ES2883240T3 - Anticuerpo contra glipicano-3 y aplicación del mismo - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo que reconoce específicamente a glipicano-3, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y su región variable de la cadena pesada comprende: la CDR1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, la CDR2 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 y la CDR3 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; y su región variable de la cadena ligera comprende la CDR1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, la CDR2 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y la CDR3 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78.
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpo contra glipicano-3 y aplicación del mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de la inmunoterapia o diagnóstico de tumores y, en particular, a anticuerpos que reconocen específicamente a glipicano-3 (GPC3) y usos de los mismos.
Antecedentes
En la actualidad, la inmunoterapia adoptiva basada en células efectoras inmunes ha logrado algunos efectos en algunos tumores, y este método de inmunoterapia puede superar los defectos del tratamiento con anticuerpos, sin embargo, los efectos terapéuticos en la mayoría de los tumores aún son insatisfactorios [Grupp SA, et al. Adoptive cellular therapy. Curr Top Microbiol Immunol., 2011; 344: 149-72.]. En los últimos años se descubrió que la especificidad de reconocimiento de los linfocitos citotóxicos (CTLs) a las células diana depende de los receptores de células T (TCRs), scFv de anticuerpos contra antígenos asociados a células tumorales y motivos activadores de señales intracelulares del receptor de linfocitos T CD3 Z o Fc £ RI y se fusionaron con un receptor de antígeno quimérico (CAR), y el linfocito T fue modificado genéticamente por los receptores de antígeno quimérico en su superficie por por medio de, por ejemplo, infección por lentivirus. Tales linfocitos T con CAR son capaces de fijar selectivamente como objetivo linfocitos T a células tumorales y matar específicamente el tumor de una manera no limitante mediante el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC). El linfocito T con CAR es una nueva estrategia de inmunoterapia en el campo de la inmunoterapia tumoral. Al diseñar células efectoras inmunes modificadas con CAR, especialmente células T, los genes del antígeno fijados como objetivo son de hecho una elección crucial. Dada la complejidad de las expresiones de genes in vivo y diversos factores incontrolables, la selección de genes adecuados para un CAR es muy difícil. Además, para muchos antígenos específicos para tumores, es difícil encontrar una molécula específica dirigida contra ellos y adecuada para construir células efectoras inmunes modificadas con CAR.
Glipicano-3 (GPC3, también conocido como DGSX, GTR2-2, MXR7, OCI-5, SDYS, SGB, SGBS o SGBS1) es una proteína de la superficie celular que pertenece a la familia de proteoglicanos de sulfato de heparán. El gen GPC3 codifica una proteína central precursora de aproximadamente 70 kDa que es escindida por furina para producir un péptido amino-terminal (N-terminal) soluble, accesible a la sangre, de aproximadamente 40-kDa y un carboxi-terminal (C- terminal) unido a la membrana que contiene aproximadamente 2 cadenas de azúcar de sulfato de heparán (HS) de aproximadamente 30 kDa. Las proteínas GPC3 se fijan a la membrana celular mediante anclajes de glicosilfosfatidilinositol (GPI).
GPC3 se expresa en gran medida en el hígado fetal, aunque no en el tejido hepático normal de un adulto; sin embargo, su expresión se restablece en el carcinoma hepatocelular y está estrechamente relacionada con el desarrollo y la progresión del carcinoma hepatocelular. GPC3 no solo se detecta en gran medida en la fase temprana del carcinoma hepatocelular, sino que la tasa de detección también aumenta con el desarrollo de cáncer de hígado. La expresión de GPC3 no se detectó en adenocarcinoma de hígado, colangiocarcinoma, metástasis hepática y 12 tumores sólidos comunes y 21 líneas celulares que no son de hepatoma. Además, GPC3 también se expresa en tumores tales como melanoma, carcinoma de células claras de ovario, tumor del saco vitelino y neuroblastoma. GPC3 se considera una diana candidata para la inmunoterapia tumoral a la vista de la alta expresión específica de GPC3 en tumores tales como carcinoma hepatocelular y melanoma.
Se ha informado de protocolos para la detección de cáncer de hígado utilizando anticuerpos anti-GPC3 y ensayos de citotoxicidad dependientes de anticuerpos (ADCC) o dependientes del complemento (CDC) utilizando anticuerpos anti-GPC3. El anticuerpo GC33 descrito en el documento CN200580000807.4 estaba en la fase I de la investigación clínica, mientras que la aplicación clínica aún no está clara. Otros anticuerpos anti-GPC3 y sus usos se describen en los documentos WO 2012/145469, WO 2009/012394, Yonghai et al. (BMC BIOTECHNOLOGY, BIOMED CENTRAL LTD., 2012, 12(1) p.23), WO 2013/070468, WO 2014/180306 y Mingqian et al. (FEBS LETTERS, 2013, 588(2) 377 382).
Los anticuerpos anti-GPC3 pueden utilizarse no solo como anticuerpos terapéuticos, sino también como inmunoterapias tales como linfocitos T para diagnóstico y modificación del receptor de antígeno quimérico (CAR). La investigación actual demuestra que diferentes anticuerpos pueden tener una inmunogenicidad diferente, y dicha inmunogenicidad conducirá a los efectos terapéuticos y los efectos secundarios de un anticuerpo o su agente terapéutico derivado. Por ejemplo, las células T con CAR basadas en anticuerpos anti-mesotelina de ratón pueden provocar reacciones alérgicas que afectan a su supervivencia a largo plazo en el cuerpo humano. A la vista de las consideraciones anteriores, existe una necesidad en la técnica de una optimización adicional y una preparación de nuevos anticuerpos anti-GPC3 que tengan una buena actividad de exterminio de tumores y excelentes perspectivas de aplicación clínica cuando se apliquen en tumores sólidos, de modo que los anticuerpos GPC3 puedan ser eficazmente utilizados en el diagnóstico y tratamiento de tumores, y beneficia a los pacientes.
Sumario de la invención
Es un objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos anti-glipicano-3 y usos de los mismos.
En el primer aspecto de la presente divulgación, se proporciona un anticuerpo que reconoce específicamente al glipicano-3 (GPC3), y el anticuerpo tiene una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, y
La CDR1 de la región variable de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69;
la CDR2 de la región variable de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70;
la CDR3 de la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20;
la CDR1 de la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64;
la CDR2 de la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 71;
la CDR3 de la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 72.
En un aspecto preferido de dicha divulgación, el anticuerpo comprende
anticuerpo (a) (P7D4), y su región variable de la cadena ligera tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 16, la CDR2 de SEQ ID n O: 18 y la CDR3 de SEQ ID NO: 20, o su región variable de la cadena pesada tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 10, la CDR2 de SEQ ID NO: 12 y la CDR3 de SEQ ID NO: 14;
anticuerpo (b) (am4), y su región variable de la cadena ligera tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 16, la CDR2 de SEQ ID NO: 18 y la CDR3 de SEQ ID NO: 20; o su región variable de la cadena pesada tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 60, la CDR2 de SEQ ID NO: 61 y la CDR3 de SEQ ID NO: 14;
anticuerpo (c) (am14), y su región variable de la cadena ligera tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 16, la CDR2 de SEQ ID NO: 18 y la CDR3 de SEQ ID NO: 20, o su región variable de la cadena pesada tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 62, la CDR2 de SEQ ID NO: 63 y la CDR3 de SEQ ID NO: 14;
anticuerpo (d) (am20), y su región variable de la cadena ligera tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 16, la CDR2 de SEQ ID NO: 18 y la c Dr 3 de SEQ ID NO: 20; o su región variable de la cadena pesada tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 64, la CDR2 de SEQ ID NO: 65 y la CDR3 de SEQ ID NO: 14;
anticuerpo (e) (am35), y su región variable de la cadena ligera tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 67, la CDR2 de SEQ ID NO: 68 y la c Dr 3 de SEQ ID NO: 20; o su región variable de la cadena pesada tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 10, la CDR2 de SEQ ID NO: 66 y la CDR3 de SEQ ID NO: 14;
anticuerpo (f) (am42), y su región variable de la cadena ligera tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 69, la CDR2 de SEQ ID NO: 70 y la CDR3 de SEQ ID NO: 20, o su región variable de la cadena pesada tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 10, la CDR2 de SEQ ID NO: 66 y la CDR3 de SEQ ID NO: 14;
anticuerpo (g) (T2-23), y su región variable de la cadena ligera tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 16, la CDR2 de SEQ ID NO: 70 y la CDR3 de SEQ ID NO: 20, o su región variable de la cadena pesada tiene la CDR1 de SEQ ID NO: 10, la CDR2 de SEQ ID NO: 71 y la CDR3 de SEQ ID NO: 72;
anticuerpo (h), que reconoce el mismo determinante antigénico que el reconocido por el anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de (a) a (g).
En otro aspecto preferido de dicha divulgación, el anticuerpo que reconoce específicamente el glipicano-3 (GPC3) puede ser un anticuerpo de cadena sencilla (scFV), un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de dominio, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab’)2 y un derivado del mismo u otras formas de anticuerpo; preferiblemente anticuerpo de cadena sencilla.
En otro aspecto preferido de dicha divulgación, el anticuerpo que reconoce específicamente al glipicano-3 (GPC3) está humanizado o está completamente humanizado; de preferencia completamente humanizado.
En otro aspecto preferido de dicha divulgación, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (a) (P7D4) se muestra en las posiciones 1-121 de SEQ ID NO: 4; o la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 137-247 de SEQ ID NO: 4;
la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (b) (am4) se muestra en las posiciones 1-121 de SEQ ID NO: 25; o la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 137-247 de SEQ ID NO: 25;
la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (c) (am14) se muestra en las posiciones 1-121 de SEQ ID NO: 27; o la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 137-247 de SEQ ID NO: 27;
la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (d) (am20) se muestra en las posiciones 1-121 de SEQ ID NO: 29; o la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 137-247 de SEQ ID NO: 29;
la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (e) (am35) se muestra en las posiciones 1-121 de SEQ ID NO: 31; o la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 137-247 de SEQ ID NO: 31;
la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (f) (am42) se muestra en las posiciones 1-121 de SEQ ID NO: 33; o la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 137-247 de SEQ ID NO: 33; o
la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (g) (T2-23) se muestra en las posiciones 1-121 de SEQ ID NO: 35; o la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 137-247 de SEQ ID NO: 35.
En un aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo que reconoce específicamente al glipicano-3 (GPC3), que es un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera. Su región variable de la cadena pesada comprende: la CDR1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, la CDR2 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 y la CDR3 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; o su región variable de la cadena ligera comprende la CDR1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, la CDR2 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y la CDR3 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78.
En una realización preferida de la invención, el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 o una región variable de la cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.
En una realización preferida de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y su cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 y su cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica los anticuerpos precedentes de acuerdo con la invención.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico. En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula huésped que comprende el vector de expresión o que tiene el ácido nucleico integrado en su genoma.
En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso in vitro de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la preparación de un fármaco fijado como objetivo, un conjugado anticuerpo-fármaco o un anticuerpo polifuncional que fija específicamente como objetivo a células tumorales que expresan glipicano-3; o para la preparación de un reactivo para diagnosticar un tumor que expresa glipicano-3; o para la preparación de células inmunes modificadas con receptor de antígeno quimérico.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un inmunoconjugado multifuncional, que comprende: un anticuerpo de acuerdo con la presente invención; y una molécula funcional enlazada al mismo (que incluye enlazada covalentemente, conjugada, unida, adsorbida); y la molécula funcional se selecciona de un grupo que consiste en una molécula que fija como objetivo un marcador de superficie tumoral, una molécula supresora de tumores, una molécula que fija como objetivo un marcador de superficie de una célula inmunitaria o un marcador detectable.
En una realización preferida, en el inmunoconjugado multifuncional, la molécula que fija como objetivo un marcador de superficie tumoral es un anticuerpo o ligando que se une a un marcador de superficie tumoral; o la molécula supresora de tumores es una citoquina antitumoral o una toxina antitumoral; y preferiblemente, la citoquina incluye, pero no se limita a: IL-12, IL-15, IFN-beta y TNF-alfa.
En otra realización preferida, el marcador detectable en el inmunoconjugado multifuncional incluye un marcador fluorescente y un marcador cromogénico.
En otra realización preferida, en el inmunoconjugado multifuncional, el anticuerpo que se une a un marcador de superficie tumoral se refiere a un anticuerpo que reconoce antígenos distintos de glipicano-3, en donde los otros antígenos incluyen: EGFR, EGFRvIII, mesotelina, HER2, EphA2, Her3, EpCAM, MUCl, MUC16, CEA, Claudina 18.2, receptor de folato, Claudina 6, WT1, NY-ESO- 1, MAGE 3, ASGPR1 o c Dh 16.
En otra realización preferida, en el inmunoconjugado multifuncional, la molécula que fija como objetivo al marcador de superficie de la célula inmune es un anticuerpo que se une al marcador de superficie de células T, que puede formar un anticuerpo bifuncional que se acopla a las células T con uno cualquiera de los anticuerpos de acuerdo con de la invención (acoplador biespecífico de células T, BiTE).
En otra realización preferida, en el inmunoconjugado multifuncional, el anticuerpo que se une al marcador de superficie de la célula inmune es un anticuerpo anti-CD3.
En otra realización preferida, el anticuerpo anti-CD3 es un anticuerpo de cadena sencilla (scFV), un anticuerpo monoclonal, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab’)2 y un derivado del mismo, o un anticuerpo de otra forma; preferiblemente anticuerpo de cadena sencilla.
En otra realización preferida, el anticuerpo anti-CD3 es humanizado, quimérico, completamente humano o murino. En otra realización preferida, el inmunoconjugado multifuncional es un péptido de fusión y, además, comprende un péptido enlazador (enlazador) entre los anticuerpos de acuerdo con la invención y la molécula funcional enlazada al mismo.
En otra realización preferida, el péptido enlazador tiene la secuencia (GlyGlyGlyGlySer)n, en donde n es un número entero de 1 a 5; más preferiblemente, n = 3.
En otra realización preferida, el inmunoconjugado multifuncional se administra en forma de polipéptido o en forma de administración génica.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica una cualquiera de los inmunoconjugados multifuncionales arriba descritos.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso in vitro de uno cualquiera de los inmunoconjugados multifuncionales arriba descritos, para la preparación de un agente antineoplásico o un agente para el diagnóstico de tumores que expresan glipicano-3; o para la preparación de células inmunes modificadas con receptor de antígeno quimérico. Preferiblemente, las células inmunes incluyen linfocitos T, células NK o linfocitos NKT.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención, y el receptor de antígeno quimérico comprende: un anticuerpo de acuerdo con la invención, una región de transmembrana y una región de señal intracelular, que están enlazados secuencialmente; y la región de señal intracelular se selecciona de un grupo que consiste en secuencias de la región de señal intracelular de CD3Z, FceRIy, CD27, CD28, CD137, CD134, MyD88, CD40 o una combinación de los mismos. En otra realización preferida, la región de transmembrana en el receptor de antígeno quimérico comprende una región de transmembrana de CD8 o CD28.
En otra realización preferida, en el receptor de antígeno quimérico, el receptor de antígeno quimérico comprende el siguiente anticuerpo conectado secuencialmente, una región de transmembrana y una región de señal intracelular: un anticuerpo de acuerdo con la invención, CD8 y CD3Z; un anticuerpo de acuerdo con la invención, CD8, CD137 y CD3Z; un anticuerpo de acuerdo con la invención, la región de transmembrana de la molécula CD28, la región de señalización intracelular de la molécula CD28 y CD3Z; o un anticuerpo de acuerdo con la invención, la región transmembrana de la molécula CD28, la región de señalización intracelular de la molécula CD28, CD137 y CD3Z.
En otra realización preferida, en el receptor de antígeno quimérico, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla. En otra realización preferida, el receptor de antígeno quimérico comprende:
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85;
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; o
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87.
De acuerdo con la presente divulgación, el receptor de antígeno quimérico comprende:
SEQ ID NO: 49 o la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 22-346 de la misma;
SEQ ID NO: 50 o la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 22-447 de la misma;
SEQ ID NO: 51 o la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 22-491 de la misma;
SEQ ID NO: 52 o la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 22-494 de la misma;
SEQ ID NO: 53 o la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 22-536 de la misma.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico. En otra realización preferida de la presente divulgación, el ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico comprende:
SEQ ID NO: 44 o la secuencia de nucleótidos mostrada en las posiciones 380-1420 o 443-1420;
SEQ ID NO: 45 o la secuencia de nucleótidos mostrada en las posiciones 380-1723 o 443-1723;
SEQ ID NO: 46 o la secuencia de nucleótidos mostrada en las posiciones 380-1855 o 443-1855;
SEQ ID NO: 47 o la secuencia de nucleótidos mostrada en las posiciones 380-1864 o 443-1864;
SEQ ID NO: 48 o la secuencia de nucleótidos mostrada en las posiciones 380-1990 o 443-1990;
En otra realización preferida de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico comprende:
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 85;
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 87; o
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 89.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico. En otra realización preferida, el vector de expresión se deriva del plásmido lentivírico pWPT (o pWPT-eGFP).
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un virus que comprende dicho vector.
Se proporciona el uso in vitro del receptor de antígeno quimérico, o un ácido nucleico codificante del mismo, o un vector de expresión o virus que comprende el ácido nucleico para la preparación de células inmunes modificadas genéticamente que fijan como objetivo al tumor que expresa glipicano-3.
En otra realización preferida, el tumor que expresa glipicano-3 incluye (pero no se limita a) cáncer de hígado, melanoma, carcinoma de células claras de ovario, tumor del saco vitelino y neuroblastoma.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula inmune modificada genéticamente, que comprende un ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico o un vector de expresión o un virus que contiene el ácido nucleico; o tiene el receptor de antígeno quimérico expresado en su superficie.
En otra realización preferida, las células inmunes llevan, además, una secuencia codificante exógena de citoquinas; y preferiblemente, las citoquinas incluyen IL-12, IL-15 o IL-21.
En otra realización preferida, la célula inmune también expresa otro receptor de antígeno quimérico que no contiene CD3Z pero contiene el dominio de señalización intracelular de CD28, el dominio de señalización intracelular de CD137 o una combinación de ambos.
En otra realización preferida, la célula inmune expresa, además, un receptor de quimioquina; y preferiblemente, el receptor de quimioquina incluye: CCR2.
En otra realización preferida, la célula inmune expresa, además, ARNip que puede reducir la expresión de PD-1 o una proteína que bloquea PD-L1.
En otra realización preferida, la célula inmune expresa, además, un interruptor de seguridad; y preferiblemente, el interruptor de seguridad incluye iCaspasa-9, EGFR Truncado o RQR8.
En otra realización preferida, las células inmunes incluyen linfocitos T, células NK o células NKT.
En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso in vitro de las células inmunes modificadas genéticamente para la preparación de un fármaco inhibidor de tumores, y el tumor es un tumor que expresa glipicano-3.
En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica (que incluye un medicamento o reactivo de diagnóstico), que comprende:
anticuerpo de acuerdo con la invención o un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de acuerdo con la invención; o
cualquiera de los inmunoconjugados de acuerdo con la invención o un ácido nucleico que codifica el conjugado de acuerdo con la invención; o
cualquiera de los receptores de antígenos quiméricos de acuerdo con la invención o un ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico de acuerdo con la invención; o
cualquiera de las células inmunes modificadas genéticamente de acuerdo con la invención.
Otros aspectos de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la divulgación en esta memoria.
Descripción de dibujos
La Figura 1 (que no forma parte de la invención) muestra la unión de los anticuerpos P1B12E y P7D4 a GPC3 humano y BSA de control en un ensayo ELISA de fago único. Los valores de los anticuerpos P1B12E y P7D4 contra GPC3 humano y BSA de control negativo demuestran que los dos anticuerpos seleccionados pueden unirse específicamente a GPC3 humano.
La Figura 2 (que no forma parte de la invención) muestra la electroforesis de purificación de anticuerpos contra GPC3 humano.
La Figura 3 (que no forma parte de la invención) muestra el análisis de la actividad de unión de los anticuerpos scFv-P1 B12E-Fc y scFv-P7D4-Fc a células HepG2 positivas para la expresión de GPC3.
La Figura 4 (que no forma parte de la invención) muestra el análisis SPR de la capacidad de unión de los anticuerpos de la serie P7D4 a GPC3.
La Figura 5 (que no forma parte de la invención) muestra anticuerpos de la serie P7D4 que se unen específicamente a GPC3 humano recombinante.
La Figura 6 muestra la electroforesis en SDS PAGE de la proteína GPC3 expresada y purificada.
La Figura 7 muestra el análisis cinético de la unión del anticuerpo Y035 a GPC3 humano.
La Figura 8 muestra el análisis cinético de la unión del anticuerpo 5A5 a GPC3 humano.
La Figura 9 muestra el anticuerpo Y035 que se une específicamente a células HepG positivas para la expresión de GPC3.
Modos para llevar a cabo la invención
Tras una intensa investigación y rastreo, los autores de la invención obtuvieron anticuerpos que reconocen específicamente a GPC3, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos humanizados. El anticuerpo de la presente invención se puede utilizar para preparar diversos fármacos antitumorales fijadores de objetivo y fármacos para diagnosticar tumores.
Anticuerpo anti-GPC3
Los presentes autores de la invención rastrearon y obtuvieron anticuerpos específicos con buenas propiedades de unión a GPC3 en colecciones de anticuerpos naturales totalmente humanos, y los sometieron adicionalmente a mutaciones de aminoácidos para obtener anticuerpos anti-GPC3 con una afinidad significativamente incrementada, y los autores de la invención también encontraron regiones CDR clave para que ejerzan sus propiedades de unión.
Los autores de la invención también obtuvieron un anticuerpo de ratón contra GPC3 utilizando la técnica de hibridoma, lo humanizaron y obtuvieron un anticuerpo anti-GPC3 humanizado mediante comparación repetida con una propiedad de unión extremadamente excelente a GPC3 y también se encontraron regiones CDR clave para su comportamiento de unión.
Los anticuerpos de la invención pueden ser moléculas de inmunoglobulina intactas o fragmentos de unión a antígeno que incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, fragmentos Fd, fragmentos Fv, fragmentos F(ab’)2, fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpo de cadena sencilla (scFv), anticuerpo de dominio, anticuerpo de cadena sencilla bivalente, anticuerpo fago de cadena sencilla, diacuerpo biespecífico, anticuerpo de cadena triple, anticuerpo de cadena cuádruple.
Las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo pueden describirse mediante tres regiones específicas ubicadas en regiones variables de las cadenas pesada y ligera, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), que dividen las regiones variables en cuatro regiones marco (FR), y las secuencias de aminoácidos de cuatro FRs son relativamente conservadoras y no están implicadas directamente en la reacción de unión. Estas CDRs forman una estructura de bucle, en la que los pliegues p formados por las FRs se ubican cerca unos de otros en el espacio y el sitio de unión al antígeno del anticuerpo está constituido por CDRs en la cadena pesada y las CDRs en la cadena ligera correspondiente. Es posible determinar qué aminoácidos componen las regiones FR o CDR comparando las secuencias de aminoácidos del mismo tipo de anticuerpo. Las regiones CDR son secuencias de proteínas inmunológicamente interesantes y las regiones CDR de los anticuerpos de la invención son completamente nuevas. El anticuerpo puede comprender dos, tres, cuatro, cinco o las seis regiones CDR descritas en esta memoria.
Otro aspecto de la invención incluye variantes funcionales de los anticuerpos descritos en esta memoria. Si la variante es capaz de competir con el anticuerpo parental por la unión específica a GPC3, su capacidad de reconocer GPC3 expresada en la superficie de las células tumorales es cercana a la de los anticuerpos específicos proporcionados en los Ejemplos de la presente invención. Las variantes funcionales pueden tener modificaciones de secuencia conservativas, incluyendo sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Estas modificaciones se pueden introducir mediante técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis aleatoria mediada por PCR, y pueden incluir nucleótidos y aminoácidos tanto naturales como no naturales. Preferiblemente, la modificación de la secuencia ocurre en una región fuera de la región CDR del anticuerpo.
Inmunoconjugado
En la presente invención, también se proporciona un inmunoconjugado multifuncional, que comprende los anticuerpos de acuerdo con la invención y comprende, además, al menos una molécula funcional de otro tipo. La molécula funcional se selecciona de, pero no se limita a una molécula que fija como objetivo un marcador de superficie tumoral, una molécula supresora de tumores, una molécula que fija como objetivo un marcador de superficie de una célula inmune o un marcador detectable. El anticuerpo y la molécula funcional pueden formar un conjugado por unión covalente, acoplamiento, fijación, reticulación o similares.
Como un modo preferido, el inmunoconjugado puede comprender un anticuerpo de la invención y al menos una molécula que fija como objetivo un marcador de superficie tumoral o una molécula supresora de tumores. La molécula supresora de tumores pueden ser citoquinas antitumorales o toxinas antitumorales. Preferiblemente, las citoquinas incluyen, pero no se limitan a IL-12, IL-15, IFN-beta, TNF-alfa. Las moléculas que se fijan como objetivo marcadores de la superficie tumoral, por ejemplo, pueden actuar de forma sinérgica con los anticuerpos de la invención para fijar con mayor precisión como objetivo a las células tumorales.
Como un modo preferido, el inmunoconjugado puede comprender un anticuerpo de la presente invención y un marcador detectable. Marcadores detectables de este tipo incluyen, pero no se limitan a marcadores fluorescentes, marcadores cromogénicos, tales como enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. También se puede incluir más de un marcador. El marcador utilizado para marcar el anticuerpo con el fin de detección y/o análisis y/o diagnóstico depende de la técnica y/o método particular de detección / análisis / diagnóstico utilizado, p. ej., muestras de tinción inmunohistoquímica (tejido), citometría de flujo y similares. Los expertos en la técnica conocen bien marcadores adecuados para técnicas de detección / análisis / diagnóstico y/o métodos conocidos en la técnica.
Como modo preferido, el inmunoconjugado puede comprender un anticuerpo de la invención, así como una molécula que fija como objetivo un marcador de superficie de una célula inmune. La molécula que fija como objetivo marcadores de superficie de células inmunes puede reconocer las células inmunes y transportar los anticuerpos de la invención a
las células inmunes, de modo que los anticuerpos de la invención pueden fijar como objetivo las células inmunes a las células tumorales y, por lo tanto, activar el inmunocito para matar específicamente el tumor.
Como un medio para generar químicamente un inmunoconjugado por conjugación, ya sea directa o indirectamente (p. ej., mediante un enlazador), el inmunoconjugado se puede producir como una proteína de fusión que comprende un anticuerpo de la invención y otras proteínas adecuadas. La proteína de fusión puede producirse mediante un método conocido en la técnica, por ejemplo puede producirse de forma recombinante construyendo y posteriormente expresando la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo en marco con una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador adecuado.
En otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica al menos un anticuerpo de la invención, una variante funcional o un inmunoconjugado del mismo. Una vez obtenida la secuencia relevante, el método de recombinación se puede utilizar para obtener la secuencia relevante en grandes cantidades. Esto generalmente se hace clonándolo en un vector, transfiriéndolo a una célula y luego aislando la secuencia relevante de las células huésped en proliferación mediante métodos convencionales.
La presente invención también se refiere a vectores que comprenden las secuencias de ADN apropiadas arriba descritas, así como promotores o secuencias de control apropiados. Estos vectores se pueden utilizar para transformar una célula huésped apropiada para permitir la expresión de la proteína. La célula huésped puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana; o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura; o una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero.
Receptor de antígeno quimérico y célula inmune modificada genéticamente
En la presente invención, se proporciona un receptor de antígeno quimérico expresado en la superficie de una célula efectora inmune (célula inmune), en donde el receptor de antígeno quimérico comprende secuencialmente enlazada: región de unión extracelular, región de transmembrana y región de señal intracelular, y la región de unión extracelular comprende el anticuerpo de la invención. Al expresar el receptor de antígeno quimérico en la superficie de células efectoras inmunes, las células efectoras inmunes pueden tener un efecto citotóxico altamente específico sobre las células tumorales que expresan GPC3.
Tal como se utiliza en esta memoria, "células inmunes" y "células efectoras inmunes" se utilizan indistintamente e incluyen: células NKT y similares; y preferiblemente, células NK y linfocitos T.
Como una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo contenido en el receptor de antígeno quimérico es un anticuerpo de cadena sencilla, que está conectado a CD8 o la región de transmembrana de CD28 a través de la región bisagra de CD8, y la región de transmembrana es seguida inmediatamente por la región de señal intracelular.
La invención también incluye ácidos nucleicos que codifican los receptores de antígenos quiméricos de la invención. La presente invención también se refiere a variantes de los polinucleótidos arriba descritos, que codifican un polipéptido, o un fragmento, análogo y derivado del polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la presente invención.
La región de transmembrana del receptor de antígeno quimérico puede seleccionarse de la región de transmembrana de una proteína tal como CD8 o CD28. La proteína CD8 humana es un heterodímero compuesto por dos cadenas, ap o y5. En una realización de la invención, la región de transmembrana se selecciona de la región de transmembrana de CD8a o CD28. Además, la bisagra de CD8a es una región flexible, de modo que CD8 o CD28 y la región de transmembrana, así como la región bisagra se utilizan para conectar el dominio de reconocimiento de la diana scFv del receptor de antígeno quimérico CAR a la región de señal intracelular.
La región de señal intracelular puede seleccionarse de un grupo que consiste en la región de señal intracelular de proteína CD3Z, FcsRIy, CD27, CD28, CD137, CD134, MyD88, CD4 y combinaciones de las mismas. La molécula CD3 consiste en cinco subunidades, en las que la subunidad CD3Z (también conocida como CD3 zeta, abreviada como Z) contiene 3 motivos ITAM que son importantes regiones de transducción de señales en el complejo TCR-CD3. CD35Z es una secuencia CD3Z truncada sin motivo ITAM y generalmente se construye en la presente invención como control negativo. FcsRIy se distribuye principalmente en la superficie de mastocitos y basófilos, que contiene un motivo ITAM, que es similar a CD3Z en estructura, distribución y función. Además, como se mencionó arriba, CD28, CD137 y CD134 son moléculas de señalización co-estimuladoras. El efecto co-estimulador de sus segmentos de señalización intracelular al unirse a los ligandos respectivos da como resultado la proliferación continua de células efectoras inmunes, principalmente linfocitos T, y un aumento en el nivel de citoquinas tales como IL-2 e IFN-y secretadas por células efectoras inmunes, y aumentan el período de supervivencia y el efecto antitumoral de las células efectoras inmunes CAR in vivo.
El receptor de antígeno quimérico de la presente invención se puede unir secuencialmente como sigue:
El anticuerpo de la invención, CD8 y CD3 Z ;
El anticuerpo de la invención, CD8, CD137 y CD3 Z ;
El anticuerpo de la invención, la región transmembrana de la molécula CD28, la región señal intracelular de la molécula CD28 y CD3 Z ; o
El anticuerpo de la invención, la región transmembrana de la molécula CD28, la región señal intracelular de la molécula CD28, CD137 y CD3 Z.
Y combinaciones de los mismos, en donde CD28a en la proteína receptor de antígeno quimérico relevante representa la región transmembrana de la molécula CD28 y CD28b representa la región de señal intracelular de la molécula CD28. A los diversos receptores de antígenos quiméricos arriba descritos se les alude colectivamente como scFv (GPC3) -CAR.
La presente invención también proporciona un vector que comprende el ácido nucleico arriba mencionado que codifica una proteína receptor de antígeno quimérico de la invención expresada en la superficie de una célula efectora inmune. En una realización específica, el vector utilizado en la presente invención es un vector plasmídico lentivírico pWPT-eGFP. Este plásmido pertenece a la tercera generación del sistema de vector lentiviral auto-activante. El sistema tiene tres plásmidos, el plásmido empaquetador psPAX2 que codifica la proteína Gag / Pol, que codifica la proteína Rev; el plásmido de la envoltura PMD2.G que codifica la proteína VSV-G; y vector vacío pWPT-eGFP, que puede utilizarse para la introducción recombinante de una secuencia de ácido nucleico de interés, es decir, un ácido nucleico que codifica CAR. En el vector vacío pWPT-eGFP, la expresión de la proteína fluorescente verde potenciada (eGFP) está regulada por el promotor del factor de elongación 1a (Ef-1a). Mientras que en el vector de expresión recombinante pWPT-eGFP-F2A-CAR que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR, la co-expresión de eGFP y CAR se logra mediante la omisión de la secuencia de salto ribosómico 2a (abreviada como F2A) del virus de la fiebre aftosa (FMDV).
La invención también incluye virus que comprenden los vectores arriba descritos. Los virus de la invención incluyen virus infecciosos empaquetados, así como virus a empaquetar que contienen los componentes necesarios para el empaquetamiento en virus infecciosos. Otros virus conocidos en la técnica que pueden utilizarse para transducir genes exógenos en células efectoras inmunes y sus correspondientes vectores plasmídicos también son útiles en la presente invención.
La presente invención incluye, además, un linfocito T genéticamente modificado, que comprende un ácido nucleico de la presente invención o transducido con el plásmido recombinante arriba mencionado que contiene el ácido nucleico de la presente invención o un sistema viral que contiene el plásmido. En la presente invención se pueden utilizar métodos de transducción de ácido nucleico convencionales en la técnica, incluyendo métodos de transducción no virales y virales. Métodos de transducción no viral incluyen métodos de electroporación y transposón. Recientemente, el instrumento de transfección nuclear nucleofector desarrollado por Amaxa puede introducir directamente genes extraños en el núcleo para lograr una transducción altamente eficiente de genes diana. Además, en comparación con la electroporación convencional, la eficiencia de transducción del sistema de transposón basado en el sistema Sleeping Beauty o el transposón PiggyBac mejoró significativamente. Se ha informado de la combinación del instrumento de transfección nucleofector y el sistema de transposón SB Sleeping Beauty [Davies JK., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010, 70(10): OF1-10.], y mediante este método se puede lograr una alta eficiencia de transducción e integración dirigida al sitio de los genes diana. En una realización de la invención, el método de transducción de un linfocito T modificado por un gen receptor de antígeno quimérico es un método de transducción basado en un virus tal como un retrovirus o un lentivirus. El método tiene las ventajas de una alta eficiencia de transducción y una expresión estable del gen exógeno, y se puede acortar el tiempo para cultivar linfocitos T in vitro hasta el nivel clínico. El ácido nucleico transducido se expresa en la superficie de los linfocitos T transgénicos por transcripción, traducción. El ensayo de citotoxicidad in vitro realizado en diversas células tumorales cultivadas demostró que las células efectoras inmunes de la presente invención tienen efectos de exterminio de células tumorales altamente específicos (también conocidos como citotoxicidad). Por lo tanto, el ácido nucleico que codifica una proteína receptor de antígeno quimérico de la presente invención, un plásmido que comprende el ácido nucleico, un virus que comprende el plásmido y células efectoras inmunes transgénicas transfectadas con el ácido nucleico, plásmido o virus arriba descritos pueden utilizarse eficazmente en la inmunoterapia de tumores.
Las células inmunes de la presente invención también pueden llevar secuencias codificantes exógenas para citoquinas, que incluyen, pero no se limitan a IL-12, IL-15 o IL-21. Estas citoquinas tienen actividad inmunomoduladora o antitumoral, potencian la función de las células T efectoras y las células NK activadas, o ejercen directamente efectos antitumorales. Por lo tanto, los expertos en la técnica comprenderán que el uso de estas citoquinas ayudará a que las células inmunes funcionen mejor.
Además del receptor de antígeno quimérico de la invención arriba descrito, las células inmunes de la presente invención también pueden expresar otro receptor de antígeno quimérico, que no contiene CD3Z, pero contiene el
dominio de señalización intracelular de CD28 y el dominio de señal intracelular de CD 137, o una combinación de ambos.
Las células inmunes de la presente invención también pueden expresar receptores de quimioquinas; los receptores de quimioquinas incluyen, pero no se limitan a CCR2. Una persona experta comprenderá que el receptor de quimioquinas CCR2 puede unirse competitivamente a CCR2 en el cuerpo y es beneficioso para bloquear la metástasis del tumor.
Las células inmunes de la presente invención también pueden expresar ARNip que pueden reducir la expresión de PD-1 o proteínas bloqueadoras de PD-L1. Una persona experta comprenderá que el bloqueo competitivo de la interacción entre PD-L1 y su receptor PD-1 facilitará la recuperación de respuestas de células T antitumorales, inhibiendo con ello el crecimiento del tumor.
Las células inmunes de la presente invención también pueden expresar un interruptor de seguridad; preferiblemente el interruptor de seguridad incluye iCaspasa-9, EGFR Truncado o RQR8.
Composición farmacéutica
Los anticuerpos, inmunoconjugados que comprenden los anticuerpos y células inmunes modificadas genéticamente de la presente invención pueden utilizarse en la preparación de una composición farmacéutica o reactivo de diagnóstico. Además de una cantidad eficaz del anticuerpo, conjugado inmunológico o célula inmune, la composición puede comprender, además, un soporte farmacéuticamente aceptable. La expresión «farmacéuticamente aceptable» significa que cuando las entidades moleculares y composiciones se administran adecuadamente a animales o seres humanos, no provocan reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones adversas.
Ejemplos específicos de algunas de las sustancias que pueden utilizarse como soportes o componentes farmacéuticamente aceptables de las mismas son azúcares, tales como lactosa, dextrosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y fécula de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y metilcelulosa; goma de tragacanto; malta; gelatina; talco; lubricantes sólidos, tales como ácido esteárico y estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y manteca de cacao; alcoholes polihídricos, tales como propilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico; emulsionantes, tales como Tween®; agentes humectantes, tales como lauril sulfato de sodio; agentes colorantes; agentes aromatizantes; comprimidos, estabilizadores; antioxidantes; conservantes; agua apirógena; soluciones salinas isotónicas; y tampones fosfato y similares.
La composición de la presente invención se puede preparar en diversas formas de dosificación según sea necesario, y un médico puede determinar la dosificación a administrar a un paciente de acuerdo con factores, tales como el tipo, la edad, el peso corporal y el estado general de la enfermedad de un paciente, modo de administración y similares. Por ejemplo, se puede utilizar una inyección u otro tratamiento.
La presente invención se describe adicionalmente a continuación con referencia a realizaciones específicas. Debe entenderse que estos ejemplos son solo para ilustrar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la presente invención, que en el sentido más amplio es como se define en las reivindicaciones adjuntas. Los procesos experimentales en los siguientes ejemplos, en los que no se indican condiciones específicas, se llevan a cabo generalmente de acuerdo con las condiciones descritas en las condiciones habituales, tales como las compiladas por J. Sambrook et al., Molecular Cloning Experiments Guide, Tercera Edición, Science Press, 2002, o de acuerdo con las condiciones sugeridas por el fabricante.
Ejemplo 1. Preparación de un anticuerpo de cadena sencilla específico (scFv) que se une a GPC3 humano (no forma parte de la invención)
1.1 Rastreo de anticuerpos de unión específicos para GPC3 basados en la presentación de fagos
Utilizando la tecnología de presentación en fagos, se rastreó el anticuerpo específico para GPC3 humano (al que se alude en lo sucesivo como huGPC3) de la colección de anticuerpos naturales totalmente humanos. Para este fin, se inocularon bacterias de glicerol (adquiridas en Shanghai Rui Jin Biotechnology Co., Ltd.) de la colección natural de anticuerpos de cadena sencilla totalmente humanos que se muestran en fagos en 400 ml de medio 2 x YT/ampicilina, de modo que la densidad celular alcanzó una DO600 = 0,1 y se incubó a 37°C y 200 rpm hasta que la densidad celular alcanzó una DO600 = 0,5. Las células se infectaron con 1012 ufp de fago auxiliar M13KO7 (adquirido de Invitrogen) y se incubaron a 30°C y 50 rpm durante 30 minutos. Después de añadir 50 mg/L de kanamicina y realizar un cultivo con agitación a 37°C y 200 rpm durante 30 minutos, el sedimento se separó por centrifugación (15 minutos, 1600 x g, 4°C) y se resuspendió en 400 ml de medio 2 x YT/penicilina/kanamicina y se agitó durante 16 horas a 37°C y 200 rpm. Finalmente, el sedimento se separó por centrifugación (5000 rpm, 4°C durante 20 minutos) y se desechó. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 pm y se añadió 1/4 de volumen de PEG 8000 al 20% (p/v), solución de NaCl 2,5 M y se incubó en un baño de hielo durante 1 hora para precipitar los sedimentos de bacteriófagos. El sedimento se precipitó por centrifugación (20 min, 8000 x g, 4°C) y el sobrenadante se desechó. Los fagos se
resuspendieron en 25 ml de PBS pre-enfriado rápidamente (NaCI 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPÜ48 mM, KH2PÜ42 mM y se centrifugaron (5 minutos, 20000 x g, 42C). Se añadió 1/4 de volumen de PEG8000 al 20% (p/v), solución de NaCI 2,5 M al sobrenadante y se incubó en un baño de hielo durante 30 minutos para precipitar de nuevo partículas de fago. Los sedimentos se centrifugaron (30 min, 20000 x g, 4°C) y los sedimentos de fagos se resuspendieron nuevamente en 2 ml de PBS pre-enfriado rápidamente, se mantuvieron en hielo durante 30 min y se centrifugaron (30 min, 17000 x g, 4°C). Los sobrenadantes se mezclaron con BSA al 4% (p/v) en PBS a 1: 1, se colocaron en un mezclador rotatorio y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de utilizarse directamente para el rastreo.
Utilizando la colección de anticuerpos de fagos anterior, se realizaron cuatro rondas de rastreo direccional en la proteína recombinante GPC3 humana biotinilada (adquirida de Shanghai Rui Jin Biotechnology Co., Ltd.) con el siguiente esquema: La colección de anticuerpos de fagos se incubó con el antígeno GPC3 marcado con biotina. a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se incubó con perlas magnéticas de estreptavidina MyOne Cl (de Invitrogen) bloqueadas con BSA (albúmina de suero bovino, adquirida de Shanghai Bioengineering) al 2% (p/v) a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, las perlas se lavaron con tampón PBST (que contenía Tween-20 al 0,1%) para eliminar los fagos que no estaban unidos específicamente o con capacidades de unión débiles. A continuación, los fagos de unión fuerte se eluyeron de perlas magnéticas con glicina-HCl (pH 2,2), se neutralizaron con solución neutralizante Tris (pH 9,1) y se utilizaron para infectar E. coli ER2738 en la fase de crecimiento logarítmico media y para la siguiente ronda de rastreo. En las cuatro rondas de rastreo, las perlas se utilizaron en una cantidad de 50 pl, 20 pl, 10 pl y 10 pl, y las concentraciones de antígeno GPC3 marcado con biotina fueron 200 nM, 10 nM, 5 nM y 1 nM, respectivamente, y el tiempo para el lavado con PBST fue de 10, 10, 15 y 20, respectivamente.
1.2 Identificación de anticuerpos de unión específicos para GPC3
Se seleccionaron aleatoriamente 96 clones en los clones obtenidos de la cuarta ronda de rastreo y se analizó su capacidad de unión a GPC3 humano mediante ELISA de fago único (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). Para este fin, cada una de las colonias individuales se inoculó en 300 pl de medio 2 x YT/ampicilina (que contenía 2% de glucosa) en una placa de 96 pocillos profundos y se cultivó con agitación a 37°C y 250 rpm durante 16 horas. Se inocularon 20 pl de cultivo en 500 pl de medio 2 x YT/ampicilina (que contenía 0,1% de glucosa) y se agitó a 37°C y 250 rpm durante 1,5 horas. Para preparar la solución del fago auxiliar, se tomaron 75 pl de M13KO7 (título de 3 x 1012 ufp/ml) y se mezclaron en 15 ml de medio 2 x YT y se añadieron a una placa de cultivo a razón de 50 pl/pocillo y se incubaron a 37°C y 150 rpm durante 30 minutos. Y luego se añadió la solución de kanamicina preparada (se tomaron 180 pl de 50 mg/ml de kanamicina y se añadieron a 15 ml de medio 2 x YT) a razón de 50 pl/pocillo y se incubó con agitación durante 16 horas a 37°C y 250 rpm. Finalmente, las células se precipitaron por centrifugación (30 min, 5000 x g, 4°C) y el sobrenadante se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos profundos
Para ELISA de fago único, se utilizaron 100 ng/pocillo de antígeno GPC3 y proteína de control negativo BSA (100 pl/pocillo) en una placa de ELISA MediSorp de 96 pocillos (adquirida de Nunc) y se recubrieron durante la noche a 4°C. Cada uno de los pocillos se bloqueó con PBST que contenía BSA al 2% (p/v). A continuación, los pocillos se lavaron con PBST tres veces y el PBST se desechó. Luego, cada una de las soluciones de fago arriba preparadas se añadió a cada uno de los pocillos de la placa a razón de 100 pl/pocillo. Después de incubar a 37°C durante 2 horas, la placa se lavó tres veces con PBST. Para detectar el fago unido, se diluyó el conjugado de peróxido dismutasa de anticuerpo anti-M13 (adquirido de GE Healthcare) a razón de 1: 5000 en PBST y se tomaron 100 pl y se añadieron a cada uno de los pocillos. Después de incubar a 37°C durante 1 hora, los pocillos se enjuagaron tres veces con PBST y luego se enjuagaron tres veces con PBS. Finalmente, se pipetearon 50 pl de sustrato TMB en los pocillos y se desarrollaron durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de 50 pl de H2SO4 2 M por pocillo para extinguir la reacción de color. Los valores de extinción se midieron a 450 nm con un inmunosorbente ligado a enzima (Bio-Rad).
Se observaron dos anticuerpos de cadena sencilla diferentes, P1B12E (SEQ ID NO: 1 (nucleótido), 2 (aminoácido)) y P7D4 (SEQ ID NO: 3 (nucleótido), 4 (aminoácido)) con el análisis de secuenciación, que mostró significativamente más señal de unión a GPC3 humano (huGPC3) en el ensayo ELISA, mientras que no se une a BSA (Figura 1).
Ejemplo 2. Expresión y Purificación de Anticuerpo de Cadena Sencilla Anti-GPC3 (no forma parte de la invención)
De acuerdo con el protocolo estándar, el fragmento scFv-P1B12E se amplificó a partir del plásmido (pCantab 5E-P1B12E) del clon P1B12E rastreado utilizando el par de cebadores V5-P1B12E-F (SEQ ID NO: 5) y V5-P1B12E-R (SEQ ID NO: 6), y el fragmento scFv-P7D4 se amplificó a partir del plásmido (pCantab 5E-P7D4) del clon p7D4 (pCantab 5E-P7D4) seleccionado utilizando el par de cebadores V5-P7D4-F (SeQ ID NO: 7) y V5-P7D4-R (SEQ ID NO: 8), se digirió con NheI/BamHI (adquirido de NEB) y se conectó al plásmido vector pCMV-V5-Fc (el fragmento Fc del anticuerpo humano IgG1 se fusionó y expresó aguas abajo del sitio de clonación múltiple de este vector, al que se alude en lo sucesivo como V5-Fc, adquirido de Shanghai Rui Jin Biotechnology Co., Ltd.) digerido con NheI/BamHI utilizando ADN ligasa T4 (adquirido de NEB) y se transformó en la cepa huésped TOP10. Se seleccionaron los clones y los clones positivos se identificaron mediante PCR y se confirmaron mediante secuenciación, obteniendo con ello los plásmidos de expresión eucariótica V5-scFv-P1 B12E-Fc y V5-scFv-P7D4-Fc, respectivamente.
Los plásmidos de expresión anteriores se transfectaron respectivamente en células HEK-293F bien desarrollados, que se cultivaron a 37°C, 5% de CO2, 125 rpm durante 7 días y se centrifugó a 4000 rpm durante 10 min. Se retiraron los sedimentos y se recogió el sobrenadante y se filtró con una membrana de 0,45 pm. Las muestras procesadas se purificaron por afinidad con la columna de afinidad de proteína A (de GE), y finalmente se obtuvieron purificados anticuerpos-proteína de fusión Fc.scFv-P1 B12E-Fc y scFv-P7D4-Fc. Los resultados de la identificación se muestran en la FIG. 2, y sus pesos moleculares están en torno a 50 kD.
Ejemplo 3. Unión de cada una de las líneas celulares al anticuerpo de cadena sencilla anti-GPC3 analizado mediante citometría de flujo (no forma parte de la invención)
La capacidad de cada uno de los anticuerpos scFv-P1B12E-Fc y scFv-P7D4-Fc de unirse a la línea celular de hepatocarcinoma HepG2 positiva para GPC3 (ATCC) se analizó mediante un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) (BD FACSCalibur).
Los métodos específicos son los siguientes:
1) inocular la línea celular de hepatocarcinoma HepG2 en fase de crecimiento logarítmico en una placa de 6 cm a una densidad celular de inoculación de aproximadamente 90%, e incubar durante la noche a 37°C en una incubadora.
2) digerir las células con EDTA 10 mM, recolectar las células mediante centrifugación a 200 g x 5 min y resuspender las células en solución salina tamponada con fosfato al 1% (NBS PBS) que contiene suero de ternero a 1 x 106 a 1 x 107/mL en un tubo de flujo específico en una cantidad de 100 pl por tubo.
3) centrifugar a 200 g X 5 min y desechar el sobrenadante.
4) añadir los anticuerpos scFv-P1B12E-Fc y scFv-P7D4-Fc a ensayar, respectivamente, mientras se usa PBS como un control negativo. La concentración final de anticuerpo es de 10 pg/ml. Se añadieron 100 pl a cada uno de los tubos y se incubaron en un baño de hielo durante 45 minutos.
5) añadir 2 ml de NBS PBS al 1% a cada uno de los tubos y centrifugar a 200 g X 5 min dos veces.
6) desechar el sobrenadante y añadir anticuerpo anti-humano de cabra marcado por fluorescencia con FITC (Shanghai Kangcheng Bioengineering Co., Ltd.) a una dilución de 1:50 añadiendo 100 ul a cada uno de los tubos, incubando en un baño de hielo durante 45 minutos.
7) añadir 2 ml de NBS PBS al 1% a cada uno de los tubos, centrifugando a 200 g x 5 min dos veces.
8) desechar el sobrenadante, resuspender en 300 ul de NBS PBS al 1 % y detectar por citometría de flujo. 9) analizar los datos utilizando el software de análisis de datos por citometría de flujo WinMDI 2.9.
Los resultados se muestran en la Fig. 3, y los resultados de la citometría de flujo demostraron que el anticuerpo scFv-P7D4-Fc puede reconocer específicamente las células HepG2 que expresan GPC3, y el anticuerpo scFv-P1 B12E-Fc no se unió a las células HepG2.
Ejemplo 4. Rastreo y preparación de mutantes de anticuerpo de cadena sencilla P7D4 con capacidad incrementada de unión a GPC3 (no forma parte de la invención)
Para potenciar la capacidad del anticuerpo de cadena sencilla P7D4 de unirse a GPC3, se mutaron aleatoriamente algunos aminoácidos en sus regiones CDR1 y CDR2 de la cadena pesada, o CDR1 y CDR2 de la cadena ligera y se construyeron las correspondientes colecciones maduras de afinidad H12 y L12.
4.1 Cadenas ligeras y pesadas de CDR de P7D4 y regiones CDR de las mismas
La secuencia de nucleótidos de scFv de P7D4 se muestra como sigue (SEQ ID NO: 3; en donde las posiciones 76 105 es CDR1 de la cadena pesada, las posiciones 148-198 es la CDR2 de la cadena pesada, las posiciones 295-330 es CDR3 de la cadena pesada, las posiciones 475-516 es CDR1 de la cadena ligera; las posiciones 562-582 es CDR2 de la cadena ligera, las posiciones 679-708 es CDR3 de la cadena ligera; en donde las posiciones 1-363 es la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada, 409-741 es la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera, las posiciones 364-408 es enlazador Gly4Ser)3)).
La secuencia de aminoácidos de scFv de P7D4 se muestra como sigue (SEQ ID NO: 4):
QVQLQESCGGLVQPGRSLRLSCAAS^FTFSSYAMH|WVRQAPGKGLEW VS^ISGSGGSTYYA|
|DSVKG|RFT1SRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCAK|DRRGSHADAFDV^YGQGTLVTVSSGGGG
,S'fíGGG,S'GOGG,S'QSALTQPPSASGSPGQSVTISCffGTSSDVGGYNYVSfW YQ Q YPG KAPKLLIY|GNSN| |r p s 1g v p d r f s g s k s g t s a s l a i t g l q a e d g a d y y c |q s y d s s l r v v |f g g g t k v t v l g
P7D4 VH CDR1:
secuencia de nucleótidos: GGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCAC (SEQ ID NO: 9); secuencia de aminoácidos: GFTFSSYAMH (SEQ ID NO: 10).
P7D4 VH CDR2:
secuencia de nucleótidos: gctattagtggtagtggtggtagcacatactacgcagactccgtgaagggc (SEQ ID NO: 11); secuencia de aminoácidos: AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 12).
P7D4 VH CDR3:
secuencia de nucleótidos: gatcgacgagggagccacgctgatgcttttgatgtc (SEQ ID NO: 13); secuencia de aminoácidos: DRRGSHADAFDV (SEQ ID NO: 14).
P7D4 VL CDR1:
secuencia de nucleótidos: actggaaccagcagtgacgttggtggttataactatgtctcc (SEQ ID NO: 15); secuencia de aminoácidos: TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 16).
P7D4 VL CDR2:
secuencia de nucleótidos: ggtaacagcaatcggccctca (SEQ ID NO: 17);
secuencia de aminoácidos: GNSNRPS (SEQ ID NO: 18).
P7D4 VL CDR3:
secuencia de nucleótidos: cagtcctatgacagcagcctgcgtgtggta (SEQ ID NO: 19);
secuencia de aminoácidos: QSYDSSLRVV (SEQ ID NO: 20).
4.2 Construcción de la Colección Madura de Afinidad de H12
Mediante alineamiento de la secuencia y análisis del anticuerpo de cadena sencilla de P7D4, se seleccionaron parte de los aminoácidos de la primera y segunda regiones CDR de la cadena pesada de P7D4 y se introdujeron mutaciones aleatorias mediante cebadores para construir una colección madura de afinidad de cadena pesada.
Para preparar un fragmento de ADN que codifica la colección mutante de P7D4, se obtuvieron respectivamente dos fragmentos de ADN mediante PCR utilizando el plásmido pCantab P7D4 como molde, seguido de corte y empalme mediante el método de PCR de derivación. Específicamente, se utilizó el siguiente proceso: para la síntesis de genes, se realizaron reacciones PCR en un volumen de 50 pl cada una utilizando el plásmido pCantab P7D4 como molde con una concentración final de 0,2 pM para cada uno de los cebadores y 5 pl de tampón 10 x KOD Plus, se añadieron 4 pl de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 2 mM cada uno), 2 pl de MgSO425 mM y 1 U de KOD Plus (de Takara) y se inició el proceso de PCR en un termociclador después de completar el volumen con agua.. La reacción se calentó primero a 94°C durante 5 minutos y luego se incubó durante 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 68°C durante 30 segundos, y finalmente, a 68°C durante 10 minutos. El primer fragmento se amplificó utilizando los cebadores S1 (SEC ID NO: 21, CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC) y 74H12F1r (SEQ ID NO: 22, CCAGCCCCTTGCCTGGAGCCTGGCGGACCCAMNNCATAGCATAMNNACTGAAGGT GAATCCAG) y el segundo fragmento se amplificó utilizando el cebador 74H12F2f (SEQ ID NO: 23, GCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCANNKATTAGTNNKNNKGNTNNKNNKA CATACTACGCAGACTCC) y S6 (SEQ ID NO: 21, GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG).
Los productos de la PCR esperados se identificaron mediante electroforesis analítica en gel de agarosa y se purificaron a partir de muestras mediante Gel Wizard SV y Kit de limpieza PCR (disponible de Promega). Los dos fragmentos se añadieron en una relación equimolar a una segunda ronda de PCR puente como molde y el sistema de reacción todavía utilizaba el sistema KOD Plus arriba mencionado. La reacción se calentó primero a 94°C durante 5 minutos y luego se incubó durante 10 ciclos, las condiciones de cada uno de los ciclos de reacción fueron 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 68°C durante 30 segundos, y finalmente, a 68°C durante 10 minutos. Posteriormente, se añadieron directamente los cebadores S1 y S6 al sistema de reacción a una concentración final de 0,2 pM y se inició el programa de la PCR. La reacción se calentó primero a 94°C durante 5 minutos y luego se incubó durante 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 68°C durante 30 segundos, y finalmente, a 68°C durante 10 minutos. Los productos de la PCR esperados se separaron mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa y se purificaron mediante Gel Wizard SV y kits de limpieza PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En la colección, los fragmentos de ADN completos contenían sitios de reconocimiento de enzimas de restricción sfiI y NotI en cada uno de los extremos y se digirieron mediante endonucleasa de restricción sfiI / NotI para la digestión por restricción y se insertaron en el vector fagémido pCANTAB 5E digerido por las mismas dos enzimas. Los productos de ligamiento se aislaron y desalaron utilizando Wizard SV Gel y Kit de limpieza PCR para la electrotransformación. Para la electrotransformación se utilizó una E. coIí ER2738 competente hecha en casa (disponible de NEB) con la cubeta de electroporación y el instrumento de electroporación Gene Pulser II (de Bio-Rad). Finalmente se confirmó una colección que contenía 8,9 x 109 mutantes.
4.3 Construcción de la Colección Madura de Afinidad de L12
Mediante alineamiento de la secuencia y análisis del anticuerpo de cadena sencilla P7D4, se seleccionaron parte de los aminoácidos de la primera y segunda regiones CDR de la cadena ligera de P7D4 y se introdujeron mutaciones aleatorias mediante cebadores para construir una colección mutante madura de afinidad de cadena ligera.
Para preparar un fragmento de ADN que codifica la colección mutante de P7D4, se obtuvieron respectivamente dos fragmentos de ADN mediante PCR utilizando el plásmido pCantab P7D4 como molde, seguido de corte y empalme mediante el método de PCR de derivación. Específicamente, se utilizó el siguiente proceso: para la síntesis de genes, se realizaron reacciones PCR en un volumen de 50 pl cada una utilizando el plásmido pCantab P7D4 como molde con una concentración final de 0,2 pM para cada uno de los cebadores y 5 pl de tampón 10 x KOD Plus, se añadieron 4 pl de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 2 mM cada uno), 2 pl de MgSO425 mM y 1 U de KOD Plus y se inició el proceso de PCR en un termociclador después de completar el volumen con agua.. La reacción se calentó primero a 94°C durante 5 minutos y luego se incubó durante 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 68°C durante 30 segundos, y finalmente, a 68°C durante 10 minutos. El primer fragmento se amplificó utilizando los cebadores S1 y 74L12F1r(SEQ ID NO: 83, GTTTGGGGGCTTTGCCTGGGTACTGTTGGTACCAGGAGACMNNAHNMNNAHNACC AACGTCACTGCTG) y el segundo fragmento se amplificó utilizando el cebador 74L12F2f (SEQ ID NO: 84, ACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCCTCATCTATNNKNNKNNKNN KCGGCCCTCAGGGGTC) y S6.
Los productos de la PCR esperados se identificaron mediante electroforesis analítica en gel de agarosa y se purificaron a partir de muestras mediante Gel Wizard SV y Kit de limpieza PCR. Los dos fragmentos se añadieron en una relación equimolar a una segunda ronda de PCR puente como molde y el sistema de reacción todavía utilizaba el sistema KOD Plus arriba mencionado. En ausencia de cebadores, la reacción se calentó primero a 94°C durante 5 minutos y luego se incubó durante 10 ciclos, las condiciones de cada uno de los ciclos de reacción fueron 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 68°C durante 30 segundos, y finalmente, a 68°C durante 10 minutos. Posteriormente, se
añadieron directamente los cebadores S1 y S6 al sistema de reacción a una concentración final de 0,2 |uM y se inició el programa de la PCR. La reacción se calentó primero a 94°C durante 5 minutos y luego se incubó durante 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 68°C durante 30 segundos, y finalmente, a 68°C durante 10 minutos. Los productos de la PCR esperados se separaron mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa y se purificaron mediante Gel Wizard SV y kits de limpieza PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En la colección, los fragmentos de ADN completos contenían sitios de reconocimiento de enzimas de restricción sfiI y NotI en cada uno de los extremos y se digirieron mediante endonucleasa de restricción sfiI / NotI para la digestión por restricción y se insertaron en el vector fagémido pCANTAB 5E digerido por las mismas dos enzimas. Los productos de ligamiento se aislaron y desalaron utilizando Wizard SV Gel y Kit de limpieza PCR para la electrotransformación. Para la electrotransformación se utilizó una E. coIí ER2738 competente hecha en casa con cubeta de electroporación e instrumento de electroporación Gene Pulser II. Finalmente se confirmó una colección que contenía 1,1 x 1010 mutantes.
Además, los autores de la invención adoptaron el método de PCR propenso a errores para mutar aleatoriamente todo el fragmento de P7D4 para construir una colección T2 con una capacidad de 7,9 X 109, en la que el par de cebadores de amplificación es S1 y S6, y la forma de clonación y la construcción es la misma que la de los H12 y L12 arriba descritos.
El rastreo de las tres colecciones maduras de afinidad anteriores es coherente con el proceso de rastreo del Ejemplo 1. Los autores de la invención identificaron seis series P7D4 de clones mutantes de alta afinidad, am4, am14, am20, am35, am42 y T2-23 mediante rastreo, información de secuencia. de los cuales se muestra como sigue:
la secuencia de nucleótidos de am4 (SEQ ID NO: 24; en donde las posiciones 76-105 es la CDR1 de la cadena pesada, las posiciones 148-198 es la CDR2 de la cadena pesada, las posiciones 295-330 son la CDR3 de la cadena pesada y las posiciones 475-516 son la CDR1 de la cadena ligera; las posiciones 562 582 es la CDR2 de la cadena ligera y las posiciones 679-708 es la CDR3 de la cadena ligera; en donde las posiciones 1-363 es la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada, 409-741 es la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera y las posiciones 364-408 son enlazador (Gly4Ser)3:
CAGGTGCÁGCTGCAGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC
tc c t g t g c a g c c t c t|g g a t t c a c c t t c a g t a c g t a t g c t a t g a c g [tg g g tc c g c c a g g c t CCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAÍTCTATTAGTAGTAGTGGT&A^AGTACATACTACl
AGACTC CGTGAAGGGC|CGGTTC AC C ATCTC C AGAGAC AATTCC AAGAAC ACGCTGT AT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAA^ÁTCGAl
^GAGGGAGCCAC.GCTGATGCTTITGATGTCfTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCAC.CGTCTCG
AGTGGTGGA GGCGGTTCA GGCGGA GGTGGTTCTGGCGGTGGCGGA 7GGCAGTCTGCCCTG ACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTC'CTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGClACTGGAl [ACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCfrGGTACCAACAGTACCC AGGCAAA
GCCCCC AAACTC CTC ATCTAT|GGTAAC AGC AATCGGC CCTC A]GGGGTC CC TGAC C GATTC TCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGAT
g g g g c t g a t t a t t a c t g c |c a g t c c ta tg a c a g c a g c c t g c g tg tg g ta [ttc g g c g g a g g g ACCAAGGTCACCGTCCTAGGT
la secuencia de aminoácidos de am4 (SEQ ID NO: 25):
QVQLQESGGGLVQPGRSLRLSCAAS|GFTFSTYAMT|WVRQAPGKGLEWVS|S[SSSGESTYY|
[ADSVKGIr FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKId RRGSHAD AFDV|WGQGTL VTVS SGGGG,S'GGGGS'GGGG,VOSALTOPPSASGSPGOSVTTSC|TGTSSDVGGYNYVS|WYQQYPGK
a p k l l [y |g n sn r ps|g v p d r f s g s k s c t s a s l a it g l q a e d c a d y y c |q s y d s s l r v v |fg g c
TKVTVLG CDR1 de la cadena pesada: GFTFSTYAMT (SEQ ID NO: 60)
CDR2 de la cadena pesada: SISSSGESTYYADSVKG (SEQ ID NO: 61)
CDR3 de la cadena pesada: DRRGSHADAFDV (SEQ ID NO: 14)
CDR1 de la cadena ligera: TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 16)
CDR2 de la cadena ligera: GNSNRPS (SEQ ID NO: 18)
CDR3 de la cadena ligera: QSYDSSLRVV (SEQ ID NO: 20)
en donde las posiciones 1-121 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, las posiciones 137-247 son la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y las posiciones 122-136 es la secuencia del enlazador (Gly4Ser)3. la secuencia de nucleótidos de am14 (SEQ ID NO: 26; en donde las posiciones 76-105 son la CDR1 de la cadena pesada, las posiciones 148- 198a son la CDR2 de la cadena pesada, las posiciones 295-330 son la CDR3 de la cadena pesada y las posiciones 475-516 son la CDR1 de la cadena ligera; las posiciones 562 582 es la CDR2 de la cadena ligera y las posiciones 679-708 es la CDR3 de la cadena ligera; en donde las posiciones 1-363 son la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada, 409-741 son la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera y las posiciones 364-408 son enlazador (Gly4Ser)3)):
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC TCc t g t GCAGCCTCt|GGATTCACCTTCAGTACTTATGCTATGGCT|TGGGTCCGCCAGGCT
c c a g g c a a g g g g c tg g a g tg g g t c tc a |g a a a t t a g t a g t t c t g g t a g t a g g a c a t a c t a c | fcCAGACTCCGTGAAGG~GC]CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
c tg c a a a t g a a c a g c c t g a g a g c c g a g g a c a c g g c c g ta ta tt a c t g t g c g a a a Ig a tc g a I ^GAGGGAGCCACGCTGATGCTTTTGATGTC|lGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCG AGTGGTGGAGGCGG'nCAGGCGGAGGTGG'n'CTGGC'GG'l'GGCGGAl'CGCAGTCTGCCCTG ACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGClACTGGAl
|a c c a g c a g t g a c g t t g g t g g t t a t a a c t a t g t c t c c |tgg TACC AAC AGTAG cc AGGC AAA GCCCCCAAACTCCTCATCTAT|GGTAACAGCAATCGGCCCTCA|GGGGTCCCTGACCGATTC TCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGAT GGGGCTGATTATTACTGC|CAGTCCTATGACAGCAGCCTGCGTGTGGTA[rTCGGCGGAGGG ACCAAGGTCACCGTCCTAGGT
la secuencia de aminoácidos de am14 (SEQ ID NO: 27):
q v q l q e sg g g l v q p g r sl r l sc a a s|g f t f st y a m a )w v r q a p g k g l e w v s|e is s s g s r t y y |
[á d sv k g |r f t is r d k s k n t l y l q m n s l r a e d f a v y y c a k [d r r g sh a d a fd v |w g q g t l v t v s
SGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPPSASGSPGOSVTISCfrGTSSDVGGYNYVSlWYQQYPGK
apk.l l iy |g n sn r ps|g v p d r f sg sk sg t sa sl a it g l q a e d g a d y y c |q sy d ss l r ~vv|fg g g
t k v t v l g
CDR1 de la cadena pesada: GFTFSTYAMA (SEQ ID NO: 62)
CDR2 de la cadena pesada: EISSSGSRTYYADSVKG (SEQ ID NO: 63)
CDR3 de la cadena pesada: DRRGSHADAFDV (SEQ ID NO: 14)
CDR1 de la cadena ligera: TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 16)
CDR2 de la cadena ligera: GNSNRPS (SEQ ID NO: 18)
CDR3 de la cadena ligera: QSYDSSLRVV (SEQ ID NO: 20)
en donde las posiciones 1-121 son la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, las posiciones 137-247 son la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y las posiciones 122-136 son la secuencia de enlace (Gly4Ser)3. la secuencia de nucleótidos de am20 (SEQ ID NO: 28; en donde las posiciones 76-105 son la CDR1 de la cadena pesada, las posiciones 148- 198 son la CDR2 de la cadena pesada, las posiciones 295-330 son la CDR3 de la cadena pesada, las posiciones 475-516 son la CDR1 de la cadena ligera, las posiciones 562 582 son la CDR2 de la cadena ligera, las posiciones 679-708 son la CDR3 de la cadena ligera, en donde las posiciones 1-363 son la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada, las posiciones 409-741 son la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera y las posiciones 364-408 son la secuencia de enlace (Gly4Ser)3)):
* CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCT|GGATTCACCTTCAGTACGTATGCTATGAAT~trGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA|GCGATTAGTATGTCTGGTGAATCTACATACTAC|
|GCAGACTCCGTGAAGGGC|CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAA|GATCGA|
ICGAGGGAGCCACGCTGATGCTTTTGATGTCtTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCG
AGTGGTGGAGG CGG TTCAGGCGGAGGTGGT1 'C1 ’G G CG GTGG CG GA 7 CG CAGTCTGCCCTG
a c t c a g c c t c c c t c c g c g t c c g g g t c t c c t g g a c a g t c a g t c a c c a t c t c c t g c |a c t g g a | |ACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCC[rGGTACCAACAGTACCCAGGCAAA
g c c c c c a a a c tc c tc a tc ta t|g g t a a c a g c a a tc g g c c c tc a |g g g g tc c c t g a c c g a tt c
TCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCC'TGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGAT
GGGGCTGATTATTACTGClCAGTCCTATGACAGCAGCCTGCGT GTGGTA|TTCGGCGGAGGG ACCAAGGTCACCGTCCTAGGT
secuencia de aminoácidos de am20 (SEQ ID NO: 29):
q v q l q e sc g g l v q p g r sl r l sc a a s|g f t f s t y Ámn|w v r q a p g k g l e w v s|a is m s g e s t y y |
[a d sv k g |r f t is r d k s k n t l y l q m n s l r a e d t a v y y c a k |d r r g sh a d a fd v |w g q g t l v t v s SGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPPSASGSPGOSVT!SC|TGTSSDVGGYNYVS|WYQQYPGK APKLL[Y|GÑSNRPS|GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDGADYYC^SYDSSLRVV|FGGG
TKVTVLG CDR1 de la cadena pesada: GFTFSTYAMA (SEQ ID NO: 64)
CDR2 de la cadena pesada: AISMSGESTYYADSVKG (SEQ ID NO: 65)
CDR3 de la cadena pesada: DRRGSHADAFDV (SEQ ID NO: 14)
CDR1 de la cadena ligera: TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 16)
CDR2 de la cadena ligera: GNSNRPS (SEQ ID NO: 18)
CDR3 de la cadena ligera: QSYDSSLRVV (SEQ ID NO: 20)
en donde las posiciones 1-121 sona secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, las posiciones 137-247 son la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y las posiciones 122-136 son la secuencia de enlace (Gly4Ser)3. la secuencia de nucleótidos de am35 (SEQ ID NO: 30; en donde las posiciones 76-105 son la CDR1 de la cadena pesada, las posiciones 148- 198 son la CDR2 de la cadena pesada, las posiciones 295-330 son la CDR3 de la cadena pesada, las posiciones 475-516 son la CDR1 de la cadena ligera, las posiciones 562 582 son la CDR2 de la cadena ligera, las posiciones 679-708 son la CDR3 de la cadena ligera, en donde las posiciones 1-363 son la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada, las posiciones 409-741 son la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera y las posiciones 364-408 son la secuencia de enlace (Gly4Ser)3)):
‘ CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCT|GGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCAC[TGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAlGCTATTAGTAGTAGTGGTGGTAGCACATACTACl
|GCAGACTCCGTGAAGGGC|CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
c tg c a a a t g a a c a g c c t g a g a g c c g a g g a c a c g g c c g ta ta tt a c t g t g c g a a a |g a tcg a | |CGAGGGAGCCACGCTGATGCTTTTGATGTC[rGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCG AGTGG'l'GGAGGCGGTTCAGGCGCfAGGl'GGTTC'/GGCGG'l'GGCGGA'J'CGC.AGlCTGC.CCTG
a c t c a g c c t c c c t c c g c g t c c g g g t c t c c t g g a c a g t c a g t c a c c a t c t c c t g c |a c tg g a |
Ia c c a g c a g t g a c g t t g g t c a t a a g t t t c c t g t c t c c ítg g ta c c a a c a g ta c c c a g g c a a a
g c c c c c a a a c tc c tc a tc ta t|a a g a a t c t t t t g c g g c c c t c a |g g g g tc c c t g a c c g a tt c
t c t g g c t c c a a g t c t g g c a c c t c a g c c t c c c t g g c c a t c a c t g g g c t c c a g g c t g a g o a t
g g g g c t g a t t a t t a c t g c |c a g tc c ta tg a c a g c a g c c t g c g tg tg g ta )ttc g g c g g a g g g
ACCAAGGTCACCGTCCTAGGT
la secuencia de aminoácidos de am35 (SEQ ID NO: 31):
QVQLQESGGGLVQPGRSLRLSCAAS|GFTFSSYAMH|WVRQAPGKGLEWVS[A[SSSGGSTYY|
[á d sv k g |r f t isr d n s k n t l y l q m n sl r a e d t a v y y c a k |d r r g sh a d a fd v |w g q g t l v t v s SGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPPSASGSPGQSVTISC^GTSSDVGHKFPVS|WYQQYPGK APKLLIY^ÑLLRPSlGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDGADY'YC^SY'DSSLRVVlFGGG
TKVTVLG CDR1 de la cadena pesada: GFTFSSYAMH (SEQ ID NO: 10)
CDR2 de la cadena pesada: AISSSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 66)
CDR3 de la cadena pesada: DRRGSHADAFDV (SEQ ID NO: 14)
CDR1 de la cadena ligera: TGTSSDVGHKFPVS (SEQ ID NO: 67)
CDR2 de la cadena ligera: KNLLRPS (SEQ ID NO: 68)
CDR3 de la cadena ligera: QSYDSSLRVV (SEQ ID NO: 20)
en donde las posiciones 1-121 son la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, las posiciones 137-247 son la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y las posiciones 122-136 son la secuencia de enlace (Gly4Ser)3. la secuencia de nucleótidos de am42 (SEQ ID NO: 32; en donde las posiciones 76-105 son la CDR1 de la cadena pesada, las posiciones 148- 198 son la CDR2 de la cadena pesada, las posiciones 295-330 son la CDR3 de la cadena pesada, las posiciones 475-516 son la CDR1 de la cadena ligera, las posiciones 562 582 son la CDR2 de la cadena ligera, las posiciones 679-708 son la CDR3 de la cadena ligera, en donde las posiciones 1-363 son la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada, las posiciones 409-741 son la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera y las posiciones 364-408 son la secuencia de enlace (Gly4Ser)3)):
‘ CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC
t c c t g t g c a g c c t c t|g g a t t c a c c t t c a g t a g c t a t g c t a t g c a c |tg g g tc c g c c a g g c t
c c a g g c a a g g g g c tg g a g tg g g t c tc a |g c t a t t a g t a g t a g t g g t g g t a g c a c a t a c t a c | iGCAGACTCCGTGAAGGGClCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
c t g c a a a t g a a c a g c c t g a g a g c c g a g g a c a c g g c c g ta ta tt a c t g t g c g a a a |g a tcg a | jCGAGGGAGCC ACGCTGATGCTTTTGATGTCjTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCG
AG7GGTGGAGGCGGTTCAGGGGGAGGTGGTTCTGCCGGTGGCGGATCGCAG1CTGCCCTG
a c t c a g c c t c c c t c c g c g t c c g g g t c t c c t g g a c a g t c a g t c a c c a t c t c c t g c íactggáI
|a c c a g c a g t g a c g t t g g t c t t a t g c a t a a t g t c t c c |tg g ta c c a a c a g ta c c c a g g c a a a
g c c c c c a a a c tc c tc a tc ta t|a a g t c t t c g t c t c g g c c c t c a |g g g g tc c c t g a c c g a tt c
t c t g g c t c c a a g t c t g g c a c c t c a g c c t c c c t g g c c a t c a c t g g g c t c c a g g c t g a g g a t GGGGCTGATTATTACTGC|CAGTCCTATGACAGCAGCCTGCGTGTGGTAfTTCGGCGGAGGG ACCAAGGTCACCGTCCTAGGT
la secuencia de aminoácidos de am42 (SEQ ID NO: 33):
QVQLQESGGGLVQPGRSLRLSCAAS|GFTFSSYAMH|WVRQAPGKGLEWVS|A1S5SGGSTYY| [ÁDSVKG|RFTlSRDKSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAK^RRGSHADAFDV|WGQGTLVTVS SGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPPSASGSPGQSVTISC|TGTSSDVGLMHNVS|WYQQYPGK
a p k l l [y ^ s s s r p s |g v p d r f sg sk sg t sa sl a it g l q a e d g a d y y c |q s y d s s l r v v |fg g g
TKVTVLG CDR1 de la cadena pesada: GFTFSSYAMH (SEQ ID NO: 10)
CDR2 de la cadena pesada: AISSSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 66)
CDR3 de la cadena pesada: DRRGSHADAFDV (SEQ ID NO: 14)
CDR1 de la cadena ligera: TGTSSDVGLMHNVS (SEQ ID NO: 69)
CDR2 de la cadena ligera: KSSSRPS (SEQ ID NO: 70)
CDR3 de la cadena ligera: QSYDSSLRVV (SEQ ID NO: 20)
en donde las posiciones 1 -121 son la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, las posiciones 137-247 son la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y las posiciones 122-136 son la secuencia de enlace (Gly4Ser)3. la secuencia de nucleótidos de T2-23 (SEQ ID NO: 34; en donde las posiciones 76-105 son la CDR1 de la cadena pesada, las posiciones 148- 198 son la CDR2 de la cadena pesada, las posiciones 295-330 son la CDR3 de la cadena pesada, las posiciones 475-516 son la CDR1 de la cadena ligera, las posiciones 562-582 son la CDR2 de la cadena ligera, las posiciones 679-708 son la CDR3 de la cadena ligera, en donde las posiciones 1-363 son la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada, las posiciones 409-741 son la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera y las posiciones 364-408 son la secuencia de enlace (Gly4Ser)3)):
’ CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC
t c c t g t g c a g c c t c t|g g a tt c a c c tt c a g ta g c ta tg c ta tg c a c|tg g g tc c g c c a g g c t
c c a g g c a a g g g g c tg g a g tg g g t c tc a |g c t a t ta g ta g t a g tg g tc g ta g c a c a ta c ta c 1
|g c a g a c tc c g tg g a g g g c |c g g t tc a c c a t c tc c a g a g a c a a t tc c a a g a a c a c g c t g t a t
c tg c a a a t g a a c a g c c t g a g a g c c g a g g a c a c g g c c g ta ta tt a c t g t g c g a a a [g a tc g a | |CGAGGGAGCCACGCTGATGCTTTAAATGTC[rGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCG AGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGCCCTG ACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGCGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTCC|ACTGGA|
|a c c a g c a g t g a c g t t g g t g g t t a t a a c t a t g t c t c c |tg g ta c c a a c a gtac cc aggc aaa
g c c c c c a a a c tc c tc a tc ta t|g g t a a c a g c a a tc g g c c c tc a |g g g g tc c c t g a c c g a tt c
tc t g g c t c c a a g t c t g g c a c c t c a g c c t c c c t g g c c a t c a c t g g g c t c c a g g c t g a g g a t
GGGGCTGATTATTACT GC|CAGTCCT AT GACAGCAGCCTGCGT GTGGTAfTTCGGCGGAGGG ACCAAGGTCACCGTCCTAGGT
la secuencia de aminoácidos de T2-23 (SEQ ID NO: 35):
q v q l q e sg g g l v q p g r sl r l sc a a s|g f t f ssy a m h |w v r q a p g k g l e w v s|a is s s g r s t y y |
[á d sv e g |r f t isr d n s k n t l y l q m n sl r a e d t a v y y c a k [d r r g siia d a l n v |w g q g t l v t v s SGGGGSGGGGSGGGGSOSALTOPPSASGSPGQSVTISC|TGTSSDVGGYKYVS|WYQQYPGK
a p k l l iy |g ñ sk r p s|g v pd r fsg sk .s g t s a sl a it g l q a e d g a d y y c |q s y d s s l r v v |fg g g
TKVTVLG CDR1 de la cadena pesada: GFTFSSYAMH (SEQ ID NO: 10)
CDR2 de la cadena pesada: AISSSGRSTYYADSVEG (SEQ ID NO: 71)
CDR3 de la cadena pesada: DRRGSHADALNV (SEQ ID NO: 72)
CDR1 de la cadena ligera: TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 16)
CDR2 de la cadena ligera: KSSSRPS (SEQ ID NO: 70)
CDR3 de la cadena ligera: QSYDSSLRVV (SEQ ID NO: 20)
en donde las posiciones 1-121 son la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, las posiciones 137-247 son la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y las posiciones 122-136 son la secuencia de enlace (Gly4Ser)3. 4.4 Análisis SPR de la capacidad de unión de los anticuerpos de la serie P7D4 a GPC3
Para analizar cuantitativamente la unión de los anticuerpos de la serie P7D4 a GPC3, se midieron los parámetros de afinidad y cinéticos de los anticuerpos de cadena sencilla de la serie P7D4 mediante el método de captura utilizando el sistema Biacore T200 (de GE). Un anticuerpo IgG (Fc) anti-humano (adquirido de GE) se acopló a la superficie de carboximetil dextrano del chip sensor CM5 a través de amino primario con acoplamiento NHS / EDC de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las mediciones se realizaron en 1 X HBS-EP tampón de trabajo a 25°C, 30 pl/min, y el estado de regeneración fue MgCl23 M, 10 pl/min durante 30 segundos. En cada ronda del ciclo de ensayo, el anticuerpo que se ha de testar se captura en primer lugar en el chip. GPC3 de una determinada concentración fluyó sobre la superficie del chip. La interacción entre GPC3 humano y el anticuerpo capturado provocó el cambio de la concentración molecular en la superficie del chip sensor que se midió de acuerdo con los cambios en la señal SPR y se expresó en unidades de resonancia (UR. Se representó gráficamente el tiempo frente a la unidad de resonancia (UR). El sensorgrama resultante documenta toda la reacción, incluyendo los procesos de unión y disociación (Figura 4). En todas las cinéticas de ciclo único, las concentraciones de GPC3 fueron 5 nM, 10 nM, 20 nM, 40 nM y 80 nM,
respectivamente. Las curvas resultantes se evaluaron utilizando el software de evaluación Biacore T200 y se calcularon los valores de afinidad KD. Los datos de unión para todos los anticuerpos de cadena sencilla de P7D4 a GPC3 se resumen en la Tabla 1 que figura a continuación.
Tabla 1 Datos de unión ara anticuer os de cadena sencilla de la serie P7D4 a GPC3
Puede verse en la Tabla 1 que los anticuerpos de cadena sencilla mutantes de la serie P7D4 obtenidos por modificación exhibían una afinidad incrementada buena y significativa con respecto al anticuerpo de cadena sencilla P7D4.
4.5 Análisis de la Especificidad de Identificación de Anticuerpos de la serie P7D4
Con el fin de analizar la especificidad de unión del anticuerpo de la serie P7D4 a la proteína GPC3, la actividad de unión del anticuerpo de cadena sencilla de la serie P7D4 a los miembros de la familia GPC humano, incluida GPC1 humana recombinante (rhGPC1), GPC2 (rhGPC2), GPC3 (rhGPC3), GPC5 (rhGPC5) y GPC6 (rhGPC6) (adquirido de Andy Biosciences (Shanghai) Co., Ltd.) se detectó mediante ELISA, respectivamente.
Para este fin, los 5 antígenos de arriba se diluyeron con solución de recubrimiento de NaHCO30,1 M (pH 9,6) y cada uno de los pocillos se recubrió con 100 ng en 50 pl/pocillo durante la noche a 4°C y se bloquearon con BSA al 2% (p/v) en PBST durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, se enjuagó la placa tres veces con PBST y se eliminó PBST. Posteriormente, se añadieron 100 ng de cada una de las proteínas de anticuerpo en PBST a cada una de las placas de pocillos, y el ensayo para cada una de las muestras se realizó en pocillos duplicados. Después de incubar durante 2 horas a 37°C, las placas se enjuagaron tres veces con PBST seguido de la adición de 100 pl/pocillo de anticuerpo Fc anti-humano de conejo marcado con HRP (adquirido de Shanghai Rui Jin Biotechnology Co., Ltd.) diluido a 1: 20000 y se incubó a 37°C durante 1 hora. Para la detección, los pocillos se enjuagaron tres veces con PBST seguido de tres veces con PBS y finalmente con TMB para el desarrollo durante 10 min. La reacción cromogénica se detuvo con 50 pl de H2SO4 2 M por pocillo, y se midió el valor de extinción a 450 nm con inmunodetector ligado a enzimas (Bio-Rad).
Los resultados se muestran en la Figura 5, y todos los anticuerpos de cadena sencilla de la serie P7D4 solo se unen específicamente a GPC3 humano y no se unen a GPC1, GPC2, GPC5 y GPC6 humanos.
Ejemplo 5. Preparación de Antígeno GPC3 Humano y Anticuerpos Monoclonales Humanizados contra el Antígeno
5.1 Expresión y purificación de GPC3 Humano en el sistema de expresión eucariótico
5.1.1 Construcción e identificación del vector GPC3
La amplificación por PCR se realizó utilizando ADNc de la línea celular de hepatoma humano Huh-7 como molde con los siguientes cebadores GPC3-F: GATCGCTAGCACAGCCCCCGCCGCCGC (SEQ ID NO: 54), GPC3-R: GTACGGATCCTTCAGCGGGGAATGAACGTTC (SEQ ID NO: 55), para obtener un fragmento de GPC3 (1,6 kb) con el sitio Nhel / BamHI en ambos extremos. El fragmento de PCR obtenido se sometió a doble digestión con endonucleasa Nhel / BamHI (adquirido de Fermentas), y el vector plásmido V5H (adquirido de Raygene) se sometió a doble digestión con endonucleasa NheI / BamHI. El vector y el fragmento insertado se recuperaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se ligaron mediante ADN ligasa de T4 (adquirida de NEB) y se transformaron en la cepa huésped TOP10 (adquirida de LIFE Co.). Las cepas huéspedes se rastrearon en cuanto a resistencia a ampicilina, se seleccionaron los clones, se extrajeron los plásmidos y se sometieron a doble digestión con NheI / BamHI (adquirido de Fermentas), y se identificaron y verificaron los clones positivos que contenían el fragmento insertado mediante secuenciación para obtener el plásmido de expresión eucariótica V5H -GPC3 que contenía la secuencia correcta del gen GPC3 humano.
5.1.2 Expresión y purificación de la proteína GPC3 humana
5.1.2.1. Transfección de liposomas y cultivo del plásmido V5H-GPC3
Células HEK293F bien desarrolladas (HEK293F, adquiridas de LIFE Co., Ltd.) se sembraron en un matraz de cultivo celular a una densidad de 1 X 106 células/ml y se incubaron durante la noche a 37°C y 120 rpm para uso futuro. El plásmido V5H-GPC3 obtenido en la etapa anterior y lipofectamina 293Fectina (adquirida de LIFE) se diluyeron con DMEM y se mezclaron suavemente y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 min. El complejo de ADN-liposoma incubado se añadió a células 293F y se cultivó a 37°C y 120 rpm durante 120 h. El cultivo celular se recogió y se centrifugó a 4500 g durante 15 min. Se eliminaron las células y se mantuvo el sobrenadante.
5.1.2.2. Purificación de la proteína GPC3
Se cargó 1 ml de relleno de afinidad Ni-NTA Agarosa y la columna de afinidad Ni-NTA se equilibró con 10 volúmenes de columna de tampón de equilibrio (PB 50 mM, NaCl 0,3 M, imidazol 10 mM, pH 8,0). Después de la centrifugación, el sobrenadante del cultivo celular se hizo pasar a través de una columna de afinidad Ni-NTA a razón de 1 ml/min y el material de paso se recogió y se almacenó a 4°C. Se utilizaron 10 volúmenes de columna de tampón de lavado 1 (PB 50 mM, NaCl 0,3 M, imidazol 20 mM, pH 8,0) para lavar y el material de paso se recogió a 4°C. Se utilizaron 4-5 volúmenes de columna de tampón de elución (PB 50 mM, NaCl 0,3 M, imidazol 250 mM, pH 8,0) para la elución y el material eluido se recogió y se dializó en fluido de diálisis (PB 50 mM, pH 7,8, NaCl 0,3 M, Glicerol) durante la noche a 4°C para obtener la proteína GPC3(H), y se utilizó una pequeña cantidad en electroforesis SDS PAGE (Figura 6).
5.2 Inmunización con antígeno GPC3 humano
Inmunización con proteína recombinante: 1 ml de la proteína GPC3 humana purificada GPC3(H) (1,0 mg/mL) obtenida en el Ejemplo 5.1 anterior como un antígeno se emulsionó suficientemente y se mezcló con 1 mL de adyuvante completo de Freund (Sigma-Aldrich Co., Ltd.) para la inmunización subcutánea de ratones BALB/c (6-8 semanas de edad, 100 gg de antígeno de proteína GPC3(H) humana por ratón). Cuatro semanas más tarde, se emulsionó el antígeno GPC3 humano y se mezcló con adyuvante incompleto de Freund. Los ratones se inmunizaron mediante inyección intraperitoneal (50 gg para cada uno de los ratones), seguido de un intervalo de 2 semanas y luego se administraron intraperitonealmente 50 gg de antígeno para la inmunización de refuerzo. Una semana después de la cuarta inmunización de refuerzo se utilizó proteína GPC3(H) para el recubrimiento. El título de antisuero de ratón se detectó por ELISA, y la inmunización de refuerzo se continuó hasta que se alcanzó el título de antisuero > 105 en ratones.
Tres semanas después de la última inmunización de refuerzo se inmunizaron 20 gg de proteína GPC3(H) humana en el bazo para uso futuro.
5.3 Establecimiento de líneas celulares de hibridoma GPC3 Anti-humano
Cuatro días después de la estimulación en el bazo de ratón, los bazos se recogieron asépticamente y los linfocitos se aislaron por filtración a través de un filtro de malla 100, se fusionaron con la línea celular de mieloma SP2/0, cultivados selectivamente con hipoxatina, aminopterina y timidina (HAT) durante tres días, y luego se añadió medio HT y se continuó el cultivo durante una semana.
Se utilizó antígeno GPC3(H) para el recubrimiento, y los clones positivos se rastrearon mediante ELISA y se subclonaron tres veces mediante dilución limitante. Las células se cultivaron durante otros 2 meses. Finalmente, se obtuvieron líneas celulares de hibridoma estables (números de clon 5A5, 7C9 y 11D3).
5.4 Producción de ascitis y purificación de anticuerpos
A ratones F1 de 8-10 semanas de edad se les inyectaron por vía intraperitoneal 100 gL de pristano (adquirido de Sigma-Aldrich), y 1 semana más tarde, se recogieron los clones de células de hibridoma del Ejemplo 5.4 anterior y por vía intraperitoneal se inyectaron a los ratones a razón de 5 x 105 células/ratón para preparar ascitis. Después de 7 a 10 días, se recogió la ascitis y se centrifugó a 10000 g durante 10 minutos, y se tomó el sobrenadante para uso futuro. La columna de afinidad de proteína G (adquirida de GE) se volvió a poner a temperatura ambiente y se utilizaron 5 volúmenes de columna de PBS (PB 0,01 M, NaCl 0,15 M, pH 7,4) para el equilibrio. El sobrenadante de ascitis se mezcló con un volumen igual de PBS (PB 0,01 M, NaCl 0,15 M, pH 7,4), se filtró a través de un filtro de 0,22 gM y el sobrenadante de ascitis filtrado se cargó en una columna de afinidad de Proteína G y se lavó con 5 volúmenes de PBS. La columna se eluyó con tampón de elución (glicina HCl 0,1 M, pH 2,7) y la elución se neutralizó con 1/10 del volumen de tampón de neutralización (NaH2PÜ41 M, pH 9,0). La solución se dializó frente a PBS (PB 0,01 M, NaCl 0,15 M, pH 7,4), durante lo cual se cambió el PBS dos veces y el intervalo entre dos cambios fue superior a 5 horas. La solución dializada se centrifugó a 10000 g durante 10 min y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 um para obtener una solución del anticuerpo monoclonal anti-GPC3 humano purificado producido por cada uno de los clones. De acuerdo con el análisis, 5A5 mostró una buena capacidad de unión al antígeno.
5.5 Humanización del clon 5A5 de GPC3
5.5.1 Análisis de la secuencia del anticuerpo 5A5
5A5 exhibió una buena capacidad de unión al antígeno. Se determinaron las secuencias de la región variable de VL y VH del anticuerpo 5A5. De acuerdo con el esquema de denominación de las CDRs de Kabat, Chothia e IMGT, se determinó la secuencia de seis CDRs de la cadena ligera y pesada del anticuerpo.
La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de 5A5 se muestra como sigue (SEQ ID NO: 56, en que los tres segmentos subrayados son sucesivamente CDR1, CDR2 CDR3:
CAGGTTCAACTGCAGCÁGTCTGGGACTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCA GTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTACTGACTATGAAATGC ACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTC ATCCAGGAAGTGGTGATACTGCCTACAATCAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCA
CACTGACTGCAGACAAATCTTCCAGCACAGCCTACATGGAGTACAGCAGCC TGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATTTTATTCCTATGCT TACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de 5A5 se muestra como sigue (SEQ ID NO: 57, en que los tres segmentos subrayados son sucesivamente CDR1, CDR2, CDR3):
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCT CTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACAGTGGTACCTGCA GAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGGGTCCCA GACAGGTTCAGTGGCAGAGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCT GAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTATATATGTTCCGTACACGTTCGGAGGAGGGA CCAAGCTGGAAATAAAACGG
Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de 5A5 (SEQ ID NO: 81, en que los tres segmentos subrayados son sucesivamente CDR1, CDR2, CDR3):
QVQLQQSGTELVRPGASVKLSCKALGYTFTDYEM H W VKQTPVHGLEW IGATHPGSGDTAYNQRF
KG KATLTAD K SSSTA YM EYSSLTSED SA VYYCTRFYSYA YW G Q G TLVTV SA
Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de 5A5 (SEQ ID NO: 82, en que los tres segmentos subrayados son sucesivamente CDR1, CDR2, CDR3)
DWMTOTPLSLPVSLGDOASISCRSSOSLVHSNGNTYLOWYLOKPGOSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGR
GSGTDFTLK.ISRVEAEDLGVYFCSOSIYVPYTFGGGTKLEIK.R
5.5.2 Selección del molde de anticuerpos
Existen cuatro factores principales en la selección de las regiones marco del molde de anticuerpos: inmunogenicidad, propiedades de unión a antígenos, expresión y estabilidad de anticuerpos.
(1) Determinación de los residuos de aminoácidos que soportan la estructura de bucle de un anticuerpo en las regiones variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo y los residuos de aminoácidos de las regiones de unión de la cadena ligera y pesada de acuerdo con el documento WO2008021156.
(2) Alineamiento de la longitud completa de la región variable de la cadena ligera o la cadena pesada de 5A5 con anticuerpos de IMGT, V BASE o NCBI.
(3) Eliminación de los residuos de aminoácidos asociados con el bucle de soporte dentro de las regiones CDR de la región variable de la cadena ligera o pesada de 5A5 y luego alineamiento de la secuencia con anticuerpos de IMGT, V BASE o NCBI.
(4) Eliminación de residuos de aminoácidos en regiones CDR en la región variable de la cadena ligera o la cadena pesada de 5A5 y luego alineamiento de la secuencia con anticuerpos de IMGT, V BASE o NCBI.
(5) Mantener únicamente los residuos de aminoácidos asociados con el bucle de soporte en la secuencia de la cadena ligera o pesada de 5A5, y luego alineamiento de la similitud de secuencia con los anticuerpos de IMGT, V BASE o NCBI.
(6) Sólo se retienen los residuos de aminoácidos asociados con el bucle de soporte en cadenas ligeras o marcos de la cadena pesada de 5A5, y luego se retiene el alineamiento de similitud de secuencia con anticuerpos de IMGT, V BASE o NCBI.
(7) Seleccionar el anticuerpo con la mayor similitud como el molde de anticuerpo de acuerdo con los resultados del alineamiento de la similitud de secuencia.
(8) Resultados del alineamiento de la similitud de secuencia de la cadena pesada: basados en la similitud, se seleccionó VH1_69 * 06 (IMGT, Números de acceso: L22583) como el molde de anticuerpo para la cadena pesada de 5A5.
(9) Resultados del alineamiento de la similitud de secuencia de la cadena ligera: basados en la similitud, se seleccionó VK2D_29 * 02 (IMGT, Números de acceso: U41644) como el molde de anticuerpo para la cadena ligera de 5A5.
5.5.3 Trasplante de CDR
Las regiones CDR de la cadena ligera o la cadena pesada del anticuerpo 5A5 se sustituyen con las regiones CDR del molde de anticuerpo. Finalmente se identificó el anticuerpo humanizado (Y035). Su secuencia de aminoácidos se muestra a continuación:
Cadena pesada Y035 humanizada (SEQ ID NO: 58):
EVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSDYEMHWVROAPGOGLEWMGA1HPGSGDTAYNO REKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFYSYAYWGOGTLVTVSA
La secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena pesada es: Asp Tyr Glu Met His (SEQ ID NO: 73); La secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena pesada es: Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly (SEQ ID NO: 74);
La secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena pesada es: Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr (SEQ ID NO: 75). Cadena ligera Y035 humanizada (SEQ ID NO: 59):
DIVMTOTPLSLPVTPGEPASISCRSSOSLVHSNGNTYLOWYLOKPGOSPOLLIYKVSNRFSGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSIYVPYTFG0GTKLE1K-R
La secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera es: Arg Ser Ser Gln Ser Leu Va1His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln (SEQ ID NO: 76);
La secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera es: Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 77);
La secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera es: Ser Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr (SEQ ID NO: 78).
5.5.4 Expresión y purificación de anticuerpo humanizado
(1) Basándose en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado (Y035), se diseñó y sintetizó la secuencia de nucleótidos.
Secuencia de nucleótidos de la cadena ligera sintetizada (SEQ ID NO: 79, incluyendo la secuencia que codifica el péptido señal):
GGÁTCGATATCCACCATGGACATGATGGTGCTGGCCCAGTTCCTGGCCTrCCTGCTGCTGTGGTTCC CAGGCGCIAGATGCGACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCCGGCGA GCCCGCCAGCATCAGCTGCCGGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACCTACC TGCAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAAC CCGTTCAGCGGCGTGCCCGACCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTCA AGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCAGCCAGAGCATCTACGTG CCCTACACCTTCGGGGAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGT4rGG7GGr/
Secuencia de nucleótidos de la cadena pesada sintetizada (SEQ ID NO: 80, incluyendo la secuencia que codifica el péptido señal):
GGXrCGATAlCTGCGGCClATCTAGCCACCATGCGGGTGCTGATCCrGCTGTGGCTGn'IACCGCCT TCCCCGGCnCCTGAfíCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCG CCACCGTCAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCCGCTACACCTTCAGCCACTACGAGATGCACTCG GTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCCACCCCGGCAGCGGCG ACACCGCCTACAACCAGCGGTTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGC ACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCG GTTCTACAGCTACGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGO/lGC/ia AAA
(2) La secuencia de nucleótidos del anticuerpo sintetizada (péptido señal: posiciones 16-81 (cadena ligera), posiciones 31 -84 (cadena pesada)) se insertó en el vector de expresión de células de mamífero para construir un vector de expresión de anticuerpos que contenga cadena pesada y cadena ligera, respectivamente, y la secuencia del anticuerpo se identificó mediante secuenciación. En particular:
La cadena ligera sintetizada y pIK-hu12L (adquiridos de Shanghai Rui Jin Biotechnology Co., Ltd.) se digirieron doblemente con EcoRV y BsiWI, y la cadena ligera se insertó en pIK-hu12L.
La cadena pesada sintetizada y el pIH-hu12H modificado (adquirido de Shanghai Rui- Jin Biotechnology Co., Ltd., se añadió un sitio de restricción NheI por mutación sinónima en CH1) se digirieron doblemente con EcoRV y NheI y se insertó la cadena pesada en pIH-hu12H.
El vector digerido y enlazado se transformó en células competentes TOP10 y los clones positivos se identificaron mediante PCR. Los clones correctos se confirmaron mediante secuenciación. El vector se transfectó transitoriamente en células 293F mediante 293Fectina y se expresó. El sobrenadante del cultivo 293F se recogió por centrifugación, se filtró a través de un filtro de 0,45 pm y se hizo pasar a través de una columna de Proteína A para cromatografía de afinidad. Se determinó A280 mediante espectrofotómetro para determinar la concentración del anticuerpo purificado.
5.6 Análisis SPR de la capacidad de unión del anticuerpo Y035 humanizado a GPC3 humano
Para analizar cuantitativamente la unión del anticuerpo Y035 al antígeno GPC3 humano, se midieron la afinidad y los parámetros cinéticos del anticuerpo Y035 mediante un ensayo cinético de ciclos múltiples utilizando el sistema Biacore T200 (de GE). El antígeno GPC3 humano (adquirido de Shanghai Rui- Jin Biotechnology Co., Ltd.) se acopló a la superficie de carboximetildextrano del chip sensor CM5 a través de amino primario con acoplamiento NHS / EDC de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la cantidad final del ligando conjugado fue 305 UR. Las mediciones cinéticas se realizaron en 1 X HBS-EP tampón de trabajo a 25°C, 30 pl/min, y la condición de regeneración fue Glicina-HCl 10 mM (pH 2,5), 10 pl/min durante 25 segundos. En cada ronda del ciclo de ensayo, el anticuerpo Y035 de una determinada concentración fluyó sobre la superficie del chip. La interacción entre el anticuerpo y la proteína antigénica humana GPC3 fijada en el chip provocó el cambio de la concentración molecular en la superficie del chip sensor que se midió de acuerdo con los cambios en la señal SPR y se expresó en unidades de resonancia (UR). Se representó gráficamente el tiempo frente a la unidad de resonancia (UR) y después de restar el valor UR del canal de referencia sin antígeno fijo, el sensorgrama resultante documenta la reacción completa, incluyendo los procesos de unión y disociación. El análisis cinético de la unión del anticuerpo Y035 y el anticuerpo 5A5 a GPC3 humana se muestra en las Figuras 7-8. En diferentes ciclos de ensayo cinético, la concentración de anticuerpo Y035 fue 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM y 100 nM, respectivamente. Las curvas resultantes se evaluaron utilizando el software de evaluación Biacore T200 y se calcularon los valores de afinidad KD. Utilizando el mismo método, también se ensayaron la afinidad y los parámetros cinéticos del anticuerpo monoclonal murino parental 5A5 antes de la humanización de Y035. Los datos de unión de los anticuerpos Y035 y 5A5 a las proteínas GPC3 humanas, respectivamente, se resumen en la Tabla 2, y el anticuerpo Y035 humanizado se une a la proteína GPC3 humana mucho mejor que 5A5 de ratón después de la humanización.
Tabla 2 Parámetro cinético de unión del anticuer o Y035 5A5 a GPC3 humano
5.7 Análisis FACS de la capacidad de unión a células del anticuerpo Y035
Se analizó la capacidad de unión del anticuerpo Y035 a la línea celular de hepatocarcinoma HepG2 positiva para GPC3 (ATCC) mediante un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) utilizando células 293T negativas (ATCC) que expresan GPC3 como un control negativo.
El método específico es el siguiente:
1) inocular células HepG2 y 297T en fase de crecimiento logarítmica en una placa de 6 cm a una densidad celular de inoculación de aproximadamente 90%, e incubar durante la noche a 37°C en una incubadora.
2) digerir las células con EDTA 10 mM, recolectar las células mediante centrifugación a 200 g x 5 min y resuspender las células en solución salina tamponada con fosfato al 1% (NBS PBS) que contiene suero de ternero a 1 x 106 a 1 x 107/mL en un tubo de flujo específico en una cantidad de 100 pl por tubo.
3) centrifugar a 200 g X 5 min y desechar el sobrenadante.
4) añadir los anticuerpos Y035 a ensayar en los grupos experimentales de ambas líneas celulares, respectivamente, al tiempo que se utiliza PBS sin anticuerpo como un control en blanco. La concentración final de anticuerpo es de 20 pg/ml. Se añadieron 100 pl a cada uno de los tubos y se incubaron en un baño de hielo durante 45 minutos.
5) añadir 2 ml de NBS PBS al 1% a cada uno de los tubos y centrifugar a 200 g X 5 min dos veces.
6) desechar el sobrenadante y añadir anticuerpo anti-humano de cabra-FITC (Shanghai Karrie Biotech Co., Ltd.) a una dilución de 1 : 100 añadiendo 100 ul a cada uno de los tubos, incubando en un baño de hielo durante 45 minutos.
7) añadir 2 ml de NBS PBS al 1% a cada uno de los tubos, centrifugando a 200 g X 5 min dos veces.
8) desechar el sobrenadante, resuspender en 300 ul de NBS PBS al 1 % y detectar por citometría de flujo.
Los datos se analizaron mediante el software de análisis de datos de citometría de flujo Flowjo7.6, y los resultados se muestran en la Figura 9. Los resultados de la citometría de flujo demuestran que el anticuerpo Y035 puede reconocer específicamente células HepG2 que expresan GPC3 y no unirse a células 293t negativas para GPC3.
Ejemplo 6. Construcción del vector de expresión CAR basado en el anticuerpo de cadena sencilla P7D4 y preparación de lentivirus (no forma parte de la invención)
A modo de ejemplo, el sistema de vector utilizado para los vectores de plásmidos lentivirales construidos a continuación pertenece al sistema de vectores lentivirales auto-inactivantes de la tercera generación, que tiene 4 plásmidos, a saber, el plásmido de empaquetamiento pMDLg RRE que codifica la proteína Gag/Pol (de addgene), plásmido de empaquetamiento pRSV-REV que codifica la proteína Rev (de addgene); el plásmido de la envoltura pCMV-VSV-G que codifica la proteína VSV-G (de addgene) y el vector de expresión recombinante que codifica el gen de interés CAR basado en el vector vacío pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE (de addgene), que puede reducir eficazmente el riesgo de formar partículas de lentivirus replicables.
En el presente sistema, el presente autor de la invención modificó en primer lugar el vector vacío pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE mediante la técnica convencional de clonación molecular, y reemplazó el promotor original en el vector con el promotor del factor de elongación 1a (EF-1a) y añadió el sitio de restricción MluI entre el promotor y el péptido señal CD8asp. Específicamente, el vector pWPT -EGFP (adquirido de Addgene) se digirió doblemente con ClaI/SalI (adquirido de NEB), y se recuperó un fragmento de ADN de 1,1 kb y se ligó con ADN ligasa T4 en el vector pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE digerido con ClaI/SalI y se transformó en la cepa huésped TOP10. Los clones positivos se seleccionaron mediante PCR de colonias y se confirmaron mediante secuenciación. Se obtuvo el plásmido recombinante pRRLSIN-cPPT.EF-1a-EGFP.WPRE.
Se prepararon receptores de antígenos quiméricos utilizando el scFv P7D4 previamente optimizado. La Tabla 3 explica el orden de conexión de las partes del receptor de antígeno quimérico ejemplificado en la presente divulgación.
Tabla 3
1. Amplificación de fragmentos de ácido nucleico
(1) Amplificación de secuencias scFv
El fragmento scFv P7D4 se obtuvo mediante PCR utilizando el plásmido V5-scFv-P7D4-Fc como molde con un cebador directo P7D4fd (SEQ ID NO: 36, ctccacgccgccaggccgcaggtgcagctgcaggag, que comprende parte de la secuencia del péptido señal CD8) y un cebador inverso P7D4re (SEQ ID NO: 37, CGGCGCTGGCGTCGTGGTACCTAGGACGGTGACCTTGG, que comprende parte de la secuencia de la bisagra CD8).
(2) Secuencias de ácido nucleico de otras partes del receptor de antígeno quimérico
Las secuencias de ácido nucleico de otras partes de la proteína receptor de antígeno quimérico anti-GPC3, excepto P7D4 scFv, se obtuvieron respectivamente mediante PCR utilizando las secuencias SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 y 30 descritas en la Solicitud de Patente N° 201310164725.X como moldes.
Específicamente, el fragmento F1 que contiene la secuencia CD8asp se obtuvo mediante amplificación por PCR con el par de cebadores PWXLF (SeQ ID NO: 38, gcaggggaaagaatagtagaca) y PRRL-CD8SP-R1 (SEQ ID NO: 39, CGGCCTGGCGGCGTGGAG), utilizando el plásmido pRRLSIN-cPPT.EF-1a-EGFP.WPRE construido en este ejemplo como un molde.
El fragmento F3-5Z que contiene CD8-CD35 zeta (5Z) se obtuvo mediante amplificación por PCR con el par de cebadores PRRL-CD8bisagra (SEQ ID NO: 40, accacgacgccagcgccg) y 5Zre (SEQ ID NO: 41, GAGGTCGACCTACGCGGGGGCGTCTGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCT) utilizando el plásmido SEQ ID NO: 26 en 201310164725.X como un molde.
Fragmento F3-Z que comprende CD8-CD3 zeta (Z), fragmento F3-BBZ que comprende CD8-CD137-CD3 zeta (BBZ), fragmento F3-28Z que comprende CD28a-CD28b-CD3 zeta (28Z) y fragmento F3-28BBZ que comprende CD28a-CD28b-CD137-CD3 zeta (28BBZ) se obtuvo mediante amplificación por PCR con el par de cebadores PRRL-CD8bisagra (SEQ ID NO: 42, accacgacgccagcgccg) y R3R (SEQ ID NO: 43, aatccagaggttgattgtcgacctagcgagggggcagggcctgc) utilizando los plásmidos correspondientes a SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 en la solicitud N° 201310164725.X, respectivamente.
2. Corte y empalme de fragmentos de ácido nucleico
El fragmento de ácido nucleico F1 obtenido como se describe arriba y el fragmento de ácido nucleico equimolar P7D4 scFv y los fragmentos de ácido nucleico equimolar F3-5Z o F3-Z o F3-BBZ o F3-28Z o F3-28BBZ se sometieron a corte y empalme de tres segmentos y PCR tal como se muestra. en la Figura 9 bajo las siguientes condiciones: Pre desnaturalización: 94°C durante 4 min; desnaturalización: 94°C durante 40 s; reasociación: 60°C durante 40 s; extensión: 68°C durante 140 s durante 5 ciclos y luego extensión total a 68°C durante 10 min. Se complementaron la ADN polimerasa y el cebador directo PWXLF y el cebador inverso R3R (el cebador inverso correspondiente a CD8-CD35 zeta era 5Z re y el otro es R3R), y luego se realizó la PCR durante 30 ciclos con las condiciones de amplificación: Pre-desnaturalización: 94°C durante 4 min; desnaturalización: 94°C durante 40 s; reasociación: 60°C durante 40 s; extensión: 68°C durante 140 s durante 30 ciclos y luego extensión total a 68°C durante 10 min. Al fragmento que
consiste en el fragmento F1, scFv de P7D4 o scFv mutante de P7D4, y diversos fragmentos F3 construidos en este Ejemplo se les puede aludir simplemente como fragmento CAR, y a los fragmentos amplificados se les alude como:
P7D4 scFv-5Z (SEQ ID NO: 44).
P7D4 scFv-Z (SEQ ID NO: 45).
P7D4 scFv-BBZ (SEQ ID NO: 46).
P7D4 scFv-28Z (SEQ ID NO: 47).
P7D4 scFv-28BBZ (SEQ ID NO: 48).
3. Construcción del vector plasmídico lentiviral
En este ejemplo, el gen diana que consiste en el fragmento F1, scFv de P7D4 y los componentes del fragmento F3 (abreviado como CAR) fue doblemente digerido por las enzimas de restricción MluI y SalI y ligado en el mismo vector pRRLSIN-cPPT.EF-1a-EGFP.WPRE doble digerido para construir un vector lentiviral que exprese cada uno de los receptores de antígeno quimérico. El vector construido se identificó mediante digestión con MluI y SalI y se secuenció correctamente, que estaba listo para el empaquetamiento de lentivirus. Como se mencionó arriba, el gen CAR relevante se transcribió y se tradujo en una cadena peptídica, en que el receptor de antígeno quimérico anti-GPC3 se localizará bajo la guía del péptido señal CD8a en la membrana celular.
Se obtuvieron 5 secuencias de polipéptidos CAR respectivamente a través de la construcción anterior, que se denominan:
P7D4-5Z (SEQ ID NO: 49);
P7D4-Z (SEQ ID NO: 50);
P7D4-BBZ (SEQ ID NO: 51);
P7D4-28Z (SEQ ID NO: 52);
P7D4-28BBZ (SEQ ID NO: 53).
4. Lentivirus de empaquetamiento 293T transfectado con plásmido
Células HEK-293T (ATCC: CRL-11268) cultivadas en el paso 6 al paso 10 se sembraron a una densidad de 6 X 106 en placas de 10 cm y se cultivaron durante la noche a 37°C en 5% de CO2 para la transfección. El medio era DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% (adquirido de Life).
Las etapas de la transfección son las siguientes:
4.1 Preparación de líquido A: disolver 5,2 pg de cada uno de los plásmidos génicos deseados pRRLSIN-cPPT.EF-1a-CAR con 6,2 pg de plásmido de empaquetamiento pMDLg RRE y pRSV -REV y 2,4 pg de plásmido de la envoltura pCMV-VSV-G en 800 pL de medio DMEM libre de suero y mezclar bien.
4.2 Preparación de líquido B: disolver 60 pg de PEI (polietilenimina 1 pg/pl, adquirido de Polysciences) en 800 pL de medio DMEM libre de suero, mezclar suavemente e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
4.3 Formación del complejo de transfección: añadir el líquido A al líquido B y mezclar suavemente, agitar con vórtice o mezclar suavemente inmediatamente después de la adición, incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
4.4 Adición gota a gota de 1,6 ml del complejo de transfección en células HEK-293T y, después de 4-5 h, cambiar a DMEM con FBS al 2% para células 293T transfectadas.
Después de 72 h de transfección, el virus se recogió mediante filtración utilizando un filtro de 0,45 pm (disponible de Millipore Corporation) y se centrifugó a 28.000 rpm utilizando una ultracentrífuga Beckman Optima L-100XP durante 2 horas a 4°C. El sobrenadante se desechó y el sedimento resultante se centrifugó a 1/10 ~ 1/50 solución madre de AIM-V (adquirida de Life) y se resuspendió en 100 pL/tubo en -80°C para la titulación del virus o la infección de los linfocitos T.
Ejemplo 7. Células T infectadas por lentivirus recombinante (no forma parte de la invención)
Se obtuvieron células mononucleares de la sangre periférica humana a partir de sangre periférica humana sana mediante centrifugación en gradiente de densidad (suministrada por Shanghai Blood Center) y se añadieron en medio de linfocitos AIM-V (adquirido de Invitrogen) a una densidad de aproximadamente 2 X 106 / mL y se añadieron. Las perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y CD28 (Invitrogen) se añadieron en una relación 1: 1 de células a perlas magnéticas e IL-2 humana recombinante (adquirida de Shanghai Huaxin Biotechnology Co., Ltd.) en una concentración final. de 300U/mL se añadió para la estimulación y el cultivo durante 48 h. Y luego las células T se infectaron con el lentivirus recombinante anterior (MOI =10). Las células infectadas se hicieron pasar cada dos días a una densidad de 5 X 105/mL y se complementó IL-2 humana recombinante a una concentración final de 300 U / mL en el medio de cultivo de linfocitos.
Las células CTL infectadas se detectaron mediante citometría de flujo el día 8 de cultivo para la expresión de diferentes receptores de antígenos quiméricos. Los ensayos FACS se realizaron utilizando proteína recombinante GPC3 humana marcada con His (adquirida de Shanghai Rui Jin Biotech Co., Ltd.); las células se incubaron en primer lugar con la proteína (50 ug / ml) durante 1 hora, se lavaron dos veces con D-PBS y se añadió el anticuerpo Anti-His-tag (dilución 1:50, adquirido de Shanghai Reagent Biotechnology Co., Ltd.) y se incubó durante 1 h y luego se lavó dos veces con D-PBS y luego con anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC (Shanghai Kangcheng Biotechnology Co., Ltd.), se incubó durante 50 min, se lavó con D-PBS tres veces y se testó por FACS. Los linfocitos T no infectados se utilizaron como control negativo, las tasas positivas de células T infectadas con virus que expresan diferentes receptores de antígenos quiméricos se muestran en la Tabla 4. Los resultados de la tasa positiva demuestran que se puede obtener una determinada tasa positiva de células T CAR+ mediante infección por lentivirus..
Tabla 4
Células T se infectaron con virus que tenían diferentes receptores de antígenos quiméricos empaquetados, respectivamente, y luego se subcultivaron a una densidad celular de 5 x 105 / ml una vez alterna al día, se contaron y se complementaron con IL-2 (concentración final de 300 U/ml). El 11° día de cultivo se obtuvieron aproximadamente 100 ~ 1000 veces de amplificación, lo que indica que las células T que expresan diferentes receptores de antígenos quiméricos pueden expandirse en una determinada cantidad in vitro, lo que asegura posteriores tests de toxicidad in vitro y experimentos in vivo.
Ejemplo 8. Ensayo de toxicidad in vitro de linfocitos T que expresan el receptor de antígeno quimérico (no forma parte de la invención)
Los experimentos de toxicidad In vitro utilizaron los siguientes materiales:
Como células diana se utilizaron células de hepatoma positivas para GPC3 (HepG2 y Huh-7) y células de hepatoma negativas para GPC3 (SK-HEP-1) como se muestra en la Tabla 5 y células efectoras se cultivaron con CTL durante 12 días in vitro, que se verificaron en el Ejemplo 7 y mediante FACS se detectó la expresión de receptor de antígeno quimérico positiva. Las relaciones objetivo efectivas fueron 3: 1, 1: 1 y 1: 3, respectivamente. El número de células diana fue 10000/pocillo, y las células efectoras correspondieron a diferentes relaciones objetivo efectivas. Cada uno de los grupos tenía 5 pocillos replicados, se calculó un promedio de 5 pozos y el tiempo de detección fue de 18 h.
Cada uno de los grupos experimentales y cada uno de los grupos de control se enumeran como sigue:
Cada uno de los grupos experimentales: cada una de las células diana CTL que expresan diferentes receptores de antígenos quiméricos;
Grupo de control 1: células diana con máxima liberación de LDH;
Grupo de control 2: células diana con liberación espontánea de LDH;
Grupo de control 3: células efectoras con liberación espontánea de LDH.
Método de detección: Se utiliza el ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega), que es un ensayo colorimétrico que puede reemplazar el ensayo de liberación de 51Cr. El ensayo CytoTox 96® mide la lactato deshidrogenasa (LDH) cuantitativamente. La LDH es una enzima citosólica estable que se libera tras la lisis de las células y se libera de la misma manera que se libera el 51Cr radiactivo. El sobrenadante con medio LDH liberado puede detectarse mediante una reacción enzimática acoplada de 30 minutos en la que LDH convierte una sal de tetrazolio (INT) en un formazán rojo. La cantidad de producto rojo producido es proporcional al número de células lisadas. Los detalles se pueden encontrar en las instrucciones del kit de detección de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96.
La citotoxicidad se calcula como:
Citotoxicidad % = [(grupo experimento - grupo control 2 - grupo control 3}(grupo control 1-grupo comntrol 2)Jx 100
Específicamente, como se muestra en la Tabla 5, el CAR del anticuerpo de cadena sencilla P7D4 de la presente divulgación exhibió una actividad exterminadora significativa en células de hepatoma positivas para GPC3, y la segunda y tercera generaciones de células T CAR P7D4 fueron ligeramente más potentes que la actividad antitumoral. de la primera generación. Además, todas las células CAR T no mostraron actividad citotóxica en células de hepatoma positivas para SK-HEP-1 negativas para GPC3. Estos resultados indican que P7D4 puede fijar selectivamente como objetivo a las células de hepatoma positivas para GPC3 y matarlas de forma eficaz. Además, la primera, segunda y tercera generación de CART que expresa P7D4 de la presente divulgación exhibió una dependencia del gradiente de la relación efector objetivo, es decir, cuanto mayor sea la relación efector objetivo, más fuertes serán los efectos citotóxicos.
Ejemplo 9. Preparación y comparación de células CAR-T basadas en Y035 y GC33
Se prepararon dos tipos de células CAR-T, Y035-BBZ, Y035-28Z y Y035-28BBZ, basándose en la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de Y035, respectivamente, de acuerdo con los procesos de los Ejemplos 6 y 7; y se prepararon dos células CAR-T, GC33-28Z y GC33-28BBZ, basándose en la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de GC33, como control. Partes del receptor de antígeno quimérico se conectan como se muestra en la Tabla 6.
Tabla 6
En donde la secuencia de nucleótidos de Y035-BBZ se muestra como sigue (SEQ ID NO: 85):
gaggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggc tacaccttcagcgactacgagatgcactgggtgcggcaggcccccggccagggcctggagtggatgggcgccatccaccccggca g cg g cg acaccgcctacaaccagcggttcaagggccgggtgaccatcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggagc tgagcagcctgcggagcgaggacaccgccgtg tactactgcgcccggttctacagctacgcctactggggccagggcaccctggtg accgtgagcgccggtggaggcggttcaggcggaggtggttctggcggtggcggatcggacatcgtgatgacccagacccccctga gcctgcccg tgacccccg g cg ag cccg ccag catcag ctg ccg g ag cag ccag ag cctg g tg cacag caacg g caacacctacc tgcagtggtacctgcagaagcccggccagagcccccagctgctgatctacaaggtgagcaaccggttcagcggcgtgcccgaccg gttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagccgggtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcagc cag ag catctacg tgccctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaaacgtaccacgacgccagcgccgcgaccaccaa caccggcgcccaccatcgcgtcg cag cccctg tccctg cg cccag ag g cg tg ccg g ccag cg g cg g g g g g cg cag tg cacacg agggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttg tggggtccttctcctg tcactggttatcacccttt actgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgt agctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagc agggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccct gagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctac agtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggac acctacg acg cccttcaca tg cag g ccctg ccccctcg c
secuencia de nucleótidos de Y035-BBZ se muestra como sigue (SEQ ID NO: 86)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWMGAIH
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secuencia de nucleótidos de Y035-28Z se muestra como sigue (SEQ ID NO: 87):
tacaccttcagcgactacgagatgcactgggtgcggcaggcccccggccagggcctggagtggatgggcgccatccaccccggca gcggcgacaccgcctacaaccagcggttcaagggccgggtgaccalcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggagc tgagcagcctgcggagcgaggacaccgccgtgtactactgcgcccggttctacagctacgcctactggggccagggcaccctggtg accgtgagcgccggtggaggcggttcaggcggaggtggttctggcggtggcggatcggacatcgtgatgacccagacccccctga gcctgcccgtgacccccggcgagcccgccagcatcagctgccggagcagccagagcctggtgcacagcaacggcaacacctacc tgcagtggtacctgcagaagcccggccagagcccccagctgctgatctacaaggtgagcaaccggttcagcggcgtgcccgaccg gttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagccgggtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcagc cagagcatctacgtgccctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaaacgtaccacgacgccagcgccgcgaccaccaa caccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacg agggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttat tattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggccaacccgcaa gcattaccagc c ctatgc ccc accacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgt accagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgg gaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcg gaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagcca ccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
secuencia de nucleótidos de Y035-28Z se muestra como sigue (SEQ ID NO: 88):
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWMGAIH PGSGDTAYNQRFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFYSYAYWGQGT LVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYL QWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSI YVPYTFGQGTKLEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAC DFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK DTYDALHMQALPPR
secuencia de nucleótidos de Y035-28BBZ se muestra como sigue (SEQ ID NO: 89):
gaggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggc tacaccttcagcgactacgagatgcactgggtgcggcaggcccccggccagggcctggagtggatgggcgccatccaccccggca gcggcgacaccgcctacaaccagcggttcaagggccgggtgaccatcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggagc tgagcagcctgcggagcgaggacaccgccgtgtactactgcgcccggttctacagctacgcctactggggccagggcaccctggtg accgtgagcgccggtggaggcggttcaggcggaggtggttctggcggtggcggatcggacatcgtgatgacccagacccccctga gcctgcccgtgacccccggcgagcccgccagcatcagctgccggagcagccagagcctggtgcacagcaacggcaacacctacc tgcagtggtacctgcagaagcccggccagagcccccagctgctgatctacaaggtgagcaaccggttcagcggcgtgcccgaccg gttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagccgggtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcagc cagagcatctacgtgccctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaaacgtaccacgacgccagcgccgcgaccaccaa caccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacg agggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttat tattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggccaacccgcaa gcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaa ccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaa gagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcagg aaggcctgLacaalgaactgcagaaagataagalggcggaggcctacaglgagaltgggatgaaaggcgagcgccggaggggca aggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
secuencia de nucleótidos de Y035-28BBZ se muestra como sigue (SEQ ID NO: 90)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWMGAIH PGSGDTAYNQRFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFYSYAYWGQGT LVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYL
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N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R
Se utilizaron células Huh-7 de hepatoma positivas para GPC3 como células diana y se llevó a cabo una prueba de toxicidad in vitro de acuerdo con el método de ensayo de la toxicidad in vitro del Ejemplo 8. Cuando la relación diana efectora era 1: 3, las tasas de exterminio de Y035-28Z e Y035 -28BBZ en Huh-7 pueden ser superiores al 35%, la tasa de exterminio de GC33-28Z fue solo del 6% y la tasa de exterminio de GC33-28BZZ fue solo del 23%. Cuando la relación diana efectora era 1: 1, la tasa de exterminio de Y035-28Z en Huh-7 puede ser superior al 60%, mientras que la tasa de exterminio de GC33-28Z fue solo del 22%. Los resultados anteriores demuestran que la actividad de exterminio de células de las células T Y035-CAR de la presente solicitud fue significativamente mejor que la de las células T GC33-CAR.
Ejemplo 10. Preparación de anticuerpos biespecíficos BiTE
(1) Preparación de Y035 de la secuencia de nucleótidos del anticuerpo de cadena sencilla Y035
La línea celular de hibridoma que secreta el anticuerpo monoclonal se cultivó hasta la fase de crecimiento logarítmico, y se contaron las células y se tomaron 1 x 107 células de hibridoma. El ARN total se extrajo del sedimento celular de acuerdo con la instrucción del kit de purificación de ARN TRIzol ® Plus (Invitrogen, 12183-555).
a. ADNc obtenido por transcripción Inversa
Los ARN totales de las células de hibridoma se utilizaron como molde y el ADNc se sintetizó mediante transcripción inversa utilizando un kit de ARN a ADNc de alta capacidad (Invitrogen, 4387406).
b. Amplificación de la región variable del anticuerpo por el método 5'-RACE
El ADNc se utilizó como molde y se amplificó con los cebadores tgctttggtttccaggtgcaagatgtgaggtgcagctggtgcaga (SEQ ID NO: 91) y el cebador TATCGGATCCACCACCTCCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTG (SEQ ID NO: 92) utilizando el kit 5’-Full RACE (TAKARA, D315). El producto de la PCR se separó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, y el producto de la PCR obtenido fue ácido nucleico de anticuerpo de cadena sencilla Y035.
(2) Construcción de la secuencia de ácido nucleico del anticuerpo de cadena sencilla CD3
La PCR se realizó con cebador (SEQ ID NO: 93, gatatcaaactgcagcagtcag) y cebador (SEQ ID NO: 94, GAGAGGGAGTACTCACCCCAAC), utilizando el anticuerpo biespecífico anti-EpCAM/CD3 descrito en 201310025302.X como molde con referencia al Manual de enzimas KOD PLUS. El gel se recuperó y se purificó, y el producto de la PCR obtenido fue un ácido nucleico de anticuerpo de cadena sencilla CD3.
(3) Introducción de sitios de restricción NheI
La PCR se realizó con cebadores (ggctaactagagaacccactgc, SEQ ID NO: 95) y PH-R (ACATCTTGCACCTGGAAACCAAAGC, SEQ ID NO: 96) utilizando el vector PIH como molde, y la reacción específica puede referirse al Manual de enzimas KOD PLUS. Se recuperó el gel y se purificó el producto de la PCR, obteniendo con ello un fragmento corto con sitio de restricción NheI.
(4) Construcción del ácido nucleico de la secuencia codificante del anticuerpo biespecífico Y035/CD3 La PCR de solapamiento se realizó utilizando los productos de PCR obtenidos en las etapas (1), (2) y (3), y la PCR se realizó con el cebador (SEQ ID NO: 95) y el cebador (SEQ ID NO: 92). Se recuperó el gel y se purificó el producto de la PCR, obteniendo con ello la secuencia codificante del anticuerpo biespecífico Y035/CD3 (SEQ ID NO: 97) con la siguiente secuencia:
Claims (19)
1. Un anticuerpo que reconoce específicamente a glipicano-3, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y su región variable de la cadena pesada comprende: la CDR1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, la CDR2 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 y la CDR3 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; y su región variable de la cadena ligera comprende la CDR1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, la CDR2 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y la CDR3 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 y una región variable de la cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y su cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 y su cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82.
5. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5.
7. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6 o que tiene el ácido nucleico de la reivindicación 5 integrado en su genoma.
8. Uso in vitro del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la preparación de un fármaco fijado como objetivo, conjugado anticuerpo-fármaco o un anticuerpo polifuncional que fija específicamente como objetivo a células tumorales que expresan glipicano-3; o
para la preparación de un reactivo para diagnosticar un tumor que expresa glipicano-3; o
para la preparación de células inmunes modificadas por receptor de antígeno quimérico.
9. Un inmunoconjugado multifuncional, que comprende:
el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y
una molécula funcional enlazada a la misma; y la molécula funcional se selecciona de un grupo que consiste en una molécula que fija como objetivo un marcador de superficie tumoral, una molécula supresora de tumores, una molécula que fija como objetivo un marcador de superficie de una célula inmunitaria o un marcador detectable; preferiblemente, la molécula que fija como objetivo a un marcador de superficie tumoral es un anticuerpo o ligando que se une a un marcador de superficie tumoral, y más preferiblemente, en donde el anticuerpo que se une a un marcador de superficie tumoral se refiere a un anticuerpo que reconoce antígenos distintos del glipicano-3, en donde los otros antígenos incluyen: EGFR, EGFRvIII, mesotelina, HER2, EphA2, Her3, EpCAM, MUC1, MUC16, CEA, Claudina 18.2, receptor de folato, Claudina 6, w T1, NY-ESO- 1, MAGE 3, ASGPR1 o CDH16; o
la molécula supresora de tumores es una citoquina antitumoral o una toxina antitumoral; y preferiblemente, la citoquina incluye: IL-12, IL-15, IFN-beta y TNF-alfa; o
el marcador detectable incluye un marcador fluorescente o un marcador cromogénico; o
la molécula que fija como objetivo al marcador de superficie de la célula inmune es un anticuerpo que se une al marcador de superficie de células T, que puede formar un anticuerpo bifuncional que se acopla a las células T con el anticuerpo de la reivindicación 1;
más preferiblemente, el anticuerpo que se une al marcador de superficie de la célula inmune es un anticuerpo anti-CD3;
más preferiblemente, el inmunoconjugado multifuncional es un péptido de fusión y, además, comprende un péptido enlazador entre el anticuerpo de la reivindicación 1 y la molécula funcional enlazada al mismo.
10. Un ácido nucleico que codifica el inmunoconjugado multifuncional de la reivindicación 9.
11. Uso in vitro del inmunoconjugado multifuncional de la reivindicación 9, para la preparación de un agente antineoplásico, o
para la preparación de un agente para el diagnóstico de tumores que expresa glipicano-3; o
para la preparación de células inmunes modificadas con receptor de antígeno quimérico; preferiblemente, las células inmunes incluyen linfocitos T, células NK o linfocitos NKT.
12. Un receptor de antígeno quimérico que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el receptor de antígeno quimérico comprende: el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, una región de transmembrana y una región de señal intracelular, que están enlazados secuencialmente; y la región de señal intracelular se selecciona de un grupo que consiste en secuencias de la región de señal intracelular de CD3Z, FocPIy, CD27, CD28, CD137, CD134, MyD88, CD40 o una combinación de los mismos;
preferiblemente, la región de transmembrana comprende una región de transmembrana de CD8 o CD28; o el receptor de antígeno quimérico comprende el siguiente anticuerpo conectado secuencialmente, una región de transmembrana y una región de señal intracelular:
el anticuerpo de la reivindicación 1, CD8 y CD3Z ;
el anticuerpo de la reivindicación 1, CD8, CD137 y CD3Z
el anticuerpo de la reivindicación 1, la región de transmembrana de la molécula CD28, la región de señalización intracelular de la molécula CD28 y CD3Z; o
el anticuerpo de la reivindicación 1, la región de transmembrana de la molécula CD28, la región de señal intracelular de la molécula CD28, CD137 y CD3Q; o
el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla; o
el receptor de antígeno quimérico comprende:
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86;
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88; o
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90.
13. Un ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 12.
14. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 13.
15. Un virus que comprende el vector de la reivindicación 14.
16. Uso in vitro del receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 12, o el ácido nucleico de la reivindicación 13, o el vector de expresión de la reivindicación 14 o el virus de la reivindicación 15 para la preparación de células inmunes modificadas genéticamente que fijan como objetivo al tumor que expresa glipicano-3;
preferiblemente, el tumor que expresa glipicano-3 incluye: cáncer de hígado, melanoma, carcinoma de células claras de ovario, tumor del saco vitelino y neuroblastoma.
17. Una célula inmune modificada genéticamente, que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 13 o el vector de expresión de la reivindicación 14 o el virus de la reivindicación 15; o
tiene el receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 12 expresado en su superficie;
preferiblemente, lleva, además, una secuencia codificante exógena para citoquinas; y preferiblemente, las citoquinas incluyen IL-12, IL-15 o IL-21; o
también expresa otro receptor de antígeno quimérico que no contiene CD3Z pero contiene el dominio de señalización intracelular de CD28, el dominio de señalización intracelular de CD137 o una combinación de ambos; o expresa, además, un receptor de quimioquinas; y preferiblemente, el receptor de quimioquinas incluye: CCR2; o expresa, además, ARNip que puede reducir la expresión de PD-1 o una proteína que bloquea PD-L1; o
expresa, además, un interruptor de seguridad; y preferiblemente, el interruptor de seguridad incluye iCaspasa-9, EGFR Truncado o RQR8; o
las células inmunes incluyen linfocitos T, células NK o células NKT.
18. Uso in vitrode la célula inmune modificada genéticamente de la reivindicación 17 para la preparación de un fármaco inhibidor de tumores, y el tumor es un tumor que expresa glipicano-3.
19. Una composición farmacéutica, que comprende:
el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o un ácido nucleico que codifica el anticuerpo; o el inmunoconjugado de la reivindicación 9 o un ácido nucleico que codifica el conjugado; o
el receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 12 o un ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico; o
la célula inmune modificada genéticamente de la reivindicación 17.
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