ES2887400T3 - Análogos mínimos de saponina, síntesis y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Compuesto, que tiene una de las fórmulas: **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN

Análogos mínimos de saponina, síntesis y uso de los mismos

Referencia cruzada a solicitudes anteriores

Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional estadounidense n.° 62/005.302, presentada el 30 de mayo de 2014.

Campo

La presente divulgación se refiere, en general, a adyuvantes derivados de saponina de glicósidos triterpénicos, a las síntesis de los mismos y a productos intermedios para los mismos. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de la presente invención y métodos de uso de dichos compuestos o dichas composiciones en el tratamiento de enfermedades infecciosas y cáncer.

Antecedentes

El éxito clínico de las vacunas contra el cáncer y antimicrobianas depende de la identificación de, y del acceso a, adyuvantes potentes y novedosos con toxicidad atenuada. Las vacunas moleculares compuestas por antígenos de subunidades a menudo son menos inmunogénicas que los patógenos completos y no provocan respuestas inmunitarias adecuadas por sí solas, lo que requiere la inclusión de un adyuvante inmunológi inmunogenicidad. Desafortunadamente, pocos adyuvantes son lo suficientemente potentes y no tóxicos para uso clínico. En este contexto, fracciones específicas de extractos de la corteza de Quillaja saponaria (QS) han demostrado ser adyuvantes extremadamente potentes en inmunoterapia. QS-21, un producto natural de saponina del árbol Quillaja saponaria, es uno de los adyuvantes más prometedores actualmente en investigación (figura 1a). Se compone de dos constituyentes isoméricos, QS-21-apiosa (1a) y QS-21-xilosa (1b), que difieren en el azúcar terminal en el dominio de tetrasacárido lineal. ^q S-21 se ha convertido en el potenciador inmunológico de elección en muchos ensayos clínicos recientes, y vacunas que contienen QS-21 están en desarrollo para varios cánceres y enfermedades infecciosas y neurodegenerativas (paludismo, VIH, hepatitis, tuberculosis, enfermedad de Alzheimer). A pesar de su promesa, QS-21 presenta varios inconvenientes, incluyendo acceso limitado a partir de su fuente natural, efectos secundarios tóxicos e inestabilidad química debido a la hidrólisis espontánea de la cadena de acilo. Además, la escasa comprensión de su mecanismo de acción molecular impide el desarrollo racional de análogos con eficacia mejorada y toxicidad disminuida.

El documento US 2013/0011421 A1 se refiere a adyuvantes derivados de saponina de glicósidos triterpénicos, a las síntesis de los mismos, a productos intermedios para los mismos y a usos de los mismos.

Sumario

La presente invención se refiere a compuestos y a composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas. Específicamente, la presente invención se refiere a compuestos que tienen una de las fórmulas:

Saponina R1 R2

16 (SQS 1-0-5-18) -CHO -OH

19 (SOS 1-11-5-18) -CH2OH -OH

20 (SQS 1-8-5-18) -Me -OH

21 (SQS 1-9-5-18) -CHO -H

22 (SQS 1-10-5-18) -CH²OH -H

18 (SQS 1-7-5-18) -Me -H

Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a una composición farmacéutica que comprende un análogo mínimo de saponina según las reivindicaciones 1 a 7, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y una cantidad inmunológicamente eficaz de un antígeno.

Además, se describe un método para inmunizar a un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica que comprende un análogo mínimo de saponina y un antígeno.

Además, se describe un método para inmunizar a un sujeto con un antígeno, que comprende: administrar al sujeto una vacuna que comprende: una cantidad eficaz del antígeno; y una cantidad eficaz del compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, la vacuna se administra por vía oral. En otras realizaciones, la vacuna se administra por vía intramuscular. En otros casos, la vacuna se administra por vía subcutánea. En determinados casos, la cantidad del compuesto de fórmula (I) administrado es de 10-1000 |ag, 500-1000 |ag, 100-500 |ag, 50-250 |ag, 50-500 |ag o 250-500 |ag.

Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a una composición farmacéutica que comprende un análogo mínimo de saponina tal como se define en las reivindicaciones 1 a 7, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y una cantidad eficaz de un fármaco citotóxico.

Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a una composición farmacéutica para su uso en la potenciación del efecto de un fármaco citotóxico en un sujeto, que puede comprender administrar al sujeto la composición farmacéutica que comprende un análogo mínimo de saponina de la presente solicitud y un fármaco citotóxico. Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a una composición farmacéutica para potenciar el efecto de un fármaco citotóxico en un sujeto, que puede comprender: administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende: el fármaco citotóxico; y una cantidad eficaz del compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Además, se describe un kit que comprende los análogos mínimos de saponina de la presente solicitud. En algunas realizaciones, los kits comprenden una ficha técnica. En algunas realizaciones, tales kits incluyen la combinación de un compuesto adyuvante de la invención y otro agente inmunoterápico. Los agentes pueden envasarse por separado o juntos. El kit incluye opcionalmente instrucciones para recetar el medicamento. En determinadas realizaciones, el kit incluye múltiples dosis de cada agente. El kit puede incluir cantidades suficientes de cada componente para tratar a un sujeto durante una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas o múltiples meses. En determinadas realizaciones, el kit incluye un ciclo de inmunoterapia. En determinadas realizaciones, el kit incluye una cantidad suficiente de una composición farmacéutica como para inmunizar a un sujeto contra un antígeno a largo plazo.

Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a un compuesto de fórmula (III),

en la que W es Me, -CHO o -CH²OH, y V es H u OH.

Además, se describe un procedimiento para preparar el compuesto de fórmula (III).

Los dibujos adjuntos ilustran una o más realizaciones de la presente divulgación y, junto con la descripción descrita, sirven para explicar los principios de las realizaciones a modo de ejemplo de la presente divulgación. Breve descripción de los dibujos

Los dibujos adjuntos ilustran una o más realizaciones de la presente divulgación y, junto con la descripción descrita, sirven para explicar los principios de las realizaciones a modo de ejemplo de la presente divulgación. La figura 1 ilustra que la saponina de yoduro de arilo 6 (no reivindicada) muestra una potente actividad adyuvante y baja toxicidad en un modelo de vacunación de ratón preclínico. (Panel a) Estructura de QS-21 y sus cuatro dominios estructurales clave. (Panel b) Síntesis de saponinas de yoduro de arilo 6 (SQS-0-0-5-18) y [131I]-6: (i) FITC, Et3N, DMF, 21°C, 2 h, 75%; (ii) 4, Et3N, DMF, 21°C, 1 h, 52%; (iii) 5, Et3N, DMF, 21°C, 1 h, 75%; (iv) [131I]-NaI, cloramina-T, MeOH, 21°C, 1 min, >50%. (Panel c) Estructura de saponina de control negativo atenuada con adyuvante 8 (SQS-0-3-7-18) y síntesis de 8: (v) [131I]-NaI, cloramina-T, MeOH, 21°C, 1 min, >50%. Evaluación biológica de saponina de yoduro de arilo 6 (SQS-0-0-5-18) con vacuna de tres componentes para (panel d) títulos de anti-KLH (IgG), (panel e) títulos de anti-MUC1 (IgG) y (panel f) títulos de anti-OvA (IgG) que indican una potente actividad adyuvante comparable a QS-21 natural y sintética (compárense las dosis de 20 g); las barras horizontales indican la mediana de los títulos; significación estadística en comparación con control sin adyuvante: * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. (Panel g) Evaluación de toxicidad basada en la mediana del porcentaje de pérdida de peso, que indica baja toxicidad de 6 (SQS-0-0-5-18); las barras de error indican los valores máximo y mínimo para cinco ratones.

La figura 2 ilustra diversas saponinas, saponina marcada con yodo radiactivo [131I]-6 (no reivindicada) y saponina fluorescente 3 (no reivindicada), ubicadas en los ganglios linfáticos y el sitio de inyección en ratones. (Panel a) Biodistribución de adyuvante activo [131I]-6 ([131I]-SQS-0-0-5-18) y adyuvante atenuado [131I]-8 ([131I]-^s Q^s -0-3-7-18) con antígeno OVA, que indica acumulación de 6, pero no de [131I]-8, en el sitio de inyección y los ganglios linfáticos; las barras de error indican la desviación estándar a partir de la media para cinco ratones; significación estadística indicada gráficamente sólo para los ganglios linfáticos y el sitio de inyección para claridad: * = p < 0,05: hígado, músculo, ganglio linfático, piel, tiroides; ** = p < 0,01: sangre, pulmones, bazo, riñones, hueso, sitio de inyección; *** = p < 0,001: corazón. (Panel b) Imágenes en el sitio de inyección (las flechas amarillas indican círculos de tinta) con adyuvante activo 3 (SQS-0-0-5-12) marcado con fluoresceína o adyuvante inactivo 2 (SQS-0-0-5-11) sin marcar y OVA marcada con Alexa-647 (OVA-A647), que indica retención de 3 y OVA-A647 en el sitio de inyección; la media luna verde en la imagen de fluoresceína para el ratón 2 se debe al efecto fantasma del software. (Panel c) Imágenes de ganglios linfáticos disecados con adyuvante activo 3 (SQS-0-0-5-12) o adyuvante inactivo 2 (SQS-0-0-5-11) y OVA-A647, que indica acumulación aumentada de OVA-A647 con 3 pero no con 2. Los ratones se inyectaron en el costado izquierdo, y el ganglio linfático derecho sirve como control negativo dentro de cada animal.

La figura 3 ilustra que la saponina truncada 16 carece del dominio de trisacárido ramificado completo de QS-21 pero conserva una potente actividad adyuvante y baja toxicidad en un modelo de vacunación de ratón preclínico. (Panel a) Síntesis de saponinas de yoduro de arilo 16 (SQS-1-0-5-18) y [131I]-16. (i) TESOTf, 2,6-lutidina, CH²O ², 0°C, 1 h, 80%; (ii) 1. 12, BF3^OEt2, T.M. de 4 A, CH²Cl², -35°C, 30 min; 2. PhSeH, EtaN, 38°C, 8 h, 58% (2 etapas); (iii) 1. HO2C(CH2)5NHBoc (14), EtOCOCI, Et3N, THF, 0°C, 2,5 h, (preactivación con ácido), después añadir a 13, 0°C, 1,5 h; 2. H² (50 psi), Pd/C (Degussa), THF/EtOH (1:1), 21°C, 24 h; 3. TFA/H²O (4:1), 0°C, 2 h, 65% (3 etapas); (iv) 4, Et3N, DMF, 21°C, 2 h, 67%; (v) 5, Et3N, DMF, 21°C, 1,5 h, 75%; (vi) [131I]-Nal, cloramina-T, MeOH, 21°C, 1 min, 55%. Evaluación biológica de saponina truncada 16 con una vacuna de tres componentes para títulos de (panel b) anti-KLH (IgG), (panel c) anti-MUC1 (IgG) y (panel d) anti-OVA (IgG), que indica una potente actividad adyuvante; las barras horizontales indican la mediana de los títulos; significación estadística en comparación con control sin adyuvante: * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. (Panel e) Evaluación de toxicidad basada en la mediana del porcentaje de pérdida de peso, que indica baja toxicidad de 16 (SQS-1-0-5-18); las barras de error indican los valores máximo y mínimo para cinco ratones.

La figura 4 ilustra que el derivado de ácido oleanólico 18, que carece tanto del sustituyente aldehído en C4 como del alcohol en C16 en el dominio de triterpeno de QS-21, muestra una escasa actividad adyuvante en un modelo de vacunación de ratón preclínico. Evaluación biológica de derivado de ácido oleanólico 18 (SQS-1-7-5-18) con una vacuna de tres componentes para (panel a) títulos de anti-KLH (IgG), (panel b) títulos de anti-MUC1 (IgG) y (panel c) títulos de anti-OVA (IgG), que indica una actividad adyuvante atenuada; las barras horizontales indican la mediana de los títulos; significación estadística en comparación con control sin adyuvante: * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. (Panel d) Evaluación de toxicidad basada en la mediana de peso en porcentaje, que indica baja toxicidad de 18 (SQS-1-7-5-18); las barras de error indican los valores máximo y mínimo para cinco ratones.

La figura 5 ilustra que el derivado de caulofilogenina 19 y el derivado de ácido equinocístico 20, que carecen del sustituyente aldehído en C4 pero conservan el alcohol en C16 en el dominio de triterpeno de QS-21, muestran una potente actividad adyuvante y ninguna toxicidad en un modelo de vacunación de ratón preclínico. (Panel a) Estructuras de saponinas adyuvantes 19-22 con modificaciones en el sustituyente aldehído en C4 y alcohol en C16 del dominio de triterpeno de QS-21. La estructura en el (panel a) se muestra con 6-(4-yodobenzoilamino)-hexanoílo como la cadena de acilo. Evaluación biológica de las variantes de triterpeno 19-22 con una vacuna de cuatro componentes (MUC1-KLH, OVA, GD3, KLH) para títulos de (panel b) anti-KLH (IgG), (panel c) anti-MUC1 (IgG), (panel d) anti-OVA (IgG), (panel e) anti-GD3 (IgM) y (panel f) anti-GD3 (IgG), que indica que no se requiere el sustituyente aldehído en C4 para la actividad adyuvante (19, 20), mientras que la retirada del alcohol en C16 atenúa la actividad (21, 22); las barras horizontales indican la mediana de los títulos; significación estadística en comparación con control sin adyuvante: * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. (Panel g) Evaluación de toxicidad basada en la mediana del porcentaje de pérdida de peso, que indica una falta de toxicidad de 19-22; las barras de error indican los valores máximo y mínimo para cinco ratones.

La figura 6 ilustra que el derivado de ácido quillaico 16 activo con adyuvante se ubica en el sitio de inyección y los ganglios linfáticos en ratones, mientras que el derivado de ácido oleanólico 18 atenuado con adyuvante no. Biodistribución in vivo en ratones de adyuvante activo [131I]-16 ([131I]-SQS-1-0-5-18) y adyuvante atenuado [131I]-18 ([131I]-SQS-1-7-5-18) a las 24 h tras la inyección en presencia de 20 |ig de OVA; las barras de error indican la desviación estándar a partir de la media para cinco ratones; significación estadística indicada gráficamente sólo para los ganglios linfáticos y el sitio de inyección para claridad: * = p < 0,05: ganglios linfáticos, sitio de inyección, piel; ** = p < 0,01: pulmones, bazo, estómago, músculo, hueso; *** = p < 0,001: sangre, corazón.

La figura 7 ilustra que la saponina de yoduro de arilo 8 (no reivindicada), que carece del dominio de tetrasacárido lineal, muestra una escasa actividad adyuvante en un modelo de vacunación de ratón preclínico. (a) Síntesis de saponina 8 de control negativo (SQS-0-3-7-18): (i) SOCh, piridina, CH²O ²/DMF, 21°C, 2 h, 91%; (ii) 1. H² (50 psi), Pd/C (Degussa), THF/EtOH (1:1), 21°C, 24 h; 2. TFA/H²O (4:1), 0°C, 3,3 h, RP-HPLC, 50% (2 etapas); (iii) 4, Et3N, DMF, 21°C, 3 h, RP-HPLC, 68%; (iv) 5, Et3N, DMF, 21°C, 2,5 h, RP-HPLC, 53%. (b) Evaluación biológica de saponina de yoduro de arilo 8 con antígeno OVA. Los ratones se vacunaron con OVA (20 |ig) según el procedimiento general comentado en el presente documento. Mediana de los títulos representada como barras horizontales rojas. La significación estadística en comparación con SQS-21 se evaluó usando la prueba de la t de Student para datos independientes bilateral con IC = 95%: * = 0,01 < p < 0,05 (significativo).

La figura 8 ilustra que la saponina marcada con yodo radiactivo [131I]-6 (no reivindicada) se ubica y retiene en los ganglios linfáticos y el sitio de inyección en ratones. Biodistribución ampliada de (a) saponina marcada con yodo radiactivo activa [131I]-6 y (b) saponina radiactiva inactiva [131I]-8 (no reivindicada) con antígeno OVA a las 24, 72 y 96 h tras la administración. Se recuperó una radiactividad significativamente más alta en los ganglios linfáticos y en el sitio de inyección con [131I]-6 a través de los tres puntos de tiempo, mientras que la radiactividad en otros órganos en los que se observó inicialmente una gran diferencia en veces (músculo, hueso, piel) disminuyó rápidamente en los últimos puntos de tiempo; el aumento en la recuperación de la tiroides en los últimos puntos de tiempo se observa habitualmente para todos los rastreadores marcados con yodo radiactivo debido a la desyodación del rastreador. Significación estadística para [131I]-6 en comparación con [131I]-8 en cada órgano en cada punto de tiempo evaluada usando la prueba de la t de Student para datos independientes bilateral con IC = 95%. A las 24 h: * = 0,01 < p < 0,05 (significativo): hígado, músculo, ganglio linfático, piel, tiroides; ** = 0,001 < p < 0,01 (muy significativo): sangre, pulmones, bazo, riñones, hueso, sitio de inyección; *** = p < 0,001 (extremadamente significativo): corazón. A las 72 h: * = 0,01 < p < 0,05 (significativo): bazo, timo, ganglios linfáticos, piel, hueso; ** = 0,001 < p < 0,01 (muy significativo): corazón, pulmones, hígado, riñones, ovarios, tiroides; *** = p < 0,001 (extremadamente significativo): sangre, sitio de inyección. A las 96 h: * = 0,01 < p < 0,05 (significativo): hueso, ovarios, timo, piel, tiroides; ** = 0,001 < p < 0,01 (muy significativo): pulmones, bazo, estómago, riñón, ganglios linfáticos, sitio de inyección; *** = p < 0,001 (extremadamente significativo): sangre, corazón, hígado.

La figura 9 ilustra que la biodistribución de saponinas marcadas con yodo radiactivo [131I]-6 (no reivindicada) y [131I]-8 (no reivindicada) no se ve alterada por la ausencia de antígeno OVA. Biodistribución de (a) adyuvante activo [131I]-6 ([131I]-SQS-0-0-5-18) y (b) adyuvante atenuado [131I]-8 ([131I]-SQS-0-3-7-18). Comparación de la radiactividad recuperada (c) en los ganglios linfáticos y (d) en el sitio de inyección, en la que se recuperó una radiactividad significativamente más alta con [131I]-6 a través de los tres puntos de tiempo, mientras que la radiactividad en otros órganos en los que se observó inicialmente una gran diferencia en veces (músculo, hueso, piel) disminuyó en los últimos puntos de tiempo. Significación estadística para [131I]-6 en comparación con [131I]-8 en cada órganos en cada punto de tiempo evaluada usando la prueba de la t de Student para datos independientes bilateral con IC = 95%, no mostrada gráficamente en las partes (a) y (b) para claridad. A las 24 h: * = 0,01 < p < 0,05 (significativo): músculo, hueso, ovarios, sitio de inyección, piel; ** = 0,001 < p < 0,01 (muy significativo): pulmones, hígado, bazo, riñones, timo; *** = p < 0,001 (extremadamente significativo): sangre, corazón. A las 72 h: * = 0,01 < p < 0,05 (significativo): bazo, timo, ganglio linfático, sitio de inyección; ** = 0,001 < p < 0,01 (muy significativo): sangre, pulmones, hígado, músculo, hueso, tiroides; *** = p < 0,001 (extremadamente significativo): corazón, riñón, ovarios, piel. A las 96 h: * = 0,01 < p < 0,05 (significativo): corazón, pulmones, hígado, bazo, riñón, timo, ganglio linfático, piel; ** = 0,001 < p < 0,01 (muy significativo): sangre, sitio de inyección.

La figura 10 ilustra que la biodistribución de ovoalbúmina marcada con yodo radiactivo ([131I]-OVA) indica una rápida desyodación. Biodistribución a las 24, 72 y 96 h tras la administración en (a) presencia (20 |ig) y (b) ausencia de adyuvante activo 6 (SQS-0-0-5-18) (no reivindicado). Significación estadística para la vacunación con 6 en comparación con sin 6 en cada órgano en cada punto de tiempo evaluada usando la prueba de la t de Student para datos independientes bilateral con IC = 95%, no mostrada gráficamente para claridad. A las 24 h: * = 0,01 < p < 0,05 (significativo): corazón, piel; ** = 0,001 < p < 0,01 (muy significativo): timo. A las 72 h: * = 0,01 < p < 0,05 (significativo): estómago, ganglio linfático, piel. A las 96 h: * = 0,01 < p < 0,05 (significativo): sangre, pulmones, estómago, riñón, hueso; ** = 0,001 < p < 0,01 (muy significativo): bazo, ovarios, timo.

La figura 11 ilustra que el adyuvante activo 3 marcado con fluoresceína (no reivindicado) se retiene en el sitio de inyección. Imágenes completas de ratón con saponina 3 fluorescente (SQS-0-0-5-12) y adyuvante inactivo que contiene amina 2 (SQS-0-0-5-11) para comparación con la figura 2b en el presente documento.

La figura 12 ilustra la síntesis de las variantes de yoduro de arilo y arilestaño derivadas de ácido oleanólico 18 ([SQS-1-7-5-18]) y S9. (i) 1. TESOTf, 2,6-lutidina, CH²Cl², 0°C, 1 h; 2. 12, BFâ OEt², T.M. de 4 A, CH²Cl², -50°C, 20 min, 21°C, 2 min [dos ciclos de temperatura], 54% (2 etapas); (ii) 1. PhSeH, Et3N, 38°C, 8 h; 2. HO2C(CH2)5NBBoc (14), EtOCOCI, Et3N, THF, 0°C, 2,5 h, [preactivación con ácido], después 0°C, 1,5 h, 77% (2 etapas); (iii) 1. H² (50 psi), Pd/C (Degussa), THF/EtOH (1:1), 21°C, 24 h; 2. TFA/H²O (4:1), 0°C, 2 h, RP-HPLC, 44% (2 etapas); (iv) 4, Et3N, DMF, 21°C, 2 h, RP-HPLC; 63%; (v) 5, Et3N, DMF, 21°C, 1,5 h, RP-HPLC, 63%; (vi) [131I]-NaI, cloramina-T, MeOH, 21°C, 1 min, RP-HPLC, 55%.

La figura 13 ilustra la síntesis de adyuvante de saponina de yoduro de arilo 19 (SQS-1-11-5-18). (i) NaBH4, MeOH, 21°C, 3 h, >99%; (ii) 1. H² (1 atm), Pd/C (Degussa), EtOH/THF (1:1), 21°C, 12 h; 2. TFA/H²O (3:1), 0°C, 1,25 h, RP-HPLC, 70% (2 etapas); (iii) 4, EtaN, DMF, 21°C, 3 h, RP-HPLC, 65%.

La figura 14 ilustra la síntesis de los elementos de construcción de triterpeno protegido. (i) TESOTf, 2,6-lutidina, CH²O ², 0°C, 1 h; S14: 94%; S17: 65%; S18: 81%; (ii) 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo (TEMPO), N-clorosuccinimida (NCS), cloruro de tetrabutilamonio hidratado (TBAChH²O), CH2Cl2/NaHCO3 0,5 M/K²CO³ 0,05 M, 21°C, 2 h, 72%.

La figura 15 ilustra la síntesis de variantes de yoduro de arilo adicionales que carecen del dominio de trisacárido ramificado, 20 (SQS-1-8-5-18), 21 (SQS-1-9-5-18) y 22 (SQS-1-10-5-18). (i) S14 o S17 o S18, BF3^OEt2, T.M. de 4 A, CH²O ², -35°C, 30 min; S19: 80%; S20: 70%; S21: 71%; (ii) 1. PhSeH, Et3N, 38°C, 8 h; 2. HO²C(CH²)aNHBoc (14), EtOCOCI, Et3N, THF, 0°C, 2,5 h, [preactivación con ácido], después 0°C, 1,5 h; S22: 73% (2 etapas); S23: 62% (2 etapas); S24: 74%; (iii) 1. H² (1 atm), Pd/C (Degussa), THF/EtOH (1:1), 21°C, 12 h; 2. TFA/H²O (3:1), 0°C, 1,25 h, RP-HPLC, S25: 53% (2 etapas); S26: 82% (2 etapas); S27: 66%; (iv) 4, Et3N, DMF, 21°C, 3 h, RP-HPLC; 20: 80%; 21: 56%; 22: 57%.

La figura 16 ilustra datos completos para la evaluación de las variantes de triterpeno 19-22 en un modelo de vacunación de ratón preclínico. Evaluación biológica de 19 (SQS-1-11-5-18), 20 (SQS-1-8-5-18), 21 (SQS-1-9-5-18) y 22 (SQS-1-10-5-18) a dosis de 20 |ig y 50 |ig con una vacuna de cuatro componentes (MUC1-KLH, OVA, GD3, KLH) para títulos de (a) anti-KLH (IgG), (b) anti-MUC1 (IgG), (c) anti-OVA (IgG), (d) anti-GD3 (IgM) y (e) anti-GD3 (IgG). Valores de la mediana de los títulos representados como barras horizontales rojas. La significación estadística es en comparación con control sin adyuvante y se evaluó usando la prueba de la t de Student para datos independientes bilateral con IC = 99%: * = 0,01 < p < 0,05 (significativo), ** = 0,001 < p < 0,01 (muy significativo), *** = p < 0,001 (extremadamente significativo). (e) Evaluación de toxicidad de 19-22 basada en la mediana del porcentaje de pérdida de peso a lo largo de una semana después de la primera inyección de vacuna.

Descripción detallada

La siguiente descripción detallada se presenta para permitir que cualquier experto en la técnica use los presentes métodos y kits. Para fines de explicación, se expone una nomenclatura específica para proporcionar una comprensión exhaustiva de los presentes métodos y kits. Sin embargo, resultará evidente para un experto en la técnica que no se requieren estos detalles específicos para poner en práctica el uso de los métodos y kits. Se proporcionan descripciones de aplicaciones específicas únicamente como ejemplos representativos. No se pretende que los presentes métodos y kits se limiten a las realizaciones mostradas, sino que se les concederá el alcance más amplio posible de acuerdo con los principios y las características dados a conocer en el presente documento.

Los encabezados usados en el presente documento son con fines de organización únicamente, y no pretenden usarse para limitar el alcance de la descripción o las reivindicaciones. Tal como se usa a lo largo de esta solicitud, la palabra “puede” se usa en un sentido permisivo (es decir, significa que tiene el potencial para), en lugar del sentido mandatorio (es decir, significa deber). Los términos “un” y “uno/una” en el presente documento no indican una limitación de cantidad, sino que más bien indican la presencia de al menos uno de los elementos a los que se hace referencia.

Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, deben aplicarse las siguientes definiciones a menos que se indique lo contrario.

El término “alifático” o “grupo alifático”, tal como se usa en el presente documento, significa una cadena de hidrocarburo de cadena lineal (es decir, no ramificada) o ramificada, sustituida o no sustituida, que está completamente saturada o que contiene una o más unidades de insaturación, o un hidrocarburo monocíclico o hidrocarburo bicíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático (también denominado en el presente documento “carbociclo”, “cicloalifático” o “cidoalquilo”), que tiene un único punto de unión a la parte restante de la molécula. A menos que se especifique lo contrario, los grupos alifáticos contienen 1-12 átomos de carbono alifáticos. En algunas realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-6 átomos de carbono alifáticos. En algunas realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-5 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-4 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-3 átomos de carbono alifáticos, y en aún otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-2 átomos de carbono alifáticos. En algunas realizaciones, “cicloalifático” (o “carbociclo” o “cicloalquilo”) se refiere a un hidrocarburo C³-C⁶ monocíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático, que tiene un único punto de unión a la parte restante de la molécula. Los grupos alifáticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo lineales o ramificados, sustituidos o no sustituidos, e híbridos de los mismos tales como (cicloalquil)alquilo, (cicloalquenil)alquilo o (cicloalquil)alquenilo.

El término “alquilo inferior” se refiere a un grupo alquilo C^1-4 lineal o ramificado. Grupos alquilo inferior a modo de ejemplo son metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo y terc-butilo.

El término “haloalquilo inferior” se refiere a un grupo alquilo C^1-4 lineal o ramificado que está sustituido con uno o más átomos de halógeno.

El término “heteroátomo” significa uno o más de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio (incluyendo cualquier forma oxidada de nitrógeno, azufre, fósforo o silicio; la forma cuaternizada de cualquier nitrógeno básico o; un nitrógeno que puede sustituirse de un anillo heterocíclico, por ejemplo N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo) o NR+ (como en pirrolidinilo N-sustituido)).

El término “insaturado”, tal como se usa en el presente documento, significa que un resto tiene una o más unidades de insaturación.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena de hidrocarburo C^1-12 (o C^1-26, C^1-16, C^1-8) bivalente o lineal o ramificada, saturada o insaturada”, se refiere a cadenas bivalentes de alquileno, alquenileno, y alquinileno que son lineales o ramificadas tal como se define en el presente documento.

El término “alquileno” se refiere a un grupo alquilo bivalente. Una “cadena de alquileno” es un grupo polimetileno, es decir, -(CH²)n-, en el que n es un número entero positivo, preferiblemente desde 1 hasta 6, desde 1 hasta 4, desde 1 hasta 3, desde 1 hasta 2 o desde 2 hasta 3. Una cadena de alquileno sustituida es un grupo polimetileno en el que uno o más átomos de hidrógeno de metileno se reemplazan por un sustituyente. Los sustituyentes adecuados incluyen aquellos descritos a continuación para un grupo alifático sustituido.

El término “alquenileno” se refiere a un grupo alquenilo bivalente. Una cadena de alquenileno sustituida es un grupo polimetileno que contiene al menos un doble enlace en el que uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan por un sustituyente. Los sustituyentes adecuados incluyen aquellos descritos a continuación para un grupo alifático sustituido.

El término “alquinileno” se refiere a un grupo alquinilo bivalente. Una cadena de alquinileno sustituida es un grupo polimetileno que contiene al menos un doble enlace en el que uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan por un sustituyente. Los sustituyentes adecuados incluyen aquellos descritos a continuación para un grupo alifático sustituido.

El término “acilo”, usado solo o como parte de un resto más grande, se refiere a grupos formados retirando un grupo hidroxilo de un ácido carboxílico.

El término “halógeno” significa F, Cl, Br o I.

Los términos “aralquilo” y “arilalquilo” se usan de manera intercambiable y se refiere a grupos alquilo en los que se ha reemplazado un átomo de hidrógeno por un grupo arilo. Tales grupos incluyen, sin limitación, bencilo, cinamilo y dihidrocinamilo.

El término “arilo”, usado solo o como parte de un resto más grande, tal como en “aralquilo”, “aralcoxilo” o “ariloxialquilo”, se refiere a sistemas de anillos monocíclicos o bicíclicos que tienen un total de cinco a catorce miembros de anillo, en los que al menos un anillo en el sistema es aromático y en los que cada anillo en el sistema contiene de 3 a 7 miembros de anillo. El término “arilo” puede usarse de manera intercambiable con el término “anillo de arilo”.

En determinadas realizaciones de la presente invención, “arilo” se refiere a un sistema de anillos aromáticos que incluye, pero sin limitarse a, fenilo, bifenilo, naftilo, antracilo y similares, que pueden portar uno o más sustituyentes. Dentro del alcance del término “arilo”, tal como se usa en el presente documento, también se incluye un grupo en el que un anillo aromático se condensa con uno o más anillos no aromáticos, tales como indanilo, ftalimidilo, naftimidilo, fenantridinilo o tetrahidronaftilo, y similares.

Los términos “heteroarilo” y “heteroar-”, usados solos o como parte de un resto más grande, por ejemplo, “heteroaralquilo” o “heteroaralcoxilo”, se refieren a grupos que tienen de 5 a 10 átomos de anillo, preferiblemente 5, 6 ó 9 átomos de anillo; que tienen 6, 10 ó 14 electrones % compartidos en una matriz cíclica; y que tienen, además de átomos de carbono, desde uno hasta cinco heteroátomos. El término “heteroátomo” se refiere a nitrógeno, oxígeno o azufre, e incluye cualquier forma oxidada de nitrógeno o azufre y cualquier forma cuaternizada de un nitrógeno básico. Los grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, tienilo, furanilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, tiadiazolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, indolizinilo, purinilo, naftiridinilo y pteridinilo. Los términos “heteroarilo” y “heteroar-”, tal como se usan en el presente documento, también incluyen grupos en los que un anillo heteroaromático se condensa con uno o más anillos de arilo, cicloalifáticos o de heterociclilo, en los que el radical o punto de unión está en el anillo heteroaromático. Los ejemplos no limitativos incluyen indolilo, isoindolilo, benzotienilo, benzofuranilo, dibenzofuranilo, indazolilo, bencimidazolilo, benzotiazolilo, quinolilo, isoquinolilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, 4H-quinolizinilo, carbazolilo, acridinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo y pirido[2,3-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona. Un grupo heteroarilo puede ser monocíclico o bicíclico. El término “heteroarilo” puede usarse de manera intercambiable con los términos “anillo de heteroarilo”, “grupo heteroarilo” o “heteroaromático”, incluyendo cualquiera de los términos anillos que están opcionalmente sustituidos. Los términos “heteroaralquilo” y “heteroarilalquilo” se refieren a un grupo alquilo sustituido con un resto heteroarilo, en los que las porciones alquilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidas de manera independiente.

El término “heteroalifático”, tal como se usa en el presente documento, significa grupos alifáticos en los que uno o dos átomos de carbono están independientemente reemplazados por uno o más de oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo. Los grupos heteroalifáticos pueden estar sustituidos o no sustituidos, ser ramificados o no ramificados, cíclicos o acíclicos, e incluyen los grupos “heterociclo”, “heterociclilo”, “heterocicloalifático” o “heterocíclico”.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “heterociclo”, “heterociclilo”, “radical heterocíclico” y “anillo heterocíclico” se usan de manera intercambiable y se refieren a un resto heterocíclico bicíclico de 7-10 miembros o monocíclico de 5 a 7 miembros estable que está o bien saturado o bien parcialmente insaturado, y que tiene, además de átomos de carbono, uno o más, preferiblemente de uno a cuatro, heteroátomos, tal como se definió anteriormente. Cuando se usa en referencia a un átomo de anillo de un heterociclo, el término “nitrógeno” incluye un nitrógeno sustituido. Como ejemplo, en un anillo saturado o parcialmente insaturado que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre o nitrógeno, el nitrógeno puede ser N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo) o NR (como en pirrolidinilo N-sustituido).

Un anillo heterocíclico puede estar unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado una estructura estable, y cualquiera de los átomos de anillo puede estar opcionalmente sustituido. Los ejemplos de tales radicales heterocíclicos saturados o parcialmente insaturados incluyen, sin limitación, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo pirrolidinilo, piperidinilo, pirrolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, dioxanilo, dioxolanilo, diazepinilo, oxazepinilo, tiazepinilo, morfolinilo y quinuclidinilo. Los términos “heterociclo”, “heterociclilo”, “anillo de heterociclilo”, “grupo heterocíclico”, “resto heterocíclico” y “radical heterocíclico” se usan de manera intercambiable en el presente documento, y también incluyen grupos en los que un anillo de heterociclilo se condensa con uno o más anillos de arilo, de heteroarilo o cicloalifáticos, tales como indolinilo, 3H-indolilo, cromanilo, fenantridinilo o tetrahidroquinolinilo, en los que el radical o punto de unión está en el anillo de heterociclilo. Un grupo heterociclilo puede ser monocíclico o bicíclico. El término “heterociclilalquilo” se refiere a un grupo alquilo sustituido con un heterociclilo, en el que las porciones alquilo y heterociclilo están opcionalmente sustituidas de manera independiente.

Tal como se usa en el presente documento, el término “parcialmente insaturado” se refiere a un resto de anillo que incluye al menos un doble enlace o triple enlace. Se pretende que el término “parcialmente insaturado” abarque anillos que tienen múltiples sitios de insaturación, pero no se pretende que incluya restos arilo o heteroarilo, tal como se definen en el presente documento.

La expresión “portador farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, significa un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, un diluyente, excipiente o disolvente que encapsula material, implicado en portar o transportar el compuesto objetivo desde un órgano, o una porción del cuerpo, a otro órgano, u otra porción del cuerpo. Cada portador debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales como propilenglicol; polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes de tamponamiento tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; disoluciones de pH tamponado; poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellas sales que son, dentro del alcance del juicio médico razonable, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares indebidas, y son acordes con una relación beneficio/riesgo razonable. En la técnica se conocen bien sales farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, S. M. Berge et al. describen sales farmacéuticamente aceptables con detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen aquellas derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos adecuados. Ejemplos de sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, no tóxicas, son sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico, o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico, o usando otros métodos usados en la técnica tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares.

En otros casos, los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más grupos funcionales ácidos y, por tanto, pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término “sales farmacéuticamente aceptables” en estos casos se refiere a las sales de adición de base inorgánicas y orgánicas relativamente no tóxicas de los compuestos de la presente invención. Del mismo modo, estas sales pueden prepararse in situ en el procedimiento de fabricación del vehículo de administración o de la forma de dosificación, o haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma de ácido libre con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, con amoniaco, o con una amina orgánica primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria farmacéuticamente aceptable. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen las sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y N+(alquilo C-^m )4. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Además, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos formados usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquilo inferior y sulfonato de arilo. Las aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de base incluyen etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares. (Véase, por ejemplo, Berge et al., citado anteriormente).

A menos que se indique lo contrario, también se pretende que las estructuras representadas en el presente documento incluyan todos los isómeros enantioméricos, isómeros enantioméricos e isómeros geométricos (o conformacionales) de la estructura; por ejemplo, las configuraciones R y S para cada estereocentro, isómeros de doble enlace Z y E isómeros conformacionales Z y E. Por tanto, los isómeros estereoquímicos únicos así como las mezclas enantioméricas, diastereoméricas y geométricas (o conformacionales) de los presentes compuestos están dentro del alcance de la invención. A menos que se indique lo contrario, todas las formas tautoméricas de los compuestos de la invención están dentro del alcance de la invención.

Los compuestos proporcionados pueden comprender uno o más restos de sacáridos. A menos que se especifique lo contrario, ambas configuraciones D y L, y mezclas de los mismos, están dentro del alcance de la invención. A menos que se especifique lo contrario, ambas realizaciones ligadas a a y p, y mezclas de los mismos, se contemplan por la presente invención.

Si, por ejemplo, se desea un enantiómero particular de un compuesto de la presente invención, puede prepararse mediante síntesis asimétrica, cromatografía quiral o mediante derivación con un auxiliar quiral, en la que la mezcla diastereomérica resultante se separa y el grupo auxiliar se escinde para proporcionar los enantiómeros deseados puros. Alternativamente, cuando la molécula contiene un grupo funcional básico, tal como amino, o un grupo funcional ácido, tal como carboxilo, se formas sales diastereoméricas con un ácido o una base ópticamente activos apropiados, seguido de resolución de los diastereómeros así formados mediante cristalización fraccionada o medios cromatográficos bien conocidos en la técnica y la posterior recuperación de los enantiómeros puros.

Además, a menos que se indique lo contrario, se pretende que las estructuras representadas en el presente documento también incluyan compuestos que difieren únicamente en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras que incluyen el reemplazo de hidrógeno por deuterio o tritio, o el reemplazo de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o14C, están dentro del alcance de esta invención. Tales compuestos son útiles, por ejemplo, como herramientas analíticas, como sondas en ensayos biológicos o como agentes terapéuticos según la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, el término “agente reductor” se refiere a un reactivo adecuado para llevar a cabo la reacción de reducción contextualmente relevante. Agentes reductores a modo de ejemplo, pero no limitativos, son: hidruro de litio y aluminio (LiAlH4), borohidruro de sodio (NaBH4), reactivos de hidroboración (BH³, B²H⁶), metales alcalinos (por ejemplo, Li o Na), metales de transición (por ejemplo, Sn, Zn o Fe), reactivos de Grignard (RMgX) y compuestos organometálicos (RLi, RNa, R²CuLi). El término también puede abarcar técnicas reductoras tales como hidrogenación catalítica. Un experto habitual en la técnica apreciará que los métodos de síntesis, tal como se describen en el presente documento, utilizan una variedad de agentes reductores.

Un experto habitual en la técnica apreciará que los métodos de síntesis, tal como se describen en el presente documento, utilizan una variedad de grupos protectores. Por el término “grupo protector”, tal como se usa en el presente documento, quiere decirse que se enmascara o bloquea un resto funcional particular, por ejemplo, O, S o N, lo que permite, si se desea, que se lleve a cabo una reacción de manera selectiva en otro sitio reactivo en un compuesto multifuncional. En realizaciones preferidas, un grupo protector reacciona de manera selectiva con buen rendimiento para dar un sustrato protegido que es estable frente a las reacciones proyectadas; preferiblemente, el grupo protector puede retirarse de manera selectiva mediante reactivos fácilmente disponibles, preferiblemente no tóxicos, que no atacan a los otros grupos funcionales; el grupo protector forma un derivado separable (más preferiblemente sin la generación de nuevos centros estereogénicos); y el grupo protector tendrá preferiblemente un mínimo de funcionalidad adicional para evitar sitios adicionales de reacción. Tal como se detalla en el presente documento, pueden utilizarse grupos protectores de oxígeno, azufre, nitrógeno y carbono. A modo de ejemplo no limitativo, los grupos protectores de hidroxilo incluyen metilo, metoximetilo (MOM), metiltiometilo (MTM), f-butiltiometilo, (fenildimetilsilil)metoximetilo (SMOM), benciloximetilo (BOM), p-metoxibenciloximetilo (PMBM), (4-metoxifenoxi)metilo (p-AOM), guaiacolmetilo (GUM), f-butoximetilo, 4-penteniloximetilo (POM), siloximetilo, 2-metoxietoximetilo (MEM), 2,2,2-tricloroetoximetilo, bis(2-cloroetoxi)metilo, 2-(trimetilsilil)etoximetilo (SEMOR), tetrahidropiranilo (THP), 3-bromotetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, 1-metoxiciclohexilo, 4-metoxitetrahidropiranilo (MTHP), 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, 5.5- dióxido de 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ilo (CTMP), 1,4-dioxan-2- ilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofuranilo, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-octahidro-7,8,8-trimetil-4,7-metanobenzofuran-2-ilo, 1- etoxietilo, 1-(2-cloroetoxi)etilo, 1-metiM-metoxietilo, 1 -metil-1-benciloxietilo, 1-metil-1-benciloxi-2-fluoroetilo, 2,2,2-tricloroetilo, 2-trimetilsililetilo, 2-(fenilselenil)etilo, f-butilo, alilo, p-clorofenilo, p-metoxifenilo, 2,4-dinitrofenilo, bencilo, p-metoxibencilo, 3,4-dimetoxibencilo, o-nitrobencilo, p-nitrobencilo, p-halobencilo, 2,6-diclorobencilo, p-cianobencilo, p-fenilbencilo, 2-picolilo, 4-picolilo, N-óxido de 3-metil-2-picolilo, difenilmetilo, p,p’-dinitrobenzhidrilo, 5-dibenzosuberilo, trifenilmetilo, a-naftildifenilmetilo, p-metoxifenildifenilmetilo, di(p-metoxifenil)fenilmetilo, tri(p-metoxifenil)metilo, 4-(4'-bromofenaciloxifenil)difenilmetilo, 4,4',4”-tris(4,5-diclo rofta limid ofe nil)metilo, 4,4',4”-tris(levulinoiloxifenil)metilo, 4,4',4”-tris(benzoiloxifenil)metilo, 3-(imidazol-1-il)bis(4',4”-dimetoxifenil)metilo, 1, 1 -bis(4-metoxifenil)-1 '-pirenilmetilo, 9-antrilo, 9-(9-fenil)xantenilo, 9-(9-fenil-10-oxo)antrilo, 1,3-benzoditiolan-2-ilo, S,S-dióxido de bencisotiazolilo, trimetilsililo (TMS), trietilsililo (TES), triisopropilsililo (TIPS), dimetilisopropilsililo (IPDMS), dietilisopropilsililo (DEIPS), dimetilthexilsililo, f-butildimetilsililo (TBDMS), f-butildifenilsililo (TBDPS), tribencilsililo, tri-p-xililsililo, trifenilsililo, difenilmetilsililo (DPMS), f-butilmetoxifenilsililo (TBMPS), formiato, benzoilformiato, acetato, cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato, metoxiacetato, trifenilmetoxiacetato, fenoxiacetato, p-clorofenoxiacetato, 3- fenilpropionato, 4-oxopentanoato (levulinato), 4,4-(etilenditio)pentanoato (levulinoilditioacetal), pivaloato, adamantoato, crotonato, 4-metoxicrotonato, benzoato, p-fenilbenzoato, 2,4,6-trimetilbenzoato (mesitoato), carbonato de alquilo y metilo, carbonato de 9-fluorenilmetilo (Fmoc), carbonato de alquilo y etilo, carbonato de alquilo y 2,2,2-tricloroetilo (Troc), carbonato de 2-(trimetilsilil)etilo (TMSEC), carbonato de 2-(fenilsulfonil)etilo (Psec), carbonato de 2-(trifenilfosfonio)etilo (Peoc), carbonato de alquilo e isobutilo, carbonato de alquilo y vinilo, carbonato de alquilo y alilo, carbonato de alquilo y p-nitrofenilo, carbonato de alquilo y bencilo, carbonato de alquilo y p-metoxibencilo, carbonato de alquilo y 3,4-dimetoxibencilo, carbonato de alquilo y o-nitrobencilo, carbonato de alquilo y p-nitrobencilo, tiocarbonato de alquilo y S-bencilo, carbonato de 4-etoxi-1-naftilo, ditiocarbonato de metilo, 2-yodobenzoato, 4-azidobutirato, 4-nitro-4-metilpentanoato, o-(dibromometil)benzoato, 2- formilbencenosulfonato, 2-(metiltiometoxi)etilo, 4-(metiltiometoxi)butirato, 2-(metiltiometoximetil)benzoato, 2.6- dicloro-4-metilfenoxiacetato, 2,6-dicloro-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1-dimetilpropil)fenoxiacetato, clorodifenilacetato, isobutirato, monosuccinoato, (£)-2-metil-2-butenoato, o-(metoxicarbonil)benzoato, a-naftoato, nitrato, N,N,N’,N’-tetrametilfosforodiamidato de alquilo, N-fenilcarbamato de alquilo, borato, dimetilfosfinotioílo, 2,4-dinitrofenilsulfenato de alquilo, sulfato, metanosulfonato (mesilato), bencilsulfonato y tosilato (Ts). Para proteger 1,2-dioles o 1,3-dioles, los grupos protectores incluyen metilen acetal, etiliden acetal, 1 -f-butiletiliden cetal, 1 -feniletiliden cetal, (4-metoxifenil)etiliden acetal, 2,2,2-tricloroetiliden acetal, acetónido, ciclopentiliden cetal, ciclohexiliden cetal, cicloheptiliden cetal, benciliden acetal, p-metoxibenciliden acetal, 2,4-dimetoxibenciliden cetal, 3,4-dimetoxibenciliden acetal, 2-nitrobenciliden acetal, metoximetilen acetal, etoximetilen acetal, ortoéster de dimetoximetileno, ortoéster de 1-metoxietilideno, ortoéster de 1-etoxietilidino, ortoéster de 1,2-dimetoxietilideno, ortoéster de a-metoxibencilideno, derivado de 1-(N,Ndimetilamino)etilideno, derivado de a-(N,N-dimet¡lammo)bendl¡deno, ortoéster de 2-oxaciclopentilideno, grupo di-f-butilsilileno (DTBS), derivado de 1,3-(1,1,3,3-tetraisopropildisiloxanilideno) (TIPDS), derivado de tetra-fbutoxidisiloxano-1,3-diilideno (TBDS), carbonatos cíclicos, boronatos cíclicos, boronato de etilo y boronato de fenilo. Los grupos protectores de amino incluyen carbamato de metilo, carbamato de etilo, carbamato de 9-fluorenilmetilo (Fmoc), carbamato de 9-(2-sulfo)fluorenilmetilo, carbamato de 9-(2,7-dibromo)fluoroenilmetilo, carbamato de 2,7-di-f-butil-[9-(10,10-dioxo-10,10,10,10-tetrah¡drot¡oxant¡l)]met¡lo (DBD-Tmoc), carbamato de 4-metoxifenacilo (Fenoc), carbamato de 2,2,2-tricloroetilo (Troc), carbamato de 2-trimetilsililetilo (Teoc), carbamato de 2-feniletilo (hZ), carbamato de 1-(1-adamantil)-1-metiletilo (Adpoc), carbamato de 1, 1 -dimetil-2-haloetilo, carbamato de 1,1-d¡met¡l-2,2-d¡bromoet¡lo (DB-f-BOC), carbamato de 1,1-d¡met¡l-2,2,2-tr¡cloroet¡lo (TCBOC), carbamato de 1 -metil-1 -(4-b¡fen¡l¡l)et¡lo (Bpoc), carbamato de 1-(3,5-d¡-f-but¡lfen¡l)-1-met¡let¡lo (f-Bumeoc), carbamato de 2-(2'- y 4'-p¡r¡d¡l)et¡lo (Pyoc), carbamato de 2-(N,N-d¡c¡clol êx¡lcarboxam¡do)et¡lo, carbamato de f-butilo (BOC), carbamato de 1-adamantilo (Adoc), carbamato de vinilo (Voc), carbamato de alilo (Alloc), carbamato de 1-isopropilalilo (Ipaoc), carbamato de cinamilo (Coc), carbamato de 4-nitrocinamilo (Noc), carbamato de 8-quinolilo, carbamato de W-hidroxipiperidinilo, alquilditiocarbamato, carbamato de bencilo (Cbz), carbamato de p-metoxibencilo (Moz), carbamato de p-nitrobencilo, carbamato de p-bromobencilo, carbamato de p-clorobencilo, carbamato de 2,4-diclorobencilo, carbamato de 4-metilsulfinilbencilo (Msz), carbamato de 9-antrilmetilo, carbamato de difenilmetilo, carbamato de 2-metiltioetilo, carbamato de 2-metilsulfoniletilo, carbamato de 2-(p-toluenosulfonil)etilo, carbamato de p-^^-ditianil^metilo (Dmoc), carbamato de 4-metilti ofenilo (Mtpc), carbamato de 2,4-dimetiltiofenilo (Bmpc), carbamato de 2-fosfonioetilo (Peoc), carbamato de 2- trifenilfosfonioisopropilo (Ppoc), carbamato de 1, 1 -dimetil-2-cianoetilo, carbamato de m-cloro-p-aciloxibencilo, carbamato de p-(dihidroxiboril)bencilo, carbamato de 5-bencisoxazolilmetilo, carbamato de 2-(trifluorometil)-6-cromonilmetilo (Tcroc), carbamato de m-nitrofenilo, carbamato de 3,5-dimetoxibencilo, carbamato de 0- nitrobencilo, carbamato de 3,4-d¡metox¡-6-n¡trobenc¡lo, carbamato de fen¡l(o-n¡trofen¡l)met¡lo, derivado de fenot¡az¡n¡l-(10)-carbon¡lo, derivado de W’-p-toluenosulfonilaminocarbonilo, derivado de W’-fenilaminotiocarbonilo, carbamato de f-amilo, tiocarbamato de S-bencilo, carbamato de p-cianobencilo, carbamato de ciclobutilo, carbamato de ciclohexilo, carbamato de ciclopentilo, carbamato de ciclopropilmetilo, carbamato de p-deciloxibencilo, carbamato de 2,2-dimetoxicarbonilvinilo, carbamato de o-WW-dimetilcarboxamido^encilo, carbamato de 1,1-d¡met¡l-3-(N,N-d¡met¡lcarboxam¡do)prop¡lo, carbamato de 1, 1 -dimetilpropinilo, carbamato de di^-piridipmetilo, carbamato de 2-furanilmetilo, carbamato de 2-yodoetilo, carbamato de isobornilo, carbamato de isobutilo, carbamato de isonicotinilo, carbamato de p-(p’-metox¡fen¡lazo)benc¡lo, carbamato de 1 -metilciclobutilo, carbamato de 1-metilciclohexilo, carbamato de 1 -metil-1-ciclopropilmetilo, carbamato de 1-metil-1-(3,5-d¡metox¡fen¡l)et¡lo, carbamato de 1 -metil-1 -(p-fenilazofenil)etilo, carbamato de 1 -metil-1-feniletilo, carbamato de 1- met¡l-1-(4-p¡r¡d¡l)et¡lo, carbamato de fenilo, carbamato de p-(fenilazo)bencilo, carbamato de 2,4,6-tri-f-butilfenilo, carbamato de 4-(tr¡met¡lamon¡o)benc¡lo, carbamato de 2,4,6-trimetilbencilo, formamida, acetamida, cloroacetamida, tricloroacetamida, trifluoroacetamida, fenilacetamida, 3-fenilpropanamida, picolinamida, 3- piridilcarboxamida, derivado de W-benzoilfenilalanilo, benzamida, p-fenilbenzamida, o-nitofenilacetamida, o-nitrofenoxiacetamida, acetoacetamida, (W’-ditiobenciloxicarbonilaminô cetamida, 3-(phidroxifeni^propanamida, 3-(o-nitrofenil)propanamida, 2-met¡l-2-(o-n¡trofenox¡)propanam¡da, 2-metil-2-(ofenilazofenoxi)propanamida, 4-clorobutanamida, 3-metil-3-nitrobutanamida, o-nitrocinamida, derivado de W-acetilmetionina, o-nitrobenzamida, o-(benzo¡lox¡met¡l)benzam¡da, 4,5-difenil-3-oxazolin-2-ona, W-ftalimida, W-ditiasuccinimida (Dts), W-^^-difenilmaleimida, N-2,5-dim etilpirrol, aducto de W-1,1,4,4-tetrametildisililazaciclopentano (STABASE), 1,3-d¡met¡l-1,3,5-tr¡azac¡clohexan-2-ona 5-sustituida, 1,3-dibencil-1,3,5-triazaciclohexan-2-ona 5-sustituida, 3,5-d¡n¡tro-4-p¡r¡dona 1-sustituida, W-metilamina, W-alilamina, W-[2-(trimetNsili êtox^metilamma (SEM), W-3-acetoxipropilamina, N-(1-¡soprop¡l-4-n¡tro-2-oxo-3-p¡rrol¡n-3-¡l)am¡na, sales de amonio cuaternario, W-bencilamina, W-di^-metoxifenipmetilamina, W-5-dibenzosuberilamina, W-trifenilmetilamina (Tr), W-^-metoxifenipdifenilmeti^amina (MMTr), W-9-fenilfluorenilamina (PhF), W-2,7-dicloro-9-fluorenilmetilenamina, W-ferrocenilmetilamino (Fcm), W’-óxido de W-2-picolilamino, W-1,1-d¡met¡lt¡omet¡lenam¡na, W-bencilidenamina, W-p-metoxibencilidenamina, W-difenilmetilenamina, W-^-piridi^mesiti^metilenamma, W-(W’W-dimetNammometile^amma, WW’-isopropilidendiamina, W-p-nitrobencilidenamina, W-salicilidenamina, W-5-clorosalicilidenamina, W-^-cloro^-hidroxifenilfenilmetilenamina, W-ciclohexilidenamina, W-(5,5-dimetil-3-oxo-1-c¡clohexen¡l)am¡na, derivado de W-borano, derivado del ácido W-difenilborónico, W-[fenil(pentacarbonilcromo o tungsteno)carbonil]amina, quelato de W-cobre, quelato de W-zinc, W-nitroamina, W-nitrosoamina, W-óxido de amina, difenilfosfinamida (Dpp), dimetiltiofosfinamida (Mpt), difeniltiofosfinamida (Ppt), fosforamidatos de dialquilo, fosforamidato de dibencilo, fosforamidato de difenilo, bencenosulfenamida, o-nitrobencenosulfenamida (Nps), 2,4-dinitrobencenosulfenamida, pentaclorobencenosulfenamida, 2-nitro-4-metoxibencenosulfenamida, trifenilmetilsulfenamida, 3-nitropiridinsulfenamida (Npys), p-toluenosulfonamida (Ts), bencenosulfonamida, 2,3,6,-trimetil-4-metoxibencenosulfonamida (Mtr), 2,4,6-trimetoxibencenosulfonamida (Mtb), 2,6-dimetil-4-metoxibencenosulfonamida (Pme), 2,3,5,6-tetrametil-4-metoxibencenosulfonamida (Mte), 4- metoxibencenosulfonamida (Mbs), 2,4,6-trimetilbencenosulfonamida (Mts), 2,6-dimetoxi-4-metilbencenosulfonamida (iMds), 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonamida (Pmc), metanosulfonamida (Ms), P-trimetilsililetanosulfonamida (SES), 9-antracenosulfonamida, 4-(4',8'-d¡metox¡naft¡lmet¡l)bencenosulfonam¡da (DNMBS), bencilsulfonamida, trifluorometilsulfonamida y fenacilsulfonamida. En el presente documento se detallan grupos protectores a modo de ejemplo, sin embargo, se apreciará que no se pretende que la presente invención se limite a estos grupos protectores; más bien, pueden identificarse fácilmente una variedad de grupos protectores equivalentes adicionales usando los criterios anteriores y utilizarse en el método de la presente invención. Además, se describen una variedad de grupos protectores por Greene y Wuts (citado anteriormente).

Tal como se describe en el presente documento, los compuestos de la invención pueden contener restos “opcionalmente sustituidos”. En general, el término “sustituido”, precedido o no por el término “opcionalmente”, significa que uno o más hidrógenos del resto designado se reemplazan por un sustituyente adecuado. A menos que se indique lo contrario, un grupo “opcionalmente sustituido” puede tener un sustituyente adecuado en cada posición que puede sustituirse del grupo, y cuando puede sustituirse más de una posición en cualquier estructura dada con más de un sustituyente seleccionado de un grupo especificado, los sustituyente pueden ser los mismos o diferentes en cada posición. Combinaciones de sustituyentes previstas por esta invención son preferiblemente aquellas que dan como resultado la formación de compuestos estables o químicamente factibles. El término “estable”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos que no se ven alterados sustancialmente cuando se someten a condiciones para permitir su producción, detección y, en determinadas realizaciones, su recuperación, purificación y uso para uno o más de los fines dados a conocer en el presente documento.

Sustituyentes monovalentes adecuados en un átomo de carbono que puede sustituirse de un grupo “opcionalmente sustituido” son independientemente halógeno; -(CH2)0-4Ro; -(CH2)0-4ORo; -O(CH2)0-4Ro, -O-(CH²)⁰-4C(O)OR°; -(CH2)0-4CH(ORo)2; -(CH2)0-4SR°; -(CH2)0-4Ph que puede estar sustituido con R°; -(CH2)o-4O(CH2)o-iPh que puede estar sustituido con R°; -CH=CHPh que puede estar sustituido con R°; -(CH2)0-4O(CH2)0-i-piridilo que puede estar sustituido con R°; -NO²; -CN; -N³; -(CH2)0-4N(R°)2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)R°; -N(R°)C(S)R°; -(CH2)0-4N(R°)C(O)NR°2; -N(R0)C(S)NR02; -(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°; -N(R°)N(R°)C(O)R°; -N(R°)N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)N(R°)C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)R°; -C(S)R°; -(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)SR°; -(CH2)0-4C(O)OSiR°3; -(CH2)0-4OC(O)R°; -OC(O)(CH2)0-4SR-, SC(S)SR°; -(CH2)0-4SC(O)R°; -(CH2)0-4C(O)NR°2; -C(S)NR°2; -C(S)SR°; -SC(S)SR°, -(CH2)0-4OC(O)NR°2; -C(O)N(OR°)R°; -C(O)C(O)R°; -C(O)CH2C(O)R°; -C(NOR°)R°; -(CH2)0-4SSR°; -(CH2)0-4S(O)2R°; -(CH2)0-4S(O)2OR°; -(CH2)0-4OS(O)2R°; -S(O)2NR°2; -(CH2)0-4S(O)R°; -N(R°)S(O)2NR°2; -N(R°)S(O)²R°; -N(OR°)R°; -C(NH)NR°²; -P(O)²R°; -P(O)R°²; -OP(O)R°²; -OP(O)(OR°)²; SiR°3; -(alquilen C^1-4 lineal o ramificado)O-N(R°)²; o -(alquilen C^1-4 lineal o ramificado)C(O)ON(R°)², en el que cada R° puede estar sustituido tal como se define a continuación y es independientemente hidrógeno, alifático C¹-⁶, -CH²Ph, -O(CH²)⁰-iPh, -CH²-(anillo de heteroarilo de 5-6 miembros), o un anillo de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre, o, a pesar de la definición anterior, dos apariciones independientes de R°, tomadas junto con su(s) átomo(s) intermedios, forman un anillo monocíclico o bicíclico de 3-12 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre, que puede estar sustituido tal como se define a continuación.

Sustituyentes monovalente adecuados en R° (o el anillo formado tomando dos apariciones independientes de R° junto con sus átomos intermedios) son independientemente halógeno, -(CH²)⁰-²R^ , -(haloR^), -(CH²)⁰-²OH, -(CH²)⁰-²O R -(CH²)⁰-²CH(OR-)²; -O(haloR-), -CN, -N³, -(CH²)⁰-²C(O)R -(CH²)⁰-²C(O)OH, -(CH²)⁰-²C(O)OR-, -(CH²)⁰-²S R -(CH²)⁰-²SH, -(CH²)⁰-²NH², -(CH²)⁰-²NHR ,^ -(CH²)⁰-²NR^ ², -NO², -SiR^, -OSiR-3, -C(O)SR -(alquilen C^1-4 lineal o ramificado)C(O)OR^ o -SSR ,^ en los que cada R^ no está sustituido o, cuando se está precedido por “halo”, está sustituido únicamente con uno o más halógenos, y se selecciona independientemente de alifático C¹-⁴, -CH²Ph, -O(CH²)⁰-¹Ph o un anillo de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los sustituyentes divalentes adecuados en un átomo de carbono saturado de R° incluyen =O y =S.

Los sustituyentes divalentes adecuados en un átomo de carbono saturado de un grupo “opcionalmente sustituido” incluyen los siguientes: =O, =S, =NNR*², =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)²R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R*2))2-3O- o -S(C(R*2))2-3S-, en los que cada aparición independiente de R* se selecciona de hidrógeno, alifático C^1-6 que puede estar sustituido tal como se define a continuación o un anillo no sustituido de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los sustituyentes divalentes adecuados que se unen a carbonos que pueden sustituirse vecinales de un grupo “opcionalmente sustituido” incluyen: -O(CR*2)2-3O-, en el que cada aparición independiente de R* se selecciona de hidrógeno, alifático C^1-6 que puede estar sustituido tal como se define a continuación o un anillo no sustituido de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.

Los sustituyentes adecuados en el grupo alifático de R* incluyen halógeno, -R^ , -(haloR^), -OH, -OR ,^ -O(haloR^), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR^, -NH², -NHR ,^ -NR^ o -NO², en los que cada R^ no está sustituido o, cuando se está precedido por “halo”, está sustituido únicamente con uno o más halógenos, y es independientemente alifático C¹-⁴, -CH²ph, -O(CH²)⁰-¹Ph o un anillo de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.

Los sustituyentes adecuados en un nitrógeno que puede sustituirse de un grupo “opcionalmente sustituido” incluyen -Rt -NRt>, -C(O)Rt -C(O)ORt -C(O)C(O)Rt -C(O)CH²C(O)Rt -S(O^Rf , -S(O)²NRt>, -C(S)NRt>, -C(NH)NR^{f 2} o -N(Rf )S(O)²Rf ; en los que cada Rf es independientemente hidrógeno, alifático C^1-6 que puede estar sustituido tal como se define a continuación, -OPh no sustituido o un anillo no sustituido de 5-6-miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre, o, a pesar de la definición anterior, dos apariciones independientes de Rf , tomadas junto con su(s) átomo(s) intermedio(s), forman un anillo monocíclico o bicíclico no sustituido de 3-12 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. Sustituyentes adecuados en el grupo alifático de Rf son independientemente halógeno, -R -(haloR-), -OH, -OR-, -O(haloR, -CN, -C(O)OH, -C(O)OR -NH², -NHR -N R o -NO², en los que cada R- no está sustituido o, cuando está precedido por “halo”, está sustituido únicamente con uno o más halógenos, y es independientemente alifático C^1-4, -CRPh, -O(CH²)o-iPh o un anillo de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.

Las expresiones “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral”, tal como se usan en el presente documento, significan modos de administración distintos de administración enteral y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, infusión e inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal.

Las expresiones “administración sistémica”, “administrado por vía sistémica”, “administración periférica” y “administrado periféricamente”, tal como se usan en el presente documento, significan la administración de un compuesto, fármaco u otro material distinta de directamente al sistema nervioso central, de tal manera que entra en el sistema del paciente y, por tanto, está sujeta al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea.

El término “enriquecida”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una mezcla que tiene una proporción aumentada de una o más especies. En algunas realizaciones, la mezcla está “enriquecida” tras un procedimiento que aumenta la proporción de una o más especies deseadas en la mezcla. En algunas realizaciones, la(s) especie(s) deseada(s) comprende(n) más del 10% de la mezcla. En algunas realizaciones, la(s) especie(s) deseada(s) comprende(n) más del 25% de la mezcla. En algunas realizaciones, la(s) especie(s) deseada(s) comprende(n) más del 40% de la mezcla. En algunas realizaciones, la(s) especie(s) deseada(s) comprende(n) más del 60% de la mezcla. En algunas realizaciones, la(s) especie(s) deseada(s) comprende(n) más del 75% de la mezcla. En algunas realizaciones, la(s) especie(s) deseada(s) comprende(n) más del 85% de la mezcla. En algunas realizaciones, la(s) especie(s) deseada(s) comprende(n) más del 90% de la mezcla. En algunas realizaciones, la(s) especie(s) deseada(s) comprende(n) más del 95% de la mezcla. Tales proporciones pueden medirse de muchas maneras, por ejemplo, como razón molar, volumen con respecto a volumen o peso con respecto a peso.

El término “puro” se refiere a compuestos que están sustancialmente libres de compuestos de estructura no objetivo relacionada o precursores químicos (cuando se sintetizan químicamente). Esta cualidad puede medirse o expresarse como “pureza”. En algunas realizaciones, un compuesto objetivo tiene menos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10%, el 5%, el 2%, el 1%, el 0,5% y el 0,1% de estructuras no objetivo o precursores químicos. En determinadas realizaciones, un compuesto puro de la presente invención es únicamente un compuesto de prosapogenina (es decir, separación de la prosapogenina objetivo de otras prosapogeninas).

El término “hidrato de carbono” se refiere a un azúcar o polímero de azúcares. Los términos “sacárido”, “polisacárido”, “hidrato de carbono” y “oligosacárido” pueden usarse de manera intercambiable. La mayoría de los hidratos de carbono son aldehídos o cetonas con muchos grupos hidroxilo, habitualmente uno en cada átomo de carbono de la molécula. En general, los hidratos de carbono tienen la fórmula molecular CnH²nOn. Un hidrato de carbono puede ser un monosacárido, un disacárido, trisacárido, oligosacárido o polisacárido. El hidrato de carbono más básico es un monosacárido, tal como glucosa, sacarosa, galactosa, manosa, ribosa, arabinosa, xilosa y fructosa. Los disacáridos son dos monosacáridos unidos. Los disacáridos a modo de ejemplo incluyen sacarosa, maltosa, celobiosa y lactosa. Normalmente, un oligosacárido incluye entre tres y seis unidades de monosacárido (por ejemplo, rafinosa, estaquiosa), y los polisacáridos incluyen seis o más unidades de monosacárido. Los polisacáridos a modo de ejemplo incluyen almidón, glicógeno y celulosa. Los hidratos de carbono pueden contener unidades de sacárido modificadas, tales como 2'-desoxirribosa, en la que se retira un grupo hidroxilo, 2'-fluororribosa, en la que se reemplaza un grupo hidroxilo por un flúor, o N-acetilglucosamina, un forma de glucosa que contiene nitrógeno (por ejemplo, 2'-fluororribosa, desoxirribosa y hexosa). Los hidratos de carbono pueden existir en muchas formas diferente, por ejemplo, confórmeros, formas cíclicas, formas acíclicas, estereoisómeros, tautómeros, anómeros e isómeros.

Análogos mínimos de saponina

Un aspecto de la presente solicitud se refiere a análogos mínimos de saponina (también denominados “saponinas truncadas”) que no contienen el dominio de trisacárido ramificado de la molécula de saponina convencional. La presente invención se refiere a compuestos que tienen una de las fórmulas:

Saponina R1 R2

16 (SQS 1-0-5-18) -CHO -OH

19 (SQS 1-11-5-18) -CH2OH -OH

20 (SQS 1-8-5-18) -Me -OH

21 (SQS 1-9-5-18) -CHO -H

22 (SQS 1-10-5-18) -CH2OH -H

18 (SQS 1-7-5-18) -Me -H

En algunas realizaciones, el análogo mínimo de saponina de la presente solicitud se produce a partir de un precursor que tiene la estructura de fórmula (III)

en la que: W es Me, -CHO o -CH²OH, y V es H u OH.

Método de síntesis

Otro aspecto descrito en el presente documento se refiere a un procedimiento para preparar los análogos mínimos de saponina de la presente solicitud. En algunos casos, el procedimiento incluye la producción del precursor que tiene la estructura de fórmula (III). En algunos casos, el precursor de fórmula (III) se produce con las siguientes etapas:

a) hacer reaccionar un compuesto de fórmula (100) con un grupo protector para formar un compuesto de fórmula (101), en la que W es Me, CHO, CH²OH o CH²ORp; en el que Rp es H o un grupo protector adecuado, según sea necesario, para conseguir regioselectividad; V es H u ORp, y TES es un grupo protector de trietilsililo;

b) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (101) con el compuesto de fórmula (102) para formar el compuesto de fórmula (103), en la que Bn es un grupo protector de bencilo;

c) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (103) con un agente reductor para formar el compuesto de fórmula (104);

d) acoplar el compuesto de fórmula (104) con el compuesto de fórmula (105) en presencia de un agente activante para formar el compuesto de fórmula (106), en la que Boc es un grupo protector de tercbutiloxicarbonilo;

e) desproteger el compuesto de fórmula (106) para formar el compuesto de fórmula (NI).

En algunos casos, el grupo protector se selecciona del grupo que consiste en metilo, metoximetilo (MOM), metiltiometilo (MTM), f-butiltiometilo, (fenildimetilsilil)metoximetilo (SMOM), benciloximetilo (BOM), p-metoxibenciloximetilo (PMBM), (4-metoxifenoxi)metilo (p-AOM), guaiacolmetilo (GUM), t-butoximetilo, 4-penteniloximetilo (POM), siloximetilo, 2-metoxietoximetilo (MEM), 2,2,2-tridoroetoximetilo, bis(2-doroetoxi)metilo, 2-(trimetilsilil)etoximetilo (SEMOR), tetrahidropiranilo (THP), 3-bromotetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, 1-metoxiciclohexilo, 4-metoxitetrahidropiranilo (MTHP), 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, 5.5- dióxido de 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ilo (CTMP), 1,4-dioxan-2- ilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofuranilo, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-octahidro-7,8,8-trimetil-4,7-metanobenzofuran-2-ilo, 1- etoxietilo, 1-(2-cloroetoxi)etilo, 1-metil-1-metoxietilo, 1 -metil-1-benciloxietilo, 1-metil-1-benciloxi-2-fluoroetilo, 2,2,2-tricloroetilo, 2-trimetilsililetilo, 2-(fenilselenil)etilo, t-butilo, alilo, p-clorofenilo, p-metoxifenilo, 2,4-dinitrofenilo, bencilo, p-metoxibencilo, 3,4-dimetoxibencilo, o-nitrobencilo, p-nitrobencilo, p-halobencilo, 2,6-diclorobencilo, p-cianobencilo, p-fenilbencilo, 2-picolilo, 4-picolilo, N-óxido de 3-metil-2-picolilo, difenilmetilo, p,p’-dinitrobenzhidrilo, 5-dibenzosuberilo, trifenilmetilo, a-naftildifenilmetilo, p-metoxifenildifenilmetilo, di(p-metoxifenil)fenilmetilo, tri(p-metoxifenil)metilo, 4-(4'-bromofenaciloxifenil)difenilmetilo, 4,4',4”-tris(4,5-diclo rofta limid ofe nil)metilo, 4,4',4”-tris(levulinoiloxifenil)metilo, 4,4',4”-tris(benzoiloxifenil)metilo, 3-(imidazol-1-il)bis(4',4”-dimetoxifenil)metilo, 1, 1 -bis(4-metoxifenil)-1 '-pirenilmetilo, 9-antrilo, 9-(9-fenil)xantenilo, 9-(9-fenil-10-oxo)antrilo, 1,3-benzoditiolan-2-ilo, S,S-dióxido de bencisotiazolilo, trimetilsililo (TMS), trietilsililo (TES), triisopropilsililo (TIPS), dimetilisopropilsililo (IPDMS), dietilisopropilsililo (DEIPS), dimetilthexilsililo, t-butildimetilsililo (TBDMS), t-butildifenilsililo (TBDPS), tribencilsililo, tri-p-xililsililo, trifenilsililo, difenilmetilsililo (DPMS), t-butilmetoxifenilsililo (TBMPS), formiato, benzoilformiato, acetato, cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato, metoxiacetato, trifenilmetoxiacetato, fenoxiacetato, p-clorofenoxiacetato, 3- fenilpropionato, 4-oxopentanoato (levulinato), 4,4-(etilenditio)pentanoato (levulinoilditioacetal), pivaloato, adamantoato, crotonato, 4-metoxicrotonato, benzoato, p-fenilbenzoato, 2,4,6-trimetilbenzoato (mesitoato), carbonato de alquilo y metilo, carbonato de 9-fluorenilmetilo (Fmoc), carbonato de alquilo y etilo, carbonato de alquilo y 2,2,2-tricloroetilo (Troc), carbonato de 2-(trimetilsilil)etilo (TMSEC), carbonato de 2-(fenilsulfonil)etilo (Psec), carbonato de 2-(trifenilfosfonio)etilo (Peoc), carbonato de alquilo e isobutilo, carbonato de alquilo y vinilo, carbonato de alquilo y alilo, carbonato de alquilo y p-nitrofenilo, carbonato de alquilo y bencilo, carbonato de alquilo y p-metoxibencilo, carbonato de alquilo y 3,4-dimetoxibencilo, carbonato de alquilo y o-nitrobencilo, carbonato de alquilo y p-nitrobencilo, tiocarbonato de alquilo y S-bencilo, carbonato de 4-etoxi-1-naftilo, ditiocarbonato de metilo, 2-yodobenzoato, 4-azidobutirato, 4-nitro-4-metilpentanoato, o-(dibromometil)benzoato, 2- formilbencenosulfonato, 2-(metiltiometoxi)etilo, 4-(metiltiometoxi)butirato, 2-(metiltiometoximetil)benzoato, 2.6- dicloro-4-metilfenoxiacetato, 2,6-dicloro-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1-dimetilpropil)fenoxiacetato, clorodifenilacetato, isobutirato, monosuccinoato, (£)-2-metil-2-butenoato, o-(metoxicarbonil)benzoato, a-naftoato, nitrato, N,N,N’,N’-tetrametilfosforodiamidato de alquilo, N-fenilcarbamato de alquilo, borato, dimetilfosfinotioílo, 2,4-dinitrofenilsulfenato de alquilo, sulfato, metanosulfonato (mesilato), bencilsulfonato y tosilato (Ts). En otro aspecto, el procedimiento en el que el grupo protector de oxígeno es trietilsililo (TES). En otro aspecto, el procedimiento en el que el reactivo reductor es fenilselenol.

En determinadas realizaciones, los análogos mínimos de saponina tienen una pureza del 80% o superior, del 85% o superior, del 90% o superior, del 95% o superior, del 96% o superior, del 97% o superior, del 98% o superior, del 99% o superior.

Composición de vacuna

Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a una composición de vacuna que comprende un antígeno y el análogo mínimo de saponina de la presente solicitud como adyuvante. En algunas realizaciones, la composición de vacuna comprende además adyuvantes adicionales.

Las composiciones de vacuna de la presente solicitud son útiles como vacunas para inducir inmunidad activa hacia antígenos en sujetos. Cualquier animal que pueda experimentar los efectos beneficiosos de las composiciones de la presente invención está dentro del alcance de los sujetos que pueden tratarse. En algunas realizaciones, los sujetos son mamíferos. En algunas realizaciones, los sujetos son seres humanos.

La mayoría de los antígenos de proteínas y glicoproteínas son escasamente inmunogénicos o no inmunogénicos cuando se administran solos. Las respuestas inmunitarias adaptativas fuertes a tales antígenos a menudo requieren el uso de adyuvantes. Los adyuvantes inmunológicos son sustancias que, cuando se administran a un sujeto, aumentan la respuesta inmunitaria a un antígeno o potencian determinadas actividades de células del sistema inmunitario. Un adyuvante también puede permitir el uso de una dosis más baja de antígeno para conseguir una respuesta inmunitaria útil en un sujeto.

Los adyuvantes habituales incluyen alumbre, adyuvante de Freund (una emulsión de aceite en agua con micobacterias muertas), adyuvante de Freund con MDP (una emulsión de aceite en agua con muramil dipéptido, MDP, un constituyente de micobacterias), alumbre más Bordetella pertussis (gel de hidróxido de aluminio con B. pertussis muertas). Se cree que tales adyuvantes actúan retardando la liberación de antígenos y postenciando la captación por los macrófagos. Los complejos inmunoestimuladores (ISCOM), tales como Quil-A (un extracto de saponina de Quillaja) son complejos similares a cajas abiertas, normalmente con un diámetro de aproximadamente 40 nm constituidos por colesterol, lípido, inmunógeno y saponina. Los ISCOM suministran el antígeno al citosol, y se ha demostrado que fomentan la respuesta al anticuerpo y la inducción de respuestas a células T cooperadoras así como linfocitos T citotóxicos en una variedad de modelos de animales de experimentación.

Las vacunas de la presente invención pueden usarse para conferir resistencia a la infección o al cáncer mediante inmunización, o bien pasiva o bien activa. Cuando las vacunas de la presente invención se usan para conferir resistencia a través de inmunización activa, se administra una vacuna de la presente invención a un animal para provocar una respuesta inmunitaria protectora que o bien previene o bien atenúa una enfermedad proliferativa o infecciosa. Cuando las vacunas de la presente invención se usan para conferir resistencia a la infección a través de inmunización pasiva, se proporciona la vacuna a un animal huésped (por ejemplo, ser humano, perro o ratón), y se recupera el antisuero provocado por esta vacuna y se proporciona directamente a un receptor que se sospecha que tiene una infección o enfermedad o expuesto a un organismo causante.

Por tanto, la presente invención se refiere a y proporciona un medio para prevenir o atenuar una enfermedad proliferativa resultante de organismos o células tumorales que tienen antígenos que se reconocen y unen por el antisuero producido en respuesta a los polipéptidos inmunogénicos incluidos en las vacunas de la presente invención. Tal como se usa en el presente documento, se dice que una vacuna previene o atenúa una enfermedad si su administración a un animal da como resultado la atenuación o bien total o bien parcial (es decir, supresión) de un síntoma o estado de la enfermedad, o la inmunidad total o parcial del animal frente a la enfermedad.

La administración de la vacuna (o el antisuero que la provoca) puede tener fines o bien “profilácticos” o bien “terapéuticos”. Cuando se proporciona(n) profilácticamente, la(s) vacuna(s) se proporciona(n) antes de cualquier síntoma de enfermedad proliferativa. La administración profiláctica de la(s) vacuna(s) sirve para prevenir o atenuar cualquier presentación posterior de la enfermedad. Cuando se proporciona(n) terapéuticamente, la(s) vacuna(s) se proporciona(n) tras o después de la detección de los síntomas que indican que un animal puede estar infectado con un patógeno o que tiene un determinado cáncer. La administración terapéutica de la(s) vacuna(s) sirve para atenuar cualquier presentación de enfermedad actual. Por tanto, las vacunas pueden proporcionarse o bien antes de la aparición de proliferación de la enfermedad (para prevenir o atenuar un infección o cáncer anticipados) o bien después del inicio de un proliferación actual.

Por tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona vacunas que comprenden uno o más antígenos bacterianos, virales, protozoarios o relacionados con tumores en combinación con uno o más compuestos de la invención. En algunas realizaciones, la vacuna comprende un único antígeno bacteriano, viral, protozoario o relacionado con tumores en combinación con un compuesto de la invención. En algunas realizaciones, la vacuna comprende dos o más antígenos bacterianos, virales, protozoarios o relacionados con tumores en combinación con un único compuesto de la invención. En algunas realizaciones, la vacuna comprende dos o más antígenos bacterianos, virales, protozoarios o relacionados con tumores en combinación con dos o más compuestos de la invención. En algunas realizaciones, la vacuna comprende un único antígeno bacteriano, viral, protozoario o relacionado con tumores en combinación con dos o más compuestos de la invención.

En algunas realizaciones, uno o más antígenos de las vacunas proporcionadas son antígenos bacterianos. En determinadas realizaciones, los antígenos bacterianos son antígenos asociados con una bacteria seleccionada del grupo que consiste en Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma pneumoniae, Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans, Enterococcus faecalis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Bacillus anthracis, Salmonella spp., Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Pasteurella pestis, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter spp., Campylobacter jejuni, Clostridium spp., Clostridium difficile, Mycobacterium spp., Mycobacterium tuberculosis, Treponema spp., Borrelia spp., Borrelia burgdorferi, Leptospria spp., Haemophilus ducreyi, Corynebacterium diphtheriae, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Shigella spp., Ehrlichia spp., Rickettsia spp. y combinaciones de los mismos.

En determinadas realizaciones, uno o más antígenos de las vacunas proporcionadas son antígenos asociados a virus. En determinadas realizaciones, los antígenos asociados a virus son antígenos asociados con un virus seleccionado del grupo que consiste en virus de la gripe, virus paragripal, virus de la parotiditis, adenovirus, virus sincitial respiratorio, virus de Epstein-Barr, rinovirus, virus de la poliomielitis, virus de Coxsackie, virus ECHO, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de la varicela-zóster, virus del herpes, virus del herpes simple, parvovirus, citomegalovirus, virus de la hepatitis, virus del papiloma humano, alfavirus, flavivirus, bunyavirus, virus de la rabia, arenavirus, filovirus, VIH 1, VIH 2, VLTH-1, VLTH-II, VLFe, VL bovino, VFeI, virus del moquillo, virus de la hepatitis contagiosa canino, calicivirus felino, virus de la rinotraqueítis felino, virus TGE, virus de la glosopeda y combinaciones de los mismos.

En determinadas realizaciones, uno o más antígenos de las vacunas proporcionadas son antígenos asociados a tumores. En algunas realizaciones, los antígenos asociados a tumores son antígenos seleccionados del grupo que consiste en células tumorales muertas y lisados de las mismas, MAGE-1, MAGE-3 y fragmentos peptídicos de los mismos; gonadotropina coriónica humana y fragmentos peptídicos de la misma; antígeno carcinoembrionario y fragmentos peptídicos del mismo, alfa-fetoproteína y fragmentos peptídicos de la misma; antígeno oncofetal pancreático y fragmentos peptídicos del mismo; MUC-1 y fragmentos peptídicos de la misma, CA 125, CA 15-3, CA 19-9, CA 549, CA 195 y fragmentos peptídicos de los mismos; antígenos específicos de la próstata y fragmentos peptídicos de los mismos; antígeno de membrana específico de la próstata y fragmentos peptídicos del mismo; antígeno de carcinoma de células escamosas y fragmentos peptídicos del mismo; antígeno de cáncer de ovarios y fragmentos peptídicos del mismo; antígeno asociado al cáncer de páncreas y fragmentos peptídicos del mismo; Her1/neu y fragmentos peptídicos del mismo; gp-100 y fragmentos peptídicos de la misma; proteínas K-ras mutantes y fragmentos peptídicos de las mismas; p53 mutante y fragmentos peptídicos de la misma; receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado, proteína quimérica p210BCR_ABL, KH-1, N3, GM1, GM2, GD2, Gd3, Gb3, Globo-H, STn, Tn, Lewisx, Lewisy, TF; y mezclas de los mismos.

En determinadas realizaciones, un antígeno se une de manera covalente a un compuesto de la invención. En algunas realizaciones, un antígeno no se une de manera covalente a un compuesto de la invención.

Un experto habitual en la técnica apreciará que las vacunas pueden incluir opcionalmente un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Por tanto, según otro aspecto, las vacunas proporcionadas comprenden uno o más antígenos que se conjugan opcionalmente con un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, dicho uno o más antígenos se conjugan de manera covalente a un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otras realizaciones, dicho uno o más antígenos se asocian de manera no covalente con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Tal como se describió anteriormente, los adyuvantes pueden usarse para aumentar la respuesta inmunitaria a un antígeno. Según la invención, las vacunas proporcionadas pueden usarse para producir una respuesta inmunitaria cuando se administran a un sujeto. En determinadas realizaciones, una respuesta inmunitaria a un antígeno puede potenciarse administrando a un sujeto una vacuna proporcionada en una cantidad eficaz para potenciar la respuesta inmunitaria de dicho sujeto a dicho antígeno.

Tal como se describió anteriormente, los compuestos proporcionados pueden usarse en vacunas contra el cáncer como adyuvantes en combinación con antígenos asociados a tumores. En determinadas realizaciones, dichas vacunas pueden usarse en el tratamiento o la prevención de neoplasias. En determinadas realizaciones, la neoplasia es una neoplasia benigna. En otras realizaciones, la neoplasia es una neoplasia maligna. Puede tratarse cualquier cáncer usando los compuestos de la invención con un antígeno.

En determinadas realizaciones, la neoplasia maligna es una neoplasia maligna hematológica. Las neoplasias malignas hematológicas son tipos de cánceres que afectan a la sangre, a la médula ósea y/o a los ganglios linfáticos. Los ejemplos de neoplasias malignas hematológicas que pueden tratarse usando los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC), tricoleucemia, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma cutáneo de células T (CTCL), linfoma periférico de células T (PTCL), linfoma de células del manto, linfoma de células B, leucemia linfoblástica aguda de células T (T-LLA), leucemia promielocítica aguda y mieloma múltiple.

También pueden tratarse otros cánceres, además de las neoplasias malignas hematológicas, usando los compuestos de la invención. En determinadas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido. Los cánceres a modo de ejemplo que pueden tratarse usando los compuestos de la invención incluyen cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de piel, cáncer de cerebro, cáncer de hígado, cáncer de ovarios, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de testículos, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer neuroendocrino, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, cáncer de laringe, cáncer bucal, cáncer de pene, tumores glandulares, cáncer rectal, cáncer de intestino delgado, sarcoma, carcinoma, melanoma, cáncer de uretra, cáncer de vagina, por nombrar algunos.

En determinadas realizaciones, los compuestos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden emplearse en terapias de combinación, es decir, los compuestos y las composiciones farmacéuticas pueden administrarse simultáneamente con, antes de, o posteriores a, uno o más de otros productos terapéuticos o procedimientos médicos deseados. La combinación particular de terapias (productos terapéuticos o procedimientos) para emplear en un régimen de combinación tendrá en cuenta la compatibilidad de los productos terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que va a conseguirse. También se apreciará que las terapias empleadas pueden conseguir un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un compuesto de la invención puede administrarse simultáneamente con otro agente antiproliferativo) o pueden conseguirse efectos diferentes (por ejemplo, control de cualquier efecto adverso).

Por ejemplo, otras terapias o agentes contra el cáncer que pueden usarse en combinación con los agentes contra el cáncer inventivos de la presente invención incluyen cirugía, radioterapia (radiación y, radioterapia con haces de neutrones, radioterapia con haces de electrones, terapia con protones, braquiterapia e isótopos radiactivos sistémicos, por nombrar algunos), terapia endocrina, modificadores de respuestas biológicas (interferones, interleucinas y factor de necrosis tumoral (TNF), por nombrar algunos), hipertermia y crioterapia, agentes para atenuar cualquier efecto adverso (por ejemplo, antieméticos) y otros fármacos quimioterápicos aprobados, incluyendo, pero sin limitarse a, fármacos alquilantes (mecloretamina, clorambucilo, ciclofosfamida, melfalán, ifosfamida), antimetabolitos (metotrexato), antagonistas de purina y antagonistas de pirimidina (6-mercaptopurine, 5-fluorouracilo, citarabina, gemcitabina), venenos del huso (vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel), podofilotoxinas (etopósido, irinotecán, topotecán), antibióticos (doxorrubicina, bleomicina, mitomicina), nitrosoureas (carmustina, lomustina), iones inorgánicos (cisplatino, carboplatino), enzimas (asparaginasa) y hormonas (tamoxifeno, leuprolida, flutamida y megestrol), por nombrar algunos. Además, la presente invención también abarca el uso de determinados agentes citotóxicos o contra el cáncer actualmente en ensayos clínicos y que, en última instancia, pueden ser aprobados por la FDA (incluyendo, pero sin limitarse a, epotilonas y análogos de las mismas y geldanamicinas y análogos de las mismas). Para un análisis más completo de terapias contra el cáncer actualizadas, véase www.nci.nih.gov, una lista de los fármacos para oncología aprobados por la FDA en www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm y The Merck Manual, decimoséptima ed. 1999.

Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a una composición farmacéutica para su uso en la inmunización de un sujeto.

Método para potenciar el efecto de otros fármacos

Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a composiciones farmacéuticas para su uso en la potenciación del efecto de un fármaco citotóxico, tal como un fármaco contra el cáncer, con un análogo mínimo de saponina de la invención o una sal del mismo. Los ejemplos de los fármacos citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, agentes contra el cáncer que pueden incluir agentes alquilantes, tales como bendamustina, busulfán, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida, dacarbazina, ifosfamida, melfalán, procarbazina, estreptozocina, temozolomida; antibióticos antitumorales, tales como actinomicina D / dactinomicina, bleomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, doxorrubicina (liposómica pegilada), epirrubicina, idarrubicina, mitomicina, mitoxantrona; alcaloides vegetales / inhibidores de microtúbulos, tales como etopósido, docetaxel, irinotecán, paclitaxel, topotecán, vinblastina, vincristina, vinorelbina; antimetabolitos, tales como asparaginasa, capecitabina, citarabina, 5-fluorouracilo, fludarabina, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed, raltitrexed; agentes de unión al ADN, tales como carboplatino, cisplatino, oxaliplatino; bisfosfonatos, tales como clodronato, ácido ibandrónico, pamidronato, ácido zolendrónico; agentes biológicos, tales como alemtuzamab, BCG, bevacizumab, cetuximab, denosumab, erlotinib, gefitinib, imatinib, interferón, ipilimumab, lapatinib, panitumumab, rituximab, sunitinib, sorafenib, temsirolimús, trastuzumab; hormonas/otros, tales como anastrozol, abiraterona, amifostina, bexaroteno, bicalutamida, buserelina, ciproterona, degarelix, exemestano, flutamida, ácido folínico, fulvestrant, goserelina, lanreotida, lenalidomida, letrozol, leuprorelina, medroxiprogesterona, megestrol, mesna, octreotida, estilboestrol, tamoxifeno, talidomida, triptorelina.

Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un análogo mínimo de saponina de la invención, o una sal del mismo, y un fármaco citotóxico.

Método de tratamiento

Además, en el presente documento se describe un método para tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención. En algunos casos, la infección es bacteriana. En algunos casos, la infección es viral. En algunos casos, la infección es protozoaria. En algunos casos, el sujeto es un ser humano.

Además, se describe una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un análogo mínimo de saponina de la invención, o una sal del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Formulaciones

Los análogos mínimos de saponina de la presente solicitud pueden combinarse con un excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una composición farmacéutica. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica incluye una cantidad farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la invención. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo del huésped que esté tratándose y del modo particular de administración. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación individual será generalmente aquella cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico. Generalmente, esta cantidad oscilará entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 99% de principio activo, preferiblemente entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 70%, lo más preferiblemente entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 30%.

En las composiciones también pueden estar presentes agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Las formulaciones de la presente invención incluyen aquellas adecuadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en una forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica de farmacia. En determinadas realizaciones, una formulación de la presente invención comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste en ciclodextrinas, liposomas, agentes de formación de micelas, por ejemplo, ácidos biliares, y portadores poliméricos, por ejemplo, poliésteres y polianhídridos; y un compuesto de la presente invención. En determinadas realizaciones, una formulación anteriormente mencionada hace que un compuesto de la presente invención esté biodisponible por vía oral.

Las formulaciones de la invención adecuadas para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, sellos, píldoras, comprimidos, pastillas para chupar (usando una base aromatizada, habitualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto), polvos, gránulos, o como una disolución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga), y/o como enjuagues bucales y similares, conteniendo cada uno de ellos una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como principio activo. Un compuesto de la presente invención también puede administrase como un bolo, un electuario o una pasta.

En formas de dosificación sólidas de la invención para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), el principio activo se mezcla con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera de los siguientes: cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; humectantes, tales como glicerol; agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato de sodio; agentes retardantes de la disolución, tales como parafina; aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico, monoestearato de glicerol y tensioactivos no iónicos; absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos; y agentes colorantes. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes de tamponamiento. Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden emplearse como cargas en cápsulas de gelatina de cubierta blanda y dura usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral de los compuestos de la invención incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del principio activo, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes habitualmente usados en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen de trigo, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano, y mezclas de los mismos.

Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, emulsionantes y agentes de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isostearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados, que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención, incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos tras los compuestos en cuestión puede garantizarse mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido sórbico de fenol y similares. También puede ser deseable incluir en las composiciones agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. Además, puede lograrse la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Las formas inyectables de depósito se elaboran formando matrices microencapsuladas de los compuestos en cuestión en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la razón de fármaco con respecto a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la tasa de liberación de fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poliortoésteres y polianhídridos. Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan encerrando el fármaco en liposomas o microemulsiones, que son compatibles con el tejido corporal.

En determinadas realizaciones, un compuesto o una preparación farmacéutica se administra por vía oral. En otras realizaciones, el compuesto o la preparación farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las vías de administración alternativas incluyen las administraciones sublingual, intramuscular y transdérmica.

Las preparaciones de la presente solicitud pueden administrarse por vía oral, parenteral, tópica o rectal. Por supuesto, se administran en formas adecuadas para cada vía de administración. Por ejemplo, se administran en comprimidos o en forma de cápsula, mediante inyección, inhalación, loción ocular, pomada, supositorio, etc., administración mediante inyección, infusión o inhalación; tópica mediante loción o pomada; y rectal mediante supositorios. Se prefieren las administraciones orales.

Los análogos mínimos de saponina de la presente solicitud pueden administrarse a seres humanos y otros animales para terapia mediante cualquier vía de administración adecuada, incluyendo por vía oral, nasal, por ejemplo, mediante un pulverizador, rectal, intravaginal, parenteral, intracisternal y tópica mediante polvos, pomadas o gotas, incluyendo bucal y sublingual.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los análogos mínimos de saponina de la presente solicitud, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos para los expertos en la técnica.

Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin que sea tóxica para el paciente.

El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto particular de la presente invención empleado, o del éster, la sal o la amida del mismo, la vía de administración, el momento de administración, la tasa de excreción o el metabolismo del compuesto particular que está empleándose, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el compuesto particular empleado, la edad, el sexo, el peso, el estado, la salud general y la historia clínica previa del paciente que está tratándose, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Un médico o veterinario que tiene experiencia habitual en la técnica puede determinar fácilmente y recetar la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar con dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado y después aumentar gradualmente la dosificación hasta que se consiga el efecto deseado.

En algunas realizaciones, un compuesto o una composición farmacéutica de la solicitud se administra a un sujeto de manera crónica. Los tratamientos crónicos incluyen cualquier forma de administración repetida durante un periodo de tiempo prolongado, tal como administraciones repetidas durante uno o más meses, entre un mes y un año, uno o más años, o más prolongado. En muchas realizaciones, un tratamiento crónico implica administrar un compuesto o una composición farmacéutica de la invención de manera repetida a lo largo de la vida del sujeto. Los tratamientos crónicos preferidos implican administraciones regulares, por ejemplo, una o más veces al día, una o más veces a la semana o una o más veces al mes. En general, una dosis adecuada, tal como una dosis diaria, de un compuesto de la invención será aquella cantidad del compuesto que es la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. En general, una dosis eficaz de este tipo dependerá de los factores descritos anteriormente. En general, las dosis de los compuestos de esta invención para un paciente, cuando se usan para los efectos indicados, oscilarán entre aproximadamente 0,0001 y aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal al día. Preferiblemente, la dosificación diaria oscilará entre 0,001 y 50 mg de compuesto por kg de peso corporal e incluso más preferiblemente entre 0,01 y 10 mg de compuesto por kg de peso corporal. Sin embargo, pueden usarse dosis más bajas o más altas. En algunas realizaciones, la dosis administrada a un sujeto puede modificarse a medida que cambia la fisiología del sujeto debido a la edad, la progresión de la enfermedad, el peso u otros factores.

En algunas realizaciones, los compuestos adyuvantes proporcionados se administran como composiciones farmacéuticas o vacunas. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es de 1-2000 |ig. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es de 1­ 1000 |ig. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es de 1-500 |ig. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es de 1-250 |ig. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es de 100-1000 |ig. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es de 100-500 |ig. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es de 100-200 |ig. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es de 250-500 |ig. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es de 10-1000 |ig. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es de 500-1000 |ig. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es dei 50-250 |ig. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto adyuvante administrado es de 50-500 |ig.

Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitarias.

Aunque es posible administrar un compuesto de la presente invención solo, en determinadas realizaciones el compuesto se administra como una formulación (composición) farmacéutica tal como se describió anteriormente.

Los compuestos según la invención pueden formularse para administración de cualquier manera conveniente para su uso en medicina humana o veterinaria, por analogía a otros productos farmacéuticos.

La invención proporciona kits que comprenden composiciones farmacéuticas de un compuesto de la invención. En determinadas realizaciones, tales kits incluyendo la combinación de un compuesto de la invención y un antígeno. Los agentes pueden envasarse por separado o juntos. El kit incluye opcionalmente instrucciones para recetar el medicamento. En determinadas realizaciones, el kit incluye múltiples dosis de cada agente. El kit puede incluir cantidades suficientes de cada componente para tratar a un sujeto durante una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas o múltiples meses. El kit puede incluir un ciclo completo de inmunoterapia. En algunas realizaciones, el kit incluye una vacuna que comprende uno o más antígenos bacterianos, virales, protozoarios o asociados a tumores, y uno o más compuestos proporcionados.

La descripción en el presente documento tiene el fin de enseñar al experto habitual en la técnica cómo poner en práctica la presente divulgación, y no pretende detallar todas las modificaciones y variaciones obvias de la misma, que resultarán evidentes para el experto tras la lectura de la descripción. Las realizaciones específicas de la presente solicitud se han presentados con fines de ilustración y descripción. No pretenden ser exhaustivas ni limitar la aplicación y el método de uso a las formas precisas dadas a conocer. Obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones a la luz de la enseñanza anterior. Se entiende que se contemplan diversas omisiones o sustituciones de equivalentes según puedan sugerir o hacer convenientes las circunstancias, pero se pretende cubrir la aplicación o implementación sin apartarse del alcance de las reivindicaciones de la presente solicitud.

Ejemplos

Ejemplo 1: Evaluación inicial de saponinas yodadas 6 y 8 (ambas no reivindicadas)

Se introdujo yodo marcado (131I) en el armazón de saponina QS-21 para permitir estudios de biodistribución in vivo. Se sintetizó el yoduro de arilo no radiomarcado 6 (SQS-0-0-5-18) mediante la acilación de amina 2 (SQS-0-0-5-11) (figura 1b). Debido a que no existe ningún modelo in vitro para evaluar la actividad adyuvante, se llevó a cabo la evaluación biológica de yoduro de arilo 6 en un modelo de vacunación de ratón preclínico que implica una formulación de múltiples antígenos compuesta por el péptido inmunogénico MUC1 (antígeno de cáncer de próstata y mama, repetición en tándem no glicosilada) conjugado con la proteína portadora altamente inmunogénica KLH (MUC1-KLH) y OVA, un inmunógeno fiable que induce respuestas tanto de anticuerpo como de células T en ratones. Se determinaron las respuestas de anticuerpo contra cada uno de los tres antígenos, administrados conjuntamente con el adyuvante de interés, mediante ELISA.

La saponina de yoduro de arilo 6 (SQS-0-0-5-18) indujo títulos de anticuerpo comparables tanto a NQS-21 (QS-21 natural) como a SQS-21 (QS-21 sintética, 65% 1a:35% 1b) (figura 1 d-f) y también mostró una toxicidad reducida en comparación con QS-21, tal como se evalúa mediante la pérdida de peso del ratón (figura 1g). Como control negativo, se sintetizó la variante de saponina yodada 8 (SQS-0-3-7-18), que carece del dominio de tetrasacárido lineal (figura 1c y figura 7), y mostró una escasa actividad adyuvante (figura 7).

Se realizaron las reacciones en tubos sellados secados a la llama o matraces Schlenk (forma de Kjeldahl) modificados ajustados con un tapón de vidrio bajo presión positiva de argón, a menos que se indique lo contrario. Se transfirieron disoluciones y líquidos sensibles al aire y a la humedad mediante una jeringa. Se secaron los reactivos de hidrato de carbono apropiados mediante retirada azeotrópica de agua con tolueno. Se activaron tamices moleculares a 350°C y se trituraron inmediatamente antes de su uso, después se secaron a la llama a vacío. Se concentraron las disoluciones orgánicas mediante evaporación rotativa por debajo de 30°C. Se realizó cromatografía ultrarrápida en columna empleando gel de sílice de 230-400 de malla. Se realizó cromatografía en capa fina usando placas de vidrio recubiertas previamente hasta una profundidad de 0,25 mm con gel de sílice de 230-400 de malla impregnado con un indicador fluorescente (254 nm).

Ejemplo 2: Biodistribución de saponinas marcadas con yodo radiactivo [131I]-6 y [131|]-8 (no reivindicadas)

Para los estudios de biodistribución, se sintetizó saponina de yoduro de arilo radiomarcada [131I]-6 ([131I]-SQS-0-0-5-18) mediante intercambio con haluro de arilestaño de trimetilestannano 7 (figura 1b). Se sintetizó saponina marcada con yodo radiactivo [131|]-8 ([131I]-SQS-0-3-7-18) de manera análoga a partir de 9 como control negativo (figura 1c).

Para identificar tejidos y órganos que pudieran desempeñar papeles en los mecanismos de acción de las saponinas, se comparó la biodistribución in vivo aguda del adyuvante activo [131I]-6 y del adyuvante atenuado [131I]-8 en ratones administrados conjuntamente con OVA. El tratamiento con [131I]-6, en comparación con [131I]-8, dio como resultado una recuperación significativamente más alta de radiactividad en el sitio de inyección (17 veces más alta, 78% de DI/g [dosis inyectada por gramo]) y en los ganglios linfáticos de drenaje más cercanos (24 veces más alta, 27% de DI/g) a las 24 h tras la inyección (figura 2a), que se retuvo a las 72 h y 96 h tras la inyección (figura 8). En cambio, la radiactividad en otros tejidos en los que se observaron inicialmente grandes diferencias en veces (músculo, hueso, piel) disminuyó rápidamente en los últimos puntos de tiempo. Se observó una mínima desyodación de [131I]-6 , evidenciada por la baja absorción en la tiroides (0,21% de DI/g), a las 24 h (figura 2a), aunque la desyodación aumentó en los últimos puntos de tiempo (figura 8). En cambio, el adyuvante atenuado [1311]-8 se recuperó a niveles significativamente más bajos en el sitio de inyección (4,5% de DI/g) y los ganglios linfáticos de drenaje más cercanos (1,1% de DI/g) a las 24 h tras la inyección (figura 2a) y se aclaró adicionalmente a partir de ambos sitios en los últimos puntos de tiempo (figura 8). Tomados en conjunto, estos datos indican que sólo el adyuvante activo 6 (SQS-0-0-5-18) se ubica y retiene en el sitio de inyección y los ganglios linfáticos, mientras que el adyuvante atenuado 8 (SQS-0-3-7-18) no.

Los mecanismos moleculares de la actividad adyuvante de QS-21 y sus variantes siguen siendo poco conocidos. Se ha notificado que QS-21 estimula respuestas de células T cooperadoras Th1/Th2 mixtas, correspondientes a la inmunidad celular y humoral, respectivamente, incluyendo linfocitos T citotóxicos CD8+ específicos de antígeno. Existen algunas evidencias que sugieren que QS-21 no se une a los receptores tipo Toll 2 y 4 y que no funciona por un efecto depósito, en el que el adyuvante aumenta la vida útil del antígeno, ampliando su presentación al sistema inmunitario. También se ha sugerido que las saponinas de Quillaja, por analogía a tucaresol, pueden unirse de manera covalente a grupos amino en receptores de superficie de células T mediante la formación de imina en el sustituyente aldehído en C4, lo que proporciona una coestimulación para la activación de células T.

Se ha notificado previamente que otros adyuvantes que contienen mezclas de saponinas de Quillaja afectan a la biodistribución de antígenos, aunque no se sabe si la biodistribución del adyuvante se ve influenciada por la presencia o ausencia del antígeno. Para investigar estos efectos con estas variantes de QS-21 estructuralmente definidas, se evaluó la biodistribución de adyuvante activo [131I]'6 y adyuvante inactivo [131I]-8 en ausencia de OVA (figura 9). En ambos casos, los perfiles de biodistribución fueron comparables con los observados en presencia de OVA anteriormente (figura 8), lo que indica que la presencia del antígeno OVA no tiene ningún impacto sobre la biodistribución de estos adyuvantes de saponinas.

En un experimento complementario, se examinó la biodistribución de [131I]-OVA en presencia y ausencia de adyuvante activo 6 (figura 10). Aunque se obtuvieron perfiles de biodistribución comparables, la captación en la tiroides también fue alta, indicativo de una rápida desyodación de [131I]-OVA, que habitualmente se observa para proteínas marcadas con yodo radiactivo. Por tanto, la influencia de 6 sobre la biodistribución de antígeno OVA no pudo evaluarse eficazmente y se requirió un enfoque experimental alternativo.

Para abordar este problema, se llevaron a cabo experimentos de obtención de imágenes por fluorescencia in vivo con adyuvante activo marcado con fluoresceína 3 (SQS-0-0-5-12) y OVA conjugada con Alexa-647 (OVA-A647). A las 24 h tras la inyección, se observó la retención de la saponina fluorescente en el sitio de inyección (figura 2b) y la acumulación dentro de los ganglios linfáticos de drenaje (ganglio izquierdo en la figura 2c), compatible con los resultados de biodistribución anteriores. El análisis inmunohistoquímico de ganglios disecados indicó una ubicación subganglionar de adyuvante 3 con respecto a la corteza de los ganglios inguinales de drenaje. El análisis por citometría de flujo demostró internalización específica de células dendríticas de 3 dentro de los ganglios linfáticos. Además, aunque se observó OVA-A647 en el sitio de inyección en ratones tratados tanto con el adyuvante activo 3 como con adyuvante inactivo sin marcar 2 (SQS-0-0-5-11) (figura 2b y figura 11), sólo se ubicó en los ganglios linfáticos de drenaje más cercanos cuando se inyectó conjuntamente con el adyuvante activo 3 (figura 2c). En general, estos datos sugieren un papel para la saponina activa 3 en el transporte del antígeno OVA por células presentadoras de antígeno a los ganglios linfáticos de drenaje, en los que el antígeno se presenta al sistema inmunitario adaptativo.

Ejemplo 3: Saponina truncada que carece del dominio de trisacárido ramificado (16)

Se sililaron selectivamente los núcleos de triterpeno necesarios (TESOTf, 2,6-lutidina) en los grupos hidroxilo para proporcionar triterpenos protegidos que tenían un ácido carboxílico libre en C28. La glicosilación de Schmidt P-selectiva (BF3^OEt2) con donante de tricloroacetimidato de trisacárido 12 (Chea, E.K. et al. Synthesis and preclinical evaluation of QS-21 variants leading to simplified vaccine adjuvants and mechanistic probes. J. Am. Chem. Soc. 134, 13448-13457 (2012)) seguido de reducción de la azida (PhSeH) dieron los ésteres de glicosilo correspondientes. La acilación de la amina con ácido 6-((t-butoxicarbonil)-amino)hexanoico (14) (EtOCOCl, Et3N) y la posterior desprotección global mediante hidrogenólisis (H², Pd/C) e hidrólisis ácida (TFA/H²O) proporcionaron las saponinas completamente desprotegidas que portaban la amina libre en el extremo terminal del dominio de la cadena de acilo. La acilación de última etapa de la amina con ésteres de succinimidilo 4 ó 5 proporcionó los yoduros de arilo correspondientes 16, 18-22 o los congéneres de arilestaño relevantes, respectivamente (figura 3a).

Habiendo establecido la variante de saponina 6 (SQS-0-0-5-18) como un potente adyuvante con baja toxicidad, se investigó el papel del dominio de trisacárido ramificado en la actividad adyuvante. Se sintetizó la saponina truncada 16 (SQS-1-0-5-18), que carece de este dominio completo, a partir de ácido quillaico 1) y trisacárido protegido 12 (figura 3a). De manera notable, la saponina truncada 16 provocó respuestas de anticuerpo KLH y MUC1 comparables a las del yoduro de arilo original 6, NQS-21 y SQS-21, y significativamente mayores que las del control sin adyuvante, con la excepción de títulos de anti-MUC1 a la dosis más baja (20 |ig) (figuras 3b ,3c). Los títulos de anticuerpo contra OVA también fueron similares a los provocados por la saponina de yoduro de arilo original 6 y considerablemente mayores que los del control sin adyuvante (figura 3d). Además, la saponina truncada 16 mostró una toxicidad mucho menor que NQS-21 y SQS-21, ligeramente menor que incluso la del yoduro de arilo original 6 (figura 3e). Por tanto, no se requiere el dominio de trisacárido ramificado completo para la actividad adyuvante en la variante de saponina truncada 16. Esto representa una simplificación importante de la estructura de saponina y proporciona un perfil de actividad/toxicidad más favorable que la propia QS-21. Ejemplo 4: Saponinas con modificaciones dirigidas del dominio de triterpeno (18-22)

Se vacunaron grupos de cinco ratones (C57BL/6J, hembra, 6-8 semanas de edad) con una vacuna de tres componentes que consistía en MUC1-KLH (2,5 mg) y OVA (20 mg) o con una vacuna de cuatro componentes que también incluía GD3-KLH (5 mg). Se administraron conjuntamente los antígenos con el adyuvante de interés (5, 20 ó 50 mg) o sin adyuvante (control sin adyuvante) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, 100 ml) mediante inyecciones subcutáneas los días 0, 7 y 14, seguido de un refuerzo el día 65. Se recogieron los sueros de ratón el día 72 y se determinaron los títulos de anticuerpo contra cada antígeno mediante ELISA. Se evaluó la significación estadística de cada respuesta de anticuerpo en comparación con el control sin adyuvante usando una prueba de la t de Student para datos independientes bilateral con IC = 95%. Como evaluación general inicial de la toxicidad, se monitorizó la pérdida de peso del ratón los días 0, 1, 2, 3 y 7 después de la primera vacunación. Se llevaron a cabo estos experimentos con animales tal como se describe en el protocolo n.° 97-11­ 051 del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del MSKCC.

Se sintetizaron las saponinas de arilestaño (7, 9, 17, S9) a partir de los precursores de amina correspondientes (2, S4, 15, S8) mediante acilación con 4-(trimetilestannil)benzoato de N-succinimidilo 4 (Et3N, DMF, 21°C, 1-2,5 h). Se consiguió el radiomarcaje mediante yodación de la saponina de arilestaño (20 |ig) con [131I]-NaI y cloramina-T (metanol, 21°C, 1 min), seguido de purificación por HPLC inmediata. Se eliminaron los disolventes mediante evaporación rotativa a 35°C y se formularon las sondas marcadas con yodo radiactivo en solución salina al 0,9% para los estudios de biodistribución. Se usó la elución conjunta de las sondas marcadas con yodo radiactivo con las saponinas radioinactivas correspondientes para el análisis de control de calidad.

Se sintetizó ovoalbúmina radiomarcada tratando 20 |ig de ovoalbúmina con [131I]-NaI y cloramina-T en metanol. Se diluyó la mezcla de reacción con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguido de filtración centrífuga a 2800 rpm durante 12 min usando un filtro de 30 kDa de corte de peso molecular. Se repitió este procedimiento dos veces y después se formuló el compuesto concentrado en 1 ml de solución salina al 0,9% para los estudios de biodistribución.

El descubrimiento de que no se requiere el dominio de trisacárido ramificado completo para la actividad adyuvante facilitó la investigación del dominio de triterpeno de QS-21 mediante semisíntesis de nuevas variantes a partir de precursores de triterpeno alternativos, por analogía a la síntesis de 16 (SQS-1-0-5-18) a partir de ácido quillaico (figura 3a). Los papeles del sustituyente aldehido en C4 y alcohol en C16 en la estructura de núcleo del ácido quillaico fueron de particular interés. Previamente, se ha propuesto que el sustituyente aldehído en C4 es importante para la actividad adyuvante de QS-21. Sin embargo, recientemente se han identificado otras saponinas que carecen de un sustituyente aldehído en el triterpeno pero son adyuvantes activos. Por tanto, se sintetizó una variante inicial 18 (SQS-1-7-5-18) a partir de ácido oleanólico (figura 12), que comparte el mismo estructura principal de carbono que el ácido quillaico, difiriendo únicamente en los estados de oxidación del sustituyente en C4 (Me frente a ^c H^o ) y C16 (H frente a OH).

El derivado de ácido oleanólico 18 (C16-Me, C16-H) condujo a títulos de anticuerpo más bajos contra los tres antígenos en comparación con el derivado de ácido quillaico original 16 (figura 4a-d). Además, los títulos de anticuerpo de OVA con derivado de ácido oleanólico 18 fueron similares a los del control sin adyuvante. Por tanto, la retirada tanto del sustituyente aldehído en C4 como del alcohol en C16 en el derivado de ácido oleanólico 18 da como resultado respuestas de anticuerpo considerablemente atenuadas en este modelo de vacunación preclínico.

Para investigar la importancia de cada una de estas funcionalidades individualmente, se sintetizaron las variantes de triterpeno 19-22, en las que los estados de oxidación del sustituyente aldehído en C4 y alcohol en C16 varían independientemente (figura 5a). A la variante de caulofilogenina 19 (SQS-1-11-5-18), en la que el sustituyente aldehído en C4 se reduce para dar un grupo hidroximetilo mientras que se retiene el alcohol en C16, se accedió a partir de un producto intermedio avanzado en la síntesis de 16 (SQS-1-0-5-18) (figura 13). Se prepararon la variante de ácido equinocístico 20 (SQS-1-8-5-18), en la que el sustituyente aldehído en C4 se reemplaza por un grupo metilo mientras que de nuevo se retiene el alcohol en C16, y la variante de hederagenina 22 (SQS-1-10-5-18), en la que el sustituyente aldehído en C4 se reemplaza por un grupo hidroximetilo y el alcohol en C16 se reemplaza por un protón, a partir de los triterpenos comercialmente disponibles correspondientes (figura 14 y figura 15). A la variante de gipsogenina 21 (SQS-1-9-5-18), que posee el sustituyente aldehído en C4 pero carece del alcohol en C16, se accedió mediante una oxidación inicial con TEMPO del sustituyente hidroximetilo en C4 en la hederagenina para proporcionar la gipsogenina.

Se evaluaron estas variantes de saponina con una vacuna de cuatro componentes compuesta por MUC1-KLH, OVA y el glicolípido escasamente inmunogénico GD3 (antígeno de melanoma, neuroblastoma, sarcoma) conjugado con ^k L^h (GD3-KLH) (figura 5b-e; véase la figura 16 para los datos completos con ambas dosis de 20 y 50 |ig). El derivado de ácido equinocístico 20 (C4-Me, C16-OH) indujo las respuestas de anticuerpo más altas para los cuatro antígenos, comparables a o mayores que las de SQS-21 y saponina 6 que contiene trisacárido ramificado completo. El derivado de caulofilogenina 19 (C⁴ -CH²OH, C16-OH) proporcionó títulos de anticuerpo ligeramente inferiores a los de derivado de ácido equinocístico 20, saponina 6 que contiene trisacárido ramificado y SQS-21, aunque únicamente a dosis elevadas (50 |ig). En cambio, el derivado de gipsogenina 21 (C4-CHO, C¹⁶ -H) y el derivado de hederagenina 22 (C4-C^h 2^o H, C16-H) generaron ambos respuestas de anticuerpo más bajas en todos los casos, excepto para la respuesta de IgG anti-GD3, y similares a los controles tratados sin adyuvante para KLH y OVA.

El subtipado de anticuerpos de los isotipos de IgG anti-MUC1 y anti-OVA reveló un sesgo significativo hacia el subtipo IgG1 e IgG2b de ratón con ambas de las saponinas activas con adyuvante en este grupo (19, 20). Se obtuvieron resultados similares con SQS-21 y con el derivado de ácido quillaico original 16. La producción de otros subtipos de IgG de ratón, incluyendo IgG2a e IgG3, fue baja o inapreciable, tal como se indica mediante ELISA específica de clase. La toxicidad permaneció drásticamente baja para las cuatro variantes en comparación con NQS-21 y SQS-21 (figura 5f).

Por tanto, el derivado de ácido equinocístico 20 proporciona actividad inmunoestimuladora que generalmente compite con la de SQS-21 pero sin la toxicidad asociada. El derivado de caulofilogenina 19 también proporciona respuestas de anticuerpo similares a la saponina que contiene trisacárido ramificado completo 6, aunque se requieren dosis más altas. De manera importante, tanto el derivado de ácido equinocístico 20 como el derivado de caulofilogenina 19 carecen del sustituyente aldehído en C4 pero retienen el alcohol en C16. En cambio, el derivado de gipsogenina 21 y el derivado de hederagenina 22 carecen ambos del alcohol en C16 e indujeron respuestas de anticuerpo más bajas para todos los antígenos sometidos a prueba. Tomados en conjunto, estos datos indican que no se requiere el sustituyente aldehído en C4 para una potente actividad inmunológica adyuvante en estas novedosas saponinas y revelan un papel previamente no apreciado para el alcohol en C16 en la potenciación de la actividad.

Ejemplo 5: Biodistribución de saponinas truncadas [131I]-16 y [131|]-18

Se inyectaron grupos de cinco ratones (no sometidos previamente a experimentación, C57BL/6J hembra, 8-10 semanas de edad) por vía subcutánea con los adyuvantes de saponinas marcadas con yodo radiactivo de interés (~25 mCi), la saponina no radiomarcada correspondiente (20 mg) y OVA (20 mg) en PBS (150 □l). Se sacrificaron los ratones a las 24 h, 72 h y 96 h tras la inyección. Se recogieron los tejidos y órganos y se analizaron para determinar la distribución de radiactividad normalizada al peso del órgano (% de Dl/g, porcentaje de dosis inyectada por gramo). Se evaluó la significación estadística de la diferencia en las recuperaciones (% de Dl/g) para el adyuvante activo y atenuado para cada tejido u órgano usando la prueba de la t de Student para datos independientes bilateral con IC = 95%. En los experimentos iniciales, los perfiles de biodistribución no cambiaron sustancialmente entre 24 h y 96 h tras la inyección, y se usó el punto de tiempo de 24 h para los experimentos posteriores.

Se afeitaron tres ratones y se inmunizaron en el costado izquierdo con 10 |ag de adyuvante activo 3 (SQS-0-0-5-12) o adyuvante inactivo 2 (SQS-0-0-5-11) y 20 |ag de OVA conjugada con Alexa-647 (OVA-A647) en PBS (100 |al). Se obtuvieron imágenes de todo el cuerpo a las 24 h tras la inyección con un sistema de obtención de imágenes Maestro. A las 24 h tras la inyección, se sacrificaron los ratones, y se disecaron los ganglios linfáticos izquierdo y derecho y se obtuvieron imágenes por separado.

Se compararon los patrones de biodistribución in vivo de la variante de ácido quillaico truncada activa con adyuvante 16 (SQS-1-0-5-18) y el derivado de ácido oleanólico atenuado con adyuvante 18 (SQS-1-7-5-18), usando los congéneres marcados con yodo radiactivo [131I]-16 (figura 3a) y [131I]-18 (figura 12), para permitir una correlación con los estudios tempranos del par adyuvante activo/atenuado 6 (s Qs -0-0-5-18) y 8 (SQS-0-3-7-18) (figura 2a). El adyuvante activo [131I]-16 mostró una ubicación significativamente más alta en el sitio de inyección (136% de DI/g) y dentro de los ganglios linfáticos (3,55% de DI/g) en comparación con [131I]-18 (11,5% y 0,50% de DI/g, respectivamente) (figura 6). Por consiguiente, en ambos estudios de biodistribución, se conservó preferentemente el adyuvante más activo en el sitio de inyección y se acumuló en los ganglios linfáticos, proporcionando una correlación positiva entre este patrón de biodistribución y la actividad adyuvante.

Ejemplo 7: Síntesis de adyuvantes de saponinas yodadas y radiomarcadas

Síntesis de variantes iniciales 6 (SQS-0-0-5-18) y 8 (SQS-0-3-7-18) (ambas no reivindicadas)

SQS-0-0-5-18 (6). (EC-V-056) A una disolución de amina 2 (véase Chea, E.K. et al. Synthesis and preclinical evaluation of QS-21 variants leading to simplified vaccine adjuvants and mechanistic probes. J. Am. Chem. Soc.

134, 13448-13457 (2012)) (9,0 mg, 6,0 |amol, 1,0 equiv) en N,N’-dimetilformamida (2,0 ml) se le inyectó trietilamina (50 |al, 0,36 mmol, 60 equiv) y se agitó la mezcla a 21°C durante 50 min. Después se añadió gota a gota yoduro de arilo 4 (véase (a) Zhi, Y.-G. et al. Systematic studies on photoluminescence of oligo(aryleneethynylene)s: tunability of excited states and derivatization as luminescent labeling probes for proteins.. Eur. J. Org. Chem. 3125-3139 (2006); (b) Shell, T.A., Mohler, D.L. Selective targeting of DNA for cleavage within DNA-histone assemblies by a spermine-[CpW(CO)3Ph]2 conjugate. Org. Biomol. Chem. 3, 3091-3093 (2005)) (20 mg, 60 |amol, 10 equiv) en N,N’-dimetilformamida (0,6 ml) y se agitó la reacción a 21°C durante 1 h. Se diluyó el contenido con acetonitrilo al 20%/agua (10 ml) y se purificó directamente mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 |am, 10 x 250 mm) usando un gradiente lineal del 20-70% de acetonitrilo/agua, a lo largo de 30 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se obtuvo SQS-0-0-5-18 (6) (5,4 mg, 52% de rendimiento) como un polvo blanco después de la liofilización.

Precursor de arilestaño para [131I]-SQS-0-0-5-18 (7). (EC-V-052) A una disolución de amina 2 (2,0 mg, 1,3 |amol, 1,0 equiv) en N,N’-dimetilformamida (0,9 ml) se le inyectó trietilamina (10 |al, 72 |amol, 55 equiv) y se agitó la mezcla a 21°C durante 50 min. Después se añadió gota a gota arilestaño 5 (Koziorowski, J., Henssen, C., Weinreich, R. new convenient route to radioiodinated N-succinimidyl 3- and 4-iodobenzoate, two reagents for radioiodination of proteins. Appl. Radiat. Isot. 49, 955-959 (1998)) (2,0 mg, 5,2 ^mol, 4,0 equiv) en N,N’-dimetilformamida (0,2 ml) y se agitó la reacción a 21°C durante 1 h. Después de este tiempo, se diluyó el contenido con acetonitrilo al 20%/agua (10 ml) y se purificó directamente mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 |am, 10 * 250 mm) usando un gradiente lineal del 20-70% de acetonitrilo/agua, a lo largo de 30 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se obtuvo la saponina 7 (1,8 mg, 78% de rendimiento) como un polvo blanco después de la liofilización.

Aminoacilprosapogenina completamente protegida S3. (EC-V-191) Se enfrió una disolución de ácido S1 (Deng, K., Adams, M.M., Gin, D.Y. Synthesis and structure verification of the vaccine adjuvant QS-7-Api. Synthetic access to homogeneous Quillaja saponaria immunostimulants. J. Am. Chem. Soc. 130, 5860-5861 (2008)) (50 mg, 24 ^mol, 1,0 equiv) en diclorometano (1,56 ml) y piridina (40 |al, 0,50 mmol, 20,5 equiv) en un baño de hielo. Después de agitar durante 5 min, se inyectó cloruro de tionilo (20 |al, 0,28 mmol, 11,5 equiv) seguido de la adición de N,N’-dimetilformamida (6,25 |al, 0,081 mmol, 3,4 equiv) y se agitó a 21°C durante 1,5 h. Se concentró la disolución amarilla clara resultante para proporcionar un sólido blanco amorfo que después volvió a disolverse en diclorometano (1,6 ml) que contenía piridina (40 |al, 0,50 mmol, 20,5 equiv). A la disolución se le inyectó S2 (0,1 ml, 0,62 mmol, 25,8 equiv), que provocó la formación de un matiz naranja. Después de 30 min, se diluyó la reacción con CH²Cl² (30 ml) y se lavó con bicarbonato de sodio saturado (30 ml). Se extrajo la fase acuosa con CH²Cl² (2 * 30 ml) y se secaron las fases orgánicas combinadas sobre Na2SÜ4, se filtraron y se evaporaron hasta sequedad para dar un aceite amarillo brillante. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos/EtÜAc 4:1) proporcionó S3 (48 mg, 91% de rendimiento) como un sólido vitreo.

Aminoacilprosapogenina S4. (EC-IV-187) En un matraz de fondo redondo de 10 ml, se disolvió S3 (24 mg, 10,8 |amol, 1,0 equiv) en tetrahidrofurano/etanol (5 ml, 1:1) y se añadió paladio al 10% (base seca) sobre carbono, húmedo, tipo Degussa E101 NE/W (63 mg, 29,6 ^mol, 2,7 equiv). Se agitó la reacción bajo presión de hidrógeno (50 psi) a 21°C durante 24 h. Se filtró la mezcla en bruto resultante de productos parcialmente desililados a través de un filtro de jeringa de nailon de 0,45 ^m, se enjuagó con metanol (20 ml), CH²Cl² (10 ml) y metanol de nuevo (5 ml) y se evaporó el filtrado transparente hasta sequedad. La desbencilación exitosa se evalúa por la desaparición de las resonancias aromáticas mediante 1H-RMN en CD³OD. Después se sometió la mezcla resultante a ácido trifluoroacético/agua (2 ml, 4:1) durante 3,3 h en un baño de hielo y después se evaporó hasta sequedad para proporcionar un sólido rosa. Se purificó el producto en bruto obtenido mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 ^ m, 10 * 250 mm) usando un gradiente lineal del 20-95% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 20 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. La saponina S4 (5,4 mg, 50% de rendimiento) eluyó como un único pico amplio y existía como un polvo blanco después de la liofilización.

SQS-0-3-7-18 (8). (EC-IV-194) A una disolución de S4 (7,1 mg, 7,1 ^mol, 1,0 equiv) en N,N’-dimetilformamida (0,4 ml) se le inyectó trietilamina (20 |al, 0,14 mmol, 20 equiv), seguido de la adición gota a gota de 4 (14 mg, 40,6 |amol, 5,7 equiv) en N,N’-dimetilformamida (0,4 ml). Después de agitar durante 3 h, se diluyó el contenido con 10 ml de agua (TfA al 0,05%) y se purificó mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 |am, 10 x 250 mm) usando un gradiente lineal del 30-80% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 30 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. SQS-0-3-7-18 (8) (5,9 mg, 68% de rendimiento) eluyó como un único pico y existía como un polvo blanco después de la liofilización.

Precursor de arilestaño para [131I]-SQS-0-3-7-18 (9). (EC-IV-193) A S4 (3,6 mg, 3,6 |amol, 1,0 equiv) disuelta en N,N’-dimetilformamida (0,2 ml) con trietilamina (20 |al, 0,14 mmol, 40 equiv) se le añadió gota a gota una disolución de 5 (5 mg, 13,1 |amol, 3,6 equiv) en N,N’-dimetilformamida (0,1 ml). Después de agitar durante 2,5 h, se diluyó el contenido con agua (4 ml) y se purificó mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 |am, 10 x 250 mm) usando un gradiente lineal del 20-95% de acetonitrilo/agua, a lo largo de 30 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. La saponina 9 (2,4 mg, 53% de rendimiento) eluyó como un único pico y se obtuvo como un polvo blanco después de la liofilización.

Síntesis de variante que carece del dominio de trisacárido ramificado (16)

Bis(silil éter) de ácido quillaico (11). (AFT-II-040) Se enfrió una suspensión de ácido quillaico 10 (200 mg, 0,41 mmol, 1,0 equiv) en CH²Cl² (20 ml) en un baño de hielo y se inyectaron 2,6-lutidina (0,48 ml, 4,1 mmol, 10 equiv) y trifluorometanosulfonato de trietilsililo (0,46 ml, 2,06 mmol, 5,0 equiv). Después de agitar durante 1 h, se lavó el contenido con NaHCO3 saturado (10 ml), se extrajo la fase acuosa con CH²Cl² (2 * 15 ml) y se secaron las fracciones orgánicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos a hexanos/EtOAc 4:1) para proporcionar 11 (235 mg, 80% de rendimiento).

Azida de saponina de ácido quillaico protegida S28. (AFT-I-165) A una disolución de 11 (38 mg, 49 ^mol, 1,05 equiv) e imidato 12 (52 mg, 47 |amol, 1,0 equiv) en CH²CI² (7 ml) se le añadieron 80 mg de tamices moleculares de 4 Á en polvo y se agitó la mezcla a 21°C durante 30 min. Después se enfrió el matraz Schlenk de reacción hasta -35°C y se inyectó dietileterato de trifluoruro de boro (1,2 |al, 9,0 ^mol, 0,2 equiv). Se agitó la mezcla durante 0,5 h a esta temperatura, se extinguió con 0,2 ml de trietilamina y se concentró. La purificación del residuo mediante cromatografía en gel de sílice (trietilamina al 0,2% en benceno a benceno/EtOAc 97:3) proporcionó un aceite incoloro que se sometió adicionalmente a cromatografía para proporcionar el producto deseado S28 (56 mg, 72% de rendimiento) como un sólido blanco.

Amina de saponina de ácido quillaico protegida 13. (AFT-I-167) A S28 (62 mg, 37 ^mol, 1,0 equiv) disuelta en trietilamina (28 ml) se le añadió una disolución recién preparada de fenilselenol (1,11 mmol, 30 equiv) mediante una cánula. Tras la adición de fenilselenol, se formó un precipitado blanco y la disolución se volvió de color amarillo brillante. Se agitó la reacción durante 8 h a 38°C y después se concentró la disolución para proporcionar un sólido blanco amarillento. Se purificó la mezcla en bruto mediante cromatografía en gel de sílice (benceno/EtOAc 90:10 a 85:15) para proporcionar la amina 13 (49 mg, 80% de rendimiento) como un sólido vítreo.

Saponina de ácido aminoacilquillaico completamente protegida S10. (AFT-I-169) A una disolución incolora transparente de ácido 6-((f-butoxicarbonil)-amino)hexanoico (14) (45 mg, 0,20 mmol, 11,5 equiv) en tetrahidrofurano (2,5 ml) a 0°C se le añadió trietilamina (213 |al, 1,53 mmol, 90 equiv) seguido de cloroformiato de etilo (16,0 |al, 0,17 mmol, 10,0 equiv). Se agitó la disolución blanca turbia durante 2,5 h a 0°C y después se añadió mediante una cánula a la amina 13 (28 mg, 17,0 ^mol, 1,0 equiv) a 0°C. Se agitó la mezcla de reacción a esta temperatura durante 1,5 h y después se extinguió con agua (0,2 ml) para dar una disolución transparente. Se diluyó el contenido con NaHCO3 saturado (30 ml) y se extrajo la fase acuosa con CH²Cl² (3 * 25 ml). Se secaron las fracciones orgánicas combinadas (Na2SO4), se filtraron y se evaporaron hasta sequedad. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos/EtOAc 2:1 con el 0,2% de trietilamina) proporcionó S10 (28 mg, 88% de rendimiento) como un sólido vítreo blanco.

Saponina de ácido aminoacilquillaico 15. (AFT-I-204) En un matraz de fondo redondo de 50 ml, se disolvió S10 (68 mg, 36,6 |amol, 1,0 equiv) en tetrahidrofurano/etanol (20 ml, 1:1) y se añadió paladio al 10% (base seca) sobre carbono, húmedo, tipo Degussa E101 NE/W (390 mg, 0,18 mmol, 5,0 equiv). Se agitó la reacción bajo presión de hidrógeno (50 psi) a 21°C durante 24 h y se filtró la suspensión a través de un filtro de jeringa de nailon de 0,45 ^m, se lavó con metanol (3 * 30 ml) y se concentró. La desbencilación exitosa se evalúa por la desaparición de las resonancias aromáticas mediante 1H-RMN en CD³OD. Después se disolvió la mezcla en bruto en una disolución de ácido trifluoroacético (8 ml, TFA/H²O 3:1) y se agitó durante 2 h en un baño de hielo. Se evaporó la reacción hasta sequedad para proporcionar un sólido blanco que se disolvió en el 20% de acetonitrilo/agua (20 ml) y se purificó mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 ^m, 10 * 250 mm) usando un gradiente lineal del 30-70% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 15 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. La saponina de ácido aminoacilquillaico 15 eluyó como un único pico y se obtuvo como un polvo blanco (28 mg, 74% de rendimiento) después de la liofilización.

SQS-1-0-5-18 (16). (AFT-I-300) A una disolución de 15 (2,1 mg, 2,0 ^mol, 1,0 equiv) en N,N’-dimetilformamida (0,4 ml) se le añadió trietilamina (11 |al, 0,08 mmol, 40 equiv) seguido de la adición gota a gota de 4 (4,0 mg, 10 |amol, 5,8 equiv) en N,N-dimetilformamida (0,2 ml). Después de agitar durante 2 h, se diluyó el contenido con acetonitrilo al 30%/agua (2,3 ml) y se purificó mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 iam, 10 x 250 mm) usando un gradiente lineal del 30-70% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 15 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se obtuvo SQS-1-0-5-18 (16) (1,7 mg, 67% de rendimiento) como un polvo blanco después de la liofilización.

Precursor de arilestaño para [131I]-SQS-1-0-5-18 (17). (EC-V-227) A 15 (0,65 mg, 0,63 |amol, 1,0 equiv) disuelta en N,N-dimetilformamida (0,2 ml) se le añadió trietilamina (10 |al, 72 |amol, 114 equiv) y 5 (1,0 mg, 2,6 |amol, 4,1 equiv). Después de agitar durante 1,5 h, se diluyó la reacción con agua (4 ml) y se purificó mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 |am, 10 x 250 mm) con un gradiente lineal del 35-95% de acetonitrilo/agua, a lo largo de 30 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. La saponina 17 (0,6 mg, 75% de rendimiento) eluyó como un único pico y se obtuvo como un polvo blanco después de la liofilización.

Síntesis de variantes con modificaciones en el dominio de triterpeno (18-22)

Silil éter de ácido oleanólico (S29). (AFT-I-137) A una disolución de ácido oleanólico S5 (250 mg, 0,55 mmol, 1,0 equiv) en CH²Cl² (10 ml) a 0°C se le añadieron 2,6-lutidina (0,38 ml, 3,28 mmol, 6,0 equiv) y trifluorometanosulfonato de trietilsililo (0,37 ml, 1,64 mmol, 3,0 equiv) y se agitó la mezcla durante 1 h. Se extinguió el contenido con HCl 0,5 N (10 ml) y se extrajo la fase acuosa con CH²Cl² (2 * 15 ml). Se secaron las fracciones orgánicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron, se concentraron y finalmente se purificaron mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos a hexanos/EtOAc 4:1) para proporcionar S29 (250 mg, 80% de rendimiento).

Azida de saponina de ácido oleanólico protegida S6. (EC-V-215) A una disolución de S29 (50 mg, 87 |mol, 1,0 equiv) e imidato 12 (97 mg, 87 |mol, 1,0 equiv) en CH²Cl² (8,0 ml) se le añadieron 120 mg de tamices moleculares de 4 Á en polvo y se agitó la mezcla a 21°C durante 1 h. Después se transfirió el matraz Schlenk de reacción a un baño a -78°C y se inyectó dietileterato de trifluoruro de boro (8,8 |l, 70 |mol, 0,8 equiv). Se agitó la reacción a -50°C durante 20 min, a 21°C durante 1 min, se enfrió de nuevo hasta -50°C, se agitó durante 20 min y finalmente de nuevo a 21°C durante 1 min. Después se extinguió la mezcla con trietilamina (0,1 ml) a -50°C y se hizo pasar a través de un tapón de gel de sílice. Se concentró el filtrado resultante y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos a hexanos/EtOAc 5:1) para proporcionar S6 (89 mg, 68% de rendimiento) como un sólido vitreo.

Amina de saponina de ácido oleanólico protegida S30. (EC-V-216) A S6 (44 mg, 29 |mol, 1,0 equiv) disuelta en trietilamina (12 ml) se le añadió una disolución recién preparada de fenilselenol (0,44 mmol, 15 equiv) por transferencia mediante una cánula. Tras la adición de fenilselenol, se formó un precipitado blanco y la mezcla se volvió de color amarillo brillante. Después de agitar a 38°C durante 8 h, se concentró la disolución para dar un sólido blanco amarillento, que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos/EtOAc 5:1 a trietilamina al 2% en EtOAc) para proporcionar S30 (41 mg, 95% de rendimiento) como un sólido blanco.

Saponina de ácido aminoaciloleanólico completamente protegida S7. (EC-V-217) A una disolución de 14 (63 mg, 0,27 mmol, 10 equiv) en tetrahidrofurano (2,6 ml) se le añadió trietilamina (365 |l, 2,6 mmol, 96 equiv) a 0°C. A la disolución incolora transparente se le inyectó cloroformiato de etilo (23 |l, 0,25 mmol, 9,0 equiv), que volvió la disolución de color blanco turbio. Se permitió que tuviera lugar la activación con ácido a 0°C durante 2,5 h antes de transferir mediante una cánula toda la disolución a un matraz Schlenk que contenía amina S30 (41 mg, 27 |amol, 1,0 equiv). Se agitó la mezcla de reacción a 0°C durante 1,5 h y después se extinguió con agua (90 |al), momento en el que la disolución cambió de color blanco turbio a transparente. Después se evaporó el contenido hasta sequedad y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos/EtOAc 5:1) para proporcionar S7 (40 mg, 81% de rendimiento) como un sólido vítreo blanco.

Saponina de ácido aminoaciloleanólico S8. (EC-V-218) En un matraz de fondo redondo de 25 ml que contenía S7 (10 mg, 5,8 ^mol, 1,0 equiv) se añadió tetrahidrofurano/etanol (2 ml, 1:1) seguido de paladio al 10% (base seca) sobre carbono, húmedo, tipo Degussa E101 NE/W (14,0 mg, 6,5 ^mol, 1,1 equiv). Se agitó la reacción bajo presión de hidrógeno (50 psi) a 21°C durante 24 h y después se filtró a través de un filtro de jeringa de nailon de 0,45 mm, se lavó con metanol (20 ml), CH²Cl² (10 ml) y metanol de nuevo (5 ml) para lavar exhaustivamente el paladio. Se evaporó el filtrado transparente hasta sequedad. La desbencilación exitosa se evaluó por la desaparición de las resonancias aromáticas mediante 1H-RMN en CD³OD. Después se disolvió la mezcla en una disolución de ácido trifluoroacético/agua (2 ml, 4:1) y se agitó durante 2 h en un baño de hielo. Después de este tiempo, se evaporó la reacción hasta sequedad para dar un sólido blanco que se purificó mediante RP-HPLC usando un gradiente lineal del 30-80% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,1%), a lo largo de 20 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se obtuvo el producto deseado S8 (2,6 mg, 44% de rendimiento) como un polvo blanco después de la liofilización.

SQS-1-7-5-18 (18). (EC-V-221) Se disolvió amina S8 (1,3 mg, 1,3 ^mol, 1,0 equiv) en N,N’-dimetilformamida (0,2 ml) y se inyectó trietilamina (3,6 |al, 25,6 ^mol, 20 equiv). A esta disolución se le añadió 4 (2,5 mg, 7,3 ^mol, 5,7 equiv) y se agitó la mezcla de reacción a 21°C durante 2 h. Después de este tiempo, se diluyó el contenido con 3 ml de agua (TFA al 0,05%) y se purificó directamente mediante HPLC usando un gradiente lineal del 3080% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 20 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min, para proporcionar SQS-1-7-5-18 (18) (1,0 mg, 63% de rendimiento) como un polvo blanco después de la liofilización.

Precursor de arilestaño para SQS-1-7-5-18 (S9). (EC-V-222) A una disolución de amina S8 (1,3 mg, 1,3 |amol, 1,0 equiv) en N,N-dimetilformamida (0,2 ml) se le añadió trietilamina (3,6 ^l, 25,6 ^mol, 20 equiv) seguido de 5 (2,6 mg, 6,8 ^mol, 5,2 equiv). Después de agitar a 21°C durante 1,5 h, se diluyó la reacción con 3 ml de agua y se purificó directamente mediante RP-HPLC usando un gradiente lineal del 30-90% de acetonitrilo/agua, a lo largo de 30 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min, para proporcionar S9 (1,0 mg, 62% de rendimiento) como un polvo blanco después de la liofilización.

Saponina de aminoacilcaulofilogenina completamente protegida S11. (AFT-I-243). A una disolución de S10 (10 mg, 5,4 |amol) en metanol (1,0 ml) se le añadió NaBH4 y se agitó la reacción a 21°C durante 3 h. Después se diluyó la mezcla con acetona (2 ml), se concentró y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (benceno/EtOAc 85:15) para proporcionar S11 (10 mg, > 99% de rendimiento).

Saponina de aminoacilcaulofilogenina S12. (AFT-I-244) En un matraz de fondo redondo de 25 ml, se disolvió S11 (15 mg, 8,1 |amol, 1,0 equiv) en 4,0 ml de tetrahidrofurano/etanol (1:1) y se añadió paladio al 10% (base seca) sobre carbono, húmedo, tipo Degussa E101 NE/W (85 mg, 0,04 mmol, 5,0 equiv). Se agitó la reacción bajo una atmósfera de hidrógeno (globo) a 21°C durante 12 h y se filtró la suspensión a través de un filtro de jeringa de nailon de 0,45 ^m, se lavó exhaustivamente con metanol (4 * 20 ml) y se concentró. La desbencilación exitosa se evalúa por la desaparición de las resonancias aromáticas mediante 1H-RMN en CD³OD. Después se disolvió la mezcla en bruto en una disolución previamente enfriada (0°C) de ácido trifluoroacético (3,2 ml, TFA/H²O 3:1) y se agitó a 0°C durante 1,25 h. Se evaporó la reacción hasta sequedad y se disolvió el producto en bruto en el 20% de acetonitrilo/agua (8 ml) y se purificó mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 |am, 10 * 250 mm) usando un gradiente lineal del 20-70% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 20 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se obtuvo el producto deseado S12 como un polvo blanco (5,8 mg, 70% de rendimiento) después de la liofilización.

SQS-1-11-5-18 (19). (AFT-I-245) A una disolución de S12 (7,0 mg, 6,7 ^mol, 1,0 equiv) en N,N’-dimetilformamida (1,3 ml) se le inyectó trietilamina (20 |al, 0,13 mmol, 20 equiv) seguido de la adición gota a gota de 4 (11,6 mg, 33,6 |amol, 5,0 equiv) en N,N’-dimetilformamida (0,7 ml). Después de agitar durante 3 h, se diluyó el contenido con acetonitrilo al 25%/agua (10 ml) y se purificó mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 |am, 10 x 250 mm) usando un gradiente lineal del 30-70% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 15 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se obtuvo SQS-1-11-5-18 (19) (5,5 mg, 65% de rendimiento) como un polvo blanco después de la liofilización.

Bis(silil éter) de ácido equinocístico (S14). (AFT-I-206) Se suspendió ácido equinocístico S13 (18 mg, 38 |amol, 1,0 equiv) en CH²Cl² (10 ml) y se enfrió en un baño de hielo. Después se añadió 2,6-lutidina (71 |al, 0,61 mmol, 16 equiv) seguido de trifluorometanosulfonato de trietilsililo (69 |al, 0,31 mmol, 8,0 equiv) y se agitó la mezcla de reacción a 0°C durante 1 h. Después de este tiempo, se lavó el contenido con NaHCO3 saturado (5 ml) y se extrajo la fase acuosa con CH²Cl² (2 * 10 ml). Se secaron las fracciones orgánicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos a hexanos/EtOAc 9:1) para proporcionar S14 (25 mg, 94% de rendimiento).

Azida de saponina de ácido equinocístico protegida S19. (AFT-I-212) Se enfrió una disolución de S14 (25 mg, 36 |amol, 1,0 equiv) e imidato 12 (50 mg, 45 ^mol, 1,25 equiv) en CH²Cl² (5 ml) con 40 mg de tamices moleculares de 4 Á en polvo hasta -45°C y se añadió dietileterato de trifluoruro de boro (0,9 |al, 7 ^mol, 0,2 equiv). Se agitó la mezcla a esta temperatura durante 0,5 h min, se extinguió con 0,2 ml de trietilamina y se concentró. La purificación del residuo mediante cromatografía en gel de sílice (trietilamina al 0,2% en benceno a benceno/EtOAc 97:3) proporcionó S19 (48 mg, 80% de rendimiento) como un sólido blanco.

Amina de saponina de ácido equinocístico protegida S31. (AFT-I-214) A S19 (52 mg, 31 ^mol, 1,0 equiv) disuelta en trietilamina (25 ml) se le añadió una disolución recién preparada de fenilselenol (0,94 mmol, 30 equiv) mediante una cánula. Se agitó la reacción a 38°C durante 8 h y después se concentró la disolución para proporcionar un sólido blanco amarillento. Se purificó la mezcla en bruto mediante cromatografía en gel de sílice (tolueno/EtOAc 9:1 a 4:1) para proporcionar la amina S31 (42 mg, 83% de rendimiento) como un sólido vitreo.

Saponina de ácido aminoacilequinocístico completamente protegida S22. (AFT-I-215) A una disolución incolora transparente de ácido 6-((f-butoxicarbonil)-amino)hexanoico (14) (44 mg, 0,19 mmol, 11,5 equiv) en tetrahidrofurano (2 ml) a 0°C se le añadió trietilamina (208 |al, 1,49 mmol, 90 equiv) seguido de cloroformiato de etilo (16,0 |al, 0,17 mmol, 10,0 equiv). Se agitó la disolución blanca turbia a 0°C durante 2,5 h y después se añadió mediante una cánula a la amina S31 (27 mg, 16,6 ^mol, 1,0 equiv) a 0°C. Se agitó la mezcla de reacción a esta temperatura durante 1,5 h y después se extinguió con agua (0,2 ml) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (benceno/EtOAc 9:1 a 5:1 con trietilamina al 0,2%) proporcionó S22 (27 mg, 88% de rendimiento) como un sólido vitreo blanco.

Saponina de ácido aminoacilequinocístico S25. (AFT-I-216) En un matraz de fondo redondo de 25 ml que contenía S22 (24 mg, 13 ^mol, 1,0 equiv) se añadió tetrahidrofurano/etanol (6 ml, 1:1) y paladio al 10% (base seca) sobre carbono, húmedo, tipo Degussa E101 NE/W (138 mg, 65 ^mol, 5,0 equiv). Se agitó la reacción bajo una atmósfera de hidrógeno (globo) a 21°C durante 12 h y después se filtró a través de un filtro de jeringa de nailon de 0,45 ^m, se lavó con metanol (3 * 10 ml) y se concentró. La desbencilación exitosa se evalúa por la desaparición de las resonancias aromáticas mediante 1H-RMN en CD³OD. Después se disolvió la mezcla en bruto en una disolución previamente enfriada (0°C) de ácido trifluoroacético (4 ml, TFA/H²O 3:1) y se agitó durante 1,25 h en un baño de hielo. Se evaporó la reacción hasta sequedad para proporcionar un sólido blanco que se disolvió en el 25% de acetonitrilo/agua (12 ml) y se purificó mediante R^p-HP^lC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 |am, 10 * 250 mm) usando un gradiente lineal del 30-70% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 15 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. La saponina de ácido aminoacilequinocístico S25 eluyó como un único pico y se obtuvo como un polvo blanco (7,0 mg, 53% de rendimiento) después de la liofilización.

SQS-1-8-5-18 (20). (AF-I-223) Se disolvió S25 (7,0 mg, ^{6 , 8} |amol, 1,0 equiv) en N,N-dimetilformamida (2 ml) en un matraz de fondo redondo de 25 ml y se inyectó trietilamina (20 |al, 0,14 mmol, 20 equiv). Se añadió gota a gota una disolución de 4 (11,8 mg, 34 |amol, 5,0 equiv) en N,N-dimetilformamida (1,5 ml) mediante una jeringa y se agitó la reacción a 21°C en la oscuridad. Después de 3 h, se diluyó el contenido con acetonitrilo al 25%/agua (9 ml) y se purificó mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 ^m, 10 x 250 mm) usando un gradiente lineal del 30-70% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 15 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. SQS-1-8-5-18 (20) (^{6 , 8} mg, 80% de rendimiento) eluyó como un único pico y se obtuvo como un polvo blanco después de la liofilización.

Gipsogenina (S16). (AFT-I-218) En un matraz de fondo redondo de 25 ml, se suspendió hederagenina S15 (45 mg, 95 ^mol, 1,0 equiv) en CH²Cl² (3,5 ml) y después se añadió una disolución acuosa (3,5 ml) de NaHCO³ 0,5 M (147 mg), K²CO³0,05 M (24,2 mg) y cloruro de tetrabutilamonio hidratado (28 mg, 95 ^mol, 1,0 equiv). A la mezcla agitada vigorosamente, se le añadió TEMPO (14,8 mg, 95 ^mol, 1,0 equiv) seguido de N-clorosuccinimida (38,0 mg, 0,29 mmol, 3,0 equiv) y se agitó la reacción durante 2 h en la oscuridad. Se sometió a reparto el contenido en un embudo de separación y se extrajo con CH²Cl² (3 * 10 ml). Se secaron los extractos orgánicos combinados sobre Na²SO⁴, se filtraron y se concentraron para dar un producto en bruto que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos/EtOAc, 7:3) para proporcionar el triterpeno de gipsogenina deseado S16 (32 mg, 72% de rendimiento).

Silil éter de gipsogenina (S17). (AFT-I-219) Se enfrió una suspensión de gipsogenina S16 (32 mg, ⁶⁸ ^mol, 1,0 equiv) en CH²Cl² (10 ml) en un baño de hielo y se inyectaron 2,6-lutidina (63 |al, 0,54 mmol, 8,0 equiv) y trifluorometanosulfonato de trietilsililo (62 |al, 0,27 mmol, 4,0 equiv). Después de agitar durante 1 h, se lavó el contenido con NaHCO³ saturado (7 ml) y se extrajo la fase acuosa con CH²Cl² (3 * 10 ml). Se secaron las fracciones orgánicas combinadas (Na²SO⁴), se filtraron y se concentraron. Se purificó el producto en bruto varias veces mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos a hexanos/EtOAc 4:1) para proporcionar S17 (26 mg, 65% de rendimiento).

Azida de saponina de gipsogenina protegida S20. (AF-I-224) Se agitó una disolución de S17 (26 mg, 44 |amol, 1,0 equiv) e imidato 12 (55 mg, 49 ^mol, 1,1 equiv) en CH²Cl² (6 ml) con 40 mg de tamices moleculares de 4 Á en polvo a 21°C durante 30 min y después se enfrió hasta -45°C antes de inyectar dietileterato de trifluoruro de boro (1,1 |al, 9 |amol, 0,2 equiv). Se agitó la reacción a esta temperatura durante 0,5 h, se extinguió con trietilamina (0,2 ml) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (benceno a benceno/EtOAc 97:3) proporcionó el producto deseado más una mezcla algo impura que se sometió adicionalmente a cromatografía para proporcionar S20 (48 mg, 70% de rendimiento) como un sólido vitreo.

Amina de saponina de gipsogenina protegida S32. (AF-I-225) A una disolución de S20 (50 mg, 32 ^mol, 1,0 equiv) en trietilamina (27 ml) se le añadió una disolución recién preparada de fenilselenol (1,07 mmol, 32 equiv) mediante una cánula. Después de agitar a 38°C durante 8 h, se concentró la disolución para dar un sólido blanco amarillento, que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (tolueno/EtOAc 9:1 a 8:2) para proporcionar S32 (35 mg, 72% de rendimiento) como un sólido blanco.

Saponina de aminoacilgipsogenina completamente protegida S23. (AFT-I-226) A una disolución de 14 (61 mg, 0,27 mmol, 11,5 equiv) en tetrahidrofurano (3 ml) a 0°C se le añadió trietilamina (290 ^l, 2,1 mmol, 90 equiv) seguido de cloroformiato de etilo (22 |al, 0,23 mmol, 10 equiv), que volvió la disolución transparente de color blanco turbio. Se permitió que tuviera lugar la activación con ácido durante 2,5 h a 0°C y se transfirió mediante una cánula toda la disolución a un matraz Schlenk que contenía amina S32 (35 mg, 23 ^mol, 1,0 equiv). Se agitó la mezcla de reacción a 0°C durante 1,5 h y después se extinguió con agua (90 |al), momento en el que la disolución cambió de color blanco turbio a transparente. Después se evaporó el contenido hasta sequedad y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (benceno/EtOAc 9:1 a 5:1 con trietilamina al 0,2%) para proporcionar S23 (34 mg, 86% de rendimiento) como un sólido vitreo blanco.

Saponina de aminoacilgipsogenina S26. (AF-I-227) En un matraz de fondo redondo de 25 ml, se disolvió S23 (27 mg, 15,5 ^mol, 1,0 equiv) en 6 ml de tetrahidrofurano/etanol (1:1) y se añadió paladio al 10% (base seca) sobre carbono, húmedo, tipo Degussa E101 NE/W (166 mg, 78 ^mol, 5 equiv). Se agitó la reacción bajo una atmósfera de hidrógeno (globo) a 21°C durante 12 h. Después de este tiempo, se filtró la mezcla a través de un filtro de jeringa de nailon de 0,45 mm, se lavó con metanol (20 ml) y se concentró. La desbencilación exitosa se evaluó por la desaparición de las resonancias aromáticas mediante 1H-RMN en CD³OD. Después se disolvió el residuo en una disolución previamente enfriada (0°C) de ácido trifluoroacético/agua (4 ml, 3:1) y se agitó durante 1,25 h en un baño de hielo. Después de este tiempo, se evaporó la reacción hasta sequedad para dar un sólido blanco que se purificó mediante RP-HPLC usando un gradiente lineal del 30-70% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 15 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se obtuvo el producto deseado S26 (13 mg, 82% de rendimiento) como un polvo blanco después de la liofilización.

SQS-1-9-5-18 (21). (AF-I-230) En un matraz de fondo redondo de 25 ml, se disolvió amina S26 (6,6 mg, 6,5 |amol, 1,0 equiv) en N,N-dimetilformamida (2,0 ml) y se inyectó trietilamina (18 ^l, 0,13 mmol, 20 equiv). A esta disolución, se le añadió gota a gota 4 (11,1 mg, 32 |amol, 5,0 equiv) disuelta en N,N-dimetilformamida (1,5 ml) y se agitó la mezcla de reacción a 21°C durante 3 h en la oscuridad. Después de este tiempo, se diluyó el contenido con 9 ml de acetonitrilo al 25%/agua (TFA al 0,05%) y se purificó directamente mediante RP-HPLC usando un gradiente lineal del 30-70% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 15 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se obtuvo SQS-1-9-5-18 (21) (4,5 mg, 56% de rendimiento) como un polvo blanco después de la liofilización.

Bis(silil éter) de hederagenina (S18). (AFT-I-228) Se suspendió hederagenina S15 (35 mg, 74 ^mol, 1,0 equiv) en CH²Cl² (15 ml) y se enfrió en un baño de hielo. Después se añadió 2,6-lutidina (138 |al, 1,18 mmol, 16 equiv) seguido de trifluorometanosulfonato de trietilsililo (134 |al, 0,59 mmol, 8,0 equiv) y se agitó la mezcla de reacción a 0°C durante 1 h. Después de este tiempo, se lavó el contenido con NaHCO3 saturado (10 ml) y se extrajo la fase acuosa con CH²Cl² (2 * 15 ml). Se secaron las fracciones orgánicas combinadas (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. Se purificó el producto en bruto varias veces mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos a hexanos/EtOAc 4:1) para proporcionar S18 (45 mg, 81% de rendimiento).

Azida de saponina de hederagenina protegida S21. (AFT-I-232) Se enfrió una disolución de S18 (28 mg, 40 |amol, 1,1 equiv) e imidato 12 (41 mg, 36,7 |amol, 1,0 equiv) en CH²Cl² (5 ml) con 35 mg de tamices moleculares de 4 Á en polvo hasta -45°C y se añadió dietileterato de trifluoruro de boro (0,9 |al, 7 |amol, 0,2 equiv). Se agitó la mezcla a esta temperatura durante 0,5 h, se extinguió con 0,2 ml de trietilamina y se concentró. La purificación del residuo mediante cromatografía en gel de sílice (trietilamina al 0,2% en benceno a benceno/EtOAc 98:2) proporcionó S21 (43 mg, 71% de rendimiento) como un sólido vitreo.

Amina de saponina de hederagenina protegida S33. (AFT-I-233) A S21 (44 mg, 26,5 ^mol, 1,0 equiv) disuelta en trietilamina (24 ml) se le añadió una disolución recién preparada de fenilselenol (0,80 mmol, 30 equiv) mediante una cánula. Se agitó la reacción a 38°C durante 8 h y después se concentró la disolución para proporcionar un sólido blanco amarillento. Se purificó la mezcla en bruto mediante cromatografía en gel de sílice (tolueno/EtOAc 9:1 a 4:1) para proporcionar la amina S33 (34,5 mg, 80% de rendimiento) como un sólido vítreo.

Saponina de aminoacilhederagenina completamente protegida S24. (AFT-I-234) A una disolución de ácido 6-((t-butoxicarbonil)-amino)hexanoico (14) (56 mg, 0,24 mmol, 11,5 equiv) en tetrahidrofurano (2,5 ml) a 0°C se le añadió trietilamina (263 |al, 1,89 mmol, 90 equiv) seguido de cloroformiato de etilo (20,0 |al, 0,21 mmol, 10,0 equiv). Se agitó la disolución blanca turbia a 0°C durante 2,5 h y después se añadió mediante una cánula a la amina S33 (34,5 mg, 21,0 ^mol, 1,0 equiv) a 0°C. Se agitó la mezcla de reacción a esta temperatura durante 1,5 h y después se extinguió con agua (0,2 ml) y se concentró. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (benceno/EtOAc 9:1 a 5:1 con 0,2% trietilamina) proporcionó S24 (36,5 mg, 92% de rendimiento) como un sólido blanco.

Saponina de aminoacilhederagenina S27. (AFT-I-235) En un matraz de fondo redondo de 25 ml, se disolvió S24 (30 mg, 16,3 ^mol, 1,0 equiv) en tetrahidrofurano/etanol (7 ml, 1:1) y se añadió paladio al 10% (base seca) sobre carbono, húmedo, tipo Degussa E101 NE/W (173 mg, 81 ^mol, 5,0 equiv). Se agitó la reacción bajo una atmósfera de hidrógeno (globo) a 21°C durante 12 h y después se filtró a través de un filtro de jeringa de nailon de 0,45 |am, se lavó con metanol ( 3 x 10 ml) y se concentró. La desbencilación exitosa se evalúa por la desaparición de las resonancias aromáticas mediante 1H-RMN en CD³OD. Después se disolvió la mezcla en bruto en una disolución previamente enfriada (0°C) de ácido trifluoroacético (4 ml, TFA/H²O 3:1) y se agitó durante 1,25 h en un baño de hielo. Se evaporó la reacción hasta sequedad y se disolvió el sólido blanco en el 30% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%) (14 ml) y se purificó mediante RP-HpLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 |am, 10 x 250 mm) usando un gradiente lineal del 30-70% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 15 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se obtuvo el producto deseado S27 como un polvo blanco (11,0 mg, 66% de rendimiento) después de la liofilización.

SQS-1-10-5-18 (22). (AF-I-236) Se disolvió S27 (6,0 mg, 5,8 |amol, 1,0 equiv) en N,N-dimetilformamida (2,5 ml) en un matraz de fondo redondo de 25 ml y se inyectó trietilamina (16,3 |al, 0,12 mmol, 20 equiv). Se añadió gota a gota una disolución de 4 (10,1 mg, 29 |amol, 5,0 equiv) en N,N-dimetilformamida (1,5 ml) mediante una jeringa y se agitó la reacción a 21°C durante 3 h. Después de este tiempo, se diluyó el contenido con acetonitrilo al 25%/agua (9 ml) y se purificó mediante RP-HPLC en una columna XBridge Prep BEH300 C18 (5 ^m, 10 x 250 mm) usando un gradiente lineal del 30-70% de acetonitrilo/agua (TFA al 0,05%), a lo largo de 15 min, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se obtuvo SQS-1-10-5-18 (22) (4,2 mg, 57% de rendimiento) como un polvo blanco después de la liofilización.

En resumen, extensos estudios sobre estructura-función de novedosas saponinas yodadas basadas en QS-21 han identificado el derivado de ácido equinocístico 20 (SQS-1-8-5-18) como adyuvante inmunológico mínimo de saponina con potente actividad y toxicidad drásticamente reducida en comparación con el producto natural (figura 5), así como accesibilidad de síntesis mejorada en relación con las variantes previamente notificadas. El subtipado de los anticuerpos IgG provocado por el derivado de ácido equinocístico 20, así como el derivado de ácido quillaico 16 (SQS-1-0-5-18) y el derivado de caulofilogenina 19 (SQS-1-11-5-18) estrechamente relacionados, indica que predominan las subclases IgG1 y IgG2b. La subclase IgG1 de ratón se asocia con respuestas de células Th2 (inmunidad humoral), mientras que IgG2b, junto con IgG2a, se relacionan con respuestas de células Th1 (inmunidad celular), y se sabe que inducen potentes funciones efectoras inmunoterápicas, incluyendo citotoxicidad dependiente del complemento y toxicidad celular dependiente de anticuerpo. Se obtuvieron resultados similares con SQS-21. Por tanto, a pesar de las considerables diferencias estructurales entre estas saponinas truncadas y QS-21, provocan inmunidad tanto de Th1 como de Th2, un rasgo distintivo de la propia Q^s -21.

Hasta la fecha, la investigación de requisitos estructurales dentro del dominio de triterpeno de QS-21 se ha visto obstaculizada por los desafíos asociados con la modificación quimioselectiva del producto natural y por las limitaciones de producción del material para análogos sintéticos que incorporan triterpenos alternativos. Por tanto, el descubrimiento de que puede omitirse todo el dominio de trisacárido ramificado al tiempo que se retiene una potente actividad adyuvante y se atenúa la toxicidad ha abierto la puerta a la investigación de tales modificaciones de triterpeno mediante semisíntesis a partir de precursores de triterpeno fácilmente disponibles alternativos.

Estos estudios revelaron que el sustituyente aldehído en C4 es indispensable para una potente actividad adyuvante mientras que el grupo hidroxilo en C16 potencia la actividad en estas saponinas truncadas. En cambio, se ha sugerido previamente que el sustituyente aldehído en C4 de QS-21 reacciona con grupos amino en receptores de superficie de células T a través de formación de base de Schiff, proporcionando la coestimulación necesaria para la activación de células T y la inmunidad de células Th1. Esta hipótesis se basó en el hallazgo de que la aminación reductora del sustituyente aldehído en C4 de QS-21 proporciona derivados de amina con una actividad adyuvante significativamente atenuada. Sin embargo, esta modificación no sólo retira el sustituyente aldehído en C4 sino que también introduce un grupo amino cargado positivamente en esta posición, que alternativamente puede comprometer las interacciones no covalentes con un supuesto receptor o interferir de otro modo con la biodistribución o ubicación subcelular apropiadas del adyuvante. De manera similar, se mostró que la variante de QS-21 2 (SQS-0-0-5-11), que retiene el sustituyente aldehído en C4 pero porta una funcionalidad amino cargada positivamente en el dominio de la cadena de acilo, era igualmente inactiva. Aunque es posible que QS-21 y estas variantes sintéticas modificadas puedan tener dianas moleculares diferentes, parece que inducen efectos celulares similares in vivo.

A la inversa, el hallazgo dado a conocer en el presente documento de que el grupo hidroxilo en C16 potencia la actividad adyuvante en estas saponinas truncadas sugiere un papel previamente no apreciado para esta funcionalidad, quizás en la estabilización de la conformación de saponina y/o en la interacción directa con un supuesto receptor. Estos resultados son compatibles con informes de otras saponinas activas con adyuvante que poseen el grupo hidroxilo en C16 pero carecen del sustituyente aldehído en C4 de triterpeno.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Compuesto, que tiene una de las fórmulas:

Saponina R1 R2

16 (SQS 1-0-5-18) -CHO -OH

19 (SQS 1-11-5-18) -CH2OH -OH

20 (SQS 1-8-5-18) -Me -OH

21 (SQS 1-9-5-18) -CHO -H

22 (SQS 1-10-5-18) -CH2OH -H

18 (SQS 1-7-5-18) -Me -H

2. Compuesto según la reivindicación 1, representado por la siguiente fórmula:

en la que R1 es -CHO y R2 es -OH.

3. Compuesto según la reivindicación 1, representado por la siguiente fórmula:

en la que R1 es -CH²OH y R2 es -OH.

4. Compuesto según la reivindicación 1, representado por la siguiente fórmula:

en la que R1 es -Me y R2 es -OH.

5. Compuesto según la reivindicación 1, representado por la siguiente fórmula:

en la que R1 es -CHO y R2 es -H.

6. Compuesto según la reivindicación 1, representado por la siguiente fórmula:

en la que R1 es -CH²OH y R2 es -H.

7. Compuesto según la reivindicación 1, representado por la siguiente fórmula:

en la que R1 es -Me y R2 es -H.

8. Compuesto de fórmula (III),

en la que W es Me, -CHO o -CH²OH, y V es H u OH.

9. Uso del compuesto según la reivindicación 8, como producto intermedio en la síntesis de un compuesto según la reivindicación 1.

10. Composición farmacéutica, que comprende:

el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

una cantidad inmunológicamente eficaz de un antígeno.

11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10, para su uso en la inmunización de un sujeto.

12. Composición farmacéutica, que comprende:

el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

una cantidad eficaz de un fármaco citotóxico.

13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, para su uso en la potenciación del efecto de un fármaco citotóxico en un sujeto.