ES2901102T3 - Método para preparar una micela polimérica que contiene fármaco aniónico - Google Patents

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Abstract

Un método para preparar una composición para aportar un fármaco aniónico, en donde dicho método (i) comprende: (a) disolver un fármaco aniónico y un lípido catiónico en un disolvente acuoso, respectivamente, y mezclarlos; y (b) disolver un copolímero de bloques anfifílico en un disolvente acuoso y mezclar con la mezcla obtenida en la etapa (a), en donde el lípido catiónico es un lípido catiónico representado por la Fórmula Química 1: **(Ver fórmula)** [Fórmula Química 1] en la fórmula 1, n, m y 1 son cada uno de 0 a 12, con la condición de que 1 <= n + m + 1 <= 12, a, b y c son independientemente de 1 a 6, R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un hidrocarburo saturado e insaturado que tiene de 11 a 25 átomos de carbono, con la condición de que al menos uno de R1, R2 y R3 sea un hidrocarburo saturado o insaturado que tiene de 11 a 25 átomos de carbono, y en donde el copolímero de bloques anfifílico es un copolímero de bloques de tipo A-B que comprende un bloque hidrófilo (A) y un bloque hidrófobo (B), donde el bloque A hidrófilo es polietilenglicol o monometoxipolietilenglicol y el bloque B hidrófobo es poliláctido, poliglicólido o uno de sus copolímeros; y en donde las etapas (a) y (b) se efectúan en una monofase, o dicho método (ii) comprende: (a') disolver un fármaco aniónico y el lípido catiónico representado por la Fórmula Química 1 que se define anteriormente en un disolvente acuoso, respectivamente, y mezclarlos, seguido por liofilización; (b-1) disolver el producto liofilizado obtenido en la etapa (a') en un disolvente orgánico; (b-2) mezclar la solución obtenida en la etapa (b-1) con un disolvente acuoso; y (b-3) retirar el disolvente orgánico de la mezcla obtenida en la etapa (b-2), en donde el copolímero de bloques anfifílico está disuelto en el disolvente orgánico de la etapa (b-1) o el disolvente acuoso de la etapa (b-2).

Description

DESCRIPCIÓN
Método para preparar una micela polimérica que contiene fármaco aniónico
Campo Técnico
La presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica para aportar un fármaco aniónico que comprende un fármaco aniónico y a un método de preparación de la misma según se definen en las reivindicaciones.
Técnica Anterior
Muchas enfermedades se producen cuando se incrementa la expresión de genes relacionados con la enfermedad debido a diversos factores o se exhibe una actividad anormal por mutación. El ARNsi (ARN interferente corto) inhibe la expresión de un gen específico de un modo específico de la secuencia en el estadio postranscripcional, y así ha adquirido mucha atención como un agente terapéutico génico. En particular, debido a su alta actividad y selectividad génica precisa, el ARNsi se espera como un agente terapéutico de ácido nucleico que puede resolver los problemas de un nucleótido antisentido, una ribozima o similares existentes. El ARNsi es un ARN bicatenario corto y escinde el ARNm de un gen que tiene una secuencia nucleotídica complementaria con el mismo para inhibir la expresión del gen diana (McManus and Sharp, Nature Rev. Genet. 3:737 (2002); Elbashir y cols., Genes Dev. 15:188 (2001). Sin embargo, a pesar de estas ventajas, se sabe que no solo el ARNsi es degradado rápidamente por nucleasas en la sangre y se excreta rápidamente del cuerpo a través del riñón, sino que además no pasa fácilmente a través de una membrana celular debido a que está fuertemente cargado negativamente.
Las tecnologías de aporte de fármacos seguras y eficaces se han estudiado durante mucho tiempo y se han desarrollado diversos sistemas de aporte y tecnologías de aporte, en el campo del tratamiento usando un fármaco aniónico, p. ej. un ácido nucleico incluyendo ARNsi. Los sistemas de aporte se clasifican en gran parte en un sistema de aporte viral que usa adenovirus o retrovirus, etc., y un sistema de aporte no viral que usa un lípido catiónico, un polímero catiónico, etc.
Se sabe que los sistemas de aporte virales están expuestos a riesgos, incluyendo respuestas inmunitarias inespecíficas, y que su uso comercial presenta un número de problemas debido a que los procedimientos de producción son complejos. Por lo tanto, una tendencia de investigación reciente es vencer las desventajas de los sistemas de aporte virales usando un sistema de aporte no viral. Estos sistemas de aporte no virales son menos eficaces que un sistema de aporte viral, pero tienen las ventajas de estar acompañados por menos efectos secundarios por lo que respecta a la seguridad in vivo y tener un coste de producción bajo por lo que respecta a la economía.
Los ejemplos más representativos de sistemas de aporte no virales incluyen un complejo de lípido catiónico-ácido nucleico (“lipoplex”) y un complejo de polímero policatiónico-ácido nucleico (“poliplex”) que usa lípido catiónico. Se han efectuado muchos estudios sobre el punto en el que estos lípidos catiónicos o polímeros policatiónicos forman un complejo a través de una interacción electrostática con un fármaco aniónico, estabilizando de ese modo un fármaco aniónico e incrementando el aporte intracelular. Sin embargo, cuando se usa una cantidad requerida para obtener efectos suficientes, mostraba un resultado que, aunque es menor que el sistema de aporte viral, induce toxicidad grave de modo que su uso como un medicamente es inapropiado. Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar una tecnología de aporte de fármacos aniónicos que pueda reducir la toxicidad al minimizar la cantidad de polímero catiónico o lípido catiónico capaz de inducir toxicidad, y también pueda ser estable en sangre y líquido corporal y permita el aporte intracelular a fin de obtener efectos suficientes.
El documento US 2009/280181 A1 divulga en el ejemplo 4 un método para preparar una composición para aportar un fármaco aniónico (ADN), que comprende: (a) disolver un fármaco aniónico y un compuesto catiónico (polietilenimina, PEI) en un disolvente acuoso (agua), respectivamente, y mezclarlos [0109]-[0113]. La mezcla obtenida en la etapa (a) se liofiliza (con adición de PEG) y se suspende adicionalmente en cloroformo [0115]-[0117]. (b) Se añaden copolímeros de bloques anfifílicos (PEG-PBT y GA-PEG-CL-GALA) al producto obtenido en la etapa (a). Se obtiene una solución después de agitar durante 30 min a 37°C [0118].
El documento US 2015/328152 A1 divulga en los ejemplos 17-21 la preparación de micelas que comprenden ARNsi, dioTETA y mPEG-PLA-tocoferol mediante un método de emulsión o doble emulsión. La dioTETA (lípido catiónico) se disuelve en cloroformo.
Por otra parte, se han realizado diversos intentos de proporcionar un sistema de aporte de fármaco que pueda solubilizar un fármaco poco hidrosoluble en la forma de una micela polimérica y estabilizarlos en una solución acuosa al usar un copolímero de bloques anfifílico (Patente Coreana N° 08180334). Sin embargo, aunque estos copolímeros de bloques anfifílicos pueden solubilizar un fármaco poco hidrosoluble que tenga hidrofobia al formar micelas poliméricas que tienen hidrofobia en las mismas, fármacos hidrófilos cargados negativamente tales como ácidos nucleicos no se pueden atrapar en la estructura micelar del polímero y, así, no es adecuado para el aporte de un fármaco aniónico incluyendo estos ácidos nucleicos. Según esto, los presentes inventores han divulgado una composición para aportar fármacos aniónicos y diversos métodos de preparación de la misma que forman un complejo mediante interacciones electrostáticas con ácidos nucleicos y permiten que el complejo sea atrapado en la estructura micelar de un copolímero de bloques anfifílico. Sin embargo, todavía existe una necesidad de una mejora en los rendimientos de producción de la composición para el aporte de fármacos aniónicos y de métodos para preparar formulaciones para potenciar la estabilidad de los ácidos nucleicos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Problema Técnico
Bajo estas circunstancias, los presentes inventores han efectuado estudios intensivos para desarrollar un método de preparación para incrementar el rendimiento de producción de una composición para aportar un fármaco aniónico y para potenciar la estabilidad del fármaco aniónico. Como resultado, los inventores han encontrado que, cuando un fármaco aniónico tal como ARNsi y un compuesto catiónico se disuelven independientemente en un disolvente acuoso y se mezclan para formar un complejo en un sistema monofásico y a continuación son atrapados en la micela polimérica, el rendimiento de los fármacos aniónicos se puede mejorar notablemente y la estabilidad de los fármacos aniónicos se puede potenciar, completando de ese modo la presente invención.
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para preparar una composición para aportar un fármaco aniónico en el que el rendimiento de producción de la composición que contiene un fármaco aniónico y la estabilidad de los ácidos nucleicos se potencian, y una composición para aportar fármacos aniónicos preparada a partir del mismo.
EFECTOS VENTAJOSOS
El método de preparación según una realización de la presente invención permite que un fármaco aniónico y un lípido catiónico como los definidos en la reivindicación 1 formen un complejo en una fase acuosa, formando eficazmente de ese modo un complejo en nanopartículas mediante interacción electrostática. Además, la fuerza de unión se incrementa durante el procedimiento de retirada de una solución acuosa a través de liofilización, incrementando mucho de ese modo el rendimiento de las micelas poliméricas preparadas finalmente. Además, este método de preparación no solo es ecológico debido al uso de una cantidad relativamente pequeña de disolvente orgánico, sino que también la producción es extremadamente fácil y la producción en masa es fácil. Además, la composición para aportar un fármaco aniónico preparada mediante el método de preparación de una realización de la presente invención puede incrementar la estabilidad del fármaco aniónico en sangre o líquido corporal cuando se administre al cuerpo y, en particular, tiene la ventaja de aportar eficazmente un fármaco aniónico a las células sin atravesar el sistema reticuloendotelial.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un diagrama esquemático que ilustra la estructura de un sistema de aporte de micelas poliméricas preparado mediante una realización de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES
Una realización de la presente invención se refiere a un método para preparar una composición para un aporte de fármaco aniónico que incrementa el rendimiento de producción del mismo al comprender formar nanopartículas al usar la interacción electrostática de un fármaco aniónico y el lípido catiónico que se define en la reivindicación 1 en una fase acuosa; e incorporar las nanopartículas en micelas poliméricas que comprenden un polímero anfifílico según se define en la reivindicación 1 y opcionalmente una sal de poli(ácido láctico) para incrementar la interacción electrostática y la unión hidrófoba, incrementando de ese modo la eficacia de atrapamiento del fármaco aniónico en la formulación.
Específicamente, la composición preparada mediante una realización de la presente invención es una composición para aportar fármacos aniónicos que tiene una estructura micelar, en la que un complejo de un fármaco y un compuesto catiónico se incorpora en la estructura micelar de un copolímero de bloques anfifílico y opcionalmente una sal de poli(ácido láctico), e incluye un fármaco aniónico, como un ingrediente activo; el lípido catiónico que se define en la reivindicación 1; el copolímero de bloques anfifílico que se define en la reivindicación 1; y, opcionalmente, una sal de poli(ácido láctico), en donde el fármaco aniónico forma un complejo mediante interacciones electrostáticas con el lípido catiónico, y el complejo así formado se atrapa en la estructura micelar formada por el copolímero de bloques anfifílico y opcionalmente la sal de poli(ácido láctico). El método de preparación de la presente invención se define en las reivindicaciones.
Posteriormente aquí, la presente invención se describirá con más detalle. Según el método (i) de la presente invención que se define en la reivindicación 1, en la etapa (a), a fin de preparar un complejo de un fármaco aniónico y el lípido catiónico, se disuelven en una fase acuosa, por ejemplo, un disolvente acuoso, respectivamente, y a continuación se mezclan entre sí. En la etapa (a), el fármaco aniónico y el lípido catiónico disueltos en el disolvente acuoso forman un complejo del fármaco aniónico y el compuesto catiónico en forma de nanopartículas mediante interacciones electrostáticas. El disolvente acuoso usado en la etapa puede ser agua destilada, agua para inyección o un tampón. La relación de mezcladura entre las soluciones acuosas en las que están disueltos el fármaco aniónico y el compuesto catiónico, respectivamente, no está particularmente limitada, y, por ejemplo, la relación en volumen de la solución acuosa de compuesto catiónico a la solución acuosa de fármaco aniónico puede ser de 1 a 20, más específicamente, de 1 a 4, pero no se limita a esto.
Las soluciones acuosas se mezclan a través de medios de mezcladura apropiados conocidos en la técnica, y ejemplos de estos métodos incluyen un homogeneizador ultrasónico y similares.
El fármaco aniónico usado en la etapa (a) es un ingrediente activo de la composición que se va a preparar finalmente, e incluye todas las sustancias que estén cargadas negativamente de la molécula en una solución acuosa y tiene actividad farmacológica. En una realización específica, la propiedad aniónica se puede proporcionar a partir de al menos un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en un grupo carboxilo, un grupo fosfato y un grupo sulfato. Además, en una realización de la presente invención, el fármaco aniónico puede ser un péptido, una proteína o un fármaco polianiónico tal como heparina o un ácido nucleico.
Además, el ácido nucleico puede ser un fármaco de ácido nucleico tal como ácido desoxirribonucleico, ácido ribonucleico o derivados polinucleotídicos en los que el esqueleto, el azúcar o la base está químicamente modificado o su extremo está modificado y, más específicamente, puede ser al menos un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en ARN, ADN, ARNsi (ARN interferente corto), un aptámero, un ODN antisentido (oligodesoxinucleótido antisentido), ARN antisentido, una ribozima, una ADNzima, y similares. Por otra parte, el esqueleto, el azúcar o la base del ácido nucleico puede estar químicamente modificado o su extremo puede estar modificado con el propósito de incrementar la estabilidad en sangre o atenuar una respuesta inmunitaria. Específicamente, una parte del enlace fosfodiéster del ácido nucleico se puede reemplazar por un enlace fosforotioato o boranofosfato, o se puede incluir al menos un tipo de nucleótido en el que varios grupos funcionales tales como un grupo metilo, un grupo metoxietilo, flúor y similares se introducen en la posición 2'-OH de una parte de las ribosas.
Además, al menos un extremo del ácido nucleico se puede modificar con al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol y un ácido graso que tiene de 10 a 24 átomos de carbono. Por ejemplo, para ARNsi, el extremo 5', o el extremo 3', o ambos extremos de la cadena de sentido y/o antisentido se puede modificar y, preferiblemente, se puede modificar el extremo de la cadena de sentido.
El colesterol, el tocoferol y el ácido graso que tiene de 10 a 24 átomos de carbono incluyen análogos, derivados y metabolitos de colesterol, tocoferol y un ácido graso.
El ARNsi se puede referir a un ARN bicatenario (ARN dúplex) que puede reducir o suprimir la expresión de un gen diana al mediar en la degradación de ARNm complementario a la secuencia del ARNsi cuando esté presente en la misma célula que el gen diana, o a un ARN monocatenario que tiene una región bicatenaria dentro del ARN monocatenario. La unión entre las cadenas dobles se realiza mediante un enlace de hidrógeno entre nucleótidos, no todos los nucleótidos en las cadenas dobles necesitan estar unidos complementariamente entre sí, y ambas cadenas pueden estar separadas o pueden no estar separadas. Según una realización, la longitud del ARNsi puede ser de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 nucleótidos (significa el número de nucleótidos de uno de los ARN bicatenarios, es decir, el número de pares de bases, y, en el caso de un ARN monocatenario, significa la longitud de cadenas dobles en el ARN monocatenario), específicamente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos, y más específicamente de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos.
Según una realización, el ARNsi bicatenario puede tener un saliente de 1 a 5 nucleótidos en el extremo 3' o 5' o en ambos extremos. Según otra realización, puede ser romo sin sobresalir en ningún extremo. Específicamente, puede ser el ARNsi divulgado en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2002-0086356 y la Patente de EE. UU. N27.056.704 .
Además, el ARNsi puede tener una estructura simétrica con las mismas longitudes de las dos cadenas, o puede tener una estructura bicatenaria asimétrica con una cadena más corta que la otra cadena. Específicamente, puede ser una molécula de ARNsi (ARN interferente pequeño) asimétrica de cadenas dobles que consisten en de 19 a 21 nucleótidos (nt) antisentido; y de 15 a 19 nt de sentido que tienen una secuencia complementaria al antisentido, en donde el extremo 5' del antisentido tiene extremo romo y el extremo 3' del antisentido tiene un saliente de 1 a 5 nucleótidos. Específicamente, puede ser el ARNsi divulgado en la Publicación Internacional WO 2009/078685.
En una realización, el fármaco aniónico se puede incluir en una cantidad de 0,001% a 10% en peso, específicamente de 0,01% a 5% en peso basado en el peso total de la composición finalmente preparada. Si la cantidad es menor de 0,001% en peso, la cantidad del sistema de aporte es demasiado grande en comparación con el fármaco y, así, un efecto secundario puede ser causado por el sistema de aporte, y, si supera 10% en peso, el tamaño de la micela puede hacerse demasiado grande de modo que se puede reducir la estabilidad de la micela y se puede incrementar la pérdida durante la esterilización por filtración.
Según el método (ii) de la presente invención que se define en la reivindicación 1, el lípido catiónico, el compuesto catiónico y el fármaco aniónico forman un complejo mediante interacciones electrostáticas en una fase acuosa, y el complejo se deshidrata a través de liofilización para formar un complejo rígido de un fármaco aniónico y un compuesto catiónico. Así, el compuesto catiónico puede ser un lípido que puede formar un complejo con el fármaco aniónico mediante interacciones electrostáticas, y es soluble en fase acuosa.
El lípido catiónico según la invención se define en la reivindicación 1 y es capaz de formar un complejo mediante interacciones electrostáticas con el fármaco aniónico. Los lípidos catiónicos descritos en la presente pero que no son parte de la invención son cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), N,N-dimetil-(2,3-dioleiloxi)propilamina (DODMA), N,N,N-tridimetil-(2,3-dioleoiloxi)propilamina (DOTm A), 1,2-diacil-3-trimetilamoniopropano (TAP), 1,2-diacil-3-dimetilamoniopropano (DAP), 3p-[N— (N',N',N'-trimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (TC-colesterol), 3p-[N— (N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-colesterol), 3p-[N-(N'-monometilaminoetano)carbamoil]colesterol (MC-colesterol), 3p-[N-(aminoetano)carbamoil]colesterol (AC-colesterol), colesteriloxipropan-1-amina (COPA), tocoferol N-(N'-aminoetano)carbamoilpropanoico (AC-tocoferol) y tocoferol N-(N'-metilaminoetano)carbamoilpropanoico (MC-tocoferol). Cuando se usa este lípido catiónico, es preferible que se use un lípido policatiónico que tenga alta densidad catiónica en la molécula en una cantidad pequeña a fin de disminuir la toxicidad inducida por el lípido catiónico, y, más específicamente, el lípido catiónico puede ser un grupo funcional que tiene propiedad catiónica en solución acuosa por molécula. Estos lípidos son 3p-[-N.(N',N',N'-trimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (TC-colesterol), 3p[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-colesterol), 3p[N-(N'-monometilaminoetano)carbamoil]colesterol (MC-colesterol), 3p[N-(aminoetano)carbamoil]colesterol (AC-colesterol), cloruro de N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), N,N-dimetil-(2,3-dioleoiloxi)propilamina (DODMA) y N,N,N-trimetil-(2,3-dioleoiloxi)propilamina (DOTMA).
Además, se describen en la presente pero no son parte de la invención lípidos que tienen una pluralidad de grupos funcionales que tienen propiedades catiónicas en una solución acuosa por molécula. Estos lípidos son cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), 1,2-diacil-3-trimetilamoniopropano (TAP) y 1,2-diacil-3-dimetilamoniopropano (DAP).
El lípido catiónico según la invención es el lípido catiónico en el que un grupo funcional amina de 1 a 12 oligoalquilenaminas está unido con un hidrocarburo saturado o insaturado que tiene de 11 a 25 átomos de carbono, y el lípido catiónico se puede representar mediante la Fórmula Química 1 posterior.
[Fórmula Química 1]
Figure imgf000005_0001
en la fórmula 1,
n, m y 1 son cada uno de 0 a 12, con la condición de que 1 < n m 1 < 12, a, b y c son cada uno de 1 a 6, R1, R2 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o un hidrocarburo saturado e insaturado que tiene de 11 a 25 átomos de carbono, con la condición de que al menos uno de R1, R2 y R3 sea un hidrocarburo saturado o insaturado que tiene de 11 a 25 átomos de carbono.
Preferiblemente, n, m y 1 son independientemente un número entero de 0 a 7, en donde 1 < n+m+1 < 7.
Preferiblemente, a, b y c pueden ser de 2 a 4.
Preferiblemente, R1, R2 y R3 son cada uno independientemente al menos uno seleccionado del grupo que consiste en laurilo, miristilo, palmitilo, estearilo, araquidilo, behenilo, lignocerilo, cerotilo, miristoleílo, palmitoleílo, sapienilo, oleílo, linoleílo, araquidonilo, eicosapentaenilo, erucilo, docosahexaenilo y cerotilo.
Ejemplos específicos del lípido catiónico pueden ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en monoleoiltrietilentetramida, dioleoiltrietilentetramida, trioleoiltrietilentetramida, tetraoleoiltrietilentetramida, monolinoleoiltetraetilenpentamida, dilinoleoiltetraetilenpentamida, trilinoleoiltetraetilenpentamida, tetralinoleoiltetraetilenpentamida, pentalinoleoiltetraetilenpentamida, monomiristoleoildietilentriamida, dimiristoleoildietilentriamida, monoleoilpentaetilenhexamida, dioleoilpentaetilenhexamida, trioleoilpentaetilenhexamida, tetraoleoilpentaetilenhexamida, pentaoleoilpentaetilenhexamida y hexaoleoilpentaetilenhexamida.
Se describen en la presente pero no son parte de la invención los polímeros catiónicos seleccionados del grupo que consiste en quitosano, glicolquitosano, protamina, polilisina, poliarginina, poliamidoamina (PAMAM), polietilenimina, dextrano, ácido hialurónico, albúmina, polietilenimina (PEI) polimérica, poliamina y polivinilamina (PVAm).
El lípido catiónico usado en la presente invención se puede incluir en una cantidad de 0,01% a 50% en peso, específicamente de 0,1% a 10% en peso basado en el peso total de la composición finalmente preparada. Si la cantidad del lípido catiónico es menor de 0,01% en peso, puede no ser suficiente para formar un complejo con el fármaco aniónico, y si supera 50% en peso, el tamaño de la micela se puede hacer demasiado grande de modo que se pueda reducir la estabilidad de la micela y se pueda incrementar la pérdida durante la esterilización por filtración.
El lípido catiónico se une con el fármaco aniónico mediante interacciones electrostáticas en una fase acuosa a fin de formar un complejo.
Según una realización específica, la relación de la cantidad de carga eléctrica del compuesto catiónico que es el lípido que se define en la reivindicación 1 (N) y el fármaco aniónico (P) (N/P: la relación de la carga eléctrica positiva del compuesto catiónico a la carga eléctrica negativa del fármaco aniónico) es de 0,1 a 128, específicamente de 0,5 a 64, más específicamente de 1 a 32, aún más específicamente de 1 a 24, y lo más específicamente de 6 a 24. Si la relación (N/P) es menor de 0,1, el compuesto catiónico no se puede unir suficientemente al fármaco aniónico, y así es ventajoso tener la relación de 0,1 o más de modo que el compuesto catiónico y el fármaco aniónico puedan formar un complejo que incluya una cantidad suficiente de fármacos aniónicos mediante interacción electrostática. En contraste, si la relación (N/P) supera 128, se puede inducir toxicidad, y así es preferible tener la relación de 128 o menos.
La etapa (b) es una etapa de disolución de un copolímero de bloques anfifílico según se define en la reivindicación 1 y opcionalmente una sal de poli(ácido láctico) en un disolvente acuoso o un disolvente orgánico y mezcladura de la solución con la mezcla obtenida en la etapa (a).
Cuando el copolímero de bloques anfifílico y opcionalmente la sal de poli(ácido láctico) se disuelven en un disolvente acuoso y se mezclan, la preparación de una composición para aportar fármacos aniónicos se lleva a cabo en fase acuosa, en la que el complejo del fármaco aniónico-compuesto catiónico en forma de nanopartículas se atrapa en la estructura micelar formada por el copolímero de bloques anfifílico y opcionalmente la sal de poli(ácido láctico).
En la presente, el disolvente acuoso es el mismo que el disolvente acuoso usado en la etapa (a).
Además, el copolímero de bloques anfifílico es un copolímero de bloques de tipo A-B que incluye un bloque A hidrófilo y un bloque B hidrófobo. El copolímero de bloques de tipo A-B forma una micela polimérica de tipo núcleo-envuelta en una solución acuosa, en donde el bloque B hidrófobo forma un núcleo (pared interna) y el bloque A hidrófilo forma una envuelta (pared externa).
A este respecto, el bloque A hidrófilo es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en monometoxipolietilenglicol o polietilenglicol. El bloque A hidrófilo puede tener un peso molecular medio en número de 200 daltons a 50.000 daltons, específicamente de 1.000 daltons a 20.000 daltons, más específicamente de 1.000 daltons a 5.000 daltons.
Además, si es necesario, un grupo funcional o un ligando que puede alcanzar un tejido o una célula específicos, o un grupo funcional capaz de promover el aporte intracelular se puede conjugar químicamente al extremo del bloque A hidrófilo a fin de controlar la distribución del sistema de aporte micelar polimérico formado por el copolímero de bloques anfifílico y opcionalmente la sal de poli(ácido láctico) en el cuerpo o incrementar la eficacia del aporte intracelular del sistema de aporte micelar polimérico. El grupo funcional o ligando puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en monosacárido, polisacárido, vitamina, péptido, proteína y un anticuerpo a un receptor de la superficie celular. Más específicamente, el grupo funcional o ligando puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en anisamida, vitamina B9 (ácido fólico), vitamina B12, vitamina A, galactosa, lactosa, manosa, ácido hialurónico, péptido RGD, péptido NGR, transferrina, un anticuerpo para un receptor de transferrina, y similares.
El bloque B hidrófobo es un polímero que tiene biocompatibilidad y biodegradabilidad, y es poliláctido, poliglicólido o uno de sus copolímeros. Según otra realización, el bloque B hidrófobo puede tener un peso molecular medio en número de 50 daltons a 50.000 daltons, específicamente de 200 daltons a 20.000 daltons, más específicamente de 1.000 daltons a 5.000 daltons. Además, a fin de incrementar la hidrofobia del bloque hidrófobo y de ese modo mejorar la estabilidad de la micela, tocoferol, colesterol o un ácido graso que tiene de 10 a 24 átomos de carbono se puede conjugar químicamente a un grupo hidroxilo del extremo del bloque hidrófobo.
El copolímero de bloques anfifílico que incluye el bloque hidrófilo (A) y el bloque hidrófobo (B) se puede incluir en una cantidad de 40% a 99,98% en peso, específicamente de 85% a 99,8% en peso, más específicamente de 90% a 99,8% en peso, basado en el peso total de la composición. Si la cantidad del copolímero de bloques anfifílico es menor de 40% en peso, el tamaño de la micela se puede hacer demasiado grande de modo que se puede reducir la estabilidad de la micela y se puede incrementar la pérdida durante la esterilización por filtración y, si la cantidad supera 99,98% en peso, la cantidad de fármacos aniónicos que se puede incorporar puede ser demasiado pequeña.
Además, como para el copolímero de bloques anfifílico, la relación de composición del bloque hidrófilo (A) y el bloque hidrófobo (B) puede estar en el intervalo de 40% a 70% en peso, específicamente de 50% a 60% en peso, basado en el peso del copolímero. Si la relación del bloque hidrófilo (A) es menor de 40% en peso, puede ser difícil formar una micela debido a que la solubilidad del polímero en agua es baja y, así, es preferible que la relación del bloque hidrófilo (A) sea 40% en peso o más de modo que el copolímero tenga una solubilidad en agua suficiente para formar micelas. En contraste, si supera 70% en peso, la hidrofilia puede ser demasiado alta de modo que se disminuya la estabilidad de la micela polimérica, y, así, es difícil usarla como una composición solubilizante para el complejo de fármaco aniónico/compuesto catiónico. Por lo tanto, es preferible que la relación del bloque hidrófilo (A) sea 70% en peso o menos teniendo en cuenta la estabilidad de las micelas.
El grupo hidroxilo terminal del bloque B hidrófobo puede estar modificado por al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol y un ácido graso que tiene de 10 a 24 átomos de carbono.
Además, la sal de poli(ácido láctico) (por ejemplo, PLANa) se puede incluir en la pared interna de la micela como un componente separado del copolímero de bloques anfifílico, y está distribuida en el núcleo (pared interna) de la micela para reforzar la hidrofobia del núcleo y de ese modo estabilizar la micela, y, al mismo tiempo, representa un papel de evitar eficazmente el sistema reticuloendotelial (RES) en el cuerpo. Esto es, el anión ácido carboxílico de la sal de poli(ácido láctico) se une al complejo catiónico más eficazmente que el poli(ácido láctico) a fin de reducir el potencial superficial de la micela polimérica, reduciendo de ese modo la carga positiva del potencial superficial en comparación con una micela polimérica que no contenga sal de poli(ácido láctico) y así es menos atrapada por el sistema reticuloendotelial. Por lo tanto, tiene la ventaja de tener una excelente eficacia de aporte a un punto deseado (por ejemplo, células cancerosas, células inflamatorias, etc.).
La sal de poli(ácido láctico) tiene preferiblemente un peso molecular medio en número de 500 daltons a 50.000 daltons, específicamente de 1.000 daltons a 10.000 daltons. Si el peso molecular es menor de 500 daltons, la hidrofobia es demasiado baja de modo que pueda ser difícil que exista en el núcleo (pared interna) de las micelas, y si el peso molecular supera 50.000 daltons, existe el problema de que el tamaño de partícula de las micelas poliméricas se haga demasiado grande.
La sal de poli(ácido láctico) se puede usar en una cantidad de 1 a 200 partes en peso, específicamente de 10 a 100 partes en peso, más específicamente de 30 a 60 partes en peso, basado en 100 partes en peso del polímero de bloques anfifílico. Si la cantidad de la sal de poli(ácido láctico) supera 200 partes en peso basado en 100 partes en peso del polímero de bloques anfifílico, el tamaño de la micela se incrementa y, así, la filtración usando una membrana esterilizada se puede hacer difícil, y, si la cantidad es menor de 1 parte en peso, los efectos deseados de estabilizar las micelas y evitar eficazmente el sistema reticuloendotelial al potenciar la hidrofobia no se pueden obtener suficientemente.
Según una realización, el copolímero de bloques anfifílico se puede usar en una cantidad de 10 a 1.000 partes en peso y la sal de poli(ácido láctico) se puede usar en una cantidad de 5 a 500 partes en peso basado en 1 parte en peso del fármaco aniónico. Preferiblemente, el copolímero de bloques anfifílico se puede usar en una cantidad de 50 a 800 partes en peso, más preferiblemente de 100 a 500 partes en peso. Preferiblemente, la sal de poli(ácido láctico) se puede usar en una cantidad de 10 a 300 partes en peso, más preferiblemente de 50 a 100 partes en peso.
Según una realización preferida, la sal de poli(ácido láctico) de la presente invención puede ser al menos una seleccionada del grupo que consiste en compuestos representados por las Fórmulas Químicas 2 a 7 posteriores:
[Fórmula Química 2] RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM
en la fórmula 2, A es -COO-CHZ-; B es -COO-CHY-, -COO-CH2CH2CH2CH2CH2- o -COO-CH2CH2OCH2 ; R es un átomo de hidrógeno o un grupo acetilo, benzoílo, decanoílo, palmitoílo, metilo o etilo; Z e Y son cada uno un átomo de hidrógeno o un grupo metilo o fenilo; M es Na, K o Li; n es un número entero de 1 a 30; y m es un número entero de 0 a 20;
[Fórmula Química 3] RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY' ]q-COO-CHZ-COOM
en la fórmula 3, X es un grupo metilo; Y' es un átomo de hidrógeno o un grupo fenilo; p es un número entero de 0 a 25 y q es un número entero de 0 a 25, con la condición de que p+q sea un número entero de 5 a 25; R es un átomo de hidrógeno o un grupo acetilo, benzoílo, decanoílo, palmitoílo, metilo o etilo; M es Na, K o Li; Z es un átomo de hidrógeno, un grupo metilo o fenilo;
[Fórmulas Química 4] RO-PAD-COO-W-M'
en la fórmula 4, W-M' es
Figure imgf000008_0001
PAD se selecciona del grupo que consiste en D,L-poli(ácido láctico), D-poli(ácido láctico), poli(ácido mandélico), un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido glicólico, un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido mandélico, un copolímero de D,L-ácido láctico y caprolactona y un copolímero de D,L-ácido láctico y 1,4-dioxan-2-ona; R es un átomo de hidrógeno o un grupo acetilo, benzoílo, decanoílo, palmitoílo, metilo o etilo; M es independientemente Na, K o Li;
[Fórmula Química 5] S-O-PAD-COO-Q
en la fórmula 5, S es
0
H-f-L— C (CHH—2) C a—-Jb COOM ■
L es -NR1- o -O-, en donde R1 es un átomo de hidrógeno o alquilo C1-10; Q es CH3 , CH2CH3 , CH2CH2CH3 , CH2CH2CH2CH3 o CH2C6H5 ; a es un número entero de 0 a 4; b es un número entero de 1 a 10; M es Na, K o Li; PAD es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en D,L-poli(ácido láctico), D-poli(ácido láctico), poli(ácido mandélico), un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido glicólico, un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido mandélico, un copolímero de D,L-ácido láctico y caprolactona y un copolímero de D,L-ácido láctico y 1,4-dioxan-2-ona;
[Fórmula Química 6]
Figure imgf000008_0002
en la fórmula 6, R' es -PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM, PAD se selecciona del grupo que consiste en D,L-poli(ácido láctico), D-poli(ácido láctico), poli(ácido mandélico), un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido glicólico, un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido mandélico, un copolímero de D,L-ácido láctico y caprolactona y un copolímero de D i ­ ácido láctico y 1,4-dioxan-2-ona; M es Na, K o Li; y a es un número entero de 1 a 4;
[Fórmula Química 7] YO-[-C(O)-(CHX)a-O-]m-C(O)-R-C(O)-[-O-(CHX' )b-C(O)-]n-OZ
en la fórmula 7, X y X' son independientemente hidrógeno, alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o arilo que tiene de 6 a 20 átomos de carbono; Y y Z son independientemente Na, K o Li; m y n son independientemente números enteros de 0 a 95, con la condición de que 5 < m n < 100; a y b son independientemente números enteros de 1 a 6; R es -(CH2)k-, un alquenilo divalente que tiene de 2 a 10 átomos de carbono, un arilo divalente que tiene de 6 a 20 átomos de carbono, o una de sus combinaciones, en donde k es un número entero de 0 a 10.
La sal de poli(ácido láctico) es preferiblemente un compuesto representado por la Fórmula Química 2 o la Fórmula Química 3.
Según una realización específica, el copolímero de bloques anfifílico permite que el complejo del fármaco aniónico y el compuesto catiónico se atrapen en la estructura micelar en una solución acuosa al formar una pared micelar opcionalmente junto con la sal de poli(ácido láctico), en donde la relación del complejo del fármaco aniónico y el compuesto catiónico (a) al peso del copolímero de bloques anfifílico (b) [a/bx100; (el peso del fármaco aniónico el peso del compuesto catiónico)/el peso del copolímero de bloques anfifílico X 100] puede ser de 0,001% a 100% en peso, específicamente de 0,01% a 50% en peso, más específicamente de 0,1% a 10% en peso. Si la relación en peso es menor de 0,001% en peso, la cantidad del complejo del fármaco aniónico y el lípido catiónico se puede hacer demasiado baja, y así puede ser difícil satisfacer la cantidad eficaz con la que el fármaco aniónico puede funcionar eficazmente. En contraste, si supera 100% en peso, no se puede formar una estructura micelar de tamaño apropiado considerando el peso molecular del copolímero de bloques anfifílico y la cantidad del complejo del fármaco aniónico y el compuesto catiónico.
Según una realización de la presente invención, el método de preparación puede incluir además una etapa (c) de estabilización de la mezcla obtenida en la etapa (b) a una temperatura de 0°C a 50°C durante de 5 minutos a 60 minutos. La estabilización se puede llevar a cabo dejando que la mezcla permanezca en reposo o con agitación. La condición de estabilización puede ser preferiblemente de 0°C a 50°C, más específicamente de 4°C a 30°C, durante de 5 minutos a 1 hora, más específicamente de 10 minutos a 30 minutos, pero no se limita a esto. Si el tiempo es menor de 5 minutos, el complejo no se estabiliza y, si supera 1 hora, se puede generar la precipitación del complejo.
Mientras, según otra realización, el método (ii) que se define en la reivindicación 1 para preparar una composición para aportar fármacos aniónicos según la presente invención incluye: (a') disolver independientemente un fármaco aniónico y el lípido catiónico que se define en la reivindicación 1 en un disolvente acuoso y mezclarlos, seguido por liofilización;
(b-1) disolver el producto liofilizado obtenido en la etapa (a') en un disolvente orgánico;
(b-2) mezclar la solución obtenida en la etapa (b-1) con un disolvente acuoso; y
(b-3) retirar el disolvente orgánico de la mezcla obtenida en la etapa (b-2).
En la presente, el copolímero de bloques anfifílico que se define en la reivindicación 1 y opcionalmente la sal de poli(ácido láctico) se pueden disolver en el disolvente orgánico de la etapa (b-1) o el disolvente acuoso de la etapa (b-2).
En la etapa (a'), la mezcla obtenida al disolver independientemente el fármaco aniónico y el lípido catiónico que se define en la reivindicación 1 en un disolvente acuoso, seguido por mezcladura, se liofiliza. En la etapa (a'), el complejo se forma eficazmente mediante interacción electrostática, y la fuerza de unión del complejo así formado se incrementa durante el procedimiento de retirada de agua a través de liofilización.
Por otra parte, en la etapa (b-1), el complejo en nanopartículas secado se disuelve en un disolvente orgánico, y el disolvente orgánico usado en la presente puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en acetona, etanol, metanol, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, acetato de etilo y ácido acético. Preferiblemente, puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en etanol, dimetilsulfóxido, acetato de etilo y ácido acético.
El disolvente orgánico puede incluir un lípido fusogénico. El lípido fusogénico puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en dilauroilfosfatidiletanolamina, dimiristoilfosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidiletanolamina, diestearoilfosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidiletanolamina, dilinoleoilfosfatidiletanolamina, 1 -palmitoil-2-oleoilfosfatidiletanolamina, 1,2-difitanoil-3-sn-fosfatidiletanolamina, dilauroilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, dilinoleoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-oleoilfosfatidilcolina, 1,2-difitanoil-3-sn-fosfatidilcolina, ácido dilauroilfosfatídico, ácido dimiristoilfosfatídico, ácido dipalmitoilfosfatídico, ácido diestearoilfosfatídico, ácido dioleoilfosfatídico, ácido dilinoleoilfosfatídico, ácido 1 -palmitoil-2-oleoilfosfatídico, ácido 1,2-difitanoil-3-sn-fosfatídico, colesterol y tocoferol.
La etapa (b-2) es una etapa de atrapamiento de la mezcla del fármaco aniónico-lípido catiónico que se define en la reivindicación 1 en la forma de nanopartículas dentro de la estructura micelar formada por el copolímero de bloques anfifílico que se define en la reivindicación 1 y opcionalmente la sal de poli(ácido láctico) al mezclar la solución obtenida en la etapa (b-1) en un disolvente acuoso, en donde el disolvente acuoso usado puede ser agua destilada, agua para inyección o un tampón. La cantidad del disolvente acuoso usada no está particularmente limitada y puede ser, por ejemplo, de 1 a 10, más específicamente de 1 a 5 veces, sobre una base en volumen con relación a la cantidad de disolvente orgánico de la etapa (b-1), pero no se limita a esto.
Además, el copolímero de bloques anfifílico que se define en la reivindicación 1 y la sal de poli(ácido láctico) usados en la etapa (b-1) o (b-2) pueden ser del mismo tipo y se pueden usar en la misma cantidad que el copolímero de bloques anfifílico y la sal de poli(ácido láctico) mencionados anteriormente.
Además, en la etapa (b-3), se obtiene una solución acuosa de la micela polimérica al retirar el disolvente orgánico de la mezcla preparada en la etapa (b-2) mediante evaporación.
Por otra parte, según una realización preferida, el método de preparación de la presente invención puede incluir además una etapa (d) de llevar a cabo liofilización al añadir un adyuvante de la liofilización después de la etapa (b-3).
Según otra realización más, el método de preparación de la presente invención puede incluir además esterilizar la solución acuosa de la micela polimérica obtenida en la etapa (b-3) con un filtro esterilizante antes de la liofilización de la etapa (d).
El adyuvante de liofilización usado en una realización de la presente invención se puede añadir para permitir que la composición liofilizada mantenga una forma de torta o para ayudar a disolver uniformemente la composición del copolímero de bloques anfifílico en un período corto durante la reconstitución después de la liofilización y, específicamente, puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en lactosa, manitol, sorbitol y sacarosa. La cantidad del adyuvante de liofilización puede ser de 1% a 90% en peso, más específicamente de 10% a 60% en peso, basado en el peso total de la composición.
Según una realización del método de preparación de la presente invención, se deja que un fármaco aniónico y el lípido catiónico que se definen en la reivindicación 1 formen un complejo en una fase acuosa, formando de ese modo eficazmente un complejo en nanopartículas mediante interacción electrostática. Además, la fuerza de unión se incrementa durante el procedimiento de retirada de una solución acuosa a través de liofilización, incrementando mucho de ese modo el rendimiento de las micelas poliméricas finalmente preparadas. Además, el método de preparación no solo es ecológico debido al uso de una cantidad relativamente pequeña de disolvente orgánico, y también se mantiene la reproducibilidad al evitar que la relación de la composición cambie debido a la tendencia del lípido catiónico a adherirse al aparato de fabricación, los recipientes o similares, y la producción es extremadamente fácil. Además, se puede realizar fácilmente una producción en masa al convertir los fármacos aniónicos en partículas de fármaco hidrófobas a través de la formación del complejo.
Además, en la composición preparada según una realización de la presente invención, puesto que el complejo del fármaco aniónico y el lípido catiónico que se define en la reivindicación 1 mantiene el estado de estar atrapado dentro de la estructura micelar formada por el copolímero de bloques anfifílico que se define en la reivindicación 1 y opcionalmente la sal de poli(ácido láctico), su estabilidad en sangre o líquido corporal se potencia.
Se describe además en la presente pero no es parte de la invención una composición para aportar fármacos aniónicos que incluye la micela polimérica preparada mediante el susodicho método de preparación.
Según el método de preparación de la presente invención, el fármaco aniónico se une al lípido catiónico que se define en la reivindicación 1 a través de interacciones electrostáticas para formar el complejo de fármaco aniónico-lípido catiónico y se prepara la estructura micelar polimérica en la que el complejo está atrapado dentro de la estructura micelar formada por el polímero de bloques anfifílico que se define en la reivindicación 1 y opcionalmente la sal de poli(ácido láctico). La estructura esquemática del sistema de aporte de micelas poliméricas preparado mediante una realización de la presente invención se muestra en la FIG. 1
Según se muestra en la FIG. 1, la estructura micelar formada por el polímero de bloques anfifílico y opcionalmente la sal de poli(ácido láctico) tiene una estructura en la que el complejo del fármaco aniónico y el compuesto catiónico está atrapado dentro de la micela formada, en donde la porción hidrófila del copolímero de bloques anfifílico forma la pared externa de la micela y la porción hidrófoba del copolímero de bloques anfifílico y la sal de poli(ácido láctico) contenida como un componente separado del copolímero de bloques anfifílico forma la pared interna de la micela.
La divulgación que se refiere al fármaco aniónico, el compuesto catiónico, el polímero de bloques anfifílico, la sal de poli(ácido láctico) y similares, que son los constituyentes de la composición, son iguales que los descritos en el método de preparación según la presente invención.
Según una realización preferida, el tamaño de partícula de la micela en la composición puede ser de 10 a 200 nm, más específicamente, de 10 a 100 nm. Además, la carga estándar de las partículas micelares es de -20 a 20 mV, más específicamente de -10 a 10 mV. El tamaño de partícula y la carga estándar son preferibles considerando la estabilidad de la estructura micelar, el contenido de los ingredientes constituyentes y la absorción y la estabilidad de los fármacos aniónicos en el cuerpo.
La composición que contiene el complejo de fármaco aniónico-lípido catiónico atrapado en la estructura micelar del copolímero de bloques anfifílico y opcionalmente la sal de poli(ácido láctico) según una realización de la presente invención se puede administrar intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, oralmente, intraóseamente, transdérmicamente, tópicamente y similares, y se puede fabricar en diversas formulaciones orales o parenterales adecuadas para las vías de administración. Ejemplos de las formulaciones orales incluyen comprimidos, cápsulas, polvos y soluciones, y ejemplos de las formulaciones parenterales incluyen gotas oculares, inyecciones y similares. En una realización preferida, la formulación puede ser una formulación para inyección. Por ejemplo, en el caso de que la composición esté liofilizada, se puede preparar en la forma de una formulación para inyección al reconstituirla con agua destilada para inyección, una solución salina al 0,9%, una solución acuosa de dextrosa al 5% y similares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES
En lo que sigue, la presente invención se explicará con detalle por medio de Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos solo son para ilustrar la invención y el alcance de la invención no está limitado de ningún modo a los mismos.
[Ejemplo Comparativo 1] Preparación de composición que contiene ARNsi/1,6-dioleoiltrietilentetramida (dio-TETA)/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/PLANa (1,7 k)
Se disolvieron 126 gg de 1,6 dioTETA en 6,3 gl de cloroformo y se disolvieron 5 gg de ARNsi en 4 gl de agua destilada. Se disolvieron 0,5 mg de PLANa (1,7 k) en 10 gl de cloroformo y se disolvió 1 mg de mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) en 20 gl de cloroformo. Se añadieron 3,7 gl de cloroformo de modo que la relación en volumen de la capa orgánica a la capa acuosa como un todo fuera 10 veces. Se añadieron 44 gl de cloroformo a 4 gl de la solución en la que se había disuelto 1 mg de mPEG-PLA-tocoferol en cloroformo, que es equivalente a 0,2 mg de mPEG-PLA-tocoferol (20% en peso), y la mezcla se añadió a un matraz de fondo redondo de 1 boca y el disolvente se retiró mediante destilación bajo presión reducida usando un evaporador giratorio.
La solución de dioTETA, la solución de PLANa y 0,8 mg de solución de mPEG-PLA-tocoferol se mezclaron y se preparó una emulsión usando un homogeneizador ultrasónico mientras se añadía gota a gota la solución acuosa de ARNsi. La emulsión se añadió a un matraz de fondo redondo de 1 boca revestido con 0,2 mg de mPEG-PLA-tocoferol, y el disolvente se retiró mediante destilación bajo presión reducida usando un evaporador giratorio. Se añadieron al matraz 100 gl de agua destilada y se agitó suavemente para disolver, preparando de ese modo una composición que contenía ARNsi/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/PLANa (Ejemplo Comparativo 1).
[Ejemplos Comparativos 2-3] Preparación de composiciones que contienen ARNsi/1,6-dioleoiltrietilentetramida (dio-TETA)/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/DOPE/(PLANa)
Los Ejemplos Comparativos 2 y 3 se prepararon del mismo modo que en el Ejemplo Comparativo 1, excepto que se cambiaron las relaciones de composición. Se disolvieron 5 gg del ARNsi en 4 gl de agua destilada, y la composición excluyendo el ARNsi se disolvió en cloroformo de modo que la relación de la capa orgánica a la capa acuosa fuera 10 veces. En el caso del Ejemplo Comparativo 2, se disolvieron 94,5 gg g de 1,6 dioTETA en 5 gl de cloroformo, se disolvió 1 mg de mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) en 20 gl de cloroformo y se disolvieron 104 gg de DOPE en 5,2 gl de cloroformo y se añadieron 9,8 gl de cloroformo. En el caso del Ejemplo Comparativo 3, se disolvieron 94,5 gg de 1,6 dioTETA en 5 gl de cloroformo, se disolvió 1 mg de mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) en 20 gl de cloroformo, se disolvieron 0,3 mg de PLANa en 9,8 gl de cloroformo y se disolvieron 104 gg de DOPE en 5,2 gl de cloroformo. Se añadieron 44 gl de cloroformo a 4 gl de la solución en la que se había disuelto 1 mg de mPEG-PLA-tocoferol en cloroformo, que es equivalente a 0,2 mg de mPEG-PLA-tocoferol (20% en peso), y la mezcla se añadió a un matraz de fondo redondo de 1 boca, y el disolvente se retiró mediante destilación bajo presión reducida usando un evaporador giratorio.
Se mezclaron la solución de dioTETA, 0,8 mg de solución de mPEG-PLA-tocoferol y (o) la solución de PLANa o la solución de DOPE y se preparó una emulsión usando un homogeneizador ultrasónico mientras se añadía gota a gota la solución acuosa de ARNsi. La emulsión se añadió a un matraz de fondo redondo de 1 boca revestido con 0,2 mg de mPEG-PLA-tocoferol, y el disolvente se retiró mediante destilación bajo presión reducida usando un evaporador giratorio. Se añadieron al matraz 100 gl de agua y se agitó suavemente para disolver, preparando de ese modo una composición que contenía ARNsi/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/DOPE (Ejemplo Comparativo 2), una composición que contenía ARNsi/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/PLANa/DOPE (Ejemplo Comparativo 3) [Tabla 1]
Figure imgf000012_0001
(La unidad de cada componente en la relación de composición es como sigue: ARNsi: pg, lípido: relación N/P, polímero: mg, relación molar de lípido fusogénico:lípido. Polímero 1 se refiere a mPEG-PLA-tocoferol: Polímero 2 se refiere a PLANa. Lo mismo se aplica a las siguientes tablas.)
[Ejemplos 1-2] Preparación de composiciones que contienen ARNsi/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/PLANa (1,7 k) (Preparación de formulaciones en fase acuosa)
Se disolvieron 126 pg de 1,6 dioTETA en 252 pl de agua destilada y a continuación se pusieron en un lavador ultrasónico durante 10 minutos para reducir el tamaño de partícula. Se disolvieron 5 pg de ARNsi en 4 pl de agua destilada y se disolvieron 1 mg de mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) y 500 pg de PLANa (1,7 k) en 10 pl y 2 pl de agua destilada, respectivamente. Se mezclaron en primer lugar ARNsi y 1,6-dioTETA, y a continuación se mezclaron mPEG-PLA-tocoferol y PLANa. Se añadió agua destilada de modo que la relación en volumen fuera 1:1. La mezcla de ARNsi y 1,6 dioTETA y la mezcla de mPEG-PLA-tocoferol y PLANa se mezclaron gota a gota bajo ultrasonidos. Después de mantener a 4°C durante 10 minutos para la estabilización de la formulación, la mezcla se filtró a través de un filtro de PVDF hidrófilo de 0,45 pm para eliminar partículas grandes. (Ejemplo 1)
En el Ejemplo 2, la composición se preparó con 500 pg de mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) y 100 pg de PLANa (1,7 k) según el procedimiento del Ejemplo 1.
[Tabla 2]
Figure imgf000012_0002
[Ejemplo 3] Preparación de composición que contiene ARNsi/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/PLANa (1,7 k) (método de preparación de formación de nanopartículas de ARNsi/dioTETA en fase acuosa y atrapamiento de ellas en micela polimérica en emulsión)
Se disolvieron 5 pg de ARNsi en 4 pl de agua destilada, se disolvieron 126 pg de dioTETA en 126 pl de agua destilada y a continuación se mezclaron gota a gota bajo ultrasonidos. La mezcla se liofilizó hasta un estado en polvo y el polvo se disolvió con una solución en la que 300 pg de PLANa estaban disueltos en 50 pl de acetato de etilo. Una solución en la que 1 mg de mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) estaba disuelto en 100 pl de agua destilada se añadió gota a gota a la mezcla de ARNsi, dioTETA y PLANa para preparar una emulsión usando un homogeneizador ultrasónico. La emulsión preparada se puso en un matraz de fondo redondo de 1 boca y se sometió a destilación bajo presión reducida usando un evaporador giratorio para retirar selectivamente acetato de etilo para preparar micelas poliméricas que contienen ARNsi/1,6-dioleoiltrietilentetramida(dioTETA)/mPEG-PLA-tocoferol ( 2 k-1,7 k)/PLANA.
[Ejemplos 4-6] Preparación de composiciones que contienen ARNsi/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/PLANa (1,7 k) (método de preparación de formación de nanopartículas de ARNsi/dioTETA en fase acuosa y atrapamiento de ellas en una micela polimérica en emulsión)
Se prepararon composiciones que contenían ARNsi/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/PLANa (1,7 k) de un modo similar al Ejemplo 3, con la salvedad de que se cambiaba el orden de mezcladura de las composiciones. La composición, el tipo y la cantidad del disolvente y el procedimiento de preparación son iguales, pero los siguientes ejemplos se dividen según el disolvente en el que se disuelva la composición. Se preparó una emulsión de complejo al usar agua destilada disuelta con PLANa después de disolver ARNsi y polvo de dioTETA en acetato de etilo que contiene mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) ( Ejemplo 4). Se preparó una emulsión de complejo al usar agua destilada disuelta con mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) y PLANa, después de disolver el polvo en acetato de etilo (Ejemplo 5). Además, se preparó una emulsión de complejo al usar agua destilada después de disolver el polvo en acetato de etilo que contiene mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) y PLANa (Ejemplo 6).
[Tabla 3]
Figure imgf000013_0001
[Ejemplos 7-12] Preparación de composiciones que contienen ARNsi/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/PLANa (1,7 k) (método de preparación de formación de nanopartículas de ARNsi/dioTETA en fase acuosa y atrapamiento de ellas en una micela polimérica en emulsión)
Se prepararon composiciones que contenían ARNsi/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/PLANa (1,7 k) del mismo modo que en el Ejemplo 3, excepto que se usaron composiciones diferentes.
Las composiciones obtenidas en los Ejemplos 7 a 12 se resumen en la Tabla 4 posterior:
[Tabla 4]
Figure imgf000013_0002
[Ejemplos 13-14] Preparación de composiciones que contienen ARNsi/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/DOPE (método de preparación de formación de nanopartículas de ARNsi/dioTETA en fase acuosa y atrapamiento de ellas en una micela polimérica en emulsión)
Se prepararon composiciones que contenían ARNsi/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/DOPE del mismo modo que en el Ejemplo 6, excepto que se usaron diferentes composiciones.
Las composiciones obtenidas en los Ejemplos 13 y 14 se resumen en la Tabla 5 posterior:
[Tabla 51
Figure imgf000014_0001
[Ejemplos 15-16] Preparación de composiciones que contienen ARNsi/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/PLANa (1,7 k)/DOPE (método de preparación de formación de nanopartículas de ARNsi/dioTETA en fase acuosa y atrapamiento de ellas en una micela polimérica en emulsión)
Se prepararon composiciones que contenían ARNsi/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)/PLANa (1,7 K)/DOPE del mismo modo que en el Ejemplo 6, excepto que se usaron composiciones diferentes.
Las composiciones obtenidas en los Ejemplos 15 y 16 se resumen en la Tabla 6 posterior:
[Tabla 61
Figure imgf000014_0002
[Ejemplo Experimental 1] Comparación de contenidos de ARNsi de micelas poliméricas según el método de preparación
El contenido de ARNsi se pesó para confirmar cómo variaba el rendimiento de nanopartículas según cada método de preparación y composición.
La cantidad de ARNsi en las micelas poliméricas preparadas se cuantificó usando el método de extracción de Bligh & Dyer modificado. Las micelas poliméricas se disolvieron en fosfato sódico 50 mM y NaCl 75 mM (pH 7,5) para formar una monofase de Bligh-Dyer y se extrajeron con fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5) y cloroformo para cuantificar el ARNsi en la capa de solución acuosa con el reactivo Ribogreen (Invitrogen).
El contenido de ARNsi de las micelas poliméricas de ARNsi/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol(2 k-1,7 k)/PLANa (1,7 k) según el método de preparación para preparar formulaciones en fase acuosa y formar nanopartículas de ARNsi/dioTETA en fase acuosa, seguido por atraparlas en micelas poliméricas se muestra en la Tabla 7 posterior.
[Tabla 71
Figure imgf000014_0003
Los contenidos de ARNsi de los Ejemplos 7 a 12 que tienen diferentes composiciones según el método de preparación de formación de nanopartículas de ARNsi/dioTETA en una fase acuosa y atrapamiento de ellas en micelas poliméricas en la emulsión se muestran en la Tabla 8 posterior.
[Tabla 8]
Figure imgf000015_0001
Los contenidos de ARNsi de los Ejemplos 13 a 16 que tienen diferentes composiciones según el método de preparación de formación de nanopartículas de ARNsi/dioTETA en una fase acuosa y atrapamiento de ellas en micelas poliméricas en la emulsión se muestran en la Tabla 9 posterior.
[Tabla 9]
Figure imgf000015_0002
Según se muestra en las Tablas 7, 8 y 9, los contenidos de ARNsi para las composiciones de los Ejemplos 1 a 16 preparadas según realizaciones del método de preparación de la presente invención eran notablemente superiores a los de los Ejemplos Comparativos. Este resultado demuestra que el método de formación de nanopartículas de ARNsi/dioTETA en una fase acuosa potencia la interacción eficaz entre ARNsi y los lípidos catiónicos, atrapando de ese modo eficazmente el ARNsi en micelas.
[Ejemplo Comparativo 4] Preparación de composición que contiene ARNsi/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) (Método para preparar emulsión de complejo)
Se disolvieron 126 gg de dioTETA en cloroformo y se disolvieron 5 gg de ARNsi en agua destilada. Se disolvió 1 mg de mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) en cloroformo. La dioTETA y el mPEG-PLA-tocoferol se mezclaron y se preparó una emulsión usando un homogeneizador ultrasónico mientras se añadía el ARNsi gota a gota. Se preparó una emulsión de complejo usando un homogeneizador ultrasónico mientras se añadía la emulsión al agua destilada. La emulsión de complejo se puso en un matraz redondo de 1 boca, y el cloroformo se retiró mediante destilación bajo presión reducida usando un evaporador giratorio para preparar una composición que contiene ARNsi/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k).
[Tabla 10]
Figure imgf000015_0003
[Ejemplo 17] Preparación de composición que contiene ARNsi/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) (método de preparación de formación de nanopartículas de ARNsi/dioTETA en fase acuosa y atrapamiento de ellas en una micela polimérica en emulsión)
Se disolvieron 5 gg de ARNsi en 4 gl de agua destilada, se disolvieron 126 gg de dioTETA en 126 gl de agua destilada y a continuación se mezclaron gota a gota bajo ultrasonidos. La mezcla se liofilizó hasta un estado en polvo, y el polvo se disolvió en 50 gl de acetato de etilo. Una solución en la que 1 mg de mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) estaba disuelto en 100 gl de agua destilada se añadió gota a gota a la mezcla de ARNsi, dioTETA y PLANa para preparar una emulsión usando un homogeneizador ultrasónico. La emulsión preparada se puso en un matraz de fondo redondo de 1 boca y se sometió a destilación bajo presión reducida usando un evaporador giratorio para retirar selectivamente acetato de etilo para preparar micelas poliméricas que contienen ARNsi/1,6-dioleoiltrietilentetramida(dio-TETA)/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k).
[Tabla 11]
Figure imgf000016_0001
[Ejemplo Experimental 2] Comparación de contenidos de ARNsi según los métodos de preparación de micelas poliméricas de ARNsi/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k)
El contenido de ARNsi se cuantificó para confirmar cómo variaba el rendimiento de las nanopartículas según cada método de preparación.
La cantidad de ARNsi en las micelas poliméricas que contienen ARNsi/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2 k-1,7 k) preparadas se cuantificó usando el método de extracción de Bligh & Dyer modificado. Las micelas poliméricas se disolvieron en fosfato sódico 50 mM y NaCl 75 mM (pH 7,5) para formar una monofase de Bligh-Dyer y se extrajeron con fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5) y cloroformo para cuantificar el ARNsi en la capa de solución acuosa con el reactivo de Ribogreen (Invitrogen).
Los resultados de la comparación para el contenido de ARNsi atrapado en la micelas del Ejemplo Comparativo 4 y el Ejemplo Experimental 17 se muestran en la Tabla 12 posterior.
[Tabla 12]
Figure imgf000016_0002
Según se muestra en la Tabla 12, el contenido de ARNsi del Ejemplo 17 preparado según una realización del método de preparación de la presente invención es notablemente superior al del Ejemplo Comparativo.
[Ejemplo Experimental 3] Comparación de la estabilidad de micelas poliméricas (ensayo de competición con heparina)
El ensayo de competición con heparina se realizó para investigar la estabilidad in vitro según cada método de preparación y composición. Se trataron 10 gl de la formulación (300 ng de ARNsi) con 40 gg de heparina y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, el ARNsi disociado se midió mediante electroforesis. La formulación tiene una estabilidad superior ya que la disociación de ARNsi se hace inferior, y la comparación de la estabilidad según la relación de composición se muestra en la Tabla 13.
[Tabla 13]
Figure imgf000017_0001
Además, la comparación de la estabilidad de los Ejemplos 13 a 16 que tienen diferentes composiciones según el método de preparación de formación de nanopartículas de ARNsi/dioTETA en una fase acuosa y atrapamiento de ellas en la micelas poliméricas en la emulsión se muestra en la Tabla 14 posterior.
[Tabla 14]
Figure imgf000017_0002
Las Tablas 13 y 14 muestran los resultados comparativos de la estabilidad del sistema de aporte de micelas poliméricas a través de competición con heparina. Se puede observar que el sistema de aporte preparado mediante una realización del método de preparación según la presente invención en el que la preparación o la formación de nanopartículas de ARNsi/dioTETA se llevaba a cabo en fase acuosa, seguido por un atrapamiento en micelas poliméricas en la emulsión, mostraba una baja disociación por heparina. Estos resultados demuestran que el ARNsi puede estar establemente atrapado en las micelas poliméricas, manteniendo de ese modo la estabilidad en la sangre o en el cuerpo.
[Ejemplo Experimental 4] Comparación de la reproducibilidad de micelas poliméricas según el método de preparación
La relación de composición y el método de preparación específicos se seleccionaron para preparar formulaciones a una escala de 200 gg basada en ARNsi. La reproducibilidad de la preparación de las formulaciones era la comparación basándose en el contenido (rendimiento) de ARNsi al repetir el mismo experimento tres veces.
La reproducibilidad de la preparación según el método de preparación del Ejemplo Comparativo 1 se comparó con las de los Ejemplos 3 y 7, y los resultados se muestran en la Tabla 15 posterior.
[Tabla 15]
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[Ejemplo Experimental 5] Comparación del contenido (rendimiento) de ARNsi con cantidad creciente de micela polimérica preparada según el método de preparación
La relación de composición y el método de preparación específicos se seleccionaron para preparar formulaciones a escalas de 200 gg, 500 gg, 100 gg basadas en ARNsi. Los rendimientos según el incremento en la cantidad de preparación se compararon al repetir el mismo experimento dos veces.
El rendimiento según el incremento en la cantidad de la preparación del Ejemplo Comparativo 1 se comparó con el del Ejemplo 7, y los resultados se muestran en la Tabla 16 posterior.
[Tabla 16]
Figure imgf000018_0002
[Ejemplo Experimental 6] Análisis de la concentración plasmática de micelas poliméricas
Las formulaciones preparadas se administraron a animales y se recogió sangre 0,5 horas y 6 horas después de la administración, y la concentración en sangre de las micelas se analizó mediante los siguientes procedimientos usando RT (transcripción inversa) y qRT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa).
Las formulaciones se inyectaron intravenosamente en ratones Balb/c a una concentración de 1 mg/kg, y se recogió sangre después de 0,5 horas y 6 horas. La sangre se centrifugó a 13000 rpm a 4°C durante 15 minutos para recoger solo la capa superior en un nuevo tubo, y la concentración de la formulación estándar se preparó al diluir con PBS hasta un total de 11 concentraciones que variaban de 4 gM a 0,00256 gM. Se añadió 1 gl de la formulación estándar diluida a una placa de 96 pocillos para PCR, y se añadieron 9 gl de suero de ratón Balb/c y se añadieron a esto 90 gl de triton X-100 al 0,25%. Después de añadir 90 gl de triton X-100 al 0,25% a 10 gl de la muestra de sangre del grupo experimental, se llevó a cabo una etapa de pretratamiento para desformular el sistema de aporte. El ARNsi expuesto según se desformulaba la formulación se sintetizó en ADNc a través de una etapa de transcripción inversa (RT), y se realizó qRT-PCR (Bio-Rad CFX96 Real-Time System) usando el ADNc sintetizado. El análisis se realizó usando el programa Bio-Rad CFX Manager.
[Tabla 17]
Figure imgf000018_0003

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar una composición para aportar un fármaco aniónico,
en donde dicho método (i) comprende:
(a) disolver un fármaco aniónico y un lípido catiónico en un disolvente acuoso, respectivamente, y mezclarlos; y
(b) disolver un copolímero de bloques anfifílico en un disolvente acuoso y mezclar con la mezcla obtenida en la etapa (a), en donde el lípido catiónico es un lípido catiónico representado por la Fórmula Química 1:
[Fórmula Química 1]
Figure imgf000019_0001
en la fórmula 1,
n, m y 1 son cada uno de 0 a 12, con la condición de que 1 < n m 1 < 12,
a, b y c son independientemente de 1 a 6,
R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un hidrocarburo saturado e insaturado que tiene de 11 a 25 átomos de carbono, con la condición de que al menos uno de R1, R2 y R3 sea un hidrocarburo saturado o insaturado que tiene de 11 a 25 átomos de carbono, y
en donde el copolímero de bloques anfifílico es un copolímero de bloques de tipo A-B que comprende un bloque hidrófilo (A) y un bloque hidrófobo (B), donde el bloque A hidrófilo es polietilenglicol o monometoxipolietilenglicol y el bloque B hidrófobo es poliláctido, poliglicólido o uno de sus copolímeros; y en donde las etapas (a) y (b) se efectúan en una monofase, o
dicho método (ii) comprende:
(a') disolver un fármaco aniónico y el lípido catiónico representado por la Fórmula Química 1 que se define anteriormente en un disolvente acuoso, respectivamente, y mezclarlos, seguido por liofilización;
(b-1) disolver el producto liofilizado obtenido en la etapa (a') en un disolvente orgánico;
(b-2) mezclar la solución obtenida en la etapa (b-1) con un disolvente acuoso; y
(b-3) retirar el disolvente orgánico de la mezcla obtenida en la etapa (b-2), en donde el copolímero de bloques anfifílico está disuelto en el disolvente orgánico de la etapa (b-1) o el disolvente acuoso de la etapa (b-2).
2. El método según la reivindicación 1, que comprende además disolver una sal de poli(ácido láctico) en un disolvente acuoso o un disolvente orgánico y mezclar con la mezcla obtenida en la etapa (a), en la etapa (b).
3. El método según la reivindicación 1, que comprende además (c) de estabilización de la mezcla obtenida en la etapa (b) a una temperatura de 0°C a 50°C durante de 5 minutos a 60 minutos.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la relación en volumen (solución acuosa de lípido catiónico/solución acuosa de fármaco aniónico) de la solución acuosa en la que está disuelto el lípido catiónico a la solución acuosa en la que está disuelto el fármaco aniónico en la etapa (a) o la etapa (a') es de 1 a 20.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el fármaco aniónico es un péptido, una proteína o un ácido nucleico.
6. El método según la reivindicación 6, en donde al menos un extremo del ácido nucleico está modificado con al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol y un ácido graso que tiene de 10 a 24 átomos de carbono.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el disolvente orgánico en la etapa (b) o (b-1) es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en acetona, etanol, metanol, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, acetato de etilo y ácido acético.
8. El método según la reivindicación 2, en donde la sal de poli(ácido láctico) es al menos una seleccionada del grupo que consiste en los compuestos representados por las Fórmulas Químicas 2 a 7:
[Fórmula Química 2] RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM
en la fórmula 2, A es -COO-CHZ-; B es -COO-CHY-, -COO-CH2CH2CH2CH2CH2- o -COO-CH2CH2OCH2 ; R es un átomo de hidrógeno, un grupo acetilo, benzoílo, decanoílo, palmitoílo, metilo o etilo; Z e Y son cada uno un átomo de hidrógeno, un grupo metilo o fenilo; M es Na, K o Li; n es un número entero de 1 a 30; y m es un número entero de 0 a 20;
[Fórmula Química 3] RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY' ]q-COO-CHZ-COOM
en la fórmula 3, X es un grupo metilo; Y' es un hidrógeno o un grupo fenilo; p es un número entero de 0 a 25 y q es un número entero de 0 a 25, con la condición de que p+q sea un número entero de 5 a 25; R es un hidrógeno, un grupo acetilo, benzoílo, decanoílo, palmitoílo, metilo o etilo; M es Na, K o Li; Z es un hidrógeno, un grupo metilo o fenilo;
[Fórmula Química 4] RO-PAD-COO-W-M'
en la fórmula 4, W-M' es
Figure imgf000020_0001
PAD se selecciona del grupo que consiste en D,L-poli(ácido láctico), D-poli(ácido láctico), poli(ácido mandélico), un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido glicólico, un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido mandélico, un copolímero de D,L-ácido láctico y caprolactona y un copolímero de D,L-ácido láctico y 1,4-dioxan-2-ona; R es un hidrógeno, un grupo acetilo, benzoílo, decanoílo, palmitoílo, metilo o etilo; M es independientemente Na, K o Li;
[Fórmula Química 5] S-O-PAD-COO-Q
en la fórmula 5, S es
Figure imgf000020_0002
L es -NR1- o -O-, en donde R1 es un hidrógeno o alquilo C1-10; Q es CH3 , CH2CH3 , CH2CH2CH3 , CH2CH2CH2CH3 o CH2C6H5 ; a es un número entero de 0 a 4; b es un número entero de 1 a 10; M es Na, K o Li; PAD es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en D,L-poli(ácido láctico), D-poli(ácido láctico), poli(ácido mandélico), un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido glicólico, un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido mandélico, un copolímero de D,L-ácido láctico y caprolactona y un copolímero de D,L-ácido láctico y 1,4-dioxan-2-ona;
[Fórmula Química 6]
Figure imgf000020_0003
en la fórmula 6, R' es -PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM, PAD se selecciona del grupo que consiste en D,L-poli(ácido láctico), D-poli(ácido láctico), poli(ácido mandélico), un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido glicólico, un copolímero de D,L-ácido láctico y ácido mandélico, un copolímero de D,L-ácido láctico y caprolactona y un copolímero de D,L-ácido láctico y 1,4-dioxan-2-ona; M es Na, K o Li; y a es un número entero de 1 a 4;
[Fórmula Química 7] YO-[-C(O)-(CHX)a-O-]m-C(O)-R-C(O)-[-O-(CHX' )b-C(O)-]n-OZ
en la fórmula 7, X y X' son independientemente hidrógeno, alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o arilo que tiene de 6 a 20 átomos de carbono; Y y Z son independientemente Na, K o Li; m y n son independientemente números enteros de 0 a 95, con la condición de que 5 < m n < 100; a y b son independientemente números enteros de 1 a 6; R es -(CH2)k-, un alquenilo divalente que tiene de 2 a 10 átomos de carbono, un arilo divalente que tiene de 6 a 20 átomos de carbono, o una de sus combinaciones, en donde k es un número entero de 0 a 10.
9. El método según la reivindicación 1, en donde el grupo hidroxilo terminal del bloque B hidrófobo está modificado con al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol y un ácido graso que tiene de 10 a 24 átomos de carbono.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el disolvente orgánico comprende un lípido fusogénico.
11. El método según la reivindicación 10, en donde el lípido fusogénico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en dilauroilfosfatidiletanolamina, dimiristoilfosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidiletanolamina, diestearoilfosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidiletanolamina, dilinoleoilfosfatidiletanolamina, 1 -palmitoil-2-oleoilfosfatidiletanolamina, 11,2-difitanoil-3-sn-fosfatidiletanolamina, dilauroilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, dilinoleoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-oleoilfosfatidilcolina, 1,2-difitanoil-3-sn-fosfatidilcolina, ácido dilauroilfosfatídico, ácido dimiristoilfosfatídico, ácido dipalmitoilfosfatídico, ácido diestearoilfosfatídico, ácido dioleoilfosfatídico, ácido dilinoleoilfosfatídico, ácido 1 -palmitoil-2-oleoilfosfatídico, ácido 1,2-difitanoil-3-sn-fosfatídico, colesterol y tocoferol.
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