ES2886572T3 - Método para glicosilación de molécula pequeña - Google Patents

Abstract

Un método para producir ácido 2-O-α-D-glucopiranosil-L-ascórbico que comprende las etapas secuenciales de: a. proveer una mezcla que comprende un donador glucosilo y un aceptor glucosilo; b. incubar dicha mezcla con una sacarosa fosforilasa; c. mantener el pH en el intervalo de pH 4,8 a 5,5 durante la incubación; d. opcionalmente dosificar un donador glicosilo adicional y/o sacarosa fosforilasa durante la reacción; y e. aislar y/o purificar ácido 2-O-α -D-glucopiranosil-L-ascórbico; en donde dicho donador glucosilo es glucosa 1-fosfato o sacarosa; y en donde dicho aceptor glucosilo es ácido ascórbico.

Description

d es c r ip c ió n

Método para glicosilación de molécula pequeña

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el método para la producción de ácido 2-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico mediado por sacarosa fosforilasa.

Antecedentes de la invención

El ácido 2-0-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico (AA-2G) es una forma altamente estable de todos los derivados de ácido L-ascórbico conocidas. La modificación del grupo hidroxilo en la posición 2 del ácido L-ascórbico (responsable de su actividad biológica y estabilidad) tiene la estabilidad significativamente mejorada del ácido L-ascórbico (L-AA). La glicosilación del grupo hidroxilo en la posición 2 del ácido L-ascórbico ofrece muchas ventajas sobre otros derivados tales como derivados de fosfato y de sulfato. Las otras isoformas de los glucósidos de L-AA esto es ácido 3-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico (AA-3G), ácido 5-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico (AA-5G) y ácido 6-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico (AA-6G) se han sintetizado, pero ninguna de estas mostró tan buena estabilidad como el AA-2G.

a. AA-2G es una forma extremadamente inerte sin que muestre ninguna actividad biológica y reduce la potencia y, de este modo, posee extremada estabilidad física y química.

b. Las propiedades del ácido L-ascórbico se revelan cuando el AA-2G se hidroliza en ácido L-ascórbico y D-glucosa por la acción de la enzima a -glucosidasa secretada por organismos vivos y presenta actividades biológicas inherentes al ácido L-ascórbico.

c. Se ha comprobado que el AA-2G se sintetiza y metaboliza in vivo bajo algunas condiciones específicas. Por lo tanto, se reconoce al AA-2G como la forma más segura de L-AA altamente estabilizado.

d. Debido a su alta solubilidad en agua y sustancias oleosas, el AA-2G se usa favorablemente en formulaciones orales y tópicas como complemento de vitamina C.

Las glicosiltransferasas (GT) son las enzimas responsables de la síntesis de glicósidos en la naturaleza considerando que las glicosilhidrolasas (GH) han evolucionado para degradarlos. Tanto las glicosiltransferasas como las glicosilhidrolasas se han usado exitosamente para la producción de una amplia variedad de glicósidos. Estas enzimas también se han usado en la síntesis enzimática del AA-2G.

Las a -glucosidasas de intestino de rata y de semillas de arroz, que pertenecen a GH, han producido AA-2G cuando la maltosa y el L-AA se han usado como sustrato donador y aceptor respectivamente. Pero estas dos enzimas siempre producen inevitablemente las isoformas AA-6G, AA-5G junto con AA-2G. Las enzimas producen solo un glucósido usando maltosa barata como sustrato donador que es interesante para aplicaciones comerciales pero que las enzimas no están disponibles de forma barata y la presencia de isoformas produce dificultades en el aislamiento y purificación de AA-2G. El a -glucosidasa de A. niger ha producido la mayor parte de AA-6G y muy poco de AA-2G.

La ciclodextrin glucanotransferasa (CGTasa), que pertenece a las GT, es otra enzima bien estudiada para la producción a gran escala de AA-2G. El documento EP0425066 divulga un proceso para producir AA-2G, que se puede llevar a cabo a escala industrial permitiendo que una enzima de transferencia de sacárido tal como la CGTasa actúe en una solución que contiene ácido L-ascórbico y un sacárido a -glucosilo para formar AA-2G y subproductos. Cuando la CGTasa se usa junto con ciclodextrina (el sustrato donador más preferido) o almidón como un sustrato donador se formaron inevitablemente muchos subproductos AA-2-maltooligosacáridos debido a la transferencia de todo o parte del maltooligosacárido linealizado al L-AA. Los muchos subproductos generados que tienen diferentes grados de polimerización fueron reducidos más a AA-2G con tratamiento adicional de glucoamilasa. El uso de CGTasa siempre produjo otras isoformas tales como AA-3G y AA-6G en cantidades relativamente menores. La presencia de estas isoformas introdujo de nuevo complicaciones en el proceso cuesta abajo especialmente en la separación de AA-2G de otras isoformas. Las CGTasas fueron diseñadas para aceptar la maltosa como sustrato donador para evitar la formación de muchos subproductos y el tratamiento de glucoamilasa adicional, pero se logró poco éxito y los rendimientos no fueron nada atractivos (Han et al. referencias).

El documento WO2004013344 da a conocer un proceso para producir AA-2G usando a- isomaltosil glucosacárido que forma la enzima (IMG) de Arthrobacter globiformis donde no se forma AA-5G o AA-6G o se forma en una cantidad tan pequeña que la formación de estos no puede ser detectada (<0,1 % p/p en base sólida seca). En este proceso la IMG se usó como una enzima transglicosilante junto con la CGTasa y el hidrolizado parcial de almidón como sustrato donador (para romper el almidón en oligosacáridos). La combinación de estas dos enzimas mejoró el rendimiento y redujo la formación de los contenidos de AA-5G y AA-6G por debajo de 0,1 %. Sin embargo, no se evitó la formación de muchos subproductos. Los subproductos se trataron adicionalmente con glucoamilasa para convertirlos en AA-2G. De este modo, este sistema necesitó en total 3 enzimas para correr eficientemente el proceso completo.

Los métodos enzimáticos actualmente disponibles pueden producir AA-2G a gran escala. La presencia de muchos subproductos y de diferentes isoformas al final de la reacción son aún cuellos de botella en el proceso completo y están interfiriendo en el aislamiento y purificación de AA-2G. Los subproductos se pueden convertir en AA-2G por tratamiento de glucoamilasa y el AA-2G se puede separar fácilmente de L-AA y glucosa usando resina de intercambio de cationes fuertemente ácida. Sin embargo, las isoformas AA-5G y AA-6G formadas junto con AA-2G difícilmente se separan debido a su similitud en solubilidades y propiedades cromatográficas. El documento EP0539196 ha divulgado un método de separación de AA-5G y AA-6G de AA-2G utilizando de forma ventajosa sus oxidabilidades que se originan a partir de sus poderes reductores. Este proceso necesita un control exacto de la condición de reacción para solo oxidar el AA-5G y AA-6G, pero no permite un exceso de oxidación que pueda afectar al AA-2G resultando en un rendimiento reducido de AA-2G. El documento WO 2014/060452 divulga un método para producir AA-2G bajo diferentes condiciones. Taeyeon Kwon et al., Biotechnology letters, Springer Netherlands, Dordrecht, vol. 29, no. 4, 10 January 2007, pages 611-615, divulga la posibilidad de producir AA-2G en una etapa de L-AA y sacarosa usando recombinantemente Bifidobacterium longum SPasa a un pH de 7,5, que no es favorable para la transferencia de glicosilo a L-AA. Dirk Aerts et al., Carbohydrate Research, Pergamon, ^g B, vol. 346, no. 13, 20 June 2011, pages 1860­ 1867, no se refiere a la producción de AA-2G específicamente incluso si se menciona el ácido ascórbico en la Tabla 3. La reacción identificada en la Tabla 3 con SPasa de B.ado/ensis, ácido ascórbico y sacarosa alfa 1 fosfato se llevó a cabo a pH de 7,5, que no aparece aquí de nuevo favorable para transferencia de glicosilo a L-AA. Nomura Koji et al., Bioscience biotechnology and biochemistry, vol. 72, no. 1, January 2008, pages 82-87, divulga transglucosilación de sacarosa en ácido acético por S. mutans SPasa, pero no se refiere específicamente a AA-2G. Lo mismo aplica a Sugimoto et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, Elsevier, Amsterdam, NL, vol. 104, no. 1, 1 July 2007, pages 22-29, que se enfoca en la síntesis de glucósido de benzoilo usando la reacción de transglucosilación de SPasa de S. mutans.

De este modo, existe aún una necesidad de un proceso mejorado para la producción de AA-2G con altos rendimientos. Breve descripción de la invención

Es un objetivo de la presente invención proveer de un proceso de producción eficiente de una etapa para la fabricación a gran escala de AA-2G.

El objetivo se resuelve por el objeto de la presente invención.

De acuerdo con la invención se provee un método para producir ácido 2-0-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico (AA-2G) que comprende las etapas secuenciales de:

a. proveer una mezcla que comprende un donador glucosilo y un aceptor glucosilo;

b. incubar dicha mezcla con una sacarosa fosforilasa;

c. mantener el pH en el intervalo de pH 4,8 a 5,5 durante la incubación; y

d. opcionalmente dosificar un donador glucosilo adicional y/o sacarosa fosforilasa durante la reacción, y

e. aislar y/o purificar ácido 2-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico, en donde dicho donador glucosilo es glucosa 1-fosfato o sacarosa; y en donde dicho aceptor glucosilo es ácido ascórbico.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la estructura química del ácido 2-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico (AA-2G).

La Figura 2 muestra los efectos del pH en la actividad de formación de AA-2G de la enzima sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium longum.

La Figura 3 muestra los efectos de la temperatura en la actividad de formación de AA-2G de la enzima sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium longum.

La Figura 4 muestra los efectos de las concentraciones del sustrato donador (sacarosa) y del aceptor (L-AA) en la actividad de formación de AA-2G de la enzima sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium longum.

La Figura 5 muestra transglucosilaciones de ácido L-ascórbico catalizado por diferentes sacarosas fosforilasas.

Descripción de las realizaciones

La presente invención provee un método novedoso y mejorado para producir ácido 2-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico que comprende las etapas secuenciales de:

a. proveer una mezcla que comprende un donador glucosilo y un aceptor glucosilo;

b. incubar dicha mezcla con una sacarosa fosforilasa;

c. mantener el pH en el intervalo de pH 4,8 a 5,5 durante la incubación;

d. opcionalmente dosificar un donador glicosilo adicional, así como sacarosa fosforilasa durante la reacción; y e. aislar y/o purificar ácido 2-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico,

en donde dicho donador glucosilo es glucosa 1-fosfato o sacarosa; y

en donde dicho aceptor glucosilo es ácido ascórbico.

La presente invención se refiere más específicamente a las materias como se reivindican.

De este modo, fue un objetivo determinar una enzima que se pudiera usar como un disacárido o monosacárido simple y de bajo costo como sustrato donador y realizar la transglicosilación solo en la posición 2 del L-AA.

Entre las clases de GT y GH, las glicósido fosforilasas (GP) son especiales en muchos aspectos. Las GP catalizan la fosforólisis de a - y p -D-glicósidos, principalmente glucósidos (Glc-OR) incluyendo disacáridos y oligo-o polisacáridos de diversos grados de polimerización. La transferencia de glucosilo a fosfato (Pi) es favorecida termodinámicamente in vivo debido a que el fosfato está usualmente presente en exceso sobre a -D-glucosa-1-fosfato (Glc-1-P). Sin embargo, las constantes de equilibrio termodinámico (K^eq) de las reacciones de GP catalizadas caen entre los valores de K^eq para la reacción de las GT (K^eq <<1) y las GH (K^eq >>1). La K^eq relativamente favorable y el hecho de que los azúcares activados por fósforo son menos costosos que aquellos activados por nucleótidos, que se requieren por la mayoría de las GT, que hace a las GP biocatalizadores interesantes para la síntesis estéreo- y regioespecífica de glucósidos.

La sacarosa fosforilasa (SPasa; EC 2.4.1.7), una glucosilfosforilasa, cataliza la conversión de sacarosa y fosfato en D-fructosa y a -D-glucosa-1-fosfato (Glc 1-P). La SPasa ha sido aislada de un número de fuentes bacterianas. Los genes que codifican la SPasa han sido clonados de diferentes bacterias y se han expresado heterólogamente (Kawasaki H et al., Biosci. Biotech. Biochem. (1996) 60:322-324; Kitao S and Nakano E, J. Ferment. Bioeng. (1992) 73:179-184; van den Broek LAM et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004) 65:219-227). De acuerdo con la clasificación con base en la secuencia sistemática de glicosilhidrolasas (GH) y glicosiltransferasas (GT) la SPasa pertenece a la familia GH13 (Clan GH-H), referida con frecuencia como la familia a -amilasa. La estructura tridimensional de la SPasa de Bifidobacterium adolescentis se ha resuelto recientemente, revelando un pliegue de barril (beta/alfa)8 y un sitio catalítico en que dos grupos carboxilato probablemente llenan el papel de un nucleófilo (Asp192) y un ácido/base general (Glu232).

La "sacarosa fosforilasa", como se usa en este documento, se refiere no solo a enzimas de la clase 2.4.1.7 sino también a moléculas o equivalentes funcionales de la misma que presentan las mismas propiedades en relación con sus sustratos y productos. Los "equivalentes funcionales" o análogos de la enzima son, dentro del alcance de la presente invención, diversos polipéptidos de la misma, que, por otra parte, poseen la función o actividad biológica deseada, por ejemplo, actividad enzimática.

Una realización de la invención se relaciona con un método para producir AA-2G, en donde la SPasa es de origen metagenómico, microbiano o bacteriano. Como se usa en este documento, el término "metagenómico" se refiere a material genético recuperado directamente de muestras ambientales.

Una realización adicional de la invención se relaciona con un método para producir AA-2G, en donde la SPasa es de origen microbiano o bacteriano, preferentemente de origen bacteriano.

La enzima homodimérica se refiere a una enzima compleja formada por dos moléculas idénticas. Algunas de las SPasas son capaces de formar homodímeros. Ejemplos de SPasas homodiméricas son, entre otras, derivadas de Bifidobacterium adolescentis, Streptococcus mutans o Bifidobacterium longum. De manera sorprendente, las SPasas homodiméricas exhiben alta selectividad al sitio en la glicosilación de L-AA. De este modo, en una realización de la invención la sacarosa fosforilasa es una sacarosa fosforilasa homodimérica. Debido a la alta selectividad del sitio de las SPasas homodiméricas, no se forman sustancialmente subproductos AA-6G. De este modo, en una realización de la invención, se provee un método para producir AA-2G, en donde no se producen sustancialmente subproductos. De acuerdo con una realización adicional de la invención, no se forman sustancialmente AA-3G, AA-5G o AA-6G durante la etapa de incubación.

Como se usa en este documento, el término "subproducto" se refiere a cualquier producto no deseado, específicamente se refiere a AA-3G, AA-5G o AA-6G. El término “sustancialmente libre de subproducto” significa que el contenido del subproducto es menor que 25 %, menor que 20 %, 15 %, 10 %, o menor que 1 % en peso.

Una realización de la invención se refiere a la sacarosa fosforilasa que muestra alta estabilidad a un pH por debajo de 7, preferentemente a un pH por debajo de 6, más preferentemente a un pH por debajo de 5 y lo más preferido a un pH por debajo de 4.

En realizaciones particulares, la sacarosa fosforilasa de la invención tiene una actividad de sacarosa fosforilasa residual después de la incubación por 48 horas a 60 °C y a un pH seleccionado de 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 y 7,0, de al menos 50 %, preferentemente al menos 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 82 %, 84 %, 86 %, 90 %, 92 % o al menos 94 %, con relación a la actividad de sacarosa fosforilasa a 0 horas (antes de empezar la incubación). En realizaciones preferidas, el pH de incubación es 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 o 7,0. En realizaciones aún más preferidas, el pH de incubación es 5,2, y la actividad residual es al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % o al menos 82 %.

La actividad de la SPasa se determinó a 30 °C usando un ensayo enzimático acoplado, en que la producción de Glc 1-P de sacarosa y fosfato inorgánico está acoplada a la reducción de NAD+ en presencia de fosfoglucomutasa (PGM) y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6P-DH) como se describió en el Ejemplo 2.

Una realización de la invención se refiere a la sacarosa fosforilasa producida de forma recombinante usando material genético obtenido directamente de muestras ambientales.

La desventaja de usar sacarosas fosforilasas microbianas es la producción y aislamiento simple y la estabilidad de estas enzimas. Se pueden obtener de microorganismos que expresen de forma natural o recombinante SPasa.

Una realización de la invención se refiere a sacarosa fosforilasa obtenida de Agrobacterium vitis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Escherichia coli, preferentemente Escherichia coli 06, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides, Listeria monocytogenes, Pseudomonas putrefaciens, Pseudomonas saccharophila, Rhodopirellula baltica, Shewanella baltica, Shewanella frigidimarina, Solibacter usitatus, Streptococcus mutans o Synechococcus sp.

Una realización de la invención se refiere a sacarosa fosforilasa producida de forma recombinante, preferentemente como una proteína de longitud completa o un fragmento activo catalítico de la misma o una proteína de fusión. Los métodos para la producción recombinante de enzimas son conocidos por el experto en la técnica (por ejemplo, Sambrook J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6).

Como se usa en este documento, "proteína de longitud completa" se refiere a una proteína sacarosa fosforilasa codificada por un gen derivado de un organismo como, por ejemplo, los que se listaron anteriormente. Dicho gen que tiene lugar de forma natural, en particular la región codificante de sacarosa fosforilasa de dicho gen, se emplea directamente para el producción recombinante de SPasa.

"Un fragmento catalíticamente activo" de una sacarosa fosforilasa se refiere a fragmentos de proteína de sacarosa fosforilasa que tienen la misma o sustancialmente la misma actividad y especificidad al sustrato que la SPasa original. La longitud de los fragmentos no es crucial siempre que los fragmentos tengan la misma especificidad al sustrato, o similar, y que catalice la formación de los mismos productos que la sacarosa fosforilasa original.

El término "proteína de fusión" se refiere a sacarosa fosforilasa o fragmentos catalíticamente activos de la misma fusionados con al menos una proteína, polipéptido o péptido adicional. Dicha al menos una proteína, polipéptido o péptido adicional puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, enzima).

Se hace notar que dentro del alcance de la invención se abarcan variantes funcionales (es decir, mutaciones que incluyen eliminaciones, sustituciones e inserciones) de sacarosa fosforilasa, siempre que estas variantes funcionales tengan la misma o sustancialmente la misma actividad que la sacarosa fosforilasa original.

Sin embargo, también es posible, por supuesto, usar sacarosa fosforilasa directamente obtenida del organismo que produce de forma natural dicha sacarosa fosforilasa.

La SPasa se puede emplear en la etapa de incubación ya sea como enzima libre de célula, que puede, pero que no necesita estar parcialmente purificada, un sistema celular completo pretratado físicamente o químicamente para permeabilidad mejorada de la membrana celular (permeabilización) y estabilidad mecánica, catalizador encapsulado en que dicha enzima libre o sistema celular completo están atrapados, preferentemente en estructuras tipo gel, o inmovilizados en un portador. De manera ventajosa, la SPasa se inmoviliza en un portador que preferentemente es un soporte sólido. El portador es preferentemente una resina de cromatografía, preferentemente seleccionada del grupo que consiste en resina de cromatografía de intercambio de aniones, resina de cromatografía de intercambio de cationes, resina de cromatografía de afinidad (por ejemplo, que comprende anticuerpos específicos a SPasa inmovilizada) y resina de cromatografía de interacción hidrofóbica.

La SPasa de la presente invención se puede inmovilizar (temporalmente o covalentemente) en cualquier portador, preferentemente partículas (por ejemplo, perlas), en particular resina de cromatografía, siempre que la actividad enzimática de la enzima no se afecte de forma que cambie su especificidad a sustrato o que reduzca su actividad a bajas tasas de conversión.

En una realización adicional de la invención, la sacarosa fosforilasa se usa en forma de célula completa, extracto libre celular, forma cruda, purificada o inmovilizada.

La reacción de la SPasa procede con la retención neta de la configuración anomérica y tiene lugar a través de un mecanismo de desplazamiento doble que implica dos etapas de configuración invertida: clivaje del enlace carbonooxígeno del donador glucosilo y formación de un producto intermedio enzima p-glucosil-covalente (p-Glc-E); y reacción del producto intermedio con fosfato para producir Glc 1-P. En una reacción secundaria, el producto intermedio p-Glc-E se puede interceptar por agua, llevándola a hidrólisis. La conversión hidrolítica de la sacarosa es irreversible pero procede cercanamente a dos órdenes de magnitud más lenta que la reacción fosforolítica. La SPasa también cataliza las reacciones de transglucosilación que tienen lugar en competencia con la hidrólisis y por medio de la cual el producto intermedio p-Glc-E es atacado por nucleófilos externos y se producen nuevos a-D-glucósidos.

Estudios bioquímicos han mostrado que la SPasa es estrictamente específica para transferir una porción glucosilo y no tolera modificaciones estructurales en el anillo glucopiranosil incluyendo epimerización y desoxigenación.

El donador glucosilo a emplearse en el método de la presente invención es uno que sirve como sustrato para la reacción de transglicosilación catalizada por la SPasa y es sacarosa o Glc 1-P. Entre estos dos donadores glicosilo conocidos, la sacarosa es un donador de glucosilo de alta energía barato y altamente estable y débilmente hidrolizado por la SPasa. Preferentemente, el donador glucosilo es sacarosa.

En contraste, la especificidad de SPasa para los aceptores glucosilo es comparablemente relajada.

La invención se refiere a un método para producir AA-2G, en donde el aceptor glucosilo es ácido ascórbico.

Se obtuvo glucosilglicerol estereoquímicamente puro en altos rendimientos de >90 % de sustrato donador y la concentración fue cercana a 1 M (25o g/L) cuando el aceptor glicerol era típicamente de < 2,5 veces molar en exceso sobre la sacarosa (Goedl et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(52):10086-9). La promiscuidad del aceptor de diferentes enzimas SPasas determinada por diferentes grupos de investigación ha sido revisada de forma excelente por Goedl et al. (Biocatal Biotrans. 2010; 28(1): 10-21). El pH óptimo para las reacciones de transferencia de glicosilo usando SPasa fue de 6,5 a 7,5. De forma interesante, el pH óptimo de 6,5 de sacarosa fosforilasa (de Streptococcus mutans) para la glucosilación de fosfato e hidroquinona se desplazó a debajo de pH 5,0 cuando se usó ácido acético como aceptor de glucosilo que indica el requerimiento de la forma protonada del grupo interactuante del aceptor para la transferencia efectiva de la unidad glucosilo.

Kwon et al. (Biotechnol Lett. 2007 Apr; 29(4):611-615) divulgó la posibilidad de producir AA-2G en una etapa de L-AA y sacarosa usando sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium longum producida de forma recombinante. Las concentraciones usadas de L-AA y sacarosa fueron de 0,5 % (p/v) y 30 % (p/v) respectivamente y nunca se intentaron a gran escala. Los resultados no dieron a conocer las concentraciones del AA-2G logrado. Aerts et al. (Carbohydr Res.

2011 Sep 27; 346(13):1860-7) comparó la actividad de transglucosilación de seis diferentes enzimas s P en 80 aceptores putativos. A pesar de que los productos transglucosilados se pueden observar claramente usando sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium adolescentis cuando se usó 65 mM de L-AA y 50 mM de sacarosa como sustrato aceptor y donador, respectivamente, la tasa de transglucosilación fue de aproximadamente 100 veces menor que la tasa de hidrólisis. De este modo, el L-AA fue descrito como un aceptor débil de sacarosa fosforilasa. Se emplearon enfoques de ingeniería de proteínas para introducir interacciones de ligandos de proteína en la sacarosa fosforilasa para la transglucosilación del ácido L-ascórbico, pero no tuvieron éxito. Estos estudios no han probado la aplicación práctica de la sacarosa fosforilasa en la producción de AA-2G. En los estudios anteriormente mencionados, las reacciones se realizaron a 37 °C y pH de 7,0 a 7,5 que no es del todo favorable para la transferencia de la unidad glucosilo a L-AA. No se realizaron intentos para verificar la posibilidad de un pH ácido.

En el objetivo de la presente invención estuvo la glicosilación de L-AA para producir AA-2G en una sola etapa sin producir muchos subproductos o isoformas de AA-2G usando SPasa. Las enzimas sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus y Streptococcus mutans fueron usadas para verificar la eficiencia y especificidad de glicosilación de L-AA. Todas las SPasas fueron exitosas al glicosilar L-AA en pH ácido. SPasas de Streptococcus mutans, SPasa de B. adolescentis y B. longum han producido solo AA-2G. Las concentraciones de reactivo y las condiciones de reacción fueron sistemáticamente optimizadas con el objetivo de la producción de AA-2G en alto rendimiento. Como resultado, el inventor de la presente invención determinó de manera inesperada que AA-2G se formó en una cantidad notable cuando la reacción se realizó a un pH de aproximadamente 5, entre 40-50 °C y con un exceso de 1.5 veces de L-AA. Al final de la reacción se observó AA-2G, L-AA, sacarosa, fructosa y muy poca glucosa en la mezcla de reacción con una impureza no identificada de menos que 3 % p/p. No se formaron otros subproductos o isoformas o se formaron en tal cantidad que pudieran ser detectados.

Una realización adicional de la invención se refiere al método para producir AA-2G, en donde la etapa de incubación se lleva a cabo a un intervalo de pH de 4,8 a 5,5. De manera sorprendente, la selectividad del sitio mejora fuertemente al trabajar a un pH en el intervalo de aproximadamente 4,8 a 5,5, o a un pH de aproximadamente 5,2. La reacción a un pH no adecuado puede llevar a una pobre selectividad del sitio. En una realización adicional de la invención la etapa de incubación se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 5,2.

El pH del medio de reacción se puede ajustar usando materiales simples orgánicos e inorgánicos o usando diferentes tipos de mezclas de soluciones amortiguadoras. El pH se puede ajustar antes de iniciar la reacción por agregado de enzima. El pH se puede ajustar también durante la reacción para mantener el pH deseado. El pH se puede ajustar manualmente o de manera automática.

Una realización adicional de la invención se relaciona con el método para producir AA-2G, en donde la etapa de incubación se lleva a cabo a un intervalo de temperatura de aproximadamente 30 a 70 °C, o en un intervalo de aproximadamente 35 a 65 °C, o en un intervalo de aproximadamente 40 a 60°

C, o en un intervalo de aproximadamente 40 a 50 °C. En una modalidad adicional de la etapa de incubación se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 40 °C.

Una realización adicional de la invención se refiera al método de producir AA-2G, en donde la etapa de incubación se realiza al menos 24 h, preferentemente por al menos 48 h, más preferido por al menos 72 h.

Una realización adicional de la invención se refiere al método para producir AA-2G, en donde el aceptor glucosilo se usa en 0,3 a 3 veces molar en exceso al donador glucosilo. En una realización adicional de la invención el aceptor glucosilo se usa en 0,5 a 2,5 veces molar en exceso al donador glucosilo, o en 1,0 a 2 veces molar en exceso. En una realización adicional de la invención, el aceptor glucosilo se usa en 1,5 veces molar en exceso al donador glucosilo. En una realización adicional de la invención el aceptor glucosilo es ácido ascórbico y el donador glucosilo es sacarosa.

Una realización adicional de la invención se refiere a un método para producir AA-2G, en donde la cantidad de sacarosa fosforilasa en la mezcla de reacción está en el intervalo de 1 U/mL a 10.000 U/mL, o en el intervalo de 5 U/mL a 100 U/mL, o en el intervalo de 10 U/mL a 50 U/mL, o en el intervalo de 20 U/mL a 40 U/mL. En una realización adicional de la invención la sacarosa fosforilasa se usa en una cantidad de aproximadamente 30 U/mL.

Una realización adicional de la invención se refiere a un método para producir AA-2G, en donde la cantidad de sacarosa fosforilasa adicional y la sacarosa se agregan a la mezcla de reacción durante la incubación para mantener la sacarosa fosforilasa en el intervalo de 1 U/mL a 10.000 U/mL, o en el intervalo de 5 U/mL a 100 U/mL, o en el intervalo de 10 U/mL a 50 U/mL, o en el intervalo de 20 U/mL a 40 U/mL, o a aproximadamente 30 U/mL y la sacarosa en el intervalo de 100 a 2.000 mM, o en el intervalo de 250 mM a 1.000 mM o aproximadamente 800 mM.

Una realización adicional de la invención se relaciona con un método para producir AA-2G, en donde la sacarosa fosforilasa y la sacarosa se agregan simultáneamente o en diferentes puntos temporales de la mezcla de reacción para mantener las cantidades requeridas como se describió anteriormente.

La presente invención se ilustra adicionalmente por las siguientes figuras y Ejemplos sin estar restringida a ellos. La Figura 1 muestra la estructura química del ácido 2-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico (AA-2G).

La Figura 2 muestra los efectos del pH en la actividad de formación de AA-2G de la enzima sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium longum. Se observó una dependencia al pH inusual de la síntesis de AA-2G. A pH 7,0 - 7,5 difícilmente se formó ningún AA-2G. La actividad aumentó bruscamente al disminuir el pH, alcanzando un máximo distinto a pH 5,2. Una disminución adicional en el pH resultó en fuerte pérdida de la actividad.

La Figura 3 muestra los efectos de la temperatura en la actividad de formación de AA-2G de la enzima sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium longum. La temperatura óptima de la síntesis de AA-2G era de 50 °C. Sin embargo, para minimizar la degradación del ácido L-ascórbico en el proceso, es preferible una temperatura menor a 40 °C.

La Figura 4 muestra los efectos de las concentraciones del sustrato donador (sacarosa) y del aceptor (L-AA) en la actividad de formación de AA-2G de la enzima sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium longum. La síntesis de AA-2G aumentó significativamente con aumento de la concentración de L-AA. La concentración y rendimiento de AA-2G se maximizaron cuando 1,5 veces de exceso de L-AA se agregaron a la reacción.

La Figura 5 muestra transglucosilaciones de ácido L-ascórbico catalizado por diferentes sacarosas fosforilasas. Las sacarosas fosforilasas seleccionadas representa la secuencia y diversidad estructural dentro de la familia de proteínas que presentaron claras diferencias en la selectividad en sitio. Los resultados se comparan en la Tabla 1.

Ejemplos

Los ejemplos que siguen se establecen para ayudar en la comprensión de la invención pero no pretenden, y no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la invención. Los Ejemplos no incluyen descripciones detalladas de métodos convencionales, por ejemplo, clonación, transfección y aspectos básicos de métodos para expresar proteínas en células huésped microbianas. Tales métodos son bien conocidos a aquellos de habilidad ordinaria en la técnica.

Ejemplo 1 - Producción de enzima sacarosa fosforilasa

La cepa huésped BL21 de E. coli que porta el vector pC21E con un inserto de gen de SPasa bajo etiqueta de histidina se usó para la producción de SPasa. El gen se clonó bajo el sistema promotor tac1 y se indujo con IPTG. Una pequeña cantidad de cultivo de la solución concentrada de glicerol se raspó con una punta de micropipeta y se inoculó en 50 mL de medio LB que contenía ampicilina (120 |jg/mL). El matraz se incubó a 30 °

C durante toda la noche en un agitador a 120 rpm por aproximadamente 12 h. El cultivo nocturno se inoculó en 200 mL de medio LB que contenía ampicilina (120 jg/mL) para generar el OD ⁶⁰⁰ de 0,01. El matraz se incubó a 37 °C, 120 rpm durante varias horas hasta que el OD ⁶⁰⁰ alcanzó 0,8 a 1,0. Se agregó IPTG al matraz para hacer la concentración final de 1 mM. El matraz se incubó en agitador a 25 °C, 120 rpm por cerca de 20 h. Las células se cosecharon por centrifugación a 5.000 rpm por 15 min. El sobrenadante se decantó y la pella se lavó con 100 mM de solución amortiguadora de citrato pH de 5.2 (se usaron 5 mL de solución amortiguadora por cada 1 g de peso celular húmedo). El 1 g de células húmedas se resuspendió en 5 mL de solución amortiguadora de lisado (100 mM de solución amortiguadora de citrato pH de 5,2 que contenía 50 mM NaCl 1 mM EDTA 0,5 mM DTT). La suspensión se pasó 2 veces a través de prensa francesa. El lisado celular resultante se centrifugó a 8.000xg para separar la fracción soluble de células sin romper y de restos celulares. La actividad enzimática de la SPasa en el sobrenadante se cuantificó, se hizo alícuota y se almacenó a - 20 °C para uso futuro.

Ejemplo 2: Ensayo de enzimas

La actividad de la SPasa se determinó a 30 °C usando un ensayo enzimático acoplado, en que la producción de Glc 1-P de sacarosa y fosfato inorgánico está acoplada a la reducción de NAD+ en presencia de fosfoglucomutasa (PGM) y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6P-DH). El ensayo estándar se realizó esencialmente como se describió en otro lugar en 50 mM de solución amortiguadora de potasio, pH de 7,0, que contenía 10 mM EDTA, 10 mM MgCh y 10 jM a -D glucosa 1,6-bisfosfato. La mezcla de reacción contenía 250 mM de sacarosa, 2,5 mM de NAD+, 3 U/mL de PGM, 3,4 U/mL de G6P-DH dependiente de NAD+ y la solución de enzimas en dilución adecuada. La formación de NADH con el tiempo se monitoreó espectrofotométricamente a 340 nm. Una (1) unidad de actividad de SPasa corresponde a la cantidad de enzima que causa la reducción de 1 micromol de NAD+ por minuto bajo las condiciones descritas anteriormente. Las concentraciones de proteína se determinaron usando el método de unión de tinte BioRad con albúmina de suero bovino como estándar.

Ejemplo 3: Síntesis de ácido 2-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico

La mezcla de reacción, que contenía 1.200 mM de L-AA y 800 mM de sacarosa o glucosa-1-fosfato y 30 U/mL de SPasa en agua, se incubó a 50 °C y 300 rpm por 48 a 72 h. La reacción se realizó preferentemente a pH de 5,2 en un contenedor hermético bajo condiciones de oscuridad. El análisis del producto se hizo usando HPLC empleando una columna BioRad HPX-87H y el perfil de elución de los picos se monitoreó con detector UV e IR. La columna se mantuvo a 25 °C y se usó 20 mM de ácido sulfúrico como eluyente a una tasa de flujo de 0,4 mL/min. Bajo estas condiciones > 30 % de L-AA se glucosiló. El análisis de NMR de producto aislado y purificado confirmó el enlace a -1-2 glicosídico de AA-2G.

Ejemplo 4: Mejorando los rendimientos del ácido 2-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico

La mezcla de reacción, que contenía 1.200 mM de L-AA y 800 mM de sacarosa o glucosa-1-fosfato y 30 U/mL de SPasa en agua, se incubó a 50 °C y 300 rpm. Durante la reacción se monitoreó la depleción de sacarosa y la pérdida en la actividad de la SPasa. Se dosificó sacarosa y SPasa adicional después de 24 h, 48 h y 72 h para restaurar la concentración de sacarosa y de actividad de SPasa a sus cantidades iniciales, esto es, 800 mM y 30 U/mL respectivamente. De esta manera los rendimientos aumentaron aproximadamente 1,5x.

Ejemplo 5: Evaluación de sacarosas fosforilasas adicionales

Se evaluaron cuatro (4) sacarosas fosforilasas adicionales, que representan la diversidad de secuencias dentro de la familia de proteínas, de Bifidobacterium adolescentis, Streptococcus mutans, Lactobacillus acidopholus, Leuconostoc mesenteroides. Las sacarosas fosforilasas homodiméricas presentaron alta selectividad al sitio en glicosilación del ácido L-ascórbico a 2-OH resultando en la formación de AA-2G en comparación con el tipo monomérico donde se formó una mezcla de AA-2G y AA-6G. Las sacarosas fosforilasas monoméricas liberaron AA-6G en proporción sustancial de producto total, considerando que, con las proteínas homodiméricas no se formó AA-6G por encima del límite de detección. Sin embargo, la síntesis de AA-2G a pH de 5,2, que es esencialmente inexistente a pH 7,5, fue una característica esencial de todas las sacarosas fosforilasas probadas.

Tabla 1

Claims (17)

r e iv in d ic a c io n e s

1. Un método para producir ácido 2-O-a-D-glucopiranosil-L-ascórbico que comprende las etapas secuenciales de: a. proveer una mezcla que comprende un donador glucosilo y un aceptor glucosilo;

b. incubar dicha mezcla con una sacarosa fosforilasa;

c. mantener el pH en el intervalo de pH 4,8 a 5,5 durante la incubación;

d. opcionalmente dosificar un donador glicosilo adicional y/o sacarosa fosforilasa durante la reacción; y

e. aislar y/o purificar ácido 2-O-a -D-glucopiranosil-L-ascórbico;

en donde dicho donador glucosilo es glucosa 1-fosfato o sacarosa; y en donde dicho aceptor glucosilo es ácido ascórbico.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sacarosa fosforilasa es de origen metagenómico, microbiano, preferentemente bacteriano.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la sacarosa fosforilasa es homodimérica.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la sacarosa fosforilasa bacteriana se obtiene de Agrobacterium vitis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Escherichia coli, Escherichia coli 06, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides, Listeria monocytogenes, Pseudomonas putrefaciens, Pseudomonas saccharophila, Rhodopirellula baltica, Shewanella baltica, Shewanella frigidimarina, Solibacter usitatus, Streptococcus mutans y/o Synechococcus sp.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la sacarosa fosforilasa bacteriana se obtiene de Bifidobacterium adolescentis.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la sacarosa fosforilasa bacteriana se obtiene de Bifidobacterium longum.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la sacarosa fosforilasa bacteriana se obtiene de Streptococcus mutans.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la sacarosa fosforilasa es una proteína original o una variante mutante.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la sacarosa fosforilasa es producida recombinantemente como una proteína de longitud completa o fragmento catalíticamente activo de la misma, o proteína de fusión.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la sacarosa fosforilasa se usa en la forma de célula completa, extracto libre celular, forma cruda, purificada o inmovilizada.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la incubación se realiza a un pH de 5,2.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la etapa de incubación se realiza por al menos 24 h, preferentemente por al menos 48 h, más preferido por al menos 72 h.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la incubación se realiza a un intervalo de temperatura de aproximadamente 30 a 70 °C, preferentemente de aproximadamente 40 a 60 °C, más preferido de aproximadamente 40 a 50 °C.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el ácido ascórbico se usa en 0,3 a 3 veces molar en exceso a sacarosa.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la cantidad de sacarosa fosforilasa en la mezcla de reacción está en el intervalo de 1 U/mL a 10.000 U/mL, o en el intervalo de 5 U/mL a 100 U/mL, o en el intervalo de 10 U/mL a 50 U/mL, o en el intervalo de 20 U/mL a 40 U/mL, o 30 U/mL.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la sacarosa fosforilasa adicional y la sacarosa se agregan a la mezcla de incubación durante la incubación para mantener la sacarosa fosforilasa en el intervalo de 1 U/mL a 10.000 U/mL, o en el intervalo de 5 U/mL a 100 U/mL, o en el intervalo de 10 U/mL a 50 U/mL, o en el intervalo de 20 U/mL a 40 U/mL, o a aproximadamente 30 U/mL y la sacarosa en el intervalo de 100 a 2.000 mM, o en el intervalo de 250 mM a 1.000 mM o aproximadamente 800 mM.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la sacarosa fosforilasa y la sacarosa se agregan simultáneamente o a diferentes puntos de tiempo.