ES2866051T3 - Métodos para obtener fosfolípidos y composiciones de los mismos - Google Patents

Abstract

Un método para proporcionar una composición con altas cantidades de fosfolípidos omega-3 que comprende: poner en contacto huevas de pescado sin secar con un disolvente polar y mezclar las huevas y el disolvente para formar una primera mezcla; filtrar la primera mezcla para retirar las partículas sólidas con un tamaño superior a 1 μm, para proporcionar una solución del disolvente polar que comprende lípidos extraídos; someter la solución a filtración por membrana en donde la membrana tiene un MWCO de 300 Daltons, para proporcionar un retenido que comprende más de un 10 % en peso seco de lípidos; en donde al menos un 40 % de los restos de ácido graso totales del retenido son ácidos grasos omega-3, los restos de ácido graso del retenido comprenden ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA), y la relación entre DHA y EPA es al menos 2:1; en donde el retenido comprende menos de un 2 % en peso de contenido de ceniza, basado en peso seco.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para obtener fosfolípidos y composiciones de los mismos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El ácido graso omega-3, ácido alfa linolénico (ALA), es un ácido graso esencial porque es necesario para la salud humana y no se produce en el cuerpo humano. Los dos ácidos grasos omega-3 poliinsaturados principales que estimulan la salud, el ácido eicosapentaenoico (EPA) y el ácido docosahexaenoico (DHA) pueden sintetizarse en el organismo a partir del ALA, pero se consideran condicionalmente esenciales porque el ALA se convierte en EPA y DHA de manera ineficaz, y el ALA a menudo se presenta en la dieta con niveles bajos. EPA y DHA se encuentran naturalmente en ciertos pescados grasos de agua fría. La dieta moderna es generalmente deficiente en ácidos grasos esenciales omega-3 y se ha sobrecargado con ácidos grasos omega-6 proinflamatorios, especialmente ácido araquidónico. Se cree que este gran desequilibrio de ácidos grasos omega-6 con respecto a omega-3 en la dieta moderna conduce a un estado inflamatorio general que contribuye a varias enfermedades.

En la dieta pueden obtenerse cantidades adecuadas de ácidos grasos omega 3, incluyendo EPA y DHA, a partir de pescados grasos de agua fría tales como arenque, salmón, atún y caballa. Sin embargo, estas especies de pescado pueden contener altos niveles de mercurio, bifenilos policlorados (PCB), dioxinas u otros contaminantes. Por lo tanto, lograr una cantidad óptima y coherente de ácidos grasos omega-3 mediante la ingesta de pescado solo plantea una serie de problemas de seguridad. Además, también EPA y DHA pueden obtenerse como extractos (éster fosfolipídico) de las huevas de pescados grasos de agua fría. Sin embargo, los métodos para obtener cantidades suficientes de fosfolípidos que incluyen EPA y DHA en formas suficientemente estables son a menudo caros, laboriosos y tienen una variedad de otras limitaciones.

La extracción lipídica de tejido animal usando disolventes orgánicos se realiza comúnmente poniendo en contacto el tejido seco y molido con un disolvente orgánico capaz de disolver los lípidos deseados, seguido de la evaporación del disolvente de los lípidos calentando a presión reducida para producir el extracto lipídico prácticamente exento de disolvente. Este proceso se ha usado a escala industrial para la fabricación de productos tales como lípidos polares (por ejemplo, fosfolípidos) a partir de harina de pescado y harina de krill. Desafortunadamente, estas prácticas pueden influir negativamente en la calidad de los productos resultantes.

Por ejemplo, las técnicas habituales de secado tisular tensan el material y sus componentes biológicos durante la aplicación del calor necesario para la retirada eficaz del agua. El calor añadido durante el secado del tejido animal acelera la oxidación y descomposición de los componentes de ácido graso omega-3 en productos de degradación. Estos productos de degradación empeoran el sabor y el olor del producto final (es decir, el calentamiento aumenta la rancidez). El proceso de secado también puede provocar caramelización e iniciar procesos de polimerización en tejidos ricos en glicolípidos. Además, el secado a altas temperaturas puede provocar un sabor y olor a "quemado" en el tejido seco, así como en el producto extraído. Los extractos lipídicos de materiales secos también tendrán generalmente un color bastante oscuro debido a la formación de componentes caramelizados y polimerizados durante el proceso de secado.

Los fosfolípidos en el tejido animal están rodeados naturalmente por diversas cantidades de agua. Como tales, son más difíciles de secar que los lípidos neutros (grasas y aceites) porque los lípidos neutros pueden separarse más fácilmente de las fases de extracción acuosas en comparación con los fosfolípidos polares. Por estas razones, la caracterización de los productos fosfolipídicos se describe comúnmente tanto por la actividad en agua como por el contenido absoluto de agua (por ejemplo, medido por el método de Karl-Fisher). La misma terminología también se usa para material de tejido animal con contenido limitado de agua, por ejemplo, harina de pescado.

El secado de los tejidos animales a niveles muy bajos de agua puede provocar la formación de nuevas interacciones y la unión entre lípidos polares y otros componentes de la matriz tisular, en particular con diversas especies proteicas. Estas interacciones y la menor disponibilidad resultante de fosfolípidos son una razón por la que hay necesidad de procesos de extracción más mejorados en términos de temperatura, tiempo y/o rendimiento de lípidos durante la extracción. El proceso de secado también requiere mucho tiempo y mano de obra, lo que aumenta el coste del proceso. Estos inconvenientes se evitan empleando el proceso descrito en el presente documento.

La evaporación de disolventes del material lipídico por calor, generalmente a presión reducida, también concentra cualquier componente de volatilidad limitada junto con los materiales lipídicos. Estos componentes incluyen la mayoría de los contaminantes ambientales que ya están presentes en el tejido animal, tales como dioxinas, furanos, bifenilos policlorados (PCB), difeniléteres polibromados (PBDE), hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH) y pesticidas. Estos contaminantes son generalmente solubles en grasa y generalmente se extraen del tejido animal junto con los lípidos. Por lo tanto, los niveles de contaminantes en la fracción lipídica pueden multiplicarse por diez o más a partir del material de partida húmedo y, en general, tienen que reducirse mediante un procesamiento adicional del material lipídico extraído. La evaporación concentrará aún más otros componentes de baja volatilidad en el tejido, incluyendo metales, sales y minerales, pudiendo ser necesario reducir muchos de los cuales mediante un procesamiento adicional. Por lo tanto, la evaporación también concentrará cualquier impureza en el disolvente con un punto de ebullición más alto que el propio disolvente. En los procesos de extracción que requieren una gran cantidad de disolvente (por ejemplo, etanol) combinado con una cantidad limitada de extracto, tales impurezas de baja volatilidad del disolvente pueden concentrarse generalmente 50 veces o más.

Por consiguiente, hay una necesidad de procesos eficaces para obtener fosfolípidos omega-3 con alta estabilidad, buenas propiedades de digestión, bajas preocupaciones de seguridad y ambientales, y sin "olores a pescado". Tales fosfolípidos podrían usarse ventajosamente para su incorporación en suplementos dietéticos, suplementos nutricionales y productos alimenticios.

El documento US 2009/028989 se publicó el 29 de enero de 2009 y desvela una composición fosfolipídica obtenible mediante un proceso que comprende poner en contacto una harina de pescado con un disolvente orgánico para producir un líquido que contiene lípidos y someter dicho líquido a microfiltración seguido opcionalmente por separación del disolvente. El documento JP2001/072693 se publicó el 21 de marzo de 2001 y desvela procesos para producir lecitina de yema de huevo purificada que comprenden ultrafiltración de soluciones micelares de lecitina y soluciones no micelares de lecitina.

El documento WO 00/78903 se publicó el 28 de diciembre de 2000 y desvela una extracción ligera de lípidos con un disolvente orgánico a partir de material biológico, mediante troceado del material biológico en presencia de un ácido con posterior adición del disolvente o troceado en presencia tanto del ácido como del disolvente tras lo que la fase líquida se separa y los lípidos se recuperan de la misma.

El documento US 2011/223246 se publicó el 15 de septiembre de 2011 y desvela medicamentos y composiciones terapéuticas que contienen fosfolípidos que tienen ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico unido covalentemente a los mismos y al menos un ácido graso poliinsaturado omega-3, o al menos un derivado de ácido graso poliinsaturado omega-3 farmacéuticamente aceptable o mezclas de los mismos.

Tanaka et al. J. Oleo. Sci., Vol. 53, N.° 9, 417-424 (2004) desvela la extracción de fosfolípidos de hueva de salmón con dióxido de carbono supercrítico y un agente de arrastre.

El documento US 6.217.926 se publicó el 17 de abril de 2001 y desvela un proceso de extracción acuosa para retirar selectivamente los fosfolípidos de yemas de huevo y para separar la mayoría de las proteínas del material de yema de huevo usando fuerza iónica, pH y fuerzas centrífugas gravitacionales.

JS Sim Egg Uses and Processing Technologies: New Developments, Capítulo 11, páginas 128-138 se publicó el 1 de enero de 2004 y desvela un proceso para separar lípidos de yema de huevo usando un sistema disolvente etanólico acuoso.

El documento US 2003/209493 se publicó el 13 de noviembre de 2003 y desvela un proceso para refinar y desgomar aceites comestibles mediante ultrafiltración que produce una fracción de permeado con contenido reducido de fosfátidos y retenido con aumento del contenido de fosfátidos.

SUMARIO

De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para proporcionar una composición fosfolipídica de acuerdo con la reivindicación 1.

De acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir un extracto fosfolipídico con bajo contenido de PCB, PCDD, PCDF y PAH de acuerdo con la reivindicación 10.

De acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para proporcionar una composición fosfolipídica de acuerdo con la reivindicación 12.

El ácido docosahexaenoico (DHA) tiene funciones estructurales importantes y funciones antiinflamatorias únicas en el organismo. La mayoría de las fuentes de ácidos grasos omega-3 son más ricas en EPA que en DHA, por lo que se necesitan nuevas fuentes de ácidos grasos ricos en DHA. Los fosfolípidos también son importantes para la nutrición animal y pueden usarse para proporcionar estos ácidos grasos fundamentales. La invención descrita en el presente documento proporciona métodos para proporcionar composiciones fosfolipídicas de alto contenido en DHA y otras composiciones útiles.

Por lo tanto, la invención se refiere a métodos para obtener composiciones lipídicas sólidas y fluidas que comprenden un contenido proporcionalmente alto de DHA. Las composiciones se obtienen de fuentes que no son mariscos ni crustáceos, tales como huevas de pescado. Las composiciones son útiles como composiciones terapéuticas, aditivos alimentarios y similares. También pueden combinarse con aceites vehículo y/u otros aditivos para proporcionar más aditivos, productos y composiciones terapéuticas nutricionales útiles.

La invención proporciona procesos para extraer composiciones lipídicas de huevas de pescado y yemas de huevo aviar, para proporcionar un concentrado fosfolipídico (PL) o aceite fosfolipídico. Cuando la extracción es de huevas de pescado, la composición resultante tiene altas cantidades de fosfolípidos omega-3. El proceso incluye poner en contacto huevas de pescado o yemas de huevo aviar con un disolvente polar; extraer una fracción lipídica de la hueva de pescado o las yemas de huevo aviar; y retirar el disolvente de la fracción lipídica, para proporcionar una composición lipídica sólida, semisólida o muy viscosa, principalmente polar que comprende fosfolípidos, particularmente fosfolípidos omega-3 en el caso de huevas de pescado. Para las huevas de pescado, al menos un 40 %, o al menos un 50 %, de los ácidos grasos totales pueden ser ácidos grasos omega-3 (con respecto a los fosfolípidos de la composición o con respecto a la composición total). Como se describe en el presente documento, al menos aproximadamente un 30 % de los ácidos grasos totales pueden ser ácidos grasos omega-3.

Se ha encontrado que el proceso descrito en el presente documento satisface los desafíos de calidad y proceso descritos anteriormente. El proceso puede incluir la extracción de tejido sin secar y posterior filtración por membrana para separar los disolventes de la fracción lipídica. Al poner en contacto el tejido sin secar directamente con un disolvente, se evita el estrés y la reducción de la calidad del material de partida provocados por un proceso de secado. Debido a las cantidades de disolvente relativamente grandes que se usan generalmente para las extracciones, en comparación con la cantidad de tejido animal, el aumento de la polaridad del disolvente debido a la introducción de agua del tejido no superará el límite que permite una extracción eficaz de los lípidos polares del tejido. El tejido es hueva de pescado, incluyendo hueva de pescado madura, y especialmente hueva de pescado inmadura o la yema de huevos aviares.

Una segunda extracción del mismo tejido con disolvente recién preparado puede proporcionar productos adicionales, en forma de lípidos en general, y lípidos neutros en particular. El número de extracciones del mismo tejido y la cantidad de disolvente usado para cada ciclo de extracción pueden adaptarse al propósito de la extracción. Para la mayoría de los propósitos pueden realizarse de una a cuatro extracciones realizadas adecuadamente. Los extractos pueden combinarse opcionalmente para producir el extracto lipídico completo del tejido o mantenerse separados para producir fracciones con diversas composiciones lipídicas, por ejemplo, en términos de contenido de lípidos polares.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para proporcionar una composición con altas cantidades de fosfolípidos omega-3. Los métodos incluyen poner en contacto huevas de pescado sin secar, con un disolvente polar y mezclar la hueva y disolvente para formar una primera mezcla. Como se describe en el presente documento, la hueva de pescado puede ser hueva de pescado secada parcialmente. La mezcla puede ser una suspensión, una emulsión, o una combinación de las mismas, y puede incluir proteínas tanto disueltas como suspendidas y otros componentes. El método incluye filtrar la primera mezcla para retirar las partículas sólidas con un tamaño superior a 1 |jm, para proporcionar una solución del disolvente polar que comprende lípidos extraídos. Como se describe en el presente documento, la filtración puede realizarse para filtrar una diversidad de tamaños de partícula incluyendo partículas con un tamaño superior a aproximadamente 0,1 jm , tamaño superior a aproximadamente 0,5 jm . En una realización, la filtración puede realizarse para filtrar tamaños de partícula incluyendo partículas con un tamaño superior a aproximadamente 2 jm , tamaño superior a aproximadamente 10 jm , o tamaño superior a aproximadamente 20 jm . A continuación el filtrado resultante se somete a filtración por membrana. Como se describe en el presente documento, la membrana tiene un MWCO de aproximadamente 200 Daltons o aproximadamente 250 Daltons. En este aspecto de la presente invención, la membrana tiene un MWCO de 300 Daltons. La filtración por membrana proporciona un retenido que comprende más de un 10 % en peso seco de lípidos. Como se describe en el presente documento, el retenido comprende más de un 5 % en peso seco de lípidos. El retenido puede contener menos de aproximadamente un 10 % del disolvente polar inicial.

El retenido comprende fosfolípidos en donde al menos un 40 % de los restos de ácido graso totales son ácidos grasos omega-3, en donde los restos de ácido graso del retenido comprenden ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA), y la relación entre DHA y EPA es al menos aproximadamente 2:1. El retenido comprende menos de un 2 % en peso de contenido de ceniza (por ejemplo, sal), basado en peso seco. El retenido puede incluir uno o más de (a) menos de aproximadamente un 2 % en peso de ácidos grasos libres, (b) menos de aproximadamente un 5 % en peso de colesterol libre, (c) menos de un 2 % en peso de aminoácidos, basado en peso seco.

El retenido puede someterse a secado a presión reducida para proporcionar un sólido. En algunas realizaciones, la hueva de pescado es hueva de pescado inmadura, por ejemplo, hueva de arenque inmadura, hueva de salmón inmadura, hueva de caballa inmadura, hueva de sábalo inmadura, o una combinación de las mismas. Como se describe en el presente documento, los huevos son huevos de gallina, aunque en este caso los productos resultantes no contienen altas cantidades de fosfolípidos omega-3.

El retenido puede incluir de aproximadamente un 50 % en peso a aproximadamente un 95 % en peso de fosfolípidos. Aproximadamente un 30-70 % en peso de los restos de ácido graso totales en los fosfolípidos pueden ser ácidos grasos omega-3, basado en peso seco. El retenido puede incluir al menos aproximadamente un 50 % en peso de fosfatidilcolina, con respecto al peso total de la composición. En algunas realizaciones, el retenido se caracteriza por un color amarillo brillante.

En una realización, la hueva de pescado es una hueva de pescado no cerosa en donde el contenido de cera de la hueva es inferior a aproximadamente un 50 % en peso, inferior a aproximadamente un 40 % en peso, inferior a aproximadamente un 30 % en peso, inferior a aproximadamente un 20 % en peso, inferior a aproximadamente un 15 % en peso, inferior a aproximadamente un 10 % en peso, inferior a aproximadamente un 7,5 % en peso, o inferior a aproximadamente un 5 % en peso, generalmente aproximadamente un 5-15 % en peso.

En algunas realizaciones, después de filtración o nanofiltración, el retenido comprende más de aproximadamente un 15 % en peso seco de lípidos, más de aproximadamente un 20 % en peso seco de lípidos, más de aproximadamente un 25 % en peso seco de lípidos, más de aproximadamente un 30 % en peso seco de lípidos, más de aproximadamente un 40 % en peso seco de lípidos, o más de aproximadamente un 50 % en peso seco de lípidos.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir un extracto fosfolipídico con bajo contenido de PCB, PCDD, PCDF y PAH (por ejemplo, menos de la mitad del contenido en el material de partida) que comprende: poner en contacto huevas de pescado marino ricas en fosfolípidos que tienen un contenido de cera de un 5 % en peso o menos, con un disolvente polar y mezclar la hueva y disolvente para formar una primera mezcla; filtrar la primera mezcla para retirar las partículas sólidas con un tamaño superior a 1 pm, para proporcionar una solución del disolvente polar que comprende lípidos y fosfolípidos. Como se describe en el presente documento, la solución se pasa a través de una membrana de nanofiltración que tiene un MWCO de aproximadamente 700 Daltons o aproximadamente 400 Daltons En este aspecto de la presente invención, la solución se pasa a través de una membrana que tiene un MWCO de 300 Daltons. La membrana puede tener un MWCO de aproximadamente 250 Daltons, o aproximadamente 200 Daltons (o un MWCO adecuado descrito en cualquier parte en el presente documento). El extracto también puede tener niveles significativamente reducidos de plomo, bromuro, potasio y sodio, que pueden reducirse a menos de un 3 %, 3 %, 10 %, y un 10 %, respectivamente, en la composición final, como un porcentaje del contenido inicial. Se obtuvieron reducciones de mercurio y cadmio similares (reducciones de al menos cinco veces y/o hasta diez veces).

Cuando un extracto de hueva de pescado se somete a nanofiltración, la filtración proporciona un retenido que comprende menos de un 10 % del disolvente polar inicial. El retenido puede incluir más de un 10 % en peso de fosfolípidos. Al menos un 40 % de los restos de ácido graso totales del retenido son ácidos grasos omega-3 y los restos de ácido graso del retenido comprenden ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA), y la relación entre DHA y EPA es al menos 2:1. El retenido comprende menos de un 2 % en peso de contenido de ceniza. El retenido puede incluir una o más de las siguientes propiedades: (a) menos de aproximadamente un 3 % en peso de ácidos grasos libres, (b) menos de un 5 % en peso de colesterol, (c) menos de un 2 % en peso de aminoácidos, (d) menos de 1 pg de WHO-TEQ/g de dioxinas y furanos, (e) menos de 2 pg WHO-TEQ/g de PCB similares a dioxina, (f) menos de 50 ng/g de PCB total (209 congéneres), y (g) menos de 1 ng/g de benzo(a)pireno. En una realización específica, el retenido comprende un contenido de ceniza inferior a aproximadamente un 1 % en peso o menos (por ejemplo, cloruro sódico y otras sales). Como se describe en el presente documento, el retenido comprende menos de un 10 % de iones de plomo, En una realización, el retenido comprende menos de un 5 % de iones de plomo, o menos de un 3 % de iones de plomo, en comparación con la concentración inicial con respecto a la cantidad de fosfolípidos.

Como se discute el presente documento, los procesos de extracción y filtración también pueden aplicarse a huevos aviares, tales como yemas de huevo de gallina. Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para proporcionar una composición fosfolipídica que comprende poner en contacto yemas de huevo aviar con un disolvente polar y mezclar las yemas de huevo y disolvente para formar una primera mezcla; filtrar la primera mezcla para retirar las partículas sólidas con un tamaño superior a 1 pm, para proporcionar una solución del disolvente polar que comprende lípidos extraídos; someter la solución a filtración por membrana en donde la membrana tiene un MWCO de 300 Daltons, para proporcionar un retenido que comprende más de un 10 % en peso seco de lípidos; en donde el retenido comprende de un 20 % en peso a un 50 % en peso de fosfolípidos y en donde el retenido comprende menos de un 2 % en peso de contenido de ceniza, basado en peso seco. La yema de huevo aviar puede ser una yema de huevo de gallina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los siguientes dibujos forman parte de la memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertas realizaciones o diversos aspectos de la invención. En algunos casos, las realizaciones de la invención pueden entenderse mejor haciendo referencia a los dibujos adjuntos en combinación con la descripción detallada presentada en el presente documento. La descripción y los dibujos adjuntos pueden resaltar un cierto ejemplo específico o un cierto aspecto de la invención. Sin embargo, un experto en la materia comprenderá que pueden usarse partes del ejemplo o aspecto en combinación con otros ejemplos o aspectos de la invención.

Figura 1. Ejemplos de estructuras fosfolipídicas, de acuerdo con diversas realizaciones. En diversas realizaciones, uno o el otro resto de cadena de ácido graso y su carbonilo asociado pueden estar ausentes para proporcionar grupos hidroxilo (es decir, lisofosfolípidos). Los restos de la cadena de ácidos grasos pueden ser, por ejemplo, EPA, DHA o un grupo enumerado en la Tabla 2-5.

Figura 2. Un ejemplo de un proceso para la producción de un concentrado fosfolipídico (PLC) y proteína de hueva de pescado aislada, de acuerdo con una realización. El proceso puede realizarse de manera similar con huevos aviares, tales como huevos de gallina, aunque con menor contenido de fosfolípidos omega-3.

Figura 3. Una imagen de un concentrado fosfolipídico de huevas húmedas congeladas preparado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento (izquierda), y un concentrado preparado usando condiciones de extracción estándar a partir de huevas secas (derecha).

DEFINICIONES

Como se usa en el presente documento, los términos enumerados tienen los siguientes significados. T odos los demás términos y expresiones usados en la presente memoria descriptiva tienen sus significados habituales, como podría entender un experto en la materia. Tales significados habituales pueden obtenerse por referencia a diccionarios técnicos, tales como Hawley's Condensed Chemical Dictionary Edición 14, de R.J. Lewis, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 2001.

En la memoria descriptiva las referencias a "una realización", etc., indican que la realización descrita puede incluir un aspecto, elemento, estructura, resto o característica particular, pero no todas las realizaciones incluyen necesariamente ese aspecto, elemento, estructura, resto o característica. Además, tales expresiones pueden referirse, aunque no necesariamente, a la misma realización a la que se hace referencia en otras partes de la memoria descriptiva. Además, cuando un aspecto, elemento, estructura, resto o característica particular se describe en relación a una realización, está dentro del conocimiento de un experto en la materia influir o conectar tal aspecto, elemento, estructura, resto o característica con otras realizaciones, descritas explícitamente o no.

Las formas en singular "un", "uno" y "el" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un compuesto" incluye una pluralidad de tales compuestos, de modo que un compuesto X incluye una pluralidad de compuestos X. Además se observa que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta afirmación pretende servir como base antecedente para usar terminología exclusiva, tal como "únicamente", "solo" y similares, en relación con la mención de elementos de reivindicación o uso de una limitación "negativa".

El término "y/o" significa uno cualquiera de los elementos, cualquier combinación de los elementos o todos los elementos a los que se asocia este término. La expresión "uno o más" la entiende fácilmente un experto en la materia, particularmente cuando se lee en el contexto de su uso. Por ejemplo, uno o más componentes de una composición se refiere a uno, dos, tres, cuatro o cinco componentes, o más de cinco componentes, cuando se describen más componentes.

El término "aproximadamente" puede referirse a una variación de ±5 %, ±10 %, ±20 %, o ±25 % del valor especificado. Por ejemplo, en algunas realizaciones "aproximadamente un 50" por ciento puede tener una variación de un 45 a un 55 por ciento. Para intervalos de números enteros, el término "aproximadamente" puede incluir uno o dos números enteros mayores que y/o menores que un número entero mencionado en cada extremo del intervalo. A menos que se indique de otro modo en el presente documento, el término "aproximadamente" pretende incluir valores, por ejemplo, porcentajes en peso, próximos al intervalo mencionado que son equivalentes en términos de la funcionalidad del ingrediente individual, la composición o la realización.

Como entenderá el experto en la materia, todos los números, incluyendo los que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción, etc., son aproximaciones y se entiende que están opcionalmente modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Estos valores pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que pretenden obtener los expertos en la materia utilizando las enseñanzas de las descripciones del presente documento. También se entiende que tales valores contienen inherentemente variabilidad resultante necesariamente de las desviaciones estándar encontradas en sus respectivas mediciones de ensayo.

Como entenderá un experto en la materia, para todos y cada uno de los propósitos, particularmente en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos enumerados en el presente documento también abarcan todos y cada uno de los posibles subintervalos y combinaciones de subintervalos de los mismos, así como los valores individuales que componen el intervalo, particularmente valores enteros. Un intervalo mencionado (por ejemplo, porcentajes en peso o grupos de carbono) incluye cada valor específico, entero, decimal o identidad dentro del intervalo. Puede reconocerse fácilmente que cualquier intervalo enumerado describe suficientemente y permite que el mismo intervalo se divida en al menos mitades, tercios, cuartos, quintos o décimos iguales. Como ejemplo no limitante, cada intervalo discutido en el presente documento puede dividirse fácilmente en un tercio inferior, tercio medio y tercio superior, etc. Como también entenderá un experto en la materia, todas las expresiones tales como "hasta", "al menos", "superior a", "inferior a", "más que", "o más", y similares, incluyen el número mencionado y tales términos se refieren a intervalos que pueden dividirse posteriormente en subintervalos como se discutió anteriormente. De la misma manera, todas las relaciones enumeradas en el presente documento también incluyen todas las subrelaciones que entran dentro de la relación más amplia. Por consiguiente, los valores específicos citados para radicales, sustituyentes e intervalos, son solo para ilustración; no excluyen otros valores definidos u otros valores dentro de intervalos definidos para radicales y sustituyentes.

Un experto en la materia también reconocerá fácilmente que cuando los miembros se agrupan de una manera común, tal como en un grupo Markush, la invención incluye no solo el grupo completo enumerado como un todo, sino cada miembro del grupo individualmente y todos los posibles subgrupos del grupo principal. Además, para todos los propósitos, la invención incluye no solo el grupo principal, sino también el grupo principal en ausencia de uno o más de los miembros del grupo. Por lo tanto, la invención prevé la exclusión explícita de uno cualquiera o más de los miembros de un grupo mencionado. Por consiguiente, pueden aplicarse condiciones a cualquiera de las categorías o realizaciones desveladas por las que uno cualquiera o más de los elementos, especies o realizaciones enumerados pueden excluirse de tales categorías o realizaciones, por ejemplo, como se usa en una limitación negativa explícita.

La expresión "poner en contacto" se refiere al acto de tocar, hacer contacto o traer a una proximidad inmediata o cercana, incluso a nivel celular o molecular, por ejemplo, para provocar una reacción fisiológica, una reacción química o una cambio físico, por ejemplo, en una solución, en una mezcla de reacción, in vitro o in vivo.

El término "disolvente" o "sistema disolvente" como se usa en el presente documento se refiere a un líquido que puede extraer moléculas fosfolipídicas del tejido de un organismo marino. Los disolventes adecuados para extraer fosfolípidos de tejido de organismos marinos incluyen disolventes alcohólicos tales como metanol, etanol, propanol y butanol, opcionalmente con hasta aproximadamente un 50 % en peso de agua. Los sistemas disolventes útiles específicos incluyen etanol al 90 %, etanol al 93 % y etanol al 95 %, donde el resto del sistema disolvente es agua.

Cuando se usa una etapa de filtración para retirar partículas de un tamaño particular, el "tamaño" de la partícula retirada se refiere al tamaño o masa de una partícula particular que no pasará a través de un filtro o membrana que tenga poros o pasos de aproximadamente ese tamaño o menor. Por ejemplo, un papel de filtro que tenga un tamaño de poro de aproximadamente 15 |jm retirará las partículas sólidas de aproximadamente 15 |jm o mayores de una mezcla pasada a través del papel de filtro.

Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz para tratar una enfermedad, trastorno y/o afección, o para provocar un efecto mencionado. Por ejemplo, una cantidad eficaz puede ser una cantidad eficaz para reducir la progresión o gravedad de la afección o los síntomas que se tratan. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la materia. La expresión "cantidad eficaz" pretende incluir una cantidad de un compuesto descrito en el presente documento, o una cantidad de una combinación de compuestos descritos el presente documento, por ejemplo, que es eficaz para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno, o para tratar los síntomas de la enfermedad o trastorno, en un hospedador. Por lo tanto, una "cantidad eficaz" significa generalmente una cantidad que proporciona el efecto deseado.

Un "ácido graso" se refiere a un ácido alcanoico o un resto de ácido alcanoico (es decir, el resto que queda después de la retirada formal del hidrógeno ácido), donde el ácido graso incluye al menos aproximadamente nueve o diez átomos de carbono. Los ejemplos no limitantes de ácidos grasos incluyen ácido decanoico (10:0), ácido undecanoico (11:0), ácido 10-undecanoico (11:1), ácido láurico (12:0), ácido cis-5-dodecanoico (12:1), ácido tridecanoico (13:0), ácido mirístico (14:0), ácido miristoleico (ácido cis-9-tetradecenoico, 14:1), ácido pentadecanoico (15:0), ácido palmítico (16:0), ácido palmitoleico (ácido cis-9-hexadecenoico, 16:1), ácido heptadecanoico (17:1), ácido esteárico (18:0), ácido elaídico (ácido trans-9-octadecenoico, 18:1), ácido oleico (ácido cis-9-octadecanoico, 18:1), ácido nonadecanoico (19:0), ácido eicosanoico (20:0), ácido cis-11-eicosenoico (20:1), ácido 11,14-eicosadienoico (20:2), ácido heneicosanoico (21:0), ácido docosanoico (22:0), ácido erúcico (ácido cis-13-docosenoico, 22:1), ácido tricosanoico (23:0), ácido tetracosanoico (24:0), ácido nervónico (24:1), ácido pentacosanoico (25:0), ácido hexacosanoico (26:0), ácido heptacosanoico (27:0), ácido octacosanoico (28:0), ácido nonacosanoico (29:0), ácido triacosanoico (30:0), ácido trans vaccénico (ácido trans-11-octadecenoico, 18:1), ácido tarírico (ácido octadec-6-inoico, 18:1), y ácido ricinoleico (ácido 12- hidroxioctadec-cis-9-enoico, 18:1) y restos de acilo graso u)3, w6, y w9 tales como ácido 9,12,15-octadecatrienoico (ácido a-linolénico) [18:3, w3]; ácido 6,9,12,15-octadecatetraenoico (ácido estearidónico) [18:4, u)3]; ácido 11,14,17-eicosatrienoico (ácido dihomo-a-linolénico) [20:3, w3]; ácido 8,11,14,17-eicosatetraenoico [20:4, u)3], ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico [20:5, u)3]; ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico [22:5, w3]; ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico [22:6, u)3]; ácido 9,12-octadecadienoico (ácido linoleico) [18:2, w6]; ácido 6,9,12-octadecatrienoico (ácido y-linolénico) [18:3, w6]; ácido 8,11,14-eicosatrienoico (ácido dihomo-Y-linolénico) [20:3 w6]; ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico (ácido araquidónico) [20:4, ui6]; ácido 7,10,13,16-docosatetraenoico [22:4, w6]; ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico [22:5, w6]; ácido 6,9-octadecadienoico [18:2, w9]; ácido 8,11-eicosadienoico [20:2, w9]; ácido 5,8,11-eicosatrienoico (ácido de Mead) [20:3, ui9]; ácido trans-10,cis-12 octadecadienoico; ácido cis-10,trans-12 octadecadienoico; ácido cis-9,trans-11 octadecadienoico; y ácido trans-9,cis-11 octadecadienoico. Los restos acilo de un resto de ácido graso también pueden ser restos de acilo conjugados, hidroxilados, epoxidados y/o hidroxiepoxidados.

Un "ácido graso omega-3" se refiere a un ácido graso poliinsaturado que tiene el doble enlace final en la cadena de hidrocarburo entre el tercer y cuarto átomos de carbono desde el extremo metilo de la molécula o resto. Los ejemplos no limitantes de ácidos grasos omega-3 incluyen ácido A-5,8,11,14,17-eicosapentaenoico (EPA), ácido ^{A-4,7,10,13,16,19-docosahexanoico (DHA) y ácido A-7,10,13,16,19-docosapentanoico} (DpA ^n-3).

El término lípido incluye mono-, di- y triglicéridos, fosfolípidos, ácidos grasos libres, alcoholes grasos, colesterol, ésteres de colesterol y similares.

El término "fosfolípido" como se usa en el presente documento se refiere a un fosfato de glicerol con un grupo principal orgánico tal como colina, serina, etanolamina o inositol y cero, uno o dos (generalmente uno o dos) ácidos grasos esterificados a la cadena principal de glicerol. Véase la Figura 1. Los fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y fosfatidilinositol así como los correspondientes lisofosfolípidos. Por ejemplo, un "fosfolípido" puede referirse a un compuesto orgánico de Fórmula I:

en donde R1 es un resto de ácido graso o H, R2 es un resto de ácido graso o H, R3 es H o un compuesto que contiene nitrógeno tal como colina (HOCH2CH2N+(CH3)3OH-), etanolamina (HOCH²CH²NH²), inositol, o serina, y R4 es una carga negativa, H, o un catión tal como un catión de metal alcalino (por ejemplo, Li+, Na+, o K+). En algunas realizaciones, el nitrógeno de la etanolamina puede estar acilado, por ejemplo, con acetato o con el resto acilo de un ácido graso. En algunas realizaciones, R1 y R2 no son simultáneamente H. Cuando R3 es H, el compuesto es un diacilglicerofosfato (también conocido como ácido fosfatídico), aunque cuando R3 es un compuesto que contiene nitrógeno, el compuesto es un fosfátido tal como lecitina, cefalina, fosfatidilserina, o plasmalógeno. El sitio R1 se denomina posición 1 del fosfolípido (según el sistema de nomenclatura estereoespecífica [sn]), el sitio R2 se denomina posición 2 del fosfolípido (la posición sn2), y el sitio R3 se denomina posición 3 del fosfolípido (la posición sn3). Los fosfolípidos también incluyen ácido fosfatídico y/o ácido lisofosfatídico. Los esfingolípidos que contienen un grupo fósforo se clasifican generalmente como fosfolípidos; contienen una base de esfingosina en lugar de una base de glicerol.

La expresión "concentrado fosfolipídico" o "concentrado PL" se refiere a una masa de fosfolípidos que pueden ser sólidos a temperatura ambiente (~23 °C). Un concentrado PL como se describe en el presente documento puede tener un intervalo de puntos de fusión en el intervalo de aproximadamente 28 °C a aproximadamente 65 °C. Algunos concentrados PL pueden tener un intervalo de puntos de fusión en el intervalo de aproximadamente 28 °C a aproximadamente 38 °C, de aproximadamente 28 °C a aproximadamente 35 °C, de aproximadamente 28 °C a aproximadamente 34 °C, de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C, de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 55 °C, o de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 65 °C. Otros concentrados PL pueden tener un intervalo de puntos de fusión en el intervalo de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 60 °C, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 50 °C, de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40 °C, de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 38 °C, de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 35 °C, o de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 33 °C. El intervalo de puntos de fusión puede ser un intervalo de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 7, o aproximadamente 10 °C dentro de uno de los intervalos mencionados. El concentrado PL puede ser maleable y el sólido puede disolverse en aceites tales como aceites vegetales o de pescado.

Como se usa en el presente documento, un "aceite PL" se refiere a un aceite viscoso derivado de un concentrado PL donde el concentrado PL se procesa o purifica adicionalmente para proporcionar el aceite viscoso, rico en fosfolípidos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "composición lipídica" se refiere a un concentrado o aceite que puede extraerse de una composición de pescado, especialmente huevas de pescado inmadura. La composición lipídica generalmente contiene aproximadamente un 60-70 % en peso, aproximadamente un 62-67 % en peso, o aproximadamente un 63-66 % en peso de fosfolípidos, y ciertos lípidos neutros y otros componentes, por ejemplo, como se resume en la Tabla 3-2. Como podría reconocer fácilmente alguien con experiencia en la materia, el perfil de ácido graso de los propios fosfolípidos tendrá un contenido de DHA y EPA mayor en peso que toda la composición lipídica (por ejemplo, un concentrado PL o aceite PL) debido a la presencia de componentes de ácido no graso en tales composiciones.

La expresión "fosfolípido omega-3", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula fosfolipídica que tiene un resto de ácido graso omega-3 en la posición sn1, la posición sn2, o ambas posiciones, de una molécula fosfolipídica.

Una composición que tiene una "cantidad elevada" de fosfolípidos omega-3 se refiere a una composición donde al menos aproximadamente un 30 % en peso de los grupos ácido graso en el fosfolípido son restos de ácido graso omega-3. Una cantidad elevada de fosfolípido omega-3 también puede ser una composición fosfolipídica donde los grupos ácido graso son los fosfolípidos con grupos ácido graso omega-3 a al menos aproximadamente un 40 % en peso o al menos aproximadamente un 50 % en peso, con respecto a la cantidad total de ácidos grasos en los fosfolípidos de la composición.

La expresión "huevas acuáticas" se refiere a la hueva de pescado y a las huevas de otros animales acuáticos.

El término "hueva" se refiere a las huevas de pescado. La expresión "hueva blanda" se refiere a la lecha del pez macho que contiene el esperma.

La expresión "hueva de pescado inmadura", como se usa en el presente documento, se refiere a la hueva de pescado en la que los huevos están principalmente (por ejemplo, más de aproximadamente un 50 %, más de aproximadamente un 60 %, más de aproximadamente un 80 %, o más de aproximadamente un 90 %) en detención de la profase meiótica antes de la maduración causada por una señal hormonal. Huevas inmaduras, tales como huevas de arenque inmaduras, se refiere a huevas recolectadas de arenque de desove primaveral (SSH) entre finales de octubre y finales de enero, por ejemplo, en aguas noruegas; mientras que las huevas maduras se recolectan en febrero y marzo o más tarde, por ejemplo, cerca de la costa noruega. El arenque del Mar del Norte generalmente desova a principios de otoño en la parte occidental del Mar del Norte, por lo que las huevas inmaduras se recolectan a fines del verano. La escala de madurez de Hjort puede usarse para evaluar la madurez de las huevas de pescado (véase Hay et al., "Assessing and monitoring maturity and gonad development in Pacific herring"; Can. Tech. Rep. of Fish and Aquat. Sci., Vol. 998; 1981; Gobierno de Canadá, Pesca y Océanos). En todos los teleósteos, parece que los ovocitos experimentan el mismo patrón básico de crecimiento, independientemente de su estrategia reproductiva. Los principales sucesos de desarrollo que ocurren durante el desarrollo de los ovocitos pueden clasificarse en seis fases, de acuerdo con el estado de crecimiento de los ovocitos; son: ovogénesis, crecimiento primario de ovocitos, estadio de alvéolo cortical, vitelogénesis, maduración y ovulación. Durante las primeras etapas del desarrollo de los ovocitos, se produce la replicación del ADN (leptoteno), los cromosomas homólogos se emparejan (cigoteno) y estos pares se acortan y engrosan (paquiteno). A continuación, los cromosomas se desemparejan en configuraciones en escobilla (diploteno), justo antes de que el ovocito entre en un largo período de crecimiento citoplásmico. El crecimiento citoplasmático del ovocito se caracteriza por una enorme acumulación de reservas de yema (vitelogénesis). La meiosis se reanuda mediante una señal hormonal y esto conduce a la maduración de los ovocitos. Durante este periodo, el núcleo, detenido en la profase meiótica, se descompone y los cromosomas entran en la primera metafase meiótica. A continuación, el ovocito se libera del ovario a la cavidad corporal y se convierte en un óvulo listo para la fertilización. Generalmente, las huevas inmaduras son huevas antes de la ovulación o hinchazón. En las últimas etapas de maduración, las huevas también se vuelven pegajosas para que las huevas se adhieran entre sí y a la superficie en la que se desovan. Las huevas inmaduras para procesamiento deberían recolectarse preferentemente antes del estadio en el que las huevas se vuelven pegajosas, esto también puede ser antes de la ovulación o hinchazón.

La expresión "huevas sin secar" se refiere a una composición de huevas donde la cantidad natural de contenido de agua no se ha reducido sustancialmente, por ejemplo menos de aproximadamente un 70 o un 75 % en peso de la hueva, mientras que las huevas completamente secas tienen más de aproximadamente un 95 % en peso de materia seca. Huevas parcialmente secas puede referirse a una composición de hueva que se ha secado en la medida en la que el agua todavía comprende al menos aproximadamente un 20 % en peso, al menos aproximadamente un 30 % en peso, al menos aproximadamente un 40 % en peso, al menos aproximadamente un 50 % en peso, al menos aproximadamente un 60 % en peso, del peso de la hueva. Opcionalmente, las huevas sin secar pueden procesarse antes de la extracción con un disolvente, por ejemplo, antes o después de agitar o mezclar las huevas sin secar con el disolvente para extracción, incluyendo etapas de procesamiento tales como tratar las huevas troceando, mezclando, sonicando o tratando con agentes cáusticos, enzimas o agentes bioactivos, etc.

La expresión "vehículo fisiológicamente aceptable" se refiere a cualquier vehículo o excipiente comúnmente usado con productos farmacéuticos, y especialmente para administración oral. Tales vehículos o excipientes incluyen, pero no se limitan a, aceites, almidón, sacarosa y lactosa, así como excipientes para otros métodos de administración tales como administración tópica y parenteral.

La expresión "vehículo para administración oral" se refiere a cualquier medio para administrar una composición deseada por vía oral, que incluye, pero no se limita a, cápsulas, píldoras, comprimidos y jarabes.

El término "suspensión" se refiere a una mezcla heterogénea que contiene partículas sólidas en una fase fluida. Las partículas sólidas son generalmente tienen un tamaño superior a aproximadamente 1 mm pero pueden ser mucho más pequeñas, por ejemplo aproximadamente 100 micrómetros, aproximadamente 250 micrómetros o aproximadamente 500 micrómetros. La fase interna (sólida) de una suspensión se dispersa por la fase externa (líquida). A diferencia de un coloide, las partículas sólidas de una suspensión pueden sedimentar finalmente. Las partículas suspendidas pueden ser visibles al microscopio y pueden sedimentar con el tiempo si no se alteran. En un coloide, las partículas en suspensión pueden tener un tamaño inferior a 1 mm y no sedimentan de la fase fluida. Los extractos iniciales de organismos marinos pueden ser diversas mezclas, incluyendo suspensiones o coloides, y combinaciones de los mismos.

El término "emulsión" se refiere a una mezcla de dos o más líquidos que normalmente son inmiscibles (no mezclables o no combinables, es decir, no forman una solución). Las emulsiones son parte de una clase más general de sistemas de materia bifásicos denominados coloides. El término emulsión se usa cuando tanto la fase dispersa como la continua son líquidos, tales como agua y un aceite, por ejemplo, una combinación de un concentrado PL y un aceite de pescado u otro aceite con alto contenido de DHA. En una emulsión, un líquido (la fase dispersa) se dispersa en el otro (la fase continua), para proporcionar una emulsión de aceite en agua (o/w) o una emulsión de agua en aceite (w/o). Las composiciones fosfolipídicas descritas en el presente documento se proporcionan generalmente como emulsiones o/w. Sin embargo, cuando se usan cantidades muy elevadas de la composición fosfolipídica respecto al agua, puede prepararse una emulsión w/o.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Los fosfolípidos omega-3 son una alternativa importante a las formas de ácidos grasos libres, ésteres metílicos y etílicos y triglicéridos de omega-3 porque proporcionan ácidos grasos esenciales en una forma más biodisponible y el organismo los procesa de una manera más eficaz. Muchas composiciones de aceite de pescado, aceite de krill y similares actuales incluyen cantidades relativamente altas de ácidos grasos libres (FFA) y, a menudo, más de un 20 % del DHA y EPA están en forma de ácido graso libre (Schuchardt et al., Lipids Health Dis. (2011) 10: 145). Los FFA tienen un sabor desagradable y conducen a problemas digestivos incluyendo dispepsia (malestar estomacal y/o indigestión) y, por lo tanto, son indeseables en suplementos y composiciones alimenticias. Sin embargo, los métodos actuales para obtener fosfolípidos omega-3 no proporcionan la pureza alta y constante que puede obtenerse mediante los métodos descritos en el presente documento. Por lo tanto, la invención proporciona procesos eficaces para obtener fosfolípidos omega-3 con alta estabilidad, buenas propiedades de digestión, sin problemas de seguridad y medioambientales, sin "olor a pescado" y que son muy adecuados para su incorporación en suplementos dietéticos, complementos nutricionales y productos alimenticios.

Las alergias alimentarias son un problema de salud pública creciente, con un cálculo de 9 millones, o un 4 %, de adultos en Estados Unidos con alergias alimentarias. Parece que la prevalencia de alergias alimentarias y anafilaxia asociada está aumentando. De acuerdo con un estudio publicado en 2008 por los Centers for Disease Control and Prevention, en Estados Unidos, entre 1997 y 2007, se observó un aumento de alergias alimentarias de aproximadamente un 18 %. Ocho alimentos representan un 90 % de todas las reacciones alérgicas alimentarias. Estos incluyen leche, huevos, cacahuetes, frutos secos, trigo, soja, pescado y marisco. Las reacciones alérgicas al marisco son generalmente una alergia de por vida. La prevalencia calculada, en parte basándose en informes personales, entre la población de Estados Unidos desde un 0,4 % para pescado y de un 1,2 % para crustáceos. Es probable que las alergias a mariscos se subestimen porque las personas sensibles a crustáceos también pueden ser sensibles a moluscos y/o bivalvos. Visualizando estos datos, la fuente ideal de fosfolípidos de ácidos grasos omega-3 debería ser la derivada del pescado (huevas, lecha, cuerpo), en lugar de derivados de mariscos/crustáceos/krill. Por lo tanto, se necesitan nuevas composiciones fosfolipídicas de origen marino que tengan un contenido de contaminantes extremadamente bajo. Los procesos para obtener estas composiciones se proporcionan en el presente documento, como se describe a continuación.

En comparación con un extracto lipídico de tejido seco, el extracto lipídico obtenido mediante los procesos descritos en el presente documento tiene menos sabor y olor a pescado, y tiene un color más claro debido a las condiciones de procesamiento más ligeras. Las composiciones lipídicas extraídas de tejido húmedo no tienen un sabor y olor ahumado o quemado asociado con ellas. La extracción del tejido húmedo también da como resultado la extracción de los lípidos de la matriz tisular antes de cualquier nueva formación de enlace o unión adicional entre los lípidos y la matriz que resulta del secado. Por lo tanto, el proceso produce la misma cantidad de extracto con un tiempo de procesamiento más corto y/o en condiciones de extracción más ligeras en comparación con la extracción de tejido seco.

Además, separar la gran mayoría del disolvente del producto lipídico mediante el uso de membranas es beneficioso por varias razones. La filtración por membrana puede producirse a temperatura ambiente y no requiere el calentamiento que requieren la mayoría de los procesos de evaporación, incluso a presión reducida. Además, el uso de filtración por membrana para separar el disolvente del extracto lipídico permite una reducción significativa del nivel de contaminantes ambientales en el extracto final, generalmente una reducción del orden de un 70-95 % en la masa o ppm de contaminantes. Los PCB marcadores o indicadores habituales que pueden reducirse 10-20 veces o más incluyen los PCB que tienen los números IUPAC 28, 52, 101, 138, 153 y 180, entre otros.

Para concentrar un extracto lipídico, que comprende principalmente fosfolípidos marinos y triglicéridos con pesos moleculares en el intervalo de 0,7-1,0 kDa, puede usarse una membrana con límite de peso molecular (MWCO) de aproximadamente 0,5 kDa. En este MWCO, la mayoría de los PCB, PCDD, PCDF (0,2-0,5 kDa) y PAH (0,2-0,3 kDa) atraviesan la membrana como componentes del permeado final, mientras que el retenido solo pierde una cantidad muy limitada de fosfolípidos y triglicéridos.

El grado de retirada de contaminantes depende no solo del MWCO y otros atributos físicos de la membrana, sino también de la cantidad de disolvente retirado del concentrado lipídico. Si un extracto nativo que contiene un 5 % de lípidos en el disolvente se concentra a un concentrado 50:50, aproximadamente un 95 % del disolvente se retira mediante el uso de la membrana. Incluso si los contaminantes atraviesan la membrana a un ritmo ligeramente más lento que el disolvente, este procedimiento proporciona aún una retirada muy eficaz de los contaminantes del concentrado lipídico. Si se desea, el concentrado también puede diluirse nuevamente y posteriormente concentrar mediante la misma membrana o una similar para alcanzar niveles de pureza aún más altos y niveles más bajos de contaminantes.

La retirada de los disolventes de extracción mediante membranas puede permitir una reducción significativa de los niveles de ácidos grasos libres (FFA, ~0,3 kDa). La retirada de los disolventes de extracción Mediante membranas también puede permitir una reducción significativa de los niveles de colesterol libre (~0,4 kDa). Por ejemplo, la cantidad de FFA puede reducirse a menos de aproximadamente un 1 % en peso, o menos de aproximadamente un 0,5 % en peso, de la composición extraída. Además, la cantidad de colesterol libre puede reducirse a menos de aproximadamente un 1 % en peso, o menos de aproximadamente un 0,5 % en peso, de la composición extraída. Estas reducciones proporcionan al producto una calidad y pureza significativamente mejoradas al retirar los FFA, que pueden ser componentes inestables con propensión a oxidar otros compuestos en una mezcla y disminuir la resistencia de las composiciones al deterioro. En cierta realización, puede usarse una segunda filtración con la misma membrana de MWCO o una diferente para reducir adicionalmente el contenido de FFA y/o colesterol libre, si se desea.

La viscosidad del producto también se mejora para diversos propósitos retirando el componente de colesterol de alto punto de fusión. La retirada del colesterol libre da como resultado una menor formación de cantidades significativas o sustancialmente de todos los óxidos de colesterol, que se sabe que son más aterogénicos que el propio colesterol. La retirada de especies lipídicas de menor peso molecular, tales como los FFA y el colesterol, también proporciona productos más potentes con niveles relativos más altos de los valiosos fosfolípidos omega-3 marinos. La reducción de los FFA también mejora las propiedades de olor y sabor del concentrado lipídico. Esta reducción hace que el producto sea significativamente más adecuado como aditivo alimentario. La reducción de componentes lipídicos neutros tales como FFA y colesterol también aumenta las propiedades emulsionantes del extracto lipídico y, por lo tanto, mejora su actuación como agente emulsionante en matrices alimentarias. La filtración por membrana también permite una reducción significativa de la cantidad de compuestos iónicos en el extracto final, por ejemplo, sales, iones metálicos y sales de los mismos, de los cuales algunos se encontrarán naturalmente en organismos marinos.

Composiciones fosfolipídicas

La invención se refiere, por lo tanto, a composiciones lipídicas que comprenden un alto contenido de DHA, que se extrae preferentemente de una fuente natural. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que las composiciones lipídicas estables, sólidas y ricas en fosfolípidos con un alto contenido de fosfolípidos y un alto contenido de ácidos grasos omega-3, enriquecidas particularmente en DHA, pueden prepararse eficazmente a partir de pescado y subproductos de pescado, incluyendo huevas de pescado inmaduras, huevas de pescado maduras, lechas, órganos internos y otras partes del pescado. Véase por ejemplo, Figura 2. El alto contenido de ácidos grasos omega-3 de los fosfolípidos extraídos puede incluir niveles particularmente altos de EPA (ácido eicosapentaenoico (20:5 (n-3))) y DHA (ácido docosahexaenoico (22:6 (n-3))).

Como se describe en el presente documento, un concentrado PL puede extraerse de un pescado o subproducto de pescado tal como huevas de pescado. El pescado puede ser un pescado pelágico de agua fría. El concentrado PL puede extraerse de huevas de pescado. Las huevas de pescado pueden ser huevas de pescado inmaduras o huevas de pescado maduras. En determinadas realizaciones, las huevas pueden ser huevas seminales. Como se describe en el presente documento, el proceso de extracción puede realizarse en subproductos de procesamiento de pescado tales como lecha, fracciones de gónadas de pescado, órganos internos de pescado, colas, cabezas, piel, espinas y similares. Como se describe en el presente documento, el proceso de extracción puede realizarse en cualquier componente del pescado, incluso pescado completo, siempre que los tejidos se procesen de una forma suficientemente extraíble. Como se describe en el presente documento, el producto es una mezcla de huevas, lechas y órganos internos. La composición lipídica puede ser sustancialmente estable a la oxidación. La estabilidad de una composición a la oxidación puede medirse mediante ensayos de vida útil acelerada, con la oxidación determinada usando índices estándar tales como la cantidad de ácidos grasos sin oxidar restantes y la presencia de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) e índice de peróxido (PV) de la composición.

El lípido polar extraído de las huevas de pescado descrito en el presente documento se conoce como "concentrado" o "concentrado PL". El concentrado PL puede ser un aceite sólido o, en otras realizaciones, un aceite viscoso. El concentrado de huevas de arenque, maduras e inmaduras, puede contener fosfolípidos en aproximadamente un 60-70 % en peso, casi sin variación relacionada con la madurez en el contenido fosfolipídico y el contenido de ácidos grasos omega-3. El concentrado PL puede contener aproximadamente un 30-65 % en peso de ácidos grasos de cadena larga omega-3 EPA, DHA y DPA n3, generalmente esterificados a fosfolípidos, predominantemente fosfatidilcolina, con una relación habitual de DHA:EPA de 2:1 a aproximadamente 4:1. Como se describe en el presente documento DHA y EPA pueden estar presentes en una relación DHA:EPA de aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 3:1 de DHA:EPA, por ejemplo, aproximadamente 1,7:1 de DHA:EPA, aproximadamente 1,8:1 de DHA:EPA, aproximadamente 2,5:1 de DHA:EPA, o aproximadamente 2,9:1 de DHA:EPA. La relación entre DHA y EPA es al menos 2:1.

Los inventores han descubierto que los fosfolípidos omega-3 extraídos de huevas de pescado inmaduras, un recurso natural previamente infrautilizado que forma parte de una industria pesquera existente, tienen un contenido deseable de ácidos grasos omega-3 como se describió anteriormente, además de tener propiedades físicas deseables que facilitan su uso para administración oral y en suplementos nutricionales, suplementos dietéticos y productos alimenticios. Como se describe en el presente documento, los fosfolípidos omega-3 pueden extraerse, por ejemplo, de huevas de pescado inmaduras, huevas de pescado maduras, huevas seminales, lecha y órganos internos. La invención no se limita a la extracción de fosfolípidos omega-3 de cualquier hueva de pescado en particular, ya sea madura o inmadura. Sin embargo, en algunas realizaciones, la hueva de pescado inmadura es de arenque, caballa, sábalo o salmón.

La extracción de fosfolípidos omega-3 puede conseguirse mediante una diversidad de métodos. En el proceso de la presente invención, para la extracción se usa un disolvente polar. En algunas realizaciones, el disolvente polar es etanol. En una realización, los fosfolípidos omega-3 se extraen mediante extracción con fluido supercrítico, preferentemente con un agente de arrastre polar tal como etanol. La extracción con un disolvente polar produce una fracción lipídica polar enriquecida lipídica en fosfolípidos omega-3. El disolvente se retira de la fracción lipídica polar para proporcionar una composición polar sólida enriquecida en fosfolípidos omega-3. En una realización, la extracción se realiza mediante extracción con fluido supercrítico (SFE) usando CO² como disolvente y etanol como agente de arrastre polar. Algunas técnicas útiles para SFE se describen en la publicación de patente de Estados Unidos N.° 2011/0160161 (Sampalis et al.).

Las composiciones lipídicas descritas en el presente documento son una fuente de DHA y EPA excelente. Las composiciones lipídicas ricas en fosfolípidos sólidas también pueden ser maleables y tener un color ámbar claro o amarillo brillante. Las composiciones lipídicas ricas en fosfolípidos sólidas son estables durante periodos de tiempo prolongados y durante periodos de tiempo más largos que los correspondientes ácidos grasos sin restos fosfolipídicos, debido a las propiedades antioxidantes de los restos fosfolipídicos. Las composiciones fosfolipídicas son muy adecuadas para formulación o incorporación en vehículos de administración oral, complementos dietéticos, complementos nutricionales y productos alimenticios. En el presente documento también se describen procesos para incorporar o formular las composiciones lipídicas descritas en el presente documento en productos deseados.

Los métodos de la presente invención proporcionan diversas composiciones fosfolipídicas que tienen cantidades y relaciones ventajosas de ésteres de ácidos grasos. Una composición fosfolipídica tal como MOPL puede incluir una combinación de un triglicérido (por ejemplo, un aceite de pescado) y un lípido polar extraído rico en fosfolípidos (por ejemplo, un concentrado PL). La combinación puede estar presente, por ejemplo, en una relación que varía de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1. Los fosfolípidos pueden tener una estructura tal como la Fórmula I:

en donde R1 es H o un resto de ácido graso, R2 es H o un resto de ácido graso, cada R3 es independientemente H, o un resto de colina, una etanolamina, un inositol, un glicerol (como en fosfatidilglicerol o ácido difosfatídico), o un resto de serina, y R4 es una carga negativa, H, o un catión tal como un catión de metal alcalino (por ejemplo, Li+, Na+, o K+). En algunas realizaciones, el fosfolípido puede tener restos de DHA y/o EPA como al menos un 1 % de los grupos R1, R2, y R3. Los fosfolípidos pueden tener una concentración general de grupos OH en estructuras de Fórmula I en el intervalo de aproximadamente un 2,5 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 60 %, o de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 50 %.

En algunas realizaciones, los restos de ácidos grasos omega-3 incluyen EPA, DHA, DPA n-3, y/o ácido a-linolénico (ALA). En diversas realizaciones, la composición está básicamente exenta de disolventes orgánicos y compuestos orgánicos volátiles tales como ácidos grasos de cadena corta, adheridos de cadena corta y cetonas de cadena corta (por ejemplo, donde cadena corta se refiere a alquilo C¹-C⁶).

En algunas realizaciones, el fosfolípido tiene al menos un 5 %, o al menos un 10 %, en peso, de una combinación de restos de EPA y DHA esterificados a la cadena principal de glicerol. En diversas realizaciones el fosfolípido, el fosfolípido tiene al menos un 20 % de una combinación de restos de EPA y DHA esterificados a la cadena principal de glicerol. El fosfolípido puede tener al menos un 30 % de una combinación de restos de EPA y DHA esterificados a la cadena principal de glicerol. Además en otras realizaciones, el fosfolípido contiene aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, o aproximadamente un 50 % de restos de EPA/DHA unidos en la posición 1 y/o posición 2 a la cadena principal de glicerol. Los grupos restantes pueden ser, por ejemplo, otros ácidos grasos descritos en el presente documento o grupos hidroxilo. En algunas realizaciones, el fosfolípido tiene una relación DHA:EPA que varía de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3:1, o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 4:1. En otras realizaciones, la composición tiene una relación de DHA:EPA que varía de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 3: 1 o de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 4:1. En otras realizaciones, pueden usarse técnicas de fraccionamiento y purificación para producir una composición con una relación DHA:EPA de 10:1 o superior.

En algunas realizaciones, los átomos de oxígeno del glicerol que no están fosforilados en la composición pueden estar acilados de aproximadamente un 30 % a aproximadamente 99 %, o acilados de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 96 %. En otras realizaciones, la composición está acilada en un intervalo de un 50 % a un 78 %. Además en otras realizaciones, los átomos de oxígeno del glicerol fosfolipídico están acilados hasta un grado de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 90 %, de aproximadamente un 55 % a aproximadamente un 85 %, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 80 %, o de aproximadamente un 55 % a aproximadamente un 75 %.

En algunas realizaciones, el fosfolípido extraído de huevos tales como huevas de pescado puede ser un sólido, tal como un concentrado PL y/o un concentrado de triglicéridos. En otras realizaciones, el fosfolípido extraído de huevos como huevas de pescado puede ser un aceite, tal como cuando se modifica el proceso de extracción (por ejemplo, por MWCO de la nanofiltración) para obtener solo ciertos compuestos o grupos de compuestos, por ejemplo, un aceite PL o un aceite de triglicéridos. La composición puede ser una composición de lípidos marinos formulada en un pienso para animales, un producto alimenticio, un complemento alimenticio, un sistema de administración de fármacos o un fármaco.

En algunas realizaciones, la composición puede incluir una cantidad nutricional de colesterol útil. Algunas composiciones, tales como un producto MOPL 50, pueden incluir aproximadamente 3-10 g, aproximadamente 4-8 g, aproximadamente 4-6 g, aproximadamente 6-8 g, aproximadamente 5 g o 7 g, de colesterol por 100 g de muestra. Otras composiciones, tales como un producto MOPL 30, pueden incluir aproximadamente 2-4 g, o aproximadamente 3 g, de colesterol por 100 g de muestra. Además, el proceso de filtración por membrana puede proporcionar productos fosfolipídicos con cantidades extremadamente bajas de colesterol y ésteres de colesterol, tales como menos de aproximadamente un 4 % en peso, menos de aproximadamente un 3 % en peso, menos de aproximadamente un 2 % en peso, o menos de aproximadamente un 1 % en peso.

Las composiciones también pueden incluir un contenido de agua extremadamente bajo. Un contenido de agua bajo puede aumentar la estabilidad y la vida útil de las composiciones, proporcionando de ese modo un producto de alta pureza. En algunas realizaciones, la composición fosfolipídica incluirá menos de aproximadamente un 2 % en peso de agua, menos de aproximadamente un 1 % en peso de agua, menos de aproximadamente un 0,75 % en peso de agua, menos de aproximadamente un 0,5 % en peso de agua, menos de aproximadamente un 0,4 % en peso de agua, menos de aproximadamente un 0,25 % en peso de agua, menos de aproximadamente un 0,1 % en peso de agua, menos de aproximadamente un 0,05 % en peso de agua, o menos de aproximadamente un 0,01 % en peso de agua.

Los niveles altos de ácidos grasos libres contribuyen a rancidez, mal sabor y mayor oxidabilidad de los productos y suplementos alimenticios. Las composiciones fosfolipídicas obtenibles mediante los procesos descritos en el presente documento pueden contener un contenido de ácidos grasos libres muy bajo o nulo, debido a los bajos niveles de origen natural en las huevas de arenque y a las etapas de extracción y purificación moderadas y ligeras empleadas. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir menos de aproximadamente un 5 % en peso, menos de aproximadamente un 4 % en peso, menos de aproximadamente un 4 % en peso, menos de aproximadamente un 2 % en peso, o menos de aproximadamente un 1 % en peso de ácidos grasos libres, debido a la mayor purificación de los productos mediante el uso de filtración por membrana. Las composiciones fosfolipídicas obtenidas a partir de huevas de pescado generalmente contienen una cantidad mucho menor de ácidos grasos libres en comparación con los productos extraídos de otras fuentes como krill, cuyos extractos pueden contener altas cantidades de ácidos grasos libres (por ejemplo, más de aproximadamente un 3 % en peso, y tan altas como aproximadamente un 20 % en peso). Las composiciones fosfolipídicas descritas en el presente documento también pueden incluir cantidades beneficiosas específicas de fosfolípidos y lisofosfolípidos no encontrados en otros extractos y composiciones. Por ejemplo, las composiciones fosfolipídicas descritas en el presente documento pueden incluir un lisofosfolípido (por ejemplo, un 1-acilo; 2-liso; 1 -liso; 2-acilo; o di-liso (ácido fosfatídico); un alquilacilo PC y/o PE; un alquenilacilo PC y/o PE; y/u otros fosfolípidos. Tales componentes a menudo se ignoran, tales como fosfatidilglicerol (PG) y difosfatidilglicerol (DPG o cardiolipina), todos los cuales son importantes lípidos bioactivos que a menudo se ignoran o no se encuentran cantidades útiles en extracciones de productos o subproductos de pescado. En otras realizaciones, los extractos pueden tener una cantidad reducida de lisofosfolípidos debido a los métodos de extracción más ligeros, incluyendo menos de aproximadamente un 6 % en moles o menos de aproximadamente un 4 % en moles de fosfolípidos totales. Los extractos también pueden incluir astaxantina (por ejemplo, a aproximadamente 1-1000 ppm, aproximadamente 5-30 ppm, aproximadamente 5-20 ppm o aproximadamente 5-10 ppm).

Los métodos para extraer fosfolípidos eficazmente de composiciones de pescado tales como huevas de pescado proporcionan una nueva composición de fosfolípidos sólidos. Aunque otros fosfolípidos han sido extractos de diversas composiciones de pescado, los inventores han identificado un conjunto de fosfolípidos único que pueden proporcionar cualidades beneficiosas para terapias y productos alimenticios, donde ciertos componentes se encuentran en cantidades muy altas y otras especies se encuentran en cantidades muy bajas o están ausentes. Los niveles naturalmente bajos específicos de la especie de ácidos grasos libres combinados con una técnica de extracción moderada han permitido a los inventores obtener una composición fosfolipídica novedosa y ventajosa como se describe en el presente documento.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, con respecto a la masa total del concentrado PL, el concentrado PL puede incluir al menos aproximadamente un 50 % en peso, al menos aproximadamente un 60 % en peso, al menos aproximadamente un 65 % en peso, al menos aproximadamente un 70 % en peso, o al menos aproximadamente un 75 % en peso de fosfolípidos. Con respecto a la masa total de fosfolípidos en el concentrado PL, el concentrado PL puede incluir al menos aproximadamente un 75 % en peso, al menos aproximadamente un 80 % en peso, al menos aproximadamente un 81 % en peso, o al menos aproximadamente un 83 % en peso de fosfatidilcolina. Con respecto a la masa total de fosfolípidos en el concentrado PL, el concentrado PL puede incluir menos de aproximadamente un 5 % en peso, menos de aproximadamente un 4 % en peso, menos de aproximadamente un 3 % en peso, menos de aproximadamente un 2,5 % en peso de fosfatidilinositol, o sustancialmente nada de fosfatidilinositol (es decir, ninguna cantidad detectable). Con respecto a la masa total de fosfolípidos en el concentrado PL, el concentrado PL puede incluir aproximadamente un 5-10 % en peso, o aproximadamente un 6-9 % en peso de fosfatidiletanolamina. En otras realizaciones, el concentrado PL puede incluir menos de aproximadamente un 10 % en peso, menos de aproximadamente un 9 % en peso, o menos de aproximadamente un 8 % en peso de fosfatidiletanolamina. Con respecto a la masa total de fosfolípidos en el concentrado PL, la relación entre fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina puede ser de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 17:1.

El concentrado PL también puede tener menos de aproximadamente un 2 % en peso, menos de aproximadamente un 1 % en peso, o fosfatidilserina no detectable, y menos de aproximadamente un 2 % en peso, menos de aproximadamente un 1 % en peso, o esfingomielina no detectable.

Para extraer los fosfolípidos del pescado, subproductos de pescado o huevas de pescado, bastará cualquier disolvente polar alimentario adecuado y eficaz que sea polar basándose en la constante dieléctrica para efectuar una buena extracción de los fosfolípidos polares. En algunas realizaciones, el disolvente polar es, por ejemplo, metanol, etanol, butanol o una combinación de los mismos. En otras realizaciones, la extracción es una extracción con fluido supercrítico con un agente de arrastre polar y/o un disolvente de fluido supercrítico tal como dióxido de carbono.

Las composiciones lipídicas descritas en el presente documento también pueden incluir proteínas o aminoácidos, tales como una proteína de pescado, de un subproducto de pescado o de huevas de pescado, como se describe en el presente documento. La composición lipídica sólida extraída generalmente tendrá poco (menos de aproximadamente un 4 % en peso, menos de aproximadamente un 3 % en peso, o menos de aproximadamente un 0,5 % en peso) o ningún componente proteico porque las proteínas se disuelven mal durante el proceso de extracción, y generalmente se retiran por filtración. Sin embargo, pueden añadirse determinados componentes proteicos o aminoácidos a una emulsión preparada a partir del sólido fosfolipídico extraído para proporcionar un vehículo de administración adecuado y eficaz para la proteína o aminoácidos.

Métodos de extracción

Una composición fosfolipídica puede extraerse de la composición de pescado, en particular huevas de pescado. El componente de pescado puede congelarse y a continuación molerse. A continuación, el material sin secar puede extraerse con un disolvente de calidad alimentaria, generalmente con agitación a temperatura ambiente (~22 °C). Puede ser ventajoso romper cualquier envoltura de huevo para mejorar la eficacia del proceso de extracción (por ejemplo, usando una batidora o licuadora). A continuación, los sólidos de la mezcla pueden separarse, por ejemplo mediante decantación o similar. Puede ser ventajoso volver a extraer los sólidos a una concentración más alta del disolvente de calidad alimentaria, seguido de separación de los sólidos del extracto. A continuación, los extractos pueden combinarse opcionalmente. A continuación, el disolvente puede retirarse mediante cualquier método adecuado y eficaz. Puede ser ventajoso proporcionar calor para mejorar la evaporación, aunque la composición generalmente se calienta a solo a 60 °C, 55 °C o menos.

Cuando el extracto alcanza aproximadamente un 20 % en peso, 15 % en peso, 10 % en peso, 5 % en peso, 2 % en peso, o un 1 % en peso de lípidos, los sólidos no solubles pueden retirarse por filtración. El contenido lipídico de los extractos puede determinarse por evaporación de volátiles de una muestra usando un rotavapor a presión reducida, o mediante mediciones de infrarrojos. La retirada del disolvente puede continuar hasta que el extracto alcance de aproximadamente un 50 % en peso a aproximadamente un 60 % en peso de lípidos, momento en el que el extracto puede centrifugarse para retirar las partículas insolubles. A continuación, el disolvente restante se retira del extracto por evaporación a presión reducida para proporcionar un sólido de color ámbar claro y un alto contenido de fosfolípidos.

Una composición fosfolipídica con un contenido aún mayor de fosfolípidos puede obtenerse aumentando la polaridad del disolvente de extracción. Por ejemplo, en lugar de usar etanol al 96 %, puede usarse un disolvente con mayor porcentaje de agua, para extraer un porcentaje más alto de fosfolípidos polares y, de ese modo, reducir la extracción de componentes menos polares (por ejemplo, ciertas grasas y colesterol).

Un proceso de extracción puede describirse adicionalmente como sigue a continuación. La hueva de pescado inmadura fresca o congelada puede combinarse con etanol al 95 % o absoluto y mezclarse en una mezcladora comercial de alta potencia. La combinación resultante puede filtrarse, por ejemplo, usando filtros de leche (poros de 12-15 |jm) (filtros M) para retirar los componentes celulares no disueltos y los materiales proteicos. También puede ser ventajoso emplear una técnica de filtración que filtre partículas más pequeñas, tales como partículas tan pequeñas como aproximadamente 1 |jm de tamaño, usando un filtro con una matriz de poros más pequeña. Puede emplearse cualquier filtro que elimine adecuadamente las partículas sólidas y el material no disuelto de un tamaño superior aproximadamente 1 jm .

El filtrado etanólico opaco resultante puede filtrarse con un filtro de papel de 15 jm a presión reducida para proporcionar un residuo sólido (retenido) y un segundo filtrado. El retenido puede reintroducirse en la mezcladora junto con otra parte de etanol al 95 % para mezclarlo adicionalmente para proporcionar una suspensión. A continuación, la suspensión puede filtrarse con un filtro M a presión reducida para proporcionar un filtrado etanólico opaco. El filtrado se puede volver a filtrar con un filtro de papel de 15 jm a presión reducida para proporcionar un residuo sólido (retenido) y un tercer filtrado.

El etanol del segundo y tercer filtrados puede retirarse mediante rotavapor a presión reducida (por ejemplo, menos de 200 mBar), opcionalmente en combinación con calentamiento (por ejemplo, de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 65 °C). Se obtiene un material sólido de color amarillo claro o casi blanco.

Puede añadirse etanol al residuo seguido de una evaporación continua para retirar cualquier cantidad restante de agua en el producto. La etapa de adición de etanol puede repetirse a continuación una o más veces, opcionalmente con calor añadido, hasta que el producto sea completamente sólido. El rendimiento de fosfolípidos aislados de hueva de arenque inmadura fresca puede ser de aproximadamente un 3-6 %, con un olor a pescado significativamente reducido.

Como se describió anteriormente, el proceso da como resultado una composición fosfolipídica que tiene cantidades muy bajas de ácidos grasos libres, generalmente menos de aproximadamente un 3-4 % en peso, por ejemplo, menos de aproximadamente un 2 % en peso o menos de aproximadamente un 1 % en peso. El proceso también proporciona una composición que tiene un contenido de sodio muy bajo, por ejemplo, menos de aproximadamente 4 mg/g, menos de aproximadamente 2 mg/g, menos de aproximadamente 1 mg/g, menos de aproximadamente 0,5 mg/g, o menos de aproximadamente 0,1 mg/g de sodio. El proceso ligero da como resultado una menor hidrólisis en comparación con los procesos de extracción conocidos. Por consiguiente, los productos pueden tener cantidades relativas más bajas de ácidos grasos libres, diacilglicéridos, monoacilglicéridos y lisofosfolípidos. En otras realizaciones, las huevas pueden procesarse para tener mayores cantidades de lisofosfolípidos.

Los productos de degradación secundarios son generalmente el resultado de la oxidación y degradación de componentes tales como aminoácidos, incluyendo aminoácidos esenciales tales como lisina, la deshidratación de azúcares, incluyendo azúcares unidos a proteínas, lípidos o fosfolípidos. Estas degradaciones reducen el valor biológico y nutricional de los productos extraídos.

Por lo tanto el proceso de extracción y filtración proporciona un sólido purificado que contiene una combinación de fosfolípidos con una cantidad muy baja de sales y ácidos grasos libres. El producto resultante puede tener menos de aproximadamente un 5 % en peso o menos de aproximadamente un 2 % en peso de ácidos grasos libres. Por lo tanto, en diversas realizaciones, el producto resultante puede tener menos de aproximadamente un 4 % en peso de ácidos grasos libres, menos de aproximadamente un 3 % en peso de ácidos grasos libres, menos de aproximadamente un 2 % en peso de ácidos grasos libres, menos de aproximadamente un 1,5 % en peso de ácidos grasos libres, menos de aproximadamente un 1 % en peso de ácidos grasos libres, menos de aproximadamente un 0,5 % en peso de ácidos grasos libres, menos de aproximadamente un 0,25 % en peso de ácidos grasos libres, menos de aproximadamente un 0,2 % en peso de ácidos grasos libres, o menos de aproximadamente un 0,1 % en peso de ácidos grasos libres. El proceso ligero también reduce la cantidad de ácido lisofosfatídico y ésteres de ácido lisofosfatídico en grados similares a los descritos para los ácidos grasos libres.

En una realización, el contenido de ácidos grasos libres del concentrado fosfolipídico puede reducirse significativamente (por ejemplo, en aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, o aproximadamente un 95 %) disolviendo el fosfolípido en una solución acuosa y poniendo en contacto la solución acuosa con una membrana de poliimida humedecida (por ejemplo, una membrana Matrimid 5218) que tiene un disolvente orgánico enfrentado a la solución fosfolipídica acuosa, con circulación de los fluidos. El límite de peso molecular (MWCO) de la membrana puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0,5 kDa, aproximadamente 1 kDa, aproximadamente 2,5 kDa, aproximadamente 5 kDa, o aproximadamente 35 kDa. Véanse por ejemplo, los Ejemplos 3 y 4 de la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2012/0077255 (Miranda et al.).

Membranas de filtración

Para reducir las impurezas de un extracto fosfolipídico, así como para aumentar la proporción de fosfolípidos polares en comparación con lípidos neutros tales como colesterol pueden usarse membranas. Las membranas adecuadas para retirar material sin disolver y componentes neutros de huevas húmedas incluyen membranas hechas de un material polimérico hidrófobo. En una realización, para retirar material no deseado de la composición fosfolipídica pueden usarse membranas de poliimida. Los ejemplos de diversos polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, membranas Lenzing P84 y Matrimid 5218. Las membranas pueden reforzarse con una capa de soporte porosa, tal como un papel de hornear de poliéster no tejido.

Las membranas pueden ser porosas en el intervalo de ultrafiltración o nanofiltración baja. La membrana hidrófoba también puede usarse para separar, o usarse como barrera entre, lípidos hidrolizados y sin hidrolizar. En algunas realizaciones, las membranas pueden presentar un rechazo superior a aproximadamente un 50 %, superior a aproximadamente un 70 % o superior al aproximadamente un 95 %, para moléculas de diglicéridos.

Las filtraciones pueden realizarse como procesos discontinuos o como procesos semicontinuos. Las membranas usadas en las filtraciones descritas en el presente documento pueden configurarse de acuerdo con cualquiera de los diseños conocidos por los expertos en la materia, tales como enrollado en espiral, placa y marco, carcasa y tubo, y diseños derivados de los mismos. Las membranas también pueden tener geometría cilíndrica o plana.

Las técnicas de microfiltración (MF) y ultrafiltración (UF) pueden usarse para la concentración de las huevas de pescado rotas y/o los fosfolípidos disueltos. Una elección de membrana adecuada puede realizarse de acuerdo con las características de la mezcla a filtrar. Pueden usarse membranas cerámicas para aprovechar su alta estabilidad química y térmica. Para filtrar las mezclas o suspensiones de fosfolípidos pueden usarse módulos de filtración de flujo cruzado que contienen una membrana tubular inorgánica, por ejemplo, membranas hechas, por ejemplo, de titanio o circonio. Como se describe en el presente documento, una membrana tubular inorgánica que puede usarse incluye un límite en el intervalo de micro (0,1-10 pm) o ultrafiltración (103-106 Da).

En una realización, la ultrafiltración puede usarse para clarificar los fosfolípidos extraídos después de la extracción de las huevas de pescado. La nanofiltración del permeado de UF clarificado puede usarse a continuación para retirar iones monovalentes (por ejemplo, sales, cationes y aniones), moléculas pequeñas (por ejemplo, menos de 200 Da) y agua. Por ejemplo, usando nanofiltración, puede retirarse al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, o al menos aproximadamente un 80 % del agua de una muestra, con un coste energético muy bajo. Mediante nanofiltración pueden retirarse, de la composición fosfolipídica, cantidades similares de cloruro sódico y otras sales.

Pueden formarse membranas adecuadas a partir de un material polimérico o cerámico que permita el paso de aceites fosfolipídicos, al tiempo que retienen moléculas más grandes. La membrana puede estar hecha de materiales poliméricos adecuados para fabricar membranas de microfiltración, ultrafiltración, nanofiltración u ósmosis inversa, incluyendo, pero sin limitarse a, polietileno, polipropileno, politetrafluoroetileno (PTFE), difluoruro de polivinilideno (PVDF), poliétersulfona, poliacrilonitrilo, poliamida, poliimidas incluyendo poliimidas reticuladas usando especies de mono, di, tri o poliamina, acetato de celulosa y mezclas de los mismos. Las membranas pueden fabricarse mediante diversas técnicas conocidas en la materia, incluyendo sinterización, estiramiento, grabado de pistas, lixiviación en molde, polimerización interfacial o inversión de fases. En una realización, una membrana adecuada se prepara a partir de uno o varios materiales inorgánicos tales como, por ejemplo, óxido de aluminio, carburo de silicio, óxido de silicio, óxido de circonio, óxido de titanio, o zeolitas, usando técnicas tales como, pero sin limitarse a, sinterización, lixiviación o procesos sol-gel.

El proceso de filtración por membrana puede ser microfiltración, ultrafiltración o nanofiltración, o una combinación de las mismas, realizada en cualquier orden. Las membranas pueden ser membranas cerámicas tubulares, con un límite menor que el tamaño de partícula de las moléculas más grandes no deseadas, por ejemplo, entre 0,01 y 50 pm. En una realización, se emplea una membrana tubular que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 0,50 pm.

Aunque las membranas de nanofiltración existen desde hace aproximadamente 30 años, el enfoque de la tecnología de membranas de nanofiltración ha sido la filtración y purificación del agua y la recuperación de alimentos contenidos en el agua. La recuperación de alimentos ha sido hasta ahora una aplicación muy limitada y es relativamente cara debido al ensuciamiento de la superficie de la membrana, lo que reduce drásticamente la productividad y el coste/rendimiento de la membrana. Los principales agentes de incrustación incluyen organismos biológicos responsables de lo que se define como bioincrustación y moléculas orgánicas, que tienen una solubilidad muy baja en agua y tienden a precipitar en la membrana una vez que se concentran en su superficie.

Cuando se usan disolventes tales como etanol y metanol, el organismo biológico generalmente se elimina o se impide su crecimiento, mientras que las moléculas orgánicas se vuelven mucho más solubles, reduciendo drásticamente los problemas de incrustaciones. Se ha encontrado que las condiciones en las que se emplean las membranas durante la etapa de recuperación de los PL (por ejemplo, un contenido de etanol que varía de un 95 a un 80 % en peso) son adecuadas para técnicas de recuperación de PL con membranas de nanofiltración. Sin embargo, el número de membranas comerciales desarrolladas para ser estables con disolventes como el etanol es muy limitado. Por lo tanto, es un desafío encontrar una membrana adecuada que pueda ser estable en etanol y pueda funcionar bien dentro del intervalo de tamaños de poro de nanofiltración (por ejemplo, por debajo de 2 nm de diámetro). Incluso las membranas poliméricas empleadas habitualmente en aplicaciones alimentarias, tales como vino y cerveza, demostraron una gran inestabilidad y un rendimiento deficiente cuando se usaron para recuperar productos PL resueltos en un líquido de extracción que contenía más de un 70 % en peso de etanol.

Después de una selección de más de diez tipos diferentes de membranas, se encontró que la mayoría proporcionaba resultados deficientes o no eran estables con altas cantidades de etanol, incluyendo ciertas membranas cerámicas, membranas basadas en piperazina y membranas basadas en zeolita, independientemente de los valores de MWCO. Muchas membranas poliméricas absorbieron disolventes tales como etanol y se volvieron inestables o simplemente dejaron de filtrar. Sin embargo, se descubrió que una membrana de poliamida con un MWCO de 300 Da proporcionaba resultados adecuados y podría aplicarse con éxito en las condiciones requeridas para el proceso de extracción. Además, se descubrió que una membrana cerámica podía adaptarse recubriéndola con nanopartículas de dióxido de titanio para proporcionar un MWCO en el intervalo de 400-200 Da, lo que proporcionaba resultados adecuados y podía aplicarse con éxito dentro de las condiciones requeridas para el proceso de extracción. El uso de estas membranas permitió la producción de un producto fosfolipídico purificado de alta calidad, aunque inicialmente se desarrollaron para su uso con líquidos que contienen agua.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención anterior y no debería interpretarse que limitan su alcance.

Ejemplo comparativo 1. Extracción estándar de fosfolípidos

Proceso 1. La hueva de arenque inmadura, congelada se molió y se secó al vacío. El material seco se extrajo con etanol al 96 % en una relación de 10 litros de etanol por kg de hueva seca en un reactor agitado a temperatura ambiente durante 30 minutos. La agitación dentro del reactor se combinó con un circuito externo mediante una mezcladora de alto cizallamiento para romper las envolturas de huevo durante la extracción. Los sólidos y el extracto líquido se separaron con un decantador. Los sólidos se volvieron a extraer con etanol al 96 %, aproximadamente 6 litros de etanol por kg de hueva en peso seco, durante otros 30 minutos. Los sólidos y líquidos se volvieron a separar en un decantador. Los líquidos combinados (extractos) tenían un contenido lipídico de aproximadamente un 1-4 % en peso, según se determina mediante la evaporación de los volátiles de una muestra usando un rotavapor a presión reducida. A continuación, la fracción lipídica se concentró mediante evaporación de etanol hasta alcanzar aproximadamente un 12 % en un evaporador de película descendente a una temperatura inferior a 50 °C. La fracción lipídica se concentró adicionalmente mediante retirada de etanol a presión reducida en un reactor agitado. Con un contenido lipídico de alrededor aproximadamente un 20 %, la solución de etanol se filtró para retirar los sólidos no solubles. A continuación, la concentración continuó hasta alcanzar aproximadamente el nivel de un 55 % a una temperatura inferior a 55 °C. A continuación, el extracto al 55 % puede centrifugarse opcionalmente para retirar las partículas insolubles. A continuación, la composición se sometió a una evaporación final en una mezcladora a presión reducida. Opcionalmente, puede añadirse etanol puro y evaporar para ayudar a la evaporación de las cantidades finales de agua inferiores a un 1 %. El producto resultante era un sólido de color ámbar, como se muestra a la derecha en la Figura 3 , y un alto contenido de fosfolípidos.

Proceso 2. Se secaron huevas de arenque frescas (2202 g) a presión reducida a una temperatura no superior a 80 °C para producir 556 g de huevas secas con un contenido de materia seca de un 96 %. Las huevas secas se suspendieron en 5560 g de etanol al 96 % y se agitaron durante 30 minutos a 25-30 °C. La solución en el recipiente de extracción se hizo circular a través de un circuito externo y una mezcladora de alto cizallamiento durante la extracción para maximizar la eficacia de extracción. Posteriormente, los sólidos se separaron del extracto etanólico por centrifugación y se extrajeron nuevamente con 3336 g de etanol al 96 % en las mismas condiciones de procesamiento. El etanol y el agua residual se retiraron gradualmente del extracto combinado a presión reducida a una temperatura que no superaba los 45 °C. Durante el proceso de evaporación se realizaron dos filtraciones, con tamaños nominales de poro de 5 pm y 0,2 pm respectivamente. El proceso produjo 53 g de un sólido marrón con un contenido total de fosfolípidos de 67 g/100 g. El contenido de etanol residual fue inferior a un 2 %.

Ejemplo comparativo 2. Extracción de fosfolípidos

Un proceso mejorado para extraer fosfolípidos de huevas de pescado se desarrolló y realizó como se describe a continuación. La extracción se realizó como se ilustra en la Figura 2, donde los recuadros numerados representan los materiales y los óvalos con letras representan las etapas del proceso, como sigue a continuación.123456789

1. Hueva de pescado inmadura de arenque de desove primaveral (SSH).

2. Residuo de huevas sólidas extraído previamente resultante.

3. La solución de etanol-grasa extraída de la hueva de pescado inmadura que contiene material soluble en etanol y agua presente en el material de partida de hueva de pescado; después de una extracción.

4. La solución de etanol-grasa resultante de la extracción del material del Recuadro 2, que contiene material soluble en etanol y agua.

5. Retenido de la nanofiltración de materiales de los Recuadros 3 y 4; una composición de moléculas con pesos moleculares superiores a 500 Daltons.

6. Concentrado fosfolipídico (concentrado PL): el producto oleoso del proceso.

7. Permeado: la solución que contiene disolventes y otras moléculas con pesos moleculares inferiores a 500 Daltons que permeaban la membrana.

8. Aguas residuales: la composición acuosa que representa la fracción no destilable del permeado del Recuadro 7.

9. Etanol casi azeotrópico: la fracción destilable del permeado del Recuadro 7.

10. Proteína de hueva desgrasada: la fracción proteica secada de la hueva de pescado inmadura.

El proceso se realizó como sigue a continuación.

a) Extracción: los huevos se pusieron en contacto con etanol casi azeotrópico (93 % o 95 %) y se mezclaron minuciosamente para extraer materiales lipófilos, grasas y aceites contenidos en las huevas. Después de la extracción, el residuo sólido se separó de la fracción líquida mediante filtración o centrifugación.

b) Extracción: el material del Recuadro 2 se extrajo mediante un proceso similar al de extracción de la etapa a). c) Secado: el residuo sólido extraído se secó a presión reducida a temperatura moderada a baja (etapa opcional). d) Nanofiltración: los extractos líquidos se presionaron contra una membrana que es capaz de separar los extractos líquidos en dos fracciones: 1) el permeado que contiene la mayor parte del disolvente y también moléculas con pesos moleculares inferiores a aproximadamente 500 Daltons (o un límite de peso molecular diferente, dependiendo de la membrana de nanofiltración usada, como se describe en el presente documento); estos materiales incluyen sales minerales, ácidos grasos libres, carbohidratos, colesterol libre, contaminantes ambientales y similares; y 2) el retenido, una fracción lipídica altamente enriquecida con fosfolípidos (PL), triglicéridos (TG) y moléculas que tienen un peso molecular superior a aproximadamente 500 Daltons (o un límite de peso molecular diferente, dependiendo de la membrana de nanofiltración usada, como se describe en el presente documento).

e) Secado final: el retenido se somete a una etapa de concentración final para retirar el disolvente residual que no se retiró mediante la nanofiltración en la etapa d).

f) Destilación: el permeado se destiló para separar una fracción volátil formada por etanol casi azeotrópico y una fracción no volátil formada por agua y cualquier contaminante contenido en el permeado.

El proceso puede describirse con más detalle como sigue a continuación. La hueva de pescado inmadura de arenque de desove primaveral (SSH) se descongeló en un refrigerador durante la noche. Para la extracción se usó etanol (desnaturalizado con agua al 5 %; (EtOH95)). Para mezclar se usó una mezcladora de acero OBH Nordica Frutti™ (~1200 RPM). Para las etapas de filtración (papel de filtro cuantitativo, 454 (12-15 pm)) se usaron filtros de leche.

Se combinó hueva de pescado inmadura (247 g) en una mezcladora con EtOH95 (540 g) y la combinación se mezcló a máxima velocidad durante aproximadamente 5 minutos para crear una suspensión. A continuación, la suspensión se filtró con un filtro de leche a presión reducida (en el extremo posterior) para proporcionar un filtrado etanólico opaco. El filtrado se filtró una vez más con un papel de filtro de celulosa de poros de 15 pm (papel de filtro VWR®) a presión reducida para proporcionar aproximadamente 233 g de residuo sólido (retenido; Recuadro 2) y 440 g de un extracto (Recuadro 3).

El retenido se introdujo nuevamente en la mezcladora junto con EtOH95 (500 g) y se mezcló durante aproximadamente 5 minutos para proporcionar una suspensión. A continuación, la suspensión se filtró con un filtro de leche a presión reducida para proporcionar un filtrado etanólico translúcido. El filtrado se filtró de nuevo con un papel de filtro de poros de 15 pm a presión reducida para proporcionar aproximadamente 210 g de residuo sólido (retenido; Recuadro 2) y aproximadamente 491 g de un extracto (Recuadro 4).

Una parte del primer extracto (Recuadro 3; 428 g) se redujo a 79 g en un rotavapor a 175 mBar y 60 °C. A continuación se añadió una parte del segundo extracto (Recuadro 4; 480 g) y la evaporación continuó hasta que se formó un material blanquecino casi sólido. En una etapa opcional, se añadió etanol (100 ml) al residuo y la evaporación continuó para retirar cualquier cantidad restante de agua en el producto, lo que también redujo la formación de espuma del concentrado resultante. La etapa de adición de etanol se repitió a continuación dos veces y se aplicó un vacío total a 60 °C hasta que la presión interna del recipiente bajó a 19 mBar y el producto era completamente sólido.

Alternativamente, el primer extracto o "principal" puede filtrarse con una membrana para proporcionar un retenido concentrado. Por ejemplo, el primer extracto puede concentrarse mediante nanofiltración con tecnología de flujo cruzado, empleando una membrana cerámica que permite obtener una fracción de permeado donde el disolvente, sales minerales y otros contaminantes con peso molecular inferior a, por ejemplo, aproximadamente 500 Daltons, se acumulan; y un retenido donde los PL y la fracción de TAG se concentran hasta que al menos aproximadamente un 80 % de la masa de partida (la combinación de agua, disolvente y masa seca) se retira del material de alimentación de partida. En algunos procedimientos, al menos un 85 % o al menos un 90 % de la masa de partida se retira del material de alimentación de partida. A continuación se añadió el segundo extracto al equipo y se unió al retenido mientras que la filtración continuaba. Cuando el retenido alcanza un nivel de aproximadamente un 40 % de materia seca, pueden añadirse opcionalmente al retenido 150 g adicionales de etanol absoluto (por ejemplo, aproximadamente un 25-30 % de la cantidad inicial de etanol). La nanofiltración puede evolucionar hasta que el retenido se reduce a una masa de aproximadamente 20 g (aproximadamente un 8-10 % en peso de la masa inicial de huevas). A continuación, el retenido puede introducirse en un rotavapor para completar la retirada del disolvente del producto a presión reducida a una temperatura ligeramente elevada por encima de la temperatura ambiente (por ejemplo, 30-40 °C, o hasta aproximadamente 60 °C).

Se produjo un total de 8,9 g de un producto amarillo claro. La materia seca promedio contenida en los extractos del Recuadro 3 y el Recuadro 4 después de la unión fue aproximadamente un 1%. El rendimiento calculado del material de partida fue de un 3,7 %. El olor a pescado del material de partida de las huevas se redujo significativamente o estaba ausente en el producto final.

El proceso descrito en este ejemplo proporcionó un producto mejorado en comparación con el proceso descrito en el Ejemplo 1. El uso del proceso de este ejemplo dio como resultado un producto que tenía aumentos claros en la proporción de fosfolípidos estables en comparación con el proceso del Ejemplo 1, y también dio como resultado un producto que tenía cantidades drásticamente aumentadas (> 10 %) de fosfolípidos y triglicéridos, en comparación con el proceso descrito en el Ejemplo 1.

Ejemplo comparativo 3. Análisis del contenido de la composición fosfolipídica

Las composiciones fosfolipídicas extraídas estaban en forma de un concentrado PL sólido, que se analizaron para balance de masa fosfolipídica y contenido de ácidos grasos. Las composiciones fosfolipídicas pueden contener de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 95 % de fosfolípidos en peso. Con una purificación adicional, las composiciones pueden tener de aproximadamente un 90 % en peso a aproximadamente 100 % en peso de fosfolípidos. Como puede observarse en la Tabla 3-1 a continuación, la fosfatidilcolina forma un gran porcentaje de la composición fosfolipídica (por ejemplo, un concentrado PL o un aceite PL), por ejemplo, al menos aproximadamente un 40 % en peso, al menos aproximadamente un 50 % en peso, o al menos aproximadamente un 54 % en peso. La composición también incluye al menos aproximadamente un 5 % en peso, o al menos aproximadamente un 6 % en peso de fosfatidiletanolamina. La Tabla 3-1 usa abreviaturas estándar incluyendo APE para acilfosfatidiletanolamina.

Tabla 3-1. Especies PL habituales tal como se cuantifica mediante RMN 1H (correlacionado con % en masa), como comparación de la distribución relativa de las diversas especies PL para los lípidos extraídos de huevas húmedas (Ejemplo 2) con respecto a huevas secas (Ejemplo 1)

Especie PL Proceso del Ejemplo 2 Proceso 1 del Ejemplo 1

PC 80,9 81,5

1-LPC 0,4 0,6

2-LPC 2,6 3,0

PI 2,5 2,6

PE 9,1 6,9

LPE 0,6 0,5

APE 0,3 0,5

PA 0,5

Otros 3,5 4,0

Suma PL 100,0 100,0

Liso PC PE, % de PC PE total 3,9 4,6

El producto del proceso del Ejemplo 2 se obtuvo de manera más eficaz (es decir, en menos tiempo y con menos coste) que el producto del proceso del Ejemplo 1. Además, los productos del proceso del Ejemplo 2 tenían un color significativamente más claro, tenían un sabor mejorado, tenían menos (o ningún) olor a pescado, se degradaron menos fosfolípidos y triglicéridos, y el producto tenía menos de otros productos de degradación que la composición obtenida mediante el proceso del Ejemplo 1.

Por ejemplo, aproximadamente un 30-40 % del coste de obtener el producto del proceso del Ejemplo 1 puede atribuirse al secado de las huevas, mientras que esos costes pueden eliminarse por completo extrayendo las huevas húmedas directamente, como en el proceso del Ejemplo 2. Además, se retiraron eficazmente pequeños iones y moléculas del retenido. El contenido de ceniza se redujo en aproximadamente un 75 %. Además, el análisis de los productos del Ejemplo 2 mostró que contienen solo un 2,5 % de la cantidad de iones de plomo en comparación con la cantidad del material inicial, y se encontró que los iones bromuro eran solo un 2,1 % de la cantidad encontrada en el material inicial.

Adicionalmente, si se desea, la cantidad de lisofosfolípidos puede aumentarse o disminuirse cambiando el MWCO de la membrana usada para filtración y/o procesando las huevas iniciales (por ejemplo, troceando, mezclando, sonicando, tratando con agentes cáusticos o similares). En algunas realizaciones, el balance de masa aproximado de la composición puede ser como se muestra en la Tabla 3-2 a continuación.

Tabla 3-2. Balance de masa total de^ concentrado PL a roximado

Las composiciones fosfolipídicas han demostrado una excelente estabilidad oxidativa (sin adición de antioxidantes) y no generan eructos con aromas de pescado que a menudo se asocian con el aceite de pescado convencional 18:12 administrado por vía oral (una queja común de los consumidores). La estabilidad no solo es superior a la del aceite de pescado 18:12, sino que también es significativamente superior a la del aceite de krill, que también tiene un olor inherentemente a pescado que es mucho menos perceptible en las composiciones fosfolipídicas descritas en el presente documento. No se informa que los metales traza se concentren en las huevas, y no hay preocupaciones sobre la cadena alimentaria o el ecosistema porque las huevas son un subproducto de las operaciones pesqueras existentes.

Las composiciones fosfolipídicas pueden incluir una cantidad muy baja de ácidos grasos libres (menos de aproximadamente un 6,5 % en peso, menos de aproximadamente un 5,5 % en peso, o menos de aproximadamente un 1 % en peso), mientras que el aceite de krill puede tener tanto como un 21-22 % de su EPA y DHA en forma de ácido graso libre, que afecta negativamente a la biodisponibilidad y/o conduce a estabilidad, oxidación y problemas sensoriales.

Otras composiciones fosfolipídicas, tales como las descritas en la patente de Estados Unidos N.° 7.759.325 (Dupont), proporcionan composiciones que incluyen lecitina al 10-50 % en peso, generalmente aproximadamente un 20 % en peso, de la composición. De los fosfolípidos totales, tales composiciones incluyen un 10-75 % de fosfatidilcolina, un 10-30 % de fosfatidil inositol, un 5-30 % de fosfatidiletanolamina, un 5-20 % de fosfatidilserina y un 5-30 % de esfingomielina, en peso. En diversas realizaciones, las composiciones fosfolipídicas descritas en el presente documento no incluyen fosfatidilserina o esfingomielina, o se incluyen solo en cantidades muy bajas (por ejemplo, menos de aproximadamente un 4 %, menos de aproximadamente un 2 % o menos de aproximadamente un 1 %), e incluyen cantidades totales de fosfolípidos superiores a un 50 % en peso.

Los análisis adicionales de diversos concentrados fosfolipídicos proporcionaron los datos de la Tabla 3-3.

Tabla 3-3. Contenido de ácido raso aproximado en concentrados fosfolipídicos de huevas de arenque

Por lo tanto, 1 g de concentrado puede contener aproximadamente 750 mg de fosfolípidos. Otros aproximadamente 160 mg pueden justificarse por los triglicéridos. Algunas variaciones del contenido real son el resultado de los métodos analíticos empleados. El contenido de ácido graso libre y colesterol, debido a la separación por membrana, se reducirá a aproximadamente un 2 % cada uno, o menos (por ejemplo, menos de aproximadamente un 1 % de uno, el otro o ambos). El contenido de ceniza y ésteres de esterol será menos de aproximadamente un 2 % cada uno, o un 1 % o menos, cada uno, mientras que el contenido de ceniza en los procesos estándar (Ejemplo 1) es al menos un 2 %, generalmente un 2-4 %.

Un análisis detallado de ácidos grasos en un extracto fosfolipídico (concentrado) proporcionó los datos mostrados a continuación en la Tabla 3-4.

T l -4. An li i l n ni i r

Ejemplo comparativo 4. Procedimiento de extracción de yema de huevo

Las yemas de huevo frescas de 10 huevos de gallina proporcionaron aproximadamente 188,7 g de líquido rojo. Las yemas se pusieron en contacto directamente con 2053 g de etanol que contenía un 8 % en peso de agua a temperatura ambiente para formar una suspensión. La suspensión se mezcló con una barra de agitación magnética durante aproximadamente 15 minutos. A continuación, la suspensión resultante se centrifugó a 25 °C durante 11 minutos a 6000 veces la fuerza de la gravedad (g). Se obtuvieron aproximadamente 2114 g de un líquido amarillo intenso que se denominó "Fracción líquida 1". La fracción sólida decantada estaba formada principalmente por proteínas y disolvente residual. La fracción sólida se puso en contacto con 2409 g de etanol que contenía un 8 % en peso de agua y se extrajo nuevamente agitando la suspensión con una barra de agitación magnética a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, la suspensión se centrifugó a 25 °C durante 11 minutos a 6000 g para proporcionar una fracción líquida de color amarillo pálido. La fracción líquida de color amarillo pálido de aproximadamente 2400 g obtenida se denominó Fracción líquida 2.

La Fracción líquida 1 y la Fracción líquida 2 se unieron y a continuación se evaporaron con un rotavapor sumergido en un baño tibio a 50 °C a presión reducida. Una vez que la presión interna del rotavapor alcanzó 25 mBar, la evaporación se detuvo. El extracto libre de disolvente obtenido fue de aproximadamente 41,2 g, lo que corresponde a un rendimiento de aproximadamente un 21,8 % en peso de la yema líquida de partida. La composición del extracto final fue aproximadamente un 30 % en peso de fosfolípidos y aproximadamente un 50-60 % en peso de triglicéridos. El extracto final puede filtrarse mediante cualquier medio adecuado, tal como con un filtro de papel (por ejemplo, 10 |jm, 1 |jm o 0,45 |jm) para proporcionar un producto final.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para proporcionar una composición con altas cantidades de fosfolípidos omega-3 que comprende:

poner en contacto huevas de pescado sin secar con un disolvente polar y mezclar las huevas y el disolvente para formar una primera mezcla;

filtrar la primera mezcla para retirar las partículas sólidas con un tamaño superior a 1 |jm, para proporcionar una solución del disolvente polar que comprende lípidos extraídos;

someter la solución a filtración por membrana en donde la membrana tiene un MWCO de 300 Daltons, para proporcionar un retenido que comprende más de un 10 % en peso seco de lípidos;

en donde al menos un 40 % de los restos de ácido graso totales del retenido son ácidos grasos omega-3, los restos de ácido graso del retenido comprenden ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA), y la relación entre DHA y EPA es al menos 2:1;

en donde el retenido comprende menos de un 2 % en peso de contenido de ceniza, basado en peso seco.

2. El método de la reivindicación 1 en donde el retenido se somete a secado a presión reducida para proporcionar un sólido.

3. El método de la reivindicación 1 en donde la hueva de pescado es hueva de arenque inmadura, hueva de salmón inmadura, hueva de caballa inmadura, hueva de sábalo inmadura, o una combinación de las mismas.

4. El método de la reivindicación 3 en donde el retenido comprende de un 50 % en peso a un 95 % en peso de fosfolípidos, y un 30-70 % en peso de los restos de ácido graso totales en los fosfolípidos son ácidos grasos omega-3, basado en peso seco.

5. El método de la reivindicación 4 en donde el retenido comprende al menos un 50 % en peso de fosfatidilcolina, con respecto al peso total de la composición.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en donde la hueva de pescado es una hueva de pescado no cerosa en donde el contenido de cera de la hueva es inferior a un 40 % en peso.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en donde el retenido comprende más de un 20 % en peso seco de lípidos, opcionalmente más de un 30 % en peso seco de lípidos, opcionalmente más de un 40 % en peso seco de lípidos.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en donde el retenido comprende un 1 % en peso de contenido de ceniza o menos, basado en peso seco.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en donde el retenido comprende menos de un 5 % de iones de plomo en comparación con la concentración inicial encontrada en la hueva de pescado sin secar con respecto a la cantidad total de lípido.

10. Un método para producir un extracto fosfolipídico con bajo contenido de PCB, PCDD, PCDF y PAH que comprende:

poner en contacto huevas de pescado marino ricas en fosfolípidos que tienen un contenido de cera de un 5 % en peso o menos con un disolvente polar y mezclar la hueva y el disolvente para formar una primera mezcla;

filtrar la primera mezcla para retirar las partículas sólidas con un tamaño superior a 1 jm , para proporcionar una solución del disolvente polar que comprende lípidos y fosfolípidos;

pasar la solución a través de una membrana de nanofiltración que tiene un MWCO de 300 Daltons, para proporcionar un retenido que comprende menos de un 10 % del disolvente polar inicial

en donde al menos un 40 % de los restos de ácido graso totales del retenido son ácidos grasos omega-3, los restos de ácido graso del retenido comprenden ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA), y la relación entre DHA y EPA es al menos 2:1; y en donde el retenido comprende menos de un 2 % en peso de contenido de ceniza.

11. El método de la reivindicación 10 en donde el peso seco del retenido comprende un 1 % en peso o menos de contenido de ceniza, opcionalmente en donde el retenido comprende menos de un 5 % de iones de plomo en comparación con la concentración inicial encontrada en la fracción lipídica de la hueva de pescado sin secar.

12. Un método para proporcionar una composición con altas cantidades de fosfolípidos que comprende:

poner en contacto yemas de huevo aviar con un disolvente polar y mezclar las yemas de huevo y disolvente para formar una primera mezcla;

filtrar la primera mezcla para retirar las partículas sólidas con un tamaño superior a 1 jm , para proporcionar una solución del disolvente polar que comprende lípidos extraídos;

someter la solución a filtración por membrana en donde la membrana tiene un MWCO de 300 Daltons, para proporcionar un retenido que comprende más de un 10 % en peso seco de lípidos;

en donde el retenido comprende de un 20 % en peso a un 50 % en peso de fosfolípidos; y

en donde el retenido comprende menos de un 2 % en peso de contenido de ceniza, basado en peso seco, opcionalmente en donde la yema de huevo aviar es una yema de huevo de gallina.

13. El método de la reivindicación 12 en donde el retenido se somete a secado a presión reducida para proporcionar un sólido.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o 12-13, en donde el retenido se caracteriza por un color amarillo brillante.