ES2857741T3

ES2857741T3 - Activador de la vía del ácido jasmónico

Info

Publication number: ES2857741T3
Application number: ES16816892T
Authority: ES
Inventors: Marc-Andre D'aoust; Stephanie Robert; Marie-Claire Goulet; Dominique Michaud; Frank Sainsbury
Original assignee: Universite Laval; Medicago Inc
Current assignee: Universite Laval; Medicago Inc
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2021-09-29
Anticipated expiration: 2036-06-30
Also published as: HK1254247A1; CA2991139A1; EP3316677B1; RU2018102745A; WO2017000074A1; US10907168B2; AU2016287799A1; MX2017016366A; RU2018102745A3; IL256156A; EP3316677A1; KR20180088629A; CN107920487A; JP2018524345A; EP3316677A4; PH12017502389A1; RU2728472C2; US20180195078A1; ZA201800555B

Abstract

Un método para enriquecer una proteína heteróloga de interés en una planta o porción de la planta que comprende, i) tratar previamente la planta o porción de la planta con un activador de la vía del jasmonato durante 1 a 14 días, antes de introducir una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés y que está unida operativamente a una región reguladora derivada de un virus vegetal de ADN; ii) introducir la secuencia de nucleótidos en la planta o porción de la planta; e iii) incubar la planta o porción de la planta en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés, el enriquecimiento observado cuando una cantidad de la proteína heteróloga de interés se extrae de la planta o porción de la planta se compara con la proteína heteróloga de interés producida en una segunda planta o porción de la segunda planta que comprende la misma secuencia de nucleótidos y que no se ha tratado previamente con el activador de la vía del jasmonato.

Description

DESCRIPCIÓN

Activador de la vía del ácido jasmónico

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción de proteínas en plantas. Esta invención también se refiere al uso de un activador de la vía del ácido jasmóni

porción de una planta.

Antecedentes de la invención

Las plantas se usan cada vez más como biofábricas para la producción de proteínas recombinantes clínicamente útiles. Las ventajas asociadas con la expresión de proteínas recombinantes producidas en plantas incluyen la maduración postraduccional similar a la de los mamíferos de las cadenas principales de proteínas, bajos costos de infraestructura (en comparación con los sistemas clásicos basados en fermentadores a escala industrial) y problemas de bioseguridad reducidos con respecto a la contaminación del producto con toxinas microbianas o patógenos humanos.

Los enfoques para enriquecer proteínas recombinantes en extractos de plantas se basan a menudo en la elección de un pH o fuerza iónica de un tampón de extracción apropiado para eliminar preferentemente las proteínas del huésped y facilitar su posterior purificación. La precipitación y extracción con sulfato de amonio a pH bajo son útiles en extractos de tejido verde para precipitar contaminantes como restos celulares y pigmentos fotosintéticos. Estos procedimientos también son útiles para precipitar la altamente abundante enzima ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCO) (Peckham y otros, 2006), que representa hasta el 50 % de las proteínas solubles totales (TSP) en las hojas y a menudo complica la preparación de un producto proteico altamente purificado (por ejemplo, Gaeda y otros, 2007).

El jasmonato de metilo (MeJA) es un derivado volátil de la hormona del estrés ácido jasmónico (Okada y otros, 2015). Se han informado efectos de regulación negativa para el MeJA y las señales que inducen el ácido jasmónico, tales como las heridas, la herbivoría o las secreciones orales de insectos sobre la transcripción de genes relacionados con la fotosíntesis (Hermsmeier y otros, 2001; Jung y otros, 2007; Bilgin y otros, 2010; Zubo y otros, 2011; Duceppe y otros, 2012). También se demostró que el MeJA promueve una expresión elevada de genes ribosomales en las hojas, presumiblemente útil para mantener activa la maquinaria de biosíntesis de proteínas en las células que responden a la vía de señalización del jasmonato (Noir y otros, 2013).

Resumen de la invención

planta.

Es un objeto de la invención proporcionar un método mejorado para producir una proteína heteróloga de interés dentro de una planta o una porción de la planta. La invención proporciona un método para enriquecer una proteína heteróloga de interés en una planta o una porción de la planta que comprende,

i) tratar previamente la planta o porción de la planta con un activador de la vía del jasmonato durante 1 a 14 días, antes de introducir una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés y que está unida operativamente a una región reguladora derivada de un virus vegetal de ADN;

ii) introducir la secuencia de nucleótidos en la planta o porción de la planta; e

iii) incubar la planta o porción de la planta en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés, el enriquecimiento observado cuando una cantidad de la proteína heteróloga de interés se extrae de la planta o porción de la planta se compara con la proteína heteróloga de interés producida en una segunda planta o porción de la segunda planta que comprende la misma secuencia de nucleótidos y que no se ha tratado previamente con el activador de la vía del jasmonato.

En algunas modalidades, el virus vegetal de ADN es un virus vegetal de ADN transmitido por insectos. En algunas modalidades, el activador de la vía del jasmonato es jasmonato de metilo, ácido jasmónico, coronatina o cualquier derivado biológicamente activo de los mismos. En algunas modalidades, en la etapa de tratamiento previo, el activador de la vía del jasmonato se pulveriza sobre la planta o porción de la planta o se añade al medio de crecimiento que soporta la planta o porción de la planta. En algunas modalidades, el activador de la vía del jasmonato es un gas o un líquido. En algunas modalidades, la planta o porción de la planta se sumerge en un medio líquido que contiene la secuencia de nucleótidos y el activador de la vía del jasmonato. En algunas modalidades, la proteína heteróloga de interés es un patógeno humano, una proteína viral, una interleucina, una citocina, eritropoyetina, insulina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, un interferón, un factor de la coagulación de la sangre, un receptor, un agonista del receptor, un anticuerpo, un neuropolipéptido, un factor de crecimiento, un regulador del crecimiento, un antígeno, un autoantígeno, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal quimérico, un anticuerpo monoclonal monocatenario, una partícula similar a un virus (VLP) o combinaciones de los mismos.

Se describe un método (A) para aumentar la expresión de una proteína heteróloga de interés en una planta o porción de la planta. El método comprende:

i) tratar la planta o porción de la planta con un activador de la vía del jasmonato;

ii) introducir una secuencia de nucleótidos que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína heteróloga de interés y que está unida operativamente a una región reguladora derivada de un virus vegetal de ADN; en la planta o porción de la planta; e

iii) incubar la planta o porción de la planta en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés, el aumento en la expresión observado cuando una cantidad de la proteína heteróloga de interés se extrae de la planta o porción de la planta se compara con la proteína heteróloga de interés producida en una segunda planta o porción de la segunda planta que comprende la misma secuencia de nucleótidos y que no se ha tratado con el activador de la vía del jasmonato.

El virus vegetal de ADN descrito en el método (A) descrito anteriormente puede ser un virus vegetal de ADN transmitido por insectos. Además, el activador de la vía del jasmonato descrito en el método (A) anterior puede ser jasmonato de metilo, ácido jasmónico, coronatina o cualquier derivado biológicamente activo de jasmonato de metilo, ácido jasmónico o coronatina.

También se describe en la presente descripción un método (A) como se define anteriormente, en donde en la etapa de tratamiento (etapa i), el activador de la vía del jasmónico se aplica como un gas a la planta o porción de la planta, o como un líquido y se pulveriza sobre la planta o porción de la planta, o se añade al medio de crecimiento que soporta la planta o porción de la planta. Alternativamente, la etapa de tratamiento (etapa i) y la de introducción (etapa ii) pueden combinarse de modo que el activador de la vía del jasmónico se introduce en la planta o porción de la planta junto con la secuencia de nucleótidos.

El activador de la vía del jasmónico que se usa en el método (A) descrito anteriormente puede ser un gas o un líquido.

Además, se proporciona un método (A) como se define anteriormente, en donde la secuencia de nucleótidos se introduce en la planta o porción de la planta de manera transitoria mediante el uso de un medio líquido dentro del cual se sumerge la planta o porción de la planta, y el activador de la vía del jasmónico se introduce en el medio líquido en la etapa de tratamiento (etapa i). Alternativamente, las etapas de tratamiento (etapa i) y la de introducción (etapa ii) pueden combinarse de modo que el activador de la vía del jasmónico se introduce en el medio líquido junto con la secuencia de nucleótidos, y el activador de la vía del jasmónico y la secuencia de nucleótidos se introducen en la planta o porción de la planta juntos.

También se proporciona un método (B) para disminuir la proteína soluble total del huésped en una planta o porción de la planta que comprende,

ii) introducir una secuencia de nucleótidos que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga de interés y que está unida operativamente a una región reguladora derivada de un virus vegetal de ADN en la planta o porción de la planta; e

iii) incubar la planta o porción de una planta en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés, la disminución de la proteína total del huésped observada cuando una cantidad de la proteína total del huésped se extrae de la planta o porción de la planta se compara con la proteína total del huésped producida en una segunda planta o porción de la segunda planta que comprende la misma secuencia de nucleótidos pero que no se ha tratado con el activador de la vía del jasmonato.

El virus vegetal de ADN descrito en el método (B) descrito anteriormente puede ser un virus vegetal de ADN transmitido por insectos. Además, el activador de la vía del jasmonato descrito en el método anterior puede ser jasmonato de metilo, ácido jasmónico, coronatina o cualquier derivado biológicamente activo de jasmonato de metilo, ácido jasmónico o coronatina.

También se describe en la presente descripción un método (B) como se define anteriormente, en donde en la etapa de tratamiento (etapa i), el activador de la vía del jasmónico se aplica como un gas a la planta o porción de la planta, o como un líquido y se pulveriza sobre la planta o porción de la planta, o se añade al medio de crecimiento que soporta la planta o porción de la planta. Alternativamente, la etapa de tratamiento (etapa i) y la de introducción (etapa ii) pueden combinarse de modo que el activador de la vía del jasmónico se introduce en la planta o porción de la planta junto con la secuencia de nucleótidos.

El activador de la vía del jasmónico que se usa en el método (B) descrito anteriormente puede ser un gas o un líquido.

Además, se proporciona un método (B) como se define anteriormente, en donde la secuencia de nucleótidos se introduce en la planta o porción de la planta de manera transitoria mediante el uso de un medio líquido dentro del cual se sumerge la planta o porción de la planta, y el activador de la vía del jasmónico se introduce en el medio líquido en la etapa de tratamiento (etapa i). Alternativamente, las etapas de tratamiento (etapa i) y la de introducción (etapa ii) pueden combinarse de modo que el activador de la vía del jasmónico se introduce en el medio líquido junto con la secuencia de nucleótidos, y el activador de la vía del jasmónico y la secuencia de nucleótidos se introducen en la planta o porción de la planta juntos.

Adicionalmente, se proporciona un método (C) para aumentar la expresión de una proteína heteróloga de interés en una planta transgénica o porción de la planta transgénica que comprende,

i) tratar la planta transgénica o porción de la planta transgénica con un activador de la vía del jasmonato, la planta transgénica o porción de la planta transgénica comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés unida operativamente a una región reguladora derivada de un virus vegetal de ADN; e

ii) incubar la planta transgénica o porción de la planta transgénica en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés, el aumento en la expresión observado cuando una cantidad de la proteína heteróloga de interés se extrae de la planta transgénica o porción de la planta transgénica se compara con la proteína heteróloga de interés producida en una segunda planta transgénica o porción de la segunda planta transgénica que comprende la misma secuencia de nucleótidos y no se ha tratado con el activador de la vía del jasmonato.

El activador de la vía del jasmonato descrito en el método (C) anteriormente puede ser jasmonato de metilo, ácido jasmónico, coronatina o cualquier derivado biológicamente activo de jasmonato de metilo, ácido jasmónico o coronatina.

También se describe en la presente descripción un método (C) como se define anteriormente, en donde en la etapa de tratamiento (etapa i), el activador de la vía del jasmónico se aplica como un gas a la planta transgénica o porción de la planta transgénica, o como un líquido y se pulveriza sobre la planta transgénica o porción de la planta transgénica, o se añade al medio de crecimiento que soporta la planta transgénica o porción de la planta transgénica.

Se describe en la presente descripción el uso del activador de la vía del jasmónico, por ejemplo, jasmonato de metilo (MeJA), para inducir un enriquecimiento de una proteína heteróloga recombinante de interés. Puede mejorarse la eficiencia general del procesamiento corriente abajo de proteínas heterólogas expresadas en una planta, lo que incluye el rendimiento de purificación y la contaminación del producto final con proteínas del huésped o sus fragmentos proteolíticos, la reducción de la degradación de proteínas en extractos crudos o medios de cultivo y la optimización de los esquemas de recuperación para el enriquecimiento de proteínas mediante el ajuste de la relación de las proteínas recombinantes con respecto a las del huésped (nativas). Como se describe en la presente descripción, se descubrió que la aplicación de un activador de la vía del jasmónico altera el proteoma en las hojas de las plantas. Sin limitarse por la teoría, esta alteración puede afectar los rendimientos específicos y relativos de la producción de una proteína heteróloga de interés en el tejido vegetal. El tratamiento con MeJA indujo una depleción de los conjuntos de subunidades grandes y pequeñas de RuBisCO y un aumento de los niveles de proteínas de defensa inducibles por jasmonato (por ejemplo, tioninas, inhibidores de la proteasa Ser e hidrolasas antimicrobianas). El aumento de las proteínas de defensa inducibles por jasmonato se redujo con la agroinfiltración. Sin embargo, se mantuvo un ambiente celular empobrecido en RuBisCO en las hojas agroinfiltradas, lo que permitió un enriquecimiento eficaz de las proteínas heterólogas de interés.

En comparación con las plantas que no se trataron con un activador de la vía del jasmónico, el tratamiento mediante el uso de un activador de la vía del jasmónico da como resultado una expresión aumentada de una proteína heteróloga de interés. Adicionalmente, el tratamiento mediante el uso de un activador de la vía del jasmónico da como resultado un enriquecimiento de aproximadamente cinco veces para una proteína heteróloga de interés expresada transitoriamente con relación a RuBisCO. El enriquecimiento en cinco veces de la proteína heteróloga de interés es el resultado de una depleción mayor de dos veces de RuBisCO y un aumento de dos veces aproximadamente en las transcritos de ARNm de la proteína heteróloga de interés y un aumento de dos veces aproximadamente en los niveles de la proteína heteróloga de interés sobre la base del peso fresco.

Por lo tanto, el tratamiento de una planta o porción de una planta con un activador de la vía del jasmónico da como resultado un aumento general en el rendimiento de una proteína heteróloga de interés y un aumento relativo en el rendimiento de una proteína heteróloga de interés en comparación con los niveles de RuBisCO. Al reducir los niveles de RuBisCO, la extracción y purificación de la proteína heteróloga de interés también puede simplificarse debido a la reducción de la contaminación con la proteína de fondo durante el proceso de extracción. Este resumen de la invención no describe necesariamente todas las características de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos en donde:

Las Figuras 1a-1d muestran las proteínas solubles totales (TSP), el perfil de proteoma 1-D y los niveles de subunidades de RuBisCO en hojas de N. benthamiana agroinfiltradas y de control tratadas con el inductor de estrés MeJA 24 h antes de la infección. La Figura 1a muestra las TSP en base al peso fresco en hojas tratadas con MeJA 0, 0,5, 1 o 2 mM. La Figura 1b muestra el perfil de proteínas teñidas con azul de Coomassie en hojas de control y tratadas con MeJA después de SDS-PAGE. Mr, marcadores comerciales de masa molecular; PR, proteínas relacionadas con la patogénesis reguladas positivamente en hojas agroinfiltradas; RbcL y RbcS, subunidad grande y pequeña de RuBisCO, respectivamente; recuadros A, B y C, áreas de gel que contienen proteínas inducibles por MeJA en plantas no infiltradas (ver Tabla 2 para las identidades de las proteínas). Las Figuras 1c y 1d muestran las cantidades relativas de subunidades grandes (RbcL; Figura 1c) y pequeñas (RbsS; Figura 1d) de RuBisCO en hojas tratadas con MeJA según se determinó por densitometría después de la inmunodetección con los anticuerpos apropiados. Las señales de proteína en las inmunotransferencias se cuantificaron mediante el uso del software Phoretix 2-D Expression v. 2005 (NonLinear USA, Durham NC, EE. UU.) después de escanear membranas de nitrocelulosa con un digitalizador Microtek ScanMaker II (Microtek Laboratory, Torrance CA, EE. UU.). Los datos se expresan como niveles relativos en comparación con los controles no tratados asignados a un nivel arbitrario de 1,0. Cada barra en los paneles (a) y (c) es la media de tres valores independientes (réplicas de hojas) ± SE. Las hojas infiltradas se transfectaron con células de A. tumefaciens 24 h después del tratamiento con MeJA. Todas las muestras de plantas se recolectaron siete días después del tratamiento con MeJA (es decir, seis días después de la agroinfiltración para las plantas transfectadas).

Las Figuras 2a-2c muestran el efecto del tratamiento con MeJA sobre la acumulación de proteína PR-2, el número de agrobacterias y el número de transcriptos de las dos proteínas de virulencia de A. tumefaciens VirB 1 y VirE1 en hojas de N. benthamiana. La Figura 2a muestra los efectos del tratamiento con MeJA sobre la acumulación de la proteína PR-2 inducible por patógenos de 33 kDa en hojas de control y agroinfiltradas según se ensayó por densitometría después de la inmunodetección. Las señales de inmunotransferencia se cuantificaron mediante el uso del software Phoretix 2-D Expression v. 2005 (NonLinear USA) después de escanear membranas de nitrocelulosa con un digitalizador Microtek ScanMaker II (Microtek Laboratory). Los datos son la media de las réplicas de tres hojas ± SE. Se asignó un valor arbitrario de 1,0 al nivel de PR-2 en hojas sanas de control. La Figura 2b muestra las bacterias recuperadas de las hojas de N. benthamiana 0, 2, 4 o 6 días después de la agroinfiltración. Los datos se expresan como números logarítmicos de unidades formadoras de colonias (CFU) en placas de agar y cada punto es la media de cinco valores independientes (réplicas de hojas) ± 6 SE. La Figura 2c muestra los números de transcriptos de ARNm para VirB1 y VirE1 en hojas agroinfiltradas tratadas con MeJA 0 o 1 mM, según se ensayó mediante RT PCR en tiempo real con cebadores de ADN apropiados. Cada valor es la media de cinco valores biológicos (réplicas de hojas) ± SE. El asterisco indica un valor significativamente más bajo para los transcriptos de VirB1 en las hojas tratadas con MeJA en comparación con las hojas de control (prueba t de Student; P<0,05).

Las Figuras 3a-3c muestran actividades de proteasa en extractos de proteína cruda de hojas de N. benthamiana agroinfiltradas y de control tratadas con MeJA 0, 0,5, 1 o 2 mM 24 h antes de la infiltración. Los ensayos de proteasa se realizaron in vitro mediante el uso de sustratos de péptidos fluorigénicos específicos para las proteasas Cys de tipo catepsina L (CIA) (Figura 3a), proteasas Ser de tipo tripsina (S1) (Figura 3b) y proteasas Asp de tipo catepsina D/E (A1) (Figura 3c), Las muestras de hojas se recolectaron siete días después del tratamiento con MeJA. Cada barra es la media de tres valores independientes (réplicas de hojas) ± SE.

Las Figuras 4a-4d muestran el rendimiento y la expresión del anticuerpo C5-1 en hojas de N. benthamiana agroinfiltradas tratadas con MeJA 0, 0,5, 1 o 2 mM. La Figura 4a muestra complejos parciales y completos (flecha) de cadena ligera y pesada de C5-1 inmunodetectados después de SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Mr, marcadores comerciales de masa molecular. La Figura 4b muestra el C5-1 ensayado por ELISA en hojas tratadas con MeJA. Los datos se expresan en base al peso (curva cuadrática; r2=0,885) o en una base relativa en comparación con las proteínas solubles totales (histograma). La Figura 4c muestra las transcriptos de ARNm para las cadenas ligeras (LC) y pesadas (HC) de C5-1 en hojas tratadas con MeJA 0 o 1 mM, según se ensayó mediante RT PCR en tiempo real. La Figura 4d muestra el C5-1 ensayado por ELISA en hojas tratadas con MeJA 0, 0,5 o 1 mM 24 h después de la infiltración o con ácido araquidónico 1 mM 24 h antes o después de la infiltración. Cada barra o punto en los paneles (b), (c) y (d) es la media de cinco valores independientes (réplica de hojas) ± SE.

La Figura 5 muestra la inmunodetección de la proteína PRD2 de 33DkDa de N. benthamiana en extractos de proteína cruda de hojas de control y agroinfectadas tratadas con MeJA 0, 0,5 o 1 mM o con ácido araquidónico (AA) 1 mM, 24 h antes (panel superior) o después (panel inferior) de la agroinfiltración. Mr, marcadores de masa molecular. Las agroinfiltraciones incluyeron tratamientos con A. tumefaciens que alberga o bien un 'vector vacío' pcambia2300 o el vector de codificación C5-1--D.

La Figura 6 muestra el rendimiento del anticuerpo C5-1 en hojas de N. benthamiana agroinfiltradas tratadas con MeJA 0 o 1 mM. Las secuencias codificantes de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo C5-1 se expresaron bajo el control del promotor de plastocianina de alfalfa (documento US 7,125,978). Los datos se presentan en base al peso de la hoja. Cada barra es la media de cinco valores independientes (réplicas de hojas) ± SE.

Descripción detallada

La siguiente descripción es de una modalidad preferida.

planta.

Como se usa en la presente descripción, los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" y variaciones gramaticales de los mismos, son inclusivos o abiertos y no excluyen elementos y/o etapas del método adicionales no mencionados. El término "que consiste esencialmente en" cuando se usa en la presente descripción en relación con un uso o método, indica que pueden presentarse elementos y/o etapas del método adicionales, pero que estas adiciones no afectan materialmente la manera en que funciona el método o uso mencionado. El término "que consiste en" cuando se usa en la presente descripción en relación con un uso o método, excluye la presencia de elementos y/o etapas del método adicionales. Un uso o método descrito en la presente descripción como que comprende ciertos elementos y/o etapas también puede, en ciertas modalidades, consistir esencialmente en esos elementos y/o etapas, y en otras modalidades consiste en esos elementos y/o etapas, ya sea que estas modalidades se refieran o no específicamente a ellos. Además, el uso del singular incluye el plural y "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. El término "pluralidad" como se usa en la presente descripción significa más de uno, por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, y similares. A menos que se defina lo contrario en la presente descripción, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica. Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" se refiere a una variación de aproximadamente /- 10 % de un valor dado. Debe entenderse que dicha variación siempre se incluye en cualquier valor dado proporcionado en la presente descripción, ya sea si se refiera específicamente o no a ella. El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa en la presente descripción junto con el término "que comprende" puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno."

Como se describe con más detalle más abajo, se proporciona un método para aumentar la expresión de una proteína heteróloga de interés en una planta o porción de la planta. El método comprende:

iii) incubar la planta o porción de la planta en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés, el aumento en la expresión observado cuando una cantidad de la proteína heteróloga de interés se extrae de la planta o porción de la planta se compara con la proteína heteróloga de interés producida en una segunda planta o porción de la segunda planta que comprende la misma secuencia de nucleótidos, y que se ha tratado de manera análoga, pero no se ha tratado con el activador de la vía del jasmonato.

Las etapas de tratamiento (etapa i) y de introducción (etapa ii) pueden combinarse de modo que el activador de la vía del jasmónico se introduce en la planta o porción de la planta al mismo tiempo, junto con la secuencia de nucleótidos.

Además, se proporciona un método para reducir la proteína soluble total del huésped en una planta o porción de la planta, para reducir la proteína de fondo del huésped y simplificar la purificación de una proteína heteróloga de interés. El método comprende,

iii) incubar la planta o porción de la planta en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés, la disminución de la proteína total del huésped observada cuando una cantidad de la proteína total del huésped se extrae de la planta o porción de la planta se compara con la proteína total del huésped producida en una segunda planta o porción de la segunda planta que comprende la misma secuencia de nucleótidos, y que se ha tratado de manera análoga, pero que no se ha tratado con el activador de la vía del jasmonato.

Además, se proporciona un método para aumentar la expresión de una proteína heteróloga de interés en una planta transgénica o porción de la planta transgénica. El método comprende:

ii) incubar la planta transgénica o porción de la planta transgénica en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés, el aumento en la expresión observado cuando una cantidad de la proteína heteróloga de interés se extrae de la planta transgénica o porción de la planta transgénica se compara con la proteína heteróloga de interés producida en una segunda planta transgénica o porción de la segunda planta transgénica que comprende la misma secuencia de nucleótidos, y que se ha tratado de manera análoga, pero que no se ha tratado con el activador de la vía del jasmonato.

Por "unida operativamente" se entiende que las secuencias particulares interactúan ya sea directa o indirectamente para llevar a cabo una función prevista, tal como la mediación o la modulación de la expresión de una secuencia de ácido nucleico. La interacción de secuencias unidas operativamente puede, por ejemplo, estar mediada por proteínas que interactúan con las secuencias unidas operativamente.

Se sabe que las moléculas de señalización de jasmonato regulan las respuestas de las plantas a una variedad de estrés ambiental, por ejemplo, heridas, estrés por sequía, ataque de patógenos o ataque de plagas. La vía del jasmonato implica varios eventos de transducción de señales. Después de una herida primaria o un estímulo de estrés, se produce una señal local y sistémica que induce la biosíntesis de jasmonato. El jasmonato interactúa con las salidas del ácido salicílico (reducen vía del salicílico), el etileno y otras vías de señalización. La señalización en la vía del jasmonato implica interacciones de proteínas que forman un complejo SCF(COI1) (una ligasa E3-ubiquitina) y un complejo CSN (señalosoma COP9). El SCF(COI1) interactúa con el CSN para controlar la mayoría de las bien caracterizadas respuestas del jasmonato. Por ejemplo, el complejo CSN/SCF(COI1) se dirige a los represores transcripcionales, lo que incluye las proteínas del JAZ, para la poliubiquitinación y su modificación o degradación por el proteasoma 26S.

Por ejemplo, se sabe que el MeJA y las señales inductoras de ácido jasmónico asociadas, tales como heridas, herbivoría o secreciones orales de insectos, regulan negativamente la transcripción de genes relacionados con la fotosíntesis (Hermsmeier y otros, 2001; Jung y otros, 2007; Bilgin y otros, 2010; Zubo y otros, 2011; Duceppe y otros, 2012). Estos efectos supresores pueden asociarse con una acumulación de proteínas relacionadas con el estrés y enzimas que metabolizan el carbono en las hojas, y pueden conducir a niveles reducidos de RuBisCO (Giri y otros, 2006; Wei y otros, 2009; Duceppe y otros, 2012; Ullmann-Zeunert y otros, 2013; Mahajan y otros, 2014; Leuzinger y otros, 2013).

Por "activador de la vía del jasmonato" se entiende cualquier compuesto que pueda activar la vía del jasmonato dentro de una planta. Sin limitarse por la teoría, un activador de la vía del jasmonato puede dar como resultado la degradación de las proteínas del dominio ZIM del jasmonato (JAZ) que se unen y reprimen la actividad de los factores de transcripción que modulan la transcripción de genes sensibles al jasmonato. La interacción entre SCF(COI1) y represores de JAZ puede dar como resultado la degradación de las proteínas JAZ y la posterior desrepresión de factores de transcripción, tales como MYC2.

El activador puede ser un líquido o un gas. Por ejemplo, lo que no debe considerarse limitante, el activador de la vía del jasmonato puede ser jasmonato de metilo:

Jasmonato de metilo (+)-6

ácido jasmónico: o coronatina:

La coronatina es una fitotoxina producida por el patógeno vegetal Pseudomonas syringae que está estructuralmente relacionada con el jasmonato de metilo (MeJA) y produce efectos similares cuando se aplica a las plantas (Feys y otros, 1994).

Otros ejemplos de activadores de la vía del jasmonato incluyen equivalentes funcionales de MeJA, por ejemplo, pero sin limitarse a, derivados, análogos o precursores biológicamente activos del ácido jasmónico tales como ácido jasmónico (libre), coronatina (microbiana), precursores de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) (por ejemplo, ácido alfa-linolénico) o sus productos de oxidación, derivados del ácido jasmónico (excepto MeJA), por ejemplo, cisjasmona, jasmonoil isoleucina (JA-Ile), jasmonoil ACC. Adicionalmente, pueden usarse análogos sintéticos de jasmonato, por ejemplo, BLUSh™ (prohidrojasmon (propil-3-oxo-2-pentilciclo-pentilacetato; comercializado por Fine Agrochemicals Ltd.), y el Compuesto I (5,7,9,10-tetrabromo derivado de metil jasmonato, un derivado activo).

El activador de la vía del jasmónico puede aplicarse a la planta o porción de la planta mediante la exposición (o el tratamiento previo) de la planta o porción de la planta al activador durante un período de tiempo, por ejemplo, de aproximadamente 0 horas a 14 días o cualquier tiempo intermedio, antes de introducir la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés. Por ejemplo, la planta o porción de la planta puede tratarse previamente con el compuesto activador aproximadamente a las 0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 552, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 horas o cualquier tiempo intermedio, o el activador puede aplicarse aproximadamente a los 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 días o cualquier tiempo intermedio, antes de introducir el ácido nucleico que codifica la proteína de interés en la planta o porción de la planta.

El activador de la vía del jasmónico también puede aplicarse a una planta transgénica o porción de la planta transgénica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de interés, mediante la exposición de la planta transgénica o porción de la planta transgénica al activador durante un período de tiempo, por ejemplo, de aproximadamente 0 horas a 14 días o cualquier tiempo intermedio, antes de extraer la proteína de interés. Por ejemplo, la planta transgénica o porción de la planta transgénica puede tratarse con el compuesto activador aproximadamente a las 0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 552, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 horas o cualquier tiempo intermedio, o el activador puede aplicarse aproximadamente a los 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 días o cualquier tiempo intermedio, antes de extraer la proteína de interés de la planta transgénica o porción de la planta transgénica.

Si el activador está en forma líquida, puede pulverizarse sobre las hojas y otros órganos de la planta según se desee para que el activador pueda interactuar con la planta o parte de la planta antes de la etapa de introducción de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés en la planta o porción de la planta, o extraer la proteína de interés de la planta transgénica o porción de la planta transgénica que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína heteróloga de interés. Si el activador es un gas, entonces la planta o porción de la planta puede alojarse en un ambiente sellado para que el gas pueda interactuar con la planta o porción de la planta antes de la etapa de introducir la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés en la planta o porción de la planta, o antes de extraer la proteína de interés de la planta transgénica o porción de la planta transgénica que expresa la proteína heteróloga de interés.

Alternativamente, si la secuencia de nucleótidos se introduce en la planta o porción de la planta de manera transitoria mediante el uso de un medio líquido dentro del cual se sumerge la planta o porción de la planta durante un período de tiempo antes de introducir el ácido nucleico que codifica la proteína de interés en la planta o porción de la planta, entonces el activador de la vía del jasmónico puede introducirse en el medio líquido. Por ejemplo, la planta o porción de la planta puede tratarse previamente de aproximadamente 0 horas a aproximadamente 24 horas o cualquier tiempo intermedio, antes de introducir el ácido nucleico que codifica la proteína de interés en la planta o porción de la planta. Alternativamente, la etapa de exponer (tratar) la planta o porción de la planta, y la etapa de introducir la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés en la planta o porción de la planta, pueden combinarse de modo que el activador de la vía del jasmónico se introduce en el medio líquido junto con la secuencia de nucleótidos, de modo que el activador de la vía del jasmónico y la secuencia de nucleótidos se introducen juntos en la planta o porción de la planta.

Como se describe en la presente descripción, el activador de la vía del jasmónico también puede aplicarse a una planta transgénica o porción de la planta transgénica que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga unida operativamente a una región reguladora derivada de un virus vegetal de ADN, y que codifica una proteína heteróloga de interés, para aumentar la expresión de la proteína heteróloga de interés en la planta transgénica o porción de la planta transgénica. En este método, la planta transgénica o porción de la planta transgénica que expresa la secuencia de nucleótidos heteróloga se trata con un activador de la vía del jasmonato y se incuba durante un período de tiempo en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína heteróloga de interés. El aumento en la expresión de la proteína heteróloga de interés puede observarse mediante la comparación del rendimiento de la proteína heteróloga de interés extraída de la planta transgénica o porción de la planta transgénica en comparación con la proteína heteróloga de interés producida en una segunda planta transgénica o porción de la segunda planta transgénica que comprende la misma secuencia de nucleótidos, y que se ha tratado de manera análoga, pero que no se ha tratado con el activador de la vía del jasmonato.

Sin limitarse por la teoría, mediante el uso de un compuesto que es selectivo para inducir la vía del jasmonato (es decir, un activador de la vía del jasmonato), pueden activarse inhibidores de proteasas endógenas, lo que reduce de esta manera la degradación in vivo de la proteína heteróloga de interés. Por ejemplo, el factor de transcripción MYC2, que está implicado en la señalización del jasmonato, regula positivamente los genes implicados en las respuestas a las heridas, pero regula negativamente los genes implicados en la defensa de patógenos (Lorenzo y otros, 2004). Además, al activar la vía del jasmonato, la vía del ácido salicílico puede regularse negativamente. La activación de la vía del ácido salicílico puede dar como resultado un aumento de la actividad de las proteasas endógenas. Por lo tanto, al regular negativamente la vía del ácido salicílico, se reduce la actividad de la proteasa vegetal endógena.

Mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción, el rendimiento de purificación y la contaminación de la proteína heteróloga de interés con las proteínas del huésped, sus fragmentos proteolíticos, o tanto las proteínas del huésped como sus fragmentos proteolíticos, y la reducción de la degradación de proteínas en extractos crudos, pueden mejorarse mediante el ajuste de la relación de la proteína heteróloga de interés con respecto a las proteínas del huésped (nativas). Se encontró que la aplicación de un activador de la vía del jasmónico alteraba el proteoma en las hojas de las plantas y provocaba un enriquecimiento de una proteína heteróloga recombinante de interés. Sin limitarse por la teoría, esta alteración puede afectar los rendimientos específicos y relativos de la producción de una proteína heteróloga de interés en el tejido vegetal. El tratamiento de una planta o porción de una planta con un activador de la vía del jasmonato indujo una depleción de los conjuntos de subunidades grandes y pequeñas de RuBisCO y un aumento de los niveles de proteínas de defensa inducibles por jasmonato (por ejemplo, tioninas, inhibidores de la proteasa Ser e hidrolasas antimicrobianas). El aumento de las proteínas de defensa inducibles por jasmonato se redujo con la agroinfiltración. Sin embargo, se mantuvo un ambiente celular empobrecido en RuBisCO en las hojas agroinfiltradas, lo que permitió un enriquecimiento eficaz de las proteínas heterólogas de interés.

En comparación con las plantas que no se trataron con un activador de la vía del jasmónico (pero que se trataron de manera análoga), el tratamiento mediante el uso de un activador de la vía del jasmónico dio como resultado un aumento de la expresión de una proteína heteróloga de interés. Adicionalmente, el tratamiento con un activador de la vía del jasmónico dio como resultado un enriquecimiento de aproximadamente cinco veces para una proteína heteróloga de interés expresada transitoriamente con relación a RuBisCO. El enriquecimiento en cinco veces de la proteína heteróloga de interés es el resultado de una depleción mayor de dos veces de RuBisCO y un aumento de dos veces en los transcriptos de ARNm de la proteína heteróloga de interés, y un aumento de dos veces en los niveles de proteína heteróloga de interés en base al peso fresco.

Por lo tanto, el tratamiento de una planta o porción de una planta con un activador de la vía del jasmónico da como resultado un aumento general en el rendimiento de una proteína heteróloga de interés, y un aumento relativo en el rendimiento de una proteína heteróloga de interés en comparación con los niveles de RuBisCO. Al reducir los niveles de RuBisCO, la extracción y la purificación de la proteína heteróloga de interés también pueden simplificarse debido a la reducción de la contaminación con la proteína de fondo durante el proceso de extracción.

Como se describe en la presente descripción, se observó un aumento en la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una proteína de interés cuando el ácido nucleico que codifica la proteína de interés se unió operativamente a una región reguladora que comprende un promotor obtenido de un virus vegetal de ADN, por ejemplo, el promotor 35S No se observó dicho aumento en la expresión de la secuencia de nucleótidos cuando se usó la región reguladora de un gen fotosintético (por ejemplo, el promotor de plastocianina). Sin limitarse por la teoría, las condiciones que inducen la activación de la vía del jasmonato, el activador de la vía del jasmonato o tanto las condiciones que inducen la activación de la vía del jasmonato como el activador de la vía del jasmonato, también pueden ser beneficiosas para la actividad de una región reguladora que comprende un promotor obtenido de un virus vegetal de ADN. Las condiciones que inducen la activación de la vía del jasmonato, el activador de la vía del jasmonato o tanto las condiciones que inducen la activación de la vía del jasmonato como el activador de la vía del jasmonato, pueden incluir condiciones de estrés o ataque de patógenos, lo que incluye la ingestión de la planta por insectos, y transmisión de cualquier virus vegetal de ADN asociado del insecto a la planta.

La región reguladora que comprende un promotor que se usará en los métodos descritos en la presente descripción puede obtenerse de cualquier virus vegetal de ADN, lo que incluye los virus de las familias Caulimoviridae, Geminiviridae y Nanoviridae. Los ejemplos de promotores, que no deben considerarse limitantes, incluyen promotores obtenidos de un gen de un virus de la familia Caulimoviridae, lo que incluye el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell y otros, 1985, Nature, 313: 810-812). De manera similar, los ejemplos de promotores de un virus de las familias Geminiviridae y Nanoviridae incluyen los de los genes Rep y CP del virus Burewala de la hoja rizada del algodón (Khan y otros, 2015, PLoS ONE 10(3): e0121656) y los del C1 a C11 del virus del enanismo de la veza de la leche (Shirasawa-Seo y otros, 2005, J Gen Virol 86: 1851-1860), respectivamente.

Como se describe en la presente descripción, se proporciona un casete de expresión que comprende en serie, un promotor o una región reguladora de la planta obtenida de un virus vegetal de ADN, unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés y una secuencia 3'UTR y una secuencia terminadora. Como apreciaría un experto en la técnica, la secuencia de terminación (terminador) puede ser cualquier secuencia que esté activa en la planta huésped, por ejemplo, la secuencia de terminación puede ser un terminador NOS.

"Casete de expresión" se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende un ácido nucleico de interés bajo el control de, y unido operablemente (u operativamente) a, un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la transcripción del ácido nucleico de interés en una célula huésped.

La región reguladora también puede comprender elementos reguladores adicionales, por ejemplo, pero sin limitarse a, potenciadores de la expresión. Los potenciadores de la expresión adecuados incluyen potenciadores obtenidos de 5'Ut R de CPMV como se describe en Sainsbury y otros, 2008 (Plant Physiol. 148:1212-1218); los documentos WO 2009/087391, PCT/CA2015/050009, PCT/CA2015/050240. El potenciador de la expresión puede unirse operativamente en el extremo 5' de la secuencia potenciadora con una región reguladora que está activa en una planta, y unirse operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés en el extremo 3' del potenciador de la expresión, para dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés dentro de una planta huésped.

Por "secuencia de nucleótidos (o ácido nucleico) de interés", "región codificante de interés" o proteína de interés, se entiende cualquier secuencia de nucleótidos o región codificante (estos términos pueden usarse indistintamente) que se expresará dentro de un organismo huésped, por ejemplo una planta, para producir una proteína de interés. Dicha secuencia de nucleótidos de interés puede codificar, pero no se limita a, proteínas heterólogas, proteínas heterólogas modificadas, una enzima industrial o una enzima industrial modificada, una proteína agrícola o una proteína agrícola modificada, una proteína auxiliar, un suplemento proteico, una proteína farmacéuticamente activa, un nutracéutico, un producto de valor agregado o un fragmento del mismo para piensos, alimentos o tanto para su uso en piensos como en alimentos, una enzima industrial, por ejemplo, celulasa, xilanasa, proteasa, peroxidasa, subtilisina.

La secuencia de nucleótidos de interés o la región codificante de interés también puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína farmacéuticamente activa, por ejemplo factores de crecimiento, reguladores del crecimiento, anticuerpos, antígenos y fragmentos de los mismos, o sus derivados útiles para la inmunización o vacunación y similares. Dichas proteínas incluyen, pero no se limitan a, una proteína que es un patógeno humano, una proteína viral, por ejemplo, pero sin limitarse a, una o más proteínas del virus sincitial respiratorio (RSV), rotavirus, virus de la influenza, virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), virus de la rabia, virus del papiloma humano (HPV), enterovirus 71 (EV71) o interleucinas, por ejemplo, una o más de una de IL-1 a IL-24, IL-26 e IL-27, citocinas, eritropoyetina (EPO), insulina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF o combinaciones de los mismos, interferones, por ejemplo, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, factores de coagulación de la sangre, por ejemplo, Factor VIII, Factor IX o tPA hGH, receptores, agonistas de receptores, anticuerpos, por ejemplo, pero sin limitarse a, Rituxan, neuropolipéptidos, insulina, vacunas, factores de crecimiento, por ejemplo, pero sin limitarse a, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento de transformación, reguladores del crecimiento, antígenos, autoantígenos, fragmentos de los mismos o combinaciones de los mismos, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal quimérico, un anticuerpo monoclonal monocatenario, una partícula similar a un virus (VLP) o combinaciones de los mismos.

La proteína de interés también puede incluir una hemaglutinina de influenza (HA; ver el documento WO 2009/009876). La HA es una glicoproteína de membrana de tipo I homotrimérica, que generalmente comprende un péptido señal, un dominio HA1 y un dominio HA2 que comprende un sitio de anclaje que abarca la membrana en el extremo C-terminal y una cola citoplasmática pequeña. Las secuencias de nucleótidos que codifican HA se conocen bien y están disponibles (ver, por ejemplo, la Base de Datos BioDefense and Public Health (Influenza Research Database; Squires y otros, 2008 Nucleic Acids Research 36:D497-d503) en URL: biohealthbase.org/GSearch/home.do?decorator=Influenza; o las bases de datos mantenidas por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (ver URL: ncbi.nlm.nih.gov).

Una proteína HA puede ser de una influenza tipo A, una influenza tipo B o es un subtipo de influenza HA tipo A seleccionada del grupo de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16. En algunos aspectos de la invención, la HA puede ser de una influenza tipo A, seleccionada del grupo H1, H2, H3, H5, H6, H7 y H9. Los fragmentos de las HA enumeradas anteriormente también pueden considerarse una proteína de interés. Además, los dominios de un tipo o subtipo de las HA enumeradas anteriormente pueden combinarse para producir HA quiméricas (ver, por ejemplo, el documento WO2009/076778).

Los ejemplos de subtipos que comprenden proteínas HA incluyen A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/Nueva York/1995, A/gaviota argéntea/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/ánade/MN/33/00, A/pato/Shanghai/1/2000, A/ánade rabudo/TX/828189/02, A/Pavo/Ontario/6118/68 (H8N4), A/pato cuchareta/Irán/G54/03, A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56(H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5), A/Gaviota/Maryland/704/77 (H13N6), A/Ánade/Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburgo/66, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong-Kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)).

La proteína HA puede ser un subtipo H1, H2, H3, H5, H6, H7 o H9. Por ejemplo, la proteína H1 puede ser de la cepa A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1), A/California/04/2009 (H1N1) o A/California/07/2009 (H1N1). La proteína h3 también puede ser de la cepa A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/Texas/50/2012 (H3N2), A/Hawaii/22/2012 (H3N2), A/Nueva York/39/2012 (H3N2) o A/Perth/16/2009 (H3N2). La proteína H2 puede ser de la cepa A/Singapur/1/57 (H2N2). La proteína H5 puede ser de la cepa A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) o A/Indonesia/5/2005. La proteína H6 puede ser de la cepa A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1). La proteína H7 puede ser de la cepa A/Equino/Praga/56 (H7N7), o H7 A/Hangzhou/1/2013, A/Anhui/1/2013 (H7N9) o A/Shanghai/2/2013 (H7N9). La proteína H9 es de la cepa A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). La proteína HA puede ser de un virus de la influenza que puede ser un virus tipo B, lo que incluye virus similar a B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, B/Brisbane/60/08, B/Massachusetts/2/2012 (linaje de Yamagata) o B/Wisconsin/1/2010 (linaje de Yamagata). Los ejemplos no limitantes de secuencias de aminoácidos de las proteínas HA de los subtipos H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 o B incluyen secuencias como se describe en los documentos WO 2009/009876, WO 2009/076778, WO 2010/003225. La proteína HA del virus de la influenza puede ser H5 Indonesia.

La HA también puede ser una HA quimérica, en donde un dominio transmembrana nativo de la HA se reemplaza por un dominio transmembrana heterólogo. El dominio transmembrana de las proteínas HA está muy conservado (ver, por ejemplo, la Figura 1C del documento WO 2010/148511). El dominio transmembrana heterólogo puede obtenerse de cualquier dominio transmembrana HA, por ejemplo, pero sin limitarse al dominio transmembrana de H1 California, B/Florida/4/2006 (GenBank Número de acceso a Ca 33493.1), B/Malasia/2506/2004 (GenBank Número de acceso ABU99194.1), H1/Bri (GenBank Número de acceso ADE28750.1), H1 A/Islas Salomón/3/2006 (GenBank Número de acceso ABU99109.1), H1/NC (GenBank Número de acceso AAP34324.1), H2 A/Singapur/1/1957 (GenBank Número de acceso AAA64366.1), H3 A/Brisbane/10/2007 (GenBank Número de acceso ACI26318.1), H3 A/Wisconsin/67/2005 (GenBank Número de acceso ABO37599.1), H5 A/Anhui/1/2005 (GenBank Número de acceso ABD28180.1), H5 A/Vietnam/1194/2004 (GenBank Número de acceso ACR48874.1), H5-Indo (GenBank Número de acceso ABW06108.1). El dominio transmembrana también puede definirse por la siguiente secuencia de aminoácidos consenso:

iLXiYystvAiSslXIXXmlagXsXwmcs (SEQ ID NO:1)

Si la proteína de interés es una VLP, entonces la VLP puede comprender una forma precursora de HA0, o los dominios HA1 o HA2 retenidos juntos por la forma de puentes disulfuro. Una VLP puede tener un tamaño promedio de aproximadamente 20 nm a 1 pm o cualquier cantidad intermedia, por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150 160, 170, 180, 190 o 200 nm, o cualquier cantidad intermedia, por ejemplo, 100 nm, y puede incluir una membrana lipídica. La VLP puede estar envuelta o no envuelta, por ejemplo, una proteína de la envoltura viral, una proteína estructural viral, una proteína de la cápside viral o una proteína de la cubierta viral. La VLP puede comprender además uno o más lípidos, fosfolípidos, ácidos nucleicos, membranas o similares.

El término "partícula similar a virus" (VLP), o "partículas tipo virus" o "VLP" se refiere a estructuras que se autoensamblan y comprenden proteínas estructurales tales como la proteína HA de influenza. Generalmente las VLP son morfológica y antigénicamente similares a los viriones producidos en una infección, pero carecen de información genética suficiente para replicarse y, por lo tanto, no son infecciosas. En algunos ejemplos, las VLP pueden comprender una sola especie de proteína o más de una especie de proteína. Para las VLP que comprenden más de una especie de proteína, la especie de proteína puede ser de la misma especie de virus, o puede comprender una proteína de una especie, género, subfamilia o familia de virus diferentes (según lo designado por la nomenclatura de ICTV). En otros ejemplos, una o más de las especies de proteínas que comprenden una VLP pueden modificarse a partir de la secuencia de origen natural. Las VLP pueden producirse en células huésped adecuadas, lo que incluye las células huésped de plantas e insectos. Tras la extracción de la célula huésped y tras el aislamiento y posterior purificación en condiciones adecuadas, las VLP pueden purificarse como estructuras intactas.

Las VLP producidas a partir de proteínas derivadas de la influenza, de acuerdo con la presente descripción, no comprenden proteína M1. Se sabe que la proteína M1 se une al ARN (Wakefield y Brownlee, 1989), que es un contaminante de la preparación de VLP. La presencia de ARN no se desea cuando se obtiene la aprobación regulatoria para el producto de VLP, por lo tanto, una preparación de VLP que carece de ARN puede ser ventajosa. La HA puede comprender un péptido señal nativo o no nativo; el péptido señal no nativo puede ser de origen vegetal. Por ejemplo, el péptido señal puede ser un péptido señal de proteína disulfuro isomerasa (PDI). El péptido señal nativo puede corresponder al de la hemaglutinina que se expresa o puede corresponder a una segunda hemaglutinina.

La presente descripción también proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias que codifican una proteína HA. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender además una o más regiones reguladoras unidas operativamente a la secuencia que codifica una proteína HA. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender una secuencia que codifica una H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o HA de influenza tipo B. Por ejemplo, la proteína HA codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser un subtipo H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9, un HA de tipo B. La proteína H1 codificada por el ácido nucleico puede ser de la cepa A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1), A/California/04/2009 (H1N1) o A/California/07/2009 (H1N1). La proteína H3 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/Texas/50/2012 (H3N2), A/Hawaii/22/2012 (H3N2), A/Nueva York/39/2012 (H3N2) o A/Perth/16/2009 (H3N2). La proteína H2 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Singapur/1/57 (H2N2). La proteína H5 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser la cepa A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) o A/Indonesia/5/2005. La proteína H6 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1). La proteína H7 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Equino/Praga/56 (H7N7) o h7 A/Hangzhou/1/2013, A/Anhui/1/2013 (H7N9) o A/Shanghai/2/2013 (H7N9). Adicionalmente, la proteína H9 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). La proteína HA codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de un virus de la influenza tipo B, lo que incluye virus similar a B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, B/Brisbane/60/08, B/Massachusetts/2/2012 (linaje Yamagata) o B/Wisconsin/1/2010 (linaje Yamagata). Los ejemplos no limitantes de secuencias de aminoácidos de las proteínas HA de los subtipos H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 o B incluyen secuencias como se describe en los documentos WO 2009/009876, WO 2009/076778, WO 2010/003225. La proteína HA del virus de la influenza puede ser H5 Indonesia.

La proteína de interés (o región codificante de interés) puede comprender un péptido señal nativo o no nativo; el péptido señal no nativo puede ser de origen vegetal u obtenido a partir de un polipéptido animal o bacteriano. El péptido señal nativo puede corresponder al de la proteína de interés que se expresa, adicionalmente, el péptido señal puede ser de una proteína estructural o hemaglutinina de un virus distinto de la influenza. Los ejemplos no limitantes de un péptido señal que puede usarse es el de la proteína disulfuro isomerasa de alfalfa (PDI SP; nucleótidos 32-103 de número de acceso Z11499) o el péptido señal de patatina (PatA SP; nucleótidos localizados 1738 - 1806 de GenBank número de acceso A08215). La secuencia de nucleótidos de PatA SP para este número de acceso es:

ATGGCAACTACTAAAACTTTTTTAATTTTATTTTTTATGATATTAGCAACTACTA GTTCAACATGTGCT (SEQ ID NO: 2);

la secuencia de aminoácidos del péptido señal de patatina A es:

MATTKTFLILFFMILATTSSTCA (SEQ ID NO: 3)

La región codificante de interés o la secuencia de nucleótidos de interés puede expresarse en cualquier planta huésped adecuado que o bien se transforma o comprende las secuencias de nucleótidos, o moléculas de ácido nucleico, o constructos genéticos o vectores de la presente descripción. Los ejemplos de plantas huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Arabidopsis, cultivos agrícolas que incluyen, por ejemplo, canola, Brassica spp., maíz, Nicotiana spp., (tabaco), por ejemplo, Nicotiana benthamiana, alfalfa, patata, batata (Ipomoea batatus), ginseng, guisante, avena, arroz, soja, trigo, cebada, girasol, algodón, maíz, centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), cártamo (Carthamus tinctorius).

Los términos "biomasa", "materia vegetal" o "porción de una planta" como se usan en la presente descripción se refieren a cualquier material derivado de una planta. La biomasa o materia vegetal puede comprender una planta completa o parte de la planta, lo que incluye la hoja, raíz, tallo, flor, semilla, también puede incluir cualquier tejido de la planta, cualquier célula de la planta o cualquier fracción de la planta, parte o la planta, tejido o célula. Además, la biomasa o materia vegetal puede comprender componentes vegetales intracelulares, componentes vegetales extracelulares, extractos líquidos o sólidos de plantas o una combinación de los mismos. Además, la biomasa o materia vegetal puede comprender plantas, células vegetales, tejidos, un extracto líquido o una combinación de los mismos, de hojas, tallos, frutos, raíces de las plantas o una combinación de los mismos. Una porción de una planta puede comprender materia vegetal o biomasa.

La proteína de interés puede extraerse y purificarse de la planta o porción de la planta mediante el uso de técnicas de purificación conocidas, lo que incluye la precipitación en presencia de una sal o PEG, cromatografía o que incluye la exclusión por tamaño, el intercambio iónico, la afinidad o una combinación de los mismos, la filtración y similares (ver Wilken, L.R. y Nikolov, Z.L. 2012, Biotechnol. Adv. 30, 419-433). El uso de un tampón de extracción a 4 °C y que tiene un pH de 7,0 o superior también puede reducir cualquier actividad proteolítica endógena durante la extracción.

Los términos "por ciento de similitud" o "por ciento de identidad" cuando se refieren a una secuencia particular se usan, por ejemplo, como se establece en el programa de software GCG de la Universidad de Wisconsin o mediante alineamiento manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros, eds. suplemento de 1995). Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. Puede realizarse un alineamiento óptimo de secuencias para la comparación, mediante el uso de, por ejemplo, el algoritmo de Smith y Waterman, (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), mediante el algoritmo de alineamiento de Needleman y Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48:443), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo: GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.).

Un ejemplo de un algoritmo adecuado para determinar el por ciento de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y otros, (1977, Nuc. Acids Res.

25:3389-3402) y Altschul y otros, (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410), respectivamente. Se usan BLAST y BLAST 2.0, con los parámetros descritos en la presente descripción, para determinar el por ciento de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos y las proteínas de la descripción. Por ejemplo, el programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) puede usar como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP puede usar como valores predeterminados una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (ver URL: ncbi.nlm.nih.gov/).

Por "región reguladora", "elemento regulador" o "promotor" se entiende una porción de ácido nucleico típicamente, pero no siempre, corriente arriba de la región codificante de proteínas de un gen, que puede estar compuesto por ADN o ARN, o tanto ADN como ARN. Cuando una región reguladora está activa, y en asociación operativa o unida operativamente, con un gen de interés, esta puede dar como resultado la expresión del gen de interés. Un elemento regulador puede ser capaz de mediar la especificidad en un órgano o controlar la activación de genes por el desarrollo o temporal. Una "región reguladora" incluye elementos promotores, elementos promotores mínimos que exhiben una actividad promotora basal, elementos que son inducibles en respuesta a un estímulo externo, elementos que median la actividad promotora tales como elementos reguladores negativos o potenciadores de la transcripción. "Región reguladora", como se usa en la presente descripción, también incluye elementos que son activos después de la transcripción, por ejemplo, elementos reguladores que modulan la expresión génica tales como potenciadores de la transcripción y la traducción, represores de la transcripción y la traducción, secuencias activadoras corriente arriba y determinantes de inestabilidad del ARNm. Varios de estos últimos elementos pueden ubicarse próximos a la región codificante.

En el contexto de esta descripción, la expresión "elemento regulador" o "región reguladora" típicamente se refiere a una secuencia de ADN, generalmente, pero no siempre, corriente arriba (5') a la secuencia codificante de un gen estructural, que controla la expresión de la región codificante al proporcionar el reconocimiento para la ARN polimerasa y/u otros factores necesarios para que la transcripción comience en un sitio particular. Sin embargo, debe entenderse que otras secuencias de nucleótidos, ubicadas dentro de los intrones o 3' de la secuencia también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona el reconocimiento de la ARN polimerasa u otros factores de transcripción para garantizar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. La mayoría, pero no todos, de los elementos promotores eucariotas contienen una caja TATA, una secuencia de ácidos nucleicos conservada compuesta por pares de bases de nucleótidos de adenosina y timidina, generalmente situados aproximadamente a 25 pares de bases corriente arriba de un sitio de inicio de la transcripción. Un elemento promotor puede comprender un elemento promotor basal, responsable del inicio de la transcripción, así como también otros elementos reguladores que modifican la expresión génica.

Hay varios tipos de regiones reguladoras, incluidas aquellas que son reguladas por el desarrollo, inducibles o constitutivas. Una región reguladora que es regulada por el desarrollo o controla la expresión diferencial de un gen bajo su control, se activa dentro de ciertos órganos o tejidos de un órgano en momentos específicos durante el desarrollo de ese órgano o tejido. Sin embargo, algunas regiones reguladoras que son reguladas por el desarrollo pueden estar activas preferentemente dentro de ciertos órganos o tejidos en etapas específicas del desarrollo, también pueden ser activas de una manera regulada por el desarrollo, o también a un nivel basal en otros órganos o tejidos dentro de la planta. Los ejemplos de regiones reguladoras específicas de tejido, por ejemplo, una región reguladora específica, incluyen el promotor de napina y el promotor de cruciferina (Rask y otros, 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau y otros, 1994, Plant Cell 14: 125-130). Un ejemplo de un promotor específico de la hoja incluye el promotor de plastocianina (ver el documento US 7,125,978).

Si la secuencia de ácido nucleico de interés codifica un producto que es directa o indirectamente tóxico para la planta, entonces dicha toxicidad puede reducirse mediante la expresión selectiva de la secuencia de nucleótidos de interés dentro de un tejido deseado o en una etapa deseada del desarrollo de la planta. Alternativamente, también puede usarse un promotor inducido por la presencia de metil jasmonato, u otro activador de la vía del jasmonato, para dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés como se describe en la presente descripción. Una región reguladora inducible es una que es capaz de activar directamente o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias de ADN o los genes no se transcribirán. Típicamente, el factor proteico que se une específicamente a una región reguladora inducible para activar la transcripción puede estar presente en una forma inactiva, que después se convierte directamente o indirectamente en la forma activa por el inductor. Sin embargo, el factor proteico también puede estar ausente. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, metabolito, regulador del crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente por calor, frío, sal o elementos tóxicos o indirectamente a través de la acción de un patógeno o agente patógeno tal como un virus. Una célula vegetal que contiene una región reguladora inducible puede exponerse a un inductor al aplicar externamente el inductor a la célula o planta tal como por pulverización, riego, calentamiento o métodos similares. Los elementos reguladores inducibles pueden derivarse de genes ya sea vegetales o no vegetales (por ejemplo, Gatz, C. y Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358). Los ejemplos de promotores inducibles potenciales incluyen, pero sin limitarse a, promotor inducible por tetraciclina (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108), promotor inducible por esteroides (Aoyama, T. y Chua, N.H., 1997, Plant J. 2, 397-404) y promotor inducible por etanol (Salter, M.G., y otros, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., y otros, 1998, Nature Biotech. 16, 177 180), genes CKI1 e IB6 inducibles por citoquinina (Brandstatter, I. y Kieber, J.J., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985) y el elemento inducible por auxina, DR5 (Ulmasov, T., y otros, 1997, Plant Cell 9, 1963-1971).

Una región reguladora constitutiva dirige la expresión de un gen a través de las diversas partes de una planta y de manera continua a lo largo del desarrollo de la planta. Los ejemplos de elementos reguladores constitutivos conocidos incluyen promotores asociados con el transcrito 35S de CaMV. (p35S; Odell y otros, 1985, Nature, 313: 810-812) o el promotor del virus del mosaico de la vena de la yuca, pCAS, (Verdaguer y otros, 1996).

El término "constitutivo", como se usa en la presente descripción, no indica necesariamente que una secuencia de nucleótidos bajo el control de la región reguladora constitutiva se expresa al mismo nivel en todos los tipos de células, sino que la secuencia se expresa en una amplia gama de tipos de células aun cuando a menudo se observa variación en la abundancia.

Los constructos de expresión como se describen en la presente descripción pueden presentarse en un vector. El vector puede comprender secuencias fronterizas que permitan la transferencia e integración del casete de expresión en el genoma del organismo o huésped. El constructo puede ser un vector binario vegetal, por ejemplo, un vector de transformación binario basado en pPZP (Hajdukiewicz, y otros 1994). Otros constructos de ejemplo incluyen pBin19 (ver Frisch, D.A., L.W. Harris-Haller, y otros, 1995, Plant Molecular Biology 27: 405-409).

Los constructos de la presente descripción pueden comprender además una región no traducida (UTR) 3'. Una región no traducida 3' contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de efectuar el procesamiento del ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza generalmente por efectuar la adición de colas de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm.

Las señales de poliadenilación se reconocen comúnmente por la presencia de homología con la forma canónica 5' AATAAA-3' (SEQ ID NO: 4) aunque las variaciones no son infrecuentes. Ejemplos no limitantes de regiones 3' adecuadas son las regiones no traducidas transcritas en 3' que contienen una señal de poliadenilación de genes de plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium, tales como la nopalina sintasa (gen Nos) y genes vegetales tales como los genes de la proteína de almacenamiento de la soja, la subunidad pequeña del gen de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO; documento US 4,962,028), el promotor usado para regular la expresión de plastocianina (Pwee y Gray 1993). La secuencia de terminación (terminador) puede obtenerse de la UTR 3' del gen de la plastocianina de alfalfa.

Si se desea, los constructos de esta descripción pueden manipularse posteriormente para incluir marcadores seleccionables. Sin embargo, es posible que esto no sea necesario. Los marcadores seleccionables útiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a productos químicos tales como antibióticos, por ejemplo, gentamicina, higromicina, kanamicina o herbicidas tales como fosfinotricina, glifosato, clorosulfurón y similares. De manera similar, pueden usarse enzimas que proporcionan la producción de un compuesto identificable por cambio de color, tal como GUS (beta-glucuronidasa) o luminiscencia, tal como luciferasa o GFP.

Un vector también puede incluir un potenciador de la expresión como se describe en la presente descripción. El potenciador de la expresión puede colocarse en un T-^dN^aque también contiene un supresor del silenciamiento génico y NPTII. El polienlazador también puede codificar uno o dos conjuntos de 6 x residuos de histidina para permitir la inclusión de etiquetas His N- o C-terminales en la proteína de interés para facilitar la purificación de la proteína.

El silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) puede estar implicado en la limitación de la expresión de transgenes en plantas, y la coexpresión de un supresor del silenciamiento del virus Y de la patata (HcPro) puede usarse para contrarrestar la degradación específica de los ARNm transgénicos (Brigneti y otros, 1998, EMBO J. 17, 6739-6746). Los supresores de silenciamiento alternativos se conocen bien en la técnica y pueden usarse como se describe en la presente descripción (Chiba y otros, 2006, Virology 346:7-14), por ejemplo, pero sin limitarse a, TEV-p1/HC-Pro (virus del grabado del tabaco-pl/HCPro), BYV -p21, p19 del virus del enanismo ramificado del tomate (TBSV p19; el constructo de p19 se describe en el documento WO 2010/0003225), proteína de la cápside del virus del arrugamiento del tomate (TCV -CP), 2b del virus del mosaico del pepino; CMV-2b), p25 del virus X de la patata (PVX-p25), p11 del virus M de la patata (PVM-p11), p11 del virus S de la patata (PVS-p11), p16 del virus de la quemadura del arándano (BScV -p16), p23 del virus de la tristeza de los cítricos (CTV-p23), p24 del virus-2 asociado al enrollamiento de la hoja de la vid, (GLRaV-2 p24), p10 del virus A de la vid, (GVA-p10), p14 del virus B de la vid (GVB-p14), p10 del virus latente de Heracleum (HLV-p10) o p16 del virus latente común del ajo (GCLV-p16).

Por lo tanto, uno o más supresores de silenciamiento, por ejemplo, pero sin limitarse a, HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-Cp , CMV-2b, PVX-p25, rgscam, proteína B²de FHV, la proteína de envoltura pequeña de CPMV y la proteína de envoltura de TCV, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 o GVA-p10 pueden coexpresarse junto con el casete de expresión basado en comovirus, el elemento de amplificación derivado de geminivirus y la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés para garantizar aún más altos niveles de producción de proteínas dentro de una planta.

Los constructos de la presente descripción pueden introducirse en células vegetales mediante el uso de plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus vegetales, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etcétera. Para revisiones de dichas técnicas ver, por ejemplo, Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, Nueva York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson y Corey, Plant Molecular Biology, 2da Ed. (1988); y Miki e Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. En: Plant Metabolism, 2da Ed. DT. Dennis, DH Turpin, Dd Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. Londres, pp. 561-579 (1997). Otros métodos incluyen la captación directa de ADN, el uso de liposomas, la electroporación, por ejemplo mediante el uso de protoplastos, microinyección, microproyectiles o fibras e infiltración al vacío. Ver, por ejemplo, Bilang, y otros (1991, Gene 100: 247-250), Scheid y otros (1991, Mol. Gen. Genet. 228: 104-112), Guerche y otros (1987, Plant Science 52: 111-116), Neuhause y otros (1987, Theor. Appl Genet. 75: 30-36), Klein y otros, (2987, Nature 327: 70-73); Freeman y otros (1984, Plant Cell Physiol. 29: 1353), Howell y otros (1980, Science 208: 1265), Horsch y otros (1985, Science 227: 1229-1231), DeBlock y otros, (1989, Plant Physiology 91: 694-701), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach y Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler y Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), documentos WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Liu y Lomonossoff (2002, J Virol Meth, 105:343-348), documentos EP 290395; WO 8706614; patentes de Estados Unidos núms. 4,945,050; 5,036,006; y 5,100,792, solicitudes de patente de Estados Unidos con núm. de serie 08/438,666, presentada el 10 de mayo de 1995 y 07/951,715, presentada el 25 de septiembre de 1992.

Los métodos de expresión transitoria pueden usarse para expresar los constructos descritos de la presente descripción (ver D'Aoust y otros, 2009, Methods in molecular biology, Vol 483, páginas 41-50; Liu y Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348). Alternativamente, puede usarse un método de expresión transitoria basado en vacío, como se describe en Kapila y otros, (1997, Plant Sci. 122, 101-108) o los documentos WO 00/063400, WO 00/037663. Estos métodos pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a, un método de agroinoculación o agroinfiltración, infiltración con jeringa, sin embargo, también pueden usarse otros métodos transitorios como se indicó anteriormente. Con agroinoculación, agroinfiltración o infiltración con jeringa, una mezcla de Agrobacteria que comprende el ácido nucleico deseado se introduce en los espacios intercelulares de un tejido, por ejemplo, las hojas, la porción aérea de la planta (lo que incluye tallo, hojas y flor), otra porción de la planta (tallo, raíz, flor) o la planta completa. Después de cruzar la epidermis, las Agrobacterias infectan y transfieren copias de ADN-t a las células. El ADN-t se transcribe de manera episomal y el ARNm se traduce, lo que conduce a la producción de la proteína de interés en las células infectadas, sin embargo, el paso del ADN-t dentro del núcleo es transitorio.

Además se consideran parte de esta descripción las plantas, células vegetales o semillas transgénicas que contienen el constructo génico de la presente descripción que puede usarse como una planta plataforma adecuada para la expresión transitoria de proteínas descrita en la presente descripción. Los métodos para regenerar plantas completas a partir de células vegetales también se conocen en la técnica (por ejemplo, ver Guerineau y Mullineaux (1993, Plant transformation and expression vectors. En: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed. Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148). En general, las células vegetales transformadas se cultivan en un medio apropiado, que puede contener agentes de selección tales como antibióticos, donde se usan marcadores seleccionables para facilitar la identificación de las células vegetales transformadas. Una vez que se forma el callo, puede fomentarse la formación de brotes con el empleo de las hormonas vegetales apropiadas de acuerdo con métodos conocidos y los brotes se transfieren a un medio de enraizamiento para la regeneración de las plantas. Las plantas pueden usarse después para establecer generaciones repetitivas, ya sea a partir de semillas o mediante el uso de técnicas de propagación vegetativa. Las plantas transgénicas también pueden generarse sin usar cultivo de tejidos. Los métodos para la transformación estable y la regeneración de estos organismos están establecidos en la técnica y son conocidos para un experto en la técnica. Las técnicas disponibles se reseñan en Vasil y otros, (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. I, II y III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984), y Weissbach y Weissbach (Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989). El método para obtener plantas transformadas y regeneradas no es crucial para la presente descripción.

Si las plantas, porciones de plantas o células vegetales van a transformarse o cotransformarse con dos o más constructos de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico puede introducirse en el Agrobacterium en un solo evento de transfección, los ácidos nucleicos se combinan y las células bacterianas se transfectan como se describió. Alternativamente, los constructos pueden introducirse en serie. En este caso, se introduce un primer constructo en el Agrobacterium como se describió, las células se cultivan en condiciones de selección (por ejemplo, en presencia de un antibiótico) donde solo pueden crecer las bacterias individualmente transformadas. Después de esta primera etapa de selección, se introduce un segundo constructo de ácido nucleico en el Agrobacterium como se describió, y las células se cultivan en condiciones de doble selección, donde solo pueden crecer las bacterias doblemente transformadas. Las bacterias doblemente transformadas pueden usarse después para transformar una planta, porción de la planta o célula vegetal como se describe en la presente descripción o pueden someterse a una etapa de transformación adicional para acomodar un tercer constructo de ácido nucleico.

Alternativamente, si las plantas, porciones de plantas o células vegetales van a transformarse o cotransformarse mediante dos o más constructos de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico puede introducirse en la planta mediante la coinfiltración de una mezcla de células de Agrobacterium con la planta, porción de la planta o célula vegetal, cada célula de Agrobacterium puede comprender uno o más constructos a introducir dentro de la planta. Para variar los niveles de expresión relativa dentro de la planta, porción de la planta o célula vegetal, de una secuencia de nucleótidos de interés dentro de un constructo, durante la etapa de infiltración, puede variarse la concentración de las diversas poblaciones de Agrobacteria que comprenden los constructos deseados.

La presente descripción proporciona un método para generar una proteína de interés, que comprende las etapas de proporcionar una planta o parte de la planta, que expresa el sistema de expresión como se describe en la presente descripción, mediante la recolección de un tejido, un órgano o la planta, en el que se ha expresado la proteína de interés, y opcionalmente, aislar la proteína de interés del tejido, órgano o planta.

La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos.

Materiales y Métodos

Muestreo de tejido vegetal y tratamientos con inductor

Para los experimentos se usaron plantas de N. benthamiana de cuarenta y dos días cultivadas en invernadero. Cada planta se pulverizó uniformemente con 50 ml de MeJA 0,5 mM, 1 mM o 2 mM en agua que contenía Triton X-100 al 0,1 % (v/v) (Sigma-Aldrich, Mississauga ON, Canadá) o con 50 ml de ácido araquidónico 1 mM (Girard y otros, 2007) en el mismo solvente, y se transfirió durante siete días a una cámara de crecimiento Conviron (Conviron, Winnipeg MB, Canadá). Las plantas pulverizadas con 50 ml de Triton X-100 al 0,1 % (v/v) en agua se usaron en paralelo como controles negativos para evitar efectos de confusión debidos a las condiciones experimentales. Se cosecharon dos o tres discos de hojas de 1 cm2 de la tercera hoja del tallo principal (ver Robert y otros, 2013) después de siete días, como material de partida para la extracción de proteínas y ARN. Las muestras de hojas se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta la extracción de proteínas o ARN. Se usaron de tres a cinco réplicas biológicas (plantas) para cada tratamiento, para permitir el tratamiento estadístico de los datos.

Constructos génicos y agroinfiltración foliar

Se usaron dos vectores génicos para los ensayos de agroinfiltración: un vector pcambia2300 modificado genéticamente que codifica las cadenas ligeras y pesadas de C5-1 fusionado a una secuencia de péptido señal N-terminal para la secreción celular (ver Goulet y otros, 2012 para obtener detalles sobre el constructo génico); y el vector binario pcambia2300 original ("vacío") (CAMBIA, Canberra, Australia) como control de la agroinfección. Los dos vectores binarios se electroporaron en la cepa LBA4404 de A. tumefaciens y los cultivos se mantuvieron en medio Luria-Bertani (LB) suplementado con kanamicina 50 pg/ml y rifampicina 50 pg/ml. Para la infiltración, las bacterias se cultivaron hasta una fase estable a 28 °C hasta una OD⁶⁰⁰de 1,0 y se recolectaron mediante centrifugación a 2000 g. Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en tampón de ácido 2-[N-morfolino] etanosulfónico] (MES) 10 mM, pH 5,8, que contiene acetosiringona 100 pM y MgCh 10 mM. La infiltración de hojas se realizó mediante el uso de una jeringa sin aguja como se describió anteriormente (D'Aoust y otros, 2009), después de mezclar la suspensión agrobacteriana de anticuerpo C5-1 (o vector vacío) con un volumen igual de suspensión bacteriana que porta un vector binario para el supresor de silenciamiento de proteínas p19 (Voinnet y otros, 2003). El tejido infiltrado para la caracterización molecular se recolectó seis días después de la infección (es decir, siete días después del tratamiento con MeJA o araquidonato), a menos que se indique lo contrario. Se usaron de tres a cinco réplicas biológicas (plantas) para cada tratamiento para permitir los análisis estadísticos.

Extracción de proteínas, SDS-PAGE e inmunotransferencia

Se extrajeron proteínas de hojas completas de tres discos de hojas de 1 cm2 en 400 pl de Tris-HCl 50 mM helado, pH 7,5, que contenía NaCl 150 mM, al romper las muestras de hojas con perlas de carburo de tungsteno (Qiagen, Mississauga ON, Canadá) en un aparato Mini-Beadbeater (BioSpec, Bartlesville OK, EE. UU.). Se añadió el 'cóctel inhibidor de proteasa' COMPLETE (Roche, Laval QC, Canadá) en el tampón de extracción antes de la ruptura del tejido según lo especificado por el proveedor, excepto en aquellos extractos dedicados al monitoreo de la actividad de proteasa. Los extractos de hojas crudos se clarificaron mediante centrifugación a 20000 g durante 30 min a 4 °C, y las proteínas solubles totales se ensayaron de acuerdo con Bradford (1976) con albúmina de suero bovino como estándar proteico (Sigma-Aldrich). La separación electroforética de las proteínas se realizó mediante SDS-PAGE al 10 % (p/v) en condiciones reductoras (Laemmli, 1970), a menos que se indique lo contrario. Las proteínas resueltas se tiñeron con azul de Coomassie para visualizar patrones de bandas de proteínas o se electrotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa para la inmunodetección con anticuerpos primarios y secundarios apropiados. La subunidad pequeña de RuBisCO se detectó mediante el uso de IgG policlonal generada en conejo contra un péptido sintético de la subunidad pequeña (Agrisera, Vannas, Suecia) y anti-IgG de conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina como anticuerpos secundarios (Sigma-Aldrich). La subunidad grande de RuBisCO se detectó mediante el uso de IgG policlonal generado en gallina contra un péptido sintético de subunidad grande (Agrisera) y anti-IgG de pollo de cabra conjugada con fosfatasa alcalina como anticuerpos secundarios (Sigma-Aldrich). La proteína PR-2 inducible por patógenos de 33 kDa se detectó mediante el uso de anticuerpos primarios IgY policlonales de conejo (Agrisera) y anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo de cabra conjugados con fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich). Se detectaron cadenas ligeras y pesadas de C5-1 con anticuerpos anti-IgG de ratón de cabra conjugados con fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich).

Espectrometría de masas

Las proteínas de las hojas para la identificación por MS (correspondientes a las áreas de gel de proteínas en los recuadros A, B y C de la Figura 1b) se extrajeron manualmente de los geles, se colocaron en 100 pl de agua Milli-Q y se enviaron al Eastern Québec Proteomics Center (Centre de Recherche du CHUL, Québec QC, Canadá) para el análisis MS/MS de trampa de iones. La digestión de proteínas en gel con tripsina de grado de secuenciación (Promega, Madison WI, EE. UU.) se realizó en un robot de manipulación de líquidos MassPrep (Waters, Milford MA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las muestras de péptidos se resolvieron mediante cromatografía líquida capilar a escala nano de fase inversa en línea y se analizaron mediante espectrometría de masas por electropulverización mediante el uso de una bomba Thermo Surveyor MS conectada a un espectrómetro de masas con trampa de iones lineal LTQ equipado con una fuente de iones de nanoelectropulverización (ThermoFisher, San Jose CA, EE. UU.). Se cargaron alícuotas de péptidos de 10 pl sobre una columna BioBasic C18 picofrit de 75 pm de diámetro interno (New Objective, Woburn MA, EE. UU.). Los péptidos se eluyeron a lo largo de un gradiente de agua-acetonitrilo/ácido fórmico 0,1 (v/v), a una tasa de flujo de 200 nl/min obtenido por división del flujo. Los espectros de masas se adquirieron en el modo de adquisición dependiente de datos, mediante el uso del software Xcalibur, v. 2.0. Cada escaneo por MS completo (de 400 a 2000 m/z) se siguió de escaneos por MS/MS de los siete iones precursores más intensos mediante el uso de disociación inducida por colisión. La energía de fragmentación de colisión relativa se estableció en 35 % y la función de exclusión dinámica se habilitó con una duración de exclusión de 30 s.

Identificación de proteínas

Los datos espectrales de MS/MS se extrajeron mediante el uso de la utilidad ExtractMSn del paquete de aplicaciones Bioworks de Thermo, sin deconvolución o desisotopado del estado de carga. Las identidades de las proteínas se evaluaron mediante el uso del programa Mascot, v. 2.3.02 (Matrix Science, Londres, Reino Unido) y el software de Open Source X! Tandem (Craig y otros, 2004). Ambos softwares se configuraron para buscar en una base de datos personalizada que contiene todas las secuencias de proteínas conocidas de especies de Solanaceae (ID de taxonomía: 4070, para 39 896 proteínas), secuencias de proteínas de A. tumefaciens (12 554 proteínas) y secuencias de datos de contaminantes de proteínas que se encuentran comúnmente en las digestiones con tripsina. Se realizaron búsquedas en la base de datos con una tolerancia de masa de iones de fragmentos de 0,50 Da y una tolerancia de iones parentales de 2,0 Da. El derivado de yodoacetamida de los residuos de Cys se especificó tanto en Mascot como en X! Tandem como una modificación fija; la citrulinación de los residuos de Arg y la oxidación de los residuos de Met se especificaron como modificaciones variables. Las identificaciones de péptidos y proteínas basadas en MS/MS se validaron mediante el uso de Scaffold, v. 3.4.9 (Proteome Software, Portland OR, EE. UU.). Se aceptaron las identificaciones si incluían al menos cuatro péptidos y podían establecerse con una probabilidad superior al 95 % según lo especificado por el algoritmo Peptide Prophet (Keller y otros, 2002). Las probabilidades de proteína se asignaron por el algoritmo de Protein Prophet como lo describen Nesvizhskii y otros (2003). Las proteínas que contenían péptidos similares y no pudieron diferenciarse en base a los datos de M^s/MS se agruparon para satisfacer los principios de parsimonia.

RT PCR en tiempo real

Los transcriptos de ARNm para las proteínas de virulencia de C5-1 y A. tumefaciens VirBI y VirEI se ensayaron mediante RT PCR en tiempo real mediante el uso de un aparato de PCR en tiempo real ABI PRISM 7500 Fast, versión del sistema 2.0.1 (Applied Biosystems, Carlsbad cA, EE. UU.). El ARN total se extrajo de dos discos de hojas de 1 cm2 recolectados en la tercera hoja del tallo principal (Robert y otros, 2013) mediante el uso del mini kit de plantas Qiagen RNeasy (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las muestras de ARN se trataron con DNasa I (Roche Diagnostics) para eliminar el ADN contaminante y se evaluó su calidad y cantidad mediante el uso de un espectrofotómetro Nanodrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington DE, EE. UU.). El ADNc de la primera cadena se sintetizó a partir de 500 ng de ARN total mediante el uso de 4 unidades de transcriptasa inversa Omniscript (Qiagen) y 1 pM de nucleótidos oligo-dT(15) (Roche). Las reacciones de PCR contenían 10 pl de mezcla maestra de PCR Fast SYBR Green (Applied Biosystems), 2 pl de plantilla de ADNc y 2,5 pl de cada uno de los cebadores directos e inversos apropiados a una concentración final de 625 nM (Tabla 1). Se incluyó un control de mezcla sin plantilla en cada placa de 96 pocillos. Las rondas de amplificación consistieron en una etapa de desnaturalización de 20 s a 95 °C, seguido de 40 ciclos de dos etapas de 3 s a 95 °C y 30 s a 60 °C. Se realizó un análisis de la curva de disociación después de la amplificación con la mezcla maestra SYBR Green, y el ciclo umbral de cada muestra se comparó después con una curva estándar de ADN diseñada para cada par de cebadores. Se generaron curvas estándar con 2 pl de plantilla de ADNc de acuerdo con el protocolo habitual de Taq polimerasa de NEB (New England Biolabs, Pickering ON, Canadá). Los productos de amplificación se purificaron mediante el uso del kit Illustra GFX (GE Healthcare) y se crearon curvas estándar de ADN con diluciones en serie de los productos de PCR purificados en agua libre de nucleasas (de 107 a 102 copias por pl). Los datos de Ct se representaron gráficamente contra el número correspondiente de copias de transcriptos. Todas las amplificaciones se llevaron a cabo por duplicado.

Tabla 1: Cebadores de oligonucleótidos directos e inversos usados para ensayos de RT PCR en tiempo real--D

Recuentos bacterianos

Las cargas bacterianas en las hojas se determinaron mediante el recuento de CFU en placas de agar LB recubiertas con bacterias recuperadas en diferentes momentos de la tercera hoja del tallo principal. Cada réplica consistió en dos discos de hojas de 1 cm2 recolectados 0, 2, 4 o 6 días después de la agroinfiltración. Los discos de hojas se homogeneizaron en tampón MES 10 mM, pH 5,8, que contenía MgCh 10 mM en el Mini-Beadbeater de BioSpec (ver Extracción de proteínas, SDS-PAGE e inmunotransferencia, más arriba). Las suspensiones resultantes se sembraron por dilución en medio LB suplementado con kanamicina (50 mg/ml) y se incubaron a 28 °C hasta el recuento de CFU después de dos días.

Ensayos de proteasa

Las actividades de proteasa se ensayaron mediante el monitoreo de las curvas de progreso de hidrólisis del sustrato (Goulet y otros, 2012) mediante el uso de los siguientes sustratos fluorigénicos sintéticos (Peptides International, Louisville KY, EE. UU.): Z-Phe-Arg-metilcumarina (MCA) para proteasas Cys CIA de tipo catepsina L, Z-Arg-MCA para proteasas S1 Ser de tipo tripsina y MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH²para proteasas A1 Asp de tipo catepsina D/E. Se dejó que la hidrólisis del sustrato por las proteasas de extracto de hoja (36 ng de proteína de hoja por pl de mezcla de reacción) procediera a 25 °C en MES 50 mM, pH 5,8, que contenía L-Cys 10 mM para el sustrato de catepsina L. Los niveles de actividad de proteasa se monitorearon mediante el uso de un fluorímetro de microplaca Fluostar Galaxy (BMG, Offenburg, Alemania) con filtros de excitación y emisión de 360 y 450 nm, respectivamente, para los sustratos de MCA; o de 340 y 400 nm, respectivamente, para el sustrato MOCAc. Se usaron tres réplicas independientes (biológicas) para cada ensayo.

Cuantificación de C5-1

Se recubrieron placas de ELISA para la cuantificación de anticuerpo C5-1 (Becton Dickinson, Mississauga ON, Canadá) con 3,75 |jg/ml de anti-IgG1 específica de cadena pesada ratón de cabra (Sigma-Aldrich) en tampón de carbonato 50 mM (pH 9,0) a 4 °C durante 16-18 h. Las placas se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato 10 mM que contenía Tween 20 (PBST) al 0,1 % (v/v), se bloquearon mediante una incubación de 1 hora a 37 °C en caseína al 1 % (p/v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Pierce, Rockford IL, EE. UU.) y se lavaron tres veces en PBS-T. Se generó una curva estándar para cada placa con 0, 4, 8, 16, 24, 32, 40 y 60 ng/ml de IgG1 de ratón purificada (Sigma-Aldrich). Todas las diluciones (controles y muestras) se realizaron en un extracto de control obtenido a partir de tejido foliar infiltrado con un inóculo simulado para eliminar cualquier efecto de matriz. Las placas se incubaron con muestras de proteína durante 1 h a 37 °C, se lavaron tres veces en PBS-T y después se incubaron con anticuerpos anti-IgG de ratón (H L) de cabra conjugados con peroxidasa (0,02 jg/ml en solución de bloqueo) (Jackson ImmunoResearch) durante 1 h a 37 °C. Después de lavados adicionales con PBS-T, las placas se incubaron con el sustrato de peroxidasa 3,3',5,5'-tetrametilbencidina Sure Blue (KPL, Gaithersburg MD, EE. UU.). La reacción se detuvo mediante la adición de HCl 1 N y se leyó la absorbancia a 450 nm. Se usaron tres réplicas independientes (biológicas) para cada ensayo.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron mediante el uso del programa SAS v. 9.1 (SAS Institute, Cary NC, EE. UU.). Se usaron procedimientos ANOVA y PROC GLM para comparar los rendimientos de C5-1 entre tratamientos, datos de densitometría y actividades de proteasa. Los cálculos de contraste se realizaron cuando el ANOVA fue significativo mediante el uso de un umbral de valor addel 5 %. Se realizaron pruebas t de Student para comparar los números de transcriptos de ARNm para proteínas de virulencia de A. tumefaciens y cadenas de C5-1 en plantas de control y tratadas con MeJA.

Ejemplo 1: i) El MeJA induce el reequilibrio del proteoma de la hoja en N. benthamiana

Se trataron plantas de N. benthamiana de 42 días con MeJA 0,5, 1 o 2 mM para determinar los efectos de la señalización del ácido jasmónico en el perfil proteico general del tejido foliar (Figura 1). Sobre la base del peso fresco, las hojas maduras de las plantas tratadas con MeJA redujeron su contenido de TSP entre un 20 y un 30 % después de siete días en comparación con las hojas de control no tratadas, en dependencia de la dosis de inductor (ANOVA; P<0,001) (Figura 1a). Como se observó con otras solanáceas (Lawrence y otros, 2008; Duceppe y otros, 2012; Ullman-Zeunert y otros, 2013), el tratamiento con MeJA provocó una fuerte depleción de los conjuntos de subunidades grandes y pequeñas de RuBisCO en extractos de hojas (Figura 1b), estimado en un 40 % menos que en los controles para la dosis de MeJA de 0,5 mM a más del 90 % menos para la dosis de 2 mM (ANOVA; P<0,05 para RbcL; P<0,001 para RbcS) (Figura 1c). La depleción de RuBisCO se contrarrestó mediante la regulación positiva de varias proteínas, en particular en los intervalos de masa molecular de ~30-kDa, ~25-kDa y ~6-kDa como se visualizó en geles teñidos con azul de Coomassie seguido de SDS-PAGE (Figura 1b, recuadros A, B y C). Se condujo un análisis proteómico de escopeta para identificar las proteínas más abundantes en estos intervalos de masa, basado en un análisis de conteo espectral de péptidos de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) obtenidos a partir de digestiones con tripsina de bandas de proteínas en los recuadros A, B y C de la Figura 1b (Tabla 2). La mayoría de las proteínas identificadas eran proteínas relacionadas con el estrés (o de defensa) inducibles por MeJA, que incluían en particular tioninas, quitinasas, inhibidores de la proteasa Ser de las familias de proteínas Kunitz e inhibidor de proteinasa II, y enzimas relacionadas con el estrés tales como superóxido dismutasa, anhidrasa carbónica y tiorredoxina peroxidasa (ver la Tabla 3 para obtener detalles sobre las secuencias de péptidos por MS/MS).

Varias plantas se infiltraron 24 h después del tratamiento con MeJA con células de A. tumefaciens que albergan un vector pCAMBIA2300 'vacío' (Goulet y otros, 2012), para evaluar si las alteraciones del proteoma de la hoja mediadas por MeJA podrían mantenerse sobre el habitual período de seis a siete días después de la infección bacteriana para la expresión de proteínas recombinantes. Se sabe que la agroinfiltración desencadena la secreción activa de proteínas PR, lo que incluye las proteínas PR-2 (p-glucanasas) y PR-3 (quitinasa), en el apoplasto de hojas de N. benthamiana, presumiblemente al implicar la vía de señalización del ácido salicílico inducible por patógenos (Goulet y otros, 2010). Tres bandas de proteínas en el intervalo de masa de 25 a 33 kDa (correspondientes a las proteínas PR-2 y PR-3) se regularon positivamente de manera muy fuerte en hojas agroinfiltradas, independientemente de la dosis de MeJA aplicada (Figura 1b). Como resultado de las interacciones antagonistas entre las vías de señalización del jasmonato y el salicilato (Derksen y otros, 2013), la inducción de la proteína PR en las hojas infiltradas se asoció con una fuerte inversión de las inducciones de la proteína del estrés mediadas por MeJA detectadas en plantas no infectadas, lo que dio como resultado señales de proteína muy débiles en los recuadros A, B y C seis días después de la infección (Figura 1b). Tanto las subunidades grandes como la pequeñas de RuBisCO se encontraron en menos del 50 % de su contenido original, en hojas tratadas con MeJA 1 o 2 mM con relación a las plantas no tratadas (Figura 1b, c). Estos datos demuestran la eficacia del MeJA como un potente desencadenante, previo a la infección, de la depleción de RuBisCO en hojas de N. benthamiana, y su uso para reducir la carga de RuBisCO al tiempo que aumenta el contenido relativo de proteína recombinante en extractos de proteína cruda antes del enriquecimiento y purificación después de la recuperación.

Tabla 2: Proteínas relacionadas con el estrés reguladas positivamente en hojas de N. benthamiana siete días después del tratamiento con MeJA12

Proteína Especie Núm. 3 Núm. de acceso ^recuentos _espectralesRecuadro A

. Endoquitinasa ácida P17514 Nicotiana tabacum 34 . Anhídrido carbónico A4D0J8 Nicotiana benthamiana 30 . Inhibidor de proteasa de tipo Kunitz A9UF61 Nicotiana alata 22 . Subunidad p de tipo 6 del

_proteasomaQ9XG77 Nicotiana tabacum 14 . Superóxido dismutasa P22302 Nicotiana plumbaginifolia 12 . Chaperonina 21 Q9M5A8 Solanum lycopersicum 12 Recuadro B

. Inhibidor de proteasa de tipo Kunitz A9UF61 N. alata 40 . Peroxidasa de tiorredoxina Q8RVF8 N. tabacum 18 . Proteína R relacionada con la

_patogénesisP13046 N. tabacum 18 . Subunidad p de tipo 6 del

_proteasomaP93395 N. tabacum 16 . Superóxido dismutasa [Fe] P22302 N. plumbaginifolia 14 Recuadro C

. Tionina específica de la flor B2BLV8 N. tabacum 39 Recuadro C

. Inhibidor de tripsina proteinasa 11 Q1WL50 N. benthamiana

1 Estas proteínas corresponden a las especies de proteínas más abundantes identificadas mediante LC-MS/MS en los recuadros A, B y C de la Figura 1b. Se incluyen en la lista identificaciones de proteínas basadas en un recuento espectral mínimo de 10 espectros.

2 En la Tabla 3 se encuentra disponible información adicional sobre secuencias por MS/MS.

3 Números de acceso del Centro Nacional de Información Biotecnológica/base de datos de GenBank (ver la URL: ncbi.nlm.nih.gov)._____________________________________________________________________________

Tabla 3: Péptidos únicos emparejados para proteínas reguladas por el estrés reguladas positivamente en hojas de N. benthamiana siete días después del tratamiento con MeJA12

Proteína Núm. de Organismo fuente Núm. de Péptidos únicos emparejados ______________acceso_____________________ espectros___________________________

Recuadro A

Endoquitinasa P17514 N. tabacum 34 GPIQLTNR (SEQ ID NO:13)

Q ácida GPIQLTNRNNYEK (SEQ ID NO:14)

NDAVEDR (SEQ ID NO:15) NDAVEDRIGYYR (SEQ ID NO:16) QGIGSIVTSDLFNEMLK (SEQ ID NO:17) RYCGMLNVAPGENLDCYNQR (SEQ ID NO: 18) YCGMLNVAPGENLDCYNQR (SEQ ID NO:19) YYGRGPIQLTNR (SEQ ID NO:20) YYGRGPIQLTNRNNYEK (SEQ ID NO:21) Anhidrasa A4D0J8 N. benthamiana 30 ALMDLPENGSESTDFIENWVK (SEQ ID NO: 22) carbónica EIYDKNPELIDELK (SEQ ID NO:23)

EIYDKNPELIDELKK (SEQ ID NO:24) FLVFACSDSR (SEQ ID NO:25) IDEITAELQTSGFQSVHPVDR (SEQ ID NO:26) IDEITAELQTSGFQSVHPVDRIK (SEQ ID NO:

27)

IKTGFDYFKK (SEQ ID NO:28) NIANMVPPYDK (SEQ ID NO:29) NIANMVPPYDKTK (SEQ ID NO:30) TGFDYFK (SEQ ID NO:31)

TGFDYFKK (SEQ ID NO:32) VENILVIGHSACGGIK (SEQ ID NO:33) VSPSHVLNFQLGEAFMVR (SEQ ID NO:34) Inhibidor de A9UF61 N. alata 22 VGDPDLTAR (SEQ ID NO:35)

proteasa de FVTTHSR (SEQ ID NO:36)

tipo Kunitz

(continuación)

Proteína Núm. de Organismo fuente Núm. de Péptidos únicos emparejados

acceso espectros

LCVNQTVWK (SEQ ID NO:37) VGDPDLTARGTR (SEQ ID NO:38) Subunidad p de Q9XG77 N. tabacum 14 AAGITSIGVR (SEQ ID NO:39)

tipo 6 del EQEAINFLEK (SEQ ID NO:40) proteasoma GKDSVCVVTQK (SEQ ID NO:41)

HITIFSPEGR (SEQ ID NO:42) LFQVEYAFK (SEQ ID NO:43) LLDQTSVSHLFPITK (SEQ ID NO:44) NEAAEFR (SEQ ID NO:45)

TLVQQAR (SEQ ID NO:46) VLTTEEIDEHLTAISERD (SEQ ID NO:47) YLGLLATGMTADAR (SEQ ID NO:48) Superóxido P22302 N. plumbaginifolia 12 AAAATQFGSGWAWLAYKPEEK (SEQ ID NO: dismutasa 49)

AAAATQFGSGWAWLAYKPEEKK (SEQ ID NO: 50)

AYVDNLNK (SEQ ID NO:51) AYVDNLNKQIDGTELDGK (SEQ ID NO:52) DFGSYDAFVK (SEQ ID NO:53) DFGSYDAFVKEFK (SEQ ID NO:54) KFELQPPPYPMDALEPHMSSR (SEQ ID NO: 55)

LVSWEAVSSR (SEQ ID NO:56) QIDGTELDGK (SEQ ID NO:57) QIDGTELDGKTLEDII LVTYN K (SEQ ID NO:58)

RPDYISIFMEK (SEQ ID NO:59) TLEDIILVTYNK (SEQ ID NO:60) Chaperonina Q9M5A8 S. lycopersicum 12 GADGSDYITLR (SEQ ID NO:61)

21 KPLSVSPGNTVLYSK (SEQ ID NO:62)

TAGGLLLTEAAK (SEQ ID NO:63) TGAQVIYSK (SEQ ID NO:64) TKVDISVK (SEQ ID NO:65) VAEAEEKTAGGLLLTEAAK (SEQ ID NO:66) VLIKVAEAEEK (SEQ ID NO:67) YAGSEFKGADGSDYITLR (SEQ ID NO:68) YAGTEVEFDGSK (SEQ ID NO:69) YTTLKPLGDR (SEQ ID NO:70) Recuadro B

Inhibidor de A9UF61 N. alata 40 VGDPDLTAR (SEQ ID NO:71)

proteasa de FVTTHSR (SEQ ID NO:72)

tipo Kunitz LCVNQTVWK (SEQ ID NO:73)

VGDPDLTARGTR (SEQ ID NO:74) Tiorredoxina Q8RVF8 N. tabacum 18 GLFIIDKEGVIQHSTINNLGIGR (SEQ ID NO:75) peroxidasa GSKEYFASI (SEQ ID NO:76)

KSGGLGDLNYPLISDVTK (SEQ ID NO. 77) LSEYIGK (SEQ ID NO:78) SGGLGDLNYPLISDVTK (SEQ ID NO:79) SVDETLR (SEQ ID NO:80) SYNVLIPDQGIALR (SEQ ID NO:81) TLQALQYVQDN PDEVCPAGWKPG EK (SEQ ID NO:82)

Proteína R P13046 N. tabacum 18 CPDAYSYPQDDPTSLFTCPSGTNYR (SEQ ID relacionada NO:83)

con la TNCNFDGSGR (SEQ ID NO:84) patogénesis TNEYCCTNGPGSCGPTDLSR (SEQ ID NO:85)

TQGGCNNPCTVIK (SEQ ID NO:86) Subunidad p P93395 N. tabacum 16 DGASGGVVR (SEQ ID NO:87)

de tipo 6 del SGSAADSQIVSDYVR (SEQ ID NO:88) proteasoma TSTGMYVANR (SEQ ID NO:89)

YFLHQHTIQLGQPATVK (SEQ ID NO:90) (continuación)

Proteína Núm. de Organismo fuente Núm. de Péptidos únicos emparejados

acceso espectros

Superóxido P22302 N. plumbaginifolia 14 AAAATQFGSGWAWLAYKPEEK (SEQ ID NO: 91) dismutasa [Fe] AYVDNLNK (SEQ ID NO:92)

AYVDNLNKQIDGTELDGK (SEQ ID NO:93) DFGSYDAFVK (SEQ ID NO:94) DFGSYDAFVKEFK (SEQ ID NO:95) KFELQPPPYPMDALEPHMSSR (SEQ ID NO: 96) LVSWEAVSSR (SEQ ID NO:97) QIDGTELDGK (SEQ ID NO:98) QIDGTELDGKTLEDIILVTYNK (SEQ ID NO:99) RPDYISIFMEK (SEQ ID NO:100) TLEDIILVTYNK (SEQ ID NO:101) Recuadro C

Tionina B2BLV8 N. tabacum 39 ACISEKFTDGHCSK (SEQ ID NO:102) específica de la FTDGHCSK (SEQ ID NO:103)

flor KACISEK (SEQ ID NO:104)

KACISEKFTDGHCSK (SEQ ID NO:105) ACISEKFTDGHCSK (SEQ ID NO:106) ACISEK (SEQ ID NO:107)

Inhibidor de Q1WL50 N. benthamiana 11 GCTFECDPR (SEQ ID NO:108)

tripsina ICTNCCAGK (SEQ ID NO:109)

proteinasa LCTNCCAGTK (SEQ ID NO:110)

NRLCTNCCAGTK (SEQ ID NO:111) YFSDDGTFVCEGESDPR (SEQ ID NO:112) YFSDDGTFVCEGESDPRNPK (SEQ ID NO: 113) YFSDDGTFVCEGESDPRNPKPCPR(SEQID NO:114)

IAYGICPLS (SEQ ID NO:115)

IAYGVCPR (SEQ ID NO:116)

1Estas proteínas corresponden a las especies de proteínas más abundantes identificadas mediante LC — MS/MS en los recuadros A, B y C de la Figura 1b.

2 Números de acceso del Centro Nacional de Información Biotecnológica/base de datos de GenBank (ver: ncbi.nlm.nih.gov).

ii) El MeJA tiene poco efecto sobre la interacción N. benthamiana-A. tumefaciens

Después de la agroinfiltración, se observó una inversión casi completa de los efectos de regulación positiva de MeJA sobre las proteínas de defensa, lo que indica una influencia limitada del tratamiento con jasmonato tanto en la capacidad de la planta para montar una respuesta de defensa basada en la proteína PR a la infección bacteriana, como en la capacidad de la bacteria para transfectar células vegetales y persistir normalmente en el tejido foliar. Para examinar más a fondo la interacción planta-bacteria, se usaron inmunotransferencias para proteínas PR-2 como referencia para la inducción de proteínas PR en hojas (Goulet y otros, 2010), y los números de transcriptos de ARNm de dos genes de virulencia agrobacterianos regulados por salicilato como marcadores para el proceso de transfección (Yuan y otros, 2007) (Figura 2). Varios estudios han informado fuertes efectos antagónicos para el ácido salicílico u homólogos funcionales sobre la señalización del jasmonato, y patrones reguladores divergentes para proteínas PR inducibles por salicilato y proteínas de defensa inducibles por jasmonato tras el tratamiento con salicilato o MeJA (Thaler y otros, 2012).

De acuerdo con los perfiles de proteína teñidos con azul de Coomassie (Figura 1b), el MeJA pulverizado a 0,5 o 1 mM no tuvo un efecto significativo sobre la expresión de una proteína PR-2 inducible por patógenos de 33 kDa expresada constitutivamente en hojas no infiltradas (ANOVA; P>0,05; Figura 2a).

Se sabe que el ácido salicílico atenúa la agroinfección en las hojas (Veena y otros, 2003; Yuan y otros, 2007; Anand y otros, 2008) mediante una regulación negativa del regulón vir de la bacteria que afecta la expresión del gen de virulencia y la integración del ADN-T en las células huésped (Yuan y otros, 2007). Se ha demostrado que las plantas defectuosas en ácido salicílico son más susceptibles al patógeno, mientras que las plantas que producen en exceso este metabolito mostraron una mayor resistencia a la infección (Yuan y otros, 2007). Aquí se realizaron recuentos bacterianos y ensayos de RT PCR en tiempo real para comparar el número de células de Agrobacterium y los conjuntos de transcriptos de ARNm de proteínas de virulencia en hojas infiltradas, con o sin tratamiento con MeJA, para buscar un posible efecto de represión de salicilatos del derivado de jasmonato que facilite el crecimiento de Agrobacterium y la expresión de genes de virulencia (Figura 2b, c).

Se recuperaron cantidades similares de bacterias a partir del apoplasto de las hojas de control y tratadas con MeJA, según se determinó a partir de recuentos bacterianos de 10 a 100 millones de unidades formadoras de colonias (CFU) por ml de extracto de apoplasto hasta dos días después de la infiltración, hasta menos de un millón de CFU después de cuatro o seis días (Figura 2b). Se usaron las secuencias de codificación de ADN para VirB1 y VirE1, dos proteínas de virulencia implicadas en la translocación del ADN-T en las células huésped receptoras y la posterior integración en el núcleo, respectivamente (Lacroix y otros, 2006) como marcadores bacterianos sensibles al salicilato para ensayos de RT PCR. La expresión de VirB1 se alteró negativamente en las hojas tratadas con MeJA y no se observó ningún efecto positivo sobre la transcripción de ninguno de los genes siete días después del tratamiento con MeJA a pesar del efecto antagonista natural de los jasmonatos sobre la señalización del salicilato (Figura 2c).

Estos datos confirman en general el inicio de una fuerte respuesta de defensa a la infección bacteriana en hojas de control y tratadas con MeJA tras la agroinfiltración, y ningún impacto positivo del tratamiento previo con MeJA tanto en esta respuesta como en la potencia de la bacteria para la transfección génica.

iii) El MeJA tiene poco efecto sobre las actividades de proteasa en hojas transfectadas

Se llevaron a cabo ensayos enzimáticos con sustratos de péptidos sintéticos para investigar el efecto del tratamiento con MeJA sobre la actividad de proteasa en extractos de hojas crudas (Figura 3). Las proteasas endógenas tienen un fuerte impacto en el rendimiento de proteínas recombinantes en sistemas vegetales, dado su papel directo en el recambio de proteínas, ya sea in planta durante la expresión o ex planta tras la ruptura del tejido para la recuperación de proteínas (Benchabane y otros, 2008). Los perfiles de proteasa están influenciados por diferentes factores ambientales o de desarrollo en N. benthamiana, lo que incluye la edad de las hojas, la infección por agrobacterias y la expresión de proteínas recombinantes (Robert y otros, 2013). Al tener en cuenta las complejas comunicaciones cruzadas entre las vías de señalización relacionadas con la defensa (Robert-Seilaniantz y otros, 2011), la importancia de las proteasas secretadas tras la infección patógena (Horger y van der Hoorn, 2013; Ramirez y otros, 2013; Howing y otros, 2014; Figueiredo y otros, 2014) y la sobreexpresión de inhibidores de proteasa mediada por MeJA que podría influir en la actividad de las proteasas endógenas en extractos crudos (ver Figura 1b y Tabla 2), se evaluó el impacto del tratamiento con MeJA en las actividades de las principales endoproteasas en hojas de control y agroinfiltradas.

Las actividades de proteasa medidas en extractos crudos representan valores netos que reflejan tanto la abundancia relativa de proteasa y moléculas inhibidoras de proteasa en el medio de extracción tras la ruptura del tejido, como la especificidad inhibidora de los inhibidores liberados hacia las proteasas endógenas (Benchabane y otros, 2009). Se ensayaron las actividades de proteasa Cys de tipo catepsina L, proteasa Ser de tipo tripsina y proteasa Asp de tipo catepsina D/E en extractos crudos de hojas de control y tratadas con MeJA recolectadas siete días después del tratamiento con MeJA para documentar el efecto básico a largo plazo de señalización del jasmonato en los perfiles de proteasa foliar. El MeJA no tuvo impacto en la actividad de tipo catepsina L para las tres dosis probadas (ANOVA; P>0,05) (Figura 3a). Las enzimas de tipo tripsina mostraron un aumento mínimo o nulo en la actividad para las dosis de 0,5 y 1 mM (P<0,001) (Figura 3b) a pesar de una regulación positiva concomitante de los inhibidores de la proteasa Ser en las hojas (ver Tabla 2). La actividad de tipo catepsina D/E mostró una disminución dependiente de la dosis siete días después del tratamiento con MeJA en plantas no infiltradas (P<0,001), que también se observó en hojas agroinfiltradas (Figura 3c). Las actividades de tipo catepsina L (P<0,05) y de tipo tripsina (P<0,001) se regularon positivamente en hojas infiltradas seis días después de la infección, independientemente del tratamiento previo con MeJA (Figura 3a,b).

Estos datos sugieren un posible papel de las proteasas Cys y Ser en la infección bacteriana y la aparición de patrones de expresión específicos para estas enzimas en hojas agroinfiltradas, independientemente de las inducciones de inhibidores de proteasa mediadas por MeJA. Los datos también apuntan al establecimiento de un proteoma reequilibrado en hojas tratadas con MeJA seis días después de la infiltración que se presentan, con un conjunto significativamente empobrecido en subunidades de RuBisCO; y cantidades fuertemente aumentadas de proteínas PR inducibles por patógenos.

iv) El tratamiento con MeJA aumenta la acumulación de una proteína recombinante expresada transitoriamente Se condujeron ensayos de agroinfiltración para determinar el impacto del tratamiento con MeJA en la expresión y los niveles en estado estacionario de una proteína recombinante clínicamente útil expresada transitoriamente en el tejido foliar (Figura 4). El anticuerpo monoclonal para la tipificación de la sangre humana C5-1 (Khoudi y otros, 1999) se seleccionó como modelo dada la abundante información disponible sobre la expresión, maduración y procesamiento proteolítico de esta proteína en sistemas vegetales (Khoudi y otros, 1999); Bardor y otros, 2003; Sainsbury y otros, 2008; Vezina y otros, 2009; D'Aoust y otros, 2009; Goulet y otros, 2012; Robert y otros, 2013). Las cadenas ligeras y pesadas de C5-1 coexpresadas en hojas de N. benthamiana se detectan en inmunotransferencias como un patrón de proteína multibanda de alto peso molecular después de SDS-PAGE en condiciones no reductoras, lo que incluye una versión completamente ensamblada de ~150 kDa del anticuerpo y varios fragmentos más pequeños pero activos (Goulet y otros, 2012; Robert y otros, 2013). Se inmunodetectó una banda de proteína principal de aproximadamente 150 kDa mediante el uso de anticuerpos primarios anti-IgG (Figura 4a). Se observaron patrones de bandas de proteína visualmente similares, con intensidad aumentada, en extractos de hojas de plantas tratadas con MeJA en comparación con las plantas de control.

Se realizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima cuantitativo (ELISA) para confirmar el efecto positivo aparente del MeJA sobre la acumulación de anticuerpos y para definir una posible relación de curva de dosis para la respuesta mediada por jasmonato (Figura 4b). Se midieron cantidades significativamente mayores de anticuerpo en hojas tratadas con MeJA, para alcanzar niveles en estado estacionario de aproximadamente 1,5 a 2,5 veces los niveles medidos en plantas de control (ANOVA; P<0,05). El efecto de regulación positiva de MeJA siguió una curva cuadrática, con un valor de rendimiento máximo de ~425 pg/g de tejido foliar medido a 1 mM de MeJA en comparación con ~325 pg/g de tejido foliar a 2 mM de MeJA o menos de 200 pg/g en hojas de control (Figura 4b). El efecto de MeJA también se confirmó en base a las proteínas para dar un rendimiento neto de 70 ng de anticuerpo/pg de proteínas solubles (o -7 % de TSP) en hojas tratadas con MeJA 1 mM, aproximadamente el doble del rendimiento obtenido con las hojas de control (P<0,05) (Figura 4b). Como se infiere de los datos de RT PCR en tiempo real para plantas pulverizadas con MeJA 1 mM, los rendimientos más altos de C5-1 en las hojas tratadas con MeJA se asociaron con un mayor número de transcriptos de ARNm para las cadenas ligeras y pesadas, aproximadamente dos veces los números medidos en los extractos de hojas de control (Figura 4c).

No se observó aumento del rendimiento cuando se pulverizó MeJA 24 h después de la infiltración (Figura 4d) o cuando se trataron las hojas 24 h antes de la infiltración con ácido araquidónico, un análogo funcional del ácido salicílico (Girard y otros, 2007) (Figura 4d). Además, una disminución de más de dos veces del rendimiento de C5-1 en las hojas de N. benthamiana pulverizadas con MeJA 1 mM 24 h antes de la infiltración cuando el anticuerpo recombinante se expresó bajo el control del promotor de plastocianina de alfalfa (documento US 7,125,978, que se incorpora en la presente descripción como referencia).

La inducción de la proteína PR-2 de 33 kDa en hojas transfectadas con el vector ^pcambia2300 vacío (ver Figura 2a) fue similar en hojas transfectadas con el vector que codifica el anticuerpo (Figura 5), lo que sugiere un impacto limitado, si no nulo, de la expresión del anticuerpo C5-1 sobre la respuesta de la planta huésped a la agroinfiltración. Nuestras observaciones sugieren en general la utilidad práctica del tratamiento con MeJA previo a la infiltración para impulsar la expresión de proteínas recombinantes en las hojas de N. benthamiana, a través de un efecto promotor de la transcripción aún por comprender de la vía del jasmonato. Referencias

Anand, A., Uppalapati, S.R., Ryu, C.M., Allen, S.N., Kang, L., Tang, Y.H. y Mysore, K.S. (2008) Salicylic acid and systemic acquired resistance play a role in attenuating crown gall disease caused by Agrobacterium tumefaciens. Plant Physiol. 146, 703-715).

Bilgin, D.D., Zavala, J.A., Zhu, J., Clough, S.J., Ort, D.R. y DeLucia, E.H. (2010) Biotic stress globally downregulates photosynthesis genes. Plant Cell Environ. 33, 1597-1613).

Chen, Y., Pang, Q., Dai, S., Wang, Y., Chen, S. y Yan, X. (2011) Proteomic identification of differentially expressed proteins in Arabidopsis in response to methyl jasmonate. J. Plant Physiol. 168, 995-1008).

Craig, R., Cortens, J.P. y Beavis, R.C. (2004) Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J. Proteome Res. 3, 1234-1242. D'Aoust, M.-A., Lavoie, P.-O., Belles-Isles, J., Bechtold, N., Martel, M. y Vezina, L.-P. (2009) Transient expression of antibodies in plants using syringe agroinfiltration. Meth. Mol. Biol. 483, 41-50.

Derksen, H., Rampitsch, C. y Daayf, F. (2013) Signaling cross-talk in plant disease resistance. Plant Sci. 207, 79-87. Duceppe, M.-O., Cloutier, C. y Michaud, D. (2012) Wounding, insect chewing and phloem sap feeding differentially alter the leaf proteome of potato, Solanum tuberosum L. Proteome Sci. 10, 73.

Feys, B., Benedetti, C.E., Penfold, C.N., y Turner, J.G. (1994). Arabidopsis mutants selected for resistance to the phytotoxin coronatine are male sterile, insensitive to methyl jasmonate, and resistant to a bacterial pathogen. Plant Cell 6: 751-759.

Figueiredo, A., Monteiro, F. y Sabastiana, M. (2014) Subtilisin-like proteases in plant-pathogen recognition and immune priming: a perspective. Front. Plant Sci. 5, 739.

Gaeda, D., Valdes, R., Escobar, A., Ares, D.M., Torres, E., Blanco, R., Ferro, W., Dorta, D., Gonzalez, M., Aleman, M.R., Padilla, S., Gomez, L., del Castillo, N., Mendoza, O., Urquiza, D., Soria, Y., Brito, J., Leyva, A., Borroto, C. y Gavilondo, J.V. (2007) Detection of Rubisco and mycotoxins as potential contaminants of a plantibody against the hepatitis B surface antigen purified from tobacco. Biologicals 35, 309-315.

Giri, A.P., Wunsche, H., Mitra, S., Zavala, J.A., Muck, A., Svatos, A. and Baldwin, I.T. (2006) Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuata. VII. Changes in the plant's proteome. Plant Physiol. 142, 1621-1641.

Gomord, V. y Faye, L. (2004) Posttranslational modification of therapeutic proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 7, 171-181.

Goossens, A., Van Montagu, M. y Angenon, G. (1999) Co-introduction of an antisense gene for an endogenous seed storage protein can increase expression of a transgene in Arabidopsis thaliana seeds. FEBS Lett. 456, 160-164. Goulet, C., Khalf, M., Sainsbury, F., D'Aoust, M.-A. y Michaud, D. (2012) A protease activity-depleted environment for heterologous proteins migrating towards the leaf cell apoplast. Plant Biotechnol. J. 10, 83-94.

Goulet, C., Goulet, C., Goulet, M.-C. y Michaud, D. (2010) 2-DE proteome maps for the leaf apoplast of Nicotiana benthamiana. Proteomics 10, 2536-2544.

Goulet, M.-C., Dallaire, C., Vaillancourt, L.-P., Khalf, M., Badri, AM, Preradov, A., Duceppe, M.-O., Goulet, C., Cloutier, C. y Michaud, D. (2008) Tailoring the specificity of a plant cystatin toward herbivorous insect digestive cysteine proteases by single mutations at positively selected amino acid sites. Plant Physiol. 146, 1010-1019.

Hermsmeier, D., Schittko, U. y Baldwin, I.T. (2001) Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuata. I. Large-scale changes in the accumulation of growth- and defense-related plant mRNAs. Plant Physiol. 125, 683-700.

Horger, A.C. y van der Hoorn, R.A.L. (2013) The structural basis of specific protease-inhibitor interactions at the plant-pathogen interface. Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 842-850.

Howing, T., Huesmann, C., Hoefle, C", Nagel, M.-K., Isono, E., Huckelhoven, R. y Gietl, E. (2014) Endoplasmic reticulum KDEL-tailed cysteine endopeptidase 1 of Arabidopsis (AtCEP1) is involved in pathogen defense. Front. Plant Sci. 5, 58.

Jung, C., Lyou, S.H., Yeu, S., Kim, M.A., Rhee, S., Kim, M., Lee, J.S., Choi, Y.D. y Cheong, J.J. (2007) Microarraybased screening of jasmonate-responsive genes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Rep. 26, 1053-1063.

Jung, S.-K., Lindenmuth, B.E., McDonald, K.A., Hwang M.S., Nguyen Bui, M.Q., Falk, B.W., Uratsu, S.L., Phu, M.L. y Dandekar, A.M. (2014) Agrobacterium tumefaciens mediated transient expression of plant cell wall-degrading enzymes in detached sunflower leaves. Biotechnol. Progr. 30, 905-915.

Khoudi, H., Laberge, S., Ferullo, J.M., Bazin, R., Darveau, A., Castonguay, Y., Allard, G., Lemieux, R. y Vezina, L.-P. (1999) Production of a diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants. Biotechnol. Bioeng. 64, 135-143. Kim, Y.-M., Lee, J.-Y., Lee, T., Lee, Y.-H., Kim, S.-H., Kang, S.-H., Yoon, U.-H., Ha, S.-H. y Lim, S.-H. (2012) The suppression of the glutelin storage protein gene in transgenic rice seeds results in a higher yield of recombinant protein. Plant Biotechnol. Rep. 6, 347-353.

Lacroix, B., Li, J., Tzfira, T. y Citovsky, V. (2006) Will you let me use your nucleus? How Agrobacterium gets its T-DNA expressed in the host plant cell. Can. J. Physiol. Pharmacol. 84, 333-345.

Laemmli, Reino Unido (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

Leuzinger, K., Dent, M., Hurtado, J., Stahnke, J., Lai, H., Zhou, X. y Chen, Q. (2013) Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins. J. Vis. Exp. 77, e50521.

Lorenzo, O., Chico, J.M., Sanchez-Serrano, J.J., y Solano, R. (2004). JASMONATE-INSENSITIVE1 encodes a MYC transcription factor essential to discriminate between different jasmonate-regulated defense responses in Arabidopsis. Plant Cell 16: 1938-1950.

Mahajan, N.S., Mishra, M., Tamhane, V.A., Gupta, V.S. y Giri, A.P. (2014) Stress inducible proteomic changes in Capsicum annuum leaves. Plant Physiol. Biochem. 74, 212-217.

Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M. y Avesani, L. (2014) Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. Biomed. Res. Int. 2014, ID 136419.

Noir, S., Bomer, M., Takahashi, N., Ishida, T., Tsui, T.-L., Balbi, V., Shanahan, H., Sugimoto, K. y Devoto, A. (2013)

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un método para enriquecer una proteína heteróloga de interés en una planta o porción de la planta que comprende,

i) tratar previamente la planta o porción de la planta con un activador de la vía del jasmonato durante 1 a 14 días, antes de introducir una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés y que está unida operativamente a una región reguladora derivada de un virus vegetal de ADN;

ii) introducir la secuencia de nucleótidos en la planta o porción de la planta; e

iii) incubar la planta o porción de la planta en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga de interés, el enriquecimiento observado cuando una cantidad de la proteína heteróloga de interés se extrae de la planta o porción de la planta se compara con la proteína heteróloga de interés producida en una segunda planta o porción de la segunda planta que comprende la misma secuencia de nucleótidos y que no se ha tratado previamente con el activador de la vía del jasmonato.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el virus vegetal de ADN es un virus vegetal de ADN transmitido por insectos.
3. El método de la reivindicación 2, en donde el activador de la vía del jasmonato es jasmonato de metilo, ácido jasmónico, coronatina o cualquier derivado biológicamente activo de los mismos.
4. El método de la reivindicación 1, en donde en la etapa de tratamiento previo, el activador de la vía del jasmonato se pulveriza sobre la planta o porción de la planta o se añade al medio de crecimiento que soporta la planta o porción de la planta.
5. El método de la reivindicación 4, en donde el activador de la vía del jasmonato es un gas o un líquido.
6. El método de la reivindicación 5, en donde la planta o porción de la planta se sumerge en un medio líquido que contiene la secuencia de nucleótidos y el activador de la vía del jasmonato.
7. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína heteróloga de interés es un patógeno humano, una proteína viral, una interleucina, una citocina, eritropoyetina, insulina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, un interferón, un factor de coagulación de la sangre, un receptor, un agonista del receptor, un anticuerpo, un neuropolipéptido, un factor de crecimiento, un regulador del crecimiento, un antígeno, un autoantígeno, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal quimérico, un anticuerpo monoclonal monocatenario, una partícula similar a un virus (VLP) o combinaciones de los mismos.