ES2851925T3 - Inhibidores de MET e IGSF1 para el tratamiento de cáncer - Google Patents

Inhibidores de MET e IGSF1 para el tratamiento de cáncer Download PDF

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Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento de cáncer de estómago o de pulmón en donde la composición comprende: (a) un agente para la inhibición de la expresión del gen del miembro 1 de la superfamilia de inmunoglobulinas (IGSF1) (NM_001555.2) o de la expresión o actividad de su proteína; y b) un agente para la inhibición de la expresión del gen del factor de transición mesénquima-epitelio (MET) (NM_001127500.1) o de la expresión o actividad de su proteína como principios activos, en donde los agentes se seleccionan del grupo que consiste en: ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN en horquilla pequeño (ARNhp), microARN (miARN), ácidos peptidonucleicos (APN), oligonucleótidos antisentido, anticuerpos y aptámeros.

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de MET e IGSF1 para el tratamiento de cáncer
[Campo técnico]
La presente divulgación se refiere a un nuevo biomarcador para predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET y a un uso del mismo. En el presente documento también se divulgan composiciones para su uso en el tratamiento de cáncer que comprenden inhibidores de MET y de IGSF1.
[Antecedentes de la técnica]
Generalmente, en las terapias contra el cáncer, la respuesta del cuerpo a un fármaco contra el cáncer administrado depende en gran medida de la susceptibilidad al fármaco de las células cancerosas a las que se dirige el fármaco. La susceptibilidad de las células cancerosas al fármaco difiere mucho en las células cancerosas. Esta diferencia en la susceptibilidad está causada por diferencias cuantitativas o cualitativas en las moléculas diana del fármaco o factores relacionados, adquisición de resistencia a fármacos, etc. Basándose en estos antecedentes, si se conocen los cambios genéticos de las células cancerosas que se producen específicamente cuando las células cancerosas diana son sensibles a un fármaco, es posible determinar la eficacia del fármaco al principio de su desarrollo, establecer métodos de tratamiento y seleccionar un nuevo método de tratamiento, que son muy útiles. Por otra parte, después del tratamiento farmacológico en células cancerosas aisladas de un tejido canceroso obtenido mediante biopsia antes del tratamiento, si se determina, mediante los cambios mencionados anteriormente, si estas células cancerosas son sensibles al fármaco, es posible predecir si el tratamiento farmacológico es eficaz, lo que es clínicamente útil.
Es decir, este fármaco contra el cáncer difiere entre los individuos en tolerancia y toxicidad y tiende a ser resistente en más de la mitad de los mismos pacientes, por lo que ella exploración utilizando un marcador de respuesta al tratamiento adecuado puede conducir a un avance revolucionario en el tratamiento con fármacos contra el cáncer. Por consiguiente, los estudios sobre la respuesta al tratamiento de cada agente contra el cáncer a un gen específico han continuado progresando.
Sin embargo, debido a la acción compleja de factores biológicos relacionados con la respuesta, la diversidad de agentes terapéuticos y vías de administración, y la dificultad de obtener un gran número de muestras, los resultados no son tan satisfactorios.
Al mismo tiempo, uno de los principales mecanismos de regulación celular es la regulación secuencial de las vías bioquímicas en las células para la señalización extracelular. La fosforilación de proteínas se refiere a la señalización intracelular entre moléculas, conduciendo en último lugar a reacciones celulares. Estas cascadas de señalización están altamente reguladas y, con frecuencia, son redundantes, como lo demuestra la presencia de varias proteína cinasas así como fosfatasa. La fosforilación es un proceso que se produce en todas las células y el fenotipo de una célula está significativamente influenciado por la actividad de esta vía. Por tanto, actualmente, se cree que la mayoría de las patologías y/o enfermedades están causados por la actividad anormal o mutaciones funcionales de componentes moleculares en cascadas de cinasas (Weinstein-Oppenheimer et al. Pharma. &. Therap., 2000, 88, 229­ 279).
Entre otros, MET (c-MET) es un receptor tirosina cinasa (RTK, por sus siglas en inglés) representativo que existe en la superficie de las células y se sobreexpresa en muchos tipos de cánceres y, en la mayoría de los casos, los pacientes con sobreexpresión de MET tienen mal pronóstico.
Esta señalización de MET en el cáncer se puede activar de dos formas: La activación de MET está mediada (i) por un mecanismo dependiente de HGF al unirse a su ligando, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, por sus siglas en inglés) para promover la señalización intracelular; o (ii) por un mecanismo independiente de HGF tal como la amplificación del gen MET o la mutación del gen MET.
Sin embargo, la mayoría de los inhibidores desarrollados para MET se centran en la activación de MET por el mecanismo dependiente de HGF, y en la actualidad no se conocen métodos de tratamiento que utilicen un biomarcador para una enfermedad tal como el cáncer provocado por la activación de MET mediada por el mecanismo independiente de HGF.
El documento Younger et al. (Nucleic Acids Research, 2011, 39(13), 5682-91) indica experimentos in vitro en líneas celulares de cáncer de mama que muestran que miR-423-5p actúa como silenciador de la expresión de IGSF1 al dirigirse a la región promotora del gen.
El documento Tanaka et al. (Oncology Reports, 2013, 29, 2169-74) divulga que la regulación negativa de los miembros de la familia miR-34 condujo a una regulación positiva de c-MET, fósforo-c-MET y Bcl-2, induciendo un fenotipo oncogénico en células mesoteliales no malignas.
El documento Corney et al. (Clin. Cáncer Res., 2010, 16(4), 1119-28) divulga que la disminución de los niveles de MET conduce a una proliferación e invasión reducidas en el cáncer de ovario epitelial.
[Divulgación]
[Problema técnico]
En estas circunstancias, los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para desarrollar biomarcadores capaces de predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET en cánceres debido a la actividad de MET mediada por un mecanismo independiente de HGF. Como resultado, los presentes inventores han analizado el patrón de expresión de IGSF1 como biomarcador para predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET en cáncer de estómago y cáncer de pulmón y el patrón de expresión del gen MET y/o su proteína y han encontrado que la inhibición de los genes IGSF1 y MET en las líneas celulares de cáncer de estómago y cáncer de pulmón disminuyeron significativamente la supervivencia, invasión y migración de células cancerosas.
Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar una composición para su uso en el tratamiento de cáncer de estómago y de pulmón. La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. Además, un objeto de la presente divulgación es proporcionar un biomarcador para predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET. Otro objeto de la presente divulgación es proporcionar una composición para predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET.
Aún otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un kit para predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET.
Otro objeto más de la presente divulgación es proporcionar un potenciador para potenciar la susceptibilidad a un inhibidor de MET.
Aún otro objeto más de la presente divulgación es proporcionar un método para predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET.
Otro objeto adicional de la presente divulgación es proporcionar un método para potenciar la susceptibilidad a un inhibidor de MET.
Otro objeto adicional de la presente divulgación es proporcionar una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía de señalización de MET.
[Solución técnica]
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle.
De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un biomarcador para predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET, que comprende el gen del miembro 1 de la superfamilia de inmunoglobulinas (IGSF1, por sus siglas en inglés) (NM_001555.2).
La característica más significativa de la presente divulgación es predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET usando un gen IGSF1 y su proteína producto como biomarcadores.
El biomarcador de la presente divulgación se puede utilizar como indicador de susceptibilidad a un agente contra el cáncer como inhibidor de MET, tiene una precisión y fiabilidad excelentes como marcador de susceptibilidad a un agente contra el cáncer y, por tanto, puede utilizarse para el tratamiento de la aparición, desarrollo y/o invasión de cáncer.
Como se usa en el presente documento, el término "susceptibilidad" se refiere a si un fármaco particular tiene un efecto sobre el cáncer en un paciente individual.
Por ejemplo, el fármaco específico es principalmente un agente contra el cáncer, y el agente contra el cáncer puede tener un efecto según el tipo de cáncer o no. Por otra parte, se sabe que, incluso en el caso de un cáncer reconocido como que es eficaz, el fármaco contra el cáncer tiene un efecto dependiendo de los pacientes individuales o no. El hecho de que un fármaco contra el cáncer tenga o no un efecto sobre el cáncer en un paciente individual se denomina susceptibilidad al fármaco contra el cáncer. Por lo tanto, si es posible predecir un paciente del que se puede predecir el efecto (que responde) antes del inicio del tratamiento y un paciente del que no se puede predecir el efecto (que no responde), se puede realizar una quimioterapia con alta eficacia y seguridad.
Como se usa en el presente documento, el término "predicción" se usa para referirse a la capacidad de un paciente sujeto de responder favorable o adversamente a un fármaco o conjunto de fármacos. En una realización, la predicción es sobre el grado de respuesta. Por ejemplo, la predicción puede estar asociada con si un paciente sobrevivirá sin reaparición del cáncer después del tratamiento con un agente terapéutico particular y/o después de la extirpación quirúrgica del tumor primario y/o después de la quimioterapia durante un período predeterminado y/o la probabilidad de supervivencia. La predicción de la presente divulgación puede usarse clínicamente para determinar la estrategia de tratamiento seleccionando el régimen de tratamiento más apropiado para pacientes con cáncer de colon. La predicción de la presente divulgación es una herramienta útil para predecir si un paciente responderá favorablemente a un tratamiento terapéutico dado, por ejemplo, a la administración de un determinado agente terapéutico o combinación, intervención quirúrgica, quimioterapia, etc. o si un paciente sobrevivirá durante mucho tiempo después de un tratamiento terapéutico.
Por otra parte, de acuerdo con una realización preferida de la presente divulgación, el MET se activa de una manera independiente del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).
La activación de MET está mediada por un mecanismo dependiente de HGF al unirse a su ligando, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, por sus siglas en inglés) para promover la señalización intracelular; o por un mecanismo independiente de HGF tal como la amplificación del gen MET o la mutación del gen MET. El MET de la presente divulgación se activa de una manera independiente de HGF, y el gen de HGF y/o su proteína producto no se expresa o se subexpresa.
Por otra parte, de acuerdo con una realización preferida de la presente divulgación, la activación es la fosforilación de MET inducida por la expresión conjunta del gen del miembro 1 de la superfamilia de inmunoglobulinas (IGSF1) y del gen del factor de transición mesénquima-epitelio (MET, por sus siglas en inglés) (NM_001127500.1).
Por lo tanto, de acuerdo con la presente divulgación, el marcador de la presente divulgación predice la susceptibilidad a un inhibidor de MET cuando MET se activa de una manera independiente de HGF, y puede aplicarse cuando no se obtiene el efecto deseado en células cancerosas con alta expresión de HGF.
Es decir, el biomarcador de la presente divulgación se dirige a las células cancerosas o a un sujeto con cáncer en el que el gen de HGF y/o su proteína producto no se expresa o se subexpresa para confirmar el nivel de expresión de un gen en las células.
De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona una composición para predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET, que comprende un agente para medir el nivel de expresión del gen del miembro 1 de la superfamilia de inmunoglobulinas (IGSF1) (NM_001555.2) o el nivel de expresión de su proteína.
De acuerdo con una realización preferida de la presente divulgación, el MET de la presente divulgación se activa de una manera independiente de h Gf , y el gen de HGF y/o su proteína producto no se expresa o se subexpresa.
Por otra parte, de acuerdo con una realización preferida de la presente divulgación, la activación es la fosforilación de MET inducida por la expresión conjunta del gen del miembro 1 de la superfamilia de inmunoglobulinas (IGSF1) y del gen del factor de transición mesénquima-epitelio (MET, por sus siglas en inglés) (NM_001127500.1).
Por lo tanto, de acuerdo con la presente divulgación, la composición de la presente divulgación predice la susceptibilidad a un inhibidor de MET cuando MET se activa de una manera independiente de HGF, y puede aplicarse cuando no se obtiene el efecto deseado en células cancerosas con alta expresión de HGF.
Asimismo, de acuerdo con una realización preferida de la presente divulgación, el inhibidor de MET es un agente terapéutico para tratar al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un tumor productor de hormona adrenocorticotrópica (ACTH, por sus siglas en inglés), leucemia linfocítica aguda o leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda o crónica, leucemia no linfocítica aguda, cáncer de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, cáncer de cérvix, leucemia mielógena crónica, linfoma, endometriosis, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, cáncer de lengua, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma, mieloma múltiple, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de pene, retinoblastoma, cáncer de piel, cáncer gástrico, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer testicular, tumor de Wilm y trofoblastoma. Más preferido es el tumor productor de ACTH, leucemia linfocítica aguda o leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda o crónica, leucemia no linfocítica aguda, cáncer de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, cáncer de cérvix, leucemia mielógena crónica, cáncer de intestino, linfoma de la zona T, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, sarcoma de Ewing, cáncer de lengua, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma, mieloma múltiple, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de pene, retinoblastoma, cáncer de piel, cáncer gástrico, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer testicular, tumor de Wilm o trofoblastoma, y el más preferido es el cáncer de pulmón o el cáncer de estómago.
En la presente divulgación, el inhibidor de MET se refiere a un agente contra el cáncer. Se puede usar cualquier inhibidor de MET siempre que tenga un efecto anticanceroso y preferentemente comprenda al menos uno seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-MET, receptores señuelo de MET, antagonistas peptídicos de MET, mutaciones de MET dominantes negativas, oligonucleótidos y ribozimas antisentido específicos de MET e inhibidores selectivos de la cinasa MET de molécula pequeña.
A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la expresión "nivel de expresión de un gen o nivel de expresión de su proteína" como se usa en el presente documento se refiere a la detección de un objeto a detectar en una muestra de interés. En la presente divulgación, el objeto a detectar es un ARNm y/o una proteína de un gen correspondiente en la muestra. Es decir, la expresión génica se puede determinar detectando ARN como producto de transcripción del gen o una proteína como producto génico.
La detección de ARN o proteína se puede realizar extrayendo un ARN o proteína de una muestra y detectando el ARN o proteína en el extracto. La detección del ARN o proteína se puede medir mediante un método de inmunoensayo, una reacción de hibridación y una reacción de amplificación, pero sin limitación a los mismos y se puede llevar a cabo fácilmente usando diversas técnicas conocidas en la técnica.
Por otra parte, de acuerdo con una realización preferida de la presente divulgación, el agente para medir el nivel de expresión génica comprende un oligonucleótido antisentido, un par de cebadores o una sonda que se une específicamente al ARNm del gen.
El agente para medir la expresión de ARNm se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido antisentido, un par de cebadores, una sonda y combinaciones de los mismos que son específicas del gen. Es decir, la detección de ácido nucleico puede realizarse mediante una reacción de amplificación usando una molécula de ácido nucleico que codifica el gen o uno o más cebadores oligonucleotídicos hibridados con un complemento de la molécula de ácido nucleico.
Por ejemplo, la detección de ARNm usando un cebador puede realizarse amplificando la secuencia del gen usando un método de amplificación tal como PCR y determinando después la amplificación del gen por un método conocido en la técnica.
Por otra parte, de acuerdo con una realización preferida de la presente divulgación, el agente para medir el nivel de expresión de una proteína comprende un anticuerpo, un péptido o un nucleótido que se une específicamente a la proteína.
El agente para medir el nivel de expresión de una proteína se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a la proteína y comprende anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes y combinaciones de los mismos.
Los anticuerpos comprenden anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes y anticuerpos intactos que tienen dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa, así como fragmentos funcionales de moléculas de anticuerpos tales como Fab, F(ab'), F(ab')2 y Fv. Los anticuerpos se pueden producir fácilmente mediante cualquier técnica bien conocida en la técnica a la que pertenece la presente divulgación, y también se encuentran disponibles anticuerpos producidos comercialmente.
La composición de la presente divulgación puede comprender además un marcador que permita la medición cuantitativa o cualitativa de la formación de un complejo antígeno-anticuerpo, un instrumento convencional, un reactivo, etc. que se utilizan para análisis inmunológicos, además del agente descrito anteriormente para medir la expresión génica.
Los ejemplos de marcadores que permiten la medición cuantitativa o cualitativa de la formación de un complejo antígeno-anticuerpo incluyen, pero sin limitación, enzimas, sustancias fluorescentes, ligandos, sustancias luminiscentes, micropartículas, moléculas redox e isótopos radiactivos. Los ejemplos de enzimas que se pueden usar como marcadores de detección incluyen, pero sin limitación, p-glucuronidasa, p-D-glucosidasa, p-D-galactosidasa, ureasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa, hexocinasa y GDPasa, RNasa, glucosa oxidasa y luciferasa, fosfofructocinasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, aspartato aminotransferasa, fosfoenolpiruvato descarboxilasa, p-lactamasa, etc. Los ejemplos de sustancias fluorescentes incluyen, pero sin limitación, fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, fluorescamina, etc. Los ejemplos de ligandos incluyen, pero sin limitación, derivados de biotina, etc. Los ejemplos de sustancias luminiscentes incluyen, pero sin limitación, ésteres de acridinio, luciferina, luciferasa, etc. Los ejemplos de micropartículas incluyen, pero sin limitación, oro coloidal, látex de color, etc. Los ejemplos de moléculas redox incluyen, pero sin limitación, ferroceno, complejos de rutenio, viológeno, quinona, iones de Ti, iones de Cs, diimida, 1,4-benzoquinona, hidroquinona, K4W (CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy )3]2+, [MO CN)s]4', etc. Los ejemplos de isótopos radiactivos incluyen, pero sin limitación, 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re, etc.
Los ejemplos del instrumento o reactivo incluyen, pero sin limitación, transportadores adecuados, solubilizantes, detergentes, tampones, estabilizantes, etc. Cuando la sustancia de marcado es una enzima, puede incluir un sustrato capaz de medir la actividad enzimática y un terminador de reacción. Los ejemplos de transportadores incluyen transportadores solubles e insolubles. Los ejemplos de transportadores solubles incluyen tampones fisiológicamente aceptables conocidos en la técnica, por ejemplo PBS, y los ejemplos de transportadores insolubles incluyen poliestireno, polietileno, polipropileno, poliéster, poliacrilonitrilo, resina de fluorocarbono, dextrano reticulado, polisacárido, otros artículos, vidrios, metales, agarosa y combinaciones de los mismos.
La composición de la presente divulgación incluye el biomarcador descrito anteriormente como principio activo y, por tanto, se omitirá una descripción del mismo para evitar una complejidad excesiva de la memoria descriptiva.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente divulgación, se proporciona un kit para predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET, que comprende la composición descrita anteriormente.
El kit puede incluir un instrumento, un reactivo, etc., que se utilizan comúnmente en la técnica para el análisis inmunológico, además del agente descrito anteriormente para medir el nivel de expresión de un gen o el nivel de expresión de su proteína.
Los ejemplos del instrumento o reactivo incluyen, pero sin limitación, transportadores adecuados, sustancias de marcado capaces de generar una señal detectable, cromóforos, solubilizantes, detergentes, tampones, estabilizantes, etc. Cuando la sustancia de marcado es una enzima, puede incluir un sustrato capaz de medir la actividad enzimática y un terminador de reacción. Los ejemplos de transportadores incluyen transportadores solubles e insolubles. Los ejemplos de transportadores solubles incluyen tampones fisiológicamente aceptables conocidos en la técnica, por ejemplo PBS, y los ejemplos de transportadores insolubles incluyen poliestireno, polietileno, polipropileno, poliéster, poliacrilonitrilo, resina de fluorocarbono, dextrano reticulado, polisacárido, polímeros tal como micropartículas magnéticas compuestas de látex recubierto con metales, otros artículos, vidrios, metales, agarosa y combinaciones de los mismos.
El kit de la presente divulgación incluye el biomarcador y la composición descritos anteriormente y, por tanto, se omitirá una descripción de los mismos para evitar una complejidad excesiva de la memoria descriptiva.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición para su uso en el tratamiento del cáncer de estómago o de pulmón que comprende un agente para inhibir la expresión del gen del miembro 1 de la superfamilia de inmunoglobulinas (IGSF1) (NM_001555.2) o la expresión o actividad de su proteína y un agente para inhibir la expresión del gen del factor de transición mesénquima-epitelio (MET) (NM_001127500.1) o la expresión o actividad de su proteína.
En la presente divulgación, el sujeto potencia la susceptibilidad a un inhibidor de MET cuando se activa (fosforila) MET de una manera independiente del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), y se puede aplicar cuando no se obtiene el efecto deseado en células cancerosas activadas (fosforiladas) de una manera independiente de HGF.
Es decir, el inhibidor de la presente invención para inhibir la expresión del o de los genes IGSF1 y/o MET o la expresión o actividad de su proteína puede reducir la fosforilación de MET y reducir la migración e invasión de células cancerosas, mostrando así un excelente efecto anticanceroso.
Por otra parte, de acuerdo con la presente invención, el inhibidor comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN en horquilla pequeño (ARNhp), microARN (miARN), ácidos peptidonucleicos (APN), oligonucleótidos antisentido, anticuerpos y aptámeros. Es más preferido el ARN de interferencia pequeño (ARNip) o el ARN en horquilla corta (ARNhc).
Como se usa en el presente documento, el término "microARN (miARN)" se refiere a aproximadamente 22 nt de ARN no traducido que actúa como inhibidor postraduccional mediante el emparejamiento de bases con la región 3' no traducida (UTR, por sus siglas en inglés) del ARNm. El método para producir miARN no está particularmente limitado y pueden usarse métodos conocidos en la técnica.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el microARN (miARN) es miR-34a que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o miR-34c que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.
Como se usa en el presente documento, el término "ARNip" se refiere a pequeños fragmentos de ARN de 21-25 nucleótidos de longitud que se producen por escisión de un ARN bicatenario mediante dicer y se unen específicamente a un ARNm que tiene una secuencia complementaria para inhibir la expresión. Es decir, se refiere a la inhibición de la expresión génica uniéndose específicamente a un ARNm diana de la presente invención. El ARNip se puede sintetizar química o enzimáticamente. El método para producir ARNip no está particularmente limitado y se pueden usar métodos conocidos en la técnica.
Como se usa en el presente documento, el término "ARNhp" se refiere a un ARN monocatenario que consta de 45 a 70 nucleótidos de longitud y significa que el oligo ADN que conecta enlazadores de 3-10 bases se sintetiza entre el sentido y el anti sentido complementario de las secuencias de ARNip del gen diana y después se clona en el vector plasmídico, o el ARNhp se inserta y se expresa en retrovirus tales como lentivirus y adenovirus para hacer de ese modo ARNhp de estructura de horquilla con bucle, que se convierte en ARNip por dicer en células, exhibiendo así efectos de ARNi. Las construcciones/vectores de expresión que contienen ARN en horquilla pequeño (ARNhp) pueden producirse mediante métodos conocidos en la técnica.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el ARN de interferencia pequeño (ARNip) es ARNip de IGSF1 que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3, El ARNip de IGSF1 que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4 o el ARNip de MET que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, y el ARN en horquilla pequeño (ARNhp) es ARNhp de IGSF1 que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6 o ARNhp de MET que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7.
De acuerdo con la presente divulgación, cuando la expresión del gen IGSF1 o su proteína producto en las células cancerosas se inhibe por el método de ARNi (ARNip, ARNhp y microARN), la fosforilación de MET se reduce de una manera dependiente de la concentración de ARNip.
Asimismo, en la presente invención, las células cancerosas en las que se inhibe la expresión de los genes IGSF1 y MET o su proteína producto muestran una tasa de supervivencia, migración e invasión significativamente baja en comparación con las células cancerosas en las que se mantiene la expresión.
Por lo tanto, esto sugiere que la inhibición de la expresión de los genes IGSF1 y/o MET o la expresión o actividad de su proteína potencia la susceptibilidad de las células cancerosas a un inhibidor de MET, y en basándose en esto, la presente divulgación tiene un efecto excelente de potenciar la susceptibilidad de un sujeto a un inhibidor de MET.
La composición para su uso de acuerdo con la presente invención puede comprender además un transportador farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de transportadores farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en la presente invención se pueden seleccionar de excipientes convencionales, disgregantes, aglutinantes, lubricantes y otros aditivos tales como estabilizantes, emolientes, emulsionantes, etc. Los ejemplos de excipientes pueden incluir celulosa microcristalina, lactosa, hidroxicelulosa de baja sustitución, etc. y los ejemplos de desintegrantes pueden incluir almidón glicolato de sodio, monohidrogenofosfato de calcio anhidro, etc. Los ejemplos de aglutinantes pueden incluir polivinilpirrolidona, hidroxipropil celulosa de baja sustitución, etc., y se pueden seleccionar ejemplos de lubricantes entre estearato de magnesio, dióxido de silicio, talco, etc.
La composición de la presente divulgación potencia la susceptibilidad al inhibidor de MET usando el nivel de expresión del biomarcador descrito anteriormente y, por tanto, se omitirá una descripción del mismo para evitar una complejidad excesiva de la memoria descriptiva.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente divulgación, se proporciona una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía de señalización de MET, que comprende el potenciador descrito anteriormente para potenciar la susceptibilidad y un inhibidor de MET como principios activos.
En la presente divulgación, los ejemplos de enfermedades asociadas con la desregulación de la vía de transducción de señales de MET incluyen cánceres, ateroesclerosis, fibrosis pulmonar, fibrosis y regeneración renal, enfermedades hepáticas, enfermedades alérgicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades cerebrovasculares o síntomas asociados con el trasplante de órganos, preferentemente cánceres.
Es decir, el inhibidor para inhibir la expresión de loa genes IGSF1 y/o MET o la expresión o actividad de su proteína como potenciador para potenciar la susceptibilidad a un inhibidor de MET de la presente divulgación aumenta la susceptibilidad a un agente contra el cáncer y, tras la administración con el fármaco contra el cáncer, aumenta la eficacia del fármaco contra el cáncer, facilitando así el tratamiento de cánceres.
El "cáncer" a mejorar, prevenir o tratar por la composición de la presente divulgación es un término genérico para enfermedades causadas por células con propiedades agresivas de las células que se dividen y crecen más allá de los límites normales, propiedades invasivas de las células que invaden el tejido circundante y propiedades metastásicas de las células que se propagan a otras áreas del cuerpo. En la presente memoria descriptiva, el término "cáncer" también se usa para referirse a un tumor maligno.
Los ejemplos de cánceres a los que se puede aplicar la composición de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de sangre, cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, sarcoma uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de ano, cáncer de colon, carcinoma de trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de intestino delgado, cáncer endocrino, cáncer endocrino, cáncer paratiroideo, cáncer suprarrenal, tumor de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de próstata, cáncer broncogénico, tumor de médula ósea, etc. Preferentemente, la composición de la presente divulgación se puede usar para el tratamiento o la prevención de cáncer de estómago o cáncer de pulmón.
Como se usa en el presente documento, el término "prevención" se refiere a la inhibición de la aparición de una enfermedad o trastorno en un animal que puede estar predispuesto a la enfermedad o trastorno, pero al que todavía no se ha diagnosticado que los tenga. Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere a: (i) la inhibición del desarrollo de una enfermedad o trastorno; (ii) el alivio de una enfermedad o trastorno; y (iii) la eliminación de una enfermedad o trastorno.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender además un transportador farmacéuticamente aceptable.
El transportador farmacéuticamente aceptable que incluyen las composiciones farmacéuticas de la presente invención se usa comúnmente para la formulación, y los ejemplos del mismo incluyen, pero sin limitación, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato de potasio, arginato, gelatina, silicato de potasio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabes, metilcelulosa, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio y aceites minerales. La composición farmacéutica de la presente invención puede incluir además un lubricante, un humectante, un edulcorante, un agente saporífero, un emulsionante, un agente de suspensión y un conservante, además de los componentes descritos anteriormente. Los detalles de los transportadores y formulaciones farmacéuticamente aceptables adecuados se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995).
Una dosis adecuada de la composición farmacéutica de la presente invención puede variar dependiendo de varios factores tales como los métodos de formulación, formas de administración, edad del paciente, peso corporal, sexo, gravedad de la enfermedad y dieta, momento de administración, vía de administración, tasa de excreción y respuesta.
Al mismo tiempo, la composición farmacéutica de la presente invención se administra a una dosis diaria de 0,0001 a 100 mg/kg (peso corporal).
La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía oral o por vía parenteral. Para administración parenteral, la composición farmacéutica de la presente composición puede administrarse por vías intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal e intradérmica. La vía de administración de la composición farmacéutica de la presente invención se puede determinar preferentemente dependiendo del tipo de enfermedad.
La concentración del inhibidor para inhibir la expresión de un gen de interés o su proteína en el potenciador que se encuentra en la composición de la presente invención como principio activo se determina dependiendo de la finalidad del tratamiento, la afección del paciente, el período requerido y la gravedad de la enfermedad, pero no se limita a un intervalo específico.
La composición farmacéutica de la presente invención puede formularse con un transportador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable en forma de dosis unitaria o en forma de dosis múltiples de acuerdo con cualquier método que sea bien conocido por los expertos en la materia. La formulación pueden encontrarse en forma de solución, una suspensión o una emulsión en aceite o medio acuoso, o extractos, polvos, gránulos, comprimidos o cápsulas y puede comprender además un dispersante o un estabilizante.
La composición de la presente divulgación potencia la muerte celular de las células cancerosas usando el potenciador descrito anteriormente para potenciar la susceptibilidad y un inhibidor de MET que es un agente contra el cáncer y, por tanto, se omitirá una descripción de la misma para evitar una complejidad excesiva de la memoria descriptiva.
De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente divulgación, se proporciona un método para predecir la susceptibilidad a un inhibidor de MET, que comprende las etapas de: (a) preparar una muestra biológica de un sujeto; y (b) medir el nivel de expresión del gen del miembro 1 de la superfamilia de inmunoglobulinas (IGSF1) (NM_001555.2) o la expresión de su proteína en la muestra biológica, en donde en la etapa (b), si el nivel de expresión del gen IGSF1 o el nivel de expresión de su proteína es mayor que el de un grupo de control, se determina que el sujeto es sensible al inhibidor de MET.
A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la expresión "grupo de control" se refiere al nivel de expresión de un gen de interés o de su proteína en una persona sana normal o al nivel de expresión de un gen de interés o de su proteína en un paciente a comparar.
El método de predicción de la presente divulgación comprende obtener una muestra biológica de un paciente sujeto, medir la expresión de IGSF1 en la muestra, y si la expresión de un gen de interés aumenta en comparación con una muestra de control, determinar que la muestra de interés es sensible a un inhibidor de MET.
Por otra parte, de acuerdo con una realización preferida de la presente divulgación, el sujeto es uno en el que el gen de HGF o su proteína está subexpresado o no está expresado en comparación con un grupo de control.
Asimismo, de acuerdo con una realización preferida de la presente divulgación, el sujeto es uno en el que el gen MET o su proteína está altamente expresado en comparación con un grupo de control.
Más específicamente, si se determina que el gen de HGF o su proteína está subexpresado o no está expresado en comparación con un grupo de control y se encuentra que los niveles de expresión de los genes IGSF1 y MET o sus proteínas aumentan en comparación con los valores del control, se determina que las células tumorales de interés obtenidas de un paciente sujeto son sensibles al inhibidor de MET que es un agente contra el cáncer.
Es decir, cuando el gen IGSF1 o su proteína está altamente expresados en un paciente en el que e1HGF no está expresado o está subexpresado, el gen IGSF1 induce la activación de MET y, por tanto, se determina que el gen IGSF1 es sensible al inhibidor de MET.
La expresión "subexpresión" utilizada en el presente documento para referirse a los niveles de expresión de genes se refiere al valor o nivel de un biomarcador en una muestra biológica que es menor que el valor o nivel de un biomarcador detectado en una muestra biológica obtenida de un individuo sano o normal o de un individuo a comparar, cuando el biomarcador muestra o indica un proceso anormal, una enfermedad u otras afecciones en el individuo.
La expresión "alta expresión" utilizada en el presente documento para referirse a los niveles de expresión de los genes se refiere al valor o nivel de un biomarcador en una muestra biológica que es mayor que el valor o nivel de un biomarcador detectado en una muestra biológica obtenida de un individuo sano o normal o de un individuo a comparar, cuando el biomarcador muestra o indica un proceso anormal, una enfermedad u otras afecciones en el individuo.
Por otra parte, las expresiones utilizadas para referirse a los niveles de expresión de genes pueden referirse a aquellos que tienen un "nivel diferencial" o "nivel diferencial" o a aquellos expresados diferencialmente en comparación con el nivel de expresión "normal" del biomarcador y abarcan diferencias en la expresión tanto cualitativas como cuantitativas.
Como se usa en el presente documento, la expresión "muestra biológica" se refiere a cualquier muestra obtenida de un individuo a partir de la cual se puede detectar el biomarcador de la presente divulgación.
De acuerdo con una realización preferida de la presente divulgación, la muestra biológica es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en saliva, biopsia, sangre, tejido cutáneo, cultivo de fluido, heces y orina, pero sin limitarse a los mismos, y se puede preparar mediante cualquier método que se utilice comúnmente en la técnica.
El método de la presente divulgación determina la susceptibilidad utilizando el biomarcador descrito anteriormente y, por tanto, se omitirá una descripción del mismo para evitar una complejidad excesiva de la memoria descriptiva.
De acuerdo con aún otro aspecto adicional no limitante de la presente divulgación, se proporciona un método para potenciar la susceptibilidad a un inhibidor de MET, que comprende la administración conjunta a un sujeto del potenciador descrito anteriormente para potenciar la susceptibilidad y un inhibidor de MET.
El método de la presente divulgación potencia la susceptibilidad usando el potenciador descrito anteriormente para potenciar la susceptibilidad y el inhibidor de MET que es un agente contra el cáncer y, por tanto, se omitirá una descripción de la misma para evitar una complejidad excesiva de la memoria descriptiva.
[Efectos ventajosos]
Con el uso del biomarcador para predecir la susceptibilidad al inhibidor de MET de la presente divulgación, es posible determinar de forma fiable la susceptibilidad de pacientes individuales antes del inicio del tratamiento y, por tanto, es posible seleccionar un agente contra el cáncer que tenga un efecto terapéutico elevado. Por otra parte, es posible evitar el uso de un agente contra el cáncer que no tenga ningún efecto y, por lo tanto, es posible evitar efectos secundarios innecesarios.
[Descripción de los dibujos]
La FIG. 1A muestra la identificación de un marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF.
La FIG. 1B muestra los resultados del análisis MALDI-TOF para la identificación del miembro 1 de la superfamilia de inmunoglobulinas (IGSF1) como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF. La FIG. 2A muestra los resultados del análisis de correlación entre la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y para a fosforilación de MET en líneas celulares humanas de cáncer de estómago.
La FIG. 2B muestra los resultados del análisis de correlación entre la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y para a fosforilación de MET en líneas celulares humanas de cáncer de pulmón.
La FIG. 2C muestra los resultados del análisis de la unión entre IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la proteína MET en líneas celulares humanas de cáncer de estómago.
La FIG. 2D muestra las posiciones de unión específicas entre IGSF1, un marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y MET en líneas celulares humanas de cáncer de estómago, así como los resultados del análisis de unión entre las proteínas MET e IGSF1.
La FIG. 2E muestra los cambios en la fosforilación de MET mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF en líneas celulares humanas de cáncer de estómago y línea celular de cáncer de pulmón.
La FIG. 2f muestra los resultados del análisis del mecanismo regulador en función de los cambios en la expresión de IGSF1 o MET en líneas celulares de cáncer de estómago.
- ! "# $% & los resultados de la inhibición del crecimiento de células cancerosas mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF en líneas celulares humanas de cáncer de estómago.
La FIG. 3B muestra los resultados de la inhibición del crecimiento de células cancerosas mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF en líneas celulares humanas de cáncer de pulmón.
La FIG. 4A muestra los resultados de la inhibición de la invasión y migración de células cancerosas mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF en líneas celulares humanas de cáncer de estómago.
La FIG. 4B muestra los resultados de la inhibición de la invasión de células cancerosas mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF en líneas celulares humanas de cáncer de pulmón.
La FIG. 5A muestra los resultados del análisis comparativo de la eficacia del inhibidor de MET dependiendo de la presencia o ausencia de expresión de IGSF1 en líneas celulares de cáncer de estómago.
La FIG. 5b muestra los resultados del análisis comparativo de la eficacia del inhibidor de MET dependiendo de la presencia o ausencia de expresión de IGSF1 en la línea celular de cáncer de pulmón.
La FIG. 6A muestra los resultados de la inhibición simultánea de IGSF1, un marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF, y MET usando microARN.
La FIG. 6B muestra los cambios en la expresión de IGSF1 y MET por miR-34a y miR-34c que inhiben simultáneamente la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de MET.
La FIG. 6C muestra los resultados del ensayo de crecimiento celular por miR-34a y miR-34c que inhiben simultáneamente la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de MET.
La FIG. 6d muestra los resultados de la inhibición de la invasión y migración celular por miR-34a y miR-34c que inhiben simultáneamente la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de MET.
La FIG. 6E muestra la recuperación de la expresión de IGSF1 y MET inhibida por mir-34a y mir-34c usando antagomir.
La FIG. 7 muestra la relación de la expresión activada de IGSF1, un marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF, MET y en tejidos de pacientes con cáncer de estómago, así como en las muestras representativas de los pacientes.
[Modo para la invención]
Método y condiciones experimentales
Inducción de fosforilación MET independiente de HGF
Se transfectaron líneas celulares AGS de cáncer de estómago humanas independientes de HGF con plásmido con MET de tipo silvestre durante 48 horas, y después se recogieron y analizaron los medios de cultivo celular mediante el ensayo ELISA de HGF (R&D Systems, Inc, Minneapolis, MN, EE.UU.). Se recogieron los lisados celulares y se verificaron los cambios en las proteínas MET e IGSF1 mediante análisis de transferencia Western.
Inmunoprecipitación y MALDI-TOF
Para identificar los genes implicados en la activación de MET independiente de HGF, el plásmido con MET de tipo silvestre se sobreexpresó en la línea celular de cáncer de estómago humana AGS durante 48 horas, y después se recogieron los lisados celulares. Se mezclaron 500 |jg de lisados de células de cáncer de estómago humanas con 1 |jg de anticuerpo anti-pMET y después se cultivaron a 4 °C durante 12 horas. A continuación, se añadieron 20 j l de perlas de proteína-sepharose (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.) y la mezcla se hizo reaccionar durante 2 horas más. Los inmunoprecipitados se lavaron con un tampón (tampón de lisis Nondiet P-40) cinco veces, y se añadieron y calentaron 20 j l de tampón SDS de muestra 2X. Los inmunoprecipitados se sometieron a SDS-PAGE y se tiñeron con un kit de tinción con plata (GE Healthcare Bio-Sciences Corp. NJ, Ee .UU.). Las proteínas identificadas mediante tinción con plata se identificaron mediante espectrometría de masas para identificar las proteínas implicadas en la activación de MET independiente de HGF.
Análisis por transferencia Western
Para realizar un análisis de transferencia Western, las proteínas aisladas de las células correspondientes se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas (membranas PolyScreen; New England Nuclear, Boston, Mass., Estados Unidos). Las proteínas se incubaron con varios anticuerpos (anti-fosfo MET, E-cadherina (Cell signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.), anti-MET, anti-r-tubulina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-IGSFl (Abnova, Jhouzih, Taipei, Taiwán)) a 4 °C durante 12 horas y después se lavó con tampón TBS-T 1X tres veces durante 10 minutos. Las proteínas se incubaron con el anticuerpo secundario anti-conejo-HRP o anti-ratón-HRP a temperatura ambiente durante 2 horas y se lavaron con tampón TBS-T 1X tres veces durante 10 minutos, y después se detectó la expresión de las proteínas usando solución ECL (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.).
Ensayo de cámara de invasión y ensayo de migración celular
Las líneas celulares de cáncer de estómago MKN45 y SNU638 y la línea celular de cáncer de pulmón HCC827 humanas independientes de HGF se transfectaron con ARNip de IGSF1 o ARNip de MET durante 48 horas. Se colocaron insertos de placa (BD Biosceinces) con un tamaño de poro de 8 mm en una placa de 24 pocillos, y se sembraron 100 pl de matrigel (BD Biosciences) en cada uno a una concentración de 200 pg/ml y se incubaron en una incubadora con CO2 durante 30 minutos. Se colocaron 2,5 x 104 células transfectadas con ARNip de MET o de IGSF1 en la placa de inserción en un volumen total de 100 pl en medio sin suero. Se sembraron 400 pl de medio de crecimiento (RPMI1640 FBS al 10 %) en la placa inferior y se cultivaron en una incubadora con CO2 durante 24 horas. Después de 24 horas, la placa de inserción se lavó con PBS y las células restantes se limpiaron con un hisopo de algodón y se fijaron en formalina al 10 % durante 20 minutos. Después de lavar con agua purificada, las células se tiñeron con una solución de cristal violeta al 0,01 % durante 20 minutos y se lavaron con agua tibia, y después se contó el número de células migradas. En el caso del ensayo de migración, se llevó a cabo el mismo procedimiento anterior sin recubrir la placa de inserción. Se contó y verificó el número de células que migraron a través de la placa de inserción en las líneas celulares de control y de cáncer de estómago y de cáncer de pulmón transfectadas con ARNip de MET o IGSF1.
Inhibición de la expresión génica
Producción de ARNip y ARNhp
Las líneas celulares de cáncer de estómago MKN45 y SNU638 y la línea celular de cáncer de pulmón HCC827 humanas independientes de HGF se transfectaron con ARNip de IGSF1 (SEQ ID NO: 3 IGSF1 n.° 1; 5'-GCAGGUCUUUACCGGUGCU-3', SEQ ID NO: 4 IGSF1 n.° 2; 5'-GGUGCUGCUACUGGAAGGA-3'), ARNip de MET (SEQ ID NO: 5; 5'-AAAGATAAACCTCTCATAATG-3'), ARNhp de IGSF1 (SEQ ID NO: 6; 5'-CAAAGAUGGAAGUGAAAUA UCUCUAUUUCACUUCCAUCUUUGUU-3') y/o ARNhp de MET (SEQ ID NO: 7; 5'-GCCAGCCUGAAUGAUGACAUCUCUGUCAUCAUUCAGGCUGGCUU-3' ) durante 48 horas y se recogieron los lisados celulares y se verificaron los cambios en las proteínas MET e IGSF1 mediante análisis por transferencia Western.
Producción de microARN
El miRNA-34a humano (SEQ ID NO: 1; UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU) o el miRNA-34c (SEQ ID NO: 2; AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. Se sembraron 4 x 105células de cáncer de estómago humanas SNU638 independientes de HGF y se transfectaron con 300 nM de miRNA-34a o miARN-34c, y después se contó el número de células usando el método de exclusión con azul tripán durante 0, 1, 2 y 3 días.
Determinación del crecimiento celular
Se transfectaron 4 x 105 células SNU638 o 3 x 105 células MKN45 humanas de cáncer de estómago independientes de HGF con 300 nM de miRNA-34a (SEQ ID NO: 1) o miRNA-34c (SEQ ID NO: 2), y después se contó el número de células usando el método de exclusión con azul tripán durante 0, 1, 2 y 3 días.
Producción de Antagomir
Los antagomirs de miARN-34a y miARN-34c humanos se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. Se sembraron 4 x 105células SNU638 o 3 x 105 células MKN45 humanas de cáncer de estómago independientes de HGF y se transfectaron con 300 nM de miRNA-34a o miRNA-34c, y después se contó el número de células usando el método de exclusión con azul tripán durante 0, 1, 2 y 3 días.
Ejemplo 1: Identificación de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF
Para identificar un marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF, los presentes inventores indujeron la fosforilación de MET independiente de HGF sobreexpresando el ADN de MET de tipo silvestre en la línea celular humana de cáncer de estómago AGS HGF negativa (Figura 1A, gráfico de la izquierda). Se realizó la inmunoprecipitación usando el anticuerpo contra p-MET y después se realizó la tinción con plata para identificar la unión de la proteína a MET (Figura 1A, imagen de gel derecha).
Por otra parte, se realizó un análisis de MALDI-TOF en el producto para identificar la unión de la proteína a MET. Como resultado, como se muestra en la FIG. 1B, el miembro 1 de la superfamilia de inmunoglobulinas (IGSF1) se identificó como un marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF.
Ejemplo 2: Determinación de la correlación entre la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la fosforilación de MET
2-1. Análisis de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la fosforilación de MET en líneas celulares humanas de cáncer de estómago Para determinar la correlación entre la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la fosforilación de MET, los presentes inventores realizaron análisis de transferencia Western usando anticuerpos contra IGSF1 y pMET (MET activo fosforilado) en un total de 8 tipos de líneas celulares de cáncer de estómago.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 2A (izquierda), cuando MET e IGSF1 se expresaron conjuntamente en las líneas celulares humanas de cáncer de estómago SNU638 y MKN45, se observó la fosforilación de MET.
Por otra parte, como resultado de la determinación de la expresión de HGF de SNU638 y MKN45, no se detectó HGF en comparación con la línea celular U87MG de control positivo, como se muestra en la FIG. 2A (derecha).
Por lo tanto, se pudo ver que la fosforilación de MET únicamente se indujo en el caso de HGF negativas (independiente) y cuando se expresaron conjuntamente MET e IGSF1.
2-2. Análisis de correlación entre la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la fosforilación de MET en líneas celulares humanas de cáncer de pulmón Para analizar la correlación entre la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la fosforilación de MET en líneas celulares humanas de cáncer de pulmón, los presentes inventores realizaron análisis de transferencia Western usando anticuerpos contra IGSF1 y pMET (MET activo fosforilado) en un total de 9 tipos de líneas celulares de cáncer de pulmón.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 2B (izquierda), la fosforilación de MET se observó cuando MET e IGSF1 se expresaron conjuntamente en las líneas celulares humanas de cáncer de pulmón H1944, H2228 y HCC827. Por otra parte, como resultado de la determinación de la expresión de HGF de H1944, H2228 y HCC827, no se detectó HGF en comparación con la línea celular U87MG de control positivo, como se muestra en la FIG. 2B (derecha). Por lo tanto, se pudo ver que la fosforilación de MET únicamente se indujo en el caso de HGF negativas (independiente) y cuando se expresaron conjuntamente MET e IGSF1.
2-3. Determinación de la unión entre IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la proteína MET en líneas celulares humanas de cáncer de estómago
Para analizar de la unión entre IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la proteína MET en líneas celulares humanas de cáncer de estómago, los presentes inventores sobreexpresaron MET e IGSF1 en la línea celular humana de cáncer de estómago AGS, realizaron la inmunoprecipitación usando el anticuerpo contra p-MET, y después determinaron la unión con IGSF1 mediante análisis de transferencia Western.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 2C (izquierda), cuando MET se sobreexpresó en la línea celular humana de cáncer de estómago AGS HGF negativa, se encontró que MET se unía a IGSF1.
Por otra parte, como se muestra en la FIG. 2C (derecha), cuando se fraccionaron el citosol y la membrana de la línea celular humana de cáncer de estómago AGS HGF negativa con MET sobreexpresado, se encontró que MET se unía a IGSF1 en la membrana celular.
Para determinar dónde se unen las dos proteínas entre sí, los presentes inventores produjeron construcciones con eliminación de cada dominio de la proteína IGSF1. Por otra parte, se produjeron construcciones con eliminación de dominio extracelular y construcciones con eliminación de dominio helicoidal o citoplásmico. Las construcciones con eliminación de MET de TS e IGSF1 se transfectaron en células 293T y las posiciones en las que se unieron las proteínas se determinaron mediante inmunoprecipitación.
Como resultado, como se muestra en la Figura 2D, se encontró que la proteína no se unía en las eliminaciones de 571-1328 (dominio extracelular) y, por tanto, se encontró que las dos proteínas se unían entre sí en estas posiciones. Por otra parte, se encontró que MET de TS e IGSF1 estaban unidas entre sí.
2-4. Cambios en la fosforilación de MET mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF en líneas celulares de cáncer de estómago y en la línea celular de cáncer de pulmón humanas
Para analizar los cambios en la fosforilación de MET mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF en la línea celular de cáncer de estómago (AGS, MKN45, SNU638) y en la línea celular de cáncer de pulmón (HCC827) humanas, los presentes inventores inhibieron la expresión de IGSF1 o MET mediante el método de ARNip y después determinaron los cambios en la fosforilación de la proteína MET mediante análisis de transferencia Western.
Como resultado, como se muestra en la Figura 2E, la fosforilación de MET disminuyó de una manera dependiente de la concentración de ARNip o ARNhp de IGSF1 en las líneas celulares de cáncer de estómago (AGS, MKN45, SNU638) y en la línea celular de cáncer de pulmón (HCC827) humanas. Por otra parte, la expresión de IGSF1 disminuyó de una manera dependiente de la concentración de ARNhp de MET.
2- 5. Análisis del mecanismo regulador en función de los cambios en la expresión de IGSF1 o MET en líneas celulares de cáncer de estómago
Los presentes inventores inhibieron la expresión de IGSF1 o MET por el método de ARNhp en las líneas celulares humanas de cáncer de estómago SNU638 y MKN45 y después determinaron los cambios en la expresión de cada gen mediante PCR en tiempo real.
Como resultado, como se muestra en el panel superior de la FIG. 2F, la expresión de IGSF1 disminuyó por la inhibición de la expresión de MET en ambas líneas celulares, y la expresión de MET disminuyó por la inhibición de la expresión de IGSF1. Estos resultados indicaron que la expresión estaba regulada a nivel de Ar N.
Por otra parte, como se muestra en el panel inferior de la FIG. 2F, se encontró que la expresión de IGSF1 y MET no estaba regulada a nivel de proteínas en las líneas celulares de cáncer de estómago. Los resultados se obtuvieron mediante análisis de transferencia Western después del tratamiento con un inhibidor de MET, seguido de tratamiento con los correspondientes inhibidores para determinar la regulación de la expresión de IGSF1.
(PHA665752: inhibidor de c-MET, MG132: inhibidores de proteosomas, Leupeptina y NH4Cl: inhibidor de proteasas lisosómicas)
Ejemplo 3: Inhibición del crecimiento celular mediante la inhibición de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación MET independiente de HG
3- 1. Análisis de la inhibición del crecimiento celular mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF en líneas celulares humanas de cáncer de estómago
Los presentes inventores inhibieron la expresión de IGSF1 o MET mediante el método de ARNhp en las líneas celulares humanas de cáncer de estómago SNU638 y MKN45 y después determinaron la inhibición del crecimiento celular.
Como resultado, como se muestra en el panel superior de la FIG. 3A, cuando se contó el número de células durante 3 días, se encontró que el crecimiento celular se inhibió por la inhibición de la expresión de MET o IGSF1.
Por otra parte, se inhibió la expresión de IGSF1 o MET en las líneas celulares humanas de cáncer de estómago SNU638 y MKN45, y después se determinó el grado de inhibición del crecimiento celular mediante un ensayo de formación de colonias.
Como resultado, como se muestra en el panel inferior de la FIG. 3A, se encontró que el número de colonias disminuyó por la inhibición de la expresión de IGSF1 o MET.
3-2. Análisis de la inhibición del crecimiento celular mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF en líneas celulares humanas de cáncer de pulmón
Los presentes inventores inhibieron la expresión de IGSF1 o la expresión de MET mediante el método de ARNhp en las líneas celulares humanas de cáncer de pulmón HCC827 y HCC194 y después determinaron la inhibición del crecimiento celular.
Como se muestra en la FIG. 3B, como resultado de contar el número de células a las 24 horas y a las 48 horas, se encontró que el crecimiento celular se inhibió en el grupo con la inhibición de la expresión de MET o IGSF1.
Ejemplo 4: Determinación de la inhibición de la invasión y migración de células cancerosas mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF
4-1. Análisis de la inhibición de la invasión y migración de células cancerosas mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF en líneas celulares humanas de cáncer de estómago
Los presentes inventores inhibieron la expresión de IGSF1 mediante el método de ARNip en las líneas celulares humanas de cáncer de estómago SNU638 y MKN45 y después analizaron el grado de inhibición de la invasión y migración mediante un ensayo de cámara de invasión y un ensayo de curación de heridas.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 4A, se observó que las células que inhibieron la expresión de IGSF1 y las células que inhibieron la expresión de MET inhibieron de manera similar la invasión y la migración.
4- 2. Análisis de la inhibición de la invasión y migración de células cancerosas mediante la inhibición de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF en líneas celulares humanas de cáncer de pulmón
Los presentes inventores inhibieron la expresión de IGSF1 mediante el método de ARNip en las líneas celulares humanas de cáncer de pulmón HCC827 y H1944 y después analizaron el grado de inhibición de la invasión y migración mediante un ensayo de cámara de invasión y un ensayo de curación de heridas.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 4B, se observó que la inhibición de IGSF1 en HCC827 y H1944 disminuyó la invasión al 80 % o menos en comparación con el control (sc). En el caso de la inhibición de MET, se observó un patrón similar.
Ejemplo 5: Análisis del efecto de IGSF1 sobre el uso de un inhibidor de MET en líneas celulares de cáncer de estómago y de pulmón
5- 1. Análisis comparativo de la eficacia del inhibidor de MET en función de la presencia o ausencia de expresión de IGSF1 en líneas celulares de cáncer de estómago
Los presentes inventores encontraron que la inhibición de la expresión de IGSF1 en las líneas celulares de cáncer de estómago SNU638 y MKN45 aumentaba la respuesta al inhibidor de MET. Como se muestra en la FIG. 5A, la inducción de apoptosis mediante el tratamiento de un inhibidor de MET, PHA665752, a cada concentración se determinó por exclusión con azul tripán, demostrando que la expresión de la caspasa 3 escindida aumentó.
5- 2. Análisis comparativo de la eficacia del inhibidor de MET en función de la presencia o ausencia de expresión de IGSF1 en línea celular de cáncer de pulmón
Los presentes inventores encontraron que la inhibición de la expresión de IGSF1 en la línea celular de cáncer de pulmón HCC827 aumentaba la apoptosis y aumentaba la respuesta al inhibidor de MET.
Ejemplo 6: Inhibición simultánea de la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de m Et independiente de HGF y la expresión de c-MET utilizando microARN
6- 1. Análisis de la inhibición de IGSF1 y MET por miR-34a y miR-34c que inhiben simultáneamente la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de c-MET
Para analizar el grado de inhibición por miR-34a y miR-34c que inhiben simultáneamente la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de MET, los presentes inventores transfectaron la línea celular humana 293 con miR-34a o miR-34c usando IGSF1 de tipo silvestre, MET de tipo silvestre y plásmidos con luciferasa que contenían la 3'UTR mutada de los mismos.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 6A, miR-34a y miR-34c mostraron baja actividad luciferasa en MET de tipo silvestre. Es decir, la actividad luciferasa de IGSF1 y MET por miR-34a y miR-34c se inhibió solamente en el tipo silvestre. Se encontró que miR-34a y miR-34c se unían simultáneamente a la región 3'UTR de los genes MET e IGSF1 e inhibían simultáneamente la expresión de ambos genes.
6-2. Cambios en la expresión de IGSF1 y c-MET por miR-34a y miR-34c que inhiben simultáneamente la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de c-MET
Para analizar el grado de cambio en IGSF1 y MET por miR-34a y miR-34c que inhiben simultáneamente la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de MET, los presentes inventores transfectaron líneas celulares humanas de cáncer de estómago MKN45 y SNU638 con miR-34a o miR-34c y después determinaron la expresión de MET y la expresión de IGSF1 mediante PCR en tiempo real. Como resultado, como se muestra en el panel superior de la FIG. 6B, se observó que la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de MET disminuían por miR-34a o miR-34c en la línea celular SNU638.
Por otra parte, como se muestra en el panel inferior de la FIG. 6B, como resultado del análisis de la expresión de MET e IGSF1 después de transfectar miR-34a o miR-34c en las líneas celulares humanas de cáncer de estómago MKN45 y SNU638, se observó que la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de c-MET se inhibían por miR-34a o miR-34c.
6-3. Análisis del crecimiento celular por miR-34a y miR-34c que inhiben simultáneamente la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de c-MET
Para analizar el crecimiento celular por miR-34a y miR-34c que inhiben simultáneamente la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de MET, los presentes inventores transfectaron la línea celular humana de cáncer de estómago SNU638 con miR-34a o miR-34c y después determinaron el crecimiento de células cancerosas.
Como resultado, como se muestra en el panel superior de la FIG. 6C, se observó que el crecimiento de células cancerosas se inhibía significativamente por miR-34a o miR-34c en comparación con el grupo de control.
Por otra parte, como se muestra en el panel inferior de la FIG. 6C, se encontró que la transfección de la línea celular humana de cáncer de estómago con miR-34a o miR-34c disminuía la expresión de la vía de señalización correspondiente.
6-4. Análisis de la inhibición de la invasión y migración celular por miR-34a y miR-34c que inhiben simultáneamente la expresión de IGSF1 como marcador para la inducción de la fosforilación de MET independiente de HGF y la expresión de c-MET
Como se muestra en el panel superior de la FIG. 6D, los presentes inventores encontraron que la transfección de las líneas celulares de cáncer de estómago SNU638 y MKN45 con mir-34a o mir-34c inhibía la migración celular.
Por otra parte, como se muestra en el panel central de la FIG. 6D, se encontró que la transfección de la línea celular de cáncer de estómago con mir-34a o mir-34c inhibía la invasión de células en aproximadamente un 50 %.
Asimismo, como se muestra en el panel inferior de la FIG. 6D, la transfección de la línea celular de cáncer de estómago SNU638 con mir-34a o mir-34c inhibió la migración de células y disminuyó la expresión de MMP9.
6-5. Recuperación de la inhibición de IGSF1 y MET por mir-34a y mir-34c usando antagomir
Como se muestra en el panel superior de la FIG. 6E, los presentes inventores encontraron que la transfección de la línea celular de cáncer de estómago SNU638 con anti-mir-34a o anti-mir-34c recuperaba la expresión de MET e IGSF1 que se inhibía por mir-34a o mir-34c a nivel de ARN (izquierda) y a nivel de proteína (derecha).
Por otra parte, como se muestra en el panel inferior de la FIG. 6E, se encontró que la transfección de las líneas celulares de cáncer de pulmón HCC827 y H1944 con mir-34a o mir-34c disminuía la expresión de pMET e IGSF1 y recuperaba la expresión de proteínas que se inhibía por anti-mir-34a y anti-mir-34c.
Al mismo tiempo, como se muestra en el panel superior de la FIG. 6F, el crecimiento celular recuperado por anti-mir-34a o anti-mir-34c en las líneas celulares de cáncer de estómago SNU638 y MKN45 se comparó con los resultados de mir-34a y mir-34c.
Adicionalmente, como se muestra en el panel inferior de la FIG. 6F, la recuperación del crecimiento celular se encontró a partir del mismo experimento en la línea celular de cáncer de pulmón.

Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para su uso en el tratamiento de cáncer de estómago o de pulmón en donde la composición comprende:
(a) un agente para la inhibición de la expresión del gen del miembro 1 de la superfamilia de inmunoglobulinas (IGSF1) (NM_001555.2) o de la expresión o actividad de su proteína; y
b) un agente para la inhibición de la expresión del gen del factor de transición mesénquima-epitelio (MET) (NM_001127500.1) o de la expresión o actividad de su proteína como principios activos, en donde los agentes se seleccionan del grupo que consiste en: ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN en horquilla pequeño (ARNhp), microARN (miARN), ácidos peptidonucleicos (APN), oligonucleótidos antisentido, anticuerpos y aptámeros.
2. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los agentes son ARN de interferencia pequeño (ARNip) o ARN en horquilla pequeño (ARNhp).
3. Una composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el ARN de interferencia pequeño (ARNip) es ARNip de IGSF1 que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3, ARNip de IGSF1 que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4 o ARNip de MET que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, y el ARN en horquilla pequeño (ARNhp) es ARNhp de IGSF1 que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6 o ARNhp de MET que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7.
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