CN112763435A - 一种肺炎链球菌致死性定量评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，包括如下步骤：用1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50的肺炎链球菌细菌原液，采用液相肺炎链球菌荚膜染色法进行染色，制备得到不同浓度的染色菌液；使用蒸馏水调零，对步骤S1中多组不同浓度的染色菌液分别进行比色，测定619nm波长处的吸光度，绘制标准曲线；将待测样本进行液相肺炎链球菌荚膜染色处理，获得的染色菌液在619nm波长条件下比色，将比色得到的吸光度值在标准曲线上找出对应的LD50数量，得到该样本的致死性量度。本发明提供的肺炎链球菌致死性定量评估方法，不需要采用动物实验，可在数小时内完成测定，是一种简单、易操作、成本低的测定方法。
Description
技术领域
本发明涉及肺炎链球菌致死性测定方法技术领域，具体涉及一种肺炎链球菌致死性定量评估方法。
背景技术
肺炎链球菌是一种人类致病性***，常引起人类呼吸道感染，如肺炎、咽炎、扁桃体炎等。该菌是一种具有荚膜的细菌，且荚膜是该菌最重要的致死性物质。有荚膜的肺炎链球菌称为有毒株，无荚膜的肺炎链球菌称为无毒株。因此，荚膜与其致病性密切正相关。
半数致死量(median lethal dose，LD50)是常用于评估细菌致死性强弱的量纲。1个LD50是指：在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数死亡所需最小细菌数量。
既往，评估肺炎链球菌的致死性强弱，通常采用LD50测定法。但是这种测定方法需要使用至少数十只动物(通常是小白鼠)做实验，费用高昂，且需要数天时间才能获得测定结果。
鉴于此，克服上述现有技术所存在的缺陷，提供一种简单、易操作、成本低、测定周期短的测定方法，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，不需要采用动物实验，可在数小时内完成测定，是一种简单、易操作、成本低的测定方法。
为了解决上述问题，本发明提供了一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，所述技术方案如下：
一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，包括如下步骤：
步骤S1，用1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50的肺炎链球菌细菌原液，采用液相肺炎链球菌荚膜染色法进行染色，制备得到不同浓度的染色菌液；
步骤S2，使用蒸馏水调零，对步骤S1中多组不同浓度的染色菌液分别进行比色，测定619nm波长处的吸光度，绘制标准曲线；
步骤S3，将待测样本进行液相肺炎链球菌荚膜染色处理，获得的染色菌液在619nm波长条件下比色，将比色得到的吸光度值在标准曲线上找出对应的LD50数量，得到该样本的致死性量度。
进一步地，步骤S1和步骤S3中，液相肺炎链球菌荚膜染色法包括如下步骤：
将肺炎链球菌菌液在5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；
向菌体沉淀物中加入7％孔雀绿水溶液10ml，轻柔搅匀，在37℃染色20分钟；5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；
向菌体中加入生理盐水10ml,5000转/分条件下离心2分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；
向菌体沉淀物中加入2ml生理盐水，轻柔搅匀，获得染色菌液。
进一步地，1LD50浓度的肺炎球菌＝6.42×108CFU/mL,2LD50浓度的肺炎球菌＝1.28×109CFU/mL,3LD50浓度的肺炎球菌＝1.93×109CFU/mL,4LD50浓度的肺炎球菌＝2.57×109CFU/mL,5LD50浓度的肺炎球菌＝3.21×109CFU/mL。
进一步地，步骤S1中，不同浓度的细菌原液采用如下方法制备得到：
制作培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，氯化钠5克，加水1000ml，加热溶解，调pH至7.5，在103.4kPa压力下灭菌20分钟；以无菌操作按10％浓度加入无菌兔血清，制备得到血清肉汤培养基；
制作肺炎链球菌培养液：接种处于对数生长期的肺炎链球菌于血清肉汤培养基中，混匀，在37℃培养箱中培养24小时；
制作不同浓度的细菌原液：将肺炎链球菌肉汤培养液在5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；通过稀释法，制备5个不同浓度的细菌原液，分别是1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50。
与现有技术相比，本发明提供的一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，有益效果在于：
本发明提供的肺炎链球菌致死性定量评估方法，使用荚膜染色和分光光度计比色测定用于定量评估肺炎链球菌致死性，无需采用动物实验，可在数小时内完成检测，是一种简单、易操作、成本低的测定方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的肺炎链球菌致死性定量评估方法中标准曲线的示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应该被视为在本文中具体公开。
本发明提供的肺炎链球菌致死性定量评估方法，实验原理是：肺炎链球菌的荚膜是该菌最重要的致死性物质，有荚膜的肺炎链球菌是有毒株，无荚膜的肺炎链球菌则称为无毒株。荚膜与其致死性呈密切正相关，因此通过荚膜的多少作为评估肺炎链球菌致死性的定量性指标。
一、实验方法
(一)培养基
本实施例使用的培养基是利于肺炎链球菌荚膜生成的血清肉汤培养基。培养基制作如下：
牛肉膏3克，蛋白胨10克，氯化钠5克，加水1000ml。加热溶解，调pH至7.5。采用103.4kPa(15磅)灭菌20分钟。以无菌操作按10％浓度加入无菌兔血清，制备得到血清肉汤培养基。
(二)肺炎链球菌培养
接种处于对数生长期的肺炎链球菌于血清肉汤培养基中，混匀，在37度培养箱中培养24小时，制备得到肺炎链球菌培养液。
(三)液相肺炎链球菌荚膜染色法
1、将肺炎链球菌肉汤培养液在5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；
2、通过稀释法，制备5个不同浓度的细菌原液，分别是1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50。本实施例中，1LD50浓度的肺炎球菌＝6.42×108CFU/mL,2LD50浓度的肺炎球菌＝1.28×109CFU/mL,3LD50浓度的肺炎球菌＝1.93×109CFU/mL,4LD50浓度的肺炎球菌＝2.57×109CFU/mL,5LD50浓度的肺炎球菌＝3.21×109CFU/mL；
3、向菌体沉淀物中加入7％孔雀绿水溶液10ml，轻柔搅匀，在37℃染色20分钟；5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；
4、向沉淀物加入生理盐水10ml,不用搅匀，5000转/分钟离心2分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；
5、向菌体沉淀物中加入2ml生理盐水，轻柔搅匀，获得染色菌液。
(四)比色测定
1、用1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50的肺炎链球菌的细菌原液，采用上述液相肺炎链球菌荚膜染色法进行染色，制备得到不同浓度的染色菌液；
2、使用蒸馏水调零，对5组不同浓度的染色菌液分别进行比色，测定619nm波长处的吸光度，绘制标准曲线；本实施例中，根据1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50中肺炎链球菌的菌落总数，绘制的标准曲线如附图1所示；
3、将待测样本进行液相肺炎链球菌荚膜染色处理，获得的染色菌液在619nm波长条件下比色，将比色得到的吸光度值在标准曲线上找出对应的LD50数量，得到该样本的致死性量度。
本发明提供的肺炎链球菌致死性定量评估方法，使用荚膜染色和分光光度计比色测定用于定量评估肺炎链球菌致死性，无需采用动物实验，可在数小时内完成检测，是一种简单、易操作、成本低的测定方法。
以上结合附图对本发明的实施方式作出详细说明，但本发明不局限于所描述的实施方式。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行的多种变化、修改、替换和变型均仍落入在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，用1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50的肺炎链球菌细菌原液，采用液相肺炎链球菌荚膜染色法进行染色，制备得到不同浓度的染色菌液；
步骤S2，使用蒸馏水调零，对步骤S1中多组不同浓度的染色菌液分别进行比色，测定619nm波长处的吸光度，绘制标准曲线；
步骤S3，将待测样本进行液相肺炎链球菌荚膜染色处理，获得的染色菌液在619nm波长条件下比色，将比色得到的吸光度值在标准曲线上找出对应的LD50数量，得到该样本的致死性量度。
2.根据权利要求1所述的一种肺炎链球菌致死性定量评估方法，其特征在于，步骤S1和步骤S3中，液相肺炎链球菌荚膜染色法包括如下步骤：
将肺炎链球菌菌液在5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；
向菌体沉淀物中加入7％孔雀绿水溶液10ml，轻柔搅匀，在37℃染色20分钟；5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；
向菌体中加入生理盐水10ml,5000转/分条件下离心2分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；
向菌体沉淀物中加入2ml生理盐水，轻柔搅匀，获得染色菌液。
3.根据权利要求1所述的肺炎链球菌致死性定量评估方法，其特征在于，1LD50浓度的肺炎球菌＝6.42×108CFU/mL,2LD50浓度的肺炎球菌＝1.28×109CFU/mL,3LD50浓度的肺炎球菌＝1.93×109CFU/mL,4LD50浓度的肺炎球菌＝2.57×109CFU/mL,5LD50浓度的肺炎球菌＝3.21×109CFU/mL。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的肺炎链球菌致死性定量评估方法，其特征在于，步骤S1中，不同浓度的细菌原液采用如下方法制备得到：
制作培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，氯化钠5克，加水1000ml，加热溶解，调pH至7.5，在103.4kPa压力下灭菌20分钟；以无菌操作按10％浓度加入无菌兔血清，制备得到血清肉汤培养基；
制作肺炎链球菌培养液：接种处于对数生长期的肺炎链球菌于血清肉汤培养基中，混匀，在37℃培养箱中培养24小时；
制作不同浓度的细菌原液：将肺炎链球菌肉汤培养液在5000转/分条件下离心8分钟，倒去上清液，留沉淀菌体；通过稀释法，制备5个不同浓度的细菌原液，分别是1个LD50、2个LD50、3个LD50、4个LD50及5个LD50。
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| 王欣等: "肺炎链球菌腹腔感染小鼠不同致死率动物模型的建立", 王欣等, vol. 47, no. 04, pages 120 - 121 * |
| 王燕等: "肺炎链球菌荚膜教学标本的制作方法研究", 中国当代医药, vol. 26, no. 6, pages 25 - 28 * |
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