ES2894126T3 - Métodos y composiciones para predecir la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar - Google Patents

Abstract

Un método para predecir el riesgo que tiene un sujeto trasplantado de pulmón de padecer la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (CLAD), que consta de las siguientes etapas: i) medir el nivel de expresión de TCL1A en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; ii) comparar el nivel de expresión de TCL1A con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el sujeto está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de TCL1A es menor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto no está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de TCL1A es mayor que el valor de referencia predeterminado; donde el riesgo de tener o no tener CLAD es respectivamente el riesgo de tener o no tener el síndrome de bronquiolitis obliterante (SBO).

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para predecir la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar

ÁMBITO DE LA PRESENTE INVENCIÓN:

La presente invención pertenece al campo del trasplante pulmonar y en particular permite identificar si un sujeto tiene riesgo de desarrollar el síndrome de bronquiolitis obliterante.

ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCIÓN:

La disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (CLAD) es la principal limitación de la supervivencia a largo plazo tras un trasplante de pulmón. La CLAD se manifiesta principalmente por una remodelación anormal de las vías respiratorias pequeñas, que produce una obstrucción progresiva del flujo de aire denominada síndrome de bronquiolitis obliterante (SBO) (1-3). Un proceso de ventilación limitada, denominado síndrome restrictivo del aloinjerto (SRA), ha sido descrito recientemente como otra forma de CLAD (4). La prevalencia de la CLAD llega al 50% a los 5 años (35% de SBO y 15% de SRA) en los receptores de trasplante pulmonar. Su diagnóstico tardío, basado en el deterioro de la función pulmonar, revela una degradación avanzada del aloinjerto. El pronóstico es malo, con una mediana de supervivencia de 4 y 2 años tras la aparición de SBO y SRA. Por lo tanto la identificación de precursores de CLAD en los receptores de trasplantes de pulmón es necesaria para permitir estrategias proactivas y específicas, a fin de dominar la progresión de la enfermedad antes de la degradación irreversible del aloinjerto.

Se supone que la CLAD surge como resultado de daños reiterados de mecanismos aloinmunes o no aloinmunes, que generan fibrosis y obstrucción de las vías respiratorias (5). El seguimiento de estos procesos inflamatorios y fibróticos se ha utilizado durante mucho tiempo para identificar los primeros signos de la enfermedad. Así, la neutrofilia BAL, los niveles de células T reguladoras, las quimiocinas/citocinas o las metaloproteasas matriciales (MMP) se han propuesto como biomarcadores tempranos de la CLAD (6-10). Más recientemente, mediante el perfilado de expresión de biopsias pulmonares se localizaron genes relacionados con la fibrosis, para diagnosticar o predecir la CLAD (11). Sin embargo, estos métodos invasivos centrados en los pulmones se vieron impedidos por la accesibilidad a muestras biológicas y por lo tanto son limitados para un control rutinario de los LTR (receptores de trasplante pulmonar). En sangre, los fibrocitos circulantes o la concentración de citocinas se han propuesto como posibles biomarcadores (12-15). Sin embargo, estos estudios correspondían a un número limitado de pacientes y aún falta la confirmación de los estudios de seguimiento. Por consiguiente ninguno de estos intentos ha demostrado suficiente viabilidad y consistencia para lograr la aceptación clínica. Por tanto existe la necesidad de conocer nuevos métodos que permitan investigar la CLAD y proporcionar biomarcadores tempranos de la misma.

RESUMEN DE LA PRESENTE INVENCIÓN:

La presente invención se refiere especialmente a un método para predecir el riesgo de un sujeto de padecer CLAD, que consta de las siguientes etapas:

i) medir el nivel de expresión de TCL1A en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto;

ii) comparar el nivel de expresión de TCL1A con un valor de referencia predeterminado y

iii) concluir que el sujeto está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de TCL1A es menor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto no está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de TCL1A es mayor que el valor de referencia predeterminado. En particular, la presente invención está definida por las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCIÓN:

Los inventores de la presente invención han usado un perfilado de expresión génica de sangre completa a gran escala para identificar biomarcadores tempranos de la CLAD. Los ensayos de micromatrices llevados a cabo en 80 pacientes (40 estables y 40 con SBO) identifican 47 genes expresados diferencialmente entre el grupo estable y el de SBO. A continuación se utilizó un conjunto independiente de pacientes (13 estables, 11 con SBO) para una validación externa por QPCR. El TCL1A se confirmó como marcador predictivo de SBO más de 6 meses antes del diagnóstico clínico.

Método para predecir el riesgo de un sujeto de padecer CLAD

Así, según un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para predecir el riesgo de un sujeto de padecer CLAD, que consta de las siguientes etapas: i) medir el nivel de expresión de TCL1A en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto; ii) comparar el nivel de expresión de TCL1A con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el sujeto está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de TCL1A es menor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto no está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de TCL1A es mayor que el valor de referencia predeterminado.

Tal como se emplea aquí, el término “predecir” se refiere a que el sujeto que debe analizarse mediante el método de la presente invención se asigna al grupo de sujetos que tendrán CLAD o a un grupo de sujetos que no tendrán CLAD.

Según la presente invención, la referencia a la CLAD significa, en particular, que el sujeto tendrá un mayor riesgo de desarrollar CLAD. Normalmente dicho riesgo es grande en comparación con el riesgo medio en una cohorte de sujetos trasplantados. En el marco de la presente invención se predecirá el riesgo de un sujeto de padecer CLAD. Tal como se emplea aquí, la frase “predecir el riesgo” se refiere a evaluar del modo aquí mencionado la probabilidad de que el paciente pueda tener CLAD. Como entenderán los especialistas en la materia, normalmente no se pretende que dicha evaluación sea correcta para el 100% de los sujetos investigados. Sin embargo la frase requiere que la predicción se pueda hacer de manera adecuada y correcta para una porción estadísticamente significativa de sujetos. El especialista en la materia puede determinar si una porción es estadísticamente significativa usando, sin más, varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, p.ej. determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. Los valores p son preferiblemente de 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001. Preferiblemente, la probabilidad contemplada por la presente invención permite que la predicción de un mayor riesgo sea correcta para al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de los sujetos de una determinada cohorte o población. La frase se refiere preferiblemente a la predicción de si existe o no un mayor riesgo de padecer CLAD respecto al riesgo medio de CLAD en una población de sujetos, en lugar de indicar una probabilidad precisa de dicho riesgo.

Tal como se emplea aquí, el término “CLAD” se refiere a una disfunción crónica del aloinjerto pulmonar. La CLAD es la principal limitación de la supervivencia a largo plazo después de un trasplante de pulmón. La prevalencia de CLAD es de alrededor del 50% a los 5 años (35% para el fenotipo SBO y 15% para el fenotipo SRA). Su diagnóstico tardío, basado en el declive de las funciones pulmonares, revela una degradación avanzada del aloinjerto. El pronóstico es malo, con una mediana de supervivencia de 4 y 2 años, respectivamente, para los fenotipos s Bo y SRA tras el inicio de la enfermedad. Concretamente, el método según la presente invención es apropiado para predecir el riesgo de tener SBO. Tal como se emplea aquí, el término “SBO” se refiere al síndrome de bronquiolitis obliterante. Se refiere a un trastorno pulmonar relacionado principalmente con la disfunción crónica del aloinjerto tras el trasplante de pulmón. El SBO se caracteriza por una inflamación y una fibrosis de las paredes bronquiolares que reduce el diámetro de los bronquiolos y da como resultado una obstrucción progresiva e irreversible del flujo de aire.

Tal como se usa aquí, el término “SRA” se refiere al síndrome restrictivo del aloinjerto (SRA). El SRA se caracteriza por un patrón de progresión escalonada, con daño tisular y lesiones fibróticas, que tiene lugar en la periferia de los pulmones (es decir, en la pleura visceral, en el intersticio alveolar y en los tabiques interlobulares), lo cual reduce la capacidad pulmonar total.

Tal como se utiliza aquí, el término “sujeto” se refiere a cualquier mamífero, por ejemplo un roedor, un felino, un canino y un primate. Especialmente, en la presente invención el sujeto es un ser humano. En una forma de ejecución particular el sujeto es una persona trasplantada. Tal como se usa aquí, el término “sujeto trasplantado”, también llamado sujeto injertado, se refiere a un sujeto que ha recibido el trasplante de un órgano. El término “trasplante de órganos” se refiere al procedimiento de sustitución de órganos, partes de órganos o tejidos enfermos por órganos o tejidos sanos. El órgano o tejido trasplantado puede obtenerse del propio sujeto (= autoinjerto), de otro donante humano (= aloinjerto) o de un animal (= xenoinjerto). Los órganos trasplantados pueden ser artificiales o naturales, íntegros (por ejemplo riñón, corazón, pulmón o hígado) o parciales (por ejemplo válvulas cardíacas, pulmón, piel y hueso). En una forma de ejecución particular el sujeto es una persona trasplantada de pulmón. En un caso particular, dicho sujeto trasplantado de pulmón puede haber sido injertado además con el hígado o el riñón del donante del pulmón o de otro donante.

Tal como se utiliza aquí, el término “TCL1A” se refiere a la proteína 1A del linfoma o leucemia de células T, que en los humanos es codificada por el gen TCL1A. El gen TCL1A humano de origen natural tiene una secuencia de nucleótidos como la indicada con el número de acceso al banco de genes NM_021966.2 (variante 1) y NM_001098725.1 (variante 2), y la proteína TCL1A humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada con el número de acceso al banco de genes NP_068801.1 (variante 1) y NP_001092195.1 (variante 2). El gen TCL1A murino de origen natural tiene una secuencia de nucleótidos como la indicada con los números de acceso al banco de genes NM_009337.3 (variante 1), NM_001289468.1 (variante 2), NM_001309485.1 (variante 4) y NM_001309484.1 (variante 5) y la proteína TCL1A murina de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada con los números de acceso al banco de genes NP_033363.1 (variante 1), NP_001276397.1 (variante 2), NP_001296414.1 (variante 4) y NP_001296413.1 (variante 5).

Tal como se emplea aquí, la expresión “nivel de expresión” se refiere al nivel de expresión del TCL1A con otros valores adicionales correspondientes a los parámetros clínicos. Usualmente el nivel de expresión del gen puede determinarse mediante cualquier tecnología conocida del especialista en la materia. En particular, cada nivel de expresión génica se puede medir a nivel genómico y/o nucleico y/o proteico. En una forma de ejecución particular, el nivel de expresión del gen se determina midiendo la cantidad de transcritos de ácido nucleico de cada gen. En otra forma de ejecución, el nivel de expresión se determina midiendo la cantidad de proteína correspondiente a cada gen. La cantidad de transcritos de ácido nucleico puede medirse mediante cualquier tecnología conocida por un especialista en la materia. En particular, la medición se puede llevar a cabo directamente en una muestra de ARN mensajero (ARNm) extraído, o en ADN complementario retrotranscrito (ADNc) preparado a partir de ARNm extraído mediante tecnologías bien conocidas del estado técnico. A partir de la muestra de ARNm o de ADNc, la cantidad de transcritos de ácido nucleico puede medirse usando cualquier tecnología conocida por un especialista en la materia, entre ellas, las micromatrices nucleicas, la PCR cuantitativa, las tarjetas microfluídicas y la hibridación con una sonda marcada. En una forma de ejecución particular, el nivel de expresión se determina mediante PCR cuantitativa. La PCR cuantitativa o en tiempo real es una tecnología bien conocida y fácilmente disponible para el especialista en la materia y no necesita una descripción precisa. Los métodos para determinar la cantidad de ARNm son bien conocidos del estado técnico. Por ejemplo, el ácido nucleico contenido en la muestra biológica se extrae primero siguiendo métodos estándar, por ejemplo usando enzimas líticos o soluciones químicas, o se extrae mediante resinas fijadoras de ácidos nucleicos según las instrucciones del fabricante. Luego el ARNm extraído se detecta por hibridación (p.ej. por análisis de transferencia Northern) y/o amplificación (p.ej. por RT-PCR). Habitualmente se prefiere la RT-PCr cuantitativa o semicuantitativa. La RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa en tiempo real es especialmente ventajosa. Otros métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) y amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA). Los ácidos nucleicos de al menos 10 nucleótidos que muestran complementariedad de secuencia u homología con el ARNm de interés encuentran aquí utilidad como sondas de hibridación o cebadores de amplificación. Se entiende que dichos ácidos nucleicos no necesitan ser idénticos, pero suelen ser al menos un 80% aproximadamente idénticos a la región homóloga de tamaño comparable, con mayor preferencia un 85% idénticos e incluso un 90-95% idénticos. En ciertas formas de ejecución será ventajoso usar ácidos nucleicos en combinación con medios apropiados, tales como un marcador detectable, para revelar la hibridación. En el estado técnico se conoce una amplia variedad de indicadores apropiados, que incluye ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos u otros (p.ej. avidina/biotina). Las sondas comprenden normalmente ácidos nucleicos monocatenarios de entre 10 y 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo entre 10 y 800, con mayor preferencia entre 15 y 700, habitualmente entre 20 y 500. Los cebadores suelen ser ácidos nucleicos monocatenarios más cortos, de entre 10 y 25 nucleótidos de longitud, que están diseñados para coincidir perfecta o casi perfectamente con un ácido nucleico de interés que debe ser amplificado. Las sondas y los cebadores son “específicos” de los ácidos nucleicos con los que se hibridan, es decir, con los que se hibridan preferiblemente en condiciones de hibridación muy rigurosas (correspondientes a la temperatura de fusión Tm más elevada, p.ej. 50% de formamida, 5x o 6x SCC. El tampón SCC es NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M). Los cebadores o sondas de ácido nucleico usados en el anterior método de amplificación y detección pueden ensamblarse como un kit. Dicho kit incluye cebadores de consenso y sondas moleculares. Un kit también lleva los componentes necesarios para determinar si ha ocurrido la amplificación. El kit también puede incluir, por ejemplo, tampones de PCR y enzimas, secuencias de control positivo, cebadores de control de reacción e instrucciones para amplificar y detectar las secuencias específicas. En una forma de ejecución particular, el método de la presente invención incluye las etapas de preparar el ARN total extraído de una muestra biológica y someterlo a amplificación e hibridación con sondas específicas, de manera más concreta mediante una RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa. En otra forma de ejecución, el nivel de expresión se determina por análisis con un chip de ADN. Dicho chip de ADN o micromatriz de ácidos nucleicos consta de diferentes sondas de ácido nucleico unidas químicamente a un substrato, que puede ser un microchip, un portaobjetos de vidrio o una perla del tamaño de una microesfera. Un microchip puede estar constituido por polímeros, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales silíceos, carbono, metales, vidrios inorgánicos o nitrocelulosa. Las sondas incluyen ácidos nucleicos tales como ADNc u oligonucleótidos que pueden tener aproximadamente 10 hasta 60 pares de bases. Para determinar el nivel de expresión se marca una muestra biológica de un sujeto objeto de ensayo, primero sometida opcionalmente a una transcripción inversa, y se pone en contacto con la micromatriz en condiciones de hibridación, lo cual da lugar a la formación de complejos entre los ácidos nucleicos diana que son complementarios de las secuencias de las sondas adheridas a la superficie de la micromatriz. Luego los complejos hibridados y marcados se detectan y se pueden cuantificar o semicuantificar. El marcaje se puede conseguir por varios métodos, p.ej. mediante el uso de marcadores radiactivos o fluorescentes. El especialista en la materia dispone de muchas variantes de la tecnología de hibridación de micromatrices (véase p.ej. la revisión de Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210).

Tal como se usa aquí, el término “muestra biológica” se refiere a cualquier muestra obtenida de un sujeto trasplantado, por ejemplo una muestra de suero, una muestra de plasma, una muestra de orina, una muestra de sangre, una muestra de linfa o una biopsia tisular. En una forma de ejecución particular, las muestras biológicas para la determinación de un nivel de expresión incluyen muestras tales como una muestra de sangre, de linfa o una biopsia. En una forma de ejecución particular la muestra biológica es una muestra de sangre, más concretamente de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Normalmente, estas células se pueden extraer de la sangre completa utilizando Ficoll, un polisacárido hidrófilo que separa capas de sangre, formando las CMSP un anillo celular debajo de una capa de plasma. Las CMSP también se pueden extraer de la sangre completa mediante una lisis hipotónica, que lisará preferentemente los glóbulos rojos. Dichos procedimientos son conocidos de los especialistas en la materia.

Tal como se usa aquí, la expresión “valor de referencia predeterminado” se refiere a un valor umbral o a un valor límite. Habitualmente, un “valor umbral” o “valor límite” se puede determinar de manera experimental, empírica o teórica. También se puede elegir arbitrariamente un valor umbral basándose en las condiciones experimentales y/o clínicas existentes, como admitiría un especialista en la materia. Por ejemplo, las mediciones anteriores en muestras históricas de sujetos debidamente depositadas pueden utilizarse para establecer el valor de referencia predeterminado. El valor umbral debe determinarse para obtener la sensibilidad y especificidad óptimas de acuerdo con el objeto de la prueba y el balance beneficio/riesgo (consecuencias clínicas de falsos positivos y falsos negativos). En general la sensibilidad y la especificidad óptimas (y por consiguiente el valor umbral) se pueden determinar mediante una curva característica receptor-operador (CRO) basada en los datos experimentales. Por ejemplo, una vez determinado el nivel de expresión del péptido escogido en un grupo de referencia, se puede realizar un análisis algorítmico para el tratamiento estadístico de los niveles de expresión determinados en las muestras analizadas, obteniéndose así un patrón significativo de clasificación de las muestras. El nombre completo de la curva CRO es curva característica receptor-operador, también conocida como curva característica operativa del receptor. Se usa principalmente para pruebas clínicas de diagnóstico bioquímico. La curva CRO es un indicador completo que refleja las variables continuas de la proporción de verdaderos positivos (sensibilidad) y de la proporción de falsos positivos (1-especificidad). Revela la relación entre sensibilidad y especificidad mediante el método de composición de imágenes. Una serie de diferentes valores límite (valores umbral o críticos, valores límite entre resultados normales y anormales de la prueba diagnóstica) se establecen como variables continuas para calcular una serie de valores de sensibilidad y especificidad. Luego se toma la sensibilidad en el eje de ordenadas y la especificidad en el eje de abscisas para dibujar una curva. Cuanto mayor sea el área bajo la curva (ABC), mayor será la precisión del diagnóstico. En la curva CRO, el punto más cercano al extremo superior izquierdo del diagrama de coordenadas es un punto crítico que tiene valores elevados de sensibilidad y especificidad. El valor ABC de la curva CRO varía entre 1,0 y 0,5. Cuando el ABC > 0,5, el resultado del diagnóstico mejora cada vez más a medida que el ABC se acerca a 1. Cuando el ABC está entre 0,5 y 0,7, la precisión es baja. Cuando el ABC está entre 0,7 y 0,9, la precisión es moderada. Cuando el ABC es superior a 0,9, la precisión es alta. Este método algorítmico se realiza preferiblemente con un ordenador. Para trazar la curva CRO se puede usar software o sistemas existentes del estado técnico como: software estadístico médico MedCalc 9.2.0.1, SPSS 9.0, ROCPOWER.SAS, DESIGNROC.FOR, MULTIREADER POWER.SAS, CREATE-ROC.SAS, GB STAT VI0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Maryland, EUA), etc.

Método para prevenir el riesgo de tener CLAD

En un segundo aspecto la presente invención se refiere al uso de un agente en un método para prevenir el riesgo de un sujeto de tener CLAD, que incluye una etapa de administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de fármacos inmunosupresores.

En el contexto de la presente invención, la frase “prevenir el riesgo” o “tratamiento profiláctico”, tal como se usa aquí, se refiere tanto al tratamiento como al tratamiento curativo o modificador de la enfermedad, incluido el tratamiento de los sujetos con riesgo de contraer la enfermedad o que presuntamente la hayan contraído, así como los sujetos que están enfermos o han sido diagnosticados de padecer una enfermedad o afección médica, e incluye la supresión de la recaída clínica. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que tenga un trastorno médico o que finalmente puede adquirirlo, a fin de prevenir, curar, retrasar el inicio, reducir la gravedad o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o de un trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento. Por “régimen terapéutico” se entiende el patrón de tratamiento de una enfermedad, por ejemplo la pauta de dosificación durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La frase “régimen de inducción” o “período de inducción” se refiere a un régimen terapéutico (o a la parte de un régimen terapéutico) que se utiliza para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción consiste en administrar un elevado nivel de fármaco a un sujeto durante el período inicial de un régimen de tratamiento. En un régimen de inducción se puede aplicar (parcial o totalmente) un “régimen de carga”, el cual puede incluir la administración de una dosis del fármaco mayor que la que utilizaría un médico durante un régimen de mantenimiento, la administración de un fármaco con una frecuencia superior a la que un médico establecería durante un régimen de mantenimiento, o ambas. La frase “régimen de mantenimiento” o “período de mantenimiento” se refiere a un régimen terapéutico (o a la parte de un régimen terapéutico) utilizado para el mantenimiento de un sujeto durante el tratamiento de una enfermedad, p.ej. para mantener al sujeto en remisión durante largos períodos de tiempo (meses o años). En un régimen de mantenimiento se puede utilizar una terapia continua (p.ej. la administración de un fármaco a intervalos regulares, p.ej. semanal, mensual, anual, etc.) o una terapia intermitente (p.ej. un tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, un tratamiento en caso de recaída o el tratamiento según un particular criterio predeterminado [p.ej. dolor, manifestación patológica, etc.]).

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad mínima de agente activo, necesaria para impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. Por ejemplo, una “cantidad terapéuticamente eficaz” para un sujeto es una cantidad que induce, mejora o produce una mejora de los síntomas patológicos, de la evolución de la enfermedad o de las condiciones fisiológicas relacionadas con ella o de la resistencia a sucumbir a un trastorno.

Tal como se usa aquí, el término “sujeto” corresponde al sujeto anteriormente descrito. Normalmente, el sujeto es un sujeto trasplantado. Más concretamente, el sujeto es un sujeto trasplantado de pulmón. En una forma de ejecución particular el sujeto tiene presuntamente SBO. En otra forma de ejecución el sujeto tiene presuntamente SRA.

Tal como se usa aquí, el término “fármacos inmunosupresores” también conocidos como agentes inmunosupresores o medicaciones antirrechazo son fármacos que inhiben o evitan la actividad del sistema inmunitario. Normalmente, el sujeto se trata con fármacos inmunosupresores u otros fármacos conocidos actualmente del estado técnico o que se encontrarán en el futuro. En una forma de ejecución particular, el sujeto está bajo tratamiento inmunosupresor cuando se le administran uno o más fármacos inmunosupresores. Los fármacos inmunosupresores que pueden emplearse en los procedimientos de trasplante incluyen: corticosteroides, inhibidores de la calcineurina (ciclosporina, tacrolimus), azatioprina, micofenolato de mofetilo e inhibidores de tirosina cinasa (everolimus, sirolimus). Estos fármacos pueden usarse en monoterapia o en terapias combinadas. En el caso del trasplante pulmonar se suelen utilizar los siguientes protocolos inmunosupresores. Los sujetos con trasplante de pulmón primario reciben un tratamiento de inducción. Los protocolos varían en gran medida entre los centros en todo el mundo, pero generalmente incluyen inyecciones de ATG (globulina anti-timocitos) o basiliximab (otras opciones son los anticuerpos anti CD3 y anti CD5), dosis elevadas de corticosteroides (> 1 mg/kg/día), un inhibidor de la calcineurina y un cuarto tratamiento inmunosupresor (MMF o azatioprina) o una combinación de dosis altas de corticosteroides, inhibidores de calcineurina y un tercer tratamiento inmunosupresor (MMF o azatioprina). Después se reduce la corticoterapia progresivamente hasta una dosis baja de mantenimiento de por vida (p.ej. de 5 a 10 mg/día).

El uso del agente en el método según la presente invención consiste en i) determinar si el sujeto está en riesgo de tener CLAD de acuerdo con el método descrito anteriormente y ii) administrar a dicho sujeto una cantidad terapéutica de fármacos inmunosupresores si el nivel de expresión de TCL1A es menor que el valor de referencia predeterminado. Normalmente, al sujeto se le administra una cantidad terapéutica incrementada de fármacos inmunosupresores.

Método de retirada gradual de la terapia inmunosupresora

En un tercer aspecto la presente invención se refiere a un método para identificar a un sujeto en tratamiento de terapia inmunosupresora como candidato a la retirada o minimización de la terapia inmunosupresora, que consta de las etapas siguientes: i) determinar si el sujeto está en riesgo de tener CLAD según el método descrito anteriormente; y ii) concluir que el sujeto es apto para la retirada o minimización de la terapia inmunosupresora si no está en riesgo de tener CLAD.

El método según la presente invención se refiere concretamente a cuando el sujeto corre el riesgo de tener SBO.

Tal como se usa aquí, la frase “retirada o minimización de la terapia inmunosupresora” se refiere a la disminución progresiva y, opcionalmente, a la posible supresión de una terapia inmunosupresora.

Kit

En otro aspecto la presente revelación se refiere a un kit para determinar si un sujeto tiene riesgo de padecer CLAD, el cual comprende al menos un reactivo para la determinación del nivel de expresión del TCL1A.

Tal como se usa aquí, la frase “un reactivo para la determinación de un nivel de expresión” se refiere a un reactivo que permite específicamente la determinación de dicho nivel de expresión, es decir, un reactivo destinado concretamente a la determinación específica del nivel de expresión de los genes comprendidos en el perfilado de expresión. Esta definición excluye los reactivos genéricos utilizables para la determinación del nivel de expresión de cualquier gen, tales como la taq polimerasa o un tampón de amplificación, aunque tales reactivos también pueden incluirse en un kit de acuerdo con la presente revelación.

En algunas formas de ejecución, el kit según la presente revelación puede incluir instrucciones para determinar si un sujeto está en riesgo de padecer CLAD. Las instrucciones para determinar si un sujeto está en riesgo de tener CLAD (SBO o SRA) pueden incluir al menos un perfilado de expresión de referencia. En una forma de ejecución particular, al menos un perfilado de expresión de referencia es estable. Alternativamente, al menos un perfilado de expresión de referencia puede ser intolerante al injerto (p.ej. un perfilado de expresión obtenido de un sujeto sano).

La presente invención se ilustrará con más detalle mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitativos del alcance de la presente invención. El alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

FIGURAS:

Figura 1. Validación por qPCR. Los datos de expresión de genes en micromatrices (histogramas de barras) fueron validados por qPCR en un grupo independiente de pacientes (histogramas de puntos). El panel superior muestra la comparación entre STA y PRED (A) y el panel inferior la comparación entre STA y DIAG (B).

Figura 2. Rendimiento del TCL1A en la predicción de SBO. (A) Curva CRO de POU2AFl, TCL1A y BLK para la predicción de SBO. (B) Análisis Kaplan-Meier de supervivencia libre de SBO categorizada por los mejores umbrales de expresión discriminantes en las curvas CRO.

EJEMPLO:

Materiales y métodos

Pacientes

Los LTR fueron reclutados de la cohorte multicéntrica COLT (de trasplantados de pulmón) (NCT00980967). El estudio fue aprobado por el comité local de ética (Comité de Protection des Personnes Ouest 1-Tours, 2009-A00036-51) y todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito. Los pacientes fueron definidos como STA o SBO por un comité de adjudicación ciega basándose en pruebas de función pulmonar: disminución > 20% del volumen espiratorio forzado persistente en 1 segundo (FEV1) desde la línea base para el grupo SBO; imágenes torácicas para confirmar el diagnóstico; y ausencia de factores de confusión según las guías ISHLT/ERS/ATS (21, 22). Los pacientes estables no presentan ningún signo de disfunción crónica durante al menos 3 años después del trasplante de pulmón. Se incluyeron 80 pacientes (40 STA y 40 SBO) en el grupo de identificación y 24 en el grupo de validación (13 STA y 11 SBO)

Aislamiento de ARN

Se recogieron muestras de sangre periférica en tubos PAXgene (PreAnalytix, Qiagen) y se conservaron a -80°C. No se informó de ninguna infección o rechazo agudo durante un mes antes o después de la extracción de sangre. El ARN total se extrajo utilizando el kit del sistema de ARN sanguíneo PAXgene con un protocolo de digestión de ADNasa en columna, siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad y la calidad del ARN total se determinaron usando un bioanalizador 2100 (Agilent Technologies Incorporation). Los análisis de micromatrices y qPCR de ARN se realizaron con un número de integridad de ARN (RIN) superior a 6,5.

Análisis de micromatrices de expresión génica

Con 100 ng del ARN total se prepararon ARN marcados con cianina-3 y cianina-5 usando el kit de marcaje Two Color Agilent Low Input Quick Amp y siguiendo las instrucciones del fabricante (Agilent Technologies Inc, Palo Alto, CA, EUA). Las muestras de ARNc marcadas se hibridaron en micromatrices de expresión génica humana SurePrint G3 v3 8x60K (Agilent). Los valores mediana de intensidad de las características se extrajeron mediante el software Feature Extraction v10.7 (Agilent Technologies). A fin de eliminar el sesgo de la intensidad de señal entre cada matriz, las medianas de intensidad de las características se normalizaron con el método lowess (regresión local ponderada de gráficos de dispersión), luego se eliminaron los puntos correspondientes a la mitad de las muestras que mostraron una señal menor que la media de todas las medianas de las señales. En los 28.867 puntos restantes se llevó a cabo la corrección entre 2 lotes de hibridación en micromatriz con el algoritmo Combat (23), disponible mediante el paquete R sva (24). Los datos normalizados de las micromatrices se depositaron en la base de datos Gene Expression Om inbus (GEO) (número de acceso GSE94557). Para identificar los genes diferenciales se realizó la prueba t de Student comparando el grupo STA con cada grupo de interés, empleando el paquete limma en R. Los genes con los valores p inferiores al 5% y el factor multiplicador del cambio (FC) superior a 1,5 se consideraron expresados diferencialmente. La importancia biológica de los genes seleccionados se evaluó utilizando el software GOminer. Solo se seleccionaron las categorías GO enriquecidas con una tasa de falso descubrimiento (TFD) inferior al 5% y con al menos 5 genes representados. La fuente de tipo celular de los genes diferenciales se evaluó utilizando la herramienta web de análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes Enrichr (25).

PCR cuantitativa (qPCR) para la validación de las micromatrices

Los resultados de las micromatrices se validaron por qPCR con una serie de muestras independientes. Después de realizar la transcripción inversa con Superscript III (Invitrogen) se efectuó una PCR cuantitativa en tiempo real con un sistema Taqman StepOne plus real time PCR (Applied Biosystems), utilizando cebadores disponibles comercialmente: HPRT1 (Hs99999909_m1), P2M (Hs00984230_m1), ACTB (Hs99999903_m1), CD19 (Hs99999192_m1), TCL1A (Hs00951350_m1) ELANE (Hs00975994_g1), AZU1 (Hs00156049_m1), FCRL6 (Hs02341772_m1), IGLL5 (Hs04330879_u1), POU2AF1 (Hs01573371_m1), BLK (Hs01017452_m1), DEFA3 (Hs00414018_m1) and OLFM4 (Hs00197437_m1). Las muestras se procesaron por duplicado y para la normalización se usó la media geométrica de los valores del ciclo de cuantificación (Cq) para HPRT1, p2M y ACTB. La expresión relativa entre una muestra y una referencia se calculó según el método 2-AACT.

Estadísticas

Para los ensayos de QPCR se aplicó la prueba no paramétrica de Whitney, empleando el programa GraphPad Prism (software Graphpad, La Jolla, California, EUA). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Resultados

Receptores de trasplante de pulmón

Los LTR incluidos en este estudio se reclutaron de la cohorte multicéntrica COLT. La COLT permitió llevar a cabo un seguimiento longitudinal, con control y biocolección de los pacientes cada 6 meses después del trasplante. Gracias al seguimiento longitudinal definimos dos clases de muestras de SBO según el tiempo transcurrido entre la extracción de sangre y el diagnóstico de CLAD (definido como el momento en que la disminución del FEV1 era > 20% desde la línea base) (datos no mostrados). Las muestras de sangre recogidas al menos 6 meses antes del diagnóstico de CLAD se incorporaron a la clase de predicción (PRED) y las muestras de sangre recogidas en el momento del diagnóstico de CLAD o más tarde (hasta 13 meses después del diagnóstico) se incorporaron a la clase de diagnóstico (DIAG) (datos no mostrados). En ambas clases no se incluyó ningún paciente duplicado. En el grupo estable (STA) se extrajo sangre a los 6 y 12 meses después del trasplante y se compararon estos 2 momentos para excluir genes irrelevantes alterados por el tiempo posterior al trasplante (datos no mostrados). Los grupos de LTR fueron homogéneos en cuanto a edad, sexo, IMC, tipo de trasplante, tratamiento de inducción e incidencias de infección y rechazo. Se observó una diferencia en la exposición a la azitromicina en la serie de identificación entre los grupos STA y SBO (52,5% frente a 82,4 y 91,3%, p = 0,0024). Aunque no es significativo, se observaron proporciones similares en la serie de validación (46,2% frente a 87,5 y 81,8%, p = 0,071). El momento de la extracción de sangre fue diferente entre los grupos. Cabe destacar que el tiempo de recogida para los grupos STA cubrió el tiempo de recogida para los grupos PRED (196 y 376 días en V3 y V4, respectivamente, frente a 260 días en la serie de identificación; y 185 y 364 días en V3 y V4, respectivamente, frente a 311 días en la serie de validación).

Identificación de firmas génicas relacionadas con la CLAD

El perfilado de expresión génica identificó un total de 47 transcripciones expresadas diferencialmente entre los grupos STA y BOS (datos no mostrados). La comparación entre los grupos STA y PRED localizó 34 transcripciones (52 sondas) expresadas diferencialmente. El análisis GO puso de relieve el enriquecimiento de 6 genes relacionados con el sistema inmunitario (GO: 0006955, respuesta inmunológica, FDR = 0,031 y GO: 0002376 proceso del sistema inmunitario, FDR = 0,048) (datos no mostrados), que son los genes codificadores del CD19 (CD19, log2FCSBO/STA = -0,65), del principal complejo de histocompatibilidad de clase II DQa1 (HLA-DQA1; log2FCSBO/STA = -0,63) y DQa2 (HLA-DQA2, log2FCSBO/STA = -0,61), del polipéptido 1 de tipo inmunoglobulina lambda (IGLL1, log2FCSBO/STA = -0,69), del factor 1 asociado a POU clase 2 (POU2AF1, log2FcSBO/STA = -0,77) y del factor de transcripción Spi-B (SPIB, log2FCSBO/STA = -0,63). El análisis mediante el uso de la herramienta Enrichr destacó el enriquecimiento de genes relacionados con las células B CD19+, entre ellos CD19, HLA-DQA1, POU2AF1, la proteína 3 del linfocito pre-B (VPREB3, log2FCSBO/STA = -0,76), tirosina cinasa linfoide B (BLK, log2FCSBO/STA = -0,66) y la proteína 1A del linfoma/leucemia de células T (TCL1A, log2FCSBO/STA = -0,83). El agrupamiento jerárquico no supervisado de todos los genes expresados reveló que estos genes estaban en el mismo grupo que otros genes conocidos relacionados con células B, como MS4A1 (4 dominios que atraviesan la membrana, subfamilia A, miembro 14 también denominado molécula CD20), BANK1 (proteína de andamio de células B con repeticiones de anquirina 1) y CD40, lo cual confirma la probable correspondencia entre los genes relacionados con células B y la predicción de s Bo .

Comparando el grupo STA con el grupo DIAG pusimos de relieve 27 transcripciones únicas (37 sondas) con expresión diferencial significativa (datos no mostrados). El análisis GO reveló genes relacionados con la respuesta de defensa biológica (datos no mostrados) (p.ej. GO: 0009617, respuesta a una bacteria, FDR < 0,0001, GO: 0006952, respuesta de defensa, FDR = 0,0002), en concreto de fosfatasa alcalina en hígado/hueso/riñón (ALPL, log2FCSBO/STA = -0,68), azurocidina 1 (AZU1, log2FCSBO/STA = -0,95), catepsina G (CTSG, log2FCSBO/STA = -0,99), defensina alfa 3 (DEFA3, log2FCSBO/STA = -1,23), defensina alfa 4 (DEFA4, log2FCSBO/STA = -1,23), de la elastasa expresada mediante neutrófilos (ELANE, log2FcSBO/STA = -0,98), proteína de reconocimiento de peptidoglicano 1 (PGLYRP1, FC = -0,94) y espondina 2 (SPON2, log2FCSBO/STA = 0,62).

Es de destacar que 11 transcritos se relacionaron con SBO, tanto con grupos DIAG como PRED, entre ellos TCL1A, VPREB3 y varias regiones variables de cadena ligera de inmunoglobulina kappa y lambda.

Validación del TCL1A como biomarcador predictivo de CLAD

Ya patentamos la identificación del POU2AF1 y del BLK como biomarcadores predictivos de CLAD. Además de estos biomarcadores, identificamos un nuevo gen, el TCL1A, como otro biomarcador de CLAD. Se midieron por qPCR diez genes elegidos según sus valores p y el factor multiplicador del cambio (FC) en un grupo independiente de pacientes (datos no mostrados). Se inscribieron veinticuatro pacientes (13 STA y 11 SBO) para 11 y 8 muestras respectivamente en las clases PRED y DIAG (datos no mostrados). La regulación a la baja de la expresión de TCL1A (p = 0,0257) en el grupo PRED fue validada por qPCR (figura 1A). En cambio no se confirmó la regulación a la baja de CD19 e IGLL5, aunque se pudo observar una tendencia para el CD19 (p = 0,0725). Cabe destacar que la expresión de TCL1A y BLK fue constante en el grupo STA, entre los 6 y 12 meses después del trasplante (datos no mostrados). Con fines de diagnóstico confirmamos la regulación al alza de FCRL6 (p = 0,0174) y la regulación a la baja de TCL1A (p = 0,0265) (figura 1B). No pudimos extrapolar los datos de expresión génica en un grupo de 7 pacientes con síndrome restrictivo del aloinjerto (SRA) (no mostrado), lo cual remarca la especificidad de la firma transcriptómica para el subtipo SBO. El TCL1A se expresó de forma diferencial en el grupo PRED, es decir, más de 6 meses antes del diagnóstico clínico de SBO. Por lo tanto decidimos evaluar el rendimiento de este marcador para la predicción de la enfermedad. La curva CRO indicó que la expresión de TCL1A (ABC 0,773, IC del 95% = 0,553 a 0,993) discriminaba bien el grupo STA de los pacientes con SBO (figura 2A). Los rendimientos globales de la predicción muestran una precisión superior al 80% para los tres marcadores. La expresión de POU2AF1, TCL1A y BLK estuvo muy correlacionada (datos no mostrados) y subsiguientemente el rendimiento de la predicción no mejoró mediante la combinación de los tres marcadores (datos no mostrados). Luego realizamos análisis Kaplan-Meier para investigar la supervivencia libre de SBO con respecto a la expresión del TCL1A. Tal como se muestra en la figura 2B, el nivel de TCL1A por debajo de 0,34 (correspondiente a los mejores umbrales de expresión según las curvas CRO) redujo significativamente la probabilidad de supervivencia libre de SBO después del trasplante de pulmón (p < 0,01).

Como conclusión, con el perfilado de sangre total identificamos y validamos el TCL1A como biomarcador predictivo de SBO, más de 6 meses antes del diagnóstico. Este gen permite clasificar el riesgo de CLAD y se podría controlar fácilmente con el fin de proporcionar a los médicos nuevas herramientas para la mejora del seguimiento y la adaptación del tratamiento del paciente con probabilidad de desarrollar CLAD antes de las manifestaciones clínicas y los daños del aloinjerto.

REFERENCIAS:

Varias referencias lo largo de esta solicitud describen el estado técnico al cual pertenece la presente invención.

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Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir el riesgo que tiene un sujeto trasplantado de pulmón de padecer la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (CLAD), que consta de las siguientes etapas:

i) medir el nivel de expresión de TCL1A en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto;

ii) comparar el nivel de expresión de TCL1A con un valor de referencia predeterminado y

iii) concluir que el sujeto está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de TCL1A es menor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto no está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de TCL1A es mayor que el valor de referencia predeterminado;

donde el riesgo de tener o no tener CLAD es respectivamente el riesgo de tener o no tener el síndrome de bronquiolitis obliterante (SBO).

2. El método según la reivindicación 1, en el cual el sujeto está trasplantado de pulmón.

3. Fármaco inmunosupresor para prevenir el riesgo de un sujeto de padecer CLAD, incluida la determinación de si el sujeto está en riesgo de tener CLAd según la reivindicación 1.

4. Un método para identificar a un sujeto sometido a una terapia inmunosupresora como candidato a la retirada o minimización de la terapia inmunosupresora, que consta de las etapas siguientes: i) determinar si el sujeto está en riesgo de tener CLAD según el método de la reivindicación 1; y ii) concluir que el sujeto es apto para la retirada o minimización de la terapia inmunosupresora si no está en riesgo de tener CLAD, siendo CLAD el s Bo .