso de un ratón para generar una secuencia de región variable de cadena ligera ^ky de cadena pesada para crear un anticuerpo humano como se describe en la presente memoria, que comprende: (a) inmunizar a un ratón como se describe en la presente memoria, con un antígeno de interés, (b) aislar el bazo del ratón inmunizado en (a), (c) exponer los linfocitos B del bazo a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar a un linfocito B de (c) que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena ligera ^k, del linfocito B, y generar así secuencias de la región variable de la cadena ligera ^ky la cadena pesada.

En un caso, se describe el uso de un ratón para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera k para crear un anticuerpo humano como se describe en la presente memoria, que comprende: (a) inmunizar a un ratón como se describe en la presente memoria, con un antígeno de interés, (b) aislar uno o más ganglios linfáticos del ratón inmunizado en (a), (c) exponer los linfocitos B de los ganglios linfáticos a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar a un linfocito B de (c) que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar un secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena ligera ^k, del linfocito B, y generar así secuencia de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera k.

En un caso, se describe el uso de un ratón para generar una secuencia de región variable de cadena ligera k y de cadena pesada para crear un anticuerpo humano como se describe en la presente memoria, que comprende: (a) inmunizar a un ratón como se describe en la presente memoria, con un antígeno de interés, (b) aislar la médula ósea del ratón inmunizado en (a), (c) exponer los linfocitos B de la médula ósea a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar a un linfocito B de (c) que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena ligera k, del linfocito B, y generar así secuencias de la región variable de la cadena ligera ^ky la cadena pesada. En varios casos, se seleccionan el uno o más anticuerpos marcados de IgM, IgG y/o una combinación de las mismas.

En varios casos, el antígeno de interés es un patógeno que afecta a seres humanos, incluidos, p. ej., un antígeno viral. Los patógenos virales son, p. ej., los de las familias Adenoviridae, bacteria Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Polyomavirus, Rhabdoviridae y Togaviridae. Estos ejemplos de virus tienen habitualmente una longitud de 20-300 nanómetros. En varios casos, el antígeno de interés es un antígeno viral seleccionado de un virus de la hepatitis (p. ej., VHC, VHB, etc.), un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o un virus de la gripe (p. ej., e1H1N1).

En varios casos, se describe el uso de un ratón para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera ^kpara crear un anticuerpo humano como se describe en la presente memoria, lo que además comprende fusionar las secuencias amplificadas de la región variable de cadena pesada y cadena ligera con secuencias de región constante de cadena pesada y cadena ligera humanas, expresar las secuencias de cadena pesada y cadena ligera fusionadas en una célula, y recuperar las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expresadas, generando así un anticuerpo humano.

En varios casos, las regiones constantes de cadena pesada humana se seleccionan de IgM, IgD, IgA, IgE e IgG. En varios casos específicos, la IgG se selecciona de una IgG1, una IgG2, una IgG3 y una IgG4. En varios casos, la región constante de cadena pesada humana comprende una secuencia C^h1, una bisagra, una secuencia C^h2, una secuencia C^h3, una secuencia C^h4 o una combinación de las mismas. En varios casos, la región constante de cadena ligera es una región constante k de inmunoglobulina. En varios casos, la célula se selecciona de una célula HeLa, una célula DU145, una célula Lncap, una célula MCF-7, una célula MDA-MB-438, una célula PC3, una célula T47D, una célula THP-1, una célula U87, una célula SHSY5Y (neuroblastoma humano), una célula Saos-2, una célula Vero, una célula CHO, una célula GH3, una célula PC12, una célula de retina humana (p. ej., una célula PER.C6™) y una célula MC3T3. En un caso específico, la célula es una célula CHO.

En un caso, se describe un procedimiento para generar un anticuerpo quimérico inverso de roedor-humano específico contra un antígeno de interés, que comprende las etapas de inmunización de un ratón con el antígeno como se describe en la presente memoria, el aislamiento de al menos una célula del ratón que produzca un anticuerpo quimérico inverso de ratón-humano específico contra el antígeno, el cultivo de al menos una célula que produzca un anticuerpo quimérico inverso de ratón-humano específico contra el antígeno, y la obtención de dicho anticuerpo.

En un caso, el anticuerpo quimérico inverso de ratón-humano comprende un dominio variable de cadena pesada humana fusionado con un gen constante de cadena pesada de ratón o de rata, y un dominio variable de cadena ligera humana fusionado con un gen constante de cadena ligera de ratón, de rata o humano. En un caso específico, el domino variable de cadena pesada humana contiene un segmento génico V^h1-69 humano reorganizado o un segmento génico V^h1-2 humano.

En un caso, el cultivo de al menos una célula productora del anticuerpo quimérico inverso de roedor-humano específico contra el antígeno se lleva a cabo en al menos una célula de hibridoma generada de al menos una célula aislada del ratón.

En un caso, el antígeno de interés es un patógeno que afecta a seres humanos, como se describe en la presente memoria.

En un caso, se describe un procedimiento para generar un anticuerpo totalmente humano específico contra un antígeno de interés, que comprende las etapas de inmunización de un ratón con el antígeno como se describe en la presente memoria, el aislamiento de al menos una célula del ratón que produzca un anticuerpo quimérico inverso de ratón-humano específico contra el antígeno, la generación de al menos una célula que produzca un anticuerpo totalmente humano a partir del anticuerpo quimérico inverso de roedor-humano específico contra el antígeno, y el cultivo de al menos una célula que produzca el anticuerpo totalmente humano, y la obtención de dicho anticuerpo totalmente humano.

En varios casos, la al menos una célula aislada del ratón y productora de un anticuerpo quimérico inverso de roedor-humano específico contra el antígeno es un esplenocito o un linfocito B.

En varios casos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En varios casos, el anticuerpo comprende un domino variable de cadena pesada que contiene un segmento génico V^h1-69 humano reorganizado o un segmento génico V^h1-2 humano.

En varios casos, la inmunización con el antígeno de interés se lleva a cabo con proteínas, ADN, una combinación de ADN y proteínas, o células que expresan el antígeno. En un caso, el antígeno de interés es un patógeno que afecta a seres humanos, como se describe en la presente memoria.

En un caso, se describe el uso de un ratón como se describe en la presente memoria para crear una secuencia de ácido nucleico que codifique una región variable de inmunoglobulina o un fragmento de la misma. En un caso, se utiliza la secuencia de ácido nucleico para crear un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En un caso, el ratón se utiliza para crear una proteína de unión a antígeno seleccionada de un anticuerpo, un anticuerpo multiespecífico (p. ej., un anticuerpo biespecífico), un scFv biespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un V-NAR, un V^hh, un V^l, un F(ab), un F(ab)2, una DVD (es decir, una proteína de unión a antígeno con dos dominios variables), y una SVD (es decir, una proteína de unión a antígeno con un dominio variable único) o un captador biespecífico de linfocitos T (BiTE).

En un caso, se describe un procedimiento para crear una proteína de unión a antígeno humana, que comprende exponer a un animal no humano genéticamente modificado a un antígeno de interés, como se describe en la presente memoria, para permitir que el animal no humano genéticamente modificado desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno; obtener del animal no humano genéticamente modificado una secuencia de ácido nucleico del dominio variable de cadena pesada que codifica un dominio variable de cadena pesada humana que se une específicamente al antígeno de interés; la clonación de la secuencia de ácido nucleico de dominio variable de cadena pesada en una secuencia de región constante humana; y la expresión en una célula de mamífero de un anticuerpo que comprende la secuencia de dominio variable de cadena pesada humana y la secuencia de región constante humana. En un caso, la célula de mamífero es una célula CHO. En un caso, el animal no humano genéticamente modificado comprende un repertorio de segmentos génicos V^hhumanos que consiste específicamente en un segmento génico V^hhumano único, presente de forma opcional en dos o más variantes polimórficas del mismo, enlazado operativamente a uno o más segmentos D y/o J humanos. En un caso, el repertorio de segmento génico V^hhumano está en un locus de segmento V^hendógeno no humano. En un caso, el repertorio de segmento génico V^hhumano está en un locus que no es un locus de segmento V^hendógeno. En un caso, el segmento génico V^hhumano se reorganiza con un segmento D humano y un segmento J humano para formar un gen VDJ humano reorganizado enlazado operativamente a una secuencia de región constante, en el que la secuencia de región constante se selecciona de una secuencia humana y una secuencia de roedor (p. ej., una secuencia de ratón, rata o hámster). En un caso, la secuencia de región constante comprende una secuencia seleccionada de una C^h1, una bisagra, una C^h2, una C^h3 y una combinación de las mismas. En un caso específico, la secuencia de región constante comprende una C^h1, una bisagra, una CH2 y una CH3. En un caso, el dominio variable humano y la secuencia constante se expresan en la célula de mamífero con un dominio variable de cadena ligera humana análoga obtenida del mismo ratón (p. ej., una secuencia obtenida del mismo linfocito B que la secuencia de dominio variable humana); en un caso, la secuencia que codifica el dominio variable de cadena ligera humana, obtenida del ratón, se fusiona a continuación con una secuencia que codifica una secuencia constante de cadena ligera humana, y la secuencia de cadena ligera y la secuencia de cadena pesada se expresan en la célula de mamífero.

En un caso, se describe un procedimiento para crear un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que se une a un antígeno de interés, que comprende expresar en una sola célula (a) una primera secuencia V^hde un animal no humano inmunizado como se describe en la presente memoria, en el que la primera secuencia V^hse fusiona con una secuencia génica C^h; y (b) una secuencia génica V^lde un animal no humano inmunizado como se describe en la presente memoria, en el que la secuencia génica V^lse fusiona con una secuencia génica C^lhumana; manteniendo la célula en condiciones suficientes para expresar un anticuerpo; y aislando el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo. En un caso, la secuencia génica V^les análoga a la primera secuencia VH.

En un caso, la célula comprende una segunda secuencia génica V^hde un animal no humano inmunizado como se describe en la presente memoria, en el que la segunda secuencia génica V^hse fusiona con una secuencia génica C^h, en el que la primera secuencia génica V^hcodifica un dominio V^hque se une específicamente a un primer epítopo, y la segunda secuencia génica V^hcodifica un dominio V^hque se une específicamente a un segundo epítopo, que no es idéntico al primer epítopo.

En un caso, todas las secuencias de región constante son secuencias de región constante humanas. En un caso, el antígeno de interés es un patógeno que afecta a seres humanos, como se describe en la presente memoria. En un caso, se describe un procedimiento para crear un anticuerpo biespecífico humano, que comprende crear el anticuerpo biespecífico utilizando secuencias génicas de región variable humanas de linfocitos B de un animal no humano, como se describe en la presente memoria.

En un caso, el procedimiento comprende (a) identificar un linfocito seleccionado clónicamente de un animal no humano previamente expuesto a un antígeno de interés y al que se ha permitido desarrollar una respuesta inmunitaria al antígeno de interés, y en el que el linfocito expresa un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés; (b) obtener del linfocito o del anticuerpo una secuencia de nucleótidos que codifique una región variable de cadena pesada humana que se una específicamente al antígeno de interés, y (c) emplear la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada humana que se une específicamente al antígeno de interés para crear el anticuerpo biespecífico. En un caso específico, la región variable de cadena pesada humana comprende un segmento génico V^h1-2 o V^h1-69 reorganizado.

En un caso, las etapas (a) a (c) se llevan a cabo la primera vez para un primer antígeno de interés, con el fin de generar una primera secuencia de región variable de cadena pesada humana, y las etapas (a) a (c) se llevan a cabo una segunda vez para un segundo antígeno de interés, con el fin de generar una segunda secuencia de región variable de cadena pesada humana; en el que la primera secuencia de región variable de cadena pesada humana se expresa fusionada con una primera región constante de cadena pesada humana para formar una primera cadena pesada humana, la segunda secuencia de región variable de cadena pesada humana se expresa fusionada con una segunda región constante de cadena pesada humana para formar una segunda cadena pesada humana, en el que la primera y la segunda cadenas pesadas humanas se expresan en presencia de una cadena ligera humana única expresada a partir de un segmento génico Vk1-39 humano reorganizado o un segmento génico Vk3-20 humano. En un caso específico, la cadena ligera humana única comprende una secuencia de línea germinal.

En un caso, el procedimiento comprende (a) clonar regiones variables de cadena pesada de linfocitos B de un animal no humano como se describe en la presente memoria que se ha expuesto a un primer antígeno de interés, y del mismo animal no humano, o de un animal no humano diferente que sea genéticamente igual y se haya expuesto a un segundo antígeno de interés; y (b) expresar en una célula las regiones variables de cadena pesada con (a) la misma región constante de cadena pesada y la misma cadena ligera para formar un anticuerpo biespecífico.

En un caso, se describe un uso de un animal no humano como se describe en la presente memoria, para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada humana. En un caso, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano reorganizado seleccionado de V^h1-2 y V^h1-69.

En un caso, se describe un uso de un animal no humano como se describe en la presente memoria, para obtener una célula que codifica un dominio variable de cadena pesada humana. En un caso, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano reorganizado seleccionado de V^h1-2 y V^h1-69.

En un caso, se describe el uso de un animal no humano como se describe en la presente memoria para formar un dominio variable de anticuerpos humanos. En un caso, el dominio variable comprende un segmento génico V^hhumano reorganizado seleccionado de V^h1-2 y V^h1-69.

En un caso, se describe el uso de un animal no humano como se describe en la presente memoria para formar un anticuerpo humano, que comprende la formación del anticuerpo utilizando secuencias génicas de región variable humanas de linfocitos B de un animal no humano como se describe en la presente memoria. En un caso, el anticuerpo humano es un anticuerpo biespecífico humano. En un caso específico, el anticuerpo biespecífico comprende un domino variable de cadena pesada derivado de un segmento génico V^h1-2 o V^h1-69 humano reorganizado. En un caso, las secuencias génicas de regiones variables humanas comprenden un segmento génico V^h1-2 o V^h1-69 humano reorganizado.

En un caso, se describe el uso de un animal no humano como se describe en la presente memoria para seleccionar un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En un caso, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano reorganizado seleccionado de V^h1-2 y V^h1-69. En un caso, se describe el uso del ratón como se describe en la presente memoria para la elaboración de un medicamento (p. ej. una proteína fijadora de antígenos), o para la elaboración de una secuencia que codifica una secuencia variable de un medicamento (p. ej. una proteína fijadora de antígenos), para el tratamiento de una enfermedad o trastorno humano. En un caso, la secuencia variable de un medicamento comprende un segmento génico V^hhumano polimórfico. En un caso, la secuencia variable de un medicamento comprende un segmento génico V^h1-69 humano. En un caso, la secuencia variable de un medicamento comprende un segmento génico V^h1-2 humano.

En un caso, se describe una construcción de ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina formado en un ratón como se describe en la presente memoria. En un caso, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada. En un caso específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^hhumano reorganizado seleccionado de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 o V^h3-23. En otro caso específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^h1-2 humano reorganizado. En otro caso específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico VH1-69 humano reorganizado.

En un caso, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera. En un caso específico, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera ^kque es análogo a un dominio variable de cadena pesada humana que comprende un segmento génico V^h1-69 humano reorganizado. En un caso específico, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera k que es análogo a un dominio variable de cadena pesada humana que comprende un segmento génico V^h1-2 humano reorganizado.

En un caso, se describe el uso de un ratón como se describe en la presente memoria para formar una construcción de ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina humana. En un caso, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera. En un caso, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera ^kque comprende un segmento génico V^khumano reorganizado seleccionado de V^k4-1, V^k5-2, V^k7-3, V^k2-4, V^k1-5, V^k1-6, V^k3-7, V^k1-8, V^k1-9, V^k2-10, V^k3-11, V^k1-12, V^k1-13, V^k2-14, V^k3-15, V^k1-16, V^k1-17, Vk2-18, Vk2-19, Vk3-20, Vk6-21, Vk1-22, Vk1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2-29, Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33, Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36, Vk1-37, Vk2-38, Vk1-39 y Vk2-40.

En un caso, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada. En un caso específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico VH humano reorganizado seleccionado de VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70 o VH3-23. En un caso específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^h1-69 humano reorganizado. En un caso específico, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico V^h1-2 humano reorganizado.

En un caso se describe el uso de un ratón como se describe en la presente memoria para formar un dominio variable de inmunoglobulina humana. En un caso, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera. En un caso, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera k que comprende un segmento génico V^khumano reorganizado seleccionado de V^k4-1, V^k5-2, V^k7-3, V^k2-4, V^k1-5, V^k1-6, V^k3-7, V^k1-8, V^k1-9, V^k2-10, V^k3-11, V^k1-12, V^k1-13, V^k2-14, V^k3-15, V^k1-16, V^k1-17, V^k2-18, V^k2-19, V^k3-20, V^k6-21, V^k1-22, V^k1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2-29, Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33, Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36, Vk1-37, Vk2-38, Vk1-39 y Vk2-40.

En un caso se describe el uso de un animal no humano como se describe en la presente memoria para formar una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada humana. En un caso, el dominio variable de cadena pesada humana se caracteriza por tener secuencias FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 humanas que se derivan de un segmento génico V^hhumano polimórfico. En un caso específico, el segmento génico V^hhumano se selecciona de un segmento génico V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 o V^h3-23 humano. En un caso, el segmento génico V^hhumano es un segmento génico V^h1-69 humano. En un caso, el segmento génico V^hhumano es un segmento génico V^h1-2 humano.

En un caso, se describe un procedimiento para formar una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio V^hhumano, cuyo procedimiento comprende inmunizar a un animal no humano como se describe en la presente memoria con un antígeno de interés, permitir que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno de interés y obtener de ahí una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio V^hhumano que se une al antígeno de interés. En un caso, el procedimiento además comprende la formación de una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio V^lhumano que es análogo al dominio V^hhumano, y comprende aislar un linfocito B que codifica el dominio V^hhumano y el dominio V^lhumano y obtener de ahí la secuencia de los dominios variables de cadena pesada y ligera. En diversos casos, el dominio V^hhumano se deriva de un segmento génico V^h1-69 humano o V^h1-2 humano reorganizado. En diversos casos, el dominio V^hhumano se selecciona de un dominio Vk humano o VA humano.

En un caso, se describe el uso de un animal no humano como se describe en la presente memoria para formar un producto terapéutico humano, que comprende inmunizar al animal no humano con un antígeno de interés, permitir que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria y obtener del animal una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina que se une al antígeno de interés, y emplear el dominio variable de inmunoglobulina en un producto terapéutico humano. En un caso, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada. En un caso específico, el dominio variable de cadena pesada se deriva de un segmento génico V^h1-69 humano o V^h1-2 humano reorganizado. En un caso, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera. En un caso específico, el dominio variable de cadena ligera se deriva de un segmento génico Vk humano o VA humano reorganizado.

En un caso, se describe un procedimiento para formar un producto terapéutico humano, que comprende inmunizar a un animal no humano como se describe en la presente memoria con un antígeno de interés, permitir que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria y obtener del animal una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina que se une al antígeno de interés, y emplear el dominio variable de inmunoglobulina en un producto terapéutico humano. En un caso, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada. En un caso específico, el dominio variable de cadena pesada se deriva de un segmento génico V^h1-69 humano o V^h1-2 humano reorganizado. En un caso, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera. En un caso específico, el dominio variable de cadena ligera se deriva de un segmento génico Vk humano o VA humano reorganizado.

En un caso, se describe un procedimiento para formar una proteína humana fijadora de antígenos, que comprende inmunizar a un animal no humano como se describe en la presente memoria con un antígeno de interés, permitir que el animal desarrolle una respuesta inmunitaria, obtener del ratón una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina que se une específicamente al antígeno de interés, clonar la secuencia de ácido nucleico en un vector adecuado para la expresión del ácido nucleico, en el que la secuencia de ácido nucleico se clona en un marco con una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de inmunoglobulina humana o un fragmento funcional de la misma, e insertar el vector en una célula de mamífero, y mantener la célula en condiciones adecuadas para expresar una proteína fijadora de antígenos que comprende el dominio variable de inmunoglobulina y la región constante de inmunoglobulina o el fragmento funcional de la misma. En un caso, la proteína fijadora de antígenos es un anticuerpo humano. En un caso específico, el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera obtenidos de un ratón como se describe en la presente memoria. En un caso específico, el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada obtenido de un ratón como se describe en la presente memoria. En diversos casos, el dominio variable de cadena pesada se deriva de un segmento génico V^h1-69 humano o V^h1-2 humano reorganizado.

En un caso, se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio humano fijador de antígenos formado en un animal no humano como se describe en la presente memoria. En un caso, la secuencia de ácido nucleico codifica un dominio V^hde inmunoglobulina humana. En un caso, la secuencia de ácido nucleico codifica un dominio V^hde inmunoglobulina humana y un dominio V^lhumano análogo. En diversos casos, el dominio V^hhumano se deriva de un segmento génico V^h1-69 humano o V^h1-2 humano reorganizado.

En un caso, se describe un procedimiento para la preparación de un anticuerpo humano, que comprende inmunizar a un animal no humano como se describe en la presente memoria con un antígeno de interés, permitir que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria, extraer un linfocito (p. ej., un linfocito B) del animal inmunizado, fusionar el linfocito con una célula de mieloma para formar una célula de hibridoma, obtener de la célula de hibridoma una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio V^hhumano y un dominio V^lhumano, clonar la secuencia de ácido nucleico en un marco (es decir, en unión operativa) con una secuencia de región constante humana para crear una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina, y expresar las cadenas pesada y ligera en una célula capaz de expresar el anticuerpo plenamente humano. En un caso, la célula es una célula CHO. En diversos casos, el dominio V^hhumano se deriva de un segmento génico V^h1-69 humano o de un segmento génico V^h1-2 humano reorganizado.

En un caso se describe un procedimiento para la preparación de un anticuerpo humano, que comprende inmunizar a un animal no humano como se describe en la presente memoria con un antígeno de interés, permitir que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria, extraer un linfocito (p. ej., un linfocito B) del animal inmunizado, obtener del linfocito una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio V^hhumano y un dominio V^lhumano, clonar la secuencia de ácido nucleico en un marco (es decir, en unión operativa) con una secuencia de región constante humana para crear una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina, y expresar las cadenas pesada y ligera en una célula capaz de expresar el anticuerpo plenamente humano. En un caso, el linfocito se obtiene del bazo de un animal no humano. En un caso, la célula es una célula CHO. En diversos casos, el dominio V^hhumano se deriva de un segmento génico V^h1-69 humano o de un segmento génico V^h1-2 humano reorganizado.

En diversos casos, el antígeno de interés es un patógeno que afecta a sujetos humano como se describe en la presente memoria. En diversos casos, el antígeno de interés es un virus capaz de infectar a un ser humano. Entre los ejemplos de antígenos que se pueden emplear en los procedimiento y usos descritos en la presente memoria se incluyen microbios o microorganismos como un virus, bacteria, prion u hongo o cualquier otro patógeno que provoque enfermedades en el ser humano. Un experto, tras leer la descripción, valorará los patógenos humanos que serán aplicables para los procedimientos y usos descritos en la presente memoria. Los diversos casos se pueden utilizar juntos, salvo que se indique expresamente lo contrario o el contexto impida claramente el uso conjunto.

Breve descripción de las figuras

En la FIG. 1 se muestra una ilustración general, que no está a escala, de una serie de pasos de direccionamiento y manipulación molecular empleados para formar un vector de direccionamiento para la construcción de un locus de cadena pesada modificado que contiene un segmento génico V^h1-69 humano único, veintisiete segmentos génicos D^hhumanos y seis J^hhumanos en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena.

En la FIG. 2 se muestra una ilustración general, que no está a escala, de una serie de pasos de direccionamiento y manipulación molecular empleados para formar un vector de direccionamiento para la construcción de un locus de cadena pesada modificado que contiene un segmento génico V^h1-2 humano único, veintisiete segmentos génicos DH humanos y seis JH humanos en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena.

En la FIG. 3 se muestran gráficos de perfiles de esplenocitos con fijación de ventana para linfocitos aislados y teñidos para CD19 (linfocito B) y CD3 (linfocito T) de un ratón de tipo natural (WT) y de un ratón homocigótico para un segmento génico VH humano único, veintisiete segmentos génicos DH humanos y seis JH humanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO).

En la FIG. 4A se muestra, a la izquierda, el porcentaje de linfocitos B CD19+ en bazos obtenidos de ratones de tipo natural (WT) y ratones homocigóticos para un segmento génico V^hhumano único, veintisiete segmentos génicos D^hhumanos y seis J^hhumanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO). A la derecha se muestra el número de linfocitos B CD19+ por bazo tanto para los ratones de tipo natural (WT) como para los ratones homocigóticos para un segmento génico V^hhumano único, veintisiete segmentos génicos D^hhumanos y seis J^hhumanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO).

En la FIG. 4B se muestra, a la izquierda, el porcentaje de linfocitos B CD19+ B en médula ósea obtenida del fémur de ratones de tipo natural (WT) y ratones homocigóticos para un segmento génico V^hhumano único, veintisiete segmentos génicos D^hhumanos y seis J^hhumanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO). A la derecha se muestra el número de linfocitos B CD19+ por fémur tanto para los ratones de tipo natural (WT) como para los ratones homocigóticos para un segmento génico VH humano único, veintisiete segmentos génicos D^hhumanos y seis J^hhumanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO).

En la FIG. 5 se muestran gráficos de perfiles de esplenocitos con fijación de ventana para linfocitos B CD19+ y teñidos para la expresión de IgA+ e IgK+ de un ratón de tipo natural (WT) y de un ratón homocigótico para un segmento génico V^hhumano único, veintisiete segmentos génicos D^hhumanos y seis J^hhumanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO).

En la FIG. 6 se muestran gráficos de perfiles de esplenocitos con fijación de ventana para linfocitos B CD19+ y teñidos para inmunoglobulina D (IgD) e inmunoglobulina M (IgM) de un ratón de tipo natural (WT) y de un ratón homocigótico para un segmento génico Vh humano único, veintisiete segmentos génicos Dh humanos y seis Jh humanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO).

En la FIG. 7 se muestra el número de linfocitos B de transición (CD19+IgMhiIgDint), linfocitos B maduros (CD19+IgMintIgDhi), y la proporción de linfocitos B maduros a inmaduros en bazos obtenidos de ratones de tipo natural (WT) y ratones homocigóticos para un segmento génico Vh humano único, veintisiete segmentos génicos Dh humanos y seis Jh humanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO).

En la FIG. 8 se muestran gráficos de perfiles de médula ósea con fijación de ventana para singuletes teñidos para inmunoglobulina M (IgM) y B220 de un ratón de tipo natural (WT) y de un ratón homocigótico para un segmento génico Vh humano único, veintisiete segmentos génicos Dh humanos y seis Jh humanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO).

En la FIG. 9 se muestra el número total de linfocitos B inmaduros (B220intIgM+) y maduros (B220hiIgM+) en médula ósea aislada del fémur de ratones de tipo natural (WT) y ratones homocigóticos para un segmento génico Vh humano único, veintisiete segmentos génicos Dh humanos y seis Jh humanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO).

En la FIG. 10 se muestran gráficos de perfiles de médula ósea con fijación de ventana para linfocitos B CD19+ y teñidos para ckit+ y CD43+ de un ratón de tipo natural (WT) y de un ratón homocigótico para un segmento génico Vh humano único, veintisiete segmentos génicos Dh humanos y seis Jh humanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO).

En la FIG. 11A se muestra el porcentaje de linfocitos CD19+ en poblaciones de linfocitos pro-B (CD19+CD43+ckit+) y pre-B (CD19+CD43-ckit- ) en médula ósea obtenida del fémur de ratones de tipo natural (WT) y ratones homocigóticos para un segmento génico Vh humano único, veintisiete segmentos génicos Dh humanos y seis Jh humanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO).

En la FIG. 11B se muestra el número absoluto de linfocitos por fémur en probaciones de linfocitos pro-B (CD19+CD43+ckit+) y pre-B (CD19+CD43-ckit- ) en médula ósea obtenida de ratones de tipo natural (Wt ) y ratones homocigóticos para un segmento génico Vh humano único, veintisiete segmentos génicos Dh humanos y seis Jh humanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO).

En la FIG. 12 se muestra la expresión relativa de ARNm (eje y) en linfocitos B esplénicos purificados de cadenas pesadas derivadas de Vh1-69 en un ensayo de RCP cuantitativo utilizando una sonda específica para el segmento génico Vh1-69 humano en ratones homocigóticos para una sustitución de la cadena pesada endógena Vh, Dh, Jh, y una sustitución de la cadena ligera endógena Vk y segmentos génicos Jk con segmentos génicos Vh, Dh, Jh, Vk y Jk humanos (Hk), ratones de tipo natural (WT), ratones homocigóticos para un segmento génico Vh humano único, veintisiete segmentos génicos Dh humanos y seis Jh humanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HET) y ratones homocigóticos para un segmento génico Vh humano único, veintisiete segmentos génicos Dh humanos y seis Jh humanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (1hVH HO). Las señales están normalizadas a la expresión del Ck de ratón.

En la FIG. 13 se muestra la alineación de nucleótidos del segundo exón para cada uno de los trece alelos registrados para el gen Vh1-69 humano. Las bases en minúscula indican diferencias de nucleótidos en la línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de la complementariedad (RDC) se indican con casillas en torno a la secuencia. Los guiones indican espacios artificiales para la correcta alineación de la secuencia. Vh1-69*01 (Id. de sec. n.°: 34); Vh1-69*02 (Id. de sec. n.°: 36); Vh1-69*03 (Id. de sec. n.°: 38); Vh1-69*04 (Id. de sec. n.°: 40); Vh1-69*05 (Id. de sec. n.°: 42); Vh1-69*06 (Id. de sec. n.°: 44); Vh1-69*07 (Id. de sec. n.°: 46); Vh1-69*08 (Id. de sec. n.°: 48); Vh1-69*09 (Id. de sec. n.°: 50); Vh1-69*10 (Id. de sec. n.°: 52); Vh1-69*11 (Id. de sec. n.°: 54); Vh1-69*12 (Id. de sec. n.°: 56); Vh1-69*13 (Id. de sec. n.°: 58).

En la FIG. 14 se muestra la alineación de proteínas de la secuencia génica variable de la cadena pesada madura para cada uno de los trece alelos registrados para el gen Vh1-69 humano. Los aminoácidos en minúscula indican diferencias en la línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de la complementariedad (RDC) se indican con casillas en torno a la secuencia. Los guiones indican espacios artificiales para la correcta alineación de la secuencia. Vh1-69*01 (Id. de sec. n.°: 35); Vh1-69*02 (Id. de sec. n.°: 37); Vh1-69*03 (Id. de sec. n.°: 39); Vh1-69*04 (Id. de sec. n.°: 41); Vh1-69*05 (Id. de sec. n.°: 43); Vh1-69*06 (Id. de sec. n.°: 45); Vh1-69*07 (Id. de sec. n.°: 47); Vh1-69*08 (Id. de sec. n.°: 49); Vh1-69*09 (Id. de sec. n.°: 51); Vh1-69*10 (Id. de sec. n.°: 53); Vh1-69*11 (Id. de sec. n.°: 55); Vh1-69*12 (Id. de sec. n.°: 57); Vh1-69*13 (Id. de sec. n.°: 59).

En la FIG. 15 se muestra una matriz de porcentaje de identidad/porcentaje de similitud para las secuencias de proteínas alineadas del gen variable maduro para cada uno de los trece alelos registrados para el gen Vh1-69 humano. El porcentaje de identidad entre los alelos V^h1-69 está indicado encima de las casillas sombreadas y el porcentaje de similitud está indicado debajo de las casillas sombreadas. Las puntuaciones del porcentaje de identidad y el porcentaje de similitud se obtuvieron mediante el instrumento de alineación ClustalW (v1.83) utilizando el software MacVector (MacVector, Inc., Carolina del Norte).

En la FIG. 16 se muestra la alineación de nucleótidos del segundo exón para cada uno de los cinco alelos registrados para el gen V^h1-2 humano. Las bases en minúscula indican diferencias de nucleótidos en la línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de la complementariedad (RDC) se indican con casillas en torno a la secuencia. Los guiones indican espacios artificiales para la correcta alineación de la secuencia. V^h1-2*01 (Id. de sec. n.°: 60); V^h1-2*02 (Id. de sec. n.°: 62); V^h1-2*03 (Id. de sec. n.°: 64); V^h1-2*04 (Id. de sec. n.°: 66); V^h1-2*05 (Id. de sec. n.°: 68).

En la FIG. 17 se muestra la alineación de proteínas de la secuencia génica variable de la cadena pesada madura para cada uno de los cinco alelos registrados para el gen V^h1-2 humano. Los aminoácidos en minúscula indican diferencias en la línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de la complementariedad (RDC) se indican con casillas en torno a la secuencia. Los guiones indican espacios artificiales para la correcta alineación de la secuencia. V^h1-2*01 (Id. de sec. n.°: 61); V^h1-2*02 (Id. de sec. n.°: 63); V^h1-2*03 (Id. de sec. n.°: 65); V^h1-2*04 (Id. de sec. n.°: 67); V^h1-2*05 (Id. de sec. n.°: 69).

En la FIG. 18 se muestra una matriz de porcentaje de identidad/porcentaje de similitud para las secuencias de proteínas alineadas del gen variable maduro para cada uno de los cinco alelos registrados para el gen V^h1-2 humano. El porcentaje de identidad entre los alelos V^h1-2 está indicado encima de las casillas sombreadas y el porcentaje de similitud está indicado debajo de las casillas sombreadas. Las puntuaciones del porcentaje de identidad y el porcentaje de similitud se obtuvieron mediante el instrumento de alineación ClustalW (v1.83) utilizando el software MacVector (MacVector, Inc., Carolina del Norte).

La FIG. 19 muestra el título de anticuerpo de ratones homocigóticos para loci genéticos variables de cadena ligera ^khumana y pesada humana (H^k; n=4) y ratones homocigóticos para un segmento génico V^h1-69 humano único, veintisiete segmentos génicos D^hhumanos y seis J^hhumanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (IIⁱV^hHO; n=10) inmunizados con un receptor de superficie celular humana (Antígeno A).

La FIG. 20 muestra el título de anticuerpo de ratones homocigóticos para loci genéticos variables de cadena ligera ^khumana y pesada humana (H^k; n=5) y ratones homocigóticos para un segmento génico V^h1-69 humano único, veintisiete segmentos génicos D^hhumanos y seis J^hhumanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (IIⁱV^hHO; n=5) inmunizados con dos vacunas distintas de gripe.

La FIG. 21 muestra el porcentaje (eje y) de cadenas pesadas imprimadas de IgM que tengan una longitud de aminoácido especificada para la región CDR3 de V^h(eje x) de los ratones homocigóticos para un segmento génico V^h1-69 humano único, veintisiete segmentos génicos D^hhumanos y seis J^hhumanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena y homocigóticos para una sustitución de loci variables de cadena ligera k endógena por loci variables de cadena ligera k humana inmunizados con un receptor de superficie celular humana (Antígeno A).

La FIG. 22 muestra el porcentaje (eje y) de cadenas pesadas imprimadas de IgG que tengan una longitud de aminoácido especificada para la región CDR3 de V^h(eje x) de los ratones homocigóticos para un segmento génico V^h1-69 humano único, veintisiete segmentos génicos D^hhumanos y seis J^hhumanos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena y homocigóticos para una sustitución de loci variables de cadena ligera k endógena por loci variables de cadena ligera k humana inmunizados con un receptor de superficie celular humana (Antígeno A).

Descripción detallada

La invención no se limita a procedimientos particulares, y las condiciones experimentales descritas, tanto los procedimientos como las condiciones pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir solo casos particulares, y no pretende ser limitante, dado que el ámbito de la presente invención se define en las reivindicaciones.

Salvo que se defina de otra manera, todos los términos y expresiones utilizados en la presente memoria incluyen los significados que los términos y expresiones han adquirido en la técnica, a no ser que lo contrario se indique o se evidencie claramente a partir del contexto en el que se usa el término o expresión. Aunque se puede utilizar cualquier procedimiento o material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la práctica o en la prueba de la presente invención, ahora se describen materiales y procedimientos particulares.

La frase “ sustancial” o “ sustancialmente” cuando se utiliza para referirse a una cantidad de segmentos génicos (p. ej., “ sustancialmente todos” los segmentos génicos V) incluye tanto los segmentos génicos funcionales como los no funcionales e incluye, en varios casos, p. ej., 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más o 99 % o más de los segmentos génicos; en varios casos, “ sustancialmente todos” los segmentos génicos incluyen, p. ej., al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de los segmentos génicos funcionales (es decir, no pseudogenes).

El término “sustitución” incluye en el que se encuentra situada una secuencia de ADN en un genoma de una célula de forma que sustituya una secuencia dentro del genoma con una secuencia heteróloga (p. ej., una secuencia humana en un ratón), en el locus de la secuencia genómica. La secuencia de ADN así colocada puede incluir una o más secuencias regulatorias que forman parte del ADN de origen utilizado para obtener la secuencia así colocada (p. ej., promotores, potenciadores, regiones no traducidas 5' o 3', secuencias de señal de recombinación apropiada, etc.). Por ejemplo, en varios casos, la sustitución es una sustitución de una secuencia endógena para una secuencia heteróloga que da lugar a la creación de un producto genético de la secuencia del ADN así colocada (que comprende la secuencia heterológica), pero sin expresión de la secuencia endógena; la sustitución es la de una secuencia genómica endógena por una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una función similar a la de una proteína codificada por la secuencia genómica endógena (p. ej., la secuencia genómica endógena codifica un dominio o un gen de inmunoglobulina, y el fragmento de ADN codifica uno o más dominios o genes de inmunoglobulina humana). En varios casos, se sustituye un fragmento o un gen endógeno del mismo por un fragmento o gen humano correspondiente del mismo. Un fragmento o un gen humano correspondiente del mismo es un fragmento o un gen humano que es un ortólogo de, un homólogo de o es sustancialmente idéntico o el mismo en estructura y/o función, que el fragmento o gen endógeno del mismo que se sustituye.

Se realizó una sustitución precisa e in situ de seis megabases de las regiones variables de los loci de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón (V^h-D^h-J^h) con un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana restringida, al tiempo que deja las secuencias de ratón complementarias intactas y funcionales dentro de los loci híbridos, incluidos todos los genes de cadena constante del ratón y las regiones de control transcripcional del locus (FIG. 1 y FIG. 2). Específicamente, se introdujeron un V^hhumano único, 27 D^hy seis segmentos génicos J^hmediante vectores objetivo BAC quiméricos en células ES de ratón usando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (ver, p. ej., patente US- 6.586.251 y Valenzuela y col., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659).

Animales no humanos con segmentos génicos V^hde inmunoglobulina restringida

Se describen animales no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina que comprenden un número restringido de genes V^hy uno o más genes D y uno o más genes J, al igual que los procedimientos para crearlos y utilizarlos. Al inmunizarlos con un antígeno de interés, los animales no humanos generan poblaciones de linfocitos B con regiones variables de anticuerpo derivadas únicamente del gen V^hpreseleccionado y restringido o del conjunto de genes V^h(p. ej., un gen V^hpreseleccionado y variantes del mismo). En varios casos, se proporcionan animales no humanos que generan poblaciones de linfocitos B que muestran dominios variables de anticuerpos humanos que son dominios variables de cadena pesada humana, junto con dominios variables de cadena ligera humana análogos. En varios casos, los animales no humanos reorganizan segmentos génicos variables de cadena pesada humana y segmentos génicos variables de cadena ligera humana a partir de loci de inmunoglobulina de ratón endógenos modificados que comprende una sustitución o una inserción de las secuencias de región variable no reorganizada no humana con secuencias de región variable no reorganizada humana.

Los primeros trabajos sobre la organización, estructura y función de los genes de inmunoglobulina se llevaron a cabo en parte en ratones con loci endógenos desactivados y se modificaron para tener loci transgénicos (colocados de forma aleatoria) con genes de inmunoglobulina humana parciales, p. ej., un repertorio parcial genético de cadena pesada humana unidos a un gen constante humano, insertados aleatoriamente en el genoma, en presencia o en ausencia de un transgén de cadena ligera humana. Aunque estos ratones eran en cierto modo poco óptimos para crear anticuerpos de gran afinidad útiles, facilitaron ciertos análisis funcionales de los loci de inmunoglobulina. Algunos de estos ratones tienen tan solo dos o tres, o incluso un solo gen variable de cadena pesada.

Se han encontrado ratones que muestran cadenas pesadas de inmunoglobulina totalmente humana derivadas de un gen V^h5-51 humano único y 10 genes D^hhumanos y seis genes J^hhumanos, con genes constantes p y y1 humanos, en un transgén insertado aleatoriamente (y loci de inmunoglobulina endógenos desactivados) (Xu and Davis, 2000, Diversity in the CDR3 Region of V^hIs Sufficient for Most Antibody Specificities, Immunity 13:37-45). Las cadenas pesadas de inmunoglobulina totalmente humana de estos ratones se pueden expresar principalmente con tan solo una de las dos cadenas ligeras A totalmente de ratón derivadas del locus de cadena ligera A de ratón endógeno (solo VA1-JA1 o VA2-JA2) y no pueden expresar ninguna cadena ligera k (los ratones son IgK_/"). Estos ratones muestran una disfunción severamente anómala en el desarrollo de linfocitos B y en la expresión del anticuerpo. Los números de los linfocitos B son, según se dice, un 5-10% de tipo natural, los niveles IgM un 5-10% de tipo natural y los niveles IgG1 son solo un 0,1-1 % de tipo natural. El repertorio IgM observado puso de manifiesto una diversidad de unión altamente restringida. Las cadenas pesadas totalmente humanas muestran una longitud de CDR3 largamente idéntica en los antígenos, el mismo uso de J^h(J^h2) en los antígenos y un residuo Q de unión inicial, reflejando así una cierta falta de diversidad CDR3. Casi todas las cadenas ligeras A completamente de ratón tienen una sustitución W96L en JAI como residuo de unión inicial. Se ha indicado que los ratones no son capaces de generar ningún tipo de anticuerpo contra polisacáridos bacterianos. Dado que los dominios variables humanos se acoplan con las cadenas ligeras del ratón, la utilidad de las regiones variables humanas está muy limitada.

Se ha informado de otros ratones que solo tienen un gen V^h3-23 humano único, genes D^hy J^hhumanos y genes de cadena ligera de ratón, pero muestran una diversidad limitada (y, por tanto, una utilidad limitada) debido en parte a un posible acoplamiento erróneo entre dominios V^hhumano y V^lde ratón (ver, p. ej., Mageed y col., 2001, Rearrangement of the human heavy chain variable region gene V3-23 in transgenic mice generates antibodies reactive with a range of antigens on the basis of V^hCDR3 and residues intrinsic to the heavy chain variable region, Clin. Exp. Immunol. 123:1-5). Del mismo modo, los ratones que llevan dos genes V^h(3-23 y 6-1) junto con genes D^hy J^hhumanos en un transgén que contiene el gen constante p humano (Bruggemann y col., 1991, Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus, Eur. J. Immunol. 21:1323-1326) y los muestran en cadenas IgM humanas con cadenas ligeras de ratón pueden mostrar un repertorio limitado debido a un acoplamiento erróneo (Mackworth-Young y col., 2003, The role of antigen in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy chain variable region gene, Clin. Exp. Immunol. 134:420-425).

También se ha informado de otros ratones transgénicos que muestran cadenas pesadas humanas totalmente restringidas de VH de un transgén humano insertado aleatoriamente en el genoma, con un repertorio A humano limitado expresado a partir de un transgén insertado aleatoriamente completamente humano (ver, p. ej., Taylor y col., 1992, A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins, Nucleic Acids Res. 20(23):6287-6295; Wagner y col., 1994, Antibodies generated form human immunoglobulin miniloci in transgenic mice, Nucleic Acids Res. 22(8):1389-1393). Sin embargo, se sabe que los ratones transgénicos que expresan anticuerpos totalmente humanos a partir de transgenes integrados aleatoriamente en el genoma del ratón, y que comprenden loci endógenos dañados, presentan diferencias sustanciales en la respuesta inmunitaria en comparación con los ratones de tipo natural lo que afecta a la diversidad de los dominios variables de anticuerpo que se pueden obtener de dichos ratones.

Los animales no humanos útiles que generan una población variada de linfocitos B que expresan dominios variables de anticuerpos humanos a partir de un repertorio genético VH restringido y uno o más genes D y uno o más genes J serán capaces de generar, preferiblemente en algunos casos, repertorios genéticos de región variable reorganizada que serán suficientemente diversos. En varios casos, la diversidad incluye diversidad de unión, hipermutación somática y diversidad polimórfica en la secuencia génica V^h(para casos donde los genes V^hestán presentes en formas polimórficas). La diversidad de combinatoria se produce en el emparejamiento de los genes V^hcon uno de la pluralidad de dominios variables de cadena ligera humana análoga (que, en varios casos, comprende diversidad de unión y/o hipermutaciones somáticas).

Los animales no humanos que comprenden un repertorio genético V^hhumano restringido y un repertorio genético V^lhumano completo o sustancialmente completo generarán, en varios casos, poblaciones de linfocitos B que reflejan las distintas fuentes de diversidad, tales como diversidad de unión (p. ej., VDJ, unión VJ, adiciones P, adiciones N), diversidad combinatoria (p. ej., cadena ligera humana, cadena pesada humana restringida de V^hanáloga) e hipermutaciones somáticas. En casos que comprenden una restricción del repertorio V^hpara un gen V^hhumano, el gen V^hhumano se puede presentar en dos o más variantes. En varios casos, la presencia de dos o más formas polimórficas de un gen V^henriquecerá la diversidad de los dominios variables de la población de linfocitos B.

Las variaciones en las secuencias de la línea germinal de los segmentos génicos (p. ej., genes V) contribuyen a la diversidad de la respuesta del anticuerpo en humanos. La contribución relativa a la diversidad debido a las diferencias de secuencia génica V varía entre los genes V. El grado de polimorfismo varía entre las familias genéticas, y se refleja en la pluralidad de haplotipos (tramos de secuencia con polimorfismos coheredados) capaces de generar una mayor diversidad tal y como se observa en las diferencias de haplotipo VH entre parientes y no parientes en la población humana (ver, por ejemplo, Souroujon y col., 1989, Polymorphisms in Human H Chain V Region Genes from the V^hIII Gene Family, J. Immunol. 143(2):706-711). Algunos sugieren, en base a los datos de, principalmente, las familias genéticas VH humanas polimórficas, que la diversidad del haplotipo en la línea germinal es el principal contribuyente a la heterogeneidad del gen VH en la población humana, que se refleja en la gran diversidad de genes V^hde distinta línea germinal en la población humana (ver, Sasso y col., 1990, Prevalence and Polymorphism of Human V^h3 Genes, J. Immunol. 145(8):2751-2757).

Aunque la población humana muestra una gran diversidad de haplotipos con respecto al repertorio genético V^hdebido al extendido polimorfismo, ciertos polimorfismos se muestran en alelos prevalentes (es decir, conservados) observados en la población humana (Sasso y col., 1990). El polimorfismo V^hse puede describir en dos formas principales. La primera es la variación que surge de la variación de los alelos asociada a diferencias en la secuencia del nucleótido entre alelos del mismo segmento génico. La segunda surge de las numerosas duplicaciones, inserciones y/o eliminaciones que se han producido en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina. Esto ha provocado una situación única en la que los genes V^hderivados de la duplicación de genes idénticos difieran de sus respectivos alelos en una o más sustituciones de nucleótidos. Esto también influye directamente en el número de copia de los genes V^hen el locus de cadena pesada.

Los alelos polimórficos de los segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana (genes V^h) han sido en gran medida el resultado de la inserción/eliminación de segmentos génicos y de diferencias de nucleótido único en las regiones de codificación, teniendo ambos el potencial de producir consecuencias funcionales en la molécula de inmunoglobulina. La Tabla 1 muestra los genes V^hfuncionales enumerados según la familia genética VH humana y el número de alelo identificado para cada gen VH en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana. Existen ciertos hallazgos que sugieren que los genes V^hpolimórficos están implicados en la susceptibilidad de ciertas enfermedades como, por ejemplo, la artritis reumatoide, aunque en otros casos la relación entre V^hy la enfermedad es menos clara. Esta ambigüedad se le ha atribuido al número de copia y a la presencia de diversos alelos en distintas poblaciones humanas. De hecho, varios genes V^hhumanos muestran variación en el número de copia (p. ej., V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 y VH3-23). En varios casos, los ratones humanizados se describen en la presente memoria con repertorios VH restringidos que comprenden múltiples variantes polimórficas de un miembro de la familia V^hindividual (p. ej., dos o más variantes polimórficas de V^h1-2, V^h1-69, V^h2-26, V^h2-70 o V^h3-23, que sustituyen todos o sustancialmente todos los segmentos VH de ratón funcionales en un locus de ratón endógeno). En un caso específico, las dos o más variantes polimórficas de los ratones descritos en la presente memoria son en número hasta e incluyen el número indicado para el miembro de la familia V^hcorrespondiente en la Tabla 1 (p. ej., para V^h1-69, 13 variantes; para V^h1-2, cinco variantes; etc.).

Las variantes habitualmente observadas de genes V^hhumanos particulares son conocidas en la técnica. Por ejemplo, uno de los polimorfismos más complejos en el locus V^hpertenece al gen V^h1-69. El gen V^h1-69 humano presenta 13 alelos (Sasso y col., 1993, A fetally expressed immunoglobulin V^h1 gene belongs to a complex set of alleles, Journal of Clinical Investigation 91:2358-2367; Sasso y col., 1996, Expression of the immunoglobulin V^hgene 51p1 is proportional to its germline gene copy number, Journal of Clinical Investigation 97(9):2074-2080) y existe en al menos tres haplotipos que conllevan duplicidad del gen V^h1-69, lo que da lugar a múltiples copias del gen V^hen un locus determinado. Estos alelos polimórficos incluyen diferencias en las regiones de determinación de la complementariedad (CDR), que pueden influir drásticamente en la especificidad del antígeno. La Tabla 2 muestra los alelos registrados para V^h1-69 humano y los Id. de sec. n.° para el ADN y las secuencias de proteína de las regiones variables de cadena pesada madura. La Tabla 3 muestra los alelos registrados para los genes V^h1-2 humano y los Id. de sec. n.° para el ADN y las secuencias de proteína de las regiones variables de cadena pesada madura.

El ADN genómico representativo y las secuencias de proteína de longitud completa de un gen V^h1-69 se muestran en el Id. de sec. n.°: 1 y Id. de sec. n.°: 2, respectivamente. La FIG. 13 y la FIG. 14 muestran, respectivamente, el ADN y las alineaciones de proteína de los trece alelos V^h1-69 indicados. El ADN representativo y las secuencias de proteína de un gen V^h1-2 se muestran en el Id. de sec. n.°: 60 y Id. de sec. n.°: 61, respectivamente. La FIG. 16 y la FIG. 17 muestran, respectivamente, el ADN y las alineaciones de proteína de los cinco alelos V^h1-2 registrados. La FIG. 15 y la FIG. 18 muestran, respectivamente, un porcentaje de la matriz de identidad/similitud para las secuencias de proteína alineadas correspondientes a los trece alelos V^h1-69 humanos registrados y a los cinco alelos V^h1-2 humanos registrados. En varios casos, el locus modificado comprende un gen VH seleccionado de la Tabla 1, presente en dos o más números de copia, en el que el número de copia incluye hasta e incluye el número de alelos mostrados en la Tabla 1. En un caso, el locus modificado de la invención comprende un gen V^h1-69 seleccionado de la Tabla 2, presente en dos o más números de copia, en el que el número de copia incluye hasta e incluye el número de alelos mostrados en la Tabla 1. En un caso, el locus modificado de la invención comprende un gen V^h1-2 seleccionado de la Tabla 3, presente en dos o más números de copia, en el que el número de copia incluye hasta e incluye el número de alelos mostrados en la Tabla 1.

Aunque se han tratado ampliamente los casos de uso de un repertorio VH humano restringido en un ratón, también se proporcionan otros animales no humanos que expresan un repertorio VH humano restringido. Dichos animales no humanos incluyen cualquiera que se pueda modificar genéticamente para expresar un repertorio VH humano restringido según se describe en la presente memoria, incluidos, p. ej., ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (p. ej., vaca, toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, hurón, primate (p. ej., tití, mono rhesus), etc. Por ejemplo, para aquellos animales no humanos para los que las células ES modificables genéticamente adecuadas no se encuentran disponibles, se emplean otros procedimientos para crear un animal no humano que comprenda la modificación genética. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo, modificar el genoma de una célula no ES (p. ej., un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y emplear la transferencia nuclear para transferir el genoma modificado a una célula adecuada, p. ej., un oocito, y gestar la célula modificada (p. ej., el oocito modificado) en un animal no humano en las condiciones adecuadas para formar un embrión. Los procedimientos para modificar un genoma de animal no humano (p. ej., un genoma de cerdo, de vaca, de roedor, de pollo, etc.) incluyen, p. ej., el uso de nucleasas con dedos de zinc (ZFN) o activadores de transcripción similares a nucleasa efectora (TALEN) para modificar un genoma para que incluya un repertorio Vh humano restringido. Así, en un caso se describe un procedimiento para editar un genoma de animal no humano para que incluya un repertorio V^hhumano restringido, que comprende un paso para editar el genoma empleando ZFN o TALEN que incluyan no más de uno o no más de dos segmentos génicos Vh humanos (o variantes polimórficas de los mismos), donde ese no más de uno o no más de dos segmentos génicos Vh humanos están operativamente unidos a una secuencia génica constante de inmunoglobulina. En un caso, la secuencia génica constante se selecciona de una secuencia constante de cadena pesada humana y una secuencia constante de cadena pesada no humana. En un caso, la secuencia constante es no humana y no más de uno o no más de dos segmentos génicos Vh humanos están operativamente unidos a una secuencia génica constante no humana en un locus de inmunoglobulina no humana endógeno.

En un caso, el animal no humano es un pequeño mamífero, p. ej., de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. En un caso, el animal genéticamente mofidicado es un roedor. En un caso, el roedor se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster. En un caso, el roedor se selecciona de la superfamilia Muroidea. En un caso, el animal modificado genéticamente procede de una familia seleccionada de Calomyscidae (p. ej., hámsteres similares a ratones), Cricetidae (p. ej., hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, topillos), Muridae (ratones y ratas auténticos, jerbos, ratones espinosos, ratas de crin), Nesomydiae (ratones trepadores, ratones de abazón de las rocas, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (p. ej., lirón espinoso de Malabar), y Spalacidae (p. ej., ratas topo, ratas de bambú, y zocos). En un caso específico, el roedor genéticamente modificado se selecciona de un ratón o rata auténtico (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso, y una rata de crin. En un caso, el ratón genéticamente modificado es un miembro de la familia Muridae.

En un caso, el animal no humano es un roedor que es un ratón de una cepa C57BL. En un caso, la cepa C57BL se selecciona de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6N, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En otro caso, el ratón es una cepa 129. En otro caso, la cepa 129 se selecciona del grupo que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (p. ej., 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, p. ej., Festing y col. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, ver también, Auerbach y col. (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). En otro caso, el ratón modificado genéticamente es una mezcla de una cepa 129 anteriormente mencionada y una cepa C57BL (p. ej., una cepa C57BL/6) anteriormente mencionada. En otro caso, el ratón es una mezcla de cepas 129 anteriormente mencionadas, o una mezcla de cepas C57BL/6 anteriormente mencionadas. En otro caso, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En otro caso, el ratón es una mezcla de una cepa 129/SvEv- y una cepa derivada de la C57BL/6. En otro caso específico, el ratón es una mezcla de una cepa 129/SvEv- y una cepa derivada de la C57BL/6 como se describe en Auerbach y col. 2000 BioTechniques 29:1024-1032. En otro caso, el ratón es una cepa BALB, p. ej., una cepa BALB/c. En otro caso, el ratón es una mezcla de una cepa BALB (p. ej., BALB/c) y otra cepa anteriormente mencionada.

En un caso, el animal no humano es una rata. En un caso, la rata se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6, y Dark Agouti. En un caso, la cepa de la rata es una mezcla de dos o más de las cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti.

Tabla 1

Familia V^hGen V^hAlelos Familia V^hGen V^hAlelos

1-2 5 4-4 7

1-3 2 4-28 6

1-8 2 4-30-1 1

1-18 3 4-30-2 5

1-24 1 4-30-4 6

1-45 3 VH4 4-31 10

1-46 3 4-34 13

1-58 2 4-39 7

1-69 13 4-59 10

4-61 8

2-5 10

2-26 1 5-51 5

2-70 13 VH5

VH6 6-1 2

3-7 3

3-9 2 VH7 7-4-1 5

3-11 4 7-81 1

3-13 4

3-15 8

3-16 2

3-20 1

3-21 4

3-23 5

3-30 19

3-30-3 2

3-30-5 1

V^h3 3-33 6

3-35 1

3-38 2

3-43 2

3-48 4

3-49 5

3-53 4

3-64 5

3-66 4

3-72 2

3-73 2

3-74 3

Tabla 2

Alelo IgHV1-69 Número de ingreso ^{Id. de}

_(A ^{sec. n.°:}

_{DN/Proteína)}

IgHV1-69*01 L22582 34/35

IgHV1-69*02 Z27506 36/37

IgHV1-69*03 X92340 38/39

IgHV1-69*04 M83132 40/41

IgHV1-69*05 X67905 42/43

IgHV1-69*06 L22583 44/45

IgHV1-69*07 Z29978 46/47

IgHV1-69*08 Z14309 48/49

IgHV1-69*09 Z14307 50/51

IgHV1-69*10 Z14300 52/53

IgHV1-69*11 Z14296 54/55

IgHV1-69*12 Z14301 56/57

IgHV1-69*13 Z14214 58/59

Tabla 3

Alelo IgHV1-2 Número de ingreso ^{Id. de sec. n.°:}

_{(ADN/Proteína)}

IgHV1-2*01 X07448 60/61

IgHV1-2*02 X62106 62/63

IgHV1-2*03 X92208 64/65

IgHV1-2*04 Z12310 66/67

IgHV1-2*05 HM855674 68/69

Uso del gen V^hdependiente del antígeno

El uso preferente dependiente del antígeno de los genes V^hse puede aprovechar para el desarrollo de terapéuticas humanas enfocadas a antígenos clínicamente significativos. La posibilidad de generar un repertorio de dominios variables de anticuerpos usando un gen V^hparticular puede proporcionar una ventaja significativa en la búsqueda de dominios variables de anticuerpos de gran afinidad para utilizarlos en terapéuticas humanas. Los estudios sobre el uso del gen V^hhumano y del inocente ratón en dominios variables de anticuerpos revelan que la mayoría de los dominios variables de cadena pesada no derivan de cualquier gen V^husado de forma dominante o único concreto. Por otra parte, los estudios sobre la respuesta de los anticuerpos a ciertos antígenos ponen de manifiesto que en algunos casos una respuesta de anticuerpo particular muestra un uso sesgado de un gen V^hparticular en el repertorio de linfocito B después de la inmunización.

Aunque el repertorio V^hhumano es bastante diverso, se estima que la frecuencia esperada de uso de cualquier gen V^hdado, asumiendo una selección aleatoria de genes V^h, es aproximadamente 2 % (Brezinschek y col., 1995, Analysis of the Heavy Chain Repertoire of Human Peripheral B Cells Using Single-Cell Polymerase Chain Reaction, J. Immunol. 155:190-202). Pero el uso de V^hen linfocitos B periféricos en humanos está sesgado. En un estudio, la abundancia genética V funcional seguía el patrón V^h3 > V^h4 > V^h1 > V^h2 > V^h5 > V^h6 (Davidkova y col., 1997, Selective Usage of V^hGenes in Adult Human Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol. 45:62-73). Uno de los primeros estudios estimó que la frecuencia de uso de la familia VH3 era de aproximadamente 0,65, mientras que la frecuencia de uso de la familia V^h1 era aproximadamente 0,15; estas y otras observaciones sugieren que la complejidad de la línea germinal del repertorio VH humano no se refleja de forma precisa en los linfocitos B periféricos en humanos que tienen un repertorio VH de línea germinal normal, una situación que es similar a la observada en el ratón, es decir, la expresión del gen V^hes no estocástica (Zouali and These, 1991, Probing V^hGene-Family Utilization in Human Peripheral B Cells by In Situ Hybridization, J. Immunol.

146(8):2855-2864). Según un informe, el uso del gen V^hen humanos, de mayor a menor, es V^h3 > V^h4 > V^h1 > V^h5 > V^h2 > V^h6; las reorganizaciones en los linfocitos B periféricos revelan que el uso de la familia V^h3 es superior al esperado en base al número relativo de genes V^h3 de la línea germinal (Brezinschek y col., 1995). Según otro informe el uso de VH en humanos sigue el patrón VH3 > VH5 > VH2 > VH1 > VH4 > VH6, en base al análisis de linfocitos B inmunocompetentes pequeños periféricos activados por mitogen de hierba carmín (Davidkova y col., 1997, Selective Usage of V^hGenes in Adult Human B Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol. 45:62-73). Un informe afirma que entre los miembros de la familia VH3 usados con más frecuencia están 3-23, 3-30 y 3-54 (Brezinschek et al., 1995). En la familia V^h4, se determinó que los miembros 4-59 y 4-4b eran relativamente más frecuentes (Id.), al igual que 4-39 y 4-34 (Brezinscheck y col., 1997, Analysis of the Human V^hGene Repertoire, J. Clin. Invest. 99(10):2488-2501). Otros postulan que el repertorio de cadena pesada activada se inclina a favor de la expresión V^h5 mayor y la expresión V^h3 menor (Van Dijk-Hard and Lundkvist, 2002, Long-term kinetics of adult human antibody repertoires, Immunology 107:136-144). Otros estudios afirman que el gen VH usado con más frecuencia en el repertorio de humanos adultos es VH4-59, seguido de V^h3-23 y V^h3-48 (Arnaout et al., 2001, High-Resolution Description of Antibody Heavy-Chain Repertoires in Humans, PLoS ONE 6(8):108). Aunque los estudios de uso se basan en números de muestra relativamente bajos y por tanto muestran una gran varianza, tomados en conjunto, los estudios sugieren que la expresión genética V no es puramente estocástica. De hecho, los estudios con antígenos particulares han establecido que, en ciertos casos, la base es sólida a favor de ciertos usos y en contra de otros.

Con el paso del tiempo, resultó evidente que el repertorio observado de dominios variables humanos de cadena pesada en respuesta a determinados antígenos es muy restringido. Algunos antígenos están relacionados casi exclusivamente con anticuerpos neutralizantes que solo tienen determinados genes V^h, en el sentido de que los anticuerpos neutralizantes efectivos se derivan esencialmente de un único gen V^h. Así ocurre con algunos patógenos humanos clínicamente importantes.

Se han observado cadenas pesadas derivadas de V^h1-69 en diversos repertorios de anticuerpos de antígenos específicos que tienen importancia terapéutica. Por ejemplo, con frecuencia se ha observado el gen V^h1-69 en transcripciones de cadena pesada de un repertorio IgE de linfocitos de sangre periférica en niños pequeños con enfermedades atópicas (Bando et al., 2004, Characterization of V^h£ gene expressed in PBL from children with atopic diseases: detection of homologous V^h1-69 derived transcripts from three unrelated patients, Immunology Letters 94:99-106). También aparecen cadenas pesadas derivadas de V^h1-69 con un alto grado de hipermutación somática en los linfomas de células B (Perez et al., 2009, Primary cutaneous B-cell lymphoma is associated with somatically hypermutated immunoglobulin variable genes and frequent use of V^h1-69 and V^h4-59 segments, British Journal of Dermatology 162:611-618), mientras que se han observado algunas cadenas pesadas derivadas de V^h1-69 con secuencias esencialmente de línea germinal (es decir, con ninguna o casi ninguna hipermutación somática) entre los autoanticuerpos de pacientes con trastornos de la sangre (Pos et al., 2008, V^h1-69 germline encoded antibodies directed towards ADAMTS13 in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura, Journal of Thrombosis and Haemostasis 7:421-428).

Además, se ha determinado que anticuerpos neutralizantes contra antígenos virales como el VIH, la gripe y la hepatitis C (VHC) utilizan secuencias derivadas de V^h1-69 de línea germinal o mutadas somáticamente (Miklos et al., 2000, Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma immunoglobulin V^hgenes show frequent use of V1-69 with distinctive CDR3 features, Blood 95(12):3878-3884; Kunert et al., 2004, Characterization of molecular features, antigen-binding, and in vitro properties of IgG and IgM variants of 4E10, an anti-HIV type I neutralizing monoclonal antibody, Aids Research and Human Retroviruses 20(7):755-762; Chan et al., 2001, V^h1-69 gene is preferentially used by hepatitis C virus-associated B cell lymphomas and by normal B cells responding to the E2 viral antigen, Blood 97(4):1023-1026; Carbonari et al., 2005, Hepatitis C virus drives the unconstrained monoclonal expansion of VH1-69-expressing memory B cells in type II cryoglobulinemia: A model of infection-driven lymphomagenesis, Journal of Immunology 174:6532-6539; Wang and Palese, 2009, Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?, Nature Structural & Molecular Biology 16(3):233-234; Sui et al., 2009, Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses, Nature Structural & Molecular Biology 16(3):265-273; Marasca et al., 2001, Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use of V^h1-69 and V^h4-34 Segments in Hepatitis C Virus-Positive and Hepatitis C Virus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma, Am. J. Pathol. 159(1):253-261).

También se observa sesgo de uso del V^hen la respuesta inmunitaria humoral a la Haemophilus influenzae tipo b (Hib PS) en humanos. Algunos estudios apuntan que la familia V^hIII (la subfamilia VHIIIb en particular, V^h9.1) caracteriza de forma exclusiva la respuesta humoral humana a la Hib PS, con genes D y J diversos (Adderson et al., 1991, Restricted Ig H Chain V Gene Usage in the Human Antibody Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Immunol. 147(5):1667-1674; Adderson et al., 1993, Restricted Immunoglobulin V^hUsage and VDJ Combinations in the Human Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Clin. Invest. 91:2734-2743). Human J^hgenes also display biased usage; J^h4 and J^h6 are observed at about 38-41 % in peripheral B cells in humans (Brezinschek et al., 1995).

Se dice que el uso de V^hen humanos infectados por VIH-1 está sesgado contra el uso de V^h3 y a favor de las familias genéticas V^h1 y V^h4 (Wisnewski et al., 1996, Human Antibody Variable Region Gene Usage in HIV-1 Infection, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes & Human Retroviology 11(1):31-38). Sin embargo, el análisis de ADNc de la médula ósea de pacientes afectados revela un uso significativo de V^h3 no expresado en el repertorio de linfocitos B funcionales donde los Fabs que reflejan el uso de V^h3 presentan una neutralización in vitro efectiva del VIH-1 (Id.). Cabe proponer que la respuesta inmunitaria humoral a la infección por VIH-1 puede verse atenuada por la restricción V^h; por tanto, los animales no humanos modificados descritos en la presente memoria (no infectables por VIH-1) podrían ser útiles para generar dominios de anticuerpos neutralizantes derivados de genes V^hconcretos presentes en los animales modificados genéticamente descritos en la presente memoria, pero derivados de genes V^hdiferentes de los observados en el repertorio restringido de los humanos afectados.

En consecuencia, la capacidad de generar dominios variables de anticuerpos humanos de alta afinidad en ratones de V^hrestringido, p. ej. (restringido, p. ej. a un miembro de la familia V^h3 y polimorfos del mismo) inmunizados con VIH-1 podrían constituir un buen recurso para diseñar terapéuticas eficaces de neutralización del VIH-1 en humanos mediante una minería exhaustiva del repertorio restringido (p. ej. restringido a un miembro de la familia V^h3 o variantes del mismo) de dicho ratón inmunizado de este modo.

La restricción de la respuesta de los anticuerpos humanos a determinados patógenos podría reducir la probabilidad de obtener regiones variables de anticuerpos de humanos afectados que puedan servir como trampolín para diseñar anticuerpos neutralizantes de alta afinidad contra el patógeno. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria humana a la infección por VIH-1 está clónicamente restringida durante toda la infección por VIH-1 y en la progresión a SIDA (Muller et al., 1993, B-cell abnormalities in AIDS: stable and clonally restricted antibody response in HIV-1 infection, Scand. J. Immunol. 38:327-334; Wisnewski et al., 1996). Además, los genes V^hno están en general presentes en ninguna forma polimórfica en ningún individuo concreto; algunos individuos de algunas poblaciones poseen una variante, mientras que algunos individuos de otras poblaciones poseen una variante diferente. Por tanto, la disponibilidad de un sistema biológico restringido a un gen V^húnico y sus variantes en varias realizaciones permite disponer de una fuente de diversidad no explotada hasta ahora para generar regiones variables de anticuerpos (p. ej., dominios pesados y ligeros humanos análogos) basadas en un gen V^hrestringido. De este modo, en un caso, se describe un animal no humano modificado genéticamente que comprende una pluralidad de variantes polimórficas de no más de uno o no más de dos miembros de la familia del segmento génico V^hhumano. En un caso, los no más de uno o no más de dos segmentos génicos V^hestán operativamente unidos a uno o más segmentos génicos D^hhumanos, uno o más segmentos génicos J^hhumanos y un segmento génico de región constante humano o no humano. En un caso, la región constante está en un locus génico endógeno constante de inmunoglobulina no humana. En un caso, el animal no humano además comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de una secuencia de V^lhumano, p. ej. un segmento génico V^lhumano reorganizado o no reorganizado o una secuencia V^l/J^lhumana reorganizada. En un caso, la secuencia de ácido nucleico derivada de la secuencia V^lhumana está en un locus génico V^lno humano endógeno. En un caso, la secuencia de ácido nucleico derivada de la secuencia de V^lhumana está en un transgén. En un caso específico, el animal no humano es incapaz de expresar un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprenda a su vez un segmento génico V^lo J^lendógeno y comprenda no más de uno o no más de dos genes de cadena ligera que codifiquen dominios de V^lhumanos reorganizados (es decir, de no más de una o no más de dos secuencias V^l/J^lhumanas reorganizadas).

Los ratones modificados genéticamente que expresan regiones variables de cadena pesada humana con un uso del segmento génico V^hrestringido son útiles para generar un repertorio relativamente grande de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana de alta afinidad juncionalmente diversas, combinatoriamente diversas y somáticamente mutadas de un repertorio por lo demás restringido. Un repertorio restringido, en un caso, se refiere a una limitación predeterminada del número y/o identidad de genes de línea germinal que hace que el ratón no pueda formar un gen de cadena pesada reorganizada que se derive de un gen V que no sea un gen V preseleccionado. En los casos que emplean un gen V preseleccionado, pero no un gen D y/o J preseleccionado, el repertorio está restringido con respecto a la identidad del gen V pero no del gen D y/o J (p. ej., el repertorio consiste esencialmente en no más de uno o no más de dos segmentos génicos V^h(y/o polimorfos del mismo); y una pluralidad de segmentos génicos D y una pluralidad de segmentos génicos J). La identidad del gen V preseleccionado (y de cualquier gen D y/o J preseleccionado) no se limita a un gen V concreto.

Diseñando un ratón para que reorganice un gen V^húnico (presente como un segmento único o un conjunto de variantes) con una variedad de segmentos génicos D y/o J humanos (p. ej. segmentos D^hy J^h) se obtiene una máquina de permutación de diversidad juncional/diversidad combinatorial/hipermutación somática in vivo que puede utilizarse para iterar mutaciones que generan secuencias de región variable de cadena pesada reorganizadas (p. ej. V/D/J o V/J, según el caso). En un ratón de este tipo, el proceso de selección clónica opera para seleccionar regiones variables adecuadas que se enlacen a un antígeno de interés y basadas en un gen V^húnico preseleccionado (o variantes del mismo). Dado que los componentes de selección clónica del ratón están dedicados a la selección basada en el segmento génico V^húnico preseleccionado, se erradica en gran medida el ruido de fondo (p. ej. una gran variedad de dominios de V^hque no se enlazan a antígenos derivados de muchos segmentos génicos de línea germinal). Con una selección juiciosa del segmento génico V^h, se puede analizar un número relativamente mayor de anticuerpos de antígenos específicos seleccionados clónicamente en menos tiempo que con un ratón con una gran diversidad de segmentos V.

Al preseleccionar un repertorio limitado y restringir un ratón a un único segmento V, se obtiene un sistema para permutar uniones V/D/J a una velocidad que en varios casos es mayor que la observada en ratones que por lo demás tienen hasta 40 o más segmentos V que recombinar con regiones D y J. Al eliminar otros segmentos V se libera el locus para formar más combinaciones V/D/J para el segmento V preseleccionado que las observadas de otro modo. Gracias al mayor número de transcripciones que se generan con la recombinación del V preseleccionado con uno de una pluralidad de segmentos D y uno de una pluralidad de segmentos J se alimentan esas transcripciones en el sistema de selección clónica en forma de linfocitos pre-B y de este modo se dedica el sistema de selección clónica a ciclar linfocitos B que expresan la región V preseleccionada. De esta manera, el organismo puede analizar más reorganizaciones de la región V única derivada del segmento V preseleccionado que las que hubieran sido posibles en un periodo de tiempo concreto.

En varios casos, se describen ratones que aumentan la diversidad juncional de las recombinaciones V/D/J para la región V preseleccionada, porque todas o sustancialmente todas las recombinaciones del locus variable de cadena pesada de la inmunoglobulina será del segmento V preseleccionado y de los segmentos D y J que se implanten en dichos ratones. Por consiguiente, los ratones constituyen un procedimiento para generar una diversidad de segmentos CDR3 utilizando un repertorio genético V^hbase o restringido.

En un caso, se describe un animal no humano, en el que la población de linfocitos B del animal no humano expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que se derivan de no más de uno o no más de dos segmentos génicos V^hhumanos. En un caso, cada uno de los no más de uno o no más de dos segmentos génicos V^hhumanos se presentan en dos o más formas polimórficas. En un caso, el segmento génico V^hse presenta en tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 formas polimórficas. En un caso, el animal no humano expresa un dominio variable de cadena ligera humana derivado de un segmento génico V^lhumano.

En un caso, se describe un procedimiento para generar una población de linfocitos B en un animal no humano, en el que la población de linfocitos B expresa cadenas pesadas humanas derivadas de un segmento génico V^hhumano único de línea germinal y dos o más segmentos génicos D humanos y dos o más segmentos génicos J humanos; el procedimiento comprende una fase de inmunización de un animal no humano como se describe en la presente memoria con un antígeno de interés, y permite que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno de interés, en el que la respuesta inmunitaria comprende expresar las cadenas pesadas humanas en la superficie de los linfocitos B de la población de células B. En un caso, el animal no humano es un roedor (p. ej. un ratón o rata). En un caso, el segmento génico V^hhumano, el segmento génico D^hhumano y el segmento génico J^hhumano están enlazados operativamente a un gen de región constante no humano. En un caso, el animal no humano además comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio V^lhumano. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio V^lhumano está unida a una secuencia génica de región constante de cadena ligera no humana.

En un caso, se describe un procedimiento para crear un animal no humano que exprese una población de inmunoglobulina caracterizada por que las inmunoglobulinas tienen cadenas pesadas derivadas de una pluralidad de reorganizaciones de un segmento génico Vh humano único (o miembro de la familia genética Vh humano único) y uno de una pluralidad de segmentos génicos Dh y uno de una pluralidad de segmentos génicos Jh. En un caso, el segmento génico Vh humano es un segmento génico Vh1-69 humano. En un caso, el segmento génico VH humano es un segmento génico Vh1-2 humano.

En un caso, se describe un procedimiento para generar una población de dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana cuyos CDR1 y CDR2 se derivan del mismo segmento génico Vh de línea germinal, y cuyo CDR3 se deriva del segmento génico de línea germinal y dos o más segmentos D humanos y dos o más segmentos J humanos; el procedimiento comprende la inmunización de un animal no humano como se describe en la presente memoria con un antígeno de interés, y permite que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno de interés, en el que la respuesta inmunitaria comprende expresar los dominios variables de cadena pesada humana en el contexto de un dominio variable de cadena ligera. En un caso, el animal no humano es un roedor (p. ej. una rata o un ratón). En un caso, el segmento génico Vh humano, el segmento génico D humano y el segmento génico J humano están enlazados operativamente a un gen de región constante no humano. En un caso, el animal no humano además comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio VL humano. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VL humano está unida a una secuencia génica de región constante de cadena ligera no humana.

En un caso, se describe un animal no humano modificado genéticamente, en el que el animal no humano es incapaz de expresar un dominio Vh no humano, y en el que cada cadena pesada de inmunoglobulina de la población de cadenas pesadas expresadas en el animal comprende un dominio Vh humano que comprende un CDR1 y un CDR2 que son idénticos salvo por una o varias hipermutaciones somáticas, y en el que la población de cadenas pesadas comprende una pluralidad de secuencias CDR3 derivada de una pluralidad de reorganizaciones con una pluralidad de segmentos D y J.

En un caso, se describe un sistema biológico para generar variación en la identidad y longitud del CDR3, que comprende un animal no humano modificado genéticamente como se describe en la presente memoria, en el que el animal no humano comprende no más de uno o no más de dos segmentos génicos Vh humanos, y dos o más segmentos génicos D y uno o más segmentos génicos J, en el que el animal no humano además comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humanizado. En varios casos, el animal no humano en respuesta a la inmunización con un antígeno de interés genera una respuesta inmunitaria que comprende la expresión de una población de cadenas pesadas de inmunoglobulina que se caracteriza porque cada cadena pesada tiene unos CDR1 y CDR2 que solo se diferencian por su hipermutación somática, y unos CDR3 que se diferencian por su reorganización e hipermutación somática. En un caso, el sistema biológico es un ratón modificado genéticamente como se describe en la presente memoria. En un caso, el segmento génico Vh humano y el segmento génico Vl humano se encuentran respectivamente en los locus de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera endógenos del ratón. En un caso, uno o más de los segmentos génicos Vh humanos y el segmento génico Vl humanos están en transgenes (es decir, en un locus que no es un locus de inmunoglobulina endógeno).

Ejemplos

Se incluyen los siguientes ejemplos con el fin de describir a al experto en la técnica cómo elaborar y utilizar procedimientos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Salvo que se indique lo contrario, la temperatura se indica en grados centígrados y la presión es atmosférica o casi atmosférica. En los ejemplos precedentes, cuando se indica el uso de equipos y reactivos de diversos proveedores, todos los procedimientos se han llevado a cabo según las especificaciones del fabricante.

Ejemplo 1 Construcción de loci de cadena pesada restringidos

Se creó un locus de cadena pesada humana diseñado de manera única que contiene un segmento génico Vh humano único situado aguas arriba de todos los segmentos génicos Dh y Jh por medio de una serie de reacciones de recombinación homólogas en células bacterianas (BHR) utilizando ADN cromosómico artificial bacteriano (BAC). Se construyeron varios constructos recombinantes para la creación de un único locus de cadena pesada con Vh utilizando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véase, p. ej. US-6.586.251 y Valenzuela, D.M. e t al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with highresolution expression analysis. N a tu re B io te c h n o lo g y 21(6): 652-659).

Construcción de un locus de cadena pesada restringido de V^h1-69 humano. Dicho sucintamente, se realizaron cuatro modificaciones utilizando ADN BAC humano para crear un constructo recombinante con un segmento génico Vh1-69 con todos los segmentos Dh y Jh humanos (FIG. 1). En la primera modificación, un BAC humano modificado que contenía múltiples segmentos génicos Vh distales (5') humanos, incluido el Vh1-69, un casete de selección de higromicina aguas arriba y un brazo de homología de ratón de 5' se recombinó con un segundo casete de espectinomicina, que también contenía una secuencia de señales de recombinación modificada (RSS; BHR 1, FIG. 1, arriba a la izquierda). Esta secuencia de señales de recombinación modificada (RSS) introdujo dos mutaciones puntuales (T-A y G-A) en la región RSS 3' del gen Vh1-69 humano que cambiaba el nonámero RSS a la secuencia de consenso óptima. De este modo, la primera modificación (BHR 1) creó un fragmento genómico que contenía el segmento génico Vh1-69 humano con una RSS 3' modificada, un punto de restricción AsiSI único situado aproximadamente 180 pb aguas abajo de la RSS y un casete de espectinomicina (FIG. 1, centro a la izquierda).

La segunda modificación (BHR 2) incluía el uso de un casete de neomicina (Neo) flanqueado por puntos Frt para eliminar el casete de higromicina y los segmentos génicos Vh humanos de 5' aguas arriba del segmento génico Vh1-69. Esta modificación se recombinó 5' con el segmento génico Vh1-69 humano para dejar intactos aproximadamente 8,2 kb de la región promotora del Vh1-69 humano y del brazo de homología de ratón de 5' (FIG. 1, abajo a la izquierda).

La tercera modificación (BHR 3) incluía otro casete de espectinomicina flanqueado por puntos PI-SceI de 5' y puntos AsiSI de 3' diseñados de manera única recombinados con un fragmento genómico humano que contenía los tres primeros segmentos funcionales génicos Vh humanos y los segmentos génicos Dh y Jh humanos (FIG. 1, centro a la derecha). El fragmento genómico humano se recombinó anteriormente con un casete de neomicina y contenía brazos de homología de 5' y 3' que contenían la secuencia genómica de ratón 5' y 3' del locus de cadena pesada endógeno, incluido el potenciador intrónico de 3' y el gen IgM. Esta modificación eliminó la secuencia genómica de ratón de 5' y los segmentos génicos Vh humanos, dejando unos 3,3 kb de la región intergénica Vh-Dh aguas arriba del segmento génico Dh1-1 humano, todos los segmentos Dh y Jh humanos, y el fragmento genómico de ratón de 3' que contenía el potenciador intrónico de 3' y el gen IgM (FIG. 1, abajo a la derecha).

La cuarta modificación se consiguió empleando los puntos PI-SceI y AsiSI únicos (anteriormente descritos) para ligar los dos BAC modificados de BHR 2 y BHR 3 (FIG. 1, abajo en el centro), con lo que se obtuvo el constructo recombinante final. El constructo recombinante final para la creación de un locus de cadena pesada modificado con un segmento génico Vh humano único y todos los segmentos génicos Dh y Jh humanos en células ES contenía, de 5' a 3', un brazo de homología de 5' que contenía aproximadamente 20 de la secuencia genómica de ratón aguas arriba del locus de cadena pesada endógeno, un punto Frt de 5', un casete de neomicina, un punto Frt de 3', aproximadamente 8,2 kb del promotor de Vh1-69 humano, el segmento génico Vh1-69 humano con una RSS de 3' modificada, 27 segmentos génicos Dh humanos, seis segmentos de Jh humano, y un brazo de homología de 3' con aproximadamente 8 kb de secuencia genómica de ratón aguas abajo de los segmentos génicos Jh de ratón incluido el potenciador intrónico de 3' y el gen IgM (FIG. 1, abajo). El vector objetivo de Vh1-69 humano (Id. de sec. n.°: 3) se linealizó y electroporó en las células ES de ratón heterocigotas para eliminar el locus de cadena pesada endógeno.

Ejemplo de referencia: Construcción de un locus de cadena pesada restringido de V^h1-2 humano. Siguiendo las etapas antes descritas, se emplean otros segmentos génicos Vh polimórficos en el contexto de regiones constantes de cadena pesada del ratón para construir una serie de ratones que tienen un número restringido de segmentos V de cadena pesada de inmunoglobulina (p. ej., 1, 2, 3, 4 o 5), en el que los segmentos V son variantes polimórficas de un miembro de la familia genética V. Los segmentos polimórficos ejemplaresgénicos Vh se derivan de segmentos génicos Vh humanos, incluidos, p. ej. Vh1-2, Vh2-26, Vh2-70 y Vh3-23. Dichos segmentos génicos Vh humanos se obtienen, p. ej. mediante síntesis de novo (p. ej., Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA) utilizando secuencias disponibles en bases de datos publicadas. Así, los fragmentos de ADN que codifican cada gen Vh se generan en algunos casos de manera independiente para incorporarse a vectores objetivo, como se describe en la presente memoria. De esta manera, se diseñan múltiples locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificada que comprenden un número restringido de segmentos génicos Vh en el contexto de regiones constantes de cadena pesada de ratón. La FIG. 2 presenta una estrategia recombinante ejemplar para crear un locus de cadena pesada humanizado restringido con un segmento génico Vh1-2 humano, 27 segmentos génicos Dh humanos y seis segmentos génicos Jh humanos.

En resumen, un clon BAC humano modificado que contiene tres segmentos génicos Vh humanos (Vh6-1, Vh1-2, Vh1-3), 27 segmentos génicos Dh humanos y seis segmentos génicos Jh humanos (véase documento USSN 13/404,075; presentado el 24 de febrero de 2012) se utiliza para crear un locus de cadena pesada humanizada restringida que contiene un segmento génico Vh1-2 humano. Este clon BAC modificado enlaza funcionalmente los segmentos génicos de cadena pesada humana anteriormente mencionados con el amplificador intrónico de ratón y la región constante de IgM. El locus de cadena pesada basado en Vh1-2 humano restringido se consigue mediante dos recombinaciones homólogas utilizando el clon BAC humano modificado descrito anteriormente.

Para la primera recombinación homóloga, 205 pb del segmento génico Vh6-1 humano (desde aproximadamente 10 pb aguas arriba (5') del codón iniciador Vh6-1 en el exón 1 hasta aproximadamente 63 pb aguas abajo (3') del inicio del exón 2) del clon BAC humano modificado se suprime mediante recombinación homóloga bacteriana utilizando un casete de espectinomicina (aadA) flanqueado por sitios de restricción PI-SceI únicos (FIG. 2, BHR 1). Esto permite la posterior eliminación del casete de aadA sin alterar otros segmentos génicos humanos dentro del locus de cadena pesada restringida.

Para la segunda recombinación homóloga, el extremo 5' del clon humano modificado BAC que incluye el segmento génico Vh1-3 humano completo y aproximadamente 60 pb aguas abajo 3' del segmento génico se suprime mediante recombinación homóloga utilizando un casete de higromicina que contiene sitios de restricción 5' AsiSI y 3' AscI flanqueadores (FIG. 2, BHR 2). Como se ha descrito anteriormente, el casete de espectomicina se elimina opcionalmente tras la confirmación del vector objetivo final que incluye la deleción de los dos segmentos génicos Vh humanos que flanquean el segmento génico Vh1-2 humano (FIG. 2, abajo). Se describe un vector objetivo Vh1-2 humano a modo de ejemplo en el Id. de sec. n.°: 70.

Emplear segmentos génicos Vh polimórficos de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringida representa un planteamiento novedoso para generar anticuerpos, poblaciones de anticuerpos y poblaciones de linfocitos B que expresan anticuerpos que tienen cadenas pesadas con diversos CDR derivados de un segmento génico Vh humano único. Explotar la maquinaria de hipermutación somática del animal hospedador junto con la asociación combinatoria con dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana reorganizada da lugar a la construcción de cadenas pesadas únicas y de pares Vh/Vl únicos que expanden el repertorio inmunológico de los animales modificados genéticamente y mejoran su utilidad como plataforma de siguiente generación para elaborar terapéuticas humanas, especialmente útiles como plataforma para elaborar anticuerpos neutralizantes específicos para patógenos humanos.

Por consiguiente, utilizar la estrategia descrita anteriormente para incorporar segmentos génicos Vh adicionales y/u otros segmentos génicos Vh polimórficos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón permite la generación de nuevos repertorios de anticuerpos para su uso en la neutralización de patógenos humanos que, de lo contrario, podrían invadir eficazmente el sistema inmunitario hospedador.

Las células ES diana anteriormente descritas se utilizaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la fase de 8 células mediante el procedimiento VELOCIMOUSE® (sup ra ). Los ratones portadores de un locus de cadena pesada humanizada que contienen un segmento génico Vh único, todos los segmentos génicos Dh y Jh humanos enlazados operativamente a los genes de región constante de inmunoglobulina de ratón se identificaron mediante genotipado utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela y col., sup ra ) que detectaba la presencia del casete de neomicina, el segmento génico Vh humano y una región dentro de los segmentos génicos DH y JH humanos, así como secuencias de cadena pesada endógena. La Tabla 4 describe los cebadores y las sondas utilizados en este ensayo para confirmar los ratones que albergan un locus de cadena pesada restringida que contienen un segmento génico Vh1-69 humano único, 27 segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos.

Los ratones portadores de un locus de cadenas pesadas modificado que contiene un segmento génico Vh humano único pueden criarse para crear una cepa de ratones supresores de FLPe (véase, p. ej., Rodriguez, C.I. y col. (2000) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. N a tu re G e n e tics 25: 139 140) con el fin de eliminar cualquier casete de neomicina Frt'ed introducido por el vector objetivo que no se ha eliminado, p. ej., en la etapa de células ES ni en el embrión. Opcionalmente, el casete de neomicina queda retenido en los ratones.

Las crías se genotipan y una cría heterocigoto para un locus de cadena pesada humanizada que contiene un segmento génico Vh humano único, todos los segmentos Dh y Jh humanos enlazados operativamente a genes constantes de inmunoglobulina de ratón endógena se selecciona para caracterizar el repertorio de cadena pesada de inmunoglobulina.

Tabla 4

Nombre (Región Id. de detectada)_____ Secuencia (5'-3') sec. n.°: hyg (casete de Hacia adelante: TGCGGCCGAT CTTAGCC 4 higromicina) Inverso: TTGACCGATT CCTTGCGG 5

Sonda: ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C 6

neo (casete de Hacia adelante: GGTGGAGAGG CTATTCGGC 7 neomicina) Inverso: GAACACGGCG GCATCAG 8

Sonda: TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG 9

hIgH9T (secuencia Hacia adelante: TCCTCCAACG ACAGGTCCC 10 genómica Dh - Jh Inverso: GATGAACTGA CGGGCACAGG 11 humana) Sonda: TCCCTGGAAC TCTGCCCCGA CACA 12

77h3 (segmento Hacia adelante: CTCTGTGGAA AATGGTATGG AGATT 13 génico Vh1-69 Inverso: GGTAAGCATA GAAGGTGGGT ATCTTT 14 humano) Sonda: ATAGAACTGT CATTTGGTCC AGCAATCCCA 15

mIgHA7 (secuencia Hacia adelante: TGGTCACCTC CAGGAGCCTC 16 genómica Dh - Jh de Inverso: GCTGCAGGGT GTATCAGGTG C 17 ratón) Sonda: AGTCTCTGCT TCCCCCTTGT GGCTATGAGC 18 88710T (secuencia Hacia adelante: GATGGGAAGA GACTGGTAAC ATTTGTAC 19 genómica 3' Vh de Inverso: TTCCTCTATT TCACTCTTTG AGGCTC 20 ratón) Sonda: CCTCCACTGT GTTAATGGCT GCCACAA 21 mIgHd10 (secuencia Hacia adelante: GGTGTGCGAT GTACCCTCTG AAC 22 genómica 5' Vh de Inverso: TGTGGCAGTT TAATCCAGCT TTATC 23 ratón) Sonda: CTAAAAATGC TACACCTGGG GCAAAACACC TG 24 mIgHp2 (secuencia Hacia adelante: GCCATGCAAG GCCAAGC 25 genómica Jh de ratón) Inverso: AGTTCTTGAG CCTTAGGGTG CTAG 26

Sonda: CCAGGAAAAT GCTGCCAGAG CCTG 27

Ejemplo 2 Caracterización de ratones que expresan cadenas pesadas derivadas de un segmento génico V^hhumano único

Ratones homocigóticos para un segmento génico Vh humano único en el locus de cadena pesada endógena como se describe en el ejemplo 1 se evaluaron con respecto a la expresión y el desarrollo de linfocitos B utilizando citrometría de flujo.

En resumen, se recolectaron bazos y médulas óseas de tipo natural (n=3 por grupo; de seis semanas de edad, machos y hembras) y ratones homocigóticos para un segmento génico Vh humano único, todos los segmentos génicos Dh y Jh humanos enlazados operativamente con regiones constantes de cadena pesada de ratón. Los glóbulos rojos de los bazos se lisaron con un tampón para lisis ACK (Lonza Walkersville) y seguidamente se lavaron con un medio RPMI completo.

Citometría de flujo . Se incubaron células (1x106) con CD16/CD32 anti-ratón (2.4G2, BD PHARMINGEN™) en hielo durante 10 minutos, seguidamente se marcaron con los siguientes paneles de anticuerpos durante 30 minutos en hielo. Panel de médula ósea: FITC-CD43 anti-ratón (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), APC-eFluor 780-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®). Panel de médula ósea y bazo: FITC-IgK anti-ratón (187.1, BD Biosciences), PE-IgA (RML-42, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), Pacific Blue-CD3 (17A2, BIOLEGEND®), APC-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-H7-CD19 (ID3, BD Biosciences). Médula ósea: linfocitos B inmaduros (B220intIgM+), linfocitos B maduros (B220hiIgM+), linfocitos pro-B (CD19+ckit+CD43+), linfocitos pre-B (CD19+ckit-CD43- ), linfocitos B IgK+ inmaduros (B220intIgM+IgK+IgA- ), linfocitos B IgA+ inmaduros (B220intIgM+IgK- IgA+), linfocitos B IgK+ maduros (B220hiIgM+IgK+IgA- ), linfocitos B IgA+ maduros (B220hiIgM+IgK- IgA+). Bazo: linfocitos B (CD19+), linfocitos B maduros (CD19+IgDhiIgMint), linfocitos B transicionales/inmaduros (CD19+IgDintIgMhi). Médula ósea y bazo: linfocitos B IgK+ (CD19+IgK+IgA-), linfocitos B IgA+ (CD19+IgK- IgA+).

Tras la tinción, las células se lavaron y se fijaron en formaldehído al 2 %. La adquisición de datos se realizó con un citrómetro de flujo LSRII y se analizaron con el software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). Los resultados para el compartimento esplénico se muestran en las Figs.3, 4A y 5 - 7. Los resultados para el compartimento de médula ósea se muestran en las Figs. 4B y 8 - 11B.

Expresión del V^hhumano. La expresión del segmento génico V^h1-69 humano se determinó para ratones heterocigóticos y homocigóticos para un segmento génico Vh1-69 humano, todos los segmentos génicos Dh y Jh humanos enlazados operativamente con regiones constantes de cadena pesada de ratón mediante un ensayo PCR cuantitativo utilizando sondas TAQMAN®.

En resumen, se purificaron linfocitos B CD19+ de los bazos de grupos de ratones (n=3 por grupo) utilizando microesferas CD19 de ratón (Miltenyi Biotec) según las especificaciones del fabricante. Se purificó el ARN total utilizando el kit RNEASY™ Mini (Qiagen) y se eliminó el ARN genómico utilizando un tratamiento en columna de DNasa sin RNasa (Qiagen). Aproximadamente 200 ng de ARNm se transcribió a la inversa en ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc First Stand (Invitrogen), seguidamente se amplificó con TAQMAN® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) utilizando el sistema de detección de secuencia ABI 7900 (Applied Biosystems). Se utilizaron combinaciones únicas de cebador/sonda para determinar específicamente la expresión de las cadenas pesadas derivadas de Vh1-69 humano (Tabla 5). La expresión relativa se normalizó respecto a la región constante k de ratón (mCK). Los resultados se muestran en la Fig 12.

Tabla 5

Nombre Secuencia (5'-3') Id. de sec. n.°:

Sentido: AACTACGCAC AGAAGTTCCA GG 28 hIgHV1-69 Antisentido: GCTCGTGGAT TTGTCCGC 29

Sonda: CAGAGTCACG ATTACC 30

Sentido: TGAGCAGCAC CCTCACGTT 31

mCK Antisentido: GTGGCCTCAC AGGTATAGCT GTT 32

Sonda: ACCAAGGACG AGTATGAA 33

Ejemplo 3 Respuesta inmunitaria humoral en ratones que expresan cadenas pesadas derivadas de un segmento génico V^hhumano único

La respuesta inmunitaria humoral se determinó para ratones homocigóticos para loci génicos variables de cadena pesada y ligera k humanas (Hk) y ratones homocigóticos para un segmento génico Vh humano único, todos los segmentos génicos Dh y Jh humanos operativamente enlazados a regiones constantes de cadena pesada de ratón (1hVH HO) mediante inmunización comparativa utilizando un receptor de superficie celular humano (antígeno A).

Inmunización. Se recogió suero de los grupos de ratones antes de la inmunización con el antígeno anterior. Se administró antígeno (2,35 pg cada uno) en una inmunización de sensibilización inicial mezclado con 10 pg de oligonucleótido CpG (Invivogen) y 25 pg de Adju-phos (Brenntag) como adyuvantes. El inmunógeno se administró a través de la almohadilla plantar (f.p.) en un volumen de 25 pl por ratón. A continuación, los ratones se estimularon vía f.p. con 2,3 pg de antígeno junto con 10 pg de CpG y 25 pg de Adju-Phos como adyuvantes los días 3, 6, 11, 13, 17 y 20 hasta alcanzar un total de seis inyecciones. Se sacó sangre a los ratones los días 15 y 22 después de la cuarta y sexta inyección, respectivamente, y se analizaron los antisueros en cuanto a los títulos de anticuerpos frente al antígeno A.

Los títulos de anticuerpos se determinaron en los sueros de los ratones inmunizados utilizando un ensayo ELISA. Placas de microtitulación de noventa y nueve pocillos (Thermo Scientific) se recubrieron con antígeno A (1 pg/ml) en una solución salina con tampón fosfato (PBS, Irvine Scientific) durante la noche a 4 °C. El siguiente día las placas se lavaron con una solución salina con tampón fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 % (PBS-T, Sigma-Aldrich) cuatro veces utilizando un lavaplacas (Molecular Devices). Entonces, las placas se bloquearon con 250 pl de albúmina de suero bovino al 1 % (BSA, Sigma-Aldrich) en PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron cuatro veces con PBS-T. Los sueros de ratones inmunizados y los sueros preinmunización se diluyeron en serie con un factor de diez en PBS-T BSA al 0,1 % empezando con 1:100 y se añadieron a las placas bloqueadas por duplicado y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Los últimos dos pocillos se dejaron vacíos para utilizarlos como control de anticuerpo secundario. Las placas se volvieron a lavar cuatro veces con PBS-T en un lavaplacas. Se añadió una dilución 1:5000 de anticuerpo secundario conjugado de peroxidasa de rábano picante IgG-Fc anti-ratón de cabra (HRP, Jackson Immunoresearch) a las placas y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se volvieron a lavar ocho veces con PBS-T y se revelaron utilizando TMB/H2O2 como sustrato. El sustrato se incubó durante veinte minutos y la reacción se paró con H2SO41 N (VWR). Las placas se leyeron en un espectrómetro (Victor, Perkin Elmer) a 450 nm. Los títulos de anticuerpos se calcularon utilizando GRAPHPAD PRISM™ (GraphPad Software, Inc).

El título de suero se calculó como dilución de suero dentro del rango de titulación experimental a la señal del equivalente de enlace del antígeno hasta dos veces por encima de la señal de fondo. El título de anticuerpos para la respuesta inmunitaria humoral frente a un receptor de superficie celular humano (antígeno A) se presenta en la FIG. 19.

En un experimento similar, la respuesta inmunitaria humoral se determinó para ratones homocigóticos para loci genéticos variables de cadena pesada y ligera k humanas (Hk) y ratones homocigóticos para un segmento génico Vh humano único, todos los segmentos génicos Dh y Jh humanos operativamente enlazados a regiones constantes de cadena pesada de ratón (1hVH HO) mediante inmunización comparativa utilizando vacunas víricas de gripe FLUVIRIN® (Novartis Vaccines) y FLUMIST® (MedImmune LLC).

En resumen, se recogió suero de los grupos de ratones antes de la inmunización con el antígeno anterior (como se ha descrito anteriormente). Ratones (n=5) homocigóticos para un segmento génico Vh humano único (Vh1-69), todos los segmentos génicos Dh y Jh humanos operativamente enlazados a regiones constantes de cadena pesada de ratón (1hVH HO) se inmunizaron por vía intranasal (i.n .) con FLUMIST® (vacuna antigripal atenuada viva) a 1/3 de la dosis normal/ratón. Una dosis normal de FLUMIST® contiene 1065'75 UFF (unidades de focos fluorescentes) de vacuna antigripal atenuada viva. Por lo tanto, cada ratón se estimuló con 70 pl de FLUMIST® el día 1 seguido por administraciones i.n. los días 3, 6, 11, 13, 17, 20 hasta un total de 6 administraciones. En esta inmunización no se utilizaron coadyuvantes. Se sacó sangre a los ratones los días 15 y 22 después de la 4a y 6a administración, respectivamente, y se analizaron los antisueros en cuanto a los títulos de anticuerpos frente a FLUMIST® (como se ha descrito anteriormente).

De un modo similar, en las inmunizaciones con FLUVIRIN® se recogió serum preinmunización de ratones antes del inicio de la inmunización. Ratones (n=5) homocigóticos para un segmento génico Vh humano único (Vh1-69), todos los segmentos génicos Dh y Jh humanos operativamente enlazados a regiones constantes de cadena pesada de ratón (1hVH HO) se inmunizaron con FLUVIRIN® (vacuna antigripal inactivada trivalente) a través de la almohadilla plantar (f.p .) con 0,75 |jg cada uno de hemaglutinina/ratón/inyección. Los ratones se estimularon el día 1 seguido por administraciones f.p. los días 3, 6, 11, 13, 17, 20 hasta un total de 6 administraciones. En esta inmunización no se utilizaron coadyuvantes. Se sacó sangre a los ratones los días 15 y 22 después de la 4a y 6a administración, respectivamente, y se analizaron los antisueros para los títulos de anticuerpos frente a FLUVIRIN® (como se ha descrito anteriormente).

El título de suero se calculó como dilución de suero dentro del rango de titulación experimental a la señal del equivalente de enlace del antígeno hasta dos veces por encima de la señal de fondo. El título de anticuerpos para la respuesta inmunitaria humoral frente a FLUMIST® y FLUVIRIN® se presenta en la FIG. 20.

Como se muestra en este ejemplo, los títulos de anticuerpos generados en ratones 1hVH HO fueron comparables a aquellos generados en ratones que tienen una pluralidad de segmentos génicos Vh humanos (Hk) tanto para un receptor de superficie celular humano como para un antígeno vírico (p. ej., gripe). Por consiguiente, los ratones que tienen loci de cadena pesada de inmunoglobulina restringida a un segmento génico Vh único son capaces de desarrollar una respuesta inmunitaria robusta frente a antígenos de un modo comparable a los ratones que tienen loci de cadena pesada de inmunoglobulina que contiene una pluralidad de segmentos génicos Vh humanos (p. ej., 80 Vh).

Ejemplo 4 Análisis del uso génico de anticuerpos y longitud de la CDR3 en ratones que tienen un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringida

Esplenocitos recolectados de ratones homocigóticos para un segmento génico Vh humano único en el locus de cadena pesada endógena y homocigóticos para una sustitución de los loci variables de cadena ligera k endógena con loci variables de cadena ligera k humana inmunizados con un receptor de superficie celular humano (antígeno A) se analizaron en cuanto al uso de segmento génico de cadena pesada y ligera mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) en ARNm de linfocitos B esplénicos.

En resumen, se recolectaron bazos y se homogeneizaron en 1xPBS (Gibco) utilizando portaobjetos de cristal. Las células se granularon en una centrífuga (500 xg durante 5 minutos), y los glóbulos rojos se lisaron en un tampón para lisis ACK (Gibco) durante 3 minutos. Las células se lavaron una vez con PBS y se filtraron utilizando un filtro para células de 0,7 jm . Los linfocitos B se aislaron de las células del bazo utilizando una selección positiva magnética MACS para CD19 (Miltenyi Biotec). El ARN total se aisló de los linfocitos B granulados utilizando el kit RNeasy Plus Kit (Qiagen). El ARNm PolyA+ se aisló del ARN total utilizando el minikit Oligotex® Direct mRNA (Qiagen).

Se preparó ADNc de cadena doble a partir de ARNm de linfocitos B esplénicos mediante 5'-RACE utilizando el kit SMARTer™ Pico cDNA Synthesis Kit (Clontech) con la sustitución de la transcriptasa inversa suministrada y los dNTP por Superscript® II y dNTP (Invitrogen). Se amplificaron los repertorios de anticuerpos Vh y Vk a partir de ADNc utilizando cebadores específicos para las regiones constantes de gM, IgG o IgK y el cebador 5'-RACE SMARTer™ (Tabla 6). Los productos de PCR se purificaron utilizando el kit QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen). Se realizó una segunda ronda de PCR utilizando el mismo cebador 5'-RACe y un cebador 3' anidado específico para las regiones constantes de IgM, IgG o IgK (Tabla 7). Los productos de p Cr de la segunda ronda se purificaron utilizando el sistema SizeSelect™ E-Gel® (Invitrogen). Se realizó una tercera PCR con cebadores que añadieron 454 adaptadores y códigos de barras. Se purificaron los productos de PCR de la tercera ronda utilizando esferas Agencourt® AMPure® XP Beads (Beckman Coulter). Los productos de PCR purificados se cuantificaron mediante SYBR® qPCR utilizando un kit de cuantificación KAPA Library Quantification Kit (KAPA Biosystems). Las bibliotecas obtenidas se sometieron a PCR en emulsión (PCRem) utilizando un kit 454 GS Junior Titanium Series Lib-A emPCR Kit (Roche Diagnostics) y a secuenciación bidireccional utilizando un instrumento Roche 454 GS Junior según con las especificaciones del fabricante.

Análisis bioinformático. Las 454 secuencias se clasificaron en base a la coincidencia perfecta del código de barras de muestra y se recortaron por cuestiones de calidad. Las secuencias se marcaron en base al alineamiento de las secuencias de inmunoglobulina reorganizada respecto a la base de datos del segmento V(D)J de la línea germinal humana utilizando la instalación local de Igblast (NCBI, v2.2.25+). Una secuencia se marcó como ambigua y se eliminó del análisis cuando se detectaron múltiples mejores coincidencias con puntuación idéntica. Se desarrolló una serie de scripts PERL para analizar los resultados y almacenar datos en la base de datos mysql. Se definió una región CDR3 entre el codón C conservado y el motivo FGXG para cadenas ligeras y el motivo WGXG para cadenas pesadas. Se determinó la longitud de CDR3 utilizando solo anticuerpos productivos. A partir de las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácido predichas de los anticuerpos, se identificó el uso génico para las secuencias iniciadas por IgM (15.650), iniciadas por IgG (18.967) e iniciadas por IgK (26.804). Los resultados se muestran en la Tabla 8, la Tabla 9, la FIG. 21 y la FIG. 22.

La Tabla 8 presenta el porcentaje de segmentos génicos Dh y Jh humanos observados utilizados entre las secuencias de región variable de cadena pesada derivadas de Vh1-69 iniciadas por IgM (15.650 secuencias) e iniciadas por IgG (18.967 secuencias). Los segmentos génicos Dh4-4/Dh4-11 humano y Dh5-5/Dh5-18 humano se presentan juntos en la Tabla 8 debido a la identidad idéntica de la secuencia entre los respectivos pares de segmentos génicos Dh. La Tabla 9 presenta el porcentaje de segmentos génicos Vk y Jk humanos observados entre el cognado de cadenas ligeras (26.804 secuencias) con regiones variables de cadena pesada derivadas de Vh1-69. Los porcentajes de las tablas 8 y 9 representan valores redondeados y en algunos casos puede que no sumen un total de 100 %.

En la FIG. 21 se muestra la longitud de aminoácidos de la región CDR3 de las cadenas pesadas derivadas de Vh1-69 iniciadas por IgM. En la FIG. 22 se muestra la longitud de aminoácidos de la región CDR3 de las cadenas pesadas derivadas de Vh1-69 iniciadas por IgG.

Como se muestra en las tablas 8 y 9, los ratones según la invención generan anticuerpos específicos al antígeno que contienen cadenas pesadas derivadas de Vh1-69, lo cual demuestra una variedad de reorganizaciones de un segmento génico Vh1-69 humano con una variedad de segmentos Dh humanos y segmentos Jh humanos. Además, los anticuerpos específicos frente al antígeno contienen cognados de cadenas ligeras humanas que contienen dominios Vk humanos que resultan de una variedad de reorganizaciones de segmentos génicos Vk y Jk humanos.

Tabla 6

Cebador Secuencia (5'-3')

3' Cg1 exterior GGAAGGTGTG CACACCGCTG GAC (Id. de sec. n.° 71)

3' Cg2ac exterior GGAAGGTGTG CACACCACTG GAC (Id. de sec. n.° 72)

3' Cg2b exterior GGAAGGTGTG CACACTGCTG GAC (Id. de sec. n.° 73)

3' Cg3 exterior AGACTGTGCG CACACCGCTG GAC (Id. de sec. n.° 74)

3' mIgM CH1 exterior TCTTATCAGA CAGGGGGCTC TC (Id. de sec. n.° 75)

3' mIgKC exterior AAGAAGCACA CGACTGAGGC AC (Id. de sec. n.° 76)

Tabla 7

Cebador Secuencia (5'-3')

3' mIgG1/2b CH1 interior AGTGGATAGA CWGATGGGGG TG (Id. de sec. n.° 77)

3' mIgG2a/2c CH1 interior AGTGGATAGA CCGATGGGGC TG (Id. de sec. n.° 78)

3' mIgG3 CH1 interior AAGGGATAGA CAGATGGGGC TG (Id. de sec. n.° 79)

3' mIgM CH1 interior GGAAGACATT TGGGAAGGAC TG (Id. de sec. n.° 80)

3' mIgKC-2 interior GGAAGATGGA TACAGTTGGT GC (Id. de sec. n.° 81)

Tabla 8

DH humano IgM IgG JH humano IgM IgG

1-1 1,2 6,0 1 7,5 1,5

1-7 39,9 9,0 2 3,3 4,2

1-14 0,5 2,3 3 22,2 12,8

1-20 2,3 1,4 4 51,5 36,4

1-26 3,5 5,7 5 10,5 9,5

2-2 1,1 3,2 6 4,9 29,4

2-8 0,7 0,6

2-15 0,3 1,2

2-21 0,7 0,3

3-3 6,3 5,2

3-9 0,6 0,6

3-10 0,9 10,3

3-16 0,9 2,0

3-22 5,1 2,7

4-4/4-11 1,5 4,0

4-17 1,5 4,7

4- 23 11,5 2,4

5- 12 1,1 1,8

5-5/5-18 1,3 3,2

5- 24 0,3 3,3

6- 6 1,8 4,5

6-13 6,1 7,4

6-19 3,0 5,1

6- 25 0,1 0,6

7- 27 3,3 7,3

Tabla 9

Vk humano % observado Jk humano % observado

1-5 3,4 1 28,1

1-6 1,3 2 25,3

1-8 0 3 12,1

1-9 1,3 4 22,5

1-12 1,0 5 11,1

1-13 0

1-16 2,5

1-17 3,6

1-22 0

1-27 0,5

1-32 0

1-33 14,3

1-35 0

1-37 0

1-39 1,6

2-4 0

2-10 0

2-14 0

2-18 0

2-19 0

2-23 0

2-24 0,7

2-26 0

2-28 0

2-29 0

2-30 1,9

2-36 0

2-38 0

2-40 1,5

3-7 0

3-11 2,7

3-15 3,9

3-20 41,2

3-25 0

3-31 0

3-34 0

4-1 13,2

5-2 0,1

6-21 0

7-3 0

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un roedor cuyo locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena está restringido de forma que comprende un segmento génico Vh humano único, uno o más segmentos génicos Dh humanos, y uno o más segmentos génicos Jh humanos y que no comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena funcional;

en el que el segmento génico Vh humano único, uno o más segmentos génicos Dh humanos y uno o más segmentos génicos Jh están enlazados operativamente a un gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, en el que el segmento génico Vh humano único es un segmento génico Vh polimórfico asociado con un alto número de copias en poblaciones humanas;

en el que el roedor además comprende uno o más segmentos génicos Vl de inmunoglobulina humana enlazados operativamente a uno o más segmentos génicos Jl humanos; y en el que el segmento génico Vh humano único es un miembro de la familia del segmento Vh3, o una variante polimórfica del mismo.

2. El roedor de la reivindicación 1 cuyo locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena consiste en un segmento génico Vh humano único, uno o más segmentos génicos Dh humanos, y uno o más segmentos génicos Jh humanos.

3. El roedor de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que es una rata o un ratón.

4. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ratón comprende una deleción de todos los segmentos génicos VH, DH y, JH endógenos.

5. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el segmento génico Vh humano único, uno o más segmentos génicos DH humanos, y uno o más segmentos génicos JH humanos sustituyen todos los segmentos génicos Vh, Dh y, Jh endógenos en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena en la línea germinal de dicho roedor.

6. El roedor de la reivindicación 5, en el que el uno o más segmentos génicos Vl humanos y el uno o más segmentos génicos Jl humanos sustituyen todos los segmentos génicos Vl y Jl endógenos en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógena.

7. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el uno o más segmentos génicos Vl humanos y/o el uno o más segmentos génicos Jl humanos se seleccionan de segmentos génicos k humanos y A humanos.

8. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el uno o más segmentos génicos Vl de inmunoglobulina humana y uno o más segmentos génicos Jl humanos están operativamente enlazados a un gen constante de cadena ligera no humano, por ejemplo, un gen de región constante k o A de ratón o de rata.

9. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el segmento génico Vh humano único, uno o más segmentos génicos DH humanos, y uno o más segmentos génicos JH humanos están operativamente enlazados a un gen de región constante de inmunoglobulina de ratón o de rata.

10. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el segmento génico Vh humano único, uno o más segmentos génicos DH humanos, y uno o más segmentos génicos JH humanos están operativamente enlazados a un gen de región constante de IgM de roedor.

11. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el segmento génico Vh humano único es un segmento Vh3 seleccionado de: Vh3-7, Vh3-9, Vh3-11, Vh3-13, Vh3-15, Vh3-16, Vh3-20, Vh3-21, Vh3-23, Vh3-30, Vh3-30-3, Vh3-30-5, Vh3-33, Vh3-35, Vh3-38, Vh3-43, Vh3-48, Vh3-49 , Vh3-53, Vh3-64, Vh3-66, Vh3-72, Vh3-73, Vh3-74 y variantes polimórficas de los mismos.

12. Una célula o un tejido derivado del roedor de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

13. Un procedimiento para producir una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio Vh humano que comprende las etapas de: (a) inmunizar a un roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 con un antígeno de interés; (b) permitir que dicho ratón desarrolle una respuesta inmunitaria al antígeno de interés; y (c) obtener una secuencia de ácido nucleico de región VH de inmunoglobulina que codifica un dominio de Vh humano de dicho ratón.

14. Uso de un roedor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en un procedimiento para producir una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada humana.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el dominio variable de cadena pesada humana se caracteriza por tener secuencias FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 humanas derivadas de un segmento génico Vh3-23 polimórfico humano.