ES2886631T3 - Método para inducir células T positivas para CD8 específicas de antígeno - Google Patents
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Abstract
Un método para inducir células T CD4-CD8+ a partir de células madre pluripotentes, que comprenden las siguientes etapas (1), (2) y (3), (1) diferenciar las células madre pluripotentes para proporcionar un cultivo celular que comprende células T CD4-CD8- y células T CD4+CD8+, (2) eliminar las células CD4-CD8- y las células CD4-CD8+ del cultivo celular obtenido en la etapa (1), y (3) diferenciar las células CD4+CD8+ en el cultivo celular obtenido en la etapa (2) en células T CD4-CD8+; o las siguientes etapas (1) y (2'): (1) diferenciar las células madre pluripotentes para proporcionar un cultivo celular que comprende células T CD4-CD8- y células T y CD4+CD8+, (2') diferenciar las células T CD4+CD8+ en el cultivo celular obtenido en (1) en células T CD4-CD8+ en presencia de una sustancia que inhibe la actividad citotóxica de las células T CD4-CD8- en donde el antígeno CD8 de las células T CD4-CD8+ es un heterodímero compuesto por cadenas CD8α y CD8β.
Description
DESCRIPCIÓN
Método para inducir células T positivas para CD8 específicas de antígeno
Campo de la invención
La presente solicitud se refiere a un método para inducir células T CD4'CD8+ a partir de células madre pluripotentes.
Ténica anterior
Cada célula T expresa un receptor de células T (TCR) con diferente especificidad. Cuando se desarrolla una enfermedad infecciosa, una célula T que tiene una especificidad adecuada proliferará para proporcionar una población de células T (clon) que luchará con el patógeno. Esta es la idea básica de la inmunidad adquirida. Si es posible amplificar artificialmente una célula T con una especificidad deseada, las células T amplificadas se pueden utilizar para la inmunoterapia adoptiva. La amplificación de una célula T determinada se denomina "clonación". De hecho, se ha realizado clínicamente el trasplante autólogo de células T específicas de antígeno preparadas mediante la amplificación de las células T específicas de antígeno obtenidas del paciente. Sin embargo, casi todas las terapias de trasplante de células T autólogas no utilizan una población de células purificadas hasta el punto de células "clonadas". Además, el subcultivo in vitro repetido de las células puede provocar la pérdida de la función de destrucción de las células cancerosas.
Se ha propuesto un método para proporcionar células T que son capaces de proliferar infinitamente inmortalizando las células. Una célula se puede inmortalizar y proliferar para proporcionar una población de células clonadas. Los procedimientos para inmortalizar una célula pueden incluir la fusión de la célula con una célula cancerosa, así como el cultivo a largo plazo de las células con TCR estimulante en presencia de citocinas. Sin embargo, el autotrasplante de células T inmortalizadas así obtenidas puede ser peligroso porque las células son, por así decirlo, células cancerosas. Además, los procedimientos de clonación podrían reducir las funciones celulares.
Se ha informado de un método para generar células madre pluripotentes, especialmente células iPS, que portan genes que codifican un TCR específico para un antígeno dado, y un método para regenerar células T que portan el TCR a partir de las células iPS (Véanse las Bibliografías de Patentes 1-7 y Bibliografías No Relacionadas con Patentes 1-6). Basándose en esos métodos, se puede preparar una gran cantidad de células T que portan genes que codifican un TCR específico. Se espera que esas células T se apliquen a inmunoterapias basadas en células. Por ejemplo, las células iPS pueden ser inducidas a partir de linfocitos T citotóxicos y a continuación, los linfocitos T citotóxicos se pueden volver a generar a partir de las células iPS. Sin embargo, hasta ahora, no existe ningún informe de que se pudieran obtener CTL regenerados que tuvieran actividades citotóxicas que se pudieran comparar con los CTL originales a partir de los cuales se indujeron las células iPS.
Los CTL generados en el organismo vivo son células T CD4-CD8+ y la molécula CD8 es un heterodímero CD8ap. Los linfocitos T CD8aa son linfocitos T de "tipo inmunidad innata", y no tienen suficiente afinidad de unión a las moléculas del MHC de clase I y tienen una función débil como correceptor del receptor de linfocitos T (TCR). Las células T de tipo CD8aa rara vez se encuentran en los tejidos linfoides y se encuentran comúnmente en los tejidos de las mucosas.
Documentos de la técnica anterior
Documentos de patente
[Bibliografía de Patentes 1] documento WO2011/096482
[Bibliografía de Patentes 2] documento WO2013/176197
[Bibliografía de Patentes 3] documento WO2015/099134
[Bibliografía de Patentes 4] documento WO2016/010148
[Bibliografía de Patentes 5] documento WO2016/010153
[Bibliografía de Patentes 6] documento WO2011/096482
[Bibliografía de Patentes 7] documento WO2011/096482
Documentos no relacionados con patentes
[Bibliografía No Relacionada con Patentes 1] Vizcardo, R., Masuda, K., Yamada, D., Ikawa, T., Shimizu, K., Fujii, S., Koseki, H., y Kawamoto, H. (2013). Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell 12, 31-36.
[Bibliografía No Relacionada con Patentes 2] Nishimura, T., Kaneko, S., Kawana-Tachikawa, A., Tajima, Y., Goto, H., Zhu, D., Nakayama-Hosoya, K., Iriguchi, S., Uemura, Y., Shimizu, T., et al. (2013). Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell 12, 114-126.
[Bibliografía No Relacionada con Patentes 3] Wakao, H., Yoshikiyo, K., Koshimizu, U., Furukawa, T., Enomoto, K., Matsunaga, T., Tanaka, T., Yasutomi, Y., Yamada, T., Minakami, H., et al. (2013). Expansion of
functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell 12, 546-558.
[Bibliografía No Relacionada con Patentes 4] Themeli, M., Kloss, C.C., Ciriello, G., Fedorov, V.D., Perna, F., Gonen, M., y Sadelain, M. (2013). Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy. Nat Biotechnol 31, 928-933.
[Bibliografía No Relacionada con Patentes 5] Ando, M., Nishimura, T., Yamazaki, S., Yamaguchi, T., Kawana-Tachikawa, A., Hayama, T., Nakauchi, Y., Ando, J., Ota, Y., Takahashi, S., et al. (2015). A Safeguard System for Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Rejuvenated T Cell Therapy. Stem Cell Reports 5, 597-608.
[Bibliografía No Relacionada con Patentes 6] Kitayama, S., Zhang, R., Liu, T.Y., Ueda, N., Iriguchi, S., Yasui, Y., Kawai, Y., Tatsumi, M., Hirai, N., Mizoro, Y., et al. (2016). Cellular Adjuvant Properties, Direct Cytotoxicity of Re-generated Va24 Invariant NKT-like Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports 6, 213-227.
El documento WO2016/010148 (Bibliografía de Patentes 4) describe un método de inducción de células T para inmunoterapia que comprende inactivar los genes Rag1 y/o Rag2 de células madre pluripotentes humanas.
El documento WO2016/076415 describe un método para inducir células T positivas para CD8 a partir de células madre pluripotentes que comprende añadir vitamina C o un derivado de la misma a un medio de cultivo líquido durante el cultivo.
MAEDA, T. et al: "Regeneration of CD8ap T cells from T-cell-derived iPSC imparts potent tumor antigen-specific cytotoxicity, CANCER RESEARCH, 21 de noviembre de 2016, vol. 76, núm. 23, páginas 6839-6850, describe la estimulación de células CD4/CD8 doble positivas derivadas de iPSC purificadas con un anticuerpo anti-CD3.
Saito, H. et al: "Adoptive Transfer of CD8+ T Cells Generated from Induced Pluripotent Stem Cells Triggers Regressions of Large Tumors Along with Immunological Memory", CANCER RESEARCH, vol. 76, núm. 12, 12 de abril de 2016, páginas 3473-3483, describe la reactividad antitumoral y la memoria inmunológica mediada por la transferencia adoptiva de células T CD8+ regeneradas derivadas de iPSC.
Vizcardo, R. et al: "Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T cells from iPSCs Derived from Mature CD8+ T Cells", CELL STEM CELL, vol. 12, núm. 1, 1 de enero de 2013, páginas 31-36, describe un enfoque para clonar y expandir células CD8+ específicas de antígeno funcional.
Kitayama, S. et al: "Cellular Adjuvant Properties, Direct Cytotoxicity of Re-differentiated V[alpha]24 Invariant NKT-like Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells", STEM CELL REPORTS, vol. 6, núm. 2, 9 de febrero de 2016, páginas 213-227, describe la regeneración y expansión de células iNKT humanas a partir de iPSC utilizando una combinación basada en IL-7/IL-15.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona un método para inducir células T CD4'CD8+ a partir de células madre pluripotentes, que comprende las siguientes etapas (1), (2) y (3),
(1) diferenciar las células madre pluripotentes para proporcionar un cultivo celular que comprende células T CD4'CD8' y células T CD4+CD8+,
(2) eliminar las células CD4'CD8' y las células CD4'CD8+ del cultivo celular obtenido en la etapa (1), y (3) diferenciar las células CD4+CD8+ en el cultivo celular obtenido en la etapa (2) en células T CD4'CD8+; o seguir las etapas (1) y (2'):
(1) diferenciar las células madre pluripotentes para proporcionar un cultivo celular que comprende células T CD4‘CD8‘ y células T CD4+CD8+,
(2') diferenciar las células T CD4+CD8+ en el cultivo celular obtenido en (1) en células T CD4'CD8+ en presencia de una sustancia que inhibe la actividad citotóxica de las células T CD4'CD8' en donde el antígeno CD8 de las células T CD4'CD8+ son un heterodímero compuesto por cadenas CD8a y CD8p.
La presente invención proporciona adicionalmente un método para establecer células T CD4'CD8+ que tienen actividad citotóxica específica para un antígeno deseado a partir de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
inducir células T CD4'CD8+ a partir de las células madre pluripotentes mediante el método de la invención, e introducir un receptor de células T o un receptor de antígeno quimérico específico para el antígeno deseado en las células T CD4'CD8+ inducidas.
De acuerdo con las reivindicaciones, un objeto de la presente solicitud es proporcionar un método para generar células T CD4'CD8+ a partir de células madre pluripotentes. Más específicamente, un objeto de la presente solicitud es proporcionar un método para generar células T CD4'CD8+ que tienen una actividad citotóxica específica de
antígeno deseada a partir de células madre pluripotentes.
En lo sucesivo, "células T CD8" representa células T CD4'CD8+. De acuerdo con las reivindicaciones, otro objeto de la presente solicitud es proporcionar una población de células T CD4'CD8+ que comparten la misma especificidad de antígeno y tienen una actividad citotóxica específica de antígeno relativamente alta.
En el método de la presente solicitud, los ejemplos de células madre pluripotentes pueden incluir aquellas que tienen receptores específicos para el antígeno deseado, por ejemplo, aquellas que tienen el receptor de células T reordenado (TCR) y el receptor de antígeno quimérico reordenado (CAR). Las células T CD4-CD8+ inducidas a partir de células madre pluripotentes que portan un TCR reordenado por el método de acuerdo con esta solicitud ejercen una actividad citotóxica específica de antígeno con la misma especificidad de antígeno que el TCR original. Las células T CD4-CD8+ inducidas a partir de células madre pluripotentes que portan un CAR reordenado son las mismas que en el caso del TCR.
Los ejemplos de células madre pluripotentes también pueden incluir aquellas que no tienen TCR y CAR. Cuando se utilizan, las células T CD4-c D8+ que ejercen una actividad citotóxica específica de antígeno que portan la especificidad de antígeno deseada se pueden obtener introduciendo el TCR deseado en las células T CD4-CD8+ inducidas a partir de células madre pluripotentes mediante un método conocido.
Mediante el método de la presente solicitud, se puede preparar un cultivo celular en el que 80% o más, 85% o más, 90% o más o 95% más de las células en el cultivo son células T CD4-CD8+ que comparten la misma especificidad de antígeno, especialmente el mismo gen TCR. La presente solicitud también proporciona el cultivo celular así obtenido.
La presente solicitud también describe una inmunoterapia basada en células que comprende administrar las células T CD4-CD8+ específicas de antígeno obtenidas mediante el método proporcionado por esta solicitud al sujeto que necesita la terapia.
De acuerdo con las reivindicaciones, se puede preparar un cultivo celular que comprende células T CD4-CD8+ que tengan una especificidad de antígeno deseada y una actividad citotóxica específica de antígeno relativamente fuerte.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un resultado del análisis FACS de un cultivo celular el día 35 de la diferenciación convencional de células T-iPS contra LMP2 en células T.
La Figura 2 muestra un resultado del análisis FACS de un cultivo celular obtenido incubando las células de la Figura 1 bajo la estimulación del anticuerpo anti-CD3 durante 6 días.
La Figura 3 es un gráfico que muestra la actividad citotóxica específica de péptido de los CTL a partir de los cuales se establecieron las células T-iPS contra LMP2.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la actividad citotóxica específica de péptido de las células CD8SP rediferenciadas de las células T-iPS contra LMP2 mediante el procedimiento convencional.
La Figura 5 es un gráfico que compara las actividades citotóxicas específicas de péptido de las células CD8SP (CTL regenerados) que se volvieron a generar a partir de las células T-iPS contra LMP2 mediante el procedimiento convencional y de los CTL originales a partir de los cuales se establecieron células iPS contra LMP2-T.
La Figura 6 muestra actividades similares a las de las células asesinas naturales de las células CD8SP (CTL regeneradas) que se regeneraron a partir de células T-iPS contra LMP2 mediante el procedimiento convencional.
La Figura 7 muestra el procedimiento del Ejemplo 1 para diferenciar células madre pluripotentes en células T. La Figura 8 muestra un resultado del análisis FACS del cultivo celular el día 13 de la diferenciación de células madre pluripotentes en células T en el Ejemplo 1.
La Figura 9 muestra un resultado del análisis FACS de los cultivos celulares el día 40 de la diferenciación de células madre pluripotentes en células T en el Ejemplo 1, antes y después del enriquecimiento de las células DP.
La Figura 10 muestra un resultado del análisis FACS de las células CD8SP inducidas por cultivo celular estimulante enriquecido para células DP con anticuerpo anti-CD3. El cultivo celular del Ejemplo 1 se enriqueció para células DP el día 40 de la diferenciación antes de la estimulación con anticuerpo anti-CD3. Las células eran específicas del antígeno LMP2 y células T de tipo CD8ap.
La Figura 11 muestra un resultado del análisis FACS de las células CD8SP de la Figura 10 que proliferaron adicionalmente en presencia de las células presentadoras de antígeno pulsadas con antígeno LMP2 (APC). La Figura 12 muestra la curva de crecimiento celular de las células CD8SP de la Figura 10 que proliferaron adicionalmente en presencia de las células presentadoras de antígeno pulsadas con antígeno LMP2 (APC). La Figura 13 (izquierda) es un gráfico que muestra la actividad citotóxica específica de péptido de las células CD8SP regeneradas (células CD8ap regeneradas). La figura de la derecha es un gráfico en el que se comparan las actividades citotóxicas específicas de péptido de los CTL originales a partir de los cuales se generaron las células T-iPS contra LMP2 y se comparan las células CD8SP regeneradas.
La Figura 14 son gráficos que muestran los porcentajes de células viables entre las células DP después de la
incubación (superior) y antes de la incubación (inferior). El día 40 de la diferenciación de las células iPS en células T, las células T se dividieron en células DP y células DN. A continuación, las células DP y las células DN se mezclaron para que la razón DP:DN fuera 1:0, 3:1, 1:1 y 1:3, y las células mezcladas se incubaron en presencia de anticuerpo anti-CD3 durante 5 horas.
La Figura 15 es un gráfico que muestra la actividad citotóxica específica del péptido WT1 de las células CD8SP inducidas a partir de células T iPS contra WT1 de acuerdo con los procedimientos mostrados en la Figura 7.
La Figura 16 es un gráfico que muestra las actividades citotóxicas específicas de péptido WT1 de las células CD8SP inducidas a partir de las células T iPS contra WT1 de acuerdo con los procedimientos mostrados en la Figura 7 y los CTL originales a partir de los cuales se establecieron las células T iPS contra WT1.
La Figura 17 muestra las actividades citotóxicas de las células CD8SP inducidas a partir de células T iPS contra WT1 de acuerdo con los procedimientos mostrados en la Figura 7 contra la proteína WT1 endógena que porta la línea celular de leucemia humana HL60 y THP1. Cuando el HLA de la célula diana fue bloqueado por un anticuerpo anti-HLA-1, las actividades citotóxicas casi desaparecieron. Por consiguiente, se confirmó que la actividad citotóxica de las células CD8SP estaba restringida por TCR.
La Figura 18 muestra las actividades citotóxicas de las células CD8SP regeneradas a partir de las células T iPS contra WT1 de acuerdo con los procedimientos mostrados en la Figura 7 contra las células leucémicas derivadas de un paciente que porta proteína WT1 endógena. Las actividades citotóxicas contra los tres tipos de células leucémicas que portan la proteína WT1 endógena fueron bloqueadas por el anticuerpo inhibidor anti-HLA-1.
La Figura 19 es un programa de administración de las células CD8SP específicas de WT1 (células CTL regeneradas) que se diferenciaron de las células T iPS contra WT1 de acuerdo con el procedimiento mostrado en la Figura 7 al ratón inmunodeficiente al que se inocularon las células de leucemia mieloide aguda humana en el Ejemplo 5.
La Figura 20 muestra el análisis FACS de la sangre periférica obtenida del ratón al que se inocularon células de leucemia mieloide aguda humana, después de administrar PBS/CTL regenerados en el Ejemplo 5.
La Figura 21 es una curva de supervivencia de los ratones a los que se inocularon células de leucemia mieloide aguda humana y se administraron PBS/CTL regenerados en el Ejemplo 5. Los CTL regenerados prolongaron el período de supervivencia de los ratones.
La Figura 22 muestra un cultivo celular el día 40 de la diferenciación de células iPS con TCR en células T en el Ejemplo 6.
La Figura 23 es un resultado del análisis FACS de las células CD8SP inducidas por cultivo celular estimulante enriquecido para células DP con anticuerpo anti-CD3. El cultivo celular del Ejemplo 6 se enriqueció en células DP el día 40 de la diferenciación. A continuación, el cultivo celular fue estimulado con el anticuerpo anti-CD3. Las células eran específicas para el antígeno WT 1 y eran células T de tipo CD8ap.
La Figura 24 muestra las actividades citotóxicas de CTL regenerados inducidos a partir de células iPS con TCR obtenidas en el Ejemplo 6 y CTL regenerados inducidos a partir de células T-iPS obtenidas en el Ejemplo 2. Ambos ejercieron actividades CTL similares.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
En la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la expresión de "células madre pluripotentes" se refiere a células madre que tienen pluripotencia, es decir, capacidad para diferenciarse en muchos tipos de células del organismo y capacidad de autopropagación. Los ejemplos de células madre pluripotentes pueden incluir células madre embrionarias (células ES), células madre embrionarias de transferencia nuclear (células ntES), células germinales embrionarias (células EG), células madre pluripotentes inducidas (células iPS), fibroblastos cultivados y células pluripotentes derivadas de células madre mieloides (células Muse). Las células madre pluripotentes son preferiblemente células de mamífero y más preferiblemente, células madre pluripotentes humanas, tales como células ES humanas y células iPS. Para crear un banco de células para la inmunoterapia basada en células de donantes humanos que tienen HLA específicos, se utilizan preferiblemente células iPS.
En la memoria descriptiva y las reivindicaciones, "células T" se refiere a células que expresan receptores para antígenos denominados receptor de células T (TCR).
En la memoria descriptiva y las reivindicaciones, todas las "células T CD4+CD8+", "células T doble positivas" y "células DP" representan células T positivas para CD4 positivas para CD8. Todas las "células T CD4'CD8'", "células T doble negativas" y "células DN" representan las células T negativas para CD8 negativas para CD4. A menos que se indique lo contrario, las "células CD8T "incluyen tanto homodímeros de CD8aa como heterodímeros de CD8ap. "TCR" significa un receptor de células T. "CTL" significa linfocito T citotóxico.
Se pueden obtener células T que portan un TCR reordenado con la especificidad de antígeno deseada estableciendo células iPS a partir de una célula T que porta el TCR reordenado que es específico para el antígeno deseado. Se ha informado del hecho de que un t Cr reordenado de una célula T se mantiene en las células iPS establecidas a partir de la célula T. Véanse el documento WO2011/096482 y Vizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31 36 2013. Las células T utilizadas como origen para las células iPS pueden ser preferiblemente células T que expresan al menos uno de CD4 y CD8, además de CD3. Los ejemplos de células T humanas preferidas pueden incluir células T auxiliares/reguladoras que son células positivas para CD4; células T citotóxicas que son células positivas para CD8; células T no sometidas a tratamiento previo que son células CD45RA+CD62L+; células T de
memoria central que son células CD45RA'CD62L+, células T de memoria efectoras que son células CD45RA'CD62L' y células T efectoras terminales que son células CD45RA+CD62L-. Se utilizan preferiblemente linfocitos T citotóxicos (CTL).
Las células T humanas se pueden aislar de un tejido humano mediante procedimientos conocidos. El tejido humano no está limitado en particular, siempre que el tejido contenga células T del tipo mencionado anteriormente, y los ejemplos del mismo pueden incluir sangre periférica, ganglios linfáticos, médula ósea, timo, bazo, sangre del cordón umbilical y un tejido del sitio de lesión. Entre estos, se prefieren la sangre periférica y la sangre del cordón umbilical, ya que se pueden obtener de forma menos invasiva del cuerpo humano y se pueden preparar con facilidad. Los procedimientos conocidos para aislar células T humanas incluyen, por ejemplo, citometría de flujo utilizando un anticuerpo que se dirige a marcadores de superficie celular, tales como CD3, y un clasificador de células. Alternativamente, las células T deseadas se pueden aislar detectando la secreción de una citocina o la expresión de una molécula funcional como indicador. En este caso, por ejemplo, los linfocitos T secretan diferentes citocinas, dependiendo de si son del tipo Th1 o Th2, y así se pueden aislar linfocitos T de un tipo Th deseado seleccionando linfocitos T utilizando la citocina como indicador. De manera similar, se pueden aislar células T citotóxicas (asesinas) utilizando la secreción o producción de granzima, perforina o similares como indicador.
Los linfocitos T citotóxicos específicos para un cáncer o antígeno asociado a una enfermedad infecciosa se pueden aislar de un individuo que padece dicho cáncer o enfermedad infecciosa o de un individuo que previamente había padecido el cáncer o la enfermedad infecciosa, y las células pueden hacer proliferar. Los linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno también se pueden inducir a partir de células obtenidas de un voluntario sano.
Las células T humanas específicas para un antígeno dado se pueden aislar del cultivo celular o tejido que contiene las células T específicas del antígeno con una columna de afinidad inmovilizada con el antígeno deseado. Alternativamente, se puede utilizar un tetrámero de un complejo principal de histocompatibilidad (MHC) unido a antígeno para aislar células T humanas específicas para determinar la especificidad antigénica deseada de tejidos humanos.
Los linfocitos T citotóxicos específicos para un antígeno dado se pueden inducir estimulando los linfocitos obtenidos de un ser humano mediante un procedimiento convencional con el antígeno o un péptido epitópico del mismo. Se conocen en la técnica diversas proteínas antigénicas o sus péptidos epitópicos específicos para diversas enfermedades tales como cáncer, enfermedades autoinmunitarias o enfermedades infecciosas. Se puede seleccionar un antígeno o péptido epitópico adecuado. El método para inducir CTL estimulando linfocitos con un antígeno es bien conocido en la técnica.
Las células T que tienen la especificidad de antígeno deseada también pueden incluir células T con CAR que son células T que portan el receptor de antígeno quimérico (CAR) obtenido mediante ingeniería genética. Las células T con CAR se pueden generar de acuerdo con los procedimientos publicados: Themeli, M. et al., Nat Biotechnol 31, 928-933 (2013) y Themeli, M. et al., Cell Stem Cell 16, 357-366 (2015).
Las células iPS se pueden inducir a partir de células T así obtenidas específicas para un antígeno deseado. El procedimiento para inducir células madre pluripotentes a partir de células T puede ser el enseñado por Vizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-362013. Por ejemplo, se pueden obtener células T específicas para un antígeno dado de un individuo que ha adquirido inmunidad contra la enfermedad que se va a tratar y se pueden introducir factores de Yamanaka en las células T para proporcionar células iPS (Takahashi y Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006), Takahashi et al., Cell 131, 861-872 (2007) y Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10.915-929 (2011).
Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) se pueden preparar mediante la introducción de factores de reprogramación específicos en las células somáticas. Las células iPS son células madre artificiales derivadas de células somáticas que tienen propiedades casi equivalentes a las de las células ES (K. Takahashi y S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008); y documento WO 2007/069666). Los factores de reprogramación pueden estar constituidos por genes o productos génicos de los mismos, o ARN no codificantes, que se expresan específicamente en células ES; o genes o productos génicos de los mismos, ARN no codificantes o compuestos de bajo peso molecular, que desempeñan funciones importantes en el mantenimiento del estado indiferenciado de las células madre embrionarias. Los ejemplos de genes incluidos en los factores de reprogramación incluyen Oct3/4, Sox2, Soxl, Sox3, Soxl5, Soxl7, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbxl5, ERas, ECAT15-2, Tell, beta-catenina, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 y Glis1, y estos factores de reprogramación se pueden utilizar individualmente o combinados. Los ejemplos de la combinación de factores de reprogramación incluyen los descritos en los documentos WO2007/069666; WO2008/118820; WO2009/007852; WO2009/032194 WO2009/058413 WO2009/057831; WO2009/075119 WO2009/079007 WO2009/091659 WO2009/101084 WO2009/101407 WO2009/102983; WO2009/114949 WO2009/117439 WO2009/126250 WO2009/126251 WO2009/126655 WO2009/157593; WO2010/009015 WO2010/033906 WO2010/033920 WO2010/042800 WO2010/050626 WO 2010/056831 ; WO2010/068955; WO2010/098419; WO2010/102267; WO 2010/11 1409; WO 2010/111422; WO2010/115050; WO2010/124290; WO2010/147395; WO2010/147612; Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797; Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528; Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474; Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26: 1269-1275; Shi Y, et al. (2008), Cell Stem
Cell, 3, 568-574; Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479; Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135; Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11 :197-203; R.L. Judson et al. (2009), Nat. Biotech., 27:459-461; Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917; Kim JB, et al. (2009), Nature. 461 :649-643; Ichida JK, et al. (2009) , Cell Stem Cell. 5:491-503; Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6: 167-74; Han J, et al. (2010), Nature.
463:1096-100; Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720, and Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.
Los factores de reprogramación se pueden poner en contacto con las células somáticas o introducirse en ellas mediante un procedimiento conocido adecuado para el tipo de factores que se van a utilizar.
En caso de que los factores de reprogramación sean proteínas, los factores de reprogramación pueden introducirse en las células somáticas mediante un método tal como lipofección, fusión con un péptido permeable a las células (p. ej., TAT derivada de VIH o poliarginina) o microinyección.
En caso de que los factores de reprogramación sean ADN, los factores de reprogramación se pueden introducir en las células somáticas mediante un vector tal como virus, plásmidos y vectores de cromosomas artificiales; lipofección; uso de liposomas; o microinyección. Los ejemplos de vector viral incluyen vectores de retrovirus, vectores de lentivirus (estos se describen en Cell, 126, pág. 663-676, 2006; Cell, 131, pág. 861-872, 2007; y Science, 318, pág. 1917-1920, 2007), vectores de adenovirus (Science, 322, 945-949, 2008), vectores de virus adenoasociados y vectores de virus Sendai (documento WO 2010/008054). Los ejemplos del vector de cromosoma artificial incluyen el cromosoma artificial humano (HAC), el cromosoma artificial de levadura (YAC) y el cromosoma artificial bacteriano (BAC y PAC). Los ejemplos del plásmido que se pueden utilizar incluyen plásmidos para células de mamíferos (Science, 322:949-953, 2008). El vector puede contener una o varias secuencias o secuencias reguladoras tales como un promotor, potenciador, secuencia de unión a ribosoma, terminador y/o sitio de poliadenilación para permitir la expresión de los factores de reprogramación nuclear; y, según se requiera, una secuencia de un marcador de selección tal como un gen de resistencia a fármacos (p. ej., gen resistente a kanamicina, gen resistente a ampicilina o gen resistente a puromicina), gen de timidina quinasa o gen de toxina diftérica; una secuencia de genes de un informador tal como la proteína verde fluorescente (GFP), p-glucuronidasa (GUS) o FLAG. Adicionalmente, para eliminar, después de la introducción del gen en las células somáticas y la expresión del mismo, los genes que codifican los factores de reprogramación, o tanto el promotor o promotores como los genes que codifican los factores de reprogramación ligados a ellos, el vector puede tener secuencias LoxP aguas arriba y aguas abajo de estas secuencias.
Adicionalmente, en caso de que los factores de reprogramación sean ARN, cada factor de reprogramación se puede introducir en las células somáticas mediante lipofección o microinyección, y se puede utilizar un ARN en el que se incorporaron 5-metilcitidina y pseudouridina (TriLink Biotechnologies) para suprimir la degradación. (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630).
Los ejemplos del medio para inducir células iPS incluyen medios DMEM, DMEM/F12 y DME con un suplemento de FBS al 10 a 15% (estos medios pueden contener adicionalmente LIF, penicilina/estreptomicina, puromicina, L-glutamina, aminoácidos no esenciales, p-mercaptoetanol y/o similares, según sea apropiado); y medios disponibles comercialmente [por ejemplo, medio para cultivar células ES de ratón (medio TX-WES, Thromb-X), medio para cultivar células ES de primate (medio para células ES/iPS de primate, ReproCELL) y medio sin suero (mTeSR, Stemcell Technology)].
Los ejemplos del método para inducir células iPS incluyen un método en el que las células somáticas y los factores de reprogramación se ponen en contacto entre sí a 37°C en presencia de CO2 al 5% en medio DMEM o DMEM/F12 con un suplemento de FBS al 10%, y las células se cultivan durante aproximadamente 4 a 7 días, sembrando a continuación las células en células alimentadoras (p. ej., células STO tratadas con mitomicina C o células SNL) y se comienza el cultivo en un medio que contiene bFGF para células ES de primate aproximadamente 10 días después del contacto entre las células somáticas y los factores de reprogramación, permitiendo así que las colonias de tipo ES aparezcan de aproximadamente 30 a aproximadamente 45 días después del contacto, o más tarde.
Alternativamente, las células se pueden poner en contacto con los factores de reprogramación y cultivar a 37°C en una atmósfera con CO2 al 5% en células alimentadoras (p. ej., células STO tratadas con mitomicina C o células SNL) en medio DMEM con un suplemento de FBS al 10% (este medio puede contener adicionalmente LIF, penicilina/estreptomicina, puromicina, L-glutamina, aminoácidos no esenciales, p -mercaptoetanol y similares, según sea apropiado) durante aproximadamente 25 a aproximadamente 30 días o más, permitiendo así que aparezcan colonias de tipo ES. Los ejemplos preferidos del método de cultivo incluyen un método en el que se utilizan las propias células somáticas que se van a reprogramar en lugar de las células alimentadoras (Takahashi K et al. (2009), PLoS One. 4:e8067 o documento WO2010/137746), y un método en el que se utiliza una matriz extracelular (p. ej., Laminina-5 (documento WO2009/123349), Laminina-5 (documento WO2009/123349), Laminina-10 (documento US2008/0213885) o su fragmento (documento WO2011/043405) o Matrigel (BD)) en su lugar.
Otros ejemplos incluyen un método en el que las células iPS se establecen utilizando un medio sin suero (Sun N et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A . 106: 15720-15725). Adicionalmente, para mejorar la eficiencia de establecimiento, las células iPS se pueden establecer en condiciones de bajo oxígeno (a una concentración de oxígeno de 0,1% a 15%) (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241 o documento WO2010/013845).
Los ejemplos de los factores utilizados para mejorar la eficiencia del establecimiento pueden incluir inhibidores de histona desacetilasa (HDAC) [p. ej., Inhibidores de bajo peso molecular tales como ácido valproico (VPA), tricostatina A, butirato de sodio, MC 1293 y M344, inhibidores de la expresión a base de ácido nucleico tales como ARNip y ARNhc contra HDAC (p. ej., HdAc 1 siRNA Smartpool.RTM. (Millipore), Construcciones de ARNhc de 29 unidades HuSH contra HDAC1 (OriGene) y similares), y similares], inhibidor de MEK (p. ej., PD184352, PD98059, U0126, SL327 y PD0325901), inhibidor de glucógeno sintasa quinasa-3 (p. ej., Bio y CHIR99021), inhibidores de ADN metil transferasa (p. ej., 5-azacitidina), inhibidores de histona metil transferasa [por ejemplo, inhibidores de bajo peso molecular tales como BIX-01294 e inhibidores de la expresión basados en ácidos nucleicos tales como ARNip y ARNhc contra Suv39h1, Suv39h2, SetDB1 y G9a], agonista del calcio del canal L (por ejemplo, Bayk8644), ácido butírico, inhibidor de TGFp o inhibidor de ALK5 (p. ej., LY364947, SB431542, 616453 y A-83-01), inhibidor de p53 (por ejemplo, ARNip y ARNhc contra p53), inhibidor de ARID3A (p. ej., ARNip y ARNhc contra a R|D3A), miARN tal como miR-291-3p, miR-294, miR-295, mir-302 y similares, Señalización por Wnt (por ejemplo, Wnt3a soluble), neuropéptido Y, prostaglandinas (p. ej., prostaglandina E2 y prostaglandina J2), hTERT, SV40LT, UTF1, IRX6, GLIS1, PlTX2, DMRTB1 y similares. Al establecer las células iPS, se puede utilizar un medio añadido con el factor para mejorar la eficiencia de establecimiento.
Durante el cultivo, el medio se puede reemplazar por el medio de nueva aportación una vez al día desde el Día 2 del cultivo. El número de células somáticas utilizadas para la reprogramación nuclear no está restringido y, por lo general, está dentro del intervalo de aproximadamente 5*103 a aproximadamente 5*106 células por área de 100 cm2 en la placa de cultivo.
Las células iPS se pueden seleccionar basándose en la forma de cada colonia formada. En los casos en los que se introduce un gen de resistencia a los fármacos tal como un gen marcador, de modo que el gen de resistencia a los fármacos se expresa junto con un gen que se expresa cuando se reprograma una célula somática (p. ej., Oct3/4 o Nanog), las células iPS establecidas se pueden seleccionar cultivando las células en un medio que contenga el fármaco correspondiente (medio de selección). Adicionalmente, las células iPS se pueden seleccionar mediante observación bajo un microscopio de fluorescencia en los casos en los que el gen marcador es el gen de una proteína fluorescente. Las células iPS inducidas (células T-iPS) portan genes que codifican el receptor de células T (TCR) derivado de la célula T original a partir de la cual se indujeron las células iPS.
En otra realización de acuerdo con esta solicitud, los genes de TCR específicos para un antígeno deseado se pueden introducir en células madre pluripotentes para proporcionar células madre pluripotentes que portan genes que codifican un receptor de células T específico para el antígeno deseado.
Se ha informado sobre TCR específicos de cáncer relacionados con varios cánceres. Los genes de TCR se pueden aislar a partir de células T específicas para un antígeno dado aislado de un paciente que tiene cáncer o inducir a partir de un voluntario sano. Los genes de TCR específicos para un antígeno dado pueden incluir genes de receptores de antígenos quiméricos específicos para el antígeno.
Los genes que codifican un TCR específico para un antígeno deseado se pueden introducir en células madre pluripotentes tales como células iPS. Por ejemplo, este procedimiento se puede llevar a cabo según lo enseñado por Morgan R.A. et al., Science, 314:126. 2006. En particular, se puede introducir un vector adecuado que porte los genes de TCR en las células iPS. Por ejemplo, los genes de TCR pueden ser introducidos por un vector tal como virus, plásmidos y vectores de cromosomas artificiales; o mediante lipofección, liposomas o microinyección. Los ejemplos de los vectores de virus incluyen vectores de retrovirus, vectores de lentivirus, vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados y vectores de virus Sendai. Los ejemplos del vector de cromosoma artificial incluyen el cromosoma artificial humano (HAC), el cromosoma artificial de levadura (YAC) y el cromosoma artificial bacteriano (BAC y PAC). Los ejemplos del plásmido que se puede utilizar incluyen plásmidos para células de mamíferos. El vector puede incluir una o varias secuencia reguladoras tales como un promotor, potenciador, secuencia de unión a ribosoma, terminador y/o sitio de poliadenilación para permitir la expresión de los genes de TCR. Si se desea, el vector también puede contener un marcador de selección tal como un gen de resistencia a fármacos (p. ej., gen resistente a kanamicina, gen resistente a ampicilina o gen resistente a puromicina), gen de timidina quinasa o gen de toxina diftérica; y un informador como la proteína verde fluorescente (GFP), pglucuronidasa (GUS) o FLAG.
En el método de la presente solicitud, las células madre pluripotentes pueden ser células iPS inducidas a partir de células somáticas distintas de las células T o células Es . En la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la expresión de "células somáticas" se refiere a células animales cualesquiera que no sean células de la línea germinal o células pluripotentes tales como espermatozoides, espermatocitos, óvulos, ovocitos y células madre embrionarias. Las células somáticas pueden ser preferiblemente células de mamífero, incluidas células humanas. Los ejemplos de células somáticas pueden incluir células somáticas fetales, células somáticas neonatales y células somáticas de individuos sanos maduros o de individuos con enfermedad. En particular, los ejemplos de células somáticas pueden incluir células diferenciadas, por ejemplo, células madre de tejido (es decir, células madre somáticas) tales como células madre neurales, células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales y células madre de pulpa dental, células progenitoras de tejido, linfocitos, células epiteliales, células endoteliales, células musculares, fibroblastos tales como células cutáneas, células ciliadas, hepatocitos, células de la mucosa gástrica, enterocitos, esplenocitos, células pancreáticas tales como células pancreáticas exocrinas, células cerebrales, células pulmonares
y adipocitos. Las células iPS pueden ser inducidas a partir de células somáticas mediante un método similar al método anterior para inducir células iPS a partir de células T.
Las células madre pluripotentes que portan los genes que codifican el TCR deseado se diferencian en una población de células T que comprende células DP y células DN. El procedimiento para diferenciar las células madre pluripotentes en células T puede ser el enseñado por Timmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879 6888.
En una realización, las células madre pluripotentes se cultivan conjuntamente con células estromales OP9, por ejemplo, con un cultivo de células estromales OP9 de ratón para proporcionar células progenitoras hematopoyéticas. Las células progenitoras hematopoyéticas obtenidas se cultivan conjuntamente con células OP9/DLL1. Tras el cocultivo con células OP9/DLL1, el medio de cultivo celular puede complementarse con IL-7, FlT-3L y SCF (Factor de Células Madre). Cuando las células madre pluripotentes se diferencian mediante este procedimiento, se puede obtener un cultivo celular que comprende tanto células DN como células DP.
Los autores de la presente invención han descubierto que cuando una mezcla de células que comprende células DN y células DP se estimula con un anticuerpo anti-CD3, las células DN destruyen las células DP. En consecuencia, en la siguiente etapa, las células DN se eliminan del cultivo celular. El cultivo de células extraídas de células DN puede no comprender sustancialmente células DN y, preferiblemente, no más de 5%, no más de 3% y especialmente menos del 1% de células DN. La etapa para eliminar células DN del cultivo celular que comprende tanto células DN como DP puede ser "enriquecimiento de células DP" y el cultivo celular extraído de células Dn se puede denominar "cultivo celular DP enriquecido".
Durante el procedimiento de diferenciación de las células madre pluripotentes en células T, el cultivo celular que comprende células DN y células DP también puede comprender células CD8SP. Las células CD8SP pueden ser células T de tipo homodímero CD8aa. Las células CD8SP se eliminan preferiblemente simultáneamente con la eliminación de las células DN. Los procedimientos para eliminar tanto las células DN como las células CD8SP no están limitados. En una realización, las células DN y las células CD8SP se pueden eliminar recolectando células positivas para CD4 utilizando un sustrato al que se une el anticuerpo anti-CD4, tal como cuentas MACS. Además, los linfocitos T de tipo homodímero CD8aa se pueden eliminar recolectando linfocitos T de tipo heterodímero CD8SPap utilizando un sustrato al que se une CD8p, tal como cuentas MACS. En otra realización, las células DN se pueden eliminar recolectando células DN utilizando un clasificador de células para proporcionar un cultivo celular que no contiene sustancialmente células DN. Alternativamente, se puede preparar un cultivo celular que no comprende sustancialmente células DN o células CD8SP recolectando células DP por medio de un clasificador de células. Adicionalmente, se puede preparar un cultivo celular que no comprende sustancialmente células T de tipo homodímero CD8SPaa recolectando células T de tipo heterodímero CD8SPap por medio de un clasificador de células.
A continuación, las células del cultivo de células DP enriquecido se diferencian en células CD8SP. Las células DP se pueden diferenciar en células CD8SP activando directamente cualquiera de las vías de activación que se producen tras la estimulación del receptor de células T. Por ejemplo, las células T se pueden activar añadiendo PMA e iononisina, de una manera similar a la estimulación de TCR. Los ejemplos de procedimientos para estimular el TCR pueden incluir la incubación de células DP en presencia de un anticuerpo anti-CD3. El medio de cultivo se puede complementar con IL-7 e IL-2 además del anticuerpo anti-CD3. El período de tiempo para cultivar las células en el medio de cultivo que comprende el anticuerpo anti-CD3 puede ser de 3 a 10 días, por ejemplo, de 4 a 8 días o aproximadamente 6 días.
Cuando se establece un cultivo de células DP a partir de células madre pluripotentes que portan un receptor, por ejemplo un TCR, específico para el antígeno deseado, las células DP se pueden diferenciar en células CD8SP estimulando las células con el propio antígeno o las células presentadoras de antígeno que presentan dicho antígeno. De manera similar, cuando las células DP expresan un CAR, las células DP se pueden diferenciar en células CD8SP estimulando las células con el antígeno reconocido por el CAR, por ejemplo, añadiendo el antígeno soluble al cultivo celular, añadiendo cuentas recubiertas con el antígeno al cultivo celular, o cultivando conjuntamente las células DP con células que expresan el antígeno.
Casi todas las células CD8SP diferenciadas del cultivo de células DP enriquecido activando directamente cualquiera de las vías de activación que se producen tras la estimulación del receptor de células T son células T de tipo CD8ap, es decir, células T que expresan el heterodímero CD8ap. Como revela el ejemplo de referencia 2 que se muestra a continuación, cuando un cultivo celular que comprende células DN y células Dp se somete a la diferenciación en presencia de anticuerpo anti-CD3 sin enriquecer las células DP, casi todas las células obtenidas eran homodímeros CD8aa. Las células T de tipo homodímero CD8aa ejercen una actividad citotóxica específica de antígeno relativamente baja mientras que ejercen una actividad de destrucción similar a la de las células NK relativamente alta.
En otra realización de la presente solicitud, el cultivo celular que comprende tanto células DN como células DP se puede diferenciar cultivando las células con la estimulación del anticuerpo anti-CD3 en presencia de una sustancia que inhibe la actividad citotóxica de las células DN, sin eliminar las celdas DN. Los ejemplos de sustancias que
inhiben la actividad citotóxica de las células DN pueden ser un inhibidor de perforina, un inhibidor de granzima, un inhibidor de la ruta Fas, un inhibidor de caspasa y un anticuerpo inhibidor contra el receptor activador de células Asesinas Naturales.
Las células CD8SP diferenciadas de las células madre pluripotentes que portan genes reordenados que codifican el TCR o el CAR según el método descrito en la presente memoria ejercen una potente actividad citotóxica. Por ejemplo, cuando las células T-iPS se establecen a partir de una célula CTL humana y a continuación, las células T-iPS se diferencian en células CD8SP (CTL regeneradas) a través de la etapa de enriquecimiento de las células DP, se pueden preparar CTLS regenerados que ejercen una actividad CTL específica de antígeno comparativa con la de los CTL originales a partir de los cuales se establecieron las células T-iPS. Adicionalmente, cuando se utilizan células madre pluripotentes que portan genes reordenados que codifican el TCR o el CAR, el gen Rag1 o Rag2 de las células madre pluripotentes se puede inactivar mediante la edición del genoma antes de diferenciar las células madre pluripotentes en células T para evitar el reordenamiento de los genes TCR o CAR (documento WO2016/010148). Los métodos para generar células madre pluripotentes que portan genes que codifican un CAR que es específico para un antígeno dado, y el método para diferenciar dichas células madre pluripotentes en células T que expresan CAR se enseñan, por ejemplo, en Themeli, M. et al., Nat Biotechnol 31, 928-933 (2013) y Themeli, M. et al., Cell Stem Cell 16, 357-366 (2015).
En otra realización más de la presente solicitud, se pueden obtener linfocitos T citotóxicos específicos para un antígeno deseado expresando el gen TCR con la especificidad antigénica deseada en las células CD8SP diferenciadas a partir de las células madre pluripotentes. En esta realización, las células madre pluripotentes pueden portar genes TCR o CAR, o pueden no portar esos genes. Los genes de TCR específicos para un antígeno deseado se pueden expresar en las células CD8SP mediante un método similar al método para expresar los genes de TCR específicos para un antígeno deseado en las células madre pluripotentes. Tras la expresión de dicho TCR, los genes de TCR endógenos en las células CD8SP generadas pueden suprimirse por medio de, por ejemplo, ARNip.
Alternativamente, se pueden generar células T que portan un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para un antígeno deseado (células T con CAR) a partir de las células CD8SP. Las células que expresan CAR se pueden obtener introduciendo genes que codifican cAr en las células CD8SP.
Los CTL específicos de antígeno preparados según el método proporcionado en la presente memoria pueden hacerse proliferar mediante un método conocido, por ejemplo estimulando las células con el propio antígeno o con células presentadoras de antígeno que presentan dicho antígeno, o con anticuerpo anti-CD3 antes de su uso.
Hay muchas proteínas relacionadas con el cáncer que se expresan en una variedad de cánceres, incluidos LMP2, WT1 y NY-ESO1. Los péptidos epitópicos de esas proteínas también se conocen en la técnica como péptidos antigénicos del cáncer y se pueden utilizar en el método de esta solicitud. Además, también se conocen en la técnica muchos genes que codifican TCR específicos para varios antígenos del cáncer. Mediante el método de la presente solicitud, es posible obtener una población celular que contiene células CD8SP de alta calidad que tienen actividad citotóxica específica para un antígeno de cáncer dado con alta pureza, que es útil en la inmunoterapia basada en células.
Como se muestra en los ejemplos proporcionados en esta solicitud, se confirmó el efecto terapéutico de las células CD8SP obtenidas mediante el método en un modelo de ratón al que se inoculó un tumor humano. Además, en los ratones a los que se administraron las células CD8SP regeneradas, no se observó daño en tejidos distintos del tumor y no se observó ningún efecto adverso. Adicionalmente, no se observó la canceración de las células administradas in vivo. Se espera que las células regeneradas preparadas según el método de la presente solicitud se utilicen en una inmunoterapia basada en células en la que se administran a un paciente CTL específicos para un antígeno específico de una enfermedad cancerosa o infecciosa. Tanto los puntos de vista de la eficacia como de la seguridad. Se considera que las células regeneradas están cerca de ser clínicamente aplicables.
Esta solicitud también describe productos de células T para su uso en inmunoterapias dirigidas a varios antígenos. Por ejemplo, los linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos para un antígeno dado pueden ser inducirse a partir de células de un voluntario sano, las células T-iPS pueden establecerse a partir de los CTL y las células CD8SP pueden volver a generarse a partir de las células T-iPS. Se puede confirmar la función de las células CD8SP así regeneradas y a continuación, las células T-iPS se pueden almacenar para crear un banco de células T-iPS. Alternativamente, las células CD8SP regeneradas se pueden hacer proliferar y almacenar en alícuotas.
Como parte de la inmunoterapia descrita en la presente memoria, se puede determinar e1HLA del paciente con un cáncer que expresa el antígeno diana y se pueden elegir células T-iPS con HLA coincidente del banco de células T-iPS. A continuación, las células CD8SP se pueden volver a generar a partir de las células T-iPS de acuerdo con el método de la presente solicitud y se pueden utilizar para la inmunoterapia basada en células. Alternativamente, las células CD8SP adecuadas se pueden seleccionar a partir de las células regeneradas almacenadas. Con este último procedimiento, se puede iniciar más rápidamente una inmunoterapia basada en células.
En la inmunoterapia basada en células descrita en la presente solicitud, las células CD8SP inducidas se dispersan en un medio adecuado tal como solución salina o PBS y la dispersión se puede administrar a un paciente que tenga
un cierto nivel de coincidencia de HLA con el donante. El nivel de compatibilidad del donante y el paciente puede coincidir completamente. Cuando el donante es homocigoto para el haplotipo HLA (en lo sucesivo denominado "haplotipo HLA homo") y el paciente es heterocigoto para el haplotipo HLA (en adelante denominado " haplotipo HLA hetero"), uno de los haplotipos HLA del paciente debe coincidir con el haplotipo HLA homocigoto del donante. Las células se pueden administrar por vía intravenosa. La cantidad de células que se deben administrar no está limitada. Las células que se han diferenciado en células T maduras se pueden administrar por vía intravenosa una o varias veces en una cantidad de 106-107 células/kg de peso corporal por administración.
Un proyecto para construir un banco de células iPS versátil está ahora en progreso en Japón utilizando un ser humano que tiene un haplotipo HLA frecuente en homocigotos como donante. Véase, CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139 (2012).
En un ejemplo en el que las células CD8SP para el método de inmunoterapia basado en células se establecen de acuerdo con el método de la presente solicitud, las células iPS que se inducen a partir de células derivadas de dicho donante homocigoto para el haplotipo HLA se utilizan de forma particularmente preferida como células madre pluripotentes.
En la inmunoterapia descrita en la presente memoria, el número de células que se debe administrar no está limitado y se puede determinar basándose, por ejemplo, en la edad, el sexo, la altura y el peso corporal del paciente y la enfermedad y afecciones que se vayan a tratar. El número de células óptimo se puede determinar mediante estudios clínicos. Las células T se pueden dirigir a varios antígenos y, por lo tanto, en un ejemplo, el método de esta solicitud se puede aplicar para una inmunoterapia basada en células contra diversas enfermedades que incluyen cánceres, enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunitarias y alergias.
Ejemplo de Referencia 1
Establecimiento de células iPS
Preparación de células mononucleares de sangre periférica, línea celular LCL auto y línea celular CIR-A*24:02 Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un voluntario sano que tenía HLA-A*24:02, y se aislaron células mononucleares de médula ósea de un paciente con leucemia según el procedimiento convencional. Los linfocitos B de sangre periférica se transformaron con el virus de Epstein Barr (EBV) para proporcionar una línea celular linfoblastoide B autóloga (auto). El gen HLA-A*24:02 se introdujo en células C1R de la línea celular LCL humana, para proporcionar la línea celular C1R-A*24:02 que expresa únicamente HLA A*24:02.
Proliferación de CTL específicos de péptidos LMP2 y WT1
Las PBMC obtenidas del voluntario sano (2,5x105 células) se añadieron a cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos y se incubaron en medio RPMI 1640 al que se le añadieron suero AB humano al 10% (Sigma), mezcla disolvente de penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 |jg/ml) (Nacalaitesque) y 10 pg/mL de un péptido sintético específico de LMP2 (TYGPVFMSL: SEQ ID NO. 1) o un péptido sintético específico de WT1 (CYTWNQMNL: SEQ ID NO. 2) (Eurofins) (Tsuboi, A et al. (2002) Cancer Immunol Immunother. 51, 614-620). Dos días después de la incubación, se añadieron a cada pocillo IL-2 recombinante (12,5 U/ml) (Peprotech), IL-7 (10 ng/ml) (Peprotech) e IL-21 (30 ng/ml) (Peprotech).
Se aislaron células T positivas para CD8 que contenían CTL específicos de antígeno mediante el procedimiento de tinción con tetrámero. Las células positivas para CD8 aisladas se cultivaron conjuntamente con lCl positivas para HLA-A*24:02 incubadas previamente en presencia de 100 nM del péptido sintético específico de LMP2 o WT1 y se irradiaron. La mezcla de células se incubó durante 2 días y a continuación se le añadió la misma concentración de IL-2, IL-7 e IL-21 que antes. Los CTL proliferaron estimulando las células con las LCL cada dos semanas. Los CTL así obtenidos se denominan "CTL originales".
Establecimiento de LMP o iPSC específicas de WT1.
Las células T-iPS específicas del antígeno del cáncer se establecieron de acuerdo con un protocolo ligeramente modificado del descrito en la Bibliografía No Relacionada con Patentes 1. Brevemente, los CTL específicos del antígeno del cáncer se enriquecieron con microesferas CD8 (Milteny Biotec) o clasificador de células FACSAria III (BD Biociencias). Los CTL específicos del antígeno del cáncer enriquecidos (1 x 106 células) se transfectaron con un vector de virus Sendai que portaba los cuatro factores de Yamanaka y el antígeno T grande de SV40 (LTa) (Addgene) (MOI MOI = 3) (Nishimura, K. et al., (2011) J Biol Chem 286, 4760-4771). Después de la infección con centrifugación, las células transformadas se inocularon en las células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y se incubaron en un medio de células T, es decir, medio RMPI-1640 con un suplemento de IL-7 (10 ng/ml) e IL-21 (30 ng/mL). El día 2, la mitad del medio se reemplazó por un medio para células iPS humanas, es decir, medio de Eagle modificado por Dulbecco con un suplemento de 20% de KnockOut™ Serum Replacement (Gibco), aminoácidos no esenciales (0,1 mM) Gibco), 2- mercaptoetanol (suplemento sanguíneo mM) (Nacalai Tesque) y factor básico de crecimiento de fibroblastos (5 ng/mL) (Wako). Las colonias comenzaron a aparecer entre los días 21 y 35. Cada una de las colonias se recogió y se hizo que proliferara.
Se seleccionó cada uno de los clones de células T-iPS establecidos a partir de las células T específicas de LMP2 y a partir de los CTLS específicos de WT1 y se sometió a los siguientes experimentos. Las colonias se representan como "células T-iPS contra LMP2" y "células T-iPS contra WT1", respectivamente.
Ejemplo de Referencia 2
Inducción de las células T-iPS a células CD8SP por medio de un procedimiento convencional
Las células LMP-T-iPS obtenidas en el Ejemplo de referencia 1 se indujeron a células T de acuerdo con el protocolo enseñado en la Bibliografía No Relacionada con Patentes 1. Hasta el día 35 de la inducción, el procedimiento fue el mismo que el del Ejemplo 1 que se muestra a continuación. El día 35 de la inducción, las células se sometieron a análisis FACS. En el cultivo celular que comprendía las células T específicas del antígeno LMP2, la proporción de células DP fue de 12,0% y el de células DN fue de 68,0% (Figura 1). El cultivo celular se incubó bajo la estimulación del anticuerpo anti-CD3 durante 6 días para proporcionar un cultivo celular que contenía 68,9% de células CD8SP. Las células CD8SP obtenidas eran específicas para el tetrámero de LMP2 y casi todas eran células T de tipo homodímero CD8aa (Figura 2). Se confirmó que los genes que codifican el TCR de las células obtenidas eran idénticos a los del CTL específico de LMP2 original (datos no mostrados). En lo sucesivo, las células así obtenidas se denominan "CTL regenerados".
Las actividades citotóxicas específicas de péptido de los CTL específicos de LMP2 originales y los CTL regenerados se determinaron utilizando células THP1 pulsadas con péptido LMP2, es decir, células de una línea celular de leucemia humana positiva HLA A*24:02. Los CTL y la línea celular de leucemia se mezclaron para que la razón Efector:Diana (E:D) fuera de 0:1, 1:9, 1:3, 1:1, 3:1 y 9:1 y las células mezcladas se incubado a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 6 horas. Las actividades citotóxicas se evaluaron basándose en la razón de células positivas a Anexina V. Los resultados se muestran en las Figuras 3 y 4. Además, las actividades citotóxicas de ambas células cuando la razón ET era 3:1 se muestran en la Figura 5. La actividad citotóxica específica de péptido de los CTL regenerados fue aproximadamente 1/100 de los CTL originales.
Además, se evaluó la actividad citotóxica similar a la de las células NK de los CTL regenerados contra las células K562. El resultado se muestra en la Figura 6. Se había confirmado que los CTL regenerados tenían una actividad citotóxica similar a la de las células NK relativamente alta.
Ejemplo 1
Se utilizó el clon de células T-iPS contra LMP2 obtenido en el ejemplo de referencia 1. Las células T se volvieron a generar a partir de las células T-iPS de acuerdo con el procedimiento explicado en la Figura 7.
1) Diferenciación de células T-iPS en una población celular que comprende células DP y células DN.
Los medios utilizados son los siguientes:
[Tabla 1]
Medio A: para el mantenimiento de las células estromales OP9
contenido cantidad añadida conc. final Medio aMEM 500 mL
FCS 125 mL 20%
solución de penicilina-estreptomicina * 6,25 mL 1%
Total 631,25 mL
* Mezcla de Penicilina (10.000 U/ml) y Estreptomicina (10.000 pg/ml). Las concentraciones finales fueron de 100 U/mL y 100 pg/ml, respectivamente.
[Tabla 2]
Medio B: para inducir la diferenciación de las células T No. 1
contenido cantidad añadida conc. final Medio A 50 mL
hrIL-7 (provisión de partida: 10 pg/mL) 25 pL 5 ng/mL hrFlT-3L (provisión de partida: 10 pg/mL) 25 pL 5 ng/mL hrSCF (provisión de partida: 10 pg/mL) 25 pL 5 ng/mL
Total 50,75 mL
* Mezcla de Penicilina (10.000 U/ml) y Estreptomicina (10.000 pg/ml). Las concentraciones finales fueron de 100 U/mL y 100 pg/ml, respectivamente.
[Tabla 3]
Medio C: para inducir de células T inmaduras a T maduras
células
contenido cantidad añadida conc. final medio A 50 mL
hrIL-7 (provisión de partida: 10 pg/mL) 25 pL 5 ng/mL hrFlT-3L (provisión de partida: 10 pg/mL) 2,5 pL 0,5 ng/mL hrSCF (provisión de partida: 10 pg/mL) 2,5 pL 0,5 ng/mL Total 50,03 mL
* Mezcla o Penicilina (10.000 U/ml) y Estreptomicina (10.000 pg/ml). Las concentraciones finales fueron de 100 U/mL y 100 pg/ml, respectivamente.
Preparación de células OP9
Se añadieron cinco mililitros (5 mL) de solución de gelatina al 0,1% en PBS a una placa de 10 cm (Falcon) y se incubó durante 30 minutos a 37°C. Las células estromales OP9 se desprendieron de una placa de cultivo confluente con una solución de tripsina/EDTA y se añadió aproximadamente 1/4 de las células obtenidas a la placa de cultivo celular de 10 cm recubierta con gelatina. Se añadieron 10 mL de medio A a la placa de cultivo celular.
Cuatro días después, se añadieron a la placa 10 mL de medio A (la cantidad final fue de 20 mL).
Preparación de células OP9/DLL1 en placa de 24 pocillos
Las células OP9/DLL1 se desprendieron separaron de una placa de cultivo confluente con solución de tripsina/EDTA y se suspendió aproximadamente 1/4 de las células obtenidas en 12 mL de medio A y se sembraron 0,5 mL de la suspensión en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Dos días después de la siembra, la placa se utilizó como placa de cultivo de células OP9/DLL1.
Inducción de células T-iPS a células progenitoras hematopoyéticas.
Las colonias de células iPS se separaron de la placa de cultivo de células T-iPS (placa de 6 cm) con una solución de desprendimiento y se fragmentaron mecánicamente a tamaños más pequeños mediante pipeteo. A continuación, las masas de células fragmentadas se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sedimento obtenido se suspendió en 10 mL de medio A. Las masas de células iPS fragmentadas obtenidas de una placa de 6 cm se sembraron en la placa de células OP9 preparada previamente.
Día 1: (se reemplazó el medio)
Se confirmó si las masas de células iPS se adhirieron a la placa y comenzaron a diferenciarse. El medio de cultivo celular se reemplazó por 20 mL de medio A de nueva aportación.
Día 5: (se reemplazó la mitad del medio)
La mitad del medio de cultivo celular se reemplazó por 10 mL de medio A de nueva aportación.
Día 9: (se reemplazó la mitad del medio)
La mitad del medio de cultivo celular se reemplazó por 10 mL de medio A de nueva aportación.
Día 13: (Las células mesodérmicas inducidas se transfirieron de la capa de células OP9 a la capa de células OP9/DLL1)
El medio de cultivo celular se aspiró para eliminarlo y la superficie de las células cultivadas se lavó con HBSS (+Mg+Ca) para lavar el medio de cultivo celular. Se añadieron a la placa 6 mL de colagenasa IV 250U en solución de HBSS (+Mg+Ca) y se incubó durante 45 minutos a 37°C.
La solución de colagenasa se eliminó por aspiración y las células se lavaron con 10 mL de PBS(-). A continuación, se añadieron a la placa 2 mL de solución de tripsina/EDTA al 0,05% y la placa se incubó durante 25 minutos a 37°C. Después de la incubación, los agregados celulares en forma de hoja se despegaron del fondo del plato y los agregados celulares se fragmentaron mecánicamente a tamaños más pequeños mediante pipeteo. A las células así tratadas se les añadieron 8 mL de medio A de nueva aportacion y se cultivaron durante más de 45 minutos a 37°C.
El medio de cultivo que contenía las células flotantes se pasó a través de una malla de 70 pm y se recogieron las células. A continuación, las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sedimento obtenido se suspendió en 10 mL de medio B. Se separó una quinta parte de la suspensión y se usó para el análisis FACS. La suspensión de células restante se sembró en nuevas placas que contenían células OP9/DLL1. Se combinaron las suspensiones de células obtenidas de varias placas y las células reunidas se sembraron en el mismo número de placas nuevas.
Para determinar si las células progenitoras hematopoyéticas estaban o no contenidas en las células obtenidas, se llevó a cabo un análisis FACS utilizando anticuerpo anti-CD34 y anticuerpo anti-CD43. Cuando se pudo confirmar un número suficiente de células en la fracción de células CD34lowCD43+, se determinó que se indujeron células progenitoras hematopoyéticas (Figura 8).
Día 15: (Se subcultivaron las células)
Las células adheridas débilmente a las células OP9 se disociaron pipeteando suavemente varias veces y se recogieron en un tubo cónico de 50 mL. El tubo se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sedimento se dispersó en 10 mL de medio B. La suspensión celular así preparada se sembró sobre las células OP9/DLL1 recién preparadas. Las suspensiones de células obtenidas de 2-3 placas de 10 cm se agruparon en una placa.
Día 22: (Se subcultivaron las células) Comenzaron a aparecer colonias de células sanguíneas.
Las células adheridas débilmente a las células OP9/DLL1 se disociaron pipeteando suavemente varias veces y se recogieron en un tubo cónico de 50 mL. El tubo se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sedimento se dispersó en 10 mL de medio B y se sembró sobre las células OP9/DLL1 recién preparadas.
Día 29: (Las células se subcultivaron)
Las células adheridas débilmente a las células OP9/DLL1 se disociaron pipeteando suavemente varias veces y se recogieron en un tubo cónico de 50 mL. El tubo se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sedimento se dispersó en 10 mL de medio C y se sembró sobre las células OP9/DLL1 recién preparadas.
Día 36: (las células se subcultivaron)
Las células adheridas débilmente a las células OP9/DLL1 se disociaron pipeteando suavemente varias veces y se recogieron en un tubo cónico de 50 mL. El tubo se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sedimento se dispersó en 10 mL de medio C y se sembró sobre las células OP9/DLL1 recién preparadas.
Enriquecimiento de células DP (Eliminación de células DN y células CD8SP)
Se utilizaron los siguientes medios:
[Tabla 4]
Tampón MACS conc. final
PBS 50 mL
BSA (provisión de partida: 10%) 500 pL (0,1%) 
Total 50,5 mL
[Tabla 5]
Medio D para la diferenciación en células CD8SP
conc. final
medio A 50 mL
hrIL-7 (provisión de partida: 10 pg/ml) 25 pL 5 ng/mL hrIL-2 (provisión de partida: 10000U/ml) 50 pL 100 U/mL
CD3Ab (provisión de partida: 1 mg/ml) 0,75 pL 15 ng/mL
Total 50,07575 mL
Día 40: Enriquecimiento de células DP (Eliminación de células DN y células CD8SP)
Las células adheridas débilmente a las células OP9/DLL1 se disociaron pipeteando suavemente varias veces y se recogieron en un tubo cónico de 50 mL. El tubo se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sedimento se dispersó en 180 pl de tampón MACS. Se añadieron 20 pl de cuentas MACS unidas al anticuerpo anti-CD4 y se incubaron durante 15 minutos a 4°C. Las células positivas para CD4 se recogieron de acuerdo con el protocolo MACS utilizando la columna MACS. Los patrones de CD4/CD8 de las células antes y después del enriquecimiento se analizaron mediante FACS. Los resultados se muestran en la Figura 9. Antes del enriquecimiento, el cultivo contenía 27,6% de células DP, 51,8% de células DN y 18,4% de células CD8SP y, después del enriquecimiento, se obtuvo un cultivo celular que contenía 96,3% de células DP, 0,263% de células DN y 0,072% de células CD8SP. Inducción de células CD8aPSP a partir de células en el cultivo de células DP enriquecido
El cultivo de células DP enriquecido se dispersó en medio D para proporcionar una suspensión celular a una concentración final de 5x105 células/mL. El medio de la placa de cultivo celular OP9/DLL1 preparada previamente se retiró por aspiración, se sembró 1 m/pocillo de la suspensión celular sobre la capa de células OP9/DLL1 y se incubó durante 6 días. Después de 6 días de incubación, las células se recogieron y se sometieron al análisis FACS. Los resultados se muestran en la Figura 10.
En el cultivo celular, el porcentaje de células CDSP fue de 95,3%. Las células CD8SP se sometieron a análisis FACS y se confirmó que 87,5% de las células CD8SP obtenidas eran células T de tipo CD8ap. En lo sucesivo, las células así obtenidas se denominan "células CD8apSP regeneradas".
Por otro lado, las células DN también se enriquecieron el día 40 para proporcionar un cultivo celular que contenía aproximadamente 99% de células DN. El cultivo de células DN enriquecido obtenido se estimuló con anticuerpo anti-CD3 durante 6 días de la misma manera que anteriormente. Como resultado, se obtuvieron células positivas para el tetrámero de LMP2, células CD8SP positivas para CD3. Sin embargo, aproximadamente 87% de las células CD8SP obtenidas eran células T de tipo CD8aa.
Proliferación de las células CD8aPSP regeneradas.
Las células CD8apSP regeneradas se hiceron proliferar mediante células presentadoras de antígeno (APC) que presentaban el antígeno LMP2.
[Tabla 6]
*2 medio E para la proliferación de células CD8SP
conc. final
medio A 50 mL
hrIL-7 (provisión de partida: 10 pg/ml) 50 pL 10 ng/mL
hrIL-21 (provisión de partida: 10 pg/ml) 100 pL 20 ng/mL)
Total 50,15 mL
Preparación de las células presentadoras de antígeno (APC)
Las LCL autólogas se incubaron en presencia del péptido antigénico LMP2: TYGPVFMSL (SEQ ID NO.1) y se utilizaron como APC. Las LCL se recogieron del frasco de cultivo y se irradiaron a una dosis de 50 Gy. Las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sedimento obtenido se dispersó en medio A para proporcionar 5x106 células/mL de suspensión celular. Se añadió el péptido para proporcionar las concentraciones finales de 10 nM y las células se incubaron durante 2 horas a 37°C.
Estimulación de las células CD8apSP regeneradas con APC
Las LCL con péptido añadido preparadas anteriormente se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sedimento obtenido se dispersó en medio A para proporcionar 4x105 células/mL de suspensión celular. Las células CD8apSP regeneradas también se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sedimento obtenido de células CD8apSP regeneradas se dispersó en x2 medio E para proporcionar una suspensión celular de 1x106 células/mL. Se cultivaron conjuntamente 0,5 mL de cada una de la suspensión de LCL estimuladas con péptido y la suspensión de células CD8apSP.
Los patrones FACS de las células el día 14 del cocultivo se muestran en la Figura 11. A partir del día 7, el medio se reemplazó con el medio recién preparado y las células proliferaron estimulando las células cada 7-14 días. Los experimentos fueron 3 veces y las curvas de proliferación se muestran en la Figura 12.
La actividad citotóxica específica del antígeno de las células CD8apSP regeneradas se sometió a prueba de la misma manera que en el Ejemplo de Referencia 2. Los resultados se muestran en la Figura 13. Además, se compararon las actividades citotóxicas a la razón E:T de 3:1 de las células CD8apSP y los CTL originales. Los resultados se muestran en la Figura 13. Las células CD8apSP regeneradas o las células CTL CD8ap regeneradas ejercieron una actividad citotóxica específica de péptido comparativa con la de los CTL originales.
Ejemplo de Referencia 3
Cultivo conjunto de las células DP y las células DN
De acuerdo con el mismo protocolo que en el Ejemplo 1, las células del clon T-iPS contra LMP2 obtenido en el ejemplo de referencia 1 se incubaron hasta el día 40. El cultivo celular obtenido se clasificó en células DP y células DN. Las células DP y las células DN se marcaron con Cell Trance Violet y CFSE, respectivamente. La pureza tanto de la población de células DP como de la población de células DN fue superior a 99%. Se mezclaron 3*104 células DP con células DN para proporcionar una razón DP:DN de 1:0, 3:1, 1:1 y 1:3 y a continuación, se incubaron en presencia o ausencia de anticuerpo anti-CD3 durante 5 horas. Las células así obtenidas se tiñeron con Anexina V y PI (yoduro de propidio) y se determinó que la fracción celular negativa para anexina V y negativa para PI eran células viables. Las células viables entre las células positivas a Violeta, es decir, las células DP y las células viables entre las células DP al comienzo del cultivo conjunto se muestran en la Figura 14. Se mostró que las células DN destruyeron las células DP bajo la estimulación del anticuerpo anti-CD3.
Ejemplo 2
Actividad citotóxica específica del péptido WT1 de células CD8SP específicas de WT1
Se indujeron células CD8SP regeneradas a partir de células T-iPS contra WT1 obtenidas en el ejemplo de referencia 1. El día 40 de la diferenciación, se obtuvo un cultivo de células DP enriquecido que contenía 84,7% de células DP. El cultivo de células DP enriquecido obtenido fue estimulado por Ab contra CD3 para proporcionar un cultivo celular que contenía las células CD8SP regeneradas. El 89,2% de las células CD8SP en el cultivo de células CD8SP regeneradas así obtenido eran células T de tipo CD8ap. Se evaluó la actividad citotóxica específica de WT1 de las células CD8SP regeneradas.
Se incubó C1R A*24:02 (línea celular humana LCL) en presencia de diversas concentraciones del péptido WT1, CYTWNQMNL (SEQ ID NO. 2) durante 2 horas. Se recogieron células C1R A*24:02 de cada cultivo y se mezclaron con las células CD8SP para proporcionar una razón E:T de 0:1, 1:3, 1:1, 3:1 y 9:1. La mezcla de células se incubó durante 6 horas a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%. Después de eso, la actividad citotóxica se determinó mediante la razón de células positivas a Anexina V. Los resultados se muestran en la Figura 15.
La actividad citotóxica aumentó dependiendo de la concentración de péptido y el número de células. Se confirmó que las células CD8SP regeneradas tenían actividad citotóxica específica del antígeno WT 1.
La actividad citotóxica de las células CD8SP regeneradas se comparó con la de los CTL específicos de WT1 originales. Los resultados se muestran en la Figura 16. Las células CD8SP regeneradas ejercían una actividad citotóxica específica del péptido WT1 en comparación con la de los CTL originales. En los siguientes Ejemplos 3-5, las células CD8SP regeneradas se denominan "CTL regenerados".
Ejemplo 3
Actividad citotóxica específica de TCR de células CD8SP específicas de WT1
(frente a la línea celular de leucemia)
Se evaluaron las actividades citotóxicas de los CTL regenerados obtenidos en el Ejemplo 2 contra células leucémicas que expresan WT1 de líneas celulares leucémicas que expresan WT1 endógenamente.
Se utilizaron líneas celulares HL60 y THP1 que expresan la proteína WT1 endógenamente y derivadas de pacientes positivos para HLA A*24:02 para determinar la actividad citotóxica in vitro de los CTL regenerados. Para confirmar si la actividad citotóxica observada es específica de TCR, las células de la línea celular de leucemia se incubaron previamente en presencia de 10 ng/mL de un anticuerpo inhibidor de HLA-1 (clon W6/32) durante 1 hora y a continuación, se incubaron conjuntamente con las células CD8SP regeneradas (control negativo). Los CTL regenerados y las células de leucemia se mezclaron para que la razón fuera 0:1, 1:3, 3:1 y 9:1 y se incubaron a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 6 horas. Las actividades citotóxicas se determinaron basándose en las células positivas a Anexina V. Los resultados se muestran en la Figura 17.
La actividad citotóxica aumentó de una manera dependiente del número de células para cualquier línea celular de leucemia. Por otro lado, la actividad citotóxica fue inhibida por el anticuerpo inhibidor de HLA-1. Basándose en los resultados, los CTL regenerados inducidos a partir de células T iPS contra WT1 ejercen una actividad citotóxica específica de TCR contra el antígeno WT1 endógeno.
Ejemplo 4
Actividad citotóxica específica de TCR de células CD8SP específicas de WT1 (frente a cultivo de células de leucemia primaria)
la actividad citotóxica de los CTL regenerados obtenidos en el Ejemplo 2 contra el cultivo primario de células leucémicas asociadas con una alta expresión de WT1 derivada de un paciente positivo para HLA A*24:02 se determinó de la misma manera que en el Ejemplo 3. Con el fin de confirmar si la actividad citotóxica observada es específica de TCR, las células de la línea celular de leucemia se incubaron previamente en presencia de 10 ng/mL de un anticuerpo inhibidor de HLA-1 (clon W6/32) durante 1 hora y a continuación, se co-incubaron con las células CD8SP regeneradas (control negativo). Como células de leucemia primarias, se utilizaron tres tipos de células de leucemia asociadas con una alta expresión de WT1. Los CTL regenerados y las células de leucemia se mezclaron para que la razón fuera 0:1, 1:3, 3:1 y 9:1 y se incubaron a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 6 horas. Las actividades citotóxicas se determinaron basándose en las células positivas a Anexina V. Los resultados se muestran en la Figura 18.
La actividad citotóxica aumentó de una manera dependiente del número de células para cualquier célula leucémica. Por otro lado, la actividad citotóxica fue inhibida por el anticuerpo inhibidor de HLA-1. Basándose en los resultados, los CTL regenerados inducidos a partir de células T-iPS contra WT1 ejercen una actividad citotóxica específica de TCR contra las células de leucemia primaria derivadas de un paciente.
Ejemplo 5
Función de los CTL regenerados evaluados in vivo utilizando un sistema de heteroinjerto de ratones
El esquema de los procedimientos de este ejemplo se muestra en la Figura 19. Se utilizaron ratones inmunodeficientes NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/Jic (NOG) adquiridos del Instituto Central de Animales Experimentales (Kawasaki, Japón). Se suspendieron 2 * 104 células de la línea celular de leucemia humana HL60 con alta expresión de WT1, positivas para HLA A*24:02 y positivas para CD3, en PBS y se inocularon intraperitonealmente a los ratones (día 0). Los días 1, 8, 15 y 22, se administraron intraperitonealmente a los ratones PBS (control) o las células CD8SP regeneradas (CTL regenerados), 5 * 106 células por administración. Los experimentos se realizaron con 5 animales por grupo. Para mantener vivas las células SD8SP, se administraron intraperitonealmente IL-2 e IL-73 veces por semana durante 4 semanas. La sangre periférica se recogió el día 37 y el día 57 y se confirmó la presencia de las células tumorales o células positivas para CD33 así como las células positivas para CTL o CD8 regeneradas en la sangre periférica. Además, se confirmó el tiempo de supervivencia de los ratones. Los resultados se muestran en las Figuras 20 y 21.
Como se muestra en la Figura 20, se observaron células tumorales en la sangre periférica del ratón de control que había recibido PBS mientras que no se observaron células T CD8 en la sangre periférica del ratón de control. Por otro lado, se confirmó la transferencia de las células T CD8 en la sangre en los ratones que recibieron los CTL regenerados, mientras que no se observó ninguna célula tumoral en la sangre periférica. El tiempo de supervivencia de los ratones que recibieron los CTL regenerados fue significativamente más largo que el de los ratones de control. Una vez completado el experimento, se diseccionaron todos los ratones para examinar el daño del tejido. En los ratones que recibieron CTL regenerados, no se observó daño tisular.
Ejemplo 6
Inducción de células CD8SP a partir de células iPS con TCR específicas del péptido WT1
Establecimiento de células iPS en las que se introduce TCR específico del antígeno WT1
Las células iPS originales utilizadas aquí fueron células iPS establecidas a partir de células mononucleares que tienen un haplotipo HLA que es el segundo más frecuente en los japoneses en homocigotos preparadas en el Departamento de Inmunología, Instituto de Ciencias Medicinales Fronterizas, Universidad de Kyoto, Kyoto, Japón. Las células iPS que portan los genes TCR específicos del péptido WT1 se prepararon mediante el protocolo descrito en el documento WO2016/010154. Los genes de TCR específicos del péptido WT1, como se emplea en la presente memoria, se clonaron a partir de los CTL específicos de WT1 regenerados descritos en el Ejemplo 2. En lo sucesivo, el TCR introducido se denomina "TCR para WT1".
1) Preparación de vector lentiviral que contiene TCR para WT 1
El vector CS-UbC-RfA-IRES2-Venus se obtuvo de Subteam for Manipulation of Cell Fate, RIKEN BioResource Center, Tsukuba, Ibaraki, Japón. Los genes WT-TCR se incorporaron en el vector con el sistema Gateway para proporcionar CS-UbC-RfA-IRES2-Venus/TCR para WT 1.
2) Obtención de sobrenadante de lentivirus con TCR para WT1 incorporado
Se introdujo CS-UbC-RfA-IRES2-Venus/TCR para WT1 en células de empaquetamiento LentiX-293T con X-treamGENE9 (Roche). El medio se cambió al día siguiente y el día 2, se recogió el sobrenadante del cultivo y se utilizó como sobrenadante lentiviral.
3) Establecimiento de células T-iPS transducidas con TCR para WT1
Las células iPS se trataron con Tryp LE Select (Life Technologies) para proporcionar una suspensión completamente unicelular. La suspensión se centrifugó y el sedimento se dispersó mediante el sobrenadante lentiviral, y a continuación, la suspensión obtenida se centrifugó a 3000 rpm a 30°C durante una hora para que las células iPS se infectaran y se introdujera el TCR para WT1 en las células iPS.
Después de la infección, las células se suspendieron en el medio para células iPS y se sembraron sobre las células alimentadoras. Las células iPS en las que se introdujo TCR para WT1 (células iPS con TCR para WT1) se seleccionaron fluoroscópicamente basándose en la expresión de la proteína Venus incluida en el vector. Los clones se establecieron independientemente de las células seleccionadas.
Uno de esos clones se seleccionó y se sometió a los experimentos que se muestran a continuación. En adelante, las células iPS obtenidas mediante la introducción de TCR se denominan "células iPS con TCR".
Las células iPS con TCR así obtenidas se diferenciaron de la misma manera que en el Ejemplo 1 (Figura 7) para proporcionar un cultivo celular que comprendía células DP y células DN (Figura 22). El cultivo celular contenía 79,1% de células DP, 12,0% de células DN y 6,6% de células CD8SP. Las células DP se enriquecieron utilizando cuentas MACS. El cultivo de células DP enriquecido se indujo en células SP CD8 de la misma manera que en el Ejemplo 1 con la excepción de que se utilizó medio D' en lugar de Medio D.
[TABLA 7]
Medio D' para la diferenciación en células CD8SP
conc. final
medio A 50 mL
hrIL-7 (provisión de partida: 10 pg/ml) 25 pL 5 ng/mL
hrIL-2 (provisión de partida: 10000U/ml) 50 pL 100 U/mL
CD3Ab (provisión de partida: 1 mg/ml) 3 pL 60 ng/mL
Total 50,078mL
Claims (15)
1. Un método para inducir células T CD4-CD8+ a partir de células madre pluripotentes, que comprenden las siguientes etapas (1), (2) y (3),
(1) diferenciar las células madre pluripotentes para proporcionar un cultivo celular que comprende células T CD4-CD8- y células T CD4+CD8+,
(2) eliminar las células CD4-CD8- y las células CD4-CD8+ del cultivo celular obtenido en la etapa (1), y (3) diferenciar las células CD4+CD8+ en el cultivo celular obtenido en la etapa (2) en células T CD4-CD8+; o las siguientes etapas (1) y (2'):
(1) diferenciar las células madre pluripotentes para proporcionar un cultivo celular que comprende células T CD4-CD8" y células T y CD4+CD8+, (2') diferenciar las células T CD4+CD8+ en el cultivo celular obtenido en (1) en células T CD4"CD8+ en presencia de una sustancia que inhibe la actividad citotóxica de las células T CD4"CD8"
en donde el antígeno CD8 de las células T CD4"CD8+ es un heterodímero compuesto por cadenas CD8a y CD8p. 2. El método según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas de:
(1) diferenciar las células madre pluripotentes para proporcionar un cultivo celular que comprende células T CD4"CD8" y células T CD4+CD8+,
(2) retirar las células CD4"CD8" y las células CD4-CD8+ del cultivo celular obtenido en la etapa (1), y (3) diferenciar las células CD4+CD8+ en el cultivo celular obtenido en la etapa (2) en células T CD4-CD8+.
3. El método según la reivindicación 1, en donde las células CD4-CD8+ con un antígeno CD8 que es un homodímero de la cadena CD8a se eliminan del cultivo celular en la etapa (2).
4. El método según la reivindicación 2 o 3, en donde el cultivo celular obtenido en la etapa (2) no contiene sustancialmente células T CD4-CD8.
5. El método según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:
(1) diferenciar las células madre pluripotentes para proporcionar un cultivo celular que comprende células T c D4‘CD8‘ y células T CD4+CD8+, (2') diferenciar las células T CD4+CD8+ en el cultivo celular obtenido en (1) en células T CD4-CD8+ en presencia de una sustancia que inhibe la actividad citotóxica de las células T CD4-CD8-.
6. El método según la reivindicación 5, en donde la sustancia que inhibe la actividad citotóxica de las células T CD4-CD8- se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de perforina, un inhibidor de granzima, un inhibidor de la ruta Fas, un inhibidor de caspasa y un anticuerpo inhibidor contra el receptor activador de Células Asesinas Naturales.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las células madre pluripotentes son células iPS.
8. El método según la reivindicación 7, en donde las células madre pluripotentes son células iPS homocigotas para el haplotipo HLA.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde las células madre pluripotentes portan genes reordenados que codifican un receptor de células T o un receptor de antígeno quimérico específico para un antígeno deseado y se inducen células T CD4'CD8+ que tienen una actividad citotóxica específica para el antígeno.
10. El método según la reivindicación 9, en donde las células madre pluripotentes son células T-iPS inducidas a partir de células T humanas que portan genes reordenados que codifican un receptor de células T específico para el antígeno deseado.
11. El método según la reivindicación 9, en donde las células madre pluripotentes son células iPS con TCR obtenidas mediante la introducción de genes reordenados que codifican un receptor de células T específico para el antígeno deseado en células T humanas.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde la etapa de diferenciación de células CD4+CD8+ en células T CD4-CD8+ se realiza activando directamente cualquiera de las vías de activación que se producen tras la estimulación del receptor de células T, tal como por ejemplo
estimulando las células con un anticuerpo anti-CD3,
estimulando las células con el antígeno deseado, tal como por ejemplo, estimulando las células con células presentadoras de antígeno que presentan el antígeno deseado, o
estimulando las células con el antígeno diana del receptor de antígeno quimérico.
13. Un método para establecer células T CD4-CD8+ que tienen actividad citotóxica específica para un antígeno deseado a partir de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
inducir células T CD4-CD8+ a partir de las células madre pluripotentes mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y
introducir un receptor de células T o un receptor de antígeno quimérico específico para el antígeno deseado en las células T CD4-CD8+ inducidas.
14. El método según la reivindicación 13, que comprende adicionalmente la etapa de hacer proliferar las células T CD4"CD8+ obtenidas que tienen actividad citotóxica específica para el antígeno deseado.
15. El método según la reivindicación 14, en donde la etapa de hacer proliferar las células T CD4"CD8+ obtenidas se realiza activando directamente cualquier parte de la vía de activación que se produce al estimular un receptor de células T, tal como por ejemplo:
estimulando las células con un anticuerpo anti-CD3,
estimulando las células con el antígeno deseado, tal como por ejemplo, estimulando las células con células presentadoras de antígeno que presentan el antígeno deseado, o
estimulando las células con el antígeno diana del receptor de antígeno quimérico.
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