ES2864772T3

ES2864772T3 - Suspensión de células y uso de la misma

Info

Publication number: ES2864772T3
Application number: ES13764726T
Authority: ES
Inventors: Andrew Quick; William Dolphin
Original assignee: AVITA MEDICAL Ltd
Current assignee: AVITA MEDICAL Ltd
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2021-10-14
Anticipated expiration: 2033-03-14
Also published as: US20150079153A1; CN104685049A; CA2874091C; EP2828378A4; WO2013142254A1; EP3896152A1; AU2013202587A1; US20220193301A1; AU2013202587B2; CA2874091A1; US20200093951A1; US20200093952A1; EP2828378A1; EP2828378B1; BR112014023272B1; HK1207662A1; BR112014023272A2

Abstract

Una composición de suspensión de células para su uso en un procedimiento relacionado con el epitelio, que comprende: una población de células que incluye células viables y funcionantes derivadas de una muestra de tejido epitelial; y un agente exógeno que comprende ácido hialurónico; en donde la población de células, antes de ser usada en un procedimiento relacionado con el epitelio, no se somete a cultivo in vitro y comprende tanto células madre como células no madre; en donde la población de células, cuando se usa en dicho procedimiento relacionado con el epitelio y se aplica a un sitio receptor, promueven el tratamiento, la cicatrización, la reconstrucción, la exfoliación, la repigmentación y/o la regeneración de tejidos epiteliales.

Description

DESCRIPCIÓN

Suspensión de células y uso de la misma

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método simple, rápido y rentable para la preparación de una suspensión de células, particularmente una suspensión que comprende células epiteliales viables, tales como células no diferenciadas/progenitoras y/o células diferenciadas. Dicha suspensión es útil para tratar un paciente en necesidad de un procedimiento relacionado con el epitelio. También se proporcionan el dispositivo para dicha preparación y el uso de la suspensión de la misma.

ANTECEDENTES

La regeneración de tejido en seres humanos está extremadamente limitada y constituye un reto importante para la reparación de la función de órganos dañados. El tratamiento de heridas es un área típica donde se requiere la regeneración de tejido. Las heridas (laceraciones o aberturas) en tejido de mamífero pueden dar como resultado la alteración del tejido y la coagulación de la microvasculatura en la cara de la herida. La reparación de dicho tejido representa una respuesta celular organizada y controlada a la lesión. Todas las heridas de tejido blando, independientemente del tamaño, cicatrizan de una manera similar. Los mecanismos de crecimiento y reparación de tejido son sistemas biológicos en donde la proliferación celular y la angiogénesis ocurren en presencia de un gradiente de oxígeno. Los cambios morfológicos y estructurales secuenciales, que ocurren durante la reparación del tejido, se han caracterizado en gran detalle y, en algunos casos, se han cuantificado. Véase Hunt, T. K., et al., "Coagulation and macrophage stimulation of angiogenesis and wound healing", The surgical wound, pp. 1 -18, ed. F. Dineen & G. Hildrick-Smith (Lea & Febiger, Philadelphia: 1981).

La regeneración de tejido en diversos órganos, tales como la piel o el corazón, depende del riego sanguíneo que repara el tejido conjuntivo y que permite que células residuales específicas de órgano, tales como queratinocitos o células de músculo, restablezcan la integridad del órgano. Así, una función relevante de las células mesenquimatosas, por ejemplo, los fibroblastos o, además, las células endoteliales de la vasculatura, es la secreción de factores que potencian el proceso de cicatrización, por ejemplo, los factores que promueven la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) o los factores que promueven la reepitelización por queratinocitos proliferantes y migrantes.

La morfología celular de una herida consiste en tres zonas distintas. El espacio de la herida avascular central es deficiente en oxígeno, acidótico e hipercárbico, y tiene altos niveles de lactato. El espacio adyacente a la herida es una zona de gradiente de isquemia local, que está poblada de fibroblastos en división. Detrás de la zona delantera está un área de síntesis activa de colágeno caracterizada por fibroblastos maduros y numerosos capilares recién formados (es decir, neovascularización). Mientras que el crecimiento de los nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) es necesario para la curación de tejido cicatricial, los agentes angiogénicos son, en general, incapaces de satisfacer la necesidad que se sentía desde hace tiempo de proporcionar los efectos biosintéticos adicionales de la reparación de tejido. Además de la herida aguda (por ejemplo, quemadura o laceración provocada por traumatismo), la herida artificialmente creada (por ejemplo, en un sitio de donante de injerto, indicación estética, procedimiento plástico o tratamiento dérmico), la herida crónica (por ejemplo, úlceras venosas o diabéticas) y otras indicaciones, tales como la remodelación cicatricial, las lesiones por pérdida de piel glabra, los problemas de pigmentación, vitiligo, leucoderma y procedimientos de rejuvenecimiento cosmético también requieren terapéuticos rápidos y eficientes. A pesar de la necesidad de una cicatrización más rápida de las heridas (por ejemplo, quemaduras intensas, incisiones quirúrgicas, laceraciones y otro traumatismo), hasta la fecha solo ha habido un éxito limitado en acelerar la cicatrización con agentes farmacológicos.

El objetivo primario en el tratamiento convencional de las heridas es lograr el cierre de la herida. Las heridas cutáneas abiertas representan una categoría principal de heridas. Esta categoría incluye quirúrgicas y traumáticas agudas, por ejemplo, úlceras crónicas, heridas por quemadura, así como heridas crónicas, tales como úlceras neuropáticas, úlceras por presión, úlceras arteriales y venosas (insuficiencia) o úlceras arteriovenosas mixtas, y úlceras diabéticas. Las heridas cutáneas abiertas cicatrizan rutinariamente por un proceso que comprende seis componentes principales: i) inflamación, ii) proliferación de fibroblastos, proliferación de vasos sanguíneos, iv) síntesis de tejido conjuntivo, v) epitelización y vi) contracción de heridas. La cicatrización se altera cuando estos componentes, ya individualmente o en conjunto, no funcionan apropiadamente. Numerosos factores pueden afectar la cicatrización, que incluyen malnutrición, infección, agentes farmacológicos (por ejemplo, fármacos citotóxicos y corticosteroides), diabetes y edad avanzada. Véase Hunt et al., en Current Surgical Diagnosis & Treatment (Way; Appleton & Lange), pp. 86-98 (1988).

Las heridas de la piel que no cicatrizan fácilmente pueden provocar en el sujeto una molestia física considerable, malestar psíquico y social, así como un gran coste económico. Véase, por ejemplo, Richey et al., Annals of Plastic Surgery 23(2): 159-65 (1989). De hecho, las heridas que no cicatrizan apropiadamente finalmente pueden requerir tratamientos quirúrgicos agresivos, tales como injerto autólogo de piel (donde se injertan capas de piel) o injerto de dermis cultivada. Por ejemplo, los procedimientos de autoinjerto epitelial cultivado (AEC) toman células de la piel del paciente para hacer crecer nuevas células de la piel en capas en un laboratorio. Las nuevas capas se usan como injertos. Sin embargo, la tasa de prendimiento de estos injertos no es satisfactoria. Véase, por ejemplo, Sood et al., Journal of Burn Care Research 31(4):559-68 (2010). Los procedimientos de injerto más nuevos combinan AEC con una matriz para más soporte. Por ejemplo, la dermis actualmente disponible como cultivada o manipulada son productos que tienen diferentes matrices en las que se incorporan fibroblastos, tales como T ransCyte® y Dermagraf®. Sin embargo, estos productos no son eficientes en la inducción de la epitelización en grandes heridas. Las células epidérmicas que incorporan piel cultivada/manipulada y fibroblastos están disponibles como Apligraf® (NOVARTIS Pharma) y VivoDerm® (Bristol-Myers Squibb). Sin embargo, hay problemas referentes a la afinidad entre la capa epidérmica cultivada y la capa dérmica, e insuficiencia en el efecto clínico obtenible.

El documento de patente WO 02/062358 A1 (15-08-2002) informa de un método y/o dispositivo para producir una suspensión celular trasplantable de tejido vivo para injertar en un paciente. En la aplicación del método y/o en el uso del dispositivo, se recoge tejido del donante, se somete a un tratamiento de disociación de células, se recogen las células a ser injertadas de nuevo en un paciente y se dispersan en una disolución que es para dispersión inmediata en el sitio de injerto del receptor.

Existe una necesidad de cicatrización mejorada, y más ampliamente, una técnica de regeneración de tejido. La presente invención proporciona una suspensión celular autóloga adecuada para la aplicación en diversos sitios receptores, que se pueden usar independientemente del tipo o tejido de la herida o la naturaleza de la población de pacientes. También se proporcionan métodos de preparación y/o uso de dicha suspensión, así como dispositivos para la preparación.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

El objeto de la invención se refiere a una composición de suspensión de células única para su uso en un método de tratamiento de un paciente en necesidad de un procedimiento relacionado con el epitelio, y a un método para su preparación que es rápido, eficiente y simple de preparar y aplicar. Se desvelan métodos a modo de ejemplo para tratar un paciente en necesidad de un procedimiento relacionado con el epitelio usando la composición de suspensión de células única, que no solo promueve la cicatrización / el cierre de heridas, sino también la regeneración de tejido. Las composiciones de suspensión de células de la invención se pueden aplicar a cualquier procedimiento relacionado con el epitelio para promover la regeneración de tejido, que incluye tejidos epiteliales, tales como el epitelio de la piel (por ejemplo, epitelio glabro), epitelio respiratorio, epitelio vascular, epitelio glandular, epitelio corneal. También se proporciona para referencia un aparato adecuado para su uso en el método de preparación y/o tratamiento. El uso del dispositivo descrito es útil para poner en práctica el método de la presente divulgación, y se ha encontrado que reduce significativamente el tiempo usado en procedimientos alternativos y la complejidad asociada al uso de tecnologías de injerto convencionales. Además, la composición de suspensión de células de la presente invención proporciona células funcionantes vivas que se pueden presentar a través de una gran área en o sobre el cuerpo del paciente, o dentro de una matriz o armazón o sustrato in vitro o in situ sobre un sitio receptor. Los profesionales clínicos tendrían, por lo demás, acceso limitado o ningún acceso a dichas células epiteliales autólogas.

Para referencia, se proporciona una suspensión de células para su uso en un procedimiento relacionado con el epitelio. La suspensión de células incluye una población de células que incluye células viables, una población de células que incluye células viables derivadas de una muestra de tejido epitelial. Las células viables pueden estar en diversos estadios de diferenciación y ser funcionantes (por ejemplo, realizar sus funciones previamente programadas, tales como señalización, producción de ciertas proteínas, secreción de ciertos factores, migración o proliferación). Las células pueden incluir células maduras/diferenciadas, así como células capaces de dividirse o diferenciarse. Las células viables también pueden estar en un estado migratorio y proliferativo. La población de células, antes de ser usada en un procedimiento relacionado con el epitelio, se expone a una condición seleccionada del grupo que consiste en estrés y un agente exógeno. La población de células puede presentar una característica inducida por el estrés. Dicha característica inducida por el estrés puede provocar que las células expresen proteína(s) mediadora(s) en el proceso de cicatrización. El (Los) agente(s) o componente(s) exógeno(s), tales como la(s) proteína(s) de choque térmico, ácido hialurónico, plasma enriquecido en plaquetas, factor(es) de crecimiento, citocina(s) y/o células madre adiposas se pueden suministrar a la población de células. La población de células, con o sin los agente(s) exógenamente suministrado(s), cuando se usa en dicho procedimiento relacionado con el epitelio y se aplica a un sitio receptor del paciente in vivo, puede promover el tratamiento, la curación, la reconstrucción, la exfoliación, la repigmentación y/o la regeneración de tejidos epiteliales. La población de células también se puede sembrar en una matriz o armazón o sustrato (in vitro o in situ), donde las células pueden, por ejemplo, crecer para formar un tejido u órgano artificial.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición para su uso en un procedimiento relacionado con el epitelio, como se define en la reivindicación 1. La composición incluye una población de células que incluye células viables y funcionantes derivadas de una muestra de tejido epitelial. Las células viables están funcionando (por ejemplo, realizando sus funciones previamente programadas, tales como la señalización, la producción de ciertas proteínas, la secreción de ciertos factores, la migración o la proliferación). Las células viables pueden estar en diversos estadios de diferenciación e incluyen células maduras/diferenciadas que están funcionando, así como células capaces de dividirse o diferenciarse. Las células también pueden estar en un estado migratorio y proliferativo. En un ejemplo comparativo, la población de células, antes de ser usada en un procedimiento relacionado con el epitelio, se expone a una condición seleccionada del grupo que consiste en estrés y un agente exógeno. En un ejemplo comparativo, la composición puede incluir, por ejemplo, una proteína de choque térmico expresada por las células en estrés, o una proteína de choque térmico aislada o recombinante, o un fragmento de la misma. La proteína de choque térmico puede estar en una cantidad eficaz para promover la cicatrización de la piel en un paciente en necesidad de la misma. En las realizaciones de la invención, la composición incluye un agente exógeno que comprende ácido hialurónico. La composición puede incluir además un agente o componente exógeno o externamente suministrado, tal como plasma enriquecido en plaquetas, factor(es) de crecimiento, citocina(s) y/o células madre adiposas. La composición, cuando se usa en un procedimiento relacionado con el epitelio y se aplica a un sitio receptor del paciente in vivo, puede promover el tratamiento, la cicatrización, la reconstrucción, la exfoliación, la repigmentación y/o la regeneración de tejidos epiteliales. La composición también se puede aplicar a una matriz o armazón o sustrato in vitro o in situ, donde las células pueden crecer (por ejemplo, cultivarse in vitro o multiplicarse in situ) para formar, por ejemplo, un tejido u órgano artificial.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de células para su uso en un procedimiento relacionado con el epitelio, como se define en la reivindicación 6. El método incluye: proporcionar una población de células que incluyen células viables y funcionantes derivadas de una muestra de tejido epitelial; y exponer la población de células a un agente exógeno que comprende ácido hialurónico. En un ejemplo comparativo, el método implica exponer la población de células a una condición seleccionada del grupo que consiste en estrés y un agente exógeno. Las células viables pueden estar en diversos estadios de diferenciación e incluyen células maduras/diferenciadas que están funcionando, así como células capaces de dividirse o diferenciarse. Las células también pueden estar en un estado migratorio y proliferativo. En ejemplos comparativos, el método incluye inducir la expresión de una proteína de choque térmico por la población de células, obteniéndose así células para su uso en un procedimiento relacionado con el epitelio que tienen un elevado nivel de dicha proteína de choque térmico en comparación con un nivel de control de dicha proteína de choque térmico sin dicha condición de estrés. En ejemplos comparativos, el agente exógeno puede ser uno o más de ácido hialurónico, plasma enriquecido en plaquetas, factor(es) de crecimiento, citocina(s) y/o células madre adiposas.

La presente divulgación proporciona, para referencia, un método de preparación y uso de células en un procedimiento relacionado con el epitelio. El método incluye: aplicar, a un sitio receptor en un paciente en necesidad del mismo, una población de células que incluye células viables derivadas de una muestra de tejido epitelial; y proporcionar a la población de células una condición seleccionada del grupo que consiste en estrés y un agente exógeno para promover el tratamiento epitelial, la cicatrización, la reconstrucción, la exfoliación, la repigmentación y/o la regeneración en dicho paciente. En algunos ejemplos, la condición es estrés que puede inducir que las células expresen una proteína de choque térmico, o una proteína de choque térmico aislada o recombinante, o un fragmento de la misma provisto exógenamente, en una cantidad eficaz para promover el tratamiento epitelial, la cicatrización, la reconstrucción, la exfoliación, la repigmentación y/o la regeneración en dicho paciente. En algunos ejemplos, la proteína de choque térmico exógena se puede proporcionar por separado o en combinación con la población de células al sitio receptor en el paciente. En ciertos ejemplos, el agente exógeno puede ser uno o más de ácido hialurónico, plasma enriquecido en plaquetas, factor(es) de crecimiento, citocina(s) y/o células madre adiposas.

En ciertas realizaciones, cuando la muestra de tejido epitelial es muestra de tejido de piel, las células viables pueden derivar de una capa dérmica, capa epidérmica, o ambas, una capa dérmica y una epidérmica de la muestra de tejido de piel, y la población de células puede comprender queratinocitos, melanocitos, fibroblastos, células de Langerhans, o cualquier combinación de los anteriores. En algunas realizaciones, la población de células puede incluir células madre de la piel y/u otras células de la piel.

La característica inducida por el estrés, citada en el presente documento, puede ser un nivel elevado de expresión de una proteína seleccionada del grupo que consiste en Hsp90 y Hsp90a. La característica inducida por el estrés se puede asociar a hipoxia, calor, traumatismo mecánico, privación de nutrientes, exposición a enzimas, u otra manipulación inducida por el estrés.

En ciertas realizaciones, cuando la muestra de tejido epitelial es muestra de tejido de piel, el procedimiento relacionado con el epitelio comprende el de tratamiento heridas de la piel, injerto de tejido de piel, procedimiento estético de piel, o tratamiento dérmico. La herida de la piel puede ser herida aguda, herida artificialmente creada o herida crónica. La muestra de tejido epitelial también se puede obtener de epitelio respiratorio, epitelio vascular, epitelio corneal o epitelio glandular, y las células derivadas de los mismos se pueden usar para tratar condiciones epiteliales correspondientes.

Otros aspectos y ventajas de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción, que sigue con referencia a los siguientes dibujos ilustrativos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 ilustra una estructura y composición típica de un tejido de piel.

La FIG. 2A ilustra una vista en perspectiva de un aparato a modo de ejemplo con la tapa abierta y un segundo miembro en su sitio.

La FIG. 2B ilustra una vista en perspectiva del aparato a modo de ejemplo con la tapa abierta y el segundo miembro quitado e invertido.

La FIG. 3A ilustra una vista en perspectiva de un primer miembro del aparato a modo de ejemplo.

La FIG. 3B ilustra una vista posterior en perspectiva del primer miembro del aparato a modo de ejemplo.

La FIG. 4 ilustra una vista en perspectiva de la base del aparato a modo de ejemplo.

La FIG. 5 muestra los resultados del ensayo de viabilidad celular de queratinocitos usando diferentes hidrogeles de ácido hialurónico.

La FIG. 6 muestra los resultados del ensayo de migración Transwell de queratinocitos usando diferentes hidrogeles de ácido hialurónico.

La FIG. 7 muestra los resultados del ensayo de escarificación in vitro de queratinocitos usando diferentes hidrogeles de ácido hialurónico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los expertos en la técnica apreciarán que las composiciones y los métodos descritos en el presente documento son adaptables a variaciones y modificaciones distintas de aquellas específicamente descritas. La divulgación también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos denominados o indicados en la memoria descriptiva, individualmente o conjuntamente, y todas y cada una de las combinaciones o cualesquiera dos o más de las etapas o características.

En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que las palabras "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implican la inclusión de un número entero establecido o grupo de números enteros, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

Teniendo en cuenta lo anterior, la presente divulgación proporciona un método y dispositivo único adecuados para producir una suspensión celular de tejido vivo adecuada para su aplicación a un paciente en un procedimiento relacionado con el epitelio. En la aplicación del método y/o en el uso del dispositivo, se recoge un tejido de donante (por ejemplo, epitelio de la piel, tal como epitelio glabro, epitelio respiratorio, epitelio vascular, epitelio corneal y epitelio glandular) de un paciente y se somete a un medio de disociación de tejido, y se recogen células adecuadas para su aplicación de nuevo a un sitio receptor del mismo paciente. En algunos ejemplos comparativos, las células así recogidas se pueden cultivar y expandir in vitro antes de la aplicación a un sitio receptor. Las células también se pueden sembrar en un armazón o matriz o sustrato donde las células pueden crecer y/o proliferar en un tejido u órgano regenerado.

En las realizaciones, las células incluyen células madre (por ejemplo, células capaces de dividirse o diferenciarse) y células no madre (por ejemplo, células en diversos estadios de diferenciación, que incluyen células diferenciadas y funcionantes). Varios órganos se basan en células madre y progenitoras no diferenciadas para la regeneración de tejido. Sin embargo, no está claro si las células madre residentes son capaces de regenerar toda la masa de tejido requerida para una lesión dada. Además, todavía no se han identificado las células madre para varios tejidos, y en los tejidos en los que se han identificado las células madre, no se entienden completamente los factores requeridos para inducir su propagación y diferenciación para adquirir los desenlaces de células en estos tejidos. Así, existe una necesidad de métodos de inducción de células diferenciadas bien definidas de identidad conocida que contribuyan a la sustitución de células y a la regeneración de tejido in vivo. La presente invención, que incluye tanto células madre como células no madre, en una suspensión de células, proporciona un medio para la regeneración mejorada de tejido.

Las células se pueden presentar en forma de una suspensión de células (usada indistintamente con "suspensión celular" en el presente documento) en una disolución que es adecuada para la dispersión inmediata (por ejemplo, inmediatamente después de la recogida y/o filtración sin cultivo in vitro de las células) en el sitio receptor. La suspensión de células se puede dispersar (inmediatamente después de la recogida o después del cultivo in vitro) en el sitio receptor solo o en combinación con factor(es) adicional(es), tales como proteína(s) de choque térmico, ácido hialurónico, plasma enriquecido en plaquetas, factor(es) de crecimiento y/o células madre adiposas, para facilitar, por ejemplo, la cicatrización, la exfoliación de la piel, u otros tratamientos epiteliales. La suspensión de células se puede dispersar por pulverización, goteo o cualquier otro proceso de aplicación. La suspensión de células también se puede inyectar directamente en un tejido.

La materia desvelada en el presente documento tiene muchas ventajas con respecto a las técnicas de injerto de tejido previamente conocidas, algunas de las cuales se ilustran del siguiente modo:

1. La invención objeto proporciona un método de tiempo eficiente para la preparación de una suspensión celular que puede ser fácilmente suministrada a un sitio receptor en un ámbito clínico. Por ejemplo, las células pueden ser rápidamente recogidas y procesadas cuando se necesite en el momento de la cirugía. Esto se logra por el tiempo de preparación muy corto de las células, que permite que el tratamiento epitelial se realice de forma perioperatoria o en la consulta de un médico especialista o médico general.

2. La divulgación proporciona un método y un aparato que reduce significativamente la complejidad asociada al uso de los métodos convencionales y es particularmente útil en casos de lesión urgente (por ejemplo, quemadura) que no han acudido al médico a tiempo. En algunos casos, las células para el injerto pueden estar no disponibles en el momento de la cirugía, ya sea debido a una derivación retardada de un paciente con una quemadura sin cicatrizar o simplemente debido a que el tiempo necesario para cultivar los autoinjertos había superado al de la preparación del lecho de la herida del receptor. La presente invención acelera significativamente la preparación de células y mejora el problema del tiempo de preparación de injertos en comparación con AEC.

3. La invención objeto ayuda a conseguir una rápida cobertura de células en áreas de sitios donantes a receptores. Proporciona un medio de reducción del tamaño de sitios donantes, ya que el sitio donante de la biopsia requerido para la presente invención es notablemente más pequeño que el sitio donante de un injerto requerido por los métodos convencionales. Como tal, la presente invención mejora la relación de expansión de la cobertura de células entre los sitios donante y receptores; también mejora la tasa de la cicatrización de heridas agudas (tales como quemaduras y laceraciones) y heridas crónicas (tales como úlceras venosas o diabéticas), es útil para las reconstrucciones de piel (tales como eliminación de cicatrices u otras indicaciones estéticas) y mejora la calidad de la cicatriz y/o minimiza la cicatrización.

4. La invención objeto mejora los problemas asociados al uso de medios o disoluciones usados durante el proceso convencional de cultivo de tejido que requiere suero xenogénico para el paciente. Según el método de preparación y tratamiento de la presente divulgación, las células pueden estar en forma de una suspensión de células, en una disolución nutritiva que está libre de suero xenogénico para el paciente. Dicha suspensión de células se puede entonces aplicar, dispersar o poner directamente sobre el sitio receptor, que reduce o elimina la probabilidad de infecciones, transmisiones virales u otras complicaciones asociadas al suero xenogénico.

5. La divulgación proporciona un medio para el tratamiento de diversas anomalías, trastornos o enfermedades de la piel. Por ejemplo, se puede usar para la exfoliación epidérmica, sustitución después de la pérdida de piel, emparejamiento de sitios durante la repigmentación de un área de piel, tratamiento de heridas por quemadura, tratamiento de leucoderma, tratamiento de vitiligo, tratamiento de piebaldismo, tratamiento de cicatrices (causadas por, por ejemplo, cicatrización incorrecta, dirección inadecuada de la cicatriz o distorsión de la cicatriz por contracción de la herida), tratamiento de cicatrices del acné, dermoabrasión cosmética por exfoliación, mejora de las indicaciones estéticas, tales como en procedimientos plásticos o reconstructivos, exfoliación después del tratamiento por láser y en asociación con reconstrucción dérmica, tratamiento de "herida" artificial donde la piel estaba intacta, pero se crea una "herida" (por ejemplo, por láser o quemadura dérmica o dermoabrasión, o en un sitio donante de injerto), aceleración de la cicatrización, reducción de infecciones y/o minimización de la cicatrización. Además, el método, la suspensión de células y la composición de la presente invención se pueden usar para la terapia de sustitución con células, que incluye, por ejemplo, tratamiento de sustitución con células nerviosas, tratamiento de sustitución con células epiteliales (tales como células uroteliales, células de la mucosa bucal y células epiteliales respiratorias), tratamiento de sustitución con células endoteliales y tratamiento de sustitución con células precursoras osteogénicas. Además, la presente invención se puede aplicar a cualquier procedimiento relacionado con el epitelio, que incluye epitelio de la piel y epitelio no de la piel, tal como epitelio glabro, epitelio respiratorio, epitelio vascular, epitelio glandular o epitelio corneal. Es decir, mientras que algunas realizaciones se describen a propósito de un procedimiento relacionado con la piel, lo mismo se puede aplicar a tejidos epiteliales no de la piel con ligeras modificaciones que están perfectamente dentro del nivel de las habilidades habituales en la técnica.

6. La invención objeto proporciona un medio para la producción de una suspensión de células de varios tipos diferentes, en donde la cantidad de cada tipo de células está en una relación con otra que es comparable con, o sustancialmente la misma que, la relación de los tipos de células detectables in situen el sitio donante y/o receptor del paciente. Es decir, debido al modo único de preparación de la suspensión celular, el porcentaje relativo de los diferentes tipos de células (en el caso de tejido de la piel, tal como queratinocitos, células de Langerhans, fibroblastos y melanocitos) tiene normalmente el mismo porcentaje que el sitio donante de donde se recogen las células (en el caso de tejido de la piel, cerca de la zona dérmica-epidérmica). Las células así preparadas también tienen tasas de supervivencia mejoradas en comparación con las técnicas habituales de cultivo de tejido, donde el cultivo habitual de células selectivas puede dar como resultado la pérdida de ciertos tipos de células, mientras que otros tipos de células las superan. Esto proporciona, por ejemplo, la ventaja de permitir la correcta exfoliación o repigmentación de la piel después de un injerto de piel u otro tratamiento o procedimiento.

7. La invención objeto permite una cirugía y cicatrización más rápida, reduciéndose así el traumatismo para pacientes durante el cuidado médico.

8. La invención objeto proporciona, en el caso de tejido de la piel, una suspensión de células madre de la piel. Debido a que las células madre de la piel se encuentran, en general, en la capa basal de la epidermis y en la base de los folículos pilosos, la presente invención permite la recogida dirigida de estas células de cerca de la zona dérmica-epidérmica y de las capas dérmica y/o epidérmica de la piel. Las células madre de la piel pueden incluir células madre epidérmicas y células madre foliculares. Normalmente, las células madre epidérmicas son responsables de la regeneración de las diferentes capas de la epidermis. Las células madre de melanocitos dan lugar a melanocitos, y las células madre foliculares pueden dar lugar a tanto el folículo piloso como a la epidermis.

Además, la base de los folículos pilosos también es una fuente rica de melanocitos, que puede ser útil para la cicatrización y se puede incluir en la suspensión de células de la presente invención.

Preparación de suspensión de células

Según un aspecto de la invención, se proporciona un método de preparación de una suspensión de células adecuada para su uso en el tratamiento, la cicatrización, la reconstrucción, la exfoliación y/o la regeneración de tejidos epiteliales.

El tejido de la piel (preferentemente de una naturaleza autóloga para el paciente receptor) se puede recoger de un paciente por medios conocidos en la técnica del injerto o la regeneración de tejido. Esto se puede lograr tomando una biopsia de espesor completo o de espesor parcial de un sitio donante del paciente. Con la recogida de la biopsia se considera la profundidad de la biopsia y el tamaño del área superficial. La profundidad y el tamaño de la biopsia pueden afectar la facilidad con la que se pueda realizar el procedimiento y/o la velocidad con la que el paciente se recupera del procedimiento. El sitio donante se puede elegir para que corresponda con el sitio receptor, por ejemplo, tejido retroauricular para la cabeza y el cuello, el muslo para extremidades inferiores, parte interna del brazo para las extremidades superiores, o la palma para la planta o viceversa.

La biopsia o muestra de tejido recogida del sitio donante se puede someter entonces a medios de disociación físicos y/o químicos capaces de disociar el estrato celular en la muestra de tejido, rompiendo así la muestra de tejido en trozos más pequeños, o al menos haciendo las diferentes capas (por ejemplo, la dermis y la epidermis) de la muestra de tejido más fácilmente separables.

Se pueden usar diversos métodos para la disociación de capas celulares dentro de los tejidos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los medios de disociación pueden ser o un medio físico o uno químico, o una combinación de ambos. Los medios de disociación físicos pueden incluir, por ejemplo, raspar la muestra de tejido con un bisturí, trocear el tejido, separar físicamente las capas, usando una mano de mortero o mortero con malla o rallador para la disociación, y/o perfudir el tejido. Los medios de disociación química pueden incluir, por ejemplo, digestión con enzimas, tales como tripsina, dispasa, colagenasa, tripsina-EDTA, termolisina, pronasa, hialuronidasa, elastasa, papaína y pancreatina. También se pueden usar disoluciones no enzimáticas para la disociación del tejido.

En ciertas realizaciones, la disociación de la muestra de tejido se puede lograr poniendo la muestra de tejido en una disolución de enzimas que contiene una cantidad de enzima suficiente para disociar el estrato celular en la muestra de tejido. Esto se puede lograr, por ejemplo, usando una disolución de tripsina. También se pueden usar otras enzimas o proteasas, tales como dispasa, colagenasa, tripsina-EDTA, termolisina, pronasa, hialuronidasa, pancreatina, elastasa y papaína. Aunque no se desea quedar ligado a teoría, se cree que dichas enzimas provocan que las células se desprendan de otras células o de superficies sólidas por proteólisis de proteínas extracelulares. Cuando la enzima usada es tripsina, la disolución de enzimas puede ser calcio y magnesio libre. Una disolución tal es, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato sin ion calcio ni magnesio.

Donde la muestra de tejido deriva de la piel de un paciente (que comprende tanto epidermis como dermis), la cantidad de tripsina u otra enzima usada en el método puede ser entre aproximadamente el 0,1 % y el 5 % de tripsina u otra enzima por volumen de disolución. En ciertas realizaciones, la concentración de tripsina u otra enzima puede ser desde aproximadamente el 0,25% hasta el 2,5%, o de aproximadamente el 0,5 %. Los expertos habituales en la técnica entenderán que la experimentación de la concentración opcional de la enzima es experimentación rutinaria.

La cantidad de tiempo durante la que la muestra de tejido se somete a la disolución de enzima puede variar dependiendo del tamaño de la muestra (por ejemplo, espesor y área superficial). Normalmente, cuanto más grande sea el tamaño de la muestra, más tiempo se deberá someter la muestra a la disolución de enzima. En algunas realizaciones, la muestra de tejido se puede disponer en la disolución durante un tiempo suficiente para debilitar la unión o el enlace entre las capas de tejido (por ejemplo, entre la epidermis y dermis). Por ejemplo, donde la muestra de tejido se toma de la piel de un paciente, la muestra se podría disponer en la disolución de enzima desde algunos segundos hasta algunas horas, o durante un periodo de 5 a 60 minutos. Preferentemente, la muestra de tejido se sumerge en la disolución de enzima durante entre 10 y 30 minutos o 15 y 20 minutos. Los expertos habituales en la técnica entenderán que la experimentación del tiempo óptimo del tratamiento con enzima es experimentación rutinaria.

Después de sumergir la muestra de tejido en la disolución de tripsina (u otra disolución de enzima) durante un tiempo suficiente, la muestra se puede sacar de la disolución y lavar con una disolución nutritiva. El lavado de la muestra de tejido puede implicar la inmersión parcial o completa de la muestra tratada con enzimas en la disolución nutritiva. Alternativamente, la disolución de lavado se puede añadir gota a gota o dispersar sobre la muestra de tejido en un volumen suficiente para retirar y o diluir significativamente el exceso de disolución de enzima de la muestra de tejido. En ciertas realizaciones, después de la dilución o el lavado, no queda más de 0,05 % de tripsina u otra enzima.

La disolución nutritiva puede reducir o eliminar significativamente el efecto de la enzima por dilución y/o neutralización. La disolución nutritiva puede ser: (i) sin suero xenogénico para el paciente, (ii) capaz de mantener la viabilidad de las células recogidas, y (iii) adecuada para la aplicación directa a un sitio receptor en el paciente. La disolución nutritiva puede ser cualquiera de una disolución de sal básica a una disolución nutritiva más compleja. En algunas realizaciones, la disolución nutritiva puede contener diversas sales que se parecen a las encontradas en los líquidos corporales, tales como una solución salina fisiológica. La disolución nutritiva puede ser sin suero. El fosfato u otras sustancias no tóxicas también pueden tamponar la disolución para mantener el pH en niveles aproximadamente fisiológicos. Una disolución nutritiva adecuada es la disolución de Hartmann.

Después de lavar la muestra de tejido con la disolución nutritiva, la muestra de tejido se puede raspar suavemente, permitiendo recoger células viables y funcionantes de la muestra de tejido. Las células pueden incluir células madre capaces de reproducción (por ejemplo, divisoras o diferenciación), así como células madre no diferenciadas que realizan funciones específicas (por ejemplo, la función de melanocitos para producir melanina). Una ventaja de la presente invención es la inclusión de células no madre que son funcionantes, que pueden ayudar a promover el tratamiento, la cicatrización, la reconstrucción, la exfoliación, la repigmentación y/o la regeneración de tejidos epiteliales. Donde la muestra de tejido es piel, primero se puede raspar la capa de la epidermis para exponer la unión dérmica-epidérmica donde se encuentran la superficie más baja de la epidermis y la superficie más alta de la dermis; entonces también se pueden raspar las células en la unión dérmica-epidérmica y la capa dérmica. Las células así recogidas incluyen tanto las células madre de la piel como las células no madre.

Como se muestra en la FIG. 1, la epidermis de la piel contiene queratinocitos, melanocitos, células de Langerhans y células de Merkel. La epidermis forma la superficie de la piel. Está constituida por varias capas de células denominadas queratinocitos. Los queratinocitos en la capa o estrato basal o germinativo (también conocidas como células basales de queratinocito o queratinocitos basales) experimentan mitosis y proliferan. Los queratinocitos que experimentan la diferenciación se mueven progresivamente al estrato espinoso, donde se vuelven de forma poliédrica y empiezan a producir tonofilamentos. Los queratinocitos son el tipo de célula más abundante en la epidermis. Los melanocitos se localizan en la capa basal de la epidermis y allí representan de cada quinta a cada décima célula. Los melanocitos producen el pigmento melanina y, por tanto, desempeñan una función importante en la pigmentación de la piel y de folículos pilosos. Las células de Langerhans residen suprabasalmente, y representan aproximadamente el 1 % de las células epidérmicas.

Todavía con referencia a la FIG. 1, la dermis está debajo de la epidermis y contiene anejos cutáneos: folículos pilosos, glándulas sebáceas (aceite) y glándulas sudoríparas. Los tipos de células en la dermis incluyen fibroblastos dérmicos, que producen matriz de soporte intercelular (por ejemplo, colágenos y elastina) y pueden tener una función en la cicatrización, así como mastocitos, macrófagos, melanocitos, células de Merkel y células que pertenecen al sistema inmunitario y los anejos cutáneos.

Las células capaces de reproducción pueden incluir células madre de la piel y/o fibroblastos. Las células madre de la piel pueden incluir células madre epidérmicas, células madre de melanocitos y células madre foliculares. Las células madre epidérmicas se encuentran en la capa basal de la epidermis y son responsables de la regeneración diaria de las diferentes capas de la epidermis. Las células madre de melanocitos son responsables de la regeneración de los melanocitos. Las células madre foliculares garantizan la constante renovación de los folículos pilosos y también pueden regenerar la epidermis y las glándulas sebáceas si estos tejidos están dañados. Las células madre de los folículos pilosos se encuentran en todos los folículos pilosos.

Las células recogidas de la muestra de piel completa, incluidas la epidermis, la dermis y la unión dérmica-epidérmica, pueden así incluir células madre de la piel y/o fibroblastos. En ciertas realizaciones, las células recogidas pueden incluir queratinocitos, células madre de melanocitos, melanocitos, fibroblastos y/o células de Langerhans. Estas células se pueden recoger de la muestra de tejido por cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden raspar de la superficie de la muestra, empezando desde la epidermis hasta que sustancialmente se recojan todas las células en la muestra, usando un instrumento tal como un bisturí. Las células también se pueden desagregar siendo forzadas a pasar a través de un tamiz de malla de tamaño apropiado. En una realización, las células así recogidas incluyen queratinocitos, células de Langerhans, fibroblastos y melanocitos. Después de la recogida de las células de la muestra de tejido, están presentes en la disolución nutritiva en una forma en suspensión (por ejemplo, dispersadas).

Entonces se puede filtrar la suspensión celular. El filtrado se puede usar para retirar o recoger los congregados celulares excesivamente grandes, de manera que se prevenga la obstrucción del aplicador y se facilite una distribución homogénea de la suspensión celular en el sitio receptor. Se puede usar cualquier medio de filtración capaz de separar los congregados celulares excesivamente grandes de la suspensión en esta etapa preferida de la invención. En una realización, el tamaño de filtro puede ser entre 50 gm y 200 gm, entre 75 gm y 150 gm, o de aproximadamente 100 gm.

Antes de la aplicación/dispersión al sitio receptor o inmediatamente después del filtrado, la suspensión celular se puede diluir para producir una densidad celular apropiada adecuada para el fin para el que se va a usar la suspensión.

Uso de la suspensión de células

Según otro aspecto de la invención, se proporciona una suspensión acuosa de células producida por el método descrito en el presente documento. La suspensión de células proporcionada por este método es adecuada para su uso en diversos procedimientos relacionados con el epitelio. Una ventaja importante de la utilización de dicha suspensión en procedimientos relacionados con el epitelio es la posibilidad de expandir enormemente el área o el tamaño o el volumen de una herida o sitio receptor que se puede tratar rápidamente por multiplicación in situ de un número limitado de células capaces de reproducción. Donde participa la piel, el procedimiento relacionado con el epitelio puede ser el tratamiento de heridas de la piel, injerto de tejido de piel, procedimiento estético de piel, u otro tratamiento epidérmico y/o dérmico. La aplicación de la suspensión de células uniformemente sobre la herida imita la capacidad de cicatrización de la piel prenatal, de forma que la herida pueda cicatrizar uniformemente y cerrarse rápidamente con cobertura completa por la suspensión de células, dando como resultado estructura y función optimizadas. La herida de la piel puede ser una herida aguda (por ejemplo, quemadura o laceración provocada por traumatismo), herida artificialmente creada (por ejemplo, en un sitio donante de injerto, indicación estética, procedimiento plástico o tratamiento dérmico) o herida crónica (por ejemplo, úlceras venosas o diabéticas). Otras indicaciones adecuadas incluyen la remodelación cicatricial, lesiones por pérdida de piel glabra, problemas de pigmentación, vitiligo, leucoderma y procedimientos de rejuvenecimiento cosmético. En diversos ejemplos, el número y/o la concentración de células sembradas en el sitio receptor puede variar dependiendo del procedimiento y/o sitio receptor, por ejemplo, modificando la concentración de células en la suspensión, y/o usando una cantidad apropiada de suspensiones que se distribuyen sobre un área dada o volumen del sitio receptor.

Poniendo las células en una disolución nutritiva que es al menos (i) sin suero xenogénico para el paciente, (ii) capaz de mantener la viabilidad de las células recogidas y (iii) adecuada para la aplicación directa a un sitio receptor en el paciente, se ha encontrado que mejora el desenlace del tratamiento del paciente. No deseando quedar ligado a teoría, una explicación parcial puede ser atribuible a la exclusión de suero xenogénico y, en ciertas realizaciones, cualquier suero de la suspensión de células. El suero xenogénico es un aditivo común en el medio de cultivo de injerto habitual y se sospecha que provoca posibles problemas infecciosos y de hipersensibilidad. Sin embargo, dicho suero se requiere, en general, para la expansión in vitro habitual de las células y para neutralizar la acción de la tripsina. La disolución nutritiva usada en la presente invención no requiere dicho suero debido a que la población de células dentro de la suspensión no requiere la expansión o multiplicación antes de la aplicación al sitio receptor. Más bien, la multiplicación celular ocurre en el sitio receptor a diferencia de en un sistema de cultivo in vitro. Aunque se desea el cultivo in vitro, que no es según la invención, también se puede usar un medio sin suero, opcionalmente complementado con factores de crecimiento adecuados, agentes tales como ácido hialurónico y/o proteínas recombinantes, tales como proteínas de choque térmico y angiopoyetinas.

Además, la disolución nutritiva puede contener agente(s) exógeno(s) o componente(s), tales como proteína(s) de choque térmico, ácido hialurónico, plasma enriquecido en plaquetas, factor(es) de crecimiento, citocina(s) y/o células madre adiposas, de forma que la composición final para la dispersión al sitio receptor pueda contener dicho(s) agente(s). Alternativamente, dichos agentes se pueden suministrar por separado al sitio receptor. Uno o más de estos agentes se puede complementar a un sistema de cultivo in vitro (en un cultivo celular o donde las células se siembran en una matriz extracelular biológica o sintética o sustrato). Las proteínas de choque térmico y el ácido hialurónico se describen con más detalle en el presente documento. El plasma enriquecido en plaquetas (también denominado PRP) es plasma sanguíneo que se ha enriquecido con plaquetas obtenidas retirando glóbulos rojos de la sangre periférica por separación centrífuga a una baja velocidad. El PRP contiene una gran cantidad de factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) contenido en la plaqueta, factor de crecimiento transformante p (TGF-p), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) o factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), y tiene efectos tales como la angiogénesis, la osteogénesis, la promoción de la cicatrización o la regeneración de tejido por una acción sinérgica de estos factores. Los factores de crecimiento y las citocinas útiles incluyen factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante-a y -p, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento de fibroblastos 1 y 2, factor de crecimiento similar a la insulina 1 y 2, interleucina 8, factor de crecimiento de tejido conjuntivo y factor de crecimiento de queratinocitos. Las células madre adiposas incluyen diversas células madre que tienen potenciales proliferativos y de diferenciación recogidas de tejidos adiposos. Las células madre adiposas pueden sufrir diferenciación adipogénica, osteogénica, condrogénica, neurogénica y/o miogénica in vitro. El (Los) agente(s) exógeno(s) o componente(s) también se pueden suministrar en una etapa separada.

Otra característica única de la suspensión de células producida según el método de la presente invención es que la composición de células en la suspensión celular es comparable a, es decir, similar a o sustancialmente la misma que, la composición in situ del sitio donante (por ejemplo, adyacente a la unión dérmica-epidérmica en el caso de la piel). Una posible explicación es que en las técnicas convencionales, el cultivo de la preparación de piel celular utiliza cultivo selectivo de queratinocitos, dando como resultado la pérdida parcial o completa de constituyentes celulares, tales como fibroblastos y melanocitos en el caso de la piel. Por el contrario, la suspensión celular producida según la presente invención tiene una composición de células, es decir, relación o porcentaje relativo de diferentes tipos de células, similar a o sustancialmente la misma que la composición de células in situ. Otra característica de la suspensión celular producida según la presente invención es que las células han mantenido una alta viabilidad, ya que experimentan etapas de tratamiento mínimas y tiempo de recogida mínimo, y se recogen en una disolución nutritiva suave.

Se proporciona un método de tratamiento de un paciente en necesidad de un procedimiento relacionado con el epitelio. Por este método, la suspensión celular producida según la presente invención se puede aplicar directamente, después de la recogida y el filtrado, a un sitio receptor del paciente. El sitio receptor puede ser un sitio de herida aguda (por ejemplo, quemadura o laceración provocada por traumatismo), herida artificialmente creada (por ejemplo, en un sitio donante de injerto, indicación estética, procedimiento plástico o tratamiento dérmico), o herida crónica (por ejemplo, úlceras venosas o diabéticas). El sitio receptor puede ser cualquier lecho de la herida preparado, que incluye la tradicional "región donante" en un procedimiento de injerto habitual del que se toma la piel, la "región receptora" tradicional que requiere el injerto de piel tradicional, así como el lecho de la herida en pacientes que no requieren un injerto de piel tradicional. Por ejemplo, quemaduras o heridas relativamente secundarias que no requieren una cirugía de injerto tradicional por el tratamiento habitual se pueden tratar por el procedimiento de "injerto celular" de la presente divulgación. Dicho injerto celular se puede aplicar como procedimiento independiente, o en combinación con o complementario a la cirugía de injerto tradicional. Por ejemplo, donde se usa un tejido de injerto con malla en un injerto tradicional, la suspensión de células de la presente invención se puede aplicar al injerto con malla para mejorar la regeneración epitelial.

El procedimiento relacionado con el epitelio que se puede tratar por el injerto celular de la presente invención incluye, sin limitación, tratamiento de herida de la piel, injerto de tejido de piel, tratamiento de enfermedad de la piel (por ejemplo, vitiligo o leucoderma, y úlceras crónicas), procedimiento estético de la piel (por ejemplo, arrugas y cicatrices por acné), u otro tratamiento epidérmico y/o dérmico.

Una suspensión líquida que contiene células de la presente invención se puede distribuir sobre el sitio receptor por cualquiera de varias técnicas, que incluyen, sin limitación, pulverización, extensión, pipeteado y/o pintado. Por tanto, la suspensión se puede aplicar a un apósito para heridas que entonces se aplica a la herida, o se introduce debajo de un apósito in situ, o se siembra en un apósito antes de la aplicación. En un ejemplo, la suspensión de células se puede pulverizar sobre un sitio receptor. La suspensión se puede pulverizar a través de cualquier tipo de boquilla que transforme el líquido en pequeñas gotitas atmosféricas. Este ejemplo está sujeto a dos consideraciones. Primera, las células en la disolución no se deben someter a un exceso de fuerzas de cizallamiento o presiones que puedan dañar o destruir un número sustancial de células. Segundo, la suspensión celular no se debe mezclar con un fluido propulsor que sea tóxico o perjudicial para las células en él o el lecho de la herida. Una variedad de boquillas que están comúnmente disponibles es adecuada para su uso. Dichas boquillas se pueden conectar en cualquier forma adecuada a un depósito que contiene la suspensión celular.

Alternativamente, la suspensión de células se puede suministrar mediante una pipeta, un dispositivo de tipo cuentagotas, una jeringa y aguja, y/u otros dispositivos similares para poner pequeñas cantidades de la suspensión de células en un sitio receptor. La suspensión de células también se puede inyectar en el tejido en el sitio receptor.

Después de que la suspensión de células se haya aplicado al sitio receptor, el sitio o el lecho de la herida se pueden cubrir con un apósito para heridas. Se pueden usar diversos tipos de apósitos, que incluyen películas (por ejemplo, películas de poliuretano), hidrocoloides (partículas coloidales hidrófilas unidas a espuma de poliuretano), hidrogeles (polímeros reticulados que contienen aproximadamente al menos 60 % de agua), espumas (hidrófilas o hidrófobas), alginatos de calcio (materiales no tejidos compuestos de fibras de alginato de calcio), derivados de ácido hialurónico (por ejemplo, ésteres) y celofán (celulosa con un plastificante). Véase Kannon et al., Dermatol. Surg. 21:583-590 (1995); Davies, Burns 10:94 (1983). En un ejemplo, el apósito puede ser Surfasoft™ que es un apósito de nailon tejido o Hyalomatrix® que es una matriz de éster de ácido hialurónico. En general, la cicatrización del lecho de la herida se sigue por protocolos convencionales para el tratamiento de injertos de piel conocidos por los expertos en la técnica.

La suspensión de células de la presente invención también se puede aplicar a un sistema de regeneración de tejidos u órganos (in vivo o in vitro), tal como a una matriz extracelular o material de matriz (por ejemplo, como en el recrecimiento de la tráquea). En diversas realizaciones, la matriz extracelular o el material de matriz usado pueden ser sintéticos o biológicos, tales como colágeno, alginato, perlas de alginato, agarosa, fibrina, pegamento de fibrina, fibrinógeno, plasma sanguíneo, perlas de fibrina, plasma completo o componentes del mismo, lamininas, fibronectinas, proteoglicanos, HSP, quitosano, heparina y/u otros polímeros sintéticos o armazones de polímero y materiales de soporte sólido, tales como apósitos para heridas, que podrían sujetarse o adherirse a las células. En ciertas realizaciones, la suspensión de células como se aplica al sistema de regeneración puede facilitar la regeneración epitelial acto seguido. Tras completarse, el sistema regenerado se puede trasplantar a un paciente en necesidad del mismo.

Dispositivo para la preparación y uso de la suspensión de células

Se proporciona un aparato para desarrollar una disolución de regeneración de tejido. El aparato puede tener un medio calefactor adecuado para calentar una disolución de enzima hasta una temperatura predeterminada y capaz de mantener esa disolución a la temperatura deseada durante una cantidad adecuada de tiempo. El aparato también puede incluir un medio de filtración, que es capaz de separar grandes congregados celulares (por ejemplo, que tienen un diámetro mayor de aproximadamente 200 pm) de una suspensión celular.

El aparato también puede incluir un depósito capaz de contener una muestra de tejido sumergida en una disolución nutritiva capaz de mantener la viabilidad de las células en la muestra de tejido. El depósito puede ser de tamaño suficiente para permitir la manipulación de la muestra de tejido, por ejemplo, permitir la separación del estrato celular de tejido (por ejemplo, epidermis y dermis) y recoger las células de la epidermis y/o dermis, produciendo así una suspensión de células para su uso en un procedimiento relacionado con el epitelio.

El aparato también puede incluir uno o más pocillos de contención de líquido o bolsas para el almacenamiento de líquidos, tales como la disolución nutritiva. Los pocillos pueden servir alternativamente de receptáculo para un recipiente, tal como un vial de plástico o de vidrio que contiene la disolución nutritiva. Preferentemente, el pocilio es capaz de contener al menos un volumen de 10 mL. Dichos pocillos permiten la conveniente aplicación de los líquidos a la muestra de tejido. El almacenamiento de dichos líquidos en estrecha proximidad también proporciona la ventaja de reducir el riesgo de fuga accidental de los líquidos y permite el fácil acceso a los líquidos para la precisa administración a cualquiera de la muestra de tejido o la suspensión de células.

El aparato puede incluir un primer y segundo miembro en donde:

(1) el primer miembro incluye:

(a) al menos un medio calefactor adecuado para calentar una disolución de enzima hasta una temperatura predeterminada y capaz de mantener esa disolución a la temperatura deseada durante una cantidad adecuada de tiempo;

(b) al menos un medio de filtración capaz de separar grandes congregados celulares de una suspensión celular; y

(c) al menos un recipiente de líquido para el almacenamiento de una disolución nutritiva;

(2) el segundo miembro forma un depósito capaz de contener una muestra de tejido sumergida en la disolución nutritiva; y

en donde el primer miembro proporciona un asiento sobre que el que se puede disponer el segundo miembro durante la manipulación de la muestra de tejido.

El primer miembro puede proporcionar un compartimento de almacenamiento en el que se pueden almacenar las herramientas y las disoluciones usadas en los métodos descritos en el presente documento. Donde dicho compartimento se proporciona en el aparato, el segundo miembro puede proporcionar la tapa o cierre para ese compartimento. En uso, la tapa se puede quitar de la parte superior del compartimento y se puede invertir. La parte inferior de la tapa forma preferentemente el depósito en ella, que permite que el segundo miembro tenga un fin doble. Se puede acceder a las herramientas y las disoluciones usadas en el método desde el compartimento. Entonces se puede volver a colocar la tapa invertida sobre el compartimento, proporcionando el depósito para el aparato.

El aparato se puede fabricar de metal, plástico o cualquier otro material adecuado. Además, el recipiente puede ser de cualquier tamaño adecuado, dependiendo de su uso previsto y la necesidad de esterilización, tal como por irradiación gamma y/o tratamiento con óxido de etileno.

Se debe apreciar que el medio calefactor empleado en el aparato puede ser una almohadilla o almohadillas calefactoras encima del primer miembro. Para evitar el vertido accidental del recipiente que se calienta, en un ejemplo, se pueden alojar uno o más medios calefactores dentro de una cavidad en el primer miembro. También puede estar localizado dentro de esa cavidad al menos un recipiente en el que se puede colocar la muestra de tejido para la exposición a la disolución de enzima. En un ejemplo alternativo, uno o más medios calefactores se pueden alojar en la base del aparato. En dicha configuración, el primer miembro puede contener al menos una abertura para recibir un recipiente para contener un líquido, abertura que puede proporcionar el acceso a los medios calefactores del recipiente.

Se apreciará que, si el aparato se diseña para múltiples usos, el medio calefactor se puede calentar y enfriar repetidamente. Alternativamente, se pueden proporcionar múltiples unidades calefactoras con el aparato para facilitar múltiples acontecimientos calefactores, donde cada unidad calefactora se puede diseñar para un solo uso.

En una configuración a modo de ejemplo del aparato, se puede localizar un collar calefactor dentro de una cavidad, que forma una cavidad calefactora en el primer miembro dentro de la cual se localiza un recipiente (por ejemplo, un vial) para la enzima. El recipiente se puede mantener en el sitio por al menos un medio inmovilizador, que rodea preferentemente al menos parte de la porción superior del recipiente, previniendo así que se suelte accidentalmente el recipiente del aparato. En ciertos ejemplos, donde el aparato está previsto para un solo uso, el medio inmovilizador puede estar formado como una parte esencial del primer miembro, así el recipiente no se puede quitar a menos que se rompa o dañe físicamente el primer miembro.

El medio calefactor usado en el aparato se puede controlar por circuitería que permite la activación del elemento calefactor, si se requiere. Por ejemplo, el medio calefactor se puede encender pulsando un botón de encendido situado, por ejemplo, en la superficie del primer miembro, o por una interfaz de usuario de pantalla táctil. Alternativamente, el medio calefactor se puede activar presionando el recipiente hacia abajo con fuerza suficiente para activar un interruptor situado en la base del aparato. Un experto habitual en la técnica apreciará que se puede usar una amplia variedad de medios electrónicos para activar la unidad calefactora proporcionada en el aparato.

La unidad calefactora también se puede unir operativamente a un mecanismo de cronómetro, que se puede adaptar para calentar la disolución de enzima durante un periodo de tiempo predefinido. En ciertos ejemplos, donde el aparato está previsto de múltiples usos, se puede poner el cronómetro para que se desactive el elemento calefactor cuando transcurra una cantidad predeterminada de tiempo. Entonces se puede activar una alarma para informar al usuario de que se acabó el tiempo. La alarma puede ser audible o en forma de una visualización de luz.

En un ejemplo preferido adicional, el medio calefactor se puede proveer de un control de temperatura ajustable. Donde se requiera el ajuste de la temperatura, dicho ajuste se puede lograr adaptando la circuitería del control calefactor para que incluya o se comunique con un mecanismo de control de la temperatura que permita que la temperatura de la unidad calefactora sea constantemente variada dentro de un intervalo constante, o puede presentar un intervalo de temperaturas seleccionadas al que se puede establecer el medio de control calefactor. Se puede incluir un medio de control de la temperatura en el aparato donde el aparato se va a usar en la recogida y la preparación de diferentes tipos de células y/o donde se usan diferentes enzimas en el método de recogida para el que el aparato tiene aplicación única.

En algunos ejemplos, el aparato se puede diseñar para un único uso. En dichos casos, el mecanismo de cronómetro puede ser parte de la circuitería que controla el medio calefactor. Una vez se ha activado el medio calefactor, calienta la disolución durante un periodo de tiempo predefinido y entonces se autodestruye. Se debe apreciar por los expertos en la técnica que dicho aparato se puede ajustar con diversos medios de monitorización que son capaces de indicar uno o más de: la disolución de enzima ha alcanzado la temperatura predeterminada; la cantidad de tiempo que la enzima ha estado en la disolución; y/o la cantidad de tiempo que queda antes de que la circuitería se autodestruya. A modo de ejemplo solo, el medio de monitorización podría consistir en una serie de LED que se activan cuando ocurren ciertos acontecimientos. En un ejemplo, el elemento calefactor permanece en el modo calefactor durante un máximo de 45 minutos a 1 hora.

El medio calefactor puede ser alimentado por cualquier medio conocido en la técnica. Preferentemente, la fuente de alimentación se proporciona por pila/pilas. En un ejemplo, la fuente de alimentación es una pila o una pluralidad de pilas situada en la base del aparato.

En un ejemplo adicional, el aparato se puede proveer de uno o más medios para facilitar la mezcla de las disoluciones usadas en la invención, por ejemplo, una disolución de enzima. A este respecto, y a modo de ejemplo solo, el aparato puede incluir un medio para agitar con vórtex la disolución, tal como un sistema electromagnético que está adaptado para agitar una perla magnética. Donde el aparato incluya un sistema de mezcla electromagnético, la perla magnética se puede proporcionar en el recipiente (por ejemplo, un vial) en el que la disolución se almacena en el aparato. Alternativamente, la perla magnética se puede añadir a la disolución cuando se desea la mezcla.

En un ejemplo, los medios de mezcla se pueden combinar con el medio calefactor, ya sea como una unidad única o como unidades separadas para facilitar el calentamiento constante de la disolución en un modo homogéneo. Usando dichos medios de mezcla se puede evitar el sobrecalentamiento de la disolución más próxima a la unidad calefactora, mientras que la disolución se calienta. Dicho sistema puede proporcionar un calentamiento constante de la disolución. Se conocen en la técnica medios alternativos para mezclar la disolución e incluyen, por ejemplo, medios mecánicos, físicos, eléctricos y electromagnéticos. Aunque se puede emplear cualquier medio de mezcla en el aparato, el medio de mezcla es preferentemente cualquiera seleccionado para minimizar la vibración del aparato o se incorpora en el aparato de un modo que se minimice dicha vibración. A este respecto, el medio de mezcla puede ser alojado en uno o más amortiguadores de la vibración o el aparato puede incluir uno o más amortiguadores de la vibración en su base.

Donde un medio de mezcla se incorpora en el aparato, el medio se puede activar automáticamente con la activación de la unidad calefactora, o alternativamente puede ser un sistema de activación separado. Además, la velocidad de mezcla puede ser fija o variable. Preferentemente, hay un sistema de activación separado para los medios de mezcla.

Puede haber una cavidad de filtro incorporada en el aparato, puede ser de cualquier tamaño o forma que facilite el filtrado de una suspensión celular para retirar o recoger grandes congregados celulares (por ejemplo, mayores de 200 pm, mayores de 150 pm o mayores de 100 pm). Además, la cavidad se puede adaptar para recibir y contener al menos un tubo o vial en el que se pueda filtrar la suspensión de células. La cavidad puede tener una base cónica que proporciona el fácil acceso al volumen completo de la suspensión de células después del filtrado. El medio de filtración también puede ser un filtro en línea.

En algunos ejemplos, se diseña una cavidad para recibir un filtro de células de 100 pm que es capaz de retirar o recoger congregados celulares mayores de aproximadamente 100 pm. El uso del filtro también puede prevenir que el pulverizador/boquilla se obstruya por los grandes congregados. La cavidad puede alojar un filtro de células de 100 pm conectado a un tubo cónico. Preferentemente, el tubo tiene graduaciones de área/volumen marcadas en un lado.

El aparato también puede incluir un conjunto de herramientas requeridas para la recogida de células. Se apreciará por los expertos en la técnica que en el dispositivo se puede incluir cualquier herramienta necesaria para la recogida de células. Preferentemente, el conjunto de herramientas es estéril. Como un ejemplo, el conjunto de herramientas puede incluir un recipiente de vidrio de enzima de separación; una disolución estéril para la suspensión de la enzima; una disolución nutritiva estéril; bisturí; pinzas; jeringa; cuentagotas para medicina, filtro de células; apósitos para heridas y/o boquillas de pulverización. En un ejemplo, el conjunto de herramientas se almacena en un compartimento formado en el primer miembro del aparato, que se cubre por el segundo miembro cuando no está en uso.

En un ejemplo, el aparato se usa para recoger y preparar una suspensión de células, y además para aplicar la suspensión de células a un sitio receptor en cualquier modo adecuado.

Por ejemplo, se puede mezclar una alícuota de agua estéril con una porción de enzima de separación liofilizada y disponer en la cavidad calefactora. Entonces se activa el medio calefactor que calienta el contenido (es decir, la disolución de enzima) del recipiente hasta una temperatura de trabajo de entre aproximadamente 30 y 37 °C, preferentemente entre aproximadamente 33 y 37 °C, o a modo de ejemplo aproximadamente 37 °C, dentro de un corto tiempo (por ejemplo, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 3 minutos, aproximadamente 2 minutos, o aproximadamente 1 minuto) y mantiene la temperatura de trabajo durante un tiempo suficiente para permitir que progrese la digestión de la enzima (por ejemplo, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 0 minutos, o más largo o más corto). Una vez se ha alcanzado una temperatura operacional, una muestra de tejido tomada de un sitio donante se pone en la disolución de enzima y se incuba a la temperatura de trabajo. La muestra de tejido se incuba durante un tiempo suficiente (por ejemplo, entre 5 a 60 minutos, entre 10 a 45 minutos, entre 20 y 30 minutos, o más o menos). Los expertos en la técnica apreciarían entonces que el momento necesario para lograr la separación de las capas de la muestra de tejido depende del espesor y del tamaño de la muestra de tejido y la temperatura de incubación, y se puede determinar por experimentación rutinaria. Una vez se logra la separación enzimática de las capas de tejido, la muestra de tejido se retira, se aclara con una disolución nutritiva y se pone en el depósito donde las capas de tejido se mantienen en el sitio usando instrumentos quirúrgicos, tales como pinzas.

Entonces se extrae una alícuota cuidadosamente medida de la segunda disolución (por ejemplo, una disolución nutritiva) del pocillo de contención de líquido por aspiración en una jeringa y luego se aplica a las capas. Se raspan las células de toda la muestra de tejido (por ejemplo, que incluye epidermis, dermis y la unión dérmica-epidérmica) usando un bisturí, y se suspenden mezclando con la disolución nutritiva. Entonces se recoge la suspensión de células, preferentemente usando una jeringa y cánula.

Entonces se pasa la suspensión de células recogida a través de un filtro de células situado en la cavidad de filtro para mover grandes congregados celulares y otros materiales no deseados, y la suspensión de células filtrada se recoge en la cavidad de filtro. El depósito se puede aclarar opcionalmente con un volumen adicional de la segunda disolución y esta suspensión de células adicional resultante también se puede filtrar y recoger en la cavidad de filtro.

Entonces se puede aspirar opcionalmente la suspensión de células filtrada en un medio dispensador (por ejemplo, jeringa) y aplicar directamente al sitio receptor. La suspensión también se puede aplicar indirectamente al área en necesidad de reparar, por ejemplo, un armazón/sustrato o apósito, ya sea in vitro o in situ.

En realizaciones adicionales, el proceso de preparación de la suspensión puede ser automático. Un dispositivo automático puede incluir una unidad de procesamiento capaz de usos múltiples junto con consumibles para uso único. Por ejemplo, se puede proporcionar un dispositivo automático que tiene cartuchos desechables. Los cartuchos desechables pueden tener blísteres que contienen agua, enzima y tampón. Se pueden usar rodillos o las placas de presión para crear presión para estallar válvulas de una vía, introduciendo el contenido de los blísteres en una cámara de procesamiento que contiene la biopsia. Después de la incubación de la enzima, la biopsia se puede procesar en un modo similar a mortero y mano de mortero, donde la base puede contener una malla o cualquier otro dispositivo de raspado para completar la etapa de raspado. En algunos ejemplos, el dispositivo puede tener más de un cartucho desechable y, por tanto, puede procesar más de una biopsia en paralelo.

Uso de proteína de choque térmico

Las proteínas de choque térmico (HSP) fueron inicialmente descubiertas como proteínas que fueron notablemente inducidas por choque térmico y otras sustancias químicas (por ejemplo, compuestos) o estrés físico. Desde entonces se las considera chaperonas moleculares, que guían y modifican las estructuras de las proteínas por su capacidad intrínseca de replegarlas de una estructura desnaturalizada a una nativa. Estas interacciones y el equilibrio hacia las proteínas funcionales completamente naturalizadas necesitan que las HSP sean abundantes. Las HSP se han clasificado, en general, en varias clases que dependen de sus pesos moleculares. Por ejemplo, los genes Hsp27, 40, 70 y 110 han resultado ser particularmente eficientes para la síntesis de masa después de o durante el estrés con la poderosa activación transcripcional, eficiente estabilización de ARN mensajero (ARNm) y traducción de ARNm selectivo. Los niveles de Hsp27, 70, 90 y 110 aumentan para llegar a ser las proteínas dominantemente expresadas después del estrés.

Las proteínas de choque térmico pueden desempeñar una función importante en la protección de la piel del estrés medioambiental y participar en la prevención y la reparación de daños causados por exposición a la luz, calor, lesiones químicas y otros traumatismos. Además, la irradiación UV-B también puede inducir la respuesta de choque térmico, que protege la piel humana del daño celular y es parte de las defensas naturales que siguen a la exposición a radiación solar. Sin embargo, en la cicatrización fisiológica, algunas células son estresadas en cualquier momento particular y, por tanto, la mayoría de las células no son activadas, ni secretan HSP ni proliferan.

Por tanto, los procesos de cicatrización se pueden beneficiar de la inducción exógena de una respuesta de choque térmico. Por ejemplo, poniendo la suspensión de células de la presente divulgación en condiciones de estrés, las células pueden presentar una respuesta de choque térmico. Las condiciones de estrés adecuadas incluyen, sin limitación, hipoxia, choque térmico, cambio en el pH, cambio en la presión osmótica y/o atmosférica, compuestos químicos, radiación, traumatismo mecánico, privación de nutrientes y/o ayunas o restricción de calorías. La hipoxia se puede lograr incubando las células en un entorno que carece de suministro de oxígeno adecuado. Además, como el método de la presente divulgación aleja la biopsia de su suministro vascular normal, las células en la biopsia, así como las células recogidas de la biopsia, pueden sufrir estrés y expresar un estado estresado y/o activado debido al suministro vascular reducido o ausente. El procesamiento por choque térmico se puede hacer en una estufa de incubación de CO², estufa de incubación de O²o un baño de agua caliente. Además, el estrés se puede inducir durante todo el procedimiento de preparación y/o dispersión de la suspensión de células, por ejemplo, de la retirada de la biopsia del suministro vascular, de la desagregación de la biopsia en una suspensión de células (por ejemplo, por medio enzimático y/o mecánico) y/o de la aerosolización o dispersión de otro modo de las células. Bajo estrés, las células pueden mostrar una característica inducida por el estrés, por ejemplo, un nivel elevado de expresión de una proteína de choque térmico. La proteína de choque térmico puede ser Hsp90 y/o Hsp90a.

Hsp90 es una de las varias clases de HSP que, en general, se sintetizan en respuesta a estrés celular, así como que se expresan constitutivamente en algunos casos. Estos tipos de estrés son numerosos, pero incluyen choque térmico, toxicidad a metales, privación de nutrientes, estrés oxidativo, así como numerosos estados de enfermedad. Hsp90 es una de las proteínas chaperonas más predominantes presentes en la célula - puede representar el 1 -2 % de la proteína celular no estresada y como máximo el 6 % en la célula estresada. Tiene la capacidad de proporcionar complejos multicomponente que se ha mostrado que inducen p60/Hop, p50Cdc37, Hsp40/HDJ2, p23, Hsp70 y una de varias inmunofilinas (tales como FKBP51 y FKBP52).

Hsp90 está presente, en general, en dos formas, Hsp90a y p. Ambas proteínas están altamente relacionadas y parece que tienen actividades idénticas; sin embargo, la primera es inducible, mientras que la última se expresa constitutivamente. Hsp90 también es una fosfo-proteína y tiene dos o tres moléculas de fosfato unidas por monómero y existe como un homodímero. Una de las claras distinciones que han hecho que sea una posible diana de fármaco es el hecho de que una cantidad significativa de sus proteínas satélite son proteínas cinasas. Estas proteínas satélite incluyen ErbB2/Her-2, EGFR, Hif1a, c-Met, Akt/PKB, Raf-1, Cdk-1 y 4, Aurora B, Ask1, CHK1, cKlI así como p53 mutante. Además, debido a la naturaleza de la red interactiva y compleja que está asociada con la regulación de la proliferación celular y la muerte celular, el enfoque de identificar una diana específica (fármaco) y bloquearla o activarla puede dar como resultado que la célula simplemente altere su regulación para mantener el fenotipo.

Recientemente, se encontró que las HSP eran activamente secretadas por células y llevaban a cabo importantes funciones extracelulares, que incluyen la estimulación de la producción de citocinas inmunológicas, la activación de células presentadoras de antígenos (CPA) y funciones antineoplásicas. La hipoxia provoca la secreción de Hsp90a en tanto las células epidérmicas como dérmicas. La Hsp90a secretada promueve a su vez la migración de estas células. Puesto que las proteínas HSP carecen de secuencias señal en el extremo amino, estas proteínas no se pueden secretar por la vía de transporte clásica de retículo endoplásmico/Golgi. En su lugar, estas proteínas son secretadas al exterior de las células por una población discreta de nanovesículas (30-90 nm de diámetro), denominadas los exosomas. Por tanto, la secreción de exosomas constituye un posible modo de comunicación intercelular y abre nuevas estrategias terapéuticas y de diagnóstico. TGFa "empuja" Hsp90a de los queratinocitos humanos por la vía del exosoma, que a su vez promueve la migración de tanto las células epidérmicas como dérmicas mediante el receptor de la superficie celular CD91/LRP-1 ("LRP" significa proteína-1 relaciona con el receptor de LDL).

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la suspensión de células de la presente invención, o una porción de las mismas, se puede administrar conjuntamente a un sitio receptor con una proteína de choque térmico, o un fragmento de la misma, para facilitar la cicatrización o promover de otro modo el tratamiento, la regeneración, la exfoliación de tejidos epiteliales en un procedimiento relacionado con el epitelio. La suspensión de células y la HSP se pueden suministrar en una mezcla y dispersar en el sitio receptor. Alternativamente, la suspensión de células y la HSP se pueden aplicar al sitio receptor por separado. También se pueden usar múltiples aplicaciones o dispersiones de la suspensión de células y/o la HSP para lograr el resultado de cicatrización deseable. La HSP o un fragmento de la misma pueden estar en una cantidad eficaz para promover la cicatrización. La HSP puede ser Hsp90 y/o Hsp90a. La HSP o un fragmento de la misma se pueden formular en una concentración de desde aproximadamente 0,1 pg/pL hasta aproximadamente 100 pg/pL, desde aproximadamente 0,3 pg/pL hasta aproximadamente 50 pg/pL, o desde aproximadamente 1 pg/pL hasta aproximadamente 10 pg/pL.

La patente de EE. UU. N° 8.022.037 desvela Hsp90a, en concreto su dominio central más la secuencia cargada, como un factor pro-motilidad extracelular para la migración de queratinocitos epidérmicos humanos (HKC), fibroblastos dérmicos (DF) y células endoteliales microvasculares (HDMEC).

En diversos ejemplos, HSP (por ejemplo, Hsp90 y Hsp90a) o un fragmento de la misma se pueden producir en gran cantidad y purificar usando clonación convencional y tecnología de ADN recombinante. HSP se puede suministrar como un componente del aparato de la presente divulgación, por ejemplo, en un formato de polvo seco, o suministrar en una aplicación líquida o sobre una venda. La HSP también se puede usar como un tratamiento individual y proporcionarse en diversos formatos; cuando se proporciona en una aplicación líquida, la HSP se puede pulverizar, añadir en gotas, dispersar o aplicar de otro modo a un sitio receptor; cuando se proporciona sobre una venda, la HSP se puede formular como una formulación de liberación lenta usando métodos conocidos en la técnica. También es posible usar HSP en combinación con un monocultivo que tiene un único tipo de células, por ejemplo, células madre de la piel, fibroblastos, queratinocitos, etc., o con una mezcla de células de los mismos.

En diversos ejemplos, la HSP puede ayudar a o aumentar la cicatrización y regeneración de tejido mejorando el proceso de reepitelización y el reclutamiento de las células. Sin desear quedar ligado a teoría, el mecanismo puede ser que queratinocitos "positivamente estresados" (por ejemplo, tanto en un modo hipóxico como por procesamiento ReCell) puedan producir la liberación potenciada de proteínas clave (por ejemplo,HSP90), plaquetas (que liberan PDGF) y células madre (que liberan proliferadores, por ejemplo, VEGF), citocinas (inmunomoduladores) y quimiocinas (migradores) que pueden regular y controlar el proceso de regeneración; la HSP90 puede bloquear la acción de TGFb, desinhibiendo la respuesta a VEGF y PDGF por células endoteliales y fibroblastos que da como resultado la proliferación y la diferenciación de tipos clave de células acompañado por el rápido desarrollo de vasos sanguíneos y nervios. La interacción de la inhibición, desinhibición y activación genera una cascada de retroalimentación positiva que da como resultado la liberación adicional de factores de crecimiento, citocinas y quimiocinas.

Uso de ácido hialurónico

El término "ácido hialurónico", como se usa en el presente documento, incluye sales de metales alcalinos, tales como sales de sodio, potasio y litio de ácido hialurónico. El término "ácido hialurónico" también pretende incluir no solo ácido hialurónico elemental, sino el ácido hialurónico con otros oligoelementos o en diversas composiciones con otros elementos, en tanto que las propiedades químicas y físicas del ácido hialurónico permanezcan inalteradas. Además, el término "ácido hialurónico", como se usa en la presente solicitud, pretende incluir fórmulas naturales, fórmulas sintéticas o la combinación de estas fórmulas naturales y sintéticas.

El ácido hialurónico (también denominado hialuronano o hialuronato o HA) es un glucosaminoglicano distribuido ampliamente en todos los tejidos conjuntivos, epiteliales y neurales. Más específicamente, el HA es un polisacárido no ramificado lineal constituido de W-acetil-D-glucosamina y ácido D-glucurónico alternos y puede alcanzar longitudes de cadena de hasta 20.000 unidades de disacárido o más. Uno de los principales componentes de la matriz extracelular, el HA, contribuye significativamente a la proliferación y migración celular. Se ha mostrado que la presencia de HA en el tejido epitelial promueve la proliferación de queratinocitos y aumenta la presencia de ácido retinoico, que efectúa la hidratación de la piel. La interacción del ácido hialurónico con CD44 impulsa la síntesis de colágeno y la función de la piel normal. Presente predominantemente en la matriz extracelular de queratinocitos basales, el HA es crítico para la integridad estructural de la matriz de colágeno dérmico.

En piel normal, el HA se encuentra en concentraciones relativas altas en la capa basal de la epidermis donde se encuentran los queratinocitos proliferantes. CD44 está colocado junto al HA en la capa basal de la epidermis donde se ha mostrado que se expresa preferentemente sobre la membrana plasmática orientada hacia las bolsas de la matriz rica en HA. El mantenimiento del espacio extracelular y que proporciona una estructura abierta e hidratada para el paso de nutrientes son las principales funciones del HA en la epidermis.

El HA también puede afectar o promover la cicatrización. La cicatrización de la piel es un proceso complejo, e incluye muchos procesos interactuantes iniciados por la hemostasia y la liberación de factores derivados de plaquetas. Las siguientes etapas incluyen la inflamación, la formación de tejido de granulación, la reepitelización y la remodelación. El HA puede desempeñar una función polifacética en la mediación de estos acontecimientos celulares y de matriz. En primer lugar, en el proceso de inflamación, se generan muchos factores biológicos, tales como los factores de crecimiento, las citocinas, los eicosanoides etc. Estos factores son necesarios para las posteriores etapas de cicatrización debido a sus funciones en promover la migración de células inflamatorias, fibroblastos y células endoteliales en el sitio de la herida. El tejido cicatricial en la fase inflamatoria temprana de la reparación de heridas contiene abundante HA, probablemente un reflejo de la elevada biosíntesis de HA. El HA puede actuar de promotor de la inflamación temprana, que es crucial en el proceso de cicatrización de piel completa.

El tejido de granulación es el tejido conjuntivo fibroso perfundido que sustituye a un coágulo de fibrina en la cicatrización de heridas. El HA es abundante en la matriz de tejido de granulación. A esta red rica en HA se le puede atribuir una variedad de funciones de la célula que son esenciales para la reparación de tejido y de heridas, que incluye la facilitación de la migración de células en una matriz de herida temporal, la proliferación celular y la organización de la matriz de tejido de granulación. Por ejemplo, la red rica en HA o matriz extracelular puede actuar de entorno conductor para la migración de células en la matriz de herida temporal.

El HA también funciona en el proceso de reepitelización. Sirve de parte integral de la matriz extracelular de los queratinocitos basales, que son los principales constituyentes de la epidermis; también es importante su función en la proliferación y la migración de queratinocitos. En el proceso de cicatrización, el HA se expresa en el margen de la herida, en la matriz de tejido conjuntivo y se pone junto con la expresión de CD44 en queratinocitos que migran, donde HA y CD44 actúan juntos para regular la proliferación y la migración de queratinocitos. HA también puede actuar reduciendo la deposición de colágeno y, por tanto, conducen a una reducción de la cicatrización.

Así, en ciertas realizaciones, la suspensión de células para su uso según la presente invención, o una porción de la misma, se puede administrar conjuntamente a un sitio receptor con HA (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como hialuronato de sodio), para facilitar la cicatrización. La suspensión de células y el HA se pueden suministrar en una mezcla y dispersar en el sitio receptor. Alternativamente, la suspensión de células y el HA se pueden aplicar al sitio receptor por separado. También se pueden usar múltiples aplicaciones o dispersiones de la suspensión de células y/o el HA para lograr el resultado de cicatrización deseable. El HA se puede proporcionar en una cantidad eficaz para promover la cicatrización, tal como desde aproximadamente 0,01 mg/mL hasta aproximadamente 60 mg/mL, desde aproximadamente 1 mg/mL hasta aproximadamente 50 mg/mL, desde aproximadamente 5 mg/mL hasta aproximadamente 40 mg/mL, desde aproximadamente 10 mg/mL hasta aproximadamente 30 mg/mL, o desde aproximadamente 20 mg/mL hasta aproximadamente 25 mg/mL. Por ejemplo, la cantidad de HA en las composiciones según la invención pueden ser 0,1, 1,2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 o 60 mg/mL. El HA puede tener cualquier peso molecular adecuado, que varía desde algunos kDa hasta millones de dáltones, dependiendo de la fuente, la degradación y el procedimiento de purificación. El HA puede ser desde aproximadamente 0,01 hasta 9x106 Da, aproximadamente 0,5 hasta 9x105 Da, o aproximadamente 0,8 hasta 8x105 Da, o más alto o más bajo.

En diversas realizaciones, el HA de peso molecular deseable se puede producir en gran cantidad y purificar usando clonación convencional y tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, usando hialuronano sintasa y/u otros genes de biosíntesis de HA en células recombinantes). El HA también se puede obtener comercialmente de crestas de gallo, ciertas cepas atenuadas de Streptococcus del grupo C que sintetizan este compuesto naturalmente como parte de su cápsula externa, o de humor vitreo bovino. Además, se pueden comprar fracciones de masa molecular de HA purificado de fuentes comerciales que incluyen Fluka Chemical Corporation (Ronkonkoma, N.Y., EE. UU.), Genzyme Corporation (Cambridge, Masa., EE. UU.), Lifecore Inc. (Chaska, Minn., EE. UU.), Hyal Pharmaceutical Corporation (Mississauga, Ontario, Canadá) y Bioniche Life Sciences, Inc. (Belleville, Ontario, Canadá).

El HA se puede proporcionar en diversas formas, tales como disolución, hidrogel, o como nanopartículas o micropartículas. Las patentes de EE. UU. N° 6.660.853 y 7.371.399 describen métodos de preparación de HA y un gel de polímero que contiene HA.

El HA se puede suministrar como un componente del aparato de la presente divulgación, por ejemplo, en un formato de polvo seco, o se suministra en una aplicación líquida o sobre una venda. El HA también se puede usar como un tratamiento individual y se proporciona en diversos formatos; cuando se proporciona en una aplicación líquida, el HA se puede pulverizar, añadir gota a gota, dispersar o aplicar de otro modo a un sitio receptor; cuando se proporciona sobre una venda, el HA se puede formular como una formulación de liberación lenta que usa métodos conocidos en la técnica. También es posible usar HA en combinación con un monocultivo que tiene un único tipo de células, por ejemplo, células madre de la piel, fibroblastos, queratinocitos, etc., o con una mezcla de células de los mismos.

EJEMPLOS

En los siguientes ejemplos se describen características adicionales de la presente invención. Se debe entender, sin embargo, que estos ejemplos están incluidos únicamente a efectos de ejemplificar la presente invención.

Los siguientes ejemplos se exponen de manera que se proporcione a los expertos habituales en la técnica con una descripción a modo de ejemplo de cómo se hacen y evalúan las composiciones y/o los métodos reivindicados en el presente documento, y pretenden ser puramente a modo de ejemplo de la invención. Las modificaciones y las variaciones de diversos aspectos de los siguientes ejemplos serán evidentes para los expertos en la técnica. Por ejemplo, mientras que algunos ejemplos se describen a propósito de un procedimiento relacionado con la piel, lo mismo se puede aplicar a tejidos de la piel no epiteliales (tales como epitelio respiratorio, epitelio vascular, epitelio glandular o epitelio corneal) con ligeras modificaciones que están perfectamente dentro del nivel de la experiencia habitual en la técnica.

Ejemplo 1

Preparación del sitio receptor

Para optimizar el éxito del procedimiento relacionado con el epitelio, se limpió la herida y se evaluó que era de la profundidad apropiada. Además, se estableció homeostasis de la sangre y la herida se comprobó para la evidencia de celulitis o infección circundante. Las técnicas de preparación del área incluyeron, sin limitación, disección cortante, dermoabrasión o exfoliación láser.

Biopsia de sitio donante

Se eligió el sitio donante para corresponder apropiadamente con el sitio receptor. Se infiltró el sitio donante con anestésico local y adrenalina debajo de la piel cerca del tejido subcutáneo. Esto permitió que el sitio donante fuera firme y ayudó en la toma de una biopsia. Las dimensiones de la biopsia se determinaron por el tamaño del área superficial del sitio receptor a cubrir. Normalmente, la presente divulgación permite un tamaño de biopsia que tiene una relación de expansión de aproximadamente 1:10 a 1:80 (tamaño de la biopsia donante: tamaño del sitio receptor). En un ejemplo, se tomó un tamaño de biopsia de 2 cm x 2 cm del sitio donante, dando una relación de expansión de 1:60.

Exfoliación de la piel usando la técnica ReCell®

El tratamiento de la herida se llevó a cabo usando el aparato de recogida de células de la técnica ReCell® Rapid, que se explica con más detalle en el Ejemplo 2 a continuación. El aparato contuvo todos los instrumentos, disoluciones, enzimas y apósitos requeridos para el tratamiento de heridas.

El elemento calefactor se activó presionando el "botón de inicio". Se transfirió la disolución A (agua estéril para inyectables) (10 mL) del recipiente de plástico suministrado etiquetado Disolución A a un recipiente de vidrio que contenía la enzima de separación (tripsina liofilizada) para dar una concentración final de 0,5 % de tripsina. Entonces se mezcló la disolución de enzima, se transfirió a un recipiente ya situado en la cavidad del elemento calefactor y se calentó hasta aproximadamente 37 °C.

El recipiente que contenía la Disolución B (disolución nutritiva) se transfirió de su recipiente suministrado al pocillo de contención de líquidos.

Entonces se colocó la muestra de tejido previamente obtenida en la disolución de enzima y se incubó a aproximadamente 37 °C durante entre 10 y 15 minutos. Después de la incubación, la muestra de tejido se sacó de la disolución de enzima con un par de pinzas, se aclaró por inmersión en el pocillo de contención de líquido que contenía la Disolución B y se dispuso con el lado dérmico hacia abajo y el lado epidérmico hacia arriba en el depósito.

Entonces se aspiró la Disolución B del pocillo en una jeringa y se añadió gota a gota de la jeringa sobre ambas capas de la biopsia.

Se manipularon las capas de piel, dermis y epidermis usando pinzas y bisturí. Empezando por la superficie superior de la epidermis y seguido por la zona de la unión dérmica-epidérmica donde se encuentran la superficie más baja de la epidermis y la superficie más alta de la dermis, las células se raspan de la muestra hasta que se recogen sustancialmente todas las células en la muestra, para desarrollar una columna de células en el depósito. Entonces se mezclaron las células en la disolución B por agitación y/o pipeteado. Entonces se extrajo la columna de células en la jeringa por una cánula de calibre 19.

Se montó el filtro suministrado (filtro de células de 100 gm) en la cavidad de filtro y la columna de células en la disolución B se pasó a través del filtro. Entonces se usó una pequeña cantidad adicional de disolución B para aclarar el depósito (por ejemplo, una placa de Petri) y recoger las células restantes, que también se pasaron a través del filtro.

La suspensión resultante de células recogidas de la cavidad cónica se aspiró en una jeringa y se unió una boquilla a la jeringa por pulverización o goteo sobre el área de la herida.

La herida se volvió a comprobar para garantizar que estuviera limpia y sin residuos y que no hubiera evidencia de contaminación bacteriana. Además, se comprobó la herida para determinar si se había logrado la homeostasis. Una vez estaba listo el sitio receptor, la suspensión de células se aplicó a la superficie de la herida usando la boquilla.

La herida se cubrió con Surfasoft™, un apósito de nailon tejido, que se suministró con el aparato. Se siguió la cicatrización de la herida usando protocolos convencionales para el tratamiento de injerto de la piel.

Ejemplo 2

El ejemplo mostrado en la FIG. 2A se refiere a un aparato recolector de células de ReCell® Rapid Technique 10 para su uso en producir una suspensión celular trasplantable de tejido vivo adecuado para aplicar a un paciente en un procedimiento relacionado con el epitelio.

Como se ilustra en la FIG. 2A, el aparato incluye una tapa de cierre 12 que posee un mecanismo de bloqueo 14 adaptado para el acoplamiento separable de una porción de base 16. El mecanismo de bloqueo 14 proporciona un medio para el cierre del aparato 16 cuando no está en uso. Localizado dentro de la porción de base 16 está un primer miembro 18 dentro del que se proporciona una abertura 20 en la que se localiza un vial 22 para la enzima. Adyacente a la abertura se proporciona un interruptor de activación 24 capaz de activar el medio calefactor (no mostrado). El primer miembro también proporciona un pocillo de contención de líquido 26 y una cavidad de filtro 28. Como se presenta en esta ilustración, el filtro 29 se muestra situado en la cavidad de filtro. En general, el filtro es un artículo opcional incluido como un artículo separado en el aparato.

La abertura 20 en el primer miembro 18 es deseablemente de un diámetro tal que permita que el cuello del vial 22 sobresalga a través de y por encima del primer miembro 18. La periferia de la abertura 20 se ajusta con un collar 21 que es ligeramente más pequeño que el diámetro del cuerpo del vial 22. Así, cuando está en uso, el vial 22 no se puede sacar del aparato 10, ya que se mantiene en el sitio por el collar 21 situado alrededor de la periferia de la abertura 20.

Localizado adyacente a la abertura 20, el pocillo de contención de líquido 26 y la cavidad de filtro 28 está el segundo miembro 30 que está situado sobre un asiento (no mostrado) situado dentro de un compartimento de almacenamiento (no mostrado) dentro del primer miembro 18. Cuando se invierte el segundo miembro 30, forma un depósito dentro del que se pueden realizar manipulaciones de tejido. Para facilitar la separación del segundo miembro 30 del primer miembro 18, se proporciona una marca 32 en el lado de una porción del segundo miembro 30, que es de un tamaño tal que una persona puede levantar el segundo miembro del asiento sobre el que reside en el primer miembro 18.

Dentro de la cavidad de filtro 28 se localiza un filtro 29 (proporcionado por separado con los otros componentes) que tiene una malla en su interior capaz de separar el material celular superior a 100 gm de un sobrenadante de células.

La FIG. 2B proporciona una vista en perspectiva parcialmente en despiece ordenado del aparato 10 en donde el segundo miembro 30 se retira del primer miembro 18 y se invierte. La inversión del segundo miembro 30 revela las paredes laterales 32 del segundo miembro 30, que forman la barrera de contención de líquido del depósito y un área de depósito 34 en la que se pueden realizar manipulaciones de tejido.

La retirada del segundo miembro 30 del primer miembro 18 también revela un compartimento de almacenamiento 36 en el primer miembro 18 en el que las disoluciones y las herramientas se pueden almacenar cuando el aparato 10 no está en uso. Dentro del compartimento de almacenamiento 36 se localiza un asiento 38 sobre el que puede residir el segundo miembro 30. El asiento 38 se localiza preferentemente alrededor de la periferia del compartimento de almacenamiento 36 a una profundidad por debajo de la superficie del primer miembro 18 que es equivalente a la altura de las paredes laterales 32 del segundo miembro 30.

La FIG. 3A proporciona una vista en perspectiva del primer miembro 18 que muestra el compartimento de almacenamiento 36, el interruptor que activa el calentador 24, la abertura 20, el pocillo de contención de líquido 26 y la cavidad de filtro 28 formada dentro del primer miembro. La FIG. 3B proporciona una vista trasera del primer miembro 18 que muestra la cavidad de filtro 28, el pocillo de contención de líquido 26, el interruptor que activa el calentador 24, el collar de abertura 21 y la pared trasera del compartimento de almacenamiento 36. Como se observa en esta figura, la cavidad de filtro tiene una base cónica, proporcionándose así un medio para el fácil acceso a la suspensión de células que se filtran en él. Situado adyacente al pocillo de contención de líquido y sobre la cara opuesta del pocillo de contención de filtro también se proporciona un miembro de posicionamiento de pila 40 que sobresale hacia la base 16 del aparato (no mostrado) y proporciona un medio para contener las pilas en su sitio, que se requieren para activar los medios calefactores.

La FIG. 4 proporciona una vista en perspectiva de la base 16 del aparato 10 que muestra el vial 22 situado dentro de un campo de contención 42. Entre el campo de contención 42 y el vial 22 se localiza un collar(es) calefactor(es) 44, que rodea el cuerpo del vial. Adyacente al campo de contención existe una placa de circuito 46, que se mantiene en su posición por los medios de contención de la placa de circuito 48, 50 y 52. Dicha placa de circuito 46 esté en comunicación eléctrica con el (los) collar(es) calefactor(es) 44 por los hilos 54. La placa de circuito también está en comunicación eléctrica por los hilos 58 con el interruptor de activación del calentador (no mostrado). Adyacente a la placa de circuito 46 se proporciona un medio de contención de pilas 58, que contiene 4 pilas AA en posición inmóvil (no mostradas). Las pilas están en comunicación eléctrica con la placa de circuito 46 por hilos 60. Cuando el primer miembro 18 se ajusta a la base 16, las pilas se mantienen en su sitio por el medio de contención de pilas 58, el medio de posicionamiento de pilas 40 y la base de cada uno del pocillo de contención de líquido 26 y la cavidad de filtro 28. Preferentemente, la base cónica de la cavidad de filtro 28 también sobresale entre las pilas en ella, proporcionando un medio adicional para asegurar las pilas en la posición inmóvil.

Ejemplo 3

Se probó si los hidrogeles de HA aumentan la viabilidad y la migración de los queratinocitos epidérmicos del estrato basal humano de donantes adultos. Se probaron los diversos hidrogeles usando ensayos que incluyen la migración de células en Transwell, el ensayo de proliferación de células acuosas CellTiter 96® y el ensayo de escarificación in vitro descrito a continuación.

Protocolo para la migración de células Transwell

1. Mantener cultivos de reserva de las células adultas humanas normales queratinocitos epidérmicos primarios (PEK) en medio basal de células dérmicas complementado con el kit de crecimiento de queratinocitos y disolución de gentamicina-anfotericina B (medios completos). Subcultivar los cultivos de reserva de células hasta 2,5 x 104 células/mL (estimado) y volver a alimentar con medio cada 2 días o cuando se alcance una densidad de casi confluencia.

2. A cada pocillo de una placa de 24 pocillos añadir 500 gL de medio. Se recubrirán piezas intercaladas con un poro de 8 um y 0,3 cm2 de área con el material de prueba y se dispondrán en un pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos.

Fila A, columnas 1-3: blanco, sin células, medio solo.

Fila B, columnas 1-3: nivel basal, solo células, sin recubrimiento.

Fila C, columnas 1 -3: colágeno de tipo 1 (control positivo)

Fila D, columnas 1 -3 y filas A-D, columnas 4-6: sustancias de prueba en una serie de dilución sucesiva.

(Ilustrado a continuación)

3. Recoger las células y lavar las células PEK en medio por centrifugación a 150 x g durante 3 a 5 minutos.

4. Determinar el número de células y la viabilidad (por exclusión con azul de tripano), y suspender las células hasta una concentración final de 3 x 105 células/mL en medio.

5. Colocar las piezas intercaladas en la placa.

6. Dispensar 100 pL de la suspensión de células (30.000 células) a todos pocillos de la placa preparada en la etapa 2. El volumen total en cada pocillo debe ser 165 pL.

7. Incubar la placa durante 6-12 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO².

8. Lavar suavemente el filtro con PBS, retirar las células no migratorias sobre la superficie superior con un hisopo de algodón.

9. Fijar las células sobre la superficie inferior con 4 % de paraformaldehído durante 2 horas.

10. Teñir las células sobre la superficie inferior con hematoxilina de Harris durante 30 minutos.

11. Para cada membrana, contar cuatro campos aleatoriamente seleccionados a 400X, determinar el promedio. Se pueden tomar imágenes de las membranas.

Protocolo para el ensayo de viabilidad celular usando el ensayo de proliferación de células acuosas CellTiter 96®

1. Mantener cultivos de reserva de las células adultas humanas normales queratinocitos epidérmicos primarios (PEK) en medio basal de células dérmicas complementado con el kit de crecimiento de queratinocitos y disolución de gentamicina-anfotericina B (medios completos). Subcultivar los cultivos de reserva de células hasta 2,5 x 104 células/mL (estimado) y volver a alimentar con medio completo cada 2 días o cuando se alcance una densidad de casi confluencia.

2. Añadir 50 pL/pocillo de muestras o patrones a medir, diluidos en medio completo.

Fila A, columnas 1 -3: blanco, sin células, medio solo.

Fila B-C, columnas 1-3: nivel basal, solo células.

Fila D-H, columnas 1-3: sanguinarina, respuesta a dosis (de toxina) (50, 10, 5, 1,0,1 pM)

Fila A-H, columnas 4-6, 7-9, 8-12: sustancias de prueba en una serie de dilución sucesiva

Equilibrar la placa a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO²mientras se recogen las células para el ensayo.

3. Recoger las células y lavar las células PEK en medio completo por centrifugación a 150 x g durante 3 a 5 minutos.

4. Determinar el número de células y la viabilidad (por exclusión con azul de tripano), y suspender las células hasta una concentración final de 6 x 105 células/mL en medio completo.

5. Dispensar 50 pL de la suspensión de células (30.000 células) a todos pocillos de la placa preparada en la etapa 2. El volumen total en cada pocillo debe ser 100 pL.

6. Incubar la placa durante 48-72 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO².

7. Añadir 20 pL por pocillo de disolución de MTS/PMS.

8. Incubar la placa durante 1-4 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO². Para medir la cantidad de formazano soluble producido por reducción celular de MTS, pasar inmediatamente a la etapa 9. Nota: para medir la absorbancia en un momento posterior, añadir 25 pL de 10 % de SDS a cada pocillo para parar la reacción. Guardar las placas tratadas con SDS protegidas de la luz en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante hasta 18 horas. Pasar a la etapa 9.

9. Registrar la absorbancia a 490 nm usando un lector de placas de ELISA.

10. Representar la absorbancia corregida a 490 nm (eje Y) frente a la concentración de productos de prueba (eje X), y determinar el valor de DE50 determinando del valor del eje X correspondiente a la mitad de la diferencia entre los valores de absorbancia máximo (meseta) y mínimo (sin control del factor de crecimiento). DE50 = la concentración de factor de crecimiento necesaria para dar la mitad de la respuesta máxima.

Nota: dependiendo de la respuesta observada de los sustratos de ensayo, se puede realizar una curva patrón de célula/pocillo para estimar numéricamente la proliferación. Esto se llevaría a cabo sembrando una variedad conocida de números de células viables por pocillo y midiendo la producción de formazano.

Protocolo para la migración de células - Ensayo de escarificación

2. Añadir a cada pocillo de una placa de 24 pocillos sustancias de prueba apropiadas.

Fila A, columnas 1 -3: blanco, sin células, medio solo.

Fila B, columnas 1-3: nivel basal, solo células, sin recubrimiento.

Fila C-D, columnas 1-3 y filas A-D, columnas 4-6: sustancias de prueba como se determinaron previamente, en una serie de dilución sucesiva según sea necesario.

3. Recoger las células y lavar las células PEK en medio por centrifugación a 150 x g durante 3 a 5 minutos. 4. Determinar el número de células y la viabilidad (por exclusión con azul de tripano), y suspender las células hasta una concentración final de 5 x 104 células/mL en medio.

5. Dispensar 600 pL de la suspensión de células (30.000 células) en todos los pocillos de la placa preparada en la etapa 2.

6. Incubar la placa durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO².

7. Con una punta de pipeta, raspar la monocapa de células para crear una zona libre de células en el centro del pocillo.

8. Aspirar el medio agotado y las células.

9. Lavar con 300 pL de medio para retirar todo el residuo celular y las células sueltas.

10. Volver a cubrir la superficie denudada con sustancias de prueba (o medio) durante 1 h a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO².

11. Aspirar los medios/sustancias de prueba gastados.

12. Lavar las capas de células una vez con medio.

13. Rellenar con 600 pL de medio.

14. Incubar la placa durante 16 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO². Las imágenes se tomarán 16 horas después de la formación de la herida.

Nota: dependiendo de los resultados observados, las células se pueden pretratar con mitomicina C. Este pretratamiento evaluará la contribución relativa de la migración de células al cierre de la herida in vitroen ausencia de proliferación.

Las células utilizadas para todos los experimentos fueron procuradas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Catálogo N° PCS-200-011, lote 59098517). Estas células fueron queratinocitos epidérmicos primarios de un humano adulto normal. Las células se mantuvieron en medio basal de células dérmicas (ATCC N°: PCS 200-030) complementado con el kit de crecimiento de queratinocitos (ATCC N° PCS 200-040) que contuvo extracto de pituitaria bovina, TGF-p humana recombinante, L-glutamina, hemisuccinato de hidrocortisona, insulina, epinefrina y apotransferrina. También se añadió una disolución de gentamicina-anfotericina B al medio (ATCC N°: 999-025). Se descongelaron las células, se cultivaron y se subcultivaron según las recomendaciones de la ATCC.

Se prepararon hidrogeles de ácido hialurónico (HA) y NINJA™ (ácido hialurónico con colágeno) del siguiente modo.

Se preparó ácido hialurónico por un método descrito en la patente de EE. UU. N° 6.660.853. En resumen, se disuelve ácido hialurónico en bruto obtenido de crestas de gallo en agua pura a una concentración estimada de entre 1 y 5 mg/mL. Usando un Centramate de tipo membrana de PES de 30 kDa MWCO de Pall-Filtron con una configuración de canal abierto, entonces se diafiltró la disolución contra 5 volúmenes de agua pura. El tipo de membrana fue una membrana de poliétersulfona de Omega con un área de filtro de 1,0 pie cuadrado (0,09 m2). Se mantuvo una presión transmembranaria (TMP) no superior a 8,0 psig, así como una velocidad de flujo cruzado de al menos 1.000 mL/min. La bomba usada para realizar la diafiltración fue una Masterflex® L/S.RTM de Cole-Parmer. Bomba de tubería habitual de precisión capaz de más de 1700 mL/min, SKU# EW-77911 -00. La esterilización se llevó a cabo por filtros de 0,22 micrómetros de nailon de Pall Bioinert. Entonces se liofilizó la disolución y se usó en formulación aséptica usando o 0,9 % de solución salina o medio celular en caso de necesidad. Las disoluciones se prepararon inicialmente hasta 30 mg de HA/mL ("HA30"), y luego se diluyeron en caso de necesidad (por ejemplo, hasta 10 mg/mL, "HA10").

Se formuló NINJA™ usando el ácido hialurónico purificado anteriormente, y combinándolo con un colágeno nativo de tipo I/III (no reticulado) en un método similar a la patente de EE. UU. N° 7.371.399. Entonces se liofilizó la disolución y se usó en una formulación aséptica usando o solución salina al 0,9 % o medio celular en caso de necesidad. Las disoluciones se prepararon inicialmente hasta 30 mg de polímero/mL ("NINJA30"), y luego se diluyeron en caso de necesidad (por ejemplo, hasta 10 mg/mL, "NINJA10").

Se compró un kit comercialmente disponible [CellTiter, Promega] y se usó para probar la viabilidad celular (ensayo de proliferación de células MTS) según las instrucciones del fabricante. El ensayo es un método colorimétrico para determinar la actividad de enzimas mitocondriales. Brevemente, se sembraron queratinocitos en placas de 96 pocillos a una densidad de 3 x 104 células por pocillo y se incubaron durante la noche con y sin hidrogeles. Luego se añadieron veinte microlitros del compuesto de tetrazolio que contenía el reactivo CellTiter y reactivos de acoplamiento con electrones a cada pocillo para ser catalizados por enzimas deshidrogenasa mitocondriales en células metabólicamente activas. Las placas se incubaron durante 1-4 h y se registró la absorbancia colorimétrica a 490 nm por un lector de microplacas. Además, se tomaron lecturas de pocillos en blanco y pocillos a cifra de células completa. Se leyeron los pocillos de cifra de células completa, se les restó los blancos y se determinó el % de viabilidad. Los resultados se representan en la FIG. 5.

Se observó una reducción en la viabilidad celular in vitro a concentraciones superiores a 0,3 mg/mL de los hidrogeles de HA. Esto es probable debido a una de dos situaciones. Primero, es posible que la viscosidad de los hidrogeles reduzca la difusión de nutrientes a las células. Esto está respaldado por la disminución añadida en la viabilidad observada en el hidrogel NINJA a concentraciones superiores a 1,25 mg/mL. NINJA es más viscoso a concentraciones de polímero equivalentes que HA. Segundo, es igualmente posible que las células no mueran de hecho a concentraciones de polímero más altas. Es igual de probable que el colorante, MTS, no fuera capaz de difundir en las células, y así no fue capaz de procesarse en formazano por las enzimas reductasa mitocondriales. Esto también aparecería como una baja absorbancia en las lecturas a 490-500 nm, y haría de una falsa lectura de baja viabilidad. Sin embargo, se debe observar que el mecanismo de difusión molecular puede no ser el mecanismo dominante in vivo. Las situaciones in vivo pueden implicar degradación enzimática, transferencia de masa convectiva (riego sanguíneo) y otros mecanismos hasta ahora no cuantificados. Por tanto, en entornos in vivo, se pueden tolerar al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, o concentraciones más altas del límite de 0,3 mg/mL in vitro.

El ensayo de migración Trans-well se realizó según el protocolo anterior. En resumen, se dispusieron piezas intercaladas de cultivo celular equipadas con un miembro de 8 um de poro de 0,3 cm2 previamente recubiertas con hidrogeles en placas de cultivo de 24 pocillos, que forman los compartimentos superior e inferior del ensayo, respectivamente. Se sembraron queratinocitos (3 x 104 por pocillo) cultivados en medio de control en los diferentes pocilios superiores recubiertos de hidrogel de viscosidades variables y medio de control y se incubaron durante 3 días. Todas las incubaciones se llevaron a cabo en aire/CO2 95 %/5 %, a 37 °C. Después de los experimentos, los filtros se lavaron dos veces con PBS, y las células sobre la superficie superior se retiraron usando hisopos de algodón. Las células sobre la superficie del filtro inferior se fijaron en 4 % de paraformaldehído (2 h) y se tiñeron con hematoxilina de Harris durante 30 min. Las células que migraron a la parte inferior de las membranas se contaron en cuatro campos de alta potencia aleatoriamente seleccionados, y se determinó la cifra media de experimentos por duplicados. Los resultados se muestran en la FIG. 6. Todas las formulaciones de hidrogel superan la situación de control (medio solo), conduciendo a NINJA10.

Se realizó el ensayo de escarificación in vitro según el protocolo anterior. En resumen, se sembraron queratinocitos cultivados (5 x 104 por mL) en placas de cultivo de tejido previamente recubiertas con hidrogel de propiedades variables y control no de hidrogel y se incubaron durante la noche. Los queratinocitos cultivados en medio de control se sembraron sobre diferentes placas de cultivo de 24 pocillos recubiertas con hidrogel durante 3 días. Entonces se raspó la monocapa de células en un modo normalizado con un aparato de plástico para crear una zona sin células en cada placa. Entonces se aspiró el medio, seguido por un amplio lavado para retirar los residuos celulares. Se recubrieron con hidrogel las superficies denudadas y el medio de cultivo de queratinocitos durante 1 h a 37 °C. Entonces se aspiró el medio de cultivo que contenía el hidrogel y se lavaron una vez las capas de células. Se repusieron las placas de cultivo con medio de queratinocitos nuevo. Se hicieron fotografías a intervalos de 24 horas después de la formación de la herida hasta 4 días. Se documentó la reepitelización in vitro por fotografía y se cuantificó manualmente la cantidad de migración por análisis de imágenes asistido por ordenador. Los datos se expresaron como un porcentaje del área de la escarificación rellena por queratinocitos (FIG. 7). Los resultados se obtuvieron de todo el campo de la "escarificación", tomada por duplicado. Además, se probó un segundo grupo de pocillos por duplicado con la presencia añadida de mitomicina c (MMC+/-). El uso de MMC ralentiza la proliferación celular. Así, las diferencias en la cicatrización de los arañazos in vitro con y sin MMC puede proporcionar una indicación sobre la función del hidrogel en la migración frente a la mera proliferación y viceversa.

Como se muestra en la FIG. 7, de todos los hidrogeles probados, NINJA10 produjo la mayor cicatrización. Fue significativamente mejor que el control de medio en el día 2 y continuó siéndolo hasta que se completó la prueba. El siguiente mejor hidrogel fue NINJA30. NINJA30 presentó un retraso de la respuesta al crecimiento. Fue indistinguible de los otros hidrogeles y medios hasta el día final cuando pasó de 33 % a 75 % en 24 horas. La viscosidad más alta de NINJA30 puede haber ralentizado la difusión de los nutrientes celulares necesarios hasta dicho momento, ya que el hidrogel se había diluido debido a la contradifusión.

Las diferencias en la cicatrización de los arañazos in vitro con y sin (+/-) MMC puede proporcionar una indicación sobre la función del hidrogel en la migración frente a la mera proliferación y viceversa. En el medio MMC-/grupo de control, el efecto sobre la cicatrización fue como cabía esperar. Las células MMC+ mostraron una cicatrización retardada en comparación con las células MMC-, aunque la diferencia no fue significativa. Este efecto, sin embargo, se invirtió en el grupo HA30 con MMC+ que muestra un aumento en la cicatrización. HA10 MMC+ mostró un retraso en la cicatrización durante los 3 primeros días en comparación con HA10 MMC-, pero entonces se invirtió en el cuarto día. NINJA30 y NINJA10 MMC+ también mostraron ligeros retrasos en la cicatrización.

Así, los hidrogeles actúan regulando por incremento tanto la proliferación como la migración celular. Dada la tenencia general de todos los hidrogeles que contribuyen a la cicatrización, y la significancia del grupo NINJA10 (y parte del grupo de NINJA30), NINJA puede ser una tecnología apropiada para aumentar ReCell® y la cicatrización.

Como se trata anteriormente, el mecanismo dominante en cualquier sistema in vitro es la difusión molecular. Los medios nutrientes difunden en hidrogeles, y los polímeros difunden de los hidrogeles con el tiempo. Esto se denomina la contradifusión. Las condiciones in vivo se añaden a la complejidad de cualquier modelo introduciendo mecanismos adicionales que incluyen convección forzada (circulación sanguínea) y degradación enzimática. Por tanto, es posible que aún cuando la prueba anterior sugiera que 0,3 mg de polímero/mL es el límite de viabilidad, esto es solo cierto de sistemas in vitro. El límite de viabilidad in vivo es probablemente más alto. De hecho, la tecnología NINJA™ se ha inyectado en pacientes ampliamente durante los últimos años, especialmente en la articulación temporomandibular que contiene una variedad de condrocitos, fibroblastos y otras poblaciones de células. Las inyecciones de 30 mg de polímero/mL mostraron aumentos significativos en la cicatrización. Por tanto, se pueden tolerar concentraciones in vivo de gel de polímero más altas en el intervalo que parecen comprometer la viabilidad celular in vitro.

Los resultados positivos iniciales sugieren una disolución que tiene una mayor viscosidad que el vehículo para la aplicación de células autólogas. Las disoluciones pueden incluir la formulación NINJA 10 o una variante de la misma.

Las modificaciones y variaciones de los métodos descritos y las composiciones de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica. La invención se ha descrito a propósito de realizaciones preferidas específicas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de suspensión de células para su uso en un procedimiento relacionado con el epitelio, que comprende:

una población de células que incluye células viables y funcionantes derivadas de una muestra de tejido epitelial; y

un agente exógeno que comprende ácido hialurónico;

en donde la población de células, antes de ser usada en un procedimiento relacionado con el epitelio, no se somete a cultivo in vitro y comprende tanto células madre como células no madre;

en donde la población de células, cuando se usa en dicho procedimiento relacionado con el epitelio y se aplica a un sitio receptor, promueven el tratamiento, la cicatrización, la reconstrucción, la exfoliación, la repigmentación y/o la regeneración de tejidos epiteliales.

2. La composición de suspensión de células de la reivindicación 1, en donde la muestra de tejido epitelial se obtiene de uno o más de epitelio de la piel, epitelio respiratorio, epitelio vascular, epitelio corneal y epitelio glandular.

3. La composición de suspensión de células de la reivindicación 1 o 2, en donde cuando la muestra de tejido epitelial es muestra de tejido de piel,

(1) las células viables derivan de una capa dérmica, capa epidérmica, o ambas, una capa dérmica y una epidérmica de la muestra de tejido de piel;

(2) la población de células comprende preferentemente queratinocitos, melanocitos, fibroblastos, células de Langerhans, o cualquier combinación de los anteriores;

(3) la población de células comprende preferentemente células madre de la piel, en donde preferentemente la células madre de la piel se combinan con células no madre; y/o

(4) el procedimiento relacionado con el epitelio comprende preferentemente tratamiento de heridas de la piel, injerto de tejido de piel, procedimiento estético de piel o tratamiento dérmico, en donde la herida de la piel es preferentemente herida aguda, herida artificialmente creada o herida crónica.

4. La composición de suspensión de células de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la población de células se siembra en una matriz o armazón in vitro o in situ en un sitio receptor, para su uso en dicho procedimiento relacionado con el epitelio.

5. La composición de suspensión de células de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el agente exógeno es ácido hialurónico o ácido hialurónico con colágeno.

6. Un método de preparación de células para su uso en un procedimiento relacionado con el epitelio, que comprende:

proporcionar una población de células que incluyen células viables y funcionantes derivadas de una muestra de tejido epitelial; y

exponer la población de células a un agente exógeno que comprende ácido hialurónico;

en donde la población de células, antes de ser usada en un procedimiento relacionado con el epitelio, no se somete a cultivo in vitro y comprende tanto células madre como células no madre.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la muestra de tejido epitelial se obtiene de uno o más de epitelio de la piel, epitelio respiratorio, epitelio vascular, epitelio corneal y epitelio glandular.

8. El método de la reivindicación 6 o 7, en donde cuando la muestra de tejido epitelial es muestra de tejido de la piel (1) las células viables derivan de una capa dérmica, capa epidérmica, o tanto una capa dérmica como una epidérmica de la muestra de tejido de la piel;

(3) la población de células comprende preferentemente células madre de la piel, en donde preferentemente la células madre de la piel se combinan con células no madre; y/o 4

(4) el procedimiento relacionado con el epitelio comprende preferentemente tratamiento de herida de la piel, injerto de tejido de piel, procedimiento estético de piel o tratamiento dérmico, en donde la herida de la piel es preferentemente herida aguda, herida artificialmente creada o herida crónica.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que comprende además sembrar la población de células en una matriz o armazón in vitro o in situ en un sitio receptor.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en donde el agente exógeno es ácido hialurónico o ácido hialurónico con colágeno.