ES2866880T3 - Métodos y kits para la detección rápida del clon O25B-ST131 de Escherichia Coli - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y kits para la detección rápida del clon O25B-ST131 de Escherichia coli

Campo de la invención:

La presente invención se refiere a métodos y kits para la detección rápida del clon O25b-ST131 de Escherichia Coli.

Antecedentes de la invención:

El clon O25b-ST131 de Escherichia Coli es un clon pandémico mundial que causa una infección predominantemente resistente a los antimicrobianos de inicio en la comunidad. Por ejemplo, se ha identificado una alta prevalencia del clon (~30%-60%) entre las E. coli resistentes a la fluoroquinolona. Además, potencialmente aloja una variedad de genes de p-lactamasa; con mayor frecuencia, se incluyen las p-lactamasas de la familia CTX-M y, con menor frecuencia, las p-lactamasas TEM, SHV y CMY. Se ha demostrado una amplia distribución entre las E. coli resistentes a los antimicrobianos de la infección humana en Europa (especialmente en el Reino Unido), América del Norte, Canadá, Japón y Corea. El espectro clínico de la enfermedad descrita es similar al de otras E. coli, con predominio de la infección de las vías urinarias. La descripción va desde la cistitis no complicada hasta la infección grave complicada por bacteriemia, absceso renal y pielonefritis enfisematosa. Otros sitios de infección han incluido el aparato respiratorio, líquido ascítico, absceso intraabdominal, huesos/articulaciones y bacteriemia sin un foco clínicamente aparente. También se ha descrito queque el clon O25b-ST131 de E. coli es una causa importante de septicemia neonatal por E. coli. Por lo tanto, el clon constituye un importante problema de salud pública y existe una necesidad insatisfecha de desarrollar un nuevo método para detectarlo, en especial cuando no es posible la detección fenotípica del clon ST131 y las técnicas basadas en ADN, incluidas MLST y PCR, siguen requiriendo mucho tiempo. Szijarto V et al. (2014): "Diagnostic Potential of Monoclonal Antibodies Specific to the Unique O-Antigen of Multidrug-Resistant Epidemic Escherichia coli Clone ST131-O25b: H4 ", Clinical and Vaccine Immunology, vol. 21, n.° 7, pág. 939-939, doi: 10.1128/CVI.00685-13, describen los anticuerpos como herramientas de diagnóstico para las infecciones por O25b: ST131 de E. coli.

Clermont O et al. (2009): "Rapid detection of the O25b-ST131 clone of Escherichia coli encompassing the CTX-M-15-producing strains", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, vol. 64, n.° 2, págs. 274-277, doi: 10.1093/jac/dkp194, describen un esquema de detección basado en PCR para la identificación de la cepa O25b: ST131 de E. coli.

Compendio de la invención:

La presente invención se refiere a métodos y kits para la detección rápida del clon O25b-ST131 de Escherichia coli. En particular, la presente invención está definida por las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención:

Los inventores han aislado un bacteriófago de podoviridae (LM33_P1) que infecta la cepa LM33 de E. coli aislada de neumonía asociada a ventilador y que pertenece al clon STI31 -O25b. De las 70 cepas de O25b ensayadas, LM33_P1 pudo infectar al 73% de ellas. Al ensayar diferentes cepas de E. coli pertenecientes a otros 129 serotipos distintos (incluidos doce O25a), los inventores descubrieron que el bacteriófago LM33_P1 es capaz de infectar exclusivamente cepas O25b (ninguna de las cepas distintas de O25b pudo ser infectada por LM33_P1). Los inventores han determinado que la especificidad exhibida por el bacteriófago LM33_P1 para infectar solo cepas del serotipo O25b se basa en un polipéptido muy específico (Gp17) utilizado por LM33_P1 para unir la célula bacteriana a través de la molécula de LPS.

Por consiguiente, un primer objeto de la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO:l

MSTITQFPSGNTQYRIEFDYLARTFVVVTLVNSSNPTLNRVLEVGRDYRFLNPT

MIEMLADQSGFDIVRIHRQTGTDLVVDFRNGSVLTASDLTNSELQATHIAEEGR

DQT VDLAKE YAD AAGS S AGN AKDS EDES RR1A AS 1K AAGKIG Y1TRRS FEKGF

NVTTWNEVLLWEEDGDYYRWDGTLPKNVPAGSTPESSGGIGLSAWVSVGDA

SLRANLADSDGAKYIGSGERTLLEHNNDVLHSKDFPTLQAAIDASLQKNDLLV

SPGNYTEKVTIGNAQLKGVGGATVLKTPADFTNTVQVNLATPHWQFRHSGGF

ATDGSGTTGAVGISFDPSDQYSGRHNFSDVYIHNINKATQKPSGNIGNTWRNIGI

STCDWGYYA1SGSEMHCGADTLYNIHFDGISTYAVYLDGTVDNGGGGAWWL

KDS1IEASGGGGIYLKSKSGDCPTSPCGVSNIWMEAIATSPAVQVDGVAQKPR

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W YVWG VNSRLQS GS ADISITS GITMGS VYTKPGEWIS TFG VGK ASTTGT VALY

VSTGGGSG AT VRFS DFFIAEFTTQ AQ ALAF ANS RMS LS

Según la invención, una primera secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con una segunda secuencia de aminoácidos significa que la primera secuencia tiene 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99 o 100% de identidad con la segunda secuencia de aminoácidos. La identidad de secuencia se mide con frecuencia en términos de porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para comparación se conocen en la técnica. Se describen varios programas y algoritmos de alineación en: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math, 2: 482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS, 5: 151-153, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16: 10881-10890, 1988; Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8: 155-165, 1992; and Pearson et al., Meth. Mol. Biol., 24: 307-31, 1994). Altschul et al., Nat. Genet., 6: 119­ 129, 1994, presenta una consideración detallada de los métodos de alineación de secuencias y los cálculos de homología. A modo de ejemplo, las herramientas de alineación ALIGN (Myers and Miller, CABIOS 4: 11-17, 1989) o LFASTA (Pearson and Lipman, 1988) se pueden utilizar para realizar comparaciones de secuencias (Internet Program® 1996, W. R. Pearson y la Universidad de Virginia, fasta20u63 versión 2.0u63, fecha de publicación diciembre de 1996). ALIGN compara secuencias completas entre sí, mientras que LFASTA compara regiones de similitud local. Estas herramientas de alineación y sus respectivos tutoriales están disponibles en Internet en el sitio web de NCSA, por ejemplo. Alternativamente, para comparaciones de secuencias de aminoácidos de más de aproximadamente 30 aminoácidos, la función de secuencias Blast 2 se puede emplear utilizando la matriz BLOSUM62 predeterminada establecida en los parámetros predeterminados (coste de existencia de huecos de 11 y un coste de hueco por residuo de 1). Al alinear péptidos cortos (menos de alrededor de 30 aminoácidos), el alineamiento debe realizarse usando la función de secuencias Blast 2, empleando la matriz PAM30 establecida en los parámetros predeterminados (hueco abierto 9, penalizaciones de huecos de extensión 1). El sistema de comparación de secuencias BLAST está disponible, por ejemplo, en el sitio web de NCBI; véase también Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990; Gish. y States, Nature Genet., 3: 266-272, 1993; Madden et al. Meth. Enzymol., 266: 131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997; y Zhang y Madden, Genome Res., 7: 649-656, 1997.

En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1.

En particular, el polipéptido de la presente invención es una variante conservadora funcional del polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 1. Como se usa en este documento, el término "variante conservadora de la función" se refiere a aquellas en las que un residuo de aminoácido dado en una proteína o enzima se ha cambiado sin alterar la conformación y función generales del polipéptido, que incluye, entre otros, el reemplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares (como, por ejemplo, polaridad, potencial de enlace de hidrógeno, ácido, básico, hidrófobo, aromático y similares). En consecuencia, una "variante conservadora de la función " también incluye un polipéptido que tiene propiedades o funciones iguales o sustancialmente similares que la proteína nativa u original con la que se compara (es decir, unión a las moléculas de LPS del clon O25b-ST131 de E. coli). Las propiedades funcionales del polipéptido de la presente invención podrían evaluarse típicamente en cualquier ensayo funcional como se describe en el Ejemplo.

En algunas realizaciones, el polipéptido de la presente invención se condensa a al menos un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido que no deriva de la SEQ ID NO: 1) para crear una proteína de fusión. La expresión "proteína de fusión" se refiere al polipéptido según la invención que se condensa directamente o mediante un espaciador a al menos un polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende el polipéptido según la invención que se condensa directamente o mediante un espaciador en su extremo C-terminal al extremo N-terminal del polipéptido heterólogo, o en su extremo N-terminal al extremo C-terminal del polipéptido heterólogo. Como se usa en este documento, el término "directamente" significa que el (primero o el último) aminoácido en el extremo terminal (extremo N o C-terminal) del polipéptido se condensa al (primero o último) aminoácido en el extremo terminal (extremo N o C-terminal) del polipéptido heterólogo. En otras palabras, en esta realización, el último aminoácido del extremo C-terminal de dicho polipéptido está directamente unido por un enlace covalente al primer aminoácido del extremo N-terminal de dicho polipéptido heterólogo, o el primer aminoácido del extremo N-terminal de dicho polipéptido está directamente unido por un enlace covalente al último aminoácido del extremo C-terminal de dicho polipéptido heterólogo. Como se usa en este documento, el término "espaciador" se refiere a una secuencia de al menos un aminoácido que une el polipéptido de la presente invención al polipéptido heterólogo. Un espaciador de este tipo puede ser útil para prevenir obstáculos estéricos. El enlazador es típicamente un péptido espaciador y, según la invención, se seleccionará para permitir la unión del polipéptido al polipéptido heterólogo. Los espaciadores adecuados serán claros para el experto en base a la descripción de este documento, opcionalmente después de cierto grado limitado de experimentación de rutina. Los espaciadores adecuados se describen en este documento y pueden, por ejemplo y sin limitación, comprender una secuencia de aminoácidos, cuya secuencia de aminoácidos tiene preferiblemente una longitud de 2 o más aminoácidos. Normalmente, el espaciador tiene 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoácidos. Sin embargo, el límite superior no es crítico, sino que se elige por razones de conveniencia con respecto a, p. ej., producción de tales proteínas de fusión. Un grupo útil de secuencias espaciadoras son los espaciadores derivados de la región bisagra de los anticuerpos de cadena pesada como se describe en los documentos WO 96/34103 y WO 94/04678. Otros ejemplos son secuencias espaciadoras de polialanina tales como Ala-Ala-Ala. Otros ejemplos preferidos de secuencias espaciadoras son espaciadores Gly/Ser de diferente longitud que incluyen (gly4ser)3, (gly4ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3 y (gly3ser2)3.

En algunas realizaciones, el polipéptido de la presente invención se condensa con un dominio de inmunoglobulina. Por ejemplo, la proteína de fusión de la presente invención puede comprender un polipéptido de la presente invención que se condensa con una porción Fc (tal como una Fc humana). Dicha porción Fc puede ser útil para aumentar la producción del polipéptido de la presente invención o para movilizar el polipéptido de la presente invención a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el polipéptido de la presente invención se condensa a uno o más dominios CH1 (típicamente humanos) y/o CH2 y/o CH3, opcionalmente mediante una secuencia espaciadora. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención condensado a un dominio CH1 adecuado podría usarse, por ejemplo, junto con cadenas ligeras adecuadas, para generar fragmentos/estructuras de anticuerpos análogos a los fragmentos Fab convencionales o los fragmentos F(ab')2, pero en los que uno o (en el caso de un fragmento F(ab')2) uno o ambos dominios VH convencionales han sido reemplazados por un polipéptido de la presente invención. En algunas realizaciones, uno o más anticuerpos de dominio único de la invención pueden condensarse a uno o más dominios constantes (por ejemplo, 2 o 3 dominios constantes que pueden usarse como parte de/para formar una porción Fc), a una porción Fc. y/o a una o más partes, fragmentos o dominios del anticuerpo que confieren una o más funciones efectoras y/o pueden conferir la capacidad de unirse a uno o más receptores Fc. Por ejemplo, para este propósito, y sin limitarse a ello, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender uno o más dominios CH2 y/o CH3 de un anticuerpo, tal como de un anticuerpo de cadena pesada y más típicamente de un anticuerpo de cadena humano convencional; y/o puede formar una región Fc, por ejemplo a partir de IgG (por ejemplo, de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), de IgE o de otra Ig humana tal como IgA, IgD o IgM.

En algunas realizaciones, el polipéptido heterólogo es un polipéptido fluorescente. Los polipéptidos fluorescentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, una proteína verde fluorescente (GFP), que incluye, pero no se limita a, una versión "humanizada" de una GFP, por ejemplo, en la que los codones de la secuencia de nucleótidos de origen natural se cambian para coincidir más estrechamente con el sesgo del codón humano; una GFP derivada de Aequoría victoria o su derivado, por ejemplo, un derivado "humanizado" tal como Enhanced GFP, que están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Clontech, Inc .; una GFP de otra especie como Renilla reniformis, Renilla mulleri o Ptilosarcus guernyi, como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 99/49019 y Peelle et al. (2001) J. Protein Chem. 20: 507-519; GFP recombinante "humanizada" (hrGFP) (Stratagene); cualquiera de una variedad de proteínas fluorescentes y coloreadas de especies de antozoos, como se describe en, p. ej., Matz et al. (1999) Nature Biotechnol.

17: 969-973; y similares.

En algunas realizaciones, el polipéptido heterólogo es una enzima. Normalmente, dicha enzima puede seleccionarse del grupo que consiste en p-galactosidasa, fosfatasa alcalina, luciferasa y peroxidasa de rábano picante). Cuando el polipéptido heterólogo es una enzima que produce un producto detectable, el producto puede detectarse usando un medio apropiado, por ejemplo, la p-galactosidasa puede, dependiendo del sustrato, producir un producto coloreado, que se detecta espectrofotométricamente, o un producto fluorescente; la luciferasa puede producir un producto luminiscente detectable con un luminómetro; etc.

En algunas realizaciones, el polipéptido heterólogo es un polipéptido que facilita la purificación o el aislamiento de la proteína de fusión, por ejemplo, polipéptidos de unión a iones metálicos tales como etiquetas 6H is (por ejemplo, Tat/6His acetilado) o glutatión-S-transferasa.

El polipéptido de la presente invención (condensado o no al polipéptido heterólogo) se produce mediante cualquier técnica conocida en la industria, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, o bien sola o en combinación. Por ejemplo, conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la técnica puede producir fácilmente dicho polipéptido (condensado o no al polipéptido heterólogo), mediante técnicas estándar para la producción de polipéptidos. Por ejemplo, se pueden sintetizar usando un método en fase sólida conocido, preferiblemente usando un aparato de síntesis de péptidos disponible comercialmente (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, el polipéptido de la presente invención (condensado o no al polipéptido heterólogo) puede sintetizarse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención (condensado o no al polipéptido heterólogo) se puede obtener como productos de expresión de ADN después de la incorporación de secuencias de ADN que codifican el polipéptido (condensado o no al polipéptido heterólogo) en vectores de expresión e introducción de dichos vectores. en hospedantes eucariotas o procariotas adecuados que expresarán el polipéptido deseado, a partir del cual pueden aislarse posteriormente usando técnicas conocidas. Se puede utilizar una variedad de sistemas hospedante/vector de expresión para contener y expresar el polipéptido de la presente invención (condensado o no al polipéptido heterólogo). Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófagos, plásmidos o cósmidos recombinantes; levadura transformada con vectores de expresión de levadura (Giga-Hama et al., 1999); sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus, véase Ghosh et al., 2002); sistemas de células vegetales transfectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322; véase, por ejemplo, Babe et al., 2000); o sistemas de células animales. Los expertos en la materia conocen diversas técnicas para optimizar la expresión de proteínas, véanse, por ejemplo, Kaufman, 2000; Colosimo et al., 2000. En la producción recombinante del polipéptido de la presente invención (condensado o no al polipéptido heterólogo), sería necesario emplear vectores que comprendan moléculas polinucleotídicas para codificar dicho polipéptido. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para preparar tales vectores, así como para producir células hospedantes transformadas con tales vectores. Las moléculas de polinucleótidos utilizadas en tal esfuerzo pueden unirse a un vector, que generalmente incluye un marcador seleccionable y un origen de replicación, para la propagación en un hospedante. Estos elementos de los constructos de expresión son bien conocidos por los expertos en la técnica. Generalmente, los vectores de expresión incluyen ADN que codifica la proteína dada que se une operativamente a secuencias reguladoras de transcripción o traducción adecuadas, tales como las derivadas de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores o potenciadores de la transcripción, sitios de unión ribosómica de ARNm y secuencias apropiadas que controlan la transcripción y la traducción. Las expresiones "vector de expresión", "constructo de expresión" o "casete de expresión" se usan indistintamente a lo largo de esta memoria y están destinadas a incluir cualquier tipo de constructo genético que contenga un ácido nucleico que codifique un producto génico en el que se pueda transcribir parte o la totalidad de la secuencia que codifica el ácido nucleico. La elección de un vector de expresión adecuado para la expresión del polipéptido de la presente invención dependerá, por supuesto, de la célula hospedante específica que se utilizará, y está dentro de la experiencia del experto en la materia. Normalmente, las secuencias de nucleótidos están unidas operativamente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con el ADN que codifica la proteína de interés (por ejemplo, un polipéptido). Por tanto, una secuencia de nucleótidos promotora está operativamente unida a una secuencia de ADN dada si la secuencia de nucleótidos promotora dirige la transcripción de la secuencia. Luego, si es necesario, pueden purificarse mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo mediante precipitación fraccionada, en particular precipitación con sulfato de amonio, electroforesis, filtración en gel, cromatografía de afinidad, etc. En particular, los métodos convencionales para preparar y purificar proteínas recombinantes pueden usarse para producir las proteínas según la invención. Típicamente, la molécula de ácido nucleico o el vector de la presente invención incluye "secuencias de control", que se refieren colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores en dirección 5’, orígenes de replicación, sitios internos de entrada al ribosoma ("IRES" ), potenciadores, y similares, que colectivamente proporcionan la replicación, transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula receptora. No es necesario que todas estas secuencias de control estén siempre presentes, siempre y cuando la secuencia codificante seleccionada sea capaz de ser replicada, transcrita y traducida en una célula hospedante apropiada. Otra secuencia de ácido nucleico es una secuencia "promotora", que se usa en este documento en su sentido ordinario para referirse a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, en la que la secuencia reguladora deriva de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante en dirección 3'). Los promotores de la transcripción pueden incluir "promotores inducibles" (donde la expresión de una secuencia polinucleotídica unida operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), "promotores reprimibles" (donde la expresión de una secuencia polinucleotídica unida operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.) y "promotores constitutivos".

Otro objeto de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención (condensado o no al polipéptido heterólogo).

Como se usa en este documento, la expresión "molécula de ácido nucleico" tiene su significado general en la técnica y se refiere a una molécula de ADN o ARN. Sin embargo, el término captura secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN como, entre otros, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico de la presente invención se incluye por tanto en un vector adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago o vector vírico. Por tanto, un objeto adicional de la invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención (condensado o no al polipéptido heterólogo).

Otro objeto de la presente invención se refiere a una célula hospedante transformada con la molécula de ácido nucleico de la presente invención. El término "transformación" significa la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN "exógeno" (es decir, extrínseco o extracelular) en una célula hospedante, de modo que la célula hospedante expresará el gen o la secuencia introducida para producir una sustancia deseada, es decir, el polipéptido codificado por el gen o la secuencia introducidos. Se ha "transformado" una célula hospedante que recibe y expresa ADN o ARN introducido. Por ejemplo, como se describió anteriormente, para expresar y producir el polipéptido de la presente invención, se elegirán células procariotas y, en particular células de E. coli. En realidad, según la invención, no es obligatorio producir los polipéptidos de la presente invención en un contexto eucariota que favorecerá modificaciones postraducción (por ejemplo, glicosilación). Normalmente, la célula hospedante puede ser adecuada para producir el polipéptido de la presente invención (condensado o no al polipéptido heterólogo) como se describió anteriormente.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, el polipéptido de la presente invención (condensado o no al polipéptido heterólogo) se conjuga con una etiqueta detectable. Las etiquetas detectables adecuadas incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, una etiqueta fluorescente, una etiqueta quimioluminiscente, una etiqueta enzimática, una etiqueta bioluminiscente u oro coloidal. Los expertos en la técnica conocen los métodos para preparar y detectar dichos inmunoconjugados etiquetados de forma detectable y se describen con más detalle a continuación. Por ejemplo, la etiqueta detectable puede ser un radioisótopo que se detecta mediante autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para el propósito de la presente invención son 3H, 125I, 131I, 35S y 14C. El polipéptido de la presente invención (condensado o no al polipéptido heterólogo) también se puede etiquetar con un compuesto fluorescente. La presencia de un polipéptido etiquetado con fluorescencia de la presente invención se determina exponiendo el inmunoconjugado a luz de la longitud de onda adecuada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos de etiquetado fluorescente incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, oftaldehído y fluorescamina, y tintes Alexa Fluor. Alternativamente, el polipéptido de la presente invención se puede etiquetar de forma detectable acoplando dicho polipéptido a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del inmunoconjugado etiquetado con quimioluminiscencia se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de etiquetado quimioluminiscentes incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato. De manera similar, se puede usar un compuesto bioluminiscente para etiquetar el polipéptido de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para etiquetar incluyen luciferina, luciferasa y aequorina. Normalmente, cuando el polipéptido se condensa a un polipéptido fluorescente como se describió anteriormente, la presencia de la proteína de fusión puede detectarse con cualquier método conocido en la técnica, tal como un microscopio o un sistema de análisis automatizado. Normalmente, cuando el polipéptido se condensa a una enzima, la proteína de fusión se incuba en presencia del sustrato apropiado, el resto de enzima reacciona con el sustrato para producir un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, mediante espectrofotometría, fluorometría o medios visuales. Los ejemplos de enzimas que pueden usarse para etiquetar de manera detectable inmunoconjugados poliespecíficos incluyen p-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina. Los expertos en la técnica conocerán otras etiquetas adecuadas que se pueden emplear según la presente invención. La unión de restos marcadores al anti-polipéptido de la presente invención se logra usando técnicas estándar conocidas en el campo. La metodología típica a este respecto es descrita por Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70: 1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81: 1, 1977; Shih et al., Int'U. Cancer 46: 1101, 1990; Stein et al., Cancer Res. 50: 1330, 1990; y Coligan, supra. Además, la conveniencia y versatilidad de la detección inmunoquímica puede mejorarse utilizando los anticuerpos de dominio único de la presente invención (condensados o no con el polipéptido heterólogo) que se han conjugado con avidina, estreptavidina y biotina. {Véanse, p. ej., Wilchek et al. (eds.), "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", en Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992).) En algunas realizaciones, la presencia del polipéptido (condensado o no al polipéptido heterólogo) se detecta con un anticuerpo secundario que es específico para el único anticuerpo de la presente invención (condensado o no al polipéptido heterólogo). Normalmente, dicho anticuerpo secundario se etiqueta mediante los mismos métodos que los descritos anteriormente. Por ejemplo, cuando el polipéptido de la presente invención se condensa a una marca (por ejemplo, una marca de histidina), el anticuerpo secundario es específico para dicha marca. Los métodos para realizar inmunoensayos están bien establecidos. {Véanse, p. ej., Cook and Self, ''Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology ", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc.

1996)).

En algunas realizaciones, el polipéptido de la presente invención está biotinilado. Como se usa en este documento, el término "biotinilación" se refiere a la unión covalente de biotina a un polipéptido. La biotinilación del polipéptido de la presente invención se realiza utilizando reactivos capaces de conjugar biotina a la cadena lateral de dicho polipéptido, donde dicha conjugación tiene lugar fundamentalmente en los grupos amino primarios y en los grupos tiol que aparecen en las cadenas laterales del polipéptido. Los reactivos adecuados para la biotinilación de grupos amino incluyen moléculas que contienen biotina y un grupo capaz de reaccionar con grupos amino tales como ésteres de succinimida, éster de pentafluorofenilo o haluros de alquilo, en donde el grupo biotina y el grupo reactivo están separados por un espaciador de cualquier longitud (por ejemplo, de 8-40 A de longitud). Algunos ejemplos de estos agentes de biotinilación incluyen agentes NHS-biotina (que contienen un enlace éster de cinco átomos de carbono entre la biotina y el grupo Nh S), sulfo-NHS-biotina, NHS-LC-biotina, sulfo-NHS-LC-Biotina, NHS-LC-LC-biotina, sulfo-NHS-LC-LC-biotina, sulfo-NHS-SS-biotina, NHS-PEO4-biotina, PFP-biotina, TFP-PEO-biotina y similares, donde "NHS" indica un grupo N-hidroxisuccinimida, "LC" se refiere a un enlace tipo amida de 6 átomos de carbono ubicado entre el grupo NHS y la biotina, "PEO" se refiere a un grupo de óxido de etileno, donde el subíndice indica el número de unidades de PEO, "PFP" se refiere a un grupo pentafluorofenilo, "TFP" se refiere a un grupo tetrafluorofenilo, "sulfo" se refiere a un grupo sulfonato (SO3 "Na+) y "SS" se refiere a un grupo disulfuro. Ejemplos de agentes reactivos de biotinilación con grupos tiol incluyen moléculas que comprenden biotina y un grupo del tipo maleimido o haluro de alquilo, separado por un espaciador de cualquier longitud. Los ejemplos de reactivos de biotinilación incluyen maleimida-PEG-biotina, biotina-BMCC (que contiene un grupo maleimido N-terminal y un grupo ciclohexilo, 2 enlaces amida y 9 átomos de carbono de enlace), PEO-yodoacetil biotina, yodoacetil-LC-biotina, biotina-HPDP (que contiene un grupo piridil disulfuro) y similares.

En algunas realizaciones, el polipéptido de la presente invención se conjuga con una partícula de látex, una partícula coloide de metal o un nanotubo de carbono.

Otro objeto de la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia del clon O25b-ST 131 de E. coli en una muestra, que comprende i) poner en contacto la muestra con el polipéptido de la presente invención que es capaz de formar complejos con las moléculas de lipopolisacárido (LPS) del clon O25b-ST131 de E. coli y ii) detectar la presencia de uno o más de dichos complejos, en donde la presencia de al menos un complejo indica la presencia del clon en la muestra.

Como se usa en este documento, el término "muestra" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un sujeto, y se puede usar en un ensayo y es susceptible de contener el clon O25b-ST131 de E. coli. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido como una muestra de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas de los mismos, y la progenie de los mismos. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra líquida. En algunas realizaciones, la muestra líquida es orina, sangre, suero, hemoderivados, plasma, saliva, fluido corporal, agua, medio de cultivo, medio de cultivo diluido, producto de petróleo, combustible, líquido sometido a fermentación o una bebida. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra sólida. En algunas realizaciones, la muestra sólida es tejido humano o animal, heces, esputo, expectorado, un producto agrícola, alimento, sólidos recogidos por centrifugación o filtración, tierra o sedimento. La muestra se puede diluir, purificar, concentrar, filtrar, disolver, suspender o manipular de otro modo antes del ensayo.

La detección de los complejos puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica y típicamente incluye inmunoensayos. Los formatos de inmunoensayo que se pueden usar incluyen típicamente un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un ensayo de inmunofluorescencia (IFA), un radioinmunoensayo (RIA), un inmunoensayo de quimioluminiscencia (CLIA), una prueba cromatográfica de flujo lateral, un Western blot, un ensayo de inmunoprecipitación, citometría de flujo o microscopía de fluorescencia. Las pruebas inmunocromatográficas de flujo lateral son especialmente adecuadas para la detección rápida del clon. Los expertos en la técnica también saben que tales ensayos pueden ser útiles para cualquiera de un gran número de problemas de microbiología clínica y otros tipos de muestras clínicas. Por tanto, para realizar dichos inmunoensayos, el polipéptido se inmoviliza típicamente sobre un soporte sólido.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, el polipéptido de la presente invención se inmoviliza sobre un soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido es una partícula, una perla, una superficie de plástico o vidrio, una membrana porosa, una matriz o un chip. En algunas realizaciones, el soporte sólido forma parte de un dispositivo de ensayo. Los ensayos en fase sólida, en general, son más fáciles de realizar que los métodos de ensayo heterogéneos que requieren un paso de separación, como precipitación, centrifugación, filtración, cromatografía o magnetismo, porque la separación de reactivos es más rápida y sencilla.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona dispositivos que son útiles para detectar y/o visualizar la presencia del clon O25b-ST131 de E. coli en una muestra. Estos dispositivos pueden comprender una superficie y el polipéptido de la presente invención. Los dispositivos de ensayo en fase sólida incluyen placas de microvaloración, dispositivos de ensayo de flujo continuo (por ejemplo, dispositivos de inmunoensayo de flujo lateral), tiras reactivas y dispositivos de inmunoensayo inmunocapilar o inmunocromatográfico. Un formato de ensayo particularmente útil es un formato de inmunoensayo de flujo lateral. En algunas realizaciones, el dispositivo incluye un soporte sólido que contiene una zona de aplicación de muestra y una zona de captura. El inmunoensayo de flujo lateral (LFA) es una realización particular que permite al usuario realizar un inmunoensayo completo en 10 minutos o menos. Los expertos en la técnica conocen muchas realizaciones y variaciones del formato de flujo lateral, que incluyen: una variedad de materiales porosos que incluyen nitrocelulosa, difluoruro de polivinilideno, papel y fibra de vidrio; una variedad de carcasas de tiras reactivas; partículas coloreadas y fluorescentes para la detección de señales que incluyen metales coloidales, soles y látex poliméricos; una variedad de etiquetas, químicas de unión y otras variaciones. Existen varios formatos conocidos de tiras reactivas inmunocromatográficas para detectar analitos en muestras líquidas. Un formato de LFA usa un ensayo de unión directa en "sándwich", en el que el analito está unido por dos moléculas de unión específicas que pueden por tanto incluir un polipéptido de la presente invención. En algunas realizaciones, el polipéptido de la presente invención se condensa al dominio Fc (como se describió anteriormente) para formar una molécula similar a un anticuerpo que se puede unir a un soporte sólido mediante cualquier método conocido en la técnica. Se describen ejemplos de formato LFA en la patente de Estados Unidos n.° 4.861.711; H. Friesen etal. (1989), que describe un dispositivo de diagnóstico en fase sólida para la determinación de sustancias biológicas; la patente de Estados Unidos n.° 4.740.468; L. Weng et al. (1988) que describe un método de unión específico de fase sólida y un dispositivo para detectar un analito; la patente de Estados Unidos n.° 4.168.146; A. Grubb et al. (1979) que describe un método en fase sólida y una tira con anticuerpos unidos, y la patente de Estados Unidos n.° 4.435.504; R. Zuk (1984) que describe un inmunoensayo cromatográfico que emplea una molécula de unión al ligando y un conjugado marcador. En un tipo de este formato, descrito en la patente de Estados Unidos n.° 4.959.307; J. Olson (1990), el resultado se revela como dos líneas (resultado positivo) o una línea (resultado negativo). Otro formato de ensayo particularmente útil es un formato de inmunoensayo de flujo continuo. Los dispositivos de inmunoensayo de flujo continuo implican un reactivo de captura (es decir, el polipéptido de la invención) unido a una membrana o filtro poroso al que se añade una muestra líquida. A medida que el líquido fluye por la membrana, el analito diana (es decir, moléculas de LPS) se une al reactivo de captura. La adición de la muestra va seguida (o se hace al mismo tiempo) de la adición de un reactivo detector, como por ejemplo, una proteína etiquetada (p. ej., conjugada con oro o conjugada con partículas de látex coloreadas). Alternativamente, el reactivo detector puede disponerse en la membrana de una manera que permita que el detector se mezcle con la muestra y de ese modo etiquete el analito. La detección visual del reactivo detector proporciona una indicación de la presencia del analito diana en la muestra. Los dispositivos de ensayo de flujo continuo representativos se describen en las patentes de Estados Unidos n.° 4.246.339; 4.277.560; 4.632.901; 4.812.293; 4.920.046; y 5.279.935; las publicaciones de solicitudes de patentes de Estados Unidos n.° 20030049857 y 20040241876; y WO 08/030.546. Los dispositivos de ensayo de migración generalmente incorporan en su interior reactivos que se han adherido a etiquetas coloreadas, lo que permite la detección visible de los resultados del ensayo sin la adición de más sustancias. Véanse, por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 4.770.853; publicación PCT n.° WO 88/08534 y patente europea n.° EP-A 0299428. Hay una serie de pruebas de tipo de flujo lateral disponibles comercialmente y patentes que describen métodos para la detección de analitos grandes (PM superior a 1.000 Daltons). La patente de EE. UU. n.° 5.229.073 describe un método de flujo lateral de inmunoensayo competitivo semicuantitativo para medir los niveles de lipoproteínas en plasma. Este método utiliza una pluralidad de zonas de captura o líneas que contienen anticuerpos inmovilizados para unir tanto la lipoproteína etiquetada como la libre para dar un resultado semicuantitativo. Además, la patente de EE. UU. n.° 5.591.645 proporciona una tira reactiva cromatográfica con al menos dos porciones. La primera parte incluye un trazador móvil y la segunda parte incluye un aglutinante inmovilizado capaz de unirse al analito. En los siguientes documentos de patente se describen ejemplos adicionales de pruebas de flujo lateral para analitos grandes: patentes de EE. UU. n.° 4.168.146; 4.366.241; 4.855.240; 4.861.711; y 5.120.643; patente europea n.2 0296724; WO 97/06439; WO 98/36278; y WO 08/030.546. Los dispositivos descritos en el presente documento generalmente incluyen una tira de material absorbente (tal como una membrana microporosa), que, en algunos casos, puede estar hecha de diferentes sustancias, cada una unida a la otra en zonas, que pueden colgarse y/o superponerse. En algunos ejemplos, la tira absorbente se puede fijar sobre un material de soporte no interactivo (tal como poliéster no tejido), por ejemplo, para proporcionar una mayor rigidez a la tira. Las zonas dentro de cada tira pueden contener diferencialmente una o más pareja(s) de unión específica(s) y/u otros reactivos requeridos para la detección y/o cuantificación del analito particular que se está ensayando, por ejemplo, una o más moléculas descritas en este documento. Por tanto, estas zonas pueden verse como sectores funcionales o regiones funcionales dentro del dispositivo de prueba. En general, se introduce una muestra de fluido en la tira en el extremo proximal de la tira, por ejemplo mediante inmersión o manchado. El fluido migra distalmente a través de todas las regiones funcionales de la tira. La distribución final del fluido en las regiones funcionales individuales depende de la capacidad de adsorción y de las dimensiones de los materiales utilizados.

Los dispositivos de flujo lateral se conocen comúnmente en la técnica. En síntesis, un dispositivo de flujo lateral es un dispositivo analítico que tiene como esencia una tira reactiva, por la cual fluye un fluido de muestra de prueba que se sospecha que contiene un analito de interés. El fluido de prueba y cualquier analito suspendido pueden fluir a lo largo de la tira hasta una zona de detección en la que el analito (si está presente) interactúa con un agente de captura (es decir, el polipéptido de la presente invención) y un agente de detección para indicar la presencia, ausencia y/o cantidad del analito. Se han descrito numerosos dispositivos analíticos de flujo lateral, e incluyen los que se muestran en las patentes de Estados Unidos n.24.313.734; 4.435.504; 4.775.636; 4.703.017; 4.740.468; 4.806.311; 4.806.312; 4.861.711; 4.855.240; 4.857.453; 4.943.522; 4.945.042; 4.496.654; 5.001.049; 5.075.078; 5.126.241; 5.451.504; 5.424.193; 5.712.172; 6.555.390; 6.258.548; 6.699.722; 6.368.876 y 7.517.699; EP 0810436; y WO 92/12428; WO 94/01775; WO 95/16207; y WO 97/06439. Muchos dispositivos de flujo lateral son ensayos de flujo lateral de un solo paso en los que se coloca un fluido biológico en un área de muestra en una tira absorbente (aunque se pueden usar materiales no absorbentes y volverlos absorbentes, por ejemplo, aplicando un tensioactivo al material) y se deja migrar a lo largo de la tira hasta que el líquido entra en contacto con una pareja de unión específica (como un anticuerpo) que interactúa con un analito (como una o más moléculas) en el líquido. Una vez que el analito interactúa con la pareja de unión, una señal (como un tinte fluorescente o visible) indica que se ha producido la interacción. Se pueden disponer múltiples parejas de unión discretas (como el polipéptido de la presente invención) en la tira (por ejemplo, en líneas paralelas) para detectar múltiples analitos (como dos o más moléculas) en el líquido. Las tiras reactivas también pueden incorporar indicadores de control, que proporcionan una señal de que la prueba se ha realizado adecuadamente, incluso si no se observa en la tira una señal positiva que indique la presencia (o ausencia) de un analito. La construcción y el diseño de los dispositivos de flujo lateral es muy conocida en la técnica, como se describe, por ejemplo, en Millipore Corporation, A Short Guide Developing Immunochromatographic Test Strips, 2a edición, pág.

1-40, 1999, disponible a pedido al (800) 645-5476; y Schleicher y Schuell, Easy to Work with BioScience, Products and Protocols 2003, pág. 73-98, 2003, 2003, disponible a pedido en Schleicher y Schuell BioScience, Inc., 10 Optical Avenue, Keene, N.H. 03431, (603) 352-3810.

En algunas realizaciones, el método de la presente invención es particularmente adecuado en ensayos de diagnóstico, en particular para el diagnóstico de infecciones bacterianas causadas por el clon O25b-ST131 de E. coli. En algunas realizaciones, el método de la presente invención es particularmente adecuado para el diagnóstico de infecciones nosocomiales y, en particular, infecciones nosocomiales adquiridas en el hospital. En algunas realizaciones, el método de la presente invención es particularmente adecuado para el diagnóstico de una enfermedad infecciosa seleccionada del grupo que consiste en fibrosis quística, otitis media, queratitis, endoftalmitis, bacteriemia, infección de heridas por quemaduras, neumonía, meningitis, peritonitis o septicemia, más preferiblemente neumonía, meningitis, peritonitis o septicemia, y lo más preferiblemente peritonitis o septicemia. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la muestra es una muestra obtenida de un paciente que padece una infección bacteriana. En algunas realizaciones, el paciente se selecciona entre pacientes inmunodeprimidos y/o gravemente enfermos en centros de cáncer, unidades de cuidados intensivos y centros de trasplante de órganos. En algunas realizaciones, el método de diagnóstico de la presente invención es una herramienta valiosa para que los médicos en ejercicio tomen decisiones rápidas sobre el tratamiento. Estas decisiones de tratamiento pueden incluir la administración de un agente antibacteriano (por ejemplo, antibiótico) y decisiones para monitorear el inicio y/o avance de la infección en un sujeto. El método descrito en el presente documento también se puede utilizar para controlar la eficacia de una terapia. El paciente puede ser monitoreado mientras se somete al tratamiento usando los métodos descritos en este documento para evaluar la eficacia del protocolo de tratamiento. De esta manera, el período de tiempo o la cantidad administrada al paciente puede modificarse basándose en los resultados obtenidos usando los métodos descritos en este documento.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invención.

Figuras:

Figura 1. El extracto de O25b LPS inhibe la infección por el bacteriófago LM33_P1: aparición en placas de agar. El extracto de LPS de la cepa LM33 se mezcló con el bacteriófago LM33_P1 (izquierda) o 536_P1 (derecha) en dos concentraciones diferentes (105 y 104 ufp/ml) y se analizó en dos placas de agar superpuestas con una cepa O25b (AVC02) o una cepa O6 (536) como control. Se muestran ampliaciones de estas dos placas para facilitar la observación.

Figura 2. Actividad del bacteriófago LM33_P1 in vivo en un modelo de infección pulmonar. Recuentos bacterianos (A) y víricos (B) 17 horas después de la infección en el homogeneizado de pulmones de ratones infectados con 1 x108 ufc de la cepa LM33. Cuatro horas después de la infección, los ratones recibieron PBS (Control, n = 8, por vía intranasal e intraperitoneal) o bacteriófago LM33_P1 por vía intranasal (9 IN, MOI 50, n = 6) o por vía intraperitoneal (9 IP, MOI 500, n = 6). Los resultados se expresan como valores individuales con mediana y rangos intercuartílicos (percentiles 25 y 75). *: p <0,001 en comparación con el grupo de control.

Figura 3. Actividad del bacteriófago LM33_P1 in vivo en un modelo de septicemia. Recuentos bacterianos (A) y víricos (B) 20 horas después de la infección en órganos indicados de ratones infectados con 1x109 ufc de la cepa H1659 (ST131-O25b:H4). Dos horas después de la infección, los ratones recibieron PBS (Control) o bacteriófago LM33_P1 por vía intraperitoneal con una MOI de 60 (9 X1: una dosis 2 horas después de la infección, 9 X2: dos dosis 2 y 12 horas después de la infección). Los resultados se expresan como valores individuales (4 animales por condición) con mediana y rangos intercuartílicos (percentiles 25 y 75 percentiles). §: p <0,05 en comparación con el grupo de control, #: p = 0,057 en comparación con el grupo de control.

Figura 4. Actividad del bacteriófago LM33_P1 in vivo en un modelo de infección de las vías urinarias. Recuentos bacterianos (A) y víricos (B) 48 horas después de la infección en homogeneizados de riñón de ratones infectados con 5x107 ufc de la cepa LM33. Veinticuatro horas después de la infección, los ratones recibieron PBS (Control, n = 13) o bacteriófago LM33_P1 por vía intraperitoneal (9, MOI 200, n = 10). Los resultados se expresan como valores individuales con mediana y rangos intercuartílicos (percentiles 25 y 75). *: p <0,001 en comparación con el grupo de control.

Ejemplo:

Material y métodos

Cepas bacterianas y bacteriófagos, pruebas de susceptibilidad

Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo pertenecen a colecciones publicadas previamente de E. coli de comensales humanos y extraintestinales. recolectadas en Francia durante la década de 2010 (13-15), de la colección ECOR (16) y la colección ColoColi (un estudio multicéntrico francés en curso que recopila cepas de E. coli en las vías respiratorias inferiores de pacientes ventilados mecánicamente). La pertenencia al filogrupo y a ST se determinó como se describe en (17, 18). Los alelos de tipo O y fimH se determinaron mediante ensayos basados en PCR como se describió anteriormente (19, 20), respectivamente. Todas las cepas se cultivaron en caldo de lisogenia (LB) (Bacto-Triptona Difco™ 10 g/l, Extracto de levadura Difco, Difco™ 5 g/l, NaCl 5 g/l). La susceptibilidad a los antibióticos mediante el método de difusión en disco se realizó siguiendo los lineamientos del Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing).

Algunas cepas de E. coli, utilizadas para ensayos de lipopolisacáridos (LPS) o pruebas de susceptibilidad a bacteriófagos, se detallan a continuación:

LM33, LM36, AVC02 (ST131-O25b:H4) y AVC03 (O25b, no ST131) son cepas clínicas responsables de la neumonía asociada al ventilador,

536 (ST127-O6), LM02 (ST69-O17) y ECOR51 (ST73-O25a) se han utilizado como fuente de sus correspondientes LPS,

81009 WT (ST131-O25b:H4) y su derivado áspero isogénico (cepa mutante obtenida mediante la eliminación del gen que codifica la ligasa del antígeno O) (21) se utilizaron para comprobar la interacción dependiente de LPS de LM33_P1.

Los bacteriófagos se aislaron de las aguas residuales, utilizando un hospedante específico. Por convención, los bacteriófagos se denominan como sigue: "bacteria hospedante_Px" (por ejemplo, LM33_P1 representa el primer bacteriófago aislado usando la cepa LM33). En todos los experimentos de competición, las disoluciones de bacteriófagos se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio como se describió anteriormente (22).

Para las pruebas de susceptibilidad a los bacteriófagos, utilizamos la prueba de doble mancha (23) como método de detección para identificar cepas resistentes. En síntesis, la prueba de manchas consistió en dejar caer 10 pl de un cultivo líquido en crecimiento de la cepa bacteriana (OD600nm 0,5) en una placa de agar. Después del secado, se añadió 1 pl de la disolución de bacteriófago (LM33_P1, 107 ufp/ml) en una mitad de la gota bacteriana. Luego se incubó la placa a 37°C durante 4 horas antes de la lectura. Una cepa susceptible se identificó por la presencia de un área de lisis en forma de media luna en la gota bacteriana o la visualización de placas individualizadas. La eficiencia de la formación de placas (EOP) se determinó para todas las cepas susceptibles titulando la disolución de LM33_P1 tanto en su hospedante (LM33) como en la cepa evaluada. La EOP se calculó como la relación entre el número de placas formadas por el bacteriófago en la cepa no hospedante y el número de placas formadas en su hospedante, utilizando la misma disolución de bacteriófago. Sólo las cepas para las que se observaron placas individualizadas se consideraron cepas susceptibles. Para la cepa 81009 WT y su mutante derivado rugoso, las pruebas se realizaron a 20°C para desactivar la expresión de la cápsula de tipo II (24).

Extracción de LPS

Los extractos de LPS se purificaron a partir de la misma cantidad de bacterias (1010 ufc) usando una extracción caliente con fenol-agua-éter dietílico (25) seguida de una diálisis extensa contra agua pirolizada estéril. El LPS de alta pureza se confirmó mediante la realización de electroforesis en gel de agarosa con tinción con bromuro de etidio (detección de ácidos nucleicos) y SDS-PAGE al 12% seguido de tinción con azul de Coomassie (detección de proteínas). Se migraron 10 pl de cada extracto de LPS en un SDS-PAGE al 10% seguido de tinción con plata para visualizar el patrón de antígeno O de LPS (SilverSNAP Stain Kit II, Pierce).

Ensayos de inhibición de placas con extractos de LPS

A partir de una disolución madre purificada de bacteriófagos en tampón TN (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5), se prepararon 3 disoluciones de 106, 105 y 104 ufp /ml en tampón TN. Cada una de estas disoluciones de tratamiento se utilizó para preparar tubos finales con bacteriófagos solos (100 pl de disolución de tratamiento 100 pl de agua pirolizada) y tubos con bacteriófagos LPS (100 pl 100 pl de extracto de LPS sin diluir). También se prepararon tubos adicionales que contenían bacteriófagos y cantidades decrecientes de LPS (se utilizó agua pirolizada para alcanzar un volumen final idéntico). Luego, se mancharon por triplicado 10 pl de cada tubo de bacteriófago final, con y sin LPS, en una placa de agar, previamente superpuesta por las bacterias para ensayo. Las placas se incubaron durante 4 horas a 37°C antes de numerar las unidades formadoras de placas en cada condición.

Caracterización del bacteriófago LM33_P1

El ensayo de adsorción y el crecimiento en un solo paso se realizaron usando LB (Bacto-Triptona Difco™ 10 g/l, Extracto de levadura Difco, Difco™ 5 g/l, NaCl 5 g/l), bajo agitación constante (100 rpm) a 37°C, como lo describen Hyman y Abedon (26), por triplicado. Se extrapoló una curva de correlación de los datos brutos mediante regresiones no lineales (GraphPad Prism 5.0, software GraphPad, California): se utilizó un modelo de dosis-respuesta para el experimento de crecimiento de un solo paso (Y = Inferior (Superior-Inferior)/(1 10A((LogCE50-X)*Pendiente Hill)) con Y = log (ufp/célula infectada) y X = tiempo) y un modelo exponencial con decaimiento de una fase para el experimento de adsorción (Y = (Y0 - Meseta)*exp (-K*X) Meseta con Y = fagos libres (%), X = tiempo). Los parámetros de crecimiento (eclipse y período latente, tamaño de ráfaga) se derivaron luego de estas regresiones. La constante de adsorción se calculó como -p/N, donde p es la pendiente de la línea recta obtenida después de una transformación logarítmica natural y N la concentración de bacterias al iniciar el ensayo de adsorción.

Cinética de lisis (con y sin extractos de LPS) y ensayos de agregación con anticuerpo O25

La cinética de lisis se realizó como se detalla en el SI. En síntesis, el crecimiento de LM33 con y sin LM33_P1 se siguió con el tiempo mediante el registro de la densidad óptica a 600 nm cada 15 minutos.

Los ensayos de agregación se realizaron utilizando anti-suero de E. coli O25 (Statens Serum Institut, Copenhague, Dinamarca) y observando bajo microscopio óptico como se detalla en el SI.

Secuenciación de la cepa LM33 y el bacteriófago LM33_P1

La secuenciación del bacteriófago LM33_P1 y la cepa LM33 se realizó utilizando la tecnología de secuenciación de Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA). Se extrajo ADN de LM33_P1 de una disolución de bacteriófago purificada, utilizando pretratamientos de DNasa y RNasa seguidos de una extracción con fenolcloroformo, modificado de Pickard (27). Se extrajo ADN genómico de LM33 se extrajo usando un kit de purificación de ADN de tejido MaxWell (Promega, Madison, WI). La anotación de genomas se realizó mediante la plataforma MicroScope para la cepa LM33 y con el servidor RAST para el bacteriófago LM33_P1 (28, 29) seguido de curación manual.

Modelos de infecciones experimentales murinas

Los animales se alojaron en instalaciones para animales según las regulaciones francesas y europeas sobre el cuidado y la protección de los animales de laboratorio. Los protocolos fueron aprobados por el personal veterinario del Institut Pasteur y las instalaciones para animales del INSERM, así como por el Comité Nacional de Ética que regula la experimentación animal. Se proporcionaron alimentos y bebidas a voluntad.

La neumonía se inició mediante la administración intranasal de 1x108 ufc de la cepa LM33 en ratones macho BALB/cJRj anestesiados, de ocho semanas de vida que pesaban 25 g (Janvier, Le Genest Saint Isle, Francia) como se describió previamente (30). Los ratones se trataron con el bacteriófago LM33_P1 cuatro horas después de la infección, o bien por vía intranasal (multiplicidad de la infección de 50, es decir, una relación de virus a bacterias igual a 50) o por vía intraperitoneal (MOI de 500). En consecuencia, los ratones control recibieron un volumen idéntico intranasal o intraperitoneal de PBS (disolución salina tamponada con fosfato). Los pulmones se extirparon 17 horas después de la infección de los animales sacrificados.

El modelo de septicemia, como se describió anteriormente, se utiliza esencialmente para estudiar la virulencia extraintestinal intrínseca de aislamientos de E. coli (7). Ratones hembra de 17 g OF1 de cuatro semanas de vida (Janvier, Le Genest Saint Isle, Francia) recibieron inyecciones subcutáneas en la nuca con 1 x 109 ufc de la cepa H1659 (ST131-O25b:H4) (6). Debido al alto inóculo utilizado, ensayamos una monodosis y una dosis doble de bacteriófagos: la monodosis (MOI 60) se administró por inyección intraperitoneal 2 horas después de la infección, mientras que la dosis doble consistió en una inyección (MOI 60) administrada 2 y 12 horas después de la infección. Los ratones control recibieron un volumen idéntico de PBS. Se extirparon los órganos diana de metástasis séptica (corazón-pulmón, bazo e hígado) de los animales que murieron entre 24 y 30 horas después de la infección.

El modelo de infección de las vías urinarias consiste en una infección retrógrada de los riñones que ocurre después de una inyección intrauretral de 5x107 ufc de la cepa LM33 en la vejiga, como se describió anteriormente (31). Veinticuatro horas después de la infección, se trataron, por vía intraperitoneal, ratones hembra de 17 g CBA/j de 8 semanas de vida (Charles River, Chatillon-sur-Chalaronne, Francia) con LM33_P1 (MOI de 200), mientras que los ratones control recibieron un volumen idéntico de PBS. Los riñones se extirparon 48 horas después de la infección.

En todos los casos, los órganos se homogeneizaron mecánicamente en PBS frío usando un disociador Octo de gentleMACS (Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) antes de ser diluidos en serie y esparcidos en placas de agar Drigalski que contenían el antibiótico apropiado para numerar la colonia. El recuento de bacteriófagos se realizó en el sobrenadante después de la centrifugación de homogeneizados según métodos de rutina.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 5.00 (GraphPad Software, La Jolla, CA). La distribución normal de todas las variables se verificó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y los resultados se expresaron luego como media ± DE. En caso de distribución no gaussiana, los resultados se expresan como mediana [percentil 25, 75]. Las pruebas estadísticas (prueba t de Student o prueba de Mann-Whitney) se eligieron en consecuencia.

Resultados:

El bacteriófago LM33_P1 se dirige a las cepas de E. coli O25b resistentes a los antibióticos. La cepa de E. coli LM33 (aislada de un paciente de la unidad de cuidados intensivos que desarrolló una neumonía asociada al ventilador) se utilizó para aislar el bacteriófago LM33_P1. La cepa LM33 exhibe un serotipo O25b:H4, un filogrupo B2 (subgrupo I) y un tipo de secuencia ST131, así como un fenotipo de resistencia a múltiples fármacos con una betalactamasa de espectro extendido, una resistencia al ácido nalidíxico, aminoglucósidos (kanamicina, tobramicina, gentamicina, netilmicina excepto amikacina donde se encuentra un fenotipo intermedio), sulfonamidas y cloranfenicol. La resistencia a los betalactámicos está respaldada por un plásmido (pLM33) que porta los genes blaTEM-1c (penicilinasa) y blaSHV-12 (beta-lactamasa de espectro extendido), así como por el cromosoma bacteriano que contiene el gen blaDHA-7que codifica una cefalosporinasa y también una copia de los genes blaSHV-12y blaTEM-1c (Tabla 1).

Determinamos el rango de hospedantes del bacteriófago LM33_P1 en un panel de 283 cepas de E. coli pertenecientes a varios tipos O (datos no mostrados). Ciento ochenta y tres (64%) de estas cepas no eran O25b, y ninguna de ellas estaba infectada por LM33_P1, incluidas doce cepas O25a y seis cepas ST131-O16. Entre las cien cepas O25b restantes (que abarcan 83 ST131,4 ST69, 10 ST95 y otras 3 ST), 64 (64%) fueron infectadas por LM33_P1 con una eficiencia mediana de formación de placas de 0,46 [0,09-1,27]. Cabe destacar que se encontró que LM33_P1 era más eficiente en ST asociadas con alta resistencia a los antibióticos (ST131 y ST69) donde el 70% de estas cepas se lisaron, mientras que era débilmente eficiente en ST asociada con baja resistencia a los antibióticos (ST95 y otras) donde solo 23% de estas cepas fueron susceptibles (datos no mostrados). Finalmente, no hallamos una correlación entre la susceptibilidad al bacteriófago LM33_P1 y el alelo fimH H30, que está fuertemente asociado con la resistencia a las fluoroquinolonas entre las cepas ST131 (32).

El bacteriófago LM33_P1 es un Podoviridae lejanamente relacionado con el bacteriófago T7. El genoma del bacteriófago LM33_P1 (38979 pb; contenido de GC del 50,8%; 49 ORF pronosticados) carece de ORF putativos con homologías con integrasa o recombinasa.

Un análisis BLAST de la secuencia genómica reveló que los cuatro bacteriófagos más estrechamente relacionados eran bacteriófagos de enterobacterias: tres colifagos llamados PE3-1, K1F (33), EcoDS1 (con 94% de identidad en > 88% de su longitud para todos ellos) y bacteriófagos Dev2 que infectan Cronobacter turicensis (con 83% de identidad en 85% de su longitud) (34). La alineación de estos bacteriófagos relacionados con LM33_P1 reveló una organización del genoma espacial similar y confirmó la alta homología entre ellos (datos no mostrados). Sorprendentemente, la extremidad 5 '(los primeros 650 nucleótidos) del gen de la fibra de la cola está muy conservada en cada genoma de bacteriófago, mientras que la parte restante es muy divergente. La región N-terminal correspondiente (IPR005604/PF03906, base de datos InterPro/Pfam) de esta proteína de la fibra de la cola está implicada en su conexión con el tubo de la cola (35), mientras que la parte C-terminal, implicada en el reconocimiento del hospedante, a menudo lleva a cabo actividades de hidrolasa, como la endosialidasa del bacteriófago K1F utilizado para la degradación de exopolisacáridos (33, 36). Las búsquedas BLAST en la parte C-terminal de la fibra de la cola del bacteriófago LM33_P1 revelaron homología con un dominio que pertenece a la superfamilia de pectina liasa (IPR011050). Predicción de estructuras tridimensionales usando la base de datos Phyre2 (37) confirmó su proximidad a la endopoligalacturonasa de Erwinia carotovora que pertenece a la superfamilia de la pectina liasa (100% aminoácido pronosticado con una confianza >90% para la estructura terciaria, índice de confianza para la proteína homóloga 94,1%, entrada del Banco de datos de proteínas: 1BHE).

El bacteriófago LM33_P1 es muy eficiente y rápido. in vitro. La adsorción del bacteriófago LM33_P1 en su hospedante es rápida con > 90% de la población vírica adherida a las células después de 3,5 minutos con una constante de adsorción de 1,2x10-8 ml/min. Los viriones recién producidos se detectan dentro de las bacterias tan solo 7 minutos después de la infección (período de eclipse), mientras que la lisis del hospedante ocurre en 9 minutos (período latente) con un tamaño de explosión de 317 (intervalo de confianza del 95%: 289-345) (datos no mostrados).

En medio líquido, cuando LM33_P1 se mezcló con su hospedante, el valor de absorbancia de las células LM33 comenzó a disminuir (signo de lisis) en 15 minutos (MOI de 1). Con muchos menos bacteriófagos (MOI de 10-6) la lisis todavía se produjo en 60 minutos. En medio sólido, LM33_P1 forma placas claras y grandes, cuyo diámetro aumenta rápidamente con el paso del tiempo con un halo visible alrededor de las áreas claras. Este halo sugiere la presencia de una enzima difusible que muy probablemente lleva una actividad despolimerasa (38).

El bacteriófago LM33_P1 se une específicamente al antígeno O de O25b LPS. El rango de hospedantes del bacteriófago LM33_P1 sugirió fuertemente que la cadena O de LPS podría estar implicada en su especificidad. Usando ensayos de competición de LPS, observamos que el LPS purificado de la cepa LM33 pudo inhibir parcialmente la interacción entre el bacteriófago LM33_P1 y la cepa LM33, así como otras cepas O25b (Tabla 2).

Primero, demostramos que el LPS purificado reducía el número de unidades formadoras de placa cuando se mezclaba con bacteriófagos antes de la aplicación sobre una capa bacteriana (reducción media de 1,0 ± 0,23 Log10 de 15 ensayos con cinco cepas O25b diferentes). Junto con la reducción del número de placas, observamos una reducción de los diámetros de las placas, lo que sugiere que las moléculas de LPS impedían que los bacteriófagos recién liberados infectaran a los hospedantes circundantes (Figura 1). Estas observaciones son específicas de la interacción del bacteriófago LM33_P1 con las cepas O25b ya que: i) el extracto de LPS O25b de la cepa LM33 no pudo afectar la interacción de otros bacteriófagos dirigidos a cepas no O25b y ii) el extracto de LPS de cepas no O25b (O25a, O6 y 017) no pudo alterar la interacción entre el bacteriófago LM33_ p 1 y la cepa LM33 (Tabla 2).

En segundo lugar, el extracto de LPS de la cepa O25b (LM33) también reducía la infectividad del bacteriófago LM33_P1 en medio líquido de una manera dependiente de la dosis (datos no mostrados), mientras que los extractos de LPS de las cepas O6 y O25a no tuvieron ningún efecto.

En tercer lugar, al utilizar un anticuerpo específico de tipo O para agregar cepas O25 para la serotipificación, encontramos que el bacteriófago LM33_P1 impedía la agregación de la cepa LM33 (datos no mostrados).

Cuarto, usando O25b 81009 de E. coli y su derivado áspero isogénico (cepa deficiente en LPS obtenida mediante la eliminación del gen que codifica la ligasa del antígeno O) (21) observamos que el bacteriófago LM33_P1 infecta la cepa 81009 de tipo salvaje mientras que la cepa deficiente en LPS es resistente. Por el contrario, confirmamos que el bacteriófago LM33_P1 no podía adsorberse en la cepa defectuosa de LPS.

La adsorción del bacteriófago LM33_P1 se ve obstaculizada por la producción de cápsulas. La producción de exopolisacáridos es un mecanismo de resistencia a bacteriófagos conocido y podría estar implicado en la no adsorción del bacteriófago LM33_P1 observado en cinco cepas resistentes a LM33_P1 elegidas al azar (81009 WT, JJ1886, S242, B-1, C-1). Dado que, en algunos casos (cápsula de tipo II), la síntesis de exopolisacáridos depende de la temperatura, investigamos la susceptibilidad LM33_P1 en todas las cepas resistentes a O25b (n = 36) a 20°C. Observamos que nueve de ellas (25%) se volvieron susceptibles a esta temperatura (datos no mostrados).

El bacteriófago LM33_P1 infecta eficazmente a su hospedante in vivo. Como el bacteriófago LM33_P1 exhibió impresionantes características in vitro, investigamos su actividad in vivo en tres modelos diferentes de infección animal relevantes para la epidemiología clínica de ST131: neumonía, septicemia e infección de las vías urinarias (Figuras 2­ 4). Dado que la cepa LM33 se aisló de un paciente con neumonía, primero intentamos establecer la neumonía en ratones. Usando un inóculo 50 veces mayor que el reportado previamente en dicho modelo (30) y a pesar de las claras lesiones pulmonares macroscópicas, la cepa LM33 no fue letal, lo que nos impidió usar la supervivencia como un indicador de la eficacia del bacteriófago. Por lo tanto, evaluamos la eficacia de LM33_P1 contando las bacterias de los homogeneizados de pulmón recolectados 17 horas después de la infección. Se trataron tres grupos de ratones 4 horas después de la infección con disolución de control (PBS), bacteriófagos intranasales (MOI 50) o intraperitoneales (MOI 500). Independientemente de la vía de administración, observamos una reducción logarítmicas de 3 de la carga bacteriana cuando los ratones recibieron tratamientos con bacteriófagos en comparación con el grupo control (animal tratado con PBS: 5,4 x 107 ufc/g, tratado con LM33_P1 por vía intranasal: 2,7x104 ufc/g, tratado con LM33_P1 por vía intraperitoneal: 3,3 x 104 ufc/g, p <0,01). Cabe destacar que el número de bacteriófagos en el tejido pulmonar fue similar entre los ratones tratados por vía intranasal e intraperitoneal a pesar de que estos últimos habían recibido una dosis 10 veces mayor.

Entonces, estudiamos la rapidez en los parámetros cinéticos in vitro del bacteriófago LM33_P1 en un modelo murino de septicemia previamente descrito (6, 7) utilizando la cepa H1659 ST131 -O25b:H4 (6) (la cepa LM33 no fue letal en este modelo), en donde LM33_P1 es tan eficiente como en la cepa LM33 (EOP = 1). Tras una inoculación subcutánea de 1x109 ufc, se observaron rápidamente metástasis sépticas en varios órganos (las primeras muertes ocurrieron en menos de 24 horas). Las administraciones intraperitoneales del bacteriófago LM33_P1 (MOI 60, dosis única en H2 después de la infección o dos dosis en H2 y H12 después de la infección) no fueron suficientes para prevenir la muerte de los animales. Sin embargo, en un subconjunto de animales que murieron dentro del mismo intervalo de tiempo (entre 24 y 30 horas), se analizó el contenido de bacterias y bacteriófagos: i) en homogeneizados de hígado, bazo y pulmón-corazón de los grupos tratados con bacteriófagos, el número de bacterias se redujo en comparación con el grupo control; ii) dos dosis parecieron ser más eficientes que una sola, alcanzando una reducción logarítmicas significativa de aproximadamente 1,4 (la mediana del recuento bacteriano disminuyó de 8,5x106 a 2,9x105 en corazónpulmones, 7,7x105 a 3,2x104 en el hígado y 3,5x105 a 1,4x104 ufc/g en el bazo); iii) los recuentos de bacteriófagos estuvieron en el mismo orden de magnitud en todos los órganos, pero fueron significativamente más altos cuando se administraron dos dosis (2,0x1010 frente a 4,0x109 ufp/g, p <0,01); iv) la cantidad de bacteriófagos fue de 3 a 6 Logs mayor que la cantidad de bacterias en cada ratón para todos los órganos. Todas estas observaciones revelaron que el bacteriófago LM33_P1 pudo infectar la cepa H1659 en cada órgano considerado.

Finalmente, como E. coli es un patógeno importante en las infecciones urinarias, evaluamos la eficacia del bacteriófago LM33_P1 en un modelo de infección urinaria murina. Veinticuatro horas después de la inyección intrauretral de 5,107 ufc de la cepa LM33, los ratones recibieron un único tratamiento con bacteriófagos por vía intraperitoneal (MOI de 200). Cuarenta y ocho horas de altura después de la infección, se observó una reducción logarítmica^ de 2 de la carga bacteriana en los riñones en el grupo tratado en comparación con el control (1,5x105 frente a 8,8x102 ufc/g, p <0,001).

En conjunto, estos datos demuestran firmemente la capacidad del bacteriófago LM33_P1 para infectar cepas O25b in vivo.

Análisis:

La resistencia a los antibióticos es un problema de salud pública en todo el mundo. En menos de 10 años, el complejo clonal de E. coli ST131-O25b:H4 resistente a múltiples fármacos se ha extendido por todo el planeta, estando ahora presente tanto en animales como en seres humanos (2). Desafortunadamente, el descubrimiento de nuevos antibióticos no resultó tan exitoso como se esperaba inicialmente, lo que llevó a una reevaluación de la terapia con fagos. Una de las principales ventajas de los bacteriófagos que se informa a menudo es su especificidad para infectar pocas cepas dentro de una especie, lo que tiene un impacto limitado en la microbiota del paciente. Junto con los anticuerpos monoclonales (se ha demostrado que los anticuerpos anti-O25b ejercen un efecto protector en el modelo de septicemia de ratón) (39), los bacteriófagos son las únicas herramientas antiinfecciosas que podrían alcanzar tal especificidad.

Usando un aislamiento clínico de ST131-O25b:H4 de E. coli (cepa LM33), aislamos un bacteriófago, LM33_P1, que resultó ser extremadamente específico. Pruebas exhaustivas en casi 300 cepas pertenecientes a varios serotipos revelaron que este bacteriófago infecta exclusivamente cepas O25b. Curiosamente, el antígeno O O25b está presente en el complejo clonal arquetípico ST131 pero también en ST69, otro clon de E. coli propagación resistente a antibióticos, el "grupo clonal A" (11,40). En una proyección terapéutica y basada en los linajes pandémicos de E. coli patogénica extraintestinal (41), observamos una mayor susceptibilidad entre estas dos ST (70%) en comparación con las ST de O25b menos resistentes a los antibióticos como ST95 y otros secundarios (23%).

Además, la mayoría de las cepas pertenecientes al complejo clonal ST131 exhibe un antígeno O de O25b mientras que una parte menor, menos resistente a los antibióticos, exhibe un serogrupo O16 (42). La especificidad del bacteriófago LM33_P1 se vinculó al antígeno O de O25b y no al tipo de secuencia (es decir, ninguna de las cepas no O25b ST131 fue susceptible al bacteriófago LM33_P1, mientras que todas las cepas O25b-ST69 ensayadas fueron susceptibles). Además, la susceptibilidad de las cepas ST131-O25b:H4 al bacteriófago LM33_P1 fue independiente del alelo fimH, un marcador de la evolución epidemiológica de este clon (32). Además, el bacteriófago LM33_P1 no pudo infectar las cepas O25a, a pesar de una estructura de antígeno O muy similar en la que las unidades repetidas de polisacáridos solo difieren en un monosacárido (fucosa frente a ramnosa), una fina discriminación que no es posible con los anticuerpos clásicos utilizados para la serotipificación hasta la reciente descripción de los anticuerpos monoclonales O25b (21).

Nuestras investigaciones llevaron a estimar que la cobertura global de hospedantes del bacteriófago LM33_P1 en cepas O25b es del 64%. Consideramos que esta cobertura es confiable, ya que primero evitamos el sesgo de muestreo mediante la selección de una colección grande (quizás una de las más grandes jamás probadas para dicho estudio) obtenidas de diferentes fuentes con muchos serotipos. En segundo lugar, evaluamos la susceptibilidad de la cepa de una manera rigurosa mediante la determinación de EOP que excluye los resultados atípicos y falsos positivos como la lisis externa (43, 44). Finalmente, el 90% de los valores de EOP estuvieron entre -1,5 y 1,5 unidades logarítmicas^, lo que indica que las cepas infectadas con muy baja eficiencia son poco frecuentes. Además de este rango de hospedantes especializados, encontramos que el bacteriófago LM33_P1 posee propiedades optimizadas para infectar a su hospedante. En comparación con los datos disponibles en la bibliografía, hallamos que es el bacteriófago tipo T7 más rápido jamás descrito, ya que lisa a su hospedante en 10 minutos, mientras que T7 tarda de 13 a 16 minutos (45, 46). Parte de este éxito se basa en su constante de absorción (1,2x10-8 ml/min) que se encontró 10 veces mayor que la mayoría de los bacteriófagos (47-50) y su tamaño de explosión que también se encuentra en la mitad superior de los valores generalmente observados (51).

Para prevenir la adsorción de fagos, las bacterias pueden enmascarar los receptores de fagos mediante la producción de exopolisacáridos extracelulares (cápsulas), que también pueden ayudar a las bacterias a escapar del reconocimiento de las células inmunitarias (52, 53). Descubrimos que el 25% de las cepas revirtieron su fenotipo hacia el bacteriófago LM33_P1 de resistente a susceptible, cuando se ensayaron a 20°C, una temperatura que se sabe que extingue la producción de cápsulas de tipo II (24). Por lo tanto, la cobertura del bacteriófago LM33_P1 aumentó al 80% entre todas las cepas ST131-O25b:H4 y al 73% entre todas las cepas O25b ensayadas. También se demostró previamente que los bacteriófagos pueden vencer este mecanismo de defensa utilizando fibras de la cola que poseen actividades de despolimerasa (54-57), y podemos asumir razonablemente que el aislamiento de variantes de LM33_P1 o diferentes bacteriófagos podría proporcionar tal solución para mejorar (por sinergia) la tasa de cobertura de las cepas O25b (56, 58, 59).

Con el objetivo de utilizar bacteriófagos para tratar infecciones bacterianas humanas, la traducción de la actividad in vitro (formar placas) a la eficacia in vivo (curar una enfermedad) no está garantizada, a pesar de la alta tasa de éxito (60). Nuestra investigación del potencial curativo in vivo del bacteriófago LM33_P1 reveló de hecho que, en los tres modelos ensayados, este bacteriófago pudo infectar bacterias diana en varios compartimentos corporales y a través de diferentes vías de administración. Estos tratamientos no se optimizaron para alcanzar la máxima eficacia, ya que sería necesario evaluar muchos parámetros, lo que requiere estudios dedicados fuera del enfoque de este trabajo. De hecho, la farmacocinética de los bacteriófagos es muy compleja, debido a sus propiedades intrínsecas (autoexpansión inducida por bacterias, difusión, adsorción, umbral para cebar una expansión vírica, etc.) (61-63) y no se puede comparar con la farmacocinética tradicional de los antibióticos. Además, en tales modelos experimentales, la dosis curativa aplicada siempre está relacionada con la dosis inicial conocida de bacterias patógenas, que es, por lo tanto, una estimación bruta de lo que se necesita (la cantidad de bacterias podría ser muy diferente entre el momento de la inoculación y el tratamiento debido al crecimiento bacteriano). En consecuencia, nuestros datos no deben sobretraducirse al ámbito clínico. Sin embargo, sigue siendo indiscutible que los bacteriófagos, incluido LM33_P1, como se muestra en este estudio, pueden reducir rápidamente la carga de su hospedante dentro de un entorno complejo que incluye el intestino de los mamíferos (64). Nuestros datos también respaldan una mayor eficacia cuando los bacteriófagos se aplican localmente (instilación intranasal para tratar la neumonía) que cuando se usan a través de una administración sistémica. En un planteamiento terapéutico, tales bacteriófagos podrían usarse como un agente antimicrobiano selectivo para controlar el transporte pasivo de cepas ST131-O25b:H4 en el intestino humano con el fin de reducir su diseminación, particularmente en entornos asociados con la atención médica. En efecto, las cepas de E. coli que residen en el tubo digestivo constituyen un reservorio conocido de infecciones urinarias, pero probablemente también de neumonía asociada al ventilador (14). Finalmente, como nunca se ha demostrado una correlación positiva entre la resistencia a antibióticos y bacteriófagos, la terapia con fagos sigue siendo un recurso valioso para controlar tales patógenos resistentes a múltiples fármacos. Ahora se requieren ensayos clínicos y, de hecho, se ven alentados por la posición reciente adoptada por la Agencia Europea de Medicina (European Medicine Agency) (65), con el fin de definir mejor en qué medida las promesas de los bacteriófagos, como la que se describe aquí, pueden traducirse en un tratamiento eficaz.

Además del planteamiento clásico de la terapia con fagos, el bacteriófago LM33_P1 o las proteínas de este ofrecen oportunidades para desarrollar varias herramientas. La fibra de la cola podría usarse para inactivar específicamente cepas O25b de E. coli que usan bacteriocinas, como se mostró anteriormente para las cepas 0104 de E. coli implicadas en la colitis enterohemorrágica (66). Se podrían prever otros planteamientos en los que los bacteriófagos se reprograman y podrían suprimir los genes de resistencia a los antibióticos utilizando el sistema CRISPR-Cas (67) o expresar enzimas beneficiosas bien elegidas para combatir la biopelícula (68). Ahora se requieren investigaciones más profundas sobre el ciclo infeccioso de este bacteriófago para determinar qué mecanismos moleculares son responsables de su componente de destrucción rápida. El bacteriófago LM33_P1 también podría utilizarse a partir de ahora como plataforma de partida para desarrollar bacteriófagos sintéticos altamente virulentos con diversas especificidades de hospedante (69).

Tabla 1. Principales características genotípicas de la cepa LM33 y el plásmido pLM33.

Tabla 2: Datos obtenidos durante los ensayos de inhibición de la prueba de placa con diferentes extractos de LPS y parejas de virus-bacterias elegidas al azar. (+)/(-): presencia/ausencia de un efecto inhibidor del extracto de LPS, -:

no ensayado.

Interacción ensayada Efecto inhibidor de varios extractos de LPS O25b O17 O25a Bacteriófago Bacterias (serotipo) (LM33) O6 (536) (LM02) (ECOR51) LM33_P1 LM33 (O25b) (+) (-) (-) (-)

" " LM34 (O25b) (+) (-) (-) (-) " " LM36 (O25b) (+) (-) (-) (-) " " AVC02 (O25b) (+) (-) (-) (-) ^{" "} AVC03 (O25b) (+) (-) (-) (-536_P1a 536 (O6) (-) (-) - -423_P1b H17 (016) (-) - - -416_P1b LM49 (O2b) (-) - - -LF82_P2c LF82 (O83) (-) - - -LF82_P2c RY09 (O4) (-) - - -adescrito en (30), bacteriófagos aislados usando cepas de neumonía asociada al ventilador (NAV) (423, 416) y activos en otras cepas NAV (H17, LM49), bacteriófago aislado mediante una cepa de E. coli invasiva adherente (LF82) y activo en la cepa n Av RY09.

Referencias:

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, que está condensado a al menos un polipéptido heterólogo.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, que está condensado a un dominio de inmunoglobulina tal como una porción Fc.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, que está condensado a un polipéptido fluorescente o a una enzima.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de la reivindicación 1.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, que está incluida en un vector adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago o un vector vírico.

7. El polipéptido de la reivindicación 1, que está conjugado con un marcador detectable.

8. El polipéptido de la reivindicación 7, en donde el marcador es un marcador fluorescente.

9. El polipéptido de la reivindicación 1, que está biotinilado.

10. El polipéptido de la reivindicación 1, que está conjugado con una partícula de látex, una partícula coloidal de metal o un nanotubo de carbono.

11. Un método para detectar la presencia del clon O25b-ST131 de E. co lien una muestra, que comprende i) poner en contacto la muestra con el polipéptido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que es capaz de formar complejos con las moléculas de lipopolisacárido (LPS) del clon O25b-ST131 de E. coli y ii) detectar la presencia de uno o más de dichos complejos, en donde la presencia de al menos un complejo indica la presencia del clon en la muestra.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la muestra es orina, sangre, suero, productos hemoderivados, plasma, saliva, fluido corporal, agua, medio de cultivo, medio de cultivo diluido, producto de petróleo, combustible, líquido sometido a fermentación o una bebida.

13. El método de la reivindicación 11, en donde la muestra es tejido humano o animal, heces, esputo, expectorado, un producto agrícola, alimento, sólidos recogidos por centrifugación o filtración, tierra o sedimento.

14. Un dispositivo de flujo lateral que comprende el polipéptido de la reivindicación 1.