ES2836279T3

ES2836279T3 - Método de preparación de una composición para administrar un fármaco aniónico

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Publication number: ES2836279T3
Application number: ES13772575T
Authority: ES
Inventors: Muhn-Ho La; Ji-Yeon Son; Sang-Hoon Kim
Original assignee: Samyang Biopharmaceuticals Corp
Current assignee: Samyang Biopharmaceuticals Corp
Priority date: 2012-04-04
Filing date: 2013-04-03
Publication date: 2021-06-24
Anticipated expiration: 2033-04-03
Also published as: EP2833869A1; US9439856B2; US20150328152A1; EP2833869B1; KR20130112794A; WO2013151326A1; KR101480055B1; DK2833869T3; EP2833869A4; PT2833869T

Abstract

Un método de preparación de una composición para la administración de fármacos aniónicos, comprendiendo la composición un fármaco aniónico, un lípido catiónico y un copolímero de bloque anfifílico, en donde el fármaco aniónico forma un complejo con un lípido catiónico, y el complejo se atrapa en una estructura de micela formada por el copolímero de bloque anfifílico, comprendiendo el método las etapas de: (1) añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico en un disolvente orgánico para producir una emulsión; y (2) añadir un disolvente acuoso o una disolución acuosa del copolímero de bloque anfifílico para formar una micela polimérica; a condición de que, cuando el disolvente acuoso se añade en la etapa (2), el método comprende además cualquiera de las etapas de añadir el copolímero de bloque anfifílico a la disolución del lípido catiónico en el disolvente orgánico, que se usa en la etapa (1), y retirar el disolvente orgánico de la emulsión preparada en la etapa (1), o las etapas de retirar el disolvente orgánico de la emulsión preparada en la etapa (1), añadir a la misma una disolución del copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico, y luego retirar el disolvente orgánico, y cuando la disolución acuosa del copolímero de bloque anfifílico se añade en la etapa (2), el método comprende, además, después de la etapa (1) o (2), la etapa de retirar el disolvente orgánico.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de preparación de una composición para administrar un fármaco aniónico

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a un método eficaz de preparación de una composición para administrar un fármaco aniónico, comprendiendo la composición un fármaco aniónico como principio activo, un lípido catiónico y un copolímero de bloque anfifílico, en donde el fármaco aniónico forma un complejo con el lípido catiónico, y el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico se atrapa en una estructura de micela formada por el copolímero de bloque anfifílico.

[Técnica anterior]

Para realizar tratamientos usando fármacos aniónicos, particularmente materiales de ácido nucleico, se han estudiado durante un largo tiempo tecnologías de administración de fármacos seguras y eficientes, y se han desarrollado diversos sistemas de administración y técnicas. Particularmente, se han desarrollado tecnologías de administración que emplean sistemas de administración viral basados en un adenovirus o un retrovirus, y sistemas de administración no viral basados en lípidos catiónicos o polímeros catiónicos.

Sin embargo, se conoce que las tecnologías que emplean los sistemas de administración viral tienen problemas en su comercialización, que incluye el riesgo de respuestas inmunitarias no específicas y la complejidad en los procesos de producción. Por este motivo, una tendencia de investigación reciente es hacia vencer las limitaciones de los sistemas de administración viral por medio del uso de sistemas de administración no viral basados en lípidos catiónicos o polímeros catiónicos. Dichos sistemas de administración no viral son menos eficientes que los sistemas de administración viral, pero tienen las ventajas de ir acompañados de menos efectos secundarios in vivo y tener costes de producción más bajos.

Se han realizado muchos estudios sobre los sistemas de administración no viral usados para la administración de materiales de ácido nucleico, y la mayoría de sus ejemplos típicos incluyen un complejo de lípido catiónico y ácido nucleico (lipoplex) y un complejo de un polímero policatiónico y ácido nucleico (poliplex). Se ha estudiado mucho este lípido catiónico o polímero policatiónico, debido a que forma un complejo por interacciones electrostáticas con un fármaco aniónico, estabilizando así el fármaco aniónico y aumentando la administración intracelular del fármaco aniónico (De Paula D, Bentley MV, Mahato RI, Hydrophobization and bioconjugation for enhanced siRNA delivery and targeting, RNA 13 (2007) 431-56; Gary DJ, Puri N, Won YY, Polymer-based siRNA delivery: Perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery, J Control release 121 (2007) 64 73).

Sin embargo, si los lípidos catiónicos o los polímeros policatiónicos desarrollados hasta la fecha se usan en una cantidad requerida para obtener efectos suficientes, puede provocar una intensa toxicidad - aunque inferior a la provocada por los sistemas de administración viral - que indica que no son adecuados para aplicaciones terapéuticas. Además, se usa ampliamente un complejo de lípido-ácido nucleico para la administración intracelular del ácido nucleico en los experimentos en líneas celulares, pero no forma una estructura estable en sangre, y así no se puede usar in vivo (véase la patente de EE. UU. N° 6.458.382).

Otro sistema de administración no viral que se usa para la administración intracelular de un ácido nucleico in vivo es un complejo de ácido nucleico-liposoma catiónico o un liposoma catiónico que contiene un ácido nucleico. Comprende un lípido anfifílico, un lípido neutro, un lípido fusogénico, o similares, y el ácido nucleico se une eléctricamente al liposoma o se atrapa en el liposoma (documentos de patente US2003-0073640, WO05/007196 y US2006-0240093). Sin embargo, este sistema de administración de liposomas puede ser fácilmente capturado por el sistema reticuloendotelial (RES) y muestra efectos secundarios con una toxicidad significativa, que indica que no es adecuado para uso sistémico. Por tanto, los efectos de la administración de ácidos nucleicos de los mismos están principalmente limitados al tejido del hígado.

Además, un sistema de administración no viral que se ha estudiado frecuentemente junto con el sistema de administración de liposomas es un sistema de administración que comprende un polímero policatiónico que contiene una carga catiónica multivalente por molécula. En este sistema de administración, un polímero que se usa frecuentemente es el polímero basado en polietilenimina (PEI) policatiónica, que se une electrostáticamente a un ácido nucleico para formar una nanopartícula que consiste en un complejo de ácido nucleico-polímero. Sin embargo, se conoce que dichos polímeros policatiónicos estimulan la muerte celular y esta citotoxicidad aumenta a medida que aumenta el peso molecular y el grado de ramificación del polímero. Por tanto, se conoce que los polímeros policatiónicos con bajo peso molecular tienen baja citotoxicidad, pero no pueden formar eficazmente un complejo con un ácido nucleico debido a su baja densidad catiónica, y así no logran la administración intracelular suficiente del ácido nucleico y no contribuyen enormemente a la estabilidad del ácido nucleico.

Otro tipo de sistema de administración de ácidos nucleicos incluye un sistema de administración obtenido conjugando un lípido o un polímero directamente con un ácido nucleico y luego formando un complejo del conjugado con una micela u otro polímero para formar una nanopartícula. Sin embargo, la conjugación del lípido o el polímero directamente con el ácido nucleico muestra dificultad en términos de eficiencia de conjugación o control de calidad, y todavía no se ha verificado claramente la eficiencia de la administración de ácidos nucleicos de este sistema de administración.

Por tanto, se requiere desarrollar un sistema de administración de fármacos aniónicos en el que se pueda minimizar la cantidad de polímero catiónico o lípido catiónico usada para reducir la citotoxicidad y que sea estable en sangre y líquido corporal y se pueda administrar en células para presentar efectos suficientes.

Mientras tanto, ha habido diversos intentos de usar copolímero de bloque anfifílico para solubilizar un fármaco poco soluble en agua en forma de una micela polimérica y de estabilizar el fármaco en una disolución acuosa, proporcionándose así un sistema de administración de fármacos (patente registrada coreana N° 0180334). Este copolímero de bloque anfifílico puede solubilizar un fármaco hidrófobo poco soluble en agua formando micelas poliméricas, pero los fármacos hidrófilos tales como los ácidos nucleicos aniónicos no se pueden atrapar en las micelas poliméricas, y así el copolímero de bloque anfifílico no es adecuado para la administración de estos fármacos aniónicos que incluyen ácidos nucleicos. Así, para administrar un fármaco aniónico en forma de una micela polimérica, se requiere un proceso de neutralización de la carga del fármaco aniónico usando un material catiónico. Este proceso se desvela en la publicación de patente internacional N° WO 2010/074540 y en el documento de patente US2011/268772.

Mientras tanto, muchas enfermedades son provocadas por un aumento de la expresión de genes relacionados con la enfermedad que ocurre debido a diversos factores o por actividad anormal provocada por mutación. El ARNip (ARN interferente pequeño) inhibe la expresión de un gen específico en un modo específico de secuencia en la etapa postranscripcional, y recibe una gran atención como agente terapéutico. Particularmente, debido a su alta actividad y selectividad genética precisa, se espera que el ARNip como agente terapéutico pueda sustituir los nucleótidos antisentido o ribozimas existentes. El ARNip es una molécula de ARN bicatenario corto compuesto de 15-30 nucleótidos y escinde el ARNm de un gen que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la misma para inhibir la expresión del gen (McManus and Sharp, Nature Rev. Genet. 3:737 (2002); Elbashir, et al., Genes Dev.

15:188 (2001)).

A pesar de dichas ventajas, se conoce que el ARNip es rápidamente degradado por las nucleasas en la sangre y es rápidamente eliminado por el riñón. Además, se conoce que el ARNip no atraviesa fácilmente la membrana celular debido a que está negativamente cargado. Por este motivo, para usar ARNip como agente terapéutico, se requiere desarrollar una tecnología para preparar un sistema para administración de ARNip, que pueda estabilizar el ARNip in ^vivo, administrar el ARNip en una célula diana o un órgano diana eficientemente y no presente toxicidad.

[Divulgación]

[Problema técnico]

Una realización de la presente invención proporciona un método eficaz de preparación de una composición para administrar un fármaco aniónico, que comprende una estructura de micela capaz de administrar eficazmente el fármaco aniónico in vivo.

Otra realización de la presente invención proporciona un método de preparación de una partícula de micela que comprende un complejo de fármaco aniónico y un lípido catiónico, donde el complejo se forma por el fármaco aniónico y un lípido catiónico por una interacción electrostática, y se atrapa no covalentemente dentro de la micela.

[Solución técnica]

Una realización de la presente invención se refiere a un método de preparación de una composición para administrar un fármaco aniónico, que comprende un fármaco aniónico como un principio activo, un lípido catiónico y un copolímero de bloque anfifílico, en donde el fármaco aniónico forma un complejo con el lípido catiónico, y el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico se atrapa en una estructura de micela formada del copolímero de bloque anfifílico. Esta composición para la administración de fármacos aniónicos está prevista para aumentar la estabilidad en la sangre o in vivo del fármaco aniónico y para evitar la captación no deseada por el sistema reticuloendotelial, de forma que el fármaco aniónico pueda ser eficientemente administrado en un tejido en el que presenta su efecto. El método de preparación de la presente invención también es útil en la producción a gran escala de la composición para la administración de fármacos aniónicos.

La presente invención proporciona un método de preparación de una composición para administrar un fármaco aniónico. La composición para la administración de fármacos aniónicos puede ser una composición farmacéutica para la administración de fármacos aniónicos que comprende un fármaco aniónico, un lípido catiónico y un copolímero de bloque anfifílico, en donde el fármaco aniónico forma un complejo con el lípido catiónico, y el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico se atrapa en una estructura de micela formada por el copolímero de bloque anfifílico.

El método de preparación puede comprender las etapas de:

(1) añadir una disolución acuosa de un fármaco aniónico a una disolución de un lípido catiónico en un disolvente orgánico para preparar una emulsión; y

(2) añadir un disolvente acuoso o una disolución acuosa de un copolímero de bloque anfifílico a la emulsión preparada en la etapa (1) para preparar una micela polimérica,

a condición de que

cuando el disolvente acuoso se añade en la etapa (2), el método comprende además cualquiera de las etapas de añadir el copolímero de bloque anfifílico a la disolución del lípido catiónico en el disolvente orgánico usado en la etapa (1), y luego retirar el disolvente orgánico de la emulsión preparada en la etapa (1), o las etapas de retirar el disolvente orgánico de la emulsión preparada en la etapa (1), añadir a la misma una disolución del copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico, y luego retirar el disolvente orgánico de la misma, y

cuando la disolución acuosa del copolímero de bloque anfifílico se añade en la etapa (2), el método comprende, además, después de la etapa (1) o (2), la etapa de retirar el disolvente orgánico.

Más específicamente, el método de preparación puede comprender las etapas de:

(1-i') disolver una porción de un copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico, disponer la disolución en un recipiente y retirar el disolvente orgánico, para recubrir el interior del recipiente con el copolímero de bloque anfifílico, en donde la etapa (1-i') es una etapa opcional y se lleva a cabo antes o después de la siguiente etapa (1-i);

(1-i) añadir una disolución acuosa de un fármaco aniónico a una disolución de un lípido catiónico en un disolvente orgánico para preparar una emulsión;

(1-ii) retirar el disolvente orgánico de la emulsión preparada en la etapa (1-i), a condición de que, cuando se lleva a cabo la etapa (1-i'), la etapa (1-ii) se lleva a cabo en el recipiente obtenido en la etapa (1-i') cuyo interior se recubrió con el copolímero de bloque anfifílico;

(1-iii) disolver un copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico, añadir la disolución de copolímero de bloque anfifílico a lo resultante de la etapa (1-ii), y retirar el disolvente orgánico, a condición de que, cuando se lleva a cabo la etapa (1-i'), el copolímero de bloque anfifílico en la etapa (1-iii) significa la porción restante del copolímero de bloque anfifílico, que es la porción no usada del copolímero de bloque anfifílico en la etapa (1-i'); y

(1-iv) añadir un disolvente acuoso a lo resultante retirado del disolvente orgánico de la etapa (1-iii) para formar una micela polimérica.

La etapa (1-i'), en la que la disolución del copolímero de bloque anfifílico en el disolvente orgánico se dispone en el recipiente y el disolvente orgánico se retira, es una etapa para el recubrimiento del interior del recipiente con el copolímero de bloque anfifílico. La etapa (1-i') se diseña para prevenir que las micelas se adsorban sobre la superficie interior del recipiente. Esta etapa (1 -i') se puede llevar a cabo opcionalmente para aumentar el rendimiento de fármaco aniónico. La etapa (1-i') se puede llevar a cabo antes de la etapa (1-iii) de retirar el disolvente orgánico, por ejemplo, antes o después de la etapa (1-i), o antes o después de la etapa (1-ii). El disolvente que se usa en la etapa (1-i') puede ser, por ejemplo, al menos uno seleccionado del grupo que consiste en, pero no se limitan a, acetato de etilo, acetonitrilo, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano y similares.

La cantidad de copolímero de bloque anfifílico que se usa en la etapa (1-i') puede ser aproximadamente 1-99 % en peso, preferentemente aproximadamente 1-50 % en peso, y más preferentemente aproximadamente 5-50 % en peso, basado en la cantidad total del copolímero de bloque anfifílico usada en las etapas (1-i') y (1-iii). Si la cantidad de copolímero de bloque anfifílico usada en la etapa (1-i') es inferior a 1 % en peso, será difícil recoger el complejo del fármaco aniónico, el lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico en la etapa (1-iv), dando como resultado la disminución del rendimiento de fármaco aniónico. Por otra parte, si la cantidad de copolímero de bloque anfifílico usada en la etapa (1-i') es superior a 99 % en peso, aumentará excesivamente el tamaño de las nanopartículas resultantes, dando como resultado la disminución del rendimiento de fármaco aniónico después de filtración. Por estos motivos, la cantidad del copolímero de bloque anfifílico usada en la etapa (1-i') está preferentemente dentro del intervalo anteriormente especificado.

En la etapa (1-i'), el disolvente orgánico se puede añadir adicionalmente, de manera que el volumen total del disolvente orgánico usado en la etapa (1-i') pueda ser superior al volumen total de la etapa (1-i). Específicamente, el volumen total del disolvente orgánico que se usa en la etapa (1-i') puede ser superior al volumen total del resultante de la etapa (1-i), y preferentemente 1,2-1,5 veces superior al volumen total del resultante de la etapa (1-i). Si el volumen total del disolvente orgánico que se usa en la etapa (1-i') es una vez o inferior al volumen total del resultante de la etapa (1-i), disminuirá el rendimiento de la etapa (1-iv). En todas las etapas anteriormente descritas, la retirada del disolvente orgánico se puede realizar por evaporación, pero no se limita a esto.

La etapa (1 -i), en la que la disolución acuosa del fármaco aniónico se mezcla con la disolución del lípido catiónico en la disolución orgánica (disolución de disolvente orgánico del lípido catiónico) para preparar la emulsión, se puede llevar a cabo usando cualquier dispositivo de mezcla que se use, en general, en la preparación de emulsiones, por ejemplo, un sonicador, una mezcladora con vórtex o agitador, y esto se aplica asimismo a todos los procesos de preparación de emulsiones descritos más adelante.

La concentración del fármaco aniónico en la disolución acuosa del fármaco aniónico puede ser 1 ng/mL a 1 kg/mL, y específicamente 1 pg/mL a 1 g/mL, y la concentración del lípido catiónico en la disolución del lípido catiónico en el disolvente orgánico puede ser 1 pg/mL a 1 kg/mL, y específicamente 1 ng/mL a 1 g/mL. La relación de mezcla en volumen entre la disolución acuosa del fármaco y la disolución de disolvente orgánico del lípido catiónico puede ser, pero no se limita a, 1:1 -50, preferentemente 1:2-1:20, y más preferentemente 1:3-1:10 (el volumen de la disolución acuosa: el volumen de la disolución de disolvente orgánico). La relación de mezcla en volumen entre la disolución acuosa y la disolución de disolvente orgánico se puede determinar como una relación apropiada para formar una emulsión.

En la etapa (1-ii), la emulsión preparada en la etapa (1-i) se dispone en el recipiente cuyo interior se puede recubrir con el copolímero de bloque anfifílico en la etapa (1-i'), y el disolvente orgánico se retira del mismo, para formar una película fina que comprende el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico. En el presente documento, la superficie interior del recipiente está recubierta con el copolímero de bloque anfifílico, previniendo así la disminución del rendimiento que se puede provocar por la adsorción del complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico sobre el interior del recipiente.

Como se ha descrito anteriormente, la porción restante del copolímero de bloque anfifílico que se usa en la etapa (1-iii) significa la porción no usada del copolímero de bloque anfifílico en la etapa opcional (1-i'). La cantidad de la porción restante del copolímero de bloque anfifílico que se usa en la etapa (1-iii) puede ser 1 a 99 % en peso, preferentemente 50 a 99 % en peso, y más preferentemente 50 a 95 % en peso, basado en la cantidad total del copolímero de bloque anfifílico usada en las etapas (1-i') y (1-iii). Si se omite la etapa opcional (1-i'), se usa la cantidad total del copolímero de bloque anfifílico en la etapa (1-iii).

El disolvente orgánico que se usa en la etapa (1-iii) para disolver el copolímero de bloque anfifílico puede ser, por ejemplo, al menos uno seleccionado del grupo que consiste en, pero no se limita a, acetato de etilo, acetonitrilo, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano y similares, y puede ser el mismo que o diferentes del disolvente orgánico usado en la etapa (1-i'). Por tanto, la cantidad de disolvente orgánico usada en la etapa (1-iii) puede estar en un intervalo tal que haga que la concentración del copolímero de bloque anfifílico disuelta en la disolución de disolvente orgánico sea 1 ng/mL a 1 kg/mL, específicamente 1 pg/mL a 1 g/mL.

En la etapa (1-iii), la disolución del copolímero de bloque anfifílico en el disolvente orgánico se añade a lo resultante de la etapa (1-ii), es decir, la película fina que comprende el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico, después de que el disolvente orgánico se retire, por lo que la película fina de copolímero de bloque anfifílico se puede formar sobre la película fina que comprende el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico.

En la etapa (1-iv), el disolvente acuoso se usa para hidratar la mezcla retirada del disolvente orgánico resultante de la etapa (1-iii), preparando así las micelas. El disolvente acuoso puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en, pero no se limita a, agua (por ejemplo, agua destilada) y disolución de tampón. La cantidad de disolvente acuoso añadida puede estar en el intervalo de manera que haga que la concentración esperada del fármaco aniónico después de añadir el disolvente acuoso sea 1 ng/mL a 1 kg/mL, y específicamente 1 pg/mL a 1 g/mL.

En la etapa (1-iv), se hidrata lo resultante de la etapa (1-iii), del que se retiró el disolvente orgánico, es decir, la mezcla de la película fina que comprende el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico y la película fina del copolímero de bloque anfifílico, obteniéndose así micelas que comprenden el fármaco aniónico, el lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico y en que el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico se atrapa en una estructura de micela formada por el copolímero de bloque anfifílico.

En otra realización, el método de preparación puede comprender las etapas de:

(2-i') disolver una porción de un copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico, disponer la disolución en un recipiente y retirar el disolvente orgánico para recubrir el interior del recipiente con el copolímero de bloque anfifílico, en donde la etapa (2-i') es una etapa opcional y se lleva a cabo antes o después de la siguiente etapa (2-i);

(2-i) añadir una disolución acuosa de un fármaco aniónico a una disolución de un lípido catiónico en un disolvente orgánico para preparar una emulsión;

(2-ii) retirar el disolvente de la emulsión preparada en la etapa (2-i), a condición de que, cuando la etapa (2-i') se lleva a cabo, la etapa (2-ii) se lleva a cabo en el recipiente cuyo interior se recubrió con el copolímero de bloque anfifílico en la etapa (2-i'); y

(2-iii) disolver un copolímero de bloque anfifílico en un disolvente acuoso, mezclar la disolución con lo resultante de la etapa (2-ii) para formar una micela polimérica, a condición de que, cuando la etapa (2-i') se lleva a cabo, el copolímero de bloque anfifílico en la etapa (2-iii) significa la porción restante del copolímero de bloque anfifílico, que es la porción no usada del copolímero de bloque anfifílico en la etapa (2-i').

Los detalles de las etapas (2-i') a (2-ii) se pueden denominar las etapas (1-i') a (1-ii), y la etapa (2-i') se puede llevar a cabo opcionalmente para aumentar el rendimiento de fármaco aniónico, como la etapa (1-i'). La etapa (2-i') se puede llevar a cabo antes de la etapa (2-iii) de retirar el disolvente, por ejemplo, antes o después de la etapa (2-i), o antes o después de la etapa (2-ii).

En la etapa (2-iii), la disolución acuosa que se usa para disolver la porción restante del copolímero de bloque anfifílico puede ser al menos una seleccionada del grupo que consiste en agua (agua destilada) y disolución de tampón, y la cantidad de disolución acuosa añadida puede estar en un intervalo tal que haga que la concentración esperada del fármaco aniónico después de añadir la disolución acuosa del copolímero de bloque anfifílico sea 1 ng/mL a 1 kg/mL, y específicamente 1 pg/mL a 1 g/mL.

En la etapa (2-iii), se hidrata lo resultante de la etapa (2-ii), del que se retiró el disolvente orgánico, es decir, la película fina que comprende el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico, por la disolución acuosa de copolímero de bloque anfifílico, obteniéndose así nanopartículas que comprenden el fármaco aniónico, el lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico y en que el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico se atrapa en una estructura de micela formada del copolímero de bloque anfifílico.

(3-i') disolver una porción de un copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico, disponer la disolución en un recipiente y retirar el disolvente orgánico de la disolución para recubrir el interior del recipiente con el copolímero de bloque anfifílico, en donde la etapa (3-i') es una etapa opcional;

(3-i) añadir una disolución acuosa de un fármaco aniónico a una disolución de un lípido catiónico y un copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico para preparar una emulsión, a condición de que, cuando la etapa (3-i') se lleva a cabo, el copolímero de bloque anfifílico en la etapa (3-i) significa la porción restante del copolímero de bloque anfifílico, que es la porción no usada del copolímero de bloque anfifílico en la etapa (3-i');

(3-ii) retirar el disolvente de la emulsión preparada en la etapa (3-i), a condición de que, cuando la etapa (3-i') se lleva a cabo, la etapa (3-ii) se lleva a cabo en el recipiente cuyo interior se recubrió con el copolímero de bloque anfifílico en la etapa (3-i'); y

(3-iii) añadir un disolvente acuoso a lo resultante retirado del disolvente de la etapa (3-ii), para formar una micela polimérica.

Los detalles de las etapas (3-i'), (3-ii) y (3-iii) se pueden denominar las etapas (1-i'), (1-ii) y (1-iii), y la etapa (3-i') se puede llevar a cabo opcionalmente para aumentar el rendimiento del proceso, como la etapa (1-i'). La etapa (3-i') se puede llevar a cabo antes de la etapa (3-iii) de retirar el disolvente, por ejemplo, antes o después de la etapa (3-i), o antes o después de la etapa (3-ii).

La etapa (3-i) es la misma que la etapa (1-i), excepto que la disolución del lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico (o la porción restante del copolímero de bloque anfifílico, que es la porción no usada del copolímero de bloque anfifílico en la etapa (3-i')) en el disolvente orgánico se usa para preparar la emulsión. Por tanto, la concentración de la disolución acuosa del fármaco aniónico que se usa en la etapa (3-i) es como se ha descrito anteriormente para la etapa (1-i).

(4-i) añadir una disolución acuosa de un fármaco aniónico a una disolución de un lípido catiónico en un disolvente orgánico para preparar una emulsión;

(4-ii) añadir la emulsión de (4-i) a una disolución acuosa de un copolímero de bloque anfifílico para preparar una emulsión doble; y

(4-iii) retirar selectivamente el disolvente orgánico de la emulsión doble preparada en la etapa (4-ii), formando así una micela polimérica.

Los detalles de la etapa (4-i) se pueden denominar la etapa (1-i), y la relación de mezcla en volumen entre la disolución acuosa del fármaco aniónico y la disolución del lípido catiónico en el disolvente orgánico (disolución de disolvente orgánico) puede ser 1:1-1:50, preferentemente 1:2-1:20 y más preferentemente 1:3-1:10 (el volumen de la disolución acuosa: el volumen de la disolución de disolvente orgánico), pero no se limita a esto.

En la etapa (4-ii), se usa toda la cantidad del copolímero de bloque anfifílico, y la disolución acuosa del copolímero de bloque anfifílico significa una disolución acuosa en la que el copolímero de bloque anfifílico se disuelve en agua a una concentración de 1 ng/mL a 1 kg/mL, específicamente 1 pg/mL a 1 g/mL. En la etapa (4-ii), el tipo de disolvente acuoso es como se ha descrito anteriormente, y la cantidad de disolvente acuoso usada puede ser 1 a 1.000 veces en volumen, y específicamente 1 a 100 veces en volumen, basado en el volumen de la emulsión de la etapa (4-i). En otra realización, el método de preparación puede comprender las etapas de:

(5-i) añadir una disolución acuosa de un fármaco aniónico a una disolución de un lípido catiónico y un copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico para preparar una emulsión;

(5-ii) añadir la emulsión de la etapa (5-i) a un disolvente acuoso para preparar una emulsión doble; y

(5-iii) retirar selectivamente el disolvente orgánico de la emulsión doble de la etapa (5-ii), para formar una micela polimérica.

Los detalles de las etapas de (5-i), (5-ii) y (5-iii) se pueden denominar las etapas de (4-i), (4-ii) y (4-iii). En la etapa (5-i), la relación de mezcla en volumen entre la disolución acuosa del fármaco aniónico y la disolución del lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico en el disolvente orgánico (disolución de disolvente orgánico) puede ser 1:1-1:50, preferentemente 1:2-1:20 y más preferentemente 1:3-1:10 (el volumen de la disolución acuosa: el volumen de la disolución de disolvente orgánico), pero no se limita a esto.

En la etapa (5-ii), el tipo de disolvente acuoso es como se ha descrito anteriormente, y la cantidad de disolvente acuoso usada puede ser 1 a 1.000 veces en volumen, y específicamente 1 a 100 veces en volumen, basado en el volumen de la emulsión de la etapa (5-i).

Las etapas anteriormente descritas, retirada del disolvente orgánico, se pueden realizar por cualquier método convencional, que incluye evaporación, destilación fraccionada y similares. Particularmente, las etapas (4-iii) y (5-iii) de retirar selectivamente el disolvente orgánico se pueden realizar por cualquier método tal como destilación fraccionada y similares.

En una realización, el método anterior 4 o 5 puede comprender además, antes de la etapa de retirar el disolvente orgánico (por ejemplo, antes o después de la etapa (4-i), antes o después de la etapa (4-ii), antes o después de la etapa (5-i), o antes o después de la etapa (5-ii)), una etapa de disolver una porción del copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico, disponer la disolución en un recipiente y entonces retirar el disolvente orgánico de la disolución, recubriéndose así el interior del recipiente con el copolímero de bloque anfifílico. En este caso, la cantidad del copolímero de bloque anfifílico usada en las etapas (4-ii) o (5-i) es la cantidad restante del copolímero de bloque anfifílico, que es la porción no usada del copolímero de bloque anfifílico en la etapa de recubrimiento, y la etapa (4-iii) o (5-iii) se lleva a cabo en el recipiente recubierto.

En los métodos anteriores 1 a 5, el copolímero de bloque anfifílico funciona atrapando el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico en disolución acuosa en la estructura de micela. La cantidad de copolímero de bloque anfifílico requerida en todas las etapas para preparar la composición para la administración de fármacos aniónicos según la presente invención puede ser una cantidad tal que la relación de peso del fármaco aniónico/lípido catiónico (a) con respecto al peso del fármaco aniónico/lípido catiónico/copolímero de bloque anfifílico (b), [a/b X 100; (peso de fármaco aniónico peso de lípido catiónico)/(peso de fármaco aniónico peso de lípido catiónico peso de copolímero de bloque anfifílico) X 100], es 0,001 % a 100 %, preferentemente 0,01 a 50 %, y más preferentemente 0,1 a 10 %. Si la relación ponderal es inferior a 0,001 % en peso, el contenido del complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico disminuirá, dificultando así lograr el contenido eficaz de fármaco aniónico. Por otra parte, si la relación ponderal es superior a 100 % en peso, no se puede formar una estructura de micela del tamaño adecuado después de tener en cuenta el peso molecular del copolímero de bloque anfifílico y la cantidad del complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico.

En los métodos anteriores 1 a 3, cuando se lleva a cabo la etapa (1 -i'), (2-i') o (3-i') de recubrimiento del interior del recipiente con una porción del copolímero de bloque anfifílico, la cantidad de la porción de copolímero de bloque anfifílico usada para recubrir el interior del recipiente es la cantidad tomada como la relación descrita en la etapa (1-i') con respecto a toda la cantidad calculada de la relación de peso del fármaco aniónico/lípido catiónico (a) con respecto al peso del copolímero de bloque anfifílico (b), (a/b), y la cantidad de la porción restante de copolímero de bloque anfifílico usada en la etapa (1-iii), (2-iii) o (3-ii) es la cantidad que queda después de restar la cantidad de la porción descrita en la etapa (1-i') de la cantidad total calculada de la relación a/b. Por tanto, cuando no se lleva a cabo la etapa (1-i'), (2-i') o (3-i'), la cantidad de copolímero de bloque anfifílico usada en la etapa (1-iii), (2-iii) o (3-ii) es toda la cantidad calculada de la relación a/b.

Las ventajas de los métodos anteriores son que, debido a que las composiciones así preparadas están en forma de nanopartículas que tienen un tamaño de partículas promedio uniforme de 10-400 nm, específicamente 50-300 nm, el rendimiento se puede mantener incluso después de realizar etapas posteriores convencionales tales como filtración estéril, de manera que se pueda logra un alto rendimiento.

Las mejoras en el método de preparación que se proporciona según la presente invención se describirán ahora en comparación con la tecnología desvelada en una solicitud de patente previamente presentada por el solicitante. El documento de patente WO 2010/074540 (que pertenece a la misma familia de patentes que US 2011/268772), fue presentado por el solicitante y desvela un método de preparación de una composición para administrar un fármaco aniónico, comprendiendo el método las etapas de:

(a) disolver un fármaco aniónico y un lípido catiónico en un disolvente miscible con agua o un disolvente mixto de una disolución acuosa y un disolvente orgánico;

(b) separar la capa de disolvente orgánico formada en la etapa (a);

(c) añadir un copolímero de bloque anfifílico a la capa de disolvente orgánico de la etapa (b) y retirar el disolvente orgánico de la misma; y

(d) añadir una disolución acuosa a la mezcla de la etapa (c) de la que se retiró el disolvente orgánico, formando así una micela.

Otro método de preparación desvelado en la solicitud de patente previa comprende las etapas de:

(a') disolver un fármaco aniónico, un lípido catiónico y un copolímero de bloque anfifílico en un disolvente miscible con agua o un disolvente mixto de una disolución acuosa y un disolvente orgánico;

(b') retirar el disolvente de la etapa (a'); y

(c') añadir una disolución acuosa a la mezcla de la etapa (b') de la que se retiró el disolvente orgánico, formando así una micela.

Por tanto, la solicitud de patente previa desvela que la preparación puede comprender además una etapa de esterilizar las nanopartículas así preparadas; la etapa de esterilización es necesaria para usar las nanopartículas como productos farmacéuticos.

Sin embargo, el método de preparación desvelado en la solicitud de patente previa tiene el inconveniente de que el rendimiento del fármaco aniónico atrapado en las nanopartículas después de la preparación es bajo. Para encontrar la causa del bajo rendimiento, se comparó el rendimiento de fármaco aniónico en las nanopartículas preparadas mediante las etapas (a') a (c') del método desvelado en la solicitud de patente previa entre antes y después del paso a través de un filtro estéril. Como resultado, se encontró que hubo una diferencia significativa en el rendimiento entre antes y después de la filtración. Esto puede sugerir que el tamaño de las nanopartículas producidas no es uniforme, y así se separan por filtración grandes partículas durante la filtración. Además, se prepararon nanopartículas según las etapas (a) a (d) del método desvelado en la solicitud de patente previa, y el rendimiento de las nanopartículas se comparó entre antes y después del paso a través del filtro estéril. Asimismo, en el caso de las nanopartículas preparadas usando este método, se encontró que hubo una diferencia significativa en el rendimiento entre antes y después de la filtración.

En el proceso de mezclar el fármaco aniónico hidrófilo con el lípido catiónico hidrófobo para formar un complejo del fármaco aniónico y el lípido catiónico, se usa un disolvente miscible con agua o un disolvente mixto de una disolución acuosa y un disolvente orgánico. En el presente documento, para prevenir la separación de fases entre la disolución acuosa y el disolvente orgánico, se usa normalmente un alcohol de bajo peso molecular, tal como metanol o etanol.

Así, los presentes inventores han intentado diversos métodos para hacer uniforme el tamaño de nanopartículas durante su preparación. Como resultado, se encontró que, en comparación con el método previo que utiliza un disolvente orgánico miscible en agua o un disolvente mixto de una disolución acuosa y un disolvente orgánico, un método de preparación de una emulsión usando un sonicador, una mezcladora con vórtex, un agitador o similares, ya sea en un proceso de mezclar una disolución acuosa de un fármaco aniónico con una disolución de un lípido catiónico en un disolvente orgánico o en un proceso de mezclar una disolución acuosa de un fármaco aniónico con una disolución de un lípido catiónico y un copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico, permite que el tamaño de partículas sea más uniforme, de forma que se pueda reducir la diferencia en el rendimiento entre antes y después de la filtración, completando así la presente invención.

Por tanto, en el método previo, el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico o el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico/copolímero de bloque anfifílico se adsorbió sobre la superficie de un matraz redondo (recipiente) en el proceso de retirar el disolvente orgánico, y el material adsorbido no se disolvió suficientemente en la fase de disolución acuosa durante el proceso de hidratación, dando como resultado una disminución en el rendimiento antes del paso a través de un filtro. En un intento por resolver este problema, los presentes inventores recubrieron una porción de un copolímero de bloque anfifílico sobre la pared interna de un recipiente en el que un fármaco aniónico y un lípido catiónico se pondrían en contacto entre sí, antes de retirar un disolvente de una mezcla del fármaco aniónico y el lípido catiónico, para reducir el grado de adsorción del complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico sobre el recipiente, y como resultado, los presentes inventores encontraron el efecto de reducir la pérdida de rendimiento antes de la filtración (correspondiente a las etapas (1 -i'), (2-i') y (3-i')).

En una realización, el método de preparación de nanopartículas basado en el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico puede comprender las etapas de: añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico en un disolvente orgánico mientras se prepara una emulsión usando un medio convencional tal como un sonicador, una mezcladora con vórtex, un agitador o similares; retirar el disolvente de la emulsión que contiene el fármaco aniónico y el lípido catiónico, formando así una película fina que comprende el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico; añadir una disolución del copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico a la película fina y retirar el disolvente orgánico de la misma, formando así una película fina del copolímero de bloque anfifílico encima; y entonces añadir un disolvente acuoso a la película fina para hidratar la película fina (etapas (1 -i) a (1 -iv)).

En otra realización, el método de preparación de nanopartículas basado en el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico puede comprender las etapas de: añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico en un disolvente orgánico mientras se prepara una emulsión usando un medio convencional como un sonicador, una mezcladora con vórtex, un agitador o similares; retirar el disolvente de la emulsión que contiene el fármaco aniónico y el lípido catiónico, formando así una película fina que comprende el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico; y añadir una disolución acuosa que contiene el copolímero de bloque anfifílico a la película fina para hidratar la película fina (etapas (2-i) a (2-iii)).

En otra realización adicional, el método de preparación de nanopartículas basado en el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico puede comprender las etapas de: añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico mientras se prepara una emulsión usando un medio convencional como un sonicador, una mezcladora con vórtex, un agitador o similares; retirar el disolvente de la emulsión que contiene el fármaco aniónico, el lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico, formando así una película fina que comprende el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico/copolímero de bloque anfifílico; y añadir un disolvente acuoso a la película fina para hidratar la película fina (etapa (3-i) a (3-iii)).

Por tanto, cuando el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico se mezclan entre sí para preparar nanopartículas, la preparación puede comprender, antes de la etapa de retirar el disolvente de la mezcla del fármaco aniónico y el lípido catiónico para producir la película fina, una etapa de recubrir la pared interna del recipiente con una porción del copolímero de bloque anfifílico, reduciéndose así el grado de adsorción del complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico sobre el recipiente (correspondiente a las etapas (1-i'), (2-i') y (3-i')). En otra realización, el método de preparación de nanopartículas basado en el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico puede comprender las etapas de: añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico en un disolvente orgánico mientras se prepara una emulsión usando un medio convencional como un sonicador, una mezcladora con vórtex, un agitador o similares; añadir la emulsión a una disolución acuosa que contiene el copolímero de bloque anfifílico, mientras se prepara una emulsión doble usando un medio de mezcla convencional tal como un sonicador, una mezcladora con vórtex, un agitador o similares; y retirar el disolvente orgánico de la emulsión doble usando un método convencional tal como destilación fraccionada (etapas (4-i) a (4-iii)).

En otra realización, el método de preparación de nanopartículas basado en el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico puede comprender las etapas de: añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico mientras se prepara una emulsión usando un medio convencional como un sonicador, una mezcladora con vórtex, un agitador o similares; añadir la emulsión a un disolvente acuoso mientras se prepara una emulsión doble usando un medio convencional como un sonicador, una mezcladora con vórtex, un agitador o similares; y retirar el disolvente orgánico de la emulsión doble usando un método convencional tal como destilación fraccionada (etapas (5-i) a (5-iii)).

Los métodos usando las etapas (4-i) a (4-iii) o las etapas (5-i) a (5-iii) tienen la ventaja adicional de que se puede omitir la etapa de hidratar la película fina, así mejoran el rendimiento del fármaco aniónico y la reproducibilidad de la eficiencia de preparación, debido a que la porción del complejo adsorbida sobre la pared interior del recipiente incluso después de la hidratación es la principal causa de la pérdida de rendimiento y se puede cambiar de lote a lote.

Los métodos usando las etapas (4-i) a (4-iii) o las etapas (5-1) a (5-iii) tienen otra ventaja adicional que procede de la omisión del estado de película fina. Para disolver la película fina que comprende el fármaco aniónico y el lípido catiónico, es necesaria una cierta cantidad de copolímero de bloque anfifílico. Sin embargo, puesto que los métodos que usan las etapas (4-i) a (4-iii) o las etapas (5-1) a (5-iii) no tienen etapa de disolver la película fina, la micela se puede formar con menor cantidad de copolímero de bloque anfifílico en comparación con los métodos que implican la etapa de disolver la película fina.

Los presentes inventores han probado si los métodos que no implican etapa de disolver la película fina pueden formar la estructura de micela que comprende fármaco aniónico, lípido catiónico y copolímero de bloque anfifílico con menor cantidad de copolímero de bloque anfifílico. Como resultado, se encontró que, en comparación con el método que implica la etapa de disolver la película fina, el método que no implica la etapa de disolver la película fina puede formar la estructura de micela con aproximadamente 1.000 veces menos cantidad de copolímero de bloque anfifílico.

La composición para administración de fármacos aniónicos preparada por el método de preparación de la presente invención comprende: un fármaco aniónico como principio activo; un lípido catiónico; y una estructura de micela que comprende un copolímero de bloque anfifílico, en donde el fármaco aniónico forma un complejo con el lípido catiónico, y el complejo formado se atrapa en la estructura de micela formada por el copolímero de bloque anfifílico. Por tanto, la composición para administración de fármacos aniónicos se caracteriza porque está en forma de nanopartículas que tienen un tamaño de partículas promedio uniforme de 10-400 nm, particularmente 50-300 nm, de manera que el rendimiento de la composición se pueda mantener incluso después de realizarse etapas posteriores tales como filtración estéril.

En una realización, el fármaco aniónico se une al lípido catiónico por interacción electrostática para formar un complejo que entonces se atrapa en la estructura de micela del copolímero de bloque anfifílico. La FIG. 1 muestra la estructura esquemática de un sistema de administración de micelas poliméricas según una realización de la presente invención, en el que se atrapa un complejo de un fármaco aniónico y un lípido catiónico. Con referencia a la FIG. 1, el fármaco aniónico se une al lípido catiónico por interacción electrostática para formar un complejo del fármaco aniónico y el lípido catiónico. El fin de formar el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico es hacer que el fármaco aniónico hidrófilo sea hidrófobo y atraparlo en la estructura de micela formada por el copolímero de bloque anfifílico.

Como se muestra en la FIG. 1, en la estructura de micela formada por el copolímero de bloque anfifílico, el resto hidrófilo del copolímero de bloque anfifílico forma la envoltura externa de la estructura de micela en un entorno acuoso, el resto hidrófobo del copolímero de bloque anfifílico forma el núcleo interno y el complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico se atrapa en el núcleo hidrófobo de la estructura de micela.

El complejo de fármaco aniónico/lípido catiónico se atrapa en la estructura de micela polimérica de la presente invención, que aumenta la estabilidad en la sangre o in vivo del complejo. En una realización, el tamaño de partículas de las micelas es 10-400 nm, y preferentemente 50-300 nm. El intervalo de tamaños de partícula es un intervalo óptimo seleccionado en vista de la estabilidad de la estructura de micela, el contenido de los componentes de la estructura de micela, la absorción del fármaco aniónico in vivo y la conveniencia de la esterilización para proporcionar una composición farmacéutica.

El fármaco aniónico según una realización de la presente invención pretende incluir todas las sustancias farmacológicamente activas que tienen cargas negativas en condición fisiológica. En una realización, la naturaleza aniónica se puede conferir de uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en grupos carboxilo, fosfato y sulfato, y grupos funcionales que llevan cargas negativas a un pH de 5 o más. En una realización, el fármaco aniónico puede ser un péptido, una proteína o un ácido nucleico.

En otra realización, el ácido nucleico puede consistir principalmente en ácido desoxirribonucleico, ácido ribonucleico o un derivado de polinucleótido, en donde el esqueleto, el azúcar o la base se modifican químicamente o se modifican el extremo del ácido nucleico. Más preferentemente, puede ser uno o más ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en ARN, ADN, ARNip (ARN interferente pequeño), un aptámero, oligodesoxinucleótido (ODN) antisentido, ARN antisentido, ribozima y DNAzima. Por tanto, para aumentar la estabilidad del ácido nucleico en sangre o debilitar la respuesta inmunitaria, el esqueleto, el azúcar o la base del ácido nucleico se puede modificar químicamente o se puede modificar el extremo del ácido nucleico. Específicamente, una porción del enlace fosfodiéster del ácido nucleico se puede sustituir por un enlace fosforotioato o boranofosfato, o el ácido nucleico puede incluir al menos un nucleótido en donde diversos grupos funcionales tales como un grupo metilo, un grupo metoxietilo o flúor se introducen en la posición 2'-OH de algunas ribosas.

En una realización, el lípido catiónico está previsto de forma que se una al fármaco aniónico por interacción electrostática para formar un complejo que entonces se atrapa en la estructura de micela del copolímero de bloque anfifílico para formar una nanopartícula. Así, el lípido catiónico puede ser cualquier tipo de lípido capaz de formar un complejo con el fármaco aniónico por interacción electrostática. Específicamente, puede ser un tipo de lípido que tiene al menos un grupo funcional, tal como un grupo amina y los grupos funcionales que llevan cargas positivas a un pH de 10 o menos.

Por ejemplo, el lípido catiónico puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cloruro de N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP); N,N-dimetil-(2,3-dioleoiloxi)propilamina (DODMA); N,N,N-trimetil-(2,3-dioleoiloxi)propilamina (DOTMA), 3p-[N-(N',N',N'-trimetilaminoetano)carbomoil]colesterol (TC-colesterol), 3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-colesterol), 3p-[N-(N'-monometilaminoetano)carbamoil]colesterol (MC-colesterol), 3p-[N-(aminoetano)carbamoil]colesterol (AC-colesterol), colesteroloxipropan-1-amina (COPA), tocoferol N-(N'-aminoetano)carbamoilpropanoico (AC-tocoferol) y tocoferol N-(N'-metilaminoetano)carbamoilpropanoico (MC-tocoferol), que tienen un grupo funcional por molécula que puede llevar cargas positivas en una disolución acuosa.

Alternativamente, el lípido catiónico puede ser un tipo de lípido que tiene una pluralidad de grupos funcionales por molécula que puede llevar iones positivos en una disolución acuosa. Específicamente, puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), 1,2-diacil-3-trimetilamonio-propano (TAP), y 1,2-diacil-3-dimetilamonio-propano (DAP).

Por tanto, el lípido catiónico puede incluir un lípido catiónico en el que un hidrocarburo saturado o insaturado que tiene 11 a 26 átomos de carbono se une al grupo funcional amina de 1-12 oligoetilenaminas, en donde la oligoetilenamina se puede representar por la siguiente fórmula 1:

[Fórmula 1]

en donde n y m son cada uno 0 a 12, con la condición de que 2 < n m < 12, a y b son cada uno 1 a 6, y R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente de grupos de hidrocarburo saturado e insaturado que tienen 11 a 25 átomos de carbono.

En la definición de la oligoetilenamina de la fórmula 1, n y m puede ser independientemente 1 a 9, con la condición de que 2 < n+m <10, y a y b puedan ser un número entero que varía desde 2 hasta 4. Por ejemplo, la oligoetilenamina se puede seleccionar del grupo que consiste en dietilentriamina, trietilentetramina, tetraetilenpentamina, pentaetilenhexamina, hexaetilenheptamina, heptaetilenoctamina, octaetilennonamina, nonaetilendecamina, decaetilenundecamina, undecaetilendodecamina, dodecaetilentridecamina y tridecaetilentetradecamina.

El hidrocarburo saturado o insaturado que se une al grupo funcional amina deriva de ácidos grasos que tienen 12 a 26 átomos de carbono y puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en lauroílo, miristoílo, palmitoílo, estearoílo, araquidoílo, behenoílo, lignoceroílo, cerotoílo, miristoleoílo, palmitoleoílo, sapienoílo, oleoílo, linoleoílo, araquidonoílo, eicosapentaenoílo, erucoílo y docosahexaenoílo.

En una realización, el copolímero de bloque anfifílico puede ser un copolímero de bloque de tipo A-B que comprende un bloque A hidrófilo y un bloque B hidrófobo. En una disolución acuosa, el copolímero de bloque de tipo A-B anfifílico forma una micela polimérica de tipo núcleo-corteza, en donde el bloque B hidrófobo forma un núcleo (pared interna) y el bloque A hidrófilo forma una corteza (pared externa).

En una realización, el bloque A hidrófilo puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polialquilenglicol, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poliacrilamida y derivados de los mismos. Más preferentemente, el bloque A hidrófilo puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en monometoxipolietilenglicol, monoacetoxipolietilenglicol, polietilenglicol, un copolímero de polietileno y propilenglicol, y polivinilpirrolidona. En otra realización, el peso molecular medio numérico del bloque A hidrófilo puede tener 200 a 50.000 dáltones, preferentemente 1.000 a 20.000 dáltones, y más preferentemente 1.000 a 5.000 dáltones.

El bloque B hidrófobo puede ser un polímero biocompatible y biodegradable. En una realización, puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en poliéster, polianhídrido, poliaminoácido, poliortoéster y polifosfazina. Más preferentemente, el bloque B hidrófobo puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polilactida, poliglicolida, policaprolactona, polidioxan-2-ona, un copolímero de polilactida y glicolida, un copolímero de polilactida y polidioxan-2-ona, un copolímero de polilactida y policaprolactona, y un copolímero de poliglicolida y policaprolactona. En otra realización, el peso molecular medio numérico del bloque B hidrófobo puede tener 50 a 50.000 dáltones, preferentemente 200 a 20.000 dáltones, y más preferentemente 1.000 a 5.000 dáltones. Por tanto, para aumentar la hidrofobia del bloque hidrófobo para mejorar la estabilidad de la micela, se puede unir químicamente tocoferol, colesterol, o un ácido graso saturado o insaturado que tiene 10-36 átomos de carbono, al extremo del bloque B hidrófobo.

En otra realización, con respecto a la relación entre el contenido del bloque hidrófilo (A) y el bloque hidrófobo (B), el copolímero de bloque anfifílico puede comprender 40-70 % en peso del bloque hidrófilo (A), y preferentemente 50 60 % en peso del bloque hidrófilo (A), basado en el peso del copolímero. Por este motivo, el contenido del bloque hidrófilo (A) en el copolímero es preferentemente 40 % en peso o más con el fin de que el copolímero tenga solubilidad en agua suficiente para formar micelas. Si el contenido del bloque hidrófilo (A) en el copolímero es inferior al 40 % en peso, la solubilidad del copolímero en agua será baja, dificultando la formación de una micela del copolímero; por otra parte, si el contenido es superior al 70 % en peso, la hidrofilia del copolímero será demasiado alta y así la estabilidad de la micela polimérica será baja, y así será difícil de solubilizar un complejo del fármaco aniónico y el lípido catiónico. Por este motivo, el contenido del bloque hidrófilo (A) en el copolímero es preferentemente 70 % en peso o menos en vista de la estabilidad de la micela.

[Efectos ventajosos]

El método inventivo de preparación de una composición farmacéutica que contiene un fármaco aniónico tiene ventajas en que puede aumentar el contenido del fármaco en la composición en comparación con el método de preparación previo y también puede aumentar la reproducibilidad de la preparación de la composición.

[Descripción de los dibujos]

La FIG. 1 es una vista esquemática de una composición para la administración de fármacos aniónicos según una realización de la presente invención.

La FIG. 2 muestra los resultados de la medición de RMN de 1,6-dioleoiltrietilentetramida preparada por un método de preparación según una realización de la presente invención.

La FIG. 3 muestra los resultados de la medición de RMN de 1,4-dimiristoleoildietilentriamida preparada por un método de preparación según una realización de la presente invención.

La FIG. 4 muestra los resultados de la medición de RMN de 1,8-dilinoleoiltetraetilenpentamida preparada por un método de preparación según una realización de la presente invención.

La FIG. 5 muestra los resultados de la medición de RMN de un mPEG-PLA (5k-4k)-oleato preparado por un método de preparación según una realización de la presente invención.

La FIG. 6 muestra los resultados de la medición de RMN de un mPEG-PLA (5k-4k)-linoleato preparado por un método de preparación según una realización de la presente invención.

[Modo para la invención]

En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos.

Ejemplo de preparación 1: Síntesis de AC-colesterol (30B-fN-(am¡noetano)carbamo¡l1colesterol)

Para la síntesis de AC-colesterol, se dejaron reaccionar entre sí cloroformiato de colesterilo (Sigma-Aldrich) y etilendiamina (Sigma-Aldrich) del siguiente modo.

Se disolvió 1 g (2,23 mmoles) de cloroformiato de colesterilo en 20 mL de cloroformo, y en un reactor separado, se diluyó un equivalente de 20 veces de etilendiamina con 30 mL de cloroformo y se mantuvo a 4 °C. Se añadió lentamente la disolución de cloroformiato de colesterilo al reactor que contenía la etilendiamina, y la mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de finalizar la reacción, el disolvente se retiró usando un evaporador rotatorio (Buchi Labortechnik AG, R-2055), y el material restante se disolvió en una pequeña cantidad de cloroformo, y luego se extrajo con una disolución saturada de NaCl y NaCÜ3 para recuperar la capa de cloroformo.

Entonces, se retiró el disolvente usando un evaporador rotatorio, y el material restante se disolvió otra vez en cloroformo y se separó por cromatografía en gel de sílice. A la fracción eluida en el cloroformo: metanol = 9:1 (v/v), se añadió una disolución de ácido clorhídrico en una cantidad de 50 equivalentes con respecto al cloroformiato de colesterilo, y se añadió metanol a la misma en pequeñas cantidades hasta que se formó una única fase, formando así el clorhidrato de AC-colesterol.

El disolvente se retiró completamente por calentamiento y destilación a presión reducida con un evaporador rotatorio. Se disolvió el clorhidrato de AC-colesterol en metanol a 60 °C, y luego se enfrió hasta 4 °C, mediante lo cual recristalizó. El rendimiento fue aproximadamente 53 %. Se analizaron la síntesis y la pureza del AC-colesterol por RMN 1H. La pureza fue del 99 % o más.

Ejemplos de preparación 2 a 4: Preparación de 1.6-d¡oleo¡ltr¡et¡lentetram¡da. 1.5-dimiristoleoildietilentriamida y 1.8-dilinoleoiltetraetilenpentaamida

Se sintetizó 1,6-dioleoiltrietilentetramida del siguiente modo por una reacción de adición nucleófila entre trietilentetramina y cloruro de oleoílo.

Se añadió 1,12 g (7,5 mmoles) de trietilentetramina a 25 mL de diclorometano y se disolvió con agitación en un baño de agua con hielo a 5 °C durante 30 minutos. A la disolución, se añadió lentamente gota a gota una disolución de 2,00 g (6,0 mmoles) de cloruro de oleoílo en 20 mL de diclorometano en un reactor separado mientras se dejó reaccionar a 5 °C durante 3 horas. Debido al cloruro de hidrógeno producido durante la reacción, precipitó e1HCl de trietilentetramina no reaccionado. Antes del final de la reacción, se recogió la disolución de la capa superior y se analizó por cromatografía en capa fina (CCF) con una fase móvil de etanol: cloroformo (2:1) para determinar si la reacción había terminado.

Después de determinarse que la reacción había terminado, se retiró el precipitado usando papel de filtro. Entonces, se evaporó la disolución de la capa superior filtrada en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente y se secó con una bomba de vacío equipada con una trampa fría. El material resultante se disolvió en 35 mL de dietil éter y luego se extrajo dos veces con 10 mL de NaOH 0,5 M en un embudo de decantación. Entonces, se calentó la fase orgánica de disolvente superior y se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar completamente el disolvente, después de eso el material restante se analizó por cromatografía en capa fina para determinar si se purificó. Se midieron la estructura del producto resultante y el grado de introducción de un grupo oleoílo en el producto por un espectrómetro de RMN 1H. El resultado obtenido se muestra en la FIG. 2. El rendimiento del producto fue 89,1 %, y se introdujeron 2,1 equivalentes del grupo oleoílo en trietilentetramina [Ejemplo de preparación 2].

[Fórmula I]

en donde n es 2, y R¹y R²son cada uno hidrocarburos derivados de ácido graso insaturado (C⁹) que tiene 18 átomos de carbono.

Según métodos similares al método anterior, se sintetizaron 1,5-dimiristoleoildietilentriamida [Ejemplo de preparación 3] y 1,8-dilinoleoiltetraetilenpentamida [Ejemplo de preparación 4]. Los resultados de RMN 1H de los compuestos obtenidos se muestran en las FIG. 3 y 4, respectivamente. Sus rendimientos fueron 40,5 % y 28,0 %, respectivamente, y las relaciones de los lípidos en los productos fueron 2,24 equivalentes y 1,82 equivalentes, respectivamente.

Ejemplo de preparación 5: Síntesis de copolímero de bloque (A-B) de monometox¡pol¡(et¡lenql¡col)-lact¡da (mPEG-PLA) (pesos moleculares medios numéricos: 5.000-4.000 Da)

Se dispuso 10 g de monometoxipoli(etilenglicol) (peso molecular: 5.000 Da) en un matraz redondo de 2 bocas de 100 mL y se secó en un vacío (1 mmHg) a 120 °C durante 5 horas. Se cargó el matraz de reacción con nitrógeno seco, y se inyectó una disolución al 50 % de un octoato estannoso (Sn(Oct)²) en tolueno en el matraz junto con 0,3 % en peso (30 mg) de DL-lactida con una jeringa. Se agitó la mezcla de reacción durante 30 minutos y se despresurizó hasta 1 mmHg a 120 °C durante 1 hora para retirar el tolueno. Se añadió 8,46 g de lactida purificada a la misma, y la mezcla se calentó a 130 °C durante 6 horas. El mPEG-PLA obtenido mediante el proceso anterior tuvo pesos moleculares medios numéricos de 5.000-4.000 Da y se determinó que era un tipo A-B por RMN 1H.

Ejemplo de preparación 6: Síntesis de mPEG-PLA-tocoferol (pesos moleculares: 5.000-4.000-530 Da) Se dispuso 5 g de mPEG-PLA sintetizado en el Ejemplo de preparación 5 en un matraz redondo de 2 bocas de 100 mL y se secó en un vacío a 120 °C durante 3 horas. Se añadió una disolución de 35,5 mg (645 pmoles) de succinilcloruro ácido de tocoferol en 3 mL de tolueno a la misma y se dejó que reaccionara a 100 °C durante 8 horas en un vacío. Se disolvió el polímero resultante en diclorometano y precipitó en heptano, tras lo cual se purificó. El polímero purificado se secó en un vacío dando partículas de polvo blanco. El rendimiento del producto fue 94,2 %, y como se puede apreciar de los resultados del análisis de RMN 1H, la pureza fue 97,0 % o más, y la tasa de introducción de tocoferol fue del 99,9 %.

Ejemplos de preparación 7 a 11: Síntesis de mPEG-PLA-oleato y mPEG-PLA-linoleato

Según el mismo método que el Ejemplo de preparación 6, se sintetizaron mPEG-PLA-oleato y mPEG-PLA-linoleato para obtener los resultados mostrados en la Tabla 1 a continuación. Los resultados de RMN 1H de los compuestos obtenidos se muestran en las FIG. 5 y 6, respectivamente.

[Tabla 1]

Ejemplo comparativo 1: Preparación de una composición que contiene ARNip/AC-colesterol/mPEG-PLA-tocoferol/DOPE (método de preparación usando disolvente miscible con agua)

Se disolvió 345,0 ug de AC-colesterol (relación N/P: 9) preparado en el Ejemplo de preparación 1 en 17,3 uL de cloroformo, y se disolvió 25 ug de ARNip en 20 uL de agua destilada. Se disolvió 340,9 ug de DOPE en 17,0 uL de cloroformo y se disolvió 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol en 0,5 mL de cloroformo. Se mezclaron entre sí la disolución de AC-colesterol, la disolución de ARNip, la disolución de DOPE y la disolución de mPEG-PLA-tocoferol, de manera que la relación entre disolución acuosa: cloroformo: etanol se ajustó a 1:1:2.

El ARNip usado fue un ARNip anti-luciferasa, que tiene estructura cadena doble 21-mera (nucleótido protuberante de 2 bases) (Mol. Ther. 16: 1995-2001 (2008)).

La mezcla se dispuso en un matraz redondo de una boca y se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se añadió 600 uL de agua destilada al matraz que luego se agitó suavemente para disolver el residuo, preparando así una composición (micela polimérica) que contenía ARNip/AC-colesterol/mPEG-PLA-tocoferol(5k-4k)/DOPE (véase la Tabla 2).

[Tabla 2]

Ejemplo 1: Preparación de composición que contiene ARNip/AC-colesterol/mPEG-PLA-tocoferol/DOPE (retirada de disolvente después de la preparación de la emulsión)

Se disolvió 345,0 ug de AC-colesterol (relación N/P: 9) preparado en el Ejemplo de preparación 1 en 17,3 uL de cloroformo, y se disolvió 25 ug de ARNip en 20 uL de agua destilada. Se disolvió 340,9 ug de DOPE en 17,0 uL de cloroformo y se disolvió 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol en 0,5 mL de cloroformo. La disolución acuosa de ARNip se añadió gota a gota a la disolución de cloroformo que contenía AC-colesterol, DOPE y mPEG-PLA-tocoferol mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. Se dispuso la emulsión preparada en un matraz redondo de una boca y se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se añadió 600 uL de agua destilada al matraz que luego se agitó suavemente desechar el residuo, preparando así una composición (micela polimérica) que contenía ARNip/AC-colesterol/mPEG-PLA-tocoferol(5k-4k)/DOPE.

Ejemplos 2 y 3: Preparación de composición que contiene ARNip/AC-colesterol/mPEG-PLA-tocoferol/DOPE (retirada de disolvente después de la preparación de la emulsión)

Se disolvió 345,0 ug de AC-colesterol (relación N/P: 9) preparado en el Ejemplo de preparación 1 en 17,3 uL de cloroformo, y se disolvió 25 ug de ARNip en 20 uL de agua destilada. Se disolvió 340,9 ug de DOPE en 17,0 uL de cloroformo y se disolvió 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol en 0,5 mL de cloroformo. De la disolución de 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol en cloroformo, se dispuso 50 uL de la disolución, que es una porción correspondiente a 1,5 mg de mPEG-PLA-tocoferol (10 % en peso), en un matraz redondo de una boca, se añadió 600 uL de cloroformo y se mezcló con la misma, y luego se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se mezcló la porción restante de la disolución de mPEG-PLA-tocoferol (correspondiente a 13,5 mg de mPEG-PLA-tocoferol) con la disolución de AC-colesterol y la disolución de DOPE, y se añadió gota a gota la disolución acuosa de ARNip a la misma, mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. Se dispuso la emulsión en el matraz redondo de una boca a la que se aplicó previamente 0,3 mg de mPEG-PLA-tocoferol como se ha descrito anteriormente, y se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se añadió 600 uL de agua destilada al matraz que luego se agitó suavemente para disolver el residuo, preparando así una composición (micela polimérica) que contenía ARNip/AC-colesterol/mPEG-PLA-tocoferol(5k-4k)/DOPE (Ejemplo 2).

El Ejemplo 3 se realizó del mismo modo que el Ejemplo 2, excepto que, de la disolución de 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol, una porción correspondiente a 0,3 mg de mPEG-PLA-tocoferol (2 % en peso) se aplicó previamente al matraz, y que la porción restante de la disolución de mPEG-PLA-tocoferol (correspondiente a 14,7 mg de mPEG-PLA-tocoferol) se mezcló con disoluciones de AC-colesterol y DOPE.

Las composiciones obtenidas en los Ejemplos 1 a 3 se resumen en la Tabla 3 a continuación.

[Tabla 3]

Ejemplo de prueba 1: Comparación del contenido de ARNip entre las composiciones que contienen ARNip/AC-colesterol/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k)/DOPE

Para examinar el cambio en el contenido de ARNip según el método de preparación, se midió el contenido de ARNip en cada una de las composiciones preparadas en el Ejemplo comparativo 1 y los Ejemplos 1 a 3.

Usando un método de extracción de Bligh & Dyer modificado, se cuantificó el ARNip en las micelas de copolímero de bloque anfifílico que contienen ARNip/lípido catiónico preparadas. Específicamente, se disolvió cada una de las micelas poliméricas preparadas en el Ejemplo comparativo 1 y los Ejemplos 1 a 3 en una disolución de fosfato de sodio 50 mM y NaCl 75 mM (pH 7,5), y se formó una fase única de Bligh & Dyer en la disolución, después de que la disolución se extrajera con fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5) y cloroformo, y se cuantificó el ARNip en la fase acuosa usando el reactivo Ribogreen (Invitrogen).

Como filtro estéril se usó un filtro de PVDF de 0,45 um de Millipore.

Los resultados de la prueba se resumen en la Tabla 4 a continuación.

[Tabla 4]

Como se puede apreciar en la Tabla 4 anterior, la pérdida de rendimiento fue significativamente menor en las micelas poliméricas, preparadas según el método inventivo de retirar el disolvente después de preparar la emulsión, que en las micelas poliméricas preparadas por el método previo que utiliza el disolvente miscible en agua. Además, se confirmó que el proceso de pretratamiento de recubrimiento del interior del recipiente tenía un efecto significativo sobre un aumento en el rendimiento y una disminución en la pérdida de rendimiento.

Ejemplo comparativo 2: Preparación de composición que contiene ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramida (dio-TETA)/mPEG-PLA-oleato (5k-4k) (relación de composición: 5-15-6) (uso de disolvente miscible en agua) Se disolvió 3,43 mg de 1,6-dio-TETA en 171,5 uL de cloroformo y se disolvió 100 ug de ARNip en 80 uL de agua destilada. También se disolvió 120 mg de mPEG-PLA-oleato (5k-4k) en 400 uL de cloroformo. Se mezclaron juntas la disolución de 1,6-dio-TETA y la disolución de ARNip mientras que la relación entre disolución acuosa: cloroformo: etanol se ajustó a 1:1:2 (200 uL: 200 uL: 400 uL). A la mezcla obtenida, se añadieron 200 uL de agua destilada y 200 uL de cloroformo para inducir la separación de fases en una fase acuosa y una fase orgánica, y la fase orgánica se recuperó y se dispuso en un matraz redondo de una boca. Se añadió la disolución de mPEG-PLA-oleato al mismo y se destiló el contenido en el matraz redondo de una boca a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se añadió 2,4 mL de agua destilada al matraz que luego se agitó suavemente para disolver el residuo, preparando así una composición que contenía ARNip/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-oleato (5k-4k) (véase la Tabla 5).

[Tabla 5]

Ejemplo 4: Preparación de composición que contiene ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramida (dio-TETA)/mPEG-PLA-oleato (5k-4k) (relación de composición: 5-15-6) (disolución acuosa que contiene polímero y emulsión doble después de la preparación de la emulsión)

Se disolvió 3,43 mg de 1,6-dio-TETA en 400 uL de cloroformo y se disolvió 100 ug de ARNip en 80 uL de agua destilada. Se disolvió 120 mg de mPEG-PLA-oleato (5k-4k) en 2 mL de agua destilada. Se añadió gota a gota la disolución de ARNip a la disolución de cloroformo de 1,6-dio-TETA mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se añadió gota a gota a la disolución acuosa de mPEG-PLA-oleato mientras que la mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión doble. La emulsión doble preparada se dispuso en un matraz redondo de una boca y se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar selectivamente el cloroformo, preparando así una composición que contenía ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramida (dio-TETA)/mPEG-PLA-oleato (5k-4k).

Ejemplo 5: Preparación de ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramida (dio-TETA)/mPEG-PLA-oleato (5k-4k) (relación de composición: 5-15-6) (disolución acuosa y emulsión doble después de la preparación de la emulsión) Se disolvió 3,43 mg de 1,6-dio-TETA en 171,5 uL de cloroformo y se disolvió 100 ug de ARNip en 80 uL de agua destilada. Se disolvió 120 mg de mPEG-PLA-oleato (5k-4k) en 400 uL de cloroformo. Se añadió gota a gota la disolución de ARNip a la disolución de cloroformo de 1,6-dio-TETA y mPEG-PLA-oleato mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se añadió gota a gota a 3 mL de agua destilada mientras que la disolución se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión doble. La emulsión doble preparada se dispuso en un matraz redondo de una boca y se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar selectivamente el cloroformo, preparando así una composición que contenía ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramida (dio-TETA)/mPEG-PLA-oleato (5k-4k) (véase la Tabla 6).

[Tabla 6]

Ejemplo de prueba 2: Comparación del contenido de ARNip entre composiciones que contienen ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramida (dio-TETA)/mPEG-PLA-oleato (5k-4k)

Para examinar el cambio en el contenido de ARNip según el método de preparación, se midió el contenido de ARNip en cada una de las composiciones preparadas en el Ejemplo comparativo 2 y el Ejemplos 4 y 5.

Usando un método de extracción de Bligh & Dyer modificado, se cuantificó el ARNip en cada una de las micelas de copolímero de bloque anfifílico que contenían ARNip/lípido catiónico preparadas en el Ejemplo comparativo 2 y los Ejemplos 4 y 5. Específicamente, cada una de las micelas poliméricas se disolvió en una disolución de fosfato de sodio 50 mM y NaCl 75 mM (pH 7,5), y se formó una fase única de Bligh & Dyer en la disolución, después de que la disolución se extrajera con fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5) y cloroformo, y se cuantificó el ARNip en la fase acuosa usando el reactivo Ribogreen (Invitrogen).

Como filtro estéril, se usó filtro de PVDF de 0,45 um Millipore.

Los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 7 a continuación.

[Tabla 7]

Como se puede apreciar en la Tabla 7 anterior, la pérdida de rendimiento fue significativamente menor en las micelas poliméricas, preparadas según el método inventivo de retirar el disolvente después de preparar la emulsión, que en las micelas poliméricas preparadas por el método previo que utiliza el disolvente miscible en agua.

Ejemplos 6 y 7: Preparación de composición que contiene ARNip/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2k-1,7k) (preparación de emulsión doble)

Se disolvió 5,48 mg de dioTETA en 274 uL de cloroformo y se disolvió 200 ug de ARNip en 160 uL de agua destilada. Se disolvió 240 mg de mPEG-PLA-tocoferol (2k-1,7k) en 1 mL de cloroformo. De la disolución de 240 mg de mPEG-PLA-tocoferol en cloroformo, se dispuso 200 uL de la disolución, que es una porción correspondiente a 48 mg de mPEG-PLA-tocoferol (20 % en peso), en un matraz redondo de una boca, se añadió 1,3 mL de cloroformo y se mezcló con la misma, y entonces se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente.

Mientras tanto, se mezclaron entre sí la disolución de dioTETA y la porción restante de la disolución de mPEG-PLA-tocoferol (correspondiente a 192 mg mPEG-PLA-tocoferol), y se añadió a la misma la disolución acuosa de ARNip mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se añadió a 8 mL de agua destilada mientras que la disolución se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión doble. Se dispuso la emulsión doble en el matraz redondo de una boca al que se había aplicado previamente 48 mg de mPEG-PLA-tocoferol como se ha descrito anteriormente, y se destiló el contenido en el matraz a presión reducida para retirar el cloroformo, preparando así una composición que contenía ARNip/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2k-1,7k) (Ejemplo 6; véase la Tabla 8).

Según un método similar al método del Ejemplo 6, se preparó una composición del Ejemplo 7. Específicamente, de la disolución de 240 mg de mPEG-PLA-tocoferol, se aplicó previamente al matraz una porción correspondiente a 120 mg de mPEG-PLA-tocoferol (50 % en peso), y la porción restante de la disolución de mPEG-PLA-tocoferol (correspondiente a 120 mg de mPEG-PLA-tocoferol) se mezcló con dioTETA, preparando así una composición que contenía ARNip/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (2k-1,7k) (Ejemplo 7; véase la Tabla 8).

Ejemplos 8 y 9: Preparación de composición que contiene ARNip/dioTETA/mPEG-PLA-linoleato (5k-4k) (preparación de emulsión doble)

Se agitó 6,86 mg de dioTETA en 343 uL de cloroformo y se disolvió 200 ug de ARNip en 160 uL de agua destilada. Se disolvió 120 mg de mPEG-PLA-linoleato (5k-4k) en 1 mL de cloroformo. De la disolución de 120 mg de mPEG-PLA-linoleato, se dispuso una porción de la disolución correspondiente a 24 mg de mPEG-PLA-linoleato (20 % en peso) en un matraz redondo de una boca, se añadió 1,3 mL de cloroformo y se mezcló con la misma, y entonces se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se mezclaron entre sí la disolución de dioTETA y la porción restante de la disolución de mPEG-PLA-linoleato (correspondiente a 96 mg de mPEG-PLA-linoleato), y la disolución acuosa de ARNip se añadió gota a gota a la misma mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se añadió gota a gota a 8 mL de agua destilada mientras que la disolución se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión doble. Se dispuso la emulsión doble en el matraz redondo de una boca al que se había aplicado previamente 24 mg de mPEG-PLA-linoleato como se describe, y se destiló el contenido en el matraz a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el cloroformo, preparando así una composición que contenía ARNip/dioTETA/mPEG-PLA-linoleato (5k-4k) (Ejemplo 8; véase la Tabla 8).

Según un método similar al método del Ejemplo 8, se preparó una composición del Ejemplo 9. Específicamente, de la disolución de 120 mg de mPEG-PLA-linoleato, se aplicó previamente al matraz una porción correspondiente a 60 mg de mPEG-PLA-linoleato (50 % en peso), y la porción restante de la disolución de mPEG-PLA-linoleato (correspondiente a 60 mg de mPEG-PLA-linoleato) se mezcló con dioTETA, preparando así una composición que contenía ARNip/dioTETA/mPEG-PLA-linoleato (5k-4k) (Ejemplo 9; véase la Tabla 8).

[Tabla 8]

Ejemplo de prueba 3: Comparación del contenido de ARNip entre composiciones que contienen ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramida (dio-TETA)/mPEG-PLA-tocoferol (2k-1,7k) o mPEG-PLA-linoleato (5k-4k)

Para examinar el cambio en el contenido de ARNip según la cantidad del polímero usada en el pretratamiento, se midió el contenido de ARNip en cada una de las composiciones preparadas en los Ejemplos 6, 7, 8 y 9.

Usando un método de extracción de Bligh & Dyer modificado, se cuantificó el ARNip en cada una de las micelas de copolímero de bloque anfifílico que contenían ARNip/lípido catiónico preparadas en los Ejemplos 6, 7, 8 y 9. Específicamente, se disolvió cada una de las micelas poliméricas en una disolución de fosfato de sodio 50 mM y NaCl 75 mM (pH 7,5), y se formó una fase única de Bligh & Dyer en la disolución, después de que la disolución se extrajera con fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5) y cloroformo, y se cuantificó el ARNip en la fase acuosa usando el reactivo Ribogreen (Invitrogen).

Como filtro estéril se usó un filtro de PVDF de 0,45 um de Millipore.

Los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 9 a continuación.

[Tabla 9]

Ejemplo 10: Preparación de composición que contiene ARNip/1,4-dimiristoleoildietilenotriamina (dimiDETA)/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) (retirada de disolvente después de la preparación de la emulsión) Se disolvió 830 ug de dimiDETA en 41,5 uL de cloroformo y se disolvió 25 ug de ARNip en 20 uL de agua destilada. También se disolvió 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) en 130 uL de cloroformo. De la disolución de 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol, se dispuso una porción correspondiente a 3 mg de mPEG-PLA-tocoferol (20 % en peso) en un matraz redondo de una boca, se añadió 1 mL de cloroformo y se mezcló con la misma, y entonces se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se mezclaron entre sí la disolución de dimiDETA y la porción restante de la disolución de mPEG-PLA-tocoferol correspondiente a 12 mg de mPEG-PLA-tocoferol, y la disolución acuosa de ARNip se añadió gota a gota a la misma mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. Se dispuso la emulsión en el matraz redondo de una boca a la que se aplicó previamente 3 mg de mPEG-PLA-tocoferol como se ha descrito anteriormente, y se destiló el contenido en el matraz a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se añadió al matraz 600 uL de agua destilada que luego se agitó suavemente para disolver el residuo, preparando así una composición que contenía ARNip/dimiDETA/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k).

Ejemplo 11: Preparación de composición que contiene ARNip/1,4-dimiristoleoildietilenotriamina (dimiDETA)/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) (retirada selectiva de disolvente orgánico después de la preparación de la emulsión doble)

Se disolvió 830 ug de dimiDETA en 41,5 uL de cloroformo y se disolvió 25 ug de ARNip en 20 uL de agua destilada. También se disolvió 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) en 130 uL de cloroformo. De la disolución de 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol, se dispuso una porción correspondiente a 3 mg de mPEG-PLA-tocoferol (20 % en peso) en un matraz redondo de una boca, se añadió 1 mL de cloroformo y se mezcló con la misma, y entonces se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se mezclaron entre sí la disolución de dimiDETA y la porción restante de la disolución de mPEG-PLA-tocoferol correspondiente a 12 mg de mPEG-PLA-tocoferol, y la disolución acuosa de ARNip se añadió gota a gota a la misma, mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se añadió gota a gota a 1 mL de agua destilada mientras que la disolución se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión doble. Se dispuso la emulsión doble en el matraz redondo de una boca al que se aplicó previamente 3 mg de mPEG-PLA-tocoferol como se ha descrito anteriormente, y se destiló el contenido en el matraz a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el cloroformo, preparando así una composición que contenía ARNip/dimiDETA/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k).

Ejemplo 12: Preparación de composición que contiene ARNip/1,8-dilinoleoiltetraetilenpentamina (diliTEPA)/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) (retirada de disolvente orgánico después de la preparación de la emulsión)

Se disolvió 367,3 ug de diliTEPA en 91,8 uL de cloroformo y se disolvió 25 ug de ARNip en 20 uL de agua destilada. También se disolvió 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) en 100 ug de cloroformo. De la disolución de 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol, se dispuso una porción correspondiente a 3 mg de mPEG-PLA-tocoferol (20 % en peso) en un matraz redondo de una boca, se añadió 1 mL de cloroformo y se mezcló con la misma, y entonces se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se mezclaron entre sí la disolución de diliTEPA y la porción restante de la disolución de mPEG-PLA-tocoferol correspondiente a 12 mg de mPEG-PLA-tocoferol, y se añadió gota a gota a la misma la disolución acuosa de ARNip, mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se dispuso en el matraz redondo de una boca al que se aplicó previamente 3 mg de mPEG-PLA-tocoferol, como se ha descrito anteriormente, y se destiló el contenido en el matraz a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se añadió 600 uL de agua destilada al matraz que luego se agitó suavemente para disolver el residuo, preparando así una composición que contenía ARNip/diliTEPA/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k).

Ejemplo 13: Preparación de composición que contiene ARNip/1,8-dilinoleoiltetraetilenpentamina (diliTEPA)/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) (retirada selectiva de disolvente orgánico después de la preparación de la emulsión doble)

Se disolvió 367,3 ug de diliTEPA en 91,8 uL de cloroformo y se disolvió 25 ug de ARNip en 20 uL de agua destilada. También se disolvió 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) en 100 ug de cloroformo. De la disolución de 15 mg de mPEG-PLA-tocoferol, se dispuso una porción correspondiente a 3 mg de mPEG-PLA-tocoferol (20 % en peso) en un matraz redondo de una boca, se añadió 1 mL de cloroformo y se mezcló con la misma, y entonces se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se mezclaron entre sí la disolución de diliTEPA y la porción restante de la disolución de mPEG-PLA-tocoferol correspondiente a 12 mg de mPEG-PLA-tocoferol, y la disolución acuosa de ARNip se añadió gota a gota a la misma, mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se añadió gota a gota a 1 mL de agua destilada, mientras que la disolución se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión doble. Se dispuso la emulsión doble en el matraz redondo de una boca a la que se aplicó previamente 3 mg de mPEG-PLA-tocoferol como se ha descrito anteriormente, y se destiló el contenido en el matraz a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el cloroformo, preparando así una composición que contenía ARNip/diliTEPA/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k).

Ejemplo de prueba 4: Comparación del contenido de ARNip entre composiciones que contienen ARNip/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k)/dimiDETA o diliTEPA

Para examinar un cambio en el contenido de ARNip según el método de preparación, se midió el contenido de ARNip en cada una de las composiciones preparadas en los Ejemplos 10, 11, 12 y 13.

Usando un método de extracción de Bligh & Dyer modificado, se cuantificó el ARNip en cada una de las micelas de copolímero de bloque anfifílico que contenían ARNip/lípido catiónico preparadas en los Ejemplos 10, 11, 12 y 13. Específicamente, se disolvió cada una de las micelas poliméricas en una disolución de fosfato de sodio 50 mM y NaCl 75 mM (pH 7,5), y se formó una fase única de Bligh & Dyer en la disolución, después de que la disolución se extrajera con fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5) y cloroformo, y se cuantificó el ARNip en la fase acuosa usando el reactivo Ribogreen (Invitrogen).

Como filtro estéril se usó un filtro de PVDF de 0,45 um de Millipore.

Los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 10 a continuación.

[Tabla 10]

Ejemplo 14: Preparación de composición que contiene ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramina (dioTETA)/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) (retirada de disolvente después de la preparación de la emulsión)

Se disolvió 6,98 mg de dioTETA en 350 uL de cloroformo y se disolvió 200 ug de ARNip en 160 uL de agua destilada. Se disolvió 40 mg de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) en 133 uL de cloroformo. De la disolución de 40 mg de mPEG-PLA-tocoferol, se dispuso una porción correspondiente a 8 mg de mPEG-PLA-tocoferol (20 % en peso) en un matraz redondo de una boca, se añadió 800 uL de cloroformo y se mezcló con la misma, y entonces se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se mezclaron entre sí la disolución de dioTETA y la porción restante de la disolución de mPEG-PLA-tocoferol correspondiente a 32 mg de mPEG-PLA-tocoferol, se añadió 1 mL de cloroformo a la misma, y la disolución acuosa de ARNip se añadió gota a gota a la misma mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se dispuso en el matraz redondo de una boca al que se aplicó previamente 8 mg de mPEG-PLA-tocoferol como se ha descrito anteriormente, y se destiló el contenido en el matraz a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente. Se añadió 2 mL de agua destilada al matraz que luego se agitó suavemente para disolver el residuo, preparando así una composición que contenía ARNip/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k). Ejemplo 15: Preparación de composición que contiene ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramina (dioTETA)/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) (retirada selectiva de disolvente después de la preparación de la emulsión doble) Se disolvió 6,98 mg de dioTETA en 350 uL de cloroformo y se disolvió 200 ug de ARNip en 160 uL de agua destilada. Se disolvió 40 mg de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) en 4 mL de agua destilada. A la disolución de dioTETA, se añadió 450 uL de cloroformo, y entonces la disolución acuosa de ARNip se añadió gota a gota a la misma, mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se añadió gota a gota a la disolución de 40 mg de mPEG-PLA-tocoferol en agua destilada, mientras que la disolución se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión doble. Se dispuso la emulsión doble en un matraz redondo de una boca y se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el cloroformo, preparando así una composición que contenía ARNip/diliTEPA /mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k).

Ejemplo 16: Preparación de composición que contiene ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramina (dioTETA)/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) (retirada selectiva de disolvente después de la preparación de la emulsión doble) Se disolvió 6,98 mg de dioTETA en 350 uL de cloroformo y se disolvió 200 ug de ARNip en 160 uL de agua destilada. Se disolvió 8 mg de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) en 3 mL de cloroformo y se disolvió 32 mg de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) en 4 mL de agua destilada (cantidad total de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k): 40 mg). Se dispuso la disolución de 8 mg (20 % en peso) de mPEG-PLA-tocoferol en cloroformo en un matraz redondo de una boca y se destiló a presión reducida para retirar el disolvente. A la disolución de dioTETA, se añadió 450 uL de cloroformo, y entonces la disolución acuosa de ARNip se añadió gota a gota a la misma, mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se añadió a la disolución acuosa de 32 mg de mPEG-PLA-tocoferol mientras que la disolución se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión doble. Se dispuso la emulsión doble en el matraz redondo de una boca al que se aplicó previamente 8 mg de mPEG-PLA-tocoferol como se ha descrito anteriormente, y se destiló el contenido en el matraz a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar selectivamente el cloroformo, preparando así una composición que contenía ARNip/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k).

Ejemplo de prueba 5: Comparación del contenido de ARNip entre composiciones que contienen ARNip/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k)/dimiDETA o diliTEPA

Para examinar el cambio en el contenido de ARNip según el método de preparación, se midió el contenido de ARNip en cada una de las composiciones preparadas en los Ejemplos 14, 15 y 16.

Usando un método de extracción de Bligh & Dyer modificado, se cuantificó el ARNip en cada una de las micelas de copolímero de bloque anfifílico que contenían ARNip/lípido catiónico preparadas en los Ejemplos 14, 15 y 16. Específicamente, se disolvió cada una de las micelas poliméricas en una disolución de fosfato de sodio 50 mM y NaCl 75 mM (pH 7,5), y se formó una fase única de Bligh & Dyer en la disolución, después de que la disolución se extrajera con fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5) y cloroformo, y se cuantificó el ARNip en la fase acuosa usando el reactivo Ribogreen (Invitrogen).

Como filtro estéril se usó un filtro de PVDF de 0,45 um de Millipore.

Los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 11 a continuación.

[Tabla 11]

Ejemplo 17: Preparación de composición que contiene ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramina (dioTETA)/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) (retirada de disolvente después de la preparación de la emulsión)

Se disolvió 872,5 ug de dioTETA en 100 uL de cloroformo y se disolvió 25 ug de ARNip en 20 uL de agua destilada. Se disolvió 5 mg de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) en 500 uL de cloroformo. Se dispuso la disolución de 1 mg (20 % en peso) de mPEG-PLA-tocoferol en cloroformo en un matraz redondo de una boca y se destiló a presión reducida para retirar el disolvente. Se añadió gota a gota la disolución acuosa de ARNip a la disolución de mezcla de dioTETA y 4 mg de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se añadió al matraz redondo de una boca al que se aplicó previamente 1 mg de mPEG-PLA-tocoferol como se ha descrito anteriormente, y se destiló el contenido en el matraz a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar el disolvente, y se añadió 600 uL de agua destilada al matraz que luego se agitó suavemente para disolver el residuo, preparando así una composición que contenía ARNip/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k).

[Tabla 12]

Ejemplo 18, 19, 20 y 21: Preparación de composición que contiene ARNip/1,6-dioleoiltrietilentetramina (dioTETA)/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) (retirada selectiva de disolvente después de la preparación de la emulsión doble)

Se disolvió 872,5 ug de dioTETA en 100 uL de cloroformo y se disolvió 25 ug de ARNip en 20 uL de agua destilada. Se disolvió 5 mg de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) en 500 uL de agua destilada. A la disolución de dioTETA, se añadió gota a gota a la misma la disolución acuosa de ARNip mientras que la disolución de mezcla se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión. La emulsión se añadió a la disolución acuosa de 5 mg de mPEG-PLA-tocoferol mientras que la disolución se sonicó usando un sonicador, preparando así una emulsión doble. Se dispuso la emulsión doble en el matraz redondo de una boca, y se destiló el contenido en el matraz a presión reducida en un evaporador rotatorio para retirar selectivamente el cloroformo, preparando así una composición que contenía ARNip/dioTETA/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) (Ejemplo 18).

Según un método similar al método del Ejemplo 18, se preparó una composición del Ejemplo 19, 20 y 21. Específicamente, se aplicaron 500 ug, 50 ug y 5 ug de mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k) al Ejemplo 19, 20 y 21, respectivamente.

[Tabla 13]

Ejemplo de prueba 6: Comparación del contenido de ARNip entre composiciones que contienen ARNip/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k)/dioTETA

Para examinar el cambio en el contenido de ARNip según el método de preparación y la cantidad de polímero, se midió el contenido de ARNip en cada una de las composiciones preparadas en los Ejemplos 17, 18, 19, 20 y 21.

Usando un método de extracción de Bligh & Dyer modificado, se cuantificó el ARNip en cada una de las micelas de copolímero de bloque anfifílico que contenían ARNip/lípido catiónico preparadas en los Ejemplos 17, 18, 19, 20 y 21. Específicamente, se disolvió cada una de las micelas poliméricas en una disolución de fosfato de sodio 50 mM y NaCl 75 mM (pH 7,5), y se formó una fase única de Bligh & Dyer en la disolución, después de que la disolución se extrajera con fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5) y cloroformo, y se cuantificó el ARNip en la fase acuosa usando el reactivo Ribogreen (Invitrogen).

Como filtro estéril se usó un filtro de PVDF de 0,45 um de Millipore.

Los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 14 a continuación.

[Tabla 14]

Ejemplo de prueba 7: Comparación de tamaño de partículas entre composiciones que contienen AR Nip/mPEG-PLA-tocoferol (5k-4k)/dioTET A

Para examinar formación de micela que comprende ARNip, lípido catiónico y copolímero de bloque anfifílico, se midió el tamaño de partículas y el ARNip libre de cada una de las composiciones preparadas en los Ejemplos 18, 19, 20 y 21.

Usando el método de dispersión dinámica de luz (DLS), se midió el tamaño de partículas de cada una de las micelas de copolímero de bloque anfifílico que contienen ARNip/lípido catiónico preparadas en los Ejemplos 18, 19, 20 y 21. Específicamente, se usó láser de He-Ne como fuente de luz y el instrumento de DLS fue ELS-8000 fabricado por Photal Otsuka Electronics.

Usando electroforesis en gel de agarosa, se midió el ARNip libre de cada una de las composiciones preparadas en los Ejemplos 18, 19, 20 y 21.

[Tabla 15]

<110> Samyang Biopharmaceuticals Corporation

<120> Método de preparación de una composición para administrar un fármaco aniónico

<130> 4/2QQ98/2

<140> EP13772575.0

<141 > 03-04-2013

<150> KR10-2012-0035087

<151 > 04-04-2012

<160>2

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1

<211> 21

<212> ARN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> hebra codificante de si-Luc, en donde n es T, y dos T se unen por enlace fosforotioato

<400> 1

cuuacgcuga guacuucgan n 21

<210 >2

<211> 21

<212> ARN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> hebra no codificante de si-Luc, en donde n es T, y dos T se unen por enlace fosforotioato

<400> 2

ucgaaguacu cagcguaagn n 21

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de preparación de una composición para la administración de fármacos aniónicos, comprendiendo la composición un fármaco aniónico, un lípido catiónico y un copolímero de bloque anfifílico, en donde el fármaco aniónico forma un complejo con un lípido catiónico, y el complejo se atrapa en una estructura de micela formada por el copolímero de bloque anfifílico, comprendiendo el método las etapas de:

(1) añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico en un disolvente orgánico para producir una emulsión; y

(2) añadir un disolvente acuoso o una disolución acuosa del copolímero de bloque anfifílico para formar una micela polimérica;

a condición de que, cuando el disolvente acuoso se añade en la etapa (2), el método comprende además cualquiera de las etapas de añadir el copolímero de bloque anfifílico a la disolución del lípido catiónico en el disolvente orgánico, que se usa en la etapa (1), y retirar el disolvente orgánico de la emulsión preparada en la etapa (1), o las etapas de retirar el disolvente orgánico de la emulsión preparada en la etapa (1), añadir a la misma una disolución del copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico, y luego retirar el disolvente orgánico, y

2. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende las etapas de:

(1-i) añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico en un disolvente orgánico para preparar una emulsión;

(1 -ii) retirar el disolvente orgánico de la emulsión preparada en la etapa (1 -i);

(1 -iii) disolver el copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico, añadir la disolución a lo resultante de la etapa (1 -ii) y retirar el disolvente orgánico; y

(1 -iv) añadir un disolvente acuoso a lo resultante de la etapa (1 -iii) para formar una micela polimérica.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende las etapas de:

(2-i) añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico en un disolvente orgánico para preparar una emulsión;

(2-ii) retirar el disolvente orgánico de la emulsión preparada en la etapa (2-i); y

(2-iii) mezclar una disolución acuosa del copolímero de bloque anfifílico con lo resultante de la etapa (2-ii) para formar una micela polimérica.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende las etapas de:

(3-i) añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico y el lípido anfifílico en un disolvente orgánico para preparar una emulsión;

(3-ii) retirar un disolvente orgánico de la emulsión preparada en la etapa (3-i); y

(3-iii) añadir una disolución acuosa a lo resultante de la etapa (3-ii), de la que se retiró el disolvente orgánico, para formar una micela polimérica.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende las etapas de:

(4-i) añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico en un disolvente orgánico para preparar una emulsión;

(4-ii) añadir la emulsión de (4-i) a una disolución acuosa del copolímero de bloque anfifílico para preparar una emulsión doble; y

(4-iii) retirar selectivamente el disolvente orgánico de la emulsión doble preparada en la etapa (4-ii), para formar una micela polimérica.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende las etapas de:

(5-i) añadir una disolución acuosa del fármaco aniónico a una disolución del lípido catiónico y el copolímero de bloque anfifílico a un disolvente orgánico para preparar una emulsión;

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el método comprende además una etapa de recubrimiento de disolver una porción del copolímero de bloque anfifílico en un disolvente orgánico, disponer la disolución del copolímero de bloque anfifílico en un recipiente y retirar el disolvente orgánico de la disolución del copolímero de bloque anfifílico, recubriéndose así el interior del recipiente con el copolímero de bloque anfifílico, en donde la cantidad de copolímero de bloque anfifílico que se usa en la etapa (1-iii), (2-iii), (3-i), (4-ii) o (5-i) es la cantidad no usada del copolímero de bloque anfifílico en la etapa de recubrimiento, y la etapa (1-ii), (2-ii), (3-ii), (4-iii) o (5-iii) se lleva a cabo en el recipiente recubierto.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la porción del copolímero de bloque anfifílico, que se usa en la etapa de recubrimiento es 1 a 50 % en peso basado en la cantidad total de copolímero de bloque anfifílico usada, y la cantidad de copolímero de bloque anfifílico usada en la etapa (1-iii), (2-iii), (3-i), (4-ii) o (5-i) es una cantidad que excluye la cantidad de la porción del copolímero de bloque anfifílico, que se usa en la etapa de recubrimiento.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el disolvente orgánico que se usa para disolver el lípido catiónico o el copolímero de bloque anfifílico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en acetato de etilo, acetonitrilo, cloruro de metileno, cloroformo y dioxano.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la concentración del fármaco aniónico en la disolución acuosa del fármaco aniónico es 1 ng/mL a 1 kg/mL, la concentración del lípido catiónico en la disolución del lípido catiónico en el disolvente orgánico es 1 pg/mL a 1 kg/mL y la relación de mezcla en volumen entre la disolución acuosa del fármaco aniónico y la disolución de disolvente orgánico del lípido catiónico es 1:1 -50.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el fármaco aniónico es un péptido, una proteína o un ácido nucleico, y preferentemente el ácido nucleico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ARN, ADN, ARN interferente pequeño (ARNip), un aptámero, oligodesoxinucleótido (ODN) antisentido, ARN antisentido, ribozima y DNAzima.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el lípido catiónico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), N,N-dimetil-(2,3-dioleoiloxi)propilamina (DODMA), 1,2-diacil-3-trimetilamonio-propano (TAP), 1,2-diacil-3-dimetilamoniopropano (DAP), 3p-[N-(N',N',N'-trimetilaminoetano)carbomoil]colesterol (TC-colesterol), 3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-colesterol), 3p-[N-(N'-monometilaminoetano)carbamoil]colesterol (MC-colesterol), 3p-[N-(aminoetano)carbamoil]colesterol (AC-colesterol), colesteroloxipropano-1-amina (COPA), tocoferol N-(N'-aminoetano)carbamoilpropanoico (AC-tocoferol) y tocoferol N-(N'-metilaminoetano)carbamoilpropanoico (MC-tocoferol).

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el lípido catiónico se representa por la siguiente fórmula 1:

en donde n y m son cada uno 0 a 12, y 2 < n m < 12, a y b son cada uno 1 a 6, y R¹y R²se seleccionan cada uno independientemente de grupos de hidrocarburo saturado e insaturado que tienen 11 a 25 átomos de carbono, y, preferentemente, R¹y R²se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en laurilo, miristilo, palmitilo, estearilo, araquidilo, behenilo, lignocerilo, cerotilo, miristoleílo, palmitoleílo, sapienilo, oleílo, linoleílo, araquidonilo, eicosapentaenilo, erucilo, docosahexaenilo y cerotilo.

14. El método de la reivindicación 14, en donde n y m son independientemente 1 a 9, o preferentemente 2 a 4, y 2 < n+m < 10.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el copolímero de bloque anfifílico es un copolímero de bloque de tipo A-B que consiste en un bloque A hidrófilo y un bloque B hidrófobo, y preferentemente el bloque A hidrófilo es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en polialquilenglicol, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y poliacrilamida, y el bloque B hidrófobo es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en poliéster, polianhídrido, poliaminoácido, poliortoéster y polifosfazina.