ES2902325T3

ES2902325T3 - Composición farmacéutica oftálmica

Info

Publication number: ES2902325T3
Application number: ES17907584T
Authority: ES
Inventors: Guang-Jin Im; Byung-Jhip Ha; Na-Won Park; Yong-Seop Park
Original assignee: Sam Chun Dang Pharm Co Ltd
Current assignee: Sam Chun Dang Pharm Co Ltd
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2022-03-28
Anticipated expiration: 2037-10-13
Also published as: KR101861163B1; JP2019517513A; EP3452075B1; US10646546B2; PL3452075T3; TW201838646A; CN109475597B; TWI763802B; EP3452075A4; EP3452075A1; CN109475597A; WO2018199408A1; US20190160145A1; JP6677827B2

Abstract

Una composición farmacéutica oftálmica que tiene un pH que varía de un pH de 5,2 a 5,7, que comprende (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de aflibercept; (b) un agente tamponante de acetato de sodio de 10 a 20 mM; (c) un azúcar del 6 al 8 % p/v o un alcohol de azúcar del 3 al 7 % p/v; y (d) un tensioactivo del 0,01 al 0,1 % p/v en un medio acuoso, en donde la composición farmacéutica oftálmica está exenta un agente de tonicidad iónica.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición farmacéutica oftálmica

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a una composición farmacéutica oftálmica que comprende aflibercept como principio activo. Más específicamente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica oftálmica que contiene aflibercept con un pH determinado, que comprende un agente tamponante de sal acetato y está exenta de un agente de tonicidad iónica.

Antecedentes de la técnica

Se sabe que la angiogénesis está implicada en la patogenia de diversas enfermedades, tales como tumores sólidos, retinopatías proliferativas, la degeneración macular asociada a la edad (DMAE) y la artritis reumatoide. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), uno de los factores necesarios para la angiogénesis, se expresa en los cánceres humanos y desempeña una función importante en la neoangiogénesis tumoral. Además, la presencia de VEGF en una concentración elevada en el líquido ocular está altamente correlacionada con la actividad de vascularización en pacientes diabéticos y otros pacientes con retinopatía isquémica (Aiello LP, et al., N Engl J Med 1994; 331: 1480-1487) y conduce a la localización de factores de crecimiento en las membranas neovasculares coroideas de pacientes con degeneración macular asociada a la edad (DMAE) (Amin R1, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. Julio de 1994; 35(8): 3178-88). Por lo tanto, los anticuerpos anti-VEGF o los inhibidores de VEGF pueden ser candidatos prometedores para el tratamiento de tumores sólidos y enfermedades asociadas a la angiogénesis en el ojo.

El aflibercept, uno de los inhibidores del VEGF, es una proteína de fusión recombinante que consiste en porciones de unión a VEGF de los dominios extracelulares de receptores 1 y 2 humanos de VEGF que se fusionan con la porción Fc de la inmunoglobulina IgG1 humana. El aflibercept se ha aprobado en los Estados Unidos y Europa para el tratamiento de la degeneración macular húmeda con el nombre comercial de Eylea™.

En composiciones farmacéuticas que contienen proteínas en condiciones no óptimas se producen modificaciones fisicoquímicas. En particular, factores tales como la concentración de una proteína, el tipo de agentes tamponantes, el tipo y la concentración de agentes estabilizantes, el tipo y la concentración de cosolventes orgánicos, la concentración de una sal, el pH, la temperatura y el contacto con el aire, afectan significativamente a la oxidación, la desamidación, la isomerización y la polimerización de una proteína. Estas modificaciones provocan agregaciones, fragmentos, isómeros de la proteína, de manera que la actividad biológica de la misma puede reducirse. Especialmente, la agregación de proteínas, que es un factor interno importante en la formación de micropartículas insolubles, puede provocar efectos secundarios tales como reacciones inmunitarias. Y además, debido a las características de las formulaciones oftálmicas, las partículas insolubles deben ser restringirse o controlarse estrictamente.

La Patente Coreana N.° 10-1406811 (Publicación de Patente Internacional N.°WO 2007/149334) ha desvelado una formulación oftálmica y una formulación liofilizable que tiene un pH de 5,8 a 7,0, que comprende aflibercept; un cosolvente orgánico tal como polisorbato; un agente de tonicidad iónica seleccionado de cloruro de sodio o cloruro de potasio; un agente tamponante de fosfato de sodio; y un estabilizante tal como sacarosa, estando cada uno de ellos en una concentración específica. La formulación desvelada en la Patente Coreana N.° 10-1406811 puede aplicarse a una jeringa precargada adecuada para la administración intravítrea.

Se ha descrito que la formulación oftálmica y la formulación liofilizable desveladas en la Patente Coreana N.° 10 1406811 tienen un efecto de inhibición de la producción de impurezas y subproductos debidos a la agregación, la fragmentación y la isomerización del aflibercept. Sin embargo, dichas formulaciones eran problemáticas en el sentido de que el efecto de estabilización del aflibercept se reducía notablemente en condiciones de estrés, por ejemplo, en condiciones de temperatura elevada de 40 °C o más (Publicación de Patente Coreana N.° 10-2017-0000356 (o documento US 2016/0376342 que pertenece a la misma familia que el documento Coreano N.° 10-2017-0000356)).

Divulgación

Problema técnico

Los presentes inventores realizaron diversas investigaciones con el fin de desarrollar una preparación oftálmica estable que pueda minimizar la formación de impurezas derivadas del aflibercept (impurezas diméricas o multiméricas) en condiciones aceleradas y de estrés, así como en condiciones de almacenamiento en frío. Especialmente, los presentes inventores realizaron diversos estudios de formulación que incluían agentes tamponantes, agentes isotónicos, intervalos de pH y similares. Como resultado de esto, los presentes inventores han descubierto que el uso de un agente de tonicidad iónica tal como el NaCl provoca la formación de impurezas diméricas o multiméricas derivadas del aflibercept. Y además, los presentes inventores han descubierto que, cuando la tonicidad se ajusta controlando la cantidad de azúcar o alcohol de azúcar sin usar un agente de tonicidad iónica tal como NaCI; y el pH se ajusta a un pH de 5,2 a 5,7 usando un agente tamponante específico, que es acetato de sodio, la formación de impurezas diméricas y multiméricas puede reducirse notablemente y la actividad biológica puede mantenerse a un nivel elevado durante mucho tiempo.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica oftálmica que contiene aflibercept como se reivindica que tiene un pH de 5,2 a 5,7, que comprende un agente tamponante de acetato de sodio y está exenta de un agente de tonicidad iónica.

Solución técnica

La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines de información. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica oftálmica que tiene un pH que varía de un pH de 5,2 a 5,7, que comprende (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de aflibercept; (b) un agente tamponante de acetato de sodio de 10 a 20 mM; (c) un azúcar del 6 al 8 % p/v o un alcohol de azúcar del 3 al 7 % p/v; y (d) un tensioactivo del 0,01 al 0,1 % p/v en un medio acuoso, en donde la composición farmacéutica oftálmica está exenta un agente de tonicidad iónica.

El aflibercept puede estar presente en una concentración que varía de 20 a 50 mg/ml.

El agente tamponante es un agente tamponante de acetato de sodio. El agente tamponante está presente en una concentración que varía de 10 a 20 mM, más preferentemente, de 10 a 15 mM.

El azúcar puede ser preferentemente sacarosa, trehalosa, o una mezcla de las mismas, más preferentemente, sacarosa o trehalosa, mucho más preferentemente, sacarosa. El azúcar está presente en una concentración que varía del 6 al 8 % p/v. Y además, el alcohol de azúcar puede ser sorbitol. El alcohol de azúcar puede estar presente en una concentración de aproximadamente el 5 % p/v.

El tensioactivo puede ser un éster de ácido graso de polioxietileno sorbitano, copolímero de bloque de polioxietilenopolioxipropileno o una mezcla de los mismos, preferentemente monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano o monooleato de polioxietileno (20) sorbitano, más preferentemente, monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano. En una realización, el tensioactivo puede estar presente en una concentración de aproximadamente el 0,03 % p/v.

En una realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica oftálmica que tiene aproximadamente un pH de 5,5, que consiste en aflibercept 40 mg/ml; un agente tamponante de acetato de sodio de 10 a 15 mM; sacarosa al 7 % p/v; monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano al 0,03 % p/v y un medio acuoso.

En otra realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica oftálmica que tiene aproximadamente un pH de 5,5, que consiste en aflibercept 40 mg/ml; un agente tamponante de acetato de sodio de 10 a 15 mM; trehalosa al 8 % p/v; monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano al 0,03 % p/v y un medio acuoso.

Efectos ventajosos

Se ha descubierto por la presente invención que el uso de un agente de tonicidad iónica tal como NaCl no solamente provoca la formación de impurezas diméricas o multiméricas derivadas del aflibercept, sino que también afecta a la actividad biológica del mismo. En la composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la presente invención, la tonicidad se ajusta controlando la cantidad de azúcar o alcohol de azúcar sin usar un agente de tonicidad iónica tal como NaCl; y el pH se ajusta a un pH de 5,2 a 5,7 usando un agente tamponante de sal acetato de sodio, siendo capaz, por lo tanto, de reducir la formación de impurezas diméricas y multiméricas en condiciones aceleradas y de estrés, así como en condiciones de almacenamiento en frío; y mantener la actividad biológica a un nivel elevado durante mucho tiempo. Por lo tanto, la composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la presente invención mejora las estabilidades fisicoquímicas y biológicas, siendo susceptible, por lo tanto, de aplicarse adecuadamente a una jeringa precargada para la administración intravítrea y la administración intraocular en pacientes que padecen diversas enfermedades oftálmicas tales como la degeneración macular asociada a la edad húmeda y el edema macular diabético.

Descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra los resultados obtenidos mediante la realización del ensayo de formación de tubos de células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC, por sus siglas en inglés) usando la composición farmacéutica oftálmica de la presente invención.

Mejor modo

La presente invención proporciona una composición farmacéutica oftálmica que tiene un pH que varía de un pH de 5,2 a 5,7, que comprende (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de aflibercept; (b) un agente tamponante de acetato de sodio de 10 a 20 mM; (c) un azúcar del 6 al 8 % p/v o un alcohol de azúcar del 3 al 7 % p/v; y (d) un tensioactivo del 0,01 al 0,1 % p/v en un medio acuoso, en donde la composición farmacéutica oftálmica está exenta un agente de tonicidad iónica.

El aflibercept utilizado como principio activo en la composición farmacéutica de la presente invención se incluye en una cantidad terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, el aflibercept puede estar presente en una concentración que varía de 10 a 50 mg/ml, preferentemente en una concentración que varía de 20 a 50 mg/ml, más preferentemente, en una concentración de aproximadamente 40 mg/ml, pero sin limitarse a esto.

El medio acuoso incluye cualquier medio acuoso que sea capaz de proporcionar un tampón junto con el agente tamponante de acetato de sodio de la invención. Por ejemplo, el medio acuoso incluye agua para inyección, agua destilada estéril, etc.

Puede proporcionarse un pH deseado controlando la relación entre el acetato y el metal (sodio) en el agente tamponante. El agente tamponante de sal acetato de sodio está presente en una concentración que varía de 10 a 20 mM, mucho más preferentemente, de 10 a 15 mM.

El azúcar puede ser preferentemente sacarosa, trehalosa, o una mezcla de las mismas, más preferentemente, sacarosa o trehalosa, mucho más preferentemente, sacarosa. El azúcar está presente en una concentración que varía del 6 al 8 % p/v o un alcohol de azúcar está presente en una concentración que varía del 3 al 7 % p/v; Y además, se ha descubierto por la presente invención que, cuando el azúcar está presente en una concentración que varía del 6 al 8 % p/v, la composición farmacéutica presenta una osmolalidad similar a la osmolalidad de la solución salina fisiológica (aproximadamente 290 mOsmol/kg), así como una estabilidad excelente. Por lo tanto, el azúcar está presente en una concentración que varía del 6 al 8 % p/v. Además, el alcohol de azúcar puede ser sorbitol. El alcohol de azúcar puede estar presente en una concentración de aproximadamente el 5 % p/v.

El tensioactivo puede ser un éster de ácido graso de polioxietileno sorbitano (por ejemplo, Polisorbato 20, Polisorbato 80, etc.), copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno (por ejemplo, Poloxamer 188™, etc.) o una mezcla de los mismos, preferentemente monolaurato de polioxietileno sorbitano (20) (Polisorbato 20) o monooleato de polioxietileno sorbitano (20) (Polisorbato 80), más preferentemente, monolaurato de polioxietileno sorbitano (20). El tensioactivo está presente en una concentración que varía del 0,01 al 0,1 % p/v. En una realización, el éster de ácido graso de polioxietileno sorbitano puede estar presente preferentemente en una concentración que varía del 0,01 al 0,03 % p/v, más preferentemente, en una concentración de aproximadamente el 0,03 % p/v. En otra realización, el copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno puede estar presente preferentemente en una concentración que varía del 0,03 al 0,1 % p/v.

La composición farmacéutica de la presente invención puede cargarse en un vial de vidrio. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede proporcionarse en forma de una jeringa precargada.

La presente invención se describirá en más detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son con fines ilustrativos únicamente y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplo: Preparación y evaluación de composiciones oftálmicas

(1) Preparación de composiciones oftálmicas

Se prepararon composiciones oftálmicas de acuerdo con los componentes y las cantidades que se muestran en las Tablas 1 y 2. Cada pH de las composiciones se controló cambiando la relación entre el sodio y el acetato en el agente tamponante de acetato de sodio o cambiando la relación entre el sodio y el citrato en el agente tamponante de citrato de sodio (las composiciones en donde el agente tamponante es citrato de sodio no son de acuerdo con la invención). Específicamente, después de preparar el tampón de acetato de sodio o el tampón de citrato de sodio que tiene cada pH, se disolvieron aflibercept, azúcar (sacarosa o trehalosa) o alcohol de azúcar (sorbitol) y Polisorbato 20 en los mismos con agitación para preparar cada formulación. La Formulación 1-13 se preparó usando fosfato de sodio como agente tamponante y disolviendo adicionalmente cloruro de sodio como agente de tonicidad iónica (esta formulación no es de acuerdo con la invención). Y además, Las Formulaciones 1-14, 2-13 y 2-14 se prepararon disolviendo adicionalmente cloruro de sodio como agente de tonicidad iónica (estas formulaciones no son de acuerdo con la invención). La osmolalidad de cada formulación resultante se muestra en las Tablas 1 y 2.

En las Tablas 1 y 2, los Ejemplos que ilustran la invención (1-15 y 2-1 a 2-10) son aquellos que pertenecen al alcance de las reivindicaciones adjuntas. Los ejemplos que no pertenecen al alcance de las reivindicaciones adjuntas (1-1 a 1-14 y 2-11 a 2-14) no son ilustrativos de la invención.

Tabla 1

_____ _____

Tabla 2

continuación

(2) Evaluación de la formación de fragmentos, dímeros y multímeros derivados de aflibercept en condiciones de estrés y aceleradas

Después del almacenamiento de cada formulación preparada en el caso anterior en un vial de vidrio de 3 ml a 25 °C o 40 °C durante 8 semanas, el contenido de aflibercept (monómero) y sus fragmentos, dímeros o multímeros se midieron a través de análisis por HPLC de exclusión por tamaño (SEC-HPLC, por sus siglas en inglés) y dispersión de luz dinámica (DLS, por sus siglas en inglés). Las condiciones para el análisis por SEC-HPLC son las siguientes; Columna: TSK-GEL G3000SWXL, 7,8 X 30 (DI mm X L cm) (Tosoh, n.° de Cat. 08541), Fase móvil: tampón de fosfato de potasio 200 mM (pH 6,2) que contiene KCI 250 mM y NaN3 al 0,05 %, Caudal: 0,5 ml/min y Longitud de onda: 280 nm. El análisis por DLS se realizó especificando el Promedio Z y el IPD (índice de polidispersidad, por sus siglas en inglés) con el sistema Zetasizer Nano (Malvern).

Los resultados del análisis por SEC-HPLC se muestran en las Tablas 3 y 4; y los resultados del análisis por DLS se muestran en las Tablas 5 y 6.

Tabla 3

Tabla 4

Tabla 5

continuación

Tabla 6

Como se muestra en los resultados de las Tablas 3 a 6, puede observarse que, cuando la formulación desvelada en el documento WO 2007/149334 (es decir, la Formulación 1-13) se almacenó en condiciones aceleradas (25 °C) y condiciones de estrés (40 °C) durante 8 semanas, las impurezas diméricas y multiméricas derivadas del aflibercept se formaron en niveles elevados. Y además, en las Formulaciones 1-14 y 2-13, que se prepararon usando el mismo agente de tonicidad iónica y el mismo azúcar que en la formulación conocida (es decir, la Formulación 1-13) y ajustando el pH usando el tampón de acetato de sodio como en la Formulación 1-3, las impurezas diméricas y multiméricas derivadas del aflibercept se formaron en niveles similares a los de la formulación conocida (es decir, la Formulación 1-13). A partir de estos resultados, puede confirmarse que la formación de impurezas diméricas y multiméricas derivadas del aflibercept aumenta significativamente por el agente de tonicidad iónica (por ejemplo, NaCl). Además, también puede confirmarse que, en los casos de las formulaciones (es decir, las Formulaciones 2-11 y 2-12) que contienen el agente tamponante de sal citrato en lugar del agente tamponante de sal acetato, el citrato actúa como una sal iónica, aumentando por lo tanto significativamente la formación de impurezas diméricas y multiméricas derivadas del aflibercept.

Se almacenaron formulaciones oftálmicas que tenían distintos pH que se prepararon aumentando la cantidad de azúcar sin el uso del agente de tonicidad iónica (es decir, las Formulaciones 1-1 a 1-12 y las Formulaciones 2-1 a 2 10) en condiciones aceleradas (25 °C) y en condiciones de estrés (40 °C) durante 8 semanas y después se midieron las impurezas diméricas y multiméricas derivadas del aflibercept. Como resultado de esto, las formulaciones que tienen un pH de 5,2 a 5,7 y están exentas del agente de tonicidad iónica, es decir, las Formulaciones 1-2, 1-3, 1-4, 1-8, 1-9, 1-10 y 2-1 a 2-10, mostraron una formación significativamente reducida de las impurezas diméricas y multiméricas derivadas del aflibercept. Especialmente, las formulaciones que tienen un pH de 5,5 y están exentas del agente de tonicidad iónica, es decir, las Formulaciones 1-3, 1-9, 2-2, 2-3, 2-4, 2-7, 2-8 y 2-9 mostraron una formación notablemente reducida de las impurezas diméricas y multiméricas derivadas del aflibercept. Además, la Formulación 1-15 preparada usando los mismos componentes que en la Formulación 1-3, excepto por el uso de alcohol de azúcar (sorbitol) en lugar de azúcar, también mostró una formación notablemente reducida de las impurezas diméricas y multiméricas derivadas del aflibercept. Entre ellas, las Formulaciones 1-15, 2-2, 2-3, 2-4, 2-7, 2-8 y 2-9 presentaron un intervalo de osmolalidad eficaz convencionalmente aceptable en una formulación de colirio, es decir, una osmolalidad de aproximadamente 230 a 320 mOsmol/kg. Especialmente, puesto que las Formulaciones 2-3 y 2-8 presentaban una osmolalidad que variaba aproximadamente de 270 a 310 mOsmol/kg, que es compatible con la osmolalidad de la solución salina fisiológica (290 mOsmol/kg), puede observarse que dichas formulaciones pueden ser muy útiles como formulaciones oftálmicas.

(3) Evaluación de la formación de fragmentos, dímeros y multímeros derivados del aflibercept en condiciones de almacenamiento en frío (en condiciones de 4 °C)

Después del almacenamiento de las Formulaciones 2-1 a 2-10, 1-13, 2-13 y 2-14 en un vial de vidrio de 3 ml a 4 °C durante 6 meses y 12 meses, el contenido de aflibercept (monómero) y sus fragmentos, dímeros o multímeros se midieron de acuerdo con los mismos métodos que en el caso anterior (2). Los resultados del análisis por SEC-HPLC se muestran en las Tablas 7 y 8; y los resultados del análisis por DLS se muestran en las Tablas 9 y 10.

Tabla 7

Tabla 8

Tabla 9

Tabla 10

Como se muestra en los resultados de las Tablas 7 a 10, puede observarse que, cuando las formulaciones se almacenaron a 4 °C durante 6 y 12 meses, tanto las formulaciones exentas del agente de tonicidad iónica (es decir, las Formulaciones 2-1 a 2-10) como las formulaciones que contienen el agente de tonicidad iónica (es decir, las Formulaciones 1-13, 2-13 y 2-14) mostraron las impurezas diméricas y multiméricas derivadas del aflibercept en un nivel bajo. Sin embargo, las formulaciones exentas del agente de tonicidad iónica mostraron la formación de impurezas diméricas y multiméricas derivadas del aflibercept en niveles significativamente menores, en comparación con las formulaciones que contenían el agente de tonicidad iónica.

(4) Análisis de desamidación de asparagina (Asn)

Las Formulaciones 1-2, 1-3, 1-4, 1-8, 1-9, 1-10, 1-13, 1-14, 1-15, 2-1 a 2-10, 2-13 y 2-14, que se almacenaron en condiciones aceleradas (25 °C) y en condiciones de estrés (40 °C) durante 8 semanas en el caso anterior, se sometieron a un análisis de desamidación de asparagina (Asn), es decir, un análisis cuantitativo de isoaspartato para la cuantificación de desamidación de asparagina, evaluando de este modo la modificación de proteínas de las mismas. Además, las Formulaciones 2-1 a 2-10, 1-13, 2-13 y 2-14, que se almacenaron en condiciones de 4 °C durante 6 y 12 meses, también se sometieron a un análisis cuantitativo de isoaspartato, evaluando de este modo la modificación de proteínas de las mismas.

El análisis de desamidación de asparagina se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando el Kit de Detección de Isoaspartato ISOQUANT™ (Promega, n.° de Cat. MA1010). Los resultados del mismo se muestran en las Tablas 11 a 14.

Tabla 11

Tabla 12

Tabla 13

continuación

Tabla 14

Como se muestra en los resultados de las Tablas 11 a 14, puede observarse que las Formulaciones 1-2, 1-3, 1-4, 1 8, 1-9, 1-10 y las Formulaciones de acuerdo con la invención 2-1 a 2-10, que se almacenaron en condiciones aceleradas (25 °C) y en condiciones de estrés (40 °C) durante 8 semanas, mostraron una formación significativamente reducida de los productos de desamidación. Especialmente, las formulaciones que tienen un pH de 5,5 y están exentas del agente de tonicidad iónica, es decir, las Formulaciones 1-3, 1-9, 2-3 y 2-9 mostraron una formación notablemente reducida de los productos de desamidación.

Y además, cuando las Formulaciones 2-1 a 2-10, 1-13, 2-13 y 2-14 se almacenaron a 4 °C durante 6 meses y 12 meses, tanto las formulaciones exentas del agente de tonicidad iónica (es decir, las Formulaciones 2-1 a 2-10) como las formulaciones que contienen el agente de tonicidad iónica (es decir, las Formulaciones 1-13, 2-13 y 2-14) mostraron los productos de desamidación en un nivel bajo. Sin embargo, las formulaciones exentas del agente de tonicidad iónica mostraron la formación de productos de desamidación en niveles significativamente menores, en comparación con las formulaciones que contenían el agente de tonicidad iónica.

(5) Evaluación de la inhibición de la proliferación celular

Se evaluaron las actividades biológicas para las Formulaciones 1-3, 1-13, 2-3, 2-8 y 2-13, que se almacenaron en condiciones aceleradas (25 °C) durante 8 semanas y a 4 °C durante 12 meses en el caso anterior. Si se tratan células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVEC) con factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), las células proliferan. En dichas condiciones, el ensayo in vitro se realizó para evaluar la inhibición de la proliferación celular, de acuerdo con el tratamiento con aflibercept de las mismas.

El ensayo se realizó a la concentración final de 50 ng/ml de rhVEGF-165 (Promokine, n.° de Cat. C-64420) y al gradiente de concentración de 2,4 a 2500 ng/ml de aflibercept. Se realizó una reacción de neutralización a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 % humidificada durante 3 horas. Las células se trataron con el producto de la reacción y después se cultivaron durante 3 días. Con el fin de evaluar la inhibición contra la proliferación celular, la absorbancia a 590 nm se midió de acuerdo con el protocolo de ensayo de proliferación celular CellTiter 96™ AQueous One Solution (Promega, n.° de Cat. G3580, Solución MTS), para determinar la concentración necesaria para la inhibición de la mitad (50 %) (CI50).

Los valores de CI50 de cada formulación obtenidos en el ensayo de inhibición de la proliferación celular como en el caso anterior se muestran en la Tabla 15.

Tabla 15

Como se muestra en los resultados de la Tabla 15, puede observarse que, cuando se almacenan en condiciones aceleradas durante mucho tiempo, las formulaciones oftálmicas 2-3 y 2-8 obtenidas de acuerdo con la presente invención no solamente tienen una excelente estabilidad, sino que también presentan las actividades biológicas aumentadas en aproximadamente el 20 al 25 % en comparación con la formulación convencional. Además, también puede observarse que, cuando se almacenan en las condiciones de almacenamiento a 4 °C, las formulaciones exentas del agente de tonicidad iónica tienen una actividad biológica superior con respecto a la formulación que contiene el agente de tonicidad iónica.

(6) Evaluación de la inhibición de la formación de tubos

Se realizó un ensayo de formación de tubos de células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) para las Formulaciones 1-3, 1-13, 2-3, 2-8 y 2-13, que se almacenaron en condiciones aceleradas (25 °C) durante 8 semanas en el caso anterior. Las células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVEC) forman tubos en una placa recubierta con Matrigel. El tratamiento de las HUVEC con factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) aumenta la capacidad de formación de tubos de las HUVEC. En dichas condiciones, el ensayo in vitro se realizó para evaluar la inhibición de la capacidad de formación de tubos, de acuerdo con el tratamiento con aflibercept de las mismas.

Se añadieron 10 pl de Matrigel (BD Matrigel, Reducido en Factor de Crecimiento, n.° de Cat. 356231) en cada pocillo del kit p-Slide Angiogenesis de Ibidi, ibiTreat (n.° de Cat. 81506) y después se realizó la reacción de polimerización a 37 °C durante 2 horas. La concentración final de rhVEGF-165 (Promokine, n.° de Cat. C-64420) se fijó en 1,56 nM (aproximadamente 60 ng/ml) y el aflibercept se fijó en una concentración de 10 nM (aproximadamente 1150 ng/ml). Se realizó una incubación a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 % humidificada durante 3 horas. Las células (1X104 células/50 pl) se mezclaron con el producto de incubación y después se añadieron en cada pocillo de p-Slide Angiogenesis recubierto con Matrigel. Después de aproximadamente 16 horas a partir de entonces, se observó la formación de tubos.

La formación de tubos de las HUVEC se fotografió con un microscopio y después se evaluó el grado de formación de tubos usando el programa Angiogenesis analyzer for Image J distribuido por los Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU. (NIH). La inhibición de la formación de tubos se evaluó midiendo el número de tubos y el número de puntos de ramificación que forman los tubos.

Los resultados de cada formulación obtenidos del ensayo de inhibición de la formación de tubos de las HUVEC como en el caso anterior se muestran en la Tabla 16 y la FIG. 1.

Tabla 16

Y además, se realizaron los mismos ensayos que en el caso anterior para las formulaciones almacenadas a 4 °C durante 12 meses. Los resultados se muestran en la Tabla 17.

Tabla 17

Como se muestra en los resultados de la Tabla 16 y la FIG. 1, puede observarse que, cuando se almacenan en condiciones aceleradas durante mucho tiempo, las formulaciones oftálmicas 2-3 y 2-8 obtenidas de acuerdo con la presente invención no solamente tienen una excelente estabilidad en comparación con la formulación convencional, sino que también presentan un nivel similar de capacidad de formación de tubos con respecto al del grupo de control, es decir, presentan una inhibición notablemente aumentada de formación de tubos en comparación con la formulación que contiene el agente de tonicidad iónica. Además, también puede observarse que, cuando se almacenan en las condiciones de almacenamiento a 4 °C, las formulaciones exentas del agente de tonicidad iónica tienen una actividad inhibidora de la formación de tubos de las HUVEC superior con respecto a la formulación que contiene el agente de tonicidad iónica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica oftálmica que tiene un pH que varía de un pH de 5,2 a 5,7, que comprende (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de aflibercept; (b) un agente tamponante de acetato de sodio de 10 a 20 mM; (c) un azúcar del 6 al 8 % p/v o un alcohol de azúcar del 3 al 7 % p/v; y (d) un tensioactivo del 0,01 al 0,1 % p/v en un medio acuoso, en donde la composición farmacéutica oftálmica está exenta un agente de tonicidad iónica.

2. La composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el aflibercept está presente en una concentración que varía de 20 a 50 mg/ml.

3. La composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el azúcar es sacarosa, trehalosa o una mezcla de las mismas.

4. La composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el azúcar es sacarosa.

5. La composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el alcohol de azúcar es sorbitol.

6. La composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el sorbitol está presente en una concentración de aproximadamente el 5 % p/v.

7. La composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tensioactivo es un éster de ácido graso de polioxietileno sorbitano, copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno o una mezcla de los mismos.

8. La composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el tensioactivo es monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano o monooleato de polioxietileno (20) sorbitano.

9. La composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el tensioactivo es monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano.

10. La composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el tensioactivo está presente en una concentración de aproximadamente el 0,03 % p/v.

11. La composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición tiene aproximadamente un pH 5,5 y consiste en aflibercept 40 mg/ml; un agente tamponante de acetato de sodio de 10 a 15 mM; sacarosa al 7 % p/v; monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano al 0,03 % p/v y un medio acuoso.

12. La composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición tiene aproximadamente un pH 5,5 y consiste en aflibercept 40 mg/ml; un agente tamponante de acetato de sodio de 10 a 15 mM; trehalosa al 8 % p/v; monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano al 0,03 % p/v y un medio acuoso.

13. Una composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con cualquier reivindicación anterior para su uso como medicamento.

14. Una composición farmacéutica oftálmica de acuerdo con cualquier reivindicación anterior para su uso en el tratamiento de enfermedades oftálmicas tales como la degeneración macular húmeda asociada a la edad y el edema macular diabético, en donde la composición se administra a través de inyección intravítrea o inyección intraocular.