ES2906057T3 - Compuesto heterocíclico quiral con actividad antagonista de la vía Hedgehog, método y uso del mismo - Google Patents

Compuesto heterocíclico quiral con actividad antagonista de la vía Hedgehog, método y uso del mismo Download PDF

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Abstract

Un método para preparar un compuesto heterocíclico quiral con actividad antagonista de la vía Hedgehog de acuerdo con la fórmula I: **(Ver fórmula)** método que comprende: i) mezclar (1S,2S)-(+)-N-p-toluensulfonil-1,2-difeniletilendiamina, dímero de dicloro (p-metilcumeno) de rutenio (II), amina y una solución de ácido fórmico-acetonitrilo para dar una solución mixta; mezclar el compuesto **(Ver fórmula)** en la solución de acetonitrilo con la solución mixta para que reaccione; ajustar el pH del sistema a 8,0 con bicarbonato sódico; realizar la extracción y la purificación para preparar **(Ver fórmula)** ii) reacción de acoplamiento entre el compuesto **(Ver fórmula)** y el compuesto **(Ver fórmula)** para preparar el compuesto **(Ver fórmula)** y iii) oxidar el metiltio del compuesto **(Ver fórmula)** y hacer reaccionar con 4-hidroxipiperazina para obtener el compuesto heterocíclico quiral **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Compuesto heterocíclico quiral con actividad antagonista de la vía Hedgehog, método y uso del mismo
Referencia cruzada a solicitud relacionada
La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente China N.° CN201610511917.7, titulada "CHIRAL HETEROCYCLIC COMPOUND WITH HEDGEHOG PATHWAY ANTAGONIST ACTIVITY, METHOD AND USE THEREOF", presentada en la Oficina Nacional de la Propiedad Intelectual China el 4 de julio de 2016.
Campo
La presente invención se refiere al campo de un compuesto heterocíclico quiral con actividad antagonista de la vía Hedgehog, y a su método de preparación y al uso del mismo, perteneciente al campo de la tecnología medicinal. Más particularmente, la presente invención se refiere a novedosos compuestos heterocíclicos que son útiles en el campo de la señalización celular y el tratamiento del cáncer. Más particularmente, la presente invención se refiere a las terapias dirigidas a las enfermedades mediadas por la vía de señalización Hedgehog, tales como el cáncer, en mamíferos.
Antecedentes
El tumor maligno es una de las principales enfermedades que ponen en peligro la salud humana. Cada año se producen aproximadamente 10,9 millones de nuevos casos de tumores malignos, y cada año mueren aproximadamente 6,7 millones de pacientes a causa de tumores malignos [1]. Por lo tanto, la prevención y el tratamiento de los tumores es también un asunto importante en la industria farmacéutica, y la investigación y el desarrollo de fármacos antineoplásicos también ha experimentado enormes cambios tras años de investigación y exploración. Los fármacos antineoplásicos utilizados anteriormente en el tratamiento clínico son principalmente fármacos citotóxicos que tienen una escasa selectividad, fuertes efectos secundarios, producen fácilmente resistencias farmacológicas y otros inconvenientes. En los últimos años, con el rápido progreso de la investigación en ciencias de la vida, la transducción de señales en las células tumorales malignas, la regulación del ciclo celular, la inducción de la apoptosis, la angiogénesis y la interacción entre las células y la matriz extracelular y otros procesos básicos, se van dilucidando gradualmente. Por lo tanto, algunas de las enzimas clave de las vías de transducción de señales celulares asociadas a la diferenciación y proliferación de las células tumorales se utilizan como objetivos en el cribado de fármacos. Los nuevos compuestos cabezas de serie, que actúan selectivamente sobre estos objetivos específicos, y con propiedades de alta eficacia y baja toxicidad, se han convertido en una dirección importante para la investigación y el desarrollo de fármacos tumorales. Los éxitos de mercado de los fármacos dirigidos, tales como trastuzumab, imatinib, gefitinib y erlotinib, son ejemplos típicos [2].
La metástasis y la regeneración no son las únicas características de los tumores malignos, sino también un obstáculo para el tratamiento de los tumores malignos. Incluso una nueva generación de fármacos dirigidos tiene poco efecto sobre la metástasis y la regeneración tumorales. Por consiguiente, en los últimos años, la investigación sobre la vía de señalización Hedgehog (Hh), la vía Hedgehog, por parte de la comunidad científica, ha atraído cada vez más atención. Esto no se debe únicamente a la activación anormal de las vías de señalización Hh, que desempeñan un papel fundamental en la aparición y el desarrollo de muchos tumores, incluyendo carcinoma basocelular, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de próstata y algunas neoplasias digestivas [3-11], sino que, de forma más importante, debido a que la vía de señalización Hh es una vía de desarrollo embrionario, que desempeña un papel importante en la regulación de las células madre tumorales, controlando por tanto la metástasis y la regeneración tumorales.
La vía de señalización Hedgehog es un sistema de transducción de señales intercelulares muy conservado. En 1980 se denominó vía Hedgehog (Hh) porque, en la mosca de la fruta, la mutación del gen en esta vía puede dar lugar a que las larvas muestren una serie de espolones en forma de erizo [12]. La vía de señalización Hh comprende el ligando Hh, dos receptores de proteínas transmembranarios: el receptor de membrana patched (PTCH) y la proteína transmembranaria smoothened (SMO), la proteína Gli del factor de transcripción anterógrado y otros [13]. El PTCH y la SMO son dos proteínas transmembranarias situadas en la membrana de la célula objetivo. El PTCH es un receptor de la superficie celular que es una proteína de 12 segmentos transmembranarios codificada por el gen supresor tumoral PTCH, con un doble papel de aislamiento y transducción de Hh. La SMO es una proteína de 7 segmentos transmembranarios que es estructuralmente muy similar a la de la familia de receptores acoplados a proteínas G, y tiene el efecto de transducir la señalización Hh. El PTCH y la SMO actúan como receptores en el proceso de transducción de la señalización Hh. En donde el PTCH es el receptor de Hh. Cuando Hh está ausente, el PTCH impide la translocación de la SMO a la membrana celular, inhibiendo así la actividad de la SMO, inhibiendo así la expresión transcripcional de los genes anterógrados. Cuando la señal Hh está presente, la Hh se une al PTCH e induce la fosforilación de múltiples residuos de serina/treonina en el extremo carboxílico de la SMO, lo que da como resultado la agregación y la activación de la SMO en la superficie celular; la SMO activada interactúa con la molécula cinesinoide Costal2 (Cos2) y la cinasa de serina/treonina fusionada (Fus), supresor de la fusionada (Sufu), para formar un complejo y disociarse de los microtúbulos. La SMO desempeña un papel en la activación transcripcional por parte de una forma completa, y en última instancia da lugar a la activación del factor de transcripción similar al cinc Gli, mientras que este último se introduce en el núcleo provocando la transcripción de los genes objetivo. Por lo tanto, en la vía de señalización Hh, Hh es el punto de partida de la vía de señalización, y Gli, como factor de transcripción, es el final de la vía de señalización, siendo Hh y SMO los activadores, PTCH el supresor, que regulan la actividad de la vía de señalización [1214].
El receptor de proteína transmembranaria SMO, un miembro clave de la vía de señalización Hh, es el convertidor de información en la vía de señalización Hh. Puede convertir las señales Hh extracelulares en señales Gli1 intracelulares, lo que inicia la transcripción génica dentro del núcleo y activa la vía de señalización Hh [15]. La mayoría de los procesos de aparición y desarrollo de células tumorales relacionados con la activación de la vía Hh presentan una mutación funcional de la SMO. Los antagonistas de molécula pequeña de la proteína SMO bloquean específicamente la vía de señalización Hh mediante el bloqueo de la SMO, mientras que la vía de señalización Hh está inactivada en los adultos normales, por lo que el antagonista no tiene efectos secundarios en otras partes del cuerpo, lo que es la base teórica de la viabilidad del tratamiento dirigido del tumor. Por lo tanto, la proteína s Mo se ha convertido en uno de los objetivos más interesantes en el desarrollo de fármacos antineoplásicos. La síntesis de antagonistas de molécula pequeña dirigidos a la proteína SMO también se ha convertido en un foco de atención en las empresas farmacéuticas internacionales. En la actualidad existen al menos cinco antagonistas de molécula pequeña dirigidos a la proteína SMO en ensayos clínicos. Entre ellos, el antagonista de molécula pequeña de la SMO GDC-0449, desarrollado conjuntamente por Genentech y Curis de Estados Unidos, fue aprobado para el tratamiento de pacientes con cáncer basocelular avanzado por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA) en enero de 2012[16]. Esto demuestra que los antagonistas de molécula pequeña de la SMO tienen un buen valor de aplicación y una buena perspectiva de mercado como investigación y desarrollo de fármacos antineoplásicos.
La vía de señalización Hedgehog (Hh) se ha implicado en la regulación del patrón, el crecimiento y la migración celulares durante el desarrollo embrionario. En las células adultas, la vía de señalización Hh se limita al mantenimiento y la reparación tisulares. Sin embargo, esta vía se reactiva durante la reparación y la regeneración tisulares. En condiciones normales, los ligandos endógenos sonic hedgehog, Indian hedgehog y desert hedgehog se unen a su receptor patched (PTCH), lo que a su vez alivia el efecto inhibidor de PTCH sobre la smoothened (Smo), una proteína anterógrada. La activación de Smo desencadena una serie de acontecimientos que, en última instancia, dan lugar a una expresión génica específica mediada por los factores de transcripción de la familia Gli (Jiang y Hui, Dev. Cell Review (2008) 15: 801-812). La señalización Hh aberrante se ha relacionado con numerosos cánceres humanos. La inactivación mutacional de los componentes de la vía inhibidora da lugar a una activación constitutiva e independiente de ligando de la vía de señalización Hh, que da como resultado cánceres tales como carcinoma basocelular y meduloblastoma (Xie et al., Nature (1998) 391: 90-92), glioblastoma (Bar et al. Stem Cells (2007) 25 (10): 2524-33; Filbin et al. Nature Medicine (2013) 19: 1518-1523 dio: 10.10. 38/nm.3328). La activación de la señalización Hh dependiente de ligando está implicada en el cáncer de próstata (Sanchez et al. PNAS 101 (2004) (34): 12561-566), el cáncer de páncreas (Thayer et al. Nature (2003) 423: 851-856), el cáncer de mama (Kubo et al. Cancer Res. (2003) 64: 6071-6074), el cáncer de pulmón no microcítico (Yuan et al. Oncogene (2007) 26: 1046-1055), el cáncer de pulmón microcítico (Watkins et al. Nature (2003) 422: 313-317) y algunos cánceres hematológicos (Scales et al., Trends Pharmacol. Sci. (2009) 30: 303-312). Por lo tanto, la inhibición de la señalización Hh aberrante representa un enfoque prometedor hacia una nueva terapia antineoplásica (Peukert y Miller-Moslin, ChemMedChem (2010) 5: 500-512).
Se ha descubierto que la señalización Hedgehog regula la expresión de las proteínas transvehículoas ABC de la proteína de resistencia a múltiples fármacos-1 (MDR1, ABCB1, glicoproteína P) y (BCRP, ABCG2), y que la inactivación dirigida de la expresión de MDR1 y de BCRP mediante un ARN interferente pequeño revierte parcialmente la quimiorresistencia inducida por Hh. Esto indica que la vía Hh puede ser un objetivo para superar la MDR y aumentar la respuesta quimioterápica (Sims-Mourtada et al. Oncogene (2007) 26: 5674-79). Se descubrió que el bloqueo de la vía de señalización sonic hedgehog potenciaba el efecto antiproliferativo de los inhibidores del EGFR en las células de cáncer de páncreas (Hu et al. Acta Pharmacol. Sin. (2007) 28 1224-30) y en las células de cáncer de próstata (Mimeault et al. Int. J. Cancer (2006) 118: 1022-31).
La vía Hedgehog también se ha asociado a la reaparición del tumor tras la quimiorradioterapia, y como un objetivo potencial para mejorar la respuesta a la radiación (Sim-Mourtada et al. Clin. Cancer Res. (2006) 12: 6565-6572).
También se ha notificado que la inhibición de la vía de señalización Hedgehog puede ser de utilidad para el tratamiento de un abanico de enfermedades relacionadas con la inflamación, la hiperplasia de células epiteliales, la fibrosis tisular o los trastornos inmunitarios (Lamb et al., documento EP1183040).
Figure imgf000004_0001
La ciclopamina, un alcaloide natural, fue el primer inhibidor de la vía de señalización Hh del que se informó (Cooper et al., Science (1998) 280: 1603-1607), y posteriormente se identificó como un antagonista de la Smo (Chen et al, Genes. Dev. (2002) 16: 2743-2748). Un derivado de la ciclopamina, IPI-926, que mostró una mejor potencia, estabilidad y otras propiedades farmacéuticas que las de la ciclopamina, ha entrado en desarrollo clínico (Trembley et al., J. Med. Chem. (2009) 52: 4400-4418). Un inhibidor de la vía embrionaria, GDC-0449 (Robarge et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2009) 19: 5576-5581), fue aprobado por la FDA en enero de 2012 para el tratamiento del carcinoma basocelular que no es operable.
A pesar de los avances con estos compuestos, hay varios problemas. Por ejemplo, GDC-0449 posee todos los carbonos con hibridación sp2 menos uno, lo que da como resultado un punto de fusión elevado (251 °C) y una mala solubilidad (9,5 pg/ml); la solubilidad mejorada se obtuvo añadiendo un grupo cloro en orto al anillo lateral derecho para introducir una inclinación y reducir la planaridad de la amida del arilo (Robarge et al.). También introdujo mutaciones en la SMO y dio como resultado una rápida recaída del tumor en al menos un paciente (Yauch et al., Science (2009) 326: 572-574).
Hemos divulgado una serie de compuestos en una patente anterior (documento WO2014113191A1), en donde los compuestos representativos (A-55 y A97) tienen una estructura representada a continuación, cuyas actividades inhibidoras (CI50 de NIH3T3-GRE-Luc) frente a la vía de señalización Hh eran de 5,5 nM (vismodegib de referencia, 8,8 nM, relación de 1,6 veces) y 84 nM (vismodegib de referencia, 45 nM, relación de 0,54 veces), respectivamente.
Figure imgf000004_0002
WO2014 1319 A1 (vismodegib 8,8 nM) vsmo eg n
Cuando el R5 y el R6 de la serie de compuestos (fórmula I) del documento WO2014113191A1 eran hidrógeno, la actividad era mejor. Sin embargo, en estudios farmacocinéticos posteriores se ha averiguado que los restos de metileno de los compuestos (la fórmula I en el documento WO2014113191A1, R5 y R6 eran hidrógeno) eran susceptibles de un metabolismo oxidativo.
GULAMHUSSEN, A.M. et al., ("Highly efficient preparation of R-1-methyltetrahydroisoquinoline using chiral Ru(ll)-catalyst", Reaction Kinetics and Catalysis Letters, vol. 97, n.° 2, 11 de julio de 2009, páginas 335-340) divulgan un método de reducción de la 1-metil-3,4-dihidroisoquinolina.
OTRAS PUBLICACIONES
1. Jemal, A.; Siegel, R.; Weingerg, R.A. Cancer statistics, 2010.CA. Cancer J. Cli., 2010, 144, 277-300.
2. Workman, P.; Collins,I. Modern Cancer Drug Discovery: Integrating Targets, Technologies and Treatments. En Cancer Drug Design and Discovery, 1a ed.; Neidle, S., Ed.; Elsevier: Nueva York, 2008; págs. 3-38.
3. di Magliano, M.P.; Hebrok,M. Hedgehog signalling in cancer formation and maintenance. Nat. Rev. Cancer 2003, 3. 903-911.
4. Beachy, P.A.; Karhadkar, S.S.; Berman, D.M. Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis. Nature 2004, 432, 324-331.
5. Dahmane, N.; Lee, J.; Robins, P.; Heller, P.; Ruizi Altaba, A. Activation of the transcription factor Gli1 and the sonic Hedgehog signaling pathway in skin tumours. Nature 1997, 389, 876-881.
6. Hutchin, M.E.; Kariapper, M.S.T.; Gratchtchouk, M.; Wang, A.; Wei, L.; Cummings, D.; Li u, J.; Michael, L.R.; Glick, A.; Dlugosz, A.A. Sustained Hedgehog signaling is required for basal cell carcinoma proliferation and survival: Conditional skin tumorigenesis recapitulates the hair growth cycle. Genes Dev. 2004, 19, 214-224.
7. Kubo, M.; Nakamura, M.; Tasaki, A.; Yamanaka, N.; Nakashima, H.; Nomura, M.; Kuroki, S.; Katano, M.
Hedgehog signaling pathway is a new therapeutic target for patients with breast cancer. Cancer Res. 2004, 64, 6071-6074.
8. Berman, D.M.; Karhadkar, S.S.; Maitra, A.; Montes de Oca, R.; Gerstenblith, M.R.; Briggs, K.; Parker, A. R.;
Shimada, Y.; Eshleman, J.R.; Watkins, D.N.; Beachy, P.A. Widespread requirement for Hedgehog ligand stimulation en growth of digestive tract tumors. Nature 2003, 425, 846-851.
9. Goodrich, L.V.; Scott, M.P. Hedgehog and Patched in neural development and disease. Neuron 1998, 21, 1243­ 1257.
10. Stecca, B.; Mas., C.; Clement, V.; Zbinden, M.; Correa, R.; Piguet, V.; Beermann, F.; Ruiz, A. Melanomas require Hedgehog-Gli signaling regulated by interactions between Gli1 and the RAS-MEK/AKT pathways. Proc.
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11. Thayer, S.P.; PascadiMagliano, M.; Heiser, P.W.; Nielsen, C.M.; Roberts, D.J.; Lauwers,G. Y.; Qi, Y.P.; Gysin,
S.; Fernandez-del Castillo, C.; Yajnik, V.; Antoniu, B.; McMahon, M.; Warsh aw, A.L.; Hebrok, M. Hedgehog is an early and late mediator of pancreatic cancer tumorigenesis. Nature 2003, 425, 851-856.
12. Lum, L.; Beachy, P.A. The Hedgehog response network: sensors,witches,and routers. Science 2004, 304, 1755­ 1759.
13. Beachy, P.A.; Karhadkar, S.S.; Berman, D.M. Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis. Nature 2004, 432, 324-331.
14. PascadiMagliano, M.; Hebrok, M. Hedgehog signalling in cancer formation and maintenance. Nat. Rev. Cancer 2003, 3, 903-911.
15. Romer, J.T.; Kimura, H.; Magdaleno, S.; Sasai, K.; Fuller, C.; Baines, H.; Connelly, M.; Stewart, C.F.; Gould,
S.; Rubin, L.L.; Curran, T. Suppression of the Shh pathway using a small molecule inhibitor eliminates medulloblastoma in Ptc1(+/-)p53(-/-) mice. Cancer Cell 2004, 6, 229-240.
16. Comunicado de prensa de Curis Pharmaceuticals: http://investors.curis.com/releasedetail.cfm?ReleaseID=643756.
Sumario
En vista de la técnica anterior mencionada anteriormente, es un objetivo de presente divulgación proporcionar un compuesto heterocíclico quiral con actividad antagonista de la vía Hedgehog, y su método de preparación y el uso del mismo. Dicho compuesto puede bloquear la vía Hedgehog, inhibiendo así el crecimiento celular anormal y bloqueando la metástasis y la regeneración de las células tumorales.
El objetivo de la presente divulgación se consigue proporcionando un método para preparar el compuesto heterocíclico quiral con actividad antagonista de la vía Hedgehog de acuerdo con la reivindicación 1 y un compuesto de acuerdo con la reivindicación 3. Las realizaciones preferidas se exponen en las subreivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un patrón de difracción de un cristal individual de la sal de D-tartrato del intermedio B1-3 en el ejemplo
1.
La FIG. 2 es una gráfica que muestra la actividad inhibidora del compuesto B1 en el ejemplo 3 frente a la vía Hh.
La FIG. 3 es una gráfica que muestra la actividad inhibidora del compuesto B en el ejemplo 3 frente a la vía Hh.
La FIG. 4 es una gráfica que muestra la actividad inhibidora del compuesto B2 en el ejemplo 3 frente a la vía Hh.
La FIG. 5 es una gráfica que muestra el perfil farmacocinético del compuesto B1 del ejemplo 5.
La FIG. 6 es una gráfica que muestra el perfil farmacocinético del compuesto B del ejemplo 5.
La FIG. 7 es una gráfica que muestra la comparación de la inhibición del volumen tumoral en el ejemplo 6.
La FIG. 8 es una imagen que muestra la comparación de la inhibición del volumen tumoral en el ejemplo 6.
La FIG. 9 es la estructura de la sal de D-tartrato del intermedio B1-3 en el ejemplo 7, determinada por difracción de un cristal individual.
La FIG.10 representa las curvas de la CI50 del compuesto patrón A en el ensayo primario
La FIG.11 representa la curva de la CI50 del compuesto B1 en el ensayo primario.
La FIG.12 representa la curva de la CI50 del compuesto B en el ensayo primario.
La FIG.13 representa la curva de la CI50 del compuesto B2 en el ensayo primario.
La FIG 14 muestra la curva de metabolismo del compuesto B1 en el ejemplo 14 en ratas.
La FIG. 15 muestra la curva de metabolismo del compuesto B del ejemplo 14 en ratas.
La FIG. 16 representa la curva del volumen tumoral en función del tiempo para el tumor en el ejemplo 15.
La FIG. 17 representa las fotos de los tumores en diferentes momentos en el ejemplo 15.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Los compuestos se describen en general en el presente documento usando la nomenclatura convencional. Para los compuestos que tienen centros asimétricos, debe entenderse que (a menos que se especifique de otro modo) están englobados todos los isómeros ópticos y las mezclas de los mismos. Además, los compuestos con dobles enlaces carbono-carbono pueden aparecer en las formas Z y E, incluyéndose en la presente invención todas las formas isómeras de los compuestos, a menos que se especifique de otro modo. Cuando un compuesto existe en varias formas tautómeras, un compuesto mencionado no está limitado a cualquier tautómero específico, sino que pretende englobar todas las formas tautómeras.
Como se utiliza en el presente documento, el término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado de cadena lineal o ramificada. Los grupos alquilo incluyen grupos que tienen de 1 a 8 átomos de carbono (alquilo C-us), de 1 a 6 átomos de carbono (alquilo C-i-a) y de 1 a 4 átomos de carbono (alquilo C1-4), incluyendo, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, ferc-butilo, pentilo, 2-pentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo y 3-metilpentilo. En algunos casos, se indica específicamente un sustituyente de un grupo alquilo. Por ejemplo, "cianoalquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con al menos un sustituyente ciano.
"Alquenilo" se refiere a grupos alqueno de cadena lineal o ramificada, que comprenden al menos un doble enlace insaturado carbono-carbono. Algunos grupos alquenilo incluyen grupos alquenilo C2-8, alquenilo C2-6 y alquenilo C2-4, que tienen de 2 a 8, de 2 a 6 o de 2 a 4 átomos de carbono, respectivamente, incluyendo, por ejemplo, etenilo, alilo o isopropenilo. "Alquinilo" se refiere a grupos alquino de cadena lineal o ramificada, que tienen uno o más enlaces carbono-carbono insaturados, al menos uno de los cuales es un triple enlace. Algunos grupos alquinilo incluyen grupos alquinilo C2-8, alquinilo C2-6 y alquinilo C2-4, que tienen de 2 a 8, de 2 a 6 o de 2 a 4 átomos de carbono, respectivamente.
Un "cicloalquilo" es un grupo que comprende uno o más anillos saturados en los que todos los miembros del anillo son carbono, incluyendo, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, adamantilo. Los grupos cicloalquilo no comprenden un anillo aromático o un anillo heterocíclico. Ciertos grupos cicloalquilo son cicloalquilo C3-7, en los que el grupo cicloalquilo contiene un único anillo que tiene entre 3 y 7 miembros en el anillo, todos los cuales son carbono. Un "cicloalquenilo" es un grupo que comprende uno o más anillos insaturados en los que todos los miembros del anillo son carbono.
"Alcoxi" significa un grupo alquilo como se ha descrito anteriormente unido a través de un puente de oxígeno. Algunos grupos alcoxi incluyen grupos alcoxi C1-6 y C1-4, que tienen de 1 a 6 o de 1 a 4 átomos de carbono, respectivamente. Metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, ferc-butoxi, n-pentoxi, 2-pentoxi, 3-pentoxi, isopentoxi, neopentoxi, hexoxi, 2-hexoxi, 3-hexoxi y 3-metilpentoxi son grupos alcoxi representativos.
"Alquilamino" se refiere a una amina secundaria o terciaria que tiene la estructura general -NH-alquilo o -N(alquilo)(alquilo), en donde cada alquilo se selecciona independientemente de los grupos alquilo, cicloalquilo y (cicloalquil)alquilo. Dichos grupos incluyen, por ejemplo, grupos mono- y diamino(alquilo C1-6), en los que cada alquilo C1-6 pueden ser iguales o diferentes. Será evidente que la definición de "alquilo" como se utiliza en el término "alquilamino" difiere de la definición de "alquilo" utilizada para todos los demás grupos que contienen alquilo, en la inclusión de grupos cicloalquilo y (cicloalquil)alquilo.
"Halógeno" significa flúor, cloro, bromo y yodo. Un "haloalquilo" es un grupo alquilo que está sustituido con 1 o más halógenos elegidos independientemente (por ejemplo, los grupos "haloalquilo C1-6" tienen de 1 a 6 átomos de carbono y al menos un halógeno). Ejemplos de grupos haloalquilo incluyen, pero no se limitan a, mono-, di- o trifluorometilo; mono-, di- o triclorometilo; mono-, di-, tri-, tetra- o pentafluoroetilo; mono-, di-, tri-, tetra- o pentacloroetilo; y 1,2,2,2-tetrafluoro-l-trifluorometiletilo.
Un "heteroarilo" es un grupo aromático en el que al menos un anillo aromático comprende al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S. Algunos heteroarilos incluyen, por ejemplo, heteroarilos de 5 a 12 miembros. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, imidazol, furano, furazano, isotiazol, isoxazol, oxadiazol, oxazol, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, tetrazol, tiazol y tiofeno.
El término "heterocíclico" o "heterociclo" se refiere a una estructura anular que contiene 3-12 átomos en el anillo, en la que al menos un átomo del anillo es carbono y al menos un átomo del anillo es un heteroátomo seleccionado entre N, O y S. Un grupo heterocíclico puede ser aromático o no aromático. Piperidina y oxetano son algunos ejemplos no limitativos de heterociclos no aromáticos. Tiazol y piridina son algunos ejemplos no limitativos de heterociclos aromáticos.
Un "sustituyente" y "sustituido", como se utiliza en el presente documento, representa que un resto molecular está unido covalentemente a un átomo dentro de una molécula de interés. Por ejemplo, un sustituyente del anillo puede ser un resto tal como un halógeno, un grupo alquilo, un grupo haloalquilo u otro grupo que esté unido covalentemente a un átomo (preferentemente un átomo de carbono o de nitrógeno) que es un miembro del anillo. Los sustituyentes de los grupos aromáticos generalmente están unidos covalentemente a un átomo de carbono del anillo. De forma similar, un sustituyente de la cadena puede ser un resto tal como un halógeno, un grupo alquilo, un grupo haloalquilo u otro grupo que esté unido covalentemente a un átomo (preferentemente un átomo de carbono o de nitrógeno) que es un miembro de la cadena.
El término "farmacéuticamente aceptable", cuando se utiliza con referencia a un compuesto de las fórmulas II-IV, pretende referirse a una forma del compuesto que es segura para su administración a un sujeto. Por ejemplo, una base libre, una forma salina, un solvato, un hidrato, un profármaco o una forma derivada de un compuesto de las fórmulas II-IV, que ha sido aprobado para su uso en mamíferos, por ingestión oral o por cualquier otra vía de administración, por un organismo oficial o una administración sanitaria, tal como la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos, es farmacéuticamente aceptable.
En los compuestos de las fórmulas II-IV se incluyen las formas salinas farmacéuticamente aceptables de los compuestos de base libre. El término "sales farmacéuticamente aceptables" engloba sales, utilizadas comúnmente para formar sales de metales alcalinos y para formar sales de adición de ácidos libres o de bases libres, que han sido aprobadas por una administración sanitaria. Las sales se forman a partir de asociaciones iónicas, interacciones cargacarga, enlaces covalentes, formación de complejos, coordinación, etc. La naturaleza de la sal no es crítica, siempre que sea farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, el o los compuestos de las fórmulas II-IV se utilizan para tratar a un sujeto administrando el o los compuestos como una composición farmacéutica. Para este fin, el o los compuestos, en una realización, se combinan con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo vehículos, diluyentes o adyuvantes, para formar una composición adecuada, que se describe con más detalle en el presente documento.
El término "excipiente", como se utiliza en el presente documento, representa cualquier aditivo, vehículo, adyuvante u otro ingrediente adecuado farmacéuticamente aceptable, distinto al principio activo (API), que normalmente se incluye con fines de formulación y/o de administración. "Diluyente" y "adyuvante" se definen a continuación en el presente documento.
Los términos "trata", "tratar", "tratamiento", y "terapia", como se utilizan en el presente documento, se refieren a una terapia, incluyendo, sin limitación, una terapia curativa, una terapia profiláctica y una terapia preventiva. El tratamiento profiláctico constituye generalmente tanto la prevención de la aparición de los trastornos por completo como el retraso de la aparición de una fase preclínica evidente de los trastornos en los individuos.
La expresión "cantidad eficaz" pretende cuantificar la cantidad de cada agente, que logrará el objetivo de mejorar la gravedad del trastorno y la frecuencia de incidencia con respecto al tratamiento de cada agente por sí mismo, al tiempo que se evitan los efectos secundarios adversos asociados normalmente a las terapias alternativas. La cantidad eficaz, en una realización, se administra en una forma farmacéutica única o en formas farmacéuticas múltiples.
Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables o por otros convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse de forma que se obtenga una cantidad del principio activo eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración en particular, sin que sean tóxicos para el paciente.
El nivel de dosificación seleccionado dependerá de diversos factores que incluyen la actividad del compuesto particular de la presente invención empleado, la vía de administración, el momento de la administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se esté empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, los compuestos y/o los materiales usados en combinación con el compuesto inhibidor de hedgehog particular empleado, la edad, el género, el peso, el estado, la salud general y los antecedentes médicos previos del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las artes médicas.
Un médico o un veterinario con experiencia en la materia puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica necesaria. Por ejemplo, el médico o el veterinario podría empezar con dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a unos niveles inferiores a los necesarios para conseguir el efecto terapéutico deseado, y aumentar gradualmente la dosificación hasta conseguir el efecto deseado.
En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invención será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis eficaz más baja para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis eficaz dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. Generalmente, las dosis intravenosas, intracerebroventriculares y subcutáneas de los compuestos de esta invención para un paciente variarán desde aproximadamente 0,0001 hasta aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal al día. El modo de administración puede tener un gran efecto en la dosificación. Pueden utilizarse dosis más altas para unas vías de administración localizadas.
Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo puede administrarse en forma de dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas farmacéuticas unitarias. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que los niveles de dosificación pueden variar en función del compuesto específico, de la gravedad de los síntomas y de la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Las dosificaciones para un compuesto dado divulgado en el presente documento pueden determinarlas fácilmente los expertos en la materia por diversos medios.
COMPUESTOS NOVEDOSOS
Los compuestos A-55 y A-97, que se muestran a continuación, fueron divulgados entre una serie de compuestos en el documento WO2014113191A1. Se informó de que los compuestos A-55 y A-97 mostraban unos valores de la CI50 en el ensayo primario, vide supra, de 5,5 nM (en términos de eficacia relativa, aproximadamente 1,6 veces la de vismodegib (8,8 nM)), y de 84 nM (en términos de eficacia relativa, aproximadamente 0,5 veces la de vismodegib (45 nM)), respectivamente. Sin embargo, el compuesto desmetilado A-55 mostrado es fácil de metabolizar a través de la oxidación bencílica en el grupo metileno C-5 del anillo de tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina. El metabolismo oxidativo bencílico puede dar lugar a la formación de un metabolito similar al dihidroisoquinolinio, un metabolito reactivo puede causar toxicidades (DMD 34: 1310-1316, 2006). Por consiguiente, es deseable bloquear este sitio de oxidación bencílica en el anillo de tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina.
Figure imgf000008_0001
En algunos casos, la presente divulgación preparó los inhibidores de la vía Hedgehog mostrados en las fórmulas II:
Figure imgf000008_0002
o una sal, un estereoisómero o un solvato de los mismos farmacéuticamente aceptables, en donde
X, Y e Y' son independientemente alquilo C1-3, CD3, CF3, CN, haluro u OMe;
R2 y R'2 son independientemente H, alquilo C1-3, CD3 o CF3, con la condición de que al menos uno de R2 y R'2 no sea H;
R1 es -NRxRy, en donde Rx y Ry son independientemente H, alquilo, cicloalquilo, alquilcicloalquilo, C(O)R", o -NRxRy juntos para formar un heterociclo de 4-7 miembros, en donde el heterociclo de 4-7 miembros está sustituido o sin sustituir;
R" es alquilo C1-5;
W1, W2, W3, W4, W5, W6, W7, W8 y W9 son independientemente H o D; y
A es N o CH.
En algunos casos, la presente divulgación preparó los inhibidores de la vía Hedgehog mostrados en las fórmulas II:
Figure imgf000009_0001
o una sal, un estereoisómero o un solvato de los mismos farmacéuticamente aceptables, en donde
X, Y e Y' son independientemente alquilo C1-3, CD3, CF3, CN, haluro u OMe;
R2 y R'2son independientemente H, alquilo C1-3, CD3 o CF3, con la condición de que al menos uno de R2 y R'2 no sea H;
R1 es -NRxRy, en donde Rx y Ry son independientemente H, alquilo, cicloalquilo, alquilcicloalquilo, C(O)R", o -NRxRy juntos para formar un heterociclo de 4-7 miembros, en donde el heterociclo de 4-7 miembros está sustituido o sin sustituir;
R" es alquilo C1-5;
W1, W2, W3, W4, W5, W6, W7, W8 y W9 son independientemente H o D; y
A es N o CH.
En algunos casos, la presente divulgación preparó los inhibidores quirales de la vía Hedgehog mostrados en las fórmulas IV:
Figure imgf000009_0002
o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde
R2 es alquilo C1-3, CD3 o CF3;
R1 es -NRxRy, en donde Rx y Ry son independientemente H, alquilo, cicloalquilo, alquilcicloalquilo, C(O)R", o -NRxRy juntos para formar un heterociclo de 4-7 miembros, en donde el heterociclo de 4-7 miembros está sustituido o sin sustituir;
R" es alquilo C1-5; y
W1, W2, W3, W4, W5, W6, W7, W8 y W9 son independientemente H o D.
En algunos casos, la presente divulgación proporcionó métodos de elaboración de los compuestos de fórmula II-IV. Por ejemplo, el siguiente esquema 1 representa las etapas que pueden utilizarse para elaborar los compuestos de fórmula IV. En algunos casos, el grupo tiometilo del intermedio A puede oxidarse para producir un intermedio metilsulfonilo, que puede ser desplazado por NHRxRy para producir un compuesto de fórmula IV
Figure imgf000010_0001
En algunos casos, el intermedio A puede producirse a partir de una reacción de acoplamiento entre los intermedios B y C, como se muestra en el siguiente esquema 2.
Figure imgf000010_0002
En algunos casos, el intermedio C puede prepararse a partir de una reacción de reducción del intermedio D, como se muestra en el siguiente esquema 3.
Figure imgf000010_0003
En algunos casos, la reducción del esquema 3 puede llevarse a cabo cuando el ácido fórmico se mantiene a entre aproximadamente 2 mmol/ml y aproximadamente 3,5 mmol/ml. En algunos casos, la reducción del esquema 3 puede llevarse a cabo cuando el intermedio D se mantiene a entre aproximadamente 0,1 mmol/ml y aproximadamente 1,0 mmol/ml.
En algunos casos, la presente divulgación divulga un compuesto quiral de fórmula IV, que comprende un carbono quiral con configuración R en la posición C-5 del anillo de tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina. Por ejemplo, el compuesto B1 de la tabla 5, vide infra, puede ser aproximadamente tres veces más potente que su homólogo racémico, el compuesto B. En algunos casos, en el ensayo de inhibición in vitro del citocromo p450 (CYP) se demostró que el compuesto racémico B (a 10 j M) puede mostrar una inhibición de aproximadamente el 52 % del CYP-2C9, mientras que el compuesto quiral B1 (a 10 j M) puede mostrar una inhibición de aproximadamente el 26 % del CYP-2C9. En comparación con el compuesto racémico B, es probable que el compuesto quiral B1 tenga menos potencial de interacción farmacológica con los fármacos metabolizados por el CYP-2C9.
En algunos casos, los experimentos de farmacocinética pueden demostrar que la biodisponibilidad del compuesto quiral B1 puede duplicarse en comparación con el compuesto racémico B hasta alcanzar casi aproximadamente el 100 %. Además, las mediciones del área bajo la curva (Au C) pueden mejorarse también para el compuesto quiral B1 con respecto al compuesto racémico B.
En algunos casos, en un modelo tumoral murino, a una dosis de 100 mg/kg, el compuesto racémico B puede detener el crecimiento del tumor. Por el contrario, en un modelo tumoral murino, el compuesto quiral B puede reducir el tamaño del tumor a lo largo del tiempo, y, en algunos casos seleccionados, puede reducir el tamaño del tumor de forma drástica hasta alcanzar un nivel de tamaño casi irreconocible.
En algunos casos, en comparación con el compuesto A-55, el análogo desmetilado del compuesto B1, el compuesto quiral B1 puede casi duplicar la biodisponibilidad del fármaco, aumentar la vida media del fármaco dentro del cuerpo del animal, mejorar el AUC.
c o m p o s ic io n e s /f o r m u l a c io n e s f a r m a c é u t ic a s
Una realización proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de las fórmulas II-IV, o un estereoisómero, un tautómero, un hidrato, un solvato o una sal farmacéuticamente del mismo, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos para regular la vía Hedgehog. El método comprende la administración a un sujeto mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto de las fórmulas II-IV. El método comprende el tratamiento o la prevención del carcinoma basocelular, carcinoma de mama, carcinoma de cuello uterino, cáncer colorrectal, carcinoma de gliomas, carcinoma hepatocelular, leucemia, carcinoma de pulmón, linfoma, meduloblastoma, mieloma múltiple, carcinoma oral, cáncer de ovario, carcinoma de páncreas, cáncer de próstata, carcinoma de estómago, cáncer de tubo digestivo superior, carcinoma de esófago, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma dérmico, osteocarcinoma, cáncer de riñón y sarcoma.
En algunas realizaciones, los compuestos descritos en el presente documento se formulan en composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas se formulan de un modo convencional usando uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse con fines farmacéuticos. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida. Puede encontrarse un sumario de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, decimonovena Ed., Easton, Pa.: Mack Publishing Company (1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1975); Liberman, H.A. y Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Nueva York, N.Y. (1980); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, decimoséptima Ed., Lippincott Williams & Wilkins (1999), incorporado como referencia en el presente documento para dicha divulgación.
Una composición farmacéutica, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una mezcla de un compuesto de fórmula II con otros componentes químicos (es decir, excipientes farmacéuticamente aceptables), tales como vehículos, excipientes, aglutinantes, agentes de relleno, agentes de suspensión, agentes saborizantes, agentes edulcorantes, agentes disgregantes, agentes dispersantes, tensioactivos, lubricantes, colorantes, diluyentes, solubilizantes, agentes humectantes, plastificantes, estabilizantes, potenciadores de la penetración, agentes humectantes, agentes antiespumantes, antioxidantes, conservantes, o una o más combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica facilita la administración del compuesto a un organismo. En la práctica de los métodos de tratamiento o de uso proporcionados en el presente documento, se administran unas cantidades terapéuticamente eficaces de los compuestos descritos en el presente documento en una composición farmacéutica a un mamífero que padece una enfermedad, un trastorno o una afección que se va a tratar. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar ampliamente dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la edad y salud relativa del sujeto, la potencia del compuesto utilizado y otros factores. Los compuestos pueden utilizarse individualmente o en combinación con uno o más agentes terapéuticos como componentes de mezclas.
Las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento, se administran a un sujeto por las vías de administración adecuadas, que incluyen, pero no se limitan a, las vías de administración oral, parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), intranasal, bucal, tópica, rectal o transdérmica. Las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, dispersiones líquidas acuosas, dispersiones autoemulsionantes, soluciones sólidas, dispersiones liposomales, aerosoles, formas farmacéuticas sólidas, polvos, formulaciones de liberación inmediata, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de fusión rápida, comprimidos, cápsulas, píldoras, formulaciones de liberación retardada, formulaciones de liberación prolongada, formulaciones de liberación pulsátil, formulaciones multiparticuladas y formulaciones mixtas de liberación inmediata y controlada.
Todas las formulaciones para administración oral están en dosis adecuadas para dicha administración. Algunos ejemplos de dichas unidades de dosificación son comprimidos o cápsulas. En algunas realizaciones, éstas contienen una cantidad de principio activo de aproximadamente 1 a 2000 mg, ventajosamente de aproximadamente 1 a 500 mg, y normalmente de aproximadamente 5 a 150 mg. Una dosis diaria adecuada para un ser humano u otro mamífero varía ampliamente dependiendo del estado del paciente y otros factores, pero, de nuevo, puede determinarse mediante métodos y prácticas rutinarias.
Algunas técnicas de formulación convencionales incluyen, por ejemplo, uno o una combinación de métodos: (1) mezcla en seco, (2) compresión directa, (3) molienda, (4) granulación en seco o no acuosa, (5) granulación en húmedo o (6) fusión. Otros métodos incluyen, por ejemplo, secado por pulverización, recubrimiento en paila, granulación en fundido, granulación, secado o recubrimiento por pulverización en lecho fluido (por ejemplo, recubrimiento de Wurster), recubrimiento tangencial, pulverización superior, compresión, extrusión y similares.
Algunos vehículos adecuados para usar en las formas farmacéuticas sólidas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, goma arábiga, gelatina, dióxido de silicio coloidal, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, maltodextrina, glicerina, silicato de magnesio, caseinato de sodio, lecitina de soja, cloruro de sodio, fosfato tricálcico, fosfato dipotásico, estearoil lactilato de sodio, carragenano, monoglicérido, diglicérido, almidón pregelatinizado, hidroxipropilmetilcelulosa, estearato acetato de hidroxipropilmetilcelulosa, sacarosa, celulosa microcristalina, lactosa, manitol, y similares.
Algunos agentes de relleno adecuados para usar en las formas farmacéuticas sólidas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, lactosa, carbonato de calcio, fosfato de calcio, fosfato cálcico dibásico, sulfato de calcio, celulosa microcristalina, polvo de celulosa, dextrosa, dextratos, dextrano, almidones, almidón pregelatinizado, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, estearato acetato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS), sacarosa, xilitol, lactitol, manitol, sorbitol, cloruro de sodio, polietilenglicol y similares.
Algunos disgregantes adecuados para usar en las formas farmacéuticas sólidas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, almidón natural, tal como almidón de maíz o almidón de patata, un almidón pregelatinizado o carboximetilalmidón sódico, una celulosa tal como celulosa microcristalina, metilcelulosa, celulosa microcristalina, croscarmelosa, o una celulosa reticulada, tal como carboximetilcelulosa sódica reticulada, carboximetilcelulosa reticulada o croscarmelosa reticulada, un almidón reticulado tal como carboximetilalmidón sódico, un polímero reticulado tal como crospovidona, una polivinilpirrolidona reticulada, alginato tal como ácido algínico o una sal del ácido algínico tal como alginato de sodio, una goma tal como agar, guar, algarrobo, karaya, pectina o tragacanto, carboximetilalmidón sódico, bentonita, laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de sodio en combinación con almidón, y similares.
Los aglutinantes confieren cohesión a las formulaciones de formas farmacéuticas sólidas orales: para la formulación de cápsulas rellenas de polvo, ayudan a la formación de tapones que pueden rellenarse en cápsulas de cubierta blanda o dura, y en la formulación de comprimidos, garantizan que el comprimido permanezca intacto después de la compresión y ayudan a asegurar la uniformidad de la mezcla antes de una etapa de compresión o de llenado. Algunos materiales adecuados para usar como aglutinantes en las formas farmacéuticas sólidas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, estearato acetato de hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, etilcelulosa y celulosa microcristalina, dextrosa microcristalina, amilosa, silicato de aluminio y magnesio, ácidos polisacáridos, bentonitas, gelatina, copolímero de polivinilpirrolidona/acetato de vinilo, crospovidona, povidona, almidón, almidón pregelatinizado, tragacanto, dextrina, un azúcar, tal como sacarosa, glucosa, dextrosa, melazas, manitol, sorbitol, xilitol, lactosa, una goma natural y sintética tal como goma arábiga, tragacanto, goma ghatti, mucílago de vainas de isapol, almidón, polivinilpirrolidona, arabinogalactano de alerce, polietilenglicol, ceras, alginato de sodio, y similares.
En general, se utilizan unos niveles de aglutinante del 20-70 % en formulaciones de cápsulas de gelatina rellenas de polvo. El nivel de uso de aglutinante en las formulaciones de comprimidos varía dependiendo de si es para compresión directa, granulación en húmedo, compactación con rodillo o el uso de otros excipientes tales como rellenos, que pueden actuar por sí mismos como un aglutinante moderado. Son comunes unos niveles de aglutinante de hasta el 70 % en las formulaciones de comprimidos.
Algunos lubricantes o deslizantes adecuados para usar en las formas farmacéuticas sólidas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, ácido esteárico, hidróxido de calcio, talco, almidón de maíz, estearil fumarato sódico, sales de metales alcalinos y de metales alcalinotérreos, tales como aluminio, calcio, magnesio, cinc, ácido esteárico, estearatos de sodio, estearato de magnesio, estearato de cinc, ceras, Stearowet®, ácido bórico, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, un polietilenglicol o un metoxipolietilenglicol tal como Carbowax™, PEG 4000, PEG 5000, PEG 6000, propilenglicol, oleato de sodio, behenato de glicerilo, palmitoestearato de glicerilo, benzoato de glicerilo, laurilsulfato de magnesio o de sodio, y similares.
Algunos diluyentes adecuados para usar en las formas farmacéuticas sólidas descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, azúcares (incluyendo lactosa, sacarosa y dextrosa), polisacáridos (incluyendo dextratos y maltodextrina), polioles (incluyendo manitol, xilitol y sorbitol), ciclodextrinas, y similares.
Algunos agentes humectantes adecuados para usar en las formas farmacéuticas sólidas descritas en el presente documento incluyen, por ejemplo, ácido oleico, monoestearato de glicerilo, monooleato de sorbitán, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, monooleato de polioxietilensorbitán, monolaurato de polioxietilensorbitán, compuestos de amonio cuaternario (por ejemplo, Polyquat 10®), oleato de sodio, laurilsulfato de sodio, estearato de magnesio, docusato de sodio, triacetina, vitamina E TPGs , y similares.
Algunos tensioactivos adecuados para usar en las formas farmacéuticas sólidas descritas en el presente documento incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, monooleato de sorbitán, monooleato de polioxietilensorbitán, polisorbatos, polaxómeros, sales biliares, monoestearato de glicerilo, copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno, por ejemplo, Pluronic® (BASF), y similares.
Algunos agentes de suspensión adecuados para usar en las formas farmacéuticas sólidas aquí descritas incluyen, pero no se limitan a, polivinilpirrolidona, por ejemplo, polivinilpirrolidona K12, polivinilpirrolidona K17, polivinilpirrolidona K25 o polivinilpirrolidona K30, polietilenglicol, por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular de aproximadamente 300 a aproximadamente 6000, o de aproximadamente 3350 a aproximadamente 4000, o de aproximadamente 7000 a aproximadamente 5400, copolímero de vinilpirrolidona/acetato de vinilo (S630), carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polisorbato-80, hidroxietilcelulosa, alginato de sodio, gomas, tales como, por ejemplo, goma de tragacanto y goma arábiga, goma guar, xantanos, incluyendo goma xantana, azúcares, celulósicos, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polisorbato-80, alginato de sodio, monolaurato de sorbitán polietoxilado, monolaurato de sorbitán polietoxilado, povidona, y similares.
Los métodos de la presente invención incluyen el uso de al menos un compuesto de las fórmulas II-IV, que inhibe la señalización Hedgehog en la regulación de la reparación y/o el rendimiento funcional de un amplio intervalo de células, tejidos y órganos, y tienen aplicaciones terapéuticas y cosméticas que van desde la regulación de los tejidos neuronales, la formación y la reparación de hueso y cartílago, la regulación de la espermatogénesis, la regulación del músculo liso, la regulación del pulmón, el hígado y otros órganos que surgen del intestino primitivo, la regulación de la función hematopoyética, la regulación del crecimiento de la piel y del cabello, etc. Por consiguiente, los métodos y las composiciones de la presente invención incluyen el uso de los inhibidores en cuestión para todos los usos que puedan implicar los inhibidores de las proteínas Hedgehog. Además, los métodos en cuestión pueden realizarse en células que se proporcionan en cultivo (in vitro) o en células de un animal completo (in vivo).
Los ejemplos y las preparaciones que se proporcionan a continuación ilustran y ejemplifican los compuestos descritos en el presente documento y los métodos de preparación de dichos compuestos. En general, los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse mediante procesos conocidos en general en las artes químicas.
Los compuestos de la presente invención pueden prepararse mediante varias rutas de síntesis, incluyendo las que se describen a continuación, a partir de materiales disponibles en el mercado. Los materiales de partida de la invención son conocidos, están disponibles en el mercado o pueden sintetizarse por analogía o según métodos conocidos en la técnica. Muchos materiales de partida pueden prepararse de acuerdo con procesos conocidos y, en particular, pueden prepararse mediante los procesos descritos en los ejemplos. En la síntesis de los materiales de partida, en algunos casos, los grupos funcionales se protegen con grupos protectores adecuados cuando es necesario. Los grupos funcionales pueden eliminarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Todos los reactivos y disolventes se obtuvieron comercialmente. Cuando fue necesario, todos los reactivos y disolventes se purificaron mediante técnicas convencionales: el tetrahidrofurano se purificó por destilación de sodio. Todos los análisis de cromatografía en capa fina (TLC) se realizaron en gel de sílice (Qingdao Haiyang Chemical Co. Ltd.) y las manchas se revelaron mediante visualización UV a 254 nm y vapor de I2 o ácido fosfomolíbdico. Todos los espectros de resonancia magnética nuclear se registraron utilizando un espectrómetro Varian unity INOVA 400NB a 400 MHz o un espectrómetro Varian Vnmrs a 300 MHz, según se indique. La CLEM se realizó con un sistema Agilent 1100 utilizando una columna Agela Durashell C18 de 3,5 pm y 4,6 x 50 mm. Los gradientes se desarrollaron utilizando 0,1 de ácido trifluoroacético/agua y acetonitrilo con un gradiente de 5/95 a 95/5 en el tiempo de desarrollo indicado.
La solución técnica de la presente divulgación puede describirse ahora en detalle para proporcionar una comprensión más clara de las características técnicas, los objetos y las ventajas de la presente divulgación, pero no debe interpretarse como limitante del alcance de la invención. Los métodos experimentales descritos en los siguientes ejemplos son métodos convencionales, sin instrucciones especiales; los reactivos y los materiales están disponibles en el mercado, a menos que se especifique de otro modo. Los disolventes y los fármacos utilizados eran analíticamente puros o químicamente puros; el disolvente se volvió a destilar antes de su uso; el disolvente anhidro se trató de acuerdo con los métodos convencionales o documentados. El gel de sílice para la cromatografía en columna (malla de 100~200) y el gel de sílice para la cromatografía en capa fina (GF254) eran productos de la fábrica de productos químicos marinos de Qingdao y de la fábrica de productos químicos de Yantai. Si no se especifica, el eluyente era éter de petróleo (60 °C~90 °C)/acetato de etilo (v/v); el reactivo cromógeno era yodo o una solución de ácido fosfomolíbdico-etanol; todo el disolvente de extracción se secó usando Na2SO4 anhidro. La RMN-1H se registró con un instrumento de resonancia magnética nuclear Bruck-400, y se utilizó TMS como patrón interno. La CLEM se registró con una cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a un espectrómetro de masas con trampa iónica (LC-MSD Trap), un detector de matriz de diodos (DAD), unas longitudes de onda de detección de 214 nm y 254 nm, una espectrometría de masas con trampa iónica (ESI). la columna de HPLC era una Agela Durashell C18 (de 4,6 x 50 mm, 3,5 |jm); la fase móvil era una solución acuosa de NH4HCO3 al 0,1 %: acetonitrilo (de 5:95 a 95:5 en 5 min); el caudal era de 1,8 ml/min.
Ejemplo 1
El presente ejemplo proporcionó un compuesto heterocíclico quiral con actividad antagonista de la vía Hedgehog (B1), que tiene una configuración R. El compuesto se preparó mediante el siguiente método:
1S, 25 - -N- 4-
l n lf nil -1 2-
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000014_0001
1) Síntesis de intermedio B1-2:
se disolvió B1-1 (4,3 g, 14,576 mmol) en 40 ml de tetrahidrofurano y se añadió una solución de cloruro de metilmagnesio (3,0 M en THF, 5,3 ml, 15,9 mmol) a -60 °C. Después de 2 horas de reacción, la mezcla de reacción se inactivó con agua (30 ml), se extrajo con acetato de etilo (30 ml x 3), y la fase orgánica se secó y se concentró con sulfato sódico anhidro. El residuo se disolvió en 20 ml de diclorometano y 10 ml de ácido trifluoroacético, y la reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 5 horas. El disolvente se extrajo por centrifugación y se añadieron 10 ml de agua. El pH del sistema se ajustó a 8-9 con bicarbonato sódico saturado. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (20 ml x 3) y se secó; después de concentrar, se purificó mediante una cromatografía en columna (éter de petróleo:acetato de etilo = 4:1) para producir un sólido de color amarillo B1-2 (1,7 g, 60 %). Los datos de la RMN de B1-2 fueron los siguientes:
RMN-1H (400 MHz, CDCla) 68,50 (s, 1H), 3,85 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,82 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,60 (s, 3H), 2,37 (s, 3H).
2) Síntesis de intermedio B1-3:
se añadieron (1S, 2S)-(+)-N-p-toluensulfonil-1,2-difeniletilendiamina (209 mg, 0,57 mmol) y dicloro(p-metilcumeno) rutenio (II) (174 mg, 0,28 mmol) en un matraz de 250 ml; se añadieron trietilamina (2,3 g, 22,8 mmol) y ácido fórmico (2,6 g, 56,5 mmol) en acetonitrilo (20 ml) bajo protección de nitrógeno. Después de agitar durante 10 minutos, se añadió una solución del intermedio B1-2 (2,2 g, 11,4 mmol) en acetonitrilo (40 ml) y la reacción se agitó a la temperatura ambiente hasta el día siguiente. La reacción se inactivó con 10 ml de agua y el pH se ajustó a 8 con bicarbonato sódico saturado. Después de la extracción del acetonitrilo, se añadió diclorometano (40 ml x 5) y las fases orgánicas se combinaron y se secaron. El producto en bruto (1,4 g) se obtuvo mediante un secado por centrifugación y purificación por cromatografía en columna (diclorometano:metanol = de 100:1 a 50:1). El producto en bruto se disolvió en 20 ml de metanol y se añadió una solución de ácido D(-)-tartárico (1,4 g, 9,3 mmol) en metanol (15 ml), se puso a reflujo a 70 °C durante 10 horas, se filtró a la temperatura ambiente. El sólido se recristalizó con metanol para producir el D-tartrato del intermedio B1-3 (1,1 g). Los resultados de las pruebas de difracción del cristal individual se mostraron en la FIG. 1, demostrando que tiene una configuración R.
El D-tartrato resultante del intermedio B1-3 se disolvió en agua (10 ml) y se ajustó el pH a 8. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (30 ml x 5), se secó y se concentró para producir B1-3 (483 mg, 21 %). RMN-1H (400 MHz, CDCh) 8 8,29 (s, 1H), 4,14 (c, J = 6,7Hz, 1H), 3,42~3,35 (m, 1H), 3,15~3,09 (m, 1H), 3,01~2,93 (m, 1H), 2,87~2,80 (m, 1H), 2,55 (s, 3H), 1,51 (d, J = 6,4 Hz, 3H). 3) Síntesis de intermedio B1-5:
Se disolvieron el intermedio B1-3 (130 mg, 0,67 mmol), B1-4 (168 mg, 0,67 mmol) y ferc-butóxido de sodio (128 mg, 1,33 mmol) en 10 ml de tolueno, y se añadieron Pd(dba) 2 (38 mg, 0,067 mmol) y BINAP (42 mg, 0,067 mmol) bajo protección de nitrógeno. La reacción se agitó a 120 °C hasta el día siguiente. Después de enfriar, la solución de reacción se filtró. El filtrado se sometió a un secado por centrifugación y a una purificación por cromatografía en columna (éter de petróleo:acetato de etilo = 5:1) para producir un aceite de color amarillo como B1-5 (50 mg, 18 %).
4) Síntesis del producto B1:
se añadieron el intermedio B1-5 (35 mg, 0,085 mmol) y 2 ml de ferc-butanol a un tubo sellado de 50 ml, y a continuación se añadió la sal compleja de persulfato de potasio (65 mg, 0,21 mmol) y se hizo reaccionar durante 5 horas. Se disolvió 4-hidroxipiperidina (86 mg, 0,85 mmol) en 5 ml de alcohol ferc-butílico y se añadió a la reacción y se calentó a 90 °C hasta el día siguiente. Después de enfriar, el disolvente se eliminó mediante un secado por centrifugación y se añadió una solución de sal común (20 ml). La extracción se realizó con acetato de etilo (10 ml x 3). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron, se concentraron y se purificaron mediante una cromatografía en columna (éter de petróleo:acetato de etilo = 2:1) para producir un sólido de color blanco (11 mg, 24% ) B1. Su estructura se representó como sigue:
Figure imgf000015_0001
Los datos de la RMN de B1 fueron los siguientes: RMN-1H (400 MHz, CDCl3) 88,35 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 6,60 (s, 1H), 5,35 (s, 1H), 4,47~4,31 (m, 3H), 3,98~3,88 (m, 1H), 3,45~3,36 (m, 1H), 3,30~3,24 (m, 2H), 2,93~2,85 (m, 1H), 2,78~2,72 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 2,00~1,90 (m, 2H), 1,54~1,50 (m, 2H), 1,42 (d, J = 6,8 Hz, 3H); ee = 97 %; [a]2D5'9 = -50,0 (c = 0,5, CHCl3).
Ejemplo 2
El presente ejemplo proporcionó un compuesto heterocíclico quiral con actividad antagonista de la vía Hedgehog (B2), que tiene una configuración S. El compuesto se preparó mediante el siguiente método:
Figure imgf000015_0002
1) Síntesis de intermedio B2-2:
se disolvieron B2-1 (1,8 g, 8,9 mmol), titanato de tetraetilo (6 g, 26 mmol) y S-ferc-butilsulfenamida (2,14 g, 17,7 mmol) en dioxano anhidro (40 ml) y se calentaron a 90 °C durante 2 horas. La solución de reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente y el disolvente se eliminó. El residuo se diluyó con acetato de etilo (150 ml) y se inactivó con una pequeña cantidad de agua. El sólido se eliminó por filtración y el filtrado se secó y se sometió a un secado por centrifugación para producir el intermedio B2-2, que se utilizó directamente en la siguiente etapa. Los datos de la RMN del intermedio B2-2 fueron los siguientes: RMN-1H (400 MHz, CDCh) 88,51 (s, 1H), 2,76 (s, 3H), 2,60 (s, 3H), 1,31 (s, 9H).
2) Síntesis de intermedio B2-3:
el intermedio B2-2 (500 mg, 1,6 mmol) se disolvió en tetrahidrofurano anhidro (25 ml) y se añadió lentamente hidruro de litio y tri-t-butoxialuminio (1,245 g, 4,9 mmol) a 0 °C. La reacción continuó a esta temperatura durante 40 minutos. La mezcla de reacción se inactivó con agua, se diluyó con acetato de etilo (50 ml) y se filtró. El filtrado se secó con sulfato de sodio y se realizó un secado por centrifugación. El residuo se purificó mediante una cromatografía en columna (éter de petróleo:acetato de etilo = 5:1) para producir un aceite de color amarillo B2-3 (220 mg, 43 %). Los datos de la RMN de B2-3 fueron los siguientes: RMN-1H (400 MHz, CDCla) 88,54 (s, 1H), 4,85~4,78 (m, 1H), 3,77 (s, 1H), 2,56 (s, 3H), 1,58 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,24 (s, 9H).
3) Síntesis de intermedio B2-4:
se añadieron el intermedio B2-3 (21 mg, 0,018 mmol), tereftalato de potasio (72 mg, 0,54 mmol), tetracilfenilfosfina de paladio (21 mg, 0,018 mmol) y fluoruro de cesio (108 mg, 0,71 mmol) a un disolvente mixto de dioxano (10 ml) y agua (2 ml), la solución de reacción se calentó a 105 °C bajo protección de nitrógeno y reaccionó durante 2 horas. La solución de reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente, se filtró, y el filtrado se diluyó con acetato de etilo (40 ml). La fase orgánica se lavó con una solución sal común saturada y se secó. Después de eliminar el disolvente por centrifugación, el residuo se purificó mediante una elución en columna (éter de petróleo:acetato de etilo = 5:1) para producir un aceite de color amarillo como B2-4 (100 mg, 93 %), cuyos datos de RMN fueron los siguientes: RMN-1H (400 MHz, CDCh) 88,56 (s, 1H), 7,08~7,01 (m, 1H), 6,74~6,70 (m, 1H), 5,74~5,71 (m, 1H), 4,84~4,77 (m, 1H), 3,41 (s, 1H), 2,59 (s, 3H), 1,57 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,23 (s, 9H).
4) Síntesis de intermedio B2-5:
el intermedio B2-4 (330 mg, 1,1 mmol) se disolvió en 4 ml de acetato de etilo y se añadió una solución 2 M de cloruro de hidrógeno en acetato de etilo (2 ml). Después de la reacción, la solución se agitó a la temperatura ambiente durante 5 horas, el disolvente se eliminó por centrifugación; el residuo se disolvió en agua (10 ml) y se añadieron carbonato potásico (305 mg, 2,2 mmol) y yoduro potásico (183 mg, 1,1 mmol). La reacción se llevó a cabo a 100 °C con agitación durante 16 horas. La solución de la reacción se extrajo con diclorometano (20 ml x 4) y las fases orgánicas combinadas se secaron, seguido de un secado por centrifugación para producir un aceite de color amarillo como B2-5 (88 mg, 40%), cuyos datos de RMN fueron los siguientes: RMN-1H (400 MHz, CDCh) 8 8,30 (s, 1H), 4,20~4,13 (m, 1H), 3,44~3,37 (m, 1H), 3,18~3,10 (m, 1H), 3,04~2,96 (m, 1H), 2,91~2,82 (m, 1H), 2,55 (s, 3H), 1,53 (d, J = 6,4 Hz, 3H).
5) Síntesis de intermedio B2-6:
se disolvieron el intermedio B2-5 (88 mg, 0,45 mmol), B1-4 (137 mg, 0,54 mmol) y ferc-butóxido de sodio (86 mg, 0,90 mmol) en 10 ml de tolueno; se añadieron Pd (dba) 2 (26 mg, 0,045 mmol) y BlNAP (28 mg, 0,045 mmol) bajo protección de nitrógeno; y la reacción se agitó a 120 °C hasta el día siguiente. Después de enfriar, la solución de reacción se filtró. El filtrado se sometió a un secado por centrifugación y a una purificación por cromatografía en columna (éter de petróleo:acetato de etilo = 5:1) para producir un aceite de color amarillo como B2-6 (40 mg, 21 %), cuyos datos de RMN fueron los siguientes: RMN-1H (400 MHz, CDCh) 88,36 (s, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 6,64 (s, 1H), 5,54 (s, 1H), 4,41~4,33 (m, 1H), 3,46~3,39 (m, 1H), 3,07~2,98 (m, 1H), 2,94~2,86 (m, 1H), 2,56 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 1,48 (d, J = 6,8 Hz, 3H).
6) Síntesis del producto B2:
se añadieron el intermedio B2-6 (40 mg, 0,1 mmol) y 10 ml de ferc-butanol a un tubo sellado de 50 ml, y a continuación se añadió la sal compleja de persulfato de potasio (76 mg, 0,25 mmol) y se hizo reaccionar durante 5 horas. se añadió 4-hidroxipiperidina (40 mg, 0,4 mmol) y se calentó a 90 °C para una reacción hasta el día siguiente. Después de enfriar, el disolvente se eliminó mediante un secado por centrifugación y se añadió una solución de sal común (20 ml). La extracción se realizó con acetato de etilo (20 ml x 3). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron, se concentraron y se purificaron mediante una cromatografía en columna (éter de petróleo:acetato de etilo = de 2:1 a 1:1) para producir un sólido de color blanco (11 mg, 24 %) B2, cuyos datos de RMN fueron los siguientes: RMN-1H (400 MHz, CDCh) 58,35 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,42 (s, 1H), 6,61 (s, 1H), 5,35 (s, 1H), 4,48-4,38 (m, 2H), 4,35-4,27 (m, 1H), 3,99-3,87 (m, 1H), 3,50-3,36 (m, 1H), 3,32-3,21 (m, 2H), 2,96-2,84 (m, 1H), 2,79-2,70 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 1,99-1,90 (m, 2H), 1,54-1,48 (m, 2H), 1,43 (d, J = 6,8 Hz, 3H);
ee = 97 %; [a]2D6“ 7 = 54,0 (c = 0,2, CHCh).
Ejemplo 3
En este ejemplo, los compuestos B1 y B2, obtenidos en los ejemplos 1 y 2, y el correspondiente compuesto racémico B se sometieron a un ensayo indicador de luciferasa NIH3T3-GRE-Luc para verificar que los compuestos obtenidos tienen efecto en el bloqueo de la vía de Hedgehog.
Las células NIH3T3 (CRL-1658, ATCC) se mantuvieron en DMEM (Gibico) suplementado con un 10% de FBS (Hyclone). El plásmido GRE-Luc se generó insertando 8 veces el elemento de respuesta a Gli-1 (GRE) en el sitio de clonación múltiple del vector pGL4.26 (Promega). La línea celular indicadora NIH3T3-GRE-Luc se estableció mediante una selección con higromicina (Invitrogen) tras transfectarla con el plásmido indicador de luciferasa GRE-Luc. Los clones individuales se validaron mediante la inducción de la luciferasa por la proteína sonic hedgehog (sHh) recombinante o el agonista de molécula pequeña SAG (ABIN629346). El clon seleccionado se utilizó para controlar la señalización Hh.
Las células NIH3T3-GRE-Luc se mantuvieron en medio de cultivo completo (DMEM con L-Gln 4mM, 1,5 g/l de bicarbonato sódico y 4,5 g/l de glucosa complementados con 100 ^g/ml de higromicina y FBS al 10 %). Cuando fueron confluentes, las células fueron tripsinizadas y resuspendidas en el medio de ensayo (DMEM que contiene un 0,5 % de suero). Después se añadieron 100 ^l/pocillo de una suspensión de células a la placa de 96 pocillos (la concentración final de células es de 15.000 células/pocillo), las células se cultivaron durante 48 horas adicionales antes de añadir los compuestos.
Los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y se volvieron a diluir con el medio de ensayo. En una realización, se añadió SAG 10 nM al medio de ensayo como el agonista de la señalización Hh. Después de preparar los compuestos y el agonista, el medio se eliminó cuidadosamente. Se añadieron con cuidado a la célula 100 ^l de medio de ensayo que contenía el compuesto y el agonista. Las placas con las células se incubaron a 37 °C durante 48 horas adicionales. Después de 48 horas de incubación, se añadieron 40 ^l/pocillo de medio de luciferasa (Brigh-Glo, Promega) a las células. La placa se incubó a la temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación suave. La señal de luminiscencia se midió con un lector de placas (PHERAstar FS, BMG). La potencia de los compuestos se calculó tomando como base la inhibición de la señalización de la luminiscencia.
En este ejemplo, la bioactividad de los compuestos B1 y B2 de los ejemplos y del compuesto racémico B se midió de acuerdo con el ensayo indicador de luciferasa NIH3T3-GRE-Luc descrito anteriormente. Como fármaco de control se utilizó el antagonista de molécula pequeña SMO GDC-0449. Los resultados se mostraron en la tabla 1 y la FIG. 2~4.
Tabla 1.
Figure imgf000017_0001
Los resultados muestran que el compuesto B2 de configuración S tiene una actividad inhibidora de la vía Hh relativamente baja y no es importante para el tratamiento de enfermedades asociadas a la vía de señalización Hh. El compuesto B1 de configuración R era el compuesto óptimo, que tiene un aumento de 3 veces en la actividad inhibidora de la vía Hh en comparación con el compuesto racémico B, más de 20 veces la del compuesto B2 de configuración S. En comparación con el compuesto racémico B y el compuesto B2 de configuración S, el compuesto B1 de la configuración R puede inhibir mejor la vía de señalización Hh, proporcionando así una mejor perspectiva de aplicación terapéutica para las enfermedades asociadas a la vía de señalización Hh y evitando los potenciales efectos secundarios asociados a la presencia del compuesto B2 de configuración S.
Ejemplo 4
En este ejemplo, se llevó a cabo el experimento de inhibición de la enzima hepática CYP para el compuesto B1 de configuración R obtenido en el ejemplo 1 y el compuesto racémico B, para evaluar la seguridad in vitro del compuesto B1 de configuración R y del compuesto racémico B.
Procedimiento experimental:
las cinco isoenzimas principales del CYP y sus respectivos sustratos de la sonda eran: CYP-1A2 (fenacetina, 30 |jM), CYP-2C9 (toluensulfonilurea, 100 j M), CYP-2C1940 j M), CYP-2D6 (dextrometorfano, 5 j M) y c Yp-3A4 (midazolam, 1 j M), Todas las sondas se utilizaron cerca o por debajo de sus concentraciones KMS. La mezcla (200 j l) se incubó en un baño de agua a una temperatura constante de 37 °C, que contenía HLM (0,2 mg/ml), tampón de fosfato (100 mM, pH 7,4), NADPH (1 j M), compuesto de prueba (10 j M) y el respectivo sustrato de sonda del CYP. Antes de la reacción con el NADPH, la mezcla se preincubó durante 10 minutos para que se produjera la interacción inhibidorenzima. Después de un periodo de tiempo específico (10 minutos para CYP-1A2, 2D6 y 3A4; 30 minutos para el CYP-2C9 y el 2C19), la reacción se inactivó mediante la adición de 100 j l de una solución de la cantidad apropiada de acetonitrilo frío. El sistema de reacción se centrifugó y se inyectó en la CL-EM/EM para cuantificar la concentración del metabolito específico formado a partir del sustrato y la enzima CYP. Cada compuesto de prueba se probó al menos tres veces de forma independiente. Los resultados se mostraron en la tabla 2.
Tabla 2.
Figure imgf000018_0001
Los resultados mostraron que las tasas de inhibición del compuesto B1 de configuración R y del compuesto racémico B eran similares entre cuatro de las cinco isoenzimas principales del CYP. Sin embargo, la tasa de inhibición de B en el CYP-2C9 fue superior al 50 % a una concentración de 10 j M, lo que muestra un riesgo potencial de interacción farmacológica; mientras que el compuesto B1 de configuración R tuvo una tasa de inhibición del 26 % en el CYP-2C9 a una concentración de 10 j M, mostrando un buen rendimiento en materia de seguridad.
Ejemplo 5
En este ejemplo, el compuesto B1 de configuración R obtenido en el ejemplo 1, el correspondiente compuesto racémico B y el análogo desmetilado A-55 divulgado en la patente WO2014113191A1 se sometieron a un ensayo de metabolismo de fármacos para comprobar las propiedades farmacocinéticas de estos fármacos.
Procedimiento específico del experimento:
las ratas macho Spraguee-Dawley (peso corporal: 220 g~250 g) se adquirieron en Slac Laboratory Animals (Shanghai). La concentración de todos los compuestos era de 1 mg/ml; la administración intravenosa fue mediante una inyección en la cola a una dosis de 1 ml/kg; la dosis oral fue de 10 ml/kg. Se tomaron muestras de sangre a través de la vena orbital posterior, y las muestras de sangre se colocaron en un tubo que contenía EDTA (como anticoagulante) y se almacenaron en un entorno de -80 °C después de centrifugarlas con una centrifugadora refrigerada. Se tomó la muestra de sangre (en una cantidad de múltiplos de 25 j l) y se añadió acetonitrilo frío que contenía el patrón interno (100 jl). La muestra se centrifugó durante 10 minutos para precipitar la proteína plasmática. Finalmente, se inyectó el sobrenadante (10 j l) en el sistema de CL-EM/EM para su análisis.
Método de análisis de CL-EM/EM: Todas las muestras se analizaron mediante el sistema de CL-EM/EM del espectrómetro de masas API4000 QTRAP equipado con controladores LC-20AD y CBM-20A, desgasificador de disolventes DGU-20A y tomamuestras automático SIL-20A (Japan Shimadzu, Colombia, MD, EE.UU.). Se utilizó una columna Bona Aeger Venusil XBP C18 (50x2,1 mm; tamaño de partícula de relleno de 5 micrómetros) para la separación por HPLC. La temperatura de la columna se mantuvo a 40 °C. El caudal era de 0,3 ml/min y el tiempo total de desarrollo fue de 6 minutos.
Para la cuantificación de EM/EM, el espectrómetro de masas API4000 QTRAP funcionó en modo ESI positivo con monitorización de reacciones múltiples (MRM). Todos los compuestos y los patrones internos se ajustaron para ser controlados durante un tiempo de permanencia de 100 milisegundos. Los demás parámetros de la EM/EM se ajustaron como sigue: gas de atomización (GS1) a 206,84 kPa (30 psi), presión de la turbina de 3,86 kg/cm2 (55 lb), tensión de pulverización iónica de 4500 V, temperatura de la fuente de iones de 500 °C. Para las transiciones iónicas seleccionadas, cada analito se probó con la sensibilidad óptima del potencial de agrupación (DP) y la energía de colisión (CE). Finalmente, los datos se recogieron y procesaron con el programa informático de recogida e integración de datos AB SCIEX Analysist 1.5.2.
Los resultados de los experimentos se mostraron en la tabla 3, la FIG. 5 y la FIG. 6:
Tabla 3
Figure imgf000019_0001
Los resultados muestran que, en comparación con el compuesto racémico B, el área bajo la curva del compuesto B1 de configuración R casi se duplicó y la biodisponibilidad aumentó del 53% al 100%. Estos datos experimentales demostraron que la tasa de absorción del compuesto B1 de configuración R era mayor que la del compuesto racémico B en el animal. A la misma dosis, la concentración plasmática del compuesto B1 de configuración R se mantuvo más estable y durante más tiempo en el animal. Cuando la dosis oral era de 10 mg/kg, el compuesto B1 de configuración R tiene una concentración plasmática de 623 ng/ml después de 8 horas, 1340 nM en términos de conversión de peso molecular, lo que era 1675 veces de su CI50 (0,8 nM), y tras restar la unión a proteínas plasmáticas, todavía puede inhibir en gran medida la vía Hh. Mientras que el compuesto racémico B de tiene una concentración plasmática de 83 ng/ml después de 8 horas, 178 nM en términos de conversión de peso molecular, lo que era 66 veces de su CI50 (2,7 nM), y tras restar la unión a proteínas plasmáticas, no había suficiente concentración plasmática para inhibir la vía Hh. En comparación con el análogo desmetilado A-55, la biodisponibilidad del compuesto quiral B1 era casi del doble; la semivida media aumentó; y la exposición al fármaco (área bajo la curva, AUC) aumentó significativamente. Por lo tanto, los resultados del ensayo farmacocinético demostraron que el compuesto B1 de configuración R puede inhibir la vía de señalización Hh mejor y de forma más homogénea que el análogo desmetilado y el compuesto racémico, por lo que tiene una mejor perspectiva de aplicación terapéutica para las enfermedades asociadas a la vía de señalización Hh.
Ejemplo 6
En este ejemplo, el compuesto B1 de configuración R obtenido en el ejemplo 1 y el correspondiente compuesto racémico B se investigaron en un modelo tumoral murino para probar el efecto inhibidor del compuesto B1 de configuración R y del compuesto racémico B en los tumores relacionados con la vía Hh.
Procedimiento específico del experimento:
se inyectaron células tumorales del meduloblastoma primario de ratones Patched (PTCH) /-, p53 -/- por vía subcutánea en el costado derecho de ratones SCID. Aproximadamente 7 días después del implante, los tratamientos se iniciaron cuando el volumen tumoral creció hasta una media de 200 mm3. Los animales se dividieron aleatoriamente en el grupo del blanco, el grupo con administración del compuesto B y el grupo con administración del compuesto B1. Las dosis del compuesto B1 y del compuesto racémico B fueron de 100 mg/kg/día. El volumen tumoral (m3) y el peso corporal (g) se registraron cada dos días. Después de 14 días de administración, los ratones se sacrificaron y se extrajeron los tumores. Los resultados se mostraron en las FIG. 7 y 8.
A una dosis de 100 mg/kg, el compuesto racémico B únicamente detuvo el crecimiento del tumor, mientras que B1 puede reducir el volumen del tumor hasta casi hacerlo desaparecer. Este resultado demostró que el compuesto B de configuración R tiene un efecto antitumoral más importante e inesperado.
Como se puede observar a partir de los ejemplos anteriores, el compuesto quiral B1 del ejemplo 1 de la presente divulgación era capaz de bloquear la vía Hedgehog, suprimiendo así el crecimiento celular anormal y bloqueando la metástasis y la regeneración de las células tumorales. En comparación con el compuesto racémico B, el compuesto quiral B1 tiene una mejor actividad para inhibir la vía Hh, mayor seguridad y mejor biodisponibilidad. En el cuerpo vivo, el compuesto quiral B1 tiene un efecto más importante e inesperado en la inhibición del crecimiento celular anormal y el bloqueo de la metástasis y la regeneración de las células tumorales, con una mejor perspectiva de aplicación en el tratamiento de tumores.
SÍNTESIS
Ejemplo 7: Preparación de (R)-1 -(6-(5'-cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2’-il)-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-il)piperidin-4-ol (B1)
Figure imgf000020_0001
Ruta de síntesis A:
(1S, 2S)-(+)-N-(4-Toluensulfoml)-1,2-difemletilendiamina,
Figure imgf000020_0002
5-Metil-2-(metiltio)-7,8-dihidropirido[4,3-d]pirimidina (B1-2). Se añadió gota a gota cloruro de metilmagnesio (3,0 M en THF, 5,3 ml, 15,9 mmol) a una solución de 2-(metiltio)-5-oxo-7,8-dihidropirido[4,3-d]pirimidin-6(5H)-carboxilato de tere-butilo (compuesto B1-1,4,3 g, 14,576 mmol) en THF (40 ml) en una atmósfera de N2 a -60 °C. Después de agitar durante 2 h a la misma temperatura, la mezcla de reacción se inactivó con salmuera (30 ml). La mezcla resultante se filtró, y el filtrado se extrajo con EtOAc (30 ml x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en 20 ml de CH2Ch, y se añadió TFA (10 ml). La mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 5 h y se concentró a presión reducida. El residuo se ajustó a pH 8-9 añadiendo NaHCO3 acuoso saturado y se extrajo con CH2Ch (30 ml x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = 1/3) para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (1,7 g, 60%). RMN-1H (400 MHz, CDCla) 88,50 (s, 1H), 3,85 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,82 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,60 (s, 3H), 2,37 (s, 3H).
(R)-5-Metil-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina (B1-3). Se cargaron (1S,2S)-(+)-N-(4-toluensulfonil)-1,2-difeniletilendiamina (209 mg, 0,571 mmol) y dímero de dicloro(p-cimeno)rutenio (II) (174 mg, 0,284 mmol) en un matraz de fondo redondo (250 ml). A continuación se añadió una solución de TEA (2,3 g, 22,772 mmol) y ácido fórmico (2,6 g, 56,522 mmol) en ACE (20 ml) en una atmósfera de N2, la mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 10 min. Se añadió una solución de 5-metil-2-(metiltio)-7,8-dihidropirido[4,3-d]pirimidina (2,2 g, 11,4 mmol) en acetonitrilo (40 ml), y la mezcla se agitó a la temperatura ambiente hasta el día siguiente en una atmósfera de N2. La solución de reacción se inactivó con agua (10 ml) y se ajustó a un pH de 8-9 añadiendo NaHCO3 acuoso saturado. La mezcla se concentró a presión reducida para eliminar la mayor parte del acetonitrilo y se extrajo con CH2Cl2 (40 ml x 5). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (CH2Ch/MeOH v:v = de 100/1 a 50/1) para dar un sólido de color pardo (1,4 g, ee = 60%.), que se disolvió en 20 ml de MeOH, a continuación se añadió una solución de ácido D-tartático (1,4 g, 9,333 mmol) en MeOH (5 ml) a 70 °C. La mezcla se agitó a la misma temperatura durante 2 h. El precipitado resultante se aisló por filtración y se lavó con MeOH (5 ml). El sólido se añadió a 15 ml de MeOH y se agitó a 70 °C durante 10 h. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, la suspensión se filtró. El sólido se añadió a MeOH (15 ml) y se agitó de nuevo a 70 °C durante 10 h. La reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente y se filtró para dar un sólido de color blanco (1,2 g) en forma de una sal del ácido D-tartático, que se disolvió en 10 ml de agua, y el pH se ajustó a 8-9 añadiendo NaHCO3 acuoso saturado. La solución acuosa se extrajo con CH2Ch (30 ml x 5). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida para dar el compuesto del título (483 mg, 22 %) en forma de un sólido de color blanco. [a j j f = 64,8 (c = 0,5, CHCh). RMN-1H (400 MHz, CDCh) 88,29 (s, 1H), 4,14 (c, J = 6,7 Hz, 1H), 3,42-3,35 (m, 1H), 3,15-3,09 (m, 1H), 3,01-2,93 (m, 1H), 2,87-2,80 (m, 1H), 2,55 (s, 3H), 1,51 (d, J = 6,4 Hz, 3H).
(R)-6-(5'-Cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina (B1-5). Se hizo reaccionar una mezcla de (R)-5-metil-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina (130 mg, 0,67 mmol), 2',5'-dicloro-3,5-dimetil-2,4'-bipiridina (B1-4, 168 mg, 0,0,67 mmol), ferc-butóxido de sodio (128 mg, 1,33 mmol), Pd(dba)2 (38 mg, 0,07 mmol) y BINAP (42 mg, 0,07 mmol) en tolueno (10 ml) en una atmósfera de N2 a 120 °C hasta el día siguiente. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró y se lavó con CH2Cl2 (20 ml). El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = 5/1) para dar el compuesto del título en forma de un aceite de color amarillo (50 mg, 18 %). [a]¡56 = -88,4(c = 0,5, CHCh).
(R)-1-(6-(5'-Cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-il)piperidin-4-ol (B1). A un tubo sellado de 10 ml se añadió (R)-6-(5'-cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina (compuesto B1-5, 50 mg, 0,12 mmol) y f-BuOH (5 ml). Se añadió lentamente una solución de oxona (93 mg, 0,30 mmol) en H2O (1 ml) a la temperatura ambiente y se dejó en agitación durante 5 h. A continuación se añadió 4-hidroxipiperidina (61 mg, 0,61 mmol) a la solución de reacción, y la mezcla se agitó a 90 °C durante 36 h. Después de eliminar el disolvente, el residuo se inactivó con salmuera (20 ml) y se extrajo con EtOAc (20 ml x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = 1/1) para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (15 mg, 26 %). [a]¡56 = -50,0 (c = 0,5, CHCla); ee = 97 %. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) 8 8,35 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 6,60 (s, 1H), 5,40-5,31 (m, 1H), 4,47-4,31 (m, 3H), 3,98-3,88 (m, 1H), 3,45-3,36 (m, 1H), 3,30-3,24 (m, 2H), 2,93-2,85 (m, 1H), 2,78­ 2,72 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 2,00-1,90 (m, 2H), 1,54-1,50 (m, 2H), 1,42 (d, J = 6,8 Hz, 3H). RMN-13C (150 MHz, CDCls) 8163,88, 160,53, 156,40, 155,92, 152,88, 148,39, 147,38, 147,36, 138,72, 133,15, 131,36, 120,37, 118,37, 107,51,68,44, 48,28, 41,63, 37,43, 34,33, 31,82, 20,44, 18,62, 18,25. HRMS (ESI): calc. para C25H29ClN6O [M+H]+ 465,2164, encontrado 465,2166.
EJEMPLO 8: Preparación de (S)-1-(6-(5'-cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-il)piperidin-4-ol (B2)
Ruta de síntesis B:
Figure imgf000022_0001
(S,E)-N-(1-(4-Cloro-2-(metiltio)pirimidin-5-il)etiliden)-2-metilpropan-2-sulfinamida (B2-2). Se hizo reaccionar una mezcla de 1-(4-cloro-2-(metiltio)pirimidin-5-il)etan-1-ona (compuesto B2-1, 1,8 g, 8,87 mmol), Ti(OEt)4 (6 g, 26,32 mmol) y (S)-(-)-2-metil-2-propansulfinamida (2,14 g, 17,69 mmol) en dioxano (40 ml) en una atmósfera de N2 a 90 °C durante 2 h. La reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. Al residuo se añadieron 150 ml de acetato de etilo (EtOAc), y a continuación se añadió H2O (1 ml) con agitación. La mezcla resultante se agitó a la temperatura ambiente durante 0,5 h y a continuación se filtró. El filtrado se secó sobre Na2SO4 y se filtró. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = 3/1) para dar el compuesto del título en forma de un aceite de color rojo (1,9 g, 70 %). RMN-1H (400 MHz, CDCh) 88,51 (s, 1H), 2,76 (s, 3H), 2,60 (s, 3H), 1,31 (s, 9H).
(S)-N-((S)-1-(4-Cloro-2-(metiltio)pirimidin-5-il)etil)-2-metilpropan-2-sulfinamida (B2-3). A una solución de (S,E)-N-(1-(4-cloro-2-(metiltio)pirimidin-5-il)etiliden)-2-metilpropan-2-sulfinamida (500 mg, 1,63 mmol) en 25 ml de THF seco se añadió LiAlH[OC(CH3)3]3 (1,24 g, 4,9 mmol) en porciones a 0 °C, y la mezcla se agitó a la misma temperatura durante 40 min. La mezcla se trató con H2O (1 ml), y se concentró a presión reducida para eliminar la mayor parte del THF. Al residuo se añadió EtOAc (40 ml), y la mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 0,5 h. La suspensión resultante se filtró. El filtrado se secó sobre Na2SO4 y se filtró. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = 5/1) para dar el compuesto del título en forma de un aceite de color amarillo (220 mg, 43 %). [a]jj7 = 19,2 (c 0,5, CHCh). RMN-1H (400 MHz, CDCh) 8 n8,54 (s, 1H), 4,85-4,78 (m, 1H), 3,77 (s, 1H), 2,56 (s, 3H), 1,58 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,24 (s, 9H).
(S)-2-Metil-N-((S)-1-(2-(metiltio)-4-vinilpirimidin-5-il)etil)propan-2-sulfinamida (B2-4). Se hizo reaccionar una mezcla de (S)-N-((S)-1-(4-cloro-2-(metiltio)pirimidin-5-il)etil)-2-metilpropan-2-sulfinamida (110 mg, 0,36 mmol), viniltrifluoroborato de potasio (72 mg, 0,54 mmol), Pd(PPh3)4 (21 mg, 0,018 mmol) y CsF (108 mg, 0,71 mmol) en una mezcla de dioxano (10 ml) y agua (2 ml) en una atmósfera de N2 a 105 °C durante 2 h. La reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente y se concentró a presión reducida para eliminar el dioxano. El residuo se diluyó con EtOAc (40 ml) y se lavó con salmuera (20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se filtró. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = 5/1) para dar el compuesto del título en forma de un aceite de color amarillo (100 mg, 93 %). [a]¡57 = 12,0 (c 0,5, CHCla). RMN-1H (400 MHz, CDCla) 88,55 (s, 1H), 7,08-7,01 (m, 1H), 6,71 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 5,72 (d, J =10,4 Hz, 1H), 4,85-4,73 (m, 1H), 3,45 (s, 1H), 2,58 (s, 3H), 1,56 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,22 (s, 9H).
(S)-5-Metil-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido [4,3-d] pirim idina (B2-5). A una solución de (S)-2-metil-N-((S)-1-(2-(metiltio)-4-vinilpirimidin-5-il)etil)propan-2-sulfinamida (330 mg, 1,1 mmol) en EtOAc (4 ml) se añadió HCl 2 N (4 mmol) en EtOAc (2 ml). La mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 5 h y se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en agua (10 ml), a continuación se añadieron K2CO3 (305 mg, 2,2 mmol) y KI (183 mg, 1,1 mmol). La mezcla se agitó a 100 °C hasta el día siguiente. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, la reacción se filtró. El filtrado se extrajo con CH2Ch (20 ml * 4). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. El filtrado se evaporó para dar el compuesto del título en forma de un aceite de color amarillo (88 mg, 0,451 mmol, 40 %). [a]¡55 = -48,0 (c 0,5, CHCh). RMN-1H (400 MHz, CDCh) 8 8,30 (s, 1H), 4,20-4,13 (m, 1H), 3,44­ 3,37 (m, 1H), 3,18-3,10 (m, 1H), 3,04-2,96 (m, 1H), 2,91-2,82 (m, 1H), 2,55 (s, 3H), 1,53 (d, J = 6,4 Hz, 3H).
(S)-6-(5'-Cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirim idina (B2-6). Se hizo reaccionar una mezcla de (S)-5-metil-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina (88 mg, 0,45 mmol), 2',5'-dicloro-3,5-dimetil-2,4'-bipiridina (137 mg, 0,54 mmol), ferc-butóxido de sodio (86 mg, 0,9 mmol), bis(dibencilidenacetona)paladio (0) (Pd(dba)2, 26 mg, 0,045 mmol) y 2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftaleno (BINAP, 28 mg, 0,045 mmol) en tolueno (10 ml) en una atmósfera de N2 a 120 °C hasta el día siguiente. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró y se lavó con CH2Ch (20 ml). El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = 5/1) para dar el compuesto del título en forma de un aceite de color amarillo (40 mg, 21 %).
[a]¡52 = 88,0 (c 0,2, CHCh). RMN-1H (400 MHz, CDCh) 88,36 (s, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 6,64 (s, 1H), 5,60-5,51 (m, 1H), 4,41-4,33 (m, 1H), 3,46-3,39 (m, 1H), 3,07-2,98 (m, 1H), 2,94-2,86 (m, 1H), 2,56 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 1,48 (d, J = 6,8 Hz, 3H).
(S)-1-(6-(5'-Cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirim idin-2-il)piperidin-4-ol (B2). A un tubo sellado de 10 ml se añadieron (S)-6-(5'-cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina (40 mg, 0,1 mmol) y f-BuOH (5 ml). Se añadió lentamente una solución de oxona (75 mg, 0,25 mmol) en H2O (1 ml) a la temperatura ambiente y se dejó en agitación durante 5 h. A continuación se añadió 4-hidroxipiperidina (40 mg, 0,4 mmol) a la solución de reacción, y la mezcla se agitó a 90 °C hasta el día siguiente. Después de eliminar el disolvente, el residuo se inactivó con salmuera (20 ml) y se extrajo con EtOAc (20 ml x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = 1/1) para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (11 mg, 24 %). [a]¡57 = 54,0 (c 0,2, CHCl3); ee > 99 %. RMN-1H (400 MHz, CDCla) 88,35 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,42 (s, 1H), 6,61 (s, 1H), 5,40-5,31 (m, 1H), 4,50-4,29 (m, 3H), 3,99-3,87 (m, 1H), 3,50-3,36 (m, 1H), 3,32-3,21 (m, 2H), 2,96-2,84 (m, 1H), 2,79­ 2,70 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 1,99-1,90 (m, 2H), 1,54-1,48 (m, 2H), 1,43 (s, 3H). RMN-13C (150 MHz, CDCla) 8 163,88, 160,53, 156,40, 155,92, 152,85, 148,37, 147,36, 138,73, 133,16, 131,37, 120,37, 118,36, 107,52, 68,43, 48,28, 41,63, 37,43, 34,32, 31,81, 20,43, 18,61, 18,24. HRMS (ESI): calc. para C2aH2gClN6O [M+H]+ 465,2164, encontrado 465,2165.
EJEMPLO 9: Preparación de (5S)-6-[5-cloro-4-(3,5-dimetil-2-piridil)-2-piridil]-N-ciclopropil-5-metil-7,8-dihidro-5H-pirido[4,3-d]pirimidin-2-amina (B3)
Figure imgf000023_0001
Ruta de síntesis C:
Figure imgf000023_0002
(S)-6-(5'-Cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-N-ciclopropil-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-amina (60). A un tubo sellado de 10 ml se añadieron (S)-6-(5'-cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina (compuesto B2-6, 40 mg, 0,1 mmol) y f-BuOH (5 ml). Se añadió lentamente una solución de oxona (75 mg, 0,25 mmol) en H2O (1 ml) a la temperatura ambiente y se dejó en agitación durante 5 h. A continuación se añadió ciclopropilamina (57 mg, 1,0 mmol) a la solución de reacción, y la mezcla se agitó a 90 °C durante 36 h. Después de eliminar el disolvente, el residuo se inactivó con salmuera (20 ml) y se extrajo con EtOAc (20 ml x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = de 2/1 a 1/1) para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (14 mg, 34 %). [a]¡52 = 86,0 (c 0,2, CHCh); ee > 99 %. RMN-1H (400 MHz, CDCh) 88,36 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 6,61 (s, 1H), 5,45-5,36 (m, 1H), 5,26 (s, 1H), 4,43-4,31 (m, 1H), 3,46-3,36 (m, 1H), 2,96-2,86 (m, 1H), 2,80-2,71 (m, 2H), 2,38 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 1,44 (d, J = 5,6 Hz, 3H), 0,84-0,79 (m, 2H), 0,57-0,50 (m, 2H).
EJEMPLO 10:
(R)-6-(5'-Cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-N-cidopropil-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-amina (B4)
Figure imgf000024_0001
Ruta de síntesis D:
Figure imgf000024_0002
(R)-6-(5'-Cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-N-cidopropil-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-amina (B4). A un tubo sellado de 10 ml se añadieron
(R)-6-(5'-cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metM-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina (compuesto B1-5, 35 mg, 0,08 mmol) y f-BuOH (5 ml). Se añadió lentamente una solución de oxona (65 mg, 0,21 mmol) en H2O (1 ml) a la temperatura ambiente y se dejó en agitación durante 5 h. A continuación se añadió ciclopropilamina (48 mg, 0,85 mmol) a la solución de reacción, y la mezcla se agitó a 90 °C durante 36 h. Después de eliminar el disolvente, el residuo se inactivó con salmuera (20 ml) y se extrajo con EtOAc (20 ml x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc = de 2/1 a 1/1) para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (7 mg, 20 %). [a]¡52 = -76,4 (c 0,5, CHCh); ee = 97 %. RMN-1H (400 MHz, CDCla) 88,35 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,16 (s, 1H), 7,42 (s, 1H), 6,61 (s, 1H), 5,44-5,35 (m, 1H), 5,22 (s, 1H), 4,42-4,30 (m, 1H), 3,44-3,37 (m, 1H), 2,97-2,85 (m, 1H), 2,80-2,70 (m, 2H), 2,37 (s, 3H), 2,17 (s, 3H), 1,44 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,86-0,79 (m, 2H), 0,54-0,51 (m, 2H).
EJEMPLO 11: Preparación de (R)-N-(6-(5'-cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,
Figure imgf000024_0003
3-d]pirimidin-2-il)propionamida (B5)
Ruta de síntesis E:
Figure imgf000025_0001
(R)-6-(5'-Cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirim idin-2-amina (B5-1). A un tubo sellado de 45 ml se añadió (R)-6-(5'-cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metM-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidina (compuesto B1-5, 550 mg, 1,3mmol) y f-BuOH (20 ml). Se añadió lentamente una solución de oxona (820 mg, 2,6 mmol) en H2O (5 ml) a la temperatura ambiente y se dejó en agitación durante 5 h. A continuación se añadió NH4OH (25-28 %, 3 ml) a la solución de reacción, y la mezcla se agitó a 90 °C durante 36 h. Después de eliminar el disolvente, el residuo se inactivó con salmuera (20 ml) y se extrajo con EtOAc (20 ml x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = de 1/1 a 1/2) para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (200 mg, 39 %).
(R)-N-(6-(5'-cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-il)propionamida (B5). A una solución de (R)-6-(5'-cloro-3,5-dimetM-[2,4’-bipiridin]-2’-M)-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-amina (compuesto B5-1, 50 mg, 0,13 mmol) y trietilamina (141 mg, 1,4 mmol) en 10 ml de CH2Cl2 se añadió cloruro de propionilo (120 mg, 1,3 mmol). La mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 5 h. Una vez completada la reacción, la mezcla se trató con salmuera (20 ml) y se extrajo con CH2Ch (30 ml). La capa orgánica se evaporó y el residuo se disolvió en 10 ml de THF. A continuación se añadió NH4OH (25-28 %, 2 ml). La mezcla resultante se agitó a la temperatura ambiente hasta el día siguiente. La reacción se diluyó con salmuera (20 ml) y se extrajo con EtOAc (15 ml x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = 1/1) para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (20 mg, 35 %). RMN-1H (400 MHz, CDCla) 88,38 (s, 1H), 8,35 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 6,64 (s, 1H), 5,62-5,50 (m, 1H), 4,41-4,38 (m, 1H), 3,46-3,39 (m, 1H), 3,07-2,98 (m, 1H), 2,90-2,86 (m, 1H), 2,80-2,66 (m, 2H), 2,38 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 1,48 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,23 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
EJEMPLO 12: Preparación de (R)-N-(6-(5'-cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-il)pivalamida (B6)
Figure imgf000025_0002
Ruta de síntesis F:
(R)-N-(6-(5'-Cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-il)pivalamida (B6). Se agitó una mezcla de (R)-6-(5'-cloro-3,5-dimetil-[2,4'-bipiridin]-2'-il)-5-metil-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-2-amina (100 mg, 0,26 mmol), cloruro de trimetilacetilo (157 mg, 1,3 mmol) y DIPEA (201 mg, 1,56 mmol) en 5 ml de dioxano a 100 °C hasta el día siguiente. La reacción se trató con NaHCO3 2 M (20 ml) y se extrajo con EtOAc (20 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante una cromatografía en columna sobre gel de sílice (éter de petróleo/EtOAc v:v = 2/1) para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (40 mg, 32 %). Rm N-1H (400 MHz, CDCh) 88,41 (s, 1H), 8,35 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,03 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 6,63 (s, 1H), 5,65-5,43 (m, 1H), 4,47-4,27 (m, 1H), 3,48-3,30 (m, 1H), 3,09-3,01 (m, 1H), 2,94-2,86 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 1,47 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 1,33 (s, 9H).
EJEMPLO 13: Evaluación in vitro de la inhibición del citocromo P450 (CYP)
Los compuestos B y B1 se analizaron en ensayos de inhibición del CYP.
Ensayo de inhibición del CYP:
las cinco isoenzimas principales del CYP y sus correspondientes sustratos son: CYP-1A2 (fenacetina, 30 j M), CYP2A6 (tolbutamida, 100 j M), CYP2C9 (hidroxilación de tolbutamida), CYP2C19 (S-mefenitoína, 40 j M), CYP2D6 (dextrometorfano, 5 j M) y CYP3A4 (midazolam, 1 j M), respectivamente. Todos los sustratos de las sondas se utilizaron a, o por debajo de, sus concentraciones KMS.
Se puede incubar una mezcla (200 j l ) a 37 °C. Esta mezcla puede comprender HLM (0,2 mg/ml), tampón de fosfato (100 mM, pH aproximadamente a 7,4), fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADPH) (1 j M), un compuesto de prueba (compuesto B o compuesto B1) y el sustrato individual de la isoenzima CYP analizada.
Antes de iniciar la reacción con el NADPH, la mezcla anterior puede preincubarse durante aproximadamente 10 minutos para que se produzcan las interacciones inhibidor-enzima. A continuación, en unos puntos temporales específicos (punto temporal de 10 minutos para CYP-1A2, 2D6 y 3A4; punto temporal de 30 minutos para CYP-2C9 y 2C19), la reacción puede inactivarse mediante la adición de aproximadamente 100 j l de acetonitrilo frío. La mezcla inactivada puede centrifugarse y, a continuación, se pueden analizar alícuotas de la mezcla mediante CL-EM/EM para cuantificar las concentraciones de los productos metabólicos específicos de cada isoenzima del CYP. Para cada compuesto de prueba se pueden completar al menos tres ensayos independientes. Los resultados del ensayo de inhibición del CYP pueden mostrarse en la siguiente tabla 6.
T l R l l inhi i i n l YP r l m B B1
Figure imgf000026_0001
De acuerdo con la tabla 6, el compuesto B mostró más de un 50 % de inhibición del CYP-2C9, mientras que el compuesto B1 mostró aproximadamente un 26 % de inhibición del CYP-2C9 a una concentración de 10 j M.
EJEMPLO 14: Experimentos de farmacocinética de los compuestos B, B1 y A-55
Los compuestos B, B1 y A-55 se sometieron a evaluaciones farmacocinéticas como sigue.
Experimentos de farmacocinética:
los sujetos de prueba, ratas Sprague-Dawley (peso corporal de aproximadamente 220 g a aproximadamente 250 g), se adquirieron en Slac Laboratory Animals (Shanghai, China). Todos los compuestos se probaron a una concentración de 1 mg/ml, bien por vía intravenosa inyectados en una vena de la cola a una dosis de 1 ml/kg en un grupo de sujetos de prueba o bien administrados por vía oral a una dosis de 10 ml/kg en otro grupo de sujetos de prueba. A continuación, se recogieron alícuotas de muestras de sangre por punción del plexo venoso retroorbital en unos intervalos de tiempo después de la inyección/administración. Las muestras de sangre se conservaron en tubos que contenían EDTA, se centrifugaron y se almacenaron a -80 °C antes del análisis. El plasma usado como blanco se recogió mediante el mismo método antes de tratar a las ratas con los compuestos. Las muestras de plasma para el análisis se obtuvieron extrayendo aproximadamente 25 j l de la muestra de sangre guardada; añadiendo acetonitrilo frío (aproximadamente 100 j l) como estándar interno; centrifugando durante 10 minutos para precipitar las proteínas plasmáticas; y recogiendo aproximadamente 10 j l de la solución clara superior para el análisis realizado mediante un sistema de CL-EM/EM.
Método de análisis de CL-EM/EM:
todas las muestras se analizaron con un sistema de CL/EM/EM API 4000 QTRAP® equipado con una bomba Shimadzu LC-20AD, un controlador CBM-20A, un tomamuestras automático SIL-20A y un desgasificador DGU-20A (Shimadzu, Columbia, MD, EE.UU.). Se utilizó una columna de HPLC Venusil XBP C18 (de 2,1 x 50 mm, 5 |jm) (Bonna-Agela Technologies) para la separación por HPLC a una temperatura isocrática de 40 °C. El caudal se mantuvo a 0,3 ml/min y el tiempo total de desarrollo se mantuvo en 6 minutos.
La cuantificación por EM/EM se realiza utilizando el espectrómetro de masas API 4000 QTRAP descrito anteriormente, equipado con modos de monitorización de reacciones múltiples (MRM) y de ionización por electropulverización positiva (ESI+). Todos los compuestos y el patrón interno se detectaron a un tiempo de retención de aproximadamente 100 milisegundos. A continuación se muestran otros parámetros de la EM/EM: gas fuente de iones 1 (GS1) a 206,84 kPa (30 psi), presión de la turbina a 3,86 kg/cm2 (55 libras), tensión de pulverización de iones a 4500 V y temperatura de la fuente de iones a 500 °C. Las mediciones de la MRM de los analitos se llevaron a cabo utilizando unos valores del potencial de desagrupación (DP) y del potencial de entrada (EP) optimizados para cada analito. Finalmente, todas las operaciones, la adquisición y el análisis de los datos se controlaron mediante Analyst (versión 1.5.2, AB Sciex, EE.UU.).
Los resultados experimentales se muestran en la tabla 7 y en las FIG. 14 y 15.
T abla 7. Resultados de los ex erimentos de farmacocinética de los com uestos B B1 A-55.
Figure imgf000027_0001
Los resultados experimentales mostraron que el compuesto quiral B1 puede ser superior al compuesto racémico B en las mediciones del AUC (casi se duplicó) y de la biodisponibilidad (aumentó del 53 % a aproximadamente el 100 %). Además, el compuesto quiral B1 puede tener una tasa de absorción mayor en los animales que el compuesto racémico B. El compuesto quiral B1 también puede tener unos niveles plasmáticos más estables y de mayor duración en comparación con el compuesto racémico B. Para la dosis p.o. de 10 mg/kg, el compuesto quiral B1 puede mantener una concentración plasmática de 623 ng/ml en el punto temporal de 8 horas, que puede ser de aproximadamente 1340 nM, aproximadamente 1675 veces su valor de la CI50 (0,8 nM). Incluso teniendo en consideración la absorción por parte de las proteínas plasmáticas, el compuesto quiral B1 puede lograr su deseada inhibición de la señalización Hedgehog. Por el contrario, el compuesto racémico B puede tener una concentración plasmática de 83 ng/ml en el punto temporal de 8 horas, o aproximadamente 178 nM, aproximadamente 66 veces su valor de la CI50 (2,7 nM).
Los resultados experimentales también mostraron que, en comparación con el compuesto desmetilado A-55, el compuesto quiral B1 puede aumentar su biodisponibilidad (100 % para B1 frente al 62 % para A-55), y su semivida es más larga en el organismo de los animales, una mejor exposición al fármaco (el AUS de B1 aumenta en un 122 % con respecto a la de A-55).
En conjunto, los resultados experimentales mostraron que, en comparación con el compuesto desmetilado A-55 y el compuesto racémico B, el compuesto quiral B1 puede inhibir mejor y durante más tiempo la vía de señalización Hh, por lo tanto, puede disfrutar de una mejor aplicación en el tratamiento de enfermedades asociadas a la vía de señalización Hh.
EJEMPLO 15: Inhibición de tumores en ratones
Los compuestos B y B1 se probaron en estudios de inhibición tumoral en ratones como sigue.
Experimentos de inhibición tumoral:
se puede inyectar por vía intravenosa meduloblastoma primario (5 x 106) de ratones Patched (PTCH)+/-, p53-/-, en los costados derechos de ratones SCID. Siete días después de la inyección, el tratamiento con fármacos puede comenzar cuando el tamaño medio de los tumores alcance los 200 mm3. Los sujetos pueden ser asignados aleatoriamente al grupo de control, al grupo de tratamiento con el compuesto B y al grupo de tratamiento con el compuesto B1. Los compuestos B y B1 pueden administrarse a unas dosis de aproximadamente 100 mg/kg/día. El volumen tumoral y los pesos corporales de los sujetos pueden medirse y registrarse cada dos días. El día 14 después de la administración del fármaco, los sujetos pueden ser sacrificados y se pueden extirpar sus tumores. Los resultados de los experimentos se muestran en las FIG. 16 y 17.
A una dosis de 100 mg/kg, el compuesto racémico B puede detener el crecimiento de los tumores. Por el contrario, a una dosis de 100 mg/kg, el compuesto quiral B1 puede disminuir el volumen tumoral y puede reducir el tamaño tumoral tan drásticamente que se puede considerar que el tumor ha sido extirpado.
La tabla 4 muestra una selección de compuestos preparados de acuerdo con los métodos divulgados de la presente divul ación.
Figure imgf000028_0001
Actividades biológicas:
El ensayo primario se basa en el ensayo del gen indicador NIH3T3-GRE-Luc:
se mantuvieron células NIH3T3 (CRL-1658, ATCC) en DMEM (11965, Gibico) suplementado con un 10% de FBS (Hyclone). El plásmido GRE-Luc se generó clonando 8 veces el elemento de respuesta a Gli-1 (GRE) en el MCS del pGL4.26 (Promega). Se establecieron líneas celulares indicadoras NIH3T3-GRE-Luc mediante una selección con higromicina (Invitrogen) tras transfectarlas con el plásmido indicador de luciferasa GRE-Luc. Los clones individuales fueron validados para la calidad del ensayo con el fragmento aminoterminal de la proteína sonic hedgehog recombinante o el agonista de molécula pequeña SAG (ABIN629346). Los clones seleccionados se utilizaron para controlar la señalización Hh.
Las células NIH3T3-GRE-Luc se mantuvieron en medio de cultivo completo (DMEM con L-Gln 4mM, 1,5 g/l de bicarbonato sódico y 4,5 g/l de glucosa suplementado con 100 pg/ml de higromicina y FBS al 10 %). Cuando fueron confluentes, las células se tripsinizaron y se resuspendieron en medio de ensayo (DMEM que contiene un 0,5 % de suero). Después se añadieron 100 pl/pocillo de una suspensión de células a la placa de 96 pocillos (la concentración final de células es de 15.000 células/pocillo), las células se cultivaron durante 48 horas adicionales antes de añadir los compuestos.
Los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y se volvieron a diluir con el medio de ensayo. En una realización, se añadió SAG 10 nM al medio de ensayo como el agonista de la señalización Hh. Después de preparar los compuestos y el agonista, se retira con cuidado el medio (se aspira el medio con una pipeta en lugar de hacerlo a vacío, ya que de lo contrario se desprendería la monocapa de células NIH3T3). Se añadieron con cuidado a la célula 100 pl de medio de ensayo que contenía el compuesto o el agonista. Las placas con las células se incubaron a 37 grados durante 48 horas adicionales.
Después de 48 horas de incubación, se añadieron 40 pl/pocillo de medio de luciferasa (Brigh-Glo, Promega) a las células. La placa se incubó a la temperatura ambiente durante 5 min con agitación suave. La señal de luminiscencia se midió con un lector de placas (PHERAstar FS, BMG). La potencia de los compuestos se calculó tomando como base la inhibición de la señalización de la luminiscencia. En la FIG. 10 se muestran las curvas de la medición de la CI 50 para el GDC-0449 patrón (vismodegib) cuando se utiliza el ensayo primario.
Figure imgf000029_0001
GDC-0449 (vismodegib)
El ensayo de confirmación se basa en el ensayo de unión de bodipy-ciclopamina:
el ensayo de unión de Bodipy-ciclopamina es un ensayo basado en fluorescencia utilizado para analizar la unión de agonistas Smo. Se establecieron clones estables Hek293-SMO mediante selección con puromicina (1 pg/ml, Invitrogen) tras la transfección con el plásmido SMO-HA-pLVX; las células Hek293-SMO se mantuvieron en medio de cultivo completo (DMEM con L-Gln 4mM, 1,5 g/l de bicarbonato sódico y 4,5 g/l de glucosa suplementado con 100 pg/ml de higromicina y FBS al 10 %). La expresión del SMO se validó mediante una inmunoelectrotransferencia y una inmunofluorescencia celular. La Bodipy-Ciclopamina se adquirió en Toronto Research Chemicals y se disolvió en metanol.
Las células Hek293-SMO se colocaron en placas de 96 pocillos (3340, Corning), la concentración final de células es de 15.000 células/pocillo en 100 pl de DMEM que contiene un 1 % de suero. Las placas se incubaron a 37 grados durante 48 horas adicionales.
Las placas Hek293-SMO se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% (PFA)/PBS durante 20 minutos a la temperatura ambiente. Después de eliminar el tampón de PFA, las células se incubaron con DAPI/PBS (5 pg/ml) durante 10 min seguido de dos lavados con PBS. Después de los lavados, las células se incubaron durante 2 h a la temperatura ambiente en tampón de unión (HBSS sin Ca2+ ni Mg2+) que contenía bodipy-ciclopamina 100 nM y compuestos en un intervalo de concentraciones de 0-10 pM para la unión competitiva. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con el PBS. Las imágenes de fluorescencia fueron capturadas y analizadas automáticamente mediante un sistema de imagen de fluorescencia de alto contenido (Arrayscan VTI, Thermo). Se utilizó GDC-0449 como compuesto de referencia para normalizar los datos. Los valores de la CI50 se calcularon con el programa informático GraphPad Prism utilizando una función sigmoide para la dosis-respuesta. La Ki se calculó siguiendo la ecuación de Cheng-Prusoff, como Kj = CI50 / [l [bodipy-ciclopamina]/Kd)]. La Kd de bodipy-ciclopamina para WT-Smo es de 3,5 ± 0,8 nM.
Los compuestos mencionados anteriormente y otros diversos compuestos se probaron en los ensayos descritos anteriormente, y los datos se resumieron en la tabla 5. El compuesto patrón era vismodegib y su potencia figuraba en la columna 4 como control. La relación era el valor de la CI50 de vismodegib con respecto a la del compuesto probado en el mismo ensayo. Algunas de las curvas probadas se muestran en las FIG. 11-13.
Tabla 5. Resultados de las pruebas de los compuestos seleccionados (B1-B6) de la presente invención y de otros compuestos (B-D) en el ensayo primario.
Figure imgf000030_0001

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar un compuesto heterocíclico quiral con actividad antagonista de la vía Hedgehog de acuerdo con la fórmula I:
Figure imgf000031_0001
método que comprende:
i) mezclar (1S,2S)-(+)-N-p-toluensulfonil-1,2-difeniletilendiamina, dímero de dicloro (p-metilcumeno) de rutenio (II), amina y una solución de ácido fórmico-acetonitrilo para dar una solución mixta; mezclar el compuesto
Figure imgf000031_0002
en la solución de acetonitrilo con la solución mixta para que reaccione; ajustar el pH del sistema a 8,0 con bicarbonato sódico; realizar la extracción y la purificación para preparar
Figure imgf000031_0003
ii) reacción de acoplamiento entre el compuesto
Figure imgf000031_0004
y el compuesto
Figure imgf000031_0005
para preparar el compuesto
Figure imgf000032_0001
y
iii) oxidar el metiltio del compuesto
Figure imgf000032_0002
y hacer reaccionar con 4-hidroxipiperazina para obtener el compuesto heterocíclico quiral
Figure imgf000032_0003
2. El método de la reivindicación 1, en donde la concentración de ácido fórmico en su solución de acetonitrilo es de 2,0 a 3,5 mmol/ml; la concentración del compuesto
Figure imgf000032_0004
en su solución de acetonitrilo es de 0,1 a 1,0 mmol/ml.
3. Un compuesto de Fórmula III:
Figure imgf000032_0005
R2 es metilo; , y R'2 es H;
R1 es
Figure imgf000033_0002
en las que W10 es H;
Wi, W2, W3, W4, W5, W6, W7, W8 y W9 son independientemente H; y
A es N.
4. El compuesto de la reivindicación 3, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000033_0001
5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 3-4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5 para usar como una composición farmacéutica antineoplásica.
7. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 3-4 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para usar como un fármaco antineoplásico.
8. El compuesto para usar de acuerdo con la reivindicación 7 en donde el tumor es cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer rectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer oral, cáncer de esófago, carcinoma nasofaríngeo, cáncer de piel, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer de sangre o una combinación de los mismos.
9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en donde la composición comprende además al menos dos sales farmacéuticamente aceptables del compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 3-4.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde la composición comprende además uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en cisplatino, paclitaxel, camptotecina, trastuzumab, gleevec, imatinib, gefitinib, erlotinib y lapatinib.
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