ES2899612T3 - Saponina conjugada a proteínas de unión a epítopos - Google Patents

Saponina conjugada a proteínas de unión a epítopos Download PDF

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Ruben Postel
Hendrik Fuchs
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Abstract

Una primera molécula proteica que comprende un primer sitio de unión para la unión a un primer epítopo de una primera molécula de la superficie celular, unida covalentemente a al menos una saponina mediante al menos una porción conectora y/o mediante un armazón oligomérico o polimérico a un residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, o unida covalentemente de manera directa a un residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, donde - el primer sitio de unión comprende o consiste en una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o una IgG, o comprende o consiste en al menos un ligando para la unión a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina, y - en donde la al menos una saponina se selecciona del grupo que consiste en: SO1861, SA1641, GE1741, QS-21, QS-21A, QS21-B, Quil-A, SO1832, SO1904 y SO1862.

Description

DESCRIPCIÓN
Saponina conjugada a proteínas de unión a epítopos
CAMPO TÉCNICO
[0001] La invención se refiere a un conjugado de una molécula para la unión a una molécula de la superficie celular y una saponina, donde dicho conjugado es para mejorar la eficacia de, por ejemplo, un ADC. El núcleo de la invención es una molécula proteica que comprende una saponina unida a un resto que se une a una molécula de la superficie celular. La invención también se refiere a una composición que comprende el conjugado de la invención y un oligonucleótido. La invención también se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco o un conjugado ligando-fármaco que comprende el conjugado de la invención y un resto efector.
ANTECEDENTES
[0002] En muchas ocasiones, las moléculas con actividad biológica terapéutica son, en teoría, adecuadas para su aplicación como fármaco terapéutico eficaz para el tratamiento de una enfermedad como el cáncer en pacientes humanos que lo necesiten. Un ejemplo típico son los restos biológicamente activos de moléculas pequeñas. Sin embargo, muchas, si no todas, las posibles moléculas y terapias similares a fármacos que se utilizan actualmente en la clínica adolecen de al menos uno de una plétora de deficiencias e inconvenientes. Cuando se administran a un cuerpo humano, las moléculas terapéuticamente activas pueden ejercer efectos offtarget o fuera de la diana, además de la actividad biológica dirigida a un aspecto subyacente de una enfermedad o problema de salud que se desea tratar. Dichos efectos fuera de la diana no son deseados y conllevan un riesgo de inducción de efectos secundarios de la molécula administrada que ponen en peligro la salud o incluso la vida. Es la ocurrencia de tales eventos adversos lo que hace que muchos compuestos similares a fármacos y restos terapéuticos fallen en los ensayos clínicos de fase III o incluso en los ensayos clínicos de fase IV (seguimiento posterior a la entrada en el mercado). Por lo tanto, existe un fuerte deseo de proporcionar moléculas farmacológicas tales como terapias de moléculas pequeñas, en las que el efecto terapéutico de la molécula farmacológica debería, por ejemplo, (1) ser altamente específico para un factor biológico o proceso biológico que desencadena la enfermedad, (2) ser suficientemente seguro, (3) ser suficientemente eficaz, (4) estar suficientemente dirigido a la célula enferma con poca o ninguna actividad fuera de la diana en células no enfermas, (5) tener un modo de acción suficientemente oportuno (por ejemplo, la molécula farmacológica administrada debe alcanzar el sitio de actuación en el paciente humano dentro de un cierto período de tiempo y debe permanecer en el sitio de actuación durante un cierto período de tiempo), y/o (6) tener una actividad terapéutica suficientemente duradera en el cuerpo del paciente, entre otros. Desafortunadamente, hasta la fecha, las terapias 'ideales' con muchas o incluso todas las características beneficiosas descritas anteriormente no están disponibles para los pacientes, a pesar de la investigación intensiva y de larga duración y a pesar de los impresionantes avances logrados en varias áreas de las dificultades e inconvenientes investigados de manera individual.
[0003] La quimioterapia es una de las opciones terapéuticas más importantes para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, a menudo se asocia con una ventana terapéutica baja porque no tiene especificidad hacia las células cancerosas sobre las células en división de los tejidos sanos. La invención de los anticuerpos monoclonales ofreció la posibilidad de explotar sus propiedades de unión específicas como mecanismo para la administración dirigida de agentes citotóxicos a las células cancerosas, sin afectar a las células normales. Esto se puede lograr mediante la conjugación química de efectores citotóxicos (también conocidos como cargas útiles) con anticuerpos, para crear conjugados anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés). Normalmente, se utilizan cargas útiles muy potentes, como la emtansina (DM1), que tienen un índice terapéutico limitado (una relación que compara la dosis tóxica con la dosis eficaz) en sus formas no conjugadas. La conjugación de DM1 con trastuzumab (ado-trastuzumab emtansina), también conocido como Kadcycla, aumenta la dosis tolerable de DM1 al menos dos veces en monos. En las últimas décadas se han realizado enormes esfuerzos e inversiones para desarrollar ADC terapéuticos. Sin embargo, sigue siendo un desafío llevar los ADC a la clínica, a pesar de los datos preclínicos prometedores. El primer ADC aprobado para uso clínico fue gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg, dirigido contra CD33, Pfizer/Wyeth) para la leucemia mielógena aguda (LMA) recidivante en el año 2000. Sin embargo, Mylotarg se retiró del mercado a petición de la Federal Drug Administration (FDA) debido a una serie de preocupaciones, incluido su perfil de seguridad. Los pacientes tratados con Mylotarg fallecieron con más frecuencia que los pacientes tratados con quimioterapia convencional. Mylotarg se volvió a aprobar para el mercado en 2017 con una dosis recomendada más baja, un esquema diferente en combinación con quimioterapia o solo y una nueva población de pacientes. Hasta la fecha, solo se han aprobado cinco ADC para uso clínico y, mientras tanto, se ha detenido el desarrollo clínico de aproximadamente cincuenta y cinco ADC. Sin embargo, el interés sigue siendo alto y, en la actualidad, aproximadamente ochenta ADC todavía están en desarrollo clínico en casi seiscientos ensayos clínicos.
[0004] A pesar de la posibilidad de utilizar cargas útiles tóxicas que normalmente los pacientes no toleran, un índice terapéutico bajo (una relación que compara la dosis tóxica con la dosis eficaz) es un problema importante que explica la interrupción de muchos ADC en desarrollo clínico, que puede ser causado por varios mecanismos como la toxicidad fuera de la diana en las células normales, el desarrollo de resistencia contra los agentes citotóxicos y la liberación prematura de fármacos en la circulación. En una revisión sistemática de la FDA de los ADC se descubrió que los perfiles de toxicidad de la mayoría de los ADC podrían clasificarse según la carga útil utilizada, pero no el anticuerpo utilizado, lo que sugiere que la toxicidad está determinada principalmente por la liberación prematura de la carga útil. De los aproximadamente cincuenta y cinco ADC que se suspendieron, se estima que al menos veintitrés se debieron a un índice terapéutico deficiente. Por ejemplo, recientemente se interrumpió el desarrollo de un conjugado de trastuzumab tesirina (ADCT-502, dirigido a HER-2, ADC Therapeutics) debido a un índice terapéutico estrecho, posiblemente debido a un efecto en el sitio de actuación y fuera del tejido en tejido pulmonar que expresa niveles considerables de HER2. Además, varios ADC en ensayos de fase 3 se han descontinuado debido a la falta de un criterio de valoración principal. Por ejemplo, los ensayos de fase 3 de un conjugado de depatuxizumab mafodotina (ABT-414, dirigido a EGFR, AbbVie) evaluado en pacientes con glioblastoma recién diagnosticado y un conjugado de mirvetuximab soravtansina (IMGN853, dirigido al receptor de folato alfa (FRa), ImmunoGen) probado en pacientes con cáncer de ovario resistente al platino, se interrumpieron recientemente y no mostraron ningún beneficio en la supervivencia. Es importante señalar que la dosis clínicamente utilizada de algunos ADC puede no ser suficiente para su actividad anticancerígena completa. Por ejemplo, ado-trastuzumab emtansina tiene una DMT de 3,6 mg/kg en humanos. En modelos preclínicos de cáncer de mama, ado-trastuzumab emtansina indujo la regresión tumoral en dosis de 3 mg/kg o más, pero se observó una eficacia más potente con 15 mg/kg. Esto sugiere que, a la dosis administrada clínicamente, es posible que ado-trastuzumab emtansina no ejerza su efecto antitumoral potencial máximo.
[0005] Los ADC se componen principalmente de un anticuerpo, un resto citotóxico como una carga útil y una porción conectora. Se han propuesto y llevado a cabo varias estrategias novedosas en el diseño y desarrollo de nuevos ADC para superar los problemas existentes, dirigidos a cada uno de los componentes de los ADC. Por ejemplo, mediante la identificación y validación de sitios de actuación antigénicos adecuados para el componente de anticuerpo, mediante la selección de antígenos que tienen altos niveles de expresión en el tumor y poca o ninguna expresión en tejidos normales, antígenos que están presentes en la superficie celular para que sean accesibles a los ADC circulantes y antígenos que permiten la internalización de a Dc en la célula después de su unión; y mecanismos alternativos de actividad; diseño y optimización de porciones conectoras que mejoran la solubilidad y la relación fármaco/anticuerpo (DAR, por sus siglas en inglés) de los ADC y superan la resistencia inducida por proteínas que pueden transportar el agente quimioterapéutico fuera de las células; mejora de la relación DAR mediante la inclusión de más cargas útiles, selección y optimización de anticuerpos para mejorar la homogeneidad y la capacidad de desarrollo de los anticuerpos. Además del desarrollo tecnológico de los ADC, también se están implementando nuevas estrategias clínicas y traslacionales para maximizar el índice terapéutico, como el cambio de la pauta de dosificación mediante la dosificación fraccionada; la realización de estudios de biodistribución; la inclusión de biomarcadores para optimizar la selección de pacientes, la captura de señales de respuesta de manera temprana y la realización de un seguimiento de la duración y profundidad de la respuesta, y la realización de estudios de combinación.
[0006] Un ejemplo de ADC con potencial clínico son aquellos ADC como brentuximab vedotina, inotuzumab ozogamicina, moxetumomab pasudotox y polatuzumab vedotina, que se evalúan como una opción de tratamiento para cánceres linfoides y mieloma múltiple. Polatuzumab vedotina, que se une a CD79b en linfocitos B (malignos), y pinatuzumab vedotina, que se une a CD22, se someten a ensayos clínicos en los que cada uno de los ADC se combina con rituximab, un anticuerpo monoclonal que se une a CD20 y no tiene carga útil, coadministrado [B. Yu y D. Liu, Antibody-drug conjugates in clinical trials for lymphoid malignancies and multiple myeloma; Journal of Hematology & Oncology (2019) 12:94]. Las combinaciones de anticuerpos monoclonales como estos ejemplos son un enfoque adicional e intentan llegar a la "solución mágica" que combine muchas o incluso todas las características deseadas de los ADC mencionados antes.
[0007] Mientras tanto, en las últimas décadas, se están desarrollando tratamientos basados en ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos terapéuticos pueden basarse en ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos antisentido (ASO, AON, por sus siglas en inglés) y ARN interferente pequeño (ARNip), microARN y aptámeros de ADN y ARN, para enfoques como la terapia génica, interferencia de ARN (ARNi). Muchos de ellos comparten la misma base fundamental de acción mediante la inhibición de la expresión de ADN o ARN, evitando así la expresión de proteínas anormales relacionadas con la enfermedad. El mayor número de ensayos clínicos se está llevando a cabo en el campo de la terapia génica, con casi 2600 ensayos clínicos en curso o completados en todo el mundo, pero solo alrededor del 4 % pasa a la fase 3. A estos les siguen los ensayos clínicos con ASO. De manera similar a los ADC, a pesar de la gran cantidad de técnicas que se están explorando, los ácidos nucleicos terapéuticos comparten dos problemas principales durante el desarrollo clínico: la administración a las células y los efectos fuera de la diana. Por ejemplo, los ASO, como el ácido nucleico peptídico (PNA), el oligómero morfolino fosforamidato (PMO), el ácido nucleico bloqueado (LNA) y el ácido nucleico con puente (BNA), se están investigando como una estrategia atractiva para inhibir genes diana específicos y especialmente aquellos genes hacia los que es difícil dirigir la acción de inhibidores que son moléculas pequeñas o anticuerpos neutralizantes. Actualmente, se está estudiando la eficacia de diferentes ASO en muchas enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica, y también en varios estadios del cáncer. La aplicación de los ASO como agentes terapéuticos potenciales requiere métodos seguros y eficaces para su administración al citoplasma y/o al núcleo de las células y tejidos diana. Aunque se ha demostrado la relevancia clínica de los ASO, la absorción celular ineficiente, tanto in vitro como in vivo, limita la eficacia de los ASO y ha sido una barrera para el desarrollo terapéutico. La captación celular puede ser <2 % de la dosis, lo que da como resultado una concentración de ASO demasiado baja en el sitio activo para un resultado eficaz y sostenido. Por consiguiente, esto requiere un aumento de la dosis administrada, lo que induce efectos fuera de la diana. Los efectos secundarios más comunes son la activación de la cascada del complemento, la inhibición de la cascada de la coagulación y la estimulación del sistema inmunológico mediada por un receptor de tipo Toll.
[0008] Los agentes quimioterapéuticos son en su mayoría moléculas pequeñas; sin embargo, su eficacia se ve obstaculizada por la gran toxicidad fuera de la diana, así como por su escasa solubilidad, rápida eliminación y exposición limitada al tumor. Los conjugados de armazón-fármaco de moléculas pequeñas, como los conjugados de polímero-fármaco (PDC, por sus siglas en inglés) son construcciones macromoleculares con actividad farmacológica, que comprenden una o más moléculas de un fármaco de moléculas pequeñas unido a un armazón de soporte (por ejemplo, polietilenglicol (PEG)).
[0009] Este principio conjugado ha atraído mucha atención y se ha estado investigando durante varias décadas. La mayoría de los conjugados de fármacos de moléculas pequeñas en desarrollo preclínico o clínico son para indicaciones oncológicas. Sin embargo, hasta la fecha solo se ha aprobado, en 2014, un fármaco no relacionado con el cáncer (Movantik, un conjugado de oligómero PEG del antagonista opioide naloxona, AstraZeneca) para el estreñimiento inducido por opioides en pacientes con dolor crónico, cuya indicación no es oncológica. La traducción de la aplicación de conjugados de fármaco-armazón en el tratamiento de sujetos humanos ha proporcionado poco éxito clínico hasta ahora. Por ejemplo, PK1 (copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HPMA) doxorrubicina; desarrollado por Pharmacia, Pfizer) mostró una gran actividad anticancerosa tanto en tumores sólidos como en leucemia en modelos murinos, y estaba bajo investigación clínica para indicaciones oncológicas. A pesar de que demostró una reducción significativa de la toxicidad inespecífica y una mejor farmacocinética en humanos, las mejoras en la eficacia contra el cáncer resultaron ser marginales en los pacientes y, como consecuencia, se interrumpió el desarrollo adicional de PK1.
[0010] El fracaso de los conjugados de armazón-fármaco de moléculas pequeñas se atribuye, al menos en parte, a su escasa acumulación en el sitio del tumor. Por ejemplo, mientras que en los modelos murinos PK1 mostró una acumulación de 45 a 250 veces mayor en el tumor que en tejidos sanos (hígado, riñón, pulmón, bazo y corazón), la acumulación en el tumor solo se observó en un pequeño subconjunto de pacientes en el ensayo clínico.
[0011] Una posible solución a los problemas mencionados antes es la aplicación de sistemas de nanopartículas para la administración de fármacos, como los liposomas. Los liposomas son vesículas en forma de esfera que constan de una o más bicapas de fosfolípidos, que se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se dispersan en agua. Las características de anfifilicidad de los fosfolípidos le otorgan las propiedades de autoensamblaje, características emulsionantes y humectantes, y estas propiedades pueden emplearse en el diseño de nuevos fármacos y nuevos sistemas de administración de fármacos. La encapsulación del fármaco en un sistema de administración liposomal puede aportar varias ventajas sobre una administración directa del fármaco, tales como una mejora y un control sobre la farmacocinética y farmacodinamia, la propiedad de direccionamiento tisular, la disminución de la toxicidad y la actividad mejorada del fármaco. Un ejemplo de tal éxito es la forma encapsulada en liposomas de un agente de quimioterapia de moléculas pequeñas, la doxorrubicina (Doxil: una forma de doxorrubicina encapsulada en liposomas pegilada; Myocet: una doxorrubicina liposomal no pegilada), que se han aprobado para uso clínico.
[0012] Gilabert-Oriol y col. (2015; Biochem. Pharmacol. 97 (3): 247-255.) describen la mejora de la eficacia de cetuximab, panitumumab y trastuzumab mediante la conjugación de estos anticuerpos con diantina y por aplicación conjunta de dichos conjugados y saponina SO1861.
[0013] Bhargava y col. (2017; Mol. One. 11: 1527-1543) describen una proteína de fusión de EGF y diantina que se combina con un triterpeno glicosilado potenciador del escape endosomal, SO1861, y describen que dicha combinación muestra una actividad antitumoral mejorada en un modelo de carcinoma de páncreas in vitro e in vivo.
[0014] Por lo tanto, todavía se necesita encontrar una solución que permita terapias con medicamentos tales como terapias antitumorales, aplicables para uso no sistémico cuando se desee, en las que el medicamento tenga, por ejemplo, un perfil de seguridad aceptable, poca actividad fuera de la diana, eficacia suficiente, tasa de aclaramiento suficientemente baja del cuerpo del paciente, etc.
RESUMEN
[0015] La presente invención se refiere a la mejora de los fármacos actuales que resultan ser menos eficaces de lo deseado cuando se administran a un paciente que los necesita. En particular, se encuentran los siguientes problemas:
- falta de especificidad, que se da cuando se administran compuestos de moléculas pequeñas terapéuticamente activos a un paciente humano que los necesita;
- especificidad no óptima para un factor biológico o proceso biológico que impulsa una enfermedad; - características de seguridad insuficientes de los fármacos actuales, cuando se administran a pacientes humanos que los necesitan;
- direccionamiento insuficiente de los fármacos a la célula enferma con poca o ninguna actividad fuera de la diana en células no enfermas, cuando se administran a pacientes humanos que los necesitan;
- modo de acción que no es en el momento adecuado (por ejemplo, la molécula farmacológica administrada debe alcanzar el sitio de actuación en el paciente humano dentro de un cierto período de tiempo y debe permanecer en el sitio de actuación durante un cierto período de tiempo), cuando se administran a pacientes humanos que los necesitan;
- actividad terapéutica de larga duración insuficiente en el cuerpo del paciente, cuando se administran a pacientes humanos que los necesitan.
[0016] La invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas, proporciona soluciones a uno o más de estos problemas.
[0017] En esencia, se ha descubierto que la captación de ciertos compuestos mejora si se coadministran con, o se unen a, una molécula que comprende una saponina unida a un resto que se dirige a las células, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
DEFINICIONES
[0018] El término "porción conectora" tiene su significado científico habitual, y en este documento se refiere a un resto químico o un tramo lineal de residuos de aminoácidos complejados a través de enlaces peptídicos, que une una molécula o un átomo a otra molécula, por ejemplo, a un ligando o una molécula efectora o un armazón. Normalmente, la porción conectora comprende una cadena de átomos unidos por enlaces químicos. En la presente memoria se puede usar cualquier molécula conectora o tecnología de unión conocida en la técnica. Cuando se indique, la porción conectora es una porción conectora para la unión covalente de moléculas a través de un grupo químico en dicha molécula adecuada para formar un enlace covalente o enlace con la porción conectora. La porción conectora puede ser una porción conectora no escindible, por ejemplo, la porción conectora es estable en condiciones fisiológicas. La porción conectora puede ser una porción conectora escindible, por ejemplo, una porción conectora que es escindible, en presencia de una enzima o en un rango o valor de pH particular, o en condiciones fisiológicas tales como condiciones intracelulares en los endosomas tales como los endosomas tardíos y los lisosomas de células de mamíferos tales como células humanas. Las porciones conectoras ejemplares que se pueden usar en el contexto de la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico (EMCH), 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo o éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (SPDP) y hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] piridinio (HATU).
[0019] El término "porción conectora trifuncional" tiene su significado científico habitual, y en este documento se refiere a una porción conectora que une tres moléculas mediante un grupo químico de cada una de las tres moléculas. El experto en la materia puede diseñar tales porciones conectoras trifuncionales, basándose en la presente memoria y en el conocimiento general común. Tal porción conectora trifuncional puede poseer, por ejemplo, un grupo maleimido que puede usarse para la conjugación con ligandos dirigidos que poseen grupos tiol para realizar una reacción tiol-eno. Además, la porción conectora trifuncional podría poseer un grupo dibenzociclooctina (DBCO) para realizar la denominada cicloadición azida-alquino promovida por la tensión anular (SPAAC, química clic) con una saponina portadora de azido. Finalmente, la porción conectora trifuncional podría obtener un tercer grupo funcional, como un grupo trans-cicloocteno (TCO), para realizar la llamada reacción de Diels-Alder de demanda inversa de electrones (IEDDA) con una molécula efectora portadora de tetrazina (Tz). El experto en la materia apreciará que los grupos químicos de la porción conectora trifuncional pueden ser los tres iguales o diferentes, o la porción conectora puede comprender dos de los mismos grupos químicos para unir una molécula a la porción conectora trifuncional. Los enlaces formados entre la porción conectora trifuncional pueden ser covalentes o no covalentes, y se prefieren los enlaces covalentes. Los enlaces formados entre la porción conectora trifuncional y una o dos o tres moléculas unidas a través de grupos químicos respectivos pueden ser enlaces escindibles (lábiles), como por ejemplo escindibles en condiciones ácidas dentro de células como endosomas y lisosomas de células de mamíferos, como células humanas, o pueden ser enlaces no escindibles. Por supuesto, la porción conectora trifuncional puede abarcar uno o dos grupos químicos para formar enlaces covalentes, mientras que los otros dos o uno o más grupos químicos, respectivamente, son para formar un enlace no covalente. Por supuesto, la porción conectora trifuncional puede abarcar uno o dos grupos químicos para formar enlaces escindibles, mientras que los otros dos o uno o más grupos químicos, respectivamente, son para formar un enlace no escindible.
[0020] El término "escindible", tal como se usa en el término "porción conectora escindible" o "enlace escindible" tiene su significado científico habitual, y en este documento se refiere a que se produce escisión en condiciones acidas, condiciones reductoras, condiciones enzimáticas o condiciones inducidas por la luz. Por ejemplo, un enlace escindible puede escindirse en condiciones ácidas, preferiblemente dicho enlace escindible puede escindirse in vivo en condiciones ácidas como las presentes en endosomas y/o lisosomas de células de mamíferos, preferiblemente células humanas, preferiblemente a un pH 4,0 - 6,5. y más preferiblemente a pH < 5,5. Como otro ejemplo, una porción conectora escindible puede someterse a escisión por una enzima, por ejemplo, por catepsina. Además, un ejemplo de enlace covalente que se puede escindir en condiciones reductoras es un puente disulfuro.
[0021] Los términos "oligómero" y "polímero”, en el contexto de un armazón oligomérico o polimérico, tienen su significado científico habitual. Un polímero en este documento se refiere a una sustancia que tiene una estructura molecular construida principal o completamente a partir de un gran número de unidades iguales o similares unidas entre sí; un oligómero en este documento se refiere a un polímero cuyas moléculas constan de relativamente pocas unidades repetidas. Por ejemplo, una estructura que comprende 5-10 o menos unidades iguales o similares puede denominarse estructura oligomérica, mientras que una estructura que comprende 10­ 50 unidades monoméricas o más puede denominarse estructura polimérica, mientras que una estructura de 10 unidades monoméricas puede denominarse oligomérica o polimérica.
[0022] El término "sitio de unión" tiene su significado científico habitual, y en este documento se refiere a una región o un epítopo de una molécula, por ejemplo, una proteína, ADN o ARN, a la que se puede unir otra molécula.
[0023] El término “armazón”, o scaffold, tiene su significado científico habitual, y en este documento se refiere a una matriz oligomérica o polimérica o un vehículo o una base (molécula de base o estructura de base), a la que una o más moléculas, por ejemplo, la molécula ligando, molécula efectora, se puede unir covalentemente, ya sea directamente o mediante una porción conectora, tal como una porción conectora escindible. Un armazón puede tener una formación ordenada estructuralmente, como un polímero, oligómero, dendrímero, polímero dendronizado u oligómero dendronizado o tener una estructura polimérica ensamblada, como un hidrogel, microgel, nanogel, micela polimérica estabilizada o liposoma, pero excluye las estructuras que están compuestas de ensamblajes no covalentes de monómeros, tales como mezclas de colesterol/fosfolípidos. Un armazón puede comprender una estructura polimérica u oligomérica, tal como poli u oligo(aminas), por ejemplo, polietilenimina y poli(amidoamina); o estructuras tales como polietilenglicol, poli u oligo(ésteres), tales como poli(lactidas), poli(lactamas), copolímeros de polilactida-co-glicólido; o poli(dextrina), poli u oligosacáridos, tales como ciclodextrina o polidextrosa; o estructuras tales como poli u oligoaminoácidos naturales y/o artificiales tales como poli-lisina o un péptido o una proteína, oligo o polímeros de ADN, polímeros de ARN estabilizados o polímeros de APN (ácido nucleico peptídico). Preferiblemente, las estructuras poliméricas u oligoméricas son biocompatibles, en donde biocompatible significa que la estructura polimérica u oligomérica no muestra toxicidad aguda o crónica sustancial en los organismos y puede ser excretada tal cual o completamente degradada en compuestos excretables y/o fisiológicos por el metabolismo del organismo.
[0024] El término "ligando" tiene su significado científico habitual, y en este documento se refiere a cualquier molécula o moléculas que pueden unirse selectivamente a una molécula de la superficie de la célula diana o a un receptor de la superficie de la célula diana que se exprese en las células diana, por ejemplo, que actúe en células cancerosas o actúe en células autoinmunes. El ligando puede unirse a un epítopo compuesto por receptores u otros antígenos en las células diana. Preferiblemente, los ligandos de unión a células son anticuerpos.
[0025] El término "anticuerpo”, como se usa en este documento, se usa en el sentido más amplio, que puede referirse a una inmunoglobulina (Ig) definida como una proteína que pertenece a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquier subclase de las mismas), o un fragmento de unión funcional o dominio de unión de una inmunoglobulina. En el contexto de la presente invención, un "fragmento de unión" o un "dominio de unión" de una inmunoglobulina se define como un fragmento o dominio de unión a antígenos u otro derivado de una inmunoglobulina que esencialmente mantiene la actividad de unión a antígenos de dicha inmunoglobulina de origen. Los fragmentos funcionales y los dominios funcionales son anticuerpos en el sentido de la presente invención incluso si su afinidad por el antígeno es menor que la de la inmunoglobulina de origen. Los "fragmentos y dominios funcionales" de acuerdo con la invención incluyen, entre otros, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fab, scFv, dsFv, anticuerpo de dominio único (sdAb), IgG monovalente, scFv-Fc, IgG reducida (rlgG), minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, proteínas de fusión Fc, nanocuerpos, dominios V variables como v Hh , Vh y otros tipos de fragmentos y dominios de inmunoglobulina que reconocen antígenos. Los fragmentos y dominios pueden diseñarse para minimizar o eliminar completamente las interacciones disulfuro intermoleculares que se producen entre los dominios CH1 y CL. Los fragmentos y dominios funcionales ofrecen la ventaja de una mayor penetración tumoral debido a su menor tamaño. Además, el fragmento o dominio funcional se puede distribuir con mayor uniformidad por toda la masa tumoral en comparación con la inmunoglobulina completa.
[0026] Los anticuerpos (inmunoglobulinas) de la presente invención pueden ser bifuncionales o multifuncionales. Por ejemplo, un anticuerpo bifuncional tiene un brazo que tiene especificidad por un receptor o antígeno, mientras que el otro brazo reconoce un receptor o antígeno diferente. Alternativamente, cada brazo del anticuerpo bifuncional puede tener especificidad por un epítopo diferente del mismo receptor o antígeno de la célula diana.
[0027] Los anticuerpos (inmunoglobulinas) de la presente invención pueden ser, entre otros, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos con superficie remodelada, anticuerpos antiidiotípicos, anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos híbridos de rata/ratón, anticuerpos de llama, anticuerpos solo de cadena pesada de llama, anticuerpos solo de cadena pesada y anticuerpos veterinarios. Preferiblemente, el anticuerpo (inmunoglobulina) de la presente invención es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos con superficie modificada, quiméricos, humanizados y completamente humanos también son más preferidos porque es menos probable que causen inmunogenicidad en humanos. Los anticuerpos del ADC de la presente invención preferiblemente se unen específicamente a un antígeno expresado en la superficie de una célula cancerosa, una célula autoinmune, una célula enferma, una célula aberrante, dejando esencialmente inalterada cualquier célula sana (por ejemplo, al no unirse a dicha célula normal, o al unirse en menor grado en número y/o afinidad a dicha célula sana).
[0028] Los anticuerpos específicos que pueden usarse para los ADC de la presente invención incluyen, entre otros, anticuerpos monoclonales anti-HER2 como trastuzumab y pertuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD20 como rituximab, ofatumumab, tositumomab e ibritumomab, anticuerpos monoclonales anti-CA125 como oregovomab, anticuerpos monoclonales anti-EpCAM (17-1A) como edrecolomab, anticuerpos monoclonales anti-EGFR como cetuximab, panitumumab y nimotuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD30 como brentuximab, anticuerpos monoclonales anti-CD33 como gemtuzumab y huMy9-6, anticuerpos monoclonales anti-integrina alfa-v beta-3 vascular como etaracizumab, anticuerpos monoclonales anti-CD52 como alemtuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD22 como epratuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CEA como labetuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD44v6 como bivatuzumab, anticuerpos monoclonales anti-FAP como sibrotuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD19 como huB4, anticuerpos monoclonales anti-CanAg como huC242, anticuerpos monoclonales anti-CD56 como huN901, anticuerpos monoclonales anti-CD38 como daratumumab, anticuerpos monoclonales anti-CA6 como DS6, anticuerpos monoclonales anti-IGF-IR como cixutumumab y 3B7, anticuerpos monoclonales anti-integrina como CNTO 95 y anticuerpos monoclonales antisindecano-1 como B-B4.
[0029] Cualesquiera otras moléculas distintas de los anticuerpos que se unen a un receptor celular o antígeno de una célula diana también puede usarse como ligando de unión celular para los conjugados ligando-fármaco de la presente invención y los ligandos provistos de saponina unida covalentemente según la invención. Estos ligandos incluyen, pero no se limitan a, proteínas, polipéptidos, péptidos, moléculas pequeñas. Algunos ejemplos de estos ligandos que no son anticuerpos son interferones (por ejemplo, IFN-a, lFN-p e IFN-y), transferrinas, lectinas, factores de crecimiento epidérmico (EGF) y dominios similares a EGF, péptidos liberadores de gastrina (GRP), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento transformantes (TGF), factor de crecimiento de vaccinia (VGF), insulina y factores de crecimiento afines a la insulina (IGF, por ejemplo, IGF-1 e IGF-2), otras hormonas adecuadas como las hormonas liberadoras de tirotropina (TRH), hormonas estimulantes de melanocitos (MSH), hormonas esteroides (por ejemplo, estrógenos y andrógenos), somatostatina, linfocinas (por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-4 e IL-6), factores estimulantes de colonias (CSF , por ejemplo, G-CSF, M-CSF y GM-CSF), bombesina, gastrina, Arg-Gly-Asp o RGD, aptámeros (por ejemplo, AS-1411, GBI-10, aptámeros de ARN contra la glicoproteína del VIH), moléculas pequeñas (por ejemplo, folato, anisamida, ácido fenilborónico), vitaminas (por ejemplo, vitamina D), carbohidratos (por ejemplo, ácido hialurónico, galactosa).
[0030] Una "molécula efectora" o "resto efector" o "carga útil" tiene su significado científico habitual y, en el contexto de esta invención, es cualquier sustancia que afecte al metabolismo de una célula mediante la interacción con una molécula efectora intracelular, en donde esta molécula efectora se dirige a cualquier molécula o estructura dentro de las células excluyendo la luz de los compartimentos y vesículas de la vía endocítica y de reciclaje, pero incluyendo las membranas de estos compartimentos y vesículas. Dichas estructuras dentro de las células incluyen, por tanto, el núcleo, las mitocondrias, los cloroplastos, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, otras vesículas de transporte, la parte interna de la membrana plasmática y el citosol.
[0031] La molécula o resto efector es una sustancia farmacéuticamente activa, tal como una toxina, tal como una toxina proteica, un fármaco, un polipéptido o un polinucleótido. Una sustancia farmacéuticamente activa en esta invención es una molécula o resto efector que se usa para lograr un resultado beneficioso en un organismo, preferiblemente un vertebrado, más preferiblemente un mamífero tal como sujetos no humanos o un ser/sujeto humano. Los beneficios incluyen el diagnóstico, pronóstico, tratamiento, cura y prevención (profilaxis) de enfermedades y/o síntomas y/o problemas de salud. La sustancia farmacéuticamente activa también puede provocar efectos secundarios no deseados y, en ocasiones, incluso perjudiciales (acontecimientos adversos como los observados durante los ensayos clínicos). En este caso, se deben sopesar los pros y los contras para decidir si la sustancia farmacéuticamente activa es adecuada en el caso particular. Si el efecto de la sustancia farmacéuticamente activa dentro de una célula es predominantemente beneficioso para el organismo en su conjunto, la célula se denomina célula diana. Si el efecto dentro de una célula es predominantemente dañino para el organismo en su conjunto, la célula se denomina célula no diana u off-target. En sistemas artificiales como cultivos celulares y biorreactores, las células diana y las células no diana dependen del propósito y las define el usuario. Los ejemplos de moléculas y restos efectores son un fármaco, una toxina, un polipéptido (tal como una enzima), un polinucleótido (incluidos polipéptidos y polinucleótidos que comprenden aminoácidos o ácidos nucleicos no naturales) y cualquier combinación de estos.
[0032] Una molécula efectora o resto efector que es un fármaco puede incluir, pero sin limitarse a, agentes anticancerososs, agentes antiinflamatorios y agentes antiinfecciosos (por ejemplo, antifúngicos, antibacterianos, antiparasitarios, antivirales). Preferiblemente, la molécula farmacológica de la presente invención es un agente anticanceroso o un agente antiautoinmune. Los agentes anticancerososs adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides antimitóticos de origen vegetal, antibióticos citotóxicos/antitumorales, inhibidores de la topoisomerasa, fotosensibilizadores e inhibidores de cinasas. También se incluyen en la definición de "agente anticanceroso": por ejemplo, (i) agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos; (ii) inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales; (iii) antiandrógenos; (iv) inhibidores de proteína cinasas; (v) inhibidores de lípido cinasas; (vi) oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante; (vii) ribozimas tales como inhibidores de la expresión de VEGF e inhibidores de la expresión de HER2; (viii) vacunas tales como vacunas de terapia génica; inhibidores de la topoisomerasa I; (ix) agentes antiangiogénicos; y sales, ácidos, solvatos y derivados aceptables desde el punto de vista farmacéutico de cualquiera de los anteriores.
[0033] Una molécula o resto efector que es una toxina puede incluir, pero no se limita a, toxinas proteicas (por ejemplo, toxinas derivadas de bacterias y toxinas derivadas de plantas), toxinas que se dirigen a los filamentos de tubulina, toxinas que se dirigen al a Dn , toxinas que se dirigen al ARN. Ejemplos de toxinas proteicas son saporina, diantina, ricina, modecina, abrina, volkensina, viscumina, toxina de Ahiga, toxina similar a Shiga, exotoxina de Pseudomonas (PE, también conocida como exotoxina A), toxina diftérica (DT) y toxina del cólera. Los ejemplos de toxinas dirigidas a filamentos de tubulina son maitansinoides (por ejemplo, DM1 y DM4), auristatinas (por ejemplo, monometil auristatina E (MMAE) y monometil auristatina F (MMAF)), toxoides, tubulisinas, criptoficinas, rizoxina. Ejemplos de toxinas dirigidas al ADN son las calicheamicinas: N-acetil-Y-calicheamicina, análogos de CC-1065, duocarmicinas, doxorrubicina, metotrexato, benzodiazepinas, análogos de camptotecina y antraciclinas. Ejemplos de toxinas dirigidas al ADN son amanitinas, espliceostatinas y tailanstatinas. Una toxina, como se usa en esta invención, se define como una sustancia farmacéuticamente activa que puede matar o inactivar una célula. Preferiblemente, una toxina dirigida es una toxina que solo es tóxica, o al menos predominantemente, para las células diana pero no para las células no diana. El efecto neto de la toxina dirigida es preferiblemente beneficioso para el organismo en su conjunto.
[0034] Una molécula o resto efector que es un polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido que recupera una función perdida, tal como, por ejemplo, sustitución de enzimas, funciones reguladoras de genes o una toxina. Ejemplos de polipéptidos como moléculas efectoras son, por ejemplo, Cas9; toxinas (por ejemplo, saporina, diantina, gelonina, (de) bouganina, agrostina, ricina (cadena de toxina A); proteína antiviral de hierba carmín, apoptina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas) enzimas metabólicas (por ejemplo, argininosuccinato liasa, argininosuccinato sintetasa), enzimas de la cascada de coagulación, enzimas reparadoras; enzimas para la señalización celular; factores de regulación del ciclo celular; factores reguladores de genes (factores de transcripción como NF-kB o represores de genes como el represor de metionina).
[0035] Una molécula efectora o un resto efector que es un polinucleótido puede ser, por ejemplo, un polinucleótido que comprende información codificante, tal como un gen o un marco de lectura abierto que codifica una proteína. También puede comprender información de regulación, por ejemplo, regiones de unión de elementos promotores o reguladores, o secuencias que codifican micro ARN. Dicho polinucleótido puede comprender ácidos nucleicos naturales y artificiales. Los ácidos nucleicos artificiales incluyen, por ejemplo, ácido peptídico nucleico (APN), morfolinos y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treosa nucleico (TNA). Cada uno de estos se distingue del ADN o ARN de origen natural por cambios en el esqueleto de la molécula. Ejemplos de nucleótidos como moléculas efectoras son, pero no se limitan a, por ejemplo, ADN: ADN monocatenario (por ejemplo, ADN para adenina fosforribosiltransferasa); ADN lineal bicatenario (por ejemplo, gen del factor IX de coagulación); ADN circular bicatenario (por ejemplo, plásmidos); ARN: ARNm (por ejemplo, nucleasas de moléculas efectoras de TAL), ARNt, ARNr, ARNip, miARN, Ar N antisentido; oligonucleótidos antisentido (ASO, AON, por ejemplo, APN, pMo, LNA y BNA).
[0036] El término “proteico”, usado por ejemplo, en "molécula proteica" y "toxina proteica”, se refiere a moléculas y toxinas que comprenden al menos una cadena de residuos de aminoácidos que se pueden obtener como un producto de expresión a partir de un solo ARNm. Dicha molécula o toxina puede comprender además cualquier modificación postraduccional, un carbohidrato tal como un carbohidrato con enlaces N u O, puentes disulfuro, fosforilaciones, sulfataciones, etc., como resultado de cualquier modificación postraduccional, y/o puede comprender además cualquier otra modificación, como las que resultan de modificaciones químicas (por ejemplo, unión de restos efectores, saponina, estructuras base, ligandos, etc., ya sea directamente a, por ejemplo, una cadena lateral de aminoácidos, o mediante al menos una porción conectora unida (covalentemente) a la molécula para modificar químicamente la molécula proteica, y unida químicamente (covalentemente) a la molécula proteica). El término “proteico” también abarca e incluye conjuntos de tales moléculas, por ejemplo, homodímeros, heterotrímeros, heterohexámeros o conjuntos complejos como los ribosomas.
[0037] Los términos "específico" y "específicamente", en el contexto de, por ejemplo, "unión específica" y "receptor o diana molecular presente o expresado específicamente en la superficie de una célula tumoral" y similares, tienen su significado científico normal conocido en la técnica, y en este documento se refieren, por ejemplo, a una interacción de unión de una primera molécula con una segunda molécula que se produce con una mayor afinidad con respecto a cualquier unión putativa de la primera molécula a una molécula adicional diferente de la segunda molécula, o por ejemplo, a la expresión o expresión en mayor medida cuando, por ejemplo, se tiene en cuanta el número de receptores o dianas moleculares de un receptor de la superficie celular o de una diana molecular de la superficie de un primer tipo de célula, como una célula tumoral, una célula autoinmune, una célula enferma, una célula aberrante, en relación con el grado de expresión del mismo receptor o diana molecular en un segundo tipo de célula, como una célula sana, etc., donde la expresión en el segundo tipo de célula puede estar completamente ausente o ser muy baja, en relación con cualquier grado de expresión en la célula tumoral, etc. Además, el término "específico", por ejemplo en "unión específica", tiene su significado científico normal conocido en la técnica, y en este documento tiene el significado de indicar una molécula que puede tener una interacción con otra molécula con mayor afinidad de unión que las interacciones de fondo entre moléculas. De manera similar, el término "especificidad" se refiere a una interacción, por ejemplo, entre dos moléculas o entre una célula y una molécula, que tiene una mayor afinidad de unión que las interacciones de fondo entre moléculas. Las moléculas de unión, como las inmunoglobulinas, se unen a través de su sitio de unión, como las regiones variables de inmunoglobulina de la inmunoglobulina, a los sitios de unión de las moléculas, como los epítopos, los receptores de la superficie celular, etc., con una mayor afinidad de unión que las interacciones de fondo entre moléculas. En el contexto de la invención, las interacciones de fondo son típicamente interacciones con una afinidad menor que una Kd de 10E-4 M. De manera similar, los "dominios de unión específicos" son dominios que se unen preferentemente a sitios de unión en moléculas, tales como epítopos, receptores de superficie celular, etc., con una mayor afinidad de unión que las interacciones de fondo entre moléculas. En el contexto de la invención, las "interacciones de fondo" son típicamente interacciones con una afinidad menor que una Kd de 10E-4 M. Preferiblemente, los dominios de unión específicos se unen con una afinidad mayor que una Kd de aproximadamente 10E-5 M.
[0038] El término "unión" se define como interacciones entre moléculas que pueden distinguirse de las interacciones de fondo.
[0039] En toda la especificación, el término "fragmento" se refiere a una secuencia de aminoácidos que forma parte de un dominio proteico o que forma un dominio proteico intacto. Los fragmentos de unión de acuerdo con la invención deben tener especificidad de unión para la diana respectiva, tal como un receptor de superficie celular, por ejemplo, en la superficie de una célula enferma, como una célula tumoral.
[0040] El término "ADC" o "conjugado anticuerpo-fármaco" tiene su significado científico habitual conocido por el experto, y en este documento se refiere a una clase de fármacos biofarmacéuticos diseñados como una terapia dirigida para tratar, por ejemplo, el cáncer. A diferencia de la quimioterapia, los ADC están destinados a atacar y destruir las células tumorales sin afectar a las células sanas. Los ADC están compuestos por un anticuerpo unido a una carga útil o fármaco citotóxico (anticanceroso) biológicamente activo. Los ADC combinan la capacidad de direccionamiento de los anticuerpos monoclonales con la capacidad de matar el cáncer de los fármacos citotóxicos. Están diseñados con la intención de discriminar entre células sanas y tejido enfermo, como las células tumorales de un tumor.
[0041] El término "Saponinum album" tiene su significado normal y, en este documento, se refiere a una mezcla de saponinas producida por Merck KGaA (Darmstadt, Alemania) que contiene saponinas de Gypsophila paniculata y Gypsophila arostii, que contiene SA1657 y principalmente SA1641.
[0042] El término "Quillaja saponina" tiene su significado normal y, en este documento, se refiere a la fracción de saponina de Quillaja saponaria y, por lo tanto, la fuente de todas las demás saponinas QS, que contienen principalmente QS-18 y Qs -21.
[0043] "QS-21" o "QS21" tiene su significado científico habitual y, en este documento, se refiere a una mezcla de QS-21 A-apio (-63 %), QS-21 A-xylo (-32 %), QS-21 B- apio (-3,3 %) y QS-21 B-xylo (-1,7 %).
[0044] De manera similar, "QS-21A" tiene su significado científico habitual y, en este documento, se refiere a una mezcla de QS-21 A-apio (-65 %) y QS-21 A-xylo (-35 %).
[0045] De manera similar, "QS-21B" tiene su significado científico habitual y, en este documento, se refiere a una mezcla de QS-21 B-apio (-65 %) y QS-21 B-xylo (-35 %).
[0046] El término "Quil-A" se refiere a un extracto de Quillaja saponaria semipurificado disponible comercialmente y que contiene cantidades variables de más de 50 saponinas distintas, muchas de las cuales incorporan la subestructura de triterpeno-trisacárido Gal-(1^2)-[Xyl-(1^-3)]-GlcA- en el grupo C-3beta-OH que se encuentra en QS-7, QS-17, QS18 y QS-21. Las saponinas que se encuentran en Quil-A se enumeran en van Setten (1995), Tabla 2 /Dirk C. van Setten, Gerrit van de Werken, Gijsbert Zomer y Gideon F. A. Kersten, Glycosyl Compositions and Structural Characteristics of the Potential Immunoadyuvant Active Saponins in the Quillaja saponaria Molina Extract Quil A, RAPID COMMUNICATIONS IN MASECTROMETRY, VOL. 9,660-666 (1995)]. Quil-A y también Quillaja saponina son fracciones de saponinas de Quillaja saponaria y ambas contienen una gran variedad de saponinas diferentes con contenido en gran parte superpuesto. Las dos fracciones difieren en su composición específica, ya que las dos fracciones se obtienen mediante diferentes procedimientos de purificación.
[0047] El término "QS1861" y el término "QS1862" se refieren a QS-7 y QS-7 api. QS1861 tiene una masa molecular de 1861 Dalton, QS1862 tiene una masa molecular de 1862 Dalton. QS1862 se describe en Fleck et al. (2019) en la Tabla 1, fila no. 28 [Juliane Deise Fleck, Andresa Heemann Betti, Francini Pereira da Silva, Eduardo Artur Troian, Cristina Olivaro, Fernando Ferreira y Simone Gasparin Verza, Saponins from Quillaja saponaria and Quillaja brasiliensis: Particular Chemical Characteristics and Biological Activities, Molecules 2019, 24, 171; doi:10.3390/molecules24010171]. La estructura descrita es la variante api QS1862 de QS-7. La masa molecular es de 1862 Dalton, ya que esta masa es la masa formal que incluye el protón en el ácido glucurónico. A pH neutro, la molécula se desprotona. Al realizar la medición en espectrometría de masas en modo de iones negativos, la masa medida es 1861 Dalton.
[0048] Los términos primero, segundo, tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Los términos son intercambiables en circunstancias apropiadas. Las formas de realización de la invención pueden funcionar en secuencias distintas a las descritas o ilustradas en el presente documento.
[0049] Además, las diversas formas de realización, aunque se denominen "preferidas" o vayan acompañadas de "por ejemplo, o "en particular”, deben interpretarse como formas ejemplares en las que se puede implementar la invención en lugar de limitar el alcance de la invención.
[0050] El término "que comprende", utilizado en las reivindicaciones, no debe interpretarse como restringido a los elementos o pasos enumerados a continuación; no excluye otros elementos o pasos. Debe interpretarse como una especificación de la presencia de las características, números enteros, pasos o componentes indicados a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, números enteros, pasos o componentes o grupos de los mismos. Por lo tanto, el alcance de la expresión "una composición farmacéutica que comprende A y B" no debe limitarse a una composición farmacéutica que consta únicamente de los componentes A y B, sino que, con respecto a la presente invención, los únicos componentes enumerados de la composición farmacéutica son A y B, y además, la reivindicación debe interpretarse en el sentido de que incluye equivalentes de esos componentes. De manera similar, el alcance de la expresión "un método que comprende el paso A y el paso B" no debe limitarse a un método que consta solo de los pasos A y B, sino que, con respecto a la presente invención, los únicos pasos enumerados del método son A y B, y además, la afirmación debe interpretarse en el sentido de que incluye equivalentes de esos pasos.
[0051] Además, la referencia a una característica con el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que estén presentes más de una de las características, como por ejemplo un componente, excipiente, saponina, etc., a menos que el contexto requiera claramente que haya una y solo una de las características. Por tanto, el artículo indefinido "un" o "una" normalmente significa "al menos uno/a”.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0052]
Figura 1. Estudio in vivo de Toxina proteica-anticuerpo + SO1861 sin conjugar. Ratones con tumor BT474 tratados con diversas concentraciones de trastuzumab-saporina (vía intravenosa) 1,5 mg/kg de SO1861 sin conjugar (inyección subcutánea 1 hora antes del tratamiento con trastuzumab-saporina).
Figura 2. Escape endosomal mediado por saponina sin conjugar y mejora de la destrución de las células diana. A) Análisis de viabilidad celular de células HeLa (EGFR+) tratadas con SO1861, SO1832, SO1862 (isómero de SO1861) o SO1904 con o sin EGFdiantina 1,5 pM. B) Análisis de viabilidad celular de células HeLa (EGFR+) tratadas con EGFdiantina y concentraciones fijas de SO1861, SO1832, SO1862 (isómero de SO1861) o SO1904. Los ejes y leyendas de A) y B) son los mismos. C) Análisis de viabilidad celular de células HeLa (EGFR+) tratadas con SO1861 o GE1741 con o sin EGFdiantina 1,5 pM. D) Análisis de viabilidad celular de células HeLa (EGFR+) tratadas con varias QSmix (mezcla de saponinas de Quillaia Saponaria) con o sin EGFdiantina 1,5 pM. Los ejes Y de C) y D) son iguales.
Figura 3. Actividad de SO1861 sin conjugar frente a SO1861-EMCH. Administración de oligonucleótidos de BNA antisentido dirigidos a EGFR y silenciamiento génico en células cancerosas, de acuerdo con la invención. A, B, C) Análisis de viabilidad celular de células A431 (EGFR++), HeLa (EGFR+) o A2058 (EGFR) tratadas con SO1861 o SO1861-EMCH con o sin 1,5 pM de EG diantina. D, E) Análisis de viabilidad celular de células A431 (EGFR++) o HeLa (EGFR+) tratadas con SO1861 o SO1861-N3 con o sin EGFdiantina 1,5 pM. Los ejes y leyendas de A), B), C), D) y E) son los mismos. Es decir, la leyenda de las Figuras 3A-C se muestra junto a la Figura 3C; la leyenda de la Figura 3D y 3E se muestra junto a la Figura 3E.
Figura 4. SO1861 sin conjugar frente a SO1861-EMCH (lábil) frente a SO1861-S (estable). Análisis de viabilidad celular de células HeLa (EGFR+) tratadas con SO1861, SO1861-S (S = HATU, porción conectora estable) y SO1861-EMCH (porción conectora lábil) con o sin EGFdiantina.
Figura 5. Administración de oligonucleótidos de BNA antisentido dirigidos a EGFR y silenciamiento génico. Análisis de expresión en ARNm de HSP27 en células A431 (EGFR++) y A2058 (EGFR) tratadas con cetuximab-(Cys-L-SO1861)39 o cetuximab-(Cys-L-SO1861)39 HSP27BNA 100 nM. Los ejes y la leyenda de A) y B) son los mismos, y la leyenda se muestra junto a la Figura 5B. El eje Y de C) y D) es el mismo. Figura 6. Administración de oligonucleótidos BNA antisentido dirigidos a tumores y silenciamiento génico en ratones con tumores. Ratones tratados con HSP27BNA cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 en ratones con tumores A431 revela un silenciamiento génico eficaz dirigido al tumor, en comparación con los controles. Figura 7. Actividad in vivo de 1T2C. La combinación 1T2C de 50 mg/kg de cetuximab-Cys-L-SO1861)4+ 25 mg/kg de cetuximab-(-L-HSP27BNA)4 en ratones con tumores A431 revela un fuerte silenciamiento génico dirigido al tumor, en comparación con los controles.
Figura 8. Actividad in vivo de 1T2C. La combinación 1T2C de 40 mg/kg de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 0,02/0,03 mg/kg de trastuzumab-saporina en un modelo de ratón con tumor PDX (alta expresión de HER2) muestra una inhibición eficaz del crecimiento tumoral.
Figura 9. 1T2C (1 diana 2 componentes). Destrucción celular dirigida a EGFR en células A431 (EGFR++) (A, C) y células CaSKi (EGFR+) (B, D) mediante una combinación terapéutica según la invención. A, B) Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 título concentración fija 10 pM de cetuximab-saporina y controles en células A431 (A) y CaSKi (B). C, D) Título de cetuximab-saporina concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861) 75 nM3,7 y controles en células A431 (C) y CaSKi (d ).
Figura 10. 1 diana 2 componentes. Destrucción celular dirigida por EGFR en células HeLa (EGFR+/-) (A, C) y células A2058 (EGFR-) (B, D) mediante una combinación terapéutica según la invención. A, B) Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 título concentración fija 10 pM de cetuximab-saporina y controles en células HeLa (A) y CaSKi (B). C, D) Título de cetuximab-saporina concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861) 75 nM3,7 y controles en células Hela (C) y A2058 (D).
Figura 11: 1 diana 2 componentes. Destrucción celular dirigida a HER2 en células SKBR3 (HER2++) (A, B) mediante una combinación terapéutica según la invención. A) Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 Título concentración fija 50 pM de trastuzumab-saporina y controles en células SKBR3. B) Título de trastuzumabsaporina concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 y controles en células SKBR3. Figura 12. 1 diana 2 componentes. Destrucción celular dirigida a HER2 en células JIMT-1 (HER2+/-) (A, C) y células MDA-MB-468 (HER2-) (B, D) mediante una combinación terapéutica según la invención. A, B) Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 Título concentración fija de trastuzumab-saporina 50 pM y controles en células JIMT-1 (A) y MDA-Mb-468 (B). C, D) Título de trastuzumab-saporina concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 y controles en células JIMT-1 (C) y m Da -MB-468 (D).
Figura 13: La cloroquina inhibe el sistema 1 diana 2 componentes. Destrucción celular dirigida a HER2 y EGFR en células SK-BR-3 (HER2++) y A431 (EGFR++), mediante una combinación terapéutica según la invención cloroquina. A) Título de trastuzumab-saporina concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 5 nM4 0,5 |jM de cloroquina y control en células SK-BR-3. B) Título de cetuximab-saporina concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861) 5 nM3,8 0,5 j M de cloroquina y control en células A431.
Figura 14: 1 diana 2 componentes. Silenciamiento génico dirigido a EGFr en células A431 (EGFR++) y células A2058 (EGFR-) mediante una combinación terapéutica según la invención. A, B) Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 Título concentración fija de cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA) 100 nM4 y control en células A431 (A) y células A2058 (B). C, D) Cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 Título concentración fija de 77 nM Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 y control en células A431 (C) y células A2058 (D).
Figura 15: 2 dianas 2 componentes. A) Destrucción de células dirigida a EGFR y HER2 en células MDA-MB-468 (EGFR++) y células HeLa (EGFR+/-) y destrucción de células dirigida a HER2 en células SK-BR-3 (HER2++) y células JIMT-1 (HER2+/-) mediante una combinación terapéutica según la invención. A) Cetuximab-Cys-(dendro (-L-SO1861)4)3,9 Título concentración fija 10 pM de cetuximab-saporina y controles en células MDA-MB-468 (a ) y células HeLa (B). C, D) Trastuzumab-(Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)4 Título concentración fija 50 pM de trastuzumab-saporina y controles en células SK-BR-3 (C) y células JIMT-1 (D).
Figura 16. 1 diana 2 componentes. Las células SK-BR-3 (HER2+/-) se pueden destruir eficazmente con la combinación terapéutica según la invención, Tratuzumab-saporina trastuzumab-2,5 nM (Cys-L-SO1861)4; sin embargo el título de T-DM1 trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 no es eficaz a concentraciones de toxinas tan bajas. T-DM1 es trastuzumab-emtansina (Kadcyla®), que transporta alrededor de 3,5 moléculas de toxina emtansina (DM1) por anticuerpo (DAR3,5).
Figura 17. 1 diana 2 componentes. Destrucción celular dirigida a EGFR en células A431 (EGFR++) (A) y células CaSKi (EGFR+) (B) y células A2058 (EGFR-) mediante una combinación terapéutica según la invención. A, B, C) Cetuximab-(Cys-L-QSmix)4'1 Título concentración fija 10 pM de cetuximab-saporina o 10 pM de cetuximab-diantina y controles en células A431 (A), células CaSKi (B) y células A2058 (C). QSmix es una mezcla de saponinas de un extracto de Quillaja Saponaria.
Figura 18: concepto 1 diana 2 componentes: mAb1-SO1861 + Toxina proteica mAbl. La SO1861 y la toxina (proteína inactivadora de ribosomas) se conjugan cada uno, independientemente, con un anticuerpo (mAb1) para su administración e internalización en las células diana. 1) mAb1-SO1861 y mAb1-toxina proteica se unen al receptor de la superficie celular, 2) ocurre endocitosis mediada por el receptor de ambos conjugados, 3) a pH endolisosómico bajo y concentración adecuada, SO1861 se activa para permitir el escape endolisosómico, 4) se produce la liberación de la toxina en el citoplasma y 5) la toxina induce la muerte celular.
Figura 19: concepto 1 diana 2 componentes: mAb1-SO1861 + mAb2-oligonucleótido de BNA. La SO1861 y el oligonucleótido de BNA antisentido se conjugan cada uno, independientemente, con un anticuerpo (mAb1) para la administración e internalización en las células diana. 1) mAb1-SO1861 y mAb1-oligonucleótido de BNA se unen al receptor de la superficie celular, 2) se produce endocitosis mediada por el receptor de ambos conjugados, 3) a pH endolisosómico bajo y concentración apropiada, SO1861 se activa para permitir el escape endolisosómico, 4) la liberación del oligonucleótido de BNA se produce en el citoplasma y 5) silenciamiento del gen diana.
Figura 20: 1 diana 2 componentes: mAb1-(armazón(-SO1861)n)n + Toxina proteica mAb1. Dendrón(-SO1861)n y la toxina proteica (proteína inactivadora de ribosomas) se conjugan cada uno, independientemente, con un anticuerpo (mAb1) para su administración e internalización en las células diana. 1) mAb1-dendrón(-SO1861)4 y mAb1-toxina proteica se unen al receptor de la superficie celular, 2) se produce la endocitosis mediada por el receptor de ambos conjugados, 3) a un pH endolisosómico bajo y una concentración adecuada, SO1861 se activa para permitir el escape endolisosómico, 4) se produce la liberación de la toxina en el citoplasma y 5) la toxina induce la muerte celular.
Figura 21: anticuerpo-(-L-SO1861)4 frente a anticuerpo-(-L-SO1861)2. Destrucción celular dirigida a HER2 y EGFR en células A431 (EGFR++) y SK-BR-3 (HER2++), mediante una combinación terapéutica según la invención A) cetuximab-(-L-SO1861)4 10 pM de cetuximab-saporina en comparación con cetuximab-(-L-SO1861)2 10 pM de cetuximab-saporina en células A431. B) Trastuzumab-(-L-SO1861)4 50 pM de trastuzumab-saporina en comparación con trastuzumab-(-L-SO1861)2 50 pM de trastuzumab-saporina en células SK-BR-3.
Figura 22: anticuerpo-(-L-SO1861)4 frente a anticuerpo-(-S-SO1861)4. Destrucción celular dirigida a HER2 en SK-BR-3 (HER2++), mediante una combinación terapéutica según la invención. B) Trastuzumab-(-L-SO1861)4 50 pM de trastuzumab-saporina en comparación con trastuzumab-(-S-SO1861)4 50 pM de trastuzumab-saporina en células SK-b R-3.
Figura 23. El sistema de 2 dianas 2 componentes evaluado en el modelo de ratones con tumores A431 revela la regresión del tumor.
Figura 24. El sistema de 2 dianas 2 componentes evaluado en el modelo de ratones con tumores A431 revela la regresión y erradicación del tumor.
Figura 25: 2 dianas 2 componentes. Destrucción celular dirigida a EGFR/HER2 en células A431 (EGFR++/ HER2+/-) (A, C) y células CaSKi (EGFR++/ HER2+/-) (B, D) mediante una combinación terapéutica según la invención. A, B) Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 Título concentración fija 50 pM de trastuzumab-saporina y controles en células A431. C, D) Título de trastuzumab-saporina concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861) 75 nM3,7 y controles en las células Caski. Los ejes y leyendas son los mismos para A) y B), y C) y D). Es decir, la leyenda de las Figuras 25A y B se muestra junto a la Figura 25B; la leyenda de la Figura 25C y 25D se muestra junto a la Figura 25D.
Figura 26.2 dianas 2 componentes. Destrucción celular dirigida a EGFR/HER2 en células HeLa (EGFR+/-/ HER2+/-) (A, C) y células A2058 (EGFR-/ HER2+/-) (B, D) mediante una combinación terapéutica según la invención. A, B) Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 Título concentración fija 50 pM de trastuzumab-saporina y controles en células HeLa. C, D) Título de trastuzumab-saporina concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861) 75 nM3,7 y controles en células A2058. Los ejes y leyendas son los mismos para A) y B). Es decir, la leyenda de las Figuras 26A y B se muestra junto a la Figura 26B.
Figura 27: 2 dianas 2 componentes. Destrucción celular dirigida a HER2/EGFR en células SKBR3 (HER2++/ EGFR+/-) (A, B) mediante una combinación terapéutica según la invención. A Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 Título concentración fija 1,5 pM de EGFdiantina y controles en células SKBR3. B) Título de EGFdiantina concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 y controles en células SKBR3.
Figura 28.2 dianas 2 componentes. Destrucción celular dirigida a HER2/EGFR en células JIMT-1 (HER2+/-EGFR+/-) (A, C) y células MDA-MB-468 (HER2-/ EGFR++) (B, D) mediante una combinación terapéutica según la invención. A, B) Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 Título concentración fija 1,5 pM EGFdiantina y controles en células JIMT-1. C, D) Título de EGFdiantina concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 y controles en células MDA-MB-468. Los ejes y leyendas son los mismos para A) y B), y C) y D). Es decir, la leyenda de las Figuras 28A y B se muestra junto a la Figura 28B; la leyenda de la Figura 28C y 28D se muestra junto a la Figura 28D.
Figura 29: 2 dianas 2 componentes. Destrucción celular dirigida a HER2/EGFR en células SKBR3 (HER2++/ EGFR+/-) (A, B) mediante una combinación terapéutica según la invención. A) Trastuzumab-(Cys-L SO1861)4 Título concentración fija 10 pM de cetuximab-saporina y controles en células SKBR3. B) Título de cetuximab-saporina concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 y controles en células SKBR3.
Figura 30.2 dianas 2 componentes. Destrucción celular dirigida a HER2/EGFR en células JIMT-1 (HER2+/-EGFR+/-) (A, C) y células MDA-MB-468 (HER2-/ EGFR++) (B, D) mediante una combinación terapéutica según la invención. A, B) Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 Título concentración fija 10 pM de cetuximabsaporina y controles en células JIMT-1. C, D) Título de cetuximab-saporina concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 y controles en células MDA-MB-468. Los ejes y leyendas son los mismos para A) y B), y C) y D). Es decir, la leyenda de las Figuras 30A y B se muestra junto a la Figura 30B; la leyenda de la Figura 30C y 30D se muestra junto a la Figura 30D.
Figura 31: La cloroquina inhibe el sistema 2 dianas 2 componentes. Destrucción celular dirigida a EGFR/HER2, EGFR/CD71 o HER2/CD71 en células A431 (EGFR++/ HER2+-/ CD71+) (A, B), células MDA-MB-468 (EGFR++/ HER2-/CD71+) (C) o SK-BR-3 (HER2++/ EGFR+/-/ CD71+) (D) mediante una combinación terapéutica según la invención cloroquina. A) Título de trastuzumab-diantina o trastuzumab-saporina concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861) 75 nM3,9 800 nM de cloroquina y controles en células A431. B) Título de CD71mab-saporina concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 10,5 nM cloroquina 500 nM y control en células A431. C) Título de CD71mab-saporina concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,910,5 nM cloroquina 500 nM y control en células MDA-MB-468. D) Título de CD71mab-saporina concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 5 nM3,9 cloroquina 500 nM y control en células SK-BR-3.
Figura 32: 2 dianas 2 componentes. Silenciamiento génico dirigido a EGFR/HER2 en células A431 (EGFR++/ HER2+/-) (A) y células A2058 (EGFR-/ HER2+/-) (B) mediante una combinación terapéutica según la invención. A) Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 Título concentración fija de trastuzumab-(Lys-L-HSP27BNA) 100 nM4,4 y control en células A431 (A) y células A2058 (B). C, D) Trastuzumab-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 Título concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861) 77 nM3,9 y controles en células A431 (A) y células A2058 (B). Los ejes y leyendas son los mismos para A) y B), y C) y D). Es decir, la leyenda de las Figuras 32A y B se muestra junto a la Figura 32B; la leyenda de la Figura 32C y 32D se muestra junto a la Figura 32D.
Figura 33: 2 dianas 2 componentes. A) destrucción celular dirigida a EGFR/CD71 o HER2/CD71 en células MDA-MB-468 (EGFR++/ CD71+) (A) Células HeLa (EGFR+/-/ CD71+), células SK-BR-3 (HER2++/ CD71+) (B) y células JIMT-1 (HER2+/-/ CD71+) mediante una combinación terapéutica según la invención. A) Cetuximab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)3,9 Título concentración fija 10 pM mab-saporina CD71 y controles en células MdA-MB-468. B) A) Cetuximab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)3,9 Título concentración fija CD71mab-saporina 10pM y controles en células HeLa. C) Trastuzumab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)4 Título concentración fija CD71mab-saporina 10pM y controles en células SK-BR-3. D) Trastuzumab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)4 Título concentración fija CD71mab-saporina 10pM y controles en células JIMT-1.
Figura 34. 2 dianas 2 componentes frente a T-DM1. Las células A431 (EGFR++/ HER2+/-) se pueden eliminar eficazmente con la combinación terapéutica según la invención, Tratuzumab-saporina cetuximab-75 nM (Cys-L-SO1861)3,9; sin embargo, el título de T-DM1 cetuximab-(Cys-L-SO1861) 75 nM3,9 no es eficaz a concentraciones de toxinas tan bajas. T-DM1 es trastuzumab-emtansina (Kadcyla®), que transporta alrededor de 3,5 moléculas de toxina de emtansina (DM1) por anticuerpo.
Figura 35: Tratamientos de control en todas las líneas celulares. A-D) Viabilidad celular cuando trastuzumab (A), cetuximab (B), T-DM1, (C) toxinas libres: saporina y diantina (D) o saporina acoplada a una IgG (D) que no se une a las células se tratan con las líneas celulares indicadas SK-b R-3, JIMT-1, MDA-MB-468, A431, CaSki, HeLa, A2058, BT-474.
Figura 36. 2 dianas 2 componentes. Destrucción celular dirigida a EGFR/CD71 y EGFR/HER2 en células A431 (EGFR+++/ HER2+/‘) (A) y células CaSKi (EGFR++/ HER2+-) (B) y células A2058 (EGFR-/ HER2+/‘) mediante una combinación terapéutica según la invención. A, B, C) Cetuximab-(Cys-L-QSmix)4,1 Título concentración fija 10 pM de trastuzumab-saporina o CD71mab-saporina 10pM y controles en células A431 (A). Células CaSKi (B) y células A2058 (C). QSmix es una mezcla de saponinas de un extracto de Quillaja Saponaria. La leyenda de las Figuras 36A y 36B se muestra junto a la Figura 36B.
Figura 37: 2 dianas 2 componentes: mAb1-SO1861 + MAb2-toxina proteica. La SO1861 y la toxina (proteína inactivadora de ribosomas) se conjugan cada uno, por separado, con un anticuerpo (mAb) para su administración e internalización en las células diana. 1) mAb1-SO1861 y mAb2-toxina proteica se unen a su correspondiente receptor de superficie celular, 2) ocurre endocitosis mediada por receptor de ambos conjugados, 3) a pH endolisosómico bajo y concentración adecuada, SO1861 se activa para permitir el escape endolisosómico, 2) se produce liberación de toxina en el citoplasma y 5) la toxina induce la muerte celular.
Figura 38: 2 dianas 2 componentes: mAb1-SO1861 + mAb2-oligonucleótido de BNA. La SO1861 y el oligonucleótido de BNA antisentido se conjugan cada uno, por separado, con un anticuerpo (mAb) para la administración y la internalización en las células diana. 1) mAb1-SO1861 y mAb2-oligonucleótido de BNA se unen a su correspondiente receptor de superficie celular, 2) se produce endocitosis mediada por receptor de ambos conjugados, 3) a pH endolisosómico bajo y concentración adecuada, SO1861 se activa para permitir el escape endolisosómico, 2) se produce liberación de oligonucleótido de BNA en el citoplasma y 5) silenciamiento del gen diana.
Figura 39: 2 dianas 2 componentes: mAb1-(armazón(-SO1861)n)n + MAb2-toxina proteica. Dendrón(-SO1861)n y la toxina proteica (proteína inactivadora de ribosomas) se conjugan cada uno, por separado, con un anticuerpo (mAb) para su administración e intemalización en las células diana. 1) mAb1-(dendrón(-SO1861)4)1) y mAb2-toxina proteica se unen a su receptor de superficie celular correspondiente, 2) se produce endocitosis mediada por el receptor de ambos conjugados, 3) a pH endolisosómico bajo y concentración adecuada, SO1861 se activa para permitir el escape endolisosómico, 2) se produce liberación de toxina en el citoplasma y 5) la toxina induce la muerte celular.
Figura 40. La administración de la toxina proteica dirigida al tumor da como resultado la reducción del volumen del tumor y la inhibición del crecimiento del tumor, en ratones con tumores. A) El aumento progresivo de la dosis (intraperitoneal, i.p.) de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-diantina)2 en ratones con tumores A431 revela una reducción del volumen del tumor, en comparación con el control. B, C) El aumento progresivo de la dosis (por vía intraperitoneal, i.p., (B) o intravenosa i.v. (C)) de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2 en ratones con tumores A431 revela una reducción del crecimiento tumoral, en comparación con los controles.
Figura 41. Silenciamiento génico y administración de oligonucleótidos de BNA antisentido dirigidos a tumores en ratones con tumores. 30 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8 en ratones con tumores A431 revela que se induce un silenciamiento génico eficaz dirigido al tumor, en comparación con los controles.
Figura 42. Silenciamiento génico y administración de oligonucleótidos de BNA antisentido dirigidos a tumores en ratones con tumores. 30 mg/kg de cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 en ratones con tumores A431 revela que se induce un silenciamiento génico eficaz dirigido al tumor, en comparación con los controles.
Figura 43: Administración de toxinas proteicas dirigidas a HER2 o EGFR y destrucción celular en células cancerosas, según la invención. A, B) Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-diantina)1,7 o Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-diantina)1,7 tratamiento y controles en células Sk-BR-3 (HEr2++) y células MDA-m B-468 (He R2-). C, D) Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-diantina)1,7 o Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-diantina)1,7 tratamiento y controles en células A431 (EGFR++) y células A2058 (EGFR-). Las Figuras 43A y B tienen la misma leyenda, descrita junto a la Figura 43B. La Figura 43C y D tienen la misma leyenda, que se describe junto a la Figura 43D.
Figura 44: Administración de oligonucleótidos de BNA antisentido dirigidos a EGFR y silenciamiento génico en células cancerosas, de acuerdo con la invención. A, B) Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)1,7 tratamiento y controles en células A431 (EGFR++) y células A2058 (eGf R-). Las Figuras 44A y B tienen la misma leyenda, descrita junto a la Figura 44B.
Figura 45: Administración de oligonucleótidos de BNA antisentido dirigidos a HER2 y silenciamiento génico, de acuerdo con la invención. Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,5 tratamiento y controles en células SK-BR-3 (HER2++).
Figura 46: Administración de oligonucleótidos de BNA antisentido dirigidos a EGFR y silenciamiento génico en células cancerosas, de acuerdo con la invención. A, B) Cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 tratamiento y controles en células A431 (EGf R++) y células A2058 (EGFR-). Figura 47: concepto (S)n-(L)(E): mAb-(SO1861)n(toxina proteica)n. Tanto la SO1861 en los residuos de cisteína (Cys) como la toxina proteica (proteína inactivadora de ribosomas) en los residuos de lisina se conjugan con el mismo anticuerpo (mAb) para su administración e internalización en las células diana. 1) mAb-(Cys-L-SO1861)4(Toxina proteica lys)2 se une a su receptor de superficie celular correspondiente, 2) se produce endocitosis mediada por receptor del conjugado, 3) a pH endolisosómico bajo y concentración apropiada, SO1861 se vuelve activa para permitir el escape endolisosómico, 2) se produce liberación de toxina en el citoplasma y 5) la toxina induce la muerte celular.
Figura 48: concepto (S)n-(L)(E): mAb-(SO1861)n(oligonucleótido de BNA antisentido)n. Tanto SO1861 en los residuos de cisteína (Cys) como el oligonucleótido de BNA antisentido en los residuos de lisina se conjugan con el mismo anticuerpo (mAb) para la administración e internalización en las células diana. 1) mAb-(Cys-SO1861)4(Lys-oligonucleótido de BNA)2 se une a su receptor de superficie celular correspondiente, 2) se produce endocitosis mediada por receptor de ambos conjugados, 3) a pH endolisosómico bajo y concentración adecuada, SO1861 se activa para permitir el escape endolisosómico, 4) se produce la liberación de oligonucleótido de BNA en el citoplasma y 5) se induce el silenciamiento dirigido de genes.
Figura 49: concepto (S)n-(L)(E): mAb-(SO1861-armazón-oligonucleótido de BNA antisentido)". (SO1861-porción conectora trifuncional-oligonucleótido de BNA)n se conjuga con un anticuerpo (mAb) para su administración e internalización en las células diana. 1) mAb-(SO1861-porción conectora trifuncionaloligonucleótido de BNA)4 se une a su receptor de superficie celular correspondiente, 2) se produce endocitosis mediada por receptor de ambos conjugados, 3) a pH endolisosómico bajo y concentración apropiada, SO1861 se activa para permitir el escape endolisosómico, 4) se produce la liberación de oligonucleótido de BNA en el citoplasma y 5) se induce el silenciamiento dirigido de genes.
Figura 50. Procedimiento de conjugación de anticuerpo-SO1861. Se muestra la reacción de acoplamiento de la unión de cuatro porciones de una saponina SO1861 de origen vegetal a las cuatro cisteínas de la cadena ligera de un anticuerpo. Primero, los puentes disulfuro de la IgG se rompen bajo la influencia de la exposición a TCEP (Tris (2-carboxietil)fosfina); en segundo lugar, la saponina SO1861, que comprende una porción conectora química unida a ella, se añade junto con ácido trifluoroacético, y cuatro porciones de saponina se unen a la IgG. Para producir saponinas escindibles "listas para conjugar", el grupo aldehido de SO1861 se hizo reaccionar con una porción conectora EMCH (hidrazida de ácido £-maleimidocaproico). El grupo hidrazida de EMCH forma un enlace hidrazona escindible en medio ácido con el aldehido de SO1861. Al mismo tiempo, la porción conectora EMCH presenta un grupo maleimida que reacciona con tiol (grupo sulfhidrilo) y, por lo tanto, puede conjugarse con tioles de la IgG, es decir, el ligando. Con esto, se proporciona un conjugado de la invención que mejora el escape endosomal y/o se proporciona una primera molécula de unión de la invención.
Figura 51. Síntesis de SO1861-EMCH
Figura 52 Síntesis de dendrón-(-L-SO1861)4
Figura 53. Síntesis de dendrón-(-L-SO1861)8
Figura 54. Síntesis de SO181-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA
Figura 55. Síntesis de HSP27BNA-dendrón-(-L-SO1861)4
Figura 56. Síntesis de dendrón(NEM)4
Figura 57: Precursor de armazón con cuatro grupos amino para la unión de saponina y un grupo azida para la química clic.
Figura 58: Evidencia del acoplamiento de saponinas al modelo de armazón. El gráfico complementario muestra los picos teóricamente esperados y la distribución de intensidad para las saponinas acopladas. Los datos experimentales obtenidos por LC-MS/ESI-MS muestran casi exactamente los mismos picos en m/z 758-760 Da, lo que demuestra un acoplamiento exitoso de las saponinas.
Figura 59: Ensayos de citotoxicidad utilizando la toxina diantina-factor de crecimiento epidérmico (diantina-EGF) dirigida. Las células sin tratar se normalizaron a 1. La estructura polimérica (Pentrimer) no tiene influencia sobre la viabilidad celular ni en presencia ni en ausencia de Diantina-EGF y saponina (SA1641), lo que indica que no hay citotoxicidad intrínseca de la estructura polimérica. La toxina dirigida que se puede hacer reaccionar por química clic (Diantina-EGF-alquino) tiene una actividad notablemente reducida, que es el resultado de la modificación de la toxina, pero no tiene ninguna relación con el armazón. La estructura polimérica funcionalizada tiene la misma actividad que la toxina dirigida sin reacción de química clic, lo que indica que la funcionalización del armazón no altera la actividad de la molécula efectora. El efecto de las saponinas es idéntico en presencia y ausencia de la estructura polimérica, lo que demuestra que la estructura polimérica no altera la eficacia de las saponinas en el sistema de dos componentes.
Figura 60: Espectro de RMN H de (A) SO1861 y (B) SO1861-EMCH (EMCH = hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico). (A) El pico a 9,43 ppm (Ha) corresponde al protón aldehído de SO1861. (B) El pico a 6,79 ppm (HC) corresponde a los protones maleimida de SO1861-EMCH, mientras que el pico a 7,68 ppm (HB) corresponde al protón de hidrazona. La ausencia de la señal a 9,43 ppm indica una conversión cuantitativa del grupo aldehído.
Figura 61: (A) Espectro MALDI-TOF-MS de SO1861-EMCH y (B) SO1861-EMCH-mercaptoetanol. (A) Modo RP: m/z 2124 Da ([M K]+, saponina-EMCH), m/z 2109 Da ([M K]+, SO1861-EMCH), m/z 2094 Da ([M Na]+, SO1861-EMCH). (B) Modo RP: m/z 2193 Da ([M K]+, saponina-EMCH-mercaptoetanol), m/z 2185 Da ([M K]+, SO1861-EMCH-mercaptoetanol), m/z 2170 Da ([M Na]+, SO1861-EMCH-mercaptoetanol).
Figura 62: Estructura de SO1861 con grupos químicos resaltados para la conjugación del escape endosomal que mejora las saponinas en una estructura polimérica. Los grupos resaltados son aldehído (círculo negro), ácido carboxílico (círculo de puntos), alqueno (pentágono de puntos) y alcohol (cuadrado de puntos). El grupo aldehído (flecha) es el grupo más adecuado para reacciones de conjugación quimioselectiva y reversible.
Figura 63: Estrategia para producir saponinas potenciadoras del escape endosomal (A) estables y (B) escindibles 'listas para conjugar'.
Figura 64: Hidrólisis del enlace hidrazona de SO1861-EMCH en condiciones ácidas.
Figura 65: Estructura SO1861-EMCH. (A) Estructura molecular estándar y (B) Modelo 3D. El grupo de maleimida está marcado con un círculo.
Figura 66: (A) Esquema de síntesis SO1861-EMCH. (B) Espectros MALDI-TOF-MS de SO1861 (m/z 1861 Da) y (C) SO1861-EMCH (m/z 2068 Da) en modo reflector negativo. TFA: ácido trifluoroacético, t.a.: temperatura ambiente, h: horas y pM: peso molecular.
Figura 67: Espectros MALDI-TOF-MS de SO1861-EMCH (A) antes y (B) después de la hidrólisis en solución de HCl a pH 3.
Figura 68: Esquema de reacción de la conjugación de SO1861-EMCH a cualquier estructura polimérica que contenga amina.
Figura 69: Espectros MALDI-TOF-MS de (A) BSA-SO1861 (m/z 70,0 kDa, 72,1 kDa, 74,2 kDa) y (B) BSA (m/z 66.6 kDa).
Figura 70: Esquema de reacción de la conjugación de (A) SO1861-EMCH y (B) SO1861-HATU (HATU = hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] piridinio) con un dendrímero G5 de poliamidoamina (PAMAM) marcado con colorante de cianina 3.
Figura 71: Espectros MALDI-TOF-MS de (A) Cy3-PAMAM, (B-D) Cy3-PAMAM-SO1861 con equivalentes de adición SO1861-EMCH crecientes desde (B) hasta la parte inferior (D). (B) corresponde a Cy3-PAMAM-SO1861 con 5 SO1861 unidos por PAMa M, (C) corresponde a Cy3-PAMAM-SO1861 con 13 SO1861 unidos por PAMAM, y (D) corresponde a Cy3-PAMAM-SO1861 con 51 SO1861 unidos por PAMAM.
Figura 72: Los espectros MALDI-TOF-MS de (A) Cy3-PAMAM-SO1861 con 5 equivalentes de adición de SO1861-EMCH y (B) Cy3-PAMAM-SO1861 con 30 equivalentes de adición de SO1861-EMCH.
Figura 73: Espectros MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 (NC = enlace estable ("no escindible").
Figura 74: (A) Esquema de reacción y espectros MALDI-TOF-Ms de (B) Cy3-PAMAM-NC-SO1861-Dibenzociclooctina (DBCO), (C) Cy3-PAMAM-(SO1861)5-DBCO y (D) Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO. Figura 75: Esquema de reacción de (A) diantina-EGF-Alexa488 y (B) diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3. Espectros MALDI-TOF-MS de (C) diantina-EGF, (D) diantina-EGF-Alexa488 y (E) diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3; Alexa488: tinte Alexa Fluor 488.
Figura 76: Esquema de reacción de (A) diantina-Alexa488 y (B) diantina-Alexa488-SS-PEG-N3. Espectros MALDI-TOF-MS de (C) diantina, (D) diantina-Alexa488 y (E) diantina-Alexa488-SS-PEG-N3; Alexa488: tinte Alexa Fluor 488.
Figura 77: Imágenes de fluorescencia de gel SDS-PAGE realizadas en un sistema de imágenes VersaDoc. M = marcador, P = Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO, D = diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3, C1 = Cy3-PAMAM-(SO1861)s-Diantina-EGF-Alexa488, C2 = Cy3-PAMAM-NC-SO1861-Diantina-EGF-Alexa488 y C3 = Cy3-PAMAM-(SO1861 )27-Diantina-EGF-Alexa488.
Figura 78: (A) Esquema de síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 mediante aminación reductora. (B y C) Espectros de MALDi-TOF-MS respectivos.
Figura 79: Esquema de reacción para la generación de poli(SO1861) utilizando SO1861-EMCH como monómero, el sistema APS/TMEDA como iniciador de polimerización y aminopropanotiol como atenuador de radicales.
Figura 80: Espectros MALDI-TOF-MS de lotes de reacción de poli(SO1861). (A) SO1861-EMCH a 60 °C, (B) SO1861-EMCH 11‘3 equivalentes de APS a 60 °C, (C) SO1861-EMCH 11‘3 equivalentes de APS/TMEDA a 60 °C.
Figura 81: Enfoque del ADN. Uso del principio de origami de ADN para generar un armazón basado en ADN que es capaz de conjugar y liberar moléculas de glucósidos. Además, una de las cadenas de ADN obtiene un resto de química clic que se puede usar para conjugar con una toxina dirigida para formar un armazón funcionalizado. bp: par de bases.
Figura 82: Enfoque de poli(péptido-SO1861). Uso de una secuencia de péptidos que puede conjugar y liberar moléculas de glucósidos y que puede reaccionar consigo misma para formar una construcción poli(péptido-SO1861). Las terminaciones de la cadena de poli(péptido) se pueden modificar adicionalmente con restos de química clic (por ejemplo, porción conectora BCN-NHS) que se pueden usar para la conjugación con una toxina.
Figura 83. Espectros MALDI-TOF-MS de (A) péptido nativo, (B) péptido-conjugado S01861.
Figura 84. Estructura molecular de dendrón G4 con grupos amino protegidos.
Figura 85. Esquema de síntesis para la generación de armazones basados en dendrones y armazones funcionales.
Figura 86. (A) Esquema de reacción para el marcaje parcial con colorante y la desprotección del dendrón G4. (B) Espectro MALDI-TOF-MS del dendrón G4 desprotegido y parcialmente marcado con colorante. Figura 87. Espectros MALDI-TOF-MS de armazones dendrón G4-SO1861 con (A) 22 equivalentes de SO1861-EMCH, (B) 10 equivalentes de SO1861-EMCH y (C) 3 equivalentes de SO1861-EMCH.
Figura 88. Curvas de viabilidad celular de células HeLa tratadas con (A) Expresión del EGFR en la superficie celular determinada por análisis FACS de células HeLa (B, véase la Tabla 19), viabilidad celular de células HeLa tratadas con SO1861 diantina-EGF (Dia-EGF), SO1861 diantina-EGF 500 nM cloroquina, SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM, SO1861 diantina-EGF 667 nM dendrón (C) viabilidad celular de células HeLa tratadas con SO1861 diantina-EGF, SO1861 diantina-EGF cloroquina 500 nM, SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM, SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(SH)16, SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(SH)65, SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(SH)108 (D) viabilidad celular de las células HeLa tratadas con SO1861 diantina-EGF, SO1861 diantina-EGF 500 nM cloroquina, SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM, SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(mPEG)s, SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(mPEG)s, SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(mPEG)18.
Figura 89. (A) Esquema de reacción de la tiolación de PAMAM usando el reactivo de tiolación 2-iminotiolano. Espectros MALDI-TOF-MS de (B) PAMAM nativa, (C) PAMAM-(SH)16 tiolada, (D) PAMAM-(SH)65 tiolada y (E) PAMAM-(SH)«)8 tiolada.
Figura 90. (A) Esquema de reacción de la PEGilación de PAMAM utilizando el reactivo de PEGilación mPEG2k-NHS. Espectros MALDI-TOF-MS de (B) PAMAM nativa, (C) PAMAM-(mPEG2k)s PEGilada, (D) PAMAM-(mPEG2k)8 PEGilada y (E) PAMAM-(MPEG2k)18 PEGilada.
Figura 91: Armazón básico con función de química clic para unir cualquier molécula efectora deseada. El usuario determina la posición de la posición de química clic en la molécula efectora y todas las propiedades adicionales de la molécula efectora, por ejemplo, la elección y posición de un ligando opcional.
Figura 92: Armazón funcionalizado con molécula efectora unida previamente y función de química clic para unir cualquier ligando deseado. Opcionalmente, se puede proporcionar un enlace sensible al pH para liberar la molécula efectora del armazón después de alcanzar los endosomas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0053] La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos.
[0054] Para que una molécula bioactiva funcione, la molécula debe poder interactuar con su diana, por ejemplo, en el suero sanguíneo, en el exterior de la superficie celular o dentro de una célula o un orgánulo. La fracción activa de casi todas las toxinas dirigidas con base proteica, por ejemplo, debe entrar en el citosol de la célula diana para mediar su efecto modulador de la diana. En muchas constelaciones, la toxina sigue siendo ineficaz ya que (1) la porción de direccionamiento está poco internalizada y permanece unida al exterior de las células, (2) se recicla de nuevo en la superficie celular después de la internalización o (3) se transporta a los endolisosomas, donde se degrada. Aunque estos problemas fundamentales se conocen desde hace décadas y se han investigado más de 500 toxinas dirigidas en las últimas décadas, los problemas aún no se han resuelto y, hasta la fecha, solo una toxina proteica dirigida a anticuerpos, moxetumomab pasudotox-tdfk (LUMOXITI®, AstraZeneca Pharmaceuticals LP), ha sido aprobada por la FDA para la leucemia de células pilosas en recaída o refractaria.
[0055] Para superar estos problemas, se han descrito muchas estrategias que incluyen enfoques para redirigir las toxinas a los complejos de transporte de la membrana celular endógena de la vía biosintética en el retículo endoplásmico y técnicas para interrumpir o debilitar la integridad de la membrana de los endosomas, es decir, los compartimentos de la vía endocítica en una célula, facilitando así el escape endosomal. Esto comprende el uso de aminas lisosomotrópicas, ionóforos carboxílicos, antagonistas de los canales de calcio, diversos péptidos de penetración celular de origen viral, bacteriano, vegetal, animal, humano y sintético, otras moléculas orgánicas y técnicas inducidas por luz. Aunque la eficacia de las toxinas dirigidas se suele incrementar en cultivo celular cien o mil veces o, en casos excepcionales, más de un millón de veces, el requisito de coadministrar potenciadores del escape endosomal con otras sustancias conlleva nuevos problemas que incluyen efectos secundarios adicionales, pérdida de la especificidad de la diana, dificultades para determinar la ventana terapéutica y las variaciones dependientes del tipo de célula.
[0056] Todas las estrategias, incluyendo las técnicas fisicoquímicas, requieren moléculas potenciadoras que interactúen de forma más o menos directa con las membranas y comprendan esencialmente pequeñas moléculas químicas, metabolitos secundarios, péptidos y proteínas. Una característica común de todas estas sustancias es que de por sí no se dirigen a células específicas y se distribuyen con otra cinética distinta de las toxinas dirigidas. Este es uno de los principales inconvenientes de los enfoques actuales.
[0057] La presente invención se describirá con respecto a formas de realización particulares, pero la invención no se limita a las mismas, sino únicamente a las reivindicaciones. Las formas de realización de la invención descritas en este documento pueden funcionar en combinación y cooperación, a menos que se especifique lo contrario.
[0058] Un aspecto de la invención se refiere a una primera molécula proteica que comprende un primer sitio de unión para la unión a un primer epítopo de una primera molécula de la superficie celular, unida covalentemente a al menos una saponina mediante al menos una porción conectora y/o mediante una porción oligomérica o polimérica a un residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, o unida covalentemente de manera directa a un residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, donde el primer sitio de unión comprende o consiste en una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o una IgG, y/o comprende o consiste en al menos un ligando para la unión a una molécula de la superficie celular como EGF o una citocina, y en donde la al menos una saponina se selecciona del grupo que consiste en: SO1861, SA1641, GE1741, q S-21, QS-21A, QS21-B, Quil-A, SO1832, SO1904 y SO1862. Por lo tanto, la invención se refiere a la provisión de un conjugado, el cual comprende o consiste en la primera molécula proteica que comprende un primer sitio de unión para la unión a un primer epítopo de una primera molécula de la superficie celular, donde al menos una saponina se une covalentemente a través de al menos una porción conectora a la primera molécula proteica y/o se une a través de una porción oligomérica o polimérica a un residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, o se une covalentemente de manera directa a un residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, donde el primer sitio de unión comprende o consiste en una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o una IgG, y/o comprende o consiste en al menos un ligando para la unión a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina, y donde la al menos una saponina se selecciona del grupo que consiste en: SO1861, SA1641, GE1741, QS-21, QS-21A, QS21-B, Quil-A, SO1832, SO1904 y SO1862.
[0059] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que el primer sitio de unión comprende o consiste en una inmunoglobulina, o al menos un dominio de unión de una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o una IgG, y/o comprende o consiste en al menos un ligando para la unión a una molécula de la superficie celular como EGF o una citocina.
[0060] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que el primer epítopo de la primera molécula de la superficie celular es un primer epítopo específico para células tumorales de una primera molécula de la superficie de una célula tumoral, más preferiblemente un primer epítopo específico para células tumorales de un primer receptor de la superficie de la célula tumoral presente específicamente en una célula tumoral.
[0061] Se proporciona pero no se reivindica la primera molécula proteica, en la que la al menos una saponina es una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpenoide bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con una función aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmente una función ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina, y/o una saponina aislada de una especie de Gypsophila y/o una especie de Saponaria y/o una especie de Agrostemma y/o una especie de Quillaja, como Quillaja saponaria.
[0062] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que al menos una saponina es una saponina específica única o es una mezcla de dos o más saponinas diferentes, como una o más de las saponinas SO1861, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21B, Quil-A, SO1832, o cualquiera de sus estereómeros y/o cualquier combinación de estas, preferiblemente la saponina es SO1861 y/o GE1741 y/o SA1641 y/o QS-21, más preferiblemente la saponina es SO1861 y/o QS-21.
[0063] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que al menos una saponina es QS-21 o cualquiera o más de QS-21A, QS-21B, Quil-A.
[0064] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que
- la al menos una saponina es una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12.13- dehidrooleanano con una función aldehído en la posición C-23,
- la al menos una saponina está acoplada covalentemente al residuo de aminoácido de la primera molécula proteica a través de una función aldehído en la saponina, preferiblemente dicha función aldehído en la posición C-23, preferiblemente a través de al menos una porción conectora, más preferiblemente a través de al menos una porción conectora escindible, en donde el residuo de aminoácido se selecciona preferiblemente de entre cisteína y lisina.
[0065] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que
- la al menos una saponina es una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12.13- dehidrooleanano con una función aldehído en la posición C-23 y que comprende una función ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato del grupo C-3beta-OH de la saponina
- la al menos una saponina está acoplada covalentemente al residuo de aminoácido de la primera molécula proteica a través de la función ácido glucurónico del sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina, preferiblemente a través de al menos una porción conectora, en donde el residuo de aminoácido se selecciona preferiblemente de entre cisteína y lisina.
[0066] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que la función aldehído en la posición C-23 de la al menos una saponina está acoplada covalentemente a la porción conectora hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico, donde dicha porción conectora está acoplada covalentemente, mediante un enlace tioéter, a un grupo sulfhidrilo de la primera molécula proteica, tal como un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
[0067] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que la función ácido glucurónico del sustituyente carbohidrato del grupo C-3beta-OH de la al menos una saponina está acoplada covalentemente a la porción conectora hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] piridinio) , donde dicha porción conectora está acoplada covalentemente mediante un enlace amida a un grupo amina de la primera molécula proteica, como un grupo amina de una lisina o un extremo N-terminal de la primera molécula proteica.
[0068] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que el primer epítopo de la primera molécula de la superficie celular al que se une el primer sitio de unión de la primera molécula proteica es un primer epítopo específico para células tumorales del receptor específico para células tumorales seleccionado preferiblemente de entre CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HER2, EGfR, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrina A4, MUC1, Trop2 , CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, más preferiblemente seleccionado de entre CD71, EGFR, HER2.
[0069] Se proporciona y no se reivindica la primera molécula proteica de la invención, en la que el primer epítopo específico para células tumorales, la primera molécula de la superficie celular tumoral o el primer receptor específico para células tumorales son un primer epítopo o una primera molécula o un primer receptor que son internalizados por la célula tumoral después de la unión de la primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 al primer epítopo o primera molécula o primer receptor, y en donde preferiblemente la primera molécula proteica se somete a intemalización mediada por un receptor de la célula tumoral, por ejemplo mediante endocitosis, o intemalización mediada por moléculas de superficie de la célula tumoral, por ejemplo, por endocitosis, cuando se une a la molécula de la superficie celular que comprende el primer epítopo, la molécula de la superficie celular tumoral o el receptor específico para células tumorales.
[0070] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que el primer sitio de unión de la primera molécula proteica comprende o consiste en cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal OKT- 9 anti-CD71 del tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-10 anti-CD38, un anticuerpo de la Tabla A2 o Tabla A3 o Tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión a receptores de células tumorales o uno de sus dominios, preferiblemente al menos un fragmento de unión a receptores específicos para células tumorales de estos y/o al menos un dominio de unión a receptores específicos para células tumorales de estos.
[0071] Un aspecto de la invención se refiere a una combinación terapéutica, en la que la combinación terapéutica comprende:
(a) una primera composición farmacéutica que comprende la primera molécula proteica de la invención y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico; y
o bien
(b) una segunda composición farmacéutica que comprende una segunda molécula proteica diferente de la primera molécula proteica y que, además, comprende opcionalmente un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, donde la segunda molécula proteica comprende
- un segundo sitio de unión para la unión a un segundo epítopo de una segunda molécula de la superficie celular diferente de la primera molécula de la superficie celular, y
- que comprende un resto efector, como una toxina, una enzima o un oligonucleótido, en el que el segundo epítopo es diferente del primer epítopo,
o bien
(c) una tercera composición farmacéutica que comprende una tercera molécula proteica y, opcionalmente, que comprende además un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, donde la tercera molécula proteica comprende
- un tercer sitio de unión para la unión al primer epítopo de la molécula de la superficie celular de (a) y - un resto efector, como una toxina, una enzima o un oligonucleótido;
en donde el primer sitio de unión y el tercer sitio de unión son iguales, y donde la primera molécula de la superficie celular y el primer epítopo de la primera molécula de la superficie celular, al que se puede unir la primera molécula proteica, y la primera molécula de la superficie celular y el primer epítopo de la primera molécula de la superficie celular, al que se puede unir la tercera molécula proteica, son iguales. Una forma de realización es la combinación terapéutica de la invención, en la que:
(a) la combinación terapéutica comprende dicha primera composición farmacéutica y dicha segunda composición farmacéutica, en la que
- el primer epítopo de la primera molécula de la superficie celular es un primer epítopo específico para células tumorales de una primera molécula de superficie específica para células tumorales, preferiblemente un primer epítopo específico para células tumorales en un primer receptor de la superficie celular presente específicamente en una célula tumoral; y
- la segunda molécula de la superficie celular es una segunda molécula de superficie específica para células tumorales diferente de la primera molécula de superficie específica para células tumorales, preferiblemente un segundo receptor de superficie celular presente específicamente en una célula tumoral diferente del primer receptor de superficie celular presente específicamente en dicha célula tumoral, y donde el segundo epítopo es un segundo epítopo específico para células tumorales;
o bien
(b) la combinación terapéutica comprende dicha primera composición farmacéutica y dicha tercera composición farmacéutica,
en donde la primera molécula de la superficie celular se expresa en la superficie de una célula tumoral, y preferiblemente la primera molécula de la superficie celular es una molécula de superficie específica para células tumorales, y en donde preferiblemente el primer epítopo es un primer epítopo específico para células tumorales.
[0072] Los inventores han establecido que la ventana terapéutica de un conjugado de anticuerpo-fármaco, tal como la segunda y tercera moléculas proteicas de la segunda o tercera composición farmacéutica de la invención, respectivamente, aumenta cuando se administra a un mamífero (ratón) con tumores al que también se le administra la primera composición farmacéutica. La primera proteína proteica tiene al menos uno de SO1861, SA1641, GE1741, QS-21, QS-21A, QS21-B, Quil-A, SO1832, SO1904 y SO1862 unido a ella, preferiblemente mediante enlaces covalentes, más preferiblemente mediante una porción conectora escindible. La saponina aumenta la eficacia terapéutica del resto efector unido a la segunda y tercera molécula proteica, probablemente al aumentar el escape endosomal del resto efector al citosol donde se desea la actividad del resto efector. De esta manera, ya a una dosis más baja que la dosis convencional del ADC, es decir, la segunda o tercera molécula proteica, el efecto terapéutico se establece bajo la influencia de la presencia de la primera molécula proteica que comprende la saponina cerca, en y/o dentro de la célula diana. La célula diana es, por ejemplo, una célula enferma, como una célula tumoral o una célula autoinmune o un linfocito B relacionado con una enfermedad de los linfocitos B, etc. El resto efector es, por ejemplo, una toxina como parte de un ADC o un oligonucleótido, como un BNA, como parte de un AOC según la invención.
[0073] Una forma de realización es la combinación terapéutica de la invención, en la que el segundo sitio de unión de la segunda molécula proteica y/o el primer sitio de unión de la tercera molécula proteica comprende o consiste en una inmunoglobulina, al menos un dominio de unión de una inmunoglobulina y/o al menos un fragmento de unión de una inmunoglobulina, como un anticuerpo, una IgG, una molécula que comprende o consiste en un dominio Vhh o dominio Vh, un fragmento Fab, scFv, Fv, dAb, F(ab)2, Fcab y/o comprende o consiste en al menos un ligando para la unión a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina.
[0074] Una forma de realización es la combinación terapéutica de la invención que comprende la segunda composición farmacéutica, en la que el segundo sitio de unión de la segunda molécula proteica para la unión al segundo epítopo es un segundo sitio de unión para un segundo epítopo específico para células tumorales en un segundo receptor de superficie celular presente específicamente en la célula tumoral, en donde el segundo sitio de unión es diferente del primer sitio de unión.
[0075] Al actuar sobre (dos) moléculas diferentes de la superficie celular con la primera y la segunda molécula proteica, se mejora y se aumenta la especificidad de la liberación de la saponina y la molécula efectora en y dentro del citosol de la misma célula diana, exponiendo ambas moléculas de la superficie celular diferentes en la superficie celular, en comparación con la exposición de tales células solo a la segunda molécula proteica, como un ADC o un AOC, sin la presencia de la saponina dirigida a la célula (primera molécula proteica). Una célula aberrante seleccionada como diana separada por el sitio de unión de la primera molécula proteica y por el sitio de unión de la segunda molécula proteica, donde los sitios de unión son diferentes y donde el epítopo al que se unen la primera y la segunda molécula proteínica es diferente y está ubicado en una clase y tipo diferente de molécula de la superficie celular, como dos receptores diferentes, lleva idealmente el primer epítopo y el segundo epítopo en la primera molécula de la superficie celular y en la segunda molécula de la superficie celular, respectivamente, en un alto grado (es decir, hay una expresión relativamente más alta de las dos moléculas de la superficie celular distintas y diferentes en la célula diana, como, por ejemplo, una célula tumoral o una célula autoinmune, que la expresión en una célula no diana como, por ejemplo, una célula sana) y/o expone la primera y segunda moléculas de la superficie celular de manera específica, cuando se tienen en cuenta células sanas (adyacentes) de un paciente. Preferiblemente, ambas moléculas de la superficie celular a las que se dirigen el primer y segundo sitios de unión tienen una expresión relativamente alta y/o específica en la célula diana (enferma, tumoral) en comparación con las células sanas. Una forma de realización es la combinación farmacéutica, en la que al menos uno del primer y segundo sitio de unión y, por lo tanto, al menos una de la primera y segunda molécula de la superficie celular, tal como un primer y segundo receptor de células tumorales, tiene una expresión relativamente alta y/o específica en comparación con la expresión de la primera molécula de la superficie celular y/o la segunda molécula de la superficie celular en la superficie de una célula sana (adyacente). Por lo tanto, el primer epítopo o el segundo epítopo, preferiblemente el primer epítopo y el segundo epítopo, en la molécula de la superficie celular diana es/son idealmente únicos para las células diana enfermas, y está/están al menos específicamente presentes y expuestos en la superficie de las células diana. La unión de la primera y segunda moléculas proteicas a su respectivo primer y segundo epítopo en una célula diana va seguida de la endocitosis de los complejos de la primera molécula proteica y la primera molécula de superficie de la célula diana y la segunda molécula proteica y la segunda molécula de superficie de la célula diana. Dado que la primera y la segunda moléculas proteicas tienen que entrar en la misma célula diana a través de la interacción de unión con dos moléculas diferentes de la superficie celular, ambas expresadas en un grado suficiente o de forma única en la célula diana en comparación con las células sanas que no deberían considerarse diana, la acumulación de una cantidad terapéuticamente activa de la primera y segunda moléculas proteicas dentro de las células diana solo es posible y ocurre si los niveles de expresión de las dos moléculas distintas de la superficie de la célula diana están ambas por encima de un cierto umbral de expresión mínimo. Al mismo tiempo, el hecho de que el resto efector unido a la segunda molécula proteica solo sea capaz de ejercer su actividad intracelular (por ejemplo, citotóxica o silenciadora de genes) en presencia de la primera molécula proteica que lleva la saponina unida covalentemente, cuando tanto la primera como la segunda moléculas proteicas fueron capaces de entrar en la célula diana en cantidades suficientes al unirse a la primera y segunda moléculas de la superficie celular suficientemente expuestas y expresadas, también proporciona una protección contra los efectos secundarios negativos y no deseados del resto efector hacia, por ejemplo, células sanas y tejido sano que no deben considerarse dianas ni ser afectados por el resto efector, cuando la expresión de al menos una de la primera y la segunda moléculas de la superficie celular es suficientemente baja en las células sanas y preferiblemente cuando la expresión, tanto de la primera como de la segunda molécula de la superficie celular, es suficientemente bajas en las células sanas. Es decir, la expresión suficientemente baja o incluso ausente de la primera y segunda moléculas de la superficie celular expuestas con respecto a la primera y la segunda moléculas de la superficie celular, y al menos la primera molécula de la superficie celular o la segunda molécula de la superficie celular, unida por el primer y segundo sitio de unión de la primera y segunda moléculas proteicas, respectivamente, idealmente no permite la entrada en células sanas (que no son diana) de la primera y segunda moléculas proteicas en cantidades que, en conjunto, resultarían en un escape endosomal del resto efector bajo la influencia de la saponina unida a la primera molécula proteica. Dado que el ADC o el AOC se pueden usar en dosis más bajas en comparación con cuando la primera molécula proteica no se agrega al régimen terapéutico, la entrada de ADC o AOC en células sanas en un grado bajo ya conlleva un riesgo menor de aparición de efectos secundarios no deseados cuando, por ejemplo, se tiene en cuenta el direccionamiento hacia células diana enfermas, como las células tumorales y las células autoinmunes, y su destrucción.
[0076] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención o la combinación terapéutica de la invención que comprende la segunda composición farmacéutica, en donde dichas primera y segunda moléculas proteicas comprenden el primer y segundo sitio de unión, respectivamente, para la unión a un primer y segundo epítopo específico para células tumorales en un primer y segundo receptor específico para células tumorales, respectivamente, siendo los receptores diferentes y estando presentes en la misma célula tumoral, en donde el primer y segundo sitio de unión son diferentes y el primer y segundo epítopo específico para células tumorales son diferentes.
[0077] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención o la combinación terapéutica de la invención que comprende la tercera composición farmacéutica, en la que dichas primera y tercera moléculas proteicas comprenden el mismo primer sitio de unión para la unión a un primer epítopo específico para células tumorales en un primer receptor específico para células tumorales.
Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención o la combinación terapéutica de la invención que comprende la segunda composición farmacéutica, en la que el primer receptor y/o el segundo receptor se seleccionan de CD71, CA125, EpCAM (17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, Eg F-IR, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg , integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrina A4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4 .4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente seleccionado de CD71, EGFR y HER2; con las condiciones de que
- cuando la primera y segunda moléculas proteicas están presentes en la combinación terapéutica, el primer sitio de unión de la primera molécula proteica es diferente del segundo sitio de unión de la segunda molécula proteica,
- cuando la primera y la tercera moléculas proteicas están presentes en la combinación terapéutica, los sitios de unión primero y tercero son el mismo.
[0078] Se proporciona y no se reivindica la primera molécula proteica de la invención o la combinación terapéutica de la invención que comprende la segunda composición farmacéutica, en donde el primer y segundo receptores específicos de células tumorales son internalizados por la célula tumoral después de unirse a la primera molécula proteica de la invención y/o la segunda molécula proteica de la invención cuando la combinación terapéutica comprende la segunda composición farmacéutica, y en la que preferiblemente la unión de la primera molécula proteica y/o la segunda molécula proteica al primer y segundo receptores específicos para células tumorales, respectivamente, resulta en una internalización mediada por receptores de células tumorales, por ejemplo, vía endocitosis, de un complejo de la primera molécula proteica y el primer receptor específico para células tumorales y de un complejo de la segunda molécula proteica y el segundo receptor específico para células tumorales.
[0079] Se proporciona y no se reivindica la combinación terapéutica que comprende el tercer producto farmacéutico de la invención o la primera composición farmacéutica según la invención, en donde el primer receptor de células tumorales, preferiblemente el primer receptor específico de células tumorales, es internalizado por la célula tumoral después de unirse a la primera molécula proteica de la invención y/o después de unirse a la tercera molécula proteica de la invención, y en donde, preferiblemente, la unión de la primera molécula proteica y/o la tercera molécula proteica al primer receptor de células tumorales, tal como el primer receptor específico de células tumorales, va seguida de la intemalizadón mediada por receptores de las células tumorales, por ejemplo, vía endocitosis, de un complejo de la primera molécula proteica y el primer receptor de células tumorales y de un complejo de la tercera molécula proteica y el primer receptor de células tumorales.
[0080] La sincronización es el paso que falta entre una estrategia de administración exitosa para ratones y su aplicación en humanos. De hecho, los inventores establecieron en una serie de modelos de tumores de ratón in vivo que la administración por separado a los ratones de una dosis de saponina libre y una dosis de ADC (segunda o tercera molécula proteica según la invención) no da como resultado ninguna actividad antitumoral deseada, como retraso en el crecimiento tumoral, regresión tumoral, crecimiento tumoral disminuido y más lento, en comparación con los animales de control no tratados con ADC y saponina libre. La saponina libre se administró usando varias vías de administración y usando varios puntos temporales de administración de la saponina libre en comparación con los puntos temporales de administración del ADC (administración de la saponina libre antes, durante y después de la administración del ADC). El ADC analizado en modelos de tumores in vivo fue cetuximab-diantina (con SO1861 libre) o trastuzumab-saporina (con SO1861 libre). La variación de la dosis de saponina libre no proporcionó una actividad antitumoral eficaz. Los ADC mencionados se administraron a una dosis que en sí misma no infligió ningún efecto antitumoral beneficioso en los animales con tumores. Sorprendentemente, los inventores han establecido ahora que se puede lograr una actividad antitumoral beneficiosa en varios bioensayos in vitro basados en células de mamíferos y/o en varios modelos de tumores animales in vivo tratando a los animales con conjugados según la invención, que, opcionalmente, comprenden un armazón según la invención, es decir, combinaciones de la primera y segunda o la primera y tercera moléculas proteicas de la invención. El armazón, por ejemplo, es una porción conectora trifuncional con una saponina unida covalentemente (por ejemplo, SO1861, QS-21) a través de un enlace escindible o no escindible, y/o con un resto efector unido covalentemente (por ejemplo, diantina, con silenciamiento de BNA (HSP27) mediante un enlace no escindible o un enlace escindible, y/o con un anticuerpo monoclonal unido covalentemente como cetuximab, trastuzumab, OKT-9, o el armazón es un dendrón, como un dendrón al que, por ejemplo, se pueden unir cuatro restos, como cuatro moléculas de saponina, o un dendrón para unir, por ejemplo, dos saponinas y dos moléculas efectoras, comprendiendo el dendrón un grupo químico para la unión (covalente) a un ligando o un anticuerpo o fragmento o dominio del mismo. Se hace referencia a la sección de Ejemplos, en la que se ejemplifican varios de estos armazones según la invención, que muestran actividad celular antitumoral in vivo y/o in vitro cuando se tiene en cuenta la toxicidad celular ejercida por, por ejemplo, una toxina proteica o cuando se tiene en cuenta el silenciamiento génico en la célula tumoral.
[0081] Sin querer ceñirse a ninguna teoría, en vista de los fracasos observados cuando se tiene en cuenta el tratamiento de animales con tumores con un ADC junto con saponina libre, se prefiere sincronizar la presencia tanto de la al menos una saponina como del resto efector, preferiblemente una toxina o un oligonucleótido, en compartimentos o vesículas de la vía endocítica de la célula diana, por ejemplo, una célula tumoral o una célula autoinmune. Con ADC y saponina libre, la sincronización de la presencia de las moléculas en los endosomas tardíos para obtener los efectos sinérgicos in vivo no se pudo obtener de manera beneficiosa según los intentos de los inventores. En un aspecto, la invención resuelve preferiblemente al menos el siguiente problema con respecto a la combinación del resto efector comprendido por la segunda molécula proteica y las saponinas comprendidas por la primera molécula proteica: sin desear ceñirse a ninguna teoría, para la actividad de escape endosomal se requiere el único grupo químico razonable dentro, por ejemplo, las saponinas que se pueden usar para un acoplamiento (covalente) duradero, en particular único y escindible. Es muy probable que las restricciones conocidas sean la razón por la que las saponinas no se han utilizado en combinación con sustancias farmacéuticamente activas en investigaciones clínicas distintas de la aplicación de saponinas en regímenes de vacunación en los que estaba implícito el uso de una sustancia adyuvante inmunopotenciadora, a pesar de que el llamativo efecto potenciador del escape endosomal de, por ejemplo, las saponinas enumeradas en la Tabla A1 y el Esquema I se conozca desde hace más de 10 años. Por ejemplo, proporcionar una primera molécula proteica de la invención con un armazón conjugado covalentemente resuelve estas dificultades, al menos en parte. Sorprendentemente, las saponinas previamente aplicadas por su actividad inmuno-potenciadora en el contexto de la vacunación que involucra a las saponinas como componente adyuvante, ahora también son adecuadas para el acoplamiento (covalente) a la primera molécula proteica de la invención, para la actividad antitumoral in vivo e in vivo.
[0082] Un resto efector útil en la presente invención se basa preferiblemente en el escape endosomal tardío para ejercer su efecto. Algunos efectores, tales como, por ejemplo, una exotoxina de pseudomonas, se redireccionan a otros orgánulos antes de la “fase endosómica tardía" y, por tanto, normalmente no se beneficiarían del acoplamiento a la segunda molécula proteica según la presente invención. Sin embargo, tal toxina puede adaptarse para su uso con la presente invención, por ejemplo, eliminando el péptido señal responsable del redireccionamiento. En particular, las toxinas que son altamente tóxicas y en las que solo haría falta que una molécula escapase de los endosomas para matar una célula pueden modificarse para que sean menos potentes. Se prefiere usar una toxina que mata una célula si al menos 2, más preferiblemente al menos 5, más preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 20, más preferiblemente al menos 50, de la manera más preferible al menos 100 moléculas de la toxina escapan del endosoma. Se prefiere además que una segunda molécula proteica de la invención comprenda un armazón funcionalizado conjugado covalentemente, es decir, un armazón que comprenda porción(es) efectora(s) unida(s) covalentemente para dirigir el armazón que comprende la(s) porción(es) efectora(s) unida(s) a una célula diana tal como una célula tumoral o una célula autoinmune. Además, con el fin de reducir la toxicidad fuera de la diana, las toxinas de moléculas pequeñas no permeables de la membrana celular son moléculas efectoras preferidas con respecto a las toxinas permeables de la membrana celular.
[0083] El término "ligando”, como se usa en esta invención, tiene su significado habitual y preferiblemente significa una molécula o estructura que es capaz de unirse a otra molécula o estructura de la superficie celular de una célula diana, donde dicha molécula o estructura de la superficie celular se puede incorporar al interior de la célula por endocitosis y preferiblemente está ausente o menos prominente en las células que no son diana. Preferiblemente, dicha molécula o estructura de la superficie celular se puede incorporar al interior de la célula por endocitosis constitutiva. Más preferiblemente, un ligando de esta invención induce la endocitosis de dicha molécula o estructura de la superficie celular de las células diana después de unirse a dicha molécula o estructura. Este es, por ejemplo, el caso del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), presente en la superficie de una variedad de células cancerosas. Ejemplos de moléculas o estructuras de la superficie celular de las células diana que se incorporan al interior son, por ejemplo, Claudina-1 o glucoproteínas del complejo principal de histocompatibilidad de clase II. Un ligando puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un factor de crecimiento o una citocina. La combinación, en una molécula portadora, de una toxina con un ligando es una posibilidad para crear una toxina dirigida. Una toxina que solo es tóxica en una célula diana porque interfiere con los procesos que ocurren solo en las células diana también puede verse como una toxina dirigida (ya que en las células no diana no puede ejercer su acción tóxica, como, por ejemplo, la apoptina). Preferiblemente, una toxina dirigida es una toxina que se combina con un ligando o, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal para que sea activa en las células diana y no en las células no diana (ya que solo se une y se incorpora por endocitosis a las células diana). En un armazón funcionalizado que comprende una molécula portadora que comprende un ligando y un resto efector (es decir, una segunda o tercera molécula proteica), el ligando o el anticuerpo monoclonal guía el resto efector y el armazón a las células diana. Después de la internalización, el al menos un glucósido, preferiblemente una saponina comprendida por el conjugado de la primera molécula proteica y la saponina, media en el escape endosomal del resto efector. La saponina es típicamente una saponina mencionada en la Tabla A1 y el Esquema I, y preferiblemente la saponina es SO1861 y/o QS-21, y/o SA1641 y/o GE1741.
[0084] Preferiblemente, el resto efector unido a la segunda o tercera molécula proteica, cuyo efecto es potenciado por las saponinas unidas a la primera molécula proteica, se desprende de la segunda o tercera molécula proteica, por ejemplo, un anticuerpo, cuando se produce la endocitosis. Esto se puede lograr mediante un enlace escindible que se rompe, por ejemplo, en condiciones ácidas, reductoras, enzimáticas o inducidas por luz.
[0085] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención y/o combinación terapéutica de la invención que comprende la segunda composición farmacéutica, en la que el primer sitio de unión y/o el segundo sitio de unión es/son o comprenden un anticuerpo monoclonal o al menos un fragmento de unión a una molécula de la superficie celular y/o su dominio, y preferiblemente comprenden o consisten en cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, OKT-9 anti-CD71 anticuerpo monoclonal de tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD38 OKT-10 y un anticuerpo de la Tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión a la molécula de la superficie celular o uno de sus dominios, con la condición de que el primer sitio de unión de la primera molécula proteica sea diferente del segundo sitio de unión de la segunda molécula proteica.
[0086] Una forma de realización es la combinación terapéutica que comprende la tercera composición farmacéutica de la invención o la primera composición farmacéutica de acuerdo con la invención cuando está comprendida por la combinación terapéutica que comprende la tercera composición farmacéutica, donde el primer sitio de unión de la primera molécula proteica y la tercera molécula proteica comprende un anticuerpo monoclonal o al menos uno de un dominio de unión a una molécula de la superficie celular y/o un fragmento de este, y preferiblemente comprende o consiste en cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-9 anti-CD71 de tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-10 anti-CD38, un anticuerpo de la Tabla A2 o Tabla A3 o Tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión a la molécula de la superficie celular y/o dominio del mismo, con la condición de que el primer sitio de unión de la primera molécula proteica sea el mismo que el primer sitio de unión de la tercera molécula proteica.
[0087] Una forma de realización es la combinación terapéutica que comprende la segunda o la tercera composición farmacéutica de la invención, en donde el segundo sitio de unión de la segunda molécula proteica y/o el primer sitio de unión de la tercera molécula proteica es o comprende un anticuerpo monoclonal o al menos un fragmento de unión a moléculas de la superficie celular o dominio del mismo, y preferiblemente comprende o consiste en cualquiera de Gemtuzumab ozogamicina, Brentuximab vedotina, Trastuzumab emtansina, Inotuzumab ozogamicina, Moxetumomab pasudotox y Polatuzumab vedotina y un conjugado de anticuerpofármaco de la Tabla A3.
[0088] Los inventores establecieron que tales inmunoglobulinas, dominios de las mismas, ligandos, etc., son particularmente adecuadas para su aplicación como primer sitio de unión de la primera molécula proteica (y el mismo sitio de unión de la tercera molécula proteica) que comprende el primer sitio de unión. De manera similar, los inventores establecieron que tales inmunoglobulinas, dominios de las mismas, ligandos, etc., son particularmente adecuadas para su aplicación como segundo sitio de unión de la segunda molécula proteica que comprende el segundo sitio de unión. Por ejemplo, los anticuerpos y los dominios de unión de los anticuerpos son adecuados para dirigirse a un epítopo de la superficie expuesta de una molécula seleccionada de la superficie celular, lo que da como resultado que la primera y la tercera (y, por separado, la segunda) molécula proteica se dirijan a las células diana que expresan la molécula de la superficie celular a la que se dirigen la primera y tercera molécula proteica y/o también células diana que expresan la segunda molécula de la superficie celular a la que se dirige la segunda molécula proteica, donde estas células también expresan la primera y tercera molécula de la superficie celular (que es la misma molécula de la superficie celular), y tienen dichas moléculas de la superficie celular en su superficie celular. De manera similar, los ligandos como EGF, que se dirigen al EGFR de las células diana, son adecuados para su aplicación como sitio de unión en la primera y tercera moléculas proteicas, o como segundo sitio de unión en la segunda molécula proteica con la condición de que el segundo sitio de unión sea diferente tanto del primer como del tercer sitio de unión, donde dicho primer y tercer sitio de unión son iguales. Se prefieren los sitios de unión para el primer y tercer epítopo o para el segundo epítopo, que son específicos para la unión de la primera y la tercera moléculas proteicas a la primera molécula de la superficie celular y/o para la unión de la segunda molécula proteica a la segunda molécula de la superficie celular, donde la primera y segunda moléculas de la superficie celular están expuestas en la misma célula diana. Los sitios de unión basados en anticuerpos o dominios o fragmentos de unión de los mismos, por ejemplo, proporcionan tal especificidad deseada para un primer, segundo, tercer epítopo seleccionado de una primera o segunda molécula de la superficie celular seleccionada de una célula seleccionada como diana, tal como una célula enferma, una célula tumoral, una célula autoinmune, etc. Por lo tanto, se prefieren los sitios de unión primero, segundo y tercero basados en anticuerpos o moléculas de unión (fragmentos, dominios) para la primera y segunda y tercera moléculas proteicas.
[0089] Al dirigirse la primera y la tercera moléculas proteicas a la misma molécula de la superficie celular, la liberación de la saponina y el resto efector en y dentro del citosol de la misma célula diana se mejora y es más específica. Una célula aberrante seleccionada para recibir la acción dirigida por el sitio de unión de la primera y tercera moléculas proteicas idealmente es portadora de la molécula de la superficie celular en un alto grado y/o específicamente, cuando se tienen en cuenta células sanas (adyacentes) de un paciente. Por tanto, el epítopo de la molécula de la superficie de la célula diana idealmente es único para las células enfermas diana, y está al menos específicamente presente y expuesto en la superficie de las células diana. La unión de la primera y tercera moléculas proteicas va seguida de la endocitosis de los complejos de la primera molécula proteica y la molécula de la superficie de la célula diana y la tercera molécula proteica y la molécula de la superficie de la célula diana. Dado que la primera y la tercera moléculas proteicas tienen que entrar en la misma célula diana a través de la interacción de unión con las mismas moléculas de la superficie celular, la acumulación de una cantidad terapéuticamente activa de la primera y tercera moléculas proteicas dentro de las células diana solo es posible y ocurre si los niveles de expresión de la molécula de la superficie de la célula diana está por encima de un cierto umbral de expresión mínimo. Al mismo tiempo, el hecho de que el resto efector unido a la tercera molécula proteica solo sea capaz de ejercer su actividad intracelular (por ejemplo, citotóxica o silenciadora de genes) en presencia de la primera molécula proteica que lleva la saponina unida covalentemente, cuando tanto la primera y terceras moléculas proteicas son capaces de entrar en la célula diana en cantidades suficientes al unirse a una molécula de la superficie celular suficientemente expuesta y expresada, también proporciona una protección contra los efectos secundarios negativos y no deseados del resto efector hacia, por ejemplo, células sanas y tejido sano que no están destinados a recibir la acción y verse afectados por el resto efector, cuando la expresión de la molécula de la superficie de la célula diana es suficientemente baja en las células sanas. Es decir, la baja expresión de la molécula de la superficie celular unida por el sitio de unión de la primera y tercera moléculas proteicas no permite la entrada de la primera y de la tercera moléculas proteicas en cantidades que, en conjunto, resultarían en un escape endosomal del resto efector bajo la influencia de la saponina unida a la primera molécula proteica. Dado que el ADC o AOC se puede usar en dosis más bajas en comparación con cuando la primera molécula proteica no se agrega al régimen terapéutico, la entrada de ADC o AOC en células sanas en un grado bajo ya conlleva un menor riesgo de aparición de efectos secundarios no deseados cuando, por ejemplo, se tiene en cuenta la acción sobre células diana enfermas, tales como células tumorales y células autoinmunes, y su destrucción.
[0090] A lo largo de la descripción y las reivindicaciones (toda la solicitud), los términos "primero" y "tercero" tienen el mismo significado cuando se tienen en cuenta el primer y tercer epítopo, el primer y tercer sitio de unión, la primera y la tercera molécula de la superficie celular. Es decir, para la primera y tercera moléculas proteicas, el epítopo diana es el mismo, el sitio de unión es el mismo, la molécula de la superficie de la célula diana, como un receptor (específico) para células tumorales, es la misma.
[0091] En las Tablas A2, A3 y A4 se enumeran ejemplos preferidos de la primera molécula de la superficie celular que comprende el primer epítopo para el primer sitio de unión de la primera y tercera molécula proteica.
Además, en las Tablas A2, A3 y A4 también se enumeran ejemplos preferidos de la segunda molécula de la superficie celular que comprende el segundo epítopo para el segundo sitio de unión de la segunda molécula proteica. Cuando la primera y/o segunda molécula de la superficie celular se expresa específicamente en la célula diana, preferiblemente tanto la primera como la segunda molécula de la superficie celular, y cuando el primer y segundo epítopos de la primera y segunda moléculas de la superficie celular, a los que el primer sitio de unión y/o el segundo sitio de unión se pueden unir respectivamente, están presentes específicamente en la primera y/o segunda molécula de la superficie celular, se facilita el direccionamiento específico de la primera, tercera y/o segunda molécula proteica a la misma célula diana deseada, tal como una célula tumoral que expone la primera y segunda moléculas de la superficie celular tumoral, mientras que otras células, como las células sanas, que no expresan la primera y/o la segunda molécula de la superficie celular o que expresan la primera y/o la segunda molécula de la superficie celular en menor grado, preferiblemente que no expresan la primera y segunda molécula de la superficie celular o que expresan la primera y segunda molécula de la superficie celular en menor grado en comparación con la expresión de la(s) molécula(s) de la superficie de la célula diana (aberrante), no reciben la acción de la primera, tercera y segunda molécula proteica o lo hacen en menor grado.
[0092] Una forma de realización es la combinación terapéutica que comprende la segunda o tercera composición farmacéutica de la invención, en la que el resto efector que está compuesto por la segunda molécula proteica o por la tercera molécula proteica comprende o consiste en uno o más de un oligonucleótido, un ácido nucleico, un ácido xenonucleico, preferiblemente seleccionado de uno o más de un vector, un gen, un transgén que induce la apoptosis celular, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótido antisentido (ASO, AON), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aptámero de ADN, aptámero de ARN, ARNm, ADN de minicírculo, ácido nucleico peptídico (APN), oligómero morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico con puente (BNA), ácido 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleico (FANA), 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), ácido nucleico con puente 2'-O, 4'-aminoetileno, ácido 3'-fluorohexitol nucleico (FHNA), un plásmido, ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treosa-nucleico (TNA), o un derivado un derivado de estos, más preferiblemente un BNA, por ejemplo un BNA para silenciar la expresión de la proteína HSP27.
[0093] Una forma de realización es la combinación terapéutica que comprende la segunda o la tercera composición farmacéutica de la invención, en la que el resto efector que está compuesto por la segunda molécula proteica o por la tercera molécula proteica comprende o consiste en al menos una molécula proteica, preferiblemente seleccionada de cualquiera o cualesquiera de un péptido, una proteína, una enzima tal como ureasa y recombinasa Cre, una proteína inactivadora de ribosomas, una toxina proteica, más preferiblemente seleccionada de una o más de una toxina proteica seleccionada de la Tabla A5 y/o una toxina viral como apoptina; una toxina bacteriana tal como toxina Shiga, toxina similar a Shiga, exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (PE) o exotoxina A de PE, toxina diftérica (TD) de longitud completa o truncada, toxina del cólera; una toxina fúngica como la alfa-sarcina; una toxina vegetal que incluya proteínas inactivadoras de ribosomas y la cadena A de proteínas inactivadoras de ribosomas de tipo 2 tales como diantina, por ejemplo, diantina-30 o diantina-32, saporina por ejemplo, saporina-S3 o saporina-S6, bouganina o el derivado desinmunizado de bouganina debouganina, toxina A similar a shiga, proteína antiviral de hierba carmín, ricina, cadena A de ricina, modecina, cadena A de modecina, abrina, cadena A de abrina, volkensina, cadena A de volkensina, viscumina, cadena A de viscumina; o una toxina animal o humana tal como RNasa de rana, o granzima B o angiogenina humana, o cualquier fragmento o derivado de los mismos; preferiblemente, la toxina proteica es diantina y/o saporina.
[0094] Una forma de realización es la combinación terapéutica que comprende la segunda o la tercera composición farmacéutica de la invención, en la que el resto efector comprendido por la segunda molécula proteica o por la tercera molécula proteica comprende o consiste en al menos una carga útil, preferiblemente seleccionada entre una o más de una toxina que se dirige a los ribosomas, una toxina que se dirige a los factores de elongación, una toxina que se dirige a la tubulina, una toxina que se dirige al ADN y una toxina que se dirige al ARN, más preferiblemente cualquiera o cualesquiera de emtansina, pasudotox, derivado de maitansinoide DM1, derivado de maitansinoide DM4, monometil auristatina E (MMAE, vedotina), monometil auristatina F (MMAF, mafodotina), una calicheamicina, N-acetil-Y-calicheamicina, un dímero de pirrolobenzodiazepina (PBD), una benzodiazepina, un análogo de CC-1065, una duocarmicina, docexorubrubilina cisplatino, ciclofosfamida, etopósido, docetaxel, 5-fluorouracilo (5-FU), mitoxantrona, una tubulisina, una indolinobenzodiazepina, AZ13599185, una criptoficina, rizoxina, metotrexato, una antraciclina, un análogo de camptotecina, SN-38, DX-8951f, mesilato de exatecano, forma truncada de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (PE38), un derivado de duocarmicina, una amanitina, a-amanitina, una espliceostatina, una tailanstatina, ozogamicina, tesirina, amberstatina269 y soravtansina, o uno de sus derivados.
[0095] Una sustancia farmacéuticamente activa en esta invención es un resto efector que se usa para lograr un resultado beneficioso en un organismo, preferiblemente un vertebrado, más preferiblemente un ser humano tal como un paciente con cáncer o un paciente autoinmune. El beneficio incluye el diagnóstico, pronóstico, tratamiento, cura y/o prevención de enfermedades y/o síntomas. La sustancia farmacéuticamente activa también puede provocar efectos secundarios dañinos no deseados. En este caso, se deben sopesar los pros y los contras para decidir si la sustancia farmacéuticamente activa es adecuada en cada caso particular. Si el efecto de la sustancia farmacéuticamente activa dentro de una célula es predominantemente beneficioso para todo el organismo, la célula se denomina célula diana. Si el efecto dentro de una célula es predominantemente dañino para todo el organismo, la célula se denomina célula no diana u off target. En sistemas artificiales como cultivos celulares y biorreactores, las células diana y las células no diana dependen del propósito y las define el usuario.
[0096] Un resto efector que es un polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido que recupera una función perdida, tal como, por ejemplo, reemplazo de enzimas, funciones de regulación de genes o una toxina.
[0097] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que la primera molécula proteica comprende más de una saponina, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64 o 1-100 saponinas, o cualquier número intermedio de saponinas, como 7, 9, 12 saponinas, unidas covalentemente de manera directa a un residuo de aminoácido de la primera molécula proteica, preferiblemente a una cisteína y/o a una lisina, y/o unidas covalentemente a través de al menos una porción conectora y/o mediante al menos una porción conectora escindible y/o mediante al menos un armazón funcionalizado polimérico u oligomérico, preferiblemente 1-8 de tales armazones o 2-4 de tales armazones, en donde al menos un armazón se basa opcionalmente en un dendrón, donde 1-32 saponinas tales como 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32 saponinas, o cualquier número intermedio de saponinas, como 7, 9, 12 saponinas, están unidas covalentemente al dicha al menos un armazón.
[0098] En la Tabla A1 y el Esquema I y las formas de realización anteriores se resumen una serie de saponinas que se han identificado por su actividad potenciadora del escape endosomal cuando entran en contacto con células de mamífero, en particular células tumorales humanas, en forma libre junto con una segunda molécula (por ejemplo, un resto efector o molécula efectora, como una toxina, un oligonucleótido). De hecho, en los bioensayos basados en células que utilizan células tumorales humanas se estableció, para las saponinas recogidas en la Tabla A1 y las del Esquema I y en las diversas formas de realización de la invención descritas en este documento, que bajo la influencia de estas saponinas, cuando se unen a la primera molécula proteica, se administra una segunda molécula (resto efector) como un ácido nucleico y/o una toxina como una toxina proteica (por ejemplo, una o más de las toxinas proteicas enumeradas en la Tabla A5), unida a la segunda o tercera molécula proteica, al citosol con mayor eficiencia y/o eficacia, presumiblemente a través de la liberación intracelular de los endosomas (tardíos) y lisosomas. Es decir, el escape endosomal y/o lisosómico de dichas segundas moléculas (restos efectores unidos a una segunda o tercera molécula proteica de la invención), por ejemplo, ácidos nucleicos y/o toxinas, es menos eficaz en ausencia de la saponina.
[0099] Sorprendentemente, los inventores ahora demuestran que una fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria, incluyendo QS-21 y los miembros de su familia QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, QS-18 y Quil-A, también posee la capacidad de potenciar un efecto biológico in vitro de, por ejemplo, un ácido nucleico unido a un anticuerpo monoclonal o una toxina proteica unida a un anticuerpo monoclonal (ejemplos de una segunda y/o tercera molécula proteica de la invención que comprende un oligonucleótido unido covalentemente o una carga útil como una toxina (proteica)), cuando se administra a las células tumorales de una especie de mamífero (humano) en forma de un conjugado covalente que comprende un anticuerpo monoclonal (primera molécula proteica de la invención), junto con la segunda y/o tercera molécula proteica que comprende el resto efector (la segunda y/o tercera molécula proteica) y el al menos un glucósido tal como QS-21 y las saponinas que forman parte de su familia abarcadas por tal preparación QS-21 (por ejemplo, fracción hidrosoluble de Quillaja saponaria), comprendida por la primera molécula proteica como un conjugado covalente, donde la molécula efectora y el glucósido, por ejemplo, fracción de saponina de Quillaja saponaria, QS-21, SO1861, SA1641, GE1741, se unen covalentemente a, por ejemplo, las moléculas proteicas de manera directa o mediante una porción conectora o mediante un armazón funcionalizado polimérico u oligomérico, ya sea directamente o mediante al menos una porción conectora. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, la estimulación o potenciación observada de, por ejemplo, la reducción mediada por BNA antisentido de la expresión de HSP27 en células tumorales (silenciamiento del gen HSP27) en presencia de saponinas derivadas de Quillaja saponaria in vitro(también) puede asociarse con la activación del inflamasoma de la célula tumoral por las saponinas, por ejemplo dando como resultado la piroptosis de la célula tumoral. Los inventores establecieron que la segunda y tercera moléculas proteicas conjugadas con, por ejemplo, BNA antisentido o diantina o saporina, ejercían actividad antitumoral en células in vitro o mejoraban la actividad antitumoral en células cuando se ponían en contacto con células en bioensayos de células, cuando estaba presente la primera molécula proteica de la invención, que comprende la saponina, y se dirigían a las mismas células (tumorales) que la molécula de la superficie celular a la que se dirigía la segunda y/o tercera molécula proteica, mientras que, en ausencia de la primera molécula proteica y por tanto, en ausencia de saponina, no se observó tal actividad hacia la célula tumoral.
[0100] QS-21, y también la fracción de saponinas hidrosolubles que comprende QS-21 de Quillaja saponaria, se conocen desde hace mucho tiempo y se han estado aplicando de forma intensiva por sus capacidades inmunopotenciadoras, por ejemplo, como adyuvante en, por ejemplo, vacunas de subunidades. Por ejemplo, QS-21 se aplicó en dos ensayos clínicos de fase III con pacientes humanos, que fueron vacunados con una vacuna de subunidades mezclada con un adyuvante que comprendía QS-21 (Glaxo-Smith-Kline, ensayo MAGRIT, estudio DERMA), donde la subunidad fue la proteína MAGE-A3, que se expresa y presenta específicamente en células tumorales. Las vacunas antitumorales, potenciadas con QS-21, tenían como objetivo la extensión de la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con cáncer (melanoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas). Además, QS-21 se ha evaluado como adyuvante en ensayos clínicos para el desarrollo de tratamientos de vacunas contra el cáncer, para vacunas para la infección por VIH-1, en el desarrollo de una vacuna contra la hepatitis B y para el desarrollo de vacunas contra la malaria utilizando QS-21 con los adyuvantes AS01 y AS02 de Glaxo-Smith-Kline. Estudios anteriores habían revelado una respuesta inmune provocada contra péptidos MAGE-A3 presentados en la superficie de la célula cancerosa, bajo la influencia del adyuvante que comprendía la saponina QS-21 (AS15; GSK). Para sorpresa de los inventores, la fracción de saponina de Quillaja saponaria y, por lo tanto, probablemente QS-21 (como parte de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria) potencia la actividad celular antitumoral de, por ejemplo, una carga útil como una toxina proteica (diantina), unida a la segunda molécula proteica (por ejemplo, el ligando EGF).
[0101] Los inventores muestran que un anticuerpo monoclonal dirigido a células tumorales provisto de BNA antisentido acoplado covalentemente, como BNA (HSP27), y que se puso en contacto con las células tumorales junto con una primera molécula proteica de la invención con saponina acoplada covalentemente (por ejemplo, SO1861, QS-21 ), con tanto el BNA como la saponina acoplados al anticuerpo respectivo (por ejemplo, cetuximab) de la primera y tercera molécula proteica a través de un enlace escindible, es capaz de silenciar HSP27 in vivo en tumores, en comparación con el control y en comparación con AOC (tercera molécula proteica) solamente, sin presencia de la primera molécula proteica con saponina acoplada. La coadministración de un ADC o un conjugado de anticuerpo-oligonucleótido (AOC), como un conjugado de anticuerpo-BNA, con una primera molécula proteica con una saponina confiere al ADC o AOC una actividad celular antitumoral que no se observa solo con el ADC o solo con el AOC a la misma dosis. Cabe destacar que el AOC (la segunda o tercera molécula proteica) y el anticuerpo monoclonal con saponina acoplada covalentemente (primera molécula proteica) aumentan la expresión de HSP27 en las células tumorales, cuando se administran a ratones con tumores por separado en grupos separados de ratones, en comparación con un grupo de control (vehículo administrado, solamente). Solo la coadministración del AOC que comprende el resto efector de la invención (segunda o tercera molécula proteica) y la primera molécula proteica con saponina acoplada covalentemente muestra una expresión de HSP27 reducida en comparación con los controles. El BNA antisentido (HSP27) era BNA con secuencia de ácido nucleico 5'-GGCacagccagtgGCG-3 'según Zhang et al. (2011) [Y Zhang, Z Qu, S Kim, V Shi, B Liao1, P Kraft, R Bandaru, Y Wu, LM Greenberger e ID Horak, Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid (LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection, Gene Therapy (2011) 18, 326-333]. Es digno de mención que, según el mejor conocimiento de los inventores, el BNA está diseñado para su aplicación como ácido nucleico libre. Los inventores son ahora los primeros en demostrar que el BNA antisentido puede acoplarse covalentemente a través de una porción conectora (no) escindible con un ligando o un anticuerpo, de manera que la actividad de silenciamiento génico se conserva in vitro y, lo que es más importante, in vivo en las células tumorales de un animal con tumores. Este enfoque de proporcionar AOC basados en BNA abre nuevas formas de administrar BNA dirigido a pacientes humanos (de cáncer) que lo necesiten.
[0102] Los inventores describen en este documento que el acoplamiento covalente de saponinas, tales como saponinas de la fracción hidrosoluble de Quillaja saponaria, QS-21, SA1641, SO1861, Tabla A1, Esquema I, a una primera molécula proteica, tal como a través de una porción conectora trifuncional, por ejemplo, la porción conectora trifuncional del Esquema II y la Estructura B, o mediante una estructura oligomérica o polimérica de un armazón que comprende saponinas unidas covalentemente, da como resultado una toxicidad celular mejorada ejercida por el resto efector tal como una toxina, comprendida por la segunda y/o la tercera molécula proteica, bajo la influencia de la saponina acoplada covalentemente en la primera molécula proteica.
[0103] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención que comprende una saponina que comprende una o varias o todas las características estructurales indicadas de la saponina de Estructura A del Esquema I, la saponina de estructura A denominada saponina con una estructura 'ideal' cuando el escape endosomal mejora la actividad hacia un resto efector presente en el endosoma de una célula en contacto con la primera molécula proteica, y/o una saponina seleccionada de una o más de las saponinas adicionales del Esquema I:
ESQUEMA I ESQUEMA I (continuación)
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ESQUEMA I (continuación)
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Ċ
ESQUEMA I (continuación)
Ċ
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ESQUEMA I (continuación)
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Según la invención, un glucósido, tal como una saponina seleccionada del grupo que consiste en: SO1861, SA1641, GE1741, QS-21, QS-21A, QS21-B, Quil-A, SO1832, SO1904 y SO1862 de acuerdo con el invención, unido a la primera molécula proteica de la invención, que tiene la estructura 'ideal' para el fin de mejorar el escape endosomal de una molécula efectora unida a la segunda o tercera molécula proteica de la invención, es una saponina bisdesmosídica de acuerdo con la Estructura A del Esquema I, que tiene una masa molecular de al menos 1500 Dalton y que comprende un triterpeno de tipo oleanano que contiene un grupo aldehido en la posición C-23 y opcionalmente un grupo hidroxilo en la posición C-16, con una primera cadena lateral hidrocarbonada ramificada en la posición C-3, donde dicha primera cadena lateral hidrocarbonada ramificada contiene opcionalmente ácido glucurónico, en la que la saponina contiene un grupo éster con una segunda cadena lateral hidrocarbonada ramificada en la posición C-28, donde dicha segunda cadena hidrocarbonada ramificada preferiblemente comprende al menos cuatro unidades hidrocarbonadas, conteniendo opcionalmente al menos un residuo acetilo tal como dos residuos acetilo y/o comprendiendo opcionalmente desoxi carbohidratos y/o comprendiendo opcionalmente quinovosa y/o comprendiendo opcionalmente glucosa y/o comprendiendo opcionalmente ácido 4-metoxicinámico y/o comprendiendo opcionalmente ácido 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico y/o que comprende opcionalmente ácido 5-O-[5-O-Rha-(142)-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico unido a un carbohidrato mediante un enlace éster.
[0104] SO1861 es diferente de la "estructura ideal" mostrada en el Esquema I, Estructura A, solo porque tiene un solo residuo de acetilo en la quinovosa y tiene una xilosa adicional. La "estructura ideal" de una saponina para mejorar el escape endosomal de una molécula efectora o resto efector es una saponina que preferiblemente tiene la Estructura A del Esquema I, y las saponinas que muestran la actividad potenciadora del escape endosomal tienen una o más de las características estructurales que se muestran en la Estructura A del Esquema I. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, los inventores creen que la Estructura A del Esquema I representa una "saponina ideal" (y no una saponina de requisito mínimo) para la actividad de mejora del escape endosomal, lo que significa que no todas las estructuras (grupos químicos) pueden o deben estar presentes en cada saponina con al menos suficiente actividad potenciadora del escape endosomal para promover la acumulación del resto efector en el citosol, lo que significa que algunas saponinas pueden tener otros elementos estructurales como cadenas acilo, y/o para otras saponinas que muestran actividad potenciadora del escape endosomal, los azúcares pueden ser diferentes a los azúcares mostrados en el Esquema I. Por ejemplo, la saponina QS-21 y algunas de las saponinas de la fracción hidrosoluble de Quillaja saponaria (Saponinas de Quillaja; Quil-A) difieren en la modificación del carbohidrato de C-28 cuando se considera la estructura ideal de la Estructura A del Esquema I: presencia de una cadena acilo en QS-21, por ejemplo. En la fracción hidrosoluble de Quillaja saponaria, las saponinas como QS-7, QS1862, son similares a la Estructura A ideal y son similares a SO1861.
[0105] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que al menos una porción conectora es una porción conectora no escindible o una porción conectora escindible, donde la porción conectora escindible se somete, por ejemplo, a escisión en condiciones ácidas, condiciones reductoras, condiciones enzimáticas o condiciones inducidas por luz, y preferiblemente la porción conectora escindible comprende un enlace hidrazona o un enlace hidrazida sometido a escisión en condiciones ácidas cuando se une a saponina, y/o comprende un enlace susceptible a lam proteólisis, por ejemplo proteólisis por catepsina B, y/o es un enlace susceptible a la escisión en condiciones reductoras, como un puente disulfuro, cuando se une a la saponina.
[0106] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que la porción conectora escindible se somete a escisión in vivo en condiciones ácidas como las presentes en los endosomas y/o lisosomas de células de mamífero, preferiblemente células humanas, preferiblemente a pH 4,0-6,5, y más preferiblemente a pH < 5,5, cuando la porción conectora escindible está unida a una saponina.
[0107] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que el armazón oligomérico o polimérico comprende una estructura polimérica u oligomérica y comprende un grupo químico, el grupo químico para el acoplamiento covalente del armazón al residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica.
[0108] De acuerdo con la invención, típicamente la saponina es una saponina enumerada en la Tabla A1, Esquema I. Se ha demostrado que es beneficioso para la actividad de la saponina, por ejemplo, el escape endosomal mejora la actividad dentro de las células cuando se tiene en cuenta la entrada en la célula y la acumulación dentro del citosol de un resto efector acoplado covalentemente a la segunda o tercera molécula proteica, cuando la saponina está acoplada covalentemente a la primera molécula proteica mediante un enlace hidrazona y/o un enlace hidrazida y/o un puente disulfuro. Dichos tipos de enlaces se escinden fácilmente en condiciones ácidas dentro de endosomas (tardíos) y lisosomas de células de mamíferos, por ejemplo, células humanas y/o en condiciones reductoras. Alternativamente, los inventores también demuestran que el acoplamiento covalente de saponina a la primera molécula proteica mediante un enlace que no se puede escindir fácilmente en las condiciones fisiológicas del interior de las células, por ejemplo, endosomas (tardíos), lisosomas, citosol, también es beneficioso para la actividad potenciadora de la saponina sobre el efecto biológico de, por ejemplo, un resto efector como un ácido nucleico (por ejemplo, BNA que silencia HSP27) y una toxina proteica como la saporina. En toda la solicitud, incluidas las reivindicaciones, el término "porción conectora escindible", "enlace escindible", etc., también se denomina "porción conectora lábil" ("L") y "enlace lábil", por ejemplo, en el contexto de la escisión de dicho enlace o porción conectora en el endosoma (tardío) y/o lisosoma cuando un conjugado de la invención, por ejemplo, una primera molécula proteica que comprende opcionalmente un armazón con saponinas acopladas a la primera molécula proteica a través de una porción conectora y/o mediante el armazón mediante enlaces hidrazona o puentes disulfuro. Por ejemplo, las Figuras 6 y 7 muestran el silenciamiento del gen HSP27 in vivo en tumores humanos en ratones. Se trató a los ratones con tumores con una primera molécula proteica que consistía en un anticuerpo monoclonal con saponina unida a él mediante una porción conectora lábil (enlace hidrazona) según la invención, mientras que la tercera molécula proteica comprendía BNA antisentido unido para silenciar el gen HSP27 en las células tumorales, acoplado covalentemente al anticuerpo monoclonal (del mismo tipo que el primer anticuerpo monoclonal) mediante un puente disulfuro. Es decir, sin querer ceñirse a ninguna teoría, el enlace hidrazona y el puente disulfuro se escinden en los endosomas (tardíos) y/o lisosomas de las células tumorales diana que expresan el epítopo en la molécula de la superficie de la célula diana, en este caso el EGFR, en la superficie celular, una vez que la combinación terapéutica de la invención es internalizada, por ejemplo, por endocitosis. Es probable que la escisión de los enlaces contribuya al escape endosomal, mejorando la actividad de la saponina cuando se tiene en cuenta la entrada del BNA desde el endosoma y/o lisosoma al citosol, aunque dicha escisión no es necesaria para que haya efecto de silenciamiento génico de la combinación del conjugado cetuximab-SO1861 y el conjugado cetuximab-BNA de la invención.
[0109] El experto en la materia apreciará que una porción conectora trifuncional es un armazón de la invención adecuado para acoplar covalentemente uno, dos o tres restos de saponina. Para la porción conectora trifuncional, se prefiere el acoplamiento covalente de uno o dos restos de saponina. El segundo y/o tercer sitio de unión es adecuado, por ejemplo, para el acoplamiento covalente de un ligando proteico tal como la primera molécula proteica. Los ligandos proteicos típicos son EGF para dirigirse a células (tumorales) que expresan EGFR en la superficie celular, y citocinas para dirigirse a células tumorales o células autoinmunes. Además, el segundo o tercer sitio de unión de la porción conectora trifuncional es adecuado para el acoplamiento covalente de una inmunoglobulina tal como un anticuerpo monoclonal, es decir, la primera molécula proteica para la unión a una molécula de la superficie celular tal como una molécula de la superficie de una célula tumoral, preferiblemente una molécula específica de las células tumorales, más preferiblemente un receptor de células tumorales que se expresa específicamente (sobreexpresa) en la superficie de las células tumorales. De manera similar, la inmunoglobulina, o cualquier fragmento(s) y/o dominio(s) de la misma que abarque la especificidad de unión de la inmunoglobulina es adecuada para la unión a una molécula de la superficie celular, como un receptor, expresada en la superficie de una célula autoinmune. Por lo tanto, en una forma de realización, la primera molécula proteica comprende la porción conectora trifuncional, donde dicha porción conectora comprende o consiste en una saponina unida covalentemente, por ejemplo, QS-21, SO1861, y el sitio de unión unido covalentemente, como un resto de direccionamiento hacia células, como un ligando o un anticuerpo para la unión (específica) a una célula tumoral, una célula autoinmune, una célula enferma, una célula aberrante, una célula no sana, una enfermedad de los linfocitos B.
[0110] Se proporciona y no se reivindica la primera molécula proteica de la invención, que comprende la porción conectora oligomérica trifuncional como estructura del núcleo del armazón, de acuerdo con el Esquema II:
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en el que las saponinas están unidas covalentemente al armazón de la porción conectora trifuncional mediante porciones conectoras hidrazona lábiles y escindibles (sensibles a los ácidos) y/o mediante un enlace que comprende maleimida, mientras que la unión del armazón al sitio de unión, como un anticuerpo, se establece mediante porciones conectoras de hidrazona lábiles y escindibles (sensibles a los ácidos) y/o mediante un enlace que comprende maleimida con cisteínas en el sitio de unión, tal como 1, 2, 3 o 4 cisteínas, formando así la Estructura B:
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Estructura B,
de modo que 1-4 armazones estén unidos covalentemente a un único anticuerpo, por ejemplo, como un anticuerpo monoclonal.
[0111] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención en la que la molécula de glucósido es una saponina y el enlace entre la saponina y la primera molécula proteica se produce preferiblemente a través de un enlace lábil en medio ácido que es estable a pH 7,4 y, preferiblemente libera la saponina por debajo de pH 6,5, más preferiblemente entre pH 6,5 y 5,0. Esto se realiza, por ejemplo, mediante una imina formada por un grupo amino de una porción conectora que une la saponina y la primera molécula proteica y el grupo aldehído de la saponina. También se pueden usar otros enlaces químicos que cumplen la condición de pH para el acoplamiento de aldehídos, por ejemplo, hidrazonas o acetales particulares, que requieren hidrazidas y grupos hidroxilo como grupo funcional de la porción conectora, respectivamente. Si el enlace es un enlace escindible, una saponina se une preferiblemente a la estructura polimérica u oligomérica de un armazón mediante una función aldehído o mediante uno de los grupos carboxilo de la saponina, más preferiblemente a través del grupo aldehído, preferiblemente un grupo aldehído en la posición 23. Alternativamente, una saponina se une preferiblemente a la primera molécula proteica a través de la estructura polimérica u oligomérica del armazón a través de una porción conectora que conecta la estructura polimérica u oligomérica del armazón, ya sea a través del grupo aldehído o mediante el grupo ácido carboxílico de la molécula de glucósido, es decir, la saponina.
[0112] Se proporciona, pero no se reivindica, la primera molécula proteica de la invención, en la que al menos una saponina está unida a la primera molécula proteica mediante un enlace estable. Se proporciona, pero no se reivindica, que el enlace estable entre la primera molécula proteica de saponina se produzca preferiblemente a través de un acoplamiento de amida o formación de amina. Esto se realiza, por ejemplo, mediante la formación de un enlace amida mediado por carbodiimida mediante un grupo amino de una estructura de armazón polimérico u oligomérico que une la saponina y la primera molécula proteica entre sí, y el grupo ácido glucurónico activado de la saponina. Los enlaces químicos que cumplen la definición de enlace estable también se pueden utilizar para el acoplamiento de aldehídos, por ejemplo, aminas particulares derivadas después de la aminación reductora, que requieren grupos amino primarios como grupo funcional de una estructura polimérica u oligomérica de un armazón o una porción conectora. Si el enlace es un enlace estable, la saponina se une preferiblemente a una porción conectora o un armazón a través de uno de los grupos carboxilo de la saponina, donde la porción conectora o armazón se une además a la primera molécula proteica.
[0113] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que la saponina se acopla al sitio de unión mediante un armazón según la invención, en el que el grupo químico para el acoplamiento covalente del armazón al sitio de unión es un grupo de química clic.
[0114] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que la saponina se acopla al sitio de unión a través de un armazón según la invención, en la que el grupo de química clic es una tetrazina, una azida, un alqueno o un alquino, o un derivado cíclico de cualquiera de estos grupos, preferiblemente una azida. Un grupo de química clic es un grupo químico funcional adecuado para la química clic, que se define como una reacción que es modular, de amplio alcance, que da rendimientos muy altos, que genera solo subproductos inofensivos, que ofrece alta selectividad y alta tolerancia para diferentes grupos funcionales y que es estereoespecífica. Las características requeridas del proceso incluyen condiciones de reacción simples, materiales de partida y reactivos de fácil obtención, sin uso de disolvente o con uso de un disolvente que sea benigno (como el agua) o que se elimine fácilmente, y el aislamiento simple del producto. El grupo de química clic para acoplar la saponina al sitio de unión en la primera molécula proteica, opcionalmente a través de un armazón o una porción conectora, es preferiblemente una tetrazina, azida, alqueno o alquino, o derivados reactivos de estos, como metil-tetrazina o maleimida (alqueno), más preferiblemente un alquino, o un derivado cíclico de estos grupos, tal como ciclooctina (por ejemplo, azadibenzociclooctina, difluorociclooctina, biciclo[6.1.0]non-4-ina, dibenzociclooctina).
[0115] De este modo, una primera molécula proteica según la invención comprende al menos una saponina seleccionada del grupo que consiste en: SO1861, SA1641, GE1741, QS-21, QS-21A, QS21-B, Quil-A, SO1832, SO1904 y SO1862. Por "al menos una”, en este contexto, se entiende que la primera molécula proteica comprende una molécula de saponina pero también puede comprender un par (por ejemplo, dos, tres o cuatro) de saponinas o una multitud (por ejemplo, 10, 20 o 100) de saponinas. Dependiendo de la aplicación, la primera molécula proteica puede comprender un armazón unido covalentemente a saponinas unidas covalentemente, en donde el armazón puede diseñarse de manera que comprenda un número definido de saponinas. Preferiblemente, una primera molécula proteica de acuerdo con la invención comprende un número o rango definido de saponinas, en lugar de un número aleatorio. Esto es especialmente ventajoso para el desarrollo de fármacos por lo que respecta a la autorización de comercialización. Un número definido a este respecto significa que una primera molécula proteica comprende preferiblemente un número previamente definido de saponinas. Esto se logra, por ejemplo, diseñando un armazón que comprenda una estructura polimérica con un cierto número de posibles restos para que se unan las saponinas. En circunstancias ideales, todos estos restos se acoplan a una saponina y el armazón comprende el número definido anteriormente de saponinas. Se prevé ofrecer un conjunto estándar de armazones, que comprenda, por ejemplo, dos, cuatro, ocho, dieciséis, treinta y dos, sesenta y cuatro, etc., saponinas, de modo que el usuario pueda probar fácilmente el número óptimo de acuerdo con sus necesidades. Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención que comprende el armazón de la invención, en la que la saponina está presente en un rango definido, como, por ejemplo, en circunstancias no ideales, no todos los restos presentes en una estructura polimérica se unen a una saponina. Dichos rangos pueden ser, por ejemplo, de 2 a 4 moléculas de saponina por armazón, de 3 a 6 moléculas de saponina por armazón, de 4 a 8 moléculas de saponina por armazón, de 6 a 8 moléculas de saponina por armazón, de 6 a 12 moléculas de saponina por armazón y así sucesivamente. En tal caso, una primera molécula proteica que comprende un armazón según la invención comprende, por tanto, 2, 3 o 4 saponinas si el rango se define como 2-4.
[0116] El armazón es fundamentalmente independiente del tipo de saponina unida covalentemente al armazón, y el armazón posteriormente (en orden secuencial) se acopla covalentemente a la primera molécula proteica. Por tanto, la primera molécula proteica que comprende el armazón es el producto de base para una nueva tecnología de plataforma. Dado que la al menos una saponina unida covalentemente media en la administración intracelular del resto efector unido a la segunda molécula proteica, la tecnología de armazón según la invención es el primer sistema conocido que media en la administración intracelular controlada del resto efector por las saponinas. El armazón proporciona una unidad optimizada y funcionalmente activa que se puede unir a la(s) saponina(s) y al sitio de unión comprendido por la primera molécula proteica, por ejemplo, un ligando, un anticuerpo, etc., en una posición única y definida.
[0117] Se proporciona, pero no se reivindica, la primera molécula proteica que comprende un armazón según la invención, en la que el número de monómeros de la estructura polimérica u oligomérica es un número o rango exactamente definido. Preferiblemente, la estructura polimérica u oligomérica comprende estructuras como poli(aminas), por ejemplo, polietilenimina y poli(amidoamina), o estructuras como polietilenglicol, poli(ésteres), como poli(lactidas), poli(lactamas), copolímeros de polilactida-co-glicólido, poli(dextrina), o un péptido o una proteína, o estructuras tales como poliaminoácidos naturales y/o artificiales, por ejemplo, polilisina, polímeros de ADN, polímeros de ARN estabilizados o polímeros de APN (ácido nucleico peptídico), que aparecen como un polímero lineal, ramificado o cíclico, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado o conjuntos de estas estructuras, de carácter puro o mixto. Preferiblemente, las estructuras poliméricas u oligoméricas son biocompatibles, en donde biocompatible significa que la estructura polimérica u oligomérica no muestra toxicidad aguda o crónica sustancial en los organismos y se puede excretar íntegra o completamente degradada en compuestos excretables y/o fisiológicos mediante el metabolismo del organismo.
Los ensamblajes se pueden construir mediante reticulación covalente o enlaces y/o atracción no covalentes. Por lo tanto, también pueden formar nanogeles, microgeles o hidrogeles, o pueden unirse a vehículos como nanopartículas inorgánicas, coloides, liposomas, micelas o estructuras en forma de partículas que comprenden colesterol y/o fosfolípidos. Dichas estructuras poliméricas u oligoméricas llevan preferiblemente un número o rango exactamente definido de restos de acoplamiento para el acoplamiento de moléculas de glucósidos (y/o moléculas efectoras y/o moléculas portadoras tales como un ligando, anticuerpo monoclonal o un fragmento de los mismos). Preferiblemente al menos un 50 %, más preferiblemente al menos un 75 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, más preferiblemente al menos un 98 %, más preferiblemente al menos un 99 %, de la manera más preferible el 100 % del número o rango exactamente definido de restos de acoplamiento en la estructura polimérica u oligomérica está ocupado por una molécula de glucósido en un armazón según la invención.
[0118] Preferiblemente, un dendrón es un polímero ramificado y claramente definido con estructura similar a un árbol con un solo grupo químicamente direccionable en el origen del árbol, llamado punto focal. Un dendrímero es una conexión de dos o más dendrones en su punto focal. Un polímero dendronizado es una conexión del punto focal de uno o más dendrones a un polímero. En una forma de realización preferida, se proporciona un armazón según la invención, en el que la estructura polimérica u oligomérica comprende un polímero lineal, ramificado o cíclico, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado o conjuntos de estas estructuras, ya sean de carácter puro o mixto, donde los ensamblajes se pueden construir mediante reticulación covalente o atracción no covalente y pueden formar nanogeles, microgeles o hidrogeles, y donde, preferiblemente, el polímero es un derivado de una poli(amina), por ejemplo, polietilenimina y poli(amidoamina), y estructuras como polietilenglicol, poli(ésteres), como poli(lactidas), poli(lactamas), copolímeros de polilactida-co-glicólido y poli(dextrina), y estructuras como poliaminoácidos naturales y/o artificiales tales como polilisina, o un péptido o una proteína o polímeros de ADN, polímeros de ARN estabilizados o polímeros de APN (ácido nucleico peptídico). Preferiblemente, las estructuras poliméricas u oligoméricas son biocompatibles.
[0119] Una forma de realización es la combinación terapéutica de la invención o la combinación terapéutica para su uso según la invención, en la que la primera molécula proteica comprende más de una saponina unida covalentemente, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64, 128 o 1-100 saponinas, o cualquier número de saponinas entre ellas, tales como 7, 9, 12 saponinas.
[0120] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que la al menos una saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica del armazón oligomérico o polimérico mediante al menos una porción conectora escindible según la invención.
[0121] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que el grupo químico del armazón oligomérico o polimérico, para el acoplamiento covalente del armazón oligomérico o polimérico al residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, es un grupo de química clic, preferiblemente seleccionado de una tetrazina, una azida, un alqueno o un alquino, o un derivado cíclico de estos grupos, más preferiblemente dicho grupo químico es una azida.
[0122] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que la estructura polimérica u oligomérica del armazón oligomérico o polimérico comprende un polímero lineal, ramificado y/o cíclico, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado, un ADN, un polipéptido, polilisina, un polietilenglicol o un ensamblaje de estas estructuras poliméricas u oligoméricas, donde el ensamblaje se construye preferiblemente mediante reticulación covalente.
[0123] Los inventores establecieron que el acoplamiento covalente, preferiblemente a través de enlaces o porciones conectoras escindibles, de la saponina a la primera molécula proteica, según cualquiera de las formas de realización anteriores, proporciona una potenciación eficaz y dirigida a la célula de la actividad de un resto efector unido a la segunda y a la tercera molécula proteica, en la que la primera y tercera moléculas proteicas comprenden el mismo primer sitio de unión y en la que la primera y segunda moléculas proteicas comprenden un primer y segundo sitio de unión que son diferentes. El acoplamiento de la saponina a una cadena lateral de cisteína o una cadena lateral de lisina de la primera molécula proteica, como un anticuerpo monoclonal, directamente o mediante una porción conectora, demostró ser una forma beneficiosa de administración específica y eficiente de la actividad potenciadora del resto efector dentro de la célula diana, cuando también el resto efector se administra en la misma célula diana usando la segunda y/o tercera molécula proteica que comprende el mismo primer sitio de unión que la primera molécula proteica cuando se tiene en cuenta la tercera molécula proteica y que comprende diferentes primer y segundo sitios de unión, respectivamente, cuando se tienen en cuenta la primera y segunda moléculas proteicas.
[0124] Para explicar la invención con más detalle, se describe el proceso de absorción celular de sustancias (aunque los inventores no desean ceñirse a ninguna teoría) y la terminología utilizada en esta invención. La captación de sustancias extracelulares en una célula por gemación de vesículas se llama endocitosis. Dicha formación de vesículas se puede caracterizar por (1) captación de ligando dependiente del receptor mediada por la proteína citosólica clatrina, (2) captación de la balsa lipídica mediada por la proteína de unión al colesterol, la caveolina, (3) captación inespecífica de líquido (pinocitosis), o (4) captación inespecífica de partículas (fagocitosis). Todos los tipos de endocitosis llevan a los siguientes procesos celulares de transporte de vesículas y clasificación de sustancias llamados vías endocíticas. Las vías endocíticas son complejas y no se comprenden completamente. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se pueden formar orgánulos de novo y madurar en el siguiente orgánulo a lo largo de la vía endocítica. Sin embargo, ahora se plantea la hipótesis de que las vías endocíticas implican compartimentos estables que están conectados por tráfico vesicular. Un compartimento es un orgánulo de membrana complejo y multifuncional que está especializado para un conjunto particular de funciones esenciales de la célula. Las vesículas se consideran orgánulos transitorios, de composición más simple y se definen como compartimentos cerrados por membranas que se forman de novo al brotar de un compartimento preexistente. A diferencia de los compartimentos, las vesículas pueden experimentar una maduración, que es una serie fisiológicamente irreversible de cambios bioquímicos. Los endosomas tempranos y los endosomas tardíos representan compartimentos estables en la vía endocítica, mientras que las vesículas endocíticas primarias, fagosomas, cuerpos multivesiculares (también llamados vesículas portadoras de endosomas), gránulos secretores e incluso lisosomas representan vesículas. La vesícula endocítica, que surge en la membrana plasmática, principalmente a partir de estructuras recubiertas de clatrina, se fusiona primero con el endosoma temprano, que es un compartimento principal de clasificación de aproximadamente pH 6,5. Una gran parte de la carga y las membranas internalizadas se reciclan de nuevo a la membrana plasmática a través de vesículas de reciclaje (vía de reciclaje). Los componentes que deben degradarse se transportan al endosoma tardío ácido (pH inferior a 6) a través de cuerpos multivesiculares. Los lisosomas son vesículas que pueden almacenar enzimas lisosomales maduras y llevarlas a un compartimento endosómico tardío cuando sea necesario. El orgánulo resultante se llama orgánulo híbrido o endolisosoma. Los lisosomas brotan del orgánulo híbrido en un proceso denominado regeneración de lisosomas. Los endosomas tardíos, los lisosomas y los orgánulos híbridos son orgánulos extremadamente dinámicos y la distinción entre ellos suele ser difícil. La degradación de una molécula endocitosada ocurre dentro de un endolisosoma o lisosoma. El escape endosomal es la liberación activa o pasiva de una sustancia desde el lumen interno de cualquier tipo de compartimento o vesícula de la vía endocítica, preferiblemente de la endocitosis mediada por clatrina, o vía de reciclaje hacia el citosol. Por tanto, el escape endosomal incluye, pero no se limita a, la liberación de endosomas, endolisosomas o lisosomas, incluidos sus orgánulos intermedios e híbridos.
[0125] A menos que se indique específicamente lo contrario y, en particular, cuando se refiere al mecanismo de escape endosomal de la molécula de glucósido tal como la saponina de la invención, siempre que la palabra "endosoma" o "escape endosomal" se use en este documento, también incluye el endolisosoma y lisosoma, y el escape del endolisosoma y lisosoma, respectivamente. Después de entrar al citosol, dicha sustancia podría trasladarse a otras unidades celulares como el núcleo.
[0126] En términos formales, un glucósido es cualquier molécula en la que un grupo azúcar está unido a través de su carbono anomérico a otro grupo a través de un enlace glucosídico. Las moléculas de glucósidos, tales como las saponinas, en el contexto de la invención son aquellas moléculas que además pueden mejorar el efecto de un resto efector, sin desear ceñirse a ninguna teoría, en particular que facilitan el escape endosomal del resto efector. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, las moléculas de glucósidos (saponinas, como las que se enumeran en la Tabla A1) interactúan con las membranas de los compartimentos y vesículas de la vía endocítica y de reciclaje y las hacen permeables para dichos restos efectores, lo que da como resultado un aumento del escape endosomal. Con la expresión "el armazón puede aumentar el escape endosomal del resto efector" se entiende que la al menos una saponina (molécula de glucósido), que está acoplada a la estructura polimérica u oligomérica del armazón, es capaz de mejorar el escape endosomal de un resto efector cuando ambas moléculas están dentro de un endosoma, por ejemplo, un endosoma tardío, opcional y preferiblemente después de que el al menos un glucósido tal como una saponina se libere de la primera molécula proteica, tal como de una porción conectora o estructura polimérica u oligomérica comprendida por dicha primera molécula proteica, por ejemplo, por escisión de un enlace escindible entre el al menos un glucósido (saponina) y la primera molécula proteica (por ejemplo, mediante una estructura polimérica u oligomérica de un armazón y/o mediante una porción conectora). Aunque un enlace entre el al menos un glucósido tal como una saponina según la invención y la primera molécula proteica, opcionalmente a través de una porción conectora o un armazón, puede ser un "enlace estable", eso no significa que dicho enlace no pueda escindirse en los endosomas mediante, por ejemplo, enzimas. Por ejemplo, el glucósido o la saponina, opcionalmente junto con una porción conectora o una parte de la estructura oligomérica o polimérica de un armazón, pueden separarse del fragmento de porción conectora restante o de la estructura oligomérica o polimérica. Podría ser, por ejemplo, que una proteasa esinda una porción conectora (proteica) o una estructura polimérica proteica, por ejemplo, albúmina, liberando así el al menos un glucósido, la saponina. Sin embargo, se prefiere que la molécula de glucósido (preferiblemente saponina) se libere en una forma activa, preferiblemente en la forma original que tenía antes de ser (preparada para ser) acoplada a la primera molécula proteica opcionalmente mediante una porción conectora y/o un armazón oligomérico o polimérico; por tanto, el glucósido (saponina) tiene su estructura natural después de tal escisión o el glucósido (saponina) tiene (parte de) un grupo químico o porción conectora unido al mismo, después de tal escisión, mientras que la actividad biológica del glucósido (actividad biológica de la saponina), por ejemplo, la actividad potenciadora del escape endosomal/lisosomal hacia un resto efector presente en el mismo endosoma o lisosoma, se mantiene o se restaura tras dicha escisión del enlace entre el glucósido (saponina) y la molécula portadora, es decir, la primera molécula proteica que comprende opcionalmente una porción conectora y/o un armazón de la invención. Con respecto a la presente invención, el término "estable”, con respecto a los enlaces entre por ejemplo, saponinas y residuos de aminoácidos de la primera molécula proteica, una porción conectora, estructuras poliméricas u oligoméricas (de el armazón), ligandos, inmunoglobulinas (monoclonales) o dominios de unión o fragmentos de las mismas, y/o efectores (restos efectores, moléculas efectoras), significa que el enlace no se rompe fácilmente o al menos no está diseñado para romperse fácilmente a causa de, por ejemplo, diferencias de pH, concentraciones de sal o condiciones reductoras con luz ultravioleta. Con respecto a la presente invención, el término "escindible" con respecto a los enlaces entre, por ejemplo, saponinas y la primera molécula proteica, porciones conectoras, residuos de aminoácidos, estructuras poliméricas u oligoméricas del armazón, ligandos, anticuerpos y/o efectores, significa que el enlace está diseñado para romperse fácilmente por, por ejemplo, diferencias de pH, concentraciones de sal, condiciones reductoras, y similares. El experto en la materia conoce estos enlaces escindibles y cómo prepararlos.
[0127] Antes de la presente invención, uno de los principales obstáculos para la introducción de ADC y AOC en el mercado era la ventana terapéutica corta: una dosis terapéuticamente eficaz de un ADC o un AOC va acompañada de efectos secundarios (inaceptables) que dificultan el desarrollo y la implicación en el tratamiento de los pacientes con los ADC. Mediante la aplicación de la primera molécula proteica de la invención, ahora es posible guiar una o múltiples moléculas de glucósidos (saponina) a una célula (diana) junto con el ADC que lleva una carga útil o junto con un anticuerpo (monoclonal) conjugado con un oligonucleótido tal como un BNA según la invención (es decir, una segunda o tercera molécula proteica particular de la invención). En particular, antes no era posible guiar específicamente un resto efector de una segunda o tercera molécula proteica y un número o rango particular (predefinido, controlable) de moléculas de glucósidos (saponinas) por resto efector al mismo tiempo al citosol de las células, por ejemplo, a través de la vía endocítica de una célula.
[0128] Una solución proporcionada por la invención comprende la unión covalente de al menos una saponina seleccionada del grupo que consiste en: SO1861, SA1641, GE1741, QS-21, QS-21A, QS21-B, Quil-A, SO1832, SO1904, y SO1862 a la primera molécula proteica. Una solución adicional proporcionada por la invención comprende (primero) polimerizar las moléculas de glucósidos (saponinas) usando un armazón oligomérico o polimérico, y proporcionar a la primera molécula proteica un grupo de saponinas unidas covalentemente, lo que permite volver a monomerizar una o más saponinas en el sitio intracelular donde se desea el modo de acción de la saponina, por ejemplo, después de la endocitosis. "Polimerizar" en este contexto significa la conjugación múltiple reversible y/o irreversible de moléculas de saponina a la primera molécula proteica, ya sea mediante una porción conectora o directamente o mediante una estructura polimérica u oligomérica para formar un armazón o la conjugación múltiple reversible y/o irreversible de saponinas (modificadas), formando así una estructura polimérica u oligomérica para formar un armazón. "Remonomerización”, en este contexto, significa la escisión de las saponinas de la primera molécula proteica, de la porción conectora que une las saponinas a la primera molécula proteica o del armazón, por ejemplo después de la endocitosis, y la recuperación del estado químico (nativo) de las saponinas no unidas, donde dichas saponinas no unidas pueden comprender o no grupos químicos adicionales tales como un grupo químico para unir la saponina a una porción conectora, un residuo de aminoácido de la primera molécula proteica o al armazón, y/o una porción conectora (química) unida a un grupo químico de la saponina tal como un grupo aldehído o un grupo ácido carboxílico. Debido a la química compleja de las saponinas, por ejemplo, la "polimerización" de las saponinas en un armazón u otra porción conectora de enlace y su "remonomerización" en una ubicación deseada, tal como intracelularmente, por ejemplo, después de la endocitosis, fue una tarea difícil. En particular, las reacciones químicas utilizadas para proporcionar las porciones conectoras y el armazón que comprenden glucósidos unidos covalentemente para la unión covalente a la primera molécula proteica, por ejemplo, saponinas triterpenoides (polimerización de los glucósidos), normalmente se dan en disolventes orgánicos exentos de agua, pero las saponinas y, por ejemplo, los polímeros biocompatibles aplicados como un armazón para llevar unidas saponinas, son moléculas hidrosolubles. Las propiedades químicas de la saponina no modificada impidieron aún más la polimerización por sí misma y, se estimó que otra posible solución, consistente en unir múltiples saponinas (directamente) a la molécula efectora, no era muy prometedora, ya que una molécula efectora (fármaco, toxina, polipéptido o polinucleótido) normalmente no proporciona suficientes sitios de unión y debido a que el producto de acoplamiento se volvería bastante heterogéneo y/o el acoplamiento de moléculas biológicamente activas como una saponina y, por ejemplo, un péptido, una toxina, un ácido nucleico juntos conlleva el riesgo de influir y obstaculizar la actividad de una o incluso ambas moléculas unidas entre sí en tal conjugado que comprende saponina. Además, existía un riesgo considerable de que el resto efector comprendido por la segunda o tercera molécula proteica perdiera su función después del acoplamiento de una saponina a por ejemplo, un ADC o un conjugado anticuerpooligonucleótido (AOC). Las formas de realización de la presente invención resuelven al menos uno de estos inconvenientes.
[0129] Un aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende la primera molécula proteica de la invención y la segunda molécula proteica de la invención.
[0130] Un aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende la primera molécula proteica de la invención y la tercera molécula proteica de la invención.
[0131] Una forma de realización es la composición que comprende la primera molécula proteica de la invención y la segunda molécula proteica de la invención, o es la composición que comprende la primera molécula proteica de la invención y la tercera molécula proteica de la invención, en la que el resto efector que está comprendido por la segunda molécula proteica o por la tercera molécula proteica es cualquiera de los restos efectores de acuerdo con la invención, preferiblemente un BNA.
[0132] Un aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende la primera molécula proteica de la invención y uno o más de un oligonucleótido, un ácido nucleico y un ácido xenonucleico, preferiblemente seleccionado de al menos uno de un un vector, un gen, un transgén que induce la apoptosis celular, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótido antisentido (ASO, AON), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aptámero de ADN, aptámero de ARN, ARNm, ADN de minicírculo, ácido nucleico peptídico (APN), oligómero morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico con puente (BNA), ácido 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleico (FANA), 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), ácido nucleico con puente 2'-O, 4'-aminoetileno, ácido 3'-fluorohexitol nucleico (FHNA), un plásmido, ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treosa-nucleico (TNA), o un derivado un derivado de estos, más preferiblemente un BNA, por ejemplo un BNA para silenciar la expresión de la proteína HSP27 (BNA antisentido (HSP27)).
[0133] Una molécula efectora, o resto efector, en el contexto de esta invención es cualquier sustancia que afecte al metabolismo de una célula por interacción con una diana molecular efectora intracelular, donde esta diana molecular efectora es cualquier molécula o estructura del interior de las células, excluyendo el lumen de los compartimentos y vesículas de la vía endocítica y de reciclaje, pero incluyendo las membranas de estos compartimentos y vesículas. Dichas estructuras del interior de las células incluyen, por tanto, el núcleo, las mitocondrias, los cloroplastos, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, otras vesículas de transporte, la parte interna de la membrana plasmática y el citosol. La administración citosólica de un resto efector en el contexto de la invención significa preferiblemente que el resto efector puede escapar del endosoma (y/o lisosoma), que, como se ha definido anteriormente, también incluye el escape del endolisosoma y del lisosoma, y preferiblemente puede alcanzar la diana efectora como se describe en el presente documento. La invención también abarca un nuevo tipo de molécula, a la que se hace referencia como armazón, que sirve para llevar tanto un resto efector como al menos una molécula de glucósido, como una saponina de la invención, en un endosoma al mismo tiempo en una proporción predefinida, cuando el resto efector está compuesto por la segunda o tercera molécula proteica de la invención y la saponina está compuesta por la primera molécula proteica. Dentro del contexto de la presente invención, la estructura polimérica u oligomérica del armazón es una formación ordenada estructuralmente, como un polímero, oligómero, dendrímero, polímero dendronizado u oligómero dendronizado, o es una estructura polimérica ensamblada como un hidrogel, microgel, nanogel, micela polimérica estabilizada o liposoma, pero excluye las estructuras que están compuestas por ensamblajes no covalentes de monómeros tales como mezclas de colesterol/fosfolípidos. Los términos "polímero, oligómero, dendrímero, polímero dendronizado u oligómero dendronizado" tienen su significado habitual. En particular, un polímero es una sustancia que tiene una estructura molecular construida principal o completamente a partir de un gran número de unidades iguales o similares unidas entre sí, y un oligómero es un polímero cuyas moléculas constan de relativamente pocas unidades repetidas. No hay consenso sobre un límite específico para "muchos" y "pocos" como se usa en la definición anterior de polímero y oligómero, respectivamente. Sin embargo, como el armazón puede comprender una estructura polimérica u oligomérica, o ambas, el rango completo de números de unidades similares unidas entre sí se aplica a dicha estructura, es decir, de 2 unidades monoméricas a 100 unidades monoméricas, 1000 unidades monoméricas y más. Una estructura que comprende 5 o menos, por ejemplo, puede llamarse estructura oligomérica, mientras que una estructura que comprende 50 unidades monoméricas puede llamarse estructura polimérica. Una estructura de 10 unidades monoméricas puede denominarse oligomérica o polimérica. Un armazón como se define en el presente documento comprende además al menos una molécula de glucósido, tal como una saponina de la invención. Un armazón incluye preferiblemente una estructura polimérica u oligomérica como poli u oligo(aminas), por ejemplo, polietilenimina y poli(amidoamina), y estructuras biocompatibles como polietilenglicol, poli (u oligo (ésteres)), como poli(lactidas), poli(lactamas), copolímeros de polilactida-co-glicólido y poli(dextrina), poli u oligosacáridos, como ciclodextrina o polidextrosa, y poli u oligoaminoácidos, como polilisina o un péptido o una proteína, u oligómeros o polímeros de ADN. Una estructura polimérica ensamblada como se define en el presente documento comprende al menos un armazón y, opcionalmente, otras estructuras poliméricas u oligoméricas individuales. Otras estructuras poliméricas u oligoméricas individuales de dicho ensamblaje pueden ser (a) armazones (que comprenden así al menos una molécula de glucósido, como una saponina de la invención), (b) armazones funcionalizados (que comprenden así al menos una molécula de glucósido, como una saponina, y un ligando, anticuerpo, etc., como la primera molécula proteica, (c) estructuras poliméricas u oligoméricas sin una molécula de glucósido tal como una saponina de la invención (véase la Tabla A1 por ejemplo), sin un ligando, anticuerpo, etc., como la primera molécula proteica. Una estructura polimérica ensamblada funcionalizada es una estructura polimérica ensamblada que contiene (a) al menos un armazón funcionalizado o (b) al menos un armazón y al menos una estructura polimérica que comprende al menos un ligando, anticuerpo, etc. como primera molécula proteica. Las estructuras poliméricas u oligoméricas dentro de una estructura polimérica ensamblada que no comprenden ninguna de las moléculas mencionadas anteriormente (es decir, sin glucósidos tales como saponinas, sin ninguna primera molécula proteica como ligandos, anticuerpos) se añaden en particular como componentes estructurales de las estructuras ensambladas, que ayudan a construir o estabilizar la estructura ensamblada (“de manera similar a un pegamento"). Sin querer ceñirse a ninguna teoría, el ambiente ácido parece ser un requisito previo para la acción sinérgica entre el glucósido (saponina) y el resto efector.
[0134] Con un ensayo como se describe en el Ejemplo 3 y como se conoce en la técnica, se puede determinar fácilmente si una primera molécula proteica que comprende saponinas, que comprende o no además una o más porciones conectoras (escindibles) y/u opcionalmente un armazón, es capaz de alterar el ambiente ácido e inhibir la función de escape endosomal del al menos un glucósido (saponina). La inhibición se describe como "aumentos por múltiplos de la cantidad de glucósidos necesarios para inducir la muerte celular al 50 %". Se prefiere que el armazón no conduzca a un aumento que sea al menos el aumento de moléculas de glucósido (saponinas) necesario para obtener un 50 % de muerte celular observado cuando se usa cloroquina como control positivo. Alternativamente, y preferiblemente, la primera molécula proteica que comprende saponinas, comprenda o no además una o más porciones conectoras (escindibles) y/u opcionalmente un armazón, no conduce a un aumento de al menos el cuádruple de las moléculas de glucósido para inducir la muerte celular en un 50 %, más preferiblemente no conduce a un aumento de al menos el doble. Los múltiplos de aumento deben medirse en un ensayo, esencialmente como se describe en el Ejemplo 4, en el que la cloroquina, como control positivo, induce un aumento del doble en la cantidad de glucósido, preferiblemente en la cantidad de saponina, en donde la saponina es una o más de las saponinas de la invención (véase Tabla A1, Esquema I, formas de realización previas), y donde se observa un 50 % de muerte celular.
[0135] Con el término "mejorar o potenciar un efecto de un resto efector" se entiende que la molécula de glucósido, preferiblemente una saponina de la invención, aumenta la eficacia funcional de ese resto efector (por ejemplo, el índice terapéutico de una toxina o un fármaco o un oligonucleótido como un BNA; la eficacia metabólica de un modificador en procesos biotecnológicos; la eficacia de transfección de genes en experimentos de investigación de cultivos celulares), preferiblemente al habilitar o mejorar su interacción con la diana. Preferiblemente, no se incluyen la aceleración, prolongación o mejora de las respuestas inmunitarias específicas para antígenos. La eficacia terapéutica incluye, pero no se limita a, un efecto terapéutico más fuerte, preferiblemente con dosis más bajas y/o con menos efectos secundarios. "Mejorar un efecto de un resto efector" también puede significar que un resto efector, que no podría usarse debido a la falta de efecto (y, por ejemplo, que no se conocía como resto efector), se vuelve eficaz cuando se usa en combinación con la presente invención. Cualquier otro efecto, que sea beneficioso o deseado y pueda atribuirse a la combinación del resto efector y la segunda o tercera molécula proteica, según lo proporcionado por la invención, se considera "un efecto mejorado". En una forma de realización, el armazón que comprende saponina o saponinas unidas y comprendidas por la primera molécula proteica mejora un efecto del resto efector comprendido por la segunda molécula proteica cuyo efecto se pretende y/o se desea. En el caso de una primera molécula proteica que comprende saponina unida a un armazón proteico, la estructura polimérica proteica del armazón como tal puede tener, por ejemplo, un efecto sobre la presión osmótica coloide en el torrente sanguíneo. Si tal efecto no es el efecto pretendido o deseado de tal armazón funcionalizado comprendido por la primera molécula proteica, la estructura proteica del armazón no es un resto efector como se define en la invención. O, por ejemplo, en el caso de un armazón basado en ADN o ARN que lleva saponinas unidas y está compuesto por la primera molécula proteica, partes de ese ADN o ARN pueden tener una función (no intencionada), por ejemplo, interferir con la expresión. Si tal interferencia no es el efecto pretendido o deseado del armazón funcionalizado final, la estructura polimérica de ADN o ARN del armazón no es el resto efector como se define en la invención.
[0136] Se pueden formular varias características preferidas para potenciadores del escape endosomal comprendidos por la primera molécula proteica, es decir, un glucósido o saponina, preferiblemente una saponina según la invención: (1) preferiblemente no son tóxicos y no invocan una respuesta inmune, ( 2) preferiblemente no median en la captación citosólica del resto efector en células no diana, (3) su presencia en el sitio de acción se sincroniza preferiblemente con la presencia del resto efector, (4) son preferiblemente biodegradables o excretables y (5) preferiblemente no interfieren sustancialmente con los procesos biológicos del organismo no relacionados con la actividad biológica de la molécula efectora con la que se combina el potenciador del escape endosomal, por ejemplo, no interactúan con las hormonas. Ejemplos de moléculas de glucósidos como las saponinas seleccionadas del grupo formado por: SO1861, SA1641, GE1741, QS-21, QS-21A, QS21-B, Quil-A, SO1832, SO1904 y SO1862 de la invención que cumplen con los criterios mencionados, al menos hasta cierto punto, son los triterpenos bisdesmosídicos, preferiblemente las saponinas triterpénicas bisdesmosídicas, tales como SO1861, SA1641, QS-21, GE1741, y las saponinas de la Tabla A1, Esquema I.
[0137] Un aspecto de la invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco o un conjugado anticuerpooligonucleótido o un conjugado ligando-fármaco que comprende la primera molécula proteica de la invención y un resto efector.
[0138] Una forma de realización es el conjugado anticuerpo-fármaco o conjugado ligando-fármaco de la invención, en el que el anticuerpo puede unirse a cualquiera de CD71, CA125, EpCAM (17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, eGf-IR, integrina , sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina , Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrina A4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7 , PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente CD71, HER2, EGFR, y/o es o comprende cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-9 anti-CD71 del tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-10 anti-CD38, un anticuerpo de la Tabla A2 o Tabla A3 o Tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión al receptor de la célula tumoral del mismo y/o al menos un dominio de unión al receptor de la célula tumoral del mismo, y/o en el que el conjugado anticuerpo-fármaco comprende cualquiera de Gemtuzumab ozogamicina, Brentuximab vedotina, Trastuzumab emtansina, Inotuzumab ozogamicina, Moxetumomab pasudotox y Polatuzumab vedotina y un conjugado anticuerpo-fármaco de la Tabla A2 y la Tabla A3. Se proporciona y no se reivindica el conjugado ligando-fármaco que comprende al menos un ligando para la unión a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina.
[0139] Una forma de realización es el conjugado anticuerpo-fármaco o conjugado anticuerpo-oligonucleótido o conjugado ligando-fármaco de la invención, en donde el resto efector es cualquiera o cualesquiera de los restos efectores según la invención.
[0140] Un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la composición que comprende la primera molécula proteica de la invención y la segunda molécula proteica de la invención, o que comprende la primera molécula proteica de la invención y la tercera molécula proteica de la invención, o que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención o que comprende el conjugado anticuerpooligonucleótido de la invención o que comprende el conjugado ligando-fármaco de la invención y, opcionalmente, comprende además un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
[0141] Un aspecto de la invención se refiere a la combinación terapéutica de la invención, o bien que comprende la segunda composición farmacéutica o bien que comprende la tercera composición farmacéutica, o que comprende la composición que comprende la primera molécula proteica de la invención y la segunda molécula proteica de la invención, o que comprende la primera molécula proteica de la invención y la tercera molécula proteica de la invención, o que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco o el conjugado anticuerpooligonucleótido o el conjugado ligando-fármaco de la invención o la composición farmacéutica de la invención, para su uso como medicamento.
[0142] Un aspecto de la invención se refiere a la combinación terapéutica de la invención, o bien que comprende la segunda composición farmacéutica o bien que comprende la tercera composición farmacéutica, o que comprende la composición que comprende la primera molécula proteica de la invención y la segunda molécula proteica de la invención, o que comprende la primera molécula proteica de la invención y la tercera molécula proteica de la invención, o que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco o el conjugado anticuerpooligonucleótido o el conjugado ligando-fármaco de la invención o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer o una enfermedad autoinmune.
[0143] Como se ha mencionado antes, la al menos una saponina que está comprendida por la primera molécula proteica según la invención aumenta la eficacia de al menos restos efectores actuales y nuevos como se define en esta invención. Los efectos secundarios potenciales disminuirán debido a la disminución de la dosificación del resto efector comprendido por la segunda o tercera molécula proteica, sin disminuir la eficacia. Por tanto, la invención proporciona una primera molécula proteica según la invención para su uso en medicina. Se prevé el uso de una primera molécula proteica según la invención para la fabricación de un medicamento. Especialmente los medicamentos contra el cáncer, y en particular los medicamentos de quimioterapia clásicos, son notorios por sus efectos secundarios. Debido al direccionamiento y la sincronización en el tiempo y el lugar tanto de la sustancia farmacéuticamente activa compuesta por la segunda o tercera molécula proteica como de la saponina compuesta por la primera molécula proteica, ya que la primera y tercera molécula proteica llevan el mismo sitio de unión para el mismo epítopo en la misma molécula de la superficie celular, o dado que la primera y la segunda molécula proteica tienen diferentes sitios de unión para diferentes primer y segundo epítopos en la primera y segunda moléculas de la superficie celular respectivamente, una combinación terapéutica de acuerdo con la invención es especialmente valiosa para su uso como medicamento, en particular para su uso en un método de tratamiento del cáncer. Por tanto, la invención proporciona una combinación terapéutica según la invención o una primera molécula proteica de la invención para su uso en un método de tratamiento del cáncer. La invención también proporciona una combinación terapéutica según la invención o una primera molécula proteica de la invención para su uso en un método de tratamiento de trastornos adquiridos o hereditarios, en particular trastornos de defecto monogénico. Por tanto, la combinación terapéutica comprende la primera y segunda molécula proteica y/o comprende la primera y tercera molécula proteica. Por tanto, un aspecto de la invención se refiere a una combinación terapéutica según la invención, en la que la segunda o tercera molécula proteica comprende un resto efector unido covalentemente, para su uso en un método para el tratamiento de un cáncer o una enfermedad autoinmune.
[0144] Una aplicación adicional de la primera, segunda y tercera moléculas proteicas de la invención en medicina es la sustitución de enzimas intracelulares en células diana que producen estas enzimas en cantidad insuficiente o con funcionalidad insuficiente. La enfermedad resultante puede ser hereditaria o adquirida. En la mayoría de los casos, solo es posible el tratamiento sintomático y, para una serie de enfermedades raras, la insuficiencia de opciones de tratamiento conduce a una menor esperanza de vida de los pacientes afectados. Un ejemplo de tal enfermedad es la fenilcetonuria, que es un error innato del metabolismo que da como resultado una disminución del metabolismo del aminoácido fenilalanina. La enfermedad se caracteriza por mutaciones en el gen de la enzima hepática fenilalanina hidroxilasa. La fenilcetonuria no tiene cura hasta la fecha. La incidencia es de aproximadamente 1:10000, con la incidencia más alta conocida en Turquía con 1:2600. Se puede usar una segunda o tercera molécula proteica, preferiblemente un anticuerpo, con fenilalanina hidroxilasa unida o con un polinucleótido unido que codifica fenilalanina hidroxilasa para actuar en las células hepáticas mediante el uso de un anticuerpo específico adecuado y para sustituir la enzima defectuosa en los hepatocitos. Este es un ejemplo de uso de la combinación terapéutica de la invención que comprende una primera molécula proteica con una saponina unida a la misma y una segunda o tercera molécula proteica con la enzima o el oligonucleótido unido a la misma según la invención para la sustitución o terapia génica. En una forma de realización preferida, se proporciona una combinación terapéutica según la invención para su uso en un método de terapia génica o terapia de sustitución.
[0145] La presente invención también proporciona un método para tratar el cáncer, método que comprende administrar un medicamento que comprende una combinación terapéutica según la invención a un paciente que lo necesite, preferiblemente administrar una dosis eficaz de dicho medicamento a un paciente que lo necesite, preferiblemente un paciente humano con cáncer.
[0146] Las consideraciones relativas a las formas adecuadas para la administración se conocen en la técnica e incluyen efectos tóxicos, solubilidad, vía de administración y mantenimiento de la actividad. Por ejemplo, las composiciones farmacológicas inyectadas en el torrente sanguíneo deben ser solubles.
[0147] Las formas galénicas adecuadas dependen en parte del uso o la vía de entrada, por ejemplo, transdérmica o por inyección. Tales formas galénicas deberían permitir que el compuesto alcance una célula diana si la célula diana está presente en un huésped multicelular. Se conocen otros factores en la técnica e incluyen consideraciones, tales como la toxicidad y la forma galénica, que retardan el efecto del compuesto o la composición.
[0148] Una forma de realización es la combinación de un conjugado potenciador del escape endosomal de acuerdo con la invención, que comprende la primera molécula proteica que comprende al menos una saponina unida covalentemente y un resto de unión, en el que el resto de unión comprende al menos un resto efector, siendo el resto de unión la segunda o tercera molécula proteica que comprende el resto efector unido, en donde el conjugado potenciador del escape endosomal y el resto de unión son, independientemente entre sí, capaces de unirse específicamente a una estructura o molécula de superficie específica de la célula diana, induciendo así la endocitosis mediada por un receptor de un complejo del conjugado potenciador del escape endosomal y la molécula de superficie específica de la célula diana, y del complejo del resto de unión y la molécula de superficie específica de la célula diana, en donde el conjugado potenciador del escape endosomal y el resto de unión pueden unirse a la misma molécula de superficie específica de la célula diana a través de su mismo sitio de unión, o en donde el conjugado potenciador del escape endosomal y el resto de unión puede unirse a las diferentes moléculas de superficie específicas de la célula diana a través de sus diferentes sitios de unión. Una forma de realización es la combinación según la invención, en la que el conjugado potenciador del escape endosomal puede competir con el resto de unión por unirse a la estructura o molécula de superficie específica de la célula diana. Una forma de realización es la combinación según la invención, en la que el conjugado potenciador del escape endosomal y el resto de unión son, independientemente uno de otro, capaces de unirse específicamente al mismo epítopo o a un epítopo diferente. Una forma de realización es la combinación para su uso en un método para el tratamiento de una anomalía, tal como un cáncer, según la invención, en el que dicho conjugado potenciador del escape endosomal y dicho resto de unión deben administrarse de manera concomitante o secuencial, preferiblemente concomitante.
[0149] Se proporciona, pero no se reivindica, un kit que comprende un primer recipiente que contiene un conjugado que mejora el escape endosomal de acuerdo con la invención (es decir, la primera molécula proteica) y un segundo recipiente que contiene un resto de unión de acuerdo con la invención (es decir, la segunda y/o tercera molécula proteica), donde el kit comprende además instrucciones para usar las moléculas de unión (es decir, la combinación terapéutica que comprende la primera y segunda o la primera y tercera composiciones farmacéuticas).
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TABLA A2- ADC que se investigaron previamente en el entorno clínico humano y posteriormente se retiraron de l inv i i n líni iinl
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TABLA A3- ADC ue alcanzaron el desarrollo clínico de fase III
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[0150] Forma parte de la invención que la combinación terapéutica, la primera composición farmacéutica, la primera molécula proteica, la segunda o tercera composición farmacéutica o la segunda o tercera molécula proteica de la invención se combinen además con un conjugado covalente (complejo) de una molécula o un resto de unión y una saponina, o se combinen además con un compuesto farmacéutico, un anticuerpo, etc., proporcionando así una composición que comprende tres o más potenciadores, ingredientes farmacéuticamente activos, etc., por ejemplo, un conjugado de la invención (por ejemplo, una primera molécula proteica y/o una segunda o tercera molécula proteica) combinado con un resto de unión complejado con una molécula efectora, combinado además con un producto farmacéutico, que está unido o no a una saponina, y que está acoplado o no a un ligando, tal como una inmunoglobulina dirigida, un dominio o un fragmento del mismo. Además, una forma de realización es la combinación terapéutica, la primera composición farmacéutica, la primera molécula proteica, la segunda o tercera composición farmacéutica o la segunda o tercera molécula proteica de la invención, en la que la segunda o tercera molécula proteica está provista de dos o más restos efectores, tal como una toxina o inmunotoxina, en donde los dos o más restos efectores son iguales o diferentes.
Formas de realización ejemplares
[0151] Se proporciona y no se reivindica el conjugado potenciador del escape endosomal, en el que la saponina es una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidro-oleanano con una función aldehído, en la posición 23, y en el que la saponina es preferiblemente una saponina que se puede aislar de la especie Gypsophila o Saponaria, más preferiblemente la saponina es la saponina SO1861 o cualquiera de sus diastereómeros.
[0152] Una forma de realización es el conjugado potenciador del escape endosomal de la invención, en el que el sitio de unión es al menos un ligando, tal como una inmunoglobulina, con al menos un resto efector unido al mismo.
[0153] Una forma de realización es el conjugado potenciador del escape endosomal de la invención, en el que el sitio de unión es una inmunoglobulina o al menos un dominio de unión de la misma (no reivindicado) para la unión a una molécula de la superficie celular, en el que preferiblemente la molécula de la superficie celular se selecciona de cualquiera de HER2, EGFR, CD20, CD22, Receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD33, CD239, CD70, CD123, CD352 , DLL3, CD25, efrinaA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD71.
[0154] Una forma de realización es el conjugado potenciador del escape endosomal de la invención, en el que una porción conectora se acopla al glucósido mediante un enlace escindible, y en el que el ligando es una inmunoglobulina, en el que preferiblemente dicho enlace escindible se escinde en condiciones ácidas, reductoras, enzimáticas o condiciones inducidas por luz, y preferiblemente el enlace escindible es un enlace covalente, preferiblemente un enlace imina, un enlace hidrazona, un enlace oxima, un enlace 1,3-dioxolano o un enlace éster, en el que preferiblemente el enlace escindible es un puente disulfuro o un enlace peptídico.
[0155] Una forma de realización es el conjugado potenciador del escape endosomal de la invención, en el que el resto de saponina es una saponina terminal, preferiblemente la saponina SO1861, la porción conectora es una porción conectora química que une covalentemente la saponina al sitio de unión de la primera molécula proteica, y el mismo primer sitio de unión de la tercera y primera moléculas proteicas es una inmunoglobulina tal como trastuzumab o cetuximab, donde la porción conectora proporciona preferiblemente un enlace escindible entre el resto de saponina terminal y el primer sitio de unión compuesto por la primera y tercera moléculas proteicas.
[0156] Una forma de realización es la combinación de un conjugado que mejora el escape endosomal (es decir, la primera molécula proteica) según la invención y un resto de unión (es decir, la segunda o tercera molécula proteica), en el que el resto de unión comprende al menos un resto efector, en el que el conjugado potenciador del escape y el resto de unión son, independientemente uno del otro, capaces de unirse específicamente a una estructura o molécula de superficie específica de la célula diana, induciendo así la endocitosis mediada por receptor de un complejo del conjugado potenciador del escape endosomal y el conjugado de molécula de superficie específica de la célula diana, y del complejo del resto de unión y la molécula de superficie específica de la célula diana.
[0157] Una forma de realización es la combinación según la invención, en la que el conjugado potenciador del escape endosomal y el resto de unión pueden unirse específicamente a la misma estructura o molécula de superficie específica de la célula diana, cuando el resto de unión es la tercera molécula proteica.
[0158] Una forma de realización es la combinación según la invención, en la que el conjugado potenciador del escape endosomal puede competir con el resto de unión por unirse a la estructura o molécula de superficie específica de la célula diana, cuando el resto de unión es la tercera molécula proteica.
[0159] Una forma de realización es la combinación según la invención, en la que el conjugado potenciador del escape endosomal y el resto de unión son, independientemente entre sí, capaces de unirse específicamente al mismo epítopo.
[0160] Una forma de realización es la combinación según la invención, en la que el conjugado potenciador del escape endosomal puede unirse específicamente a un primer epítopo, que es el mismo que el primer epítopo al que el resto de unión puede unirse específicamente, cuando el resto de unión es la tercera molécula proteica.
[0161] Una forma de realización es la combinación según la invención, en la que el conjugado potenciador del escape endosomal y el resto de unión pueden unirse específicamente a diferentes moléculas o estructuras de superficie específicas de la célula diana, cuando el resto de unión es la segunda molécula proteica.
[0162] Una forma de realización es la combinación de acuerdo con la invención, en la que la estructura o molécula de superficie específica de la célula diana se selecciona de entre HER2, EGFR, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, Cd56, CD19, CD138, CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD33, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrina A4, MUC1, Trop2, CEACAM5, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD71.
[0163] Se proporciona, pero no se reivindica, la combinación en la que la molécula de glucósido es un triterpeno bisdesmosídico, preferiblemente una saponina.
Se proporciona, pero no se reivindica, la combinación en la que la molécula de glucósido es una saponina triterpénica bisdesmosídica.
Se proporciona, pero no se reivindica, la combinación en la que la saponina es una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con una función aldehído en la posición 23. Se proporciona, pero no se reivindica, la combinación, en la que la saponina es una saponina que puede aislarse de especies de Gypsophila o Saponaria.
Una forma de realización es la combinación según la invención, en la que la saponina es una SO1861 o cualquiera de sus diastereómeros.
[0164] Una forma de realización es la combinación de acuerdo con la invención, en la que el al menos un glucósido seleccionado del grupo que consiste en: SO1861, SA1641, GE1741, QS-21, QS-21A, QS21-B, Quil-A, SO1832, SO1904 y SO1862 se une al ligando (sitio de unión para el epítopo en la molécula de la superficie celular) a través de un enlace escindible, en el que preferiblemente dicho enlace escindible se escinde en condiciones acidas, reductoras, enzimáticas o inducidas por luz, y donde el enlace escindible preferiblemente es un puente disulfuro o un enlace peptídico.
[0165] Una forma de realización es la combinación según la invención, en la que el enlace escindible es un enlace covalente, preferiblemente un enlace imina, un enlace hidrazona, un enlace oxima, un enlace 1,3-dioxolano o un enlace éster.
[0166] Una forma de realización es la combinación según la invención, en la que el conjugado potenciador del escape endosomal comprende un número definido de glucósidos o un rango definido.
[0167] Una forma de realización es la combinación de acuerdo con la invención, en la que el rango definido está entre 1-30 glucósido(s), preferiblemente entre 1-20, más preferiblemente entre 1-10, más preferiblemente entre 1-6, más preferiblemente entre 2-6, más preferiblemente entre 2-5, más preferiblemente entre 3-5, más preferiblemente entre 3-4 glucósidos.
[0168] Una forma de realización es la combinación según la invención, en la que el resto efector es una sustancia farmacéuticamente activa, tal como una toxina tal como una toxina proteica, un fármaco, un polipéptido o un polinucleótido.
[0169] Una forma de realización es la combinación de acuerdo con la invención, en la que la célula diana es una célula enferma o una célula relacionada con una enfermedad, preferiblemente una célula tumoral o una célula asociada a un tumor (por ejemplo, una célula vascular tumoral), o una célula inmunitaria (por ejemplo, un linfocito T regulador) o una célula autoinmune.
[0170] Se proporciona y no se reivindica la combinación de acuerdo con la invención, en la que al menos un resto efector está unido al resto de unión (segunda o tercera molécula proteica) mediante un enlace escindible, en el que preferiblemente dicho enlace escindible se escinde en condiciones ácidas, reductoras, condiciones enzimáticas o inducidas por luz, y/o en las que el enlace escindible es un puente disulfuro o un enlace peptídico.
[0171] Se proporciona y no se reivindica la combinación según la invención, en la que el glucósido (saponina) es capaz de aumentar el escape endosomal de la molécula efectora.
[0172] Una forma de realización es la combinación según la invención, para su uso como medicamento.
[0173] Una forma de realización es la composición farmacéutica que comprende una combinación de acuerdo con la invención (formas de realización anteriores) y un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
[0174] Una forma de realización es la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, que comprende además al menos otro ingrediente farmacéuticamente activo adicional, tal como una inmunoglobulina adicional.
[0175] Una forma de realización es la combinación para su uso según la invención, o la composición farmacéutica según la invención, para su uso en un método de tratamiento del cáncer o de una enfermedad autoinmune.
[0176] Se proporciona y no se reivindica la combinación para su uso según la invención, en la que el conjugado de potenciador del escape endosomal (primera molécula proteica) y el resto de unión (segunda o tercera molécula proteica) deben administrarse de manea concomitante o secuencial, preferiblemente de manera concomitante.
[0177] Se proporciona y no se reivindica un método para el tratamiento del cáncer, método que comprende administrar una combinación según la invención a un paciente que lo necesite.
[0178] Se proporciona y no se reivindica el método para el tratamiento del cáncer, método que comprende administrar una composición farmacéutica según la invención a un paciente que lo necesite.
[0179] Se proporciona, pero no se reivindica, un kit que comprende un primer recipiente que contiene un conjugado potenciador del escape endosomal según la invención y un segundo recipiente que contiene un resto de unión según la invención, donde el kit comprende además instrucciones para usar las moléculas de unión.
[0180] La primera molécula proteica es adecuada para su uso como un producto semiacabado para la fabricación de un ADC funcionalizado o un AOC funcionalizado, en el que el ADC funcionalizado o el OAC funcionalizado comprende al menos una saponina acoplada covalentemente de la invención y al menos un resto efector de la invención. Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, que comprende además una carga útil o resto efector de la invención, tal como una toxina o un oligonucleótido unido covalentemente a la primera molécula proteica de la invención, ya sea directamente o mediante una porción conectora de la invención, preferiblemente una porción conectora escindible de la invención y/o mediante un armazón oligomérico o polimérico según la invención. Por ejemplo, tal ADC u OAC funcionalizado comprende 2-4 saponinas acopladas covalentemente a, por ejemplo, una cadena lateral de cisteína en la primera molécula proteica tal como un ligando o un anticuerpo (fragmento), ya sea directamente o mediante una porción conectora (escindible), o comprende, por ejemplo, un dendrón que comprende 1-16 saponinas acopladas covalentemente unidas al mismo, donde el dendrón está acoplado covalentemente a, por ejemplo, una cadena lateral de cisteína y/o una cadena lateral de lisina de la primera molécula proteica según la invención.
Al menos uno de los objetivos de las formas de realización de la invención, como se enumeran en este documento, en el apartado Resumen de la invención, se logra al proporcionar una primera molécula proteica de la invención, que comprende un resto que se dirige a las células y al menos una saponina, donde la primera molécula proteica también es adecuada para su uso como medicamento o adecuada para formar parte de una combinación farmacéutica de acuerdo con la invención, y adecuada para su uso como un producto semiacabado en la fabricación de un ADC o un conjugado anticuerpo-oligonucleótido (AOC) de la invención, de acuerdo con la invención. La combinación terapéutica comprende la primera molécula proteica que comprende saponina unida covalentemente y comprende una segunda molécula proteica que comprende una molécula efectora, también denominada resto efector, en donde la primera y segunda molécula proteica comprenden un sitio de unión diferente para un epítopo diferente expuesto en una molécula diferente de la superficie celular de una célula diana, en donde las diferentes moléculas de la superficie celular son expresadas por la misma célula diana y expuestas en la superficie de la misma célula diana.
[0181] Según la invención, la primera molécula proteica es un producto terminado para su aplicación en, por ejemplo, una combinación terapéutica que comprende una primera composición farmacéutica que comprende la primera molécula proteica con saponina acoplada covalentemente a ella (primer conjugado que comprende la primera molécula proteica con saponina o saponinas acoplada(s) covalentemente). En segundo lugar, la primera molécula proteica con saponina acoplada covalentemente también es un producto semiacabado. La primera molécula proteica se puede unir a, por ejemplo, al menos un resto efector tal como una enzima, una toxina tal como una toxina proteica, un oligonucleótido tal como un BNA, además de proporcionar un ADC o un AOC de acuerdo con la invención, donde el ADC o AOC está provisto de una o más saponinas unidas covalentemente, opcionalmente mediante una porción conectora y/o un armazón oligomérico o polimérico. Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a un conjugado que comprende o consiste en la primera molécula proteica que comprende un primer sitio de unión para la unión a un primer epítopo de una primera molécula de la superficie celular, con al menos una saponina unida covalentemente a través de al menos una porción conectora a la primera molécula proteica y/o con al menos una saponina unida covalentemente mediante un armazón oligomérico o polimérico a un residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, o unida covalentemente de forma directa a un residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, donde el primer sitio de unión comprende o consiste en una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o una IgG, y/o comprende o consiste en al menos un ligando para la unión a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina, y al menos una saponina se selecciona del grupo que consiste en: SO1861, SA1641, GE1741, QS-21, QS-21A, QS21-B, Quil-A, SO1832, SO1904 y SO1862.
[0182] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, en la que el primer epítopo específico para células tumorales, la primera molécula de la superficie celular tumoral o el primer receptor específico para células tumorales son un primer epítopo o una primera molécula o un primer receptor que son internalizados por la célula tumoral después de la unión de la primera molécula proteica de la invención al primer epítopo o primera molécula o primer receptor, y en la que preferiblemente la primera molécula proteica se somete a internalización mediada por un receptor de células tumorales, por ejemplo, por endocitosis, o internalización mediada por moléculas de superficie de células tumorales, por ejemplo, por endocitosis, cuando se une a la molécula de la superficie celular que comprende el primer epítopo, la molécula de la superficie celular tumoral o el receptor específico para células tumorales.
[0183] Una forma de realización es la primera molécula proteica y/o la segunda molécula proteica de la invención, que es un producto semiacabado para la fabricación de un ADC conjugado con al menos una saponina, o que es un producto semiacabado para la fabricación de un AOC conjugado con al menos una saponina, donde la al menos una saponina está acoplada al ADC o al AOC a través de enlaces covalentes, preferiblemente a través de al menos una porción conectora, y preferiblemente a través de un armazón oligomérico o polimérico al que al menos una saponina está acoplada covalentemente, preferiblemente a través de una porción conectora (Figura 91, 92).
[0184] Un aspecto de la invención se refiere a cualquiera de los siguientes ADC y AOC, y sus conjugados semiacabados, que comprende la primera molécula proteica de la invención y/o la segunda molécula proteica de la invención y/o la tercera molécula proteica de la invención. y que comprende al menos una saponina de la invención, o comprende tanto dicha saponina como al menos una molécula efectora de la invención:
Anticuerpo anti EGFR - SO1861;
Anticuerpo anti EGFR - GE1741;
Anticuerpo anti EGFR - SA1641;
Anticuerpo anti EGFR - Quil-A;
Anticuerpo anti EGFR - QS-21;
Anticuerpo anti EGFR - saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria;
Cetuximab - SO1861;
Cetuximab - GE1741;
Cetuximab - SA1641;
Cetuximab - Quil-A;
Cetuximab - QS-21;
Cetuximab - saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria;
Anticuerpo anti HER2 - SO1861;
Anticuerpo anti HER2 - GE1741;
Anticuerpo anti HER2 - SA1641;
Anticuerpo anti HER2 - Quil-A;
Anticuerpo anti HER2 - QS-21;
Anticuerpo anti HER2 - saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria;
Trastuzumab - SO1861;
Trastuzumab - GE1741;
Trastuzumab - SA1641;
Trastuzumab - Quil-A;
Trastuzumab - QS-21;
Trastuzumab: saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria;
Anticuerpo anti CD71 - SO1861;
Anticuerpo anti CD71-GE1741;
Anticuerpo anti CD71 - SA1641;
Anticuerpo anti CD71 - Quil-A;
Anticuerpo anti CD71 - QS-21;
Anticuerpo anti CD71 - saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria; OKT-9-SO1861;
OKT-9: GE1741;
OKT-9 - SA1641;
OKT-9 - Quil-A;
OKT-9: QS-21;
OKT-9 - saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria;
Anticuerpo anti EGFR - oligonucleótido;
Anticuerpo anti EGFR - oligonucleótido antisentido;
Anticuerpo anti EGFR - ARNip;
Anticuerpo anti EGFR - BNA antisentido;
Anticuerpo anti EGFR - BNA antisentido (HSP27);
Anticuerpo anti EGFR - toxina proteica;
Anticuerpo anti EGFR - proteína inactivadora de ribosomas;
Anticuerpo anti EGFR - diantina;
Anticuerpo anti EGFR - saporina;
Cetuximab - oligonucleótido;
Cetuximab - oligonucleótido antisentido;
Cetuximab - ARNip;
Cetuximab - BNA antisentido;
Cetuximab - BNA antisentido (HSP27);
Cetuximab - toxina proteica;
Cetuximab - proteína inactivadora de ribosomas;
Cetuximab - diantina;
Cetuximab - saporina;
Anticuerpo anti HER2 - oligonucleótido;
Anticuerpo anti HER2 - oligonucleótido antisentido;
Anticuerpo anti HER2 - ARNip;
Anticuerpo anti HER2 - BNA antisentido;
Anticuerpo anti HER2 - BNA antisentido (HSP27);
Anticuerpo anti HER2 - toxina proteica;
Anticuerpo anti HER2 - proteína inactivadora de ribosomas;
Anticuerpo anti HER2 - diantina;
Anticuerpo anti HER2 - saporina;
Trastuzumab - oligonucleótido;
Trastuzumab - oligonucleótido antisentido;
Trastuzumab - ARNip;
Trastuzumab - BNA antisentido;
Trastuzumab - BNA antisentido (HSP27);
Trastuzumab - toxina proteica;
Trastuzumab - proteína inactivadora de ribosomas;
Trastuzumab - diantina;
Trastuzumab - saporina;
Anticuerpo anti CD71 - oligonucleótido;
Anticuerpo anti CD71 - oligonucleótido antisentido;
Anticuerpo anti CD71 - ARNip;
Anticuerpo anti CD71 - BNA antisentido;
Anticuerpo anti CD71 - BNA antisentido (HSP27);
Anticuerpo anti CD71 - toxina proteica;
Anticuerpo anti CD71 - proteína inactivadora de ribosomas;
Anticuerpo anti CD71 - diantina;
Anticuerpo anti CD71 - saporina;
OKT-9 - oligonucleótido;
OKT-9 - oligonucleótido antisentido;
OKT-9 - ARNip;
OKT-9 - BNA antisentido;
OKT-9 - BNA antisentido (HSP27);
OKT-9 - toxina proteica;
OKT-9 - proteína inactivadora de ribosomas;
OKT-9 - diantina;
OKT-9 - saporina;
Anticuerpo anti EGFR (-oligonucleótido) (-saponina), en el que el oligonucleótido es uno o más oligonucleótidos antisentido, ARNip, BNA antisentido y BNA antisentido (HSP27), y donde la saponina es una o más de SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria, en donde el anticuerpo anti EGFR es preferiblemente cetuximab;
Anticuerpo anti EGFR (-toxina proteica) (-saponina), en el que la toxina proteica es una o más de una proteína inactivadora de ribosomas, diantina y saporina, y en el que la saponina es una o más de SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria, en donde el anticuerpo anti EGFR es preferiblemente cetuximab;
Anticuerpo anti HER2 (-oligonucleótido) (-saponina), en el que el oligonucleótido es uno o más oligonucleótidos antisentido, ARNip, BNA antisentido y BNA antisentido (HSP27), y donde la saponina es una o más de SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria, en donde el anticuerpo anti HER2 preferiblemente es trastuzumab;
Anticuerpo anti h ER2 (-toxina proteica) (-saponina), en el que la toxina proteica es una o más de una proteína inactivadora de ribosomas, diantina y saporina, y en el que la saponina es una o más de SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria, donde el anticuerpo anti HER2 preferiblemente es trastuzumab;
Anticuerpo anti CD71 (-oligonucleótido) (-saponina), en el que el oligonucleótido es uno o más oligonucleótidos antisentido, ARNip, BNA antisentido y BNA antisentido (HSP27), y donde la saponina es una o más de SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria, en donde el anticuerpo anti CD71 es preferiblemente OKT-9; y
Anticuerpo anti CD71 (-toxina proteica) (-saponina), en el que la toxina proteica es una o más de una proteína inactivadora de ribosomas, diantina y saporina, y en el que la saponina es una o más de SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria, en donde el anticuerpo anti CD71 preferiblemente es OKT-9.
[0185] Una forma de realización es la primera molécula proteica de la invención, el conjugado semiacabado de la invención o el conjugado de la invención, en el que el primer sitio de unión se selecciona de entre cetuximab, trastuzumab, OKT-9 y/o en el que la molécula efectora se selecciona de entre diantina, saporina y BNA antisentido (HSP27), y/o en el que la saponina se selecciona de entre SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria.
[0186] Una forma de realización es el conjugado según la invención, en el que la primera molécula proteica se selecciona de entre cetuximab, trastuzumab, OKT-9 y/o en el que la molécula efectora se selecciona de entre diantina, saporina y BNA antisentido (HSP27), y/o en el que la saponina se selecciona de entre SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria.
[0187] Un aspecto de la invención se refiere a un ADC o un AOC o un conjugado de ADC semiacabado o un conjugado de AOC semiacabado que comprende la primera molécula proteica de la invención y que comprende al menos una molécula efectora de la invención y/o que comprende al menos una saponina de la invención, con la Estructura C:
A (- S)b (- E)c Estructura C,
donde A es el primer sitio de unión;
S es la saponina;
E es la molécula efectora;
b = 0-64, preferiblemente 0, 1,2, 3, 4, 8, 16, 32, 64 o cualquier número entero o fracción entre ellos;
c = 0-8, preferiblemente 0, 1,2, 3, 4, 6, 8 o cualquier número entero o fracción entre ellos,
donde S está acoplada a A y/o E, E está acoplada a A y/o S, preferiblemente S está acoplada a A y E está acoplada a A, donde A es un anticuerpo anti EGFR como cetuximab, un anticuerpo anti HER2 como trastuzumab, un anticuerpo anti CD71 como OKT-9, y donde S es una o más de SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas de la fracción hidrosoluble de saponina de Quillaja saponaria, y/o en donde E es uno cualquiera o más de un oligonucleótido, un oligonucleótido antisentido, un ARNip, un BNA antisentido y un BNA antisentido (HSP27), y/o uno o más de una toxina proteica, una proteína inactivadora de ribosomas, diantina y saporina.
[0188] Un aspecto de la invención se refiere al uso como medicamento de cualquiera de los conjugados de la invención antes mencionados o los conjugados semiacabados de la invención o la primera molécula proteica de la invención.
[0189] Un aspecto de la invención se refiere al uso de cualquiera de los conjugados de la invención o el conjugado semiacabado de la invención o la primera molécula proteica de la invención para el tratamiento o profilaxis de un cáncer o una enfermedad autoinmune.
[0190] La Figura 91 y la Figura 92 muestran ejemplos de ADC de la invención con saponinas acopladas covalentemente y OAC de la invención con saponinas acopladas covalentemente.
[0191] La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes de la presente invención de ninguna manera: la invención está limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLOS EJEMPLO A - EL TRATAMIENTO DE UN MAMÍFERO CON TUMOR CON UN CONJUGADO DE LA INVENCIÓN EN COMBINACIÓN CON UN ADC RESULTA EN SUPERVIVENCIA Y REGRESIÓN TUMORAL
[0192] Se inyectó por vía subcutánea a ratones nude Balb/c hembra una suspensión de células tumorales A431 humanas. Debajo de la piel de los ratones, se desarrolló un carcinoma epidérmico humano en el modelo de tumor animal de xenoinjerto. Después de la inyección de las células tumorales, se dejó que el tumor del xenoinjerto se desarrollara hasta un tamaño de aproximadamente 170-180 mm3. Las células tumorales A431 tienen las siguientes características: expresión de EGFR alta, expresión CD71 media, expresión de HER2 baja.
[0193] En la Tabla A se presentan los resultados del tratamiento de ratones de control y ratones con tumores. Los ratones con tumores se trataron con los anticuerpos indicados dirigidos a Her2/neu humano, EGFR humano o CD71 humano, que son receptores de la superficie celular en el tumor xenoinjertado. Cetuximab se conjugó covalentemente con saponina SO1861. Primero se proporcionó a la SO1861 la porción conectora EMCH (hidrazida del ácido N-£-mateimidocaproico), ya que la EMCH es un reticulante de maleimida e hidrazida para la conjugación covalente de sulfhidrilos (cisteínas reducidas del anticuerpo) a carbonilos (aldehidos o cetonas; en este documento, el carbonilo del aldehído en la posición C-23 de la saponina). La saponina-EMCH se acopló covalentemente a cisteínas reducidas del Cetuximab, formando un enlace tio-éter covalente entre la EMCH y la cadena lateral de cisteína. Los ADC trastuzumab-saporina (conjugado covalente) y mAb anti-CD71 (OKT-9, IgG)-saporina (conjugado covalente) se evaluaron para determinar su eficacia de ataque tumoral en ratones, medida como volumen tumoral en el tiempo después del inicio del tratamiento con los ADC. La dosis de los ADC fue subóptima en el modelo de tumor. Es decir, a partir de experimentos previos, se estableció a qué dosis subóptima de los ADC no se observaría regresión tumoral o detención del crecimiento tumoral.
Figure imgf000077_0001
[0194] Estos resultados demuestran que la terapia de combinación de un ADC a una dosis que es ineficaz cuando se tiene en cuenta el tratamiento de ratones con tumores con el ADC solo (crecimiento tumoral, no se evita la muerte de los ratones (eutanasia)), con un conjugado del invención que consiste en un anticuerpo dirigido a un receptor específico para las células tumorales unido covalentemente a una saponina, es decir, SO1861, cuando el conjugado covalente se administra a ratones que padecen cáncer, en una dosis no eficaz cuando se administra solo (crecimientos tumorales, no se evita la muerte de los ratones (eutanasia)), proporciona un régimen de tratamiento eficiente y eficaz, expresado como tumores en regresión y supervivencia prolongada de los animales tratados (más allá de la duración del experimento). La dosis subóptima de ADC combinada con un conjugado de la invención que comprende saponina unido covalentemente que no tiene actividad antitumoral cuando se administra solo, proporciona así una opción de tratamiento eficaz para pacientes con cáncer, en donde una dosis relativamente baja de ADC es eficaz. Una dosis más baja de ADC conlleva la promesa de un menor riesgo de eventos adversos, o incluso ningún efecto secundario. Además, el efecto estimulante del conjugado que contiene saponina de la invención cuando se considera la eficacia del ADC, demuestra que los ADC que previamente han demostrado carecer de eficacia cuando se trata del tratamiento de pacientes con tumores, pueden ganar atención y un valor renovado, ya que la eficacia de los ADC mejora en el entorno de la terapia de combinación, como lo ha demostrado el ejemplo actual. Se hace referencia a la Tabla A2 y la Tabla A3, que resumen los ADC investigados previamente en el entorno clínico humano, pero que luego se retiraron de la investigación clínica adicional en el caso de algunos ADC. Especialmente los ADC para los que se interrumpió el desarrollo clínico debido a la falta de eficacia observada y/o debido a la aparición de un evento adverso inaceptable son los ADC que pueden ganar un valor renovado para los pacientes con cáncer cuando se combinan con un conjugado de la invención que comprende saponina unida covalentemente, como el conjugado cetuximab-saponina evaluado.
EJEMPLO B - Mezcla de saponinas de Quillaja saponaria que comprende QS-21, con actividad potenciadora del escape endosomal/lisosomal
[0195] El esquema I muestra la estructura molecular común de una serie de saponinas QS-21 (parcialmente adaptado de: Conrado Pedebos, Laércio Pol-Fachin, Ramon Pons, Cilaine V. Teixeira Hugo Verli, Atomic Model and Micelle Dynamics of QS-21 Saponin, Molecules 2014, 19, 3744-3760). Una mezcla de saponinas hidrosolubles obtenidas de Quillaja saponaria (Sigma-Aldrich, producto No. S4521; Roth, Artículo No. 6857; InvivoGen, producto 'Quil-A') se puede aplicar en la composición del conjugado, composición o combinación potenciador/a del escape endosomal/lisosomal de la invención, basada en propiedades potenciadoras del escape endosomal/lisosomal de al menos una saponina individual presente en la mezcla, por ejemplo, QS-21, o basada en una combinación de dos o más de las saponinas que componen la mezcla, como QS-21 y QS-7.
[0196] Los inventores han demostrado que la mezcla de saponinas de Quillaja saponaria a una dosis de 2,5 microgramos/ml fue capaz de potenciar el escape endosomal de diantina, como se demostró con células tumorales de mamíferos en un bioensayo realizado en células. El resto efector expuesto a las células fue diantina acoplada covalentemente al ligando eGF: EGF-diantina. Las células evaluadas fueron líneas celulares tumorales HeLa para saponinas libres, y A431, MDA-MB-468, CaSki y A2058 para evaluar las saponinas acopladas covalentemente a cetuximab.
Ejemplo 1
[0197] Se evaluaron varias concentraciones de trastuzumab-saporina (conjugado proteína-toxina dirigido a HER2; vía intravenosa) en combinación con 1,5 mg/kg de SO1861 (1 hora antes de la inyección de anticuerpotoxina; vía subcutánea) para mejorar la eficacia en un modelo de ratón xenógrafo BT474 (HER2 +). La administración comenzó el día 13 cuando los tumores alcanzaron ~ 150 mm3 y se determinó el volumen del tumor después de cada tratamiento. Aunque se observó una inhibición del crecimiento tumoral en los ratones tratados con 1 mg/kg y 0,3 mg/kg de trastuzumab-saporina, no se observó una mayor inhibición del crecimiento tumoral en los ratones tratados con la combinación de trastuzumab-saporina SO1861. Esto muestra que la 501861 sin conjugar no puede mejorar las toxinas proteína-anticuerpo dentro de esa configuración y modelo de ratón.
Ejemplo 2
Materiales:
[0198] QSmix (1): S4521 (Sigma Aldrich); QSmix (2): 6857.1 (Carl Roth) QSmix (3): Adyuvante Quil-A®: vacquil (InvivoGen/Brenntag).
Anteriormente, la eficacia de varias saponinas (SO1861, SO1642) se coadministraba como moléculas 'libres' sin conjugar a las células en combinación con una fusión de ligando-toxina (por ejemplo, EGFdiantina) o un conjugado anticuerpo-toxina proteica, lo que resultaba en una mayor actividad de destrucción celular de las células de expresión de la diana. En este caso, se evaluaron tres moléculas de saponina diferentes (SO1861, 501862 (isómero de SO1861), SO1832 y SO1904) aisladas de un extracto de raíz de Saponaria officinalis en presencia y en ausencia de una concentración fija no eficaz de 1,5 pM de EGFdiantina en células HeLa (EGFR+).
Esto reveló una fuerte mejora de la actividad de destrucción celular para todas las variantes de saponina evaluadas (CI50 = 300 nM; Figura 2A) en comparación con los tratamientos sin EGFdiantina. A continuación, se valoró EGFdiantina con una concentración fija de saponina (-1000 nM), lo que reveló una fuerte mejora de la destrucción celular dirigida a concentraciones bajas de pM de EGFdiantina (CI50 = 0,4 pM; Figura 2B), observada para todas las saponinas SO1861, SO1862 (isómero de SO1861), SO1832 y SO1904. La EGF­ diantina sola solo podía inducir la muerte celular a concentraciones muy altas (CI50 = 10000 pM). Esto demuestra que todos estos tipos específicos de saponinas tienen la capacidad intrínseca de inducir de manera eficaz el escape endosomal con solo una cantidad muy baja de toxina dirigida disponible.
[0199] Para ampliar esta prueba, se analizaron saponinas de otras fuentes. Una saponina purificada a partir de un extracto de raíz de Gypsophila elegans M.Bieb. (GE1741) se valoró en células HeLa en presencia y ausencia de EGFdiantina 1,5 pM y se comparó con SO1861 purificada. GE1741 también mejora la destrucción de células HeLa inducida por EGFdiantina, pero posee una eficacia ligeramente menor en comparación con SO1861. (GE1741 CI50 = 800 nM; Figura 2C) y también muestra una mayor toxicidad general (CI50 = 5000 nM en ausencia de EGFdiantina; Figura 1C). Una prueba similar en la que se coadministraron diferentes mezclas parcialmente purificadas de saponinas de Quillaja saponaria (QSmix 1-3) con 1,5 pM de EGFdiantina en células HeLa reveló, para 2 de 3 (QSmix 1 y QSmix 3), una actividad similar a SO1861 (CI50 QSmix/QSmix3 = 300 nM; Figura 1D). QSmix (2) es menos eficaz para mejorar la muerte celular inducida por EGFdiantina 1,5 pM (CI50 = 2000 nM; Figura 2D); sin embargo, no se observa toxicidad general. Esto demuestra que, también en los extractos de QS, están disponibles tipos específicos de saponinas que inducen de manera eficaz el escape endosomal del conjugado ligando-toxina dirigido EGFdiantina.
Ejemplo 3
[0200] Para conjugar moléculas de SO1861 con anticuerpos, de acuerdo con la invención, se conjugaron porciones conectoras lábiles/sensibles en medio ácido (-EMCH o-N3) con SO1861 mediante el grupo aldehído, produciendo SO1861-EMCH o SO1861-N3 (Figura 60-66. Para verificar la actividad de SO1861-EMCH, la molécula se valoró en presencia y ausencia de una concentración fija de EGFdiantina no eficaz (1,5 pM) en células que expresan eGfR (A431, HeLa) y células que no expresan (A2058). En todas las líneas SO1861 por sí solas hubo una fuerte reducción de la viabilidad celular, mientras que SO1861-EMCH como compuesto único no mostró toxicidad hasta 25000 nM (Figura 3A-C). Cuando SO1861-EMCH se combinó con 1,5 pM de EGFdiantina, se observó una fuerte reducción de la viabilidad celular específica de la diana en las células A431 y HeLa EGFR+(CI50 = 3000 nM; Figura 2A, B), mientras que las células A2058l EGFR- no se vieron afectadas en absoluto (Figura 3C). Se obtuvieron resultados similares para SO1861-N3. SO1861-N3 coadministrado con 1,5 pM de EGFdiantina también muestra una destrucción celular eficaz en células A431 y HeLa (CI50 = 3 000 nM), pero sin EGFdiantina se observa una toxicidad general por encima de 10000 nM (Figura 3D, 2E).
[0201] Para la conjugación estable de SO1861 con anticuerpos, de acuerdo con la invención, se conjugó una porción conectora estable (HATU, Figura 70) con SO1861 mediante el grupo ácido carboxílico de SO1861, que produjo SO1861-(S). Para determinar la actividad, se coadministraron diferentes concentraciones de SO1861-(S) con EGFdiantina 1,5 pM y se analizó la actividad destructora de células en células HeLa que expresaban EGFR. SO1861-(S) mostró una actividad similar a SO1861, lo que indica que la conjugación con el ácido carboxílico no afecta a la potenciación del escape endosomal de la molécula como se observa con SO1861-EMCH (Figura 4).
[0202] El sistema de 1 diana 2 componentes (1T2C) es el tratamiento de combinación de mAb1-toxina proteica y mAb1-SO1861, como se ilustra en la Figura 19. SO1861-EMCH se conjugó mediante residuos de cisteína (Cys) y el oligonucleótido HSP27BNA se conjugó mediante residuos de lisina a cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFR humano), ambos con un DAR 4, dando como resultado la producción de 2 conjugados: cetuximab-(Cys-L-SO1861)4 y cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4. La combinación de cetuximab-(Cys-L-SO1861)4 (administración intraperitoneal, (i.p.)) y cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 (administración intravenosa, (i.v.)) se analizó en un modelo de tumor de ratón xenógrafo A431 para la actividad de silenciamiento génico de EGFR dirigido al tumor. La administración comenzó el día 12 cuando los tumores alcanzaron un tamaño de ~ 150 mm3, y se recogieron muestras del tumor 72 h después de la primera dosis y se analizaron para determinar la expresión del gen HSP27 en comparación con los niveles de expresión en el ARNm del gen de control (genes de referencia). Esto reveló que 1 dosis de 50 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)4+ 25 mg/kg de cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 resultó en una reducción del 50 % en la expresión del gen HSP27 en los tumores A431 en comparación con la dosis única de cetuximab-(Cys-L-SO1861)4 o cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 como monoterapia (Figura 7). En comparación con los tumores de control con vehículo, se observó una reducción del 40 % del silenciamiento del gen HSP27. Esto muestra y asegura que la combinación de SO1861 conjugada con cetuximab oligonucleótido HSP27BNA conjugado con cetuximab, de acuerdo con el sistema 1T2C de la invención, induce una administración dirigida eficiente de un oligonucleótido antisentido terapéutico en el citoplasma de las células tumorales sólidas, induciendo así el silenciamiento génico dirigido al tumor, in vivo.
[0203] A continuación, se conjugó SO1861-EMCH mediante residuos de cisteína (Cys) con trastuzumab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une a HER2 humano), con un DAR 4 que da como resultado la producción de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4. La combinación de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 y trastuzumabsaporina (conjugado de toxina proteica y trastuzumab) se analizó en un modelo de tumor de ratón (modelo de tumor xenógrafo derivado de paciente, PDX) con altos niveles de expresión de HER2 y resistente a la monoterapia con trastuzumab. La combinación, según el sistema 1T2C de la invención, de 40 mg/kg de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 (administración intraperitoneal, (i.p.)) 0,03 (día 1, 8)/0,02 (día 15, 22, 30, 36,43) mg/kg de trastuzumab-saporina (administración intravenosa, (i.v.)) reveló una fuerte inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el control con vehículo y las monoterapias de trastuzumab de 40 mg/kg (Cys-L-SO1861)4 o trastuzumab-saporina de 0,03/0,02 mg/kg (Figura 8). Además, en ratones con tumores que fueron tratados con una combinación de dosis más baja (40 mg/kg de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4+ 0,01 mg/kg de trastuzumab-saporina) no se observó actividad inhibidora del crecimiento tumoral (Figura 8). Esto muestra y asegura que la combinación 1T2C de SO1861 conjugada con trastuzumab toxina proteica conjugada con trastuzumab induce una administración dirigida eficaz de una toxina proteica terapéutica en el citoplasma de las células tumorales sólidas, induciendo así la muerte de las células tumorales y la inhibición del crecimiento tumoral in vivo.
[0204] El sistema de 1 diana 2 componentes (1T2C) es el tratamiento combinado de mAb1-SO1861 y mAb1-toxina proteica (Figura 19)
[0205] SO1861-EMCH se conjugó mediante residuos de cisteína (Cys) a cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGfR humano), con un DAR 3,7 (cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7). Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 se valoró en una concentración fija de cetuximab-saporina 10 pM (cetuximab, conjugado con la toxina proteica, saporina) y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células que expresan EGFR (a 431, EGFR++; CaSKi, EGFR+). Esto reveló una gran actividad de destrucción celular a bajas concentraciones de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 (A431: CI50 = 0,6 nM y Caski CI50 = 1 nM; Figura 9A, 9b ) mientras que cetuximab, cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 o cetuximab cetuximab-saporina 10 pM no pudieron inducir ninguna actividad de destrucción celular en células que expresan EGFR. Esto demuestra que SO1861 conjugada con cetuximab mejora eficazmente el escape endosomal de la toxina proteica conjugada con cetuximab (a concentraciones no eficaces), induciendo así la muerte celular de las células que expresan EGFR. La actividad de destrucción celular en A431 es más eficaz en comparación con CaSki, en correlación con los niveles de expresión de EGFR en estas líneas celulares. La competencia para la unión al receptor EGFR entre ambos conjugados dentro del sistema 1T2C también se observa cuando aumentan las concentraciones de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7, la actividad destructora de células disminuye debido a que cetuximab-saporina predomina a la hora de unirse al receptor e internalizarse (Figura 9A, 9B).
[0206] A continuación, se valoró cetuximab-saporina en una concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 de 45 nM y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células que expresan EGFR. Esto reveló que cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 75nM en combinación con cetuximab-saporina en concentraciones bajas indujo una muerte celular ya eficaz en células que expresan EGFR (A431: CI50 = 0,4 pM; y CaSKi: (CI50 = 2 pM; Figura 9C y 9D), mientras que con cetuximab-saporina solo o cetuximab-saporina Cetuximab 75 nM se observó muerte celular solo a concentraciones altas de cetuximab-saporina (CI50 = 40 pM, CI50 = 1000 pM, respectivamente) en ambas líneas celulares (Figura 9C, 9D). Todo esto demuestra que concentraciones relativamente bajas de cetuximab-saporina pueden ser eficaces e inducir la muerte celular solo en combinación con concentraciones bajas de cetuximab-SO1861 en células con una alta expresión de EGFR. La competencia por el receptor entre ambos conjugados dentro del sistema 1T2C también se observa en los tratamientos de ajuste de la dosis de cetuximab-toxina cuando se compara la actividad destructora de células de cetuximab-saporina con y sin cetuximab 75 nM (Figura 9C, 9D).
[0207] A continuación, cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 se valoró en una concentración fija de cetuximab-saporina 10 pM y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por toxina proteica en células con baja expresión de EGFR o en células sin expresión de EGFR (HeLa, EGFR+/-; A2058, EGFR-). Las células con baja (HeLa) o ninguna (A2058) expresión de EGFR no fueron sensibles en absoluto a ninguna combinación de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 Cetuximab-saporina 10 pM (HeLa: CI50> 1000 nM; A2058: CI50> 1000 nM; Figura 10A, 10B). Esto demuestra que, en ausencia de expresión suficiente del receptor de EGFR, las concentraciones de SO1861 eficaces administradas intracelularmente no son óptimas (umbral) para inducir el escape endosomal de la toxina proteica y la muerte celular mediada por la toxina. A continuación, se valoró cetuximab-saporina en una concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861) 75 nM3,7 y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células con baja expresión (HeLa) o sin expresión (A2058) de EGFR. Las células con baja expresión de EGFR (HeLa) mostraron muerte celular solo a concentraciones altas de cetuximab-saporina en combinación con cetuximab-(Cys-L-SO1861) 75 nM3,7 (HeLa: CI50 = 60 pM), Figura 10C), mientras que las células A2058 (EGFR) no son sensibles a ninguna de las concentraciones evaluadas (A2058: CI50> 10000 pM; Figura 10D). Todo esto demuestra que las células con baja o nula expresión del receptor de EGFR no son susceptibles a la combinación de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 cetuximab-saporina, debido a la falta de suficiente receptor de EGFR que facilite la liberación mediada por anticuerpos de suficiente SO1861 dentro de los compartimentos endolisosomales, para facilitar el escape de la toxina proteica.
[0208] A continuación, se conjugó SO1861-EMCH mediante residuos de cisteína (Cys) con trastuzumab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al HER2 humano, con un DAR 4, (trastuzumab-(Cys-LSO1861)4). Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 se valoró en una concentración fija de trastuzumab-saporina 50 pM (trastuzumab, conjugado con la toxina proteica, saporina) y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por toxina proteica en células que expresan HER2 (SK-BR-3, HER2++). Esto reveló una gran destrucción celular a bajas concentraciones de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 (SK-BR-3: CI50 = 0,8 nM; Figura 11A), mientras que las concentraciones equivalentes de trastuzumab, trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 o trastuzumab trastuzumabsaporina 50 pM no pudieron inducir ninguna actividad de destrucción celular en las células que expresan HER2. Esto demuestra que SO1861 conjugada con trastuzumab mejora eficazmente el escape endosomal de la toxina proteica conjugada con trastuzumab (a concentraciones no eficaces), induciendo así la muerte celular de las células que expresan HER2. La competencia por el receptor entre ambos conjugados dentro del 1T2C también se observa cuando aumentan las concentraciones de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4, y la actividad destructora de células disminuye debido a que cetuximab-saporina predomina a la hora de unirse al receptor e internalizarse (Figura 11A).
[0209] A continuación, se valoró trastuzumab-saporina en una concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)42,5 nM, de acuerdo con la invención, y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células que expresan HER2. Esto reveló que trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 2,5 nM en combinación con bajas concentraciones de trastuzumab-saporina indujo una muerte celular ya eficaz en las células que expresan HER2 (SK-BR-3: CI50 = 2 pM; Figura 11B), mientras que trastuzumab-saporina solo o trastuzumab-saporina trastuzumab 2,5 nM produjo destrucción celular solo a altas concentraciones de trastuzumab-saporina (Figura 11B). Todo esto demuestra que concentraciones relativamente bajas de trastuzumab-saporina pueden ser efectivas e inducir la muerte celular solo en combinación con concentraciones bajas de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 en células con una alta expresión de HER2.
[0210] A continuación, trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 se valoró en una concentración fija de trastuzumabsaporina 50 pM, de acuerdo con la invención, y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por toxina proteica en células con baja expresión de h ER2 (A431 HER2+/-) o células sin expresión de HER2 (JIMT-1: HER2+; MDA-MB-468: HER2-). Las células con expresión de HER2 baja o nula no fueron sensibles en absoluto a ninguna combinación de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4+ 50 pM de trastuzumab-saporina (JIMT-1: CI50> 1000 nM; MDA-MB-468: CI50> 1000 nM; Figura 13A, 13B). Esto demuestra que, en ausencia de suficiente expresión del receptor HER2, las concentraciones de SO1861 administradas intracelularmente eficaces no son óptimas (umbral) para inducir el escape endosomal de la toxina proteica y la muerte celular mediada por la toxina. A continuación, se valoró trastuzumab-saporina en una concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)42,5 nM y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células con expresión de HER2 baja o nula. Las células con baja expresión de HER2 (JIMT-1) mostraron muerte celular solo a concentraciones altas de trastuzumab-saporina en combinación con trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 (JIMT-1: CI50> 10000 pM; Figura 13C), mientras que las células MDA-MB-468 (HEr2-) no fueron sensibles a ninguna de las concentraciones probadas (MDA-MB-468: CI50> 10000 pM; Figura 13D).
[0211] Todo esto demuestra que las células con baja o nula expresión del receptor HER2 no son susceptibles a la combinación de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,7+ trastuzumab-saporina, debido a la falta de suficiente receptor HER2 que facilite la liberación mediada por anticuerpos de suficiente SO1861 dentro de los compartimentos endolisosomales, para facilitar el escape de la toxina proteica.
[0212] Para demostrar que la actividad del sistema 1T2C es impulsada por la acidificación de los compartimentos endolisosomales, se analizó el sistema 1T2C, según la invención, en combinación con un inhibidor de la acidificación endosomal, la cloroquina. Se valoró trastuzumab-saporina en combinación con trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 5 nM4 en combinación con o sin cloroquina. Trastuzumab-saporina trastuzumab 5 nM-(Cys-L-SO1861)4 mostró una fuerte actividad destructora de células en células con alta expresión de HER2 (SK-Br-3, HER2++; CI50 = 0,2 pM;), sin embargo, trastuzumab-saporina trastuzumab-5 nM (Cys-L-SO1861)4+ 0,5 pM de cloroquina dio como resultado una fuerte inhibición de la actividad destructora de células de 1T2C en células SK-BR-3 (HER2++) (CI50 = 40 pM). Esto demuestra que la actividad de SO1861 conjugada con el anticuerpo se reduce/bloquea cuando no se permite la acidificación de los endoslisomas (Figura 14A). Se obtuvieron los mismos resultados con la combinación 1T2C según la invención de cetuximab-saporina cetuximab-5 nM (Cys-L-SO1861)3,8 (CI50 = 1 pM) en comparación con cetuximab-saporina cetuximab-5 nM (Cys-L-SO1861)3,8 0,5 pM de cloroquina (Cl50 = 200 pM) en células que expresan EGFR (A431, EGFR++; Figura 14B).
[0213] El sistema de 1 diana 2 componentes (1T2C) también puede ser el tratamiento combinado de mAb1-SO1861 y mAb1-oligonucleótido de BNA antisentido como se ilustra en la Figura 20. Para esto se utilizó un oligonucleótido de BNA antisentido contra el ARNm de un gen diana específico del cáncer (con mayor presencia en células cancerosas), la proteína de choque térmico 27 (HSP27). Tras la liberación en el citoplasma, el BNA antisentido reconoce y se une al ARNm que codifica HSP27, dirigiéndose al ARNm para su destrucción, con lo que se reduce la expresión en el ARNm de HSP27 dentro de la célula cancerosa. HSP27BNA se conjugó con cetuximab con un DAR4 (Cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4) y se analizó en combinación con cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 para detectar una actividad de silenciamiento del gen HSP27 mejorada en células que expresan EGFR (A431, EGFR++) y células que no expresan (A2058, EGFR), según la invención (Figura 20). Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8+ 100 nM de cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 mostró un fuerte silenciamiento del gen HSP27 en células que expresan EGFR (A431: CI50 = nM, Figura 15A), mientras que cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 por sí solo no mostró ninguna actividad de silenciamiento génico. En las células A2058 (EGFR) no se observó actividad de silenciamiento génico en la combinación 1T2C (Figura 15B). A continuación, cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,876,9 mostró una fuerte actividad de silenciamiento del gen HSP27 en células que expresan EGFR (A431: CI50 = 4 nM, Figura 15C), mientras que cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 o cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 o la combinación de Cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 cetuximab 77 nM no reveló ninguna actividad de silenciamiento de genes significativa (CI50> 100 nM). Cuando el experimento se realizó en células que no expresaban EGFR (A2058), no se observó actividad de silenciamiento génico en la combinación 1T2C (CI50> 100 nM; Figura 15D). Todo esto demuestra que el sistema 1T2C administra eficientemente un oligonucleótido de BNA antisentido al citoplasma de células con alta expresión de EGFR, induciendo así la degradación de ARNm del ARNm en el que actúa el BNA que da como resultado el silenciamiento del gen diana.
[0214] El sistema de 2 componentes 1 diana (1T2C) también puede ser el tratamiento combinado de mAb1-(armazón(-SO1861)n)n y mAb1-toxina proteica como se ilustra en la Figura 21. El dendrón(-L-SO1861)4 se conjugó con cetuximab mediante la conjugación de residuos de cisteína (Cys) con un DAR3,9 y cetuximab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)3,9 se analizó para determinar la actividad de destrucción celular mejorada en combinación con un conjugado de anticuerpo anti-EGFR-toxina proteica (cetuximab-saporina) en células que expresan EGFR (MDA-MB-468). Cetuximab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)3,9 cetuximab-saporina 10 pM induce eficazmente la muerte celular mediada por toxinas en células con alta expresión de EGFR (CI50 = 0,4 nM; Figura 16A), mientras que esto no sucedió con cetuximab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)3,9 o cetuximab cetuximab-saporina o cetuximab 10 pM (Figura 16A). Esto demuestra que, de acuerdo con el sistema 1T2C de la invención, el dendrón(-L-SO1861)4 conjugado con cetuximab mejora de manera eficiente el escape endosomal de la toxina proteica conjugada con cetuximab (en concentraciones no efectivas), induciendo así la muerte celular de las células con alta expresión de HER2. Se realizaron experimentos similares de 1T2C en células con bajos niveles de expresión de EGFR (HeLa, EGFR+/-) y no se obsevó actividad de destrucción celular cuando se usó la combinación 1T2C según la invención (CI50> 100 pM; Figura 16B), lo que indica que, en ausencia de suficiente expresión del receptor de EGFR, las concentraciones intracelulares efectivas de SO1861 no son óptimas (umbral) para inducir la administración citoplásmica de la toxina proteica que da como resultado la muerte celular mediada por la toxina.
[0215] A continuación, se conjugó el dendrón(-L-SO1861)4 con el anticuerpo anti-HER2, trastuzumab, mediante conjugación de cisteína (Cys) con un DAR4, trastuzumab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)4 y se evaluó para detectar una mejora de la actividad de destrucción celular en combinación con un conjugado de anticuerpo anti-HER2-toxina proteica-(trastuzumab-saporina) en células que expresan HER2 (SK-BR-3, HER2++). Trastuzumab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)4 50 pM trastuzumab-saporina induce eficazmente la muerte celular mediada por toxinas (CI50 = 2 nM, Figura 16C), mientras que esto no sucedió con trastuzumab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)4 o trastuzumab trastuzumab-saporina o trastuzumab 50 nM (Figura 16C). Esto demuestra que el dendrón(-L-SO1861)4 conjugado con trastuzumab mejora eficazmente el escape endosomal de la toxina proteica conjugada con trastuzumab (en concentraciones no eficaces), induciendo así la muerte celular de las células con alta expresión de HER2. Otros experimentos similares en células que expresan niveles bajos de HER2 (JIMT-1, h ER2+/) no revelaron actividad de Trastuzumab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)4 50 pM de trastuzumab-saporina (CI50> 200 nM; Figura 16D) que indique que, en ausencia de suficiente expresión del receptor HER2, las concentraciones intracelulares eficaces de SO1861 no son óptimas (umbral) para inducir el escape endosomal de la toxina proteica y la muerte celular mediada por la toxina.
[0216] Trastuzuzmab-emtansina (T-DM1), un ADC aprobado para uso clínico, es un conjugado de trastuzumab (un anticuerpo anti-Her2) y la toxina de moléculas pequeñas emtansina (DAR3.5). Se valoró T-DM1 en combinación con trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 y en comparación con el conjugado anticuerpo-toxina proteica, trastuzumab-saporina trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4, según la invención. Mientras que trastuzumab-saporina 2,5 nM trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 mostró una actividad mejorada en comparación con trastuzumab-saporina trastuzumab 2,5 nM o trastuzumab-saporina solo (CI50 = 2 pM, Figura 17), T-DM1 trastuzumab-25,6 nM (Cys-L-SO1861)4 no mostró una actividad de destrucción celular mejorada (CI50> 100 pM; Figura 17). Esto muestra que el sistema 1T2C, de acuerdo con la invención, no puede mejorar la liberación de un conjugado de anticuerpo - moléculas pequeñas, ya que las moléculas pequeñas por sí mismas pueden atravesar de manera pasiva membranas (endolisosomales).
[0217] El sistema de 1 diana 2 componentes (1T2C) también puede ser el tratamiento combinado de mAb1-QSmix (mezcla de saponinas de Quillaja Saponaria) y mAb1-toxina proteica.
[0218] QSmix-EMCH se conjugó mediante residuos de cisteína (Cys) a cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFr humano), con un DAR 4.1 (cetuximab-(Cys-L-QSmix)4,1). Cetuximab-(Cys-L-QSmix)4,1 se valoró en una concentración fija de cetuximab-saporina 10 pM o cetuximab-diantina 10 pM y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por toxina proteica en células A431 (EGFR++), CaSKi (EGFR+) y A2058 (EGFR). Esto reveló una gran destrucción celular a bajas concentraciones de cetuximab-(Cys-L-QSmix)41 cetuximab-saporina 10pM o cetuximab-diantina 10 pM en células A431 (EGFR++) y CaSKi (EGFR+) (A431: CI50 = 3 nM, Figura 18A; CaSKi: CI50 = 1 nM, Figura 18B), mientras que ninguno de los tratamientos de control pudo inducir muerte celular en las células que expresan EGFR. En células que no expresan EGFR (A2058; EGFR-) no se observa silenciamiento del gen HSP27 con la combinación de acuerdo con la invención (CI50> 1000 nM; Figura 18C). Esto demuestra que QS21mix conjugado con cetuximab mejora eficazmente el escape endosomal de la toxina proteica conjugada con cetuximab (a concentraciones no eficaces), induciendo así la muerte celular sólo en células que expresan EGFR.
Ejemplo 4
[0219] Se conjugó SO1861 lábil mediante residuos de cisteína (Cys) al anticuerpo anti-EGFR cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFR humano), con DAR3.9 (cetuximab-(Cys-L-SO1861)39) y se analizó su administración mejorada de oligonucleótidos de BNA antisentido, lo que resultó en un silenciamiento mejorado del gen diana. En este estudio se utilizó un oligonucleótido de BNA antisentido contra el ARNm de un gen diana específico del cáncer, la proteína de choque térmico 27 (HSP27). Dentro del citoplasma de la célula, HSP27BNA se une al ARNm que codifica HSP27 y actúa sobre el ARNm para su destrucción, reduciendo así la expresión de HSP27 dentro de la célula cancerosa. Cetuximab-(Cys-L-SO1861)39 se valoró en una concentración fija de HSP27BNA 100 nM en células EGFR++ (A431) y EGFR (a 2058). La combinación según la invención mostró un silenciamiento eficiente de HSP27 en A431 (CI50 = 2 nM; Figura 5A), mientras que no se observó silenciamiento para cetuximab-(Cys-L-SO1861)39 solo. Cetuximab-(Cys-L-SO1861)39 100nM HSP27BNA no mostró actividad de silenciamiento génico en células EGFR-(A2058) (Figura 5B). Esto demuestra que concentraciones bajas de SO1861 conjugada con anticuerpo pueden mejorar eficazmente la liberación citoplásmica y el escape endolisosómico de un oligonucleótido de BNA antisentido, induciendo así un silenciamiento génico eficaz en células que expresan la diana.
[0220] A continuación, HSP27BNA se valoró en células EGFR++ (A431) y EGFR-(A2058) en combinación con una concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861)39. Esto muestra que HSP27BNA en combinación con cetuximab-(Cys-L-SO1861)39 28,6 nM o cetuximab-(Cys-L-SO1861)39 77 nM mejora con mucha eficacia el silenciamiento del gen HSP27 en células A431 (CI50 = 10 nM; Figura 5C). HSP27BNA solo o combinado con un equivalente fijo de cetuximab 77 nM son menos eficientes (CI50 = 1000 nM; Figura 12C). El tratamiento combinado de HSP27BNA cetuximab-(Cys-L-SO1861)3977 nM también se analizó en células EGFR-(A2058), y esto no reveló ninguna mejora del silenciamiento del gen HSP27 (CI50 = 1000 nM; Figura 5D). Esto demuestra que las células con una expresión del receptor de EGFR baja o nula no son susceptibles a la combinación de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 HSP27b Na , mientras que SO1861 con cetuximab puede mejorar el silenciamiento del gen HSP27 de manera eficiente a concentraciones bajas de HS27BNA no dirigido en células con alta expresión de EGFR.
[0221] A continuación, se conjugó SO1861-EMCH mediante residuos de cisteína (Cys) a cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFR humano), con un DAR 3,8. La combinación según la invención, cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 HSP27BNA (oligonucleótido antisentido HSP27BNA que se dirige a la oncodiana hsp27 del ARNm e induce su degradación (silenciamiento génico) en células cancerosas) se analizó en un modelo de tumor de ratón 'nude' xenógrafo A431 para el silenciamiento del gen HSP27 dirigido a tumores mediado por EGFR. La administración comenzó el día 12 cuando los tumores alcanzaron ~ 150 mm3 de tamaño y se determinó la expresión en el ARNm de HSP27. Para ello, se recogieron muestras tumorales 72 h después de la primera administración y se analizaron los niveles de expresión del gen HSP27 en comparación con los niveles de expresión en el ARNm de control celular (genes de referencia). Se trató a ratones con tumores (n = 3) (por vía intraperitoneal; i.p.) el día 12 con 25 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 25 mg de HSP27BNA y, el día 15 con 25 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 10 mg de HSP27BNA y esto reveló una reducción del 25 % en la expresión en el ARNm de HSP27 en los tumores en comparación con el control con vehículo o la dosis única de 25 mg/kg de HSP27BNA (Figura 6). Esto demuestra y asegura que la conjugación de SO1861 a un anticuerpo de direccionamiento, de acuerdo con la invención, induce de manera eficaz la liberación citoplásmica mejorada mediada por SO1861 de un oligonucleótido antisentido terapéutico en tumores sólidos de ratones con tumores, induciendo silenciamiento génico dirigido a tumores, in vivo.
DAR2 frente a DAR4
[0222] SO1861-EMCH (porción conectora lábil, L) se conjugó mediante residuos de cisteína (Cys) a cetuximab, con DAR3.7 (cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7) o DAR2 (cetuximab-(Cys-L-SO1861)2). Estos conjugados de cetuximab-SO1861 se analizaron para determinar la actividad de destrucción celular mejorada en combinación con cetuximab-saporina 10 pM en células con alta expresión de EGFR (A431, EGFR++). Esto reveló la misma potencia de destrucción celular para SO1861, DAR2 y DAR4 conjugados con cetuximab (Figura 22A). Se obtuvieron los mismos resultados cuando trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 y trastuzumab-(Cys-L-SO1861)21 se compararon en combinación con trastuzumab-saporina 50 pM en células con alta expresión de HER2 (SK-BR-3, HER2++) (Figura 22B), lo que demuestra que la reducción de la cantidad de SO1861 conjugada, de acuerdo con la invención, reduce la potencia para el escape endosomal eficaz y la destrucción celular mediada por toxinas.
Estable vs lábil
[0223] SO1861-HATU (porción conectora estable, S) se conjugó mediante residuos de cisteína (Cys) al anticuerpo anti-EGFR cetuximab con DAR3.7 (cetuximab-(Cys-S-SO1861)3J). Este conjugado cetuximab-SO1861 se combinó con una concentración fija de 10 pM del conjugado anticuerpo anti-EGFR- toxina proteica (cetuximab-saporina) y se analizó para detectar la actividad mejorada de destrucción celular en células con alta expresión de EGFR (MDA-MB-468, EGFR++), en comparación con el conjugado lábil (cetuximab-(Cys-L-SO1861)37. Esto reveló que la SO1861 conjugada con anticuerpo estable o lábil, según la invención, muestra la misma actividad de destrucción celular mejorada cuando se combina con concentraciones no eficaces de un conjugado anticuerpo-toxina proteica (Figura 23A). Se revelaron los mismos datos cuando trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 se comparó con trastuzumab-(Cys-S-SO1861)4 en combinación con trastuzumab-saporina 50 pM en células Sk-BR-3 (HER2++) (Figura 23B). Todo esto indica que la SO1861 conjugada estable o lábil, según la invención, funciona eficazmente para inducir el escape endosomal de la toxina conjugada con anticuerpo.
Sistema de 2 dianas 2 componentes (in vivo)
[0224] El sistema de 2 dianas 2 componentes (2T2C) es el tratamiento de combinación de mAb1-SO1861 y mAb2-toxina proteica, (Figura 37). SO1861-EMCH se conjugó a través de residuos de cisteína (Cys) con cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFR humano), con un DAR 4 que da como resultado la producción de: cetuximab-(Cys-L-SO1861)4. La combinación de cetuximab-(Cys-L-SO1861)4 y trastuzumab-saporina o CD71mab-saporina se analizó en un modelo de tumor xenógrafo de ratón 'nude' A431 (EGFR++/ HER2+/-/ CD71+) para la destrucción celular dirigida al tumor EGFR como se ilustra en la Figura 37. Se modificó progresivamente la dosis para determinar la eficacia terapéutica (Día 9: 0,3 mg/kg de trastuzumabsaporina o 0,1 mg/kg de CD71mab-saporina + 5 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)4; Día 14, 18: 0,1 mg/kg de trastuzumab-saporina o 0,05 mg/kg de CD71mab-saporina + 5 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)4; Día 21: 0,05mg/kg de trastuzumab-saporina o 0,05mg/kg de CD71mab-saporina + 15mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)4; Día 28: 0,02 mg/kg de trastuzumab-saporina o 0,02 mg/kg de CD71mab-saporina + 15 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)4 trastuzumab-saporina/cetuximab-SO1861. Se aplicó el mismo esquema de dosificación a los controles, respectivamente, solo el cetuximab se administró (por vía intravenosa) a razón de 25 mg/kg cada día de tratamiento). En los días 32 (línea discontinua), 35 y 39 se inició la combinación, según el sistema 2T2C de la invención, de 25 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)4 (inyección intraperitoneal (i.p.) 0,02 mg/kg de trastuzumab-saporina o 0,02 CD71mab-saporina (administración intravenosa, (i.v.)) y esto reveló una fuerte regresión tumoral para ambos grupos de combinación 2T2C en comparación con el control con vehículo, 25 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)4 o monoterapia de 0,02 mg/kg de trastuzumabsaporina/CD71mab-saporina (Figura 24). El sistema 2T2C incluso supera al cetuximab, el anticuerpo monoclonal usado clínicamente contra EGFR. A continuación, se realizó el mismo experimento pero luego se comenzó con un tratamiento de 25 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)4 (inyección intraperitoneal (ip) 0,03 mg/kg de trastuzumab-saporina o 0,03 CD71mab-saporina (administración intravenosa, (i.v.)) con una dosis el día 9 y 14 y posteriormente 1 dosis por semana. El sistema 2T2C según la invención mostró regresión tumoral en todos los ratones e incluso, en 1 ratón en los dos grupos 2T2C, la erradicación completa del tumor (volumen tumoral = 0 mm3) (Figura 25). También en este caso los controles mostraron un fuerte aumento en el volumen del tumor, mientras que el control positivo para este modelo de ratones A431, cetuximab, mostró solo inhibición del crecimiento tumoral, pero no regresión (Figura 25). Esto demuestra y valida el enfoque del sistema 2T2C, de acuerdo con la invención, de que trastuzumab conjugado con cetuximab+ toxina proteica conjugada con SO1861 o la toxina proteica conjugada con CD71mab induce una administración dirigida altamente eficiente de una toxina proteica terapéutica en el citoplasma de tumores sólidos de ratones con tumores, in vivo, induciendo así incluso la erradicación total del tumor en algunos ratones y una fuerte regresión tumoral en otros, incluso en tumores de gran tamaño (2000 mm3).
Sistema de 2 dianas 2 componentes (in vitro)
Resultados
[0225] El sistema de 2 dianas 2 componentes (2T2C) es el tratamiento de combinación de mAb1-SO1861 y mAb2-toxina proteica, (Figura 37). SO1861-EMCH se conjugó mediante residuos de cisteína (Cys) a cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFR humano), con un DAR 3,7 (cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7). Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 se valoró en una concentración fija de trastuzumab-saporina 50 pM (trastuzumab, conjugado con la toxina proteica, saporina) y la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células que expresan EGFR/HER2 (A431, eGFr++/ HER2+/-; CaSKi, EGFR+/ HER2+/-) se determinó como se ilustra en la Figura 37. Esto reveló una importante destrucción celular a bajas concentraciones de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 (A431: CI50 = 3 nM y CaSKi CI50 = 10 nM; Figura 26A, 26B) mientras que las concentraciones equivalentes de cetuximab, cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 o cetuximab trastuzumab-saporina 50 pM no pudieron inducir ninguna actividad de destrucción celular en células que expresan EGFR/HER2. Esto demuestra que concentraciones relativamente bajas de conjugado cetuximab-SO1861 mejoran eficazmente el escape endosomal de la toxina proteica conjugada con trastuzumab (a concentraciones no eficaces), induciendo así la muerte celular eficaz de las células con alta expresión de EGFR/baja expresión de HER2.
[0226] A continuación, se valoró trastuzumab-saporina en una concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861) 75 nM3,7 y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células que expresan EGFR/HER2. Esto reveló que cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,775 nM en combinación con bajas concentraciones de trastuzumab-saporina indujo una muerte celular ya eficaz en células que expresan EGFR/HER2 (A431: CI50 = 5 pM; y CaSKi: CI50 = 1 pM; Figura 26C y 26D), mientras que trastuzumab-saporina solo o trastuzumab-saporina 75 nM cetuximab no mostró una actividad de destrucción celular significativa (CI50> 10000 pM) en ambas líneas celulares (Figura 26C, 26D). Todo esto demuestra que concentraciones relativamente bajas de trastuzumab-saporina pueden ser eficaces e inducir la muerte celular en combinación con concentraciones bajas de conjugado cetuximab-SO1861 en células con alta expresión de EGFR/baja expresión de HER2.
[0227] A continuación, cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 se valoró en una concentración fija de trastuzumab-saporina 50 pM y la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en HeLa (Eg f R+/_/ HER2+/_) o A2058 (eGfR-/ HER2+/_) se determinó como se ilustra en la Figura 37. Ni las células HeLa (EGFR+/_/ HER2+/_) ni A2058 (EGFR"/ HER2+/_) muestran muerte celular a bajas concentraciones de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 50 pM de trastuzumab-saporina (HeLa: CI50 = 400 nM; A2058: CI50> 400 nM; Figura 27A, 27B). Esto demuestra que, en ausencia de suficiente expresión del receptor, no se alcanzan concentraciones de SO1861 administrada intracelularmente que sean eficaces (umbral) para inducir el escape endosomal y la liberación citoplásmica de la toxina proteica. A continuación, se valoró trastuzumab-saporina en una concentración fija de cetuximab-(Cys-L-SO1861) 75 nM3,7 y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en HeLa o A2058 (EGFR-/ HER2+/-). Ni las células HeLa (EGFR+/-/ HER2+-) ni A2058 (EGFR-/ HER2+-) no mostraron actividad de destrucción celular (HeLa: CI50> 10000 pM; A2058: CI50> 10000 pM; Figura 27C, 27D). Todo esto demuestra que las células con baja o nula expresión del receptor de EGFR no son susceptibles a la combinación de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 trastuzumab-saporina, debido a la falta de suficiente receptor de EGFR que facilite la liberación mediada por anticuerpos de suficiente SO1861 (umbral) para asegurar el escape endosomal de la toxina dentro del citoplasma de la célula.
[0228] A continuación, se conjugó SO1861-EMCH a través de residuos de cisteína (Cys) a trastuzumab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al HER2 humano), con un DAR 4 (trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4). Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 se valoró en una concentración fija de 1,5 pM de EGFdiantina (proteína de fusión de toxina ligando dirigida a EGFR) y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células que expresan HER2/eGfR (SK-BR-3: HER2++/ EGFR+/-). Esto reveló una fuerte destrucción celular a bajas concentraciones de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 1,5 pM EGFdiantina (SK-BR-3: CI50 = 1 nM; Figura 28A), mientras que las concentraciones equivalentes de trastuzumab, trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 o trastuzumab EGFdiantina 1,5 pM no pudieron inducir ninguna actividad de destrucción celular en células con expresión de HER2++/ EGFR+/_. Esto demuestra que SO1861 conjugada con trastuzumab mejora con eficacia el escape endosomal de la toxina proteica de fusión EGF (a concentraciones no eficaces), induciendo así la muerte celular de las células con alta expresión de HER2/baja expresión de EGFR.
[0229] A continuación, se valoró EGFDiantina en una concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células con expresión de SK-BR-3 (HER2++/ EGFR+/_). Esto reveló que trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 en combinación con bajas concentraciones de EGFdiantina indujo una destrucción celular ya eficiente en células que expresan HER2/EGFR (SK-BR-3: CI50 = 1 pM) (Figura 28B), mientras que EGFdiantina sola o EGFdiantina 2,5 nM trastuzumab no mostró actividad de destrucción celular (CI50 > 10000 pM) (Figura 28B). Todo esto demuestra que concentraciones relativamente bajas de EGFdiantina pueden ser efectivas e inducir la muerte celular solo en combinación con concentraciones bajas de trastuzumab (Cys-L-SO1861)4 en células con alta expresión de HER2/baja expresión de EGFR.
[0230] A continuación, trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 se valoró en una concentración fija de 1,5 pM de EGFdiantina y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en JIMT-1 (HER2+/"/ EGFR+/_) o MDA-MB-468: HER2"/EGFR++). Ninguna de las líneas celulares fue sensible a ninguna combinación de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4+ 1,5 pM EGFdiantina (JIMT-1: CI50> 1000 nM; MDA-MB-468: CI50> 1000 nM; Figura 29A, 29B). Esto demuestra que, en ausencia de suficiente expresión del receptor HER2, no se alcanzan concentraciones intracelularmente eficaces (umbral) de SO1861 administrada para inducir el escape endosomal y la liberación citoplásmica de la toxina proteica.
[0231] A continuación, se valoró EGFDiantina en una concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en JIMT-1 (HER2+/_/ eGf R+/_) o MDA-MB-468 (HER2"/EGFR++). Ambas líneas celulares mostraron destrucción celular a concentraciones elevadas de EGFdiantina con o sin trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 (JIMT-1: CI50 = 10000 pM; MDA-MB-468: CI50 = 200 pM Figura 29C, 29D).
[0232] Todo esto demuestra que las células con baja o nula expresión del receptor HER2 no son susceptibles a la combinación de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,7+ EGFdiantina1,5 pM, debido a la falta de suficiente receptor HER2 que facilite la liberación mediada por anticuerpos de suficiente SO1861 (umbral) para asegurar el escape endosomal de la toxina dentro del citoplasma de la célula.
[0233] A continuación, se conjugó SO1861-EMCH a través de residuos de cisteína (Cys) con trastuzumab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une a HER2 humano), con un DAR 4, (trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4). Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 se valoró en una concentración fija de cetuximab-saporina 5 pM (conjugado de toxina proteica-anticuerpo dirigido a EGFR) y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células que expresan HER2/EGFR (SK-BR-3: HER2++/ EGFR+/-) como se ilustra en la Figura 37. Esto reveló una fuerte destrucción celular a bajas concentraciones de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 Cetuximab-saporina 5 pM (SK-BR-3: CI50 = 1 nM; Figura 30A) mientras que las concentraciones equivalentes de trastuzumab, trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 o trastuzumab cetuximab-saporina 5 pM no pudieron inducir ninguna actividad de destrucción celular en células con expresión de HER2++/ EGFR+/-. Esto demuestra que SO1861 conjugada con trastuzumab mejora eficazmente el escape endosomal de la toxina proteica conjugada con cetuximab (en concentraciones no eficaces), induciendo así la muerte celular de células con expresión de HER2++/ EGFR+/-.
[0234] A continuación, se valoró cetuximab-saporina en una concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2.5 nM4 y trastuzumab 75 nM (Cys-L-SO1861)4 y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células que expresan HER2/EGFR (SK-BR-3: HER2++/ EGFR+/-). Esto reveló que trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 en combinación con bajas concentraciones de cetuximab-saporina indujo una muerte celular ya eficaz en células SK-BR-3 (SK-BR-3: CI50 = 1 pM; Figura 30B), mientras que cetuximab-saporina solo o cetuximab-saporina trastuzumab 2,5 nM mostraron destrucción celular sólo a altas concentraciones de trastuzumab-saporina (SK-BR-3: CI50> 4000 pM; Figura 30B). Todo esto demuestra que concentraciones relativamente bajas de cetuximab-saporina pueden ser efectivas e inducir la muerte celular solo en combinación con concentraciones bajas de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 en células con expresión de HER2++/ EGFR+/-.
[0235] A continuación, trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 se valoró en una concentración fija de cetuximab-saporina 5 pM y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células JIMT-1 (HER2+/-/ eGf R+/-) y MDA-MB-468 (HER2-/EGFR++). Ninguna de las líneas celulares fue sensible a la combinación de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 Cetuximab-saporina 5 pM (JIMT-1: CI50> 1000 nM; MDA-MB-468: CI50> 1000 nM; Figura 31A, 31B). Esto demuestra que, en ausencia de suficiente expresión del receptor HER2, no se alcanzan concentraciones eficaces (umbral) de SO1861 administrada intracelularmente para inducir el escape endosomal y la liberación citoplásmica de la toxina proteica.
[0236] A continuación, se valoró cetuximab-saporina en una concentración fija de trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2.5 nM4 y se determinó la destrucción celular dirigida mediada por la toxina proteica en células JIMT-1 (HER2+/-/ EGFR+/-) y MDA-MB-468 (HER2-/EGFR++). Ambas líneas celulares mostraron destrucción celular a concentraciones similares de cetuximab-saporina con o sin trastuzumab-(Cys-L-SO1861) 2,5 nM4 (JIMT-1: CI50 = 80 pM; MDA-MB-468: CI50 = 100 pM; Figura 31C, 31D).
[0237] Todo esto demuestra que las células con baja o nula expresión del receptor HER2 no son susceptibles a la combinación de trastuzumab-(Cys-L-SO1861)4 cetuximab-saporina, debido a la falta de suficiente receptor HER2 que facilite la liberación mediada por anticuerpos de suficiente SO1861 (umbral) para asegurar el escape endosomal de la toxina dentro del citoplasma de la célula.
[0238] Con el fin de demostrar que la actividad de la SO1861 conjugada está impulsada por la acidificación de los compartimentos endosomales, se analizó el sistema de 2T2C, según la invención, en combinación con un inhibidor de la acidificación endosomal, la cloroquina. Trastuzumab-saporina cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 77 nM o trastuzumab-diantina cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,977 nM mostró una fuerte actividad de destrucción de células en A431 (EGFR++/ HER2+/-), mientras que esta actividad del sistema 2T2C, según la invención, se inhibió cuando se coadministró cloroquina 800 nM junto con ambas combinaciones (Figura 32A). Se observaron los mismos resultados cuando se analizó CD71mab-saporina cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 10,5 nM cloroquina 500 nM en células A431 (EGFR++/ CD71+) y MDA-MB-468 (EGFR++/ CD71+)(Figura 32B, 9C) o cuando se analizó CD71mab-saporina trastuzumab 5 nM-(Cys-L-SO1861)4 cloroquina 500 nM en SK-b R-3 (HER2++/ CD71+) (Figura 32D). Esto demuestra que la actividad intracelular de la SO1861 conjugada dentro del sistema 2T2C puede inhibirse cuando se bloquea la acidificación de los endosomas.
[0239] El sistema de 2 dianas 2 componentes (2T2C) es también el tratamiento de combinación de mAb1-SO1861 y mAb2-oligonucleótido de BNA antisentido (Figura 38). Por lo tanto, el sistema 2T2C también se analizó en combinación con un oligonucleótido BNA antisentido contra el ARNm de un gen diana específico del cáncer, la proteína de choque térmico 27 (HSP27). Tras la liberación en el citoplasma, el BNA antisentido reconoce y se une al ARNm que codifica HSP27, dirigiéndose al ARNm para su destrucción, agotando así la expresión de HSP27 dentro de la célula cancerosa. HSP27BNA se conjugó con trastuzumab con un DAR4.4 (trastuzumab-(Lys-L-HSP27BNA)4,4) y se analizó en combinación con Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 para observar la mejora de la actividad de silenciamiento del gen HSP27 en A431 (EGFR++/ He R2+/-) células y a 2058 (EGFR-/ HER2+/-) como se ilustra en la Figura 38. Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 se valoró en una concentración fija de 100 nM de Trastuzumab-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 y se determinó la actividad de silenciamiento génico dirigido mediada por HSP27BNA. Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 100 nM Trastuzumab-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 muestran una fuerte actividad de silenciamiento génico en células A431 (EGFR++/ HER2+/-) (A431: CI50 = 1 nM; Figura 33A), en comparación con Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 solo. En células A2058 (EGFR-/ HER2+/-), la combinación según la invención no mostró silenciamiento del gen HSP27 (A2058: CI50> 100 nM; Figura 33B). Esto demuestra que la SO1861 conjugada con cetuximab mejora eficazmente el escape endosomal del oligonucleótido de BNA conjugado con trastuzumab (a concentraciones no eficaces), induciendo así el silenciamiento del gen diana en células con expresión de EGFR++/ HER2+/-.
[0240] A continuación, se valoró Trastuzumab-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 en una concentración fija de Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 y la actividad de silenciamiento del gen mediada por HSP27BNA dirigida se determinó en células A431 (EGf R++/ HER2+/-) y A2058 (EGFR-/ HER2+/-) como se ilustra en la Figura 38. Trastuzumab-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,977 nM muestra una fuerte actividad de silenciamiento génico en células A431 (EGFR++/ HER2+/-) (A431: CI50 = 1 nM; Figura 33C), mientras que trastuzumab-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 solo o Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9 solo o trastuzumab-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 cetuximab 77 nM no reveló ninguna actividad significativa de silenciamiento génico (CI50> 100 nM). Las células A2058 (EGFR-/ HER2+/-) no mostraron ninguna actividad de silenciamiento génico en la combinación según la invención (A2058: CI50> 100 nM; Figura 33D). Todo esto demuestra que concentraciones relativamente bajas de trastuzumab-HSP27BNA pueden ser efectivas e inducir la muerte celular solo en combinación con concentraciones bajas de cetuximab-(-L-SO1861) en células con expresión de HER2++/ EGFR+/-.
[0241] El sistema de 2 dianas 2 componentes (2T2C) también puede ser el tratamiento combinado de mAb1-(dendrón(-SO1861)n)n y mAb2-toxina proteica (Figura 39). Dendrón(-L-SO1861)4 se conjugó con el anticuerpo anti-EGFR cetuximab mediante residuos de cisteína (Cys) con un DAR3,9, (cetuximab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)3,9) y se analizó para observar la actividad mejorada de destrucción celular en combinación con un conjugado de toxina proteica anticuerpo anti-CD71 (CD71mab-saporina) en células que expresan MDA-MB-468 (EGFR++/ CD71+) como se ilustra en la Figura 39. Cetuximab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)3,9 CD71mabsaporina 10 pM induce eficazmente la muerte celular mediada por toxinas en células que expresan MDA-MB-468 (EGFR++/ CD71+) (CI50 = 0,4 nM, Figura 34A), mientras que esto no sucedió con Cetuximab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)3,9) o cetuximab mab-saporina CD71 10 pM o cetuximab (Figura 34A). Esto demuestra que el dendrón conjugado con cetuximab (-L-SO1861)4 mejora de manera eficiente el escape endosomal de la toxina proteica CD71mab (en concentraciones no efectivas), lo que induce la muerte celular en células que expresan EGFR++/ CD71+. Se realizaron experimentos similares en células HeLa (HER2+/-/ CD71+), que no revelaron actividad de cetuximab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)3,9) CD71mab-saporina 10 pM (CI50> 100 nM Figura 34B), lo que indica que, en ausencia de suficiente expresión del receptor de EGFR, no se alcanzan concentraciones intracelulares eficaces de SO1861 (umbral) para inducir el escape endosomal y la liberación citoplásmica de la toxina proteica.
[0242] A continuación, se conjugó dendrón(-L-SO1861)4 con el anticuerpo anti-HER2 trastuzumab mediante conjugación de cisteína (Cys) con un DAR4, trastuzumab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)4 y se analizó para detectar la actividad mejorada de destrucción celular en combinación con un conjugado de toxina proteica-anticuerpo anti-CD71 (CD71mab-saporina) en células que expresan SK-BR-3 (HER2++/ CD71+). Trastuzumab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)4 CD71mab-saporina 10 pM induce eficientemente la muerte celular mediada por toxinas en células SK-BR3 (CI50 = 3 nM, Figura 34C), mientras que esto no fue inducido por trastuzumab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)4 o trastuzumab (equivalente) CD71mab-saporina o trastuzumab 10 pM (Figura 34C). Esto demuestra que el dendrón conjugado con trastuzumab (-L-SO1861)4 de acuerdo con la invención mejora con eficacia el escape endosomal de la toxina proteica CD71mab (a concentraciones no eficaces), induciendo así la muerte celular de células que expresan HER2++/ CD71+. Se realizaron experimentos similares en células JIMT-1 (HER2+/-/ CD71+) que no revelaron actividad de trastuzumab-Cys-(dendrón(-L-SO1861)4)4 CD71mab-saporina 10pM (CI50> 100 nM Figura 34C), lo que indica que, en ausencia de suficiente expresión del receptor HER2, no se alcanzan concentraciones intracelulares eficaces de SO1861 (umbral) para inducir el escape endosomal y la liberación citoplásmica de la toxina proteica.
[0243] El ADC aprobado para uso clínico, trastuzumab-emtansina (T-DM1), es un conjugado del anticuerpo anti-Her2, trastuzumab y la toxina de moléculas pequeñas emtansina (DAR3-4). T-DM1 se analizó dentro del sistema 2T2C según la invención en combinación con cetuximab-(Cys-L-SO1861)4. T-DM1 cetuximab de 77 nM-(Cys-L-SO1861)3,9 no mostró actividad de destrucción celular mejorada en comparación con T-DM1 solo o T-DM1 cetuximab 77 nM (CI50 = 80.000 pM, Figura 35), mientras que trastuzumab-saporina cetuximab-75 nM (Cys-L-SO1861)3,7 de acuerdo con la invención mostró una actividad de destrucción celular mejorada en comparación con trastuzumab-saporina cetuximab 75 nM o trastuzumab-saporina solo (CI50 = 3 pM, Figura 35). Todo esto demuestra que el sistema 2T2C no mejora la administración de moléculas pequeñas conjugadas con anticuerpos, que ya son capaces de atravesar pasivamente las membranas celulares (endosomales).
Resultados
[0244] El sistema de 2 dianas 2 componentes (1T2C) también puede ser el tratamiento combinado de mAb1-QSmix (mezcla de saponinas de Quillaja Saponaria) y mAb2-toxina proteica.
[0245] QSmix-EMCH se conjugó mediante residuos de cisteína (Cys) a cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFr humano), con un DAR 4,1 (cetuximab-(Cys-L-QSmix)4'1). Cetuximab-(Cys-L-QSmix)4,1 se valoró en una concentración fija de trastuzumab-saporina o CD71mab-saporina 10 pM y se determinó la destrucción celular mediada por la toxina proteica dirigida en A431 (EGFR++/ HER2+/-/ CD71+) y CaSKi (EGFR+/ HER2+/-/ CD71+). Esto reveló una fuerte destrucción celular a bajas concentraciones de Cetuximab-(Cys-L-QSmix)4'1 10 pM de trastuzumab-saporina (A431: CI50 = 100 nM; Figura 36A CaSKi: CI50 = 10 nM Figura 36B) así como con Cetuximab-(Cys-L-QSmix)4,1 10 pM CD71mab-saporina (A431: CI50 = 3 nM, Figura 36A; CaSKi: CI50 = 0,8 nM, Figura 36B) mientras que cetuximab, cetuximab-(Cys-L-QSmix)4,1 o cetuximab trastuzumab-saporina 10 pM o cetuximab CD71mab-saporina 10 pM no pudieron inducir ninguna muerte celular en células con expresión de EGFR++/ HER2+/-/ CD71+ o EGFR+/ He R2+/-/ CD71+. Esto demuestra que concentraciones relativamente bajas de conjugado cetuximab-QSmix mejoran eficazmente el escape endosomal de la toxina proteica conjugada con trastuzumab y de la toxina proteica conjugada CD71mab (en concentraciones no eficaces), lo que induce la muerte celular eficaz de células con expresión de EGFR++/ HER2+/-/CD71 o EGFR+/ HER2+/-/ CD71+. Cuando se realizó el mismo experimento en células A2058 (EGFR-/ HER2+/-/ CD71+), no se pudo observar actividad de cetuximab-(Cys-L-QSmix)4,1 10 pM de trastuzumabsaporina o cetuximab-(Cys-L-QSmix)4,1 CD71mab-saporina 10pM (Figura 36C), lo que indica que, en ausencia de suficiente expresión del receptor de EGFR, no se alcanzan concentraciones de saponina QS administradas intracelulares efectivas (umbral) para inducir el escape endosomal y la liberación citoplásmica de la toxina proteica.
Ejemplo 5
[0246] Se conjugó SO1861 (lábil) mediante residuos de cisteína (Cys) y se conjugó diantina (toxina proteica) (estable) mediante residuos de lisina (Lys) con cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFR humano), dando como resultado la producción de: Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-diantina)2. El conjugado se analizó en un modelo de tumor xenógrafo de ratón A431 (EGFR++) para observar la muerte de células diana tumorales EGFR como se ilustra en la Figura 47. La administración comenzó el día 12, cuando los tumores alcanzaron ~ 150 mm3, y se determinó el volumen del tumor después de la administración de cada dosis. Se trató a ratones (n = 3) (vía intraperitoneal; i.p.; con dosis en aumento) a razón de: día 12: 0,5 mg/kg; día 15: 1 mg/kg y día 24: 1,5 mg/kg con cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-diantina)2 o cetuximab-(Lys-S-diantina)1,6. El día 26, en comparación con el grupo de control, se pudo observar una reducción del volumen del tumor en los ratones con tumores tratados con cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-diantina)2 (Figura 40A). Esto demuestra que la conjugación lábil de SO1861 a un conjugado anticuerpo-toxina proteica (estable) puede mejorar la eficacia terapéutica dirigida de la toxina proteica-anticuerpo dirigida al tumor, induciendo así una terapia dirigida al tumor más eficaz.
[0247] A continuación, se conjugó SO1861 (lábil) mediante residuos de cisteína (Cys) y diantina (toxina proteica) se conjugó (lábil) mediante residuos de lisina (Lys) a cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFR humano), dando como resultado la producción de: Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2. El conjugado se analizó en un modelo de tumor xenógrafo de ratón A431 (EGFR++) para observar la muerte de células diana de tumor EGFR como se ilustra en la Figura 47. La administración de las dosis comenzó el día 12 cuando los tumores alcanzaron ~ 150 mm3 y se determinó el volumen del tumor después de la administración de cada dosis. Se trataron ratones (n = 3) (intraperitoneal; i.p .; aumento de la dosis) el día 12: 0,5 mg/kg; día 15: 1 mg/kg, día 24: 1,5 mg/kg con cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2 o cetuximab-(Lys-L-diantina)1,6. Esto reveló que después de 35 días en comparación con el control, los ratones con tumores tratados con cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2 mostró inhibición del crecimiento tumoral (Figura 40B). Cuando los ratones (n = 3; fueron tratados (intravenoso, iv; aumento de la dosis) día 12: 0,5 mg/kg; día 15: 1 mg/kg, día 18: 2 mg/kg, día 24: 2,5 mg/kg con cetuximab-( Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2 de acuerdo con la invención también se pudo observar la inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el control (los datos representan 1 ratón, ya que 2 ratones murieron durante los tratamientos). Esto demuestra que la conjugación lábil de SO1861 con un conjugado anticuerpo-toxina proteica (lábil) puede mejorar la eficacia terapéutica dirigida de la toxina proteica-anticuerpo dirigida al tumor, induciendo así una terapia dirigida al tumor más eficaz.
[0248] A continuación, SO1861-EMCH se conjugó mediante residuos de cisteína (Cys) a cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFr humano), con un DAR 3,9 y el oligonucleótido antisentido HSP27BNA (dirigiendo e induciendo la degradación de la onco-diana hsp27 ARNm (silenciamiento génico) en células cancerosas) a través de una porción conectora lábil (L) a los residuos de lisina (Lys) del anticuerpo, con un DAR 1,8 que da como resultado la producción de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8. Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8 se analizó en un modelo de tumor de ratón 'nude' xenógrafo A431 para el silenciamiento del gen HSP27 dirigido a tumores mediado por EGFR, de acuerdo con la invención como se ilustra en la Figura 48. La administración comenzó el día 12 cuando los tumores alcanzaron ~ 150 mm3 de tamaño y se determinó la expresión en el ARNm de HSP27. Para ello, se recogieron muestras tumorales 72 h después de la primera administración y se analizaron los niveles de expresión del gen HSP27 en comparación con los niveles de expresión en el ARNm de control celular (genes de referencia). En ratones con tumores (n = 3) tratados (intraperitoneal; i.p.,) con 30 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8 se observó, después de 1 dosis, una reducción del 40 % en la expresión en el ARNm de HSP27 en los tumores en comparación con una dosis única de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 o cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)1'5 (Figura 41). En comparación con el tumor del control con vehículo, se observó una reducción del 25 % de la expresión del gen HSP27. Esto demuestra y asegura que la conjugación de SO1861 y HSP27BNA con el mismo anticuerpo de direccionamiento, según la invención, induce eficazmente la liberación citoplasmática mejorada mediada por SO1861 de un oligonucleótido antisentido terapéutico en tumores sólidos de ratones con tumores, lo que induce el silenciamiento génico con tumor. En otro ejemplo, se diseñó y produjo un armazón de porción conectora trifuncional con 3 grupos finales químicos específicos para la conjugación con SO1861 en un brazo y el HSP27BNA en el otro brazo para producir SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA. A continuación, se conjugó SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA con su tercer brazo a residuos de cisteína (Cys) del anticuerpo anti-EGFR, cetuximab (cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7) y se analizó en un modelo de tumor de ratón 'nude' xenógrafo A431 su actividad de silenciamiento génico dirigido a tumores mediada por EGFR, de acuerdo con la invención como se ilustra en la Figura 49. La administración de las dosis comenzó el día 12 cuando los tumores alcanzaron ~ 150 mm3 de tamaño y se determinó la expresión en el ARNm de HSP27. Para ello, se recogieron muestras tumorales 72 h después de la primera administración y se analizaron los niveles de expresión del gen HSP27 en comparación con los niveles de expresión en el ARNm de control celular (genes de referencia). Esto reveló que 1 dosis de 30 mg/kg de cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 resultó en una reducción del 40 % en la expresión del gen HSP27 en los tumores en comparación con la administración única de monoterapias de 25 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 o 25 mg/kg de cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 (Figura 42). En comparación con los tumores de control con vehículo, se observó una reducción del 25 % de la expresión del gen HSP27 en ratones con tumores tratados con 1 dosis de cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7. Esto demuestra y asegura que cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 induce eficazmente la administración citoplásmica mejorada mediada por SO1861 de un oligonucleótido antisentido terapéutico en un tumor sólido de ratones con tumores, induciendo el silenciamiento génico dirigido, in vivo.
[0249] En otro ejemplo de acuerdo con la invención, SO1861 (lábil) y la toxina proteica, diantina (lábil o estable) se conjugaron con el anticuerpo dirigido a HER2, trastuzumab. Trastuzumab-(Cys-L-S0O1861)3,8(Lys-L-diantina)1,7 o trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-diantina)1,7, se produjeron y evaluaron para observar la mejora en la destrucción celular en SK-BR-3 (HER2++) y MDA-MB-468 (HER2-) como se ilustra en la Figura 47. Tanto trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-diantina)1,7 (CI50 = 0,8 nM) como trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-diantina)1,7 (CI50 = 0,8 nM) inducen eficazmente la muerte celular de las células SK-BR-3 (HER2++) (Figura 43A). Esto no se observó en células SK-BR-3 tratadas con trastuzumab, trastuzumab-(Lys-L-diantina)1,7, trastuzumab-(Lys-S-diantina)1,7 o trastuzumab-(L-SO1861)3,8 solo (Figura 43A). En células MDA-MB-468 (HER2-) no se puede observar actividad de destrucción celular para ninguno de los conjugados, de acuerdo con la invención (Figura 43B). Esto demuestra que la conjugación de SO1861 a un conjugado de toxina proteicaanticuerpo dirigido a HER induce de manera eficaz la liberación citoplásmica mejorada mediada por SO1861 de la toxina proteica en la célula diana, dando como resultado la destrucción de la célula diana.
[0250] En otro ejemplo de acuerdo con la invención, SO1861 (lábil) y la toxina proteica, diantina (lábil o estable) se conjugaron con el anticuerpo dirigido a EGFR, cetuximab. Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2 o cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-diantina)2, se evaluó para observar la mejora de la destrucción celular en células A431 (EGFR++) y células A2058 (EGFR) como se ilustra en la Figura 47.Tanto cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2 (CI50 = 0,3 nM) como cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-diantina)1,7(CI50 = 0,3 nM) mostraron una mayor destrucción celular en células A431 (EGFR++) en comparación con cetuximab-(Lys-L-diantina)1,6 (CI50 = 2 pM), cetuximab-(Lys-S-diantina)1,6 (CI50f = 2 pM) solo (Figura 43C). En células a 2058 (EGFR-), la combinación de acuerdo con la invención no mostró ninguna actividad destructora de células (CI50> 200 nM; Figura 43D). Esto demuestra que la conjugación de SO1861 a un conjugado de toxina proteicaanticuerpo dirigido a EGFR mejora con eficacia la liberación citoplasmática mediada por SO1861 de la toxina proteica en la célula diana, lo que da como resultado una destrucción mejorada de las células diana.
[0251] En otro ejemplo de acuerdo con la invención, SO1861 (lábil) y el oligonucleótido HSP27BNA (lábil) se conjugaron con el anticuerpo dirigido a EGFR, cetuximab. Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,8 se analizó para observar el silenciamiento mejorado del gen HSP27 en células A431 (EGFR++) y células A2058 (EGFR), de acuerdo con la invención como se ilustra en la Figura 48. Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,8 induce de manera eficaz el silenciamiento del gen HSP27 en células A431 (CI50 = 3 nM) en comparación con cetuximab, cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)3,9 o cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 solo (Figura 44A). En las células A2058 (EGFR) no se puede observar actividad de silenciamiento génico con cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,8 (CI50> 100 nM; Figura 44B). Esto demuestra y asegura que la conjugación de SO1861 y HSP27BNA con el mismo anticuerpo de direccionamiento, según la invención, induce de manera eficaz la liberación citoplasmática mejorada mediada por SO1861 de un oligonucleótido antisentido terapéutico en las células diana, induciendo el silenciamiento génico dirigido.
[0252] En otro ejemplo de acuerdo con la invención, SO1861 (lábil) y el oligonucleótido HSP27BNA (lábil) se conjugaron con el anticuerpo dirigido a HER2, trastuzumab. Se analizó Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,5 para observar el silenciamiento del gen HSP27 mejorado en células Sk -BR-3 (HER2++), de acuerdo con la invención como se ilustra en la Figura 48. Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,5 induce de manera eficaz el silenciamiento del gen HSP27 en células SK-BR-3 (CI50 = 9 nM) en comparación con trastuzumab-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 solo (Figura 45). Esto demuestra y asegura que la conjugación de SO1861 y HSP27BNA con un anticuerpo dirigido a HER2, según la invención, induce de manera eficaz la liberación citoplasmática mejorada mediada por SO1861 de un oligonucleótido antisentido terapéutico en las células diana, induciendo el silenciamiento génico dirigido.
[0253] En otro ejemplo, cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 se analizó para observar el silenciamiento mejorado del gen HSP27 en células A431 (EGFR++) y A2058 (EGFR-) de acuerdo con la invención como se ilustra en la Figura 49. Cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 induce de manera eficaz el silenciamiento del gen HSP27 en células A431 (CI50 = 2 nM) en comparación con Cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 o Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 solo (Figura 46A). En células A2058 (EGFR-), la actividad de silenciamiento génico solo se observó a concentraciones altas (> 80 nM) de Cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 (CI50 = 100 nM; Figura 46B). Esto demuestra y asegura que, en células con alta expresión de EGFR, cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 induce de manera eficaz la administración citoplásmica mejorada mediada por SO1861 de un oligonucleótido antisentido terapéutico en las células diana, induciendo el silenciamiento génico dirigido.
Ejemplo 6
[0254] La Figura 50A-D muestra la viabilidad celular relativa cuando trastuzumab (Figura 50A), cetuximab (Figura 50B) o T-DM1 (Figura 50C), toxinas proteicas no conjugadas, saporina, diantina y saporina conjugados a un anticuerpo IgG (que no se une a las células) (Figura 50D) se administran a diversas líneas de células cancerosas SK-BR-3, JIMT-1, MDA-MB-468, A431, CaSki, HeLa, A2058.
[0255] Trastuzumab y cetuximab no influyen o apenas influyen en la viabilidad celular cuando se exponen a la mayoría de las líneas celulares, con algún efecto sobre la inhibición del crecimiento celular mediante el bloqueo de la función del receptor del factor de crecimiento HER2 cuando trastuzumab se expone a células SK-BR-3 en dosis relativamente altas y con algún efecto sobre la inhibición del crecimiento celular mediante el bloqueo de la función del receptor del factor de crecimiento EGFR cuando cetuximab se expone a células MDA-MB-468 en dosis relativamente altas.
[0256] TDM-1, o ado-trastuzumab emtansina, es una terapia dirigida aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el tratamiento del cáncer de mama metastásico HER2 positivo que se ha tratado previamente con Herceptin (nombre químico: trastuzumab) y quimioterapia con taxanos; del cáncer de mama positivo para HER2 en estadio temprano después de la cirugía si se ha encontrado enfermedad residual después del tratamiento neoadyuvante (antes de la cirugía) con Herceptin y quimioterapia con taxanos. El TDM-1 es una combinación de Herceptin (Trastuzumab) y emtansina, un medicamento de quimioterapia. La Figura 8C muestra que el TDM-1 da como resultado una menor viabilidad celular para todas las líneas celulares evaluadas a concentraciones >1000 pM
[0257] Las toxinas libres saporina y diantina y la toxina saporina acopladas a una IgG de control sin afinidad por ninguna de las moléculas de la superficie celular en las líneas celulares evaluadas no tienen o apenas tienen influencia sobre la viabilidad celular en un amplio rango de concentraciones de toxina evaluadas, hasta 100000 pM (Figura 50D).
Ejemplo 7
Síntesis de dendrón(-L-SO1861)n (Figura 52, 53, 54)
Materiales y métodos
Abreviaturas
[0258]
DCM diclorometano
DIPEA N, N-diisopropiletilamina
DMF N,N-dimetilformamida
EDCl.HCl Cloruro de 3-((etilimino)metilenamino)-N, N-dimetilpropan-1-aminio
EMCH.TFA hidrazida del ácido N-(s-maleimidocaproico), sal de ácido trifluoroacético
min minutos
t.r. tiempo de retención
TCEP clorhidrato de tris (2-carboxietil)fosfina
Temp temperatura
TFA ácido trifluoroacético
THF tetrahidrofurano
Métodos analíticos
Método LC-MS 1,1
[0259] Aparato: Bomba binaria Agilent 1200: G1312A, desgasificador; inyector automático de muestras, ColCom, DAD (detector de matriz de diodos): Agilent G1316A, 210, 220 y 220-320 nM, PDA (detector de matriz de fotodiodos: 210-320 nM, MSD (detector selectivo de masas): Agilent LC/MSD G6130B ESI, pos/neg 100-1000; ELSD Alltech 3300 con flujo de gas 1,5 ml/min, temperatura del gas: 40 °C; columna: XSelect ™ CSH C18 de Waters, 30 x 2,1 mm, 3,5 pM, temperatura: 35 °C, flujo: 1 ml/min, gradiente: a = 5 % A, t1,6min = 98 % A, t3min = 98 % A, tiempo de espera: 1,3 min, Eluyente A: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo, Eluyente B: ácido fórmico al 0,1 % en agua.
Método LC-MS 2, 2
[0260] Aparato: Bomba binaria Agilent 1260: G7112B, Inyector de muestras múltiple, compensación de columna, DAD: Agilent G7115A, 210, 220 y 220-320 nM, PDA: 210-320 nM, MSD: Agilent LC/MSD G6130B ESI, rangos de masa según el peso molecular del producto:
Apos/neg 100-1000
Bpos/neg 100-1400
; ELSD Alltech 3300 flujo de gas 1,5 ml/min, temperatura del gas: 40 °C; columna: XSelect ™ C18 de Waters, 30 x 2,1 mm, 3,5 pM, temperatura: 40 °C, flujo: 1 ml/min, gradiente: hasta = 5 % A, t1,6min = 98 % A, t3min = 98 % A, tiempo de espera: 1,3 min, Eluyente A: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo, Eluyente B: ácido fórmico al 0,1 % en agua.
Método de LC-MS 3, 3
[0261] Aparato: Waters IClass; Bomba binaria: UPIBSM, SM: UPISMFTN con SO; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nM, SQD: ACQ-SQD2 ESI, pos/neg 800-1500; ELSD: presión de gas 40 psi, temperatura del tubo de derivación: 50 °C; columna: XSelect ™ CSH C18 de Waters, 50 x 2,1 mm, 25 pM Temperatura: 25 °C, Flujo: 0,6 ml/min, Gradiente: a = 5 % A, t230min = 98 % A, t2.7min = 98 % A, tiempo de espera: 0,3 min, Eluyente A: acetonitrilo, Eluyente B: bicarbonato de amonio 10 mM en agua (pH = 9,5).
Método LC-MS 4, 4
[0262] Aparato: Waters IClass; Bomba binaria: UPIBSM, SM: UPISMFTN con SO; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nM, SQD: ACQ-SQD2 ESI, pos/neg 1500-2500; ELSD: presión de gas 40 psi, temperatura del tubo de derivación: 50 °C; columna: XSelect ™ CSH C18 de Waters, 50 x 2,1 mm, 25 pM Temp: 25 °C, Flujo: 0,6 ml/min, Gradiente: a = 15 % A, t2,0min = 60 % A, t2,7min = 98 % A, tiempo de espera: 0,3 min, Eluyente A: acetonitrilo, Eluyente B: bicarbonato de amonio 10 mM en agua (pH = 9,5).
Método de LC-MS 5, 5
[0263] Aparato: Waters IClass; Bomba binaria: UPIBSM, SM: UPISMFTN con SO; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nM, SQD: ACQ-SQD2 ESI, rangos de masa en función del peso molecular del producto:
Apos/neg 1500-2500
Bneg 2000-3000
; ELSD: presión de gas 40 psi, temperatura del tubo de derivación: 50 °C; columna: Acquity C18, 50 x 2.1 mm, 1,7pm Temp: 60 °C, Flujo: 0,6 ml/min, Gradiente: to = 2 % A, t5,0min = 50 % A, t6,0min = 98 % A, tiempo de espera: 1,0 min, Eluyente A: acetonitrilo, Eluyente B: bicarbonato de amonio 10 mM en agua (pH = 9,5).
Métodos preparativos
Método preparativo de MP-LC 1,1
[0264] Tipo de instrumento: MPLC preparativa Reveleris™; columna: XSelect ™ CSH C18 de Waters (145x25 mm, 10 p); Flujo: 40 ml/min; Temperatura de la columna: temperatura ambiente; Eluyente A: bicarbonato de amonio 10 mm en agua pH = 9,0); Eluyente B: acetonitrilo al 99 % bicarbonato de amonio 10 mm al 1 % en agua; Gradiente: tümin = 5 % B, t^n = 5 % B, t2min = 10 % B, t^min = 50 % B, t1Smin = 100 % B, t23min = 100 % B; Detección UV: 210, 225, 285 nM.
Método preparativo de MP-LC 2, 2
[0265] Tipo de instrumento: MPLC preparativa Reveleris™; Columna: LUNA C18(3) de Phenomenex (150 x 25 mm, 10 |j); Flujo: 40 ml/min; Temperatura de la columna: temperatura ambiente; Eluyente A: ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en agua, Eluyente B: ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en acetonitrilo; Gradiente: t0m¡n = 5 % B, timin = 5 % B, t2min = 10 % B, t17min = 50 % B, t1Smin = 100 % B, t23min = 100 % B; Detección UV: 210, 225, 285 nM.
Método preparativo de LC-MS 1,3
[0266] Tipo de instrumento de MS: G6130B Quadrupole de Agilent Technologies; Tipo de instrumento de HPLC: 1290 preparative LC de Agilent Technologies; Columna: XSelect™ CSH de Waters (C1S, 100 x 30 mm, 10 j); Flujo: 25 ml/min; Temperatura de la columna: temperatura ambiente; Eluyente A: acetonitrilo al 100 %; Eluyente B: bicarbonato de amonio 10 mM en agua pH = 9,0; gradiente lineal en función de la polaridad del producto: At0 = 20 % A, t2min = 20 % A, ts,5min = 60 % A, t10min = 100 % A, t13min = 100 % A
Bt0 = 5 % A, t2min = 5 % A, ts,5min = 40 % A, t10min = 100 % A, t13min = 100 % A
Ct0 = 10 % A, t2min = 10 % A, ts,5min = 50 % A, t10min = 100 % A, t13min = 100 % A
; Detección: DAD (220-320 nM); Detección: MSD (ESI pos/neg) rango de masa: 100-800; Recolección de fracciones en función de DAD.
Método preparativo de LC-MS 2, 4
[0267] Tipo de instrumento MS: G6130B Quadrupole de Agilent Technologies; Tipo de instrumento de HPLC: 1290 preparative LC de Agilent Technologies; columna: XBridge Shield de Waters(C18, 150 x 19 mm, 5 j); Flujo: 25 ml/min; Temperatura de la columna: temperatura ambiente; Eluyente A: acetonitrilo al 100 %; Eluyente B: bicarbonato de amonio 10 mM en agua pH = 9,0; gradiente lineal: tü = 5 % A, t2,5min = 5 % A, tnmin = 40 % A, t^min = 100 % A, t17min = 100 % A; Detección: DAD (220-320 nM); Detección: MSD (ESI pos/neg) rango de masa: 100­ 800; Recolección de fracciones en función de DAD
Cromatografía flash
[0268] Grace Reveleris X2® C-S15 Flash; Sistema de suministro de disolvente: bomba de 3 pistones con cebado automático, 4 canales independientes con hasta 4 disolventes en un solo cromatograma, líneas de conmutación automática cuando se agota el disolvente; caudal máximo de la bomba 250 ml/min; presión máxima 50 bar (725 psi); Detección: UV 200-400nm, combinación de hasta 4 señales UV y barrido de todo el rango UV, ELSD; Tamaños de columna: 4-330g en instrumento, tipo luer, 750g hasta 3000g con soporte opcional.
Síntesis de S01861-EMCH (Figura 52)
[0269] Se añadió metanol (extra seco, 3,00 ml) y TFA (0,020 ml, 0,260 mmol) a SO1861 (121 mg, 0,065 mmol) y EMCH.TFA (110 mg, 0,325 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 1,5 horas, la mezcla de reacción se sometió a MP-LC preparativa1. Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (120 mg, 90 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 96 %.
LRMS (m/z): 2069 [M-1]1-T.r. LC-MS (min): 1,084
Síntesis de dendrón(-L-SO1861)4 (Figura 53)
Intermedio 1:
(((6-azidohexanoil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))dicarbamato de di-tert-butilo
[0270] Se disolvieron ácido 6-azidohexanoico (0,943 g, 6,00 mmol), EDCI.HCl (1,21 g, 6,30 mmol) y Oxyma Pure (0,938 g, 6,60 mmol) en DMF (10,0 ml) y la mezcla se agitó durante 5 min. A continuación, se añadió una solución de (azanodiilbis(etano-2,1-diil))dicarbamato de di-tert-butilo (1,82 g, 6,00 mmol) en DMF (5,00 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 5 horas, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo (50 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (50 ml), una solución saturada de bicarbonato de sodio (2 x 50 ml) y salmuera (50 ml), se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía flash (gradiente de acetato de etilo-heptano, 10:90 aumentando hasta 100:0) para dar el compuesto del título (2,67 g, 100 %) como un sólido blanco. Pureza basada en LC-MS 98 %.
LRMS (m/z): 287/343/465 [M-155/M-99/M 23]1+
T.r. LC-MS (min): 2,022A
Intermedio 2:
Dihidrocloruro de N,N-bis(2-aminoetil)-6-azidohexanamida
[0271] Se añadió HCl en isopropanol (5-6 N, 20,0 ml, 110 mmol) a (((6-azidohexanoil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))dicarbamato de di-tert-butilo (2,66 g, 6,00 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 4 horas, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el crudo resultante se coevaporó con DCM (3 x 20 ml) para dar el producto del título crudo (1,49 g, 79 %) como un sólido blanco.
[0272] LRMS (m/z): 243 [M 1]1+
Intermedio 3:
((5S,5'S)-((((6-azidohexanoil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))bis(azanodiil))bis(6-oxohexano-6,1,5-triil))tetracarbamato de tetra-tert-butilo
[0273] A una solución de diclorhidrato de N,N-bis (2-aminoetil)-6-azidohexanamida (1,19 g, 3,76 mmol) en DMF (30,0 ml) y DIPEA (2,62 ml, 15,1 mmol) se le añadió Boc-Lys(Boc)-ONp (3,69 g, 7,90 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo (100 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (100 ml) y una solución saturada de bicarbonato de sodio (5 x 100 ml), se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía flash (DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100:0 aumentando hasta 0:100) para dar el producto del título (3,07 g, 91 %) como un sólido ligeramente amarillento. Pureza basada en LC-MS 94 %.
LRMS (m/z): 800/900/922 [M-99/M 1/M 23]1+
T.r. LC-MS (min): 2.172A
Intermedio 4
3-(acetiltio)propanoato de 4-nitrofenilo
[0274] 4-Se disolvieron trifluoroacetato de nitrofenilo (5,17 g, 22,0 mmol) y ácido 3-(acetiltio)propiónico (2,96 g, 20,0 mmol) en DCM (50,0 ml). A continuación, se añadió DIPEA (6,97 ml, 40,0 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo (50 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (50 ml), una solución saturada de bicarbonato de sodio (5 x 50 ml) y salmuera (50 ml), se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía flash (DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100: 0 aumentando a 0:100) para dar el producto del título (4,90 g, 91 %) como un sólido ligeramente amarillento. Pureza basada en LC-MS 99 %.
LRMS (m/z): 292 [M 23]1+
T.r. LC-MS (min): 1,942A
Intermedio 5:
tetrahidrocloruro de (S)-2,6-diamino-N-(2-(6-azido-N-(2-((S)-2,6-diaminohexanamido)etil)hexanamido)etil)hexanamida
[0275] Se disolvió ((5S,5'S)-((((6-azidohexanoil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))bis(azanodiil))bis(6-oxohexano-6,1,5-triil))tetracarbamato de tetra-tert-butilo (1,80 g, 2,00 mmol) en HCl en isopropanol (5-6 N, 50,0 ml, 275 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el crudo resultante se coevaporó con DCM (3 x 20 ml) para dar el producto del título crudo como un sólido blanco.
LRMS (m/z): 250 [M 2]2+, 500 [M 1]1+.
Intermedio 6:
(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]-N-[2-(6-azido-N-{2-[(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]hexanamido]etil}hexanamido)etil]hexanamida
[0276] A una solución de tetrahidrocloruro de (S)-2,6-diamino-N-(2-(6-azido-N-(2-((S)-2,6-diaminohexanamido)etil)hexanamido)etil)hexanamida (1,29 g, 2,00 mmol) en DMF (30 ml) y DIPEA (3,48 ml, 20,0 mmol) se le añadió 3-(acetiltio)propanoato de 4-nitrofenilo (2,26 g, 8,40 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante el fin de semana . La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se disolvió en DCM/metanol (95: 5, v/v, 100 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (100 ml), una solución de hidróxido de sodio 1 N (3 x 100 ml) y salmuera (100 ml), se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía flash (DCM-metanol/DCM (1/9, v/v)(gradiente de 100:0 aumentando a 0:100) para dar el producto del título (1,33 g, 65 %) como un sólido blanco. En la LC-MS se encontró una impureza (15 %) con valores m/z correspondientes al producto con un grupo tioacetato desprotegido. La impureza se formó durante o después del tratamiento. Pureza basada en LC-MS 85 %.
LRMS (m/z): 510 [M 2]2+, 1019/1041 [M 1/M 23]1+
T.r. LC-MS (min): 1,862B
Intermedio 7:
Formiato de N,N'-((9S,19S)-14-(6-aminohexanoil)-1-mercapto-9-(3-mercaptopropanamido)-3,10,18-trioxo-4,11,14,17-tetraazatricosano-19,23-diil) bis(3-mercaptopropanamida)
[0277] Se disolvió el armazón 2 (102 mg, 0,100 mmol) en metanol (1,00 ml). A continuación, se añadió una solución de hidróxido de sodio 1 N recién preparada (0,440 ml, 0,440 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió una solución de trimetilfosfina 1,0 M en THF (0,500 ml, 0,500 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente. Después de 30 min, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y se coevaporó con metanol (2 x 10 ml). El residuo se disolvió en una mezcla de metanol/agua (9: 1, v/v, 1,00 ml) y la solución resultante se sometió a MP-LC preparativa.2 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (75,6 mg, 87 %) como un aceite pegajoso incoloro. Pureza basada en LC-MS 96 %.
LRMS (m/z): 513 [M 2]2+, 825 [M 1]1+
T.r. LC-MS (min): 1,422A
Intermedio 8:
Dendrón(-LSO1861)4-amina
[0278] Se disolvió formato de N,N'-((9S,19S)-14-(6-aminohexanoil)-1-mercapto-9-(3-mercaptopropanamido)-3,10,18-trioxo-4,11,14,17-tetraazatricosano-19,23-diil)bis(3-mercaptopropanamida) (2,73 mg, 3,13 jMol) en una mezcla de NH4HCO3 20 mM con TCEP/acetonitrilo 0,5 mM (3: 1, v/v, 3,00 ml). A continuación, se añadió SO1861-EMCH (29,2 mg, 0,014 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 1,5 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.3B Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (12,3 mg, 43 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 97 %.
LRMS (m/z): 1517 [M-6]6-, 1821 [M-5]5-2276 [M-4]4-T.r. LC-MS (min): 4,395A
Intermedio 9:
Dendrón(-L-SO1861)4-azida
[0279] Se disolvió dendrón(SO1861)4-amina (6,81 mg, 0,748 jMol) y 1-azido-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (2,90 mg, 7,48 jMol) en DMF (1,00 ml ). A continuación, se añadió DIPEA (1,302 |_il, 7,48 |jMol) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.3C Las fracciones correspondientes al producto se agruparon inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (5,86 mg, 84 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 90 %.
LRMS (m/z): 2344 [M-4]4-T.r. LC-MS (min): 4,785B
Intermedio 10:
Dendrón(-LSO1861)4-maleimida1
[0280] Se disolvió dendrón(SO1861)4-amina (8,12 mg, 0,891 jMol) y 2,5-1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de dioxopirrolidin-1-ilo (3,94 mg, 8,91 jMol) en DMF (1,00 ml). A continuación, se añadió DIPEA (1,55 pl, 8,91 pMol) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 3 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.30 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (6,76 mg, 80 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 66 %.
LRMS (m/z): 2358 [M-4]4
T.r. LC-MS (min): 2,1360
Intermedio 11:
Dendrón(-LSO1861 )4-maleimida2
[0281] Se disolvió el armazón 2 (5,10 mg, 5,00 pMol) en metanol (100 pl). A continuación, se añadió una solución de hidróxido de sodio 1 N recién preparada (22,0 pl, 22,0 pMol) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió una solución de trimetilfosfina 1,0 M en THF (25,0 pL, 25,0 pMol) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y se coevaporó con metanol (2 x 5 ml). El residuo resultante se disolvió en una mezcla de NH4HCO320 mM con TCEP/acetonitrilo 0,5 mM (3:1, v/v, 3,242 ml). De esta solución, directamente, se añadieron 1000 pl a SO1861-EMCH (14,4 mg, 6,94 pMol, 4,5 equiv. En comparación con el armazón) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 10 min, la mezcla de reacción se liofilizó durante la noche. Al residuo resultante se añadieron 3-(2-(2-(3-(2,5-dioxo-2h-pirrol-1(5h)-il)propanamido)etoxi)etoxi)propanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (5,84 mg, 0,014 mmol) y DMF (1,00 ml). A continuación, se añadió DlpEA (2,39 pl, 0,014 mmol) y la suspensión se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.30 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (10,9 mg, 85 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 80 %.
LRMS (m/z): 2354 [M-4]4
T.r. LC-MS (min): 4,165B
Síntesis de dendrón(-L-SO1861)8 (Figura 54)
Intermedio 1:
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(6-azido-N-{2-[(2S)-2,6-bis[(2S)-2],6-bis({[(tertbutoxi)carbonil]amino})hexanamido]hexanamido]etil}hexanamido)etil]carbamoil}-5-[(2S)-2,6-bis({[(tertbutoxi)carbonil]amino})hexanamido]pentil]carbamoil}-5-{[(tert-butoxi)carbonil]amino}pentil]carbamato de tert-butilo
[0282] Se disolvió tetrahidrocloruro de (S)-2,6-diamino-N-(2-(6-azido-N-(2-((S)-2,6-diaminohexanamido)etil)hexanamido)etil)hexanamida (964 mg, 1,50 mmol ) en DMF (25,0 ml) y trietilamina (2,08 ml, 15,0 mmol). A continuación, se añadió Boc-Lys(Boc)-ONp (3,36 g, 7,18 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía flash (DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100:0 aumentando a 0:100) para dar el producto del título (2,71 g, 100 %) como un sólido blanco. Pureza basada en LC-MS 97 %.
LRMS (m/z): 807 [M-198]2+
T.r. LC-MS (min): 2,352B
Intermedio 2:
Octahidrocloruro de (2S, 2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-diamino-10-(6-azidohexanoil)-15-((S)-2,6-diaminohexanamido)-6,14,21-trioxo-7,10,13,20-tetraazahexacosano-1,5-diil)bis(2,6-diaminohexanamida) [0283] El intermedio 1 (2,71 g, 1,50 mmol) se disolvió en HCl en isopropanol (5-6 N, 25,0 ml, 138 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el crudo resultante se coevaporó con DCM (3 x 20 ml) para dar el producto del título crudo como un sólido blanco.
LRMS (m/z): 203/254 [M-200/M+4]4+, 338 [M+3]3+, 507 [M+2]2+, 1012 [M+1]1+
Intermedio 3:
(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]-N-[(1S)-1-{[2-(6-azido-N-{2-[(2S)-2,6-bis[(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]hexanamido]hexanamido]etil}hexanamido)etil]carbamoil}-5-[(2S)-2,6-bis[3-(acetMsulfanil)propanamido]hexanamido]pentN]hexanamida
[0284] Se añadió DMF (20,0 ml), trietilamina (320 pl, 2,30 mmol) y 3-(acetiltio)propanoato de 4-nitrofenilo (595 mg, 2,21 mmol) a octahidrocloruro de (2S,2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-diamino-10-(6-azidohexanoil)-15-((S)-2,6-diaminohexanamido)-6,14,21-trioxo-7,10,13,20-tetraazahexacosan-1,5-diil)bis(2,6-diaminohexanamida) (300 mg, 0,230 mmol). La suspensión resultante se sonicó a 60 °C durante 30 min y se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se purificó realizando primero cromatografía flash (DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100: 0 aumentando a 0:100), seguido de MP-LC preparativa2 para dar el producto del título (70 mg, 15 %) como un sólido blanco. Pureza basada en LC-MS 100 %.
LRMS (m/z): 685 [M 3]3+
T.r. LC-MS (min): 1,912A
Intermedio 4:
Formiato de (2S)-N-[(1S)-1-{[2-(6-amino-N-{2-[(2S)-2,6-bis[(2S)-2,6-bis(3-sulfanilpropanamido))hexanamido]hexanamidoetil}hexanamido)etil]carbamoil}-5-[(2S)-2,6-bis(3-sulfanilpropanamido)hexanamido]pentil]-2,6-bis(3-sulfanilpropanamido)hexanamida
[0285] El armazón 4 (10,0 mg, 4,87 pMol) se disolvió en metanol (200 pl). A continuación, se añadió una solución de hidróxido de sodio 1 N recién preparada (42,9 pl, 0,043 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió una solución de trimetilfosfina 1,0 M en THF (24,4 pl, 0,024 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, la mezcla de reacción se diluyó con agua (1 ml) y se sometió directamente a MP-LC preparativa.2 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (4,02 mg, 48 %) como un sólido blanco esponjoso.
LRMS (m/z): 564 [M 3]3+, 846 [M 2]2+ T.r. LC-MS (min): 1,542C
Intermedio 5:
Dendrón(-LSO1861)8-amina
[0286] El armazón 5 (0,52 mg, 0,299 pMol) y SO1861-EMCH (29,2 mg, 0,014 mmol) se disolvieron en una mezcla de NH4HCO320 mM con TCEp/acetonitrilo 0,5 mM (3: 1, v/v, 1,00 ml) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió TCEP (0,30 mg, 1,05 pMol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 min. A continuación, la mezcla se sometió directamente a LC-MS preparativa.38 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (2,17 mg, 40 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 97 %.
LRMS (m/z): 2282 [M-8]8-, 2607 [M-7]7-T.r. LC-MS (min): 4,415A
Ejemplo 8
Síntesis de S01861-porción conectora trifuncional-oligonucleótido de BNA (Figura 55)
Materiales y métodos
Porción conectora trifuncional
[0287] La porción conectora trifuncional (DBCO, TCO, maleimida) se adquirió en Bio-Synthesis Inc. (Lewisville, Texas).
Oligonucleótido HSP27BNA
[0288] Los oligonucleótidos de HSP27BNA(-tiol) (secuencia 5'-GGCacagccagtgGCG-3 ') (Zhang et al., 2011) se adquirieron en Bio-Synthetic Inc. (Lewisville, Texas)
Intermedio 1:
S01861-azida
[0289] A SO1861 60 mg, 0,032 mmol)) y 1-azido-3,6,9,12-tetraoxapentadecano-15-hidrazida (39,3 mg, 0,129 mmol) se añadió metanol (extra seco, 1,00 ml) y TFA (9,86 pl, 0,129 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se sometió a MP-LC preparativa.1 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (58,4 mg, 84 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 100 %.
LRMS (m/z): 2150 [M-1]1'
T.r. LC-MS (min): 1,103B
Intermedio 2:
S01861-porción conectora trifuncional
[0290] Se disolvieron SO1861-azida (45 mg, 0,021 mmol) y porción conectora trifuncional (26,5 mg, 0,022 mmol) en d Mf (2,50 ml) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.30 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (58,4 mg, 84 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 89 %.
LRMS (m/z): 1677 [M-2]2-T.r. LC-MS (min): 2,546A
Intermedio 3:
(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil)hidraziniliden)metil)benzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecano-15-amida
[0291] Se añadió metanol (extra seco, 2,00 ml) y TFA (11,1 pL, 0,145 mmol) a 1-(4-formilbenzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (28,0 mg, 0,048 mmol) y e Mc h .t Fa (24,5 mg, 0,072 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 50 °C. Después de 30 min, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el residuo resultante se purificó mediante MP-LC.1 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (33,4 mg, 88 %) como un sólido esponjoso de color púrpura intenso. Pureza basada en LC-MS 92 %.
LRMS (m/z): 394 [M 2]2+, 789 [M 1]1+
T.r. LC-MS (min): 1,287A
Intermedio 4:
Metiltetrazina -oligonucleótido de BNA
[0292] Se disolvió disulfuro de oligonucleótido de BNA HSP27 (70,0 mg, 0,012 mmol) en NH4HCO3 20 mM (20,0 ml). A continuación, se añadió TCEP (14,3 mg, 0,050 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró usando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 3000 Da (5000 xg durante 30 min). A continuación, se añadió una solución de NH4HCO320 mM con TCEP 2,5 mM (20,0 ml) a la solución del residuo y la mezcla resultante se filtró de nuevo en las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución del residuo se diluyó con NH4HCO3 20 mM (30.0 ml) y la mezcla resultante se añadió a una solución de (E)-1-(4-((2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) hexanoil)hidraziniliden)metil)benzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (14,8 mg, 18,8 pMol) en acetonitrilo (10,0 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, la mezcla de reacción se congeló y se liofilizó durante el fin de semana para producir el producto del título crudo como un sólido esponjoso de color rosa. Al producto crudo se le añadió una solución de NH4HCO320 mM (20,0 ml) y la suspensión resultante se filtró con un filtro de jeringa de 0,45 pM. El filtrado se filtró usando un filtro centrífugo con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. A continuación, de nuevo se añadió una solución de NH4HCO320 mM (20,0 ml) a la solución del residuo y la mezcla resultante se filtró de nuevo usando un filtro centrífugo con las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución del residuo se diluyó con NH4HCO320 mM (20,0 ml) y la mezcla resultante se liofilizó durante la noche para producir el producto del título (90,0 mg, 115 %) en forma de un sólido esponjoso de color rosa. Pureza basada en LC-MS 91 %.
LRMS (m/z): 1631 [M-4]4', 2174 [M-3]3
T.r. LC-MS (min): 0,737B
Intermedio 5:
S01861-porción conectora trifuncional- oligonucleótido de BNA
[0293] Se disolvieron oligonucleótido de metiltetrazina-BNA (90,0 mg, 0,014 mmol) y SO1861-porción conectora trifuncional (48,6 mg, 0,014 mmol) en una mezcla de agua/acetonitrilo (4: 1, v/v, 12,0 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 15 min, la mezcla se sometió a LC-MS preparativa.4A Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (82,0 mg, 60 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 92 % (2 picos con ambos valores m/z correspondientes al compuesto del título).
LRMS (m/z): 1641 [M-6]6', 1970 [M-5]5
T.r. LC-MS (min): 3,24 y 3,406B
Intermedio 1:
S01861-azida
[0294] Se añadió metanol (extra seco, 1,00 ml) y TFA (9,86 |_il, 0,129 mmol) a SO1861 60 mg, 0,032 mmol)) y 1-azido-3,6,9,12-tetraoxapentadecano-15-hidrazida (39,3 mg, 0,129 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se sometió a MP-LC preparativa.1 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (58,4 mg, 84 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 100 %.
LRMS (m/z): 2150 [M-1]1-T.r. LC-MS (min): 1,103B
Intermedio 2:
S01861-porción conectora trifuncional
[0295] Se disolvieron SO1861-azida (45 mg, 0,021 mmol) y porción conectora trifuncional (26,5 mg, 0,022 mmol) en d Mf (2,50 ml) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.3C Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (58,4 mg, 84 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 89 %.
LRMS (m/z): 1677 [M-2]2
T.r. LC-MS (min): 2,546A
Intermedio 3:
(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil)hidraziniliden)metil)benzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida
[0296] Se añadió metanol (extra seco, 2,00 ml) y TFA (11,1 pL, 0,145 mmol) a 1-(4-formilbenzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida ( 28,0 mg, 0,048 mmol) y e Mc h .t Fa (24,5 mg, 0,072 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 50 °C. Después de 30 min, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el residuo resultante se purificó mediante MP-LC.1 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (33,4 mg, 88 %) como un sólido esponjoso de color púrpura intenso. Pureza basada en LC-MS 92 %.
LRMS (m/z): 394 [M 2]2+, 789 [M 1]1+
T.r. LC-MS (min): 1,287A
Intermedio 4:
Metiltetrazina-oligonucleótido de BNA
[0297] Se disolvió disulfuro de oligonucleótido de BNA HSP27 (70,0 mg, 0,012 mmol) en NHaHCO3 20 mM (20,0 ml). A continuación, se añadió TCEP (14,3 mg, 0,050 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró usando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 3000 Da (5000 xg durante 30 min). A continuación, se añadió una solución de NH4HCO320 mM con TCEP 2,5 mM (20,0 ml) a la solución de residuo y la mezcla resultante se filtró de nuevo en las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución del residuo se diluyó con NH4HCO3 20 mM (30.0 ml) y la mezcla resultante se añadió a una solución de (E)-1-(4-((2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil)hidraziniliden)metil)benzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (14,8 mg, 18,8 pMol) en acetonitrilo (10,0 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, la mezcla de reacción se congeló y se liofilizó durante el fin de semana para producir el producto del título crudo como un sólido esponjoso de color rosa. Al producto crudo se le añadió una solución de NH4HCO320 mM (20,0 ml) y la suspensión resultante se filtró sobre un filtro de jeringa de 0,45 pM. El filtrado se filtró usando un filtro centrífugo con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. A continuación, se añadió de nuevo una solución de NH4HCO320 mM (20,0 ml) a la solución de residuo y la mezcla resultante se filtró de nuevo usando un filtro centrífugo con las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución del residuo se diluyó con NH4HCO320 mM (20,0 ml) y la mezcla resultante se liofilizó durante la noche para producir el producto del título (90,0 mg, 115 %) en forma de un sólido esponjoso de color rosa. Pureza basada en LC-MS 91 %.
LRMS (m/z): 1631 [M-4]4-, 2174 [M-3]3
T.r. LC-MS (min): 0,737B
Intermedio 5:
S01861-porción conectora trifundonal-oligonudeótido de BNA
[0298] Se disolvieron oligonucleótido de BNA-metiltetrazina (90,0 mg, 0,014 mmol) y SO1861-porción conectora trifuncional (48,6 mg, 0,014 mmol) en una mezcla de agua/acetonitrilo (4:1, v/v, 12,0 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 15 min, la mezcla se sometió a LC-MS preparativa.4* Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (82,0 mg, 60 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 92 % (2 picos con ambos valores m/z correspondientes al compuesto del título).
LRMS (m/z): 1641 [M-6]6-, 1970 [M-5]5-T.r. LC-MS (min): 3,24 y 3,406B
Ejemplo 9
Conjugación de S01861-oligonudeótido de BNA
[0299] Se disolvió disulfuro de oligonucleótido de BNA HSP27 (1,10 mg, 0,187 pMol) en NH4HCO320 mM con TCEP 1,0 mM (500 pl) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 1 hora, la mezcla de reacción se filtró usando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 3000 Da (14000 xg durante 30 min). La solución del residuo se diluyó con NH4HCO320 mM con TCEP 1,0 mM (500 pl) y la mezcla resultante se filtró de nuevo en las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución de residuo se diluyó con NH4HCO320 mM/ acetonitrilo (3:1, v/v, 1,00 ml) y la mezcla resultante se añadió a SO1861-EMCH (3,54 mg, 0,375 pMol). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 10 min, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.4* Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (1,25 mg, 85 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 100 %.
LRMS (m/z): 1561 [M-5]5Í951 [M-4]4
T.r. LC-MS (min): 2,466B
Conjugación de dendrón(SO1861)4-oligonucleótido de BNA (Figura 56)
[0300] Se disolvió disulfuro de oligonucleótido de BNA HSP27 (1,1 mg, 0,187 pMol) en NH4HCO320 mM con TCEP 1,0 mM (500 pl) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 1 hora, la mezcla de reacción se filtró usando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 3000 Da (14000 xg durante 30 min). La solución del residuo se diluyó con NH4HCO320 mM con TCEP 1,0 mM (500 pl) y la mezcla resultante se filtró de nuevo en las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución del residuo se diluyó con NH4HCO3 20 mM/ acetonitrilo (3: 1, v/v, 1,0 ml) y la mezcla resultante se añadió a dendrón(SO1861)4-maleimida1 (3,54 mg, 0,375 pMol). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 10 min, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.4A Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (1,25 mg, 85 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 94 %
LRMS (m/z): 1896 [M-8]8', 2167 [M-7]7
T.r. LC-MS (min): 3,776B
Síntesis de dendrón(NEM)4 (Figura 57)
[0301] A bencil bis(2-((S)-2,6-bis(3-mercaptopropanamido)hexanamido)etil)carbamato (1,69 mg, 2,00 jMol) y N-etilmaleimida (1,05 mg, 8,40 jMol) se añadió una mezcla de NH4HCO320 mM/ acetonitrilo (3:1, v/v, 2,00 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se liofilizó durante la noche. El residuo resultante se purificó mediante LC-MS 3A preparativa para dar el compuesto del título (1,53 mg, 57 %) en forma de un sólido esponjoso de color blanco. Pureza basada en LC-MS 98 %.
LRMS (m/z): 1346 [M 1]1+
T.r. LC-MS (min): 1,433A
Ejemplo 10
Modelo de ratón de tumor de ratón A431 y estudios de silenciamiento génico in vitro e in vivo
Materiales y métodos
[0302] HSP27BNA con oligonucleótidos de porciones conectoras (secuencia 5'-GGCacagccagtgGCG-3 ') (Zhang et al., 2011) se adquirieron en Bio-Synthesis Inc. (Lewisville, Texas)
Análisis de aislamiento de ARN y expresión génica in vitro
[0303] El ARN de las células se aisló y analizó de acuerdo con protocolos estándar (Biorad)
Modelo de tumor de ratón in vivo
[0304] El estudio con ratones se realizó en CrownBio (China) de acuerdo con los protocolos y procedimientos estándar. Modelo: Modelo de xenoinjerto de carcinoma epidermoide humano subcutáneo A431 en ratones nude BALB/c hembra. Se realizó un seguimiento del volumen del tumor y se recolectaron muestras de tumor para el análisis de silenciamiento génico (ver a continuación)
Análisis de expresión génica y aislamiento de ARN de muestras tumorales de ratones
[0305] Se aisló el ARN total de los tumores usando TriZol (Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN aislado se resuspendió en agua libre de nucleasas (NFW). Se comprobó la integridad del ARN de las muestras de ARN en el gel. Para preparar ADNc, primero se mezclaron 100 ng de ARN total con hexámeros aleatorios (Qiagen; concentración final 2 j M) en un volumen final de 12,5 j l en NFW, se desnaturalizaron durante 5 min a 70 °C e inmediatamente se enfriaron en hielo. A continuación, se añadieron 7,5 j l de una mezcla de síntesis de ADNc, que constaba de 4 j l de tampón 5xRT (Promega), 0,4 j l de dNTP 25 mM (Promega), 1 j l 200 U/jL de enzima mmLV RT (Promega), 0,5 jL 40 U/jL Inhibidor de ARNasa (Promega) y 1,6 jL de NFW. Se utilizó el siguiente protocolo de síntesis de ADNc: 1) 10 minutos 25 °C 2) 60 minutos 37 °C 3) 5 minutos 85 °C 4) ~ 4 °C
[0306] Para una sola reacción de qPCR se preparó la siguiente mezcla: 1 jL de ADNc, 0,05 jL de cebador directo (250 j M), 0,05 jL de cebador inverso (250 j M), 8,9 j l de LNFW, 10 j l de SYBR Green (Bio-Rad). Se utilizó el siguiente protocolo de qPCR: 1 ciclo: 5 minutos 95 °C, 40 ciclos: 15 s 95 °C 30 s 60 °C.
[0307] La expresión del gen HSP27 se calculó utilizando 2'(C‘hsp27'geomean (Ctref1 ;Ctref2;Ctref3;Ctref4)), donde ref1, ref2, ref3 y ref4 son los genes de referencia IMMT, EIF2S2, GUSB y UBC para el análisis de los tumores. Se eligieron cuatro genes de referencia basándose en la forma de realización de un análisis GeNORM entre nueve genes de referencia evaluados para elegir el gen de referencia más ideal y estable para estas muestras de tumor. Para ello, se importaron los resultados de qPCR en el programa informático Qbase+, mediante el cual se calculan dos medidas de calidad: el coeficiente de variación de los niveles de expresión génica de referencia normalizados (V); y el valor M de estabilidad geNorm (M)1. Un gen de referencia con un M <0,2 y un V <0,15 se considera muy estable. En función de este análisis, se eligieron IMMT y EIF2S2 como los genes de referencia más estables. Sin embargo, UBC y GUSB también se añadieron al grupo de genes de referencia para mejorar aún más la precisión de la normalización. Cada muestra se analizó como réplica técnica triplicada en una máquina de qPCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad).
Tabla 1. Los cebadores utilizados en PCR se muestran a continuación:
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Ejemplo 11
Síntesis de conjugados
Anticuerpos monoclonales, SO1861, saponinas QS
[0308] Se compraron Trastuzumab (Herceptin®), cetuximab (Erbitux®) y T-DM1 (Kadcyla®) en una farmacia (Charite, Berlín). El anticuerpo monoclonal Cd71 se adquirió de BioCell (Okt9, n° BE0023). La SO1861 se aisló y purificó en Analyticon Discovery GmbH a partir de un extracto vegetal crudo obtenido de Saponaria officinalis L. Se compró extracto de saponina de Quillaja Saponaria (QSmix) (Sigma Aldrich, # S4521)
materiales
[0309] Trastuzumab (Tras, Herceptin®, Roche), cetuximab (Cet, Erbitux®, Merck KGaA), clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, 98 %, Sigma-Aldrich), ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB, reactivo de Ellman, 99 %, Sigma-Aldrich), columnas de centrifugación y desalinización Zeba™ (2 ml, Thermo-Fisher), geles de proteínas Bis-Tris NuPAGE™ al 4-12 % (Thermo-Fisher), tampón de desarrollo NuPAGE™ MES s Ds Running Buffer (Thermo-Fisher), Estándar de proteínas preteñido Novex™ Sharp (Thermo-Fisher), solución de tinción de proteínas PageBlue ™ (Thermo-Fischer), kit de ensayo de proteínas Pierce™ BCA (Thermo-Fisher), N-etilmaleimida (NEM, 98 %, Sigma-Aldrich), 1,4-Ditiotreitol (DtT, 98 %, Sigma-Aldrich), Sephadex G25 (GE Healthcare), Sephadex G50 M (GE Healthcare), Superdex 200P (GE Healthcare), Alcohol isopropílico (IPA, 99,6 %, VWR), Tris(hidroximetil)aminometano (Tris, 99 %, Sigma-Aldrich), clorhidrato de Tris(hidroximetil)aminometano (Tris.HCL, Sigma-Aldrich), L-Histidina (99 %, Sigma-Aldrich) ), D-(+)-Trehalosa dihidrato (99 %, Sigma-Aldrich), monolaurato de polioxietilen(20)sorbitán (TWEEN 20, Sigma-Aldrich), solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, Thermo-Fisher), clorhidrato de guanidina (99 %, Sigma-Aldrich), sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético dihidrato (EDTA-Na2, 99 %, Sigma-Aldrich), filtros estériles de 0,2 pM y 0,45 pM (Sartorius), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC, Thermo-Fisher), Diantina-Cys (Dia-Cys, Diantina mutante con una única cisteína C-terminal, Proteogenix), concentrador Vivaspin T4 y T15 (Sartorius), Superdex 200PG (GE Healthcare), tetra(etilenglicol) succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (PEG4-SPDP, Thermo-Fisher), oligonucleótido de HSP27 BNA disulfuro (biosíntesis), hexafluorfosfato de [O-(7-Azabenzotriazol-1-il)-N,N,N,N-tetrametiluronio] (HATU, 97 %, Sigma-Aldrich), Dimetilsulfóxido (DMSO, 99 %, Sigma-Aldrich), sal de trifluoroacetato de N-(2-aminoetil)maleimida (AEM, 98 %, Sigma-Aldrich), L-cisteína (98,5 %, Sigma-Aldrich), agua desionizada (DI) recién extraída de Ultrapure Lab Water Systems (MilliQ, Merck), agarosa de níquel-ácido nitrilotriacético (ní-nta agarose), glicina (99,5 %, VWR), ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico) ( Reactivo de Ellman, DTNB, 98 %, Sigma-Aldrich), fluoresceína de anhídrido S-acetilmercaptosuccínico (reactivo SAMSA, Invitrogen) Bicarbonato de sodio (99,7 %, Sigma-Aldrich), carbonato de sodio (99,9 %, columnas Sigma-Aldrichal), columnas de desalinización PD MiniTrap con resina Sephadex G-25 (Ge Healthcare), columna de desalinización PD10 G25 (GE Healthcare), columnas de desalinización Zeba Spin de 0,5, 2, 5 y 10 ml (Thermo-Fisher), filtros centrífugos Vivaspin T4 10 kDa MWCO, T4 100 kDa MWCO, y T15 (Sartorius), columna Biosep s3000 aSEC (Phenomenex), unidades de ultrafiltración Vivacell MWCO de 10 y 30 kDa (Sartorius), filtro de flujo rápido Nalgene (Thermo-Fisher), Métodos
MALDI-TOF-MS
[0310] Se registraron espectros de tiempo de vuelo de ionización/desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF) en un espectrómetro de masas MALDI (Bruker Ultrafex III). Por lo general, la muestra disuelta en agua MilliQ en un rango de nanomoles a micromoles se depositó en la microplaca (microplaca de acero pulido MTP 384 target plate polished steel T F, Bruker Daltons) utilizando super-DHB (99 %, Fluka) o ácido sinapínico (SA, 99 %, Sigma-Aldrich) como la matriz disuelta en acetonitrilo (MADLI-TOF-MS ensayado, Sigma)/TFA al 0,1 % (7: 3 v/v) mediante el método de gota seca. PepMix (estándar de calibración de péptidos, Bruker Daltons) o ProteoMass (estándar de calibración de proteínas, Sigma-Aldrich) sirvieron como estándares de calibración. El modo RP se refiere al modo reflector positivo. El modo RN se refiere al modo reflector negativo. El modo LP se refiere al modo lineal positivo.
Diálisis
[0311] Se utilizaron membranas de celulosa regenerada: MWCO = 1 y 2 kDa (Spectra/Por) y MWCO = 12-14 kDa (Cari Roth) para realizar la diálisis. Normalmente, la diálisis se realizó durante 24 h con 1 L de disolvente que se cambió tras las primeras 6 h del proceso.
Liofilización
[0312] La liofilización se realizó en un Alpha 1-2 LD plus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH). Normalmente, las muestras se congelaron con nitrógeno líquido y se colocaron en el liofilizador a alto vacío. UV-Vis
[0313] Las mediciones de absorbancia se realizaron en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 25 UV-Vis o Thermo NanoDrop ND-2000 en el rango espectral de 200-750 nM.
[0314] Las concentraciones se determinaron utilizando un espectrómetro Thermo Nanodrop 2000 o Lambda 25 utilizando los siguientes parámetros:
Trastuzumab DO280 = 1,5 (mg/ml)-1 cm-1
Cetuximab DO280 = 1,4 (mg/ml)-1 cm-1
oligonucleótido HSP27 DO260 = 153000 M-1 cm-1; Rz260:280= 1,819
Dia-Cys DO280 = 0,57 (mg/ml)1 cm-1
PEG4-SPDP (PDT) DO343 = 8080 M-1 cm-1
SAMSA-Fluoresceína DO495 = 64500 M-1 cm-1; Rz280:495 = 0,232
Ellmans (TNB) DO412 = 14150 M-1 cm-1
Cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC)
[0315] Se realizó una cromatografía de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) para purificar la proteína marcada con histidina y los conjugados de proteína. Brevemente, se pipeteó agarosa Ni-NTA (10 ml) en una columna de flujo por gravedad para un volumen de lecho de 5 ml. La resina se lavó con 20 ml de agua desionizada y se añadieron 5 ml de una solución de NiSO4 100 mM. La resina se lavó de nuevo cinco veces con 5 ml de agua desionizada y se equilibró cinco veces con DPBS. La solución de proteína se incubó con la agarosa Ni-NTA lavada con rotación a 4 °C durante 30 min. Posteriormente, la solución de proteína Ni-NTA se pipeteó de nuevo a la columna de flujo por gravedad. Se recogió el flujo a través y la resina se lavó tres veces con 5 ml de DPBS. Luego se eluyó la muestra inmovilizada aumentando la concentración de imidazol de 50 ml de 125 mM, pH 8 a 50 ml de 250 mM, pH 8. Las fracciones de elución se dializaron con PBS pH 7,4 para obtener la muestra purificada.
Cromatografía de exclusión por tamaño
[0316] La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se llevó a cabo en un purificador AKTA. Las muestras se analizaron mediante SEC usando una columna Biosep SEC-S3000 o una columna Sephadex G50M (10 x 40 cm) eluyendo con solución de TBS/alcohol isopropílico (85:15 v/v). Las purezas de la muestra se determinaron mediante la integración del pico de la muestra de anticuerpo con respecto a los picos agregados de trazas. Método de Ellman
[0317] Se llevó a cabo la prueba de Ellman (o método de Ellman) para determinar cuantitativamente la concentración de tiol en una muestra mediante espectrofotometría. La presencia de tioles se indicó mediante la liberación estequiométrica del 2-nitro-5-tiobenzoato (TNB) del reactivo de Ellman en presencia de tioles. El TNB obtiene un máximo de absorción a 412 nM y un coeficiente de extinción de DO412 = 14150 M-1 cm-1 en sistemas tamponados. Brevemente, se mezclaron 2 pL de una solución de 0,5 mg/ml del reactivo de Ellman (ácido 5,5-Ditiobis(2-nitrobenzoico), DTNB) en tampón de fosfato (0,1 M, EDTA 1 mM, pH 7,4) con 20 pL de una muestra que contiene tiol en tampón. La mezcla se agitó con vórtex durante 5 segundos. Luego, se midió la absorbancia de UV-Vis a 412 nM en un Thermo Nanodrop 2000 para determinar la concentración de TNB y, por lo tanto, el contenido de tiol de la muestra.
Producción de diantina
[0318] La diantina se expresó en un cultivo de bacterias y la proteína se purificó siguiendo los pasos convencionales de cultivo celular y purificación de proteínas conocidas en la técnica.
Producción de conjugados de saporina
[0319] Se compraron conjugados de trastuzumab-saporina, cetuximab-saporina, CD71mab-saporina preparados especialmente por Advanced Targeting Systems (San Diego, CA). La IgG-saporina y saporina se adquirieron de Advanced Targeting Systems.
Síntesis de anticuerpo-(Cys-dendrón-(L-S01861)n)n
[0320] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con saponina dendrítica [dendrón-(L-SO1861)4-maleimida] mediante una porción conectora tetra(etilenglicol) succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (PEG4-SPDP) que lleva a cabo una reacción de tipo Michael tioleno entre Ab y saponina dendrítica. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Cetuximab-(S-dendrón-(L-SO1861)4)4:
Se desaló cetuximab en tampón DPBS pH 7,5 y luego se normalizó a 2,50 mg/ml. A una alícuota de Ab (9,19 mg, 61 nMol) se le añadió una alícuota de Solución de PEG4-SPDP recién preparada (5,0 mg/ml, 6,70 equivalentes molares, 411 nMol), la mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de la incubación, la reacción se detuvo con la adición de glicina (20 mg/ml, 7,7 |_il), luego se redujo el resto de SPD in situ mediante la adición de TCEP (5,0 mg/ml, 4,0 equivalentes molares por SPDP, 1,64 |jMol). Esta mezcla se mezcló con rodillos durante 15 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. El Ab-SH resultante se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización por centrifugación Zeba en TBS pH 7,5. El Ab-SH se caracterizó mediante análisis UV-vis y método de Ellman (relación tiol a Ab = 5,4). Al volumen de Ab-SH (7,41 mg, 1,93 mg/ml, 49 nMol) se le añadió una alícuota de solución recién preparada de dendrón-(L-SO1861)4-maleimida en DMSO (10 mg/ml, 8,0 equivalentes molares por Ab, 0,4 jMol, 3,16 mg, 0,32 ml), la mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante la noche a 20 °C. Además de la reacción de conjugación, se retiraron dos alícuotas del Ab-SH desalinizado (0,25 mg, 1,67 nMol) antes de la conjugación y se hicieron reaccionar con NEM (8,0 equivalentes molares por Ab, 13,3 nMol, 6,7 j l de una solución de 0,25 mg/ml) o tampón TBS pH 7,5 (6,7 j l) durante la noche a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación durante 18 horas (antes de la adición de NEM), la mezcla de conjugado crudo se centrifugó brevemente y se extrajo una alícuota de 100 j l para su análisis por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizaron mediante el método de Ellman para obtener la incorporación de dendrón-(L-SO1861)4. A la masa Ab-dendrón-(L-SO1861)4 se le añadió una alícuota de solución NEM recién preparada (2,5 mg/ml, 5,0 equivalentes molares, 0,25 jMol) y la mezcla se purificó mediante una columna Sephadex G50 de 1,6 x 30 cm eluyéndola con DPBS pH 7,5 para dar el conjugado Cetuximab-(S-dendrón-(L-SO1861)4)4. El producto se filtró a 0,2 jM para aclararlo y luego se concentró cuidadosamente para a aproximadamente 3 mg/ml usando un concentrador vivaspin T15 (3000 g, intervalos de 5 minutos, 5 °C) para dar el conjugado final Cetuximab-(S-dendrón(L-SO1861)4)4. Rendimiento: 4,41 mg, 48 %. Relación de dendrón-(L-SO1861)4 a Ab = 4,4.
Tabla 2. Resultados de reacción resumidos
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Anticuerpo-(L-SO1861)n (como se ilustra en la figura 51)
[0321] Trastuzumab, Cetuximab se denominan "Ab" en lo sucesivo. Ab se conjugó con la saponina SO18161-EMCH mediante una reacción de conjugación de tioleno tipo Michael en DAR de 1, 2, 3, 4, 5 y 6. La molécula de SO1861-EMCH obtiene un enlace lábil (L) de hidrazona entre su estructura y su grupo maleimida, lo que genera un enlace lábil entre la saponina y Ab. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-SO1861)4:
A una solución de Cetuximab (40 mg, 8,0 ml) se le añadieron 10 jl/m l de concentrado de Tris (127 mg/ml, 1,05 M), concentrado de Tris.HCl (623 mg/ml, 3,95 M) y concentrado de EDTA-Na2 (95 mg/ml, 0,26 M) para dar un tampón de TBS 50 mM, EDTA 2,5 mM pH 7,5.
[0322] Al Cetuximab dividido en cuatro porciones (cada una de 9,73 mg, 4,864 mg/ml, 65 nMol) se añadió una alícuota de solución de TCEP recién preparada (0,5-2,0 mg/ml, 1,15-7,02 equivalentes molares, 75-455 nMol), las mezclas se agitaron brevemente en vórtex y luego se incubaron durante 300 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de la incubación (antes de la adición de SO1861-EMCH), se extrajo una alícuota de alrededor de 1 mg (0,210 ml) de Ab-SH de cada mezcla y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Estas alícuotas se caracterizaron mediante análisis UV-vis y método de Ellman (relación tiol a Ab = 2,0, 4,2, 5,9 y 6,8 respectivamente). A cada uno de los Ab-SH a granel se añadió una alícuota de solución SO1861-EMCH recién preparada (2 mg/ml, 1,3 equivalentes molares por 'tiol', 0,15-0,61 jMol, 0,16-0,63 ml), las mezclas se agitaron brevemente y luego se incubaron durante 120 minutos a 20 °C. Además de cada reacción de conjugación, se hicieron reaccionar dos alícuotas de Ab-SH desalinizado (0,25 mg, 1,67 nMol) con NEM (1,3 equivalentes molares por 'tiol', 4,3-17,4 nMol, 2,2-8,7 |_il de una solución de 0,25 mg/ml) o Tampón TBS pH 7,5 (2,2-8,7 pl) durante 120 minutos a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación (antes de la adición de NEM), se retiró una alícuota de 0,200 ml de mezcla de Ab-SO1861-EMCH y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizaron mediante el método de Ellman para obtener incorporaciones de SO1861-EMCH. A la mezcla de Ab-SO1861-EMCH a granel se añadió una alícuota de solución NEM recién preparada (2,5 mg/ml, 2,5-10 equivalentes molares, 0,15-0,58 pMol) y las mezclas se purificaron mediante columnas de desalinización zeba spin eluyendo con DPBS pH 7,5 para dar conjugados purificados de Cetuximab-(L-SO1861). Los productos se normalizaron a 2,5 mg/ml y se filtraron a 0,2 pM antes de dispensarlos para su evaluación biológica.
^ - -
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T l 4. n i i n ^ r i n r mi r l r n xim -L- 1 1
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Síntesis de anticuerpo-(S-SO1861)n
Síntesis de SO1861-S-Mal
[0323] Se colocaron SO1861 de Saponaria officinalis L (15,4 mg, 8,28 pMol) y HATU (140 mg, 368 pMol, 44,5 equivalentes molares) en forma sólida en un vial de vidrio de 20 ml con agitador magnético y se añadieron 5 ml de DMSO para disolver los materiales. La mezcla disuelta se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió 1 ml de solución de AEM recién preparada (65 mg, 256 pMol, 31 equivalentes molares) en DMSO a la mezcla de SO1861-HATU en agitación. La mezcla de reacción se agitó durante 17 horas a temperatura ambiente. Después de agitación durante 17 horas, la mezcla se diluyó con agua desionizada y se dializó extensamente durante 24 h con agua desionizada utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (Spectra/Por 7) con un MWCO de 1 kDa. Después de la diálisis, la solución se liofilizó para obtener un polvo blanco.
[0324] Rendimiento: 7,22 mg (44 %).
[0325] Se utilizaron además alícuotas secas para la caracterización mediante MALDI-TOF-MS.
[0326] MALDI-TOF-MS (modo RN): m/z 1983 Da ([M-H]-, Conjugado SO1861-S-Mal), 2136 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-S-Mal).
[0327] MALDI-TOF-MS (modo RP): m/z 2007 Da ([M Na]+, Conjugado SO1861-S-Mal), 2107 Da ([M-Na]+, conjugado de saponina-S-Mal).
[0328] El grupo funcional maleimida se verificó mezclando el SO1861-S-Mal purificado con una solución de L-cisteína recién preparada (1000 moles de exceso) y observando el cambio de masa esperado en MALDI-TOF-MS produciendo un conjugado de cisteína en m/z 2103 Da.
Conjugación de anticuerpos
[0329] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". Se conjugó Ab con la saponina SO18161-S-Mal mediante una reacción de conjugación de tioleno de tipo Michael. La saponina obtiene un enlace amida estable (S) entre su estructura y su grupo maleimida, lo que genera un enlace estable entre la saponina y Ab.
[0330] Se hizo un intercambio de tampones de 5 mg de Ab disuelto en solución salina fosfatada (PBS) a solución salina tris(hidroximetil)-aminometano (TBS) pH 7,5 a través de una columna de desalación zeba spin y se normalizó a una concentración de 3 mg/ml. Al Ab se le añadió una alícuota de solución de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) recién preparada (0,25 mg/ml, 2,92 equivalentes molares), la mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante 90 min a 20 °C. Después, el Ab-SH resultante se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Se analizó una alícuota mediante método de Ellman para determinar el contenido de sulfhidrilo. El Ab-SH obtenido se dividió en una sola porción para la conjugación y dos alícuotas de 0,25 mg para los controles. A la porción principal de AB-SH se le añadió una alícuota de solución de SO1861-S-Mal recién preparada (2 mg/ml, 2 equivalentes molares con respecto al contenido de sulfhidrilo), a la segunda alícuota de control se le añadió tampón TBS pH 7,5. Cada mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante 2 horas a 20 °C. Después, se analizó una alícuota de cada uno mediante el método de Ellman para determinar el contenido de sulfhidrilo que quedaba en el conjugado con respecto a los controles. Después de la purificación mediante filtración en gel a través de una columna de desalación por centrifugación zeba spin en p Bs de Dulbecco, pH 7,1, se obtuvo Ab-S-SO1861. El conjugado se analizó adicionalmente mediante SEC para determinar el % de pureza. Para la muestra de Trastuzumab-(S-SO1861)4 se determinó una pureza del 99 %. Para la muestra de Cetuximab-(S-SO1861)4 se determinó una pureza del 98,3 %. Los volúmenes de retención para Trastuzumab-(S-SO1861)4 (9.1 ml) y Cetuximab-(S-SO1861)4 (8,8 ml) fueron similares y son coherentes con un Ab no modificado (por ejemplo, IgG). Anticuerpo-(L-HSP27 BNA)n
Síntesis de Trnstuzumab-(L-HSP27)4,, Cetuximab-(L-HSP27)4, mediante PEG4-SPDP con un DAR4 y síntesis de Cetuximab-(L-HSP27)2 mediante PEG4-SPDP con un DAR2
[0331] Trastuzumab, Cetuximab, se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con HSP27 BNA disulfuro a través de un succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato de tetra(etilenglicol) (PEG4-SPDP) que forma un puente disulfuro lábil (L) entre Ab y HSP27 BNA. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-HSP27 BNA)4:
Se hizo reaccionar oligonucleótido de HSP27 BNA disulfuro (2,7 mg, 470 nMol, 6,10 mg/ml) con TCEP (10 equivalentes molares, 4,7 pMol, 1,34 mg, 50 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, el oligo-SH se purificó mediante una columna de desalación PD10 G25 con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo oligo-SH (2,48 mg, 90 %, 1,24 mg/ml, relación de SH a oligonucleótido = 0,8) [0332] Se hizo reaccionar trastuzumab (1,5 mg, 10,3 nMol, 2,50 mg/ml) con una alícuota de solución de PEG4-SPDP recién preparada (6,81 equivalentes molares, 70,1 nMol, 39 pg) en DMSO (1 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (15,1 pl de 2 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desaló mediante una columna de desalinización zeba con elución con TBS pH 7,5. Una alícuota del Tras-S-PEG4-SPDP resultante se extrajo y se analizó mediante análisis UV-Vis. La incorporación de SPDP se determinó usando TCEP para liberar piridiil-2-tiona (PDT) y mediante análisis UV-vis a 343 nM (relación de SPDP a Ab: 4). El resto de Tras-(S-PEG4-SPDP)4 se hizo reaccionar con una alícuota de oligonucleótido HSP27 recién preparado (oligo-SH) (8 equivalentes molares, 82,4 nMol, 1,24 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, se analizó el conjugado mediante análisis UV-vis para determinar la incorporación de HSP27 mediante el desplazamiento de piridiil-2-tiona (PDT) a 343 nM. El conjugado crudo se purificó usando una columna Sephadex G50 de 1,6 x 33 cm con elución con DPBS pH 7,5. El trastuzumab-(L-HSP27)4 resultante se obtuvo como una sola fracción. Rendimiento: n.d . Pureza: 96 %, relación HSP27 BNA a Ab = 4,4
Tabla 5. Condiciones resultados de reacción resumidos
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n.d. = no determinado
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Anticuerpo-(L-HSP27 BNA-L-bloqueado)"
Trastuzumab-(L-HSP27-L-bloqueado)4,, Cetuximab-(L-HSP27-L-bloqueado)
[0333] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con un derivado de HSP27 portador de maleimido (Mal), que se denominará en lo sucesivo "HSP27-Mal". El Ab se conjugó con HSP27-Mal mediante una reacción de conjugación de tioleno de tipo Michael. El HSP17-Mal obtiene un enlace lábil (L) hidrazona entre su estructura y su función maleimida, generando un enlace lábil entre e1HSP27 BNA y Ab. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-HSP27 BNA-L-bloqueado)n:
El trastuzumab se reconstituyó a 21 mg/ml con agua desionizada (DI), luego se diluyó a 5 mg/ml usando tampón de histidina pH 6. A una alícuota de 20 mg (4,0 ml) se agregaron 10 jl/m l de cada uno de concentrado de Tris (127 mg/ml, 1,05 M), concentrado de Tris.Hcl (623 mg/ml, 3,95 M) y concentrado de EDTA-Na2 (95 mg/ml, 0,26 M) para dar un tampón TBS 50 mM, EDTA 2,5 mM pH 7,5. A trastuzumab (20,30 mg, 4,920 mg/ml, 0,14 |jMol) se le añadió una alícuota de solución de TCEP recién preparada (1,00 mg/ml, 2,35 equivalentes molares, 0,32 jMol), la mezcla se agitó brevemente y luego se incubó durante 90 minutos a 20 °C. con mezclador de rodillos. Después de la incubación (antes de la adición de HSP27-Mal), se extrajo una alícuota de alrededor de 2 mg (0,439 ml) de Ab-SH de cada mezcla y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó mediante análisis UV-vis y método de Ellman (relación tiol a ab = 4,0). Al Ab-SH (5,1 mg, 35 nMol) se añadió una alícuota del derivado HSP27-Mal (recién preparado en TBS pH 7,5, 2 mg/ml, 1,3 equivalentes molares por 'tiol', 182 nMol), la mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante 120 minutos a 20 °C. Además de la reacción de conjugación del derivado de Trasuzumab-HSP27 BNA, se hicieron reaccionar dos alícuotas de Ab-SH desalinizado (0,5 mg, 3,3 nMol) con NEM (1,3 equivalentes molares por 'tiol', 17,3 nMol, 6,7 j l de una solución de 0,25 mg/ml) o tampón TBS pH 7,5 (6,7 j l) durante 120 minutos a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación (antes de la adición de NEM), se retiró una alícuota de 0,100 ml de mezcla de Ab-HSP27 BNA y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizó mediante el método de Ellman para obtener la incorporación de HSP27. A la mezcla de Ab-HSP27 a granel se añadió una alícuota de solución de NEM recién preparada (0,25 mg/ml, 2,5 equivalentes molares, 89 nMol) y la mezcla se purificó mediante filtración en gel usando un Sephadex G50M de 1,6 x 30 cm con elución con DPBS pH 7,5 seguido por filtración centrífuga repetida y lavado usando un concentrador MWCO de 100 KDa para dar conjugado Trastuzumab-(L-HSP27-L-bloqueado)4 purificado. Los productos se filtraron a 0,2 jM antes de su distribución para evaluación biológica.
Tabla 6. Condiciones resultados de reacción resumidos
Figure imgf000106_0002
Anticuerpo-(Cys-porción conectora trifuncional-(L-SO1861)-(L-HSP27 BNA))n
Trastuzumab-[S-Tri-(L-SO1861)-(L-HSP27)]4, Trastuzumab-[S-Tri-(bloqueado)-(L-HSP27)]4, Cetuximab-[S-Tri-(L-S 01861)-(L-HSP27)]4, Cetuximab-[S-Tri-(bloqueado)-(L-HSP27)]4
[0334] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". El Ab se conjugó mediante una reacción tioleno de tipo Michael con dos derivados de HSP27 BNA portadores de maleimida (Mal) diferentes que se denominan en lo sucesivo "HSP27-Mal". Estos derivados de HSP27-Mal fueron, a saber: 1) Mal-porción conectora trifuncional-(L-SO1861)-(L-HSP27), 2) Mal-porción conectora trifuncional-(bloqueada)-(L-HSP27). El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-[S-porción conectora trifuncionañ-(L-SO1861)-(L-HSP27 BNA)]4:
El trastuzumab se reconstituyó a 21 mg/ml con agua desionizada (DI), luego se diluyó a 5 mg/ml usando tampón de histidina pH 6. A una alícuota de 20 mg (4,0 ml) se agregaron 10 jl/m l de cada uno de concentrado de Tris (127 mg/ml, 1,05 M), concentrado de Tris.Hcl (623 mg/ml, 3,95 M) y concentrado de EDTA-Na2 (95 mg/ml, 0,26 M) para dar un tampón TBS 50 mM, EDTA 2,5 mM pH 7,5.
[0335] A trastuzumab (20,30 mg, 4,920 mg/ml, 0,14 jMol) se le añadió una alícuota de solución de TCEP recién preparada (1,00 mg/ml, 2,35 equivalentes molares, 0,32 jMol), la mezcla se agitó brevemente y luego se incubó durante 90 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de la incubación (antes de la adición de la construcción), se extrajo una alícuota de alrededor de 2 mg (0,439 ml) de Ab-SH de cada mezcla y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Estas alícuotas se caracterizaron mediante análisis UV-vis y método de Ellman (relación tiol a ab = 4,0). El Ab-SH a granel se dividió en dos alícuotas (1,1 mg, 7,6 nMol y 1,2 mg, 8,3 nMol), y a cada alícuota se le añadió una alícuota de cada uno de los derivados de HSP27 BNA-Mal1-2 (recién preparados en TBS pH 7,5, 2 mg/ml, 1,3 equivalentes molares por "tiol", 40 nMol y 43 nMol), las mezclas se agitaron en vórtex brevemente y luego se incubaron durante 120 minutos a 20 °C. Además de la reacción de conjugación de derivados de trastuzumab-HSP27 BNA 2, se hicieron reaccionar dos alícuotas de Ab-SH desalinizado (0,5 mg, 3,3 nMol) con NEM (1,3 equivalentes molares por 'tiol', 17,3 nMol, 6,7 pl de una solución de 0,25 mg/ml) o tampón TBS pH 7,5 (6,7 pl) durante 120 minutos a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación (antes de la adición de NEM), una alícuota de 0,100 ml de la mezcla de Ab-construcción se extrajo y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización por centrifugación Zeba en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizó por el método de Ellman para obtener la incorporación de derivados de HSP27 BNA 2. A cada mezcla de Ab-construcción a granel se añadió una alícuota de solución de NEM recién preparada (0,25 mg/ml, 2,5 equivalentes molares, 19 y 21 nMol) y las mezclas se purificaron mediante filtración en gel usando un Sephadex G50M de 1,6 x 30 cm con elución con DPBS pH 7,5 seguido de filtración centrífuga repetida y lavado usando un concentrador MWCO de 100 KDa para dar conjugados de Trastuzumab-construcción 1-2. Los productos se filtraron a 0,2 pM antes de su distribución para su evaluación biológica.
Tabla 7. Condiciones resultados de reacción resumidos
Figure imgf000107_0001
Anticuerpo-(L-SO1861)n-(L-HSP27 BNA)n
Síntesis de Trastuzumab-(L-SO1861)4-(L-HSP27)4, Cetuximab-(L-SO1861)4-(L-HSP27)4 mediante PEG4-SPDP con un DAR4
Síntesis de Cetuximab-(L-SO1861)4-(L-HSP27)2 (FBR703 STB17/7-8) mediante PEG4-SPDP con un DAR2
[0336] Trastuzumab-(L-SO1861)4, Cetuximab-(L-SO1861)4 se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con BNA HSP27 disulfuro a través de una porción conectora tetra(etilenglicol) succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (PEG4-SPDP) que forma un puente disulfuro lábil (L) entre Ab y HSP27 BNA. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-SO1861)4-(L-HSP27)4:
Se hizo reaccionar oligonucleótido de HSP27 BNA disulfuro (2,7 mg, 470 nMol, 6,10 mg/ml) con TCEP (10 equivalentes molares, 4,7 pMol, 1,34 mg, 50 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, el oligo-SH se purificó mediante una columna de desalinización PD10 G25 con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo oligo-SH (2,48 mg, 90 %, 1,24 mg/ml, relación de SH a oligonucleótido = 0,8) Se hizo reaccionar Trastuzumab-(L-SO1861)4 (1,3 mg, 8,7 nMol, 2,50 mg/ml) con una alícuota de solución de PEG4-SPDP recién preparada (9,26 equivalentes molares, 80,3 nMol, 45 pg) en DMSO (1 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (15,1 pl de 2 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desalinizó mediante una columna de desalinización zeba con elución con TBS pH 7,5. Una alícuota del Tras-(L-SO1861)-(L-PEG4-SPDP) se extrajo y se analizó mediante análisis UV-Vis. Se determinó la incorporación de SPDP usando TCEP para liberar piridiil-2-tiona (PDT) y mediante análisis UV-vis a 343 nM (relación SPDP a Ab = 4). El resto de Tras-(L-SO1861)-(L-PEG4-SpDP) se hizo reaccionar con una alícuota de oligonucleótido HSP27 recién preparado (oligo-SH) (8 equivalentes molares, 54,8 nMol, 0,32 mg, 1,24 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, se analizó el conjugado mediante análisis UV-vis para determinar la incorporación de HSP27 mediante el desplazamiento de piridiil-2-tiona (PDT) a 343 nM. El conjugado crudo se purificó usando una columna Sephadex G50 de 1,6 x 33 cm con elución con Dp BS pH 7,5. El trastuzumab-(L-SO1861)4-(L-HSP27 BNA)4 resultante se obtuvo como una sola fracción. Rendimiento: 0,47 mg, 45 % (0,49 mg/ml), relación HSP27 a Ab = 3,5
Tabla 8. Condiciones resultados de reacción resumidos
Figure imgf000108_0001
Anticuerpo-(L-QS Mix)"
[0337] Trastuzumab, Cetuximab, se denominan en lo sucesivo "Ab". El Ab se conjugó con la saponina QS Mix-EMCH mediante una reacción de conjugación de tioleno de tipo Michael. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-L-QS Mix:
Trastuzumab ("Ab", 600 mg) se reconstituyó a 21 mg/ml con agua desionizada (DI), luego se diluyó a 5 mg/ml usando tampón de histidina recién preparado de pH 6 (histidina 5 mM pH 6, trehalosa al 2 %, Tween 20 al 0,01 %). Se añadieron 10 pL/mL de cada uno de concentrado de Tris (127 mg/mL, 1,05M), concentrado de Tris.HCL (623 mg/mL, 3,95M) y concentrado de EDTA-Na2 (95 mg/ml, 0,26 M) para dar un tampón de TBS 50 mM, e DtA 2,5 mM, pH 7,5. A trastuzumab (603,8 mg, 4,887 mg/ml, 4,0 pMol) se le añadió una alícuota de solución de TCEP recién preparada (1 mg/ml, 2,35 equivalentes molares, 9,5 pMol, 2,72 mg), la mezcla se agitó a mano para mezclarla y luego se incubó durante 90 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de la incubación (antes de la adición de QS Mix-EMCH), se retiró una alícuota de 2 mg (0,409 ml) de Ab-SH y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó mediante análisis UV-vis y método de Ellman. A la masa Ab-SH se le añadió una alícuota de solución QS Mix-EMCH recién preparada (2 mg/ml, 5,2 equivalentes molares, 21 pMol, 21,6 ml), las mezclas se agitaron en vórtex brevemente y luego se incubaron durante 120 minutos a 20 °C. Además de la reacción de conjugación, se hicieron reaccionar dos alícuotas de Ab-SH desalinizado (0,5 mg, 0,134 ml, 3,33 nMol) con NEM (8,00 equivalentes, 26,6 nMol, 3,3 pg, 13,3 pL de una solución de 0,25 mg/ml) o tampón TBS pH 7,5 (13,3 |_iL) durante 120 minutos a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación (antes de la adición de NEM), se extrajo una alícuota de 2 mg (0,481 ml) de mezcla Ab-QS Mix-EMCH y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización giratoria Zeba en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizó mediante el método de Ellman para obtener incorporaciones QS Mix-EMCH. A la mezcla Ab-QS Mix-EMCH a granel se añadió una alícuota de solución NEM recién preparada (2,5 mg/ml, 5 equivalentes molares, 20 pMoL, 2,51 mg) y la mezcla se almacenó a 2-8°C durante la noche. El conjugado se purificó mediante una columna Sephadex G50M de 10 x 40 cm con elución con DPBS pH 7,5 para dar el conjugado de Trastuzumab-(L-QS Mix) purificado. El producto en su conjunto se concentró y luego se normalizó a 5 mg/ml usando un concentrador vivacell 100 (2 000 g, 4 °C, 200 minutos). El producto se filtró a 0,2 pM y se distribuyó para evaluación biológica. Rendimiento: n.d. Relación de QS mix a Ab = 4,1.
Tabla 9. Resultados de reacción resumidos
Figure imgf000108_0002
Anticuerpo-(L-HSP27BNA-L-S01861)n
[0338] Trastuzumab-(L-HSP27BNA-L-SO1861)4, Cetuximab-(L-HSP27BNA-L-SO1861)4 con un DAR4. Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con una saponina SO1861 y un derivado de HSP27 portador de maleimido (Mal) que se denomina en lo sucesivo "HSP27-Mal". El Ab se conjugó con HSP27-Mal mediante una reacción de conjugación de tioleno de tipo Michael. E1HSP17-Mal obtiene un enlace lábil (L) hidrazona entre su estructura y su función maleimida, con lo que se genera un enlace lábil entre el HSP27 BNA y Ab. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-HSP27 BNA-L-SO1861)4:
El trastuzumab se reconstituyó a 21 mg/ml con agua desionizada (DI), luego se diluyó a 5 mg/ml usando tampón de histidina pH 6. A una alícuota de 20 mg (4,0 ml) se agregaron 10 pl/ml de cada uno de concentrado de Tris (127 mg/ml, 1,05 M), concentrado de Tris.HCl (623 mg/ml, 3,95 M) y concentrado de EDTA-Na2 (95 mg/ml, 0,26 M) para dar un tampón TBS 50 mM, EDTA 2,5 mM pH 7,5. A trastuzumab (20,30 mg, 4,920 mg/ml, 0,14 pMol) se le añadió una alícuota de solución de TCEP recién preparada (1,00 mg/ml, 2,35 equivalentes molares, 0,32 pMol), la mezcla se agitó brevemente y luego se incubó durante 90 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de la incubación (antes de la adición de HSP27-Mal), se extrajo una alícuota de alrededor de 2 mg (0,439 ml) de Ab-SH de cada mezcla y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó mediante análisis UV-vis y método de Ellman (relación tiol a ab = 4,0). A la masa Ab-SH (4,7 mg, 32 nMol) se añadió una alícuota del derivado HSP27-Mal (recién preparado en TBS pH 7,5, 2 mg/ml, 1,3 equivalentes molares por 'tiol', 166 nMol), la mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante 120 minutos a 20 °C. Además de la reacción de conjugación del derivado de Trasuzumab-HSP27 BNA, se hicieron reaccionar dos alícuotas de Ab-SH desalinizado (0,5 mg, 3,3 nMol) con NEM (1,3 equivalentes molares por 'tiol', 17,3 nMol, 6,7 pl de una solución de 0,25 mg/ml) o tampón TBS pH 7,5 (6,7 pl) durante 120 minutos a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación (antes de la adición de NEM), se retiró una alícuota de 0,100 ml de mezcla de Ab-HSP27 BNA y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizó mediante el método de Ellman para obtener la incorporación de HSP27. A la mezcla de Ab-HSP27 a granel se añadió una alícuota de solución de NEM recién preparada (0,25 mg/ml, 2,5 equivalentes molares, 80 nMol) y la mezcla se purificó por filtración en gel usando un Sephadex G50M de 1,6 x 30 cm con elución con DPBS pH 7,5 seguido por filtración centrífuga repetida y lavado usando un concentrador MWCO de 100 KDa para dar el conjugado Trastuzumab-(L-HSP27 BNA-L-SO1861)4 purificado. Los productos se filtraron a 0,2 pM antes de su distribución para su evaluación biológica.
Tabla 10. Condiciones resultados de reacción resumidos
Figure imgf000109_0001
Anticuerpo-(L-SO1861 "-(S-Diantina)"
Síntesis de trastuzumab-(L-SO1861)4-(S-Diantina)2 y Cetuximab-(L-SO1861)4-(S-Diantina)2 a través de SMCC con un DAR2
[0339] Trastuzumab-L-SO1861 y Cetuximab-L-SO1861 se denominan en lo sucesivo "Ab". El Ab se conjugó con Diantina-Cys mediante una porción conectora de succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), lo que proporciona un enlace amida (S) estable entre Ab y Diantina. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-SO1861)4-(S-Diantina)2:
Se hizo reaccionar diantina-Cys (7,8 mg, 261 nMol, 0,78 mg/ml) con TCEP (5 equivalentes molares, 1,31 pMol, 0,37 mg, 1 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la proteína-SH se purificó mediante una columna de desalinización de zeba con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo proteína-SH (5,2 mg, 67 %, 0,52 mg/ml, con una relación de SH a proteína = 1 ± 0,1).
[0340] Se hizo reaccionar trastuzumab-(L-SO1861)4 (1.5 mg, 10 nMol, 2,50 mg/ml) con una alícuota de solución SMCC recién preparada (4,83 equivalentes molares, 48,3 nMol, 16 pg) en DMSO (0,5 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (18,1 pl de 1 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desalinizó mediante una columna de desalinización Zeba con elución con TBS pH 7,5. El Tras-(L-SO1861)-(S-SMCC) (1,22 mg, 8,1 nMol, 2,03 mg/ml) resultante se hizo reaccionar con una alícuota de Diantina-Cys recién reducida (3,2 equivalentes molares, 32,5 nMol, 0,97 mg, 0,52 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, el conjugado se concentró a < 1 ml usando un concentrador vivaspin T4 y se purificó usando una columna Superdex 200PG de 1,6 x 37 cm con elución con DPBS pH 7,5. El conjugado tras-(L-SO1861)4-(S-Diantina)2 resultante se obtuvo como fracciones de alto peso molecular (HMW) (0,36 mg, 30 %, 0,34 mg/ml, relación diantina a Ab = no determinada) y bajo peso molecular (LMW) (0,49 mg, 40 %, 0,30 mg/ml, relación de diantina a Ab = no determinada). Rendimiento: n.d. Pureza: 79,3 %.
Tabla 11. Condiciones resultados de reacción resumidos
Figure imgf000109_0002
12. Anticuerpo-(S-diantina)"
Síntesis de Trastuzumab-(S-Diantina)2, Cetuximab-(S-diantina)2, a través de SMCC con un DAR2
[0341] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". El Ab se conjugó con Diantina-Cys mediante una porción conectora de succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) que proporciona un enlace amida (S) estable entre Ab y Diantina. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(S-Diantina)2:
Se hizo reaccionar diantina-Cys (7,8 mg, 261 nMol, 0,78 mg/ml) con TCEP (5 equivalentes molares, 1,31 pMol, 0,37 mg, 1 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la proteína-SH se purificó mediante una columna de desalinización de zeba con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo proteína-SH (5,2 mg, 67 %, 0,52 mg/ml, relación de SH a proteína = 1 ± 0,1).
[0342] Se hizo reaccionar trastuzumab (1,5 mg, 10 nMol, 2,50 mg/ml) con una alícuota de solución SMCC recién preparada (3,16 equivalentes molares, 31,6 nMol) en DMSO (0,5 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (18,1 pl de 1 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desalinizó mediante una columna de desalinización Zeba con elución con TBS pH 7,5. El Tras-(S-SMCC) resultante (1,22 mg, 8,1 nMol, 2,03 mg/ml) se hizo reaccionar con una alícuota de Diantina-Cys recién reducida (3,2 equivalentes molares, 32,5 nMol, 0,97 mg, 0,52 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, el conjugado se concentró a < 1 ml usando un concentrador vivaspin T4 y se purificó usando una columna Superdex 200PG de 1,6 x 37 cm con elución con DPBS pH 7,5.
[0343] Rendimiento: n.d. Pureza: 99 %.
Tabla 12. Condiciones resultados de reacción resumidos
Figure imgf000110_0001
Anticuerpo-(L-SO1861)n-(L-diantina)n
Síntesis de Trastuzumab-(L-SO1861)4-(L-Diantina)2 y Cetuximab-(L-SO1861)4-(L-Diantina)2 mediante PEG4-SPDP con un DAR2
[0344] Trastuzumab-L-SO1861 y Cetuximab-L-SO1861 se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con Diantina-Cys a través de un tetra(etilenglicol) succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (PEG4-SPDP) que forma un puente disulfuro lábil (L) entre Ab y Diantina. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-L-SO1861:
Se hizo reaccionar diantina-Cys (7,8 mg, 261 nMol, 0,78 mg/ml) con TCEP (5 equivalentes molares, 1,31 pMol, 0,37 mg, 1 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la proteína-SH se purificó mediante una columna de desalinización de zeba con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo proteína-SH (5,2 mg, 67 %, 0,52 mg/ml, relación de SH a proteína = 1 ± 0,1).
[0345] Trastuzumab-(L-SO1861)4 (0.75 mg, 5 nMol, 2,50 mg/ml) se hizo reaccionar con una alícuota de solución de PEG4-SPDP recién preparada (4,95 equivalentes molares, 24,75 nMol, 14 pg) en DMSO (1 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (18,1 pl de 1 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desalinizó mediante una columna de desalinización Zeba con elución con TBS pH 7,5. Se extrajo una alícuota de Tras-(L-SO1861)-(S-PEG4-SPDP) y se analizó mediante análisis UV-Vis. La incorporación de SPDP se determinó usando TCEP para liberar piridiil-2-tiona (PDT) y mediante análisis UV-vis a 343 nM (relación de SPDP a Ab = 2,4). El resto de Tras-(L-SO1861)-(S-PEG4-SPDP) se hizo reaccionar con una alícuota de Diantina-Cys (proteína-SH) recién preparada (4 equivalentes molares, 20 nMol, 0,6 mg, 0,52 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, se analizó una alícuota del conjugado mediante análisis UV-vis para determinar la incorporación de Diantina-Cys por desplazamiento de PDT. Después, el conjugado se concentró a < 1 ml usando un concentrador vivaspin T4 y se purificó usando una columna Superdex 200PG de 1,6 x 37 cm con elución con DPBS pH 7,5. Relación de diantina a Ab = 2). Rendimiento: n.d. Pureza: 60,5 %.
Tabla 13. Condiciones resultados de reacción resumidos
Figure imgf000110_0002
__________
Figure imgf000111_0001
Anticuerpo-(L-diantina)"
Trastuzumab-(L-diantina)2, Cetuximab-(L-diantina)2 y síntesis a través de PEG4-SPDP con un DAR2
[0346] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con Diantina-Cys a través de una porción conectora tetra(etilenglicol) succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (PEG4-SPDP) que forma un puente disulfuro lábil (L) entre Ab y Diantina. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-L-SO1861:
Se hizo reaccionar diantina-Cys (7,8 mg, 261 nMol, 0,78 mg/ml) con TCEP (5 equivalentes molares, 1,31 jMol, 0,37 mg, 1 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la proteína-SH se purificó mediante una columna de desalinización de zeba con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo proteína-SH (5,2 mg, 67 %, 0,52 mg/ml, relación de SH a proteína = 1 ± 0,1).
[0347] Se hizo reaccionar trastuzumab (0,75 mg, 5 nMol, 2,50 mg/ml) con una alícuota de Solución de PEG4-SPDP recién preparada (3,35 equivalentes molares, 16,75 nMol) en DMSO (1 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (18,1 j l de 1 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desalinizó mediante una columna de desalinización Zeba con elución con TBS pH 7,5. Se extrajo una alícuota del Tras-(S-PEG4-SPDP) y se analizó mediante análisis UV-Vis. La incorporación de SPDP se determinó usando TCEP para liberar piridiil-2-tiona (PDT) y mediante análisis UV-vis a 343 nM. El resto de Tras-(S-PEG4-SPDP) se hizo reaccionar con una alícuota de Diantina-Cys (proteína-SH) recién preparada (4 equivalentes molares, 20 nMol, 0,6 mg, 0,52 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, se analizó una alícuota del conjugado mediante análisis UV-vis para determinar la incorporación de Diantina-Cys por desplazamiento de p Dt . Después, el conjugado se concentró a < 1 ml usando un concentrador vivaspin T4 y se purificó usando una columna Superdex 200PG de 1,6 x 37 cm con elución con DPBS pH 7,5. Relación de diantina a Ab = 2). Rendimiento: n.d. Pureza: 67,7 %.
Tabla 14. Condiciones resultados de reacción resumidos
Figure imgf000111_0002
Ejemplo 12
Materiales y métodos
[0348] En nuestra investigación actual, se investigó un modelo de armazón que consiste en cuatro brazos moleculares para la unión de la saponina mediante una base de Schiff (imina) y un brazo para la química clic. La estructura polimérica (Figura 19) es un dendrímero de polietilenglicol pentavalente de la primera generación (es decir, número de ciclos de ramificación repetidos) que se adquirió de Iris Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania). La saponina (en este ejemplo, SA1641) se purificó a partir de un extracto crudo compuesto de saponina de la especie Gypsophila llamada Saponinum album obtenido de Merck (Darmstadt, Alemania). El extracto crudo en polvo (2,5 g) se hidrolizó en agua (100 ml) con hidróxido de sodio (0,2 g). La solución se agitó durante 20 h a 40 °C y luego se complementó con ácido acético glacial hasta que se alcanzó un pH de 5,0. Para eliminar los taninos, la solución se agitó en un embudo de decantación con 30 ml de butanol. Se recapturó la fase acuosa y se repitió la extracción con butanol dos veces. Las fases de butanol se suplementaron con sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se agruparon. Se evaporó el butanol y el polvo de saponina restante se resolvió en metanol al 20 % hasta una concentración final de 30 mg/ml. Después de una breve sonicación, se separaron diferentes saponinas mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los tubos (excluyendo la columna) se enjuagaron con agua tibia (40 °C) a un flujo de 1,5 ml/min y luego se incluyó la columna Eurospher RP-C18 (5 |jM, 250 x 8 mM) con isopropanol (100 %). Se aplicaron saponinas a la columna y se eluyeron con un gradiente de metanol (20 % de metanol a 70 % de metanol en 30 min a 1,5 ml/min en agua suplementada con ácido trifluoroacético al 0,01 % seguido de metanol al 70 % durante 60 min más) (Sama et al., 2018). Se analizaron alícuotas de las fracciones para determinar su contenido de SA1641 mediante espectrometría de masas con ionización por electropulverización (ESI-MS). Se reunieron las fracciones que contenían SA1641 puro y se evaporó el metanol. La solución acuosa se congeló como una película delgada en un matraz giratorio de fondo redondo mediante el uso de hielo seco. Después de almacenamiento durante 16 h a-80 °C, la muestra se liofilizó. Para producir el armazón como se define en la invención, la estructura polimérica (0,2 mM) y SA1641 (3,2 mM) se disolvieron en agua (aproximadamente pH 8) y se mezclaron volúmenes iguales y se agitaron durante 24 h a 26°C. Luego, se añadió cianoborohidruro de sodio (NaCNBHa; 0,1 M) en un exceso molar de 4 veces referido a SA1641 y la muestra se incubó durante 24 h más. A continuación, se verificó la estructura mediante cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC)/ESI-MS. Las muestras se aplicaron a una columna RP-C4 y se eluyeron con un gradiente de metanol (metanol al 25 % a metanol al 80 % en 15 min en agua suplementada con ácido trifluoroacético al 0,01 % de seguido de metanol al 80 % durante 10 min más). Las fracciones se analizaron mediante el uso de LockSpray ™, que es una fuente de iones diseñada específicamente para la medición de masa exacta con ionización por electropulverización utilizando espectrómetros de masas LC-time-of-flight (LC-TOF) de Waters Corporation.
Resultados
[0349] La Tabla de la Figura 58 muestra el espectro de masas teóricamente esperado obtenido de un cálculo con la calculadora de patrones de isótopos enviPat Web 2.0. El patrón considera la carga de la molécula y la aparición natural de isótopos, razón por la cual se espera más de un pico para una sola sustancia. Los datos experimentales (Figura 58) obtenidos por UPLC/ESI-Ms muestran casi exactamente los mismos picos en m/z 758-760 con la misma intensidad que la esperada, lo que demuestra un acoplamiento exitoso de SA1641 a la estructura polimérica.
Ejemplo 13
Materiales y métodos
[0350] Como ejemplo de una sustancia activa farmacéutica, se utilizó la toxina diantina-factor de crecimiento epidérmico (diantina-EGF) dirigida. Se añadió el plásmido His-diantina-EGF-pET11d (Weng et al, 2009) (100 ng) a 20 |_iL de Escherichia coli Rosetta™ 2 (DE3) pLysS Competent Cells (Novagen, San Diego, CA, EE. UU.). Las células se transformaron mediante choque térmico (30 min en hielo, 90 s a 42 °C y 1 min en hielo). Posteriormente, se añadieron 300 pl de caldo de lisogenia (LB) y la suspensión se incubó durante 1 h a 37 °C mientras se agitaba a 200 r.p.m. Se inoculó una placa de agar de caldo de lisogenia precalentada con 50 pg/ml de ampicilina con 100 pl de suspensión de bacterias y la placa se incubó durante la noche a 37 °C. Se inoculó caldo de lisogenia (3 ml) con 50 pg/mL de ampicilina con una colonia de la placa y se incubaron las bacterias durante 8 h a 37 °C y 200 r.p.m. La suspensión (50 pl) se añadió a 500 ml de caldo de lisogenia con 50 pg/ml de ampicilina y se incubó durante la noche a 37 °C y 200 r.p.m. Posteriormente, el volumen se aumentó a 2,0 L y las bacterias crecieron en las mismas condiciones hasta que se alcanzó una densidad óptica a una longitud de onda de 600 nM de 0,9. A continuación, se indujo la expresión de proteínas mediante la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM. La expresión de proteínas duró 3 h a 37 °C y 200 r.p.m. Finalmente, la suspensión bacteriana se centrifugó a 5000 x g y 4 °C durante 5 min, se resuspendió en 20 ml de PBS (NaCl137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO48,1 mM, KH2PO41,47 mM) y se almacenó a -20 °C hasta su uso. Para la purificación, las suspensiones bacterianas se descongelaron y se lisaron mediante sonicación. Los lisados se centrifugaron (15800 x g, 4 °C, 30 min) y se añadió imidazol hasta una concentración final de 20 mM. El sobrenadante se incubó con 2 ml de agarosa de ácido Ni-nitrilotriacético bajo agitación continua durante 30 min a 4 °C en presencia de imidazol 20 mM. Posteriormente, el material se vertió en una columna de 20 ml y se lavó tres veces con 10 ml de tampón de lavado (NaH2PO450 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) y diantina-EGF eluidos por porciones de 10 ml de concentraciones crecientes de imidazol (31, 65, 125 y 250 mM) en tampón de lavado. Las fracciones de eluato (2 ml) se dializaron durante la noche a 4 °C con a 2,0 l de PBS. La diantina-EGF desalinizada se concentró mediante un Amicon® Ultra-15 (10 kDa) y se cuantificó la concentración de proteína.
[0351] Para introducir un grupo de química clic adecuado en diantina-EGF, se disolvió éster de alquino-PEG-N-hidroxisuccinimidilo en un exceso molar de 8 veces referido a diantina-EGF en dimetilsulfóxido y se añadió a 9 volúmenes de diantina-EGF (1 mg en NaH2PO4/N/A2HPO40,2 M, pH 8). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 4 h, se separó el alquino no unido mediante el uso de una columna PD10 (GE-Healthcare, Freiburg, Alemania). La química clic con la estructura polimérica se llevó a cabo mediante cicloadición de alquino-azida catalizada por cobre (I). Alquino-diantina-EGF (0,02 mM), dendrímero (0,05 mM), CuSO4 (0,1 mM), tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (0,5 mM) y ascorbato de sodio (5 mM) se incubaron con agitación suave durante 1 h a temperatura ambiente en NaH2PO4/N/A2HPO4 0,1 M, pH 8. A continuación, se separaron las sustancias de bajo peso molecular utilizando una columna PD10.
[0352] Para probar la eficacia de la invención, se realizó un ensayo de viabilidad con células HER14. Estas células son fibroblastos transfectados de forma estable con el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano y, por lo tanto, son células diana de la toxina diantina-EGF dirigida. Se sembraron células HER14 (2000 células/100 pl/pocillo) en pocillos de placas de cultivo celular de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % a 37 °C, 5 % CO2 y 98 % de humedad. A continuación, se añadieron las diferentes sustancias de prueba (véanse los resultados y la Figura 59) por triplicado en un volumen de 25 pL y se complementaron con 25 pL adicionales de medio. Después de una incubación de 72 h, se añadieron 30 pl de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (0,5 mg/ml en agua) por pocillo y se incubó durante 2 h. Después de eso, el medio se retiró cuidadosamente y se reemplazó por una solución acuosa que contenía isopropanol al 10 % (v/v), dodecilsulfato de sodio al 5 % (p/v) y HCl 400 mM, y se incubó durante 5 min. El formazán solubilizado se cuantificó fotométricamente a 570 nM en un lector de microplacas (Spectra MAX 340 PC, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). Las células sin tratar se normalizaron a 1 y todas las muestras se refirieron al control sin tratar. La significancia se determinó mediante pruebas t de dos muestras independientes.
Resultados
[0353] La estructura polimérica, en el ejemplo un dendrímero pentamérico (pentrímero), no tiene ningún efecto citotóxico sobre las células diana, ni en ausencia ni en presencia de SA1641 (Figura 59, columnas 2 y 3). En ausencia del armazón, la toxina dirigida (diantina-EGF) muestra la mitad de la toxicidad máxima a una concentración de 0,1 nM (columna 4). En presencia de SA1641, la misma concentración da como resultado la destrucción de todas las células, lo que indica la capacidad general de SA1641 para actuar como un potenciador del escape endosomal (columna 5). La presencia de la estructura polimérica no afecta a la toxicidad de diantina-EGF ni en presencia ni en ausencia de SA1641 (columnas 6 y 7), lo que indica que el armazón no afecta a la toxicidad de diantina-EGF. Para acoplar la estructura polimérica modelo mediante química clic a la sustancia farmacéuticamente activa de ejemplo de diantina-EGF, la sustancia tenía que acoplarse antes con un grupo alquino. Como consecuencia de esta modificación, la diantina-EGF perdió algo de actividad (compárese las columnas 8 y 9 con 6 y 7, respectivamente); sin embargo, la modificación no dirigida de alquino no afecta a la idea de la invención y tampoco se requiere en aplicaciones futuras. Hubo que introducir el alquino de forma no dirigida con fines de prueba solo con el riesgo de afectar al centro farmacéuticamente activo de la toxina. Un fabricante de una sustancia farmacéuticamente activa puede introducir la posición de clic durante la síntesis directamente en la sustancia en una posición de su elección en la que la actividad de la sustancia no se vea afectada. No hubo pérdida adicional de actividad con la reacción de química clic entre la sustancia farmacéuticamente activa modificada con alquino y la estructura polimérica, lo que indica que la estructura polimérica en sí no era tóxica (columnas 10 y 11).
Ejemplo 14
Materiales
[0354] Los siguientes productos químicos se utilizaron tal como se compraron: metanol (MeOH, LiChrosolv, Merck), hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico (EMCH, 95 %, TCI Chemicals), ácido trifluoroacético (TFA, 99,8 %, Carl Roth), 2-mercaptoetanol ( 98 %, Sigma-Aldrich), poli(amidoamina) (dendrímero PAMAM, núcleo de etilendiamina, solución de generación 5.0, Sigma-Aldrich), cianina 3 ácido carboxílico (Cy3-COOH, 95 %, Lumiprobe), 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazol[4,5-b]piridinio hexafluorofosfato 3-óxido, N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]piridina-1-ilmetilen]-N-metilmetanaminio hexafluorofosfato N-óxido (HATU, 97 %, Sigma-Aldrich), fracción V de albúmina sérica bovina (BSA, Carl Roth), dimetilsulfóxido (DMSO, 99 %, Carl Roth), clorhidrato de 2-iminotiolano (98 %, Sigma-Aldrich), rodamina b (RhodB, 95 %, Merck), solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS, Gibco), ácido clorhídrico (HCl, 37 %, Merck), NHS-PEG13-DBCO (Click Chemistry Tools), Alexa Fluor 488 5-t Fp (Thermo-Fischer), azido-PEG3-SS-NHS (Conju-Probe), cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3, 95 %, Sigma-Aldrich), persulfato de amonio (APS, 98 %, Sigma-Aldrich), N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TMEDA, 99 %, Sigma-Aldrich), péptido personalizado SESDDAMFCDAMDESDSK (95 % , PeptideSynthetics), azido-dPEG12-NHS (95 %, Quanta Biodesign), dendrón PFd-G4-Azida-NH-BOC (4G-dendrón, 95 %, Polymer Factory), Cianina5-DBCO (Cy5-DBCO, 95 %, Lumiprobe), Cloroformo (CHCh, 99,5 %, Sigma), filtros centrífugos Amicon Ultra de 0,5 ml (mWCo de 3 kDa, Sigma), mPEG-SCM (mPEG2k-NHS, 95,6 %, Creative PEG Works), filtros centrífugos Amicon Ultra de 15 ml (MWCO de 10 kDa, Sigma).
Métodos
MALDI-TOF-MS
[0355] Se registraron espectros MALDI-TOF en un espectrómetro de masas MALDI (Bruker Ultrafex III). Por lo general, la muestra disuelta en agua MilliQ en un rango nanomolar a micromolar se depositó en la diana (MTP 384 placa de acero pulido TF, Bruker Daltons) usando super-DHB (99 %, Fluka) o ácido sinapínico (SA, 99 %, Sigma-Aldrich) como matriz disuelta en acetonitrilo (evaluado por MADLI-TOF-MS, Sigma)/TFA al 0,1 % (7:3 v/v) mediante el método de gotas secas. PepMix (estándar de calibración de péptidos, Bruker Daltons) o ProteMass (estándar de calibración de proteínas, Sigma-Aldrich) sirvieron como estándares de calibración. El modo RP se refiere al modo reflector positivo. El modo RN se refiere al modo reflector negativo. El modo LP se refiere al modo lineal positivo.
H-RMN
[0356] El análisis de RMN de H1 se realizó usando un espectrómetro de RMN Bruker de 400 MHz. La preparación de la muestra, en la que se habían disuelto 2 mg de muestra en 0,8 ml de metanol-Ü4 (99 %, Deutero), se realizó 24 h antes de la medición.
UV-Vis
[0357] Las mediciones de UV-Vis se realizaron en un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 en el rango espectral de 200-750 nM.
Cromatografía de exclusión por tamaño
[0358] La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se realizó con Sephadex G 25 Superfine de GE Healthcare y en columnas PD10 preempaquetadas (GE Healthcare, Sephadex G 25 M). El material se activó mediante hinchamiento en el eluyente respectivo antes de realizar la cromatografía.
Diálisis
[0359] Se utilizaron membranas de celulosa regenerada: MWCO = 1 y 2 kDa (Spectra/Por) y MWCO = 12-14 kDa (Carl Roth) para realizar la diálisis. Normalmente, la diálisis se realizó durante 24 h con 1 L de disolvente, que se cambió después de las primeras 6 h del proceso.
Liofilización
[0360] La liofilización se realizó en un Alpha 1-2 LD plus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH). Normalmente, las muestras se congelaron con nitrógeno líquido y se colocaron en el liofilizador a alto vacío. Síntesis de S01861-EMCH
[0361] Se colocaron SO1861 de Saponaria officinalis L (59 mg, 31,7 pMol) y EMCH (301 mg, 888 pMol) en un matraz redondo con agitador y se disolvieron en 13 ml de metanol. Se añadió TFA (400 |_il, cat.) a la solución y la mezcla de reacción se agitó durante 3 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un agitador magnético RCT B (IKA Labortechnik). Después de agitación durante 3 h, la mezcla se diluyó con agua MilliQ o PBS y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ o PBS utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (Spectra/Por 7) con un MWCO de 1 kDa. Después de la diálisis, la solución se liofilizó para obtener un polvo blanco. Rendimiento 62,4 mg (95 %). Las alícuotas secas se utilizaron adicionalmente para la caracterización mediante RMN de 1H y MALDI-TOF-MS.
[0362] RMN de 1H (400 MHz, metanol-Ü4) (Figura 60 A, SO1861): 5 = 0,50-5,50 (m, triterpenoide de saponina y protones del esqueleto de azúcar), 9,43 (1H, s, protón de aldehído de saponina, Ha).
[0363] RMN de 1H (400 MHz, metanol-Ü4) (Figura 60 B. SO1861-EMCH, tratratamiento del crudo de reacción con PBS): 5 = 0,50-5,50 (m, triterpenoide de saponina y protones del esqueleto de azúcar), 6,79 (2 H, s, protones de maleimida, HC), 7,62-7,68 (1 H, m, protón de hidrazona, HB).
[0364] MALDI-TOF-MS (modo RP) (Figura 61 A): m/z 2124 Da ([M K]+, saponina-EMCH), m/z 2109 Da ([M K] , SO1861-EMCH), m/z 2094 Da ([M Na]+, SO1861-EMCH)
[0365] MALDI-TOF-MS (modo RN): m/z2275 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2244 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2222 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2178 Da ([M-H]-, conjugado saponina-EMCH), 2144 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2122 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2092 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2070 Da ([M-H]-, SO1861-EMCH), 2038 Da ([M-H]-, SO1832-EMCH), 1936 Da ([M-H]', SO1730-EMCH), 1861 Da ([M-H]', SO1861).
SO1861 -EMCH-mercaptoetanol
[0366] A SO1861-EMCH (0,1 mg, 48 nMol) se añadieron 200 |_il de mercaptoetanol (18 mg, 230 pMol) y la solución se agitó durante 1 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 1 h, la solución se diluyó con metanol y se dializó extensamente durante 4 h con metanol utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (Spectra/Por 7) con un MWCO de 1 kDa. Después de la diálisis, se extrajo una alícuota y se analizó mediante MALDI-TOF-MS.
[0367] MALDI-TOF-MS (Figura 61B) (modo RP): mlz 2193 Da ([M K]+, SO1861-EMCH-mercaptoetanol), m/z 2185 Da ([M K]+, SO1861-EMCH-mercaptoetanol), m/z 2170 Da ([M Na]+, SO1861-EMCH-mercaptoetanol).
Síntesis de BSA-SO1861
[0368] Se añadió 2-iminotiolano (231 pg, 1,1 pMol) disuelto en 47 pL de PBS a una solución de BSA-RhodB (10 mg, 0,15 pMol) en 200 pL de PBS y la mezcla se agitó durante 40 min a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 40 min, la mezcla de reacción se pasó inmediatamente a través de una columna de exclusión de tamaño superfino Sephadex G25 (volumen de columna de 16 ml) y se añadió SO1861-EMCH (1 mg, 0,5 pMol) disuelto en 100 pL de PBS a la fracción de BSA-SH recogida. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, el BSA-SO1861 se concentró mediante filtración centrífuga a 4 000 r.p.m (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: no determinado.
[0369] MALDI-TOF-MS (Figura 69 A) (modo LP): miz 74.2 kDa ([M H]+, BSA-SO1861 con 4 SO1861 unidas), 72,2 kDa ([M H]+, BSA-SO1861 con 3 SO1861 unidas), 70,2 kDa ([M H]+, BSA-SO1861 con 2 SO1861 unidas), 37,0 kDa ([M H]2+, BSA-SO1861 con 4 SO1861 unidas), 35,9 kDa ([M H]2+, BSA-SO1861 con 3 SO1861 unidas), 34,7 kDa ([M H]2+, BSA-SO1861 con 2 SO1861 unidas).
Cy3-PAMAM
[0370] Se colocaron pL 720 de PAMAM disuelta en metanol (30 mg, 1,04 pMoL) en un matraz redondo de 250 ml y se extrajo el metanol mediante un evaporador rotatorio (20 mbar, 60 °C). La PAMAM restante se disolvió en 9 ml de DMSO. Se añadió HATU (7,6 mg, 20 pMol) disuelto en 0,5 ml de Dm SO a una solución de Cy3-COOH (0,6 mg, 1,2 pMol) en DMSO y la mezcla se agitó durante 1 h a 800 r.p.m a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf ). Después de la agitación durante 1 h, se añadió la solución de HATU-Cy3 a la solución de PAMAM en agitación y la mezcla de reacción se agitó durante 12 h a temperatura ambiente. Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (SpectraiPor 6) con un MWCO de 2 kDa. Después de la diálisis, el volumen de la solución de conjugado se redujo mediante un evaporador rotatorio (20 mbar, 60 °C) y la solución de conjugado concentrada se pasó a través de una columna de exclusión de tamaño superfino Sephadex G25 (volumen de columna de 16 ml). La primera fracción se recogió y liofilizó para obtener el conjugado rosa viscoso PAMAM-Cy3. La formación del conjugado PAMAM-Cy3 se confirmó mediante cromatografía en capa fina (metanollagua, viv 1: 1) y la aparición de una banda más rápida en una columna superfina Sephadex G 25. Rendimiento 21,3 mg (63 %). La relación molar de colorante por PAMAM determinada por espectrofotometría UV-Vis fue de 0,43.
[0371] MALDI-TOF-MS (Figura 71 A) (modo LP): miz 28,0 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM).
Síntesis Cy3-PAMAM-SO1861
[0372] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Cy3-PAMAM-(SO1861)5. Se añadió 2-iminotiolano (1 mg, 6,7 pMol) disuelto en 250 pL de agua MilliQ a una solución de PAMAM-Cy3 (0,5 mg, 17 nMol) en 125 pL de agua MilliQ y la mezcla se agitó durante 40 min a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 40 min, la mezcla de reacción se pasó inmediatamente por una columna de exclusión de tamaño superfino Sephadex G25 (volumen de columna de 16 ml) y se añadió SO1861-EMCH (176 pg, 85 nMol) disuelto en 40 pL de agua MilliQ a la fracción de Cy3-PAMAM-SH recogida. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución Cy3-PAMAM-SO1861 se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m (15 °C) a través de filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,5 mg (75 %).
[0373] Los espectros MALDI-TOF-MS se ilustran en las Figuras 71 B-D y la Figura 72. MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-(SO1861)6 (Figura 71 B) (modo LP): miz 38,4 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-SO1861), 17,9 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-SO1861).
[0374] La síntesis de Cy3-PAMAM-(SO1861)5, Cy3-PAMAM-(SO1861)13, Cy3-PAMAM-(SO1861)51y Cy3-PAMAM-(SO1861)27, se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en los equivalentes de los materiales de partida 2-iminotiolano y SO1861-EMCH. Los respectivos equivalentes de los materiales de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 15.
Tabla 15. Parámetro de reacción para la síntesis de C 3-PAMAM-SO1861.
de Masa del
61- conjugado S
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y3- mediante p
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Figure imgf000116_0001
Síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861
[0375] Cy3-PAMAM (0,5 mg, 18 nMol), SO1861 (2,3 mg, 1,24 pMol) y HATU (64,6 mg, 170 pMol) se disolvieron por separado en 200 pL de DMSO. Las soluciones de SO1861 y HATU se mezclaron y agitaron durante 20 min a 800 r.p.m y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 20 min, se añadió solución Cy3-PAMAM a la solución SO1861-HATU en agitación y se dejó agitar la mezcla de reacción durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 se concentró usando filtración centrífuga a 4 000 r.p.m (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado de Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17 se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,77 mg (69 %).
[0376] MALDI-TOF-MS (Figura 73) (modo LP): miz 62.3 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861), 35,7 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861).
Marcado con colorante y desprotección de 4G-dendrón
[0377] Se colocó PFd-G4-Azida-NH-BOC (4G-dendrón) (9,75 mg, 2,11 pMol) en un tubo de reacción de 2 ml (Eppendorf) y se disolvió en 200 pL de DMSO. Se añadieron 100 pL de una solución de Cy5-DBCO en DMSO (1,72 pMol * ml-1, 170 nMol) a la solución de 4G-dendrón (dendrón de 4a generación) y la mezcla se agitó durante 12 horas a temperatura ambiente y 800 r.p.m en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (SpectraiPor 7) con un MWCO de 1 kDa. Después de la diálisis, la solución se liofilizó para obtener un polvo azul. El producto crudo se usó tal como se obtuvo por liofilización para el paso de desprotección.
[0378] Se disolvió 4G-dendrón liofilizado parcialmente marcado con Cy5 en 12 ml de CHCh en matraz redondo de 50 ml con agitador. Se añadieron 12 ml de TFA y la mezcla de reacción se agitó durante 3 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un agitador magnético RCT B (IKA Labortechnik). Después de la agitación durante 3 h, se extrajo el disolvente a presión reducida (50 °C, 30 mbar) en un evaporador rotatorio (Heidolph WB 2000). Después de la evaporación, el lote se disolvió en agua MilliQ y se pasó a través de una columna de exclusión por tamaño PD10. La formación del conjugado 4G-dendrón se confirmó mediante cromatografía en capa fina (metanoliagua, viv 1: 1) y la aparición de una banda más rápida en una columna PD10. La fracción obtenida de la cromatografía de exclusión por tamaño se liofilizó para obtener un polvo azul.
[0379] Rendimiento 5,7 mg (93 %). La relación molar de colorante por Dendrón G4 determinada por espectrofotometría UV-Vis fue de 0,012.
[0380] MALDI-TOF-MS (modo RP): miz 3956 Da ([M Na]+, Cy5-4G-dendrón PF6-contraión), 3820 Da ([M Na]+, Cy5-4G-dendrón-PF6'contraión), 3617 Da ([M H]+, Impureza 4G-dendrón), 3017 ([M H]+, 4G-dendrón). Síntesis de 4G-dendrón-SO1861
[0381] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para la relación más baja de 4G-dendrón a SO1861-EMCH. Se añadió 2-iminotiolano (2,65 mg, 19,2 pMol) disuelto en 300 pL de agua MilliQ a una solución de dendrón G4 parcialmente marcada con Cy5 (0,577 mg, 192 nMol) en 252 pL de agua MilliQ y la mezcla se agitó durante 40 min a 800 r.p.m. y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 40 min, la mezcla de reacción se pasó inmediatamente a través de una columna de exclusión por tamaño PD10 y se añadió SO1861-EMCH (1,19 mg, 575 nMol) disuelto en 100 pL de agua MilliQ a la fracción de 4G-dendrón-SH recogida. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se concentró mediante filtración centrífuga usando filtros centrífugos Amicon Ultra (MWCO de 3 kDa). El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 90 nMol (47 %).
[0382] Los espectros MALDI-TOF-MS se ilustran en la Figura 87. MALDI-TOF-MS de 4G-dendrón-SO1861 (Figura 87 C) (modo LP): miz 10,19 kDa ([M H]+, Cy5-4G-dendrón-[SO1861]s), 9,27 kDa ([M H]+, 4G-dendrón-[SO1861]s), 7,92 kDa ([M H]+, Cy5-4G-dendrón-[SO1861]2), 7,14 kDa ([M H]+, 4G-dendrón-[SO1861]2), 5,86 kDa ([M H]+, Cy5-4G-dendrón-[SO1861]1), 5,07 kDa ([M H]+, 4G-dendrón-[SO1861]1).
[0383] La síntesis de otros conjugados de 4G-dendrón-(SO1861)n se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en los equivalentes del material de partida SO1861-EMCH. Los respectivos equivalentes de los materiales de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 16.
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Tiolación de PAMAM
[0384] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para la relación más alta de PAMAM a 2-iminotiolano. A una solución de PAMAM (333 pg, 12,8 nMol) disuelta en 30 pL de metanol se añadió 2-iminotiolano (0,53 mg, 3,84 pMol) disuelto en 128 pL de agua MilliQ. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se lavó 4 veces con agua MilliQ mediante filtración centrífuga usando filtros centrífugos Amicon Ultra (MWCO de 3 kDa) a 15 °C y 13500 r.p.m. Después del lavado, la muestra se liofilizó para obtener un sólido blanco. No se determinó el rendimiento.
[0385] Los espectros MALDI-TOF-MS se ilustran en la Figura 89. MALDI-TOF-MS de PAMAM-(SH)108 (Figura 89 E) (modo LP): miz 41.5 kDa ([M H]+, PAMAM-[SH]10s).
[0386] La síntesis de otros conjugados de PAMAM-iminotiolano se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en los equivalentes del material de partida 2-iminotiolano. Para la reacción de partida de 2-iminotiolano más baja, se utilizó Cy3-PAMAM.
[0387] Los respectivos equivalentes de los materiales de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 17.
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PEGilación de PAMAM
[0388] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para la relación más baja de PAMAM a mPEG2k. A una solución de PAMAM (333 pg, 12,8 nMol) disuelta en 10 pL de DMSO se añadió mPEG2k-NHS (0,268 mg, 128 nMol) disuelto en 13 pL de DMSO. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (SpectraiPor 6) con un MWCO de 2 kDa. Después de la diálisis, el lote se concentró mediante filtración centrífuga usando filtros centrífugos Amicon Ultra de 15 ml (MWCO de 10 kDa). El lote concentrado se pasó a través de una columna de exclusión por tamaño PD10 seguido de liofilización para obtener un polvo esponjoso blanco. No se determinó el rendimiento.
[0389] Los espectros MALDI-TOF-MS se ilustran en la Figura 90. MALDI-TOF-MS de PAMAM-(mPEG2k)3 (Figura 90 C) (modo LP): miz 33.46 kDa ([M H]+, PAMAM-[mPEG2k]3).
[0390] La síntesis de otros conjugados de PAMAM-mPEG2k se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en los equivalentes del material de partida mPEG2k-NHS. Los respectivos equivalentes de los materiales de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 18.
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Síntesis de Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO
[0391] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)i0. Cy3-PAMAM-(S0l861)27 (0.41 mg, 4,71 nMol) se liofilizó y se disolvió en 100 pL de DMSO. Se añadió éster de DBCO-PEG13-NHS (0,197 mg, 188 nMol) disuelto en DMSO a la solución de Cy3-PAMAM-SO1861 y la mezcla se agitó a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 3 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,1 mg (22 %).
[0392] MALDI-TOF-MS (Figura 74 D) (modo LP): miz 92.5 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO), 53,0 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-S01861-DBCO).
[0393] La síntesis de Cy3-PAMAM-(SO1861)5-(DBCO)38 y Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)10 se realizó mediante la metodología descrita anteriormente. Los respectivos equivalentes del material de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 19.
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Síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO
[0394] Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17 (0,3 mg, 4,8 nMol) se liofilizó y se disolvió en 100 pL de DMSO. Se añadió éster de DBCO-PEG13-NHS (0,202 mg, 194 nMol) disuelto en DMSO a la solución Cy3-PAMAM-NC-SO1861 y la mezcla se agitó a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 3 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-S01861-DBCO se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,1 mg (22 %). La espectrometría de masas indica la conjugación de 30 restos de DBCO por molécula de PAMAM. MALDI-TOF-MS (Figura 74 B) (modo LP): miz 93.2 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO), 49,6 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO).
Expresión de EGFdiantina y diantina
[0395] Se transformó ADN plasmídico (His-diantina-EGF-pET11d o His-diantina-pET11d) [20] en Escherichia coli NiCo21 (DE3) químicamente competente (New England Biolabs®, Inc.) y se cultivó en 3 ml de caldo de lisogenia complementado con 50 pgiml de ampicilina a 37 °C durante 5 h a 200 r.p.m. Estas bacterias se usaron para inocular 500 ml de caldo de lisogenia suplementado con 50 jg/ml de ampicilina para cultivarlo durante la noche a 37 °C. Posteriormente, el volumen del cultivo se aumentó hasta 2 L y las bacterias se cultivaron hasta una densidad óptica (A600) de 0,9. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM. Las células se cultivaron adicionalmente durante 3 horas a 37 °C y 200 r.p.m. Después de la centrifugación (5 min, 5000 g, 4 °C), los sedimentos celulares se resuspendieron en 20 ml de solución salina tamponada con fosfato (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) con Ca2+ y mg2+, pH 7,4) y se almacenaron a -20 °C. Después de la descongelación, las proteínas se liberaron mediante un dispositivo de ultrasonido (Branson Sonifier 250, G. Heinemann). La solución se centrifugó (15800 x g, 30 min, 4 °C) y se ajustó a una concentración de imidazol de 20 mM. La construcción contenía una etiqueta de histidina N-terminal y se purificó mediante cromatografía en ácido nitrilotriacético de níquel (Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Alemania). Después de eluir con imidazol (20-250 mM), los eluatos se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) (12 %). Las fracciones que contenían diantina-EGF o diantina se dializaron con 2 l de tampón de dominio de unión a quitina (tris(hidroximetil)-aminometano/HCl 20 mM, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,1 %, pH 8,0) a 4 °C. La purificación adicional mediante cromatografía de afinidad en columna de quitina sirvió para eliminar proteínas bacterianas con actividad de unión a agarosa Ni-NTA. Después de la elución con tampón de dominio de unión a quitina, las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE (12 %). Las fracciones que contenían diantina-EGF o diantina se dializaron con 5 L de PBS a 4 °C. Las proteínas purificadas se concentraron mediante dispositivos de filtro centrífugo Amicon (10 kDa, Millipore, Eschborn, Alemania). La concentración de proteína se determinó mediante un ensayo de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, EE. UU.).
Síntesis de Diantina-EGF-Alexa488
[0396] Se colocó una solución de diantina-EGF (240 jg , 6,7 nMol) en PBS en un filtro Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa y se centrifugó tres veces a 4000 r.p.m y 4 °C durante 30 min. Después de cada ciclo, el filtro Amicon se volvió a llenar con tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9. Después del tercer ciclo de centrifugación, el volumen se redujo a 0,5 ml mediante centrifugación. La solución de carbonato de sodio de diantina-EGF se colocó en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió Alexa Fluor ™ 4885-TFP (50 jg, 56 nMol) disuelto en 10 j l de DMSO a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 80 min. Después de la agitación, la mezcla se pasó a través de una columna de exclusión de tamaño Sephadex G25 M (GE Healthcare, columna PD10). El conjugado diantina-EGF-Alexa488 se almacenó en solución en tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9 en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 210 jg (85 %).
[0397] MALDI-TOF-MS (Figura 75 D) (modo LP): m/z 36.8 kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488), m/z 33.6 kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488), 18,8 kDa ([M H]2+, diantina-EGF-Alexa488), 16,6 kDa ([M H]2+, diantina-EGF-Alexa488).
Síntesis de Diantina-Alexa488
[0398] Se colocó una solución de diantina (184 jg, 6,2 nMol) en PBS en un filtro Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa y se centrifugó tres veces a 4000 r.p.m y 4 °C durante 30 min. Después de cada ciclo, el filtro Amicon se volvió a llenar con tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9. Después del tercer ciclo de centrifugación, el volumen se redujo a 0,5 ml mediante centrifugación. La solución de carbonato sódico y diantina se colocó en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió Alexa Fluor ™ 4885-TFP (16,7 jg, 19 nMol) disuelto en 3,5 j l de DMSO a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 80 min. Después de la agitación, la mezcla se pasó a través de una columna de exclusión de tamaño Sephadex G25 M (GE Healthcare, columna PD 10). El conjugado de diantina-Alexa488 se almacenó en solución en tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9 en el frigorífico y se tomaron alícuotas para análisis. Rendimiento: no determinado MALDI-TOF-MS (Figura 76 D) (modo LP): m/z 30.7 kDa ([M H]+, Diantina-Alexa488).
Síntesis de diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3 y diantina-EGF-Alexa488-PEGi2-n3
[0399] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3. Se colocó una solución de carbonato de sodio de Diantina-EGF-Alexa488 (70 jg , 1,9 nMol) en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió azido-PEG3-S-S-NHS (120 jg, 272 nMol) disuelto en 9 jL de DMSO a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 r.p.m y 15 °C en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 12 h. Después de la agitación, la mezcla de reacción se diluyó con PBS y se lavó con PBS mediante filtración centrífuga a 4000 r.p.m y 4 °C usando un filtro Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa.
[0400] Rendimiento: 54 jg (70 %).
[0401] MALDI-TOF-MS (Figura 75 E) (modo LP): m/z 40,8 kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3), m/z 37,5 kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3).
[0402] La síntesis de diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3 y diantina-EGF-Alexa488-PEGi2-n3 se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en la porción conectora azido-PEG utilizada. La respectiva porción conectora azido-PEG, sus equivalentes de adición y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 20.
Tabla 20. Parámetros de reacción ara la síntesis de diantina-EGF-Alexa488-PEG-N3
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Diantina-Alexa488-S-S-PEG-N3
[0403] Se colocó una solución de carbonato de sodio de Diantina-Alexa488 (24,5 pg, 0,8 nMol) en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió azido-PEG3-S-S-NHS (34 pg, 78 nMol) disuelto en 9 pL de DMSO a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 r.p.m y 15 °C en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 12 h. Después de la agitación, la mezcla de reacción se diluyó con PBS y se lavó con PBS mediante filtración centrífuga a 4000 r.p.m y 4 °C usando un filtro Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa.
[0404] Rendimiento: 10,3 pg (39 %).
[0405] MALDI-TOF-MS (Figura 76 E) (modo LP): miz 32.9 kDa ([M H]+, Diantina-Alexa488-S-S-PEG-N3).
Síntesis del conjugado Cy3-PAMAM-Saponina-Toxina
[0406] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO. Se mezcló una solución de Cy3-PAMAM-(S01861)27-DBCO (17 pg, 0,184 nMol) en agua MilliQ con una solución de diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG3-N3 (3,6 pg, 0,089 nMol) en PBS en un tubo de reacción de 1,5 ml y la mezcla de reacción se agitó a 800 r.p.m y 15 °C en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 2 h. Después de la agitación, se tomaron pequeñas alícuotas para analizarlas mediante SDS-PAGE y obtener imágenes de fluorescencia en un sistema de imágenes Molecular Imager® VersaDoc ™ MP 4000 (Bio-Rad) (Figura 77).
[0407] La síntesis de Cy3-PAMAM-(SO1861)5-S-S-Diantina-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-(SO1861)27-S-S-Diantina-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)1/-S-S-Diantina-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-S-S-Diantina-Alexa488 y Cy3-PAMAM-NC-(So1861)17-Diantina-EGF-Alexa488 se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en el lote de PAMAM-saponina-DBCO usado, el lote de toxina azido usada y sus equivalentes de adición. Los respectivos equivalentes de los materiales de partida se destacan en la Tabla 21.
Tabla 21. Parámetros de reacción para la síntesis de Cy3-PAMAM-saponina-toxina.
Lote de PAMAM- Equivalentes de Lote de toxina Equivalentes Conjugado saponina-DBCO utilizado adición de PAMAM- azido utilizado de adición de resultante saponina-DBCO toxina azido
Cy3-PAMAM-(SO1861)5- 3 Diantina-E 1 Cy3-PAMAM-(DBCO)38 Alexa488- (SO1861)5-S-S-PEG3-n3 Diantina-EGF-Alexa488 Cy3-PAMAM-(SO1861 )27- 2,1 Diantina-E 1 Cy3-PAMAM-(DBCO)10 Alexa488- (SO1861)27-S-S-PEG3-n3 Diantina-EGF-Alexa488 Cy3-PAMAM-NC- 2,3 Diantina-E 1 Cy3-PAMAM-(SO1861)17-(DBCO)30 Alexa488- NC-(SO1861)17-PEG3-n3 S-S-Diantina-EGF-Alexa488 Cy3-PAMAM-NC- 7,1 Diantina- 1 Cy3-PAMAM-(SO1861)17-(DBCO)30 Alexa488- NC-(SO1861)17-PEG3-n3 S-S-Diantina-
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Alexa488 Cy3-PAMAM-NC- 2,3 Diantina-E - 1 Cy3-PAMAM-(SO1861)17-(DBCO)30 Alexa488-PEG12- NC-(SO1861)17
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Síntesis de Cy3-PAMAM-NC-S01861 mediante aminación reductora
[0408] Cy3-PAMAM (0,19 mg, 13 nMol) y SO1861 (0,73 mg, 0,39 pMol) se disolvieron por separado en 200 pL de tampón de acetato 0,1 M a pH 5. Las soluciones de SO1861 y Cy3-PAMAM se mezclaron y agitaron durante 20 min a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 20 min, se añadió NaCNBH3 (5 mg, 81 pMol) a la solución de reacción con agitación y la mezcla de reacción se dejó agitar durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: no determinado [0409] MALDI-TOF-MS (Figura 78 B, C) (modo LP): miz 88,7 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861), 49,2 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861).
[0410] La síntesis de Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)30 y Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)10, se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en el tiempo después del cual el agente reductor NaCNBH3 se añadió al lote de reacción. El momento de la adición de NaCNBH3 y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 22.
Tabla 22. Parámetros de reacción de síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 mediante aminación reductora.
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Síntesis de poli(SO1861)
[0411] Se disolvió SO1861-EMCH (0,13 mg, 63 nMol) en 30 pl de agua MilliQ desgasificada. Se añadió APS (0,2 pg, 0,8 nMol) disuelto en 4 pl de agua MilliQ desgasificada a la solución de SO1861-EMCH y la solución se colocó en un ThermoMixer C (Eppendorf) a 60°C. Luego, se añadió TMEDA (cat., 0,5 pl) a la mezcla y la mezcla se agitó a 800 r.p.m y 60 °C en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 2 h. Después de 2 h, se extrajo una pequeña alícuota para su análisis mediante espectrometría de masas.
[0412] MALDI-TOF-MS (Figura 80 C) (modo LP): miz 18.2 kDa ([M H]+, poli(SO1861)g), 16,0 kDa ([M H]+, poli(SO1861)s), 14,2 kDa ([M H]+, poli(SO1861)/), 12,2 kDa ([M H]+, poli(SO1861)a), 10,2 kDa ([M H]+, poli(SO1861)5), 8,2 kDa ([M H] , poli(SO1861)4), 6,2 kDa ([M H]+, poli(SO1861)3).
Acoplamiento de péptidos y SO1861-EMCH
[0413] El péptido personalizado con la secuencia SESDDAMFCDAMDESDSK (0,6 mg, 0,3 pMol) y SO1861-EMCH (0,8 mg, 0,39 pMol) se disolvieron por separado en 200 pl de PBS. Las soluciones de SO1861-EMCH y de péptidos se mezclaron y agitaron durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación, se extrajeron pequeñas alícuotas para su análisis. Rendimiento: no determinado MALDI-TOF-MS (Figura 83 B) (modo RN): miz 4.05 kDa ([M H]-, péptido-SO1861), 3,92 kDa ([M H]-, péptido-SO1730), 1,98 kDa ([M H]-, péptido), 1,86 kDa ([M H]-, SO1861).
Ensayo de viabilidad celular
[0414] Después del tratamiento, las células se incubaron durante 72 horas a 37 °C antes de que se determinara la viabilidad celular mediante un ensayo MTS, realizado según las instrucciones del fabricante (ensayo de proliferación celular CellTiter 96® AQueous One Solution, Promega). Brevemente, la solución de MTS se diluyó 20x en DMEM sin rojo de fenol (PAN-Biotech GmbH) suplementado con FBS al 10 % (PAN-Biotech GmbH). Las células se lavaron una vez con 200 pl de PBS por pocillo, después de lo cual se añadieron 100 pl de solución de MTS diluida por pocillo. La placa se incubó durante aproximadamente 20-30 minutos a 37 °C. Posteriormente, se midió la densidad óptica a 492 nM en un lector de placas Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo Scientific). Para la cuantificación, la señal de fondo de los pocillos de “solo medio'' se restó de todos los demás pocillos antes de calcular la proporción de células sin tratar/tratadas, dividiendo la señal de fondo corregida de los pocilios no tratados por la señal de fondo corregida de los pocillos tratados.
Análisis FACS
[0415] Se sembraron células HeLa en DMEM (PAN-Biotech GmbH) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (PAN-Biotech GmbH) y penicilina/estreptomicina al 1 % (PAN-Biotech GmbH), a 500000 c/placa en placas de 10 cm y se incubaron durante 48 horas (5 % CO2, 37 °C), hasta alcanzar una confluencia del 90 %. A continuación, las células se tripsinizaron (TryplE Express, Gibco Thermo Scientific) en células individuales. 0,75 x 106 células se transfirieron a un tubo Falcon de 15 ml y se centrifugaron (1400 r.p.m, 3 min). El sobrenadante se descartó dejando sumergido el sedimento celular. El sedimento se disoció golpeando suavemente el tubo Falcon en un agitador de vórtice y las células se lavaron con 4 ml de PBS frío (sin mg2+ y Ca2+, 2 % FBS). Después de lavar, las células se resuspendieron en 3 ml de PBS frío (sin mg2+ y Ca2+, FBS al 2 %) y dividido en partes iguales en 3 tubos FACS de fondo redondo (1 ml/tubo). Las células se centrifugaron de nuevo y se resuspendieron en 200 pL de PBS frío (Mg2+ y Ca2+ libre, FBS al 2 %) o 200 pl de solución de anticuerpo; que contiene 5 pL de anticuerpo en 195 pL de PBS frío (sin mg2+ y Ca2+, 2 % FbS). Se usó IgG1 de ratón APC, K Isotype Ctrl FC (n. ° 400122, Biolegend) como control de isotipo, y se usó APC anti-EGFR humano (n. ° 352906, Biolegend) para teñir el receptor de Eg Fr , HER2: APC anti-CD340 humano (erbB2/HER-2) (324408, Biolegend). CD71: APC anti-CD71 humano # 334108, Biolegend. Las muestras se incubaron durante 30 min a 4 °C en un mezclador de tubo de rodillo. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con PBS frío (sin mg2+ y Ca2+, FBS al 2 %) y se fijaron durante 20 min a temperatura ambiente utilizando una solución de PFA al 2 % en PBS. Las células se lavaron 2 veces con PBS frío y se resuspendieron en 250-350 pl de PBS frío para el análisis FACS. Las muestras se analizaron con un sistema de citometría de flujo BD FACSCanto Il (BD Biosciences) y el software FlowJo.
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Resultados
[0416] Teniendo en cuenta los grupos químicos disponibles para las reacciones de conjugación con la molécula SO1861, se han identificado cuatro grupos químicos: los alcoholes y dioles de los residuos de azúcar, el grupo aldehído del esqueleto triterpenoide, el ácido carboxílico de uno de los residuos de azúcar (ácido glucurónico) y el grupo alqueno del esqueleto triterpenoide, como se destaca en la Figura 62.
[0417] En vista de los pros y los contras de cada grupo químico identificado (Tabla 24), los grupos aldehído y alcohol son los más adecuados para reacciones de conjugación reversibles, mientras que el alqueno y el ácido carboxílico (ácido glucurónico) son los grupos más adecuados para reacciones de conjugación irreversibles/estables. El grupo aldehído dentro de la estructura de la molécula de SO1861, sin embargo, es el más adecuado para reacciones de conjugación reversibles, en comparación con los alcoholes. Por un lado, porque solo hay un aldehído presente en la estructura que permite reacciones quimioselectivas. Por otro lado, debido a que el aldehído puede realizar reacciones de conjugación reversibles con una variedad de grupos químicos tales como aminas, hidrazidas e hidroxilaminas, formando restos que se pueden escindir con ácidos como iminas, hidrazonas y oximas. Este factor permite una libertad de elección sobre el grupo químico para la reacción de conjugación reversible deseada. Por el contrario, los alcoholes son buenos candidatos para la reacción de conjugación reversible a través de la formación de acetales y cetales, pero carecen de quimioselectividad, ya que están presentes en una gran cantidad en la estructura glicosídica.
[0418] Para la formación de un enlace irreversible y estable, el ácido carboxílico es el más adecuado, ya que puede formar amidas y ésteres con las herramientas habituales utilizadas en la química de péptidos (por ejemplo, reacción con aminas mediante la formación de amidas mediadas por carbodiimidas).
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[0419] Así, para el desarrollo de una saponina potenciadora del escape endosomal (como SO1861) se ha establecido una metodología que permite la generación de saponinas no escindibles y escindibles 'listas para conjugar' (Figura 63) utilizando los grupos químicos más adecuados presentes en SO1861.
[0420] Para producir saponinas no escindibles "listas para conjugar", el grupo carboxílico de SO1861 se activa mediante un reactivo utilizado en la química de acoplamiento de péptidos para generar un éster activo (por ejemplo, hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio, HATU). El éster activo resultante de SO1861 es capaz de reaccionar con aminas formando conjugados estables unidos a amida (Figura 63 A).
[0421] Para producir saponinas escindibles "listas para conjugar", el grupo aldehído de SO1861 se hace reaccionar con una porción conectora EMCH (hidrazida de ácido £-maleimidocaproico). El grupo hidrazida de EMCH forma un enlace hidrazona escindible en medio ácido con el aldehído de SO1861. Al mismo tiempo, la porción conectora EMCH presenta un grupo maleimida que es reactivo con tiol (grupo sulfhidrilo) y, por tanto, puede conjugarse con tioles (Figura 63 B).
[0422] El grupo maleimida de SO1861-EMCH realiza una reacción de adición de Michael rápida y específica con tioles y estructuras poliméricas que llevan tiol cuando se lleva a cabo en un rango de pH de 6,5 a 7,5 (Figura 63 B). Además, el enlace hidrazona sensible en medio ácido entre SO1861 y EMCH se puede utilizar para realizar la liberación de saponina desde un armazón en un ambiente ácido (Figura 64). Por tanto, la porción conectora EMCH satisface tanto la necesidad de una estrategia de escisión por pH como de una estrategia de conjugación a una estructura polimérica. Con respecto a la longitud ideal del espaciador EMCH para la conjugación a una estructura polimérica, la simulación por ordenador (PerkinElmer, ChemBio3D, Ver. 13.0.0.3015) muestra que el grupo maleimida de SO1861-EMCH está ubicado en la periferia de la molécula y, por lo tanto, debe ser accesible para estructuras polimérica que lleven tiol (Figura 65).
[0423] Para sintetizar el SO1861-EMCH, se ha desarrollado una estrategia que permite la conversión del grupo aldehído de la SO1861 a EMCH (Figura 66 A). El conjugado S01861-Em Ch se aisló y caracterizó con éxito mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear (véase la sección de materiales y métodos, Figura 60B) y espectrometría de masas con ionización con analizador de tiempo de vuelo/desorción láser asistida por matriz (mAlDI-TOF-MS) como se muestra en Figura 66 B y 66 C, y Figura 61 A.
[0424] Para evaluar la hidrólisis dependiente del pH del enlace hidrazona, se disolvió SO1861-EMCH en una solución de HCl a pH 3 y se registraron los espectros MALDI-TOF-MS en dos puntos diferentes en el tiempo (Figura 67). Como se muestra en la Figura 67 A y 67 B, una clara tendencia decreciente del pico en m/z 2070 Da que corresponde a SO1861-EMCH es visible en la Figura 67 B. Dado que la SO1861 se genera durante la hidrólisis, se registró un aumento del pico en m/z 1861 Da que acompañó la tendencia decreciente en m/z 2070 Da. Estos resultados demuestran que el enlace de hidrazona responde a la hidrólisis y se escinde incluso si está unido a SO1861.
[0425] Para conjugar SO1861-EMCH a una estructura polimérica, las aminas accesibles de la estructura polimérica se convierten en tioles con la ayuda del agente 2-iminotiolano. Los tioles libres generados sobre la estructura polimérica actúan entonces como nucleófilos para la adición de tioleno de tipo Michael al grupo maleimida de SO1861-EMCH (Figura 68). Esta metodología desarrollada es adecuada para la conjugación de SO1861-EMCH a cualquier estructura polimérica disponible que obtenga grupos amina accesibles, y permite además un control sobre el número de moléculas de SO1861 conjugadas en función de la estructura polimérica, respectivamente.
[0426] La primera prueba de concepto para la conjugación de saponinas listas para conjugar a una estructura polimérica se obtuvo mediante el uso de la amina de una proteína (ejemplo de armazón de poliaminoácidos), la albúmina de suero bovino (BSA). Después de la conjugación, con la espectrometría de masas se obtuvieron los picos correspondientes de BSA-SO1861 en m/z ~ 70, ~ 72 y ~ 74 kDa (Figura 69 A). En comparación con la masa detectada de BSA con m/z 66 kDa (Figura 69 B), las masas obtenidas de BSA-SO1861 corresponden a una mezcla de conjugados de BSA-SO1861 que consiste en 2, 3 y 4 moléculas de SO1861 por BSA.
[0427] La siguiente prueba de concepto para la conjugación de 'saponinas listas para conjugar' a una estructura polimérica se obtuvo mediante el uso del dendrímero poli(amidoamina) de 5a generación (G5) que lleva amina (PAMAM con colorante rojo fluorescente acoplado covalentemente (Cy3)). Se utilizó PAMAM-Cy3 como estructura polimérica para la conjugación tanto con SO1861-EMCH como con SO1861-HATU y sirvió como modelo para la conjugación de S01861 con una estructura polimérica (Figura 70).
[0428] Todos los grupos amina accesibles de Cy3-PAMAM se convirtieron en tioles usando un exceso de 3 veces de 2-iminotiolano por aminas Cy3-PAMAM seguido de la reacción con SO1861-EMCH. Se utilizaron tres equivalentes de adición diferentes (5, 20 y 57) de SO1861-EMCH para los tres lotes de reacción. Después de la reacción, las masas registradas de los conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 en MALDI-TOF-MS muestran un incremento de las masas correspondientes al aumentar la cantidad añadida de SO1861-EMCH (Figura 71). Las tres cantidades de adición diferentes correspondieron a una masa obtenida de m/z 38,4 kDa, m/z 53,9 kDa y m/z 133,8 kDa para los conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 que corresponden a 6, 13 y 51 moléculas de SO1861 unidas por dendrímero PAMAM, como se muestra en la Figura 71 B-D.
[0429] En otra reacción, solo un cierto número de aminas PAMAM se convirtieron en tioles antes de la reacción con SO1861-EMCH. En este documento, se utilizaron dos equivalentes de adición diferentes de 2-iminotiolano (8 y 32) y dos equivalentes de adición diferentes de SO1861-EMCH (5 y 30), respectivamente. Después de la reacción, los espectros respectivos de los conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 en MALDI-TOF-MS muestran picos en m/z 37,7 kDa (5 equivalentes de adición de SO1861-EMCH) y en m/z 87,0 kDa (30 equivalentes de adición de SO1861-EMCH) como se muestra en la Figura 72. Las masas obtenidas en m/z 37,7 kDa y m/z 87,0 kDa corresponden a conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 con 5 y 30 moléculas de SO1861 unidas, y demuestran que con este método se conjugaron casi todos los SO1861-EMCH alimentados.
[0430] Para la generación de un conjugado de saponina no escindible según el pH, se activó el ácido carboxílico de SO1861 con HATU y luego se hizo reaccionar con las aminas de Cy3-PAMAM formando una amida estable con respecto al pH unida entre Cy3-PAMAM y SO1861. La masa resultante del conjugado se detectó mediante MALDI-TOF-MS con una masa de m/z 62,3 kDa que corresponde al conjugado Cy3-PAMAM-NC-S01861 (NC = no escindible) con 17,5 de moléculas SO1861 unidas por PAMAM (Figura 70 B, Figura 73).
[0431] A continuación, los armazones conjugados con saponina se conjugaron con puntos de enlace para una posible conjugación con terapias dirigidas (por ejemplo, toxinas dirigidas) a través de la denominada cicloadición de alquino-azida promovida por tensión anular (SPAAC, química clic) para obtener un armazón funcionalizado. Para esta reacción, Cy3-PAMAM-SO1861 (Figura 74 C, D) y Cy3-PAMAM-NC-S01861 (Figura 74 B) se conjugaron a una porción enlazadora NHS-PEG13-DBCO heterobifuncional que generó un alquino deformado en la superficie de los conjugados (Figura 74 A). El resto NHS (N hidroxisuccinimida) de la porción conectora reaccionó con las aminas restantes de los conjugados PAMAM-saponina formando un enlace amida entre el armazón y la porción conectora. El resto de DBCO (dibenzociclooctina) resultante en los conjugados es capaz de realizar SPAAC con las azidas correspondientes en las terapias dirigidas.
[0432] La diantina-EGF sirvió como una toxina dirigida modelo y la diantina sirvió como una toxina no dirigida. Ambas toxinas se marcaron con Alexa Fluor™ 488 usando el derivado de tetrafluorofenil éster (TFP) del tinte. Las proteínas marcadas con tinte se conjugaron luego a una porción conectora NHS-SS-PEG 3-azida heterobifuncional para obtener el resto químico correspondiente para la SPAAC a los conjugados PAMAM-saponina. Las mediciones de Maldi-TOF-MS mostraron que se unieron una molécula de Alexa Fluor™ 488 y 9 moléculas de NHS-SS-PEG3-azida por molécula de diantina-EGF (Figura 75, Figura 76). Además, la diantina-EGF marcada con Alexa Fluor ™488 se conjugó con una porción conectora de NHS-PEG12-azida heterobifuncional que carecía del puente disulfuro y, por tanto, generaría una construcción no escindible por toxina.
[0433] Los conjugados Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO y Cy3-PAMAM-S01861-DBCO se hicieron reaccionar con azido-toxinas marcadas con Alexa Fluor 488 para realizar una cicloadición de alquino-azida promovida por tensión anular. La conjugación entre los agentes reactivos se indicó mediante electroforesis en gel y la colocalización de las señales fluorescentes de Cy3, que solo se adhiere al polímero PAMAM, y Alexa Fluor™ 488, que solo se adhiere a las toxinas, en un gel de poliacrilamida después de la electroforesis en gel (Figura 77).
[0434] Como estructura polimérica alternativa al dendrímero PAMAM, se utilizó un dendrón G4 (PFd-G4-Azide-NH-BOC, Polymer Factory) con 16 grupos terminales amino funcionales y un grupo azido en el punto focal para la conjugación con SO1861 (Figura 84). La ventaja de usar un dendrón en lugar de un dendrímero es el punto focal que muestra la estructura del dendrón. Este punto focal permite la conjugación directa a una toxina dirigida sin la necesidad de su modificación posterior con funciones clic ortogonales (Figura 85). Como se muestra en la Figura 85, el dendrón se sometió a la misma metodología que se describe para el dendrímero PAMAM. Brevemente, después del marcaje y desprotección parcial con colorante (Figura 86), los grupos amino del dendrón se convirtieron en tioles usando el reactivo tiolante 2-iminotiolano seguido de conjugación con SO1861-EMCH. Para la conjugación con SO1861-EMCH se utilizaron tres equivalentes de adición diferentes de SO1861-EMCH. Los conjugados dendrón-SO1861 se analizaron mediante MALDI-TOF-MS. Como era de esperar, las especies conjugadas de 1 y 2 moléculas de SO1861 por molécula de dendrón se obtuvieron cuando se utilizaron equivalentes de adición bajos de SO1861-EMCH de 3 y 10 (Figura 87 B, C). Se obtuvieron especies conjugadas de dendrón-SO1861 más altas de hasta 9 moléculas de SO1861 por dendrón (Figura 87 A) cuando se utilizó una alimentación equivalente de 22 moléculas de SO1861-EMCH por molécula de dendrón. En experimentos adicionales, el dendrón funcionalizado con saponina se conjugará con toxinas dirigidas sobre su punto focal para producir un armazón funcionalizado, y se evaluará biológicamente.
[0435] Los ejemplos anteriores demuestran que se ha desarrollado una metodología que permite la conjugación de una cantidad determinada de moléculas de SO1861 u otras moléculas potenciadoras del escape endosomal a una estructura polimérica para una liberación citoplásmica mejorada de sustancias terapéuticas tales como toxinas dirigidas.
[0436] Para evaluar más otras metodologías de conjugación de SO1861 a una estructura polimérica, se utilizó la vía de aminación reductora. Para ello, el grupo aldehído de SO1861 se conjugó directamente con aminas PAMAM formando un enlace imina. La formación del enlace imina fue seguida de una etapa de aminación reductora mediante la adición del agente reductor cianoborohidruro de sodio formando un enlace amina estable al pH entre SO1861 y PAMAM (Figura 78 A). De manera similar al enfoque EMCH y HATU, esta metodología permite un control sobre el número de saponinas conjugadas por polímero, como se muestra en la Figura 78 B, C. En este caso, se produjeron conjugados PAMAM-saponina que obtuvieron un número de 10 (Figura 78 B) y 30 (Figura 78 C) moléculas de SO1861 por PAMAM.
[0437] Otro enfoque para el desarrollo de un armazón de SO1861 entre los polímeros y proteínas mencionados es el enfoque de poli(SO1861). La idea de este enfoque es generar un polímero que conste únicamente de moléculas de SO1861, con enlaces escindibles sensibles al pH que liberan la SO1861. Además, la poli(SO1861) debería poder realizar reacciones de conjugación a toxinas y biopolímeros. El objetivo principal de este enfoque es mantenerlo lo más simple y rentable posible. Dado que ya se ha desarrollado un protocolo para la generación de SO1861 escindible en medio ácido (enfoque SO1861-EMCH), sería interesante ver si es posible polimerizar el SO1861-EMCH mediante la simple adición de un iniciador de polimerización sin modificar más la SO1861 o identificar otros sitios de conjugación en la molécula de S01861. En el pasado, varios artículos han tratado sobre la polimerización de grupos maleimida usando iniciadores de radicales que atacan el doble enlace del grupo maleimida y así inician una polimerización radical a lo largo de los dobles enlaces de las maleimidas (29-31). Dado que SO1861-EMCH tiene un grupo maleimida en su estructura, este grupo podría explorarse potencialmente para reacciones de polimerización de radicales para producir una poli(SO1861) con función escindible en medio ácido. Si la reacción de polimerización tiene un tiempo de reacción razonable, los polímeros de SO1861 generados podrían inactivarse con un inhibidor de radicales que no solo inactive la reacción, sino que también genere un grupo funcional para la conjugación de toxina o biopolímero. Tal esquema de reacción se ilustra en la Figura 79. En este caso, el sistema de persulfato de amonio (APS) y tetrametiletilendiamina (TMEDA) se muestra a modo de ejemplo como generador de radicales, y el aminopropanotiol sirve como un inhibidor de radicales modelo. Usando aminopropanotiol como un ejemplo de atenuador, el grupo amina generado podría modificarse adicionalmente específicamente en un grupo utilizable para química clic o usarse para conjugar directamente la poli(SO1861) con una toxina.
[0438] En la polimerización por radicales libres, las condiciones de reacción tienen una gran influencia en las propiedades del polímero y el resultado de la reacción. Por ejemplo, la temperatura, la concentración del monómero y la concentración del iniciador desempeñan un papel importante en la formación del polímero y deben ajustarse con precisión de acuerdo con las propiedades deseadas del polímero. Como las polimerizaciones por radicales se llevan a cabo habitualmente a temperaturas superiores a 50 °C, las primeras reacciones se realizaron a una temperatura de 60 °C. Fue interesante ver si la polimerización de SO1861-EMCH podía iniciarse espontáneamente y si APS y TMEDA influirían en el grado de polimerización. Así, se llevaron a cabo tres reacciones, utilizando la misma concentración de SO1861-EMCH, pero diferentes en su composición de APS/TMEDA. En la primera reacción, solo el SO1861-EMCH se calentó hasta 60 °C durante 3 h, mientras que la segunda reacción contenía SO1861-EMCH y APS, y la tercera reacción contenía SO1861-EMCH, APS y TMEDA. (Para estos experimentos se utilizaron la misma cantidad y concentración de materiales de partida que se mencionan en la sección de Materiales y Métodos "Síntesis de poli(SO1861)"). Los lotes se analizaron mediante MALDI-TOF-MS como se muestra en la Figura 80 A-C. Curiosamente, se demostró que SO1861-EMCH comenzó a formar oligómeros consistentes en 2, 3, 4, 5 y 6 moléculas de SO1861 de forma espontánea al calentarse hasta 60 °C (Figura 80 A). La suma de 11-3 equivalentes de APS a la misma temperatura no influyó en esta tendencia (Figura 80 B). Sin embargo, al usar el sistema iniciador de APS/TMEDA, se pudieron detectar oligómeros de SO1861 de hasta 9 moléculas de SO1861 con un peso molecular de 18,2 kDa (Figura 80 C). Además, los picos obtenidos para los oligómeros parecían mucho más grandes en comparación con los picos de la Figura 80 A y 80 B, lo que indica un mayor consumo de SO1861-EMCH para esta reacción.
[0439] Para ajustar aún más las condiciones de reacción, se evaluarán otros iniciadores como los azoiniciadores, como 2,2'-azobis [2-metil-N-(2-hidroxietil)propionamida] y azobisisobutironitrilo, así como otras técnicas de polimerización como como polimerización radicalaria controlada (polimerización radicalaria por transferencia de átomos, transferencia de cadena mediante adición-fragmentación reversible, etc.). Además, podría considerarse otra porción conectora de hidrazida como sustituto de EMCH que obtenga un grupo funcional (tal como un residuo de acrilo o acrolol) que sea más adecuada para la polimerización por radicales que el grupo maleimida.
[0440] Otro enfoque para el desarrollo de un armazón SO1861 es el enfoque de ADN. La idea de este enfoque es utilizar el concepto del llamado ADN origami (Kolb et al, 2004; Bird et al, 1988). El ADN origami como estructura polimérica o polimérica ensamblada para conjugar saponinas a ella puede ofrecer varias ventajas inherentes que incluyen estabilidad, adaptabilidad progresiva y control preciso del tamaño y forma final del armazón de ADN-saponina resultante. Dado que estos nanoportadores de ADN están compuestos de ADN natural, son biocompatibles y no muestran toxicidad para las células vivas, y pueden facilitar la liberación de carga de los compartimentos celulares internos. La multivalencia de una estructura de este tipo puede permitir un ajuste preciso de las capacidades de focalización y una alta capacidad para una variedad de cargas útiles, como fluoróforos y toxinas. Por lo tanto, en este enfoque se identifican cadenas de ADN que ofrecen grupos funcionales químicos en los extremos 3 'y 5' respectivamente, y que pueden hibridar solo en ciertas áreas deseadas de la secuencia que permiten un control sobre la forma final de la construcción. Los grupos químicos deben utilizarse para acoplar saponinas, por ejemplo, mediante una reacción tioleno entre el SO1861-EMCH ya desarrollado y un grupo tiol en una de las cadenas de ADN 3 'y 5'. La cadena de ADN complementaria puede ofrecer un grupo de función clic que se puede utilizar para acoplarse a una toxina dirigida. El concepto se ilustra en la Figura 81.
[0441] Es posible imaginar un enfoque similar utilizando una secuencia de péptidos específica, en lugar de cadenas de ADN, que sea capaz de unirse y liberar saponinas y que se pueda polimerizar formando una gran estructura similar a un poli(péptido). En este enfoque, se ha identificado y comprado una secuencia de péptidos que tiene una longitud que se ajusta al tamaño calculado de una molécula SO1861-EMCH, que tiene un residuo de cisteína en el medio de la secuencia y que obtiene un grupo amina tanto en el extremo N-terminal como en el C-terminal. El residuo de cisteína se puede utilizar para conjugar SO1861-EMCH mediante una reacción tioleno del grupo maleimida de SO1861-EMCH y el grupo tiol del residuo de cisteína. Los dos grupos amina se pueden utilizar para polimerizar el conjugado péptido-S01861 con un reticulante adecuado como se muestra en la Figura 82.
[0442] Los ensayos de conjugación han demostrado que la conjugación de SO1861-EMCH con el péptido personalizado (secuencia: SESDDAMFCDAMDESDSK) tuvo éxito. El péptido que lleva una cisteína reactiva con maleimida en el medio de la secuencia y su conjugación con SO1861-EMCH se analizó mediante MALDI-TOF-MS (Figura 83). El espectro de MALDI-TOF-MS muestra el pico esperado para el conjugado péptido-S01861 en m/z 4053 Da y un pico adicional en m/z 3821 Da que es el conjugado péptido-Sd 861 de la correspondiente saponina-EMCH de SO1730. Como SO1861-EMCH se utilizó en un ligero exceso (1,3 equivalentes) y no se detectó ningún pico de SO1861-EMCH después de la reacción, se puede suponer que la conjugación fue cuantitativa. Para iniciar las primeras reacciones de polimerización del péptido-S01861, se utilizará tartrato de disuccinimidilo como reticulante reactivo con amina.
[0443] Dado que las propiedades de mejora del escape endosomal de la SO1861 solo se exponen a un pH endosómico bajo (<pH5), el armazón o el armazón funcionalizado no debe contener grupos químicos que puedan interferir en la acidificación de los endosomas y, por lo tanto, bloquear la actividad de la SO1861.
[0444] Se analizaron las estructuras poliméricas que contienen amina de una PAMAM G5 (128 aminas primarias y aproximadamente 126 aminas terciarias) y 4G-dendrón (16 aminas primarias), con el fin de determinar si estas moléculas inhiben la capacidad de mejora del escape endosomal de SO1861. Se realizaron experimentos de coadministración de PAMAM (nativa o tiolada) o dendrón (nativo) en combinación con diantina-EGF y diversas concentraciones de SO1861 en células HeLa. Como control para la inhibición de la acidificación endosómica se utilizó cloroquina.
[0445] Las células HeLa muestran suficientes cantidades de EGFR en la superficie celular (Figura 88 A). Se observa que tanto la PAMAM "nativa" como la cloroquina inhiben el escape endosomal mediado por SO1861 de la toxina dirigida y la subsiguiente muerte celular en las células Hela (Figura 88 B). PAMAM a 500 nM inhibe incluso en la misma medida que la cloroquina, un inhibidor de la acidificación endosomal, mientras que el dendrón 667 nM no tiene ningún efecto. Para abordar aún más si la actividad inhibidora de la PAMAM 'nativa' se debe a la disponibilidad de grupos amino de la PAMAM, los grupos amino primarios de PAMAM se tiolaron parcialmente mediante reacción con 2-iminotiolano (Figura 89), lo que resultó en 16 de 128 (Figura 89 C), 65/128 (Figura 89 D) y 108/128 (Figura 89 E) aminas primarias bloqueadas. Se observa que la tiolación de 65 y 108 aminas primarias supera la inhibición del escape endosomal mediado por SO1861, mientras que la tiolación de hasta 16 grupos de aminas todavía muestra los efectos inhibidores del escape endosomal mediado por SO1861 de la toxina dirigida (Figura 88 C). Los grupos amino primarios de PAMAM también se pegilaron parcialmente mediante una reacción con mPEG2k-NHS (Figura 90), lo que resultó en 3 de 128 (Figura 90 C), 8/128 (Figura 90 D) y 18/128 (Figura 90 E) aminas primarias bloqueadas. El bloqueo de solo 3 aminas primarias mediante PEGilación ya es suficiente para revertir la inhibición del escape endosomal mediado por SO1861 (Figura 89 D). El efecto de protección de la PEGilación probablemente se extiende más allá del pequeño número de aminas que se convierten, ya que se sabe que la PEGilación introduce una capa de hidratación que puede proteger a una molécula completa, si se alcanza un nivel suficiente.
[0446] Estos resultados demuestran que la presencia de un cierto número de grupos amino libres en estructuras poliméricas, tales como PAMAM, puede bloquear la acidificación endosomal y, así, inhibir la actividad de escape endosomal de SO1861 u otros glucósidos. Cuando el número de grupos amino es menor, como se muestra para el dendrón G4, o si los grupos amino se han protegido, como por tiolación o PEGilación, el efecto inhibidor se invierte.
REFERENCIAS
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Claims (30)

REIVINDICACIONES
1. Una primera molécula proteica que comprende un primer sitio de unión para la unión a un primer epítopo de una primera molécula de la superficie celular, unida covalentemente a al menos una saponina mediante al menos una porción conectora y/o mediante un armazón oligomérico o polimérico a un residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, o unida covalentemente de manera directa a un residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, donde
- el primer sitio de unión comprende o consiste en una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o una IgG, o comprende o consiste en al menos un ligando para la unión a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina, y
- en donde la al menos una saponina se selecciona del grupo que consiste en: SO1861, SA1641, GE1741, QS-21, QS-21A, QS21-B, Quil-A, SO1832, SO1904 y SO1862.
2. Primera molécula proteica de la reivindicación 1, en la que el primer epítopo de la primera molécula de la superficie celular es un primer epítopo específico para células tumorales de una primera molécula de la superficie celular tumoral.
3. Primera molécula proteica de la reivindicación 1 o 2, en la que al menos una saponina es SO1861.
4. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que
- la al menos una saponina es una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12.13- dehidrooleanano con una función aldehído en la posición C-23,
- la al menos una saponina está acoplada covalentemente al residuo de aminoácido de la primera molécula proteica mediante una función aldehído de la saponina, preferiblemente dicha función aldehído en la posición C-23, preferiblemente mediante al menos una porción conectora, más preferiblemente mediante al menos una porción conectora escindible, en la que el residuo de aminoácido se selecciona preferiblemente de cisteína y lisina.
5. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que
- la al menos una saponina es una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12.13- dehidrooleanano con una función aldehído en la posición C-23 y que comprende una función ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato del grupo C-3beta-OH de la saponina,
- la al menos una saponina está acoplada covalentemente al residuo de aminoácido de la primera molécula proteica a través de la función ácido glucurónico en el sustituyente carbohidrato del grupo C-3beta-OH de la saponina, preferiblemente a través de al menos una porción conectora, en la que el residuo de aminoácido se selecciona preferiblemente de entre cisteína y lisina.
6. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en la que la función aldehído en la posición C-23 de la al menos una saponina está acoplada covalentemente a la porción conectora hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico, donde dicha porción conectora está acoplada covalentemente a través de un enlace tioéter a un grupo sulfhidrilo de la primera molécula proteica, tal como un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
7. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en la que la función ácido glucurónico del sustituyente carbohidrato del grupo C-3beta-OH de la al menos una saponina está acoplada covalentemente a la porción conectora hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio, donde dicha porción conectora está acoplada covalentemente mediante un enlace amida a un grupo amina de la primera molécula proteica, tal como un grupo amina de una lisina o un extremo N terminal de la primera molécula proteica.
8. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicho primer epítopo es un primer epítopo específico para células tumorales de un receptor específico para células tumorales seleccionado preferiblemente de entre CD71, CA125, EpCAM (17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrina A4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, más preferiblemente seleccionado de entre CD71, EGFR, HER2.
9. Primera molécula proteica de la reivindicación 8, en la que dicho primer sitio de unión comprende o consiste en cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-9 anti-CD71 de tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal o Kt -10 anti-CD38, un anticuerpo de la Tabla A2 o Tabla A3 o Tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión al receptor de células tumorales o dominio de estos, preferiblemente al menos un fragmento de unión al receptor específico para células tumorales de estos y/o al menos un dominio de unión al receptor específico para células tumorales de estos.
10. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la primera molécula proteica comprende más de una saponina, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64 o 1-100 saponinas, o cualquier número de saponinas entre estos, tal como 7, 9, 12 saponinas, en donde las saponinas están:
- unidas covalentemente de manera directa a un residuo de aminoácido de la primera molécula proteica, preferiblemente a una cisteína y/o a una lisina, y/o
- unidas covalentemente mediante al menos una porción conectora y/o mediante al menos una porción conectora escindible y/o mediante al menos un armazón funcionalizado polimérico u oligomérico, preferiblemente 1-8 de tales armazones o 2-4 de tales armazones, donde el al menos un armazón está opcionalmente basado en un dendrón, en cuyo caso 1-32 saponinas tales como 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32 saponinas, o cualquier número de saponinas entre estos, tal como 7, 9, 12 saponinas, están unidas covalentemente a dicho al menos un armazón.
11. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en la que el al menos una porción conectora es una porción conectora no escindible o una porción conectora escindible, en la que la porción conectora escindible, por ejemplo
- se escinde en condiciones ácidas, condiciones reductoras, condiciones enzimáticas o condiciones inducidas por la luz, y preferiblemente la porción conectora escindible comprende un enlace hidrazona o un enlace hidrazida escindible en condiciones ácidas cuando está unida a saponina, y/o
- comprende un enlace susceptible de proteólisis, por ejemplo proteólisis por catepsina B, y/o es un enlace susceptible de escisión en condiciones reductoras tales como un puente disulfuro, cuando se une a saponina.
12. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, en la que la porción conectora escindible se escinde in vivo en condiciones ácidas como las presentes en endosomas y/o lisosomas de células de mamífero, preferiblemente células humanas, preferiblemente a pH 4,0-6,5, y más preferiblemente a pH < 5,5, cuando la porción conectora escindible está unida a una saponina.
13. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que el armazón oligomérico o polimérico comprende una estructura polimérica u oligomérica y comprende un grupo químico, donde dicho grupo químico es para el acoplamiento covalente del armazón al residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica.
14. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que la al menos una saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica del armazón oligomérico o polimérico mediante al menos una porción conectora escindible como se define en cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11.
15. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que el grupo químico del armazón oligomérico o polimérico, para el acoplamiento covalente del armazón oligomérico o polimérico al residuo de aminoácido de dicha primera molécula proteica, es un grupo de química clic, preferiblemente seleccionado de entre una tetrazina, una azida, un alqueno o un alquino, o un derivado cíclico de estos grupos, más preferiblemente dicho grupo químico es una azida.
16. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en la que la estructura polimérica u oligomérica del armazón oligomérico o polimérico comprende un polímero lineal, ramificado y/o cíclico, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado, un ADN, un polipéptido, polilisina, un polietilenglicol o un ensamblaje de estas estructuras poliméricas u oligoméricas, donde el ensamblaje se construye preferiblemente mediante reticulación covalente.
17. Combinación terapéutica, en la que la combinación terapéutica comprende:
(a) una primera composición farmacéutica que comprende la primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico; y o bien
(b) una segunda composición farmacéutica que comprende una segunda molécula proteica diferente de la primera molécula proteica y que comprende opcionalmente además un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, donde la segunda molécula proteica comprende
- -un segundo sitio de unión para la unión a un segundo epítopo de una segunda molécula de la superficie celular diferente de la primera molécula de la superficie celular, y
- -un resto efector, como una toxina, una enzima o un oligonucleótido
donde el segundo epítopo es diferente del primer epítopo,
o bien
(c) una tercera composición farmacéutica que comprende una tercera molécula proteica y que, opcionalmente, comprende además un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, donde la tercera molécula proteica comprende
-un tercer sitio de unión para la unión al primer epítopo en la molécula de la superficie celular de (a) y -un resto efector, como una toxina, una enzima o un oligonucleótido;
en donde el primer sitio de unión y el tercer sitio de unión son iguales, y en donde la primera molécula de la superficie celular y el primer epítopo de la primera molécula de la superficie celular, adonde se puede unir la primera molécula proteica, y la primera molécula de la superficie celular y el primer epítopo de la primera molécula de la superficie celular, adonde se puede unir la tercera molécula proteica, son iguales.
18. Combinación terapéutica según la reivindicación 17, en la que:
(a) la combinación terapéutica comprende dicha primera composición farmacéutica y dicha segunda composición farmacéutica, en la que
- -el primer epítopo de la primera molécula de la superficie celular es un primer epítopo específico para células tumorales en una primera molécula de superficie específica de las células tumorales, preferiblemente un primer epítopo específico para células tumorales en un primer receptor de la superficie celular presente específicamente en una célula tumoral; y
- -la segunda molécula de la superficie celular es una segunda molécula de superficie específica de las células tumorales diferente de la primera molécula de superficie específica de las células tumorales, preferiblemente un segundo receptor de la superficie celular presente específicamente en una célula tumoral diferente del primer receptor de la superficie celular presente específicamente en dicha célula tumoral, y en donde el segundo epítopo es un segundo epítopo específico para células tumorales;
o
(b) la combinación terapéutica comprende dicha primera composición farmacéutica y dicha tercera composición farmacéutica,
en donde la primera molécula de la superficie celular se expresa en la superficie de una célula tumoral, y preferiblemente la primera molécula de la superficie celular es una molécula de superficie específica de las células tumorales, y en donde preferiblemente el primer epítopo es un primer epítopo específico para células tumorales.
19. Combinación terapéutica de la reivindicación 17 o 18, en la que el segundo sitio de unión de la segunda molécula proteica o el tercer sitio de unión de la tercera molécula proteica comprende o consiste en una inmunoglobulina, al menos un dominio de unión de una inmunoglobulina y/o al menos una fragmento de unión de una inmunoglobulina, como un anticuerpo, una IgG, una molécula que comprende o consiste en un dominio Vhh o dominio Vh, un Fab, un scFv, un Fv, un dAb, un F(ab)2, un fragmento Fcab o comprende o consiste en al menos un ligando para la unión a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina.
20. Combinación terapéutica de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en la que
- -dicho primer sitio de unión une un primer epítopo específico para células tumorales a un primer receptor específico para células tumorales, y
- -dicho segundo sitio de unión une un segundo epítopo específico para células tumorales a un segundo receptor específico para células tumorales, y en donde
- -dichos primer y segundo receptores específicos para células tumorales son diferentes y están presentes en la misma célula tumoral,
- -el primer y segundo sitio de unión son diferentes y
- -el primer y el segundo epítopo específico para células tumorales son diferentes.
21. Combinación terapéutica de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en la que dicho primer y tercer sitio de unión, que son el mismo, son un sitio de unión para un primer epítopo específico para células tumorales en un primer receptor específico para células tumorales.
22. Combinación terapéutica de la reivindicación 20 o 21, en la que el primer receptor y/o el segundo receptor se seleccionan de entre CD71, CA125, EpCAM (17-1A), CD52, CeA, CD44v6, FAP, Eg F-IR, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HEr2, EGf R, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3 , CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrina A4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1 , CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente se seleccionan de entre CD71, EGFR y HER2; con las condiciones de que
- -cuando la primera y segunda moléculas proteicas están presentes en la combinación terapéutica, el primer sitio de unión de la primera molécula proteica es diferente del segundo sitio de unión de la segunda molécula proteica,
- -cuando la primera y la tercera moléculas proteicas están presentes en la combinación terapéutica, el primer y el tercer sitio de unión son los mismos.
23. Primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o combinación terapéutica de cualquiera de las reivindicaciones 17-22,
donde el primer sitio de unión y/o el segundo sitio de unión es/son o comprenden un anticuerpo monoclonal o al menos un fragmento y/o dominio de unión a la molécula de la superficie celular del mismo, y preferiblemente comprenden o consisten en cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-9 anti-CD71 de tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-10 anti-CD38 y un anticuerpo de la Tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión a una molécula de la superficie celular o uno de sus dominios, con la condición de que el primer sitio de unión de la primera molécula proteica sea diferente del segundo sitio de unión de la segunda molécula proteica.
24. Combinación terapéutica de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en la que
(a) dicho primer sitio de unión y dicho tercer sitio de unión comprenden un anticuerpo monoclonal, o un dominio o fragmento de unión de la molécula de la superficie celular del mismo, y preferiblemente comprenden o consisten en cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-9 anti-CD71 de tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-10 anti-CD38, un anticuerpo de la tabla A2 o Tabla A3 o Tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión a una molécula de la superficie celular y/o uno de sus dominios, con la condición de que el primer sitio de unión de la primera molécula proteica sea el mismo que el tercer sitio de unión de la tercera molécula proteica; o (b) dicho segundo sitio de unión o dicho tercer sitio de unión es o comprende un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a una molécula de la superficie celular o uno de sus dominios, y preferiblemente comprende o consiste en cualquiera de Gemtuzumab ozogamicina, Brentuximab vedotina, Trastuzumab emtansina, Inotuzumab ozogamicina, Moxetumomab pasudotox, Polatuzumab vedotina o un conjugado anticuerpo-fármaco de la Tabla A2 o la Tabla A3.
25. Combinación terapéutica de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, en la que el resto efector que está comprendido por la segunda molécula proteica, respectivamente por la tercera molécula proteica, comprende o consiste en:
(i) uno o más de un oligonucleótido, un ácido nucleico, un ácido xenonucleico, preferiblemente seleccionado de uno o más de un vector, un gen, un transgén que induce la apoptosis celular, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótido antisentido (ASO, AON), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aptámero de ADN, aptámero de ARN, ARNm, ADN de minicírculo, ácido peptídico nucleico (APN), oligómero morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico en puente (BNA), ácido 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleico (FANA), 2'-O-metoxietil-ARN (Mo E), 2'-0,4'-ácido nucleico con puente de aminoetileno, ácido 3'-fluorohexitol nucleico (FHNA), un plásmido, ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treosa-nucleico (TNA), o un derivado de estos, más preferiblemente un BNA, por ejemplo un BNA para silenciar la expresión de proteínas HSP27; o
(ii) al menos una molécula proteica, preferiblemente seleccionada de cualquiera o más de un péptido, una proteína, una enzima tal como ureasa y recombinasa Cre, una proteína inactivadora de ribosomas, una toxina proteica, más preferiblemente seleccionada de cualquiera o más de una toxina proteica seleccionada de la Tabla A5 y/o una toxina viral como apoptina; una toxina bacteriana tal como toxina Shiga, toxina similar a Shiga, exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (PE) o exotoxina A de PE, toxina diftérica (TD) de longitud completa o truncada, toxina del cólera; una toxina fúngica como la alfa-sarcina; una toxina vegetal que incluye proteínas inactivadoras de ribosomas y la cadena A de proteínas inactivadoras de ribosomas de tipo 2 tales como diantina, por ejemplo, diantina-30 o diantina-32, saporina, por ejemplo, saporina-S3 o saporina-S6, bouganina o derivado desinmunizado de bouganina debouganina, toxina A similar a shiga, proteína antiviral de hierba carmín, ricina, cadena A de ricina, modecina, cadena A de modecina, abrina, cadena A de abrina, volkensina, cadena A de volkensina, viscumina, cadena A de viscumina; o una toxina animal o humana tal como RNasa de rana, o granzima B o angiogenina humana, o cualquier fragmento o derivado de las mismas; preferiblemente, la toxina proteica es diantina y/o saporina; o
(iii) al menos una carga útil, preferiblemente seleccionada de una o más de una toxina que se dirige a los ribosomas, una toxina que se dirige a los factores de elongación, una toxina que se dirige a la tubulina, una toxina que se dirige al ADN y una toxina que se dirige al ARN, más preferiblemente uno o más de emtansina, pasudotox, derivado de maitansinoide DM1, derivado de maitansinoide DM4, monometil auristatina E (MMAE, vedotina), monometil auristatina F (MMAF, mafodotina), una calicheamicina, N-acetil-i-calicheamicina, una pirroloina (abenzodiazepimerina) un análogo de CC-1065, una duocarmicina, doxorrubicina, paclitaxel, docetaxel, cisplatino, ciclofosfamida, etopósido, docetaxel, 5-fluorouracilo (5-FU), mitoxantrona, tubulisina, indolinobenzodiazepina, AZ13599185, antropotrexato, criptotrexato antraciclina, un análogo de camptotecina, SN-38, DX-8951f, mesilato de exatecano, forma truncada de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (PE38), un derivado de duocarmicina, una amanitina, a-amanitina, una espliceostatina, una tailanstatina, ozogamicina, tesirina, Amberstatin269 y soravtansina, o un derivado de estos.
26. Composición que comprende la primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 y
- la segunda molécula proteica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 17-25 y opcionalmente un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, o
- la tercera molécula proteica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 17-25 y opcionalmente un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, y
- en donde, opcionalmente, el resto efector que está compuesto por la segunda molécula proteica o por la tercera molécula proteica es cualquiera de los restos efectores: un oligonucleótido, un ácido nucleico, un ácido xenonucleico, preferiblemente seleccionado de uno cualquiera o más de un vector, un gen, un transgén que induce la apoptosis, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótido antisentido (a So , AON), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aptámero de ADN, aptámero de ARN, ARNm, ADN de minicírculo, ácido nucleico peptídico (APN), oligómero morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico con puente (BNA), ácido 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleico (FANA), 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), ácido nucleico con puente de 2'-O,4'-aminoetileno, ácido 3'-fluorohexitol nucleico (FHNA), un plásmido, ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treosa-nucleico (TNA), o un derivado de estos, más preferiblemente un BNA, por ejemplo un BNA para silenciar la expresión de la proteína HSP27.
27. Composición que comprende
- -la primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o como se define en cualquiera de las reivindicaciones 17-23 y
- -uno o más de un oligonucleótido, un ácido nucleico y un ácido xenonucleico, preferiblemente seleccionado de al menos uno de entre un vector, un gen, un transgén que induce la apoptosis, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), anti oligonucleótido antisentido (ASO, AON), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aptámero de ADN, aptámero de Ar N, ARNm, ADN de minicírculo, ácido peptídico nucleico (APN), oligómero morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico con puente (BNA), ácido 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleico (FANA), 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), ácido nucleico con puente de 2'-O,4'-aminoetileno, ácido 3'-fluorohexitol nucleico (FHNA), un plásmido, ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treosa-nucleico (TNA), o un derivado de estos, más preferiblemente un BNA, por ejemplo un BNA para silenciar la expresión de la proteína HSP27.
28. Conjugado anticuerpo-fármaco o conjugado ligando-fármaco que comprende la primera molécula proteica de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 y un resto efector, opcionalmente donde:
(i) el anticuerpo puede unirse a cualquiera de CD71, CA125, EpCAM (17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HER2 , Eg Fr , CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrina A4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente CD71, HER2, EGFR, y/o es o comprende cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-9 anti-CD71 de tipo IgG, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-10 anti-CD38, un anticuerpo de la Tabla A2 o Tabla A3 o Tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión al receptor de células tumorales de estos y/o al menos un dominio de unión al receptor de células tumorales de estos, y/o en donde el conjugado anticuerpo-fármaco comprende cualquiera de Gemtuzumab ozogamicina, Brentuximab vedotina, Trastuzumab emtansina, Inotuzumab ozogamicina, Moxetumomab pasudotox y Polatuzumab vedotina y un conjugado anticuerpo-fármaco de la Tabla A2 y la Tabla A3; y/o
(ii) el resto efector es cualquiera o más de los restos efectores definidos en la reivindicación 26.
29. Composición farmacéutica que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco o el conjugado ligando-fármaco de la reivindicación 28, y que, opcionalmente, comprende además un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
30. Combinación terapéutica de cualquiera de las reivindicaciones 17-25 o composición de la reivindicación 26 o 27 o conjugado anticuerpo-fármaco o conjugado ligando-fármaco de la reivindicación 28 o composición farmacéutica de la reivindicación 29, para su uso como medicamento o para su uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer o una enfermedad autoinmune.
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