ES2893482T3 - Métodos y composiciones para predecir la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar - Google Patents

Abstract

Un método para predecir el riesgo que tiene un sujeto trasplantado de pulmón de padecer la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (CLAD), que consta de las siguientes etapas: i) medir el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK en una muestra de sangre obtenida de dicho sujeto; ii) comparar el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el sujeto está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK es menor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto no está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK es mayor que el valor de referencia predeterminado.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para predecir la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar

ÁMBITO DE LA PRESENTE INVENCIÓN:

La presente invención pertenece al campo del trasplante pulmonar y en particular permite identificar si un sujeto tiene riesgo de desarrollar el síndrome de bronquiolitis obliterante.

La presente invención se expone en la serie de reivindicaciones adjunta.

ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCIÓN:

La disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (CLAD) es la principal limitación de la supervivencia a largo plazo tras un trasplante de pulmón. La CLAD se manifiesta principalmente por una remodelación anormal de las vías respiratorias pequeñas, que produce una obstrucción progresiva del flujo de aire denominada síndrome de bronquiolitis obliterante (SBO) (1-3). Un proceso de ventilación limitada, denominado síndrome restrictivo del aloinjerto (SRA), ha sido descrito recientemente como otra forma de CLAD (4). La prevalencia de la CLAD llega al 50% a los 5 años (35% de SBO y 15% de SRA) en los receptores de trasplante pulmonar. Su diagnóstico tardío, basado en el deterioro de la función pulmonar, revela una degradación avanzada del aloinjerto. El pronóstico es malo, con una mediana de supervivencia de 4 y 2 años tras la aparición de SBO y SRA. Por lo tanto la identificación de precursores de CLAD en los receptores de trasplantes de pulmón es necesaria para permitir estrategias proactivas y específicas, a fin de dominar la progresión de la enfermedad antes de la degradación irreversible del aloinjerto.

Se supone que la CLAD surge como resultado de daños reiterados de mecanismos aloinmunes o no aloinmunes, que generan fibrosis y obstrucción de las vías respiratorias (5). El seguimiento de estos procesos inflamatorios y fibróticos se ha utilizado durante mucho tiempo para identificar los primeros signos de la enfermedad. Así, la neutrofilia BAL, los niveles de células T reguladoras, las quimiocinas/citocinas o las metaloproteasas matriciales (MMP) se han propuesto como biomarcadores tempranos de la CLAD (6-10). Más recientemente, mediante el perfilado de expresión de biopsias pulmonares se localizaron genes relacionados con la fibrosis, para diagnosticar o predecir la CLAD (11). Sin embargo, estos métodos invasivos centrados en los pulmones se vieron impedidos por la accesibilidad a muestras biológicas y por lo tanto son limitados para un control rutinario de los LTR (receptores de trasplante pulmonar). En sangre, los fibrocitos circulantes o la concentración de citocinas se han propuesto como posibles biomarcadores (12-15). Sin embargo, estos estudios correspondían a un número limitado de pacientes y aún falta la confirmación de los estudios de seguimiento. Por consiguiente ninguno de estos intentos ha demostrado suficiente viabilidad y consistencia para lograr la aceptación clínica. Por tanto existe la necesidad de conocer nuevos métodos que permitan investigar la CLAD y proporcionar biomarcadores tempranos de la misma.

Kastelijn y otros (23) revelan diferencias en los niveles de expresión de las citocinas y quimiocinas (IL-4, IL 5, IL-13 y VEGF) en suero y en el condensado del aliento espirado de pacientes trasplantados de pulmón, que pueden ser útiles como biomarcadores para predecir el desarrollo del SBO. También indican que, con la excepción de IL-13, el espectro de citocinas y quimiocinas en la circulación sistémica (sangre) de pacientes con y sin SBO difiere significativamente del existente en el compartimento pulmonar (condensado del aire exhalado).

Zhang y otros (24) revelan que la BLK funciona como un supresor de tumores en células madre leucémicas sin afectar a las células madre hematopoyéticas normales. También revelan que la inhibición de la vía BLK acelera el desarrollo de la leucemia mieloide crónica, mientras que el aumento de la actividad de la vía BLK retrasa su desarrollo, lo cual justificaría tomar como diana las células madre leucémicas mediante la restauración de la vía BLK, como parte de la terapia del cáncer.

RESUMEN DE LA PRESENTE INVENCIÓN:

La presente invención se refiere especialmente a un método para predecir el riesgo de un sujeto de padecer CLAD, que consta de las siguientes etapas:

i) medir el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK en una muestra de sangre obtenida de dicho sujeto;

ii) comparar el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el sujeto está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK es menor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto no está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK es mayor que el valor de referencia predeterminado. En particular, la presente invención está definida por las reivindicaciones.

La presente invención se expone en la serie de reivindicaciones adjuntas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCIÓN:

Los inventores de la presente invención han usado un perfilado de expresión génica de sangre completa a gran escala para identificar biomarcadores tempranos de la CLAD. Los ensayos de micromatrices llevados a cabo en 80 pacientes (40 estables y 40 con SBO) identifican 47 genes expresados diferencialmente entre el grupo estable y el de SBO. A continuación se utilizó un conjunto independiente de pacientes (13 estables, 11 con SBO) para una validación externa por QPCR. Los genes del Factor 1 asociado a POU clase 2 (POU2AF1) y de la cinasa celular de linfocitos B (BLK) se confirmaron como marcadores predictivos de SBO más de 6 meses antes del diagnóstico clínico.

Método para predecir el riesgo de un sujeto de padecer CLAD

Por consiguiente, según un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para predecir el riesgo de un sujeto de padecer CLAD, que consta de las siguientes etapas: i) medir el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK en una muestra de sangre obtenida de dicho sujeto; ii) comparar el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el sujeto está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK es menor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto no está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK es mayor que el valor de referencia predeterminado.

Tal como se emplea aquí, el término “predecir” se refiere a que el sujeto que debe analizarse mediante el método de la presente invención se asigna al grupo de sujetos que tendrán CLAD o a un grupo de sujetos que no tendrán CLAD. Según la presente invención, la referencia a la CLAD significa, en particular, que el sujeto tendrá un mayor riesgo de desarrollar CLAD. Normalmente dicho riesgo es grande en comparación con el riesgo medio en una cohorte de sujetos trasplantados. En el marco de la presente invención se predecirá el riesgo de un sujeto de padecer CLAD. Tal como se emplea aquí, la frase “predecir el riesgo” se refiere a evaluar del modo aquí mencionado la probabilidad de que el paciente pueda tener CLAD. Como entenderán los especialistas en la materia, normalmente no se pretende que dicha evaluación sea correcta para el 100% de los sujetos investigados. Sin embargo la frase requiere que la predicción se pueda hacer de manera adecuada y correcta para una porción estadísticamente significativa de sujetos. El especialista en la materia puede determinar si una porción es estadísticamente significativa usando, sin más, varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, p.ej. determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. Los valores p son preferiblemente de 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001. Preferiblemente, la probabilidad contemplada por la presente invención permite que la predicción de un mayor riesgo sea correcta para al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de los sujetos de una determinada cohorte o población. La frase se refiere preferiblemente a la predicción de si existe o no un mayor riesgo de padecer CLAD respecto al riesgo medio de CLAD en una población de sujetos, en lugar de indicar una probabilidad precisa de dicho riesgo.

Tal como se emplea aquí, el término “CLAD” se refiere a una disfunción crónica del aloinjerto pulmonar. La CLAD es la principal limitación de la supervivencia a largo plazo después de un trasplante de pulmón. La prevalencia de CLAD es de alrededor del 50% a los 5 años (35% para el fenotipo SBO y 15% para el fenotipo SRA). Su diagnóstico tardío, basado en el declive de las funciones pulmonares, revela una degradación avanzada del aloinjerto. El pronóstico es malo, con una mediana de supervivencia de 4 y 2 años, respectivamente, para los fenotipos s Bo y SRA tras el inicio de la enfermedad.

En una forma de ejecución particular, el método según la presente invención es apropiado para predecir el riesgo de tener SBO. Tal como se usa aquí, el término “SBO” se refiere al síndrome de bronquiolitis obliterante. Es el subtipo principal de CLAD y se refiere a un trastorno pulmonar asociado principalmente a la disfunción crónica del aloinjerto tras el trasplante de pulmón. El SBO se caracteriza por una inflamación y fibrosis de las paredes bronquiolares, que reduce el diámetro de los bronquiolos produciendo una obstrucción progresiva e irreversible del flujo de aire.

En una forma de ejecución particular, el método es apropiado para predecir el riesgo de tener SRA. Tal como se usa aquí, el término “SRA” se refiere al síndrome restrictivo del aloinjerto (SRA). El SRA se caracteriza por un patrón de progresión escalonada, con daño tisular y lesiones fibróticas, que ocurre en la periferia de los pulmones (es decir, en la pleura visceral, en el intersticio alveolar y en los tabiques interlobulares), lo cual reduce la capacidad pulmonar total.

Tal como se utiliza aquí, el término “sujeto” se refiere a cualquier mamífero, por ejemplo un roedor, un felino, un canino y un primate. Especialmente, en la presente invención el sujeto es un ser humano. En una forma de ejecución particular el sujeto es una persona trasplantada. Tal como se usa aquí, el término “sujeto trasplantado”, también llamado sujeto injertado, se refiere a un sujeto que ha recibido el trasplante de un órgano. El término “trasplante de órganos” se refiere al procedimiento de sustitución de órganos, partes de órganos o tejidos enfermos por órganos o tejidos sanos. El órgano o tejido trasplantado puede obtenerse del propio sujeto (= autoinjerto), de otro donante humano (= aloinjerto) o de un animal (= xenoinjerto). Los órganos trasplantados pueden ser artificiales o naturales, íntegros (por ejemplo riñón, corazón, pulmón o hígado) o parciales (por ejemplo válvulas cardíacas, pulmón, piel y hueso). En una forma de ejecución particular el sujeto es una persona trasplantada de pulmón. En un caso particular, dicho sujeto trasplantado de pulmón puede haber sido injertado además con el hígado o el riñón del donante del pulmón o de otro donante.

Tal como se emplea aquí, la expresión “nivel de expresión” se refiere al nivel de expresión de cada uno de los 2 genes con otros valores adicionales correspondientes a los parámetros clínicos. Normalmente, el nivel de expresión de los 2 genes puede determinarse mediante cualquier tecnología conocida del especialista en la materia. En particular, cada nivel de expresión génica se puede medir a nivel genómico y/o nucleico y/o proteico. En una forma de ejecución particular, el nivel de expresión del gen se determina midiendo la cantidad de transcritos de ácido nucleico de cada gen. En otra forma de ejecución, el nivel de expresión se determina midiendo la cantidad de proteína correspondiente a cada gen. La cantidad de transcritos de ácido nucleico puede medirse mediante cualquier tecnología conocida por un especialista en la materia. En particular, la medición se puede llevar a cabo directamente en una muestra de ARN mensajero (ARNm) extraído, o en ADN complementario retrotranscrito (ADNc) preparado a partir de ARNm extraído mediante tecnologías bien conocidas del estado técnico. A partir de la muestra de ARNm o de ADNc, la cantidad de transcritos de ácido nucleico puede medirse usando cualquier tecnología conocida por un especialista en la materia, entre ellas, las micromatrices nucleicas, la PCR cuantitativa, las tarjetas microfluídicas y la hibridación con una sonda marcada. En una forma de ejecución particular, el nivel de expresión se determina mediante PCR cuantitativa. La PCR cuantitativa o en tiempo real es una tecnología bien conocida y fácilmente disponible para el especialista en la materia y no necesita una descripción precisa. Los métodos para determinar la cantidad de ARNm son bien conocidos del estado técnico. Por ejemplo, el ácido nucleico contenido en la muestra biológica se extrae primero siguiendo métodos estándar, por ejemplo usando enzimas líticos o soluciones químicas, o se extrae mediante resinas fijadoras de ácidos nucleicos según las instrucciones del fabricante. Luego el ARNm extraído se detecta por hibridación (p.ej. por análisis de transferencia Northern) y/o amplificación (p.ej. por RT-PCR). Habitualmente se prefiere la RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa. La RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa en tiempo real es especialmente ventajosa. Otros métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) y amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA). Los ácidos nucleicos de al menos 10 nucleótidos que muestran complementariedad de secuencia u homología con el ARNm de interés encuentran aquí utilidad como sondas de hibridación o cebadores de amplificación. Se entiende que dichos ácidos nucleicos no necesitan ser idénticos, pero suelen ser al menos un 80% aproximadamente idénticos a la región homóloga de tamaño comparable, con mayor preferencia un 85% idénticos e incluso un 90-95% idénticos. En ciertas formas de ejecución será ventajoso usar ácidos nucleicos en combinación con medios apropiados, tales como un marcador detectable, para revelar la hibridación. En el estado técnico se conoce una amplia variedad de indicadores apropiados, que incluye ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos u otros (p.ej. avidina/biotina). Las sondas comprenden normalmente ácidos nucleicos monocatenarios de entre 10 y 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo entre 10 y 800, con mayor preferencia entre 15 y 700, habitualmente entre 20 y 500. Los cebadores suelen ser ácidos nucleicos monocatenarios más cortos, de entre 10 y 25 nucleótidos de longitud, que están diseñados para coincidir perfecta o casi perfectamente con un ácido nucleico de interés que debe ser amplificado. Las sondas y los cebadores son “específicos” de los ácidos nucleicos con los que se hibridan, es decir, con los que se hibridan preferiblemente en condiciones de hibridación muy rigurosas (correspondientes a la temperatura de fusión Tm más elevada, p.ej. 50% de formamida, 5x o 6x SCC. El tampón SCC es NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M). Los cebadores o sondas de ácido nucleico usados en el anterior método de amplificación y detección pueden ensamblarse como un kit. Dicho kit incluye cebadores de consenso y sondas moleculares. Un kit también lleva los componentes necesarios para determinar si ha ocurrido la amplificación. El kit también puede incluir, por ejemplo, tampones de PCR y enzimas, secuencias de control positivo, cebadores de control de reacción e instrucciones para amplificar y detectar las secuencias específicas. En una forma de ejecución particular, el método de la presente invención incluye las etapas de preparar el ARN total extraído de una muestra biológica y someterlo a amplificación e hibridación con sondas específicas, de manera más concreta mediante una RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa. En otra forma de ejecución, el nivel de expresión se determina por análisis con un chip de ADN. Dicho chip de ADN o micromatriz de ácidos nucleicos consta de diferentes sondas de ácido nucleico unidas químicamente a un substrato, que puede ser un microchip, un portaobjetos de vidrio o una perla del tamaño de una microesfera. Un microchip puede estar constituido por polímeros, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales silíceos, carbono, metales, vidrios inorgánicos o nitrocelulosa. Las sondas incluyen ácidos nucleicos tales como ADNc u oligonucleótidos que pueden tener aproximadamente 10 hasta 60 pares de bases. Para determinar el nivel de expresión se marca una muestra biológica de un sujeto objeto de ensayo, primero sometida opcionalmente a una transcripción inversa, y se pone en contacto con la micromatriz en condiciones de hibridación, lo cual da lugar a la formación de complejos entre los ácidos nucleicos diana que son complementarios de las secuencias de las sondas adheridas a la superficie de la micromatriz. Luego los complejos hibridados y marcados se detectan y se pueden cuantificar o semicuantificar. El marcaje se puede conseguir por varios métodos, p.ej. mediante el uso de marcadores radiactivos o fluorescentes. El especialista en la materia dispone de muchas variantes de la tecnología de hibridación de micromatrices (véase p.ej. la revisión de Hoheisel (16)).

Tal como se usa aquí, el término “muestra biológica” se refiere a cualquier muestra obtenida de un sujeto trasplantado, por ejemplo una muestra de suero, una muestra de plasma, una muestra de orina, una muestra de sangre, una muestra de linfa o una biopsia tisular. En una forma de ejecución particular, las muestras biológicas para la determinación de un nivel de expresión incluyen muestras tales como una muestra de sangre, de linfa o una biopsia. En una forma de ejecución particular la muestra biológica es una muestra de sangre, más concretamente de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Normalmente, estas células se pueden extraer de la sangre completa utilizando Ficoll, un polisacárido hidrófilo que separa capas de sangre, formando las CMSP un anillo celular debajo de una capa de plasma. Las CMSP también se pueden extraer de la sangre completa mediante una lisis hipotónica, que lisará preferentemente los glóbulos rojos. Dichos procedimientos son conocidos de los especialistas en la materia.

Tal como se usa aquí, el término “POU2AF1” se refiere al factor 1 asociado a POU clase 2. El gen POU2AF1 humano de origen natural tiene una secuencia de nucleótidos como la indicada con el número de acceso al banco de genes NM_006235 y la proteína POU2AF1 humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada con el número de acceso al banco de genes NP_006226.2. También se han descrito las secuencias de aminoácidos y nucleótidos murinos (números de acceso al banco de genes NM_011136.2 y NP_035266.1).

Tal como se usa aquí, el término “BLK” se refiere a la cinasa celular de linfocitos B. La proteína BLK codificada por el gen BLK juega un papel en la señalización del receptor de células B y en el desarrollo de células B. El gen BLK humano de origen natural tiene una secuencia de nucleótidos como la indicada con el número de acceso al banco de genes NM_001715.2 y la proteína BLK humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada con el número de acceso al banco de genes NP_001706.2. También se han descrito las secuencias de aminoácidos y nucleótidos murinos (números de acceso al banco de genes NM_007549.2 y NP_031575.2).

Tal como se usa aquí, la expresión “valor de referencia predeterminado” se refiere a un valor umbral o a un valor límite. Habitualmente, un “valor umbral” o “valor límite” se puede determinar de manera experimental, empírica o teórica. También se puede elegir arbitrariamente un valor umbral basándose en las condiciones experimentales y/o clínicas existentes, como admitiría un especialista en la materia. Por ejemplo, las mediciones anteriores en muestras históricas de sujetos debidamente depositadas pueden utilizarse para establecer el valor de referencia predeterminado. El valor umbral debe determinarse para obtener la sensibilidad y especificidad óptimas de acuerdo con el objeto de la prueba y el balance beneficio/riesgo (consecuencias clínicas de falsos positivos y falsos negativos). En general la sensibilidad y la especificidad óptimas (y por consiguiente el valor umbral) se pueden determinar mediante una curva característica receptor-operador (CRO) basada en los datos experimentales. Por ejemplo, una vez determinado el nivel de expresión del péptido escogido en un grupo de referencia, se puede realizar un análisis algorítmico para el tratamiento estadístico de los niveles de expresión determinados en las muestras analizadas, obteniéndose así un patrón significativo de clasificación de las muestras. El nombre completo de la curva CRO es curva característica receptor-operador, también conocida como curva característica operativa del receptor. Se usa principalmente para pruebas clínicas de diagnóstico bioquímico. La curva CRO es un indicador completo que refleja las variables continuas de la proporción de verdaderos positivos (sensibilidad) y de la proporción de falsos positivos (1-especificidad). Revela la relación entre sensibilidad y especificidad mediante el método de composición de imágenes. Una serie de diferentes valores límite (valores umbral o críticos, valores límite entre resultados normales y anormales de la prueba diagnóstica) se establecen como variables continuas para calcular una serie de valores de sensibilidad y especificidad. Luego se toma la sensibilidad en el eje de ordenadas y la especificidad en el eje de abscisas para dibujar una curva. Cuanto mayor sea el área bajo la curva (ABC), mayor será la precisión del diagnóstico. En la curva CRO, el punto más cercano al extremo superior izquierdo del diagrama de coordenadas es un punto crítico que tiene valores elevados de sensibilidad y especificidad. El valor ABC de la curva CRO varía entre 1,0 y 0,5. Cuando el ABC > 0,5, el resultado del diagnóstico mejora cada vez más a medida que el ABC se acerca a 1. Cuando el ABC está entre 0,5 y 0,7, la precisión es baja. Cuando el ABC está entre 0,7 y 0,9, la precisión es moderada. Cuando el ABC es superior a 0,9, la precisión es alta. Este método algorítmico se realiza preferiblemente con un ordenador. Para trazar la curva CRO se puede usar software o sistemas existentes del estado técnico como: software estadístico médico MedCalc 9.2.0.1, SPSS 9.0, ROCPOWER.SAS, DESIGNROC.FOR, MULTIREADER POWER.SAS, CREATE-ROC.SAS, GB STAT VI0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Maryland, EUA), etc.

Uso médico para prevenir el riesgo de tener CLAD

En un segundo aspecto la presente invención se refiere a un fármaco inmunosupresor destinado a la prevención del riesgo de un sujeto de tener CLAD, y además incluye la determinación del riesgo de que el sujeto tenga CLAD según el método descrito anteriormente.

En una forma de ejecución particular, el uso médico según la presente invención es adecuado para prevenir el riesgo de tener SBO.

En una forma de ejecución particular, el uso médico según la presente invención es adecuado para prevenir el riesgo de tener SRA.

En el contexto de la presente invención, la frase “prevenir el riesgo” o “tratamiento profiláctico”, tal como se usa aquí, se refiere tanto al tratamiento como al tratamiento curativo o modificador de la enfermedad, incluido el tratamiento de los sujetos con riesgo de contraer la enfermedad o que presuntamente la hayan contraído, así como los sujetos que están enfermos o han sido diagnosticados de padecer una enfermedad o afección médica, e incluye la supresión de la recaída clínica. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que tenga un trastorno médico o que finalmente puede adquirirlo, a fin de prevenir, curar, retrasar el inicio, reducir la gravedad o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o de un trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento. Por “régimen terapéutico” se entiende el patrón de tratamiento de una enfermedad, por ejemplo la pauta de dosificación durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La frase “régimen de inducción” o “período de inducción” se refiere a un régimen terapéutico (o a la parte de un régimen terapéutico) que se utiliza para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción consiste en administrar un elevado nivel de fármaco a un sujeto durante el período inicial de un régimen de tratamiento. En un régimen de inducción se puede aplicar (parcial o totalmente) un “régimen de carga”, el cual puede incluir la administración de una dosis del fármaco mayor que la que utilizaría un médico durante un régimen de mantenimiento, la administración de un fármaco con una frecuencia superior a la que un médico establecería durante un régimen de mantenimiento, o ambas. La frase “régimen de mantenimiento” o “período de mantenimiento” se refiere a un régimen terapéutico (o a la parte de un régimen terapéutico) utilizado para el mantenimiento de un sujeto durante el tratamiento de una enfermedad, p.ej. para mantener al sujeto en remisión durante largos períodos de tiempo (meses o años). En un régimen de mantenimiento se puede utilizar una terapia continua (p.ej. la administración de un fármaco a intervalos regulares, p.ej. semanal, mensual, anual, etc.) o una terapia intermitente (p.ej. un tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, un tratamiento en caso de recaída o el tratamiento según un particular criterio predeterminado [p.ej. dolor, manifestación patológica, etc.]).

Normalmente, en el marco de la presente invención, al sujeto se le administra una cantidad terapéutica incrementada de fármacos inmunosupresores.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad mínima de agente activo, necesaria para impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. Por ejemplo, una “cantidad terapéuticamente eficaz” para un sujeto es una cantidad que induce, mejora o produce una mejora de los síntomas patológicos, de la evolución de la enfermedad o de las condiciones fisiológicas relacionadas con ella o de la resistencia a sucumbir a un trastorno.

Tal como se usa aquí, el término “sujeto” corresponde al sujeto anteriormente descrito. Normalmente, el sujeto es un sujeto trasplantado. Más concretamente, el sujeto es un sujeto trasplantado de pulmón. En una forma de ejecución particular el sujeto tiene presuntamente SBO. En otra forma de ejecución el sujeto tiene presuntamente SRA.

Tal como se usa aquí, el término “fármacos inmunosupresores” también conocidos como agentes inmunosupresores o medicaciones antirrechazo son fármacos que inhiben o evitan la actividad del sistema inmunitario. Normalmente, el sujeto se trata con fármacos inmunosupresores u otros fármacos conocidos actualmente del estado técnico o que se encontrarán en el futuro. En una forma de ejecución particular, el sujeto está bajo tratamiento inmunosupresor cuando se le administran uno o más fármacos inmunosupresores. Los fármacos inmunosupresores que pueden emplearse en los procedimientos de trasplante incluyen: corticosteroides, inhibidores de la calcineurina (ciclosporina, tacrolimus), azatioprina, micofenolato de mofetilo e inhibidores de tirosina cinasa (everolimus, sirolimus). Estos fármacos pueden usarse en monoterapia o en terapias combinadas. En el caso del trasplante pulmonar se suelen utilizar los siguientes protocolos inmunosupresores. Los sujetos con trasplante de pulmón primario reciben un tratamiento de inducción. Los protocolos varían en gran medida entre los centros en todo el mundo, pero generalmente incluyen inyecciones de ATG (globulina anti-timocitos) o basiliximab (otras opciones son los anticuerpos anti CD3 y anti CD5), dosis elevadas de corticosteroides (> 1 mg/kg/día), un inhibidor de la calcineurina y un cuarto tratamiento inmunosupresor (MMF o azatioprina) o una combinación de dosis altas de corticosteroides, inhibidores de calcineurina y un tercer tratamiento inmunosupresor (MMF o azatioprina). Después se reduce la corticoterapia progresivamente hasta una dosis baja de mantenimiento de por vida (p.ej. de 5 a 10 mg/día).

Método de retirada gradual de la terapia inmunosupresora

En un tercer aspecto la presente invención se refiere a un método para identificar a un sujeto en tratamiento de terapia inmunosupresora como candidato a la retirada o minimización de la terapia inmunosupresora, que consta de las etapas siguientes: i) determinar si el sujeto está en riesgo de tener CLAD según el método descrito anteriormente; y ii) concluir que el sujeto es apto para la retirada o minimización de la terapia inmunosupresora si no está en riesgo de tener CLAD.

Una forma de ejecución particular del método según la presente invención se refiere a cuando el sujeto corre el riesgo de tener SBO.

Una forma de ejecución particular del método según la presente invención se refiere a cuando el sujeto corre el riesgo de tener SRA.

Tal como se usa aquí, la frase “retirada o minimización de la terapia inmunosupresora” se refiere a la disminución progresiva y, opcionalmente, a la posible supresión de una terapia inmunosupresora.

Kit

Se revela un kit para determinar si un sujeto tiene riesgo de tener CLAD, el cual comprende al menos un reactivo para la determinación de un nivel de expresión que incluye los siguientes genes: POU2AF1 o BLK.

Tal como se usa aquí, la frase “un reactivo para la determinación de un nivel de expresión” se refiere a un reactivo que permite específicamente la determinación de dicho nivel de expresión, es decir, un reactivo destinado concretamente a la determinación específica del nivel de expresión de los genes comprendidos en el perfilado de expresión. Esta definición excluye los reactivos genéricos utilizables para la determinación del nivel de expresión de cualquier gen, tales como la taq polimerasa o un tampón de amplificación, aunque tales reactivos también pueden incluirse en un kit de acuerdo con la presente invención.

El kit puede incluir instrucciones para determinar si un sujeto está en riesgo de padecer CLAD. Las instrucciones para determinar si un sujeto está en riesgo de tener CLAD (s Bo o SRA) pueden incluir al menos un perfilado de expresión de referencia. En particular, al menos un perfilado de expresión de referencia puede ser estable. Alternativamente, al menos un perfilado de expresión de referencia puede ser intolerante al injerto (p.ej. un perfilado de expresión obtenido de un sujeto sano).

La presente invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos.

Validación de POU2AF1 y BLK como biomarcadores predictivos de CLAD

Basándonos en sus valores predictivos, funciones biológicas, valor p y FC superior a 1,5, elegimos 8 genes que luego fueron probados por qPCR en una serie independiente de pacientes. Entonces investigamos el valor predictivo general de los genes elegidos, independientemente del tiempo transcurrido entre la recolección de sangre y el diagnóstico de CLAD, agrupando muestras de clase LTP y MTP. Se llevaron a cabo ensayos de qPCR en 13 muestras estables y 11 muestras de SBO. La regulación a la baja de la expresión de POU2AF1 6 meses o más antes del diagnóstico de CLAD fue validado por QPCR (valor p < 0,01, FC = 0,51) (figura 1A). La curva CRO indicó que la expresión de POU2AF1 segregaba de forma estable los pacientes con SBO, con un ABC de 0,8322 (IC del 95% = 0,6382 a 1,026) (figura 1B). Es de destacar que la expresión de POU2AF1 en los pacientes estables fue constante, entre V3 y V4 (6 y 12 meses posteriores al trasplante). Con respecto a la expresión de BLK notamos un nivel reducido de expresión de BLK en el grupo SBO (p < 0,05, FC = 0,56), 6 meses o más antes del diagnóstico de la CLAD (figura 2A). La curva CRO muestra una separación clara entre los dos grupos de pacientes (ABC = 0,7797, IC del 95% = 0,5688 a 0,9907) (figura 2B). En cuanto al POU2AF1, la expresión de BLK en un paciente estable fue constante con el tiempo. La expresión diferencial de los otros 6 genes seleccionados no fue confirmada por qPCR. Por último realizamos análisis de Kaplan-Meier para investigar la supervivencia libre de SBO respecto a la expresión de POU2AF1 (figura 1C) y BLK (figura 2C). Los niveles de POU2AF1 o BLK por debajo de 0,45 o 0,505, respectivamente, disminuyeron significativamente la probabilidad de supervivencia libre de SBO después del trasplante pulmonar.

REFERENCIAS:

Varias referencias lo largo de esta solicitud describen el estado técnico al cual pertenece la presente invención.

1. Meyer KC, Raghu G, Verleden GM, Corris PA, Aurora P, Wilson KC, Brozek J, Glanville AR, ISHLT/ATS/ERS BOS Task Force Committee, ISHLT/ATS/ERS BOS Task Force Committee. An international ISHLT/ATS/ERS clinical practice guideline: diagnosis and management of bronchiolitis obliterans syndrome [Guía práctica clínica internacional ISHLT/ATS/ERS: diagnóstico y control del síndrome de bronquiolitis obliterante], Eur Respir J 2014; 44: 1479-1503.

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20. Koutsokera A, Royer PJ, Antonietti JP, Fritz A, Benden C, Aubert JD, Tissot A, Botturi K, Roux A, Reynaud-Gaubert ML, Kessler R, Dromer C, Mussot S, Mal H, Mornex J-F, Guillemain R, Knoop C, Dahan M, Soccal PM, Claustre J, Sage E, Gomez C, Magnan A, Pison C, Nicod LP, Consortium TS. Development of a Multivariate Prediction Model for EarlyOnset Bronchiolitis Obliterans Syndrome and Restrictive Allograft Syndrome in Lung Transplantation [Desarrollo de un modelo de predicción multivariante para el síndrome de bronquiolitis obliterante de inicio temprano y el síndrome restrictivo de aloinjerto en el trasplante pulmonar], Front Med 2017; 4.

21. Pain M, Royer P-J, Loy J, Girardeau A, Tissot A, Lacoste P, Roux A, Reynaud-Gaubert M, Kessler R, Mussot S, Dromer C, Brugiére O, Mornex J-F, Guillemain R, Dahan M, Knoop C, Botturi K, Pison C, Danger R, Brouard S, Magnan A, COLT Consortium. T Cells Promote Bronchial Epithelial Cell Secretion of Matrix Metalloproteinase-9 via a C-C Chemokine Receptor Type 2 Pathway: Implications for Chronic Lung Allograft Dysfunction [Las células Tpromueven la secreción de la metaloproteinasa 9 de la matriz en las células epiteliales bronquiales a través de una vía del receptor de quimiocina C-C tipo 2: implicaciones para la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar], Am J Transplant Off J Am Soc Transplant Am Soc Transpl Surg 2016; doi: 10.1111/ajt.14166.

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2010.04.013.

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir el riesgo que tiene un sujeto trasplantado de pulmón de padecer la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (CLAD), que consta de las siguientes etapas:

i) medir el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK en una muestra de sangre obtenida de dicho sujeto;

ii) comparar el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el sujeto está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK es menor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto no está en riesgo de tener CLAD cuando el nivel de expresión de POU2AF1 o BLK es mayor que el valor de referencia predeterminado.

2. El método según la reivindicación 1, el cual es apropiado para predecir el riesgo de padecer el síndrome de bronquiolitis obliterante (SBO).

3. El método según la reivindicación 1, el cual es apropiado para predecir el riesgo de padecer el síndrome de restrictivo del aloinjerto (SRA).

4. Un fármaco inmunosupresor para prevenir el riesgo de un sujeto de padecer CLAD, cuando se ha determinado que el sujeto está en riesgo de tener CLAD según el método de la reivindicación 1.

5. Un método para identificar a un sujeto sometido a una terapia inmunosupresora como candidato a la retirada o minimización de la terapia inmunosupresora, que consta de las etapas siguientes:

i) determinar si el sujeto está en riesgo de tener CLAD según el método de la reivindicación 1; y

ii) concluir que el sujeto es apto para la retirada o minimización de la terapia inmunosupresora si no está en riesgo de tener CLAD.

6. El método según la reivindicación 5, en que el sujeto está en riesgo de tener SBO.

7. El método según la reivindicación 5, en que el sujeto está en riesgo de tener SRA.

8. Un fármaco inmunosupresor para usar según la reivindicación 4, cuando el sujeto está en riesgo de tener SBO.

9. Un fármaco inmunosupresor para usar según la reivindicación 4, cuando el sujeto está en riesgo de tener SRA.