CN108004274B - 一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法 - Google Patents

一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108004274B
CN108004274B CN201810051564.6A CN201810051564A CN108004274B CN 108004274 B CN108004274 B CN 108004274B CN 201810051564 A CN201810051564 A CN 201810051564A CN 108004274 B CN108004274 B CN 108004274B
Authority
CN
China
Prior art keywords
saccharomyces cerevisiae
gene
delta
genes
acrylic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810051564.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108004274A (zh
Inventor
卓炳照
胡欣
李棋
林炜锋
江会锋
王文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Small Molecule New Drug Innovation Center Co ltd
Original Assignee
Jiaxing Synbiolab Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiaxing Synbiolab Biotechnology Co ltd filed Critical Jiaxing Synbiolab Biotechnology Co ltd
Priority to CN201810051564.6A priority Critical patent/CN108004274B/zh
Publication of CN108004274A publication Critical patent/CN108004274A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108004274B publication Critical patent/CN108004274B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法，以丙三醇为原料，酿酒酵母菌为宿主菌，经过宿主菌体内若干酶的催化而完成。本发明的有益效果：1)以低成本化合物为原料，工艺原材料成本低。2)以改造微生物为技术基础，在微生物体内进行生物酶的催化合成，避免大规模的提取、分离、纯化过程，从生产成本和对环境友好方面容易控制。3)本工艺在生产设备的规模和数量上比其他方法要要少，操作简单，易于产业转化。4)本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序，产品纯化工艺简单，产品质量比一般方法纯度更好、含量更高。5)合成过程没有废液排放，环境友好，无污染，可持续生产。

Description

一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法
技术领域
本发明涉及一种丙烯酸的生物合成方法，具体的说涉及一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法。
背景技术
丙烯酸分子式：C3H4O2；英文名称：Acrylic acid；CAS：79-10-7；分子量：72.06；物理性质：与水混溶，可混溶于乙醇、***，无色液体，有刺激性气味；熔点为13℃，沸点为141℃，闪点为54℃，密度为1.05g/cm。
丙烯酸是重要的有机合成原料及合成树脂单体，是聚合速度非常快的乙烯类单体。是最简单的不饱和羧酸，由一个乙烯基和一个羧基组成。纯的丙烯酸是无色澄清液体，带有特征的刺激性气味。它可与水、醇、醚和氯仿互溶。大多数用以制造丙烯酸甲酯、乙酯、丁酯、羟乙酯等丙烯酸酯类。丙烯酸及丙烯酸酯可以均聚及共聚，其聚合物用于合成树脂、合成纤维、高吸水性树脂、建材、涂料等工业部门。丙烯酸作为市场需求排名近20位的大宗化学品，丙烯酸及其聚合物等在工业生产、航空航天、污水处理、医用材料及纳米材料等方面都有广泛的应用。随着科技的发展，人们对绿色环保材料的需求日益增加，使得以丙烯酸作为有机合成原料和合成树脂单体的功能性材料越来越受到人们的青睐。
丙烯酸工业生产主要采用丙烯氧化法。丙烯先与氧气反应生成丙烯醛，丙烯醛再去氧作用生成丙烯酸，转化率较高。尽管该法存在诸多优点，但是原料依赖于传统化石能源，污染重、耗能高、不可持续。目前也有利用半生物合成法或生物全合成法来合成丙烯酸。丙烯酸半生物合成法是指利用微生物体将丙烯腈、丙烯酰胺等石油化工原料转化为丙烯酸的方法。
丙烯酸的半生物法虽然产量较高，但其原料丙烯腈、丙烯酰胺在成本上比丙烯酸还高，限制了这种方法的工业化生产。丙烯酸全生物法是指微生物直接利用糖类等生物质发酵生产丙烯酸的方法。合成途径复杂、合成机理不清晰、合成效率极低是现有现有的丙烯酸生物全合成方法的缺点。本发明旨在解决上述技术问题，提供一种反应温和、合成效率高的丙烯酸生物合成方法。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法，该方法反应温和、合成效率高、产量高，无污染，生产周期短。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法，所述合成方法以丙三醇为原料，酿酒酵母菌为宿主菌，经过宿主菌体内若干酶的催化而完成；
所述宿主菌按下述方法构建获得：
1)根据酿酒酵母密码子偏好性优化基因GlyDH和DAK的密码子，然后利用双向启动子，将两个基因构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体1，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性和酿酒酵母的筛选标记URA基因；在酿酒酵母中构建异源甘油代谢途径，GlyDH基因所表达的酶能将甘油转化成二羟基丙酮，DAK基因所表达的酶再将二羟基丙酮转化成磷酸二羟基丙酮；
2)依据酿酒酵母密码子偏好性对ceaS2基因及NOX基因进行优化，然后将两个基因同时构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体2，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因和酿酒酵母的筛选标记Leu基因；
ceaS2基因所表达的酶具有将磷酸二羟基丙酮或3-磷酸甘油醛转化为丙烯酸的功能，由于GlyDH酶需要依赖NADH才能具有催化甘油转化成二羟基丙酮的功能，在这个过程中，NADH会转化成NAD+。为了提高NADH的供给，从而提高1)中构建的异源甘油代谢途径的效率，在酿酒酵母中构建了异源NADH循环模块，即利用引入NOX基因，NOX基因所表达的酶能够将NAD+还原成NADH；
3)敲除酿酒酵母BY4741中的PDC1基因、DLD1基因、GPD1基因和GPD2基因，得到经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2菌株；目的是为了减少核心中间产物磷酸二羟基丙酮和3-磷酸甘油醛被其他代谢途径消耗；
4)将上述载体1和2同时转入3)中所描述的经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2中，根据酿酒酵母的筛选标记ura和Leu基因，筛选阳性克隆，然后提取酿酒酵母基因组，进一步PCR验证。
优选的，步骤1)中GlyDH和DAK基因分别根据嗜热脂肪土芽孢杆菌和毕赤酵母中相应基因的氨基酸序列来合成。
优选的，步骤2)中ceaS2和NOX基因分别根据棒状链霉菌和嗜热脂肪土芽孢杆菌相应基因的氨基酸序列来合成。
一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法，所述合成方法步骤如下：
1)根据酿酒酵母密码子偏好性优化基因GlyDH和DAK的密码子，然后利用双向启动子，将两个基因构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体1，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性和酿酒酵母的筛选标记URA基因；
2)依据酿酒酵母密码子偏好性对ceaS2基因及NOX基因进行优化，然后将两个基因同时构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体2，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因和酿酒酵母的筛选标记Leu基因；
3)敲除酿酒酵母BY4741中的PDC1基因、DLD1基因、GPD1基因和GPD2基因，得到经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2菌株；
4)将上述载体1和2同时转入3)中所描述的经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2中，根据酿酒酵母的筛选标记ura和Leu基因，筛选阳性克隆，然后提取酿酒酵母基因组，进一步PCR验证；
5)将酿酒酵母宿主菌培养，诱导表达；
6)在表达后的菌液中添加甘油底物，继续反应20-26h；
7)将反应液中的丙烯酸提取、分离纯化。
优选的，步骤6)中甘油的添加量为：10g/L-100g/L，反应温度为：25-35℃。
本专利涉及到的基因为GlyDH、DAK、NOX和ceaS2(见表1)。
Figure BDA0001552463180000031
Figure BDA0001552463180000041
本发明制备丙烯酸与现有技术不同之处在于：
1)以低成本化合物为原料，工艺原材料成本低。
2)以改造微生物为技术基础，在微生物体内进行生物酶的催化合成，避免大规模的提取、分离、纯化过程，从生产成本和对环境友好方面容易控制。
3)本工艺在生产设备的规模和数量上比其他方法要要少，操作简单，易于产业转化。
4)本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序，产品纯化工艺简单，产品质量比一般方法纯度更好、含量更高。
5)合成过程没有废液排放，环境友好，无污染，可持续生产，本发明工艺从经济、环境和职业健康角度均为优良的工业化生产指路线。
附图说明
图1为本发明的丙烯酸生物合成路线图；
图2(a)为本发明中的YCplac33-GlyDH-DAK质粒图谱；
图2(b)为本发明中的YCplac33-ceaS2-NOX质粒图谱；
图3为本发明合成样品的液相结果图；
图4为本发明合成样品的质谱结果图，其中图4(a)为丙烯酸标品LC-MS分析的色谱图，图4(b)为对照样品LC-MS分析的色谱图，图4(c)为改造过后菌株培养反应液LC-MS分析的色谱图，图4(d)为改造过后菌株培养反应液LC-MS分析的质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法，其合成路线如图1所述，所述合成方法以丙三醇为原料，酿酒酵母菌为宿主菌，经过宿主菌体内若干酶的催化而完成；所述宿主菌按下述方法构建获得：
1)根据酿酒酵母密码子偏好性优化基因GlyDH和DAK的密码子，然后利用双向启动子，将两个基因构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体1，如图2(a)所示，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性和酿酒酵母的筛选标记URA基因；在酿酒酵母中构建异源甘油代谢途径，GlyDH基因所表达的酶能将甘油转化成二羟基丙酮，DAK基因所表达的酶再将二羟基丙酮转化成磷酸二羟基丙酮；
2)依据酿酒酵母密码子偏好性对ceaS2基因及NOX基因进行优化，然后将两个基因同时构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体2，如图2(b)所示，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因和酿酒酵母的筛选标记Leu基因；
ceaS2基因所表达的酶具有将磷酸二羟基丙酮或3-磷酸甘油醛转化为丙烯酸的功能，由于GlyDH酶需要依赖NADH才能具有催化甘油转化成二羟基丙酮的功能，在这个过程中，NADH会转化成NAD+。为了提高NADH的供给，从而提高1)中构建的异源甘油代谢途径的效率，在酿酒酵母中构建了异源NADH循环模块，即利用引入NOX基因，NOX基因所表达的酶能够将NAD+还原成NADH；
3)敲除酿酒酵母BY4741中的PDC1基因、DLD1基因、GPD1基因和GPD2基因，得到经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2菌株；目的是为了减少核心中间产物磷酸二羟基丙酮和3-磷酸甘油醛被其他代谢途径消耗；
4)将上述载体1和2同时转入3)中所描述的经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2中，根据酿酒酵母的筛选标记ura和Leu基因，筛选阳性克隆，然后提取酿酒酵母基因组，进一步PCR验证。
具体到本实施例，步骤1)中GlyDH和DAK基因分别根据嗜热脂肪土芽孢杆菌和毕赤酵母中相应基因的氨基酸序列来合成。
具体到本实施例，步骤2)中ceaS2和NOX基因分别根据棒状链霉菌和嗜热脂肪土芽孢杆菌相应基因的氨基酸序列来合成。
一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法，所述合成方法步骤如下：
1)根据酿酒酵母密码子偏好性优化基因GlyDH和DAK的密码子，然后利用双向启动子，将两个基因构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体1，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性和酿酒酵母的筛选标记URA基因；
2)依据酿酒酵母密码子偏好性对ceaS2基因及NOX基因进行优化，然后将两个基因同时构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体2，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因和酿酒酵母的筛选标记Leu基因；
3)敲除酿酒酵母BY4741中的PDC1基因、DLD1基因、GPD1基因和GPD2基因，得到经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2菌株；
4)将上述载体1和2同时转入3)中所描述的经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDCl-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2中，根据酿酒酵母的筛选标记ura和Leu基因，筛选阳性克隆，然后提取酿酒酵母基因组，进一步PCR验证；
5)将酿酒酵母宿主菌培养，诱导表达；
6)在表达后的菌液中添加甘油底物，继续反应20-60h，优选36-48h；
7)将反应液中的丙烯酸提取、分离纯化。
优选的，步骤6)中甘油的添加量为：10g/L-100g/L，优选60-80g/L，反应温度为：25-35℃，优选30℃。
本发明合成的样品的液相结果图和质谱结果图分别如图3和图4(a)-(d)所示。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司
嘉兴欣贝莱生物科技有限公司
<120> 一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法
<130> 20182018
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 10513
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 60
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 120
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 180
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 240
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 300
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 360
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 420
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 480
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 540
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 600
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 660
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 720
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 780
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 840
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 900
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 960
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 1020
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 1080
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 1140
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 1200
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 1260
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 1320
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 1380
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 1440
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 1500
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 1560
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 1620
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 1680
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 1740
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 1800
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 1860
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 1920
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 1980
ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 2040
acgaggccct ttcgtcttca agaattagct tttcaattca attcatcatt ttttttttat 2100
tctttttttt gatttcggtt tctttgaaat tttttttaac tgtgggaata ctcaggtatc 2160
gtaagatgca agagttcgaa tctcttagca accattattt ttttcctcaa cataacgaga 2220
acacacaggg gcgctatcgc acagaatcaa attcgatgac tggaaatttt ttgttaattt 2280
cagaggtcgc ctgacgcata tacctttttc aactgaaaaa ttgggagaaa aaggaaaggt 2340
gagagccgcg gaaccggctt ttcatataga atagagaagc gttcatgact aaatgcttgc 2400
atcacaatac ttgaagttga caatattatt taaggaccta ttgttttttc caataggtgg 2460
ttagcaatcg tcttactttc taacttttct taccttttac atttcagcaa tatatatata 2520
tatatttcaa ggatatacca ttctaatgtc tgcccctaag aagatcgtcg ttttgccagg 2580
tgaccacgtt ggtcaagaaa tcacagccga agccattaag gttcttaaag ctatttctga 2640
tgttcgttcc aatgtcaagt tcgatttcga aaatcattta attggtggtg ctgctatcga 2700
tgctacaggt gtcccacttc cagatgaggc gctggaagcc tccaagaagg ttgatgccgt 2760
tttgttaggt gctgtgggtg gtcctaaatg gggtacaggt agtgttagac ctgaacaagg 2820
tttactaaaa atccgtaaag aacttcaatt gtacgccaac ttaagaccat gtaactttgc 2880
atccgactct cttttagact tatctccaat caagccacaa tttgctaaag gtactgactt 2940
cgttgttgtc agagaattag tgggaggtat ttactttggt aagagaaagg aagacgatgg 3000
tgatggtgtc gcttgggata gtgaacaata caccgttcca gaagtgcaaa gaatcacaag 3060
aatggccgct ttcatggccc tacaacatga gccaccattg cctatttggt ccttggataa 3120
agctaatgtt ttggcctctt caagattatg gagaaaaact gtggaggaaa ccatcaagaa 3180
cgaatttcct acattgaagg ttcaacatca attgattgat tctgccgcca tgatcctagt 3240
taagaaccca acccacctaa atggtattat aatcaccagc aacatgtttg gtgatatcat 3300
ctccgatgaa gcctccgtta tcccaggttc cttgggtttg ttgccatctg cgtccttggc 3360
ctctttgcca gacaagaaca ccgcatttgg tttgtacgaa ccatgccacg gttctgctcc 3420
agatttgcca aagaataagg tcaaccctat cgccactatc ttgtctgctg caatgatgtt 3480
gaaattgtca ttgaacttgc ctgaagaagg taaggccatt gaagatgcag ttaaaaaggt 3540
tttggatgca ggtatcagaa ctggtgattt aggtggttcc aacagtacca cggaagtcgg 3600
tgatgctgtc gccgaagaag ttaagaaaat ccttgcttaa aaagattctc tttttttatg 3660
atatttgtac ataaacttta taaatgaaat tcataataga aacgacacga aattacaaaa 3720
tggaatatgt tcatagggta gattattacc caattctcat gtttgacagc ttatcatcga 3780
tcgtccaact gcatggagat gagtcgtggc aagaatacca agagttcctc ggtttgccag 3840
ttattaaaag actcgtattt ccaaaagact gcaacatact actcagtgca gcttcacaga 3900
aacctcattc gtttattccc ttgtttgatt cagaagcagg tgggacaggt gaacttttgg 3960
attggaactc gatttctgac tgggttggaa ggcaagagag ccccgagagc ttacatttta 4020
tgttagctgg tggactgacg ccagaaaatg ttggtgatgc gcttagatta aatggcgtta 4080
ttggtgttga tgtaagcgga ggtgtggaga caaatggtgt aaaagactct aacaaaatag 4140
caaatttcgt caaaaatgct aagaaatagg ttattactga gtagtattta tttaagtatt 4200
gtttgtgcac ttgcctgcaa gccttttgaa aagcaagcat aaaagatcta aacataaaat 4260
ctgtaaaata acaagatgta aagataatgc taaatcattt ggctttttga ttgattgtac 4320
aggaaaatat acatcgcagg gggttgactt ttaccatttc accgcaatgg aatcaaactt 4380
gttgaagaga atgttcacag gcgcatacgc tacaatgacc cgattcttgc tagccttttc 4440
tcggtcttgc aaacaaccgc cggcagctta gtatataaat acacatgtac atacctctct 4500
ccgtatcctc gtaatcattt tcttgtattt atcgtctttt cgctgtaaaa actttatcac 4560
acttatctca aatacactta ttaaccgctt ttactattat cttctacgct gacagtaata 4620
tcaaacagtg acacatatta aacacagtgg tttctttgca taaacaccat cagcctcaag 4680
tcgtcaagta aagatttcgt gttcatgcag atagataaca atctatatgt tgataattag 4740
cgttgcctca tcaatgcgag atccgtttaa ccggacccta gtgcacttac cccacgttcg 4800
gtccactgtg tgccgaacat gctccttcac tattttaaca tgtggaatta attctcatgt 4860
ttgacagctt atcatcgaac tctaagaggt gatacttatt tactgtaaaa ctgtgacgat 4920
aaaaccggaa ggaagaataa gaaaactcga actgatctat aatgcctatt ttctgtaaag 4980
agtttaagct atgaaagcct cggcattttg gccgctccta ggtagtgctt tttttccaag 5040
gacaaaacag tttctttttc ttgagcaggt tttatgtttc ggtaatcata aacaataaat 5100
aaattatttc atttatgttt aaaaataaaa aataaaaaag tattttaaat ttttaaaaaa 5160
gttgattata agcatgtgac cttttgcaag caattaaatt ttgcaatttg tgattttagg 5220
caaaagttac aatttctggc tcgtgtaata tatgtatgct aaagtgaact tttacaaagt 5280
cgatatggac ttagtcaaaa gaaattttct taaaaatata tagcactagc caatttagca 5340
cttctttatg agatatatta tagactttat taagccagat ttgtgtatta tatgtattta 5400
cccggcgaat catggacata cattctgaaa taggtaatat tctctatggt gagacagcat 5460
agataaccta ggatacaagt taaaagctag tactgttttg cagtaatttt tttctttttt 5520
ataagaatgt taccacctaa ataagttata aagtcaatag ttaagtttga tatttgattg 5580
taaaataccg taatatattt gcatgatcaa aaggctcaat gttgactagc cagcatgtca 5640
accactatat tgatcaccga tatatggact tccacaccaa ctagtaatat gacaataaat 5700
tcaagatatt cttcatgaga atggcccagc gatatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 5760
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 5820
aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 5880
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 5940
ccagtgaatt cgagctctgt caacgcagat taagcacacc ctaaaacttg aataatgcaa 6000
attccatagc ttagtttaat caaggcgcca ttattcctca gttgaaaagt atatctaatg 6060
gttaggatta gaaatatgtt cattgctcat tgttatgtgt atcatatcgt acaaaaatta 6120
tataaagaaa taataatgaa aaagagtaaa acaaagacaa atagacaaaa atagaggata 6180
gaaaaagaaa aacaacagat acataaataa gtcttatgac aaaaaaacga ttgtataaaa 6240
attaaagtgc atgccatttt tacctccttt tgcttaactt aaacttttca ttgcaatcat 6300
gatagacaaa gcaccgaaac cacctggttg gaagtcgtag ttaactggaa cttcgatcaa 6360
gaatggtcta cccaattcag caccctttct caaagcagcc aacaattctt ctctgttagt 6420
agctctagta gcgtcaacac cgttagcttc agccaaagca acgaagtcaa caccaccgaa 6480
cttaacagct gggtcgtgag atctgtggtg accgatgttt tggtacaatt cgatcaaacc 6540
gttagtgtcg ttgttaacaa caacagtaac gattggcaag ttcaatctag cgatagtttc 6600
caagtcagaa gagttagagt ggaaaccacc gtcaccagcg atcaagaaag ttggttggtc 6660
tggtctagcc atttgagcac cgatagcagc tgggataccg taaccgaaag aagaacaacc 6720
agcagaagtc aagaaaccga atggttggtc agctctagcg aacaaaacac cgtagtgtct 6780
gaagaaaccg atgtcagaaa cgatagtacc ttcacctggt tcagcagctt cttccataac 6840
agtgttcata gagtcgataa cttggtgaac tctcataccg tcttcgtaag tttctgggtc 6900
agccaagaat tcagcgattc tagctctcaa tggttcgatg tcgtgtcttt gcttagcacc 6960
gaaagaagca gtagcagttt cgaagtgttc aacgaaagcc aaaacgtcag taacaacgtc 7020
aacgtctggt ctgtaaactc ttgggattgg gttaacagtt ggagagattc taacagtctt 7080
cttttcgata cccttttgcc acatagatgg tctcaagtct tcagcgtagt cgtaaccaac 7140
agtcaaaacc aagtcaactg gagcgaacat agtttgcaaa gctgggaagt tcaagatacc 7200
gtccatgtaa ccagtaacag caccgtagtt caattcgtga ccaactggca aaacaccctt 7260
agcgatgtaa gtagtgataa ctgggatgtt caatctttca gccaaagctc tgatagctgg 7320
aacagcacca gatctgatag cagcagcacc aacaaccaaa actgggtgct tagcttcagc 7380
caacaaagca gcagcttggt cagcagcctt ttgccaaccg tcagcaacaa caccaactgg 7440
cttagctgga gtgttagctg gtgggtttgg aacagtagtg tcgatacctt cagaagaacc 7500
caacaagtca actggcaaag agatgaaaga tggaccaact ggttcagtca tagcagcgtt 7560
aacagcagag tcaaccaagt cagtgatttc gtgtggtctt tgcaattcaa cagcgtactt 7620
agacattgga gcaacgatag caacagagtc caaacattgg tgagtgtcgt ttgggaagat 7680
gtcgtgagat tcagattgag cagccaaagc gataactgga gatctgtcca aaacagaagt 7740
agcgatacca gtagacaagt tagtcatacc tggacccaaa gtagcccaac aagcttgtgg 7800
tctaccagtg attctagcca aaacgtcagc agcaacacca gcagtgaatt cgtgtctagt 7860
caaaacgaag tcgatacctt caacttcgtc gaacaagata gaagcagctt ctctaccaac 7920
aacaccgaaa accttaccaa caccgtggtc tctcaatcta gacaacaaag cgtgagcagc 7980
agttggctta ccagatggag cagtagaaac tctagacatt ttgtttgttt atgtgtgttt 8040
attcgaaact aagttcttgg tgttttaaaa ctaaaaaaaa gactaactat aaaagtagaa 8100
tttaagaagt ttaagaaata gatttacaga attacaatca atacctaccg tctttatata 8160
cttattagtc aagtagggga ataatttcag ggaactggtt tcaacctttt ttttcagctt 8220
tttccaaatc agagagagca gaaggtaata gaaggtgtaa gaaaatgaga tagatacatg 8280
cgtgggtcaa ttgccttgtg tcatcattta ctccaggcag gttgcatcac tccattgagg 8340
ttgtgcccgt tttttgcctg tttgtgcccc tgttctctgt agttgcgcta agagaatgga 8400
cctatgaact gatggttggt gaagaaaaca atattttggt gctgggattc tttttttttc 8460
tggatgccag cttaaaaagc gggctccatt atatttagtg gatgccagga ataaactgtt 8520
cacccagaca cctacgatgt tatatattct gtgtaacccg ccccctattt tgggcatgta 8580
cgggttacag cagaattaaa aggctaattt tttgactaaa taaagttagg aaaatcacta 8640
ctattaatta tttacgtatt ctttgaaatg gcagtattga taatgataaa ctcgaactga 8700
aaaagcgtgt tttttattca aaatgattct aactccctta cgtaatcaag gaatcttttt 8760
gccttggcct ccgcgtcatt aaacttcttg ttgttgacgc taacattcaa cgctagtatt 8820
atacttacat atagtagatg tcaagcgtag gcgcttcccc tgccggctgt gagggcgcca 8880
taaccaaggt atctatagac cgccaatcag caaactacct ccgtacattc atgttgcacc 8940
cacacattta tacacccaga ccgcgacaaa ttacccataa ggttgtttgt gacggcgtcg 9000
tacaagagaa cgtgggaact ttttaggctc accaaaaaag aaagaaaaaa tacgagttgc 9060
tgacagaagc ctcaagaaaa aaaaaattct tcttcgacta tgctggaggc agagatgatc 9120
gagccggtag ttaactatat atagctaaat tggttccatc accttctttt ctggtgtcgc 9180
tccttctagt gctatttctg gcttttccta tttttttttt tccatttttc tttctctctt 9240
tctaatatat aaattctctt gcattttcta tttttctctc tatctattct acttgtttat 9300
tcccttcaag gttttttttt aaggagtact tgtttttaga atatacggtc aacgaactat 9360
aattaactaa acactagtac catggaagct actttgccag ttttggacgc taagactgct 9420
gctttgaaga gaagatctat cagaagatac agaaaggacc cagttccaga aggtttgttg 9480
agagaaatct tggaagctgc tttgagagct ccatctgctt ggaacttgca accatggaga 9540
atcgttgttg ttagagaccc agctactaag agagctttga gagaagctgc tttcggtcaa 9600
gctcacgttg aagaagctcc agttgttttg gttttgtacg ctgacttgga agacgctttg 9660
gctcacttgg acgaagttat ccacccaggt gttcaaggtg aaagaagaga agctcaaaag 9720
caagctatcc aaagagcttt cgctgctatg ggtcaagaag ctagaaaggc ttgggcttct 9780
ggtcaatctt acatcttgtt gggttacttg ttgttgttgt tggaagctta cggtttgggt 9840
tctgttccaa tgttgggttt cgacccagaa agagttagag ctatcttggg tttgccatct 9900
cacgctgcta tcccagcttt ggttgctttg ggttacccag ctgaagaagg ttacccatct 9960
cacagattgc cattggaaag agttgttttg tggagataag cttgttgtct acaaattata 10020
aaatagtttt ttataatcaa ccattaaata attttgtaca cttataataa cactttattt 10080
ctcgttccaa ttatgcgatg catgtgcctt ccgtttagag tgagcattat caaatataaa 10140
gtcaaatcct tttggcattt attttgattg aaacccagtc tgtccttaac tcttttgcct 10200
atcaaacgct gtaggtcact cttggtacgg tacagcggat agcgctattt attcagcaag 10260
agaagcaaga ttaggcgact acaatagatc aaaattttag gatcctctag agtcgacctg 10320
caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 10380
gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 10440
atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 10500
cctgtcgtgc cag 10513
<210> 3
<211> 10763
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 60
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 120
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 180
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 240
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 300
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 360
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 420
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 480
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 540
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 600
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 660
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 720
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 780
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 840
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 900
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 960
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 1020
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 1080
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 1140
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 1200
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 1260
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 1320
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 1380
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 1440
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 1500
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 1560
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 1620
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 1680
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 1740
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 1800
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 1860
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 1920
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 1980
ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 2040
acgaggccct ttcgtcttca agaattagct tttcaattca attcatcatt ttttttttat 2100
tctttttttt gatttcggtt tctttgaaat ttttttgatt cggtaatctc cgaacagaag 2160
gaagaacgaa ggaaggagca cagacttaga ttggtatata tacgcatatg tagtgttgaa 2220
gaaacatgaa attgcccagt attcttaacc caactgcaca gaacaaaaac atgcaggaaa 2280
cgaagataaa tcatgtcgaa agctacatat aaggaacgtg ctgctactca tcctagtcct 2340
gttgctgcca agctatttaa tatcatgcac gaaaagcaaa caaacttgtg tgcttcattg 2400
gatgttcgta ccaccaagga attactggag ttagttgaag cattaggtcc caaaatttgt 2460
ttactaaaaa cacatgtgga tatcttgact gatttttcca tggagggcac agttaagccg 2520
ctaaaggcat tatccgccaa gtacaatttt ttactcttcg aagacagaaa atttgctgac 2580
attggtaata cagtcaaatt gcagtactct gcgggtgtat acagaatagc agaatgggca 2640
gacattacga atgcacacgg tgtggtgggc ccaggtattg ttagcggttt gaagcaggcg 2700
gcagaagaag taacaaagga acctagaggc cttttgatgt tagcagaatt gtcatgcaag 2760
ggctccctat ctactggaga atatactaag ggtactgttg acattgcgaa gagcgacaaa 2820
gattttgtta tcggctttat tgctcaaaga gacatgggtg gaagagatga aggttacgat 2880
tggttgatta tgacacccgg tgtgggttta gatgacaagg gagacgcatt gggtcaacag 2940
tatagaaccg tggatgatgt ggtctctaca ggatctgaca ttattattgt tggaagagga 3000
ctatttgcaa agggaaggga tgctaaggta gagggtgaac gttacagaaa agcaggctgg 3060
gaagcatatt tgagaagatg cggccagcaa aactaaaaaa ctgtattata agtaaatgca 3120
tgtatactaa actcacaaat tagagcttca atttaattat atcagttatt acccaattct 3180
catgtttgac agcttatcat cgatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt ggcaagaata 3240
ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag actgcaacat 3300
actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg attcagaagc 3360
aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg gaaggcaaga 3420
gagccccgag agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa atgttggtga 3480
tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg agacaaatgg 3540
tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat aggttattac 3600
tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgcctg caagcctttt gaaaagcaag 3660
cataaaagat ctaaacataa aatctgtaaa ataacaagat gtaaagataa tgctaaatca 3720
tttggctttt tgattgattg tacaggaaaa tatacatcgc agggggttga cttttaccat 3780
ttcaccgcaa tggaatcaaa cttgttgaag agaatgttca caggcgcata cgctacaatg 3840
acccgattct tgctagcctt ttctcggtct tgcaaacaac cgccggcagc ttagtatata 3900
aatacacatg tacatacctc tctccgtatc ctcgtaatca ttttcttgta tttatcgtct 3960
tttcgctgta aaaactttat cacacttatc tcaaatacac ttattaaccg cttttactat 4020
tatcttctac gctgacagta atatcaaaca gtgacacata ttaaacacag tggtttcttt 4080
gcataaacac catcagcctc aagtcgtcaa gtaaagattt cgtgttcatg cagatagata 4140
acaatctata tgttgataat tagcgttgcc tcatcaatgc gagatccgtt taaccggacc 4200
ctagtgcact taccccacgt tcggtccact gtgtgccgaa catgctcctt cactatttta 4260
acatgtggaa ttaattctca tgtttgacag cttatcatcg aactctaaga ggtgatactt 4320
atttactgta aaactgtgac gataaaaccg gaaggaagaa taagaaaact cgaactgatc 4380
tataatgcct attttctgta aagagtttaa gctatgaaag cctcggcatt ttggccgctc 4440
ctaggtagtg ctttttttcc aaggacaaaa cagtttcttt ttcttgagca ggttttatgt 4500
ttcggtaatc ataaacaata aataaattat ttcatttatg tttaaaaata aaaaataaaa 4560
aagtatttta aatttttaaa aaagttgatt ataagcatgt gaccttttgc aagcaattaa 4620
attttgcaat ttgtgatttt aggcaaaagt tacaatttct ggctcgtgta atatatgtat 4680
gctaaagtga acttttacaa agtcgatatg gacttagtca aaagaaattt tcttaaaaat 4740
atatagcact agccaattta gcacttcttt atgagatata ttatagactt tattaagcca 4800
gatttgtgta ttatatgtat ttacccggcg aatcatggac atacattctg aaataggtaa 4860
tattctctat ggtgagacag catagataac ctaggataca agttaaaagc tagtactgtt 4920
ttgcagtaat ttttttcttt tttataagaa tgttaccacc taaataagtt ataaagtcaa 4980
tagttaagtt tgatatttga ttgtaaaata ccgtaatata tttgcatgat caaaaggctc 5040
aatgttgact agccagcatg tcaaccacta tattgatcac cgatatatgg acttccacac 5100
caactagtaa tatgacaata aattcaagat attcttcatg agaatggccc agcgatatat 5160
gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc 5220
attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca 5280
gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca 5340
gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attcgagctc tgtcaacgca gattaagcac 5400
accctaaaac ttgaataatg caaattccat agcttagttt aatcaaggcg ccattattcc 5460
tcagttgaaa agtatatcta atggttagga ttagaaatat gttcattgct cattgttatg 5520
tgtatcatat cgtacaaaaa ttatataaag aaataataat gaaaaagagt aaaacaaaga 5580
caaatagaca aaaatagagg atagaaaaag aaaaacaaca gatacataaa taagtcttat 5640
gacaaaaaaa cgattgtata aaaattaaag tgcatgccat ttttacctcc ttttgcttaa 5700
cttaaacttt tcattgcaat catttacaac ttagtttcag acttgaagta agcgtcagtg 5760
ataccagaga tcaaagcagc caaaccgata gcacctgggt ctggcaaacc accttcagat 5820
tcgaattgct tgaattcttc ttcagcaacg taagaagctc taccgaactt agcttccaac 5880
tttctagtag cttcagcacc gtcgtgagca gccttgttag ccaacttcaa gtccttagac 5940
ttagcgaatt ccttaacgaa tggttccaaa gcgtcgatca aagttctgtc accagttcta 6000
gctctagtgt acttgaacaa agattgcaaa gcagcttgca aagaaccaga gatagtttcc 6060
aaagtcaaag tgtaagcacc ttcagacaat tccttttcct tcaaagactt agccaaagca 6120
gagatgaaga tagagtacaa accaccagaa gtaccaccca tagcagtttc aacgatgtca 6180
gtgatttgaa ccaaagactt aacaccgtcc ttcaagtcca acttaccttc agccaaagcc 6240
ttcaagatag cgttagaacc gttagccaaa gtttcaccac agtcaccgtc accagcaaca 6300
gtgtcgtaca aagtgatctt tggttcctta gagataacct tcttaacacc agattccaac 6360
aagtcagcgt acaacttagc gtcaacagaa accttagaag aagagtcacc ttcgtcgatt 6420
tctggagcag caacgatgaa gttgtcaact ctaccagacc agtcagagat gttagagttc 6480
caacctggag cagaagtctt gtggtccaag aacttcaaga tgtccttgtc accagtctta 6540
gtagcgttca acaaagtgat agagaaacct ggaccgtcca aagaagtagt gaaagtacca 6600
gtgaagattc taactggctt gatagagtac ttagaagcca attggtcaac aacgatgttt 6660
tggatagcgt acaattccaa aacagaagta ccacccaagt tgttgatcaa caaaacaact 6720
tcgtcgttct tgtcgaattg aacgtagttt ctgtccttgt cagtagtaga caacaagtat 6780
tccaacaatt cagcaaccaa ttcgtcaaca gttgggattg gagaagactt cttgatacct 6840
ggttcgttgt ggatacccat accgatttcg aattcgtcgt gcttcaaaac ttcgtaaccg 6900
tgttcgtcgt cagagtcgtc ttcttcttgc ttgttagctc tagctgggat agtaacgtgg 6960
tccaaagaag caccgatagt aaccaagtta gcaacaacct tttcaccgaa agtaaccaat 7020
tggtgcaatt ccaagttgtc cttttgcaag taagccttag cacccaagat cttgtgaacc 7080
aaagaagtac cagccaaacc tcttctacca accaaaccgt tcttagcctt accaacagaa 7140
acgtcgtctt gaacgatcaa caattcagcg ttcaaacctt cagccttagc cttttcagca 7200
gccaaaccga agtgcaagat gtcaccagtg tagttcttaa cgatgatcaa agtacccttc 7260
ttagatggct tagccttgat agcagagaag atttgcttag tagatggaga agcgaagatg 7320
aaaccagcaa cagcagcgtc caacaaaccg tccttagtaa cgaaaccagc gtgcaatggt 7380
tcgtgaccag aaccaccacc agagatcaaa gtgatcttgt cttcttggtt ttcagcagag 7440
ataacaactc tttcagattc gatcaatcta acgtgtgggt tagattgaca caaaccagcc 7500
aagtgagaca aaaccaagtc cttcttgtag tcccagtgct tagaagacat tgtttttata 7560
tttgttgtaa aaagtagata attacttcct tgatgatctg taaaaaaaga gaaaaagaaa 7620
gcatctaaga acttgaaaaa actacgaatt agaaaagacc aaatatgtat ttcttgcatt 7680
gaccaattta tgcaagttta tatatatgta aatgtaagtt tcacgaggtt ctactaaact 7740
aaaccacccc cttggttaga agaaaagagt gtgtgagaac aggctgttgt tgtcacacga 7800
ttcggacaat tctgtttgaa agagagagag taacagtacg atcgaacgaa ctttgctctg 7860
gagatcacag tgggcatcat agcatgtggt actaaaccct ttcccgccat tccagaacct 7920
tcgattgctt gttacaaaac ctgtgagccg tcgctaggac cttgttgtgt gacgaaattg 7980
gaagctgcaa tcaataggaa gacaggaagt cgagcgtgtc tgggtttttt cagttttgtt 8040
ctttttgcaa acaaatcacg agcgacggta atttctttct cgataagagg ccacgtgctt 8100
tatgagggta acatcaattc aagaaggagg gaaacacttc ctttttctgg ccctgataat 8160
agtatgaggg tgaagccaaa ataaaggatt cgcgcccaaa tcggcatctt taaatgcagg 8220
tatgcgatag ttcctcactc tttccttact cacgagtaat tcttgcaaat gcctattgtg 8280
cagatgttat aatatctgtg cgtcttgagt tgaagtcagg aatctaaaat aacatgtagg 8340
tggcggaggg gagatataca atagaacaga taccagacaa gacataatgg gctaaacaag 8400
actacaccaa ttacactgcc tcattgatgg tggtacataa cgaactaata ctgtagccct 8460
agacttgata gccatcatca tatcgaagtt tcactaccct ttttccattt gccatctatt 8520
gaagtaataa taggcgcatg caacttcttt tctttttttt tcttttctct ctcccccgtt 8580
gttgtctcac catatccgca atgacaaaaa aatgatggaa gacactaaag gaaaaaatta 8640
acgacaaaga cagcaccaac agatgtcgtt gttccagagc tgatgagggg tatctcgaag 8700
cacacgaaac tttttccttc cttcattcac gcacactact ctctaatgag caacggtata 8760
cggccttcct tccagttact tgaatttgaa ataaaaaaaa gtttgctgtc ttgctatcaa 8820
gtataaatag acctgcaatt attaatcttt tgtttcctcg tcattgttct cgttcccttt 8880
cttccttgtt tctttttctg cacaatattt caagctatac caagcataca atcaactatc 8940
tcatatacaa tggctgctga aagagttttc atctctccag ctaagtacgt tcaaggtaag 9000
aacgttatca ctaagatcgc taactacttg gaaggtatcg gtaacaagac tgttgttatc 9060
gctgacgaaa tcgtttggaa gatcgctggt cacactatcg ttaacgaatt gaagaagggt 9120
aacatcgctg ctgaagaagt tgttttctct ggtgaagctt ctagaaacga agttgaaaga 9180
atcgctaaca tcgctagaaa ggctgaagct gctatcgtta tcggtgttgg tggtggtaag 9240
actttggaca ctgctaaggc tgttgctgac gaattggacg cttacatcgt tatcgttcca 9300
actgctgctt ctactgacgc tccaacttct gctttgtctg ttatctactc tgacgacggt 9360
gttttcgaat cttacagatt ctacaagaag aacccagact tggttttggt tgacactaag 9420
atcatcgcta acgctccacc aagattgttg gcttctggta tcgctgacgc tttggctact 9480
tgggttgaag ctagatctgt tatcaagtct ggtggtaaga ctatggctgg tggtatccca 9540
actatcgctg ctgaagctat cgctgaaaag tgtgaacaaa ctttgttcaa gtacggtaag 9600
ttggcttacg aatctgttaa ggctaaggtt gttactccag ctttggaagc tgttgttgaa 9660
gctaacactt tgttgtctgg tttgggtttc gaatctggtg gtttggctgc tgctcacgct 9720
atccacaacg gtttcactgc tttggaaggt gaaatccacc acttgactca cggtgaaaag 9780
gttgctttcg gtactttggt tcaattggct ttggaagaac actctcaaca agaaatcgaa 9840
agatacatcg aattgtactt gtctttggac ttgccagtta ctttggaaga catcaagttg 9900
aaggacgctt ctagagaaga catcttgaag gttgctaagg ctgctactgc tgaaggtgaa 9960
actatccaca acgctttcaa cgttactgct gacgacgttg ctgacgctat cttcgctgct 10020
gaccaatacg ctaaggctta caaggaaaag cacagaaagt aaatttattg gagaaagata 10080
acatatcata ctttccccca cttttttcga ggctcttcta tatcatattc ataaattagc 10140
attatgtcat ttctcataac tactttatca cgttagaaat tacttattat tattaaatta 10200
atacaaaatt tagtaaccaa ataaatataa ataaatatgt atatttaaat tttaaaaaaa 10260
aaatcctata gagcaaaagg attttccatt ataatattag ctgtacacct cttccgcatt 10320
ttttgagggt ggttacaaca ccactcattc agaggctgtc ggcacagttg cttctagcat 10380
ctggcgtccg tattccgata cgccttgtct ccaactcaat acagtcggta gctgaacgag 10440
aaaactcttg ataagctggg gaatggttct tggaagtagt ataggcgcca gctaggatct 10500
ttctcttccc agccccgttc tgtcaggtag aactcgtcca attgagacgg gatcctctag 10560
agtcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 10620
attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 10680
ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 10740
agtcgggaaa cctgtcgtgc cag 10763

Claims (5)

1.一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法，其特征在于，以丙三醇为原料，酿酒酵母菌为宿主菌，经过宿主菌体内若干酶的催化而完成；
所述宿主菌按下述方法构建获得：
1)根据酿酒酵母密码子偏好性优化基因GlyDH和DAK的密码子，然后利用双向启动子，将两个基因构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体1，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性和酿酒酵母的筛选标记URA基因；
2)依据酿酒酵母密码子偏好性对ceaS2基因及NOX基因进行优化，然后将两个基因同时构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体2，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因和酿酒酵母的筛选标记Leu基因；
3)敲除酿酒酵母BY4741中的PDC1基因、DLD1基因、GPD1基因和GPD2基因，得到经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2菌株；
4)将上述载体1和2同时转入3)中所描述的经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2中，根据酿酒酵母的筛选标记ura和Leu基因，筛选阳性克隆，然后提取酿酒酵母基因组，进一步PCR验证。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法，其特征在于，步骤1)中GlyDH和DAK基因分别根据嗜热脂肪土芽孢杆菌和毕赤酵母中相应基因的氨基酸序列来合成。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法，其特征在于，步骤2)中ceaS2和NOX基因分别根据棒状链霉菌和嗜热脂肪土芽孢杆菌相应基因的氨基酸序列来合成。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法，其特征在于，所述合成方法步骤如下：
1)根据酿酒酵母密码子偏好性优化基因GlyDH和DAK的密码子，然后利用双向启动子，将两个基因构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体1，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性和酿酒酵母的筛选标记URA基因；
2)依据酿酒酵母密码子偏好性对ceaS2基因及NOX基因进行优化，然后将两个基因同时构建于酿酒酵母表达载体YCplac33，得到载体2，表达载体YCplac33带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因和酿酒酵母的筛选标记Leu基因；
3)敲除酿酒酵母BY4741中的PDC1基因、DLD1基因、GPD1基因和GPD2基因，得到经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2菌株；
4)将上述载体1和2同时转入3)中所描述的经过改造的酿酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2中，根据酿酒酵母的筛选标记ura和Leu基因，筛选阳性克隆，然后提取酿酒酵母基因组，进一步PCR验证；
5)将酿酒酵母宿主菌培养，诱导表达；
6)在表达后的菌液中添加甘油底物，继续反应20-60h；
7)将反应液中的丙烯酸提取、分离纯化。
5.根据权利要求4所述的酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法，其特征在于，步骤6)中甘油的添加量为：10g/L-100g/L，反应温度为：25-35℃。
CN201810051564.6A 2018-01-19 2018-01-19 一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法 Active CN108004274B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810051564.6A CN108004274B (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810051564.6A CN108004274B (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108004274A CN108004274A (zh) 2018-05-08
CN108004274B true CN108004274B (zh) 2021-06-04

Family

ID=62050515

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810051564.6A Active CN108004274B (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108004274B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108728474A (zh) * 2018-06-25 2018-11-02 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 一种利用蓝藻合成丙烯酸的方法
CN109266565B (zh) * 2018-09-14 2022-05-13 中国科学技术大学 L-乳酸生产的耐热酵母工程菌株的构建及应用
WO2023049789A2 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Nitto Denko Corporation Yeast cells with reduced propensity to degrade acrylic acid

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101638676A (zh) * 2009-08-24 2010-02-03 山东禹王实业有限公司 一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法
WO2011003893A1 (en) * 2009-07-10 2011-01-13 Dsm Ip Assets B.V. Fermentative production of ethanol from glucose, galactose and arabinose employing a recombinant yeast strain
CN107586795A (zh) * 2017-10-10 2018-01-16 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 一种酿酒酵母发酵生产根皮素的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011003893A1 (en) * 2009-07-10 2011-01-13 Dsm Ip Assets B.V. Fermentative production of ethanol from glucose, galactose and arabinose employing a recombinant yeast strain
CN101638676A (zh) * 2009-08-24 2010-02-03 山东禹王实业有限公司 一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法
CN107586795A (zh) * 2017-10-10 2018-01-16 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 一种酿酒酵母发酵生产根皮素的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Direct fermentation route for the production of acrylic acid;Hun Su Chu等;《Metabolic Engineering》;20151231;全文 *
酿酒酵母乙醇及3-羟基丙酸代谢的辅因子工程研究;索凡;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20180831;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108004274A (zh) 2018-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109735479B (zh) 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN108004274B (zh) 一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法
US20050260625A1 (en) Process and system for crosslinking polynucleotide molecules
CN108998464B (zh) pSP107质粒及其应用、构建方法
CN102010870B (zh) 高表达量的溶血素基因及其分泌表达载体和应用
CN113166772B (zh) 具有1,3-pdo生产力和降低的3-hp生产力的重组棒状杆菌以及使用其生产1,3-pdo的方法
CN100510107C (zh) 一种分子量内标的制备方法及用该方法制备的分子量内标
CN113215155A (zh) 一种针对表位点为flyalalll的tcr所设计的引物及其应用
CN113388612A (zh) 一种针对表位点为iyvlvmlvl的tcr所设计的引物及其应用
CN113943782B (zh) 一种评估水体中2-甲基异莰醇浓度的方法
CN114195884B (zh) 一种重组人源胶原蛋白及其制备方法
CN107988202B (zh) 一种敲除酿酒酵母染色体的方法
CN114480499A (zh) 环状RNA分子表达元件以及环状RNA分子的表达载体circEXPRO
CN113493800B (zh) 一种提高酿酒酵母中异源蛋白分泌或表面展示表达的方法
CN110777146A (zh) 一种pdgfb启动子活性报告质粒的构建方法
CN112342216B (zh) 用于提高CHO细胞的表达效率的CRISPR-Cas13d***以及重组CHO细胞
CN113308466A (zh) 一种针对表位点为tygpvfmsl的tcr所设计的引物及其应用
CN111378677A (zh) 一种dna组装的方法及其应用
KR101562866B1 (ko) 2,3-부탄다이올 생산용 균주 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법
KR102176556B1 (ko) 스쿠알렌 생산이 증대된 균주 및 이를 이용한 스쿠알렌 생산방법
CN116497052A (zh) 一种生产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法
JP2711326B2 (ja) ブリ成長ホルモン構造遺伝子ｄｎａ
CN109706149B (zh) 一种改进的16S-seq方法及其应用
CN114574376A (zh) 一种高产类胡萝卜素的酿酒酵母Delta-M3及其应用
CN111690674A (zh) 一种用于嗜热微生物遗传操作的诱导型毒素-抗毒素元件

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210928

Address after: 518110 A1501, building 1, Yinxing Zhijie phase II, No. 1301-76, sightseeing Road, Xinlan community, Guanlan street, Longhua District, Shenzhen, Guangdong

Patentee after: Shenzhen small molecule New Drug Innovation Center Co.,Ltd.

Address before: Room 101, 3 Floors, 2 Buildings, 3 Floors, Zhejiang Euro-American Biotechnology Industrial Park, 501 Changsheng South Road, Nanhu District, Jiaxing City, Zhejiang Province

Patentee before: JIAXING SYNBIOLAB BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A method for producing acrylic acid by fermentation of Saccharomyces cerevisiae

Effective date of registration: 20230628

Granted publication date: 20210604

Pledgee: Shenzhen hi tech investment small loan Co.,Ltd.

Pledgor: Shenzhen small molecule New Drug Innovation Center Co.,Ltd.

Registration number: Y2023980046396

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right