ES2875274T3 - Procedimientos de preparación de formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína - Google Patents

Procedimientos de preparación de formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de producción de una proteína, en el que la proteína se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, comprendiendo el procedimiento: cultivar una célula huésped genomanipulada para expresar la proteína en un medio de cultivo, en el que la célula huésped es una célula huésped con supresión de GDP-ceto-6-desoximanosa-3,5- epimerasa,4-reductasa (FX), y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en la proporción predeterminada.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos de preparación de formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 62/249.828, presentada el 2 de noviembre de 2015, y la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 62/338.280, presentada el 18 de mayo de 2016.
Envío de listado de secuencias en archivo de texto ascii
El contenido del siguiente envío en un archivo de texto ASCII es: un formulario legible por ordenador (CRF) del listado de secuencias (nombre del archivo: 146392035340SEQLIST.txt, fecha registrada: 27 de octubre de 2016, tamaño: 2 KB).
Campo técnico
La presente solicitud se refiere a procedimientos de producción de formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína en una proporción predeterminada.
Antecedentes
Las glucoproteínas son esenciales para el funcionamiento apropiado de todas las ramas del sistema inmunitario, incluyendo el sistema inmunitario innato y adaptativo. Las glucoproteínas participan en el reconocimiento, unión, señalización y eliminación de amenazas por medio de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Rudd et al., Science, 291,2001,2370-2376; y Jefferis et al., Immunol Rev, 163, 1998, 59-76). Los anticuerpos expresados en mamíferos llevan un único polisacárido en los residuos Asn297 de su cadena pesada (HC). La presencia y composición de la estructura del polisacárido influye en la unión al receptor y la función efectora del anticuerpo (Rudd et al., Science, 291, 2001, 2370-2376; y Jefferis et al., Immunol Rev, 163, 1998, 59-76). Por ejemplo, las variaciones en la composición del polisacárido de la región Fc de una IgG (Fcy) afectan diferencialmente a la afinidad de unión de la región Fc y a los receptores de unión a Fc (FcyR). Existen tres clases de FcyR, a saber, FcyRI, FcyRII y FcyRIII (Jefferis et al., Immunol Rev, 163, 1998, 59-76; Ravetch y Bolland, Annu Rev Immunol, 19, 2001, 275-290). Las afinidades diferenciales de un anticuerpo y los receptores Fcy dictan el destino de la respuesta inmunitaria del huésped a un antígeno particular y además pueden ser responsables de la activación, inhibición, eficacia/semivida de anticuerpos, tolerancia y respuesta autoinmunitaria (Ravetch y Bolland, Annu Rev Immunol, 19, 2001, 275-290). La afinidad de un anticuerpo por diferentes tipos de receptores puede cambiar dependiendo de la presencia y composición de los polisacáridos que lleva, destacando, por tanto, la importancia de las interacciones oligosacárido/proteína en la función biológica de los anticuerpos (Raju et al., Glycobiology, 10, 2000, 477-486; Jefferis et al., Immunol Rev, 163, 1998, 59-76).
Los avances en el campo de las proteínas terapéuticas permiten la expresión de proteínas recombinantes en cultivos libres de suero (Wurm, Nat Biotechnol, 22, 2004, 1393-1398) y el desarrollo de un número creciente de tratamientos basados en proteínas, tales como tratamientos basados en anticuerpos, para tratar enfermedades (Carter, Exp Cell Res, 317, 2011, 1261-1269).
Después de la expresión de proteínas en eucariotas, por ejemplo, células huésped de mamífero, las proteínas experimentan modificaciones postraduccionales, que a menudo incluyen la adición enzimática de residuos glucídicos, denominada, en general, "glucosilación".
La glucosilación de polipéptidos es típicamente unida a N o bien unida a O. Unida a N se refiere a la fijación del resto glucídico a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos, asparagina (Asn)-X-serina (Ser) y asparagina (Asn)-X-treonina (Thr), en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática del resto glucídico a la cadena lateral de asparagina. La glucosilación unida a O se refiere a la fijación de uno de los glúcidos N-acetilgalactosamina, galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también pueden participar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina en la glucosilación unida a O.
Los patrones de glucosilación para proteínas producidas por mamíferos se describen en detalle en The Plasma Proteins: Structure, Function and Genetic Control, Putnam, F. W., ed., 2.a edición, vol. 4, Academic Press, Nueva York, 1984, especialmente las págs. 271-315. En este capítulo, se analizan los oligosacáridos unidos a asparagina, incluyendo su subdivisión en al menos tres grupos denominados estructuras híbridas y complejas, con alto contenido en manosa, así como oligosacáridos unidos de forma glucosídica.
En el caso de los polisacáridos unidos a N, existe un enlace amida que conecta el carbono anomérico (C-1) de un residuo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) terminal reductor del oligosacárido y un nitrógeno de un residuo de asparagina (Asn) del polipéptido. En las células animales, los polisacáridos unidos a O se fijan por medio de un enlace glucosídico entre N-acetilgalactosamina (GalNAc), galactosa (Gal), fucosa, N-acetilglucosamina o xilosa y uno de varios hidroxiaminoácidos, lo más comúnmente serina (Ser) o treonina (Thr), pero también hidroxiprolina o hidroxilisina en algunos casos.
La vía biosintética de los oligosacáridos unidos a O consiste en una transferencia paso a paso de residuos glúcidos individuales de los glúcidos nucleotídicos por una serie de glucosiltransferasas específicas. Los glúcidos nucleotídicos que funcionan como donantes de monosacáridos son uridina-difosfo-GalNAc (UDP-GalNAc), UDP-GlcNAc, UDP-Gal, guanidina-difosfo-fucosa (GDP-Fuc) y ácido citidina-monofosfo-siálico (CMP-SA).
En la síntesis de oligosacáridos unidos a N, el inicio del ensamblaje de oligosacáridos unidos a N no se produce directamente en los residuos Asn de la proteína, sino que implica el ensamblaje previo de un oligosacárido precursor unido a lípido que a continuación se transfiere a la proteína durante o muy poco después de su traducción de ARNm. Este oligosacárido precursor (Glc3Man9GlcNAc2) se sintetiza mientras está fijado por medio de un puente pirofosfato a un lípido transportador poliisoprenoide, un dolicol, con la ayuda de una serie de glucosiltransferasas unidas a la membrana. Después de que se completa el ensamblaje del precursor unido a lípido, otra enzima unida a la membrana lo transfiere a residuos Asn estéricamente accesibles que se producen como parte de la secuencia -Asn-X-Ser/Thr-.
Los residuos Asn glucosilados de glucoproteínas recién sintetizadas transportan de forma transitoria solo un tipo de oligosacárido, Glc3Man9GlcNAc2. El procesamiento de esta estructura de oligosacáridos genera la gran diversidad de estructuras encontradas en las glucoproteínas maduras.
El procesamiento de oligosacáridos unidos a N se logra por la acción secuencial de una serie de enzimas unidas a la membrana e incluye la retirada de los tres residuos de glucosa, la retirada de un número variable de residuos de manosa y la adición de diversos residuos glúcidos al núcleo recortado resultante.
Dependiendo del modo de acción y la necesidad de la función efectora, se están empleando modificaciones de proteínas o polisacáridos dirigidos para potenciar el potencial clínico de los anticuerpos terapéuticos (Carter, Exp Cell Res, 317, 2011, 1261-1269). Una de estas modificaciones implica la expresión de anticuerpos recombinantes que no tienen molécula de fucosa en su polisacárido (afucosilado) con núcleo de quitobiosa (unido a N), lo que da como resultado un incremento de ADCC debido a su mayor afinidad por el FcyRIII, normalmente expresado en monocitos de sangre periférica y linfocitos citolíticos naturales (Shields et al., J Biol Chem, 277, 2002, 26733­ 26740). La correlación entre la fucosilación de anticuerpos y la reducción de los niveles de ADCC también se ha estudiado y documentado por varios grupos (Shields et al., J Biol Chem, 277, 2002, 26733-26740; Kanda et al., J Biotechnol, 130, 2007, 300-310; y Yamane-Ohunuki et al., Biotechnol Bioeng, 87, 2004, 614-622).
La fucosilación de polisacáridos requiere la síntesis de GDP-fucosa por medio de la vía de novo o de rescate. El procedimiento de fucosilación implica la función secuencial de varias enzimas que dan como resultado la adición de una molécula de fucosa al primer resto N-acetilglucosamina (GlcNAc) del extremo reductor de un polisacárido (Becker y Lowe, Glycobiology, 13, 2003, 41R-53R). Los laboratorios de Lowe y Fukuda descubrieron las dos enzimas clave de la vía de novo responsables de la producción de GDP-fucosa a partir de manosa y/o glucosa. Específicamente, los laboratorios descubrieron, GDP-D-manosa-4,6-deshidratasa (GMD) y GDP-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa, 4-reductasa (FX) (Ohyama et al., J Biol Chem, 273, 1998, 14582-14587; Smith et al., J Cell Biol, 158, 2002, 801-815; y Becker, Genetic and Biochemical Determination of Fucosylated Glycan Expression, 2002, Tesis de la Universidad de Michigan, UMI3121891). En ausencia de fucosa, GMD y FX convierten manosa y/o glucosa en GDP-fucosa. A su vez, la GDP-fucosa se transporta al complejo de Golgi donde nueve fucosiltransferasas (FUT1-9) actúan en conjunto para fucosilar la primera molécula de GlcNAc de un polisacárido (Becker y Lowe, Glycobiology, 13, 2003, 41R-53R). Sin embargo, en presencia de fucosa, la fucosacinasa y la GDP-fucosa pirofosforilasa pueden convertir la fucosa en GDP-fucosa, evitando la necesidad de la síntesis de novo de GDP-fucosa por las enzimas GMD y FX (Becker y Lowe, Glycobiology, 13, 2003, 41R-53R).
Se han utilizado muchas estrategias distintas a la supresión (KO) de FX para incrementar el porcentaje de especies de anticuerpos afucosilados expresados por las líneas celulares CHO para potenciar la función efectora de ADCC, sin embargo, su uso normalmente va acompañado de contratiempos particulares. Por ejemplo, se ha demostrado que la sobreexpresión de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GNTIII) reduce los niveles de anticuerpos fucosilados a través de niveles crecientes de especies intermedias de GlcNAc bisecante (fijación de una tercera GlcNAc a la 1.a manosa del polisacárido) (Umana et al., Nat Biotechnol, 17, 1999, 176-180; Davies et al., Biotechnol Bioeng, 74, 2001,288-294). Sin embargo, estas especies de polisacáridos no están comúnmente presentes en los anticuerpos y mantenerlos a niveles consecuentes y reproducibles puede ser complejo, haciendo peligrar la calidad y la consistencia del producto en un entorno de fabricación. Adicionalmente, la reducción de los niveles de expresión de GNTIII recombinante a lo largo del tiempo, debido al silenciamiento o la pérdida del número de copias de ADN, dificulta la expresión reproducible de niveles predecibles de anticuerpos afucosilados para propósitos de fabricación. Asimismo, la sobreexpresión de la enzima procariota GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) (von Horsten et al., Glycobiology, 20, 2010, 1607-1618), o cualquier enfoque que utilice la sobreexpresión para incrementar el porcentaje de especies de anticuerpos afucosilados, podría experimentar dichos contratiempos.
El uso de estrategias de atenuación (Imai-Nishiya et al., BMC Biotechnol, 7, 2007, *1-13), o de inhibidores de la vía de fucosilación disponibles comercialmente es complejo debido a la estabilidad de la atenuación o las actividades colaterales de los inhibidores que pueden dar como resultado una heterogeneidad del producto. Sin mencionar el costo asociado con la utilización de inhibidores químicos de la fucosilación en un entorno de fabricación. El tratamiento de productos de anticuerpos después de la expresión o purificación con fucosidasas (Intra et al., Gene, 392, 2007, 34-46) también es ineficaz, dando como resultado una inconsistencia por falta de calidad del producto y complica el procedimiento de fabricación debido a la(s) etapa(s) adicional(es) requerida(s) para la retirada de estas enzimas.
Se ha sugerido la utilización de un huésped KO de GMD para la expresión de anticuerpos afucosilados (Kanda et al., J Biotechnol, 130, 2007, 300-310), pero dicho huésped no se ha utilizado ampliamente y la productividad específica informada de este huésped no es muy alta (Kanda et al., J Biotechnol, 130, 2007, 300-310).
Por otra parte, el huésped KO de FUT8 se ha usado ampliamente para generar clones que puedan expresar anticuerpos afucosilados adecuados para propósitos de fabricación (Yamane-Ohunuki et al., Biotechnol Bioeng, 87, 2004, 614-622; y Malphettes et al., Biotechnol Bioeng, 106, 2010, 774-783). Sin embargo, utilizar el huésped KO de FUT8 no está exento de deficiencias y complejidades. En general, se requiere el análisis de la función del anticuerpo in vivo e in vitro para determinar la necesidad y eficacia de los anticuerpos afucosilados frente a los naturales (fucosilados). Puesto que el huésped KO de FUT8 solo puede expresar anticuerpos afucosilados, es necesario emprender un proyecto de desarrollo de líneas celulares (CLD) paralelas para expresar anticuerpos naturales con propósitos de comparación, duplicando los proyectos de CLD requeridos. Además, es necesario cribar una gran cantidad de clones que expresan anticuerpos afucosilados y naturales para obtener clones con atributos de calidad de producto comparables para garantizar que cualquier ventaja observada se deba solo a la falta de fucosilación. Adicionalmente, se ha observado que los huéspedes KO de FUT8 tienen problemas de crecimiento y pueden requerir un tiempo de adaptación de la suspensión más largo, incrementando los plazos de CLD con posibles implicaciones para valores más bajos (Malphettes et al., Biotechnol Bioeng, 106, 2010, 774-783).
Por tanto, existe una necesidad en la técnica de una línea celular, y procedimientos de cultivo de dicha línea celular que puedan producir formas afucosiladas y fucosiladas de una proteína en una proporción deseada, y composiciones que comprenden la proteína de la misma.
Breve sumario de la invención
La presente solicitud en algunos modos de realización proporciona procedimientos de producción de una proteína, en los que la proteína se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, comprendiendo los procedimientos: cultivar una célula huésped genomanipulada para expresar la proteína en un medio de cultivo, en los que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad GDP-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa,4-reductasa (FX), y en los que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, la proporción predeterminada es de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 1:50 (incluyendo, por ejemplo, aproximadamente 50:5,5, aproximadamente 50:12,5, aproximadamente 50:21,5, aproximadamente 50:33,5, aproximadamente 50:50, aproximadamente 50:75, aproximadamente 50:116,5, aproximadamente 50:200 o aproximadamente 50:450).
En algunos aspectos de la divulgación, se proporcionan procedimientos de producción de una proteína que tiene función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN, comprendiendo los procedimientos: cultivar una célula huésped genomanipulada para expresar la proteína en un medio de cultivo, en los que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en los que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, la función ADCC se determina por un ensayo de ADCC. En algunos modos de realización, la función ADCC se determina por un ensayo de unión a FCyRIII.
En algunos modos de realización, se proporcionan procedimientos para ajustar un nivel de fucosilación de una proteína producida por una célula huésped genomanipulada para producir la proteína, comprendiendo los procedimientos: cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, en los que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en los que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación de la proteína; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que la proteína se produzca a un nivel predeterminado de fucosilación. En algunos modos de realización, determinar el nivel de fucosilación de la proteína comprende determinar la forma fucosilada de la proteína. En algunos modos de realización, determinar el nivel de fucosilación de la proteína comprende determinar la forma afucosilada de la proteína. En algunos modos de realización, ajustar la cantidad de la fuente de fucosa comprende incrementar la cantidad de la fuente de fucosa cuando el nivel de fucosilación es bajo. En algunos modos de realización, ajustar la cantidad de la fuente de fucosa comprende disminuir la cantidad de la fuente de fucosa cuando el nivel de fucosilación es alto.
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el procedimiento comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo libre de la fuente de fucosa antes de cultivar la célula huésped en el medio de cultivo que comprende la fuente de fucosa. En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el procedimiento comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo, en el que la fuente de fucosa está presente en el medio de cultivo al comienzo de la etapa de cultivo. En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el procedimiento comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo, en el que la fuente de fucosa se añade al medio de cultivo durante la etapa de cultivo. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa se añade al medio de cultivo por medio de la adición de un bolo. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa se añade al medio de cultivo por medio de alimentación continua.
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el procedimiento comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo, en el que la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo durante la etapa de cultivo está entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 1 mM.
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el procedimiento comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo, en el que la etapa de cultivo se lleva a cabo a menos de aproximadamente 37 °C.
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el procedimiento comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende además una fuente de glucosa o una fuente de manosa.
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el procedimiento comprende además aislar la proteína del cultivo celular.
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
En algunos aspectos de la divulgación, se proporcionan procedimientos de caracterización de una proteína en una forma afucosilada, comprendiendo los procedimientos: comparar la actividad biológica de la proteína afucosilada con una forma fucosilada de la proteína, en los que las formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína se producen por la misma célula huésped genomanipulada para producir la proteína, y en los que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, la forma afucosilada de la proteína se produce por la célula huésped en un primer cultivo celular libre de una fuente de fucosa. En algunos modos de realización, la forma fucosilada de la proteína se produce por la célula huésped en un segundo cultivo celular que comprende una fuente de fucosa.
En algunos aspectos, el procedimiento de caracterización de una proteína en forma afucosilada comprende comparar la actividad biológica in vitro. En algunos aspectos, el procedimiento de caracterización de una proteína en forma afucosilada comprende comparar la actividad biológica in vivo. En algunos modos de realización, la función ADCC se determina por un ensayo de ADCC. En algunos modos de realización, la función ADCC se determina por un ensayo de unión a FCyRIII.
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la forma fucosilada de la proteína se determina a nivel de estructura de polisacárido. En algunos modos de realización, se usa PNGasa F para escindir una estructura de polisacárido de la proteína. En algunos modos de realización, la forma fucosilada de la proteína se determina a nivel de estructura de polisacárido, en los que la forma fucosilada de la proteína se determina por electroforesis capilar (EC).
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la forma fucosilada de la proteína se determina a nivel de proteína. En algunos modos de realización, la forma fucosilada de la proteína se determina a nivel de proteína, en los que la forma fucosilada de la proteína se determina por espectrometría de masas (EM).
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la proteína es una proteína que contiene Fc. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc comprende una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento de la misma. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc es un anticuerpo de longitud completa. En algunos modos de realización, el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo monoclonal. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc es una proteína de fusión que contiene Fc. En algunos modos de realización, la proteína de fusión que contiene Fc es una inmunoadhesina.
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la célula huésped es una célula eucariota. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO).
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la célula huésped comprende no más de un 20 % de FX en comparación con una célula huésped que comprende un gen de FX natural, respectivamente, sin inactivación.
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el gen de FX en la célula huésped está inactivado. En algunos modos de realización, el gen de FX se inactiva por ARNip. En algunos modos de realización, el gen de FX se inactiva por ARNhp. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento en el que el gen de FX se inactiva por una deleción de secuencia. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento en el que el gen de FX se inactiva por una adición o sustitución de secuencia. En algunos modos de realización, el gen de FX se inactiva usando un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas, regularmente espaciadas (CRISPR). En algunos modos de realización, el gen de FX se inactiva usando un sistema de nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN). En algunos modos de realización, el gen de FX se inactiva usando un sistema de nucleasa con dedos de cinc (ZFN). En algunos modos de realización, el gen de FX se inactiva usando un sistema de meganucleasa.
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX.
En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
Además, se proporcionan en el presente documento composiciones que comprenden la proteína producida por uno cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
En algunos aspectos, se proporcionan composiciones que comprenden una proteína que tiene función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos p Mn , en las que la composición comprende formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada.
En algunos aspectos, la composición comprende una forma fucosilada de la proteína que comprende fucosa en el extremo reductor de una estructura de polisacárido. En algunos aspectos, la composición es una composición farmacéutica. En algunos aspectos, la composición es un medio de cultivo celular. En algunos aspectos, la composición es un lisado celular. En algunos aspectos, la composición es un eluido de una columna de purificación de proteínas.
También se proporcionan en el presente documento cultivos de células que comprenden: una célula huésped genomanipulada para expresar una proteína, en los que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX; y un medio de cultivo que comprende una fuente de fucosa a de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM.
También se proporcionan en el presente documento procedimientos de tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita, que comprenden: administrar al individuo una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En algunos aspectos, la composición se administra por vía parenteral. En algunos aspectos, la composición se administra por vía intravenosa o por vía subcutánea. En algunos aspectos, la composición se administra localmente. En algunos aspectos, la composición se administra por vía tópica.
Estos y otros aspectos y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la descripción detallada y las reivindicaciones adjuntas posteriores. Se ha de entender que una, algunas o todas las propiedades de los diversos modos de realización descritos en el presente documento se pueden combinar para formar otros modos de realización de la presente invención.
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1 muestra una visión general de la vía de fucosilación que incluye las vías de novo y de rescate para generar GDP-fucosa. La GDP-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa,4-reductasa (FX) y la GDP-D-manosa-4,6-deshidratasa (GMD) son miembros de la vía de novo.
Las FIGS. 2A-2B muestran un flujo de trabajo para inactivar FX y el análisis por PCR de células con un gen de FX inactivado. La FIG. 2A muestra un flujo de trabajo para inactivar FX. La FIG. 2B muestra el análisis por PCR de la población 3, la población 9 y un control para la detección de alelos de FX delecionados. Se usaron cebadores naturales (WT; interior) y de supresión (KO; exterior) en reacciones separadas. Se usaron como control células CHO-K1 transfectadas solo con ARNg (sin Cas9).
La FIG. 3 muestra el análisis FACS de células CHO-K1 sin teñir (sin teñir), células CHO-K1 teñidas con LCA-FITC con inactivación de FX (CHO-K1 FXKO-población 3) y células CHO-K1 naturales teñidas con LCA-FITC (huésped WT CHO-K1).
Las FIGS. 4A-4B muestran el gen de FX y el análisis de proteínas de clones de células individuales obtenidos de la población 3. La FIG. 4A muestra el análisis por PCR del gen de FX usando cebadores naturales (WT) y de supresión (KO). La FIG. 4B muestra el análisis de inmunoelectrotransferencia de la proteína FX. Téngase en cuenta que en el panel de transferencia de FX, la banda inferior indicada con un asterisco (*) es una banda no específica que está presente en todas las muestras. La transferencia de actina se usa como control de carga.
Las FIGS. 5A-5F muestran el análisis FACS de clones de células individuales obtenidos de la población 3. Cada análisis FACS muestra células CHO-K1 sin teñir (sin teñir), células CHO-K1 teñidas con LCA-FITC con inactivación de FX cultivadas en medios que comprenden fucosa (FXKO fucosa), células CHO-K1 teñidas con LCA-FITC con inactivación de FX cultivadas en medios que carecen de fucosa (FXKO) y células CHO-K1 naturales teñidas con LCA-FITC (WT CHO-K1). La FIG. 5A muestra el análisis FACS del clon 3. La FIG. 5B muestra el análisis FACS del clon 5. La FIG. 5C muestra el análisis FACS del clon 6. La FIG. 5D muestra el análisis FACS del clon 7. La FIG.
5E muestra el análisis FACS del clon 9. La FIG. 5F muestra el análisis FACS del clon 11.
Las FIGS. 6A-6C muestran el procedimiento para producir un anticuerpo usando las líneas celulares con FXKO y el análisis de las estructuras de polisacárido producidas por dichas líneas celulares con FXKO. La FIG.6A muestra un esquema de transfección y selección de poblaciones para expresar el anticuerpo A a partir de poblaciones de los huéspedes 3-5, 3-7 y 3-11 con FXKO, en presencia o ausencia de fucosa en los medios. El huésped CHO-K1 se usó como control. La FIG. 6B muestra un perfil de electroforetograma representativo del anticuerpo A, expresado por el clon 3-11 con FXKO, sometido a electroforesis capilar. La FIG. 6C muestra especies de polisacáridos detectadas por electroforesis capilar de diferentes poblaciones, en presencia o ausencia de fucosa. La falta de fucosilación se indica con "-F". No se muestran las especies de polisacáridos de nivel inferior. G0 = polisacárido con núcleo de quitobiosa fucosilado, G1 = una galactosa en una de las ramas de GlcNac, G-1 = polisacárido con núcleo de quitobiosa que carece de una GlcNAc ramificada, G1' = isómero posicional de G1, G1-1 = polisacárido con núcleo de quitobiosa que carece de una GlcNAc ramificada con una galactosa en la GlcNAc ramificada restante, G2 = dos galactosas, una en cada GlcNAc ramificada, Man5 = GlcNAc-GlcNAc-5x(manosa), G0-1 = polisacárido con núcleo de quitobiosa que carece de una GlcNAc ramificada, G0-1-F = polisacárido con núcleo de quitobiosa afucosilado que carece de una GlcNAc ramificada, G0-F = polisacárido con núcleo de quitobiosa afucosilado, G1-F = polisacárido con núcleo de quitobiosa afucosilado con una galactosa en una de las ramas de GlcNAc, G1'-F = isómero posicional de G1-F, G2-F = polisacárido con núcleo de quitobiosa afucosilado con dos galactosas, una en cada GlcNAc ramificada.
Las FIGS. 7A-7F muestran los análisis de un anticuerpo producido por 24 clones del huésped con FXKO3-11 siguiendo un procedimiento de CLD estándar. La FIG. 7A muestra el valor (g/l) del anticuerpo. La FIG. 7B muestra la productividad específica (pg/célula-día) de los clones. La FIG. 7C muestra el crecimiento de los clones. La FIG.
7D muestra el porcentaje de estructuras de polisacárido que son G0-F (polisacárido con núcleo de quitobiosa afucosilado) producidas por los clones. La FIG. 7E muestra el porcentaje de estructuras de polisacárido que son G1-F (polisacárido con núcleo de quitobiosa afucosilado con una galactosa en una de las ramas de GlcNAc) producidas por los clones. La FIG. 7F muestra el porcentaje de estructuras de polisacárido que son G0-1-F (polisacárido con núcleo de quitobiosa afucosilado que carece de una GlcNAc ramificada) producidas por los clones.
Las FIGS. 8A-8F muestran los análisis de las formas naturales y afucosiladas del anticuerpo A y el anticuerpo B producidas por clones con FXKO cultivados en ausencia de fucosa o bien en presencia de fucosa 1 mM. La FIG.
8A muestra el porcentaje de variantes de carga del anticuerpo A purificado producidas por clones con FXKO, cultivados en ausencia de fucosa o bien en presencia de fucosa 1 mM, en comparación con un control de huésped CHO-K1. La FIG. 8B muestra el porcentaje de agregación del anticuerpo A purificado producido por clones con FXKO, cultivados en ausencia de fucosa o bien en presencia de fucosa 1 mM, en comparación con un control de huésped CHO-K1. La FIG. 8C muestra el valor (g/l) del anticuerpo B producido por clones con FXKO cultivados en ausencia de fucosa o bien en presencia de fucosa 1 mM. La FIG. 8D muestra el porcentaje de las principales glucoformas del anticuerpo B producidas por clones con FXKO cultivados en ausencia de fucosa o bien en presencia de fucosa 1 mM. G0 = polisacárido con núcleo de quitobiosa fucosilado, G1 = una galactosa en una de las ramas de GlcNac, Man5 = GlcNAc-GlcNAc-5x(manosa), G0-F = polisacárido con núcleo de quitobiosa afucosilado, G1-F = polisacárido con núcleo de quitobiosa afucosilado con una galactosa en una de las ramas de GlcNAc. La FIG. 8E muestra el porcentaje de variantes de carga del anticuerpo B purificado producidas por clones con FXKO cultivados en ausencia de fucosa o bien en presencia de fucosa 1 mM. La FIG. 8F muestra el porcentaje de agregación del anticuerpo B purificado producido por clones con FXKO cultivados en ausencia de fucosa o bien en presencia de fucosa 1 mM.
Las FIGS. 9A-9E muestran los análisis del anticuerpo B producido por clones con FXKO cultivados en un intervalo de concentraciones de fucosa. La FIG. 9A muestra el porcentaje de las principales glucoformas del anticuerpo B producidas por el clon 1 con FXKO cultivado en un intervalo de concentraciones de fucosa (0-1 mM). La FIG. 9A muestra el porcentaje de las principales glucoformas del anticuerpo B producidas por el clon 1 con FXKO cultivado en un intervalo de concentraciones de fucosa (0-2 mM). G0 = polisacárido con núcleo de quitobiosa fucosilado, G1 = una galactosa en una de las ramas de GlcNac, Man5 = GlcNAc-GlcNAc-5x(manosa), G0-F = polisacárido con núcleo de quitobiosa afucosilado, G1-F = polisacárido con núcleo de quitobiosa afucosilado con una galactosa en una de las ramas de GlcNAc. La FIG. 9C muestra el valor (g/l) del anticuerpo B producido por el clon 1 y 2 con FXKO cultivados en un intervalo de concentraciones de fucosa (0-1 mM). La FIG. 9D muestra el porcentaje de agregación del anticuerpo B producido por el clon 1 y 2 con FXKO cultivados en un intervalo de concentraciones de fucosa (0-1 mM). La FIG. 9E muestra el porcentaje de variantes de carga del anticuerpo B producidas por el clon 1 y 2 con FXKO cultivados en un intervalo de concentraciones de fucosa (0-1 mM).
Las FIGS. 10A-10G muestran los análisis de los anticuerpos producidos por clones con FXKO cultivados en un intervalo de concentraciones de fucosa. La FIG. 10A muestra las proporciones de glucoformas afucosiladas con respecto a fucosiladas del anticuerpo B (IgG1) producidas por un clon con FXKO cultivado en medios de producción con las concentraciones indicadas de fucosa. La FIG. 10B muestra los resultados de un ensayo de unión a FcyRIII de los anticuerpos de anticuerpo B purificados a una concentración no saturante de 10 pg/ml. La FIG. 10C muestra las proporciones de especies de polisacáridos afucosilados con respecto a fucosilados del anticuerpo C (IgG1) producidas por un clon con FXKO cultivado en medios de producción con las concentraciones indicadas de fucosa. La FIG. 10D muestra el % de actividad de ADCC que resulta de un ensayo de ADCC basado en linfocitos NK de anticuerpos de anticuerpo C purificados a partir de diferentes cultivos alimentados con fucosa. La FIG. 10E muestra la suma porcentual de polisacáridos afucosilados y el porcentaje de actividad de ADCC relativa de mezclas de anticuerpos preparadas a partir de cultivos con alimentación de fucosa 0 y 1 mM. La FIG. 10F muestra el % de actividad de ADCC en relación con la suma porcentual de especies de polisacáridos afucosilados. La FIG. 10G muestra las curvas de respuesta a la dosis de ADCC para muestras de anticuerpo C con diferentes proporciones de polisacáridos fucosilados con respecto a afucosilados.
Descripción detallada de la invención
La presente solicitud utiliza el principio de que una célula con supresión de GDP-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa,4-reductasa (FXKO) puede producir formas tanto fucosiladas como afucosiladas de un anticuerpo cuando se cultiva en un medio de cultivo que comprende cantidades variadas de fucosa. Se descubrió que la valoración de fucosa en los medios de producción permite la producción de un anticuerpo con una proporción deseada de formas de polisacárido fucosiladas y afucosiladas sin ningún cambio en el valor de anticuerpos o la calidad del producto. Los clones de la célula huésped con FXKO expresaron el anticuerpo diana con productividades específicas relativamente altas y buenos perfiles de crecimiento.
Por tanto, la presente solicitud proporciona procedimientos para producir proteínas fucosiladas y afucosiladas a partir de la misma célula huésped con FXKO. Esto es ventajoso ya que permite la producción de formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína con calidades de producto similares. A su vez, la comparación de proteínas fucosiladas y afucosiladas con calidades de producto similares permite determinar si la falta de fucosa en una proteína afucosilada es realmente responsable o no de los cambios observados en la función biológica (por ejemplo, una función ADCC potenciada). A diferencia de las células huésped con supresión de FUT8, que pueden producir una forma natural o bien afucosilada de una proteína, el huésped con FXKO obvia la necesidad de emprender dos proyectos de desarrollo de líneas celulares (CLD) separados. Además, el uso de una única célula huésped para producir formas tanto fucosiladas como afucosiladas de una proteína evita la necesidad de cribar muchas colonias para identificar posiblemente clones con calidades de producto comparables.
Adicionalmente, los clones con FXKO se pueden utilizar para expresar cualquier anticuerpo o polipéptido que contenga Fc con una proporción terapéuticamente pertinente de glucoformas fucosiladas y afucosiladas. Se ha informado de que mientras que los anticuerpos afucosilados potencian la destrucción celular mediada por ADCC por medio de leucocitos monomorfonucleares (tales como los linfocitos NK), los leucocitos polimorfonucleares (PMN) reconocen y destruyen preferentemente sus dianas por medio de la unión a anticuerpos con polisacáridos fucosilados (Peipp et al., Blood, 112, 2008, 2390-2399). Por tanto, el uso de una célula huésped con FXKO y la valoración de la cantidad correcta de fucosa en el medio de cultivo se pueden usar para producir una proporción deseada de formas fucosiladas y afucosiladas de un anticuerpo, que en principio debería ser eficaz para potenciar la destrucción celular mediada por ADCC por leucocitos tanto monomorfonucleares como PMN. Además, la capacidad de ajustar la proporción de formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína permite la producción de una proteína con un nivel máximo de función ADCC mientras que minimiza cualquier posible toxicidad vinculada a ADCC.
Por tanto, la presente solicitud, en un aspecto, proporciona un procedimiento de producción de una proteína en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada que comprende cultivar una célula huésped sustancialmente sin actividad FX o sustancialmente sin actividad GMD, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en la proporción predeterminada. La presente solicitud, en otro aspecto, proporciona un procedimiento de producción de una proteína que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. La presente solicitud, en otro aspecto, proporciona un procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de proteínas que comprende cultivar una célula huésped sustancialmente sin actividad FX o sustancialmente sin actividad GMD, determinar el nivel de fucosilación de la proteína y ajustar la cantidad de fucosa en el medio de cultivo de modo que la proteína se produzca a un nivel predeterminado de fucosilación. La presente solicitud, en otro aspecto, proporciona un procedimiento de caracterización de una proteína en una forma afucosilada que comprende comparar la actividad biológica de la proteína afucosilada con una forma fucosilada de la proteína, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína se producen por la misma célula huésped genomanipulada para producir la proteína, y en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD. La presente solicitud, en otro aspecto, proporciona una composición que comprende la proteína producida por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. La presente solicitud, en otro aspecto, proporciona un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar una composición farmacéutica que comprende la proteína. La presente solicitud, en otro aspecto, proporciona un cultivo celular que comprende la célula huésped sin sustancialmente actividad FX o sin sustancialmente actividad GMD y una fuente de fucosa a de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM.
Definiciones
Una forma fucosilada de una proteína, como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura de polisacárido que tiene un resto fucosa.
Una forma afucosilada de una proteína, como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura de polisacárido que carece de un resto fucosa.
"Proteína que contiene Fc", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína (por ejemplo, un anticuerpo o una proteína de fusión que contiene Fc) que comprende un dominio Fc. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc comprende una o más subunidades de proteína. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc comprende uno o más polipéptidos.
"Dominio Fc", como se usa en el presente documento, se refiere a una región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento C terminal de la misma. El término incluye dominios Fc naturales y dominios Fc variantes. En algunos modos de realización, el dominio Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxílico de la cadena pesada (el número de aminoácidos es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). En algunos modos de realización, el término incluye un fragmento C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y una o más regiones constantes. En algunos modos de realización, para IgG, el dominio Fc puede comprender los dominios CH2 y CH3 y la bisagra entre CH1 y CH2 de inmunoglobulina.
Como se usa en el presente documento, "proteína de fusión que contiene Fc" se refiere a una proteína que comprende un dominio Fc fusionado con al menos otra unidad de proteína heteróloga o polipéptido.
El término "cadena pesada" usado en el presente documento se refiere a una cadena pesada de inmunoglobulina.
Los anticuerpos son glucoproteínas, con glucosilación en la región Fc. Por tanto, por ejemplo, la región Fc de una inmunoglobulina IgG es un homodímero que comprende regiones bisagra unidas por disulfuro intercatenarias, dominios CH2 glucosilados que llevan oligosacáridos unidos a N en la asparagina 297 (Asn-297) y dominios CH3 emparejados no covalentemente. La glucosilación desempeña un papel importante en los mecanismos de efectores mediados por FcyRI, FcyRII, FcyRIII y C1q. Por tanto, los fragmentos de anticuerpo de la presente invención deben incluir una región Fc glucosilada y una región de unión a antígeno.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, que incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que comprendan un dominio Fc.
El término "anticuerpo de longitud completa" se usa en el presente documento para hacer referencia a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.
Los "anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dáltones, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1 , IgG2 , IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 6, £, y y M, respectivamente.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 ; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de regiones hipervariables (HVR) no humanas y residuos aminoacídicos de regiones estructurales (FR) humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades insignificantes. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular.
Como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con una especificidad de unión deseada, siendo distinta esta secuencia de aminoácidos del sitio de unión y reconocimiento de antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga" en comparación con una región constante de un anticuerpo) y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina (por ejemplo, la secuencia Ch2 y/o Ch3 de una IgG). Las secuencias de adhesina ejemplares incluyen secuencias de aminoácidos contiguas que comprenden una porción de un receptor o un ligando que se une a una proteína de interés. Las secuencias de adhesina también pueden ser secuencias que se unen a una proteína de interés, pero no son secuencias de receptor o ligando (por ejemplo, secuencias de adhesina en pepticuerpos). Dichas secuencias polipeptídicas se pueden seleccionar o identificar por diversos procedimientos, incluyen técnicas de presentación en fagos y procedimientos de clasificación de alto rendimiento. La secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA (incluyendo IgA1 e IgA2), IgE, IgD o IgM.
El término "anticuerpo terapéutico" se refiere a un anticuerpo que se usa en el tratamiento de una enfermedad. Un anticuerpo terapéutico puede tener diversos mecanismos de acción. Un anticuerpo terapéutico se puede unir y neutralizar la función normal de una diana asociada con un antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que bloquea la actividad de la proteína necesaria para la supervivencia de una célula cancerosa provoca la muerte de la célula. Otro anticuerpo monoclonal terapéutico se puede unir y activar la función normal de una diana asociada con un antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal se puede unir a una proteína en una célula y desencadenar una señal de apoptosis. Aún otro anticuerpo monoclonal se puede unir a un antígeno diana expresado solo en un tejido afectado; la conjugación de una carga útil tóxica (agente eficaz), tal como un agente quimioterápico o radioactivo, con el anticuerpo monoclonal puede crear un agente para el suministro específico de la carga útil tóxica al tejido afectado, lo que reduce el daño en el tejido sano. Un "fragmento biológicamente funcional" de un anticuerpo terapéutico presentará al menos una, sino algunas o todas las funciones biológicas atribuidas al anticuerpo intacto, comprendiendo la función al menos una unión específica al antígeno diana.
Los términos "receptor de Fc" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferente es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y, de forma alternativa, formas empalmadas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición del inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase la revisión de M. en Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se vayan a identificar en el futuro, se engloban por el término "FcR" en el presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y media un catabolismo más lento, por tanto, una semivida más larga.
Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.
Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos FcyRIII y realizan la función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; siendo preferentes las PBMC y los linfocitos NK. Las células efectoras se pueden aislar a partir de una fuente natural de las mismas, por ejemplo, de sangre o de PBMC como se describe en el presente documento.
La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción celular en la que células citotóxicas inespecíficas que expresan los receptores Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen un anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. Las células principales para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyR i, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula de lisar una diana en presencia del complemento. La vía de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que forma un complejo con un antígeno análogo. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
Una "célula huésped", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que puede producir una proteína o un producto polipeptídico. En algunos modos de realización, la célula huésped puede producir una proteína que contiene Fc.
Como se usa en el presente documento, "sustancialmente sin actividad FX" o "sustancialmente sin actividad GMD" se refiere a una reducción de un nivel de actividad FX o GMD, respectivamente, en comparación con una célula huésped que comprende FX o GMD natural, respectivamente, sin una reducción del nivel de actividad, en al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %. En algunos modos de realización, el nivel de actividad se reduce en aproximadamente de un 80 % a un 100 %, aproximadamente de un 85 % a un 100 %, aproximadamente de un 90 % a un 100 % o aproximadamente de un 95 % a un 100 %. En algunos modos de realización, el nivel de actividad se reduce en al menos un 95 %. En algunos modos de realización, el nivel de actividad se reduce en un 100 %. En algunos modos de realización, el nivel de actividad de la enzima no es más de un 20 %, en comparación con una célula huésped que comprende una enzima natural sin una reducción del nivel de actividad de la enzima. En algunos modos de realización, el nivel de actividad de la enzima no es más de un 15 %, en comparación con una célula huésped que comprende una enzima natural sin una reducción del nivel de actividad de la enzima. En algunos modos de realización, el nivel de actividad de la enzima no es más de un 10 %, en comparación con una célula huésped que comprende una enzima natural sin una reducción del nivel de actividad de la enzima. En algunos modos de realización, el nivel de actividad de la enzima no es más de un 5 %, en comparación con una célula huésped que comprende una enzima natural sin una reducción del nivel de actividad de la enzima.
Las frases "desactivación del gen" y "desactivación génica" se refieren a una mutación de la secuencia de ADN endógeno natural y/o la región activadora de un gen para disminuir o evitar la expresión de ese gen en la célula en comparación con la secuencia natural del gen.
El término "supresión" se refiere a una alteración en la secuencia de ácido nucleico de un gen que reduce la actividad biológica del polipéptido normalmente codificado a partir del mismo en al menos un 80 % en comparación con el gen inalterado. La alteración, por ejemplo, puede ser una inserción, sustitución, deleción, mutación por desplazamiento del marco de lectura o mutación de aminoácido.
El término "atenuación" se refiere a técnicas por las que se reduce la expresión de uno o más genes, a través de modificación genética (un cambio en el ADN de uno de los cromosomas del organismo) o bien por tratamiento con un reactivo tal como un oligonucleótido de ADN o ARN corto con una secuencia complementaria a un transcrito de ARNm o bien un gen. Si se realiza una modificación genética del ADN, el resultado es un "organismo atenuado" o una "célula huésped atenuada".
Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".
Una proteína "aislada" es una que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, una proteína se purifica hasta más de un 95 % o un 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforética (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Por ejemplo, para una revisión de procedimientos de evaluación de la pureza de anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" o "que trata" es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Para los propósitos de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: aliviar uno o más síntomas resultantes de la enfermedad, disminuir el grado de la enfermedad, estabilizar la enfermedad (por ejemplo, evitar o retrasar el empeoramiento de la enfermedad), evitar o retrasar la diseminación (por ejemplo, metástasis) de la enfermedad, evitar o retrasar la recidiva de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, mejorar el estado de la enfermedad, proporcionar una remisión (parcial o total) de la enfermedad, disminuir la dosis de uno o más de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad, incrementar la calidad de vida y/o prolongar la supervivencia. Los procedimientos de la invención contemplan uno cualquiera o más de estos aspectos del tratamiento.
El término "individuo" se refiere a un mamífero e incluye, pero no se limita a, humano, bovino, caballo, felino, canino, roedor o primate. En algunos modos de realización, el individuo es un ser humano.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es al menos la concentración mínima requerida para efectuar una mejora mensurable de un trastorno particular. Una cantidad terapéuticamente eficaz en el presente documento puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del paciente, y la capacidad del anticuerpo de provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo se compensa con los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, puesto que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una fase más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz puede ser menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Se entiende que los aspectos y modos de realización de la invención descritos en el presente documento incluyen "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en" aspectos y modos de realización.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) variaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".
Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/a", "o" y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.
Procedimientos de producción de formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína
La presente solicitud, en algunos aspectos, proporciona procedimientos de producción de una proteína, en los que la proteína se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, en los que los procedimientos comprenden cultivar cualquier célula huésped que no comprenda sustancialmente actividad FX como se describe en los modos de realización en el presente documento en un medio de cultivo, y en los que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína, en el que la proteína se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que contiene Fc, en el que la proteína que contiene Fc se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, que comprende cultivar una célula huésped que no comprende sustancialmente actividad FX en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína que contiene Fc en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que contiene Fc, en el que la proteína que contiene Fc se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína que contiene Fc en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo, en el que el anticuerpo se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, que comprende cultivar una célula huésped que no tiene sustancialmente actividad FX en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas del anticuerpo en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo, en el que el anticuerpo se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas del anticuerpo en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula CHO. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína, en el que la proteína se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, que comprende cultivar una célula huésped que no tiene sustancialmente actividad Fx , en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en un cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína, en el que la proteína se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que contiene Fc, en el que la proteína que contiene Fc se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, que comprende cultivar una célula huésped que no comprende sustancialmente actividad FX en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína que contiene Fc en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que contiene Fc, en el que la proteína que contiene Fc se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína que contiene Fc en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo, en el que el anticuerpo se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, que comprende cultivar una célula huésped que no tiene sustancialmente actividad FX en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas del anticuerpo en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo, en el que el anticuerpo se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas del anticuerpo en la proporción predeterminada. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula CHO. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
En algunos modos de realización, la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína es aproximadamente de 50:1 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:2,5 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:5,5 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:8,5 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:12,5 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:15,5 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:21,5 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:27 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:33,5 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:41 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:61 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:75 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:93 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:116,5 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:150 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:200 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:283,5 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 50:450 a aproximadamente 1:50 o de aproximadamente 50:950 a aproximadamente 1:50.
En algunos modos de realización, la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína es aproximadamente de 50:1 a aproximadamente 2,5:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 5,5:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 8,5:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 12,5:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 15,5:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 21,5:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 27:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 33,5:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 41:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 50:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 61:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 75:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 93:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 116,5:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 150:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 200:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 283,5:50, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 450:50 o de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 950:50.
En algunos modos de realización, la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína es de aproximadamente 50:2,5 a aproximadamente 2,5:50, de aproximadamente 50:5,5 a aproximadamente 5,5:50, de aproximadamente 50:8,5 a aproximadamente 8,5:50, de aproximadamente 50:12,5 a aproximadamente 12,5:50, de aproximadamente 50:15,5 a aproximadamente 15,5:50, de aproximadamente 50:15,5 a aproximadamente 21,5:50, de aproximadamente 50:27 a aproximadamente 27:50, de aproximadamente 50:33,5 a aproximadamente 33,5:50 o de aproximadamente 50:41 a aproximadamente 41:50.
En algunos modos de realización, la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína es de aproximadamente 12,5:50 a aproximadamente 2,5:50, de aproximadamente 12,5:50 a aproximadamente 5,5:50, de aproximadamente 12,5:50 a aproximadamente 8,5:50, de aproximadamente 12,5:50 a aproximadamente 12,5:50 o de aproximadamente 12,5:50 a aproximadamente 15,5:50.
En algunos modos de realización, la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína es de aproximadamente 21,5:50 a aproximadamente 2,5:50, de aproximadamente 21,5:50 a aproximadamente 5,5:50, de aproximadamente 21,5:50 a aproximadamente 8,5:50, de aproximadamente 21,5:50 a aproximadamente 12,5:50 o de aproximadamente 21,5:50 a aproximadamente 15,5:50.
En algunos modos de realización, la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína es de aproximadamente 33,5:50 a aproximadamente 2,5:50, de aproximadamente 33,5:50 a aproximadamente 5,5:50, de aproximadamente 33,5:50 a aproximadamente 8,5:50, de aproximadamente 33,5:50 a aproximadamente 12,5:50, de aproximadamente 33,5:50 a aproximadamente 15,5:50, de aproximadamente 33,5:50 a aproximadamente 21,5:50 o de aproximadamente 33,5:50 a aproximadamente 27:50.
En algunos modos de realización, la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína es de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 2,5:50, de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 5,5:50, de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 8,5:50, de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 12,5:50, de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 15,5:50, de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 21,5:50, de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 27:50, de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 33,5:50 o de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 41:50.
En algunos modos de realización, la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína es de aproximadamente 75:50 a aproximadamente 2,5:50, de aproximadamente 75:50 a aproximadamente 5,5:50, de aproximadamente 75:50 a aproximadamente 8,5:50, de aproximadamente 75:50 a aproximadamente 12,5:50, de aproximadamente 75:50 a aproximadamente 15,5:50, de aproximadamente 75:50 a aproximadamente 21,5:50, de aproximadamente 75:50 a aproximadamente 27:50, de aproximadamente 75:50 a aproximadamente 33,5:50, de aproximadamente 75:50 a aproximadamente 41:50, de aproximadamente 75:50 a aproximadamente 50:50 o de aproximadamente 75:50 a aproximadamente 61:50.
En algunos modos de realización, la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína es aproximadamente de 116,5:50 a aproximadamente 2,5:50, de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 5,5:50, de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 8,5:50, de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 12,5:50, de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 15,5:50, de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 21,5:50, de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 27:50, de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 33,5:50, de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 41:50, de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 50:50, de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 61:50, de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 75:50 o de aproximadamente 116,5:50 a aproximadamente 93:50.
En algunos modos de realización, la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína es de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 2,5:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 5,5:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 8,5:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 12,5:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 15,5:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 21,5:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 27:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 33,5:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 41:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 50:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 61:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 75:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 93:50, de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 116,5:50 o de aproximadamente 200:50 a aproximadamente 150:50.
En algunos modos de realización, la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína es de aproximadamente 50:1, de aproximadamente 50:2,5, de aproximadamente 50:5,5, de aproximadamente 50:8,5, de aproximadamente 50:12,5, de aproximadamente 50:15,5, de aproximadamente 50:21,5, de aproximadamente 50:27, de aproximadamente 50:33,5, de aproximadamente 50:41, de aproximadamente 50:50, de aproximadamente 50:61, de aproximadamente 50:75, de aproximadamente 50:93, de aproximadamente 50:116,5, de aproximadamente 50:150, de aproximadamente 50:200, de aproximadamente 50:283,5, de aproximadamente 50:450 o de aproximadamente 50:950.
La cantidad de una fuente de fucosa en un medio de cultivo que comprende la fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en la proporción predeterminada depende en gran medida de los componentes del sistema, tales como el tipo de célula huésped, número de células huésped, tasa de producción de proteínas y la proporción predeterminada de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa está entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 1 mM. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa está entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,06 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,04 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,03 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,02 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,06 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,04 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,03 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,06 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,04 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,6 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 0,06 mM, aproximadamente 0,06 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,06 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,06 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,06 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,07 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,07 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,07 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,08 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,08 mM y aproximadamente 0,9 mM o aproximadamente 0,09 mM y aproximadamente 0,1 mM. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es aproximadamente 0,01 mM, aproximadamente 0,02 mM, aproximadamente 0,03 mM, aproximadamente 0,04 mM, aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,06 mM, aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,11 mM, aproximadamente 0,12 mM, aproximadamente 0,13 mM, aproximadamente 0,14 mM, aproximadamente 0,15 mM, aproximadamente 0,16 mM, aproximadamente 0,17 mM, aproximadamente 0,18 mM, aproximadamente 0,19 mM, aproximadamente 0,2 mM, aproximadamente 0,3 mM, aproximadamente 0,4 mM, aproximadamente 0,5 mM, aproximadamente 0,6 mM, aproximadamente 0,7 mM, aproximadamente 0,8 mM, aproximadamente 0,9 mM o aproximadamente 1 mM.
También se proporcionan en el presente documento procedimientos de producción de una proteína que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN, comprendiendo los procedimientos: cultivar una célula huésped genomanipulada para expresar la proteína en un medio de cultivo, en los que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en los que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que contiene Fc que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN que comprende cultivar una célula huésped que no tiene sustancialmente actividad FX, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en un cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que contiene Fc que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN que comprende cultivar una célula huésped que no tiene sustancialmente actividad FX y genomanipulada para expresar la proteína que contiene Fc en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína que contiene Fc en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que contiene Fc que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para expresar la proteína que contiene Fc en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína que contiene Fc en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN que comprende cultivar una célula huésped genomanipulada para expresar el anticuerpo en un medio de cultivo, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas del anticuerpo en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para expresar un anticuerpo en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas del anticuerpo en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni GMD. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula CHO. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN que comprende cultivar una célula huésped que no tiene sustancialmente actividad FX, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína en una proporción que proporciona la función ADCc potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que contiene Fc que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos Nk como por leucocitos PMN que comprende cultivar una célula huésped que no tiene sustancialmente actividad FX, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en un cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que contiene Fc que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos Nk como por leucocitos p Mn que comprende cultivar una célula huésped que no tiene sustancialmente actividad FX y genomanipulada para expresar la proteína que contiene Fc en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína que contiene Fc en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una proteína que contiene Fc que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para expresar la proteína que contiene Fc en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína que contiene Fc en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN que comprende cultivar una célula huésped genomanipulada para expresar el anticuerpo en un medio de cultivo, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas del anticuerpo en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende cultivar una célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para expresar un anticuerpo en un medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas del anticuerpo en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula CHO. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
En algunos modos de realización, la función ADCC potenciada de una proteína es en comparación con una proteína producida a partir de un huésped natural sin un nivel reducido de actividad FX o GMD. En algunos modos de realización, la función ADCC potenciada de una proteína es en comparación con una forma fucosilada de la proteína. En algunos modos de realización, la función ADCC potenciada de una proteína es en comparación con una proteína natural. En algunos modos de realización, la función ADCC de una proteína se potencia aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces o 100 veces, en comparación con una proteína producida a partir de un huésped natural sin un nivel reducido de actividad FX o GMD.
En algunos modos de realización, la función ADCC se determina por un ensayo de ADCC. Los ensayos de ADCC y los procedimientos de determinación de la función ADCC son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Tada et al., PLoS One, 9, 2014, e95787; Cheng et al., J Immunol Methods, 414, 2014, 69-81. Por ejemplo, la función ADCC de una proteína se puede determinar incubando una proteína, tal como una proteína que contiene Fc, con una célula efectora que expresa un receptor de Fc en su superficie, tal como leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) o linfocitos citolíticos naturales (linfocitos NK) y células diana. Tras el acoplamiento de la región Fc de la proteína unida a una célula patológica diana con un receptor de Fc, el receptor de Fc transduce señales intracelulares dentro de la célula efectora dando como resultado la eliminación de la célula diana. Posteriormente, la lisis de la célula diana se mide por la liberación del marcador intracelular por un contador de centelleo o espectrofotometría. Entre estos procedimientos se incluyen los ensayos de liberación de cromo-51, ensayos de liberación de europio y ensayos de liberación de azufre-35. Por ejemplo, la lisis de la célula diana se puede evaluar, por ejemplo, midiendo la liberación de sondas específicas de células diana previamente marcadas, usando 51Cr o tintes fluorescentes, por ejemplo, calceína-AM44, éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-(y-6)-carboxifluoresceína (BCECF) o europio, o midiendo la liberación de enzimas citosólicas tales como lactato deshidrogenasa (LDH) o ATP. Otro ensayo para evaluar la función ADCC incluye, por ejemplo, un procedimiento bioluminiscente acoplado que mide la liberación de enzimas presentes de forma natural en las células diana (ACELLA™ TOX; Promega). No se requiere ninguna etapa de mareaje de células diana y no se usan agentes radioactivos.
En algunos modos de realización, la función ADCC de una proteína se determina por un ensayo de ADCC, en el que el ensayo de ADCC comprende linfocitos NK. En algunos modos de realización, la función ADCC de una proteína se determina por un ensayo de ADCC, en el que el ensayo de ADCC comprende PBMC. En algunos modos de realización, el ensayo de ADCC es un ensayo in vitro. En algunos modos de realización, el ensayo de ADCC es un ensayo in vivo.
En algunos modos de realización, la función ADCC se determina por un ensayo de unión a FCyIII. Véase, por ejemplo, Miller et al., J Immunol Methods, 385, 2012, 45-50. Se pueden usar procedimientos de unión indirectos para la evaluación de la función ADCC. En general, estos procedimientos miden la unión de la región determinante de la complementariedad (CDR) al antígeno diana de la superficie celular, y la unión de Fc a los FcyR, por separado o bien simultáneamente. Se pueden usar diversos formatos de citometría de flujo y basados en placas para los ensayos de unión a CDR y FcyR. Se han desarrollado ensayos de unión a receptor de proteína recombinante y de unión a C1q con una serie de plataformas, incluyendo ensayos de resonancia de plasmón superficial y de inmunoadsorción enzimática. En algunos modos de realización, la función ADCC se determina por medio de un ensayo basado en ELISA.
También se proporcionan procedimientos para ajustar un nivel de fucosilación de una proteína producida por una célula huésped genomanipulada para producir la proteína, comprendiendo los procedimientos: cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, en los que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en los que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación de la proteína; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que la proteína se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de una proteína producida por una célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir la proteína que comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación de la proteína; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que la proteína se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de una proteína que contiene Fc producida por una célula huésped genomanipulada para producir la proteína, que comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación de la proteína que contiene Fc; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que la proteína que contiene Fc se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de una proteína que contiene Fc producida por una célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir la proteína, que comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación de la proteína que contiene Fc; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que la proteína que contiene Fc se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de un anticuerpo producido por una célula huésped genomanipulada para producir el anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación del anticuerpo; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que el anticuerpo se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, el procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de un anticuerpo producido por una célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir el anticuerpo, comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación del anticuerpo; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que el anticuerpo se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni GMD. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula CHO. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de una proteína producida por una célula huésped que no tiene sustancialmente actividad FX y genomanipulada para producir la proteína que comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación de la proteína; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que la proteína se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de una proteína producida por una célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir la proteína que comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación de la proteína; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que la proteína se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de una proteína que contiene Fc producida por una célula huésped genomanipulada para producir la proteína, que comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación de la proteína que contiene Fc; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que la proteína que contiene Fc se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de una proteína que contiene Fc producida por una célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir la proteína, que comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación de la proteína que contiene Fc; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que la proteína que contiene Fc se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de un anticuerpo producido por una célula huésped genomanipulada para producir el anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación del anticuerpo; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que el anticuerpo se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, el procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de un anticuerpo producido por una célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir el anticuerpo, comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa; determinar el nivel de fucosilación del anticuerpo; y ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que el anticuerpo se produzca en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula CHO. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de determinación del nivel de fucosilación de la proteína que comprende determinar una forma fucosilada de la proteína. Los procedimientos de determinación de una forma fucosilada de una proteína se describen en la solicitud en el presente documento. En algunos modos de realización, determinar el nivel de fucosilación de la proteína comprende determinar una forma afucosilada de la proteína. Los procedimientos de determinación de una forma afucosilada de una proteína se describen en la solicitud en el presente documento. En algunos modos de realización, determinar el nivel de fucosilación de la proteína comprende determinar las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína.
En algunos modos de realización, el nivel de fucosilación y/o afucosilación se determina durante una etapa de cultivo. En algunos modos de realización, el nivel de fucosilación y/o afucosilación se determina más de una vez durante el cultivo de una célula huésped. En algunos modos de realización, la cantidad de una fuente de fucosa en un medio de cultivo se ajusta después de determinar un nivel de fucosilación y/o afucosilación. En algunos modos de realización, la cantidad de una fuente de fucosa no se ajusta después de determinar un nivel de fucosilación y/o afucosilación. En algunos modos de realización, la cantidad de la fuente de fucosa se ajusta más de una vez durante el cultivo de una célula huésped.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para ajustar una cantidad de una fuente de fucosa en un medio de cultivo inicial que comprende incrementar la cantidad de la fuente de fucosa cuando un nivel de fucosilación sea bajo. En algunos modos de realización, incrementar una cantidad de una fuente de fucosa en un medio de cultivo inicial comprende añadir una fuente de fucosa al medio de cultivo inicial por medio de la adición de un bolo. En algunos modos de realización, incrementar una cantidad de una fuente de fucosa en un medio de cultivo inicial comprende añadir un segundo medio de cultivo que comprende una fuente de fucosa al medio de cultivo inicial por medio de la adición de un bolo, en el que la cantidad de la fuente de fucosa en el segundo medio de cultivo es mayor que la cantidad de fucosa en el medio de cultivo inicial. En algunos modos de realización, incrementar una cantidad de una fuente de fucosa en un medio de cultivo inicial comprende añadir una fuente de fucosa al medio de cultivo inicial por medio de alimentación continua. En algunos modos de realización, incrementar una cantidad de una fuente de fucosa en un medio de cultivo inicial comprende añadir un segundo medio de cultivo que comprende la fuente de fucosa a un medio de cultivo inicial por medio de alimentación continua, en el que la cantidad de la fuente de fucosa en el segundo medio de cultivo es mayor que la cantidad de fucosa en el medio de cultivo inicial.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para ajustar una cantidad de una fuente de fucosa en un medio de cultivo inicial que comprende disminuir la cantidad de una fuente de fucosa en el medio de cultivo inicial cuando un nivel de fucosilación sea alto. En algunos modos de realización, disminuir una cantidad de una fuente de fucosa en un medio de cultivo inicial comprende añadir un segundo medio de cultivo que carece de una fuente de fucosa. En algunos modos de realización, disminuir la cantidad de la fuente de fucosa en un medio de cultivo inicial comprende añadir un segundo medio de cultivo que comprende un nivel reducido de una fuente de fucosa en comparación con el medio de cultivo inicial.
La presente solicitud, en algunos aspectos, proporciona procedimientos de comparación de la actividad biológica de formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína que comprenden: comparar la actividad biológica de una proteína afucosilada con una forma fucosilada de la proteína, en los que las formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína se producen por la misma célula huésped genomanipulada para producir la proteína, y en los que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de una proteína afucosilada con una forma fucosilada de una proteína, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína se producen por la misma célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir la proteína, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de una proteína que contiene Fc afucosilada con una forma fucosilada de la proteína que contiene Fc, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína que contiene Fc se producen por la misma célula huésped genomanipulada para producir la proteína que contiene Fc, y en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad Fx . En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de una proteína que contiene Fc afucosilada con una forma fucosilada de la proteína que contiene Fc, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína que contiene Fc se producen por la misma célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir la proteína que contiene Fc. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de un anticuerpo afucosilado con una forma fucosilada de un anticuerpo, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas del anticuerpo se producen por la misma célula huésped genomanipulada para producir el anticuerpo, y en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de un anticuerpo afucosilado con una forma fucosilada de un anticuerpo, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas del anticuerpo se producen por la misma célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir el anticuerpo. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni GMD. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula CHO. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de una proteína afucosilada con una forma fucosilada de una proteína, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína se producen por la misma célula huésped genomanipulada para producir la proteína, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de una proteína afucosilada con una forma fucosilada de una proteína, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína se producen por la misma célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir la proteína, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de una proteína que contiene Fc afucosilada con una forma fucosilada de la proteína que contiene Fc, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína que contiene Fc se producen por la misma célula huésped genomanipulada para producir la proteína que contiene Fc, y en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de una proteína que contiene Fc afucosilada con una forma fucosilada de la proteína que contiene Fc, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína que contiene Fc se producen por la misma célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir la proteína que contiene Fc. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de un anticuerpo afucosilado con una forma fucosilada de un anticuerpo, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas del anticuerpo se producen por la misma célula huésped genomanipulada para producir el anticuerpo, y en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de un anticuerpo afucosilado con una forma fucosilada de un anticuerpo, en el que las formas afucosiladas y fucosiladas del anticuerpo se producen por la misma célula huésped que tiene desactivación génica en FX y genomanipulada para producir el anticuerpo. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni GMD. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula CHO. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
La producción de formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína a partir de la misma célula huésped permite la generación de las formas de la proteína con atributos de calidad de producto similares y que se atribuyan las diferencias de actividad biológica entre las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína al estado de fucosilación.
En algunos modos de realización, la forma afucosilada de una proteína se produce por una célula huésped en un primer cultivo celular libre de una fuente de fucosa. En algunos modos de realización, la forma fucosilada de una proteína se produce por una célula huésped en un segundo cultivo celular que comprende una fuente de fucosa. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende: a) producir la forma afucosilada de una proteína cultivando una célula huésped en un primer cultivo celular libre de una fuente de fucosa, b) aislar la proteína afucosilada, c) producir la forma fucosilada de una proteína cultivando la célula huésped en un segundo cultivo celular que comprende una fuente de fucosa, d) aislar la proteína fucosilada, y e) comparar la actividad biológica de las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento que comprende comparar la actividad biológica de formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína, en el que la forma fucosilada de la proteína se produce en un primer cultivo celular, y en el que la forma afucosilada de la proteína se produce en un segundo cultivo celular.
En algunos modos de realización, las formas afucosiladas y fucosiladas de una proteína se producen por una célula huésped en un medio de cultivo que comprende una fuente de fucosa. En algunos modos de realización, la cantidad de una fuente de fucosa en el medio de cultivo está entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 1 mM. En general, si las formas afucosiladas y fucosiladas de una proteína se producen por una célula huésped en el mismo medio de cultivo, es necesario separar las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína. La separación de formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína se puede lograr usando, por ejemplo, técnicas de arrastre (pull-down) con LCA. Véanse, por ejemplo, Seth et al., Dev Dyn, 239, 2010, 3380-3390; y Jilani et al., J Histochem Cytochem, 2003, 51, 597-604.
La actividad biológica de las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína se puede comparar usando formas fucosiladas y afucosiladas aisladas de la proteína. En algunos modos de realización, la comparación de la actividad biológica se lleva a cabo in vitro. En algunos modos de realización, la comparación de la actividad biológica se lleva a cabo in vivo. En algunos modos de realización, la actividad biológica es una función ADCC. En algunos modos de realización, la función ADCC se determina por un ensayo de ADCC. Los ensayos de ADCC son bien conocidos en la técnica y se describen en la solicitud en el presente documento. En algunos modos de realización, la función ADCC se determina por un ensayo de ADCC indirecto. Los ensayos de ADCC indirectos son bien conocidos en la técnica y se describen en la solicitud en el presente documento. En algunos modos de realización, el ensayo de ADCC indirecto es un ensayo de unión a FCyRIII. En algunos modos de realización, la función ADCC se determina por un ensayo de unión a FCyRIII. Los ensayos de unión a FCyRIII son bien conocidos en la técnica y se describen en la solicitud en el presente documento.
La presente solicitud, en algunos aspectos, proporciona procedimientos de identificación de una célula huésped que puede producir formas fucosiladas y/o afucosiladas de una proteína.
Los procedimientos adecuados para identificar una célula huésped que puede producir formas fucosiladas y/o afucosiladas de una proteína son bien conocidos en la técnica. En algunos modos de realización, la identificación de una célula huésped que puede producir una proteína fucosilada se determina a nivel celular. En algunos modos de realización, la identificación de una célula huésped que puede producir una proteína afucosilada se determina a nivel celular. Por ejemplo, se pueden usar ensayos basados en aglutinina de Lens culinaris (LCA) para identificar una célula huésped que puede producir formas fucosiladas y/o afucosiladas de una proteína a nivel celular. Véase, por ejemplo, Okeley et al., PNAs , 110, 5404-5409. La LCA se une a los carbohidratos, tales como polisacáridos, con una fucosa central. La LCA marcada, tal como LCA conjugada con fluoresceína (FITC) (LCA-FITC), se puede usar para unir polisacáridos fucosilados en la superficie de una célula huésped. El uso posterior de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) se puede usar para identificar una célula huésped que puede producir formas fucosiladas y/o afucosiladas de una proteína. En algunos modos de realización, se realiza la identificación de una célula huésped que puede producir una forma fucosilada. En algunos modos de realización, se realiza la identificación de una célula huésped que puede producir una forma afucosilada de una proteína. En algunos modos de realización, se realiza la identificación de una célula huésped que puede producir las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína, en los que la célula huésped se evalúa después de que se cultiva en un medio de cultivo que comprende fucosa, y por separado, en los que la célula huésped se evalúa después de que se cultiva en un medio de cultivo que carece de fucosa.
En algunos modos de realización, la célula huésped que puede producir una forma fucosilada de una proteína se identifica por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En algunos modos de realización, la célula huésped que puede producir una forma afucosilada de una proteína se identifica por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En algunos modos de realización, la célula huésped que puede producir las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína se identifica por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En algunos modos de realización, la célula huésped que puede producir una forma fucosilada de una proteína se identifica por un ensayo basado en LCA. En algunos modos de realización, la célula huésped se tiñe con una aglutinina de Lens culinaris (LCA) conjugada con fluoresceína (FITC). En algunos modos de realización, la célula huésped que puede producir una forma afucosilada de una proteína se identifica por un ensayo basado en LCA. En algunos modos de realización, la célula huésped no se tiñe con una aglutinina de Lens culinaris (LCA) conjugada con fluoresceína (FITC).
La presente solicitud, en algunos aspectos, proporciona procedimientos de determinación de formas fucosiladas y/o afucosiladas de una proteína.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma fucosilada de una proteína se determina a nivel de estructura de polisacárido. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma afucosilada de una proteína se determina a nivel de estructura de polisacárido. Como se usa en el presente documento, "nivel de estructura de polisacárido" se refiere al análisis de fucosilación o afucosilación usando una estructura de polisacárido aislada. En general, los procedimientos de determinación de fucosilación o afucosilación a nivel de estructura de polisacárido implican escindir una estructura de polisacárido de una proteína. Los procedimientos para escindir la estructura de polisacárido de una proteína son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Szabo et al., Anal Chem, 82, 2010, 2588-2593; y Mulloy et al., Essentials of Glycobiology, 2.a edición, capítulo 47, 2009. En algunos modos de realización, la estructura de polisacárido se escinde por medio de escisión enzimática. En algunos modos de realización, la enzima es específica para una estructura de polisacárido unido a N. En algunos modos de realización, se usa PNGasa F para escindir una estructura de polisacárido de una proteína.
A continuación, se analizan las estructuras de los polisacáridos aislados para determinar la composición de la estructura del polisacárido, por ejemplo, la presencia o ausencia de fucosilación. Los procedimientos de análisis de estructuras de polisacárido son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Mulloy et al., Essentials of Glycobiology, 2.a edición, capítulo 47, 2009. En general, las mezclas de estructuras de polisacáridos se separarán, por ejemplo, por electroforesis capilar o cromatografía de líquidos de alta presión. A continuación, se usan procedimientos analíticos posteriores para identificar tipos de estructuras de polisacáridos presentes en una mezcla de estructuras de polisacáridos.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma fucosilada de una estructura de polisacárido se determina por electroforesis capilar (EC). En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma afucosilada de una estructura de polisacárido se determina por EC. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma fucosilada de una estructura de polisacárido se determina por espectrometría de masas (EM). En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma afucosilada de una estructura de polisacárido se determina por EM. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma fucosilada de una estructura de polisacárido se determina por resonancia magnética nuclear (RMN). En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma afucosilada de una estructura de polisacárido se determina por RMN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma fucosilada de una estructura de polisacárido se determina por centelleo, en el que la fucosa es una fucosa radiomarcada. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma afucosilada de una estructura de polisacárido se determina por un ensayo basado en marcaje, en el que un extremo reductor libre de la estructura de polisacárido se marca con una marca, tal como una marca fluorescente.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma fucosilada de una proteína se determina a nivel de proteína. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma afucosilada de una proteína se determina a nivel de proteína. Como se usa en el presente documento, "nivel de proteína" se refiere a un análisis de fucosilación o afucosilación usando una proteína unida a una estructura de polisacárido (por ejemplo, una glucoproteína). Los procedimientos para determinar formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína a nivel de proteína son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Balaguer y Neususs, Anal Chem, 78, 2006, 5384-5393. En algunos modos de realización, la forma fucosilada de una proteína se determina por espectrometría de masas (EM). En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma afucosilada de una proteína se determina por EM. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma fucosilada de una proteína se determina por EM de arriba hacia abajo. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma afucosilada de una proteína se determina por EM de arriba hacia abajo.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma fucosilada de una proteína se determina a nivel de estructura de polisacárido y a nivel de proteína. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento, en el que la forma afucosilada de una proteína se determina a nivel de estructura de polisacárido y a nivel de proteína.
Medio de cultivo y procedimientos de cultivo
Las células huésped usadas para producir una proteína deseada descrita en los modos de realización en el presente documento se pueden cultivar en una variedad de medios de cultivo. En general, se conocerá el contenido de fucosa de dichos medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como F10 de Ham (Sigma), medio esencial mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado de Dulbecco ((Dm EM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth Enz, 58, 1979, Barnes et al., Anal Biochem, 102, 1980, las patentes de EE. UU. n.os 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; las solicitudes de patente internacional n.os WO 90/03430 o WO 87/00195; o la reedición de la patente de EE. UU. n.° 30.985 se pueden usar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. En algunos modos de realización, el medio de cultivo comprende además una fuente de glucosa. En algunos modos de realización, el medio de cultivo comprende además una fuente de manosa. Cualquier otro complemento necesario también se puede incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica.
En algunos modos de realización, el medio de cultivo está libre de una fuente de fucosa. En algunos modos de realización, el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa. Como se usa en el presente documento, "fuente de fucosa" se refiere a un resto que comprende fucosa implicado en la vía de fucosilación. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa. En algunos modos de realización, el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa, en los que la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo está entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 1 mM. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa está entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 1 mM. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa está entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,06 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,04 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,03 mM, aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 0,02 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,06 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,04 mM, aproximadamente 0,02 mM y aproximadamente 0,03 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,06 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,03 mM y aproximadamente 0,04 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,6 mM, aproximadamente 0,04 mM y aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,05 mM y aproximadamente 0,06 mM, aproximadamente 0,06 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,06 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,06 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,06 mM y aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,07 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,07 mM y aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,07 mM y aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,08 mM y aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,08 mM y aproximadamente 0,9 mM o aproximadamente 0,09 mM y aproximadamente 0,1 mM. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es aproximadamente 0,01 mM, aproximadamente 0,02 mM, aproximadamente 0,03 mM, aproximadamente 0,04 mM, aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,06 mM, aproximadamente 0,07 mM, aproximadamente 0,08 mM, aproximadamente 0,09 mM, aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,11 mM, aproximadamente 0,12 mM, aproximadamente 0,13 mM, aproximadamente 0,14 mM, aproximadamente 0,15 mM, aproximadamente 0,16 mM, aproximadamente 0,17 mM, aproximadamente 0,18 mM, aproximadamente 0,19 mM, aproximadamente 0,2 mM, aproximadamente 0,3 mM, aproximadamente 0,4 mM, aproximadamente 0,5 mM, aproximadamente 0,6 mM, aproximadamente 0,7 mM, aproximadamente 0,8 mM, aproximadamente 0,9 mM o aproximadamente 1 mM.
Los procedimientos de cultivo de una célula huésped en un medio de cultivo son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Li et al., MAbs, 2, 2010. En algunos modos de realización, cultivar una célula huésped comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo libre de la fuente de fucosa antes de cultivar la célula huésped en el medio de cultivo que comprende la fuente de fucosa. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa está presente en el medio de cultivo al comienzo de la etapa de cultivo. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa se añade al medio de cultivo durante la etapa de cultivo. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa se añade a una densidad celular de, por ejemplo, al menos 2*105 células/ml. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa se añade a un nivel de oxígeno de, por ejemplo, un 50 % de O2 disuelto. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa se añade a un nivel de glucosa de, por ejemplo, 6 g/l. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa está presente en el medio de cultivo al comienzo de la etapa de cultivo, y en los que se añade una fuente de fucosa durante la etapa de cultivo. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa se añade al medio de cultivo durante la etapa de cultivo por medio de la adición de un bolo. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa se añade al medio de cultivo durante la etapa de cultivo por medio de alimentación continua. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa se añade al medio de cultivo por medio de la adición de un bolo. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa se añade al medio de cultivo por medio de alimentación continua. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, pueden ser las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica. En algunos modos de realización, la etapa de cultivo se lleva a cabo a menos de aproximadamente 37 °C, 36 °C, 35 °C, 34 °C, 33 °C, 32 °C, 31 °C o 30 °C. En algunos modos de realización, la etapa de cultivo se lleva a cabo a menos de aproximadamente 37 °C. En algunos modos de realización, la etapa de cultivo se lleva a cabo a menos de aproximadamente 34 °C. En algunos modos de realización, la etapa de cultivo se lleva a cabo a aproximadamente 37 °C. En algunos modos de realización, la etapa de cultivo se lleva a cabo a aproximadamente 34 °C. En algún modo de realización, la etapa de cultivo se lleva a cabo a una temperatura inicial y a continuación se cambia a una segunda temperatura. En algunos modos de realización, la temperatura inicial es de aproximadamente 37 °C y la segunda temperatura es de aproximadamente 34 °C. En algunos modos de realización, la temperatura inicial es de aproximadamente 34 °C y la segunda temperatura es de aproximadamente 37 °C.
En general, la producción de proteínas se realiza a gran escala (tal como a escala comercial). Para conseguir una población de una célula huésped adecuada para la producción a escala comercial, un experto en la técnica reconocerá la utilidad de usar un enfoque escalonado para expandir una población de células huésped. Por ejemplo, el procedimiento implica el crecimiento de una célula huésped deseada en una escala más pequeña para permitir un incremento en la población de células huésped, tal como una siembra en serie. Para incrementar además la población de la célula huésped, los procedimientos implicaban, en general, el uso de la siembra en serie para inocular un depósito de cultivo más grande, tal como un depósito de inóculo. A menudo, se usan una serie de depósitos de inóculo de tamaño creciente para expandir la población de una célula huésped, tal como una inoculación en serie. Este procedimiento proporcionará una población adecuada de una célula huésped para el cultivo en un cultivo de producción. En algunos modos de realización, el cultivo de producción es un depósito de cultivo de 1000 l.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de preparación de una proteína que comprende cultivar la célula huésped usando un procedimiento de alimentación por lotes. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de preparación de una proteína que comprende cultivar la célula huésped usando un procedimiento de alimentación continua. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de preparación de una proteína que contiene Fc que comprende cultivar la célula huésped usando un procedimiento de alimentación que comprende un procedimiento de alimentación por lotes y un procedimiento de alimentación continua.
La presente solicitud, en otros aspectos, proporciona un cultivo celular que comprende cualquier célula huésped descrita en los modos de realización en el presente documento y un medio de cultivo que comprende un nivel bajo de una fuente de fucosa. En algunos modos de realización, el cultivo celular puede comprender además las formas afucosiladas y fucosiladas de una proteína. En algunos modos de realización, el cultivo celular puede comprender además las formas afucosiladas y fucosiladas de una proteína en una proporción específica. En algunos modos de realización, se proporciona un cultivo celular que comprende una célula huésped genomanipulada para expresar una proteína, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y un medio de cultivo que comprende una fuente de fucosa a de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM. En algunos modos de realización, se proporciona un cultivo celular que comprende una célula huésped genomanipulada para expresar una proteína, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en los que la célula huésped es una célula huésped con supresión, y un medio de cultivo que comprende una fuente de fucosa a de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM. En algunos modos de realización, se proporciona un cultivo celular que comprende una célula huésped genomanipulada para expresar una proteína, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y un medio de cultivo que comprende una fuente de fucosa a de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM, en el que la proteína es una proteína que contiene Fc. En algunos modos de realización, se proporciona un cultivo celular que comprende una célula huésped genomanipulada para expresar una proteína, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad Fx , y en el que la célula huésped es una célula huésped con supresión, y un medio de cultivo que comprende una fuente de fucosa a de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM, en el que la proteína es una proteína que contiene Fc. En algunos modos de realización, se proporciona un cultivo celular que comprende una célula huésped genomanipulada para expresar una proteína, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y un medio de cultivo que comprende una fuente de fucosa a de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM, en el que la proteína es un anticuerpo. En algunos modos de realización, se proporciona un cultivo celular que comprende una célula huésped genomanipulada para expresar una proteína, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX, y en el que la célula huésped es una célula huésped con supresión, y un medio de cultivo que comprende una fuente de fucosa a de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM, en el que la proteína es un anticuerpo. En algunos modos de realización, se proporciona un cultivo celular que comprende una célula huésped que expresa formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni GMD. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula CHO. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
En algunos modos de realización, el cultivo celular mantiene una célula huésped en un entorno para su crecimiento. En algunos modos de realización, el cultivo celular mantiene una célula huésped en un entorno para la producción de una proteína. En algunos modos de realización, la proteína se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada.
En algunos modos de realización, el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa a de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM. En algunos modos de realización, el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa a de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 0,1 mM. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
En algunos modos de realización, el cultivo celular es un cultivo de siembra. En algunos modos de realización, el cultivo celular es un cultivo de inóculo. En algunos modos de realización, el cultivo de inóculo es un cultivo de inóculo primario. En algunos modos de realización, el cultivo de inóculo es un inóculo secundario. En algunos modos de realización, el sistema de cultivo celular comprende un cultivo de producción.
En algunos modos de realización, el cultivo celular se mantiene a una temperatura especificada. En algunos modos de realización, la temperatura especificada es de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 45 °C. En algunos modos de realización, la temperatura especificada es de aproximadamente 30 °C. En algunos modos de realización, la temperatura especificada es inferior a aproximadamente 37 °C. En algunos modos de realización, la temperatura especificada es inferior a aproximadamente 35 °C. En algunos modos de realización, la temperatura especificada es inferior a aproximadamente 34 °C.
En algunos modos de realización, el cultivo celular se mantiene a un pH especificado. En algunos modos de realización, el cultivo celular se mantiene a una concentración de oxígeno disuelto especificada. En algunos modos de realización, el cultivo celular se mantiene a un nivel de nutrientes especificado.
En algunos modos de realización, el sistema de cultivo celular comprende una proteína como se describe en los modos de realización en el presente documento. En algunos modos de realización, el cultivo celular comprende una pluralidad de proteínas como se describe en los modos de realización en el presente documento. En algunos modos de realización, el cultivo celular comprende una composición que comprende una proteína como se describe en los modos de realización en el presente documento.
Células huésped
La presente solicitud proporciona, en algunos aspectos, una célula huésped para la expresión de una proteína, en la que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX.
Entre las células huésped que se pueden emplear están las células eucariotas, tales como las células de levadura o eucariotas superiores. Las células eucariotas superiores incluyen células de insecto y líneas celulares establecidas de origen mamífero.
Los ejemplos de célula huésped de mamífero adecuada incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell, 23, 1981), células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO) o sus derivados tales como Veggie CHO y líneas celulares relacionadas que crecen en medios sin suero (Rasmussen et al., Cytotechnology, 28, 1998), células HeLa, líneas celulares de BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CVI/EBNA derivada de la línea celular CVI de riñón de mono verde africano (ATCC CCL 70) como se describe por McMahan et al., EMBO J, 10, 1991, células de riñón embrionario humano tales como 293, 293 de EBNA o MSR293, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, otras líneas celulares de primate transformadas, células diploides normales, estirpes celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HL-60, U937, HaK o Jurkat. Opcionalmente, por ejemplo, se pueden usar líneas celulares de mamífero tales como HepG2/3B, KB, NIH 3T3 o S49 como células huésped.
En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula CHO. Las células CHO son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Xu et al., Nat Biotechnol, 29, 2011. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped DP12. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped DP12 carente de DHFR derivada de DUXB-11. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped CHO-K1. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped CHO-K1 positiva para DHFR. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped CHOK1M.
En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped de ratón. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped Sp2/0. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped NS0.
En algunos modos de realización, la célula huésped es un hibridoma. En algunos modos de realización, el hibridoma es una célula productora de anticuerpos, en el que la célula productora de anticuerpos se recoge de un huésped tras la inmunización del huésped con un antígeno. En algunos modos de realización, la célula productora de anticuerpos se fusiona con una célula de mieloma. En algunos modos de realización, la célula huésped es una línea celular derivada de mieloma de ratón.
De forma alternativa, la célula huésped puede ser una eucariota inferior, tal como una levadura. Las levaduras adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, cándida o cualquier cepa de levadura que pueda expresar polipéptidos heterólogos.
Como se usa en el presente documento, "sustancialmente sin actividad FX o sustancialmente sin actividad GMD", se refiere a una célula huésped que no comprende más de un 40 % de actividad FX o GMD en comparación con una célula huésped que comprende un gen de FX o GMD natural, respectivamente, sin inactivación. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende no más de un 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de actividad FX o GMD en comparación con una célula huésped que comprende un gen de FX o GMD natural, respectivamente, sin inactivación. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende no más de un 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de actividad FX en comparación con una célula huésped que comprende un gen de FX natural sin inactivación. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende actividad FX en comparación con una célula huésped que comprende un gen de FX natural sin inactivación. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende no más de un 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de actividad GMD en comparación con una célula huésped que comprende un gen de GMD natural sin inactivación. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende actividad GMD en comparación con una célula huésped que comprende un gen de GMD natural sin inactivación. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende no más de un 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de actividad FX y GMD en comparación con una célula huésped que comprende un gen de FX y GMD natural sin inactivación. En algunos modos de realización, la célula huésped no comprende ni actividad FX ni GMD en comparación con una célula huésped que comprende un gen de FX y GMD natural sin inactivación.
FX y GMD son enzimas que pertenecen a la vía de rescate y producen GPD-fucosa a partir de L-fucosa. Véase, Becker y Lowe, et al., Biochim Biophys Acta, 1455, 1999, 193-204. En el citosol, FX convierte L-fucosa en L-fucosa-1-fosfato y GMD convierte L-fucosa-1-fosfato en GPD-fucosa. A continuación, la GPD-fucosa se transporta a la luz del aparato de Golgi donde sirve como sustrato usado para fucosilar la estructura del polisacárido.
En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD en una célula huésped está inactivado. Como se usa en el presente documento, "inactivado" se refiere a inhibir la traducción, o la potencial traducción futura, de un gen funcional (es decir, la expresión de una enzima funcional). La inactivación se puede producir en cualquier fase o proceso de la expresión génica, incluyendo, pero sin limitarse a, la transcripción, traducción y expresión de proteínas, y la inactivación puede afectar a cualquier gen o producto génico, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN, ARN, tal como ARNm, y polipéptidos.
En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD en la célula huésped está inactivado, en el que la actividad FX o GMD se basa en un nivel de ADN. En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD en la célula huésped está inactivado, en el que la actividad FX o GMD se basa en un nivel de ARN. En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD en la célula huésped está inactivado, en el que la actividad FX o GMD se basa en un nivel de polipéptido.
En la presente solicitud también se proporcionan procedimientos de producción de una célula huésped con supresión. Por ejemplo, los procedimientos incluyen, pero no se limitan al uso de sistemas CRISPR, TALEN, ZFN y meganucleasa. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una deleción génica o una adición o sustitución génica.
En general, los procedimientos de producción de una célula huésped que no comprende sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD comprenden inactivar el gen de FX o GMD de la célula huésped. Los procedimientos y técnicas para inactivar el gen de FX o GMD en una célula huésped incluyen, pero no se limitan a, ARN interferente pequeño (ARNip), ARN horquillado pequeño (ARNhp; también denominado ARN horquillado corto), repeticiones palindrómicas cortas agrupadas, regularmente espaciadas (CRISPR), nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN), nucleasa con dedos de cinc (ZFN), recombinación homóloga, unión de extremos no homólogos, meganucleasa e inhibición enzimática. Véanse, por ejemplo, O'Keefe, Mater Methods, 3, 2013; Doench et al., Nat Biotechnol, 32, 2014; Gaj et al., Trends Biotechnol, 31, 2014; y Silva et al., Curr Gene Ther, 11, 2011.
En general, el sistema CRISPR usado en el presente documento puede comprender una proteína caspasa, tal como Cas9, y una secuencia de ARN que comprende una secuencia de nucleótidos, denominada secuencia guía, que es complementaria a una secuencia de interés. La caspasa y la secuencia de ARN forman un complejo que identifica una secuencia de ADN de una célula huésped y, posteriormente, la actividad nucleasa de la caspasa permite la escisión de la hebra de ADN. Los isotipos de caspasas tienen actividad nucleasa de ADN monocatenario o ADN bicatenario. El diseño de secuencias de ARN guía y el número de secuencias de ARN guía usadas en un sistema CRISPR permiten la retirada de un tramo específico de un gen y/o la adición de una secuencia de ADN.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de Fx o GMD usando un sistema CRISPR. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende un vector codificante. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende un vector codificante que comprende un gen de ADN endonucleasa. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o g Md usando un sistema CRISPR que comprende un vector codificante que comprende un gen de CAS. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende un vector codificante que comprende un gen de CAS9. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende un vector codificante que codifica un gen de CAS9. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende una proteína Cas. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende una proteína Cas9. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar un gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende un vector codificante que codifica una molécula de ARN que puede interactuar con la proteína Cas9. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende un vector codificante que codifica una molécula de ARN que comprende una unidad de ARN guía (ARNg), en el que la unidad de ARNg comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de una secuencia génica de FX o g Md . En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende una molécula de ARN que comprende una unidad de ARNg, en el que la unidad de ARNg comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de una secuencia génica de FX o GMD. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o g Md usando un sistema CRISPR que comprende un vector codificante que codifica una molécula de ARN que comprende una unidad de ARNcr transactivador (ARNcrtra). En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende una molécula de ARN que comprende una unidad de ARNcrtra. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende un vector codificante que codifica una molécula de ARN que comprende una unidad de ARNg y una unidad de ARNcrtra, en la que la unidad de ARNg comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de una secuencia génica. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende una molécula de ARN que comprende una unidad de ARNg y una unidad de ARNcrtra, en la que la unidad de ARNg comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de una secuencia génica de FX o GMD. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema CRISPR que comprende: a) una primera molécula de ARN que comprende una unidad de ARNg, en la que la unidad de ARNg comprende una primera secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de una secuencia génica de FX o GMD; y b) una segunda molécula de ARN que comprende una unidad de ARNg, en la que la unidad de ARNg comprende una segunda secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de una secuencia génica de FX o GMD. En algunos modos de realización, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos son diferentes. En algunos modos de realización, la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a una porción de una secuencia génica de FX o GMD que está en una localización diferente a la región de la porción del gen de FX o GMD que es complementaria a la segunda secuencia de nucleótidos.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema CRISPR en la célula huésped. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un vector que comprende un sistema CRISPR usando un vector de inserción. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un vector de virus. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un lentivirus. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un adenovirus. En algunos modos de realización, el vector comprende un activador.
En general, el sistema TALEN usado en el presente documento puede comprender una o más nucleasas de restricción y dos o más complejos de proteínas que permiten el reconocimiento de una secuencia de ADN y la posterior escisión del ADN bicatenario. Un complejo de proteínas del sistema TALEN comprende una serie de efectores de tipo activador de la transcripción (TALE), que reconoce cada uno un nucleótido específico, y un dominio de una nucleasa de restricción. En general, un sistema TALEN se diseña de modo que dos complejos de proteínas, que comprende cada uno los TALE y un dominio de una nucleasa de restricción, se unirán individualmente a las secuencias de ADN de una manera que permita que los dos dominios (uno de cada complejo de proteínas) de una nucleasa de restricción formen una nucleasa activa y escindan una secuencia de ADN específica. El diseño de un número de complejos de proteínas y secuencias que se van a escindir en un sistema TALEN permite la retirada de un tramo específico de un gen y/o la adición de una secuencia de ADN.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped tiene un nivel reducido de actividad FX o GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema TALEN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o g Md usando un sistema TALEN que comprende una primera unidad de TALEN. En algunos modos de realización, la primera unidad de TALEN comprende una primera unidad de unión de TALEN. En algunos modos de realización, la primera unidad de unión de TALEN comprende al menos un efector de tipo activador de la transcripción (TALE) y un primer dominio nucleasa. En algunos modos de realización, la primera unidad de unión de TALEN comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 TALE y un primer dominio de nucleasa, en la que los TALE se enlazan entre sí, y en la que los TALE enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD. En algunos modos de realización, la primera unidad de unión de TALEN comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 TALE y un primer dominio de nucleasa, en la que los TALE se enlazan entre sí, en la que los TALE enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD, y en la que los TALE enlazados se enlazan además al primer dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la primera unidad de TALEN comprende además una segunda unidad de unión de TALEN. En algunos modos de realización, la segunda unidad de unión de TALEN comprende al menos un efector de tipo activador de la transcripción (TALE) y un segundo dominio nucleasa. En algunos modos de realización, la segunda unidad de unión de TALEN comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 TALE y un segundo dominio de nucleasa, en la que los TALE se enlazan entre sí, y en la que los TALE enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD. En algunos modos de realización, la segunda unidad de unión de TALEN comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 TALE y un segundo dominio de nucleasa, en la que los TALE se enlazan entre sí, en la que los TALE enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD, y en la que los TALE enlazados se enlazan además al segundo dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la primera unidad de unión de TALEN y la segunda unidad de unión de TALEN se unen a diferentes secuencias del gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, el primer dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa. En algunos modos de realización, el primer dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa de restricción. En algunos modos de realización, el primer dominio de nucleasa es un dominio de Fok1. En algunos modos de realización, el segundo dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa. En algunos modos de realización, el segundo dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa de restricción. En algunos modos de realización, el segundo dominio de nucleasa es un dominio de Fok1. En algunos modos de realización, el primer dominio de nucleasa y el segundo dominio de nucleasa se asocian para comprender una endonucleasa de restricción activa. En algunos modos de realización, el primer dominio de nucleasa y el segundo dominio de nucleasa se asocian para comprender una enzima Fok1 activa.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema TALEN que comprende además una segunda unidad de TALEN. En algunos modos de realización, la segunda unidad de TALEN comprende una tercera unidad de unión de TALEN. En algunos modos de realización, la tercera unidad de unión de TALEN comprende al menos un efector de tipo activador de la transcripción (TALE) y un tercer dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la tercera unidad de unión de TALEN comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 TALE y un tercer dominio de nucleasa, en la que los TALE se enlazan entre sí, y en la que los TALE enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD. En algunos modos de realización, la tercera unidad de unión de TALEN comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 TALE y un tercer dominio de nucleasa, en la que los TALE se enlazan entre sí, en la que los TALE enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD, y en la que los TALE enlazados se enlazan además al tercer dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la segunda unidad de TALEN comprende además una cuarta unidad de unión de TALEN. En algunos modos de realización, la cuarta unidad de unión de TALEN comprende al menos un efector de tipo activador de la transcripción (TALE) y un cuarto dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la cuarta unidad de unión de TALEN comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 TALE y un cuarto dominio de nucleasa, en la que los TALE se enlazan entre sí, y en la que los TALE enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD. En algunos modos de realización, la cuarta unidad de unión de TALEN comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 TALE y un cuarto dominio de nucleasa, en la que los TALE se enlazan entre sí, en la que los TALE enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD, y en la que los TALE enlazados se enlazan además al cuarto dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la tercera unidad de unión de TALEN y la cuarta unidad de unión de TALEN se unen a diferentes secuencias del gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, el tercer dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa. En algunos modos de realización, el tercer dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa de restricción. En algunos modos de realización, el tercer dominio de nucleasa es un dominio de Fok1. En algunos modos de realización, el cuarto dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa. En algunos modos de realización, el cuarto dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa de restricción. En algunos modos de realización, el cuarto dominio de nucleasa es un dominio de Fok1. En algunos modos de realización, el tercer dominio de nucleasa y el cuarto dominio de nucleasa se asocian para comprender una endonucleasa de restricción activa. En algunos modos de realización, el tercer dominio de nucleasa y el cuarto dominio de nucleasa se asocian para comprender una enzima Fok1 activa.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema TALEN, en el que el sistema TALEN comprende una primera unidad de TALEN y una segunda unidad de TALEN que se unen a porciones diferentes, que no se superponen, de una secuencia génica de FX o GMD.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema TALEN, en el que el sistema TALEN comprende un vector codificante que codifica una primera unidad de TALEN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema TALEN, en el que el sistema TALEN comprende un vector codificante que codifica una primera unidad de TALEN, en el que el sistema TALEN comprende un vector codificante que codifica una segunda unidad de TALEN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema TALEN, en el que el sistema TALEN comprende un vector codificante que codifica una primera unidad de TALEN, en el que el sistema TALEN comprende un vector codificante que codifica una primera unidad de TALEN y una segunda unidad de TALEN.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema TALEN, en el que el sistema TALEN comprende una primera unidad de TALEN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema TALEN, en el que el sistema TALEN comprende una segunda unidad de TALEN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema TALEN, en el que el sistema TALEN comprende una primera unidad de TALEN y una segunda unidad de TALEN.
En algunos modos de realización, la primera unidad de unión de TALEN comprende un grupo de TALE enlazados, en el que el grupo de TALE reconoce una secuencia de nucleótidos. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos es una secuencia que comprende una porción de un gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos es una secuencia que comprende una porción de un activador del gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos es una secuencia que comprende una porción de una secuencia que flanquea un gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % homóloga a una porción de un gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % homóloga a una porción de un activador del gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % homóloga a una porción de una secuencia que flanquea un gen de FX o GMD.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema TALEN en la célula huésped. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un vector que comprende un sistema TALEN usando un vector de inserción. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un vector de virus. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un lentivirus. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un adenovirus.
En general, el sistema ZFN usado en el presente documento puede comprender una o más nucleasas de restricción y dos o más complejos de proteínas que permiten el reconocimiento de una secuencia de ADN y la posterior escisión del ADN bicatenario. Un complejo de proteínas del sistema ZFN comprende una serie de dedos de cinc, que reconoce cada uno un codón de nucleótido específico, y un dominio de una nucleasa de restricción. En general, un sistema ZFN se diseña de modo que dos complejos de proteínas, que comprende cada uno dedos de cinc y un dominio de una nucleasa de restricción, se unirán individualmente a las secuencias de ADN de una manera que permita que los dos dominios (uno de cada complejo de proteínas) de una nucleasa de restricción formen una nucleasa activa y escindan una secuencia de ADN específica. El diseño de un número de complejos de proteínas y secuencias que se van a escindir en un sistema ZFN permite la retirada de un tramo específico de un gen y/o la adición de una secuencia de ADN.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema ZFN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema ZFN que comprende una primera unidad de ZFN. En algunos modos de realización, la primera unidad de ZFN comprende una primera unidad de unión de ZFN. En algunos modos de realización, la primera unidad de unión de ZFN comprende al menos un dedo de cinc y un primer dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la primera unidad de unión de ZFN comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dedos de cinc y un primer dominio de nucleasa, en la que los dedos de cinc se enlazan entre sí y en la que los dedos de cinc enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD. En algunos modos de realización, la primera unidad de unión de ZFN comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dedos de cinc y un primer dominio de nucleasa, en la que los dedos de cinc se enlazan entre sí, en la que los dedos de cinc enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD, y en la que los dedos de cinc enlazados se enlazan además al primer dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la primera unidad de ZFN comprende además una segunda unidad de unión de ZFN. En algunos modos de realización, la segunda unidad de unión de ZFN comprende al menos un dedo de cinc y un segundo dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la segunda unidad de unión de ZFN comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dedos de cinc y un segundo dominio de nucleasa, en la que los dedos de cinc se enlazan entre sí y en la que los dedos de cinc enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD. En algunos modos de realización, la segunda unidad de unión de ZFN comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dedos de cinc y un segundo dominio de nucleasa, en la que los dedos de cinc se enlazan entre sí, en la que los dedos de cinc enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD, y en la que los dedos de cinc enlazados se enlazan además al segundo dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la primera unidad de unión de ZFN y la segunda unidad de unión de ZFN se unen a diferentes secuencias del gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, el primer dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa. En algunos modos de realización, el primer dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa de restricción. En algunos modos de realización, el primer dominio de nucleasa es un dominio de Fok1. En algunos modos de realización, el segundo dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa. En algunos modos de realización, el segundo dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa de restricción. En algunos modos de realización, el segundo dominio de nucleasa es un dominio de Fok1. En algunos modos de realización, el primer dominio de nucleasa y el segundo dominio de nucleasa se asocian para comprender una endonucleasa de restricción activa. En algunos modos de realización, el primer dominio de nucleasa y el segundo dominio de nucleasa se asocian para comprender una enzima Fok1 activa.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o g Md usando un sistema ZFN que comprende además una segunda unidad de ZFN. En algunos modos de realización, la segunda unidad de ZFN comprende una tercera unidad de unión de ZFN. En algunos modos de realización, la tercera unidad de unión de ZFN comprende al menos un dedo de cinc y un tercer dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la tercera unidad de unión de ZFN comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dedos de cinc y un tercer dominio de nucleasa, en la que los dedos de cinc se enlazan entre sí y en la que los dedos de cinc enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD. En algunos modos de realización, la tercera unidad de unión de ZFN comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dedos de cinc y un tercer dominio de nucleasa, en la que los dedos de cinc se enlazan entre sí, en la que los dedos de cinc enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD, y en la que los dedos de cinc enlazados se enlazan además al tercer dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la segunda unidad de ZFN comprende además una cuarta unidad de unión de ZFN. En algunos modos de realización, la cuarta unidad de unión de ZFN comprende al menos un dedo de cinc y un cuarto dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la cuarta unidad de unión de ZFN comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dedos de cinc y un cuarto dominio de nucleasa, en la que los dedos de cinc se enlazan entre sí, y en la que los dedos de cinc enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD. En algunos modos de realización, la cuarta unidad de unión de ZFN comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dedos de cinc y un cuarto dominio de nucleasa, en la que los dedos de cinc se enlazan entre sí, en la que los dedos de cinc enlazados reconocen una porción de una secuencia de nucleótidos de FX o GMD, y en la que los dedos de cinc enlazados se enlazan además al cuarto dominio de nucleasa. En algunos modos de realización, la tercera unidad de unión de ZFN y la cuarta unidad de unión de ZFN se unen a diferentes secuencias del gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, el tercer dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa. En algunos modos de realización, el tercer dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa de restricción. En algunos modos de realización, el tercer dominio de nucleasa es un dominio de Fok1. En algunos modos de realización, el cuarto dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa. En algunos modos de realización, el cuarto dominio de nucleasa es un dominio de una endonucleasa de restricción. En algunos modos de realización, el cuarto dominio de nucleasa es un dominio de Fok1. En algunos modos de realización, el tercer dominio de nucleasa y el cuarto dominio de nucleasa se asocian para comprender una endonucleasa de restricción activa. En algunos modos de realización, el tercer dominio de nucleasa y el cuarto dominio de nucleasa se asocian para comprender una enzima Fok1 activa.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema ZFN, en el que el sistema ZFN comprende una primera unidad de ZFN y una segunda unidad de TALEN que se unen a porciones diferentes, que no se superponen, de una secuencia génica de FX o GMD.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema ZFN, en el que el sistema ZFN comprende un vector codificante que codifica una primera unidad de ZFN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, comprende inactivar el gen de Fx o GMD usando un sistema ZFN, en el que el sistema ZFN comprende un vector codificante que codifica una primera unidad de ZFN, en el que el sistema ZFN comprende un vector codificante que codifica una segunda unidad de ZFN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema ZFN, en el que el sistema ZFN comprende un vector codificante que codifica una primera unidad ZFN, en el que el sistema ZFN comprende un vector codificante que codifica una primera unidad de ZFN y una segunda unidad de ZFN.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema ZFN, en el que el sistema ZFN comprende una primera unidad de ZFN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema ZFN, en el que el sistema ZFN comprende una segunda unidad de ZFN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema ZFN, en el que el sistema ZFN comprende una primera unidad de ZFN y una segunda unidad de ZFN.
En algunos modos de realización, la primera unidad de unión de ZFN comprende un grupo de dedos de cinc enlazados, en la que el grupo de dedos de cinc reconoce una secuencia de nucleótidos. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos es una secuencia que comprende una porción de un gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos es una secuencia que comprende una porción de un activador del gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos es una secuencia que comprende una porción de una secuencia que flanquea un gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % homóloga a una porción de un gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % homóloga a una porción de un activador del gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % homóloga a una porción de una secuencia que flanquea un gen de FX o GMD.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema ZFN en la célula huésped. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un vector que comprende un sistema ZFN usando un vector de inserción. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un vector de virus. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un lentivirus. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un adenovirus.
En general, el sistema de meganucleasas usado en el presente documento puede comprender una o más meganucleasas que permiten el reconocimiento de una secuencia de ADN y la posterior escisión del ADN bicatenario.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de meganucleasa. En algunos modos de realización, la meganucleasa tiene una secuencia de reconocimiento de ADN que tiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 35 pares de bases de nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, la meganucleasa tiene una secuencia de reconocimiento de ADN que tiene de aproximadamente 12 a aproximadamente 30 pares de bases de nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, la secuencia de reconocimiento de ADN es una secuencia que comprende una porción de un gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia de reconocimiento de ADN es una secuencia que comprende una porción de un activador del gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia de reconocimiento de ADN es una secuencia que comprende una porción de una secuencia que flanquea un gen de FX o GMD.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema de meganucleasa en la célula huésped. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un vector que comprende un sistema de meganucleasa usando un vector de inserción. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un vector de virus. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un lentivirus. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un adenovirus.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no tiene sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende además determinar un nivel de actividad FX o GMD. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD, en el que se detecta una deleción génica de FX o GMD. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD, en el que se detecta una adición o sustitución génica de FX o GMD. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD, en el que se determina un nivel de expresión de FX o GMD antes de inactivar un gen en una célula huésped. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad Fx o GMD, en el que se determina un nivel de actividad FX o GMD después de usar un sistema CRISPR para inactivar el gen de FX o GMD en una célula huésped. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD, en el que se determina un nivel de actividad FX o g Md después de usar un sistema TALEN para inactivar el gen de FX o GMD en una célula huésped. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD, en el que se determina un nivel de actividad FX o g Md después de usar un sistema ZFN para inactivar el gen de FX o GMD en una célula huésped. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de inactivación del gen de FX o GMD, en el que se determina un nivel de actividad FX o GMD después de usar un sistema de meganucleasa para inactivar el gen de FX o GMD en una célula huésped.
En algunos de los procedimientos divulgados en el presente documento, el nivel de actividad FX o GMD se determina a nivel de ADN. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se determina a nivel de ARN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando PCR. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando PCR, en el que se detecta una secuencia variante. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando qPCR. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando qPCR.
En algunos de los procedimientos divulgados en el presente documento, el nivel de actividad FX o GMD se puede determinar a nivel de proteína. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando inmunohistoquímica. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando inmunoelectrotransferencia. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende determinar el nivel de actividad Fx o GMD usando citometría de flujo.
En algunos modos de realización, el nivel de inactivación del gen de FX o GMD se determina comparando el nivel de actividad FX o GMD después de la inactivación del gen de FX o GMD con un valor de control. En algunos modos de realización, el nivel de inactivación del gen de FX o GMD se determina comparando un nivel de actividad FX o GMD después de la inactivación del gen de FX o GMD con un nivel de actividad FX o GMD antes de la inactivación del gen de FX o GMD.
En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD se inactiva por un sistema de ARN interferente pequeño (ARNip), en el que una célula huésped comprenderá el sistema ARNip.
En algunos modos de realización, el sistema de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos de ARNip que tiene aproximadamente de 10 a 200 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 100 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 100 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 60 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 60 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 50 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 50 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 30 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 30 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos de ARNip tiene aproximadamente 10-25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos de ARNip tiene aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos de ARNip tiene al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20 o al menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, el sistema de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % complementaria a una región de una molécula de ARNm de FX o GMD. En algunos modos de realización, el sistema de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % complementaria a una región de una molécula de pro-ARNm de FX o GMD. En algunos modos de realización, el sistema de ARNip comprende una molécula de ARN bicatenaria. En algunos modos de realización, el sistema de ARNip comprende una molécula de ARN monocatenaria. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un sistema de ARNip como se describe en cualquiera de los modos de realización en el presente documento. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una secuencia de nucleótidos de pro-ARNip que se procesa para producir una molécula de ARNip activa como se describe en cualquiera de los modos de realización en el presente documento. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una secuencia de nucleótidos de ARNip que es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % complementaria a una región de una molécula de ARNm de FX o GMD. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un vector de expresión que codifica una molécula de ARNip como se describe en cualquiera de los modos de realización en el presente documento. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un vector de expresión que codifica una molécula de pro-ARNip como se describe en cualquiera de los modos de realización en el presente documento.
En algunos modos de realización, el sistema de ARNip comprende un vector de inserción. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un vector de inserción. En algunos modos de realización, el vector de inserción comprende la molécula de pro-ARNip y/o ARNip.
En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD se inactiva por un sistema de ARN horquillado pequeño (ARNhp; también denominado ARN horquillado corto), en el que una célula huésped comprenderá el sistema de ARNhp. La inactivación de genes por sistemas de ARNhp es bien conocida en la técnica. En algunos modos de realización, el sistema de ARNhp comprende una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente de 10 a 200 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 100 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 100 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 60 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 60 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 50 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 50 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 30 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 30 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos de ARNhp tiene aproximadamente 10-25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos de ARNhp tiene aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos de ARNhp tiene al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20 o al menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, el sistema de ARNhp comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % complementaria a una región de una molécula de ARNm de FX o GMD. En algunos modos de realización, el sistema de ARNhp comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % complementaria a una región de una molécula de pro-ARNm de FX o GMD. En algunos modos de realización, el sistema de ARNhp comprende una molécula de ARN bicatenaria. En algunos modos de realización, el sistema de ARNhp comprende una molécula de ARN monocatenaria. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un sistema de ARNhp como se describe en cualquiera de los modos de realización en el presente documento. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una secuencia de nucleótidos de pre-ARNhp que se procesa para producir una secuencia de nucleótidos de ARNhp activa como se describe en cualquiera de los modos de realización en el presente documento. En algunos modos de realización, la molécula de pro-ARNhp está compuesta por ADN. En algunos modos de realización, la molécula de pro-ARNhp es una construcción de ADN. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una secuencia de nucleótidos de ARNhp que es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % complementaria a una región de una molécula de ARNm de FX o GMD. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un vector de expresión que codifica una molécula de ARNhp como se describe en cualquiera de los modos de realización en el presente documento. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un vector de expresión que codifica una molécula de pro-ARNhp como se describe en cualquiera de los modos de realización en el presente documento.
En algunos modos de realización, el sistema de ARNhp comprende un vector de inserción. En algunos modos de realización, el huésped comprende un vector de inserción. En algunos modos de realización, el vector de inserción comprende la molécula de pro-ARNhp y/o ARNhp.
En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD se inactiva, en el que una célula huésped comprende una deleción génica. Como se usa en el presente documento, "deleción génica" se refiere a la retirada de al menos una porción de una secuencia de ADN, tal como un único ácido nucleico, de, o en las proximidades de, un gen. En algunos modos de realización, la secuencia sometida a deleción génica comprende una secuencia exónica de un gen. En algunos modos de realización, la secuencia sometida a deleción génica comprende una secuencia activadora de un gen. En algunos modos de realización, la secuencia sometida a deleción génica comprende una secuencia flanqueante de un gen. En algunos modos de realización, una porción de una secuencia génica se retira de un gen. En algunos modos de realización, una porción de la secuencia génica de FX o GMD se retira de, o en las proximidades de, el gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la secuencia génica completa se retira de un cromosoma. En algunos modos de realización, la secuencia de FX o GMD completa se retira de un cromosoma. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una deleción génica como se describe en cualquiera de los modos de realización en el presente documento. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una deleción génica en el gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una deleción génica en las proximidades del gen de FX o GMD.
En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD se inactiva, en el que una célula huésped comprende una adición o sustitución génica. Como se usa en el presente documento, "adición génica" o "sustitución génica" se refiere a una alteración de una secuencia génica, que incluye la inserción o sustitución de uno o más nucleótidos o pares de bases de nucleótidos. En algunos modos de realización, se altera la secuencia intrónica del gen. En algunos modos de realización, se altera la secuencia exónica del gen. En algunos modos de realización, se altera la secuencia activadora del gen. En algunos modos de realización, se altera la secuencia flanqueante del gen. En algunos modos de realización, se añade un nucleótido o un par de bases de nucleótidos a una secuencia genética. En algunos modos de realización, se añade al menos un nucleótido o un par de bases de nucleótidos consecutivo a una secuencia génica. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una adición o sustitución génica como se describe en cualquiera de los modos de realización en el presente documento. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una adición génica o una sustitución génica en el gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una adición génica o una sustitución génica en el gen de FX y GMD.
En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD se inactiva por una deleción génica, en el que la deleción de al menos un nucleótido o un par de bases de nucleótido en una secuencia génica da como resultado un producto génico no funcional. En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD se inactiva por una deleción génica, en el que la deleción de al menos un nucleótido en una secuencia génica da como resultado un producto génico que ya no tiene la función o actividad del producto génico original. En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD se inactiva por una deleción génica, en el que la deleción de al menos un nucleótido en una secuencia génica da como resultado un producto génico disfuncional.
En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD se inactiva por una adición o sustitución génica, en el que la adición o sustitución de al menos un nucleótido o un par de bases de nucleótidos en la secuencia génica de FX o GMD da como resultado un producto génico no funcional. En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD se inactiva por una inactivación génica, en el que la incorporación o sustitución de al menos un nucleótido en la secuencia génica de FX o GMD da como resultado un producto génico que ya no tiene la función o actividad del producto génico original. En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD se inactiva por una adición o sustitución génica, en el que la incorporación o sustitución de al menos un nucleótido en la secuencia génica de FX o GMD da como resultado un producto génico disfuncional.
En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un producto génico de FX o GMD no funcional. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un producto génico de FX o GMD que no tiene la función o actividad del producto génico de FX o GMD original, respectivamente. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un producto génico de FX o GMD disfuncional.
En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un gen de FX o GMD inactivado, en la que el gen de FX o GMD inactivado no expresará un producto génico de FX o GMD de longitud completa y funcional (por ejemplo, una secuencia polipeptídica de FX o GMD de longitud completa), respectivamente. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un gen de FX o GMD inactivado, en el que el gen de FX o GMD inactivado no expresará una secuencia de producto génico de FX o GMD endógeno, respectivamente. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un gen de FX o GMD inactivado, en la que el gen de FX o GMD inactivado expresará un producto génico de Fx o GMD variante, respectivamente. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un producto génico de FX o GMD variante.
En algunos modos de realización, la célula huésped comprende un vector de inserción. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un vector de virus. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un lentivirus. En algunos modos de realización, el vector de inserción es un adenovirus. En algunos modos de realización, el vector comprende un activador.
En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped atenuada estable. En algunos modos de realización, la célula huésped es una línea celular atenuada de FX o GMD estable. En algunos modos de realización, la célula huésped es una línea celular atenuada transitoria. En algunos modos de realización, la célula huésped es una línea celular atenuada de FX o GMD transitoria.
En algunos modos de realización, el gen de FX o GMD se inactiva por un sistema de ARN interferente pequeño (ARNip). Los procedimientos para identificar secuencias de ARNip adecuadas para la inactivación del gen de FX o GMD son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la consideración general para desarrollar e identificar ARNip para seleccionar como diana al gen de FX o g Md incluye: a) en primer lugar, buscar secuencias que tienen preferentemente 21-23 nucleótidos de longitud (seguido de la reducción de la longitud de la secuencia según sea necesario), b) evitar las regiones dentro de 50-100 pares de bases del codón iniciador y del codón finalizador, c) evitar las regiones de intrones, d) evitar los tramos de cuatro o más bases, por ejemplo, a Aa A, e) evitar las regiones con contenido de GC que sea menor a un 30 % o mayor a un 60 %, f) evitar las repeticiones y la baja complejidad de secuencia, g) evitar los sitios de polimorfismo mononucleotídico, y h) evitar las secuencias que son complementarias a secuencias en otros genes distintos de la diana. Véanse, por ejemplo, Rules of siRNA design for RNA interference, Protocol Online, 29 de mayo de 2004; y Reynolds et al., Nat Biotechnol, 22, 2004.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de Fx o GMG usando un sistema de ARNip. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNip que comprende una secuencia de nucleótidos de ARNip que tiene aproximadamente de 10 a 200 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 100 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 100 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 60 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 60 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 50 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 50 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 30 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 30 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNip que comprende una secuencia de nucleótidos de ARNip que tiene aproximadamente 10-25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNip que comprende una secuencia de nucleótidos de ARNip que tiene aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNip que comprende una secuencia de nucleótidos de ARNip que es al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20 o al menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNip que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % complementaria a una región de una molécula de ARNm de FX o GMD. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNip que comprende una secuencia de nucleótidos de ARNip que es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % complementaria a una región de una molécula de pro-ARNm de FX o GMD. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNip que comprende una molécula de ARN bicatenaria. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNip que comprende una molécula de ARN monocatenaria.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema de ARNip en una célula huésped. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema de ARNip en una célula huésped, en el que el sistema de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos de ARNip. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema de ARNip en la célula huésped usando electroporación. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema de ARNip en la célula huésped usando técnicas de transfección. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema de ARNip en la célula huésped usando un virus.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende además determinar el nivel de actividad FX o GMD en la célula huésped. En algunos modos de realización, determinar el nivel de actividad FX o GMD comprende determinar un nivel de actividad FX o GMD antes de insertar una secuencia de nucleótidos de ARNip en una célula huésped. En algunos modos de realización, determinar el nivel de actividad FX o GMD comprende determinar un nivel de actividad FX o GMD después de insertar una secuencia de nucleótidos de ARNip en una célula huésped. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se determina a nivel de ARN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de determinación de un nivel de actividad FX o GMD que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando PCR. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se determina a nivel de proteína. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de determinación de un nivel de actividad FX o GMD que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando inmunohistoquímica. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de determinación de un nivel de actividad FX o GMD que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando inmunoelectrotransferencia. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de determinación de un nivel de actividad FX o GMD que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando citometría de flujo. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se determina comparando un nivel de actividad FX o GMD después de la inserción de un ARNip con un valor de control. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se determina comparando un nivel de actividad FX o GMD después de la inserción de un ARNip con un valor natural. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se determina comparando un nivel de actividad FX o GMD después de la inserción de un ARNip con un nivel de actividad FX o GMD antes de la inserción de un ARNip de FX o GMD, respectivamente. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se basa en un nivel de expresión de un gen de FX o GMD, tal como la expresión de ARN y/o proteína de FX o GMD. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se basa en un nivel de expresión de una proteína de FX o GMD.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNhp. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNhp que comprende una secuencia de nucleótidos de ARNhp que tiene aproximadamente de 10 a 200 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 100 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 100 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 60 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 60 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 50 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 50 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 10 a 30 nucleótidos de longitud, o aproximadamente de 15 a 30 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNhp que comprende una secuencia de nucleótidos de ARNhp que tiene aproximadamente 10-25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNhp que comprende una secuencia de nucleótidos de ARNhp que tiene aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNhp que comprende una secuencia de nucleótidos de ARNhp que tiene al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20 o al menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNhp que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % complementaria a una región de una molécula de ARNm de FX o GMD. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GM D usando un sistema de ARNhp que comprende una secuencia de nucleótidos de ARNhp que es al menos al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % complementaria a una región de una molécula de pro-ARNm de FX o GMD. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNhp que comprende una molécula de ARN bicatenaria. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende inactivar el gen de FX o GMD usando un sistema de ARNhp que comprende una molécula de ARN monocatenaria.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema de ARNhp en una célula huésped. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema de ARNhp en una célula huésped, en el que el sistema de ARNhp comprende una secuencia de nucleótidos de ARNhp. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema de ARNhp en la célula huésped usando electroporación. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema de ARNhp en la célula huésped usando técnicas de transfección. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped que comprende insertar un sistema de ARNhp en la célula huésped usando un virus.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una célula huésped, en el que la célula huésped no comprende sustancialmente actividad FX ni sustancialmente actividad GMD, que comprende además determinar un nivel de actividad FX o GMD en la célula huésped. En algunos modos de realización, determinar un nivel de actividad FX o GMD comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD antes de insertar una secuencia de nucleótidos de ARNhp en una célula huésped. En algunos modos de realización, determinar un nivel de actividad FX o GMD comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD después de insertar una secuencia de nucleótidos de ARNhp en una célula huésped. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se determina a nivel de ARN. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de determinación de un nivel de actividad FX o GMD que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando PCR. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se determina a nivel de proteína. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de determinación de un nivel de actividad FX o GMD que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando inmunohistoquímica. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de determinación de un nivel de actividad FX o GMD que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando inmunoelectrotransferencia. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de determinación de un nivel de actividad FX o GMD que comprende determinar el nivel de actividad FX o GMD usando citometría de flujo. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se determina comparando un nivel de actividad FX o GMD después de la inserción de un ARNhp con un valor de control. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se determina comparando un nivel de actividad FX o GMD después de la inserción de un ARNhp con un valor natural. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se determina comparando un nivel de actividad FX o GMD después de la inserción de un ARNhp con un nivel de expresión de FX o GMD antes de la inserción de un ARNhp de Fx o GMD, respectivamente. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se basa en un nivel de expresión de un gen de FX o GMD, tal como la expresión de ARN y/o proteína de FX o GMD. En algunos modos de realización, el nivel de actividad FX o GMD se basa en un nivel de expresión de una proteína de FX o GMD.
En algunos modos de realización, la célula huésped comprende además un gen inactivado distinto de FX o GMD.
En general, las células huésped se transforman con un vector de expresión recombinante que comprende ADN que codifica una proteína deseada. Adicionalmente, las células huésped de la presente solicitud pueden ser una célula huésped en blanco. Como se usa en el presente documento, "huésped en blanco" se refiere a una célula que no contiene un vector de expresión que codifica una proteína. En algunos modos de realización, la célula huésped en blanco es una célula CHO. En algunos modos de realización, la célula huésped en blanco es una célula de ratón.
También se proporcionan por la presente solicitud células huésped que comprenden ácidos nucleicos que codifican una proteína descrita en el presente documento. Las moléculas de ácido nucleico proporcionadas por la invención incluyen ADN y ARN tanto en forma monocatenaria como bicatenaria, así como las correspondientes secuencias complementarias. El ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado por PCR y combinaciones de los mismos. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen genes de longitud completa o moléculas de ADNc, así como una combinación de fragmentos de los mismos. Los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento se derivan preferentemente de fuentes humanas.
En determinados modos de realización, los ácidos nucleicos están sustancialmente libres de material endógeno contaminante. La molécula de ácido nucleico se ha derivado preferentemente de ADN o ARN aislado al menos una vez en forma sustancialmente pura y en una cantidad o concentración que posibilita la identificación, manipulación y recuperación de sus secuencias de nucleótidos componentes por procedimientos bioquímicos estándar (tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Preferentemente, dichas secuencias se proporcionan y/o se construyen en forma de un marco abierto de lectura ininterrumpido por secuencias no traducidas internas, o intrones, que están típicamente presentes en genes eucarióticos. Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes en 5' o en 3' de un marco abierto de lectura, donde las mismas no interfieren con la manipulación o expresión de la región codificante.
En algunos modos de realización, la célula huésped puede expresar una proteína. En algunos modos de realización, la célula huésped puede expresar una proteína que contiene Fc. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una proteína. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende una proteína que contiene Fc. En algunos modos de realización, la célula huésped puede secretar una proteína. En algunos modos de realización, la célula huésped puede secretar una proteína que contiene Fc.
En algunos modos de realización, la célula huésped puede expresar una proteína a una tasa de producción similar de la célula huésped antes de la inactivación del gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la célula huésped puede expresar una proteína a la misma tasa de producción que la célula huésped antes de la inactivación del gen de FX o GMD. En algunos modos de realización, la célula huésped puede expresar una proteína en aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de la tasa de producción de la célula huésped antes de la inactivación del gen de FX o GMD.
En algunos modos de realización, la célula huésped comprende además una modificación génica. La optimización de una célula huésped con propósitos de producir una proteína por medio de la modificación génica es bien conocida en la técnica e incluye consideraciones relativas, por ejemplo, a las propiedades de selección de vectores para los procedimientos de integración y cualquier otra propiedad celular que sería deseable manipular para la producción de una proteína. En algunos modos de realización, la modificación génica es una modificación génica dirigida. En algunos modos de realización, la modificación génica es una modificación génica de supresión. En algunos modos de realización, la modificación génica es una modificación génica de inserción.
También se proporcionan procedimientos de evaluación de una célula huésped para determinar la idoneidad de la expresión de proteínas que comprenden determinar la actividad FX o GMD, en la que un nivel reducido de actividad FX o GMD es indicativo de idoneidad.
Células genomanipuladas para producir una proteína
La presente solicitud, en algunos aspectos, proporciona una célula huésped genomanipulada para producir una proteína como se describe en los modos de realización en el presente documento. La presente solicitud, en otros aspectos, proporciona procedimientos para preparar células huésped como se describe en los modos de realización en el presente documento.
En algunos modos de realización, la célula huésped se genomanipula para producir una proteína.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para preparar una célula huésped genomanipulada para producir una proteína que comprende: a) transformar la célula huésped con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína.
Los procedimientos para transformar una célula huésped usando un vector de expresión son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kim et al., Anal Bioanal Chem, 397, 2010. El procedimiento para transfectar una célula huésped incluye, pero no se limita a, transfección, infección, coprecipitación con fosfato cálcico, electroporación, microinyección, lipofección, transfección mediada por DEAE-dextrano u otras técnicas conocidas. El procedimiento seleccionado será función, en parte, del tipo de célula huésped que se vaya a usar. Estos procedimientos y otros procedimientos adecuados son bien conocidos por el experto en la técnica.
También se proporcionan sistemas de expresión y construcciones en forma de plásmidos, vectores de expresión, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos una proteína descrita en el presente documento. En determinados modos de realización, un plásmido, vector de expresión, casete de transcripción o expresión proporcionados en el presente documento comprende un polinucleótido que codifica al menos una proteína.
En algunos modos de realización, los vectores de expresión usados en las células huésped contendrán secuencias para el mantenimiento del plásmido y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Dichas secuencias, denominadas conjuntamente "secuencias flanqueantes", en determinados modos de realización incluirán típicamente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un activador, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de finalización de la transcripción, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de empalme donante y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para la secreción de polipéptidos, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región policonectora para insertar el ácido nucleico que codifica la proteína que se va a expresar y un elemento marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se analiza a continuación.
Las secuencias flanqueantes pueden ser homólogas (es decir, de la misma especie y/o estirpe que la célula huésped), heterólogas (es decir, de una especie distinta de la especie o estirpe de la célula huésped), híbridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), sintéticas o naturales. Como tal, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier vegetal, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en, y se pueda activar por, la maquinaria de la célula huésped.
Las secuencias flanqueantes útiles en los vectores de la presente invención se pueden obtener por cualquiera de varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes útiles en el presente documento se habrán identificado previamente por cartografía y/o por digestión con endonucleasas de restricción y, por tanto, se pueden aislar de la fuente de tejido apropiada usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, se puede conocer la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia flanqueante. Aquí, la secuencia flanqueante se puede sintetizar usando los procedimientos descritos en el presente documento para la síntesis o clonación de ácidos nucleicos.
Ya sea que se conozca toda o solo una porción de la secuencia flanqueante, se puede obtener usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o cribando una colección genómica con una sonda adecuada tal como un oligonucleótido y/o un fragmento de secuencia flanqueante de la misma o de otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante se puede aislar a partir de un trozo más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento se puede lograr por digestión con endonucleasas de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado seguido de aislamiento usando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna Qiagen® (Chatsworth, CA) u otros procedimientos conocidos por el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este propósito será fácilmente evidente para un experto en la técnica.
Un origen de replicación es típicamente una parte de los vectores de expresión adquiridos comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula huésped. Si el vector de elección no contiene un origen del sitio de replicación, uno se puede sintetizar químicamente en base a una secuencia conocida, y fijarse en el vector. Por ejemplo, diversos orígenes víricos (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de la estomatitis vesicular (VEV) o papilomavirus tales como VPH o v Pb ) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. En general, el origen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen de SV40 se usa a menudo solo porque también contiene el activador temprano del virus).
Una secuencia de finalización de la transcripción se localiza típicamente en 3' con respecto al extremo de una región codificante de polipéptido y sirve para finalizar la transcripción. Si bien la secuencia se clona fácilmente a partir de una colección o incluso se adquiere comercialmente como parte de un vector, también se puede sintetizar fácilmente usando los procedimientos para la síntesis de ácidos nucleicos tales como los descritos en el presente documento.
Un gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas; (b) complementan las deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes cruciales no disponibles en medios complejos o definidos. Los marcadores seleccionables específicos son el gen de resistencia a la canamicina, el gen de resistencia a la ampicilina y el gen de resistencia a la tetraciclina. De forma ventajosa, también se puede usar un gen de resistencia a la neomicina para la selección en células huésped eucariotas.
Se pueden usar otros genes seleccionables para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el proceso en el que los genes que se requieren para la producción de una proteína crucial para el crecimiento o la supervivencia celular se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen genes de dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina cinasa sin activador. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo una presión de selección en la que solo los transformantes están adaptados de forma única para sobrevivir en virtud del gen seleccionable presente en el vector. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se incrementa sucesivamente, dando lugar, de este modo, a la amplificación tanto del gen seleccionable como del ADN que codifica otro gen, tal como la cadena ligera o pesada de un anticuerpo. Como resultado, se sintetizan cantidades incrementadas de un polipéptido a partir del ADN amplificado.
Normalmente es necesario un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción del ARNm y se caracteriza, por ejemplo, por una secuencia de Kozak. El elemento se localiza típicamente en 3' con respecto al activador y en 5' con respecto a la secuencia codificante del polipéptido que se va a expresar. En determinados modos de realización, una o más regiones codificantes pueden estar enlazadas de forma funcional a un sitio de unión al ribosoma interno (IRES), lo que permite la traducción de dos marcos abiertos de lectura a partir de un único transcrito de ARN.
Los vectores de expresión y de clonación de la invención contendrán típicamente un activador que se reconoce por el organismo huésped y está enlazado de forma funcional a la molécula que codifica el polipéptido. Los activadores son secuencias no transcritas localizadas en dirección 5' (es decir, 5') con respecto al codón iniciador de un gen estructural (en general dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controla la transcripción del gen estructural. Los activadores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: activadores inducibles y activadores constitutivos. Los activadores inducibles inician niveles incrementados de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. Los activadores constitutivos, por otra parte, transcriben uniformemente el gen al que están enlazados de forma funcional, es decir, con poco o ningún control sobre la expresión génica. Son bien conocidos un gran número de activadores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales. Un activador adecuado se enlaza de forma funcional al ADN que codifica, por ejemplo, la cadena pesada o la cadena ligera, retirando el activador del ADN fuente por digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia activadora deseada en el vector.
Los activadores adecuados para su uso con huéspedes de levadura también son bien conocidos en la técnica. Los potenciadores de levadura se usan de forma ventajosa con los activadores de levadura. Los activadores adecuados para su uso con células huésped de mamífero son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, los obtenidos de los genomas de virus tales como poliomavirus, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y lo más preferentemente virus símico 40 (SV40). Otros activadores de mamífero adecuados incluyen activadores de mamífero heterólogos, por ejemplo, activadores de choque térmico y el activador de actina.
Los activadores adicionales que pueden ser de interés incluyen, pero no se limitan a: activador temprano de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310); activador de c Mv (Thomsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A.
81:659-663); el activador contenido en la repetición terminal larga en 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); activador de timidina cinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); secuencias activadoras y reguladoras del gen de metalotionina de Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42; o el activador tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). También son de interés las siguientes regiones de control de la transcripción de animales, que presentan especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen elastasa I que es activa en las células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Omitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control del gen de la insulina que es activa en las células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en las células linfáticas (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444); la región de control del virus del tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfáticas y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); la región de control del gen de la albúmina que es activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); la región de control del gen de la alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); la región de control del gen de la alfa 1 -antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); la región de control del gen de la beta-globina que es activa en las células mielocíticas (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen de la proteína básica de mielina que está activa en las células de oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); la región de control del gen de la cadena ligera 2 de la miosina que está activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); y la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropinas que está activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
Se puede insertar una secuencia potenciadora en el vector para incrementar la transcripción del ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada de la invención por eucariotas superiores. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actúan sobre el activador para incrementar la transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y la posición, habiéndose encontrado en las posiciones tanto en 5' como en 3' con respecto a la unidad de transcripción. Son conocidas varias secuencias potenciadoras disponibles de genes de mamífero (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfafetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente se usa un potenciador de un virus. El potenciador de SV40, el potenciador del activador temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma y los potenciadores de adenovirus conocidos en la técnica son elementos potenciadores ejemplares para la activación de activadores eucariotas. Si bien un potenciador se puede situar en el vector en 5' o bien en 3' con respecto a una secuencia codificante, típicamente se localiza en un sitio 5' del activador. Se puede incorporar una secuencia que codifica una secuencia señal (secuencia líder o péptido señal) natural o heteróloga apropiada en un vector de expresión, para estimular la secreción extracelular del anticuerpo. La elección del péptido señal o líder depende del tipo de células huésped en las que se va a producir el anticuerpo, y una secuencia señal heteróloga puede reemplazar la secuencia señal natural. Los ejemplos de péptidos señal que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen los siguientes: la secuencia señal para interleucina 7 (IL-7) descrita en la patente de EE. UU. n.° 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de interleucina 2 descrita en Cosman et al., 1984, Nature 312:768; el péptido señal del receptor de interleucina 4 descrito en la patente EP n.° 0367 566; el péptido señal del receptor de interleucina I de tipo I descrito en la patente de EE. UU. n.° 4.968.607; el péptido señal del receptor de interleucina I de tipo II descrito en la patente EP n.° 0460 846.
El vector puede contener uno o más elementos que facilitan la expresión cuando el vector se integra en el genoma de la célula huésped. Los ejemplos incluyen un elemento EASE (Aldrich et al. 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38) y una región de fijación a la matriz (MAR). Las MAR median en la organización estructural de la cromatina y pueden aislar al vector integrado del efecto de "posición". Por tanto, las MAR son en particular útiles cuando el vector se usa para crear transfectantes estables. Son conocidos en la técnica una serie de ácidos nucleicos que contienen Ma R naturales y sintéticos, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.239.328; 7.326.567; 6.177.612; 6.388.066; 6.245.974; 7.259.010; 6.037.525; 7.422.874; 7.129.062.
Los vectores de expresión proporcionados por la invención se pueden construir a partir de un vector de partida, tal como un vector disponible comercialmente. Dichos vectores pueden contener o no todas las secuencias flanqueantes deseadas. Cuando una o más de las secuencias flanqueantes descritas en el presente documento no estén ya presentes en el vector, se pueden obtener individualmente y fijarse en el vector. Los procedimientos usados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes son bien conocidos por el experto en la técnica.
Después de que se ha construido el vector y se ha insertado una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de proteína en el sitio apropiado del vector, el vector completo se puede insertar en una célula huésped adecuada para su amplificación y/o la expresión del polipéptido.
Los procedimientos para preparar un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína, tal como una proteína que contiene Fc, son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.923.221.
La construcción de vectores adecuados que comprenden una proteína y las secuencias de control y codificación deseadas emplea técnicas de fijación estándar. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN se escinden, se adaptan y se vuelven a fijar en la forma deseada para formar los plásmidos requeridos. Los procedimientos empleados no dependen de la fuente de ADN o del huésped previsto.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de preparación de una proteína que comprende además determinar una proporción óptima del polinucleótido para su introducción en una célula huésped. En algunos modos de realización, se usa espectrometría de masas para determinar el rendimiento de la proteína y la proporción se ajusta para maximizar el rendimiento de la proteína. En algunos modos de realización, se usa ELISA de doble antígeno para determinar el rendimiento de la proteína, tal como una proteína que contiene Fc, y la proporción se ajusta para maximizar el rendimiento de la proteína.
Purificación
Los procedimientos descritos en el presente documento, en algunos aspectos, comprenden además procedimientos para aislar una proteína producida por los procedimientos descritos en el presente documento.
Los procedimientos para obtener una proteína son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Huse et al., J Biochem Bioph Meth, 51, 2002. Las proteínas se pueden producir intracelularmente o secretar directamente en el medio. Si las proteínas se producen intracelularmente, como primera etapa, los restos de partículas, células huésped o bien fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Si las proteínas se secretan en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión, en general, se concentran en primer lugar usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. En algunos modos de realización, se puede incluir un inhibidor de proteasa en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes fortuitos.
La composición preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferente. Para las proteínas que contienen Fc, la idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en la proteína que contiene Fc. La proteína A se puede usar para purificar proteínas que contienen Fc que se basan en inmunoglobulinas humanas que contienen 1, 2 o 4 cadenas pesadas (véase, por ejemplo, Lindmark et al., J Immunol Meth, 62, 1983). Se recomienda la proteína G para todos los isotipos de ratón y para los humanos 3 (véase, por ejemplo, Guss et al., EMBO, 5, 1986). La matriz a la que se fija el ligando de afinidad es a menudo agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina-SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna con poli(ácido aspártico)), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de purificación de una proteína que comprende usar un filtro. En algunos modos de realización, el filtro es un sistema de diafiltración. En algunos modos de realización, el filtro es un sistema de ultrafiltración. En algunos modos de realización, el filtro es un sistema de filtración vírica. En algunos modos de realización, la purificación de una proteína comprende usar una serie de etapas de filtración. En algunos modos de realización, la serie de etapas de filtración se selecciona de al menos una de las siguientes: diafiltración, ultrafiltración y filtración vírica.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento de purificación de una proteína que comprende usar una serie de técnicas de purificación de proteínas seleccionadas de filtración, purificación con proteína A, purificación por intercambio catiónico, purificación por intercambio catiónico fuerte, purificación por intercambio aniónico, purificación en fase inversa y purificación multimodal.
Composiciones
La presente solicitud, en algunos aspectos, proporciona una proteína que comprende una estructura de polisacárido, en la que la proteína está en una proporción predeterminada de formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína, producida por cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
En algunos modos de realización, la proteína es una proteína que contiene Fc. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc comprende un dominio Fc. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc comprende uno o más dominios Fc. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc comprende dos dominios Fc.
En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc comprende una cadena pesada o un fragmento de la misma. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc comprende al menos una cadena pesada. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc comprende una o más cadenas pesadas. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc comprende dos cadenas pesadas.
En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc es un anticuerpo de longitud completa. En algunos modos de realización, el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo humano. En algunos modos de realización, el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo humanizado. En algunos modos de realización, el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo monoclonal. En algunos modos de realización, el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo quimérico. En algunos modos de realización, el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo biespecífico. En algunos modos de realización, el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo multiespecífico.
En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc es una proteína de fusión que contiene Fc. En algunos modos de realización, la proteína de fusión que contiene Fc comprende uno o más dominios Fc.
En algunos modos de realización, el dominio Fc de la proteína de fusión que contiene Fc prolonga la semivida en plasma de la proteína de fusión que contiene Fc. En algunos modos de realización, el dominio Fc de la proteína de fusión que contiene Fc prolonga la actividad biológica de la proteína de fusión que contiene Fc. En algunos modos de realización, el dominio Fc de la proteína de fusión que contiene Fc disminuye la tasa de depuración renal de la proteína de fusión que contiene Fc. En algunos modos de realización, el dominio Fc de la proteína de fusión que contiene Fc incrementa la solubilidad de la proteína de fusión que contiene Fc. En algunos modos de realización, el dominio Fc de la proteína de fusión que contiene Fc incrementa la estabilidad de la proteína de fusión que contiene Fc.
Las proteínas de fusión que contienen Fc son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Czajkowsky et al., EMBO Mol Med, 4, 2012, 1015-1028. En algunos modos de realización, la proteína de fusión que contiene Fc es una inmunoadhesina. En algunos modos de realización, la proteína de fusión que contiene Fc es una proteína de fusión citocina-Fc.
En algunos modos de realización, la proteína es una proteína multimérica. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc es una proteína multimérica. En algunos modos de realización, la proteína de fusión que contiene Fc es una proteína multimérica.
En algunos modos de realización, la proteína está conjugada con un agente. En algunos modos de realización, la proteína está conjugada con al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 moléculas de un agente. En algunos modos de realización, la proteína está conjugada con aproximadamente 2-10, aproximadamente 4-10, aproximadamente 6-10 o aproximadamente 8-10 moléculas de un agente. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc está conjugada con un agente, en la que el agente está conjugado con el dominio Fc de la proteína que contiene Fc. En algunos modos de realización, el agente es un agente terapéutico. En algunos modos de realización, el agente terapéutico es un agente terapéutico de molécula pequeña. En algunos modos de realización, el agente terapéutico es un agente quimioterápico. En algunos modos de realización, el agente es un agente de detección. En algunos modos de realización, el agente de detección es un radiomarcador. En algunos modos de realización, el agente de detección es un marcador fluorescente. En algunos modos de realización, el agente de detección es un inmunomarcador. En algunos modos de realización, la proteína es un diagnóstico con fines terapéuticos. En algunos modos de realización, la proteína que contiene Fc es un diagnóstico con fines terapéuticos.
En algunos modos de realización, la proteína comprende una modificación postraduccional. En algunos modos de realización, la modificación postraduccional no se produce enzimáticamente. En algunos modos de realización, la modificación postraduccional se produce enzimáticamente. En algunos modos de realización, la modificación postraduccional se selecciona del grupo que consiste en un emparejamiento de disulfuro, una desamidación, una oxidación y una ciclación de glutamina N terminal.
En algunos modos de realización, la proteína, tal como una proteína que contiene Fc, se puede unir a, o interactuar con, cualquier proteína, incluyendo, sin limitación, un miembro de la familia de receptores HER, tal como HER1 (EGFR), HER2, HER3 y HER4; proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD21, CD22 y CD34; moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Mol, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina av/p3 incluyendo a o bien p o subunidades de las mismas (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11 a, anti-CD18 o anti-CD11 b); receptor de macrófagos tal como CRIg, factores de necrosis tumoral tales como TRAIL/Apo-2, factores de crecimiento tales como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); IgE; antígenos de grupos sanguíneos; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); y proteína C. Otras proteínas ejemplares incluyen la hormona del crecimiento (GH), que incluye la hormona del crecimiento humana (hGH) y la hormona del crecimiento bovina (bGH); el factor de liberación de la hormona del crecimiento; la hormona paratiroidea; la hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; a-1 - antitripsina; cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; la hormona foliculoestimulante; calcitonina; la hormona luteinizante; glucagón; factores de la coagulación tales como el factor VIIIC, tromboplastina tisular y el factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como la proteína C; péptido natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa o activador de tipo tisular del plasminógeno (t-PA); bombacina; trombina; factor de necrosis tumoral a y p; encefalinasa; RANTES (regulado por activación y normalmente expresado y secretado por linfocitos T); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-a); seroalbúmina tal como seroalbúmina humana (HSA); la hormona antimuleriana; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; DNasa; inhibina; activina; receptores de hormonas o factores de crecimiento; una integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurótrofo tal como el factor neurótrofo derivado del hueso (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5 o 6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento y transformación (TGF) tal como TGF-a y TGF-p, que incluye TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor insulínico de crecimiento I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I del cerebro); proteínas de unión al factor insulínico de crecimiento (IGFBP); eritropoyetina (EPO); trombopoyetina (TPO); factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón a, p y y; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, de IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración de la descomposición (DAF); un antígeno vírico tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del SIDA; proteínas de transporte; receptores de asentamiento; adresinas; proteínas reguladoras; inmunoadhesinas; anticuerpos; y fragmentos o variantes biológicamente activos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente. Se pueden usar muchos otros anticuerpos y/u otras proteínas de acuerdo con la presente invención, y las listas anteriores no pretenden ser limitantes.
La presente solicitud, en algunos aspectos, proporciona composiciones que comprenden una proteína preparada por cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. La presente solicitud, en otro aspecto, proporciona una composición que comprende una proteína que tiene una función ADCC potenciada mediada por linfocitos NK y leucocitos PMN, en la que la composición comprende formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada.
En algunos modos de realización, la forma fucosilada de la proteína comprende fucosa en el extremo reductor de una estructura de polisacárido. En algunos modos de realización, la forma fucosilada de la proteína comprende fucosa en el extremo reductor de una estructura de polisacárido, en la que la fucosa se fija covalentemente a un primer resto W-acetilglucosamina (GlcNAc) del extremo reductor de la estructura de polisacárido. En algunos modos de realización, la estructura de polisacárido comprende un resto fucosa en el extremo reductor de la estructura de polisacárido. En algunos modos de realización, el resto fucosa es una única molécula de fucosa unida covalentemente a la estructura de polisacárido. En algunos modos de realización, la estructura de polisacárido comprende una L-fucosa. En algunos modos de realización, la proteína comprende dos o más estructuras de polisacáridos.
En algunos modos de realización, la composición es una composición farmacéutica. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica está en una forma para su almacenamiento. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica está en una forma para el transporte del producto. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica está congelada. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica está liofilizada. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica está reconstituida. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica es una composición de administración. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica está en una forma para su administración a un individuo que la necesita.
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica es una composición farmacéutica estéril. Las formulaciones farmacéuticas estériles se combinan o fabrican de acuerdo con las pautas de esterilización de calidad farmacéutica (por ejemplo, los capítulos 797, 1072 y 1211 de la Farmacopea de los Estados Unidos; Código de Profesiones y Comercio de California 4127.7; 16 Código de Reglamentos de California 1751, 21 Código de Reglamentos Federales 21 o ex homólogos de EE. UU. de dichas regulaciones) conocidas por los expertos en la técnica.
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica es una formulación estable. Como se usa en el presente documento, una formulación "estable" es aquella en la que las proteínas en la misma esencialmente retienen la estabilidad e integridad física y química durante el almacenamiento. Diversas técnicas analíticas para medir la estabilidad de las proteínas están disponibles en la técnica y se revisan, por ejemplo, en Jones, Adv Drug Delivery Rev, 10, 1993. La estabilidad se puede evaluar a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo seleccionado. Por ejemplo, se puede usar el grado de agregación durante el almacenamiento como un indicador de la estabilidad de la proteína. Por tanto, una formulación "estable" puede ser aquella en la que menos de aproximadamente un 10 % y preferentemente menos de aproximadamente un 5 % de la proteína está presente como un agregado en la formulación.
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica es una formulación reconstituida. Como se usa en el presente documento, una formulación "reconstituida" es aquella que se ha preparado disolviendo una formulación de proteína liofilizada en un diluyente de modo que la proteína se dispersa por todas partes. La formulación reconstituida es adecuada para su administración (por ejemplo, administración intravenosa o subcutánea) a un individuo que la necesita.
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica es una formulación isotónica. Como se usa en el presente documento, una formulación "isotónica" es aquella que tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas tendrán en general una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. El término "hipotónico" describe una formulación con una presión osmótica por debajo de la de la sangre humana. De forma correspondiente, se usa el término "hipertónico" para describir una formulación con una presión osmótica por encima de la de la sangre humana.
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica está a un pH especificado. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica está a un pH de aproximadamente 5-7, aproximadamente 5-6 o aproximadamente 5-5,5. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica está a un pH de aproximadamente 5,3. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica está a un pH de aproximadamente 5,4. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica se ajusta al pH.
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto a un ingrediente activo. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas a pH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). En algunos modos de realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en acetato de sodio, sacarosa, polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20), succinato de sodio, histidina HCl y cloruro de sodio.
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica comprende además un ácido farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, un "ácido farmacéuticamente aceptable" incluye ácidos orgánicos e inorgánicos que no son tóxicos a la concentración y manera en las que se formulan. Por ejemplo, los ácidos inorgánicos adecuados incluyen clorhídrico, perclórico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, sulfúrico, sulfónico, sulfínico, sulfanílico, fosfórico, carbónico, etc. Los ácidos orgánicos adecuados incluyen mono, di y tricarboxílico, insaturado, saturado, heterocíclico, arilalifático, cicloalifático, cíclico, aromático, con alquilo de cadena lineal y ramificada, incluyendo, por ejemplo, fórmico, acético, 2-hidroxiacético, trifluoroacético, fenilacético, trimetilacético, t-butilacético, antranílico, propanoico, 2-hidroxipropanoico, 2-oxopropanoico, propandioico, ciclopentanopropiónico, ciclopentanopropiónico, 3-fenilpropiónico, butanoico, butandioico, benzoico, 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, 2-acetoxi-benzoico, ascórbico, cinámico, lauril sulfúrico, esteárico, mucónico, mandélico, succínico, embónico, fumárico, málico, maleico, hidroximaleico, malónico, láctico, cítrico, tartárico, glicólico, glicónico, glucónico, pirúvico, glioxálico, oxálico, mesílico, succínico, salicílico, Itálico, palmoico, palmeico, tiociánico, metanosulfónico, etanosulfónico, 1,2-etanodisulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, bencenosulfónico, 4-clorobencenosulfónico, naftaleno-2-sulfónico, p-toluenosulfónico, alcanforsulfónico, 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxílico, glucoheptónico, ácido 4,4'-metilenobis-3-(hidroxi-2-eno-1-carboxílico), hidroxinaftoico.
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica comprende además una base farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, una "base farmacéuticamente aceptable" incluye bases orgánicas e inorgánicas que no son tóxicas a la concentración y manera en las que se formulan. Por ejemplo, las bases adecuadas incluyen las formadas a partir de metales formadores de bases inorgánicas tales como litio, sodio, potasio, magnesio, calcio, amonio, hierro, cinc, cobre, manganeso, aluminio, N-metilglucamina, morfolina, piperidina y bases orgánicas no tóxicas que incluyen, aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, por ejemplo, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperacina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina y similares. Las bases orgánicas no tóxicas preferentes en particular son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetamina, diciclohexilamina, colina y cafeína.
Los ácidos y bases farmacéuticamente aceptables adicionales utilizables con la presente invención incluyen los que se derivan de los aminoácidos, por ejemplo, histidina, glicina, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina y asparagina.
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica comprende además un tampón o sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, los derivados de sales de adición de ácidos y bases de los ácidos y bases indicados anteriormente. Los tampones y/o sales específicos incluyen histidina, succinato y acetato.
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica comprende además un glúcido farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, un "glúcido farmacéuticamente aceptable" es una molécula que, cuando se combina con una proteína, evita o reduce significativamente la inestabilidad química y/o física de la proteína durante su almacenamiento. Cuando se pretende liofilizar la formulación y, a continuación, reconstituirla, los "glúcidos farmacéuticamente aceptables" también se pueden conocer como "lioprotectores". Los glúcidos ejemplares y sus alditoles correspondientes incluyen: un aminoácido, tal como glutamato monosódico o histidina; una metilamina, tal como betaína; una sal liotrópica, tal como sulfato de magnesio; un poliol, tal como alditoles trihídricos o de mayor peso molecular, por ejemplo, glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; PLURONICS®; y combinaciones de los mismos. Los lioprotectores ejemplares adicionales incluyen glicerina y gelatina, y los glúcidos melibiosa, melecitosa, rafinosa, manotriosa y estaquiosa. Los ejemplos de glúcidos reductores incluyen glucosa, maltosa, lactosa, maltulosa, isomaltulosa y lactulosa. Los ejemplos de glúcidos no reductores incluyen glucósidos no reductores de compuestos polihidroxilados seleccionados de alditoles y otros polialcoholes de cadena lineal. Los alditoles preferentes son monoglucósidos, especialmente los compuestos obtenidos por reducción de disacáridos tales como lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa. El grupo lateral glucosídico puede ser glucosídico o bien galactosídico. Los ejemplos adicionales de alditoles son glucitol, maltitol, lactitol e isomaltulosa. Los glúcidos farmacéuticamente aceptables preferentes son los glúcidos no reductores trehalosa o sacarosa. Los glúcidos farmacéuticamente aceptables se añaden a la formulación en una "cantidad protectora" (por ejemplo, preliofilización) lo que significa que la proteína retiene esencialmente su estabilidad e integridad física y química durante su almacenamiento (por ejemplo, después de la reconstitución y el almacenamiento).
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica comprende además un conservante farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, un "conservante farmacéuticamente aceptable" es un compuesto que se puede añadir a las formulaciones en el presente documento para reducir la actividad bacteriana. Los ejemplos de conservantes potenciales incluyen, pero no se limitan a, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en la que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol.
En algunos modos de realización, la composición que comprende una pluralidad de proteínas es un medio de cultivo celular. En algunos modos de realización, el medio de cultivo celular es un medio nutritivo. Los medios nutritivos contienen todos los elementos necesarios para el crecimiento de la célula huésped. En algunos modos de realización, el medio de cultivo celular es un medio mínimo. Los medios mínimos contienen los nutrientes mínimos posibles para el crecimiento de la célula huésped, por ejemplo, en general sin la presencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el medio de cultivo celular es un medio selectivo. Los medios selectivos comprenden un agente que inhibe el crecimiento de un organismo seleccionado.
En algunos modos de realización, el medio de cultivo celular comprende además un nutriente del medio de cultivo celular para soporte y/o crecimiento celular. En algunos modos de realización, el nutriente del medio de cultivo celular se selecciona de, por ejemplo: proteínas; péptidos; aminoácidos; carbohidratos; metales y minerales, por ejemplo, calcio, magnesio, hierro; oligoelementos metálicos, por ejemplo, fosfatos y sulfatos; tampones indicadores de pH, por ejemplo, rojo fenol, púrpura de bromo-cresol; y agentes antimicrobianos.
En algunos modos de realización, el medio de cultivo celular comprende además una célula huésped. En algún modo de realización, el medio de cultivo está sustancialmente desprovisto de una célula huésped.
En algunos modos de realización, el medio de cultivo celular comprende una fuente de fucosa. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es una fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa. En algunos modos de realización, la fucosa es L-fucosa-1-fosfato. En algunos modos de realización, la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
En algunos modos de realización, la composición es un lisado celular. En algunos modos de realización, el lisado celular comprende una pluralidad de proteínas y componentes de la célula huésped. En algunos modos de realización, el lisado celular es un lisado celular centrifugado. En algunos modos de realización, el lisado celular comprende una porción precipitada del lisado celular y una porción sobrenadante del lisado celular. En algunos modos de realización, el lisado celular comprende una porción sedimentada del lisado celular y una porción sobrenadante del lisado celular.
En algunos modos de realización, la composición es un eluido de una columna de purificación de proteínas. Como se usa en el presente documento, "eluido" se refiere a cualquier fluido que pasa a través de una columna de purificación de proteínas. En algunos modos de realización, el eluido comprende un fluido que se aísla de un fluido que fluye a través. En algunos modos de realización, el eluido comprende un fluido que se aísla de un fluido de lavado. En algunos modos de realización, el eluido comprende un fluido que se aísla de uno o más fluidos de lavado. En algunos modos de realización, el eluido comprende un fluido que se aísla de un fluido de elución.
En algunos modos de realización, la composición es una colección de proteínas, en la que al menos dos de las proteínas de la pluralidad de proteínas son diferentes. En algunos modos de realización, la colección comprende al menos dos proteínas que se unen a diferentes antígenos. En algunos modos de realización, la colección comprende al menos dos proteínas que se unen a diferentes epítopos. En algunos modos de realización, las proteínas diferentes están contenidas en recipientes diferentes. En algunos modos de realización, la presente invención proporciona colecciones que comprenden al menos 2, 3, 4, 5, 10, 30, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500, 10.000, 25.000, 50.000, 75.000, 100.000, 250.000, 500.000, 750.000, 1.000.000, 2.500.000, 5.000.000, 7.500.000, 10.000.000 o más de 10.000.000 de proteínas diferentes.
La presente solicitud proporciona lotes a gran escala (por ejemplo, lotes comerciales o lotes a escala de fabricación) de cualquiera de las composiciones descritas en los modos de realización en el presente documento. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el lote comprende las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, el lote comprende una proteína con una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN. En algunos modos de realización, el lote comprende las formas fucosiladas y afucosiladas de un anticuerpo en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, el lote comprende un anticuerpo con una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN.
En algunos modos de realización, el lote comprende al menos aproximadamente 5 g, 10 g, 50 g, 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g, 3500 g, 4000 g, 4500 g o 5000 g de una proteína, en el que las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína están en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, el lote comprende al menos aproximadamente 5-5000 g, 50­ 4000 g o aproximadamente 100-1000 g de una proteína, en el que las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína están en una proporción predeterminada.
En algunos modos de realización, el lote está en una forma para el almacenamiento de fármacos. En algunos modos de realización, el lote está en una forma para el transporte del producto. En algunos modos de realización, el lote está en una forma para su administración a un individuo que lo necesita. En algunos modos de realización, el lote está liofilizado. En algunos modos de realización, el lote no está conjugado con un agente. En algunos modos de realización, el lote está conjugado con un agente. En algunos modos de realización, el lote comprende además un componente de formulación.
En algunos modos de realización, el lote es un medio de cultivo celular. En algunos modos de realización, el lote es un lisado celular.
En algunos modos de realización, el lote, o una porción del mismo, está en un recipiente. En algunos modos de realización, el lote, o porción del mismo, está en un vial. En algunos modos de realización, el lote, o porción del mismo, está en una pluralidad de viales. En algunos modos de realización, el lote, o porción del mismo, está en una jeringa.
En algunos modos de realización, el lote, o una porción del mismo, está en una pluralidad de viales, en el que cada vial comprende una proteína, en el que las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína están en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, el lote, o una porción del mismo, está en una pluralidad de viales, en el que al menos aproximadamente un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los viales comprenden las formas fucosiladas y afucosiladas de una proteína en una proporción predeterminada.
En algunos modos de realización, el lote se divide en alícuotas en una dosificación unitaria. Como se usa en el presente documento, una "dosificación unitaria" es la cantidad de proteína destinada a la administración como una dosis unitaria única. En algunos modos de realización, la dosis unitaria única es de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg de una proteína. En algunos modos de realización, la dosificación unitaria se envasa en un recipiente. En algunos modos de realización, la dosificación unitaria se envasa en un vial.
En algunos modos de realización, el tamaño del lote comercial no es mayor de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces el tamaño del lote clínico. Como se usa en el presente documento, "lote comercial" se refiere a una cantidad de proteína producida durante una o más tandas de producción completadas con propósitos de producción y/o distribución comercial. Como se usa en el presente documento, "lote clínico" se refiere a una cantidad de proteína producida durante una o más tandas de producción completadas con propósitos de pruebas clínicas. En algunos modos de realización, el tamaño del lote comercial no es mayor de 10 veces el tamaño del lote clínico.
En algunos modos de realización, el recipiente comprende una alícuota de un lote comercial como se describe en el presente documento, en el que el lote comercial comprende una composición que comprende una proteína, en la que las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína están en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, el vial comprende una alícuota de un lote comercial como se describe en el presente documento, en el que el lote comercial comprende una composición que comprende una proteína, en la que las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína están en una proporción predeterminada. En algunos modos de realización, la jeringa comprende una alícuota de un lote comercial como se describe en el presente documento, en la que el lote comercial comprende una composición que comprende una proteína, en la que las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína están en una proporción predeterminada.
Procedimientos de tratamiento
La presente solicitud proporciona, en algunos aspectos, procedimientos de tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita, que comprenden administrar al individuo una composición farmacéutica descrita en los modos de realización en el presente documento.
En algunos modos de realización, la cantidad eficaz de una composición farmacéutica se administra a un individuo que la necesita, en la que la composición farmacéutica comprende las formas afucosiladas y fucosiladas de una proteína en una proporción predeterminada.
En algunos modos de realización, la cantidad eficaz de una composición farmacéutica se administra a un individuo que la necesita, en la que la composición farmacéutica comprende una proteína que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN. En algunos modos de realización, la cantidad eficaz de una composición farmacéutica se administra a un individuo que la necesita, en la que la composición farmacéutica comprende una proteína que tiene una función ADCC potenciada mediada tanto por linfocitos NK como por leucocitos PMN, en la que la composición farmacéutica comprende las formas afucosiladas y fucosiladas de la proteína en una proporción que proporciona la función ADCC potenciada.
La composición farmacéutica descrita en el presente documento se puede administrar por medio de diversas vías, tales como vía parenteral, que incluye intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intrapulmonar, oral, inhalatoria, intravesicular, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intraocular, intratecal o transdérmica. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica descrita en el presente documento se puede administrar por vía parenteral. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica descrita en el presente documento se puede administrar por vía intravenosa. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica descrita en el presente documento se puede administrar por vía subcutánea. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica descrita en el presente documento se puede administrar localmente. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica descrita en el presente documento se puede administrar por vía tópica.
Las enfermedades que se pueden tratar por los procedimientos en el presente documento son cualquier enfermedad que se pueda tratar con una proteína. En algunos modos de realización, la enfermedad es un cáncer. En algunos modos de realización, la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria. En algunos modos de realización, la enfermedad es una infección.
En algunos modos de realización, la composición farmacéutica descrita en el presente documento se usa en combinación con otra modalidad de administración o tratamiento.
La invención se describirá ahora con mayor detalle por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Los siguientes ejemplos ilustran además la invención pero, por supuesto, no se deben interpretar como limitantes de su alcance de ninguna manera.
Ejemplos
Ejemplo 1:
Desarrollo de líneas celulares de CHO con supresión de FX, de las que cada una puede expresar un anticuerpo con una proporción de fucosilación:afucosilación que se puede ajustar por valoración de fucosa
Para evaluar los cambios en la función biológica de una forma afucosilada de un anticuerpo, es necesario producir las formas tanto naturales (fucosiladas) como afucosiladas del anticuerpo. Previamente, se han usado huéspedes con supresión de FUT8 (FUT8-KO) para desarrollar líneas celulares de CHO que pueden expresar la forma afucosilada de un anticuerpo con valores relativamente razonables (Malphettes et al., Biotechnol Bioeng, 106, 2010, 774-783). Sin embargo, se ha observado que las líneas celulares FUT8-KO tienen tasas de crecimiento y adaptación de los clones más lentas. Además, para producir también el anticuerpo en una forma naturales (es decir, una forma fucosilada) se requiere un desarrollo de la línea celular (CLD) adicional y separado. Para lograr esto, es necesario producir y cribar un gran número de clones, una tarea abrumadora y engorrosa, para obtener clones que produzcan formas naturales y afucosiladas del anticuerpo con calidades de producto coincidentes. Incluso más complejo es obtener clones naturales y con FUT8-KO que produzcan anticuerpos con atributos de calidad de producto suficientemente similares para garantizar que cualquier diferencia observada con la forma natural y afucosilada del anticuerpo se pueda atribuir estrictamente a la afucosilación.
Una línea de células individuales que puede producir la forma natural y afucosilada del anticuerpo permitiría la producción de un anticuerpo con los mismos atributos de calidad de producto. Aquí, se planteó la hipótesis de que inactivando la vía de novo y controlando el nivel de fucosa puede ser posible producir una línea celular que puede producir las formas fucosiladas naturales y afucosiladas un anticuerpo. Se ha informado previamente de la generación y caracterización de una línea huésped de CHO con supresión de GMD, sin embargo, las productividades específicas (Qp) logradas fueron bajas, aproximadamente de 16 pg/célula-d (Kanda et al., J Biotechnol, 130, 2007, 300-310). Aquí, se explora la supresión del gen de FX en la línea de huésped CHO-K1 por medio del sistema CRISPR/Cas9 y se evalúa el crecimiento, la expresión y el estado de fucosilación de los anticuerpos en dicho(s) huésped(es).
Resultados:
Selección como diana del locus de FX usando un sistema CRISPR/Cas9
Para seleccionar como diana el locus de FX, se secuenciaron las regiones codificantes en 5' y en 3' del gen de FX en CHO-K1. Usando la secuencia, se diseñaron construcciones de ARN guía (ARNg) que eran complementarias a la secuencia para su uso con un sistema CRISPR/Cas (Le Cong et al., Science, 339, 2013, 819-823; Mali et al., Nat procedimientos, 10, 2013, 957-963). Se diseñaron secuencias de ARNg que flanquean las regiones 5' y 3' del gen de FX y se cotransfectaron junto con un vector que expresaba Cas9 en una proporción equimolar para delecionar todo el gen de FX de 6 Kb. Los ARNg individuales se clonaron y expresaron bajo el control del activador U6 humano del vector pLKO.5 (n.° de cat. SHC-201, Sigma). Setenta y dos horas después de la transfección, se seleccionaron poblaciones de células transfectadas en medios que contenían 200 pg/ml de LCA (para seleccionar las células con glucoproteínas de superficie fucosiladas). Se usaron el kit de extracción de sangre y tejidos QIAGEN (n.° de cat. 69506) y la polimerasa Taq HiFi de Roche (n.° de cat. 11732650001) para la extracción de ADN y el análisis por PCR, respectivamente. Se diseñaron cebadores de PCR externos e internos en relación con los ARNg para distinguir entre alelos con deleción de FX completa frente a aquellos con deleciones naturales o pequeñas, respectivamente (figura 2A). Se transfectaron células CHO-K1 con vectores que expresaban ARNg y Cas9 y se seleccionaron como poblaciones en presencia de aglutinina de Lens culinaris (LCA). Se usó reactivo de LCA conjugado con fluoresceína (FITC) (LCA-FITC) para confirmar la reducción de la glucoproteína fucosilada sobre la superficie celular por un clasificador de flujo.
La deleción génica de FX se confirmó por medio de análisis por PCR (FIG. 2B). Se usaron cebadores internos para los ARNg para detectar alelos naturales o alelos con pequeñas deleciones, mientras que se usaron cebadores externos para detectar alelos con deleción completa del gen de FX.
Las poblaciones con deleción de FX se sometieron a clonación de células individuales por medio de dilución limitada y se cribaron por PCR, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) e inmunoelectrotransferencia para detectar la deleción del gen de FX. El análisis de citómetro de flujo de la población 3 con FXKO, teñida con LCA-FITC, confirmó la ausencia/reducción en los niveles de glucoproteínas fucosiladas en la superficie celular (FIG. 3).
Aislam iento de clones de células individuales y confirmación de la supresión del gen de FX
Para obtener clones individuales donde el gen de FX está suprimido en todos los alelos, las células de la población 3 se sometieron a clonación de células individuales por dilución limitada y se cribaron por PCR para detectar deleciones en el gen de FX (FIG. 4A). Entre los clones cribados, 5 clones poseían al menos un alelo delecionado y uno natural, y un clon (clon 11) presentó la deleción de FX completa en todos sus alelos (FIG. 4A). Téngase en cuenta que, si bien la presencia del/de los producto(s) de PCR detectado(s) por el conjunto de cebadores KO es indicativa de la deleción génica de FX, la presencia de una banda de PCR amplificada por el conjunto de cebadores naturales no implica necesariamente que el gen de FX pueda expresar una proteína funcional (FIG. 2A y FIG. 4A). El enfoque de cribado diseñado para los cebadores naturales no distingue entre mutaciones puntuales y pequeñas deleciones, lo que puede dar como resultado la expresión de una proteína FX truncada o no funcional, o incluso una carencia en la expresión de la proteína FX en conjunto. Para confirmar la falta de expresión de la proteína FX, se analizaron los 6 clones superiores por un ensayo de inmunotransferencia y se confirmó que todos los clones carecían de expresión de la proteína Fx (FIG. 4B). Esto sugiere que el gen de FX se suprime por medio de una deleción del alelo completa o bien una combinación de deleción y desplazamiento del marco de lectura. También se usó tinción con LCA-FITC y citometría de flujo para confirmar que, dependiendo de la ausencia o presencia de fucosa en los medios, estos clones pueden expresar glucoproteínas afucosiladas o fucosiladas, respectivamente (FIGS. 5A-5F).
Evaluación de clones con FXKO para expresar anticuerpos naturales o afucosilados
Los huéspedes con FXKO 3-5, 3-7 y 3-11 se eligieron en base a los perfiles de crecimiento y viabilidad para realizar una evaluación adicional, específicamente para garantizar que pueden expresar anticuerpos afucosilados. Con este fin, estos huéspedes con FXKO se transfectaron con una construcción que expresaba el anticuerpo A y se seleccionó la población durante 3 semanas (FIG. 6A). Se usó un huésped CHO-K1 original como control y se confirmó la expresión del anticuerpo para todas las poblaciones usando el ensayo HTRF (datos no mostrados). A continuación, se usaron estas poblaciones para preparar cultivos de producción de lotes alimentados de 14 días en presencia o ausencia de fucosa. A continuación, se purificaron las moléculas de anticuerpo A expresado de cada cultivo a partir de los medios de cultivo usando columnas con proteína A y se analizaron sus diversas especies de polisacáridos por electroforesis capilar después del tratamiento con PNGasa F (FIG. 6B). Un pico principal que representa la especie de polisacárido G0-F (afucosilado) estaba presente en todos los huéspedes con FXKO en ausencia de fucosa, mientras que en presencia de fucosa, la especie G0 formaba el pico principal en los gráficos del electroforetograma (FIG. 6b ). El análisis de más de un 98 % de todas las especies de polisacáridos de anticuerpos de cada huésped con FXKO mostró que todos expresan sólo anticuerpos afucosilados en ausencia de fucosa mientras que cuando está presente la fucosa, menos de un 2 % de los anticuerpos están afucosilados (FIG. 6C). Por lo tanto, si bien es insuficiente para la fucosilación en ausencia de fucosa, el proceso de fucosilación del anticuerpo se restauró completamente en todos los clones con FXKO cuando estaba presente la fucosa (FIG.
6C). Puesto que el gen de FX está completamente delecionado en todos los alelos del huésped con FXKO3-11 (FIG. 4A), se eligió este huésped para estudios adicionales.
Evaluación del huésped con FXKO en el procedimiento de CLD
Para evaluar el comportamiento del huésped con FXKO3-11 durante el CLD, este huésped se transfectó con un vector que expresaba el anticuerpo B y la glutamina sintasa (GS) como marcador de selección y se realizó un CLD completo. Se evaluaron los 24 clones superiores en un ensayo de producción y mostraron tener valores de 3,5­ 5,5 g/l (FIG. 7A). A diferencia de las líneas con supresión de GMD informadas previamente que tenían la Qp más alta de 16 pg/célula-día (Kanda et al., J Biotechnol, 130, 2007, 300-310), los clones con FXKO3-11 tenían una Qp que variaban de 25-130 pg/célula-día, teniendo la mayoría de los clones una Qp de 40-70 pg/célula-día (FIG. 7B). Los clones con FXKO3-11 que expresan el anticuerpo B presentaron un amplio intervalo de crecimiento (4-18 millones de células/ml) y viabilidad en el día 14 (40-95 %) y, como era de esperar, los clones con mayor Qp crecieron más lentamente en comparación con los que tenían menor Qp. (FIG. 7C) (datos adicionales no mostrados). Adicionalmente, todos los clones con FXKO3-11 expresaron moléculas de anticuerpo B completamente afucosiladas, con la mayoría de las glucoformas como G0-F (FIG. 7D), G1-F (FIG. 7E) y G0-1-F (FIG. 7F), en orden de abundancia, respectivamente. La expresión del anticuerpo B también se evaluó de forma independiente en un huésped DP12 de FUT8-KO, siguiendo un protocolo de CLD idéntico, expresando los clones superiores el anticuerpo B afucosilado en valores de 30-40 % más bajos en comparación con los de los clones con FXKO3-11 superiores (datos no mostrados). Estos hallazgos indican que los huéspedes con FXKO pueden expresar una molécula de anticuerpo dada en valores comparables o mayores en relación con los del huésped de FUT8-KO y con el potencial de expresar las versiones tanto naturales como afucosiladas del anticuerpo.
El huésped con FXKO expresa versiones tanto WT como afucosiladas de un anticuerpo con calidades de producto similares
Para evaluar si los clones con FXKO que expresan anticuerpos pueden expresar las versiones tanto naturales como afucosiladas del mismo anticuerpo con calidades de producto comparables, se usaron clones con FXKO que expresan el anticuerpo A (FIGS. 6A-6C) en un ensayo de producción con o sin fucosa 1 mM en los medios. El porcentaje de variantes de carga y los niveles de agregación del anticuerpo A fueron similares para cada clon en presencia o ausencia de fucosa en los medios (FIGS. 8A-8B). Se realizó un ensayo de producción similar para dos clones con FXKO que expresaban el anticuerpo B (FIGS. 7A-7F) en presencia o ausencia de fucosa 1 mM y ambos clones tuvieron valores comparables independientemente de los niveles de fucosa (FIG. 8C). En ausencia de fucosa, todas las especies de polisacáridos del anticuerpo B estaban afucosiladas, sin embargo, por adición de fucosa a los medios de producción, ambos clones expresaron el anticuerpo B con la distribución normal y esperada de las especies de polisacáridos WT (FIG. 8D).
Si bien el porcentaje de especies de variantes de carga fue comparable entre los dos clones en presencia o ausencia de fucosa (FIG. 8E), se observó que el porcentaje del pico principal es algo mayor (4 %) y el porcentaje del pico ácido es algo menor (4 %) cuando se añade fucosa a los medios de producción (FIG. 8E). Téngase en cuenta que no se observó un comportamiento de este tipo para las poblaciones de producción del anticuerpo A (FIG. 8A). El porcentaje de niveles de agregado permaneció comparable para los clones que expresaban el anticuerpo B en presencia o ausencia de fucosa (FIG. 8F).
Puesto que el huésped con FXKO ofrece la opción de expresar anticuerpos tanto naturales como afucosilados con calidades de producto casi idénticas, es adecuado para evaluar el papel de la afucosilación en la potenciación de ADCC de un anticuerpo in vitro e in vivo. Dicho rasgo garantiza que el resultado de los estudios de la función efectora o de la toxicidad podría estar directamente vinculado con los niveles de especies de anticuerpos naturales y afucosilados, y no con las diferencias de calidad del producto que están presentes de forma accidental cuando diferentes clones expresan estos anticuerpos.
El huésped con FXKO se puede usar para expresar un anticuerpo con las proporciones deseadas de glucoformas WT con respecto a afucosiladas
En los casos donde tener especies de anticuerpos completamente afucosilados es innecesario o indeseable debido a la toxicidad, puede ser beneficioso determinar los niveles de anticuerpos afucosilados necesarios para ejercer el efecto completo de ADCC, mientras se minimiza la toxicidad. Para evaluar si los clones con FXKO pueden expresar anticuerpos con un nivel(es) deseado(s) de glucoformas afucosiladas, se seleccionaron dos clones que expresaban el anticuerpo B para establecer cultivos de producción con niveles crecientes de fucosa en los medios (0-1 mM). Este experimento se realizó un par de veces para ajustar los niveles de alimentación de fucosa que corresponde a un determinado porcentaje de la especie de anticuerpo afucosilado en el cultivo. Las FIGS. 6A-6B muestran que la adición de determinadas concentraciones de fucosa a los medios de producción y la alimentación se pueden usar para lograr una proporción deseada de niveles de anticuerpos naturales con respecto a afucosilados. Para estos experimentos se usó el enfoque de alimentación en bolo. Sin embargo, se concibe que también se puede usar un enfoque de equilibrio continuo para producir las proporciones de anticuerpo natural con respecto a afucosilado deseadas.
Puesto que los niveles de diversas especies de polisacáridos se determinan por tratamiento con PNGasa F seguido de electroforesis capilar, no es posible determinar la fracción de moléculas de anticuerpo con cero, uno o dos polisacáridos afucosilados por este procedimiento. De todas formas, los valores de anticuerpos (FIG. 6C), los niveles de agregación (FIG. 6D) y los porcentajes de variantes de carga (FIG. 6E) fueron comparables independientemente de la concentración de fucosa en los medios de producción. En general, estos hallazgos muestran que un huésped con FXKO permitió la expresión de anticuerpos con las proporciones deseadas de glucoformas naturales con respecto a afucosiladas, adecuadas para medir los niveles de ADCC deseados mientras se evita la toxicidad. Además, se pueden lograr las proporciones deseadas de anticuerpos naturales con respecto a afucosilados con calidades de producto comparables valorando la fucosa en los medios de producción y la alimentación, para evaluar los niveles de afucosilación necesarios para maximizar la ADCC mientras se minimiza la toxicidad.
Procedimientos:
Construcciones de vectores y reactivos
La expresión de anticuerpos constitutivos se logró clonando los genes de la cadena pesada y la ligera bajo el control del activador del citomegalovirus (CMV) en un vector de expresión de anticuerpos que también dirige la expresión de glutamina sintasa (GS) para la selección. El ensamblaje del vector de expresión final y la selección usando este vector se ha descrito previamente. Véase, Hu et al., Biotechnol Progr, 29, 2013, 980-985. Para la inmunotransferencia se usaron anti-p-actina de ratón (Sigma, n.° de cat. A2228, a 1:30.000), y anticuerpo policlonal de conejo frente a FX (GeneTex, n.° de cat. 101663, a 1:2000). En los tampones de lisis se usó un combinado inhibidor de proteasa (Roche, n.° de cat. 11 -836-153-001). Los reactivos de aglutinina de Lens Culinaris (LCA) (n.° de cat. L-1040) y LCA conjugado con FITC (LCA-FITC) (n.° de cat. FL-1041) se adquirieron de Vector Laboratories. La fucosa se adquirió de Sigma (n.° de cat. F2252). Se usaron los siguientes cebadores para amplificar los segmentos del gen WT o con FXKO:
Cebador de FX WT directo: G T C A C C C A A A G C T C T C C T T G (SEQ ID NO. 1);
cebador de FXWT inverso: A A A A G T C C T C C T C T G C T T G C (SEQ ID NO. 2);
cebador con FXKO directo: C T A G G C T T C C C T A G G C C A T T (SEQ ID NO. 3); y
cebador con FXKO inverso: G C T A T G C C C T T G A G T C T T ü ü (SEQ ID NO. 4).
Inmunotransferencia
Para el análisis de inmunotransferencia, las células se lisaron a 30-50 millones de células/ml en tampón de lisis NP40 (Tris 10 mM, pH 8,0, NP40 al 0,5 %, NaCl 150 mM y MgCh 5 mM con combinado inhibidor de proteasa) durante 20 minutos en hielo. A continuación, los lisados se centrifugaron durante 10 minutos a 13.000 rpm a 4 °C y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se determinó la concentración de proteína por el ensayo BCA (Thermo Scientific). Se mezclaron 150 pl de cada lisado con 50 pl de 4X tampón de carga reductor y se llevó a ebullición durante 5 minutos. Se cargaron concentraciones de proteína iguales para cada muestra en gel de SDS-PAGE (Tris-glicina al 4-20 %) y se transfirieron a la membrana para inmunotransferencia.
Análisis FACS de células teñidas con LCA-FITC
Se centrifugaron 200.000 células y se lavaron una vez con 0,5 ml de PBS y se resuspendieron en 0,3 ml de PBS con BSA al 1 %. Las células se tiñeron con LCA-FITC a una concentración final de 2 pg/ml durante 30 minutos en hielo. A continuación, las células se transfirieron a tubos de FACS y se analizaron usando un citómetro de flujo analítico FACSCalibur (Becton Dickinson). Se usó el programa informático Flow Jo para analizar todas las muestras.
Cultivo celular y transfección estable
Se cultivaron células huésped CHO-K1 en medios de Genentech patentados sin suero a 37 °C y 5 % de CO2. Se usó el kit V nucleofector Amaxa (Lonza, n.° de cat. VCA-1003) para transfectar de forma estable células CHO-K1 siguiendo los protocolos de transfección estándar. Las células transfectadas se sembraron en placas de 384 pocillos y se seleccionaron con metionina sulfoximina (MSX). 3-4 semanas más tarde, se recogieron 1000 colonias en crecimiento en placas de 96 pocillos en presencia de MSX. Después de 4-5 días, las colonias recogidas se sometieron a ensayo para determinar la expresión de anticuerpos usando un ensayo de FRET de resolución temporal homogénea (HTRF). Los clones superiores se sometieron a clonación de células individuales usando dilución limitante en placas de 384 pocillos, seguido de formación de imágenes 3-4 semanas más tarde, se recogieron aproximadamente 700 clones en crecimiento en placas de 96 pocillos y se sometieron a un ensayo de HTRF (días 4-6). Los 200 clones que expresan anticuerpos superiores y, posteriormente, los 100 superiores se sometieron a ensayo por medio de HTRF. Los 48 clones sometidos a clonación de células individuales superiores y confirmados con imágenes se adaptaron al crecimiento en suspensión y se evaluaron en ensayos de producción como se describe previamente (Misaghi et al., Biotechnol Progr, 30, 2014, 1432-1440). En resumen, las células se sembraron a 1x106 células/ml en un medio de producción, con las cantidades indicadas de fucosa. Los cultivos recibieron medio de alimentación patentado y fucosa (en las concentraciones indicadas) los días 3, 7 y 10. El recuento de células viables (VCC) y el % de viabilidad de las células en cultivo se midieron los días 0, 3, 7, 10 y 14 usando un instrumento Vi-Cell X r (Beckman Coulter). Los valores de anticuerpos se determinaron los días 7, 10 y 14 del cultivo de producción (purificación con proteína A). La glucosa y el lactato se midieron los días 7 y 14 usando un analizador Bioprofile 400 (Nova Biomedical). Las variantes de carga se midieron por medio de enfoque isoeléctrico capilar (clEF) y los subtipos de polisacáridos se identificaron por digestión con PNGasaF seguido de electroforesis capilar. Los niveles de agregados se determinaron sometiendo el anticuerpo purificado con proteína A una columna de filtración en gel (por tamaño).
Ejemplo 2:
La modulación de la fucosilación del anticuerpo en el huésped con FXKO puede regular la unión a FcyRIII y los niveles de ADCC
Procedimientos:
Ensayo de ADCC
Se usó una línea de linfocitos NK genomanipulada (Roche) para proporcionar células efectoras y se usaron células WIL2-S marcadas con DELFIA BATDA (Perkin Elmer) como células diana. Se preparó una mezcla de células diana WIL2-S marcadas (2 x 104) y linfocitos NK (1,0 x 105) en medio de ensayo (RPMI 1640 con FBS termoinactivado al 10 %, L-glutamina 2 mM, y HEPES 20 mM, pH 7,2) y se añadió a cada pocilio de una placa de histocultivo de 96 pocillos de fondo redondo. Se añadieron a las placas diluciones seleccionadas de anticuerpos (de 100 a 0,06 ng/ml) y las placas se incubaron durante 3 horas. La lisis celular se midió usando fluorescencia resuelta en el tiempo en unidades de fluorescencia relativas (UFR) por excitación a 345 nm y cuantificación de la emisión a 615 nm usando un lector de microplacas SPECTRAMAX® 190 (Molecular Devices). La absorbancia de los pocillos que contenían solo células diana marcadas sirvió como control para el fondo (fondo), mientras que los pocillos que contenían células diana marcadas con tampón de lisis DELFIA BATDA proporcionaron la señal máxima disponible (liberación máxima). Se midió la liberación espontánea (SR) a partir de los pocillos que contenían solo células diana, mientras que se midió SR NK a partir de los pocillos que contenían tanto células diana como efectoras sin anticuerpo. El porcentaje de toxicidad específica (% ST) se determinó de acuerdo con la siguiente fórmula:
% ST = {[(liberación específica - fondo) -(liberación espontánea - fondo)] x 100} / [(liberación máxima - fondo) -(liberación espontánea - fondo)].
Las curvas de respuesta a la dosis se generaron trazando la media del % ST de triplicados frente a la concentración de la muestra de anticuerpo en ng/ml usando un ajuste de 4 parámetros. El análisis de datos se realizó usando el programa informático de ajuste de curvas de análisis de líneas paralelas (PLA) de SOFTmaxPROTM. Véase Shatz et al., MAbs, 5, 2013, 872-81.
Ensayo de unión a FcyRIII
Se usó un instrumento Biacore T200 (GE healthcare) para el análisis de SPR. El anticuerpo anti-His (R&D Systems) se diluyó hasta 50 pg/ml y se inmovilizó en micromatrices de CM5 sensoras de Biacore (GE healthcare) inyectando durante 7 minutos a 10 pl/min usando un kit de acoplamiento de aminas (GE healthcare). En cada ciclo, se capturó la proteína con marca FcYRIIIa-6xHis (Genentech) antes de la inyección de la muestra. La proteína con marca FcYRIIIa-6xHis se diluyó hasta 0,5 mg/ml en PBS con BSA al 0,1 % y Tween 20 al 0,05 % y se capturaron durante 2 minutos a 10 pl/min. Se inyectaron muestras preparadas a una concentración de anticuerpo de 10 pg/ml en PBS con Tween 20 al 0,05 % durante 5 minutos a 50 pl/min para la unión a FcYRIIIa. La fase de disociación se logró pasando el mismo tampón de migración a través de la cámara durante 5 minutos. Todos los experimentos se realizaron a 25 °C. Se hicieron fluir inyecciones por triplicado de cada muestra y un blanco de tampón sobre las dos superficies (una cubeta de lectura de referencia y una cubeta de lectura de pruebas). Los datos se recogieron a una frecuencia de 1 Hz. La lectura fue la respuesta de unión máxima durante la fase de asociación, cinco segundos antes del final de la inyección de la muestra. Se procesó una cubeta de lectura de referencia junto con la cubeta de lectura de pruebas para anular los efectos de la unión no específica. Además, se incluyeron inyecciones de tampón de migración en blanco en cubetas de lectura experimentales. Las señales de la cubeta de lectura de referencia y las inyecciones de tampón en blanco se restaron de la respuesta absoluta de las inyecciones de muestra en las cubetas de lectura experimentales (procedimiento de doble resta). Los datos se analizaron usando el programa informático de evaluación Biacore T200 y el programa informático JMP.
Resultados:
Para evaluar la función de anticuerpos con diferentes proporciones de glucoformas afucosiladas con respecto a fucosiladas, se usó un clon con FXKo que expresaba el anticuerpo B para configurar ensayos de producción con diferentes niveles de alimentación de fucosa (FIG. 10A). El incremento de las concentraciones de alimentación de fucosa durante la producción dio como resultado un incremento gradual en los niveles de especies de anticuerpos fucosilados mientras que los niveles de especies de anticuerpos afucosilados disminuyeron en consecuencia. A continuación, se purificó el anticuerpo B a partir de estos cultivos y se sometió a un ensayo de unión a FcyRIII in vitro como sustituto de la unión de linfocitos NK (FIG. 10B). Como se ilustra, una disminución en los niveles de especies de anticuerpos fucosilados corresponde a una disminución en la unión a FcyRIII (FIG. 10B). Aunque a concentraciones de fucosa de 0,025 mM sólo se afucosilan aproximadamente un 40-50 % de los polisacáridos, aproximadamente un 80 % de la competencia de unión a FcyRIII permanece intacta. Las células huésped con FXKO se transfectaron con una construcción que expresaba el anticuerpo C (IgG1), para lo que se había desarrollado un ensayo de ADCC funcional. Después de la selección de la población, se realizaron ensayos de producción de la población con las concentraciones indicadas de alimentación de fucosa para obtener cultivos de anticuerpo C con proporciones variables de especies de anticuerpos afucosilados con respecto a fucosilados (FIG.
10C). Se usó anticuerpo C purificado a partir de estos cultivos en ensayos de ADCC y se observó una correlación lineal entre el % de actividad de ADCC y los niveles de especies de polisacáridos afucosilados (FIG. 10D). La mezcla de muestras de anticuerpo C principalmente fucosilado (fucosa 1 mM) y completamente afucosilado (fucosa 0 mM) podría desencadenar una respuesta de ADCC predecible (FIG. 10E) en base a los niveles de especies de polisacáridos afucosilados y el gráfico de valoración de fucosa (FIG. 10D). Esto sugiere que el enfoque de alimentación de fucosa es de hecho un procedimiento viable para generar anticuerpos con calidades de producto similares y la distribución deseada de especies de polisacáridos fucosilados con respecto a afucosilados para desencadenar ADCC de una manera predecible. Es digno de mención que el enfoque de alimentación de fucosa elimina la necesidad de dos campañas de fabricación separadas requeridas para generar anticuerpos tanto completamente afucosilados como principalmente fucosilados.
El análisis de respuesta a la dosis de ADCC mostró que las moléculas de anticuerpo C completamente afucosiladas podían lograr un 50 % de la actividad máxima de ADCC a concentraciones 20 veces menores en comparación con sus homólogas principalmente fucosiladas (FIG. 10G). Téngase en cuenta que casi un 80 % de la actividad de ADCC se puede mantener con solo un 60 % de moléculas de anticuerpo que tienen especies de polisacáridos afucosilados (FIGS. 10D, 10E y 10F). Adicionalmente, con una alimentación de fucosa 0,02 mM donde menos de un 40 % de los polisacáridos están afucosilados, se puede lograr un % de actividades de ADCC relativamente comparable con las mismas concentraciones de anticuerpo C que con las muestras completamente afucosiladas (fucosa 0 mM) (FIG. 10G). Por consiguiente, los hallazgos sugieren que no es necesario tener un 100 % de anticuerpos completamente afucosilados para lograr niveles casi máximos de actividad de ADCC.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de producción de una proteína, en el que la proteína se produce en formas fucosiladas y afucosiladas en una proporción predeterminada, comprendiendo el procedimiento:
cultivar una célula huésped genomanipulada para expresar la proteína en un medio de cultivo, en el que la célula huésped es una célula huésped con supresión de GDP-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa,4-reductasa (FX), y
en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa en una cantidad suficiente para producir las formas fucosiladas y afucosiladas de la proteína en la proporción predeterminada.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proporción predeterminada es de 50:1 a 1:50.
3. Un procedimiento para ajustar un nivel de fucosilación de una proteína producida por una célula huésped genomanipulada para producir la proteína, comprendiendo el procedimiento:
a) cultivar la célula huésped en un medio de cultivo inicial, en el que la célula huésped es una célula huésped con supresión de FX, y en el que el medio de cultivo comprende una fuente de fucosa;
b) determinar el nivel de fucosilación de la proteína; y
c) ajustar la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo de modo que la proteína se produzca a un nivel predeterminado de fucosilación, en el que ajustar la cantidad de la fuente de fucosa comprende incrementar la cantidad de la fuente de fucosa cuando el nivel de fucosilación es bajo, o disminuir la cantidad de la fuente de fucosa cuando el nivel de fucosilación es alto.
4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el procedimiento comprende cultivar la célula huésped en un medio de cultivo libre de la fuente de fucosa antes de cultivar la célula huésped en el medio de cultivo que comprende la fuente de fucosa, en particular en el que la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo durante la etapa de cultivo está entre 0,01 mM y 1 mM.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la fuente de fucosa está presente en el medio de cultivo al comienzo de la etapa de cultivo, en particular en el que la cantidad de la fuente de fucosa en el medio de cultivo durante la etapa de cultivo está entre 0,01 mM y 1 mM.
6. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la etapa de cultivo se lleva a cabo a menos de 37 °C.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-6, que comprende además aislar la proteína del cultivo celular.
8. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la fuente de fucosa es una fucosa, en particular en el que (i) la fucosa es L-fucosa, (ii) la fucosa es L-fucosa-1-fosfato, o (iii) la fuente de fucosa es GDP-fucosa.
9. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína es una proteína que contiene Fc.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la proteína que contiene Fc comprende una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento de la misma.
11. El procedimiento de la reivindicación 9 o 10, en el que la proteína que contiene Fc es un anticuerpo de longitud completa, en particular en el que el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo monoclonal.
12. El procedimiento de la reivindicación 9 o 10, en el que la proteína que contiene Fc es una proteína de fusión que contiene Fc, en particular en el que la proteína de fusión que contiene Fc es una inmunoadhesina.
13. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la célula huésped es una célula eucariota y/o en el que la célula huésped es una célula de mamífero, en particular en el que la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO).
14. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el gen de FX se inactiva por una deleción de secuencia, adición de secuencia o sustitución de secuencia.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el gen de FX se inactiva usando un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas, regularmente espaciadas (CRISPR), un sistema de nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN), un sistema de nucleasa con dedos de cinc (ZFN) o un sistema de meganucleasa.
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