ES2870096T3 - Biomarcadores de respuesta a los inhibidores de EZH2 - Google Patents

Biomarcadores de respuesta a los inhibidores de EZH2 Download PDF

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Abstract

Un inhibidor de EZH2 para usar en el tratamiento de un cáncer en un sujeto que lo necesita, en donde la expresión de un biomarcador de BAP1 en el cáncer del sujeto está ausente o se expresa en un nivel más bajo que un nivel de control de referencia de BAP1, en donde el nivel de control de referencia de BAP1 es el nivel de expresión del biomarcador de BAP1 en una muestra de control de referencia; en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en mesoteliomas malignos, melanomas uveales, carcinoma de células renales, melanomas cutáneos, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de piel no melanoma, meningioma, colangiocarcinoma, leiomiosarcoma, tumores neuroendocrinos, cáncer pancreático, paraganglioma, histiocitoma fibroso maligno, tumores intradérmicos atípicos melanocíticos de BAP1 mutada (MBAIT), leucemia mieloide aguda, síndromes mielodisplásicos y cáncer de vejiga; y en donde el inhibidor de EZH2 se selecciona del grupo que consiste en UNC1999, 3-deazaneplanocina A, EI1, EPZ- 6438, EPZ-5676, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 y GSK126.

Description

DESCRIPCIÓN
Biomarcadores de respuesta a los inhibidores de EZH2
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad a la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N.° de Serie 62/014.594, presentada el 19 de junio de 2014.
1. Introducción
La presente invención se refiere a biomarcadores que pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de que un inhibidor de EZH2 produzca un efecto anticanceroso en un sujeto. Como tales, estos biomarcadores pueden utilizarse en métodos para tratar pacientes con cáncer.
2. Antecedentes de la invención
La proteína-1 asociada a BRCA1 (BAP1; del inglés, BRCA1 associated protein-1) es una hidrolasa carboxiterminal de ubiquitina que participa en la eliminación de ubiquitina de las proteínas. BAP1 se une a la proteína de susceptibilidad del cáncer de mama tipo 1 (BRCA1; del inglés, breast cancer type 1 susceptibility protein) a través del dominio de dedo RING de la BRCA1 y puede actuar como supresor de tumores. BAP1 está implicada en la regulación de la transcripción, la regulación del ciclo celular y crecimiento celular, la respuesta al daño del ADN y la dinámica de la cromatina. Los estudios de secuenciación del genoma han demostrado que las mutaciones de la línea germinal en BAP1 pueden asociarse con el síndrome de predisposición tumoral (TPDS; del inglés, tumor predisposition syndrome), que implica un mayor riesgo de cánceres que incluyen el mesotelioma maligno, melanoma uveal y melanoma cutáneo. Estudios adicionales han identificado mutaciones de la línea germinal BAP1 asociadas con otros cánceres, que incluyen el adenocarcinoma de pulmón y el carcinoma de células renales. El pronóstico de algunos pacientes con mutaciones de BAP1 es bastante malo sin tratamientos eficaces identificados, ya que muchos pacientes con mesotelioma maligno morirán a causa de su enfermedad. Las mutaciones BAP1 en pacientes con carcinoma de células renales predicen un mal pronóstico y las mutaciones BAP1 en pacientes con melanoma uveal predicen un grupo de mayor riesgo y metástasis.
El potenciador del homólogo 2 de zeste (EZH2), es un miembro de la familia del grupo Polycomb (PcG), cuyos miembros están involucrados en la regulación del estado transcripcional de genes por metilación de proteínas histonas. Se han desarrollado fármacos que se dirigen específicamente a EZH2 y el efecto de dichos fármacos en pacientes con diversos tumores ha sido un área de investigación activa. Actualmente, los inhibidores de EZH2 se están probando clínicamente en pacientes con linfoma con mutaciones activadoras de EZH2. Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de tratamientos para pacientes con mutaciones de BAP1 y biomarcadores que serán útiles para determinar cuándo debe usarse un inhibidor de EZH2 para tratar un cáncer.
Solo para referencia, el documento US 2014/011696 describe un kit con cebadores dirigidos o anticuerpos de BAP1. El documento WO 2012/144220 describe una expresión de EZH2 aumentada como marcador de diagnóstico en algunos cánceres. El documento WO 2013/049770 describe mutaciones específicas de EZH2 como marcador para la respuesta al tratamiento con inhibidores de EZH2. Hui Shen et al. (2013) debate la interrelación entre el genoma del cáncer y el epigenoma hace referencia a BAP1.
3. Sumario de la invención
En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un inhibidor de EZH2 para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto que lo necesita, en donde la expresión de un biomarcador de BAP1 en el cáncer del sujeto está ausente o se expresa en un nivel más bajo que un nivel de control de referencia de BAP1, en donde el nivel de control de referencia de BAP1 es el nivel de expresión del biomarcador de BAP1 en una muestra de control de referencia; en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en mesoteliomas malignos, melanomas uveales, carcinoma de células renales, melanomas cutáneos, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de piel no melanoma, meningioma, colangiocarcinoma, leiomiosarcoma, tumores neuroendocrinos, cáncer pancreático, paraganglioma, histiocitoma fibroso maligno, tumores intradérmicos atípicos melanocíticos de BAP1 mutada (MBAIT; del inglés, melanocytic BAP1-mutated atypical intradermal tumors), leucemia mieloide aguda, síndromes mielodisplásicos y cáncer de vejiga; y en donde el inhibidor de EZH2 se selecciona del grupo que consiste en UNC1999, 3-deazaneplanocina A, EI1, EPZ-6438, EPZ-5676, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 y GSK126.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un inhibidor de EZH2 para su uso en un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende determinar la expresión de un biomarcador de BAP1 en una o más células del cáncer del sujeto, donde si el biomarcador de BAP1 está ausente o se expresa en niveles más bajos en el cáncer, en comparación con un nivel de control de referencia de BAP1, a continuación, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de EZH2 al sujeto para producir un efecto anticanceroso, en donde el nivel de control de referencia de BAP1 es el nivel de expresión del biomarcador de BAP1 en una muestra de control de referencia; en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en mesoteliomas malignos, melanomas uveales, carcinoma de células renales, melanomas cutáneos, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de piel no melanoma, meningioma, colangiocarcinoma, leiomiosarcoma, tumores neuroendocrinos, cáncer pancreático, paraganglioma, histiocitoma fibroso maligno, tumores intradérmicos atípicos melanocíticos de BAP1 mutada (MBAIT), leucemia mieloide aguda, síndromes mielodisplásicos y cáncer de vejiga; y en donde el inhibidor de EZH2 se selecciona del grupo que consiste en UNC1999, 3-deazaneplanocina A, EI1, EPZ-6438, EPZ-5676, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 y GSK126.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para determinar si es probable que un efecto anticanceroso se produzca en un cáncer por un inhibidor de EZH2, que comprende la obtención de una muestra de un cáncer y determinar, en la muestra, el nivel de expresión de un biomarcador de BAP1, donde si el biomarcador de BAP1 está ausente o se expresa en un nivel más bajo en el cáncer, en comparación con un nivel de control de referencia de BAP1, es más probable que el inhibidor de EZH2 tenga un efecto anticanceroso sobre el cáncer, en donde el nivel de control de referencia de BAP1 es el nivel de expresión del biomarcador de BAP1 en una muestra de control de referencia; en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en mesoteliomas malignos, melanomas uveales, carcinoma de células renales, melanomas cutáneos, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de piel no melanoma, meningioma, colangiocarcinoma, leiomiosarcoma, tumores neuroendocrinos, cáncer pancreático, paraganglioma, histiocitoma fibroso maligno, tumores intradérmicos atípicos melanocíticos de BAP1 mutada (MBAIT), leucemia mieloide aguda, síndromes mielodisplásicos y cáncer de vejiga; y en donde el inhibidor de EZH2 se selecciona del grupo que consiste en UNC1999, 3-deazaneplanocina A, EI1, EPZ-6438, EPZ-5676, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 y GSK126.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para predecir la sensibilidad de un cáncer a un inhibidor de EZH2, que comprende obtener una muestra del cáncer y determinar el nivel de expresión de un biomarcador de la proteína bAP1 en las células de la muestra, en donde si el biomarcador de BAP1 está ausente o se reduce en el nivel de expresión en comparación con un nivel de control de referencia de BAP1, a continuación, se predice que el cáncer es sensible a un inhibidor de EZH2, en donde el nivel de control de referencia de BAP1 es el nivel de expresión del biomarcador de BAP1 en una muestra de control de referencia; en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en mesoteliomas malignos, melanomas uveales, carcinoma de células renales, melanomas cutáneos, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de piel no melanoma, meningioma, colangiocarcinoma, leiomiosarcoma, tumores neuroendocrinos, cáncer pancreático, paraganglioma, histiocitoma fibroso maligno, tumores intradérmicos atípicos melanocíticos de BAP1 mutada (MBAIT), leucemia mieloide aguda, síndromes mielodisplásicos y cáncer de vejiga; y en donde el inhibidor de EZH2 se selecciona del grupo que consiste en UNC1999, 3-deazaneplanocina A, EI1, EPZ-6438, EPZ-5676, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 y GSK126.
En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un kit en el método para determinar si es probable que un efecto anticanceroso se produzca en un cáncer por un inhibidor de EZH2 como se ha definido anteriormente, en donde el kit comprende unos medios para detectar un biomarcador de BAP1. En ciertas realizaciones, los medios para detectar un biomarcador de BAP1 comprenden uno o más cebadores, sondas, matrices/micromatrices, anticuerpos específicos de biomarcadores y/o perlas, envasados. En ciertas realizaciones, los medios para detectar un biomarcador de BAP1 comprenden uno más anticuerpos o fragmento(s) de unión a antígeno del (los) mismo(s), para detectar un biomarcador de BAP1. En ciertas realizaciones, el kit comprende adicionalmente uno o más cebadores, sonda, matrices/micromatriz, anticuerpo específico de biomarcador y/o perla para detectar la expresión de EZH2 y/o SUZ12.
4. Breve descripción de las figuras
FIGURA 1. La pérdida de BAP1 reguló positivamente la histona H3K27me3 in vitro.
FIGURA 2. EZH2 se sobreexpresó en células de mesotelioma mutantes de BAP1.
FIGURA 3. La ganancia/pérdida de la expresión de BAP1 dio como resultado la expresión de la subunidad PRC2 alterada.
FIGURA 4. La inhibición de EZH2 disminuyó el volumen del tumor en xenoinjertos de mesotelioma.
FIGURA 5A-L. Caracterización de la deleción hematopoyética condicional de Bap1. (a) Expresión génica promedio de BAP1, ASXL1, ASXL2 y ASXL3 en AML (leucemia mieloide aguda; del inglés, acute myeloid leukemia) del TCGA y (b) pacientes de mesotelioma expresados como una media matemática con error típico de los recuentos de lecturas normalizadas. (c) Expresión de Bap1 mediante qRT-PCR en poblaciones purificadas de células hematopoyéticas en ratones C57/B6H. LT-HSC, células madre hematopoyéticas (HSC; del inglés, hematopoietic stem cells) a largo plazo, (Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-); ST-HSC, HSC a corto plazo (Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48+); MPP, progenitor multipotente, (Lin'Sca-1+c-Kit+CD150'CD48+); LSK, Lin'Sca-1+c-Kit+; MP, progenitores mieloides (Lin'Sca-1'c-Kit+), GMP, progenitores de macrófagos y granulocitos (Lin'Sca-1'c-Kit+ CD34+Fcy+); CMP, progenitores mieloides comunes (Lin'Sca-1'c-Kit+ CD34+FcyId); Me P; progenitores de eritroides y macrófagos (Lin'Sca-1'c-Kit+ CD34'PcY'), MONO; monocitos (Mac1+Gr1‘), Pm N; (neutrófilo polimorfonuclear, Mac1+Gr1+), linfocitos T, CD3+; y linfocitos B, B220+. (d) Esquema de diana de Bap1 en células madre embrionarias murinas obtenidas del consorcio EUCOMM. Después de la generación quimérica, se cruzaron los ratones con ratones transgénicos FLPE para escindir el casete de parada prematura. A continuación, se cruzaron los ratones con ratones transgénicos Mx1-Cre. Esquemas de genotipado que confirman el genotipo y la escisión 4 semanas tras el tratamiento poliIpoliC (pIpC). (e) Enumeración de leucocitos en sangre periférica en ratones de control y Bap1 KO después del tratamiento con (pIpC) para inducir la escisión y (f) enumeración citométrica de flujo de células mieloides (Mac1+Gr1+). (g) Porcentajes de hematocrito en sangre periférica y (h) enumeración citométrica de flujo de precursores de eritrocitos (CD71+Ter119+) en la médula ósea de ratón control y de Bap1 KO después de la escisión inducida por pIpC. (i) Frecuencias relativas de poblaciones progenitoras mieloides de médula ósea de control y Bap1 KO (Linx-Kit+Sca1'). Las células se sometieron a selección de poblaciones vivas de linajes negativos. (j) Cuantificación relativa de las poblaciones de células progenitoras mieloides de la médula ósea (GMP, CMP, MEP) en ratones de control y Bap1 KO. (k) Diagramas de flujo de animales de control y de médula ósea de ejemplo para demostrar la expansión de progenitores y de GMP. (l) Enumeración citométrica de flujo de células progenitoras de ciclo (tinción Ki67/DAPI); para todos los experimentos: n=5 ratones CON y n=8 ratones Bap1 KO.
FIGURA 6A-L. La deleción de Bap1 conduce a una activación de la ruta diferencial, en comparación con la pérdida de Asxll y de H3K27me3 aumentada. (a) Imágenes del bazo tres semanas después de la deleción condicional de Bap1 y verificación de la deleción de Bap1 mediante transferencia Western de médula ósea de control (ratones Bap1f/f compañeros de camada, CON) y Bap1 inactivado (ratones Mx1-Cre Bap1f/f, Bap1, KO). (b) Diagramas de Venn que comparan la expresión génica de progenitores mieloides en ratones Bap1 y Asxll KO, p < 0,05; las comparaciones incluyen solapamiento de genes y genes que cambian en la misma dirección. (c) qPCR cuantitativa en tiempo real (qRT- PCR) del agrupamiento HoxA en progenitores de granulocitos-macrófagos clasificados (GMP; Lin- c-Kit+Scal-CD34+ Fcy+); de ratones Bap1 KO y de control (n=3). (d) Análisis espectrométrico de masas de histonas purificadas de células de médula ósea enriquecidas con c-Kit+ de Bap1 KO y de controles normalizados para la histona H3 total. (e) Transferencia Western de H3K27me3 y H3 total en histonas purificadas de Bap1 KO y médula ósea de control. (f) Número de dominios amplios de H3K27me3 que están identificados en las muestras de CON y de Bap1 KO. Diagrama de Venn que muestra un dominio amplio único y solapante. (g) Diagrama de cajas que muestra las lecturas de H3K27me3 normalizadas en células de médula ósea enriquecidas con c-Kit (n=2) (h) Representación de la densidad de dominios amplios en función de la distancia desde un dominio de H3K27me3 que se identificó en muestras tanto de CON como de Bap1 KO. (i) GSEA que demuestra correlaciones de expresión génica con genes regulados negativamente. (j) Gráfico local de ChlP-seq de H3K27me3 en el locus de HOXA. (k) Identificación de picos de ChlP-seq de H3K27me3 en células GMP clasificadas mostradas en un diagrama de volcán como se muestra por la relación (KO/CON) frente al valor p. (l) Significación de las firmas de los genes especificados para los genes unidos a H3K27me3 y RNA-Seq. Las estadísticas se calcularon con la prueba de la t de Student; *p<0,05, **p<0,005; ± valores notificados de ETM.
FIGURA 7A-C. La pérdida de Bap1 y Asxll da como resultado cambios en la expresión de genes opuestos. (a) Datos de RNA-Seq de genes expresados diferencialmente en progenitores de granulocitos-macrófagos (GMP; Linx-Kit+Sca1'CD34+ Fcy+) de ratones de control frente a Bap1 KO; celdas analizadas con DESeq2 (valor de corte p<0,05). La matriz cromática indica genes que aumentan (rojo) y que disminuyen (azul) en la expresión. (b) Número de conjuntos de genes enriquecidos positiva y negativamente del análisis GSEA de Bap1 KO y Asxll KO que alcanzan un FDR<0,25 (arriba). Diagrama de Venn que representa conjuntos de genes enriquecidos de forma opuesta en progenitores mieloides Bap1 KO y Asxll Ko mediante RNA-Seq (abajo). (c) GSEA de conjuntos de genes de agrupamiento HoxA enriquecidos de forma opuesta y estadísticamente significativos en células progenitoras de Bap1 KO y Asxll KO. Se indican los valores p y f Dr .
FIGURA 8A-C. La deleción de Bap1 mejora la actividad de PRC2. (a) ELISA de H3K27me3 normalizado para H3 total en histonas purificadas a partir de células de médula ósea de ratones Bap1 KO y de control. (b) Porcentaje de dominios amplios de H3K27me3 identificados en relación con el sitio de inicio de la transcripción del gen (promotor, exón, intrón, en dirección 3' (+/-2 kb), distal (2-5 kb) e intergénico (> 50 kb)). (c) Se analizó el RNA-Seq publicado de poblaciones de médula ósea clasificadas (Lara-Astiaso et al., 2014) y se comparó con genes que se regularon negativamente y se marcaron con H3K27me3 tras la pérdida de Bap1 y se analizaron utilizando GSEA. Los genes que estaban regulados negativamente y marcados por H3K27me3 solo se correlacionaron con las poblaciones de progenitores hematopoyéticos, lo que sugiere que estas pueden ser las poblaciones diana relevantes. Estos datos son explicativos de la expansión de progenitores que se observó en el modelo de ratón Bap1 KO.
FIGURA 9A-C. Las perturbaciones in vitro de BAP1 conducen a cambios en H3K27me3. (a) Transferencia Western de células SET2 transducidas con dos ARNhc de BAP1 independientes que revela niveles de H3K27me3 en histonas purificadas e inactivación de BAP1 del extracto de células completas. (b) Ensayo de metilcelulosa con células de médula ósea de control y Bap1 KO. Las construcciones de ADNc de BAP1 se reintrodujeron en las células de control y en las de Bap1 suprimido. Se realizaron ensayos ELISA de histonas para H3K27me3. qPCR cuantitativa para evaluar la expresión de la construcción BAP1. (c) Reintroducción de BAP1 y del mutante de desubiquitinasa BAP1 C91A en células murinas deficientes en Bap1. Se realizaron transferencias Western de histonas para H3K27me3 y H3 total. qPCR cuantitativa para mostrar los niveles de expresión de la construcción.
FIGURE 10A-D. Caracterización de ratones KO del compuesto Bap1/Ezh2. (a) Patología de la médula ósea para diversos genotipos de Bap1/Ezh2. (b) Tinción citométrica de flujo para células eritroides en los genotipos indicados (CD71, Ter119) y cuantificación. (I-IV) son indicativos de etapas de diferenciación eritroide, siendo I la más inmadura y la IV la más madura. Cuantificación de estos fenotipos a la derecha de los diagramas de flujo representativos. (c) Tamaños del bazo para los genotipos indicados, 4 semanas tras el pIpC. (d) Recuento de leucocitos para los genotipos indicados, 4 semanas tras el pIpC.
FIGURA 11A-K. La proliferación inducida por la deleción de Bap1 se rescata mediante la pérdida de Ezh2. (a) Transferencia Western de los niveles de H3K27me3 en histonas purificadas de la médula ósea de ratones Bap1 KO, Ezh2 KO, Bap1/Ezh2 KO y de control. (b) Imágenes representativas de bazos y (c) enumeración del peso del bazo de los genotipos indicados de ratones, 3 semanas tras el pIpC. (d) Recuentos de leucocitos periféricos y (e) porcentajes de hematocrito cuantificados por un Hemavet. (f) Enumeración citométrica de flujo de progenitores mieloides (Lin- c-Kit+ Sca1‘) y (g) células mieloides maduras (Mac1+Gr1+) (h) Análisis del ciclo celular en progenitores mieloides utilizando tinción Ki67 y DAPI (n=3/grupo) (i) Transferencia Western para los niveles de H3K27me3 en ratones (n=5/grupo) tratados con EPZ011989 dos veces al día a 500 mg/kg durante 16 días. (j) Pesos del bazo y (k) recuentos de leucocitos después del tratamiento. A menos que se indique lo contrario, n=5/CON, n=5/Ezh2 KO, n=8/Bap1 KO y n=11/Bap1/Ezh2 KO, Las estadísticas se calcularon con la prueba de la t de Student; *p<0,05, **p<0,005; ± valores notificados de ETM.
FIGURA 12A-C. Análisis de histonas en animales Bap1 KO. (a) Transcripción de EZH2 evaluada por qPCR en células de control y Bap1 KO. Las células se transdujeron con un vector vacío o una construcción de sobreexpresión de BAP1. (b) Espectrometría de masas de histonas en células de médula ósea enriquecidas con c-kit de animales de control y Bap1 KO, n=2. (c) Experimentos de ChlP-qPCR de H4K20me1 en células 293T que sobreexpresan BAP1, ASXL1 y Bmi1 marcadas con FLAG.
FIGURA 13A-L. El agotamiento de BAP1 conduce a un aumento en la expresión del componente PRC2, aumento de H4K20me1 y desubiquitinación de L3MBTL2. (a) Coinmunoprecipitación de EZH2 y BAP1 endógenos en células SET2 seguido del análisis de transferencia Western (realizado en presencia de benzonasa para inhibir interacciones dependientes de ADN). (b) Expresión de Bap1, Ezh2 y Suz12 mediante qRT-PCR de progenitores de granulocitosmacrófagos clasificados (GMP; Linx-Kit+Sca1'CD34+FcY+). (c) Análisis de Transferencia Western de Bap1 y Ezh2 en células de médula ósea de ratones Bap1 KO y de control. (d) Cuantificación de H4K20me1 a partir de experimentos de espectrometría de masas de histonas, (e) Viabilidad celular evaluada mediante el ensayo de viabilidad Cell Titer Glo y (f) ensayos de Anexina V para experimentos de sobreexpresión de SETD8 en BAP1 de tipo silvestre (MSTO-21lH, MesolO) y líneas celulares mutantes H226, deleción; mutación catalítica de H2452). g) qPCR cuantitativa para SETD8 y EZH2 en células mutantes de BAP1 con sobreexpresión de SETD8. (h) Análisis de transferencia Western para SETD8 y EZH2 en una línea celular de tipo silvestre BAP1. (i) Ensayo Cell Titer Glo en células tratadas con DMSO o BVT594 5, 10, 20 |j M. (j) Expresión de L3MBTL2 y BAP1 en BAP1 de tipo silvestre (Met5a, JMN) y líneas celulares de mesotelioma mutantes (H226, H2452, H28). (k) Células 293T que sobreexpresan ubiquitina marcada con Myc-His y ADNc de L3MBTL2 y niveles variables de BAP1 (0, 5 jg , 2,5 jg , 1 jg). Se realizaron experimentos de coinmunoprecipitación con perlas de Ni y una serie de lavados rigurosos. (l) Modelo que representa la regulación de BAP1 que conduce a efectos sobre la cromatina y la expresión génica. Las estadísticas se calcularon con la prueba de la t de Student; *p<0,05, **p<0,005; ± valores notificados de ETM.
FIGURA 14A-B. Análisis de la unión de BAP1, ASXL1, HCF-1 y OGT. (a) Análisis de agrupación de K-medias para BAP1, ASXL1, HCF-1 y OGT ChIP-Seq. (b) Análisis de motivos de novo de Homer en agrupamientos unidos a bA p 1.
FIGURA 15A-I. L3MBTL2 y BAP1 corregulan EZH2. (a) Expresión de Bap1 y L3mblt2 en células de médula ósea de control y Bap1 KO. (b) Expresión de L3mbtl2 mediante qPCR en GMP. (c) Transferencia Western de células H226 y H2452 tratadas con MG13225 uM. Las fracciones insolubles se extrajeron usando SDS al 2 % que contenía tampón de lisis. (d) Expresión de EZH2 en líneas celulares que sobreexpresan L3MBTL2. (e) Ensayo de actividad del promotor EZH2 con una construcción que contiene 1,9 kB del promotor EZH2 y un vector de control de Renilla transfectado transitoriamente en células 293T con un vector vacío, un vector de expresión BAP1 o L3MBTL2. La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó para la actividad de Renilla en cada una de estas condiciones. (f) Se usaron dos horquillas independientes para inactivar la proteína L3MBTL2 en células SET2. Se realizaron análisis de transferencia Western en L3MBTL2, EZH2 y actina, incluyendo exposiciones cortas y largas. (g) ChIP para L3MBTL2 seguido de qPCR en los loci EZH2, SUZ12, E2F6 (control positivo), PHF20 (control positivo) y MORC3 (control negativo) en células 293T. (h) Anti-FLAG ChIP seguido de qPCR en el locus de EZH2 en células 293T que sobreexpresan FLAG-L3MBTL2 o FLAG-BAP1. JAM2 es un control positivo. Comparado con células 293T sin sobreexpresión de FLAG. (i) Transferencia Western para L3MBTL2 y BAP1 siguiendo las respectivas IP en las células 293T. Gel de ADN de agarosa incluido para mostrar la digestión del ADN.
FIGURE 16A-H. Las líneas celulares de mesotelioma mutantes BAP1 y los modelos de xenoinjerto son sensibles a la inhibición de EZH2. (a) Expresión de transcritos de EZH2 en pacientes con mesotelioma del TCGA en comparación con los normales coincidentes. (b) Ensayos de Anexina V en líneas celulares BAP1 de tipo silvestre y mutantes que expresan un vector vacío u horquillas dirigidas a EZH2. (c) Cuantificación de experimentos con Anexina V en líneas celulares de mesotelioma. (d) Tamaño del tumor de las líneas celulares Meso10 y H226 que expresan horquillas de EZH2 implantadas en ratones NOD-SCID, n=6/grupo. (e) Ensayos de viabilidad Cell Titer Glo 2D después de 2 semanas de tratamiento con EPZ011989 a 1,25 pM. (f) Ensayos de viabilidad Cell Titer Glo 3D después de 3 semanas de tratamiento con EPZ011989 a 1,25 pM. (g) Formación del tamaño del tumor a partir del mutante de BAP1 (MSTO y Meso10) o (h) células de tipo silvestre (H226 y H2452) implantadas en ratones NOD-SCID y tratadas con vehículo o con BID EPZ011989 500 mg/kg. Los tumores se midieron 3x semanalmente, n=6/grupo. La inhibición de la diana se evaluó mediante transferencias Western de histonas en tumores extraídos (mostrados en las figuras respectivas). Patología de pulmón de células H2452 con vehículo y tratamiento EPZ011989. La flecha indica tumor con metástasis en masa. Las estadísticas se calcularon con la prueba de la t de Student; *p<0,05, **p<0,005; ± valores notificados de ETM.
FIGURA 17. La expresión del componente PRC2 aumentó en poblaciones clasificadas y en médula ósea completa.
FIGURA 18. H3K27me3 aumentó local y globalmente en ratones BAP1 KO. La metilación de histonas en los animales BAP1 KO se evaluó mediante extracción con ácido seguida de transferencia Western en la médula ósea de control y BAP1 KO. La secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChlP-Seq) se completó también en médula ósea enriquecida con cKit. La superposición de ChlP-Seq con datos de secuenciación de ARN demostró que los genes regulados negativamente en los ratones BAP1 KO se marcaron de forma creciente con H3K27me3. En ratones BAP1 KO, se observó que H3K27me3 aumentó en los genes diana de EZH2, tales como el locus de HOXA.
FIGURA 19. La regulación positiva de H3K27me2/3 en células BAP1 KO se produjo a expensas de H3K27me0/1.
FIGURA 20A-D. Las líneas celulares mutantes de BAP1 son más sensibles a la inhibición de EZH2. (a) La línea celular Meso10 que sobreexpresa EZH2 proliferó de forma creciente tras la inyección en el costado de ratones NOD-SCID. (b) EZH2 se sobreexpresó en líneas celulares MSTO-211H y Meso10. Las líneas celulares se volvieron más sensibles de forma creciente para EZP011989 con la sobreexpresión de EZH2. (c) Las células mutantes de BAP1 se volvieron menos invasivas cuando se trataron con el inhibidor de EZH2 GSK126. (d) La expresión de E-cadherina aumentó en la línea celular H226 después del tratamiento con GSK126.
FIGURE 21A-C. Las líneas celulares de mesotelioma mutantes BAP1 y los modelos de xenoinjerto son sensibles a la inhibición de EZH2. (a) Volumen tumoral de xenoinjertos H2452 tratados diariamente con GSK126 a 150 mg/kg o vehículo (n=10 ratones por grupo). Se sacrificaron 5 ratones de cada grupo después de 16 días de tratamiento para evaluar el agotamiento de H3K27me3. Los ratones restantes se trataron durante el resto del ensayo. (b) ELISA de histonas y análisis de transferencia Western de los niveles de H3K27me3 en tumores de ratones tratados in vivo después de 16 días de tratamiento. (c) Tinción H&E, tinción Ki67 y tinción TUNEL de tumores extraídos de ratones tratados con vehículo y tratados con GSK126, aumento de 10X.
5. Descripción detallada
Para mayor claridad y no a modo de limitación, la descripción detallada de la presente divulgación se divide en las siguientes subsecciones:
(i) biomarcadores de BAP1;
(ii) inhibidores de EZH2;
(iii) objetivos de cáncer;
(iv) detección de biomarcadores;
(v) métodos de uso; y
(vi) kits.
5.1 BIOMARCADORES DE BAP1
El término "biomarcador", como se usa en el presente documento, incluye ácidos nucleicos y proteínas que están relacionados con el nivel de actividad de la proteína-1 asociada a BRCA1, denominada BAP1 en el presente documento, en un sujeto.
Un "paciente" o "sujeto", como se usa indistintamente en el presente documento, hace referencia a un sujeto humano o no humano. Entre los ejemplos no limitativos de sujetos no humanos se incluyen primates no humanos, perros, gatos, ratones, ratas, cobayas, conejos, cerdos, ave, caballos, vacas, cabras, ovejas, cetáceos, etc.
En ciertas realizaciones no limitativas, un biomarcador de BAP1 desvelado puede ser un ácido nucleico. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, el biomarcador puede ser un ácido desoxirribonucleico (ADN) o un ácido ribonucleico (ARN), por ejemplo, ARNm.
En ciertas realizaciones no limitativas, un biomarcador de ácido nucleico de BAP1 puede ser un ácido nucleico de BAP1 humano que tiene la secuencia como se establece en el N.° de entrada NG_031859.1 o NM_004656 de la base de datos NCBI o un ácido nucleico que codifica una molécula de proteína BAP1 que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en el N.° de entrada NP 004647 de la base de datos NCBI.
En una realización específica no limitativa, un biomarcador de ácido nucleico de BAP1 puede ser un ácido nucleico de BAP1 de ratón que tiene la secuencia como se establece en el N.° de entrada NM_027088 de la base de datos NCBI o un ácido nucleico que codifica una molécula de proteína BAP1 que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en el N.° de entrada NP_081364.1 de la base de datos NCBI.
En una realización específica no limitativa, un biomarcador de ácido nucleico de BAP1 puede ser un ácido nucleico de BAP1 de rata que tiene la secuencia como se establece en el N.° de entrada NM_00ll07292.1 de la base de datos NCBI o un ácido nucleico que codifica una molécula de proteína BAP1 que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en el N.° de entrada NP_001100762.1 de la base de datos NCBI.
En ciertas realizaciones no limitativas, un biomarcador de BAP1 puede ser una proteína.
En una realización específica no limitativa, un biomarcador de proteína BAP1 puede ser una proteína BAP1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en el N.° de entrada NP_004647 de la base de datos NCBI.
En una realización específica no limitativa, un biomarcador de proteína BAP1 puede ser una proteína BAP1 de ratón que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en el N.° de entrada NP_081364.1 de la base de datos NCBI.
En una realización específica no limitativa, un biomarcador de proteína BAP1 puede ser una proteína BAP1 de rata que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en el N.° de entrada NP_001100762.1 de la base de datos NCBI.
En ciertas realizaciones, el nivel del biomarcador de BAP1 se compara con un nivel de control de referencia. Un "nivel de control de referencia" o "nivel de expresión de control de referencia" de BAP1, como se usa indistintamente en el presente documento, puede, por ejemplo, establecerse utilizando una muestra de control de referencia. Entre los ejemplos no limitativos de muestras de control de referencia se incluyen células normales y/o sanas que tienen actividad de BAP1 de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, un nivel de control de referencia de BAP1 puede, por ejemplo, establecerse utilizando células normales, por ejemplo, células benignas, situadas adyacentes al tumor en un paciente.
En ciertas realizaciones no limitativas de la presente divulgación, un nivel de un biomarcador de BAP1 puede evaluarse mediante la evaluación de la función de BAP1, donde el nivel de expresión de BAP1 es directamente proporcional al nivel de la función de BAP1. En un ejemplo no limitativo, la función de BAP1 puede ser la regulación negativa de la expresión de EZH2 (por ejemplo, expresión de la proteína o expresión del ácido nucleico de EZH2). Por ejemplo y no a modo de limitación, el nivel de un biomarcador de BAP1 puede determinarse definiendo el nivel de expresión de EZH2 en una célula cancerosa de un sujeto en comparación con un nivel de control de referencia de EZH2. En ciertas realizaciones, puede establecerse un nivel de control de referencia de EZH2 utilizando células normales y/o sanas que tienen actividad EZH2 de tipo silvestre y/o normal y/o actividad BAP1 normal. En ciertas realizaciones no limitativas, EZH2 puede ser un ácido nucleico de EZH2 humano que tiene la secuencia como se establece en el (los) N.° de entrada NG_032043.1; NM_004456.4; NM_001203249.1; NM_152998,2; NM_001203247.1 y/o NM_001203248.1 de la base de datos NCBI o un ácido nucleico que codifica una molécula de proteína EZH2 que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en el (los) N.° de entrada NP_001190176.1; NP_001190177.1; NP_001190178.1; NP_004447.2; y/o NP_694543.1 de la base de datos NCBI. En una realización específica no limitativa, EZH2 puede ser una proteína EZH2 humana que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en el (los) N.° de entrada NP_001190176.1; NP_001190177.1; NP_001190178.1; NP_004447.2; y/o NP_694543.1 de la base de datos NCBI.
En un ejemplo no limitativo, la función de BAP1 puede ser la regulación de la expresión de SUZ12 (por ejemplo, expresión de la proteína o expresión del ácido nucleico de SUZ12). En ciertas realizaciones no limitativas, el nivel de un biomarcador de BAP1 puede determinarse definiendo el nivel de expresión de SUZ12 en una célula cancerosa de un sujeto en comparación con un nivel de control de referencia de SUZ12. En ciertas realizaciones, puede establecerse un nivel de control de referencia de SUZ12 utilizando células normales y/o sanas que tienen actividad SUZ12 de tipo silvestre y/o normal y/o actividad BAP1 normal. En ciertas realizaciones no limitativas, SUZ12 puede ser un ácido nucleico de SUZ12 humano que tiene la secuencia como se establece en el N.° de entrada NM_015355.2 de la base de datos NCBI o un ácido nucleico que codifica una molécula de proteína SUZ12 que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en el N.° de entrada NP_056170.2 de la base de datos NCBI. En una realización específica no limitativa, SUZ12 puede ser una proteína SUZ12 que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en el N.° de entrada nP_056170.2 de la base de datos NCBI.
Cuando se hace referencia en el presente documento a comparaciones con los niveles de expresión de control de referencia, el biomarcador se evalúa en relación con el nivel de expresión de control de referencia dentro de la misma especie. Por ejemplo, un nivel de expresión y/o presencia de un biomarcador de BAP1 humano se compara(n) con un nivel de control de referencia de BAP1 humano.
En realizaciones no limitativas particulares, la ausencia y/o una expresión reducida de un biomarcador de BAP1 significa la detección de menos de aproximadamente un 90 %, menos de aproximadamente un 80 %, menos de aproximadamente un 70 %, menos de aproximadamente un 60 %, menos de aproximadamente un 50 %, menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 30 % de expresión respecto al nivel de control de referencia.
5.2 INHIBIDORES DE EZH2
Entre los ejemplos no limitativos de inhibidores de EZH2 se incluyen compuestos, moléculas, sustancias químicas, polipéptidos, proteínas que inhiben y/o reducen la expresión y/o actividad de EZH2. Entre los ejemplos no limitativos adicionales de inhibidores de EZH2 se incluyen inhibidores de molécula pequeña competitivos de S-adenosilmetionina. En realizaciones no limitativas particulares, el inhibidor de Ez H2 se deriva de compuestos de tetrametilpiperidinilo. Entre los ejemplos no limitativos adicionales se incluyen UNC1999, 3-Deazaneplanocina A (DZNep), EI1, EPZ-5676, EPZ-6438, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 y GSK126.
Se describen ejemplos no limitativos adicionales de inhibidores de EZH2 en Garapaty-Rao et al., Chemistry and Biology, 20: págs. 1-11 (2013), solicitudes de patente PCT N.° WO 2013/138361, WO 2013/049770 y WO 2003/070887 y las patentes de Estados Unidos US 9.334.527, US 8.895.245 y US 9.688.665 y la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2011/0251216.
Entre los ejemplos no limitativos adicionales de inhibidores de EZH2 se incluyen ribozimas, oligonucleótidos antisentido, moléculas de ARNhc y moléculas de ARNip que inhiben específicamente la expresión o actividad de EZH2. Un ejemplo no limitativo de un inhibidor de EZH2 comprende una secuencia de ácido nucleico antisentido, ARNhc o ARNip homóloga para al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico de EZH2, en donde la homología de la porción relativa a la secuencia de EZH2 es al menos aproximadamente un 75 o al menos aproximadamente un 80 o al menos aproximadamente un 85 o al menos aproximadamente un 90 o al menos aproximadamente un 95 o al menos aproximadamente un 98 por ciento, donde el porcentaje de homología se puede determinar mediante, por ejemplo, el software BLAST o FASTA. En ciertas realizaciones no limitativas, la porción complementaria puede constituir al menos 10 nucleótidos o al menos 15 nucleótidos o al menos 20 nucleótidos o al menos 25 nucleótidos o al menos 30 nucleótidos y las moléculas de ácido nucleico antisentido, ARNhc o ARNip pueden ser de hasta 15 o de hasta 20 o de hasta 25 o de hasta 30 o de hasta 35 o de hasta 40 o de hasta 45 o de hasta 50 o de hasta 75 o de hasta 100 nucleótidos de longitud. Las moléculas antisentido, ARNhc o ARNip pueden comprender ADN o restos atípicos o de origen no natural, por ejemplo, aunque no de forma limitativa, restos de fosforotioato.
En ciertas realizaciones no limitativas, El inhibidor de EZH2 se puede utilizar solo o en combinación con uno o más agentes anticancerosos. Un agente anticanceroso puede ser cualquier molécula, compuesto químico o composición que tenga un efecto anticanceroso. Los agentes anticancerosos incluyen, pero sin limitación, agentes quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos, citocinas, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis o inmunotoxinas anticancerosas, tales como anticuerpos. "En combinación con" significa que el inhibidor de EZH2 y dichos uno o más agentes anticancerosos se administran a un sujeto como parte de un régimen o plan de tratamiento. Estos términos no requieren que el inhibidor de EZH2 y uno o más agentes anticancerosos estén físicamente combinados antes de la administración ni que se administren durante el mismo periodo de tiempo.
5.3 DIANAS DEL CÁNCER
Entre los cánceres que están sujetos a la materia objeto desvelada en el presente documento se incluyen mesoteliomas malignos, melanomas uveales, carcinoma de células renales, melanomas cutáneos, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de piel no melanoma, meningioma, colangiocarcinoma, leiomisarcoma, tumores neuroendocrinos, cáncer pancreático, paraganglioma, histiocitoma fibroso maligno, síndromes mielodisplásicos, leucemia mieloide aguda, tumores intradérmicos atípicos melanocíticos de BAP1 mutada (MBAIT) y cáncer de vejiga.
5.4 DETECCIÓN DE BIOMARCADORES
Los métodos para detectar y/o determinar cualitativa y cuantitativamente el nivel de expresión de un biomarcador de ácido nucleico de BAP1, un ácido nucleico de EZH2, un ácido nucleico de L3MBTL2 o un ácido nucleico de SUZ12 incluyen, pero sin limitación, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo la convencional, la qPCR y la PCR digital, hibridación in situ (por ejemplo, aunque no de forma limitativa hibridación in situ fluorescente ("FISH"; del inglés, fluorescent in situ hybridization)), electroforesis en gel, secuenciación y análisis de secuencia, análisis de micromatrices y otras técnicas conocidas en la técnica.
En ciertas realizaciones, el método de detección puede ser PCR en tiempo real (RT-PCR), PCR cuantitativa, PCR fluorescente, RT-MSP (reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación de RT), detección PicoGreen™ (Molecular Probes, Eugene, Oregón) de ADN, radioinmunoensayo o radiomarcaje directo de ADN. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un biomarcador de ácido nucleico puede transcribirse en sentido inverso en ADNc seguido de una reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR); o puede utilizarse una enzima única para ambas etapas como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 5.322.770 o puede transcribirse el biomarcador en sentido inverso en ADNc seguido de una reacción en cadena de ligasa con huecos simétricos (RT-AGLCR) como se describe por R.
L. Marshall, et al., PCR Methods and Applications 4: 80-84 (1994). En la Tabla 1 se muestran ejemplos no limitativos de cebadores para su uso en los métodos desvelados.
En ciertas realizaciones, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) se utiliza para evaluar los niveles de ARNm del biomarcador. Los niveles de un biomarcador y un ARNm de control se pueden cuantificar en tejido o células cancerosas y tejidos benignos adyacentes. En ciertas realizaciones, los niveles de uno o más biomarcadores pueden cuantificarse en una muestra biológica.
En una realización no limitativa, el método de detección de la presente divulgación se puede llevar a cabo sin depender de la amplificación, por ejemplo, sin generar ninguna copia o duplicación de una secuencia diana, sin la implicación de ninguna polimerasa o sin la necesidad de ningún ciclo térmico. En ciertas realizaciones, la detección de la presente divulgación puede realizarse usando los principios expuestos en el método QuantiGene™ descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 7709198, presentada el 19 de junio de 2006.
En ciertas realizaciones, puede emplearse la visualización de hibridación in situ, donde una sonda de ARN antisentido marcada radiactivamente se hibrida con una sección delgada de una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de biopsia, se lava, se escinde con ARNasa y se expone a una emulsión sensible para autorradiografía. Las muestras se pueden teñir con hematoxilina para demostrar la composición histológica de la muestra y las imágenes de campo oscuro con un filtro de luz adecuado muestran la emulsión desarrollada. También pueden utilizarse marcadores no radiactivos tales como la digoxigenina.
En ciertas realizaciones no limitativas, la evaluación de la expresión de biomarcadores de ácidos nucleicos puede realizarse mediante hibridación fluorescente in situ (FISH). FISH es una técnica que puede identificar directamente una región específica de ADN o de ARN en una célula y por tanto, permite la determinación visual de la expresión del biomarcador en muestras de tejido. El método FISH tiene las ventajas de un sistema de puntuación más objetivo y la presencia de un control interno integrado que consiste en las señales del gen biomarcador presentes en todas las células no neoplásicas en la misma muestra. FISH es una técnica directa in situ que puede ser relativamente rápida y sensible y puede también automatizarse. La inmunohistoquímica puede combinarse con un método FISH cuando el nivel de expresión del biomarcador es difícil de determinar mediante FISH solo.
En ciertas realizaciones, la expresión de un biomarcador de ácido nucleico puede detectarse en una matriz, microplaca o micromatriz de ADN. Los oligonucleótidos correspondientes al (los) biomarcador(es) se inmovilizan sobre un chip que, a continuación, se hibrida con ácidos nucleicos marcados de una muestra biológica, por ejemplo, muestra de tumor, obtenida de un sujeto. Se obtiene una señal de hibridación positiva con la muestra que contiene transcritos de biomarcadores. Los métodos para preparar matrices de ADN y su uso son bien conocidos en la técnica. (Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 6.618.6796; 6.379.897; 6.664.377; 6.451.536; 548.257; patente de Estados Unidos N.° 6989262 y Schena et al. 1995 Science 20:467-470; Gerhold et al. 1999 Trends in Biochem. Sci.
24, 168-173; y Lennon et al. 2000 Drug discovery Today 5: 59-65. También puede realizarse el análisis en serie de la expresión génica (SAGE; del inglés, serial analysis of gene expression) (véase, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 20030215858).
En ciertas realizaciones, para monitorizar un biomarcador de ácido nucleico, por ejemplo, ARNm de BAP1, niveles de expresión, el ARNm puede extraerse de la muestra biológica a analizar, pueden generarse sondas de ADNc de transcripción inversa y marcadas fluorescentes. Las sondas de ADNc marcadas pueden aplicarse, a continuación, a micromatrices capaces de hibridar con un biomarcador, permitiendo la hibridación de la sonda a micromatrices y escaneando los portaobjetos para medir la intensidad de la fluorescencia. Esta intensidad se correlaciona con la intensidad de hibridación y los niveles de expresión del biomarcador.
Los tipos de sondas para la detección de biomarcadores de ácidos nucleicos incluyen ADNc, ribosondas, oligonucleótidos sintéticos y sondas genómicas. El tipo de sonda utilizada generalmente lo dictará la situación particular, tales como ribosondas para hibridación in situ y ADNc para transferencia Northern, por ejemplo. En ciertas realizaciones no limitativas, la sonda se dirige a regiones de nucleótidos únicas para el biomarcador de ARN particular. Las sondas pueden ser tan cortas como se requiera para reconocer diferencialmente los transcritos de ARNm del biomarcador particular y pueden ser tan cortas como, por ejemplo, 15 bases. También pueden utilizarse sondas de al menos 17 bases, 18 bases y 20 bases. En ciertas realizaciones, los cebadores y las sondas se hibridan específicamente en condiciones rigurosas con un fragmento de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos correspondiente al gen diana. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "condiciones rigurosas" significa que la hibridación ocurrirá solo si hay al menos un 95 % o al menos un 97 % de identidad entre las secuencias.
La forma de marcaje de las sondas puede ser cualquiera que sea apropiada, tal como el uso de radioisótopos, por ejemplo, 32P y 35S o fluoróforos. El marcaje con radioisótopos se puede lograr, si la sonda se sintetiza química o biológicamente, mediante el uso de bases marcadas adecuadamente.
Los métodos para detectar y/o determinar el nivel de un biomarcador de proteína, por ejemplo, un biomarcador de proteína BAP1, proteína EZH2, proteína L3MBTL2 o proteína SUZ12, son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero sin limitación, técnicas de espectrometría de masas, sistemas de análisis basados en gel de 1-D o 2D, cromatografía, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA), transferencia Western, inmunoprecipitación e inmunohistoquímica. Estos métodos usan anticuerpos o equivalentes de anticuerpos, para detectar proteínas o usan técnicas biofísicas. También pueden emplearse matrices de anticuerpos o microplacas de proteínas, véanse, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2003/0013208; y las patentes de Estados Unidos N.° US6.329.209, US7.429.466, US7.112.408 y US6.365.418.
En ciertas realizaciones no limitativas, un método de detección para medir la expresión de biomarcadores de proteínas incluye las etapas de: poner en contacto una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de tejido, con un anticuerpo o variante (por ejemplo, fragmento) del mismo, que se une selectivamente al biomarcador y detectar si el anticuerpo o una variante del mismo está unido a la muestra. El método puede incluir adicionalmente poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo marcado. El método puede incluir adicionalmente una o más etapas de lavado, por ejemplo, para eliminar uno o más reactivos.
En ciertas realizaciones no limitativas, la transferencia Western puede usarse para detectar y cuantificar los niveles de expresión de proteínas de biomarcadores. Las células pueden homogeneizarse en tampón de lisis para formar un lisado y, a continuación, someterse a SDS-PAGE y transferencia a una membrana, tal como un filtro de nitrocelulosa. Los anticuerpos (sin marcar) pueden, a continuación, ponerse en contacto con la membrana y analizarse mediante un reactivo inmunológico secundario, tal como proteína A marcada o antiinmunoglobulina (los marcadores adecuados incluyen 125I, peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina). También puede utilizarse la detección cromatográfica. En ciertas realizaciones, la inmunodetección puede realizarse con un anticuerpo para un biomarcador usando el sistema de quimioluminiscencia mejorado (por ejemplo, de PerkinElmer Life Sciences, Boston, Massachusetts). A continuación, la membrana se puede quitar y volver a transferir con un anticuerpo de control específico para una proteína de control, por ejemplo, actina.
Puede utilizarse inmunohistoquímica para detectar la expresión y/o presencia de un biomarcador, por ejemplo, en una muestra de biopsia. Se puede poner en contacto un anticuerpo adecuado con, por ejemplo, una capa fina de células, seguido de un lavado para eliminar el anticuerpo no unido y, a continuación, poner en contacto con un segundo anticuerpo marcado. El marcaje puede ser mediante marcadores fluorescentes, enzimas, tales como peroxidasa, avidina o radiomarcaje. El ensayo puede puntuarse visualmente, usando microscopía y los resultados pueden cuantificarse. También pueden utilizarse sistemas basados en máquinas o de autoimágenes para medir los resultados de inmunotinción para el biomarcador.
Se encuentran disponibles diferentes sistemas automatizados de procesamiento, escaneo y análisis de muestras adecuados para usar con inmunohistoquímica en la técnica. Tales sistemas pueden incluir tinción automatizada (véase, por ejemplo, el sistema Benchmark, Ventana Medical Systems, Inc.) y barrido microscópico, análisis de imágenes computarizado, comparación de secciones en serie (para controlar la variación en la orientación y tamaño de una muestra), generación de informe digital y archivo y seguimiento de muestras (tales como portaobjetos sobre los que se colocan secciones de tejido). Los sistemas de imágenes celulares están disponibles comercialmente y combinan microscopios ópticos convencionales con sistemas de procesamiento de imágenes digitales para realizar análisis cuantitativos en células y tejidos, incluyendo muestras inmunoteñidas. Véase, por ejemplo, el sistema CAS-200 (Becton, Dickinson and Co.).
Los anticuerpos marcados contra biomarcadores pueden utilizarse también con fines de formación de imágenes, por ejemplo, para detectar la presencia de un biomarcador en las células de un sujeto. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos, yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (112In) y tecnecio (99mTc), marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina y biotina. Las interacciones inmunoenzimáticas se pueden visualizar utilizando diferentes enzimas, tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina o diferentes cromógenos, tales como DAB, AEC o Fast Red. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado se acumulará preferentemente en el lugar de las células que contienen un biomarcador. El anticuerpo marcado o variante del mismo, por ejemplo, fragmento de anticuerpo, a continuación, puede detectarse utilizando técnicas conocidas.
Los anticuerpos incluyen cualquier anticuerpo, ya sea natural o sintético, de longitud completa o un fragmento del mismo, monoclonal o policlonal, que se une suficientemente fuerte y específicamente al biomarcador a detectar. Un anticuerpo puede tener una Kd de como máximo aproximadamente 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M y 10-12 M. La expresión "se une específicamente" se refiere a la unión de, por ejemplo, un anticuerpo para un epítopo o antígeno o determinante antigénico de tal manera que la unión puede desplazarse o competir con una segunda preparación de epítopo, antígeno o determinante antigénico idéntico o similar.
Los anticuerpos y derivados de los mismos, que pueden utilizarse abarcan anticuerpos policlonales o monoclonales, anticuerpos sintéticos y obtenidos por ingeniería genética, anticuerpos quiméricos, humanos, humanizados, primatizados (injertados con CDR), revestidos o monocatenarios, anticuerpos producidos en fases (por ejemplo, de bibliotecas de presentación en fagos), así como fragmentos de unión funcional, de anticuerpos. Por ejemplo, pueden utilizarse fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a un biomarcador o porciones del mismo, que incluyen, aunque no de forma limitativa, fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')2. Tales fragmentos pueden producirse por escisión enzimática o por técnicas recombinantes. Entre los ejemplos no limitativos de anticuerpos de BAP1 disponibles en el mercado se incluyen SC-8132, SC-48386, SC-13576, SC-28236, SC-8133 y SC-28383 de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California), Ab167250 de Abcam (Cambridge, Inglaterra) y HPA028814 de Sigma-Aldrich (San Luis, Misuri). Entre los ejemplos no limitativos de anticuerpos de EZH2 disponibles en el mercado se incluyen los N.° de cat. 39933, 39875 y 39901 de Active Motif (Carlsbad, California), 07-689 de Millipore (Billerica, Massachusetts) y PA1-46476 y PA5-24594 de Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts). Un ejemplo no limitativo de anticuerpo de SUZ12 disponible en el mercado incluye Ab12073 de Abcam. Un ejemplo no limitativo de anticuerpo de L3MBTL2 disponible en el mercado incluye 39569 de Active Motif.
En ciertas realizaciones no limitativas, se utilizan agentes que se unen específicamente a un polipéptido distinto de los anticuerpos, tales como péptidos. Los péptidos que se unen específicamente pueden identificarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, bibliotecas de presentación en fagos de péptidos. Generalmente, puede utilizarse un agente capaz de detectar un polipéptido biomarcador, de tal manera que se detecta y/o cuantifica la presencia de un biomarcador. Como se define en el presente documento, un "agente" se refiere a una sustancia que es capaz de identificar o detectar un biomarcador en una muestra biológica (por ejemplo, identifica o detecta el ARNm de un biomarcador, el ADN de un biomarcador, la proteína de un biomarcador).
Además, un biomarcador puede detectarse utilizando espectrometría de masas, tal como MALDI/TOF (tiempo de vuelo), SEL-DI/TOF, cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía líquida de alto rendimiento-espectrometría de masas (HPLC- MS), electroforesis capilar-espectrometría de masas, espectrometría de resonancia magnética nuclear o espectrometría de masas en tándem (por ejemplo, MS/MS, MS/MS/MS, ESI-MS/MS, etc.). Véase, por ejemplo, las solicitudes de patentes de Estados Unidos N.° 2003/0199001 y 2003/0077616 y la patente de Estados Unidos N.° 8.068.987.
Los métodos de espectrometría de masas son bien conocidos en la técnica y se han utilizado para cuantificar y/o identificar biomoléculas, tales como proteínas (véanse, por ejemplo, Li et al. (2000) Tibtech 18:151-160; Rowley et al. (2000) Methods 20: 383-397; y Kuster y Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400). Adicionalmente, se han desarrollado técnicas de espectrometría de masas que permiten la secuenciación de novo al menos parcial de proteínas aisladas. Chait et al., Science 262:89-92 (1993); Keough et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 (1999); revisado en Bergman, EXS 88:133-44 (2000).
La detección de la presencia de un biomarcador u otras sustancias implicará normalmente la detección de la intensidad de la señal. Esto, a su vez, puede reflejar la cantidad y el carácter de un polipéptido unido al sustrato. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, puede compararse la intensidad de la señal de los valores de los picos de los espectros de una primera muestra y de una segunda muestra (por ejemplo, visualmente o mediante análisis informático), para determinar las cantidades relativas de un biomarcador concreto. Pueden utilizarse programas informáticos tales como el programa Biomarker Wizard (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, California) para ayudar en el análisis de espectros de masas.
Se describen métodos adicionales para determinar la expresión de biomarcadores de ácidos nucleicos y/o de proteínas en muestras, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 6.271.002; la patente de Estados Unidos N.° 6.218.122; la patente de Estados Unidos N.° 6.218.114; y la patente de Estados Unidos N.° 6.004.755; y en Wang et al., J. Clin. Oncol., 22(9): 1564-1671 (2004); y Schena et al., Science, 270:467-470 (1995).
5.5 MÉTODOS DE USO
En ciertas realizaciones no limitativas, la presente divulgación proporciona métodos para determinar si es probable que un efecto anticanceroso se produzca en un cáncer por un inhibidor de EZH2, que comprenden, determinar la presencia, ausencia y/o nivel de expresión de un biomarcador de BAP1, por ejemplo, un biomarcador de ácido nucleico y/o proteína de BAP1. Los métodos para determinar la presencia, ausencia y/o niveles de expresión de un biomarcador de BAP1, se exponen en la sección 5.4 anterior. Los cánceres adecuados para el tratamiento se describen en la sección 5.3 anterior. Los inhibidores de EZH2 se describen en la sección 5.2 anterior.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para producir un efecto anticanceroso en un cáncer, que comprende determinar si las células del cáncer contienen un biomarcador de BAP1, donde, si el biomarcador de BAP1 está ausente y/o se expresa en niveles más bajos en el cáncer, en comparación con un nivel de control de referencia, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de EZH2 para producir un efecto anticanceroso. Como alternativa, si se encuentra que el biomarcador de BAP1 se expresa a niveles iguales o superiores respecto a un nivel de control de referencia, a continuación, se administra una terapia alternativa con un agente que no es un inhibidor de EZH2.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es capaz de lograr uno o más de un efecto anticanceroso, una prolongación de la supervivencia y/o una prolongación del período hasta una recaída.
Un "efecto anticanceroso" se refiere a uno o más de una reducción en la masa de células cancerosas agregadas, una reducción en la tasa de crecimiento de células cancerosas, una reducción en la proliferación de células cancerosas, una reducción en la masa tumoral, una reducción en el volumen del tumor, una reducción en la proliferación de células del tumor, una reducción en la tasa de crecimiento tumoral y/o una reducción en la metástasis tumoral. En ciertas realizaciones, un efecto anticanceroso puede referirse a una respuesta completa, una respuesta parcial, una enfermedad estable (sin progresión o recaída), una respuesta con una recaída posterior o supervivencia libre de progresión en un paciente diagnosticado de cáncer.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para producir un efecto anticanceroso en un cáncer, que comprende determinar el nivel de expresión de un biomarcador de BAP1 en una o más células del cáncer del sujeto, donde si el biomarcador de proteína BAP1 está ausente y/o se expresa en niveles más bajos en las células, en comparación con un nivel de control de referencia, a continuación, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de EZH2 para producir un efecto anticanceroso. En ciertas realizaciones, el control de referencia es el nivel de BAP1 en células normales, por ejemplo, células benignas, situadas adyacentes al cáncer.
En ciertas realizaciones no limitativas, el nivel de BAP1 en la muestra de cáncer y/o la muestra de control de referencia se puede normalizar frente a un ácido nucleico y/o proteína presente en ambas muestras, por ejemplo, una proteína de referencia o ácido nucleico, tal como un gen constitutivo y/o proteína, para permitir la comparación. Por ejemplo y no a modo de limitación, la proteína o ácido nucleico de referencia puede ser actina o tubulina.
En ciertas realizaciones no limitativas, la presente divulgación proporciona un método para predecir la sensibilidad de un cáncer en un paciente a un inhibidor de EZH2, que comprende, obtener una muestra del cáncer del paciente y determinar el nivel de expresión de un biomarcador de una proteína BAP1 en las células que comprende la muestra, donde si el biomarcador de la proteína BAP1 está ausente o se reduce en expresión en comparación con un nivel de control de referencia, a continuación, se predice que el cáncer es sensible al inhibidor de EZH2. En ciertas realizaciones, si se predice que el cáncer de un paciente es sensible al inhibidor de EZH2, a continuación, el paciente puede tratarse con un inhibidor de EZH2. En ciertas realizaciones, si se predice que el cáncer de un paciente es insensible al inhibidor de EZH2, a continuación, el paciente puede tratarse con un agente que no es un inhibidor de EZH2.
En ciertas realizaciones no limitativas, la presente divulgación proporciona un método para tratar un sujeto que tiene un cáncer. Por ejemplo y no a modo de limitación, el método comprende obtener una muestra del cáncer del sujeto y determinar, en la muestra, el nivel de expresión de un biomarcador de BAP1, donde si el biomarcador de BAP1 está ausente o se expresa en un nivel más bajo que un nivel de control de referencia de BAP1, a continuación, iniciar el tratamiento del sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de EZH2. Como alternativa, si se encuentra que el biomarcador de BAP1 se expresa a niveles iguales o superiores respecto a un nivel de control de referencia, a continuación, el sujeto puede tratarse con un agente que no es un inhibidor de EZH2.
En ciertas realizaciones, los métodos de la presente divulgación pueden también comprender detectar el nivel de expresión de EZH2, L3MBTL2 y/o SUZ12 en la muestra. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, pueden detectarse los niveles de expresión de ARNm y/o proteína de EZH2, L3MBTL2 y/o SUZ12. En ciertas realizaciones, un método para tratar un sujeto que tiene un cáncer, que comprende, obtener una muestra del cáncer del sujeto y determinar, en la muestra, el nivel de expresión de un biomarcador de BAP1 y el nivel de expresión de EZH2, L3MBTL2 y/o SUZ12, donde si el biomarcador de BAP1 está ausente o se expresa en un nivel más bajo que un nivel de control de referencia de BAP1 y la expresión de EZH2 y/o SUZ12 está aumentada en comparación con un nivel de control de referencia de EZH2 y/o SUZ12 (y/o la expresión de L3MBTL2 está disminuida en comparación con un nivel de control de referencia de L3MBTL2), a continuación, iniciar el tratamiento del sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de EZH2. En ciertas realizaciones, una muestra puede recogerse antes y después del tratamiento con un inhibidor de EZH2 y pueden compararse los niveles de expresión de EZH2 de las muestras.
En ciertas realizaciones no limitativas, una muestra incluye, aunque no de forma limitativa, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma sanguíneo, líquido biológico (por ejemplo, sangre, plasma, suero, heces, orina, líquido linfático, líquido ascítico, lavado ductal, aspirado del pezón, saliva, lavado broncoalveolar, lágrimas y líquido cefalorraquídeo) y muestras de tejido. La fuente de la muestra puede ser tejido sólido (por ejemplo, de una muestra de órgano o tumor fresco, congelado y/o conservado, muestra de tejido, biopsia o aspirado), sangre o cualquier constituyente de la sangre, líquidos corporales (tales como, por ejemplo, orina, linfa, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial) o células del individuo, incluyendo células tumorales en circulación. En ciertas realizaciones no limitativas, la muestra se obtiene de un tumor. En ciertas realizaciones, la muestra puede ser una "muestra clínica", que es una muestra derivada de un paciente.
5.6 KITS
En ciertas realizaciones no limitativas, la presente divulgación proporciona un kit para determinar si es probable que un efecto anticanceroso se produzca en un cáncer por un inhibidor de EZH2, que comprende unos medios para detectar un biomarcador de BAP1, como se expone en las secciones precedentes. Dicho kit puede incluir adicionalmente instrucciones o material de apoyo que describa el uso del kit para determinar si es probable que un inhibidor de EZH2 produzca un efecto anticanceroso en un cáncer y/o una referencia a un sitio web o publicación que describa el mismo.
Entre los tipos de kits se incluyen, pero sin limitación, conjuntos de sondas y cebadores específicos de biomarcadores envasados (por ejemplo, conjuntos de sondas/cebadores de TaqMan), matrices/micromatrices, anticuerpos específicos de biomarcadores, perlas específicas de biomarcadores, que contienen adicionalmente una o más sondas, cebadores u otros reactivos para detectar uno o más biomarcadores de la presente divulgación.
En ciertas realizaciones no limitativas, la presente divulgación proporciona un kit para determinar si es probable que un efecto anticanceroso se produzca en un cáncer por un inhibidor de EZH2, que comprende unos medios para detectar la presencia de un biomarcador de ácido nucleico de BAP1.
En una realización específica no limitativa, un kit puede comprender un par de cebadores de oligonucleótidos, adecuados para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la secuenciación de ácidos nucleicos, para detectar el (los) biomarcador(es) de ácidos nucleicos a identificar. Un par de cebadores puede comprender secuencias de nucleótidos complementarias de un biomarcador expuesto anteriormente y tener una longitud suficiente para hibridar selectivamente con dicho biomarcador. Como alternativa, los nucleótidos complementarios pueden hibridar selectivamente con una región específica en la proximidad suficientemente cercana 5' y/o 3' a la posición del biomarcador para realizar PCR y/o secuenciación. Se pueden incluir múltiples cebadores específicos de biomarcadores en el kit para detectar simultáneamente más de un biomarcador. El kit también puede comprender adicionalmente una o más polimerasas, transcriptasa inversa y bases nucleotídicas, en donde las bases nucleotídicas pueden marcarse adicionalmente de forma detectable.
En ciertas realizaciones no limitativas, un cebador puede ser de al menos aproximadamente 10 nucleótidos o de al menos aproximadamente 15 nucleótidos o de al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud y/o hasta de aproximadamente 200 nucleótidos o de hasta aproximadamente 150 nucleótidos o de hasta aproximadamente 100 nucleótidos o de hasta aproximadamente 75 nucleótidos o de hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Los ejemplos no limitativos de cebadores se proporcionan en la Tabla 1. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un cebador de la presente divulgación puede comprender una o más de las secuencias desveladas en la Tabla 1.
En una realización no limitativa adicional, los cebadores de oligonucleótidos pueden inmovilizarse sobre una superficie sólida, sustrato o soporte, por ejemplo, sobre una micromatriz de ácido nucleico, en donde la posición de cada cebador de oligonucleótido unido a la superficie sólida o soporte es conocida e identificable. Los oligonucleótidos pueden fijarse a un sustrato, tal como vidrio, plástico, papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, microplaca, perla o cualquier otro soporte sólido adecuado. Los polinucleótidos pueden sintetizarse directamente sobre el sustrato o pueden sintetizarse por separado del sustrato y a continuación, fijarse al sustrato. Las matrices se preparan utilizando métodos conocidos.
En una realización específica no limitativa, un kit puede comprender al menos una sonda de ácido nucleico, adecuada para la hibridación in situ o la hibridación in situ con fluorescencia, para detectar el (los) biomarcador(es) a identificar. Tales kits comprenderán generalmente una o más sondas de oligonucleótidos que tienen especificidad para diferentes biomarcadores. Los medios para analizar múltiples biomarcadores pueden estar comprendidos opcionalmente en un solo kit.
En ciertas realizaciones, los kits pueden comprender recipientes (que incluyen placas de microlitros adecuadas para usar en una implementación automatizada del método), cada uno con uno o más de los diversos reactivos (generalmente en forma concentrada) utilizados en los métodos, incluyendo, por ejemplo, microplacas prefabricadas, tampones, los trifosfatos de nucleótidos apropiados (por ejemplo, dATP, dCTP, dGTP y dTTP o rATP, rCTP, rGTP y UTP), transcriptasa inversa, ADN polimerasa, ARN polimerasa y una o más sondas y cebadores de la presente divulgación (por ejemplo, cebadores de poli(T) o aleatorios de longitud adecuada unidos a un promotor reactivo con la ARN polimerasa).
En realizaciones no limitativas, la presente divulgación proporciona un kit para determinar si es probable que un efecto anticanceroso se produzca en un cáncer por un inhibidor de EZH2, que comprende unos medios para detectar los niveles de un biomarcador de proteína BAP1.
En realizaciones no limitativas, un kit puede comprender al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, para la inmunodetección del (de los) biomarcador(es) a identificar. Los anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, específicos para un biomarcador, pueden prepararse utilizando técnicas de inmunización convencionales, que serán conocidas generalmente por los expertos en la materia. Los reactivos de inmunodetección del kit pueden incluir marcadores detectables que están asociados o unidos con el propio anticuerpo o antígeno en sí. Tales marcadores detectables incluyen, por ejemplo, moléculas quimioluminiscentes o fluorescentes (rodamina, fluoresceína, proteína fluorescente verde, luciferasa, Cy3, Cy5 o ROX), radiomarcadores (3H, 35S, 32P, 14C o 131I) o enzimas (fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante).
En una realización no limitativa adicional, dichos uno o más anticuerpos específicos de biomarcadores, pueden proporcionarse unidos a un soporte sólido, tal como una matriz de columna, una matriz o pocillo de una placa de microtitulación. Como alternativa, el soporte se puede proporcionar como un elemento separado del kit.
En ciertas realizaciones no limitativas, donde los medios de medición en el kit emplean una matriz, el conjunto de biomarcadores expuestos anteriormente puede constituir al menos un 10 por ciento o al menos un 20 por ciento o al menos un 30 por ciento o al menos un 40 por ciento o al menos un 50 por ciento o al menos un 60 por ciento o al menos un 70 por ciento o al menos un 80 por ciento de las especies de biomarcadores representadas en la micromatriz.
En ciertas realizaciones no limitativas, un kit de la presente divulgación puede contener una o más sondas, cebadores, anticuerpos u otros reactivos de detección para detectar el nivel de expresión de EZH2 en la muestra. Por ejemplo, un kit puede contener un anticuerpo o fragmento del mismo, para la detección del nivel de expresión de proteínas de EZH2 en una muestra biológica.
En ciertas realizaciones no limitativas, un kit de la presente divulgación puede contener una o más sondas, cebadores, anticuerpos u otros reactivos de detección para detectar el nivel de expresión de SUZ12 en la muestra. Por ejemplo, un kit puede contener un anticuerpo o fragmento del mismo, para la detección del nivel de expresión de proteínas de SUZ12 en una muestra biológica.
En ciertas realizaciones no limitativas, un kit de la presente divulgación puede contener una o más sondas, cebadores, anticuerpos u otros reactivos de detección para detectar el nivel de expresión de L3MBTL2 en la muestra. Por ejemplo, un kit puede contener un anticuerpo o fragmento del mismo, para la detección del nivel de expresión de proteínas de L3MBTL2 en una muestra biológica.
Un kit puede contener adicionalmente medios para permitir la comparación entre el nivel de biomarcadores dentro de la muestra de cáncer y el nivel de biomarcadores en una muestra de control de referencia. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un kit de la presente divulgación puede contener una o más sondas, cebadores, anticuerpos u otros reactivos de detección para detectar una proteína o ARNm de referencia, que puede utilizarse para normalizar los niveles de expresión de dichos uno o más biomarcadores de las muestras para permitir la comparación. Entre los ejemplos no limitativos de una proteína de referencia, por ejemplo, una proteína constitutiva, se incluyen alfa o betatubulina, actina, cofilina, vinculina y GADPH.
En ciertas realizaciones no limitativas, un kit puede incluir adicionalmente instrucciones de uso del kit para detectar el biomarcador de interés. Por ejemplo, las instrucciones pueden describir que la ausencia y/o una expresión más baja de un biomarcador de BAP1, expuesto en el presente documento, en una muestra de cáncer de un paciente, en comparación con un nivel de control de referencia, es indicativa de una posibilidad aumentada de producir un efecto anticanceroso en el cáncer por un inhibidor de EZH2.
En ciertas realizaciones, un kit de la presente divulgación puede incluir adicionalmente uno o más inhibidores de EZH2. Se desvelan ejemplos no limitativos de inhibidores de EZH2 en la sección 5.2.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar totalmente la divulgación, pero no deben interpretarse como una limitación del alcance de la misma.
6. EJEMPLO 1: LA PÉRDIDA DE BAP1 DA COMO RESULTADO EXPRESIÓN DE EZH2 AUMENTADA Y ACTIVIDAD IN VITRO.
En este ejemplo, el mecanismo por el que la pérdida de actividad de BAP1 da como resultado patologías se investigó in vitro.
6.1. RESULTADOS
Las células SET2 se transdujeron con ARNhc que se dirige a BAP1 para reducir la expresión de BAP1 in vitro. La reducción en la expresión de BAP1, como se validó mediante transferencia Western, dio como resultado un aumento en la trimetilación de la Histona 3 en K27 (H3K27me3) (FIGURA 1). Véase también la Figura 9A. La expresión de la proteína BAP1 se agotó en las células BaF3, con confirmación de la pérdida de BAP1 mediante transferencia Western y se realizó una espectrometría de masas de histonas. La inactivación de BAP1 en las células BaF3 reveló un aumento en H3K27me3 (FIGURA 1).
Se ha demostrado que BAP1 está altamente mutado en tumores sólidos (Carbone et al., 2012), tales como en el mesotelioma maligno y el melanoma uveal. En las células de mesotelioma, que tenían mutaciones en BAP1, por ejemplo, deleción homocigótica de H28, mutaciones homocigóticas de sentido alterado de H2452 y de deleción de H226, se observó una regulación positiva de la expresión de EZH2 en comparación con las células con actividad de BAP1 de tipo silvestre (FIGURA 2). Asimismo, la sobreexpresión in vitro de BAP1 en las células 293T dio como resultado la reducción de la expresión de EZH2 y SUZ12, si bien la pérdida de la expresión de BAP1 dio como resultado la regulación positiva de la expresión de SUZ12 (FIGURA 3).
6.2. DISCUSIÓN
Como se ha descrito anteriormente, la pérdida de la expresión de la proteína BAP1 provocó un aumento en H3K27me3, una marca de cromatina represiva colocada por EZH2 y un aumento en la expresión de EZH2 y SUZ12 en sistemas de líneas celulares cancerosas in vitro. Actualmente, los inhibidores de EZH2 se están probando clínicamente en pacientes con linfoma con mutaciones activadoras de EZH2. Por tanto, el estado de la mutación de BAP1 podría ayudar a identificar a los pacientes que pueden responder al tratamiento con inhibidores de EZH2, lo que puede ser eficaz para prolongar la supervivencia en pacientes con mutaciones de BAP1.
7. EJEMPLO 2: LA PÉRDIDA DE BAP1 DA COMO RESULTADO EXPRESIÓN DE EZH2 AUMENTADA Y ACTIVIDAD IN VIVO.
7.1 MÉTODOS Y MATERIALES
Cebadores:
Tabla 1
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Figure imgf000015_0003
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continuación
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Animales: Todos los animales se alojaron en el Memorial Sloan Kettering Cáncer Center. Todos los procedimientos con animales se completaron de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por los comités institucionales de cuidado y uso de animales del Memorial Sloan Kettering Cancer Center.
Generación de ratones deficientes en Bap1 y deficientes en Bap1/Ezh2: Las células madre embrionarias dirigidas a los exones 6-12 de Bap1 se obtuvieron del European Conditional Mouse Consortium. Se insertó en dirección 5' un casete de parada prematura flanqueado por Frt que contenía un casete de lacZ y neomicina. Los clones de células ES se expandieron y se inyectaron en blastocistos primarios. Los ratones generados se cruzaron con la línea germinal Flp-deleter (The Jackson Laboratory) para escindir el casete flanqueado por Frt.
Estos ratones se cruzaron posteriormente con los ratones transgénicos Mx1-cre inducibles por IFN-a (The Jackson Laboratory) para evaluar los efectos de la pérdida inducible de Bap1 en el sistema hematopoyético. Los ratones compañeros de camada Bap1 fl/fl, Bap1 fl/+ y Bap1+/+ se genotiparon mediante PCR con los cebadores BAPI-arriba (actgcagcaatgtggatctg (SEQ ID NO: 1)), BAPl-abajo (gaaaaggtctgacccagatca (SEQ ID NO: 2)) utilizando los siguientes parámetros: 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 94 °C durante 10 s, 65 °C durante 40 s y 72 °C durante 1 min y a continuación, 72 °C durante 5 min. El alelo de TS se detectó en la PCR de 300 pb si bien el alelo floxeado se detectó en 500 pb. La escisión después de la inducción por IFN-a se confirmó mediante una PCR con cebadores para detectar la banda floxeada y escindida: BAP1-D (actgcagcaatgtggatctg (SEQ ID NO: 1)), BAP1-D2 (gcgcaacgcaattaatgata (SEQ ID NO: 3)) y BAP1-I (cagtgtccagaatggctcaa (SEQ ID NO: 4)), utilizando los mismos parámetros de PCR enumerados anteriormente. Los ratones Mx1-Cre-Bap1 f/f se cruzaron con ratones Ezh2 f/f 12. Los ratones condicionales Mx-cre Bap1 f/f y los Bap1 f/f de control recibieron cuatro inyecciones intraperitoneales de poliI:poliC de 200 pl de una solución 1 mg/ml. Dos semanas después de la escisión, se extrajo sangre periférica mediante sangrado retroorbitario utilizando tubos capilares de microhematocrito heparinizados (Thermo Fisher Scientific). La escisión se confirmó y se obtuvieron recuentos de sangre periférica utilizando un HemaVet de acuerdo con las instrucciones estándar del fabricante. Se tiñeron secciones de tejido embebidas en parafina fijadas con formalina con hematoxilina y eosina (H&E). La deleción de Bap1 se confirmó mediante PCR de escisión genómica y análisis por transferencia de Western. Las colas se remitieron al servicio de genotipado de Transnetyx (Cordova, Tennessee) para el genotipado basado en qPCR para alelos de Ezh2 floxeados y escindidos. La escisión se confirmó mediante transferencia Western.
Xenoinjertos y administración de EPZ011989 in vivo: Se inyectaron por vía subcutánea grupos de ratones NOD-SCID de 10 semanas de edad en el costado con 6-10*10® líneas celulares de mesotelioma (MSTO-211H, Meso10, H226 y H2452) en una mezcla 1:1 de matrigel y medios. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 60-80 mm3, se inició el tratamiento con vehículo (NaCMC+ al 0,5 % Tween-80 al 0,1 % en agua) o EPZ011989. Se administró EPZ011989 o vehículo por vía oral dos veces al día en una concentración de 500 mg/kg durante la duración del experimento. Los volúmenes de los tumores se evaluaron en tres dimensiones utilizando un calibre. Se extrajeron tumores o tejido pulmonar después del tratamiento y se utilizaron para transferencia Western para evaluar la inhibición de la diana. Se generaron criterios preestablecidos para excluir ratones en experimentos de xenoinjertos si los tumores no se formaron después de la implantación (75 % más pequeños que la media de los animales implantados del mismo grupo. No se excluyó a los animales de los ensayos con fármacos. Para todos los estudios de fármacos de xenoinjerto, se siguió el tamaño del tumor durante 10 días y los ratones se aleatorizaron en este punto para el tamaño del tumor. El ensayo genético de EPZ011989 de Bap1 KO se realizó con aleatorización utilizando análisis de CBC 3 semanas después de poliI:poliC y confirmando que los promedios de recuentos de leucocitos (WBC) fueron equivalentes tanto en el vehículo como en los grupos tratados. Se trataron cinco animales por grupo por vía oral con vehículo (descrito anteriormente) o con 500 mg/kg de EPZ011989 dos veces al día durante 16 días. No hubo ocultación para los investigadores en estos experimentos.
Análisis histológicos: Los ratones se sacrificaron y se les realizó la autopsia y, a continuación, las muestras de tejido diseccionadas se fijaron durante 24 horas en paraformaldehído al 4 %, se deshidrataron y se incluyeron en parafina. Los bloques de parafina se seccionaron a 4 pm y se tiñeron con H&E, Ki67, E-Cadherina o TUNEL. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio Axio Observer A1 (Carl Zeiss).
Cultivo celular: Las células 293T se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 % y aminoácidos no esenciales. Las líneas celulares de leucemia humana (SET2) y las líneas celulares de mesotelioma humano (JMN, Met5a, MSTO-211H, H2373, H226, H2452) se cultivaron en medio RPMI-1640 complementado con FBS al 10%. MSTO-211H se obtuvo de ATCC, si bien las líneas de mesotelioma restantes fueron obsequios generosos de Prasad Adusumilli.
Aislamiento de ARN, amplificación de SMARTer, secuenciación de transcriptoma Proton y análisis: Las células de la médula ósea se clasificaron mediante FACS para determinar las GMP (Lin'c'Kit+Sca1'CD34+FcY+) usando FACS Aria. Se extrajo el ARN total de 200-500.000 células usando reactivos de aislamiento de ARN TRlzol (N.° de cat.
15596-026, Life Technologies). La calidad del ARN se aseguró antes de la amplificación analizando 20-50 pg de cada muestra utilizando el kit RNA 6000 pico y un bioAnalyzer (Agilent). Se amplificaron posteriormente 10 ng de ARN total de alta calidad (RIN> 8), utilizando el kit SMARTEr® Universal Low Input RNA para secuenciación (Clonetech Laboratory, N.° de cat. 634940) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. El material amplificado se sometió a la preparación de la biblioteca de transcriptomas completos de acuerdo con el protocolo Ion Total RNA-Seq Kit v2 (Life Technologies), con 16 ciclos de PCR. Las muestras tuvieron un código de barras y las partículas ION PI™ ION SPHERE™ (ISP) positivas para el molde se prepararon utilizando el sistema ion one touch II y el kit ION PI™ Template OT2 200kit v2 (Life Technologies). Las partículas enriquecidas se secuenciaron en un sistema de secuenciación Proton usando química de 200 pb versión 2. Se generó un promedio de 70 a 80 millones de lecturas por muestra y un 76 a un 82 % de las lecturas se asignaron a bases de ARNm. Los BAM de salida RAW se volvieron a convertir a FASTQ utilizando Sam2Fastq de PICARD. A continuación, las lecturas se asignaron primero al genoma de ratón utilizando RNASTAR. El genoma utilizado fue MM9 con uniones de ENSEMBL (Mus_musculus.NCBIM37.67) y una proyección de lectura de 49. A continuación, todas las lecturas sin asignar se asignaron a MM9 utilizando BWA MEM (versión 0.7.5a). A continuación, los dos BAM cartografiados se combinaron y clasificaron y los recuentos a nivel de genes se computaron utilizando htseq-count (opciones -s y -m intersection-strict) y los mismos modelos de genes (Mus_musculus.NCBIM37.67). Los datos brutos se cargaron en la base de datos GEO con el siguiente número de acceso: GSE61360.
Extracción de histonas, ELISA de histonas, transferencias Western de histonas y LC/MS de histonas: Las histonas se extrajeron mediante técnicas de extracción estándar o durante la noche utilizando el Active Motif Histone Extraction Minikit (40026). Los ELISA de histonas se llevaron a cabo usando el kit Elisa de trimetil K27 (Active Motif, 53106) normalizado para una curva estándar de H3K27me3 y proteína H3 total. Se realizaron transferencias Western de histonas con 3-5 pg de histonas. Para la LC/MS de histonas, se lisaron 12 millones de células de control y Bap1 KO, se aislaron los núcleos y se extrajeron las histonas utilizando H2SO4 0,4 N y se derivatizaron químicamente utilizando anhídrido propiónico, como se describió previamente 26. A continuación, las histonas se digirieron con tripsina y se separaron por nanocromatografía líquida (75 pm i.d., 15 cm de largo, envasadas con medios MagicC18aq, dp 3 p) acopladas a un espectrómetro de masas TSQ Quantum Ultra. Los datos se analizaron con Skyline 27 y la cuantificación relativa se realizó por área de pico.
Preparación e inm unoprecipitación de cromatina, preparación y secuenciación de la biblioteca de ChIP y análisis de los datos de ChlP-Seq: Las células de la médula ósea se enriquecieron para las células c-Kit+ utilizando el kit de enriquecimiento celular hematopoyético de ratón EasySep (Stem Cell Technologies, 19756). Se fijaron 5x106 células en una solución de formaldehído sin metanol al 1 % y, a continuación, se resuspendieron en tampón de lisis de SDS. Los lisados se sometieron a ultrasonidos en un ultrasonicador enfocado E220 (Covaris) hasta una distribución de tamaño de fragmento deseada de 100-500 pares de bases. Las reacciones IP se realizaron utilizando anti-trimetil H3K27 (Cell Signalling, 9733), antimonometil H4K20 (Abeam, 9051) e IgG (Santa Cruz, 2027) cada uno en aproximadamente 400.000 células como se ha descrito anteriormente (Krivtsov et al., 2008). Los ensayos de ChIP se procesaron en un sistema automatizado compacto SX-8G IP-STAR (Diagenode) utilizando un protocolo de ChIP directo como se describe en otra parte (O'Geen et al., 2011). A continuación, los fragmentos de cromatina eluidos se desentrecruzaron y los fragmentos de ADN se purificaron usando perlas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter).
Las bibliotecas con códigos de barras se prepararon a partir de ADN enriquecido y aportado de ChlP y utilizando un conjunto de mezcla maestra de preparación de biblioteca de ChlPSeq de NEBNext para Illumina (New England Biolabs) y adaptadores TruSeq (Illumina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un sistema automatizado compacto SX-8G IP-STAR (Diagenode). Se utilizó la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs) y los cebadores de PCR TruSeq (Illumina) para amplificar las bibliotecas, que, a continuación, se purificaron para eliminar los dímeros adaptadores utilizando perlas AMPure XP y se multiplexaron en HiSeq 2000 (Illumina).
Las lecturas se recortaron con respecto a calidad y adaptador usando 'trim_galore' antes de alinearlas con ensamblaje de ratón mm9 con bowtie2 usando los parámetros predeterminados. Las lecturas alineadas con la misma posición de inicio y orientación se colapsaron en una sola lectura antes del análisis posterior. Los perfiles de densidad se crearon alargando cada lectura al tamaño de fragmento de biblioteca promedio y, a continuación, computando la densidad utilizando el paquete BEDTools. Las regiones enriquecidas se descubrieron utilizando MACS 1.4 con parámetros predeterminados y se puntuaron frente a bibliotecas de entradas coincidentes. Todos los rastreos del explorador del genoma y las tablas de densidad de lectura se normalizaron para la profundidad de secuenciación. Para la comparación de muestras de ChlP-seq en condiciones de control y KO, se analizaron las señales de tres réplicas por condición utilizando la prueba de la U de Mann-Whitney o la prueba de la t. El análisis de agrupamientos se realizó sobre datos de recuento normalizados en Matlab con el paquete de agrupación de k-medias. El análisis de motivos se realizó en Homer utilizando parámetros predeterminados para el programa findMotifsGenome.
Transferencia Western e inmunoprecipitación: Las células se lisaron para los experimentos de transferencia Western y de inmunoprecipitación en el siguiente tampón: NaCl 150 mM, Tris 20 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, Triton al 1 %, Protease Arrest (EMD) e inhibidores de fosfatasa (Calbiochem). Para realizar las inmunoprecipitaciones en presencia de benzonasa, las células se lisaron en el tampón BC-300: Tris 20 mM (pH 7,4), glicerol al 10 %, KCl 300 mM, NP-40 al 0,1 %. El lisado aclarado se trató con MgCl2 a 2,5 mM y se añadió benzonasa a 1250 U/ml. El lisado se incubó durante 1 hora con rotación y la reacción se terminó añadiendo EDTA 5 mM. La digestión de ADN se confirmó ejecutando lisado en un gel de bromuro de etidio antes de establecer el experimento de inmunoprecipitación. Los anticuerpos utilizados incluyen: BAP1 (C-4; Santa Cruz sc-28383), EZH2 (Active Motif, 39933, Active Motif, 39901 o Millipore, 07-689), SUZ12 (Abcam, Ab12073), ASXL1 (N-13; Santa Cruz sc-85283), L3MBTL2 (Active Motif, 39569), Myc-Tag (Cell Signaling, 2276), Tubulin (Sigma, T9026), H3K27me3 (Abcam, 6002 o Millipore, 07-449), H3 (Abcam, Ab1791) y H4K20me1 (Abcam, Ab9051).
Análisis de citometría de flu jo y anticuerpos: La tinción de marcadores de superficie de células vivas de médula ósea y bazo se realizó primero lisando células con tampón de lisis de cloruro de amonio-bicarbonato potásico y lavando las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se tiñeron con anticuerpos en PBS durante 20 minutos en hielo. Para la tinción de madres y progenitores hematopoyéticos, las células se tiñeron con un cóctel de linajes que incluye CD4 (RM4-5), CD3 (17A2), B220 (RA3-6B2), NK1.1 (PK136), Gr-1 (RB6-8C5), Cd11b (M1/70) y Ter119, permitiendo la exclusión de linajes maduros del análisis. Las células también se tiñeron con anticuerpos contra c-Kit (2B8), Sca-1 (D7), FcyRN/NI (2.4G2) y CD34 (RAM34). Para evaluar la composición de las células mononucleares maduras, se utilizaron Mac1, Gr-1, B220 y CD4/CD3. El análisis del ciclo celular se realizó mediante la tinción de las células con la mezcla de madres y progenitores hematopoyéticos descrita anteriormente. Las células se fijaron usando el kit FIX y PERM (Invitrogen N.° de cat. GAS-003). Las células se tiñeron con Ki67 después de la fijación y a continuación, se tiñeron con DAPI antes del análisis en LSR Fortessa.
Plásmidos: El clon de ADNc de longitud completa de FLAG-L3MBTL2 humano se obtuvo de Addgene (Plásmido 28232). La construcción de ubiquitina marcada con Myc-His fue un obsequio generoso de Xuejun Jiang. El clon de ADNc de longitud completa humano de HA-FLAG BAP1 se obtuvo de Addgene (Plásmido 22539). La construcción de BAP1 marcado con 3X FLAG fue un obsequio generoso de Marc Ladanyi. Se generaron construcciones mutantes de desubiquitinasa (C91A,C91S) usando kits de mutagénesis dirigida al sitio de Agilent y se confirmaron mediante secuenciación de ADN de longitud completa. Se obtuvieron ARN de horquilla corta del RNAi Consortium (TRC) en un vector de puromicina pLKO.1. Las secuencias para las horquillas cortas fueron las siguientes: BAP1 humana (ID de oligo TRC: TRCN0000078702 y TRCN0000078698), BAP1 de ratón (TRCN0000030719 y TRCN0000030720), L3MBTL2 humana (TRCN0000021724 y TRCN0000021726) y un vector de puromicina pLKO.1 de control que codifica un ARNhc para la luciferasa (shLUC).
Ensayos de ubiquitina: Las células HEK293T se sembraron en una placa de 10 cm y 24 horas después se transdujeron con 4 |jg de una construcción y control de expresión de Myc-His-Ubi, 1 |jg de L3MBTL2 y/o 1-10 |jg de construcciones de sobreexpresión de BAP1-GFP. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lisaron en un tampón de lisis basado en Guanidina HCl: guanina 6 M, NaH2PO4 0,1 M, Tris 10 mM, pH 8,0 y BME 10 mM. Las proteínas His-Ubi se purificaron mediante incubación con 20 j l de agarosa Ni-NTA (Qiagen) durante 4 horas a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron secuencialmente con 1 ml de 4 tampones de lavado: tampón A guanina 6 M, NaH2PO4 0,1 M, Tris 10 mM, pH 8,0, BME 10 mM y Triton-X al 0,2 %, tampón B urea 8 M, NaH2PO4 0,1 M, Tris 10 mM, pH 8,0, BME 10 mM y Triton-X al 0,2 %, tampón C NaH2PO40,1 M, Tris 10 mM, pH 6,3, BME 10 mM y Triton-X al 0,2 % y tampón D NaH2PO4 0,1 M, Tris 10 mM, pH 6,3, BME 10 mM y Triton-X al 0,1%. Todos los tampones se complementaron con imidazol 15 mM. Las proteínas marcadas con His se purificaron a partir de las perlas al hervirlas con tampón Laemmli 2x SDS complementado con imidazol. A continuación, las proteínas se analizaron mediante transferencia Western.
Ensayos de formación de colonias in vitro: Las células se clasificaron para las células Lin-c-Kit+Sca1+ usando el FACSAria. Se sembraron 100 células por duplicado en metilcelulosa (MethoCult GF M3434, Stem Cell Technologies). Las colonias se contaron 14 días después de la siembra en placa y las colonias se recogieron lavando con PBS. A continuación, las células se lisaron para la extracción de ARN e histonas.
Transfección transitoria: Se transfectaron células 293T con las construcciones indicadas con el reactivo de transfección del gen X-treme (Roche). Se extrajeron proteínas y/o histonas 48-72 horas después de la transfección.
Ensayos de invasión: Se sembraron células de mesotelioma (MSTO-211H, H2373, H226 y H2452) en matraces T75 (100.000 células). 12 horas más tarde, las células sembradas en placa se trataron con GSK126 (0-2 j M) (Chemitek) y a continuación, se dejaron proliferar durante 7 días. A continuación, se colocaron 250.000 células tratadas en la parte superior de una cámara de invasión de Matrigel (BD Biosciences, N.° de cat. 354480) en medios libres de suero al tiempo que la cámara inferior contenía medios con suero. 22 horas después, las células del fondo de la membrana se tiñeron con cristal violeta y se cuantificaron con ImageJ.
Ensayos de luciferasa: Las células 293T se transfectaron transitoriamente con la construcción informadora del promotor de EZH2 pGL3 (obsequio generoso de Naomi Goldfinger) y una construcción de control de Renilla Switchgear, además de las construcciones EV, BAP1 y L3MBTL2. Se evaluó la actividad luciferasa de las células usando el sistema de ensayo indicador DualLuciferase (Promega). Las células se sembraron en placas de 24 pocillos y se cotransfectaron con 200 ng de pGL3-EZH2-Luciferasa, 200 ng de la construcción de control de luciferasa de Renilla y 500 ng de construcciones experimentales. Las células se incubaron 48 horas después de la transfección, se lisaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y se evaluó la actividad de luciferasa en un luminómetro. Las lecturas de luciferasa de luciérnaga se normalizaron para el control de transfección de Renilla.
Análisis estadísticos: Se utilizó la prueba de la t de Student con la corrección de Welch para analizar la significación estadística, a menos que se describa en el texto. Se utilizó el software Prizm de GraphPad para los cálculos estadísticos. El error se calculó utilizando el ETM (en inglés, SEM), *p<0,05, **p<0,005.
7.2 RESULTADOS
Los estudios genómicos identificaron mutaciones somáticas en los supresores de tumores ASXL1 y BAP1 en diferentes neoplasias malignas. El homólogo de Drosophila ASXL1 Asx y el homólogo de BAP1 Calypso forman un complejo que elimina H2AK119Ub (Scheuermann et al., 2010). Sin embargo, no se ha demostrado que el complejo BAP1-ASXL1 tenga un papel en la transformación del mutante de BAP1. Las mutaciones inactivadoras en ASXL1 son más comunes en las neoplasias malignas mieloides (Abdel-Wahab et al., 2011; Bejar et al., 2011; Gelsi-Boyer et al., 2009), si bien las mutaciones de BAP1 recurrentes se observan comúnmente en mesotelioma (Bott et al., 2011), carcinoma de células renales (Pena-Llopis et al., 2012) y melanoma uveal metastásico (Harbour et al., 2010) sugiriendo que BAP1 y ASXL1 tienen diferentes papeles en la supresión del tumor. Estos perfiles mutacionales no se pueden explicar por la expresión diferencial de BAP1 y ASXL1 específica de tejido (FIGURA 5A-C). Este ejemplo identifica los mecanismos por los que la pérdida de BAP1 conduce a la transformación, independiente de ASXL1 e identifica las vulnerabilidades terapéuticas en células cancerosas mutantes de BAP1.
Estudios recientes han demostrado que la pérdida somática de Bap1 puede promover la transformación hematopoyética (Dey et al., 2012). Se investigó el impacto de la deleción condicional de Bap1 sobre la expresión génica y el estado de la cromatina en células hematopoyéticas (FIGURA 5A, B). La deleción condicional de Bap1 se generó usando el esquema mostrado en la FIGURA 5D. Se utilizó MX-Cre, una recombinasa que dirige la deleción de Bap1 en tejidos hematopoyéticos después de la inducción en el animal adulto. La pérdida de Bap1 condujo a una enfermedad mieloproliferativa completamente penetrante con esplenomegalia (FIGURA 6A), leucocitosis (FIGURA 5E, F), anemia (FIGURA 5G, H) y expansión de progenitores de granulocitos y macrófagos (GMP) (FIGURA 5I-K). Por ejemplo, en ratones con inactivación (KO) de Bap1, se observó que el tamaño, por ejemplo, peso y longitud, del bazo fue mayor que el de los ratones de tipo silvestre BAP1 (FIGURA 6A, 10C y 11C). También se observó un aumento en la proliferación y la progresión del ciclo celular de los progenitores mieloides deficientes en Bap1 (FIGURA 5L). El análisis de secuenciación de ARN reveló que la mayoría de genes expresados diferencialmente en GMP deficientes en Bap1 tuvieron expresión reducida (pajus <0,001) (FIGURA 7A). Aunque se observó un solapamiento significativo entre el conjunto de genes expresados diferencialmente en los progenitores de Bap1 y AsxII KO, en muchos casos se observó un efecto inverso paradójico sobre la expresión génica (FIGURA 6B). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) identificó conjuntos de genes con impacto inverso enriquecidos en progenitores de Bap1 y Asxll KO (Abdel-Wahab et al., 2013) (FIGURA 7B). El silenciamiento de ASXL1 conduce a la expresión aumentada de los genes del agrupamiento HoxA, consecuente con una actividad de PRC2 reducida (Abdel-Wahab et al., 2012). En cambio, se observó la expresión reducida de los miembros de los genes HoxA (FIGURA 6C) y la expresión disminuida de las firmas del gen HoxA en células deficientes en Bap1 (FIGURA 7C). Estos datos demuestran que la pérdida de Asxll y Bap1 tiene efectos opuestos sobre la regulación génica.
ASXL1 interactúa directamente con el complejo PRC2 y el agotamiento de ASXL1 reduce e1H3K27me3 global y específico del sitio (Abdel-Wahab et al., 2012). Dados los efectos divergentes de la pérdida de Asxll y Bap1 en la expresión génica, se investigó el impacto de la deleción de Bap1 en H3K27me3. Los niveles de H3K27me3 aumentaron en células Bap1 KO mediante espectrometría de masas de histonas (FIGURA 6D), transferencia Western (FIGURA 6E) y ELISA (FiGu RA 8A). La secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChlP-Seq) de H3K27me3 reveló un aumento global en ratones Bap1 KO (FIGURA 6F), con un número aumentado de dominios amplios de H3K27me3 (Beguelin et al., 2013) (FIGURA 6G) y una mayor "dispersión" del dominio amplio de H3K27me3 en loci cercanos (FIGURA 6H). Este aumento y dispersión de H3K27me3 se ilustra bien dentro del locus de HoxA en células Bap1 KO (FIGURA 6I). Los sitios marcados con H3K27me3 en células Bap1 KO, aparecieron principalmente en regiones promotoras de genes (FIGURA 8B) y genes con los promotores ocupados por H3K27me3 se enriquecieron para potenciar la represión (FDR<0,001) (FIGURA 6J). Se observaron hallazgos similares en las GMP purificadas (FIGURA 6K). Los genes desregulados por H3K27me3 asociado a Bap1 KO y la represión génica estuvieron implicados en la regulación dependiente de EZH2, el compromiso/diferenciación y la proliferación de linajes (FIGURA 6L, FIGURA 8C). El silenciamiento de BAP1 aumentó H3K27me3 (FIGURA 9A) y la reexpresión de BAP1 en células deficientes para Bap1 redujo los niveles de H3K27me3 (FIGURA 9B). En cambio, un alelo de BAP1 deficiente en desubiquitinasa no redujo H3K27me3 (FIGURA 9C), demostrando que las alteraciones en H3K27me3 se deben a la actividad catalítica de bAP1.
A continuación, se evaluó el papel de H3K27me3 mediado por PRC2 en la transformación dependiente de BAP1 investigando el impacto de la pérdida de Ezh2 (Su et al., 2003) sobre la transformación in vivo. La deleción de Ezh2 redujo los niveles de H3K27me3 en ratones deficientes en Bap1/Ezh2 en comparación con ratones inactivados para Bap1 (FIGURA 11A). La deleción de Ezh2 anuló la malignidad mieloide inducida por la pérdida de Bap1 (FIGURA 10A), con esplenomegalia reducida (FIGURA 11B, C), leucocitosis (FIGURA 11D) y anemia (FIGURA 11E). La pérdida concomitante de Bap1/Ezh2 redujo la expansión del progenitores mieloides (FIGURA 11F), redujo la proporción de células mieloides Mac1+Gr1+ (FIGURA 11G) y restauró la diferenciación eritroide (CD71+Ter119+) (FIGURA 10B). Se observó una proliferación disminuida de progenitores deficientes en Bap1/Ezh2 (FIGURA 11H). La haploinsuficiencia de Ezh2 disminuyó, pero no anuló, la proliferación de mieloproliferación deficiente en Bap1 (FIGURA 10C, 10D), coherente con un requerimiento dependiente de la dosis para Ezh2. De manera consecuente con los datos genéticos, el tratamiento de ratones Bap1 KO con el inhibidor de molécula pequeña EPZ011989 (Campbell et al., 2015) disminuyó la H3K27me3, la esplenomegalia y los recuentos de leucocitos (FIGURA 11I-K). Estos datos demuestran que PRC2 y específicamente la actividad de Ezh2, se requiere para la transformación mieloide deficiente en Bap1.
A continuación, se investigó el mecanismo por el que la deleción de Bap1 aumentó los niveles de H3K27me3. A diferencia de las interacciones notificadas entre ASXL1 y BAP1 y entre ASXL1 y PRC2, no se identificó una interacción entre BAP1 y EZH2 por co-IP (FIGURA 13A). Se observó un aumento en la expresión de ARNm y proteínas de Ezh2 y Suz12 (FIGURA 13b , C), consecuente con un papel de Bap1 en la regulación de la expresión de PRC2. Además, el análisis de células Lin-Sca+Kit+ clasificadas (una población que contiene las células madre hematopoyéticas) de la médula ósea completa de ratones Bap1 KO mostró aumentos significativos en la expresión de ARN de Suz12 y Ezh2 en comparación con los ratones BAP1 de tipo silvestre (FIGURA 17). Adicionalmente, las transferencias Western de médula ósea completa revelaron un aumento en la expresión de proteínas de EZH2 y SUZ12 en células Bap1 KO en comparación con las células de control (FIGURA 17). La reexpresión de BAP1 en células de médula ósea Bap1 KO redujo la expresión de ARNm de Ezh2 a niveles normales (FIGURA 12A). Se planteó la hipótesis de que la pérdida de Bap1 podría alterar directamente otras marcas de histonas, que, a continuación, alterarían el estado de la cromatina en los loci diana clave, incluyendo EZH2. La espectrometría de masas de histonas reveló una marcada disminución en H4K20me1 en células Bap1 KO (FIGURA 13D) en comparación con otras marcas de histonas medidas (FIGURA 12B). La expresión de BAP1, pero no la de ASXL1 o BMI1, aumentó H4K20me1 en el locus de EZH2 (FIGURA 12C). Por tanto, se planteó la hipótesis de que la pérdida de la marca de H4K20me1 puede tener un papel importante en la expresión génica dependiente de BAP1. SETD8 es la única metiltransferasa conocida que coloca H4K20me1 (Nishioka et al., 2002). La expresión de SETD8 en células de mesotelioma mutantes de BAP1 (H226, H2452) aumentó la apoptosis y redujo la proliferación, mientras que las células de tipo silvestre (MSTO-211H y Meso10) no se vieron afectadas (FIGURA 13E, F). La sobreexpresión de SETD8 en células de mesotelioma disminuyó la expresión de ARNm y proteínas de EZH2 (FIGURA 13G, H). Las líneas celulares de tipo silvestre de BAP1 fueron más sensibles a un inhibidor de SETD8 (Blum et al., 2014) (BVT594) que las líneas celulares mutantes de BAP1 (FIGURA 13I).
Se planteó la hipótesis de que BAP1 desubiquitina un modulador de cromatina que regula H4K20me1. El análisis de los datos de ChlP-Seq (Abdel-Wahab et al., 2013; Dey et al., 2012) identificó un agrupamiento de genes con ocupación de Bap1, pero sin unión de Asxl1 (Agrupamiento 1) y se enriquecieron para un motivo de E-box (FIGURA 14a , B). Estudios previos han demostrado que las proteínas atípicas polycomb L3MBTL1 y L3MBTL2 se unen a motivos de E-box y pueden unirse y mantener H4K20me1 (Guo et al., 2009; Qin et al., 2012; Trojer et al., 2011; Trojer et al., 2007). Los ratones deficientes en L3mbtl1 no tienen un fenotipo manifiesto (Qin et al., 2010), mientras que los ratones deficientes en L3mbtl2 son embrionarios letales similares en el tiempo a la pérdida de Bap1 (Dey et al., 2012; Qin et al., 2012). Por tanto, se investigó si la pérdida de Bap1 condujo a alteraciones en la expresión de L3mbtl2. La proteína L3mbtl2, pero no la expresión de ARN, se redujo en células hematopoyéticas Bap1 KO (FIGURA 15A, B) y en células de mesotelioma mutantes de BAP1 en comparación con células de mesotelioma de tipo silvestre de BApI (FIGURA 13J). La ubiquitinación de L3MBTL2 se redujo en células que expresan BAP1 (FIGURA 13K) y el tratamiento con inhibidor de proteosoma aumentó la estabilidad de L3MBTL2 en células mutantes de BAP1 (FIGURA 15C). La expresión de L3MBTL2 disminuyó los niveles de proteína EZH2 con y sin coexpresión de BAP1 (FIGURA 15D) y la expresión de BAP1 o la sobreexpresión de L3MBTL2 redujo la actividad del promotor de EZH2 (FIGURA 15E). Por el contrario, el silenciamiento de L3MBTL2 aumentó la expresión de EZH2 (FIGURA 15F). Se observó un enriquecimiento de L3MBTL2 y BAP1 en el locus de EZH2 en células que expresan L3MBTL2 y BAP1 (FIGURA 15G, H). Sin quedar ligado a teoría concreta alguna, estos datos sugieren que BAP1 y L3MBTL2 interactúan (FIGURA 15l) y co-ocupan el locus de EZH2. La pérdida de BAP1 conduce a la reducción de la estabilidad de L3MBTL2 y al aumento de la producción transcripcional de EZH2 (FIGURA13L).
El análisis de los datos del TCGA reveló que la expresión de ARNm de EZH2 aumentó en el mesotelioma (FIGURA 16A). A continuación, se evaluó si la inhibición de EZH2 podría inhibir la supervivencia de las líneas celulares de mesotelioma mutantes de BAP1. El silenciamiento de EZH2 indujo la apoptosis en líneas celulares mutantes de BAP1, mientras que las líneas celulares de tipo silvestre continuaron proliferando (FIGURA 16B, C). El silenciamiento de EZH2 anuló la formación de tumores in vivo de líneas celulares mutantes de BAP1 pero no de tipo silvestre (FIGURA 16D). La sobreexpresión de EZH2 en líneas celulares de tipo silvestre de BAP1 aumentó la proliferación (FIGURA 20A) y sensibilidad a la inhibición de EZH2 (FIGURA 20B). Las líneas celulares mutantes de BAP1 fueron más sensibles a la inhibición de EZH2 (EPZ011989) in vitro tanto en cultivo 2D (FIGURA 16E) como en cultivo 3D (FIGURA 16F). A continuación, se evaluó el impacto de la inhibición de EZH2 in vivo. La inhibición de EZH2 redujo significativamente el tamaño del tumor mutante de BAP1 en comparación con los ratones tratados con vehículo (FIGURA 16G), mientras que los tumores de tipo silvestre respondieron menos/no respondieron a la inhibición de EZH2 (FIGURA 16H), a pesar de efectos similares sobre H3K27me3. La inhibición de EZH2 anuló la metástasis pulmonar en una línea celular de mesotelioma mutante de BAP1 con potencial metastásico (FIGURA 16G), consecuente con un papel para BAP1/EZH2 en la metástasis (Harbour et al., 2010). La inhibición de EZH2 redujo la invasión y aumentó la expresión de E-Cadherina in vitro (FIGURA 20C-D). A continuación, se evaluó el impacto de la inhibición de EZH2 utilizando el inhibidor de BAP1 GSK126. Se inyectaron células de mesotelioma mutantes de BAP1 en el costado de ratones NOD-SCID y, a continuación, se inició el tratamiento con vehículo o 150 mg/kg de GSK126 después de la formación del tumor. La inhibición de EZH2 redujo significativamente el tamaño del tumor en comparación con los ratones tratados con vehículo (FIGURA 21A y FIGURA 4). El tratamiento con GSK126 atenuó significativamente H3K27me3 en células mutantes de BAP1 in vivo (FIGURA 21B). El análisis patológico reveló que la inhibición de EZH2 se asoció con una tinción de Ki67 reducida y un aumento de la tinción de TUNEL (FIGURA 21C). Estos datos indican que EZH2 representa una diana terapéutica potencial en células cancerosas mutantes de BAP1.
La identificación de mutaciones oncogénicas de EZH2 (Morin et al., 2010; Morin et al., 2011; Pasqualucci et al., 2011) ha conducido al desarrollo de terapias epigenéticas específicas de mutantes. Sin embargo, la mayoría de las mutaciones en reguladores epigenéticos dan como resultado una pérdida de función, de manera que no representan dianas terapéuticas directas tratables. Los inhibidores de EZH2 han entrado recientemente en ensayos clínicos (McCabe et al., 2012) y los datos desvelados sugieren que la pérdida de BAP1 da como resultado una dependencia específica de mutación en PRC2 que debe explorarse adicionalmente en estudios preclínicos y clínicos. Estos datos resuenan con estudios recientes que sugieren un papel de la inhibición de PRC2 en tumores rabdoides mutantes de SWI/SNF (Alimova et al., 2013; Knutson et al., 2013) y los análisis que muestran que las mutaciones de BAP1 son mutuamente excluyentes con las mutaciones SWI/SNF (Wilson et al., 2010). Estos datos sugieren que se pueden utilizar estudios detallados de mutaciones en reguladores epigenéticos para informar el desarrollo de terapias que revierten los efectos específicos de mutantes sobre el estado epigenético en diferentes contextos malignos.
7.3. DISCUSIÓN
BAP1 y ASXL1 interactúan para formar un complejo de desubiquitinasa de polycomb que puede eliminar la monoubiquitina de la histona H2A lisina 119 (H2AK119Ub). Sin embargo, BAP1 y ASXL1 están mutados en distintos tipos de cáncer, consecuente con papeles independientes en la regulación del estado epigenético y en la transformación maligna. En este ejemplo, se demuestra que la pérdida de Bap1 da como resultado un aumento de la lisina 27 de histona H3 trimetilada (H3K27me3), una expresión de Ezh2 elevada y una represión mejorada de las dianas del complejo represivo Polycomb 2 (PRC2). Estos hallazgos contrastan con la reducción en H3K27me3 observada con la pérdida de Asxll. La deleción condicional de Bap1 y Ezh2 in vivo anula la expansión de progenitores mieloides inducida por la pérdida de Bap1 sola. La pérdida de Bap1 da como resultado una marcada disminución de la monometilación de H4K20 (H4K20me1). Consecuente con el papel de H4K20me1 en la regulación transcripcional de EZH2, la expresión de SETD8, la H4K20me1 metiltransferasa, reduce la expresión de EZH2 y anula la proliferación de células mutantes de BAP1. Adicionalmente, las células de mesotelioma que carecen de BAP1 son sensibles a la inhibición farmacológica de EZH2, lo que sugiere un nuevo enfoque terapéutico para las neoplasias malignas mutantes de BAP1.
8. REFERENCIAS
Abdel-Wahab, O., Adli, M., LaFave, L.M., Gao, J., Hricik, T., Shih, A.H., Pandey, S., Patel, J.P., Chung, Y.R., Koche, R., et al. (2012). ASXL1 mutations promote myeloid transformation through loss of PRC2-mediated gene repression. Cancer Cell 22, 180-193.
Abdel-Wahab, O., Gao, J., Adli, M., Dey, A., Trimarchi, T., Chung, Y.R., Kuscu, C., Hricik, T., Ndiaye-Lobry, D., Lafave, L.M., et al. (2013). Deletion of Asxl1 results in myelodysplasia and severe developmental defects in vivo. J Exp Med 210, 2641-2659.
Abdel-Wahab, O., Pardanani, A., Patel, J., Wadleigh, M., Lasho, T., Heguy, A., Beran, M., Gilliland, D.G., Levine, R.L. y Tefferi, A. (2011). Concomitant analysis of EZH2 and ASXL1 mutations in myelofibrosis, chronic myelomonocytic leukemia and blast-phase myeloproliferative neoplasms. Leukemia 25, 1200-1202.
Alimova, I., Birks, D.K., Harris, P.S., Knipstein, J.A., Venkataraman, S., Marquez, V.E., Foreman, N.K. y Vibhakar, R. (2013) . Inhibition of EZH2 suppresses self-renewal and induces radiation sensitivity in atypical rhabdoid teratoid tumor cells. Neuro Oncol 15, 149-160.
Beguelin, W., Popovic, R., Teater, M., Jiang, Y., Bunting, K.L., Rosen, M., Shen, H., Yang, S.N., Wang, L., Ezponda, T., et al. (2013). EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell 23, 677-692.
Bejar, R., Stevenson, K., Abdel-Wahab, O., Galili, N., Nilsson, B., Garcia-Manero, G., Kantarjian, H., Raza, A., Levine, R.L., Neuberg, D., et al. (2011). Clinical effect of point mutations in myelodysplastic syndromes. The New England journal of medicine 364, 2496-2506.
Blum, G., Ibanez, G., Rao, X., Shum, D., Radu, C., Djaballah, H., Rice, J.C. y Luo, M. (2014). Small-molecule inhibitors of SETD8 with cellular activity. ACS Chem Biol 9, 2471-2478.
Bott, M., Brevet, M., Taylor, B.S., Shimizu, S., Ito, T., Wang, L., Creaney, J., Lake, R.A., Zakowski, M.F., Reva, B., et al. (2011). The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature genetics 43, 668-672.
Campbell, J.E., Kuntz, K.W., Knutson, S.K., Warholic, N.M., Keilhack, H., Wigle, T.J., Raimondi, A., Klaus, C.R., Rioux, N., Yokoi, A., et al. (2015). EPZ011989, A Potent, Orally-Available EZH2 Inhibitor with Robust in Vivo Activity. ACS Med Chem Lett 6, 491-495.
Dey, A., Seshasayee, D., Noubade, R., French, D.M., Liu, J., Chaurushiya, M.S., Kirkpatrick, D.S., Pham, V.C., Lill, J.R., Bakalarski, C.E., et al. (2012). Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science 337, 1541-1546.
García, B.A., Mollah, S., Ueberheide, B.M., Busby, S.A., Muratore, T.L., Shabanowitz, J. y Hunt, D.F. (2007). Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nat Protoc 2, 933-938.
Gelsi-Boyer, V., Trouplin, V., Adelaide, J., Bonansea, J., Cervera, N., Carbuccia, N., Lagarde, A., Prebet, T., Nezri, M., Sainty, D., et al. (2009). Mutations of polycomb-associated gene ASXL1 in myelodysplastic syndromes and chronic myelomonocytic leukaemia. British journal of haematology 145, 788-800.
Guo, Y., Nady, N., Qi, C., Allali-Hassani, A., Zhu, H., Pan, P., Adams-Cioaba, M.A., Amaya, M.F., Dong, A., Vedadi, M., et al. (2009). Methylation-state-specific recognition of histones by the MBT repeat protein L3MBTL2. Nucleic Acids Res 37, 2204-2210.
Harbour, J.W., Onken, M.D., Roberson, E.D., Duan, S., Cao, L., Worley, L.A., Council, M.L., Matatall, K.A., Helms, C. y Bowcock, A.M. (2010). Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science 330, 1410-1413. Knutson, S.K., Warholic, N.M., Wigle, T.J., Klaus, C.R., Allain, C.J., Raimondi, A., Porter Scott, M., Chesworth, R., Moyer, M.P., Copeland, R.A., et al. (2013). Durable tumor regression in genetically altered malignant rhabdoid tumors by inhibition of methyltransferase e Zh 2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 7922-7927.
Krivtsov, A.V., Feng, Z., Lemieux, M. E., Faber, J., Vempati, S., Sinha, A.U., Xia, X., Jesneck, J., Bracken, A.P., Silverman, L.B., et al. (2008). H3K79 methylation profiles define murine and human MLL-AF4 leukemias. Cancer Cell 14, 355-368.
Lara-Astiaso, D., et al. Immunogenetics. Chromatin state dynamics during blood formation. Science 345, 943-949 (2014) .
Love, M.I., Huber, W. y Anders, S. (2014). Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome biology 15, 550.
MacLean, B., Tomazela, D.M., Shulman, N., Chambers, M., Finney, G.L., Frewen, B., Kern, R., Tabb, D. L., Liebler, D. C. y MacCoss, M.J. (2010). Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics 26, 966-968.
McCabe, M.T., Ott, H. M., Ganji, G., Korenchuk, S., Thompson, C., Van Aller, G.S., Liu, Y., Graves, A.P., Della Pietra, A., 3rd, Diaz, E., et al. (2012). EZH2 inhibition as a therapeutic strategy for lymphoma with EZH2-activating mutations. Nature 492, 108-112.
Morin, R.D., Johnson, N.A., Severson, T.M., Mungall, A.J., An, J., Goya, R., Paul, J.E., Boyle, M., Woolcock, B.W., Kuchenbauer, F., et al. (2010). Somatic mutations altering EZH2 (Tyr641) in follicular and diffuse large B-cell lymphomas of germinal-center origin. Nature genetics 42, 181-185.
Morin, R.D., Mendez-Lago, M., Mungall, A.J., Goya, R., Mungall, K.L., Corbett, R.D., Johnson, N.A., Severson, T.M., Chiu, R., Field, M., et al. (2011). Frequent mutation of histone-modifying genes in non-Hodgkin lymphoma. Nature 476, 298-303.
Nishioka, K., Rice, J.C., Sarma, K., Erdjument-Bromage, H., Werner, J., Wang, Y., Chuikov, S., Valenzuela, P., Tempst, P., Steward, R., et al. (2002). PR-Set7 is a nucleosome-specific methyltransferase that modifies lysine 20 of histone H4 and is associated with silent chromatin. Mol Cell 9, 1201-1213.
O'Geen, H., Echipare, L. y Farnham, P.J. (2011). Using ChIP-seq technology to generate high-resolution profiles of histone modifications. Methods Mol Biol 791, 265-286.
Pasqualucci, L., Trifonov, V., Fabbri, G., Ma, J., Rossi, D., Chiarenza, A., Wells, V.A., Grunn, A., Messina, M., Elliot, O. , et al. (2011). Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet 43, 830-837.
Pena-Llopis, S., Vega-Rubin-de-Celis, S., Liao, A., Leng, N., Pavia-Jimenez, A., Wang, S., Yamasaki, T., Zhrebker, L., Sivanand, S., Spence, P., et al. (2012). BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nat Genet 44, 151-759.
Phung, Y.T., Barbone, D., Broaddus, V.C. y Ho, M. (2011). Rapid generation of in vitro multicellular spheroids for the study of monoclonal antibody therapy. Journal of Cancer 2, 507-514.
Qin, J., Van Buren, D., Huang, H.S., Zhong, L., Mostoslavsky, R., Akbarian, S. y Hock, H. (2010). Chromatin protein L3MBTL1 is dispensable for development and tumor suppression in mice. J Biol Chem 285, 27767-27775.
Qin, J., Whyte, W.A., Anderssen, E., Apostolou, E., Chen, H.H., Akbarian, S., Bronson, R.T., Hochedlinger, K., Ramaswamy, S., Young, R.A., et al. (2012). The polycomb group protein L3mbtl2 assembles an atypical PRC1-family complex that is essential in pluripotent stem cells and early development. Cell Stem Cell 11, 319-332.
Scheuermann, J.C., de Ayala Alonso, A.G., Oktaba, K., Ly-Hartig, N., McGinty, R.K., Fraterman, S., Wilm, M., Muir, T.W. y Muller, J. (2010). Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature 465, 243-247.
Skarnes, W.C., Rosen, B., West, A.P., Koutsourakis, M., Bushell, W., Iyer, V., Mujica, A.O., Thomas, M., Harrow, J., Cox, T., et al. (2011). A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature 474, 337-342.
Su, I.H., Basavaraj, A., Krutchinsky, A.N., Hobert, O., Ullrich, A., Chait, B.T. y Tarakhovsky, A. (2003). Ezh2 controls B cell development through histone H3 methylation and Igh rearrangement. Nat Immunol 4, 124-131.
Suraokar, M.B., Nunez, M.I., Diao, L., Chow, C.W., Kim, D., Behrens, C., Lin, H., Lee, S., Raso, G., Moran, C., et al. (2014). Expression profiling stratifies mesothelioma tumors and signifies deregulation of spindle checkpoint pathway and microtubule network with therapeutic implications. Annals of oncology: official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO 25, 1184-1192.
Trojer, P., Cao, A.R., Gao, Z., Li, Y., Zhang, J., Xu, X., Li, G., Losson, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., et al. (2011). L3MBTL2 protein acts in concert with PcG protein-mediated monoubiquitination of H2A to establish a repressive chromatin structure. Mol Cell 42, 438-450.
Trojer, P., Li, G., Sims, R. J., 3rd, Vaquero, A., Kalakonda, N., Boccuni, P., Lee, D., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P. , Nimer, S.D., et al. (2007). L3MBTL1, a histone-methylation-dependent chromatin lock. Cell 129, 915-928.
Wilson, B.G., Wang, X., Shen, X., McKenna, E.S., Lemieux, M. E., Cho, Y.J., Koellhoffer, E.C., Pomeroy, S.L., Orkin, S.H. y Roberts, C.W. (2010). Epigenetic antagonism between polycomb and SWI/SNF complexes during oncogenic transformation. Cancer Cell 18, 316-328.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor de EZH2 para usar en el tratamiento de un cáncer en un sujeto que lo necesita, en donde la expresión de un biomarcador de BAP1 en el cáncer del sujeto está ausente o se expresa en un nivel más bajo que un nivel de control de referencia de BAP1,
en donde el nivel de control de referencia de BAP1 es el nivel de expresión del biomarcador de BAP1 en una muestra de control de referencia;
en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en mesoteliomas malignos, melanomas uveales, carcinoma de células renales, melanomas cutáneos, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de piel no melanoma, meningioma, colangiocarcinoma, leiomiosarcoma, tumores neuroendocrinos, cáncer pancreático, paraganglioma, histiocitoma fibroso maligno, tumores intradérmicos atípicos melanocíticos de BAP1 mutada (MBAIT), leucemia mieloide aguda, síndromes mielodisplásicos y cáncer de vejiga; y
en donde el inhibidor de EZH2 se selecciona del grupo que consiste en UNC1999, 3-deazaneplanocina A, EI1, EPZ-6438, EPZ-5676, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 y GSK126.
2. Un inhibidor de EZH2 para su uso en un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende determinar la expresión de un biomarcador de BAP1 en una o más células del cáncer del sujeto, donde si el biomarcador de BAP1 está ausente o se expresa en niveles más bajos en el cáncer, en comparación con un nivel de control de referencia de BAP1, a continuación, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de EZH2 al sujeto para producir un efecto anticanceroso,
en donde el nivel de control de referencia de BAP1 es el nivel de expresión del biomarcador de BAP1 en una muestra de control de referencia;
en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en mesoteliomas malignos, melanomas uveales, carcinoma de células renales, melanomas cutáneos, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de piel no melanoma, meningioma, colangiocarcinoma, leiomiosarcoma, tumores neuroendocrinos, cáncer pancreático, paraganglioma, histiocitoma fibroso maligno, tumores intradérmicos atípicos melanocíticos de BAP1 mutada (MBAIT), leucemia mieloide aguda, síndromes mielodisplásicos y cáncer de vejiga; y
en donde el inhibidor de EZH2 se selecciona del grupo que consiste en UNC1999, 3-deazaneplanocina A, EI1, EPZ-6438, EPZ-5676, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 y GSK126.
3. El inhibidor de EZH2 para su uso de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente determinar, en dichas una o más células del cáncer del sujeto, el nivel de expresión de EZH2 y/o SUZ12, donde si el biomarcador de BAP1 está ausente o se expresa en un nivel más bajo que un nivel de control de referencia de BAP1 y si la expresión de EZH2 está aumentada en comparación con un nivel de control de referencia de EZH2 y/o la expresión de SUZ12 está aumentada en comparación con un nivel de control de referencia de SUZ12, a continuación, administrar al sujeto el inhibidor de EZH2.
4. El inhibidor de EZH2 para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el cáncer es un mesotelioma maligno, un melanoma uveal o un carcinoma de células renales.
5. El inhibidor de EZH2 para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la expresión del biomarcador de BAP1 se determina mediante inmunofluorescencia, transferencia Western, hibridación in situ, reacción en cadena de la polimerasa o utilizando un reactivo que se une específicamente con el biomarcador de BAP1, por ejemplo, en donde el reactivo es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
6. El inhibidor de EZH2 para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el inhibidor de EZH2 es EPZ-6438.
7. Un método para determinar si es probable que un efecto anticanceroso se produzca en un cáncer por un inhibidor de EZH2, que comprende determinar en una muestra de un cáncer el nivel de expresión de un biomarcador de BAP1, donde si el biomarcador de BAP1 está ausente o se expresa en un nivel más bajo en el cáncer, en comparación con un nivel de control de referencia de BAP1, es más probable que el inhibidor de EZH2 tenga un efecto anticanceroso sobre el cáncer,
en donde el nivel de control de referencia de BAP1 es el nivel de expresión del biomarcador de BAP1 en una muestra de control de referencia;
en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en mesoteliomas malignos, melanomas uveales, carcinoma de células renales, melanomas cutáneos, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de piel no melanoma, meningioma, colangiocarcinoma, leiomiosarcoma, tumores neuroendocrinos, cáncer pancreático, paraganglioma, histiocitoma fibroso maligno, tumores intradérmicos atípicos melanocíticos de BAP1 mutada (MBAIT), leucemia mieloide aguda, síndromes mielodisplásicos y cáncer de vejiga; y
en donde el inhibidor de EZH2 se selecciona del grupo que consiste en UNC1999, 3-deazaneplanocina A, EI1, EPZ-6438, EPZ-5676, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 y GSK126.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el biomarcador de BAP1 es un biomarcador de proteína BAP1 o un biomarcador de ácido nucleico de BAP1.
9. El método de la reivindicación 7 u 8, en donde la expresión del biomarcador de BAP1 se determina mediante inmunofluorescencia o transferencia Western.
10. Un método para predecir la sensibilidad de un cáncer a un inhibidor de EZH2, que comprende determinar en una muestra de un cáncer el nivel de expresión de un biomarcador de la proteína BAP1 en las células de la muestra, en donde si el biomarcador de BAP1 está ausente o se reduce en el nivel de expresión en comparación con un nivel de control de referencia de BAP1, a continuación, se predice que el cáncer es sensible a un inhibidor de EZH2, en donde el nivel de control de referencia de BAP1 es el nivel de expresión del biomarcador de BAP1 en una muestra de control de referencia; en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en mesoteliomas malignos, melanomas uveales, carcinoma de células renales, melanomas cutáneos, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de piel no melanoma, meningioma, colangiocarcinoma, leiomiosarcoma, tumores neuroendocrinos, cáncer pancreático, paraganglioma, histiocitoma fibroso maligno, tumores intradérmicos atípicos melanocíticos de BAP1 mutada (MBAIT), leucemia mieloide aguda, síndromes mielodisplásicos y cáncer de vejiga; y
en donde el inhibidor de EZH2 se selecciona del grupo que consiste en UNC1999, 3-deazaneplanocina A, EI1, EPZ-6438, EPZ-5676, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 y GSK126.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en donde el inhibidor de EZH2 es EPZ-6438.
12. Uso de un kit en el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde el kit comprende unos medios para detectar el biomarcador de BAP1.
13. El uso de la reivindicación 12, en donde los medios para detectar el biomarcador de BAP1 comprenden uno o más cebadores, sondas, matrices/micromatrices, anticuerpos específicos de biomarcadores y/o perlas, envasados, opcionalmente en donde los medios para detectar el biomarcador de BAP1 comprenden uno más anticuerpos o fragmento(s) de unión a antígeno del (los) mismo(s), para detectar el biomarcador de BAP1.
14. El uso de la reivindicación 12 o 13, en donde el kit comprende adicionalmente uno o más cebadores, sonda, matrices/micromatriz, anticuerpo específico de biomarcador y/o perla para detectar la expresión de EZH2, la expresión de L3MBTL2 y/o la expresión de SUZ12.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10493076B2 (en) 2015-08-24 2019-12-03 Epizyme, Inc. Method for treating cancer
TW201718598A (zh) 2015-08-27 2017-06-01 美國禮來大藥廠 Ｅｚｈ２抑制劑
CN109073659B (zh) * 2016-02-16 2022-05-17 新加坡科技研究局 表观基因组分析揭示了原发性胃腺癌的体细胞启动子局面
GB201615842D0 (en) * 2016-09-16 2016-11-02 Ucl Business Plc Cell death biomarker
CN106963765B (zh) * 2017-03-28 2020-04-07 上海交通大学医学院附属第九人民医院 Ezh2抑制剂化合物在制备治疗眼部黑色素瘤的药物中的应用
GB201919219D0 (en) 2019-12-23 2020-02-05 Otsuka Pharma Co Ltd Cancer biomarkers

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US548257A (en) 1895-10-22 Hay rake and loader
US5322770A (en) 1989-12-22 1994-06-21 Hoffman-Laroche Inc. Reverse transcription with thermostable DNA polymerases - high temperature reverse transcription
DE69132843T2 (de) 1990-12-06 2002-09-12 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben
US6379897B1 (en) 2000-11-09 2002-04-30 Nanogen, Inc. Methods for gene expression monitoring on electronic microarrays
US6465611B1 (en) 1997-02-25 2002-10-15 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy of prostate cancer and methods for their use
US5932422A (en) * 1997-11-14 1999-08-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Modulation of drug resistance via ubiquitin carboxy-terminal hydrolase
US6218114B1 (en) 1998-03-27 2001-04-17 Academia Sinica Methods for detecting differentially expressed genes
US6004755A (en) 1998-04-07 1999-12-21 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Quantitative microarray hybridizaton assays
US6218122B1 (en) 1998-06-19 2001-04-17 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods of monitoring disease states and therapies using gene expression profiles
US6406921B1 (en) 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
US6271002B1 (en) 1999-10-04 2001-08-07 Rosetta Inpharmatics, Inc. RNA amplification method
US7429466B2 (en) 2000-01-24 2008-09-30 Hypromatrix, Inc Methods and arrays for detecting biological molecules
US6618679B2 (en) 2000-01-28 2003-09-09 Althea Technologies, Inc. Methods for analysis of gene expression
US20030077616A1 (en) 2001-04-19 2003-04-24 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomolecule characterization using mass spectrometry and affinity tags
EP1390497A2 (en) 2001-05-25 2004-02-25 Genset Human cdnas and proteins and uses thereof
US7112408B2 (en) 2001-06-08 2006-09-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Detection of ovarian cancer based upon alpha-haptoglobin levels
US20030013208A1 (en) 2001-07-13 2003-01-16 Milagen, Inc. Information enhanced antibody arrays
IL160324A0 (en) 2001-08-13 2004-07-25 Beyond Genomics Inc Method and system for profiling biological systems
AU2003213054A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF POLYCOMB GROUP PROTEIN EZH2 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20030215858A1 (en) 2002-04-08 2003-11-20 Baylor College Of Medicine Enhanced gene expression system
US20030199001A1 (en) 2002-04-23 2003-10-23 Pitt Aldo M. Sample preparation of biological fluids for proteomic applications
US20080038725A1 (en) 2005-06-20 2008-02-14 Yuling Luo Methods of detecting nucleic acids in individual cells and of identifying rare cells from large heterogeneous cell populations
US20110251216A1 (en) 2010-02-19 2011-10-13 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for inhibiting ezh2
US8895245B2 (en) 2010-09-10 2014-11-25 Epizyme, Inc. Inhibitors of human EZH2 and methods of use thereof
US9175331B2 (en) 2010-09-10 2015-11-03 Epizyme, Inc. Inhibitors of human EZH2, and methods of use thereof
US20140011696A1 (en) * 2011-02-16 2014-01-09 Thomas Wiesner Bap1 mutational analysis in determining susceptibility to, prognosis of, and treatment of melanocytic neoplasia
WO2012144220A1 (en) * 2011-04-22 2012-10-26 Oncotherapy Science, Inc. Ezh2 as target gene for cancer therapy and diagnosis
AU2012315566A1 (en) 2011-09-30 2014-04-17 Glaxosmithkline Llc Methods of treating cancer
KR102587175B1 (ko) 2012-03-12 2023-10-06 에피자임, 인코포레이티드 인간 ｅｚｈ2의 억제제 및 이의 사용 방법
PL2908823T3 (pl) 2012-10-15 2020-03-31 Epizyme, Inc. Sposoby leczenia nowotworu

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