KR102082395B1 - 고정화된 효소를 이용한 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아밀로수크라아제(amylosucrase)를 이용한 다이하이드록시벤젠 글루코시드(dihydroxybenzene glucoside)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, Deinococcus geothermalis DSM 11300 유래 코돈 최적화된 유전자(dgAS)를 이용하여 제조된 아밀로수크라아제(DgAS) 및 이를 이용한 글리코실전이반응(transglycosylation)을 포함하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 온도, pH, 공급원 및 수용체 기질 농도를 포함하는 반응 파라미터를 최적화하여 글리코실전이반응(transglycosylation)의 다이하이드록시벤젠 글루코시드 생산 수율을 증가시켰으며, 상업적으로 입수 가능한 아밀로글루코시드가수분해효소(amyloglucosidase)를 사용하여 gluco-oligosaccharides를 최소화함으로써 단일-글루코시드의 표적 생산성을 향상시켰다. 나아가, 에폭시 지지체에 고정화된 DgAS는 glycosylation 반응의 효율을 향상시키며, 반복적인 사용이 가능하고, 생성물과 효소의 분리가 매우 쉽다는 점에서 산업적으로 유용하다.
Description
본 발명은 아밀로수크라아제(amylosucrase)를 이용한 다이하이드록시벤젠 글루코시드(dihydroxybenzene glucoside)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, Deinococcus geothermalis DSM 11300 유래 코돈 최적화된 유전자(dgAS)를 이용하여 제조된 아밀로수크라아제(DgAS) 및 이를 이용한 글리코실전이반응(transglycosylation)을 포함하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 제조방법에 관한 것이다.
아밀로수크라아제(amylosucrase; AS)는 구조적으로 글리코시드 가수분해효소(glycoside hydrolase)에 속하는 당전이효소(glycosyltransferase; GT)다(Kim MD, et al . 2016. Acceptor specificity of amylosucrase from einococcus radiopugnans and its application for synthesis of Rutin Derivatives. J. Microbiol. Biotechnol . 26: 1845-1854.; Overwin H, et al . 2016. Flavanone and isoflavone glucosylation by non-Leloir glycosyltransferases. J. Biotechnol . 233: 121-128.). AS의 글리코실전이반응(transglycosylation)은 보통, Leloir GTs와 비교하여 큰 장점이 있는 단일 및/또는 다중(gluco-oligosaccharides) 당(sugar)의 결합이다. 생체 활성 페놀 글리코시드(phenolic glycosides)의 생산을 위해, AS는 아밀로오스-유사 폴리머, 전분, dendritic nanoparticles 및 microparticle encapsulation을 포함하는 다양한 생체재료 합성에 사용되어왔다(Lim M-C, et al . 2015. Amylosucrase-mediated synthesis and self-assembly of amylose magnetic microparticles. RSC Advances 5: 36088-36091.; Letona CAM, et al. 2017. Amylosucrase-mediated beta-carotene encapsulation in amylose microparticles. Biotechnol . Prog . 33: 1640-1646.; O'Neill EC, et al . 2014. Sugar-coated sensor chip and nanoparticle surfaces for the in vitro enzymatic synthesis of starch-like materials. Chem . Sci . 5: 341-350.). AS는 glycodiversification 면에서 잠재적인 응용 가능성을 가지고 있지만, 페놀 화합물의 글리코실전이반응에 대해서는 거의 보고되지 않고 있다.
생물학적으로 활성화된 활성 페놀 화합물(phenolic compounds)은 일반적으로 방향족 탄화수소에 결합된 하이드록실 및 메틸 잔기와 같은 단일 또는 다중 작용기를 함유한다. 이러한 하이드록실기(hydroxyl groups)는 모(parent) 화합물과 비교할 때, 생리화학적 기능을 변화시키는 후속 변형이 일어나기 쉽다. 피부 미백제로 널리 알려져 있으며 화장품 산업에서 널리 사용되는 하이드로퀴논(hydroquinone; para-dihyroxybenzene)의 글루코시드는 피부에서 멜라닌 형성을 억제하고, 어두운 피부를 밟게 하며, 주근깨 및 검버섯을 완화시키고 햇빛 손상을 치료한다(Smit N, Vicanova J, Pavel S. 2009. The hunt for natural skin whitening agents. Int . J. Mol . Sci . 10: 5326-5349.). 레조르시놀(resorcinol) 및 카테콜(catechol)은 meta- 및 ortho-dihydroxybenzenes 유도체이다. 이들 역시 잠재적인 생물학적 활성을 나타내어, 약학뿐만 아니라 화장품에도 적용 가능하다. Resorcinol은 피부 미백제, 통증 및 가려움을 완화시키는 연고제로서 사용되며(Boer J, Jemec GB. 2010. Resorcinol peels as a possible self-treatment of painful nodules in hidradenitis suppurativa. Clin . Exp . Dermatol . 35: 36-40.; Limsuwan T, et al . 2017. Ethosomes of Phenylethyl Resorcinol as Vesicular Delivery System for Skin Lightening Applications. BioMed Res . Int . 83: 8310979.; Kim BS, et al . 2017. The Improvement of skin whitening of phenylethylrResorcinol by nanostructured lipid carriers. Nanomaterials 7: 241.), catechol은 항암제 및 화장품 보조제로 사용된다(Lim M-C, et al . 2015. Amylosucrase-mediated synthesis and self-assembly of amylose magnetic microparticles. RSC Advances 5: 36088-36091.; Jung CT, et al . 2003. In vitro and in vivo percutaneous absorption of catechol. Food Chem Toxicol . 41: 885-895.). 이들 페놀 화합물은 매우 유용하지만, 안정성, 낮은 용해성 및 감광성 환경에서의 짧은 수명과 관련된 문제로 인해 그 적용이 제한되어왔다. 이러한 화합물들에 부피가 큰 당을 부착하여 수용성, 안정성 및 생물학적 특성의 문제를 해결해왔다(Zhang P, et al . 2013. Enhanced chemical and biological activities of a newly biosynthesized eugenol glycoconjugate, eugenol alpha-D-glucopyranoside. Appl . Microbiol . Biotechnol . 97: 1043-1050.).
일반적으로 glycosylated 생성물의 독성은 aglycones 생성물에 비해 현저하게 낮아진다(Suzuki Y, Uchida K. 1999. Enzymatic Glycosylation of Aglycones of Pharmacological Significance, pp. 297-312. In Bucke C (ed.), Carbohydrate Biotechnology Protocols, Ed. Humana Press, Totowa, NJ). 따라서 hydroquinone, resveratrol, genistein 및 catechin과 같은 페놀 화합물을 변형시켜 각각의 glucosides를 생산하는 데 transglycosylation 반응이 널리 사용된다(Cho HK, Kim HH, et al . 2011. Biosynthesis of (+)-catechin glycosides using recombinant amylosucrase from Deinococcus geothermalis DSM 11300. Enzyme and microbial technology. 49: 246-253.; Park H, et al . 2012. Enzymatic synthesis of piceid glucosides using maltosyltransferase from Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725. Journal of agricultural and food chemistry . 60: 8183-8189.).
이러한 기술 배경 하에 본 발명자들은 페놀 화합물의 글루코시드 제조를 위한 효율적인 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, Deinococcus geothermalis DSM 11300 유래 코돈 최적화된 유전자(dgAS)를 이용하여 제조된 아밀로수크라아제를 이용하여 3개의 다이하이드록시벤젠(하이드로퀴논, 카테콜 및 레조르시놀)을 글리코실화 하고, 다양한 반응 파라미터의 최적화, 효소 고정화 및 아밀로글루코시드가수분해효소(amyloglucosidase) 처리를 통해 페놀 단일-글루코시드(phenolic mono-glucosides)의 생성이 향상되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 아밀로수크라아제(DgAS)를 이용한 글리코실전이반응(transglycosylation)을 포함하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드(dihydroxybenzene glucoside)의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 다이하이드록시벤젠(dihydroxybenzene) 및 당 공여체(sugar donor)를 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 아밀로수크라아제(DgAS)와 함께 혼합하여 글리코실전이반응(transglycosylation)을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 글리코실전이반응으로 생성된 다이하이드록시벤젠 글루코시드를 회수하는 단계를 포함하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드(dihydroxybenzene glucoside)의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 온도, pH, 공급원 및 수용체 기질 농도를 포함하는 반응 파라미터를 최적화하여 글리코실전이반응(transglycosylation)의 다이하이드록시벤젠 글루코시드 생산 수율을 증가시켰으며, 상업적으로 입수 가능한 아밀로글루코시드가수분해효소(amyloglucosidase)를 사용하여 gluco-oligosaccharides를 최소화함으로써 단일-글루코시드의 표적 생산성을 향상시켰다. 나아가, 에폭시 지지체에 고정화된 DgAS는 glycosylation 반응의 효율을 향상시키며, 반복적인 사용이 가능하고, 생성물과 효소의 분리가 매우 쉽다는 점에서 산업적으로 유용하다.
도 1은 코돈 최적화된 dgAS 유전자 서열을 나타낸 것으로, 원래 서열은 NCBI로부터 확인하였다(accession number: ABF44874.1). 노란색 표시는 시작 및 종료 코돈, 밑줄은 제한 효소 위치(NdeI: CATATG, XhoI: CTCGAG, HindIII: AAGCTT)이며, 6x histidine tagged 영역은 붉은 색으로 표시하였다.
도 2는 발현된 DgAS의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다(Lane M: molecular weight marker, lane 1: insoluble DgAS, lane 2: soluble DgAS, lane 3: purified DgAS).
도 3은 hydroquinone, resorcinol 및 catechol의 transglycosylation 반응의 HPLC-PDA chromatogram으로, 도 3(A)는 Hydroquinone standard 도 3(B)는 Hydroquinone reaction, 도 3(C)는 Resorcinol standard, 도 3(D)는 Resorcinol reaction 도 3(E)는 Catechol standard, 도 3(F)는 Catechol reaction이다.
도 4는 hydroquinone, resorcinol 및 catechol의 transglycosylation 반응 혼합물의 고분해능 HRQTOF-ESI/MS 분석으로, 초록색 화살표는 반응 혼합물에서 검출된 mono- 및 oligo-sugar 부착 생성물을 나타낸 것이다.
도 5는 반응 혼합물에서 transglycosylation 파라미터의 최적화를 나타낸 그래프로, Hydroquinone reaction(도 5A), Resorcinol reaction(도 5B) 및 Catechol reaction(도 5C)에서 Sucrose 농도 최적화, Hydroquinone reaction(도 5D), Resorcinol reaction(도 5E) 및 Catechol reaction(도 5F)에서 배양 온도 최적화이다. Hydroquinone reaction(도 5G), Resorcinol reaction(도 5H) 및 Catechol reaction(도 5I)을 위한 pH 최적화이며, 각 반응은 여러 번 수행되었고 errors bars로 표시하였다.
도 6은 반응 혼합물 및 20% amyloglucosidase 처리의 HPLD-PDA 분석으로, hydrochinone amylosucrase(도 6A), amyloglucosidase를 처리한 hydroquinone amylsucrase(도 6B), resorcinol amylosucrase(도 6C), amyloglucosidase를 처리한 resorcinol amylosucrase(도 6D), catechol amylosucrase(도 6E), amyloglucosidase를 처리한 catechol amylosucrase(도 6F)이다. 도 6C, 6D, 6E 및 6F의 초록색 직사각형은 각각 resorcinol 및 catechol에 결합된 oligosaccharides의 감소(mono-glucose으로)를 나타낸다.
도 7은 기질 농도 최적화로 인한 hydroquinone, resorcinol 및 catechol glucosides의 높은 수득율을 나타낸 그래프로, 기질 농도는 20mM에서 500mM로 증가시키고, HPLC-PDA로 반응 혼합물을 분석하였다. 도 7A는 Hydroquinone 농도 최적화, 도 7B는 Resorcinol 농도 최적화, 도 7C는 Catechol 농도 최적화이다.
도 8은 hydroquione glucoside의 1H NMR spectrum이다.
도 9는 hydroquione glucoside의 13C NMR spectrum이다.
도 10은 resorcinol glucoside의 1H NMR spectrum이다.
도 11은 resorcinol glucoside의 13C NMR spectrum이다.
도 12는 catechol glucoside의 1H NMR spectrum이다.
도 13은 catechol glucoside의 13C NMR spectrum이다.
도 14는 정제된 hydroquinone glucoside(도 14A), resorcinol glucoside(도 14B) 및 catechol glucoside(도 14C)의 HPLC-PDA chromatogram이다.
도 15는 각 기질 및 glucoside의 1H NMR signal 비교이다.
도 16은 phenolic glucosides를 생성하기 위해 고정화된 효소를 50 cycles까지 반복적으로 사용한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 발현된 DgAS의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다(Lane M: molecular weight marker, lane 1: insoluble DgAS, lane 2: soluble DgAS, lane 3: purified DgAS).
도 3은 hydroquinone, resorcinol 및 catechol의 transglycosylation 반응의 HPLC-PDA chromatogram으로, 도 3(A)는 Hydroquinone standard 도 3(B)는 Hydroquinone reaction, 도 3(C)는 Resorcinol standard, 도 3(D)는 Resorcinol reaction 도 3(E)는 Catechol standard, 도 3(F)는 Catechol reaction이다.
도 4는 hydroquinone, resorcinol 및 catechol의 transglycosylation 반응 혼합물의 고분해능 HRQTOF-ESI/MS 분석으로, 초록색 화살표는 반응 혼합물에서 검출된 mono- 및 oligo-sugar 부착 생성물을 나타낸 것이다.
도 5는 반응 혼합물에서 transglycosylation 파라미터의 최적화를 나타낸 그래프로, Hydroquinone reaction(도 5A), Resorcinol reaction(도 5B) 및 Catechol reaction(도 5C)에서 Sucrose 농도 최적화, Hydroquinone reaction(도 5D), Resorcinol reaction(도 5E) 및 Catechol reaction(도 5F)에서 배양 온도 최적화이다. Hydroquinone reaction(도 5G), Resorcinol reaction(도 5H) 및 Catechol reaction(도 5I)을 위한 pH 최적화이며, 각 반응은 여러 번 수행되었고 errors bars로 표시하였다.
도 6은 반응 혼합물 및 20% amyloglucosidase 처리의 HPLD-PDA 분석으로, hydrochinone amylosucrase(도 6A), amyloglucosidase를 처리한 hydroquinone amylsucrase(도 6B), resorcinol amylosucrase(도 6C), amyloglucosidase를 처리한 resorcinol amylosucrase(도 6D), catechol amylosucrase(도 6E), amyloglucosidase를 처리한 catechol amylosucrase(도 6F)이다. 도 6C, 6D, 6E 및 6F의 초록색 직사각형은 각각 resorcinol 및 catechol에 결합된 oligosaccharides의 감소(mono-glucose으로)를 나타낸다.
도 7은 기질 농도 최적화로 인한 hydroquinone, resorcinol 및 catechol glucosides의 높은 수득율을 나타낸 그래프로, 기질 농도는 20mM에서 500mM로 증가시키고, HPLC-PDA로 반응 혼합물을 분석하였다. 도 7A는 Hydroquinone 농도 최적화, 도 7B는 Resorcinol 농도 최적화, 도 7C는 Catechol 농도 최적화이다.
도 8은 hydroquione glucoside의 1H NMR spectrum이다.
도 9는 hydroquione glucoside의 13C NMR spectrum이다.
도 10은 resorcinol glucoside의 1H NMR spectrum이다.
도 11은 resorcinol glucoside의 13C NMR spectrum이다.
도 12는 catechol glucoside의 1H NMR spectrum이다.
도 13은 catechol glucoside의 13C NMR spectrum이다.
도 14는 정제된 hydroquinone glucoside(도 14A), resorcinol glucoside(도 14B) 및 catechol glucoside(도 14C)의 HPLC-PDA chromatogram이다.
도 15는 각 기질 및 glucoside의 1H NMR signal 비교이다.
도 16은 phenolic glucosides를 생성하기 위해 고정화된 효소를 50 cycles까지 반복적으로 사용한 결과를 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 고정화된 아밀로수크라아제(DgAS)를 이용한 지속 가능한 접근법을 사용하여 모(parent) 화합물보다 우수한 산업 적용성을 나타낼 것으로 예상되는 3가지 dihydroxybenzenes(hydroquinone, resorcinol 및 catechol)의 glucosylated 유도체를 생산했다. Deinococcus geothermalis DSM 11300에서 유래한 아밀로수크라아제를 encoding하는 유전자를 코돈 최적화하고 Escherichia coli에서 발현시켰으며, glucose moiety의 공급원으로서 sucrose를 사용하였다. 온도, pH, 공급원(sucrose) 및 수용체 기질 농도를 포함하는 반응 파라미터를 최적화하여 생산 수율을 증가시켰으며, 상업적으로 입수 가능한 amyloglucosidase를 사용하여 gluco-oligosaccharides를 최소화함으로써 단일-글루코시드의 표적 생산성을 향상시켰다. 나아가, AMICOGEN LKZ118 beads에 고정화된 DgAS는 glycosylation 반응의 효율을 향상시키며, 반복적인 사용이 가능함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 다이하이드록시벤젠(dihydroxybenzene) 및 당 공여체(sugar donor)를 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 아밀로수크라아제(DgAS)와 함께 혼합하여 글리코실전이반응(transglycosylation)을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 글리코실전이반응으로 생성된 다이하이드록시벤젠 글루코시드를 회수하는 단계를 포함하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드(dihydroxybenzene glucoside)의 제조방법에 관한 것이다.
당 공여체(sugar donor)로서 sucrose를 사용하는 생체 분자의 transglycosylation 반응에서, DgAS는 다양한 미생물 공급원 중에서 가장 열 안정성이 있는 AS이다(Guerin F, et al . 2012. Structural investigation of the thermostability and product specificity of amylosucrase from the bacterium Deinococcus geothermalis. J. Biol. Chem. 287: 6642-6654.).
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오타이드는 데이노코커스 지오써말리스 DSM 11300(Deinococcus geothermalis DSM 11300) 유래 아밀로수크라아제의 뉴클레오타이드 서열을 코돈 최적화한 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 할 수 있다.
E. coli systems에서 재조합 효소가 이종성으로 과발현될 때, 가용성 분획에서 동등하게 발현되지 않는다. 따라서 E. coli의 가용성 분획에서 단백질 번역 및 가공의 문제를 해결하고 재조합 효소를 효율적으로 발현시키기 위해서는, 일반적으로 코돈-최적화된 유전자가 사용된다. 코돈 최적화는 DNA의 발현률을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 코돈 최적화는 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 염기를 치환하는 것으로, 숙주 내에서 DNA가 단백질로 전사(transcription) 및 번역(translation)될 때 아미노산을 지령하는 코돈 사이에 숙주에 따라 선호도가 높은 코돈이 존재하는데, 이들 선호도가 높은 코돈으로 치환함으로써 그 핵산이 암호화하는 아미노산 또는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 것을 말한다.
본 발명의 아밀로수크라아제(DgAS)를 암호화하는 핵산 서열은 야생형과 동일한 서열을 그대로 사용할 수 있으나, 바람직하게는 E. coli에서 아밀로수크라아제(DgAS)의 발현 빈도가 증가하도록 아밀로수크라아제(DgAS)의 유전자 코돈을 최적화한 서열을 사용한다. 상기 "유전자 코돈을 최적화한 서열" 또는 본 발명에서 사용된 용어 "코돈 최적화"는 E. coli에서 목적 물질(예를 들어, 본 발명의 아밀로수크라아제(DgAS) 등)의 발현량이 증가하도록 목적 물질을 암호화하고 있는 아미노산 코돈 중 일부 아미노산 코돈을 치환하는 것을 말한다. 이러한 아미노산 코돈의 일부 치환은 당업자에 의하여 다양한 조합 및 응용이 가능할 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는, Deinococcus geothermalis DSM 11300 유래 아밀로수크라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 코돈 최적화하고(도 1), 이를 서열번호 1로 나타내었으며, 단백질 합성을 위한 발현벡터에 클로닝했다.
본 발명에 있어서, 상기 아밀로수크라아제(DgAS)는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 배양하여 제조된 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단 부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation)(Neumann, et al ., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현벡터가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 뼈대 벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a, pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용할 수 있다.
염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)" 된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다이하이드록시벤젠은 하이드로퀴논(hydroquinone; para-dihyroxybenzene), 레조르시놀(resorcinol; meta-dihydroxybenzen) 및 카테콜(catechol; ortho-dihydroxybenzen)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 당 공여체는 수크로스(sucrose)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 다이하이드록시벤젠 글루코시드는 하이드로퀴논 글루코시드, 레조르시놀 글루코시드 및 카테콜 글루코시드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실전이반응은 400mM 하이드로퀴논 및 300~400mM 수크로스를 포함하고, 40~55℃ 및 pH 6~7에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실전이반응은 200mM 레조르시놀 및 50~200mM 수크로스를 포함하고, 35~50℃ 및 pH 7~8에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실전이반응은 300mM 카테콜 및 100~200mM 수크로스를 포함하고, 35℃ 및 pH 8~9에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, transglycosylation 반응 파라미터를 최적화하여 생산성을 향상시켰다(도 5). 첫째로, 각 반응에서 sucrose 농도 400mM까지 glucoside 생성이 증가하는 곳에서 sucrose 농도를 최적화하였다. Hydroquinone, resorcinol, catechol의 최적 sucrose 농도는 각각 300mM, 200mM 및 100mM였다. 또한, 각각 400mM hydroquinone, 200mM resorcinol 및 300mM catechol을 수용체 기질로 사용한 경우, hydroquinone glucosides 325.6mM(88.6g/L), resorcinol glucosides 130.2mM(35.4g/L) 및 catechol glucosides 284.4mM(77.4g/L)의 가장 높은 몰수율을 나타냈다.
또한, 온도와 pH는 각각 40℃와 pH 7로 최적화되었다. sucrose 농도, 온도 및 pH의 최적 조건 하에서 dihydroxybenzenes의 농도는 증가하였다. Hydroquinone 반응 혼합물로부터 95% 이상의 전환이 이루어졌으며, resorcinol의 70% 이상이 glycosides로 전환되었다. catechol glycosides 생합성은 100mM sucrose 농도가 될 때까지 90% 이상의 수율로 상승했다. Glycosylated 생성물 생산에 있어 이러한 전환율은 상당히 높은 결과이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실전이반응은 아밀로글루코시드가수분해효소(amyloglucosidase)를 추가로 첨가하고 수행하는 것을 특징으로 하는 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 각 다이하이드록시벤젠의 단일-글루코시드 합성을 목표로 하였다. 본 발명의 일 실시예에서, 예비 transglycosylation 반응에 기초하여, 기질은 3개의 모든 반응에서 glucosides로 효율적으로 전환되었다. 대량 분석 결과, multiple sugar(gluco-oligosaccharides)-conjugated 생성물이 있음을 확인하였다. Hydroquinone은 최대 3개의 당과 결합되어있는 반면, resorcinol과 catechol은 거의 9개의 당 사슬과 연결되어있는 것으로 밝혀졌다(도 3 및 도 4). 그러나 본 발명의 목적은 3가지 다이하이드록시벤젠의 single sugar-conjugated 생성물을 얻는 것이므로, 시판중인 Aspergillus niger 유래 amyloglucosidase를 처리하여 단일-글루코시드를 수득하였다.
Amyloglucosidase는 전분에서 포도당을 얻기 위해 상업적으로 사용되는 효소이다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 효소로 2개의 당 사이에서 α-(1,4) glycoside 결합의 절단을 촉매하여 단일-글루코시드를 수득하였다. sugar chain-attached glycosides 생성량은 감소되었지만, HPLC-PDA chromatogram 분석 동안 단일-글루코시드 수준은 증가했다(도 6).
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 아밀로수크라아제(DgAS)는 담체에 고정화된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 담체는 에폭시 비드인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
효소의 불안정성에 의해 효소의 생명공학적 과정에의 실제 적용에는 종종 어려움이 있었다. 효소의 활성을 안정화시키는 접근법에는 효소 응집을 방지하고, 적절한 담체에 고정화시켜 비가역적인 unfolding을 감소시키는 것이 있다(Bryjak J, Trochimczuk AW. 2006. Immobilization of lipase and penicillin acylase on hydrophobic acrylic carriers. Enzyme and microbial technology . 39: 573-578.; Kim TS, et al . 2016. A highly efficient sorbitol dehydrogenase from Gluconobacter oxydans G624 and improvement of its stability through immobilization. Scientific reports . 6: 33438.). 효소의 고정화는 일반적으로 효소를 산업적 생체 촉매로 사용하기 위해 수행되며, 에폭시 지지체로 효소를 고정시키는 것이 매우 쉽다는 것이 증명되었다(Hernaiz MJ, Crout DH. 2000. Immobilization/stabilization on Eupergit C of the beta-galactosidase from B. circulans and an alpha-galactosidase from Aspergillus oryzae. Enzyme and microbial technology. 27: 26-32.).
본 발명에서는 DgAS 고정화를 위해 고성능 에폭시 지지체(AMICOGEN LKZ118)를 이용하였다. 고정화된 효소를 사용하는 hydroquinone의 transglycosylation 반응은 35회까지 반응성이 일정하게 유지됨을 보여 주었다. 그러나 resorcinol과 catechol의 전환율은 40회까지 일정하였다. 고정화 반응 시스템에서 이른 hydroquinone 전환율 감소(resorcinol 및 catechol보다 5회 더 빠른)는 hydroquinone에 대한 DgAS의 상이한 촉매작용에 기인한 것일 수 있다. 또한, hydroquinone 반응은 resorcinol 및 catechol 보다 높은 농도의 공여체(2M) 및 수용체(400mM)로 수행되었다. 이는 hydroquinone의 전환율을 일찍 감소시키는 또 다른 이유가 될 수 있다. 고정화된 DgAS는 35회에서 mono-glycosylated된 hydroquinone, catechol 및 resorcinol의 최종 농도가 각각 278.4mM(75.8g/L), 108.8mM(29.6g/L) 및 211.2mM(57.5g/L)로 나타났다. Hydroquinone과 catechol의 총 glycosides 퍼센트 수율은 85%에서 90%까지, resorcinol의 경우 65%에서 70% 사이였다. 이러한 결과는 DgAS가 안정한 효소이며, glucosides 생산에 대한 중요한 활성을 감소시키지 않으면서 효소를 고정시킴으로써 다량의 dihydroxybenzenes을 glucosides로 전환시키는데 사용될 수 있음을 의미한다. 고정화된 DgAS는 glycosylation 반응의 효율을 향상시키며, 반복적인 사용이 가능하고, 생성물과 효소의 분리가 매우 쉽다는 점에서 산업적 응용에 효과적이다.
본 발명에 있어서, 상기 글리코실전이반응으로 생성된 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 회수는 반응 결과물로부터 분리함으로써 이루어지는데, 예시적으로 분자량 및/또는 친화성 차이를 이용하는 정제방법, 즉, 멤브레인 분리법, 겔 여과 크로마토그래피법, 컬럼 크로마토그래피법, 고속액체크로마토그래피법 및 이온 교환 크로마토그래피법 등을 이용하여 정제하여 수득할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1: 화학물질 및 시약
Hydroquinone, resorcinol, catechol, ascorbic acid, sucrose, amyloglucosidase(Aspergillus niger 유래)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Mallinckrodt Baker(Phillipsburg, USA)에서 구입한 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography; HPLC) grade acetonitrile과 water는 Mallinckrodt Baker(Phillipsburg, USA)로부터 구입하였다. 제한 효소는 Takara Bio(Shiga, Japan) 및 Promega(Madison, WI, USA)로부터 구입 하였다. AMICOGEN LKZ118 beads는 Amicogen(Gyonggi-Do, Republic of Korea)에서 구입하였다.
실시예
2: 분석 방법
Reverse-phase HPLC-PDA 분석은 YMC-Pack ODS-AQ로 패킹된 C18 column을 사용하여 280nm UV absorbance에서 수행하였다; 4.6mm internal diameter, 150mm long 및 5μm particle size이며, solvent A(0.05% trifluoroacetic acid buffer-TFA) water 및 100% acetonitrile이 25분 동안 1mL/min의 flow rate로 유지되는 binary condition에서 photo diode array(PDA)에 연결된다. Acetonitrile은 0-40%(0-15분), 40-75%(15-20분), 75-0%(20-25분)로 설정되었다. 화합물의 정제는 36-min binary program을 사용하여 UV 검출기에 연결된 C18 column(YMC-PACK ODS-AQ; 150-250mm long, 20mm internal diameter, 10μm particle size)을 사용하는 예비 HPLC에 의해 수행되었다. 0-20분(40%), 20-30분(75%), 30-36분(0%) 동안 acetonitrile flow로서 유량은 프로그램 전반에 걸쳐 10mL/분이었다.
양이온 모드에서 Acquity mass spectrometer(with UPLC; Waters, Milford, MA USA) coupled with Synapt G2-S system(Waters)을 사용하여 high resolution quadruple-time of flight electrospray ionization-mass spectrometry(HRQTOF-ESI/MS)를 수행하였다. TCI CryoProbe(5mm)를 갖춘 Avance II 300 Bruker(Germany) BioSpin NMR spectrometer로 정제된 화합물을 구조적으로 결정하였다. 모든 샘플을 D2O로 교환하고 1H NMR(proton), 13C NMR(carbon)을 위해 methanol-d 4에 용해시켰다.
실시예
3: 박테리아 균주,
클로닝
및 배양
Escherichia coli XL1 blue는 모든 DNA 조작을 위한 숙주로 사용하였으며, E. coli BL21(DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany)은 pHCE IIB(NdeI) 벡터를 이용한 DgAS의 발현 및 생산에 사용되었다. 재조합 균주를 37℃에서 Luria-Bertani(LB) agar plate와 ampicillin(100μg/mL)이 보충된 broth medium에서 성장시켰다. Deinococcus geothermalis DSM 11300 유래 amylosucrase의 뉴클레오타이드 서열(GenBank accession no. ABF44874.1)은 General Biosystems (USA)로부터 코돈-최적화되고 합성되었다. 1984-bp 유전자 단편은 NdeI 및 HindIII 제한 부위 측면에 위치 하였다.
실시예
4:
DgAS
발현 및 정제
dgAS를 함유하는 재조합 E. coli BL21(DE3)을 50mL LB broth에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 840Хg에서 4℃, 10분간 원심분리하여 세포를 수확하고, 50mM Tris-HCl과 10% glycerol(pH 7.5)을 포함하는 버퍼를 사용하여 세척하였다. 이들 세포를 동일 버퍼에 재현탁시키고, ice bath에서 sonicator로 파쇄하였다. 13,475Хg에서 4℃, 15분 동안 원심분리하여, 상층액과 세포 파편을 분리하였다. 발현된 단백질을 12%(w/v) acrylamide gel을 사용한 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분석하였다. nickel nitrilotriacetic acid(Ni-NTA) affinity column chromatography(Qiagen Inc, Valencia, CA, USA)를 사용하여 상층액을 정제하고, 다양한 농도의 imidazole(10mM, 100mM, 200mM 및 500mM)로 용출시켰다(Parajuli P, et al . 2014. Enzymatic synthesis of epothilone A glycosides. AMB Express 4: 31.; Pandey RP, et al . 2014. Assessing acceptor substrate promiscuity of YjiC-mediated glycosylation toward flavonoids. Carbohyd . Res . 393: 26-31.).
코돈-최적화되고 합성된 dgAS 유전자(도 1, 서열번호 1)는 carboxyl 말단에 6x histidine이 표지 된 pHCE IIB(NdeI)에 클로닝되었다. 1.984Kb의 클로닝된 유전자는 NdeI/HindIII 효소를 이용하여 제한 효소 분해에 의해 확인되었다. E. coli BL21(DE3)에 유전자를 발현시켰다. 발현된 단백질의 가용성 분획을 상기 기재된 방법으로 정제하고, SDS-PAGE 분석으로 분석하여 6x-his 태그가 융합된 DgAS(도 2)와 유사한 72.49kDa의 단백질을 확인하였다.
실시예
5: 페놀 화합물의
글리코실전이반응
(
transglycosylation
)
아밀로수크라아제(DgAS)는 당 공여체(sugar donor)인 sucrose의 존재 하에서 효소 촉매 작용에 사용되었다. Hydroquinone, resorcinol 및 catechol을 기질로 사용하였다. 본 실시예의 목적은 DgAS의 glucosyltransferase 활성에 의해 촉매되는 저렴한 glucose donor source를 사용하여 각 기질의 단일-글루코시드 유도체를 합성하는 것이다. 특히 sucrose를 가수분해하고 glycosylation 동안 글루코스 잔기를 페놀 기질의 하이드록실기로 이동시킨다(Guerin F, et al . 2012. Structural investigation of the thermostability and product specificity of amylosucrase from the bacterium Deinococcus geothermalis. J. Biol . Chem . 287: 6642-6654.).
글루코스 공여체(glucose donor)인 sucrose의 존재 하에서 dihydroxybenzenes(hydroquinone, resorcinol 및catechol)을 수용체(acceptor) 분자로 사용하여 글리코실전이반응(transglycosylation)을 수행하였다. 총 반응 혼합물의 200μL는 20mM dihyroxybenzene, 2mM ascorbic acid, 200mM sucrose, 0.4mg/mL amylosucrase 및 200 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7)를 함유하였다. 37℃에서 30분 동안 배양하고, 반응 혼합물을 boiling water bath에서 10분간 유지하여 반응을 중단시켰다. 반응 혼합물을 13U/mL amyloglucosidase로 40℃에서 3시간 동안 처리하였다. 샘플에 chilled methanol을 처리하여 추가 반응을 중지시키고, 13,475Хg에서 15분 동안 원심분리하여 단백질 침전물로부터 분리 하였다. 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)-photo diode array(HPLC-PDA)로 반응 혼합물을 분석하고, electrospray ionization mass spectrometry(ESI/MS) 및 nuclear magnetic resonance(NMR) 분석으로 확인하였다. 생산 수율은 반응 혼합물에 다양한 10% antioxidants(ascorbic acid)를 첨가함으로써 향상되었다.
3가지 dihydroxybenzenes 모두의 반응 혼합물의 HPLC-PDA 분석은 다중 생성물을 생산하기 위한 각 기질의 glucosylation을 보여준다. 표준 hydroquinone은 8.2분의 retention time(t R)에 mono 생성물로 전환되었으며, multiple 생성물은 t R 6.6분 미만에서 나타났다(도 3A 및 3B). 단일-글루시드 전환에 있어, resorcinol은 t R 10.4분(도 3C 및 3D) 및 catechol은 t R 11분(도 3E 및 3F)으로, 유사한 결과가 관찰되었다. Resorcinol 및 catechol의 다중 글루코시드 생성물은 각각 t R 7.2 내지 t R 8.4분 및 t R 8.2 내지 t R 10.8분에 나타났다. 각 기질의 단일-글루코시드와 함께 hydroquinone, resorcinol 및 catechol에 부착된 gluco-oligosaccharides(glucotriose, glucotetraose, glucopentaose 등)와 결합된 minor 생성물이 검출되었다(도 3). 고분해능 QTOF-ESI/MS를 이용하여 aglycons에 multiple sugar units가 결합된 것을 확인하였다(도 4).
실시예
6:
글리코실전이반응
(
transglycosylation
) 반응 조건의 최적화
상이한 비율, 온도 및 pH에서 필요한 공여체 및 수용체 기질 농도를 연구함으로써 글리코실전이반응을 최적화하였다. 생산 수율 백분율을 기초로 한 최적화 파라미터를 결정하기 위해 HPLC-PDA로 반응 혼합물을 분석하였다.
실시예
6-1:
sucrose
농도의 최적화
Hydroquinone, resorcinol 및 catechol의 반응 혼합물에 50mM 내지 400mM 범위의 상이한 농도의 sucrose를 첨가하고, 각 기질 20mM 및 다른 성분을 일정하게 유지하였다. 상기 반응 성분의 존재 하에 페놀 화합물과 sucrose의 비율을 2.5:1, 5:1, 10:1, 15:1 및 20:1로 변화시켜 동일한 반응을 수행한 후, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 가장 많은 표적 생성물을 생산하는 최대 공여체(sucrose) 기질의 농도 최적화를 통해 생산성을 증가시켰다.
20mM hydroquinone을 transglycosylation 기질로 사용했을 때, 300mM까지 sucrose 농도가 증가함에 따라 하이드로퀴논 단일-글루코시드(arbutin)는 증가하였으며, 추가로 sucrose를 400mM로 증가시켜도 생산량은 일정했다(도 5A). 300 ~ 400mM의 sucrose를 사용하였을 때 hydroquinone의 전환율은 95.1%였다.
Resorcinol의 경우, 레조르시놀 단일-글루코시드가 합성되고, oligosaccharide-conjugated resorcinol(다중-글루코시드)가 생성되었다. 단일-글루코시드의 합성은 200mM의 sucrose 농도까지 연속적으로 증가하였고, 400mM까지 안정적 이었지만, oligosaccharide-conjugated resorcinol 유도체의 생산은 공여체 기질 농도가 400mM로 증가할 때까지 계속 증가했다(도 5B).
Catechol이 기질로 사용될 때, 카테콜 단일-글루코시드의 형성은 100mM sucrose 농도가 될 때까지 증가하고 그 후에 전환율이 감소하게 된다(도 5C). 동시에 oligosaccharide-conjugated catechol은 sucrose 농도가 400mM이 될 때까지 서서히 증가하였다(도 5C).
이러한 결과는 sugar 가수 분해 효소에 의한 resorcinol 및 catechol의 oligosaccharide-결합 생성물의 합성이 최소화됨으로써 단일-글루코시드 생성이 증가함을 시사한다.
실시예
6-2: 온도 최적화
200mM Tris-HCl buffer(pH 7.0), 2mM ascorbic acid, 100mM sucrose 및 20mM 페놀 화합물을 사용하여 35℃ 내지 60℃ 범위의 다양한 배양 온도에서 반응을 수행하였다. Hydroquinone의 transglycosylation 반응을 위한 최적 온도는 40℃인 것으로 밝혀졌다(도 5D). Resorcinol(도 5E) 및 catechol(도 5F)을 사용하였을 때 가장 높은 전환율은 35℃에서 관찰되었다.
실시예
6-3:
sucrose
농도, 온도 및
pH의
최적화
pH 최적화를 위해, pH 5에서 pH 9까지 다양한 범위의 pH 완충액을 다른 반응 성분과 함께 사용하였으며, 반응물을 40℃에서 배양하였다. hydroquinone(98% 전환) 및 resorcinol(43.6% 전환)의 반응은 ~ pH 7에서 최고 생성물을 산출하는 반면, catechol(60.6% 전환)의 경우 pH 8.0에서 가장 높은 생산량을 보였다(도 5G, 5H 및 5I).
실시예
7:
아밀로글루코시드가수분해효소
(
amyloglucosidase
)에 의한
글리코실전이반응
(transglycosylation) 개선
Amyloglucosidase는 oligosaccharides로부터 glucosidic 결합을 가수분해하는데, 전분에서 D-glucose를 상업적으로 생산하기 위한 광범위한 산업적 응용이 가능하다(Selmi B, et al . 2000. Amyloglucosidase hydrolysis of high-pressure and thermally gelatinized corn and wheat starches. J. Agric . Food Chem . 48: 2629-2633.).
페놀 단일-글루코시드 생산 향상을 위해 DgAS 촉매 반응 생성물의 처리에 동일한 amyloglucosidase가 적용되었다. Transglycosylation 반응이 종결된 후 A. niger 유래 효소가 사용되었다. Hydroquinone, resorcinol 및 catechol의 각 반응 혼합물을 처리하기 위해 약 13U/mL amyloglucosidase(최적화된 농도)를 사용하였다. 반응 혼합물로부터 생성물을 형성시키는 동안 HPLC-PDA chromatographic profile로 glucosidase 활성의 효과를 직접 관찰하였다(6C, 6D, 6E 및 6F). Amyloglucosidase 처리는 single sugar-conjugated 생성물을 증가시키면서 oligosaccharide-conjugated 생성물을 감소시켰다. 그러나, 이 현상은 hydroquinone 반응 혼합물에서는 관찰되지 않았다. 생성물의 대부분은 단일-글루코시드(도 6A 및 6B)였다. 이 데이터는 다중-당-결합 생성물을 단일-글루코스-결합 생성물로 전환할 수 있는 가능성을 시사하며, 결과적으로 목표 생성물의 생산이 향상될 수 있다.
실시예
8:
Dihydroxybenzenes
농도의 최적화
최종적으로 배양 온도, pH 및 sucrose 농도의 최적 조건 하에서 각 hydroquinone glucoside, resorcinol glucoside 및 catechol glucoside의 생성을 관찰하였다. 또한, 13U/mL amyloglucosidase로 처리한 후 데이터를 얻었다. Hydroquinone의 transglycosylation 반응을 위해 총 반응 용량은 500μL에서 수행되었다. 다른 반응 성분을 일정하게 유지하면서 기질 농도를 20mM에서 500mM까지 증가시켰다. 50mM 내지 100mM의 sucrose 농도를 최적화하면서, 기질을 생성물로 효율적으로 전환시켰다(도 5A, 5B 및 5C). 반응은 상이한 시간 간격, 즉 각각 0.5시간, 1시간, 3시간, 6시간 및 12시간마다 HPLC-PDA에 의해 분석되었다. 결과는 400mM hydroquinone의 81%가 30분의 배양 시간에서 글루코시드로 전환되었다. 200mM resorcinol의 65% 이상이 30분 내에 글루코시드로 전환되었다(도 7A 및 7B). 마찬가지로, 동일한 배양 시간에 300mM catechol의 94%가 생성물로 전환되었다(도 7C).
60분간의 반응 시간 동안 325.6mM(88.6g/L) hydroquinone glucosides, 130.2mM(35.4g/L) resorcinol glucosides 및 284.4mM(77.4g/L) catechol glucosides를 얻었다. 이는 보고된 바와 비교하여, 짧은 반응 시간동안 hydroquinone glucoside(α-arbutin), resorcinol glucoside, 및 catechol glucoside의 최고 생산량이다.
실시예
9: 생성물의 구조 확인
각각의 반응 생성물을 prep-HPLC로 정제하고, NMR 분석을 통해 단일-글루코시드 또는 다중-당-결합 생성물인지 결정하였다(도 8 내지 도 13). HPLC-PDA chromatogram은 화합물 정제 후 별개의 단일 피크를 나타냈다(도 14). 각 glucoside 생성물의 1H NMR 신호를 기질과 비교하였다. Hydroquinone glucoside는 3.2 내지 4 ppm에서 다른 sugar 양성자의 존재를 포함하여 J value 3.7 Hz, 5.28 ppm에서 anomeric 신호를 나타냈으며, 생성물은 alpha configuration으로 부착된 single sugar인 것으로 확인된다(도 15). Resorcinol glucoside 및 catechol glucoside는 J value 3.7 Hz, 5.43 ppm에서 anomeric 신호를 나타내고, alpha configuration으로 J value 3.5 Hz, 5.28 ppm을 나타내었다.
실시예
10:
아밀로수크라아제(amylosucrase)의
고정화
AMICOGEN LKZ118 beads를 사용하여 효소 고정화 실험을 수행하였다. Beads를 증류수로 3회 세척한 후, 진공 펌프를 사용하여 40초 동안 탈수시켰다. 삼각 플라스크에 약 5g의 beads와 증류수 10.2mL를 넣고 혼합한 다음, .1M Na2SO4를 첨가하여 용해시키고, 25℃에서 100rpm으로 배양하였다. Beads 1그램 당 약 70mg의 효소를 혼합하고, 24시간 동안 100rpm에서 25℃로 고정시켰다. 고정화 후 증류수로 3회 세척하고, 진공 펌프로 다시 40초 동안 탈수시킨 다음, 4℃에서 보관한다. 고정화된 효소 반응은 40℃에서 30분 동안 수행되었다. 반응 배양 시간 동안 반응 혼합물을 격렬하게 진탕(200rpm)하였다. 반응은 200mM Tris-HCl(pH 7.0), 2M sucrose, 400mM hydroquinone, 40mM ascorbic acid 및 300mg DgAS-immobilized beads를 함유하는 5mL 부피에서 수행되었다. Resorcinol 및 catechol을 사용하여 동일한 반응을 수행하였으나, sucrose, 수용체 기질 및 ascorbic acid의 농도를 상이하게 하였다. Resorcinol의 경우, 1M sucrose, 200mM resorcinol 및 20mM ascorbic acid를 사용하였고, catechol 반응 혼합물의 경우, 1.5M sucrose, 300mM catechol 및 20mM ascorbic acid를 사용하였다. 고정화된 효소의 초기 및 최종 농도로부터 고정화 비율을 계산하였다.
고정화된 효소를 세척하고, 50회 반복하여 transglycosylation 시켰다. 각 사이클에서 공급된 dihydroxybenzene의 글루코시드로의 전환을 측정하였다. Hydroquinone의 경우, 반응성은 평균 35회까지 일정하게 유지되었고, 수율은 85% 내지 90%로 유지되었다. 그러나 35회 반복 후 반응성이 급격히 감소했다. 한편, resorcinol 및 catechol은 거의 40배의 반응성을 보였다. resorcinol의 퍼센트 수율은 65%와 70% 사이에서 변했으며, catechol의 수율은 85%와 90% 사이였다(도 16). 고정화된 DgAS를 단일 사이클에서 hydroquinone, catechol 및 resorcinol의 총 glycosylated 생성물의 95g/L, 36.9g/L 및 72.2g/L 최종 농도로 유도하였다. 또한, AMICOGEN LKZ118 beads를 이용한 효소 고정화를 통해 실험 효율을 향상시켜, 동일한 고정화 효소를 사용하여 저렴하고 효율적으로 페놀 글루코시드를 합성할 수 있었다(도 16).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SUNMOON UNIVERSITY INDUSTRY- UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION
<120> Method for Preparing Dihydroxybenzene Glucosides Using
Immobilized Enzyme
<130> P18-B177
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1984
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon optimized dgAS gene
<400> 1
catatgctga aagatgttct gaccagcgaa ctggccgccc aggtgcgtga tgcatttgat 60
gatgatcgtg atgccgaaac ctttctgctg cgtctggaac gctatggtga agatctgtgg 120
gaaagcctgc gtgcagttta tggcgatcag gtgcgtgcac tgccgggtcg tctgctggaa 180
gtgatgctgc atgcatatca tgcacgcccg gcagaactgc gtcgcctgga tgaagcacgc 240
ctgctgcgcc ctgattggct gcagcgtccg gaaatggtgg gttatgtggc atataccgat 300
cgctttgccg gcaccctgaa aggcgttgaa gaacgtctgg attatctgga aggcctgggt 360
gttaaatatc tgcatctgat gccgctgctg cgtccgcgcg aaggtgaaaa tgatggcggt 420
tatgccgttc aggattatcg cgcagttcgt ccggatctgg gtaccatgga tgatctgagc 480
gcactggcac gcgccctgcg tggtagaggt attagcctgg tgctggatct ggtgctgaat 540
catgttgcac gtgaacatgc atgggcccag aaagcccgtg ccggtgaccc taaatatcgc 600
gcatattttc atctgtttcc ggatcgtcgc ggcccggatg cctttgaagc aaccctgccg 660
gaaatttttc cggattttgc accgggtaat tttagttggg atgaagaaat tggcgaaggc 720
gaaggcggct gggtgtggac aacctttaat agctatcagt gggatctgaa ttgggcaaat 780
ccggatgttt ttctggaatt tgttgatatt atcctgtacc tggccaatcg tggcgtggaa 840
gtttttcgtc tggatgcaat tgcattcatt tggaaacgcc tgggtaccga ttgtcagaat 900
cagccggaag ttcatcatct gacccgcgca ctgcgtgcag cagccagaat tgtggcaccg 960
gccgttgcct ttaaagccga agccattgtt gcaccggccg atctgattca ttatctgggt 1020
acccgtgcac atcatggcaa agtgagcgat atggcctatc ataatagcct gatggtgcag 1080
ctgtggagta gcctggccag tcgcaatacc cgtctgtttg aagaagcact gcgtgccttt 1140
ccgccgaaac cgaccagcac cacctggggt ctgtatgtgc gttgtcatga tgatattggc 1200
tgggcaatta gtgatgaaga tgcagcccgc gcaggtctga atggcgcagc acatcgccat 1260
tttctgagtg atttttatag tggtcagttt ccgggtagtt ttgcacgtgg tctggttttt 1320
cagtataatc cggtgaatgg tgaccgccgt attagcggca gcgccgcaag cctggcaggt 1380
ttagaagcag ccctggaaac cggtgacccg ggtcgtattg aagatgcagt tcgccgcctg 1440
ctgctgctgc ataccgttat tctgggtttt ggcggtgttc cgctgctgta tatgggcgat 1500
gaactggccc tgctgaatga ttatgccttt gaagatgtgc cggaacatgc cccggataat 1560
cgctgggtgc atcgcccgca gatggattgg gccctggccg aacgcgtgcg tcaggaacct 1620
agtagcccgg ccggccgtgt taataccggt ctgcgtcatc tgctgcgcgt tcgccgcgat 1680
accccgcaac tgcatgccag tattgaaagc caggttctgc cgagcccgga tagtcgtgca 1740
ctgctgctgc gtcgcgatca tccgctgggt ggtatggttc aggtgtataa ttttagtgaa 1800
gaaaccgtga tgctgccgag tcatgttctg cgtgatgttc tgggtgacca tgttcaggat 1860
cgtctgagtg gtagtgcatt tcgtctggac cgtccgaccg tgcgtctgga aggctatcgt 1920
gcactgtggc tgaccgcagg tgaagcaccg gccctcgagc accatcacca tcaccattaa 1980
gctt 1984
Claims (10)
- (a) 다이하이드록시벤젠(dihydroxybenzene) 및 수크로스(sucrose)를 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 아밀로수크라아제(DgAS)와 함께 혼합하여 글리코실전이반응(transglycosylation)을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 글리코실전이반응으로 생성된 다이하이드록시벤젠 글루코시드를 회수하는 단계;를 포함하며,
상기 (a) 단계의 글리코실전이반응은 하기의 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드(dihydroxybenzene glucoside)의 제조방법:
(i) 다이하이드록시벤젠인 레조르시놀(resorcinol; meta-dihydroxybenzene) 및 수크로스의 몰 농도 비 1:0.25~0.5, 35~50℃ 및 pH 7~8; 또는
(ii) 다이하이드록시벤젠인 카테콜(catechol; ortho-dihydroxybenzene) 및 수크로스의 몰 농도 비 1:0.33~0.67, 35℃ 및 pH 8~9.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오타이드는 데이노코커스 지오써말리스 DSM 11300(Deinococcus geothermalis DSM 11300) 유래 아밀로수크라아제의 뉴클레오타이드 서열을 코돈 최적화한 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 아밀로수크라아제(DgAS)는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 배양하여 제조된 것을 특징으로 하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 제조방법.
- 제3항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 다이하이드록시벤젠 글루코시드는 레조르시놀 글루코시드 또는 카테콜 글루코시드인 것을 특징으로 하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실전이반응은 아밀로글루코시드가수분해효소(amyloglucosidase)를 추가로 첨가하고 수행하는 것을 특징으로 하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 아밀로수크라아제(DgAS)는 담체에 고정화된 것을 특징으로 하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 담체는 에폭시 비드인 것을 특징으로 하는 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 제조방법.
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KR1020180113432A KR102082395B1 (ko) | 2018-09-21 | 2018-09-21 | 고정화된 효소를 이용한 다이하이드록시벤젠 글루코시드의 제조방법 |
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2018
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Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
2018 한국당과학회 연례학술대회, 학생구두발표, pp. 46-47 (2018.07.)* * |
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NCBI GenBank Accession No. ABF44874.1 (2014.01.28.) * |
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