ES2879373T3 - Métodos y composiciones para la regulación de la expresión de proteínas de dedo de zinc - Google Patents

Abstract

Una construcción que comprende un polinucleótido que codifica un modulador génico, comprendiendo el modulador génico un dominio de represión y un dominio de unión al ADN que se une a un sitio diana previsto, en donde el polinucleótido está operativamente unido a un promotor heterólogo que comprende un sitio diana autorregulado unido por el dominio de unión al ADN del modulador génico con una afinidad más baja que el sitio diana previsto, en donde la unión del modulador génico a la secuencia diana autorreguladora disminuye la expresión del polinucleótido, y en donde el dominio de unión al ADN comprende una proteína de dedo de zinc, una proteína TALE o un sistema CRISPR/Cas.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para la regulación de la expresión de proteínas de dedo de zinc

Campo técnico

La presente divulgación pertenece al campo de la expresión y modificación por ingeniería genética del genoma, particularmente a la regulación de la expresión de moduladores génicos en una célula.

Antecedentes

Se han descrito varios métodos y composiciones para la modulación dirigida de la expresión génica del ADN genómico endógeno. Se describe la modulación dirigida de la expresión génica mediante proteínas de unión al ADN, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 6.534.261; 6.607.882; 6.599.692; 6.689.558; 7.067.317; 7.947.873; 7.253.273; 7.358.085; 7.361.635; 7.534.775; 8.586.526 y la publicación de patente de Estados Unidos n.° 20110082093. Asimismo, se pueden usar los acontecimientos de escisión dirigida usando nucleasas específicas del sitio, por ejemplo, para inducir mutagénesis dirigida, inducir deleciones dirigidas de secuencias de ADN celular y facilitar la recombinación dirigida en un locus cromosómico predeterminado. Véase, por ejemplo, 8.623.618; 8.034.598; 8.586.526; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.067.317; 7.262.054; 7.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; las publicaciones de patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 y 20130177960 y la solicitud de Estados Unidos N.° 14/278.903).

Estos métodos frecuentemente implican el uso de proteínas modificadas por ingeniería genética que modulan la expresión de un gen diana o sistemas de nucleasa modificados por ingeniería genética. En particular, los factores de transcripción modificados por ingeniería genética activan o reprimen los genes dirigidos y las nucleasas inducen una rotura de la doble cadena (DSB) o una muesca en una secuencia de ADN diana de tal manera que la reparación de la rotura por unión de extremos no homólogos (NHEJ) o por reparación dirigida por homología (HDR) puede provocar la inactivación de un gen y/o la inserción de una secuencia de interés (integración dirigida). La modulación y/o escisión de genes endógenos puede tener lugar mediante el uso de proteínas y sistemas, tales como los factores de transcripción de proteína de dedo de zinc (ZFP-TF), las nucleasas de dedo de zinc (ZFN), los factores de transcripción de tipo activador de la transcripción (TALE-TF), los factores de transcripción CRISPR/Cas (véase, por ejemplo, Perez-Pinera et al. (2013) Nature Methods 10:973-976), transcription-activator like effector nucleases (TALENs), las nucleasas Ttago o usando el sistema CRISPR/Cas con un ARNcr/ARNtracr modificado por ingeniería genética ('ARN de guía única') para guiar la escisión específica. Los ensayos clínicos que utilizan estos factores de transcripción modificados por ingeniería genética que contienen proteínas de dedo de zinc han demostrado que estos nuevos factores de transcripción son capaces de tratar diversas afecciones (véase, por ejemplo, Yu et al. (2006) FASEB J.

20:479-481). Adicionalmente, los ensayos clínicos que utilizan nucleasas de dedo de zinc modificadas por ingeniería genética también han demostrado su utilidad terapéutica (véase, por ejemplo, Tebas et al. (2014) New Eng J Med 370(10):901).

La modulación génica que utiliza estas proteínas y sistemas tiene el potencial de tratar diversas enfermedades y trastornos, incluyendo, a modo de ejemplo, infección por VIH, fibrosis quística, cánceres, tales como glioblastomas, neuropatías, trastornos por repetición de trinucleótidos, trastornos relacionados con HLA, hemofilias, dolencias neurológicas, infección por patógenos, enfermedades por almacenamiento lisosómico y hemoglobinopatías. Véase, por ejemplo, patente de EE.UU N.° 7.951.925; publicaciones de patente de Estados Unidos números 20140017212; 20140093913; 20140080216; 20130145484, 20080188000, 20110082078, 20110082093, 20120196370, 20120128635, 20120214241, 20130253040. Sin embargo, incluso en los casos en donde el modulador se une preferentemente (de una manera específica de la secuencia) a un alelo mutante del sitio diana en comparación con un alelo de tipo silvestre (véase, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos números 20110082093 y 20130253040, la sobreexpresión del modulador puede tener como resultado la unión y/o alteración no deseada de una secuencia de tipo silvestre.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de composiciones y métodos para regular la expresión de moduladores de genes exógenos dentro de una célula para lograr niveles óptimos de expresión de los moduladores y la posterior modificación de los niveles de expresión génica.

Garriga-Canut et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 109(45):E3136-45 divulga una estrategia para ensayar la represión del gen de la huntingtina mutante con proteínas con dedo de zinc en un modelo de enfermedad de Huntington.

Hermsen et al. (2010) PLoS Comput Biol 6(6):el000813 divulga que hasta el 59 % de los factores de transcripción en Escherichia coli regulan la tasa de transcripción de sus propios genes. Los autores estudian una posible función de la autorregulación utilizando un algoritmo evolutivo y un modelo químico-físico de regulación de la transcripción para diseñar modelos cis-reguladores con funciones de respuesta predefinidas.

Sumario

En un aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un polinucleótido que codifica un modulador génico, comprendiendo el modulador génico un dominio de represión y un dominio de unión al ADN que se une a un sitio diana previsto, en donde el polinucleótido está operativamente unido a un promotor heterólogo que comprende un sitio diana autorregulado unido por el dominio de unión al ADN del modulador génico con una afinidad más baja que el sitio diana previsto, en donde la unión del modulador génico a la secuencia diana autorreguladora disminuye la expresión del polinucleótido, y en donde el dominio de unión al ADN comprende una proteína de dedo de zinc, una proteína TALE o un sistema CRISPR/Cas.

En determinadas realizaciones, el sitio diana previsto es un genoma endógeno. En determinadas realizaciones, las construcciones descritas en el presente documento comprenden además un ácido nucleico donante.

En determinadas realizaciones, la construcción que comprende los polinucleótidos como se describe en el presente documento es una construcción viral, por ejemplo, un vector lentiviral (LV), un vector lentiviral de integración defectuosa (IDLV), un adenovirus o una construcción de AAV.

En otros aspectos, en el presente documento se describen células que comprenden una o más de las construcciones descritas en el presente documento.

Se pueden incluir secuencias adicionales (secuencias codificantes o no codificantes) en la construcción, que incluyen, pero sin limitación, secuencias que codifican un péptido 2A, un sitio SA, IRES y similares, así como secuencias codificantes adicionales tales como indicadores, polipéptidos terapéuticos y similares.

En otros aspectos, la divulgación proporciona métodos para regular la expresión de un modulador génico exógeno introducido en una célula, comprendiendo los métodos introducir una construcción como se describe en el presente documento en una célula, en donde la expresión del modulador génico se reprime tras la unión del modulador génico al sitio diana autorregulado y en donde: (i) dicho método se realiza ex vivo o in vitro, o (ii) dicha célula es una célula vegetal.

En otro aspecto, la invención proporciona una construcción como se describe en el presente documento para usar en un método de tratamiento, comprendiendo dicho método administrar dicha construcción a un sujeto, en donde la expresión del modulador génico se reprime al unirse el modulador génico al sitio diana autorregulador. En otro aspecto, la invención proporciona una célula como se describe en el presente documento para usar en un método de tratamiento, comprendiendo dicho método administrar dicha célula a un sujeto, en donde la expresión del modulador génico se reprime al unirse el modulador génico al sitio diana autorregulador.

En algunos aspectos, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden las construcciones o células como se describe en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para administración sistémica (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica, pulmonar o infusión intracraneal) o aplicación tópica.

También se proporciona un kit, que comprende las construcciones de la invención. El kit puede comprender además como se describe en el presente documento, moléculas donantes, instrucciones para realizar los métodos de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A a 1D son esquemas que muestran construcciones que comprenden represores ZFP ("ZFP-KOX") y la variante GFP Venus ("VENUS"). KOX se refiere al dominio de represión KRAB de la proteína KOX1. La Figura 1A muestra una construcción en la cual la expresión de la proteína está dirigida por el promotor Htt. La Figura 1B muestra una construcción en la cual la expresión de la proteína está dirigida por el promotor de CMV. La Figura 1C muestra una construcción en la cual el promotor de CMV se modifica para incluir 7-20 repeticiones CAG, que actúan como sitios diana de baja afinidad para las ZFP de unión a CAG. La Figura 1D muestra una construcción en la cual la expresión está dirigida por el promotor Htt con exón 1 no codificante que contiene 17 repeticiones CAG que actúan como sitios diana de baja afinidad para las ZFP de unión a CAG. También se muestra el intrón de beta-globina humana, una señal de localización nuclear ("NLS"), la etiqueta del epítopo FLAG, las secuencias 2A y la señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento humano (hGH poliA).

La Figura 2 es un gráfico que representa la expresión del número de copias de ARNm de ZFP-2A-Venus en las neuronas de la enfermedad de Huntington (HD) infectadas con LV que comprenden las construcciones indicadas. Las ZFP usadas en las construcciones son las proteínas de unión a Htt o control (Chk2) como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 3 es un gráfico que representa la expresión de Htt relativa medida por RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) en neuronas de HD infectadas con las construcciones de LV indicadas.

La Figura 4 es un gráfico que representa la expresión de Htt relativa medida por RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) en células 293T infectadas con las construcciones de IDLV indicadas.

La Figura 5 es un gráfico que representa la intensidad media de fluorescencia (MFI) de células 293T transfectadas con plásmido con el promotor de CMV, el promotor Htt (Http) o el promotor Htt y el exón 1 con una repetición CAG de 17 (Http-CAG17).

Las Figuras 6A y 6B son gráficos que representan el análisis de células 293T transfectadas con plásmidos de las construcciones indicadas. La Figura 6A muestra la MFI de la GFP expresada en células transfectadas con construcciones incluidas como se muestra en la Figura 1C y el Ejemplo 1. Como se indica (panel izquierdo), las construcciones no incluían sitios diana Htt de baja afinidad (0) o incluían 7, 10, 13, 15, 18 o 20 sitios diana Htt de baja afinidad en forma de repeticiones CAG. La Figura 6B es un gráfico que representa la expresión de ZFP-2A-VENUS mediante análisis cuantitativo Taqman® de las células transfectadas con las construcciones descritas en la Figura 6A.

La Figura 7 es un gráfico que representa el análisis de células 293T transfectadas con las construcciones indicadas. La Figura 7A es un gráfico que representa la MFI de la GFP de las células 293T transfectadas con las construcciones indicadas como se describe en el Ejemplo 1.

Las Figuras 8A a 8C son gráficos que representan el análisis de células 293T transducidas con AAV que comprende las construcciones indicadas. La Figura 8A es un gráfico que representa la MFI de la expresión de la GFP en células 293T transducidas con las construcciones indicadas como se describe en el Ejemplo 1. La Figura 8B es un gráfico que muestra el análisis Taqman® de las células para la expresión de ZFP. La Figura 8C representa la expresión del gen indicador (VENUS) de las construcciones que comprenden de 0 a 20 repeticiones CAG, donde la expresión se visualiza mediante citometría de flujo y microscopía fluorescente.

Las Figuras 9A y 9B son gráficos que representan el análisis de neuronas de HD transducidas con diferentes multiplicidades de infección (MOI) de AAV que contienen las construcciones del promotor como se describe en el Ejemplo 1. La Figura 9A representa la expresión del gen Htt a partir del alelo Htt de tipo silvestre ("CAG17") o un alelo Htt mutante (asociado a enfermedad) ("CAG48") en presencia de AAV con ZPF 33074 de unión a CAG o 5475 control en las construcciones del promotor como se describe en el Ejemplo 1. La Figura 9B muestra la expresión de ZFP TF medida por análisis cuantitativo Taqman® de las neuronas transducidas con las construcciones descritas en la Figura 9A.

Descripción detallada

En el presente documento se divulgan composiciones y métodos para regular la expresión de un modulador génico exógeno dentro de una célula. En particular, en el presente documento se divulgan construcciones que codifican uno o más moduladores génicos modificados por ingeniería genética (por ejemplo, factores de transcripción) en los que la expresión del modulador génico modificado por ingeniería genética puede regularse mediante la inclusión de uno o más sitios diana de baja afinidad para el factor de transcripción. De esta manera, cuando el factor de transcripción se expresa en niveles suficientemente altos dentro de la célula (por ejemplo, sobreexpresado), el modulador génico se une a los sitios diana de baja afinidad y la expresión del modulador génico se regula negativamente. En algunas realizaciones, la expresión de un transgén de interés también puede modularse creando un transgén de fusión de modo que el transgén de fusión codifique tanto el gen modulador como un gen de interés.

Por lo tanto, las composiciones y los métodos de la invención dan como resultado una regulación negativa de la expresión del modulador génico dentro de una célula en la que la sobreexpresión no es deseada y/o perjudicial para la célula.

General

La puesta en práctica de los métodos, así como la preparación y el uso de las composiciones divulgadas en el presente documento emplean, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, estructura y análisis de la cromatina, química computacional, cultivo de células, ADN recombinante y campos relacionados como se conocen dentro del campo de la técnica. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABOrAt ORY MANUAL, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y Tercera edición, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987 y actualizaciones periódicas; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Definiciones

La expresión "ácido nucleico", y los términos "polinucleótido", y "oligonucleótido" se usan indistintamente y se refieren a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido, en conformación lineal o circular, y en forma de cadena sencilla o doble. Para los fines de la presente divulgación, estos términos no deben interpretarse como limitantes con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos que se modifican en los restos de la base, el azúcar y/o el fosfato (p.ej., cadenas principales de fosforotioato). En general, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases; es decir, un análogo de A se emparejará con T.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. El término también se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácido son análogos químicos o derivados modificados de los correspondientes aminoácidos de origen natural.

"Unión" se refiere a la interacción específica de la secuencia, no covalente, entre macromoléculas (por ejemplo, entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de unión necesitan ser específicos de secuencia (por ejemplo, contactos con residuos de fosfato en una cadena principal de ADN), siempre que la interacción en su totalidad sea específica de la secuencia. Dichas interacciones se caracterizan generalmente por una constante de disociación (Kd) de 10-6 M-1 o menos. La "afinidad" se refiere a la fuerza de la unión: correlacionándose una afinidad de unión aumentada con una Kd menor.

Una "proteína de unión" es una proteína que es capaz de unirse a otra molécula. Una proteína de unión puede unirse а, por ejemplo, una molécula de ADN (una proteína de unión al ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteína). En el caso de una proteína de unión a proteína, esta se puede unir consigo mismo (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o se puede unir a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes. Una proteína de unión puede tener más de un tipo de actividad de unión. Por ejemplo, las proteínas de dedo de zinc tienen actividad de unión al ADN, unión al ARN y unión a proteínas.

Una "proteína de unión al ADN de dedo de zinc" (o dominio de unión) es una proteína, o un dominio con una proteína más grande, que se une al ADN de forma específica de la secuencia a través de uno o más dedos de zinc, que son regiones de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza a través de la coordinación de un ion de zinc. La expresión proteína de unión al ADN de dedo de zinc frecuentemente se abrevia como proteína de dedo de zinc o ZFP.

Un "dominio de unión al ADN de TALE" o "TALE" es un polipéptido que comprende uno o más de dominios/unidades repetidas TALE. Los dominios repetidos están implicados en la unión de TALE a su secuencia de ADN diana afín. Una "unidad de repetición" (también denominada como una "repetición") tiene normalmente de 33-35 aminoácidos de longitud y exhibe al menos homología de secuencia con otras secuencias de repetición TALE dentro de una proteína TALE de origen natural.

Los dominios de unión de dedos de zinc y TALE se pueden "modificar" para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo mediante ingeniería genética (alterando uno o más aminoácidos) de la región de la hélice de reconocimiento de un dedo de zinc o proteína TALE de origen natural. Por lo tanto, las proteínas de unión al ADN modificadas (dedos de zinc o TALE) son proteínas que no son de origen natural. Ejemplos no limitativos de métodos para modificar proteínas de unión al ADN son el diseño y la selección. Una proteína de unión al ADN modificada es una proteína que no existe en la naturaleza y cuyo diseño/composición es el resultado principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños ZFP y/o TALE existentes y datos de unión. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 8.586.526; 6.140.081; 6.453.242; б. 534.261 y 8.586.526; véase también los documentos WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.

Una proteína de dedo de zinc o TALE "seleccionada" es una proteína que no existe en la naturaleza cuya producción resulta principalmente de un proceso empírico, tal como la presentación en fagos, trampa de interacción o selección de híbridos. Véanse por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos números 8.586.526; 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; 8.586.526 y los documentos WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970, WO 01/88197, WO 02/099084.

"TtAgo" es una proteína Argonauta procariota que se cree que está implicada en el silenciamiento génico. TtAgo deriva de la bacteria Thermus thermophilus. Véase, por ejemplo, Swarts et al, ibid, G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111,652). Un "sistema TtAgo" tiene todos los componentes requeridos incluyendo, por ejemplo, ADN guías para la escisión por una enzima TtAgo. "Recombinación" se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos, que incluyen, pero sin limitación, captura de donantes por unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga. Para los fines de esta divulgación, "recombinación homóloga (HR)" se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de doble cadena en las células a través de mecanismos de reparación dirigidos por homología. Este proceso requiere una homología de secuencia de nucleótidos, utiliza una molécula "donante" para reparar el molde de una molécula "diana" (es decir, el que experimentó la rotura de la doble hebra), y se conoce como "conversión génica sin entrecruzamiento" o "conversión génica de tramo corto", porque conduce a la transferencia de información genética del donante a la diana. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, dicha transferencia puede implicar la corrección de errores del ADN heterodúplex que se forma entre la diana rota y el donante, y/o "hibridación de cadena dependiente de síntesis", en la que el donante se utiliza para resintetizar información genética que se convertirá en parte de la diana y/o procesos relacionados. Tal HR especializada a menudo da como resultado una alteración de la secuencia de la molécula diana de manera que parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpora al polinucleótido diana.

"Recombinación" se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos, que incluyen, pero sin limitación, captura de donantes por unión de extremos no homólogos (NHEj ) y recombinación homóloga. Para los fines de esta divulgación, "recombinación homóloga (HR)" se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de doble cadena en las células a través de mecanismos de reparación dirigidos por homología. Este proceso requiere una homología de secuencia de nucleótidos, utiliza una molécula "donante" para reparar el molde de una molécula "diana" (es decir, el que experimentó la rotura de la doble hebra), y se conoce como "conversión génica sin entrecruzamiento" o "conversión génica de tramo corto", porque conduce a la transferencia de información genética del donante a la diana. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, dicha transferencia puede implicar la corrección de errores del ADN heterodúplex que se forma entre la diana rota y el donante, y/o "hibridación de cadena dependiente de síntesis", en la que el donante se utiliza para resintetizar información genética que se convertirá en parte de la diana y/o procesos relacionados. Tal HR especializada a menudo da como resultado una alteración de la secuencia de la molécula diana de manera que parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpora al polinucleótido diana. En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, se pueden usar parejas adicionales de proteínas con dedos de zinc o TALEN para la escisión adicional de doble cadena de sitios diana adicionales dentro de la célula.

La secuencia de ácido nucleico exógeno puede comprender, por ejemplo, uno o más genes o moléculas de ADNc, o cualquier tipo de secuencia codificante o no codificante, así como uno o más elementos de control (p. ej., promotores). Además, la secuencia de ácido nucleico exógeno puede producir una o más moléculas de ARN (por ejemplo, ARN de horquilla pequeña), ARN inhibidores (ARNis), microARN (miARN), etc.).

"Escisión" se refiere a la rotura de la cadena principal de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante varios métodos que incluyen, pero sin limitación, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Es posible la escisión de cadena sencilla y la escisión de cadena doble y la escisión de cadena doble puede producirse como resultado de dos eventos de escisión de cadena sencilla. La escisión del ADN puede dar como resultado la producción de extremos romos o extremos escalonados. En determinadas realizaciones, los polipéptidos de fusión se usan para la escisión dirigida del ADN de doble cadena.

Un "semidominio de escisión" es una secuencia de polipéptidos que, junto con un segundo polipéptido (ya sea idéntico o diferente) forma un complejo que tiene actividad de escisión (preferentemente actividad de escisión de doble cadena). Las expresiones los términos "primer y segundo semidominios de escisión"; "semidominios de escisión y -" y "semidominios de escisión derecho e izquierdo" se usan indistintamente para referirse a parejas de semidominios de escisión que se dimerizan.

Un "semidominio de escisión modificado por ingeniería genética" es un semidominio de escisión que se ha modificado para formar heterodímeros obligados con otro semidominio de escisión (por ejemplo, otro semidominio modificado por ingeniería genética). Véase, también, las patentes de Estados Unidos números 7.914.796; 8.034.598; 8.623.618 y la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2011/0201055.

El término "secuencia" se refiere a una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN; puede ser lineal, circular o ramificado y puede ser de cadena sencilla o de doble cadena.

"Cromatina" es la estructura de nucleoproteína que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende ácido nucleico, principalmente ADN y proteínas, incluidas las histonas y las proteínas cromosómicas no histonas. La mayoría de la cromatina celular eucariota existe en forma de nucleosomas, en donde un núcleo de nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociados a un octámero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y el ADN conector (de longitud variable dependiendo del organismo) se extiende entre núcleos de nucleosomas. Una molécula de histona HI generalmente se asocia con el ADN conector. Para los fines de la presente divulgación, el término "cromatina" pretende abarcar todos los tipos de nucleoproteína celular, tanto procariota como eucariota. La cromatina celular incluye cromatina cromosómica y episomal.

Un "cromosoma", es un complejo de cromatina que comprende toda o parte del genoma de una célula. El genoma de una célula a menudo se caracteriza por su cariotipo, que es la colección de todos los cromosomas que comprenden el genoma de la célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas.

Un "episoma" es un ácido nucleico replicante, un complejo de nucleoproteína u otra estructura que comprende un ácido nucleico que no forma parte del cariotipo cromosómico de una célula. Los ejemplos de episomas incluyen plásmidos y ciertos genomas virales.

Un "sitio diana" o "secuencia diana" es una secuencia de ácido nucleico que define una porción de un ácido nucleico a la que se unirá una molécula de unión, siempre que existan condiciones suficientes para la unión. Un sitio diana "previsto" es aquel en el que la molécula de unión al ADN está diseñado y/o se selecciona para la unión (véase, por ejemplo, Tabla 2).

Un sitio diana o secuencia diana de "baja afinidad" o "autorregulador" es una secuencia de ácido nucleico que se une a una molécula de unión (por ejemplo, modulador génico) cuando hay un exceso de la molécula de unión presente y/o que se une a una molécula de unión con menor afinidad de unión que el sitio diana previsto. Un sitio diana de baja afinidad (autorregulador) puede diferir del sitio diana previsto en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más pares de bases y/o puede comprender el sitio diana previsto, por ejemplo, los sitios diana que incluyen pares de bases adicionales o menos en comparación con el sitio diana previsto (por ejemplo, puede incluir repeticiones adicionales tales como CAG o CCG). En determinadas realizaciones, por ejemplo, cuando el sitio diana de baja afinidad comprende la misma secuencia que el sitio diana previsto, el sitio diana de baja afinidad se une solo cuando hay un exceso de la molécula de unión presente (es decir, cuando los sitios diana previstos (por ejemplo, sitios diana endógenos) están todos unidos por la molécula de unión). La expresión también incluye partes de un sitio diana, por ejemplo, repeticiones de un motivo presente en un sitio diana.

Una molécula "exógena" es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero puede introducirse en una célula mediante uno o más métodos genéticos, bioquímicos u otros. La "presencia normal en la célula" se determina con respecto al estadio de desarrollo particular y condiciones ambientales de la célula. Por lo tanto, por ejemplo, una molécula que está presente solo durante el desarrollo embrionario del músculo es una molécula exógena con respecto a una célula muscular adulta. De manera similar, una molécula inducida por choque térmico es una molécula exógena con respecto a una célula no sometida a choque térmico. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión funcional de una molécula endógena que funciona mal o una versión que funciona mal de una molécula endógena que funciona normalmente.

Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una molécula pequeña, como la que se genera mediante un proceso de química combinatoria, o una macromolécula tal como una proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípidos, glucoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser de cadena sencilla o doble; pueden ser lineales, ramificados o circulares; y pueden ser de cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen aquellos capaces de formar dúplex, así como los ácidos nucleicos formadores de tríplex. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 5.176.996 y 5.422.251. Las proteínas incluyen, pero sin limitación, proteínas de unión al ADN, factores de transcripción, factores de remodelación de la cromatina, proteínas de unión al ADN metiladas, polimerasas, metilasas, desmetilasas, acetilasas, desacetilasas, cinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.

Una molécula exógena puede ser del mismo tipo de molécula que una molécula endógena, por ejemplo, una proteína o ácido nucleico exógenos. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma viral infectante, un plásmido o episoma introducido en una célula, o un cromosoma que está normalmente presente en la célula. Los expertos en la materia conocen los métodos para la introducción de moléculas exógenas en las células e incluyen, pero sin limitación, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas, coprecipitación con fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vectores virales. Una molécula exógena también puede ser del mismo tipo de molécula que una molécula endógena pero derivada de una especie diferente de la que se deriva la célula. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico humano puede introducirse en una línea celular derivada originalmente de un ratón o hámster.

Por el contrario, una molécula "endógena" es aquella que normalmente está presente en una célula particular en un estadio de desarrollo particular en condiciones ambientales particulares. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, u otro orgánulo, o un ácido nucleico episomal natural. Las moléculas endógenas adicionales pueden incluir proteínas, por ejemplo, factores de transcripción y enzimas.

Una molécula de "fusión" es una molécula en donde dos o más moléculas de subunidad están unidas, preferentemente de forma covalente. Las moléculas de subunidad pueden ser del mismo tipo químico de molécula, o pueden ser diferentes tipos químicos de moléculas. Los ejemplos del segundo tipo de molécula de fusión incluyen, pero sin limitación, una fusión entre un ácido nucleico formador de tríplex y un polipéptido, y una fusión entre un ligando de unión al surco menor y un ácido nucleico.

La expresión de una proteína de fusión en una célula puede ser el resultado la administración de la proteína de fusión a la célula o de la administración de un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, en donde el polinucleótido se transcribe y el transcrito se traduce, para generar la proteína de fusión. El corte y empalme en trans, la escisión de polipéptidos y la ligadura de polipéptidos también pueden estar implicados en la expresión de una proteína en una célula. Los métodos para la administración de polinucleótidos y polipéptidos a las células se presentan en otra parte de esta divulgación.

Un "dominio de multimerización", (también denominado como "un dominio de dimerización" o "dominio de interacción con proteína") es un dominio incorporado en las regiones amino, carboxi o amino y carboxi terminal de un ZPF TF o TALE TF. Estos dominios permiten la multimerización de múltiples unidades ZFP TF o TALE TF, de modo que grandes extensiones de dominios de repetición de trinucleótidos se unen preferentemente a ZFP TF o TALE TF multimerizados respecto a tramos más cortos con números de longitudes de tipo silvestre. Los ejemplos de dominios de multimerización incluyen cremalleras de leucina. Los dominios de multimerización también pueden regularse mediante moléculas pequeñas en las que el dominio de multimerización asume una conformación adecuada para permitir la interacción con otro dominio de multimerización solo en presencia de una molécula pequeña o ligando externo. De esta manera, pueden usarse ligandos exógenos para regular la actividad de estos dominios.

Un "gen", para los fines de la presente divulgación, incluye una región de ADN que codifica un producto génico (véase infra), así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, independientemente de que tales secuencias reguladoras sean o no adyacentes a las secuencias de codificación y/o transcritas. En consecuencia, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de la traducción, como los sitios de unión al ribosoma y los sitios internos de entrada al ribosoma, potenciadores, silenciadores, aisladores, aisladores de la cromatina, orígenes de replicación, sitios de unión de matriz y regiones de control de locus.

"Expresión génica" se refiere a la conversión de la información, contenida en un gen, en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (p.ej., ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por la traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen ARN que se modifican, mediante procesos como la adición de una caperuza, poliadenilación, metilación y edición, y proteínas modificadas mediante, por ejemplo, metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, miristilación y glicosilación.

La "modulación" de la expresión génica se refiere a un cambio en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero sin limitación, activación génica y represión génica. Se puede usar la edición del genoma (p.ej., escisión, alteración, inactivación, mutación aleatoria) para modular la expresión. La inactivación génica se refiere a cualquier reducción en la expresión génica en comparación con una célula que no incluye una ZFP, TALE o sistema CRISPR/Cas como se describe en el presente documento. Por lo tanto, la inactivación génica puede ser parcial o completa.

Una "región de interés" es cualquier región de cromatina celular, tal como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificante dentro de o adyacente a un gen, en la cual es deseable unir una molécula exógena. La unión puede ser para fines de escisión dirigida del ADN y/o recombinación dirigida. Una región de interés puede estar presente en un cromosoma, un episoma, un genoma de orgánulos (p.ej., mitocondrial, de cloroplastos), o un genoma viral infectante, por ejemplo. Una región de interés puede estar presente en la región codificante de un gen, dentro de regiones no codificantes transcritas tales como, por ejemplo, secuencias líderes, secuencia de remolque o intrones, o dentro de regiones no transcritas, en dirección 5' o 3' de la región codificante. Una región de interés puede ser tan pequeña como un solo par de nucleótidos o tener hasta 2.000 pares de nucleótidos de longitud, o cualquier valor integral de pares de nucleótidos.

Las células "eucariotas" incluyen, pero sin limitación, células fúngicas, (tales como células de levadura), células vegetales, células animales, células de mamífero y células humanas (p. ej., linfocitos T).

Las expresiones "enlace operativo" y "unido operativamente" (o "unido de forma operativa") se usan indistintamente con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (tales como elementos de secuencia), en donde los componentes están dispuestos de manera que ambos componentes funcionen normalmente y permite la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar una función que se ejerce sobre al menos uno de los otros componentes. A modo de ilustración, una secuencia reguladora de la transcripción, tal como un promotor, está operativamente unida a una secuencia codificante si la secuencia reguladora de la transcripción controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores de la transcripción. Una secuencia reguladora de la transcripción generalmente está operativamente unida en cis a una secuencia codificante, pero no necesita estar directamente adyacente a ella. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia reguladora de la transcripción que está operativamente unida a una secuencia codificante, aunque no sean contiguas.

Con respecto a los polipéptidos de fusión, la expresión "unido operativamente" puede referirse al hecho de que cada uno de los componentes realiza la misma función estando unido con el otro componente como lo haría si no estuviera tan unido. Por ejemplo, con respecto a un polipéptido de fusión en el cual un dominio de unión al ADN se fusiona con un dominio de represión, el dominio de unión al ADN y el dominio de represión están en unión operativa si, en el péptido de fusión, la porción del dominio de unión al a Dn se puede unir al sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de represión puede regular negativamente la expresión génica.

Un "fragmento funcional" de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la de la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, aunque todavía mantiene la misma función que la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede poseer más, menos, o el mismo número de restos que la molécula nativa correspondiente, y/o puede mantener uno o más aminoácidos o sustituciones de nucleótidos. Los métodos para determinar la función de un ácido nucleico (p. ej., función de la codificación, capacidad para hibridar con otro ácido nucleico) son bien conocidos en la técnica. De manera similar, los métodos para determinar la función de las proteínas son bien conocidos. Por ejemplo, la función de unión al ADN de un polipéptido se puede determinar, por ejemplo, por unión al filtro, cambio de movilidad electroforética o ensayos de inmunoprecipitación. La escisión del ADN se puede analizar mediante electroforesis en gel. Véase Ausubel et al., supra. La capacidad de una proteína para interactuar con otra proteína puede determinarse, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación conjunta, ensayos de dos híbridos o complementación, tanto genéticos como bioquímicos. Véase, por ejemplo, Fields et al. (1989) Nature 340: 245-246; la patente de Estados Unidos N.° 5.585.245 y el documento PCT WO 98/44350.

Un "vector" o "construcción" es capaz de transferir secuencias génicas a células diana. Normalmente, "construcción de vectores", "vector de expresión", y "vector de transferencia génica", significan cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias de genes a células diana. Por lo tanto, la expresión incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores de integración.

Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y hacen referencia a mamíferos, tales como pacientes humanos y primates no humanos, así como a animales experimentales, tales como conejos, perros, gatos, ratas, ratones y otros animales. En consecuencia, el término "sujeto" o "paciente", como se usa en el presente documento, significa cualquier paciente o sujeto (por ejemplo, mamífero) al que se pueden administrar los compuestos de la invención.

Dominios de unión al ADN

Las construcciones como se describen en el presente documento y las células que comprenden estas construcciones incluyen secuencias que codifican uno o más dominios de unión al ADN que se unen específicamente a una secuencia diana en cualquier gen endógeno. El dominio de unión al ADN usado en las composiciones y métodos divulgados en el presente documento comprenden un dominio de unión al ADN de dedo de cinc, un dominio de unión al ADN de TALE o un dominio de unión al ADN de un sistema CRISPR/Cas.

En determinadas realizaciones, el dominio de unión al ADN comprende una proteína de dedo de zinc. Preferentemente, la proteína de dedo de zinc es una proteína de origen no natural en el sentido de que está modificada para unirse a un sitio diana de elección. Véase, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; las Patentes de Estados Unidos números 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; y las publicaciones de patente de Estados Unidos números 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

Un dominio de unión de dedo de zinc modificado puede tener una especificidad de unión nueva, en comparación con una proteína de dedo de zinc de origen natural. Los métodos de modificación incluyen, pero sin limitación, un diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, la utilización de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de triplete (o cuadruplete) y secuencias de aminoácidos de dedo de zinc individuales, en las cuales cada secuencia de nucleótidos de triplete o cuadruplete se asocia con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc que se unen a la secuencia triplete o cuadruplete particular. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 6.453.242 y 6.534.261.

Los ejemplos de métodos de selección, incluyendo la presentación en fagos y los sistemas de dos híbridos, se divulgan en las patentes de Estados Unidos 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como en el documento WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237. Además, la mayor especificidad de unión para dominios de unión de dedos de zinc se ha descrito, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 6.794.136.

Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de dedos de zinc y/o las proteínas de dedos de zinc de múltiples dedos pueden unirse entre sí usando cualquier secuencia de conector adecuada, incluyendo, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véase, también, las patentes de Estados Unidos números 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para ejemplos de secuencias de conector de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína. Además, la mayor especificidad de unión para dominios de unión de dedos de zinc se ha descrito, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 6.794.136.

La selección de sitios diana y métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que codifican las mismas) son conocidos por el experto en la materia y se describen en detalle en las patentes de Estados Unidos números 8.586.526; 6.140.081; 5.789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.

Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de dedos de zinc y/o las proteínas de dedos de zinc de múltiples dedos pueden unirse entre sí usando cualquier secuencia de conector adecuada, incluyendo, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véase, también, las patentes de Estados Unidos números 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para ejemplos de secuencias de conector de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende dos dominios de unión al ADN de la ZFP unidos entre sí. Por tanto, estas proteínas de dedo de zinc pueden comprender 8, 9, 10, 11, 12 o más dedos. En algunas realizaciones, los dos dominios de unión al ADN se unen mediante un enlazador flexible extensible de modo que un dominio de unión al ADN comprende 4, 5 o 6 dedos de zinc y el segundo dominio de unión al ADN comprende 4, 5 o 5 dedos de zinc adicionales. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador entre dedos estándar de modo que la matriz de dedos comprende un dominio de unión al ADN que comprende 8, 9, 10, 11 o 12 o más dedos. En otras realizaciones, el enlazador es un enlazador atípico tal como un enlazador flexible. Los dominios de unión al ADN se fusionan con al menos un dominio regulador y se pueden considerar como una arquitectura "ZFP-ZFP-TF". Los ejemplos específicos de estas realizaciones pueden denominarse "ZFP-ZFP-KOX" que comprende dos dominios de unión al ADN unidos con un enlazador flexible y fusionados a un represor KOX y "ZFP-KOX-ZFP-KOX" donde dos proteínas de fusión ZFP-KOX se fusionan mediante un enlazador.

Las proteínas con dedos de zinc "a dos manos" son aquellas proteínas en las que dos grupos de dominios de unión al ADN de dedo de zinc están separados por aminoácidos intermedios, de modo que los dos dominios de dedo de zinc se unen a dos sitios diana discontinuos. Un ejemplo de una proteína de unión de dedo de zinc de tipo dos manos es SIP1, donde un grupo de cuatro dedos de zinc está localizado en el extremo amino de la proteína y un grupo de tres dedos está localizado en el extremo carboxilo (véase Remacle et al. (1999) EMBO Journal 18 (18): 5073-5084). Cada grupo de dedos de zinc en estas proteínas puede unirse a una secuencia diana única y el espaciamiento entre las dos secuencias diana puede comprender muchos nucleótidos. Las ZFP de dos manos pueden incluir un dominio funcional, por ejemplo fusionado a una o ambas ZFP. Por lo tanto, resultará evidente que el dominio funcional puede estar unido al exterior de una o ambas ZFP o puede colocarse entre las ZFP (unido a ambas ZFP). Véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos N.° 20130253940.

En determinadas realizaciones, el dominio de unión al ADN comprende un dominio de unión al ADN del efector TAL (TALE) natural o modificado por ingeniería genética (no natural). Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 8.586.526. Las bacterias patógenas de plantas del género Xanthomonas son conocidas por provocar muchas enfermedades en plantas de cultivo importantes. La patogenicidad de Xanthomonas depende de un sistema conservado de secreción de tipo III (T3S) que inyecta más de 25 proteínas efectoras diferentes en la célula vegetal. Entre estas proteínas inyectadas se encuentran los efectores similares a los activadores de la transcripción (TALE) que imitan a los activadores transcripcionales vegetales y que manipulan el transcriptoma de la planta (véase Kay et al. (2007) Science 318:648-651). Estas proteínas contienen un dominio de unión al ADN y un dominio de activación de la transcripción. Uno de los TALE mejor caracterizados es AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (véase Bonaset et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 y el documento WO2010079430). Los TALE contienen un dominio centralizado de repeticiones en tándem, conteniendo cada repetición aproximadamente 34 aminoácidos, los cuales son clave para la especificidad de unión al ADN de estas proteínas. Además, contienen una secuencia de localización nuclear y un dominio de activación de la transcripción ácido (para una revisión véase Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Además, en la bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum se han descubierto dos genes, designados brg11 y hpx17 que son homólogos con la familia AvrBs3 de Xanthomonas en la cepa GMI1000 de R. solanacearum biovar 1 y en la cepa RS1000 biovar 4 (Véase Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384). Estos genes son 98,9 % idénticos en la secuencia de nucleótidos entre sí, pero difieren en una deleción de 1.575 pb en el dominio de repetición de hpx17. Sin embargo, ambos productos génicos tienen menos del 40 % de identidad de secuencia con las proteínas de la familia AvrBs3 de Xanthomonas.

La especificidad de estos TALE depende de las secuencias encontradas en las repeticiones en tándem. La secuencia repetida comprende aproximadamente 102 pares de bases y las repeticiones son normalmente 91-100% homólogas entre sí (Bonas et al, ibid). El polimorfismo de las repeticiones generalmente se encuentra en las posiciones 12 y 13 y parece haber una correspondencia biunívoca entre la identidad de dos restos hipervariables en las posiciones 12 y 13 con la identidad de los nucleótidos contiguos en la secuencia diana del TALE (véase Moscou y Bogdanove, (2009) Science 326:1501 y Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512). Experimentalmente, el código para el reconocimiento del ADN de estos TALE se ha determinado de modo que una secuencia de HD en las posiciones 12 y 13 conduce a una unión a citosina (C), NG se une a T, NI a A, C, G o T, NN se une a A o G, e IG se une a T. Estas repeticiones de unión al ADN se han ensamblado en proteínas con nuevas combinaciones y números de repeticiones, para crear factores de transcripción artificiales que pueden interactuar con nuevas secuencias y activar la expresión de un gen indicador no endógeno en células vegetales (Boch et al, ibid). Las proteínas TAL modificadas por ingeniería genética se han asociado a un semidominio de escisión FokI para dar una fusión de nucleasa y dominio efector TAL (TALEN) que muestra actividad en un ensayo de indicador de levadura (diana basada en plásmido). Christian et al. ((2010)< Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717). Además, también se han descrito los TALEN con truncamientos en C y/o N terminal (secuencias de caperuza C y/o caperuza N) y regiones con dos residuos variables de repetición (RVD) atípicos. Véase, la patente de Estados Unidos N.° 8.586.526.

Se han publicado métodos y composiciones para modificar por ingeniería genética estas proteínas TALEN para una interacción sólida, específica del sitio con la secuencia diana elegida por el usuario (véase patente de Estados Unidos N.° 8.586.526).

Moléculas de fusión

También se divulgan moléculas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión) que comprenden dominios de unión al ADN (por ejemplo, ZFP, TALE, guía única) como se describe en el presente documento y un dominio de represión.

Los dominios de represión de ejemplo incluyen, pero sin limitación, KRAB A/B, KOX, gen temprano inducible por TGF-beta (TIEG), v-erbA, SID, MBD2, MBD3, miembros de la familia DNMT (por ejemplo, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb y MeCP2. Véase, por ejemplo, Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; y Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342. Los dominios de represión de ejemplo adicionales incluyen, pero sin limitación, ROM2 y AtHD2A. Véase, por ejemplo, Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; y Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27.

Las moléculas de fusión se construyen mediante métodos de clonación y conjugación bioquímica que son bien conocidos por los expertos en la materia. Las moléculas de fusión comprenden un dominio de unión al ADN y un dominio de represión. Las moléculas de fusión también comprenden opcionalmente señales de localización nuclear (tal como, por ejemplo, la del antígeno T SV40 medio) y etiquetas de epítopo (tales como, por ejemplo, FLAG y hemaglutinina). Las proteínas de fusión (y los ácidos nucleicos que las codifican) están modificadas por ingeniería genética de modo que el marco de lectura de la traducción se conserva entre los componentes de la fusión.

Las fusiones entre un componente polipeptídico de un dominio funcional (o un fragmento funcional del mismo) por un lado, y un dominio de unión al ADN no proteico (por ejemplo, un ARN guía único, antibiótico, intercalador, ligando de unión al surco menor, ácido nucleico) por otro lado, se construyen mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo, pero sin limitación, conjugación bioquímica, expresión conjunta en una célula y similares.

En determinadas realizaciones, el sitio diana unido por el dominio de unión al ADN (por ejemplo, sitio diana previsto y/o sitio de baja afinidad) está presente en y/o cerca del elemento de control, por ejemplo en, adyacente o cerca de, un elemento de control endógeno o del elemento de control (por ejemplo, promotor) que dirige la expresión del modulador génico exógeno en la célula hospedadora. En determinadas realizaciones, el sitio diana es una región accesible de cromatina celular. Las regiones accesibles se pueden determinar como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 6.511.808. Si el sitio diana no está presente en una región accesible de cromatina celular, se pueden generar una o más regiones accesibles como se describe en la patente de los Estados Unidos N.° 7.001.768.

Las moléculas de fusión como se describen en el presente documento se pueden formular con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como conocen los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1985; y el documento de propiedad conjunta WO 00/42219.

El componente/dominio funcional de una molécula de fusión se puede seleccionar entre varios componentes diferentes capaces de influir en la transcripción de un gen una vez que la molécula de fusión se une a una secuencia diana a través de su dominio de unión al ADN.

También se pueden seleccionar dominios funcionales que están regulados por moléculas pequeñas exógenas o ligandos. Por ejemplo, se puede emplear la tecnología RheoSwitch® en la que un dominio funcional solo asume su conformación activa en presencia del ligando RheoChem™ externo (véase por ejemplo el documento US 20090136465). Por lo tanto, el dominio de unión al ADN (por ejemplo, ZFP o TALE o guía única) pueden estar operativamente unidos al dominio funcional regulable en donde la actividad resultante del modulador génico (por ejemplo, ZPF-TF o TALE-Tf o CRISPR/Cas-TF) está controlado por el ligando externo.

El sistema de nucleasa CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR Associated) es un sistema de nucleasa modificado por ingeniería genética reciente basado en un sistema bacteriano que se puede usar para la modificación por ingeniería genética del genoma. Está basado en parte de la respuesta inmunitaria adaptativa de muchas bacterias y arqueas. Cuando un virus o plásmido invade a una bacteria, los segmentos del ADN del invasor se convierten en ARN CRISPR (ARNcr) por la respuesta inmunitaria. Este ARNcr se asocia a continuación, a través de una región de complementariedad parcial, con otro tipo de ARN denominado ARNtracr para guiar la nucleasa Cas9 a una región homóloga al ARNcr en el ADN diana denominado un "protoespaciador". Cas9 escinde el ADN para generar extremos romos en el DSB en sitios especificados por una secuencia guía de 20 nucleótidos contenida en el transcrito de ARNcr. Cas9 requiere tanto el ARNcr como el ARNtracr para el reconocimiento y la escisión del ADN específico del sitio. Este sistema ahora se ha modificado por ingeniería genética de manera que el ARNcr y el ARNtracr se pueden combinar en una molécula (el "ARN guía único"), y la porción equivalente del ARNcr del ARN guía único se puede modificar por ingeniería genética para guiar a la nucleasa Cas9 para que se dirija a cualquier secuencia deseada (véase Jinek et al. (2012) Science 337, pág. 816-821, Jinek et al. (2013), eLife 2:e00471, y David Segal, (2013) eLife 2:e00563).

Sitios diana

Las construcciones descritas en el presente documento incluyen uno o más sitios diana de baja afinidad por el dominio de unión al ADN. Como se ha indicado anteriormente, un sitio diana de baja afinidad es aquel que normalmente se une al dominio de unión al ADN del modulador génico cuando hay un exceso del modulador génico presente y/o cuando el dominio de unión al ADN se une con menor afinidad que al sitio diana previsto (contra el cual se diseña y prueba el dominio de unión al ADN). La afinidad de unión se puede determinar por cualquier medio adecuado, o incluyendo, pero sin limitación, análisis de Kd o análisis funcional en genes indicadores o endógenos (por ejemplo, midiendo los niveles de expresión o escisión génica). La afinidad de unión se puede expresar cuantitativamente (por ejemplo, Kd, expresión génica o niveles de escisión) o cualitativamente (por ejemplo, respecto a otros dominios de unión, incluyendo los que se unen a la misma secuencia diana o una diferente dentro del mismo gen).

Como se ha indicado anteriormente, los sitios diana para los factores de transcripción de las construcciones divulgadas en el presente documento normalmente incluyen una pluralidad de sitios de unión (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o más). Por ejemplo, las ZFP que incluyen tres dedos normalmente reconocen un sitio diana que incluye 9 o 10 nucleótidos; las z Fp que incluyen cuatro dedos normalmente reconocen un sitio diana que incluye de 12 a 14 nucleótidos; mientras que las ZFP que tienen seis dedos pueden reconocer sitios diana que incluyen de 18 a 21 nucleótidos, donde cada dedo de zinc de la proteína multi-dedo se une a un subsitio diana de 3 pares de bases con nucleótidos no unidos opcionales dentro del sitio diana general. De manera similar, los sitios diana unidos por proteínas de unión al ADN de TALE incluyen cualquier número de nucleótidos en los que se unen 1-2 nucleótidos mediante dos residuos variables de repetición (RVD) de una sola repetición de TALE (o media repetición). Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 8.586.526.

las moléculas de unión al ADN están modificadas por ingeniería genética y/o se seleccionan para unirse a un sitio diana previsto. Véase, por ejemplo, Tabla 2. No obstante, cuando se expresan a niveles suficientemente altos, estas moléculas de unión al ADN pueden unirse a sitios diana de baja afinidad menos preferidos. Las construcciones autorreguladoras como se describen en el presente documento utilizan este fenómeno al proporcionar sitios diana de baja afinidad que dirigen la expresión del modulador génico (represor) de modo que, cuando se expresan a niveles suficientemente altos, el modulador génico se une al sitio de baja afinidad. presente en el promotor. La unión del modulador génico (represor) al sitio diana de baja afinidad reprime a su vez la expresión del modulador génico, proporcionando así una construcción autorreguladora.

La secuencia del sitio diana de baja afinidad normalmente no es idéntica a la secuencia del sitio diana previsto. Se pueden alterar uno o más nucleótidos incluyendo todos los nucleótidos. En determinadas realizaciones, el sitio diana de baja afinidad incluye al menos la mitad de los mismos pares de bases (contiguos o no contiguos) que el sitio diana previsto. En otras realizaciones, el sitio diana de baja afinidad incluye al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de los mismos pares de bases que el sitio diana previsto. Por ejemplo, en un sitio diana de 18 pares de bases, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 pares de bases pueden ser diferentes entre el sitio diana de baja afinidad y el sitio diana previsto. De manera similar, para un sitio diana previsto de 21 pares de bases, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 1718, 19, o 20 pares de bases pueden ser diferentes entre el sitio diana de baja afinidad y el sitio diana previsto. En determinadas realizaciones, el sitio diana de baja afinidad puede incluir secuencias contiguas (por ejemplo, porciones) (repetidas o no) de subsitios diana encontrados en el sitio diana previsto, por ejemplo repeticiones CAG o CCG como se encuentran en moduladores génicos implicados en trastornos por repetición de trinucleótidos. En determinadas realizaciones, el sitio diana de baja afinidad y los sitios diana previstos son los mismos pero los subsitios diana unidos por el dominio de unión al ADN no son contiguos.

Se puede incluir en la construcción cualquier número de sitios diana de baja afinidad (o porciones de los mismos). En determinadas realizaciones, el sitio diana de baja afinidad incluye una o más repeticiones de un motivo encontrado en la secuencia diana deseada, por ejemplo, repeticiones CAG o CCG encontradas en moduladores que se unen a alelos mutantes y/o de tipo silvestre encontrados en sujetos con trastornos por repetición de trinucleótidos. Por lo tanto, el experto en la materia puede determinar fácilmente el número de sitios diana de baja afinidad incluidos en la construcción dependiendo de la cantidad o grado de autorregulación deseada. Por ejemplo, para la regulación de un modulador con fuerte afinidad de unión por el sitio diana previsto, se pueden incluir menos sitios diana de baja afinidad que para los moduladores con menor afinidad de unión por su sitio diana previsto. Véase, los ejemplos a continuación.

Adm inistración

Las proteínas (por ejemplo, ZFP, TALE, CRISPR/Cas), los polinucleótidos que las codifican y las composiciones que comprenden las proteínas y/o polinucleótidos descritos en el presente documento pueden administrarse a una célula diana por cualquier medio adecuado, incluyendo, por ejemplo, mediante inyección de proteínas ZFP-TF, TALE-TF o mediante el uso de ARNm que codifica ZFN o TALEN o mediante la co-introducción de polinucleótidos (por ejemplo, ARN de guía única) y dominios funcionales asociados.

Las células adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células y/o líneas celulares eucariotas y procariotas. Los ejemplos no limitantes de dichas células o líneas celulares generadas a partir de dichas células incluyen células COS, CHO (por ejemplo, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (por ejemplo, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) y perC6, así como células de insectos tales como Spodoptera fugiperda (Sf), o células fúngicas tales como Saccharomyces, Pichia y Schizosaccharomyces. En determinadas realizaciones, la línea celular es una la línea celular CHO-K1, MDCK o HEK293. Las células adecuadas también incluyen células madre, tales como, a modo de ejemplo, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre hematopoyéticas, células madre neuronales y células madre mesenquimales.

Los métodos para administrar proteínas que comprenden proteínas de dedo de zinc como se describen en el presente documento se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 8.586.526, 6.453.242; 6.503.717; 6.534.261; 6.599.692; 6.607.882; 6.689.558; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824.

Las construcciones como se describen en el presente documento también pueden administrarse usando vectores que contienen secuencias que codifican una o más de las composiciones descritas en el presente documento. Se puede usar cualquier sistema de vectores incluyendo, pero sin limitación, vectores plasmídicos, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores de adenovirus, vectores de poxvirus; vectores de herpesvirus y vectores de virus adenoasociados, etc. Véase, también, las patentes de Estados Unidos números 6.534.261; 6.607.882; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824. Asimismo, será evidente que cualquiera de estos vectores puede comprender una o más secuencias codificantes de proteínas de dedo de cinc o TALE. Por lo tanto, cuando se introducen en la célula uno o más polinucleótidos y/o proteínas ZFP, TALE o CRISPR/Cas, las secuencias que codifican las proteínas ZFP, TALE o CRISPR/Cas pueden transportarse en el mismo vector o en vectores diferentes. Cuando se usan múltiples vectores, cada vector puede comprender una secuencia que codifica una o múltiples ZFP, TALE o sistemas CRISPR/Cas.

Se pueden utilizar métodos convencionales de transferencia de genes virales y no virales para introducir ácidos nucleicos que codifiquen ZFP, TALE, Ttago y/o sistemas CRISPR/Cas en células (por ejemplo, células de mamífero) y tejidos diana. Dichos métodos también se pueden usar para administrar ácidos nucleicos que codifican ZFP, TALE, Ttago y/o sistemas CRISPR/Cas a células in vitro. En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos que codifican las ZFP, TALE, Ttago y/o sistemas CRISPR/Cas se administran para usos de terapia génica in vivo o ex vivo. Los sistemas de administración de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ácido nucleico desnudo y ácido nucleico en forma de complejo con un vehículo de administración tal como un liposoma o un poloxámero. Los sistemas de administración de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episómicos o integrados después de la administración a la célula. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel y Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

Los métodos de administración no viral de ácidos nucleicos incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policationes o ácidos nucleicos, ADN desnudo, ARN desnudo, viriones artificiales, y captación de ADN reforzada con un agente. La sonoporación que usa, por ejemplo, el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) también se puede usar para la administración de ácidos nucleicos. En una realización preferida, uno o más ácidos nucleicos se administran como ARNm. También se prefiere el uso de ARNm protegidos para aumentar la eficacia de traducción y/o la estabilidad del ARNm. Son especialmente preferidas las caperuzas ARCA (análogo de caperuza anti-inverso) o variantes de las mismas. Véanse las patentes de Estados Unidos US7074596 y US8153773.

Sistemas de administración de ácido nucleico de ejemplo adicionales incluyen aquellos proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) y Copernicus Therapeutics Inc, (véase, por ejemplo, el documento US6008336). La lipofección se describe en p. ej., las patentes de Estados Unidos números 5.049.386; 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™, Lipofectin™ y Lipofectamine™ RNAiMAX). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección eficiente de polinucleótidos con reconocimiento de receptor incluyen los de Feigner, los documentos WO 91/17424, WO 91/16024. La administración puede ser a células (administración ex vivo) o a tejidos diana (administración in vivo).

La preparación de los complejos lípido:ácido nucleico, incluidos los liposomas dirigidos tales como los complejos de inmunolípidos, es bien conocida por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res.

52:4817-4820 (1992); patentes de Estados Unidos números 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, y 4.946.787).

Los métodos adicionales de administración incluyen el uso del empaquetamiento de los ácidos nucleicos para ser administrados en los vehículos de administración EnGeneIC (EDV). Estos EDV se administran específicamente a los tejidos diana utilizando anticuerpos biespecíficos donde un brazo del anticuerpo tiene especificidad por el tejido diana y el otro tiene especificidad por el EDV. El anticuerpo lleva los EDV a la superficie de la célula diana y luego el EDV es introducido en la célula por endocitosis. Una vez en la célula, el contenido se libera (véase MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).

El uso de sistemas basados en ARN o ADN viral para la administración de ácidos nucleicos que codifican ZFP, TALE o sistemas CRISPR/Cas modificados por ingeniería genética aprovecha procesos altamente evolucionados para dirigir un virus a células específicas del cuerpo y transportar la carga viral al núcleo. Los vectores virales se pueden administrar directamente a los pacientes (in vivo) o pueden usarse para tratar células in vitro y las células modificadas se administran a pacientes (ex vivo). Los sistemas basados en virus convencionales para la administración de ZFP, TALE o sistemas CRISPR/Cas incluyen, pero sin limitación, vectores retrovirales, de lentivirus, adenovirales, adeno asociados, del virus vaccinia y del herpes simple para la transferencia génica. La integración en el genoma del hospedador es posible con los métodos de transferencia génica de retrovirus, lentivirus, y virus adenoasociados, lo que a menudo tiene como resultado la expresión a largo plazo del transgén insertado. Adicionalmente, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos diferentes de células y tejidos diana.

El tropismo de un retrovirus puede alterarse incorporando proteínas de la envoltura extrañas, expandiendo la población diana potencial de células diana. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que son capaces de transducir o infectar células que no se dividen y normalmente producen altos títulos virales. La selección de un sistema de transferencia génica retroviral depende del tejido diana. Los vectores retrovirales están compuestos por repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento de hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR que actúan en cis mínimas son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de los vectores, que se utilizan a continuación para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar una expresión transgénica permanente. Los vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de leucemia del gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (véase por ejemplo, Buchscher et al., J. Virol.

66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).

En aplicaciones en las que se prefiere la expresión transitoria, se pueden usar sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con tales vectores, se ha obtenido un alto título y altos niveles de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Los vectores de virus adenoasociados ("AAV") también se usan para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (véase, por ejemplo, West et al., Virology 160:38-47 (1987); la patente de Estados Unidos N.° 4.797.368; el documento WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). La construcción de vectores de AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, incluyendo la patente de Estados Unidos. N.° 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al,, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

Actualmente existen al menos seis enfoques de vectores virales para la transferencia génica en ensayos clínicos, que utilizan enfoques que implican la complementación de vectores defectuosos mediante genes insertados en líneas celulares auxiliares para generar el agente transductor.

pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovirales que se han usado en ensayos clínicos (Dunbar et al. 85: 3048-305(1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico usado en un ensayo de terapia génica. (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Se han observado eficiencias de transducción del 50 % o más en vectores empaquetados en MFG-S. (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).

Los vectores adecuados para la introducción de polinucleótidos descritos en el presente documento también incluyen vectores de lentivirus no integrantes (IDLV). Véase, por ejemplo, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol.72:8463-8471; Zufferyet et al. (1998) J. Virol.72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222; publicación de patente de Estados Unidos N.° 20090117617.

Los vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) también pueden usarse para administrar las composiciones descritas en el presente documento. Todos los vectores se derivan de un plásmido que retiene solo las repeticiones terminales invertidas de 145 pb del AAV que flanquean el casete de expresión del transgén. La transferencia eficiente de genes y la administración estable de transgenes debido a la integración en los genomas de la célula transducida son características clave de este sistema de vectores. (Wagner et al. Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). Otros serotipos de AAV, incluyendo AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8AAV 8.2, AAV9 y AAV rh10 y AAV pseudotipados tales como AAV2/8, AAV2/5 y AAV2/6 también se pueden usar de acuerdo con la presente invención.

Los vectores adenovirales (Ad) recombinantes deficientes en replicación pueden producirse a un título alto e infectar fácilmente varios tipos de células diferentes. La mayoría de los vectores de adenovirus están modificados de tal manera que un transgén reemplaza los genes Ad E1a, E1b, y/o E3; posteriormente el vector defectuoso de replicación se propaga en células 293 humanas que suministran la función del gen eliminado en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidos in vivo, incluyendo células que no se dividen, células diferenciadas, tales como las que existen en el hígado, riñón y músculo. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad de carga. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico incluyó la terapia con polinucleótidos para la inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman et al. Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Los ejemplos adicionales del uso de vectores para la transferencia génica en ensayos clínicos incluyen Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:71083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther.

7:1083-1089 (1998).

Las células de empaquetamiento se usan para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula hospedadora. Dichas células incluyen células 293, que empaquetan adenovirus, y células ^2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores virales utilizados en la terapia génica generalmente son generados por una línea celular productora que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores normalmente contienen las secuencias virales mínimas requeridas para el empaquetamiento y la posterior integración en un hospedador (si corresponde), siendo reemplazadas otras secuencias virales por un casete de expresión que codifica la proteína a expresar. Las funciones virales que faltan se suministran en trans por la línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores de AAV utilizados en terapia génica generalmente poseen secuencias de repetición terminal invertida (ITR) del genoma de AAV que se requieren para el empaquetamiento y la integración en el genoma del hospedador. El ADN viral se empaqueta en una línea celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes de AAV, concretamente rep y cap, pero que carece de las secuencias ITR. La línea celular también se infecta con adenovirus como un auxiliar. El virus auxiliar promueve la replicación del vector AAV y la expresión de genes de AAV a partir del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no está empaquetado en cantidades significativas debido a la falta de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus puede reducirse mediante, por ejemplo, tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que el AAV.

En muchas aplicaciones de terapia génica, es deseable que el vector de terapia génica se administre con un alto grado de especificidad a un tipo de tejido particular. En consecuencia, un vector viral puede modificarse para tener especificidad para un tipo de célula dado al expresar un ligando como una proteína de fusión con una proteína de cubierta viral en la superficie externa del virus. El ligando se elige de modo que tenga afinidad por un receptor que se sabe que está presente en el tipo de célula de interés. Por ejemplo, en Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995) se describe que el virus de la leucemia murina de Moloney se puede modificar para expresar heregulina humana fusionada a gp70, y el virus recombinante infecta ciertas células de cáncer de mama humano que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. Este principio puede extenderse a otros pares de virus-célula diana, en los cuales la célula diana expresa un receptor y el virus expresa una proteína de fusión que comprende un ligando para el receptor de la superficie celular. Por ejemplo, se pueden modificar por ingeniería genética fagos filamentosos para mostrar fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, FAB o Fv) que tienen afinidad de unión específica por prácticamente cualquier receptor celular elegido. Aunque la descripción anterior se aplica principalmente a los vectores virales, los mismos principios se pueden aplicar a los vectores no virales. Dichos vectores pueden modificarse para contener secuencias de captación específicas que favorecen la captación por células diana específicas.

Los vectores de terapia génica pueden administrarse in vivo mediante la administración a un paciente individual, normalmente mediante administración sistémica (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratecal, subdérmica, o infusión intracraneal) o administración tópica, como se describe a continuación. Como alternativa, los vectores se pueden administrar a células ex vivo, tal como las células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido) o células madre hematopoyéticas de donantes universales, seguido de reimplantación de las células en un paciente, generalmente después de la selección de células que han incorporado el vector.

La transfección de células ex vivo para diagnóstico, investigación o terapia génica (por ejemplo, mediante reinfusión de las células transfectadas en el organismo hospedador) es bien conocida por los expertos en la materia. En una realización preferida, las células se aíslan del organismo diana, se transfectan con un ácido nucleico de ZFP, TALE o sistema CRISPR/Cas (ADNc o ARNm gen.) y se vuelven a infundir en el organismo diana (por ejemplo, paciente). En una realización preferida, uno o más ácidos nucleicos se administran como ARNm. También se prefiere el uso de ARNm protegidos para aumentar la eficacia de traducción y/o la estabilidad del ARNm. Son especialmente preferidas las caperuzas ARCA (análogo de caperuza anti-inverso) o variantes de las mismas. Véanse las patentes de Estados Unidos 7.074.596 y 8.153.773. Varios tipos de células adecuadas para la transfección ex vivo son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)) y las referencias allí citadas para una discusión sobre cómo aislar y cultivar células de pacientes).

En una realización, se usan células madre en procedimientos ex vivo para la transfección de células y terapia génica. La ventaja de utilizar células madre es que se pueden diferenciar en otros tipos de células in vitro, o pueden introducirse en un mamífero (tal como el donante de las células) donde se injertarán en la médula ósea. Los métodos para la diferenciación de células CD34+ in vitro en tipos celulares inmunitarios clínicamente importantes usando citocinas tales como GM-CSF, IFN-y y TNF-a son conocidos (véase Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)).

Las células madre se aíslan para su transducción y diferenciación utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, las células madre se aíslan de las células de la médula ósea mediante inmunopurificación de las células de la médula ósea con anticuerpos que se unen a células no deseadas, tales como CD4+ y CD8+ (linfocitos T), CD45+ (células panB), GR-1 (granulocitos), y lad (células presentadoras de antígeno diferenciadas) (véase Inaba et al., J. Exp. Med.

176:1693-1702 (1992)).

Las células madre que se han modificado también se pueden usar en algunas realizaciones. Por ejemplo, las células madre neuronales que se han hecho resistentes a la apoptosis pueden usarse como composiciones terapéuticas en las que las células madre también contienen los TF de ZFP de la invención. La resistencia a la apoptosis puede producirse, por ejemplo, inactivando BAX y/o BAK utilizando TALEN o ZFN específicas de BAX o bA k (véase la publicación de patente de Estados Unidos N.° 20100003756) en las células madre, o aquellas que se descomponen en una caspasa, usando de nuevo ZFN específicas de caspasa-6 por ejemplo. Estas células se pueden transfectar con los TF de ZFP o TF de TALE que se sabe que regulan Htt mutante o de tipo silvestre.

Vectores (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contienen ácidos nucleicos de ZFP terapéuticas se pueden administrar directamente a un organismo para la transducción de las células in vivo. Como alternativa, se puede administrar ADN desnudo. La administración se realiza por cualquiera de las vías que normalmente se utilizan para introducir una molécula en contacto final con las células sanguíneas o tisulares incluyendo, pero sin limitación, inyección, infusión, aplicación tópica y electroporación. Los métodos adecuados para administrar tales ácidos nucleicos están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la materia y, aunque se puede usar más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular a menudo puede proporcionar un camino más inmediato y más eficaz que otra vía.

En determinadas realizaciones, las composiciones para usar en un método de tratamiento como se describe en el presente documento (por ejemplo, polinucleótidos y/o proteínas) se administran directamente in vivo. Las composiciones (células, polinucleótidos y/o proteínas) se pueden administrar directamente en el SNC, incluyendo, pero sin limitarse a, inyección directa en el cerebro o la médula espinal. Pueden dirigirse a una o más áreas del cerebro, que incluyen, pero sin limitación, el hipocampo, la sustancia negra, el núcleo basal de Meynert (NBM), el cuerpo estriado y/o la corteza. Como alternativa o además de la administración en el SNC, las composiciones pueden administrarse por vía sistémica (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intracardíaca, intramuscular, intratecal, subdérmica y/o infusión intracraneal). Los métodos y composiciones para la administración de composiciones como se describe en el presente documento directamente a un sujeto (incluyendo directamente en el SNC) incluyen, pero no se limitan a, inyección directa (por ejemplo, inyección estereotáctica) a través de conjuntos de agujas. Estos métodos se describen, por ejemplo, en las Patente de los Estados Unidos n.° 7.837.668; 8092429, que se refieren a un conjunto de agujas para la administración de composiciones en el cerebro y la publicación de patente de Estados Unidos N.° 20060239966.

Los métodos para la introducción de ADN en células madre hematopoyéticas se divulgan, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 5.928.638. Los vectores útiles para la introducción de transgenes en células madre hematopoyéticas, por ejemplo, células CD34+, incluyen adenovirus de tipo 35.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden determinarse en parte por la composición particular que se administre, así como por el método particular usado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas disponibles, como se describe posteriormente (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1989).

La transfección de células ex vivo para diagnóstico, investigación o terapia génica (por ejemplo, mediante reinfusión de las células transfectadas en el organismo hospedador) es bien conocida por los expertos en la materia. En una realización preferida, las células para usar en un método de tratamiento se aíslan del organismo diana, se transfectan con un ácido nucleico de ZFP (gen o ADNc) y se reinfunden de nuevo en el organismo diana (por ejemplo, paciente). Varios tipos de células adecuadas para la transfección ex vivo son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)) y las referencias allí citadas para una discusión sobre cómo aislar y cultivar células de pacientes).

Como se ha indicado anteriormente, los métodos y composiciones divulgados se pueden usar en cualquier tipo de célula incluyendo, pero sin limitación, células procariotas, células fúngicas, células de arquea, células vegetales, células de insecto, células animales, células de vertebrado, células de mamífero y células humanas. Las líneas celulares adecuadas para la expresión de proteínas se conocen bien por los expertos en la materia e incluyen, pero sin limitación, COS, CHO (por ejemplo, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (por ejemplo, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, células de insectos tales como Spodoptera fugiperda (Sf), cualquier célula vegetal (diferenciada o indiferenciada) así como células de insectos tales como Spodopterafugiperda (Sf), o células fúngicas tales como Saccharomyces, Pichia y Schizosaccharomyces. En determinadas realizaciones, la línea celular es una la línea celular CHO-K1, MDCK o HEK293. Adicionalmente, las células primarias pueden aislarse y usarse ex vivo para la reintroducción en el sujeto a tratar después del tratamiento con los moduladores génicos (por ejemplo, ZFN o TALEN) o sistemas moduladores de genes (por ejemplo, Ttago y/o CRISPR/Cas). Las células primarias adecuadas incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y otros subconjuntos de células sanguíneas tales como, pero sin limitación, linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+. Las células adecuadas también incluyen células madre, tales como, a modo de ejemplo, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre hematopoyéticas (CD34+), células madre neuronales y células madre mesenquimales.

En una realización, se usan células madre en procedimientos ex vivo para la transfección de células y terapia génica. La ventaja de utilizar células madre es que se pueden diferenciar en otros tipos de células in vitro, o pueden introducirse en un mamífero (tal como el donante de las células) donde se injertarán en la médula ósea. Los métodos para la diferenciación de células CD34+ in vitro en tipos celulares inmunitarios clínicamente importantes usando citocinas tales como GM-CSF, IFN-y y TNF-a son conocidos (véase, Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)).

Las células madre se aíslan para su transducción y diferenciación utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, las células madre se aíslan de las células de la médula ósea mediante inmunopurificación de las células de la médula ósea con anticuerpos que se unen a células no deseadas, tales como CD4+ y CD8+ (linfocitos T), CD45+ (células panB), GR-1 (granulocitos), y lad (células presentadoras de antígeno diferenciadas) (véase Inaba et al., J. Exp. Med.

176:1693-1702 (1992)).

Las células madre que se han modificado también se pueden usar en algunas realizaciones. Por ejemplo, las células madre que se han hecho resistentes a la apoptosis pueden usarse como composiciones terapéuticas en las que las células madre también contienen las ZFP, TALE, ZFN, TALEN, sistemas CRlSPR/Cas y/o donantes de la invención. La resistencia a la apoptosis puede producirse, por ejemplo, inactivando BAX y/o BAK utilizando nucleasas específicas de BAX o BAK (véase la publicación de patente de Estados Unidos N.° 2010/0003756) en las células madre, o aquellas que se descomponen en una caspasa, usando de nuevo ZFN específicas de caspasa-6 por ejemplo. Como alternativa, la resistencia a la apoptosis puede lograrse también mediante el uso de inhibidores de la caspasa como Z-VAD-FMK (carbobenzoxi-valil-alanil-aspartil-[O-metil]-fluorometilcetona).

Vectores (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contienen ZFP terapéuticas, TALE, ZFN, TALEN, sistema CRlSPR/Cas y/o ácidos nucleicos donantes pueden administrarse también directamente a un organismo para la transducción de las células in vivo. Como alternativa, se puede administrar ADN desnudo o ARNm. La administración se realiza por cualquiera de las vías que normalmente se utilizan para introducir una molécula en contacto final con las células sanguíneas o tisulares incluyendo, pero sin limitación, inyección, infusión, aplicación tópica y electroporación. Los métodos adecuados para administrar tales ácidos nucleicos están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la materia y, aunque se puede usar más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular a menudo puede proporcionar un camino más inmediato y más eficaz que otra vía.

Los siguientes ejemplos se refieren a realizaciones ilustrativas de la presente divulgación en las cuales la composición comprende un represor del factor de transcripción de dedo de zinc (ZFP- TF). Se apreciará que esto es solo para fines ilustrativos y que se pueden usar otras composiciones. Además, con fines ilustrativos exclusivamente, la regulación de los alelos Htt se ilustra cuando los promotores autorreguladores contenían múltiples dianas de las proteínas de unión a CAG, pero se apreciará que los métodos y composiciones de la invención se pueden llevar a cabo usando cualquier sitio(s) diana de baja afinidad en la construcción de expresión, lo que da como resultado la misma autorregulación.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcciones

Se generaron construcciones de vectores víricos adenoasociados (AAV), lentivirales (LV) y lentivirales de integración defectuosa (IDLV) (Hong et al. (2002) Science. 295(5556):868-72 que expresan Zf P de unión a Htt (véase la publicación de patente de Estados Unidos N.° 20130253040) y la variante de GFP Venus (Nagai et al. (2002) Nature Biotech. 20 (1): 87-90) con la secuencia codificante de ZFP operativamente unida a una secuencia promotora Htt (Fig. 1A), un promotor CMV (Fig. 1B), un promotor de CMV modificado en el que las repeticiones CAG (7 a 20) se clonaron en el promotor CMV en dirección 3' de la caja TATA (Figura 1C, también conocida como la "construcción promotora autorreguladora" o "construcción de sitio diana de baja afinidad"), y un promotor Htt modificado con exón 1 no codificante que contiene 17 repeticiones CAG que actúan como sitios diana de baja afinidad para ZFP de unión a CAG (Figura 1D).

Los diseños de ZFP y los sitios diana se muestran a continuación en las Tablas 1 y 2. Las ZFP están unidas al dominio de represión KRAB de KOX1. Las ZFP designadas como 32528 y 31809 se unen al promotor de Htt y reprimen la transcripción de los alelos Htt tanto mutantes como naturales. Las ZFP designadas 33074, 30640 y 30648 se designan por su unión a repeticiones CAG; 30648 puede unir repeticiones CAG en alelos Htt tanto mutantes como silvestres y reprimir la transcripción de ambos; 30640 y 33074 se unen preferentemente a las repeticiones CAG expandidas y reprimen selectivamente la transcripción de Htt mutante. La ZFP designada 5475 es una ZFP de control que se designa por su unión al gen Chk2 y no se une a las repeticiones CAG. En la Tabla 2, los nucleótidos en el sitio diana que están en contacto con las hélices de reconocimiento de ZFP se indican en letras mayúsculas; los nucleótidos sin contacto se indican en minúsculas.

Tabla 1: Diseños de dedo de zinc

______ _____ ______ _____ ______ ______

Tabla 2: Sitios diana

Ejemplo 2: Construcciones dirigidas por promotores Htt y de CMV

Las neuronas de HD se infectaron con las construcciones LV-CMV-ZFP-2A-VENUS o LV-Http-ZFP-2A-VENUS y las células se recolectaron 21 días después de la infección (Figuras 2 y 3). Además, se infectaron células 293T con las construcciones de IDLV con los diferentes promotores (CMV o Htt) (Figura 4) o se transfectaron con plásmidos de expresión (Figura 5). Las células 293T se recolectaron 48 horas después de la transducción o transfección y la expresión de GFP/VENUS se analizó mediante citometría de flujo (Gauva). También se realizó una RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) para medir los niveles de expresión del ARNm de Htt y/o ZFP-2A-VENUS.

Para una ZFP que se dirige al promotor Htt (32528), la construcción dirigida por el promotor Htt dio como resultado una menor expresión de ARNm de ZFP (en comparación con la construcción dirigida por el promotor de CMV, Figura 2) y, en consecuencia, una menor represión de Htt endógeno (Figura 3) en neuronas de HD.

Para una ZFP diferente que también se dirige al promotor Htt (31809), la construcción dirigida por el promotor Htt también dio como resultado una menor represión de Htt endógeno en comparación con la construcción dirigida por el promotor de CMV (Figura 4).

Los niveles de expresión de ZFP-2A-VENUS dirigida por diferentes promotores se midieron mediante la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las células transfectadas (que se muestra en la Figura 5). ZFP 30640 se une a las repeticiones CAG mientras que ZFP 31089 se une a un sitio diana que no es CAG en el promotor Htt. Para las construcciones del promotor de CMV, los niveles de expresión de 30640-2A-VENUS y 31809-2A-VENUS eran similares. Para las construcciones del promotor Htt, se expresó 31809-2A-VENUS a un nivel inferior en comparación con 30640-2A-VENUS, lo que sugiere que ZFP 31809 regula negativamente su expresión a través de su sitio diana en el promotor Htt. Por otra parte, el nivel de expresión de 30640-2A-VENUS se reduce cuando se expresa a partir de un promotor Htt que también incluye 17 repeticiones CAG, lo que sugiere que ZFP 30640 regula su propia expresión a través de las repeticiones CAG.

Ejemplo 3: Construcciones autorreguladoras con un promotor de CMV modificado

También se evaluaron las construcciones que contenían sitios diana de baja afinidad modificados por ingeniería genética en la construcción del promotor de CMV (Figura 1C) donde se incluyó un número variable de repeticiones CAG en dirección 3' del promotor de CMV.

Las células 293T se transfectaron con 1 pg (Figura 6A y 6B) o 3 pg (Figura 6B y 7) de ADN plasmídico. El análisis de los niveles de expresión de ZFP-2A-VENUS se llevó a cabo 2 días después de la transfección utilizando citometría de flujo (Figura 6A) y análisis de PCR cuantitativa (Taqman®) (Figura 6B). En estos experimentos, se transfectaron células 293T con plásmido de ADN que comprendía el vector CMV-33074-k Ox -FLAG-2A-VENUS, donde el promotor de CMV contenía un número (entre 0 y 20) de repeticiones CAG; ZFP 33074 se une a repeticiones CAG.

Los resultados, mostrados en la Figura 6A, demuestran que la expresión de ZFP 33074 se autorregula utilizando el promotor de CMV modificado donde hay aproximadamente 15-20 repeticiones CAG. La Figura 6B muestra que cuando el nivel de expresión de ZFP era alto (por ejemplo, a partir de 3 |jg de transfección), la ZFP era capaz de regular su propia expresión a partir de una construcción que incluía menos repeticiones CAG. La presencia de una repetición CAG en sí misma no redujo la expresión del ZFP 5475 control, que no se une a repeticiones CAG.

Cuando se probó el promotor de CMV modificado (con 7-20 CAG) con las diferentes ZFP de unión a CAG, 33074, 30640 o 30648, los represores más activos (30648) requirieron menos repeticiones CAG para exhibir autorregulación que los represores más débiles (33074 y 30640). Véase, Figura 7.

Las células 293T también se infectaron con vectores AAV, AAV-CMV-CAG(0-20)-ZFP-2A-VENUS. Las células 293T se recolectaron 4 días después de la transducción y se midió la expresión de GFP/VENUS mediante citometría de flujo (Figura 8A) o microscopía (Figura 8C). También se realizó una PCR cuantitativa (qPCR) para determinar los niveles de ARNm de ZFP-2A-VENUS (Figura 8B). En conjunto, estos resultados demostraron que una ZFP dirigida a la repetición CAG puede regular sus propios niveles de expresión a través de sitios diana (repetición CAG) diseñados por ingeniería genética en el promotor del vector de expresión; la región de repetición CAG más larga en el promotor se correlaciona con menor expresión de la ZFP.

Las construcciones promotoras autorreguladoras que comprenden ZFP 33074, que es un represor específico de alelo del Htt mutante, también se probaron en neuronas derivadas de células madre embrionarias de HD que llevan un alelo Htt de tipo silvestre ("CAG17") y un alelo Htt mutante ("CAG48 "). Con la infección por AAV en MOI superiores a 10.000 (véase la Figura 9A), la ZFP 33074 expresada a partir del promotor que carecía de repeticiones CAG ("0") pudo reprimir parcialmente (hasta ~ 50%) el alelo Htt de tipo silvestre (CAG17); el alelo Htt mutante (CAG48) fue reprimido en ~ 90% o más en todas las dosis. En construcciones de promotor con 18 o 20 repeticiones CAG, no se observó represión del alelo CAG17 de tipo silvestre a ninguna dosis. Adicionalmente, en las muestras que comprenden las construcciones de expresión de repetición CAG más largas, la represión del alelo CAG48 fue menor a MOI bajas que la de las construcciones con repeticiones CAG más cortas o sin repeticiones CAG.

Los niveles de expresión de ZFP 33074 se evaluaron usando un conjunto de sondas de qPCR diseñadas para detectar el ARNm de ZFP 33074 (Figura 9B). Las repeticiones de CAG más largas en el promotor de los vectores de expresión se correlacionan en general con la expresión reducida de la ZFP.

En conjunto, estos ejemplos muestran que las ZFP pueden regular la expresión a través de sitios diana modificados por ingeniería genética en el promotor de la construcción de expresión, y el grado de autorregulación depende del número de sitios de unión que se incluyen en la construcción de expresión. Estos resultados también muestran que tal autorregulación es factible en el contexto de un vector plasmídico, o un vector de AAV, LV o IDLV.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una construcción que comprende un polinucleótido que codifica un modulador génico, comprendiendo el modulador génico un dominio de represión y un dominio de unión al ADN que se une a un sitio diana previsto,

en donde el polinucleótido está operativamente unido a un promotor heterólogo que comprende un sitio diana autorregulado unido por el dominio de unión al ADN del modulador génico con una afinidad más baja que el sitio diana previsto,

en donde la unión del modulador génico a la secuencia diana autorreguladora disminuye la expresión del polinucleótido, y

en donde el dominio de unión al ADN comprende una proteína de dedo de zinc, una proteína TALE o un sistema CRISPR/Cas.

2. La construcción de la reivindicación 1, en donde el sitio diana previsto está en el genoma de una célula.

3. La construcción de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el sitio diana autorregulador difiere de la secuencia del sitio diana previsto en al menos un par de bases.

4. La construcción de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la construcción comprende un elemento de control y el sitio diana autorregulador está dentro del elemento de control.

5. La construcción de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la construcción es una construcción viral, opcionalmente en donde la construcción viral es un lentivirus (LV), un vector lentiviral de integración defectuosa (IDLV), un adenovirus o una construcción de AAV.

6. La construcción de la reivindicación 1, que comprende además un ácido nucleico donante.

7. La construcción de la reivindicación 1, que comprende además al menos una secuencia codificante de polipéptido adicional operativamente unida al polinucleótido que codifica el modulador génico y el sitio diana autorregulador, en donde opcionalmente la secuencia codificante del polipéptido adicional está separada de la secuencia que codifica el regulador génico por una secuencia de péptido autoescindible 2A o un sitio IRES.

8. Una célula que comprende la construcción de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un método de regulación de la expresión de un modulador génico exógeno introducido en una célula, comprendiendo los métodos introducir una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en una célula, en donde la expresión del modulador génico se reprime al unirse el modulador génico al sitio diana autorregulado y en donde:

(i) dicho método se realiza ex vivo o in vitro, o

(ii) dicha célula es una célula vegetal.

10. El método de la reivindicación 9 (i), en donde la célula es una célula de mamífero y/o en donde la célula es una célula madre.

11. Una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para usar en un método de tratamiento, comprendiendo dicho método administrar dicha construcción a un sujeto, en donde la expresión del modulador génico se reprime al unirse el modulador génico al sitio diana autorregulador.

12. Una célula de acuerdo con la reivindicación 8, para usar en un método de tratamiento, comprendiendo dicho método administrar dicha célula a un sujeto, en donde la expresión del modulador génico se reprime al unirse el modulador génico al sitio diana autorregulador.

13. Una composición farmacéutica que comprende una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una célula de acuerdo con la reivindicación 8.

14. Un kit que comprende la construcción de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la célula de acuerdo con la reivindicación 8 y que comprende opcionalmente una molécula donante y/o instrucciones.