ES2843973T3

ES2843973T3 - Composiciones y métodos para inducir cambios conformacionales en cereblon y otras ubiquitina ligasas E3

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Publication number: ES2843973T3
Application number: ES15811480T
Authority: ES
Inventors: Philip Paul Chamberlain; Brian Cathers; Antonia Lopez-Girona
Original assignee: Celgene Corp
Current assignee: Celgene Corp
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2021-07-21
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: US10668057B2; US11419861B2; JP2017528690A; US20150374678A1; EP3160486A4; US10092555B2; WO2015200795A1; EP3160486A1; EP3827836A1; US20210000813A1; US20190030019A1; JP6640126B2; EP3160486B1

Abstract

Un método para identificar un compuesto de ensayo que induce un cambio conformacional en cereblon (CRBN) o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN, que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN; y en donde dicho cambio conformacional o alteración tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN; tiene un efecto en E377 de CRBN; o tiene un efecto en V388 de CRBN.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para inducir cambios conformacionales en cereblon y otras ubiquitina ligasas E3

1. Campo

En la presente memoria se describen composiciones, métodos terapéuticos, métodos de cribado, métodos computacionales y biomarcadores basados en la elucidación de la interacción entre cereblon, sus sustratos y determinados compuestos o agentes, incluyendo moléculas pequeñas, péptidos, y proteínas.

2. Antecedentes

2.1 Cereblon

Existen al menos dos isoformas de la proteína cereblon (CRBN), que tienen una longitud de 442 y 441 aminoácidos, respectivamente, y el CRBN está conservado de plantas a seres humanos. En los seres humanos, el gen de CRBN se ha identificado como un gen candidato de un retraso mental no sindrómico autosómico recesivo (ARNSMR). Véase, Higgins, J.J. etal., Neurology, 2004, 63:1927-1931.

El CRBN se caracterizó inicialmente como una proteína nueva que contenía RGS que interaccionaba con una proteína del canal de potasio activado por calcio (SLO1) en el cerebro de rata, y posteriormente se mostró que interaccionaba con un canal de cloro activado por voltaje (CIC-2) en la retina con AMPK1 y DDB1. Véase Jo, S. et al., J. Neurochem, 2005, 94:1212-1224; Hohberger B. et al., FEBS Lett, 2009, 583:633-637; Angers S. et al., Nature, 2006, 443:590-593. Originalmente, se identificó a DDB1 como una proteína de reparación por escisión de nucleótidos que se asocia con la proteína de unión al ADN dañado 2 (DDB2). Su actividad defectiva causa el defecto de reparación en los pacientes con el grupo de complementación E del xeroderma pigmentoso (XPE). DDB1 también parece funcionar como un componente de numerosos complejos distintos de DCX (DDB1 -CUL4-caja-X) ubiquitina-proteína ligasa E3 que median la ubiquitinación y posterior degradación proteosómica de proteínas diana. El CRBN también se ha identificado como una diana para el desarrollo de agentes terapéuticos para enfermedades de la corteza cerebral. Véase WO 2010/137547 A1.

El CRBN se ha identificado recientemente como una diana molecular clave que se une a talidomida para causar defectos congénitos. Véase Ito, T. et al., Science, 2010, 327:1345-1350. Se encontró que DDB1 interaccionaba con CRBN y, así, estaba indirectamente asociado con la talidomida. Además, la talidomida era capaz de inhibir la autoubiquitinación de CRBN in vitro, sugiriendo que la talidomida es un inhibidor de la ubiquitina-ligasa E3. Id. Importantemente, esta actividad se inhibió por la talidomida en células de tipo salvaje, pero no en células con sitios de unión de CRBN mutados que previenen la unión de la talidomida. Id. El sitio de unión de la talidomida se mapeó a una región de 104 aminoácidos C-terminal altamente conservada en el CRBN. Id. Las mutaciones puntuales individuales en CRBN, Y384A y W386A, eran ambas defectivas para la unión a la talidomida, teniendo el doble mutante puntual la menor actividad de unión a la talidomida. Id. Se confirmó un vínculo entre CRBN y el efecto teratogénico de la talidomida en modelos animales de pez cebra y embriones de pollo. Id.

Todavía debe establecerse si se requiere la unión a CRBN, el complejo de CRBN ubiquitina-ligasa E3, o uno o más sustratos de CRBN, para los efectos beneficiosos de la talidomida y otros fármacos. La comprensión de estas interacciones con la talidomida y otras dianas de fármacos permitirá la definición de los mecanismos moleculares de eficacia y/o toxicidad y puede dar lugar a fármacos con unos perfiles de eficacia y toxicidad mejorados.

2.2 Compuestos

Se han realizado varios estudios con el objetivo de proporcionar compuestos que puedan usarse de forma segura y efectiva para tratar enfermedades asociadas con la producción anormal de TNF-a. Véanse, p. ej., Marriott, J.B., et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2001, 1(4): 1-8; G.W. Muller, et al., J Med Chem., 1996, 39(17): 3238-3240; y G.W. Muller, et al., Bioorg & Med Chem Lett., 1998, 8: 2669-2674. Algunos estudios se han centrado en un grupo de compuestos seleccionados por su capacidad de inhibir potentemente la producción de TNF-a por PBMC estimuladas por LPS. L.G. Corral, et al., Ann. Rheum. Dis., 1999, 58:(Supl I) 1107-1113. Estos compuestos muestran no solo una inhibición potente de TNF-a sino también una inhibición importante de la producción de IL1B e IL12 por monocitos inducida por LPS. La IL6 inducida por LPS también es inhibida por dichos compuestos, aunque parcialmente. Estos compuestos son estimuladores potentes de IL-10 inducida por LPS. Id.

Los compuestos para los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen, pero no están limitados a, las 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) ftalimidas sustituidas y 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindoles sustituidos descritos en las Patentes de EE. UU. No. 6.281.230 y 6.316.471, ambas de G.W. Muller, et al. Otros compuestos específicos adicionales descritos en la presente memoria pertenecen a una clase de isoindol-imidas descrita en las Patentes de EE. UU. No. 6.395.754, 6.555.554, 7.091.353, Publicación de EE. UU. No. 2004/0029832, y Publicación Internacional No. WO 98/54170.

La talidomida, lenalidomida y pomalidomida han mostrado respuestas notables en pacientes con mieloma múltiple, linfoma y otras enfermedades hematológicas tales como síndrome mielodisplásico. Véase Galustian C, et al., Expert Opin Pharmacother., 2009, 10:125-133. Estos fármacos presentan un amplio espectro de actividad, incluyendo propiedades antiangiogénicas, modulación de citoquinas proinflamatorias, coestimulación de células T, toxicidad incrementada de células NK, efectos antitumorales directos y modulación de la diferenciación de las células madre.

Por ejemplo, la talidomida y la lenalidomida han surgido como opciones importantes para el tratamiento del mieloma múltiple en pacientes recién diagnosticados, en pacientes con enfermedad avanzada en los que no ha tenido éxito la quimioterapia o el trasplante, y en pacientes con mieloma múltiple recidivante o refractario. La lenalidomida en combinación con dexametasona ha sido aprobada para el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple que han recibido al menos una terapia previa. La pomalidomida también puede administrarse en combinación con dexametasona. La Publicación de Patente de EE. UU. No. 2004/0029832 A1 describe el tratamiento del mieloma múltiple.

Otro compuesto descrito en la presente memoria es 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (“Compuesto A”), que tiene la siguiente estructura:

o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo.

El Compuesto A puede prepararse como se describe en la Pat. de EE. UU. No. 7.635.700. El compuesto también puede sintetizarse según otros métodos evidentes para los expertos en la técnica sobre la base de la enseñanza de la presente memoria. En determinadas realizaciones, el Compuesto A está en una forma cristalina descrita en US2012232100. En algunas realizaciones, la sal hidrocloruro del Compuesto A se usa en los métodos proporcionados en la presente memoria. Los métodos para tratar, prevenir y/o gestionar los cánceres y otras enfermedades usando el Compuesto A se describen en US2012230983.

Otros compuestos se describen en la Sección 5.8 de la presente memoria.

La comprensión de las interacciones de CRBN, el complejo de CRBN ubiquitina-ligasa E3, o uno o más sustratos de CRBN con talidomida, lenalidomida, pomalidomida y otras dianas de fármaco permitirán la definición de los mecanismos moleculares de eficacia y/o toxicidad y pueden dar lugar a fármacos con perfiles de eficacia y toxicidad mejorados.

WO 2014/004990 A2 se refiere a métodos para determinar la eficacia de compuestos inmunomoduladores, a métodos para usar proteínas asociadas a cereblon como biomarcadores para la sensibilidad clínica al cáncer y enfermedades inflamatorias, y a la respuesta de los pacientes a los fármacos.

Ocio etal. (2013, Leukemia., vol. 28, no.3, p. 525 a 542) informa de agentes, combinación de agentes, o mecanismos de terapia dirigida para el tratamiento del mieloma múltiple, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-CD38, inhibidor de la proteína del huso quinesina Arry-520 y un anticuerpo monoclonal anti-CSI con lenalidomida y dexametasona.

WO 2004/004652 A2 se refiere a la identificación, caracterización y estructura tridimensional de un sitio de unión a ligando de la proteína del huso quinesina (KSP).

Sadowski et al. (1993, Chemical reviews, American Chemical Society, vol. 93, p. 2567 a 2561) describe las bases de los métodos que implican coordenadas atómicas tridimensionales.

3. Resumen

Hemos descubierto que CRBN tiene un potencial pluripotente como una diana de fármacos para el tratamiento de diversas enfermedades. Creemos que somos los primeros en informar y entender que el cereblon puede inducirse para experimentar cambios conformacionales mediante el uso de determinadas moléculas pequeñas u otros agentes que denominaremos “agentes modificadores de cereblon” (CMA). El uso del agente apropiado da lugar a un cambio conformacional distintivo u otra alteración en las propiedades de la superficie de CRBN, y a una respuesta fenotípica resultante distintiva. El cereblon no es simplemente una proteína unidimensional o monotípica que interacciona con un único sustrato. En lugar de esto, sin estar limitado por teoría, el cambio conformacional o respuesta fenotípica del cereblon o su ruta depende del tipo celular y, lo más importantemente, del CMA usado para interaccionar con el cereblon o su ruta.

Como tal, en la presente memoria describimos una variedad de distintos cambios conformacionales, alteraciones de las propiedades de la superficie, respuestas fenotípicas y CMA. También describimos métodos de tratamiento, composiciones, cribados de fármacos y métodos computacionales que explotan estos descubrimientos.

También describimos el uso de agentes conocidos como CMA para nuevos métodos de tratamiento. En otro ejemplo, describimos el uso de nuevos CMA o clases de CMA sobre la base del cambio conformacional, alteración en las propiedades de la superficie, o respuesta fenotípica. Debe indicarse que estos descubrimientos permiten el uso de una plétora de métodos para tratar enfermedades asociadas con la ruta del cereblon. Así, en la presente memoria también se describen agentes conocidos o nuevos como CMA para su uso en métodos para tratar enfermedades.

La presente invención proporciona un método para identificar un compuesto de ensayo que induce un cambio conformacional en el cereblon (CRBN) o que altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN, que comprende

a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas;

(b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y

(c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas;

en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN; y

en donde dicho cambio conformacional o alteración tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN; tiene un efecto en E377 de CRBN; o tiene un efecto en V388 de CRBN.

En una realización, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a un agente modificador (CMA) de CRBN del CRBN, o en una región adyacente del mismo.

En una realización, dicho primer conjunto de coordenadas atómicas y/o dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas define un dominio de unión a CMA.

En una realización, la diferencia en las coordenadas atómicas se determina evaluando diferencias en las distancias atómicas.

En una realización, el compuesto de ensayo tiene una actividad biológica específica aguas abajo y en donde la diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de que el compuesto de ensayo tiene la actividad biológica específica aguas abajo.

En una realización, el método comprende además ensayar la actividad biológica específica aguas abajo.

En una realización, el compuesto de ensayo tiene una eficacia terapéutica específica y en donde la diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de que el compuesto de ensayo tiene la eficacia terapéutica específica.

En una realización, el CRBN se une además a la proteína de unión al ADN dañado 2 (DDB1), Culina-4 (Cul-4), proteína de cremallera de leucina homeótica ROC1 (Roc1), o cualquier combinación de las mismas.

En una realización, el CRBN se une además a DDB1.

En una realización, el CRBN es CRBN humano o CRBN murino.

En el contexto de la presente invención, la estructura tridimensional se determina o evalúa por cristalografía de rayos x. La ubiquitina ligasa E3 es CRBN.

En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína.

En determinadas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto.

En la presente memoria también se describe un método para identificar un compuesto de ensayo que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN. En determinados ejemplos, el método comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN. En algunas realizaciones, la primera estructura tridimensional es de un CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (referido también algunas veces como un “CRBN no unido” en la presente memoria, y que no se pretende que excluya que el CRBN está unido a otras proteínas, p. ej., DDB1). En algunas realizaciones, el CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (o CRBN no unido) tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas;

en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de un CRBN no unido, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En algunas realizaciones, la primera estructura de cristal del CRBN no unido tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de un CRBN no unido; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura de cristal de CRBN es una estructura de cristal de CRBN de ratón. En algunas realizaciones, la estructura de cristal de CRBN es una estructura de cristal de CRBN de ratón que está unido a un compuesto de referencia. En otras realizaciones, la estructura de cristal de CRBN es una estructura de cristal de CRBN de ratón que no está unido a un compuesto de referencia. En una realización, la estructura de cristal de CRBN de ratón que no está unido a un compuesto de referencia tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En determinadas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura de cristal de CRBN es una estructura de cristal de CRBN humano. En algunas realizaciones, la estructura de cristal de CRBN es una estructura de cristal de CRBN humano que está unido a un compuesto de referencia. En otras realizaciones, la estructura de cristal de CRBN es una estructura de cristal de CRBN humano que no está unido a un compuesto de referencia. En determinadas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1. En otras realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, el bolsillo de unión a CMA de CRBN es un bolsillo de unión a IMiD®.

En un tercer aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para identificar un compuesto de ensayo que tiene una actividad biológica específica aguas abajo que comprende: (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN y que tiene la actividad biológica específica aguas abajo; y en donde dicho cambio conformacional o alteración tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN; tiene un efecto en E377 de CRBN; o tiene un efecto en V388 de CRBN. En algunas realizaciones, la primera estructura de cristal es de un CRBN que no está unido a un compuesto de referencia. En una realización, la estructura de cristal de CRBN de ratón que no está unido a un compuesto de referencia tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En algunas realizaciones, el primer conjunto de coordenadas atómicas y/o dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas define un dominio de unión a CMA. En determinadas realizaciones, la diferencia en las coordenadas atómicas se determina evaluando diferencias en las distancias atómicas. En algunas realizaciones, el método comprende además ensayar la actividad biológica específica. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunas realizaciones, el compuesto induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En determinados ejemplos, el método comprende además administrar dicho compuesto a un paciente, en donde dicha actividad biológica se modula en dicho paciente. En determinaos ejemplos, el paciente tiene una enfermedad, y en donde uno o más síntomas de dicha enfermedad se alivian después de dicha administración.

En la presente memoria también se describe un método para identificar un compuesto de ensayo que tiene una actividad biológica específica aguas abajo que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que tiene la actividad biológica específica aguas abajo. En algunas realizaciones, la primera estructura tridimensional es de un CRBN que no está unido a un compuesto de referencia. En una realización, la estructura de cristal de CRBN de ratón que no está unido a un compuesto de referencia tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otro ejemplo, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, la estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1.

En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, el CRBN es un CRBN de ratón. En determinadas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, el CRBN es un CRBN humano. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1. En otras realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, el bolsillo de unión a CMA de CRBN es un bolsillo de unión a IMiD®.

En un quinto aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para identificar un compuesto de ensayo que tiene una eficacia terapéutica específica que comprende: (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN y que tiene la eficacia terapéutica específica; y en donde dicho cambio conformacional o alteración tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN; tiene un efecto en E377 de CRBN; o tiene un efecto en V388 de CRBN. En algunas realizaciones, la primera estructura de cristal es de un CRBN que no está unido a un compuesto de referencia. En una realización, la primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En algunas realizaciones, el primer conjunto de coordenadas atómicas y/o dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas define un dominio de unión a CMA. En determinadas realizaciones, la diferencia en las coordenadas atómicas se determina evaluando diferencias en las distancias atómicas. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En determinados ejemplos, el método comprende además administrar dicho compuesto a un paciente que tiene una enfermedad, trastorno o afección, en donde uno o más síntomas de dicha enfermedad, trastorno o afección se alivia después de dicha administración. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria también se describe un método para identificar un compuesto de ensayo que tiene una actividad biológica específica aguas abajo que comprende: (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que tiene la actividad biológica específica aguas abajo. En algunas realizaciones, la primera estructura tridimensional es de un CRBN que no está unido a un compuesto de referencia. En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria también se describe un método para diseñar un compuesto de ensayo sobre la base del ajuste en el bolsillo de unión a CMA del CRBN, que comprende: (a) generar, en un ordenador, características estructurales tridimensionales de un CRBN que tiene un cambio conformacional en el bolsillo de unión a CMA, (b) diseñar un compuesto de ensayo capaz de unirse selectivamente dicho bolsillo de unión a CMA, (c) sintetizar dicho compuesto de ensayo, (d) poner en contacto el CRBN con dicho compuesto de ensayo sintetizado, y (e) determinar si dicho compuesto de ensayo se une a dicho CRBN. En determinados ejemplos, el cambio conformacional ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunos ejemplos, el cambio conformacional es en relación con un CRBN que no está unido a un compuesto de referencia. En otros ejemplos, el cambio conformacional es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia.

En la presente memoria se describe un cristal de un complejo que comprende CRBN y un CMA, o un análogo del mismo. En la presente memoria también se proporciona un método para obtener el cristal, que comprende concentrar un complejo purificado del CRBN y el CMA, o análogo del mismo, y obtener el cristal. En determinadas realizaciones, hay un cristal que comprende CRBN. En algunos ejemplos, en la presente memoria se describe un cristal que consiste en CRBN. En determinadas realizaciones, hay un cristal de un complejo que comprende CRBN y DDB1. En algunas realizaciones, hay un cristal de un complejo que consiste en CRBN y DDB1. En determinadas realizaciones, hay un cristal de un complejo que comprende CRBN y un CMA, o un análogo del mismo. En algunas realizaciones, hay un cristal de un complejo que consiste en CRBN y un CMA o un análogo del mismo. En determinadas realizaciones, hay un cristal de un complejo que comprende CRBN, DDB1, y un CMA, o un análogo del mismo. En algunas realizaciones, hay un cristal de un complejo que consiste en CRBN, DDB1, y un CMA o un análogo del mismo. En la presente memoria también se proporcionan los métodos para obtener dichos cristales.

En determinadas realizaciones, el CRBN está unido a DDB1. En algunas realizaciones, el CRBN está unido a Cul4. En otras realizaciones, el CRBN está unido a Roc1. En algunas realizaciones, el CRBN está unido a DDB1 y Cul4. En otras realizaciones, el CRBN está unido a DDB1 y Roc1. En otras realizaciones más, el CRBN está unido a Cul4 y Roc1. En algunas realizaciones, el CRBN está unido a DDB1, Cul4 y Roc1. En determinadas realizaciones, el CRBN que está unido a DDB1, Cul4 y/o Roc1 es un complejo con DDB1, Cul4 y/o Roc1, respectivamente. También se contemplan los cristales que comprenden CRBN y DDB1, Cul4 y/o Roc1, así como los métodos para obtener dichos cristales.

En determinadas realizaciones, el CMA es talidomida. En otras realizaciones, el CMA es pomalidomida. En algunas realizaciones, el CMA es CC-220. En otras realizaciones, el CMA es 1-(3-cloro-4-metilfenil)-3-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1 -oxoisoindolin-5-il)metil)urea (CC-885). En determinadas realizaciones, el CMA es un análogo de talidomida. En otras realizaciones, el CMA es un análogo de pomalidomida. En algunas realizaciones, el CMA es un análogo de CC-220. En otras realizaciones, el CMA es un análogo de CC-885. En otras realizaciones, el CMA no es talidomida. En otras realizaciones, el CMA no es pomalidomida. En algunas realizaciones, el CMA no es CC-220. En otras realizaciones, el CMA no es CC-885. En otras realizaciones, el CMA no es un análogo de talidomida. En otras realizaciones, el CMA no es un análogo de pomalidomida. En algunas realizaciones, el CMA no es un análogo de CC-220. En otras realizaciones, el CMA no es un análogo de CC-885.

En la presente memoria también se describe un cristal de un complejo que comprende CRBN y un compuesto de ensayo, en donde dicho cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7. En una realización, el cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 3. En otra realización, el cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 4. En otras realizaciones, el cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 5. En otras realizaciones, el cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 6. En otras realizaciones, el complejo tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 7. En algunas realizaciones, el cristal comprende además DDB1, Cul4 y/o Roc1. En una realización específica, el complejo comprende además DDB1.

En la presente memoria también se describe un cristal de un complejo que comprende un CRBN y un compuesto de ensayo, en donde dicho cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x, en donde dicha estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas mostradas en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7. En una realización, el cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x, en donde dicha estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 3. En otra realización, el cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x, en donde dicha estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 4. En otra realización más, el cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x, en donde dicha estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 5. En otra realización más, el cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x, en donde dicha estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 6. En algunas realizaciones, el cristal comprende además DDB1, Cul4 y/o Roc1. En una realización específica, el cristal comprende además DDB1. En otra realización más, el cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x, en donde dicha estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 7. En algunas realizaciones, el complejo comprende además DDB1, Cul4 y/o Roc1. En una realización específica, el complejo comprende además DDB1.

En determinadas realizaciones de los métodos proporcionados en la presente memoria, un complejo que comprende CRBN y un compuesto de referencia tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x, que tiene las coordenadas atómicas mostradas en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7. En una realización, la estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 3. En otra realización, la estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 4. En otra realización más, la estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 5. En otra realización más, la estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 6. En otra realización más, la estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 7. En algunas realizaciones, el complejo comprende además DDB1, Cul4 y/o Roc1. En una realización específica, el complejo comprende además DDB1.

En la presente memoria también se describe un método para identificar un compuesto de ensayo que induce una actividad biológica específica, que comprende poner en contacto el compuesto de ensayo con CRBN, inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alterar de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN, y evaluar el cambio conformacional o alteración, en donde el cambio conformacional o alteración es indicativo de una actividad biológica específica. En algunas realizaciones, el método comprende además ensayar la actividad biológica específica. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN en relación con un CRBN que se pone en contacto con un compuesto de referencia. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN en relación con un CRBN unido a un compuesto de referencia. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN en relación con un CRBN que no se pone en contacto con un compuesto de referencia. En una realización, el CRBN que no se pone en contacto con un compuesto de referencia tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN en relación con un CRBN no unido. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN en relación con un CRBN que se pone en contacto con un compuesto de referencia. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN en relación con un CRBN unido a un compuesto de referencia. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN en relación con un CRBN que no se pone en contacto con un compuesto de referencia. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN en relación con un CRBN no unido. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En determinados ejemplos, el método comprende además administrar dicho compuesto a un paciente, en donde dicha actividad biológica se modula en dicho paciente. En determinados ejemplos, el paciente tiene una enfermedad, y en donde uno o más síntomas de dicha enfermedad se alivian después de dicha administración. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En algunas realizaciones, la primera estructura de cristal es de un CRBN que no está unido a un compuesto de referencia. En una realización, la primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otros ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria también se describe un método para identificar un compuesto de ensayo que tiene una utilidad terapéutica específica, que comprende poner en contacto el compuesto de ensayo con CRBN, inducir un cambio conformacional en CRBN o alterar de otra forma las propiedades de la superficie de CRBN, y evaluar el cambio conformacional o alteración, en donde un cambio conformacional o alteración es indicativo de la utilidad terapéutica específica. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN en relación con un CRBN que se pone en contacto con un compuesto de referencia. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN en relación con un CRBN unido a un compuesto de referencia. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN en relación con un CRBN que no se pone en contacto con un compuesto de referencia. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN en relación con un CRBN no unido. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN en relación con un CRBN que se pone en contacto con un compuesto de referencia. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN en relación con un CRBN unido a un compuesto de referencia. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN en relación con un CRBN que no se pone en contacto con un compuesto de referencia. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN en relación con un CRBN no unido. En una realización, la estructura del CRBN no unido tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En algunos ejemplos, el método comprende además administrar dicho compuesto a un paciente que tiene una enfermedad, en donde uno o más síntomas de dicha enfermedad se alivian después de dicha administración. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une a DDB1.

En la presente memoria también se describe un método para inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), que comprende poner en contacto el CRBN con un compuesto, en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una actividad biológica específica. En una realización, el compuesto induce un cambio conformacional en CRBN. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en el bolsillo de unión a CMA del CRBN. En una realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una realización, el CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En una determinada realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En otra realización, el compuesto induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En una realización específica, la alteración de las propiedades de una superficie de CRBN son en una región adyacente de la proteína. En una realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una determinada realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En algunas realizaciones, la actividad biológica es un efecto tumoricida. En otras realizaciones, la actividad biológica es un efecto en la apoptosis. En algunas realizaciones, la actividad biológica es antiproliferación. En otras realizaciones más, la actividad biológica es viabilidad de las PBMC. En algunas realizaciones, la actividad biológica es toxicidad. En determinadas realizaciones, la actividad biológica es degradación del sustrato. En una realización, la actividad biológica es degradación de Aiolos. En otras realizaciones, la actividad biológica es degradación de Ikaros. En otras realizaciones, la actividad biológica es un efecto mediado por inmunidad. En otra realización, la actividad biológica es inducción de IL-2. En algunas realizaciones, la actividad biológica es represión de IL-2. En otras realizaciones más, la actividad biológica es un efecto en la hemoglobina fetal (HbF). También se contempla cualquier combinación de una, dos, tres o más de las actividades biológicas mencionadas anteriormente. En determinadas realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías específicas de tipos celulares. En otras realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías específicas de tipos tisulares. En otras realizaciones más, la actividad biológica se basa en tumores sólidos o categorías de tumores sólidos. En algunas realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías de tumores no sólidos. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración en las propiedades de una superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En otros ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo); (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria también se describe un método para inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), que comprende poner en contacto el CRBN con un compuesto, en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una utilidad terapéutica específica. En una realización, el compuesto induce un cambio conformacional en CRBN. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en el bolsillo de unión a CMA del CRBN. En una realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una determinada realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En otra realización, el compuesto induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En una realización específica, la alteración de las propiedades de una superficie de CRBN es en una región adyacente de la proteína. En una realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una determinada realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En algunas realizaciones, el CRBN no unido o el CRBN antes de pnerse en contacto con el compuesto de ensayo tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En algunas realizaciones, la utilidad terapéutica se basa en tumores sólidos o categorías de tumores sólidos. En otras realizaciones, la utilidad terapéutica se basa en categorías de tumores no sólidos. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo), y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo); (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria también se describe un método para inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), que comprende poner en contacto el CRBN con un compuesto de ensayo, en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una especificidad por el sustrato diferente en comparación con la especificidad por el sustrato de un CRBN que se pone en contacto con un compuesto de referencia. En la presente memoria también se describe un método para inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), que comprende poner en contacto el CRBN con un compuesto de ensayo, en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una especificidad por el sustrato diferente en comparación con la especificidad por el sustrato de un CRBN no unido (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo). En una realización, el compuesto induce un cambio conformacional en CRBN. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en el bolsillo de unión a CMA del CRBN. En una realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una determinada realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En otra realización, el compuesto induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En una realización específica, la alteración de las propiedades de una superficie de CRBN es en una región adyacente de la proteína. En una realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una determinada realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En algunas realizaciones, el CRBN no unido o el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo), y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo); (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria también se describe un método para inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), que comprende poner en contacto el CRBN con un compuesto de ensayo. En una realización, el compuesto induce un cambio conformacional en CRBN. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en el bolsillo de unión a CMA del CRBN. En una realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una determinada realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En otra realización, el compuesto induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En una realización específica, la alteración de las propiedades de una superficie de CRBN es en una región adyacente de la proteína. En una realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una determinada realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En una realización, el CRBN no unido o el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo tiene una primera estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En algunas realizaciones, dicho cambio conformacional o alteración en CRBN comprende un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) que es diferente del cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) que se pone en contacto con un compuesto de referencia. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una actividad biológica diferente. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una utilidad terapéutica diferente. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una especificidad por el sustrato diferente. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo), y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo); (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria también se describe un método para inducir una actividad biológica en una célula que comprende CRBN, que comprende poner en contacto dicha célula con un compuesto de ensayo, en donde dicho compuesto induce un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) de dicho CRBN, y en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN es en comparación con un compuesto de referencia, y en donde el cambio conformacional o alteración da como resultado dicha actividad biológica. En la presente memoria también se describe un método para inducir una actividad biológica en una célula que comprende CRBN, que comprende poner en contacto dicha célula con un compuesto de ensayo, en donde dicho compuesto induce un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) de dicho CRBN, y en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN es en comparación con un CRBN no unido (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo), y en donde el cambio conformacional o alteración da como resultado dicha actividad biológica. En una realización, el compuesto induce un cambio conformacional en CRBN. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en el bolsillo de unión a CMA del CRBN. En una realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una determinada realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En una realización, el CRBN no unido o el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo tiene una primera estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En otra realización, el compuesto induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En una realización específica, la alteración de las propiedades de una superficie de CRBN es en una región adyacente de la proteína. En una realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una determinada realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En algunas realizaciones, la actividad biológica es un efecto tumoricida. En otras realizaciones, la actividad biológica es un efecto en la apoptosis. En algunas realizaciones, la actividad biológica es antiproliferación. En otras realizaciones más, la actividad biológica es viabilidad de las PBMC. En algunas realizaciones, la actividad biológica es toxicidad. En determinadas realizaciones, la actividad biológica es degradación de sustrato. En una realización, la actividad biológica es degradación de Aiolos. En otras realizaciones, la actividad biológica es degradación de Ikaros. En otras realizaciones, la actividad biológica es un efecto mediado por inmunidad. En otra realización, la actividad biológica es inducción de IL-2. En algunas realizaciones, la actividad biológica es represión de IL-2. En otras realizaciones más, la actividad biológica es un efecto en HbF. También se contempla cualquier combinación de una, dos, tres o más de las actividades biológicas mencionadas anteriormente. En determinadas realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías específicas de tipos celulares. En otras realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías específicas de tipos tisulares. En otras realizaciones más, la actividad biológica se basa en tumores sólidos o categorías de tumores sólidos. En algunas realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías de tumores no sólidos. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo), y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo); (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En una realización, el CRBN no unido o el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo tiene una primera estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria también se describe un método para tratar o aliviar uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno mediado por CRBN en un paciente, que comprende administrar un compuesto de ensayo al sujeto, en donde dicho compuesto de ensayo induce un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), y en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN es en comparación con un compuesto de referencia, y en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado el tratamiento o alivio de uno o más síntomas de dicha enfermedad o trastorno. En la presente memoria también se describe un método para tratar o aliviar uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno mediado por CRBN en un paciente, que comprende administrar un compuesto de ensayo al sujeto, en donde dicho compuesto de ensayo induce un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), y en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN es en comparación con un CRBN no unido (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo), y en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado el tratamiento o alivio de uno o más síntomas de dicha enfermedad o trastorno. En una realización, el compuesto induce un cambio conformacional en CRBN. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en el bolsillo de unión a CMA del CRBN. En una realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una determinada realización, el cambio conformacional en CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En una realización, el CRBN no unido o el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo tiene una primera estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En otra realización, el compuesto induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En una realización específica, la alteración de las propiedades de una superficie de CRBN es en una región adyacente de la proteína. En una realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN que está unido a un compuesto de referencia. En una determinada realización, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con un CRBN no unido. En una realización específica, la alteración de las propiedades de la superficie de CRBN es en relación con el CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo. En determinadas realizaciones, la enfermedad o trastorno es un cáncer o tumor. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo), y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo); (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En una realización, la primera estructura de cristal de CRBN tiene una primera estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1. En algunos ejemplos, en la presente memoria se describe el compuesto de ensayo descrito anteriormente para su uso en a método para tratar o aliviar uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno mediado por CRBN en un paciente.

En la presente memoria también se describe una composición que comprende un CRBN y un compuesto de ensayo, en donde dicho CRBN tiene un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) en comparación con un compuesto de referencia. En la presente memoria también se describe una composición que comprende un CRBN y un compuesto de ensayo, en donde dicho CRBN tiene un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) en comparación con un CRBN no unido (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo). En una realización, el CRBN tiene un cambio conformacional. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en el bolsillo de unión a CMA del CRBN. En otra realización, el CRBN tiene una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En una realización específica, la alteración de las propiedades de una superficie de CRBN es en una región adyacente de la proteína. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo), y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo); (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN como se determina por difracción de rayos x tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria también se describe un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) después de ponerse en contacto con dicho CRBN, en comparación con el cambio conformacional o alteración en comparación con un compuesto de referencia. En la presente memoria también se describe un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) después de ponerse en contacto con dicho CRBN, en comparación con el cambio conformacional o alteración en comparación con un CRBN no unido (p. ej., antes de ponerse en contacto con el compuesto). En una realización, el CRBN no unido tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En una realización, el compuesto induce un cambio conformacional en CRBN. En una realización específica, el cambio conformacional en CRBN es en el bolsillo de unión a CMA del CRBN. En otra realización, el compuesto induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En una realización específica, la alteración de las propiedades de una superficie de CRBN es en una región adyacente de la proteína. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una actividad biológica diferente. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una utilidad terapéutica diferente. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una especificidad por el sustrato diferente. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo), y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo); (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8 como se determina por difracción de rayos x. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria también se describe un complejo que comprende un CRBN y compuesto de ensayo, en donde dicho CRBN tiene un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) en comparación con un cambio conformacional de dicho CRBN en contacto con un compuesto de referencia. En la presente memoria también se describe un complejo que comprende un CRBN y compuesto de ensayo, en donde dicho CRBN tiene un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) en comparación con un cambio conformacional de un CRBN no unido (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo). En una realización, el CRBN tiene un cambio conformacional. En una realización específica, el CRBN tiene un cambio conformacional en el bolsillo de unión a CMA del CRBN. En otra realización, el CRBN tiene una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En una realización específica, la alteración de las propiedades de una superficie de CRBN es en una región adyacente de la proteína. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a c Ma tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la presente invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo), y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo); (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria también se describe un método para identificar un sustrato ubiquitinado por un complejo de ubiquitinación ligasa E3 que comprende CRBN, comprendiendo dicho método: (i) poner en contacto dicho CRBN con un compuesto que induce un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado la ubiquitinación de dicho sustrato, (ii) ensayar la ubiquitinación de uno o más sustratos, e (iii) identificar dichos uno o más sustratos ubiquitinados; en donde dicho sustrato no está ubiquitinado por dicho complejo de ubiquitinación ligasa E3 en ausencia de dicho compuesto. También se describe un sustrato identificado por este método. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración es en comparación con el bolsillo de unión a CMA cuando el CRBN se pone en contacto con un compuesto de referencia. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración es en comparación con el bolsillo de unión a CMA de un CRBN no unido (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto que induce un cambio conformacional o alteración de las propiedades de la superficie de CRBN). En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otro ejemplo, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo), y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia (p. ej., un CRBN antes de ponerse en contacto con el compuesto de ensayo); (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En una realización, la primera estructura tridimensional de CRBN que no está unido a un compuesto de referencia tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el CRBN se une además a DDB1.

En la presente memoria se describe un método para reclutar un sustrato para la ubiquitinación por un complejo de ubiquitinación ligasa E3 que comprende CRBN, comprendido dicho método poner en contacto dicho CRBN con un compuesto que induce un cambio conformacional del CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado el reclutamiento y ubiquitinación de dicho sustrato; y en donde dicho sustrato no está ubiquitinado por dicho complejo de ubiquitinación ligasa E3 en ausencia de dicho compuesto. En algunas realizaciones, la inducción del cambio conformacional o alteración es en comparación con el CRBN (p. ej., el bolsillo de unión a CMA de CRBN) o superficie del CRBN cuando el CRBN se pone en contacto con un compuesto de referencia. En otras realizaciones, la inducción del cambio conformacional o alteración es en comparación con el CRBN (p. ej., el bolsillo de unión a CMA de CRBN) o superficie del CRBN cuando el CRBN no está unido (p. ej., antes de ponerse en contacto con el compuesto). En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, el cristal comprende una proteína CRBN de longitud completa. En otras realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, el cristal comprende una porción de la proteína CRBN. En determinadas realizaciones, la porción de la proteína CRBN es un dominio de unión a CMA. Esto es, en determinadas realizaciones proporcionadas en la presente memoria, los métodos que comprenden obtener un cristal que comprende CRBN y un compuesto, incluyen, sin limitación, obtener un cristal que comprende un dominio de unión a CMA (es decir, no el CRBN de longitud completa) y un compuesto. En algunas realizaciones, el cristal comprende el dominio de unión a talidomida (TBD) (un tipo de dominio de unión a CMA) del CRBN humano (aminoácidos 319-427). En otras realizaciones, el cristal comprende el TBD de CRBN de ratón (aminoácidos 322-430). También se contemplan los cristales que comprenden otros dominios de unión a CMA.

En otras realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional comprende una proteína CRBN de longitud completa. En otras realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional comprende una porción de la proteína CRBN. En determinadas realizaciones, la porción de la proteína CRBN es un dominio de unión a CMA. Esto es, en determinadas realizaciones proporcionadas en la presente memoria, los métodos que comprenden obtener una estructura tridimensional de un complejo que comprende CRBN y un compuesto, incluyen, sin limitación, obtener una estructura tridimensional de un complejo que comprende un dominio de unión a CMA (es decir, no el CRBN de longitud completa) y un compuesto. En algunas realizaciones, el cristal comprende el TBD de CRBN humano (aminoácidos 319-427). En otras realizaciones, el cristal comprende el TBD de CRBN de ratón (aminoácidos 322-430). También se contemplan las estructuras tridimensionales que comprenden otros dominios de unión a CMA.

En otro lugar de la presente memoria se proporcionan métodos ejemplares para obtener la estructura de cristal, p. ej., de un CRBN (o un dominio de unión a CMA del mismo), bien solo o formando un complejo con un CMA.

En determinadas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, las coordenadas atómicas son como se muestran en la Tabla 3. En otras realizaciones de las diversas composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria, las coordenadas atómicas son como se muestran en la Tabla 4. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, las coordenadas atómicas son como se muestran en la Tabla 5. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, las coordenadas atómicas son como se muestran en la Tabla 6. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, las coordenadas atómicas son como se muestran en la Tabla 7.

En determinadas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional se ve reflejada por las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 3. En otras realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional se ve reflejada por las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 4. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional se ve reflejada por las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 5. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional se ve reflejada por las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 6. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional se ve reflejada por las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 7. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional se ve reflejada por las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 8.

En determinadas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional está en una cualquiera de las figuras, incluyendo, por ejemplo, las FIG. 12-18 o 20. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional está en la FIG. 12. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional está en la FIG. 13. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional está en la FIG. 14. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional está en la FIG. 15. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional está en la FIG. 16. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional está en la FIG. 17. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional está en la FIG. 18. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la estructura tridimensional está en la FIG. 20.

4. Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 representa las diferencias en la homeostasis de proteínas después del tratamiento con un CMA debido a la ubiquitinación y degradación alteradas de proteínas.

La FIG. 2 representa cristales de CRBN formando un complejo con un Apo (control negativo), talidomida, pomalidomida, CC-220, o CC-885. Las proyecciones idénticas de las superficies de unión a CMA de CRBN muestran cambios conformacionales en la proteína.

Las FIG. 3A-B representan la estructura de cristal de CC-220 en CRBN, en el que el fármaco puede actuar como un "pegamento molecular" o puente con un sustrato, tal como una proteína asociada a CRBN. (A) CRBN de ratón no unido antes de la unión de CC-220, y (B) CRBN de ratón formando un complejo con CC- 220.

La FIG. 4 representa un complejo de CRBN y CC-220 o talidomida, y se observa una rotación de 50° del anillo "ftalimida” en CC-220 en relación con talidomida o pomalidomida.

Las FIG. 5A-B representan que la lenalidomida compite con el Compuesto A y 1-(3-cloro-4-metilfenil)-3-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-5-il)metil)urea (CC-885) por CRBN. (A) y (B) El cotratamiento de lenalidomida bien con el Compuesto A o CC-885 bloquea los efectos antiproliferativos de cada fármaco a través de la competición para la unión al complejo CRBN en DLBCL tanto ABC como GCB. El cocultivo de Lenalidomida bien con CC-122 o CC-885 disminuye la actividad de estos compuestos ya que están dirigidos al mismo bolsillo de unión con afinidad relativa.

La FIG. 6 muestra que CC-885 indujo una apoptosis temprana en la línea celular de mieloma múltiple (MM) H929.

La FIG. 7 muestra que CC-885 es potente a lo largo de un panel de líneas de tumores sólidos.

La FIG. 8 muestra que CC-885 se une a extractos de células de MM con proteína CRBN.

La FIG. 9 muestra que CRBN se requiere para la actividad antiproliferativa de CC-885 en células de mieloma.

La FIG. 10 muestra que CRBN se requiere para la actividad antiproliferativa de CC-885 en células de mieloma.

La FIG. 11 muestra que CRBN se requiere tanto para la inhibición como para la actividad proapoptótica de CC-885 en las células de cáncer de mama MDA-MB-213.

La FIG. 12 muestra la estructura de cereblon humano en complejo con DDB1 humano. La lenalidomida se une al dominio de unión a talidomida (TBD; algunas veces también referido como dominio de unión a IMID® (IBD) en la presente memoria) (un tipo de dominio de unión a CMA) en la cara opuesta al resto de unión a DDB1. El dominio semejante a Cereblon Lon (LLD) se muestra en amarillo. El TBD se muestra en azul con la región delecionada en un polimorfismo humano mostrada en rojo. El DDB1 se muestra en verde con una superficie gris. Los dominios de DDB1 con hélices de láminas beta están marcados con BPA, BPB y BPC. La lenalidomida se muestra como palos amarillos, y el ion cinc como una esfera gris.

La FIG. 13 muestra la superposición estructural de cereblon con la proteasa lon de Bacillus subtilis (rojo, código PDB 3M65. El dominio semejante a cereblon lon (LLD) se muestra en amarillo y el TBD se muestra en azul. El resto de unión a DDB1 se inserta en el LLD, mientras el TBD no presenta similitud con la proteasa lon y está presente en el extremo C.

La FIG. 14 muestra la superposición estructural de cereblon:DDB1 (amarillo y verde, respectivamente) con DDB2:DDB1 (DDB2 mostrado en azul, DDB1 omitido). La unión a DDB1 está mediada típicamente por un resto de hélice-giro-hélice tal como las hélices c y d, que interaccionan con el dominio de hélice de láminas beta C de DDB1 (BPC). El CRBN realiza interacciones con BPC de DDB1, pero también hace que la hélice e interaccione con el dominio de hélice de láminas beta A de DDB1 (BDA).

La FIG. 15 muestra el TBD de cereblon humano. El dominio de unión a IMiD® se muestra en azul, la lenalidomida se muestra en palos amarillos, el dominio semejante a Lon se muestra en el fondo en amarillo. El bolsillo de unión a IMiD® está compuesto por 3 residuos de triptófano: W380, W386 y W400. Se muestran tres enlaces de hidrógeno entre el TBD y la lenalidomida como una línea punteada respecto al esqueleto de la proteína en H378 y W380 y respecto a la cadena lateral de H378. El sitio de unión a cinc se muestra como una esfera gris, y está aproximadamente a 18 Á de la lenalidomida. La región de lámina beta que varía en las demás estructuras está marcada con una "p".

La FIG. 16 muestra el TBD murino formando un complejo con talidomida.

La FIG. 17 muestra el TBD murino formando un complejo con pomalidomida.

La FIG. 18 muestra la superposición estructural de TBD de cereblon (azul) con metionina sulfóxido reductasa (verde) y RIG-I (magenta).

La FIG. 19 muestra las diferencias en el alineamiento de secuencias mapeadas en la superficie del dominio de unión a IMiD® de cereblon. Los residuos conservados en relación con la proteína humana se muestran en rojo, los cambios conservativos se muestran en naranja, los cambios no conservativos se muestran en blanco. El bolsillo de unión a IMiD® se indica por una flecha azul. Los residuos de triptófano implicados directamente en la unión a IMiD® se muestran en negrita en el alineamiento de secuencias. El bolsillo de unión a IMiD® demuestra una conservación extremadamente alta a lo largo de los reinos vegetal y animal.

La FIG. 20 muestra el TBD de cereblon murino que muestra los contactos de cristal formados entre los monómeros de proteína, conectados por puentes de moléculas de talidomida.

Las FIG. 21A-21C muestran un ensayo de unión de CRBN con enantiómeros de talidomida. (A) Ensayo de elución competitivo usando perlas con talidomida inmovilizada acopladas con talidomida racémica. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de lisis NP-40 al 0,5 % y las proteínas unidas se eluyeron con tampón de lavado que contenía S, R-talidomida 1 mM (S-Tal o R-Tal) o DMSO al 0,1 % durante el tiempo indicado. El eluato se analizó entonces por SDS-PAGE e inmunotransferencia (IB). (B) Igual que en A, pero se eluyó con una disolución de tampón que contenía las concentraciones indicadas de S o R-talidomida (S o R-Tal). (C) Se detectaron efectos inhibidores de enantiómeros de talidomida en la autoubiquitilación de FH-CRBN en presencia de MG132. Las células se trataron con DMSO o las concentraciones indicadas de S o R-talidomida durante 4 horas antes de su recogida.

La FIG. 22 muestra que los residuos de triptófano filogenéticamente conservados (W386 y W4000) confieren unión de CRBN a IMiD® y se requieren para la función de IMiD® in vivo. (A) Se ensayaron líneas celulares que reexpresaban CRBN de longitud completa de tipo salvaje. Los mutantes W386A o W400A se ensayaron para determinar su capacidad de unirse a compuestos IMiD®. El ensayo se repitió al menos tres veces. Se muestra una transferencia Western representativa de un experimento representativo. (B) Ensayo de proliferación celular de células DF15 (sensibles). DF15R (resistentes; CRBNnul°), CRBNWT, CRBNW386A; CRBN400 tratadas con una respuesta a la dosis de pomalidomida. Los ensayos se hicieron en triplicado y las barras de error representan s.d. Los datos para cada línea celular se normalizaron respecto al tratamiento con vehículo (DMSO). (C) Transferencias Western de efectores clave aguas abajo de la resistencia a IMiD®.

Las FIG. 23A-23B muestran los efectos de la mutación E377V en la actividad de CRBN in vivo. (A) Se ensayaron líneas celulares que reexpresaban RFP o CRBN de longitud completa de tipo salvaje o mutante E377V para determinar la capacidad de las proteínas CRBN de unirse a compuestos IMiD®. El ensayo se repitió al menos tres veces. Se muestra una transferencia Western representativa de un experimento representativo. (B) Ensayo de proliferación celular de células DF15 (sensibles), DF15R (resistentes; CRBNnult)), CRBNWT, CRBNE377V tratadas con una respuesta a la dosis de pomalidomida. Los ensayos se hicieron en triplicado y las barras de error representan s.d. Los datos para cada línea celular se normalizaron respecto al tratamiento con vehículo (DMSO). El inserto muestra transferencias Western de Aiolos y p-actina.

Las FIG. 24A-24D muestran CRBN en lisados de DF15. (A) Análisis por inmunotransferencia de CRBN en lisados de células DF15, DF15R, DF15R RFP (RFP ctrl), DF15R CRBNWT (CRBN wt), DF15R CRBNW386A y CRBNW400A. (B) Análisis de CRBN en líneas celulares DF15 y DF15R y derivadas de DF15R por inmunohistoquímica y microscopía confocal. Las imágenes se obtuvieron usando un microscopio confocal Nikon E800 a un aumento de 40x. La señal de CRBN se muestra en el citoplasma y núcleo de las células. La tinción con DAPI identifica el núcleo de las células (tinción más oscura). (C) Inmunotransferencia de la inmunoprecipitación con anti-FLAG de extractos de células usando proteínas CRBN etiquetadas con FLAG. (D) Inmunotransferencia de la unión de perlas de afinidad del análogo de talidomida a CRBN en extractos de células DF15, DF15R y DF15R CRBNWT. Descripción de los carriles en orden (izquierda a derecha): In = entrada de DF15 antes de la purificación de las perlas; V = extracto de DF15 control (preincubación con DMSO al 1 %); Len = extracto de DF15R preincubado con lenalidomida (30 pM); Pom = extracto de DF15R preincubado con pomalidomida (30 pM); In = entrada de DF15R CRBNWT antes de la purificación de las perlas; V = DF15R CRBNWT control (preincubación con DMSO al 1 %); Len = extracto de DF15R CRBNWT preincubado con lenalidomida (30 pM); Pom = extracto de DF15R CRBNWT preincubado con pomalidomida (30 pM). Se muestra la inmunotransferencia representativa de dos experimentos independientes con resultados similares.

Las FIG. 25A-25F muestran que las células con inactivación inducible de CRBN tenían una inducción de ARNsh dependiente de la dosis y del tiempo como se mide por un incremento en el porcentaje de células positivas para RFP. (A) Se transdujo una construcción de ARNsh inducible dirigida a CRBN o una construcción control en las líneas celulares de mieloma múltiple H929 y U266. La expresión de ARNsh inducible (marcada por turbo-RFP) se monitorizó por citometría de flujo durante un periodo de 1 a 9 días como se indica en los histogramas (Flecha superior). El ensayo de tinción con anexina V demostró que después de la inducción por tratamiento con doxiciclina, la inactivación inducible de CRBN no dio lugar a la muerte celular (Flecha inferior A y C). (B) La expresión de la proteína CRBN se cuantificó por transferencia Western. Las células con inactivación inducible de CRBN no mostraron cambios significativos en los niveles de proteína de IRF4 o actina. (C) Después del tratamiento con doxiciclina, la inactivación inducible de CRBN en células H929 y U266 no mostró ningún efecto en la viabilidad como se mide por tinción con anexina V 7AAD y se analizó pro citometría de flujo durante un periodo de 1-9 días. (D) -(F) Después de 9 días de inactivación inducible por ARNsh, las células se trataron con dosis crecientes de pomalidomida y se ensayó el efecto del compuesto en la viabilidad celular por citometría de flujo después de 5 días de tratamiento. En las células con inactivación inducible de CRBN, la pomalidomida tuvo efectos antiproliferativos reducidos en comparación con las células con inactivación con sh Control. Los datos se muestran como media de tres experimentos independientes ± s.d.

La FIG. 26 muestra la coestimulación de IL2 por pomalidomida. (A) Coestimulación de la liberación de IL2 por pomalidomida en PBMC humanas tratadas con anti-CD3. Los datos se muestran como media ± s.d. (B) Coestimulación de la liberación de IL2 por anti-CD28 (cuadrados) o pomalidomida (círculos) en PBMC de ratón tratadas con anti-CD3. Los datos se muestran como media ± s.d.

La FIG. 27 muestra que V388 es esencial para la degradación de IKZF1/3 por lenalidomida.

5. Descripción detallada

Los métodos proporcionados en la presente memoria se basan, en parte, en el descubrimiento de que las ubiquitina ligasas E3, incluyendo CRBN, experimentan cambios conformacionales o se altera de otra forma la superficie, después de la unión del ligando (p. ej., CMA). Como se muestra en la FIG. 1, el CRBN se une a proteínas, tales como DDB1, Cul4 y Roc1 para formar un complejo de E3-ubiquitan ligasa, que sirve para facilitar la ubiquitinación y degradación dirigidas de proteínas. En presencia de un CMA, el complejo de CRBN tiene una especificidad de unión y efectos biológicos aguas abajo posteriores alterados. Se cree que el CRBN actúa como un nuevo receptor de sustratos para el complejo. Sin pretender la vinculación a ninguna teoría, se cree que este cambio conformacional o alteración de la ubiquitina ligasa E3 dependiente de ligando (p. ej., CRBN) da como resultado que se expongan diferentes superficies de la ubiquitina ligasa E3, afectando de esta forma el reclutamiento y unión de diferentes sustratos al complejo de ubiquitina ligasa E3 y dando como resultado los efectos fenotípicos y/o terapéuticos diferenciales aguas abajo. Además, los ligandos (incluyendo los CMA) proporcionan interacciones de unión para los diversos sustratos diferentes de la proteína. En realizaciones específicas, la ubiquitina ligasa E3 es CRBN, y los ligandos de CRBN incluyen CMA, tales como CC-885, o cualquier análogo del mismo.

5.1 Definiciones

A no ser que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica. En el caso en el que haya una pluralidad de definiciones para un término en la presente memoria, las de esta sección prevalecerán a no ser que se afirme otra cosa.

El término "aproximadamente” o “alrededor de” significa en un 20 %, preferiblemente en un 10 %, y más preferiblemente en un 5 % (o un 1 % o menos) de un valor o rango dado.

Tal y como se usa en la presente memoria, “administrar” o “administración” se refiere al acto de inyectar o administrar físicamente de otra forma una sustancia ya que esta existe fuera del cuerpo en un paciente, tal como por administración mucosal, intradérmica, intravenosa, intramuscular y/o cualquier otro método de administración física descrito en la presente memoria o conocido en la técnica. Cuando se está tratando una enfermedad, trastorno o afección, o un síntoma de los mismos, la administración de la sustancia se produce típicamente después del inicio de la enfermedad, trastorno o afección o síntomas de los mismos. Cuando se está previniendo una enfermedad, trastorno o afección, o síntomas de los mismos, la administración se produce típicamente antes del inicio de la enfermedad, trastorno o afección o síntomas de los mismos.

“Muestra biológica” tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una muestra obtenida de un sujeto biológico, incluyendo una muestra con origen en un tejido o fluido biológico, obtenida, lograda, o recogida in vivo o in situ. Una muestra biológica también incluye muestras de una región de un sujeto biológico que contiene células o tejidos precancerosos o cancerosos. Dichas muestras pueden ser, pero no están limitadas a, órganos, tejidos, fracciones y células aisladas de un mamífero. Las muestras biológicas ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, un lisado celular, un cultivo celular, una línea celular, un tejido, tejido oral, tejido gastrointestinal, un órgano, un orgánulo, un fluido biológico, una muestra de sangre, una muestra de orina, una muestra de piel, y similares. Las muestras bilógicas preferidas incluyen, pero no están limitadas a, sangre completa, sangre parcialmente purificada, PBMC, biopsias de tejido, y similares.

Un marcador biológico o “biomarcador” es una sustancia cuya detección indica un estado biológico particular, tal como, por ejemplo, la presencia de cáncer. En algunas realizaciones, los biomarcadores pueden determinarse bien individualmente, o pueden medirse varios biomarcadores simultáneamente. En algunas realizaciones, un “biomarcador” indica un cambio en el nivel de la expresión de ARNm que puede correlacionarse con el riesgo o progresión de una enfermedad, o con la susceptibilidad de la enfermedad a un tratamiento dado. En algunas realizaciones, el biomarcador es un ácido nucleico, tal como un ARNm o ADNc. En realizaciones adicionales, un “biomarcador” indica un cambio en el nivel de la expresión de un polipéptido o proteína que puede correlacionarse con el riesgo, susceptibilidad al tratamiento, o progresión de una enfermedad. En algunas realizaciones, el biomarcador puede ser un polipéptido o proteína, o un fragmento de los mismos. El nivel relativo de proteínas específicas puede determinarse por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse los métodos basados en anticuerpos, tales como inmunotransferencia, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), u otros métodos.

Los términos "cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular desrregulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no están limitados a, tumores hemáticos (p. ej., mieloma múltiple, linfoma y leucemia), y tumores sólidos. Otros cánceres ejemplares se describen en otro lugar de la presente memoria.

El término "agente de captura”, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un agente que se une a un ARNm o proteína a través de una interacción que es suficiente como para permitir que el agente se una y concentre el ARNm o proteína a partir de una mezcla homogénea.

Los términos "cereblon” o “CRBN” y términos similares se refieren a los polipéptidos (“polipéptidos”, “péptidos” y “proteínas” se usan indistintamente en la presente memoria) que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquier CRBN, tal como una proteína CRBN humana (p. ej., isoforma 1 de CRBN humano, No. de Acceso de GenBank NP_057386; o isoformas 2 de CRBN humano, No. de Acceso de GenBank NP_001166953), y polipéptidos relacionados, incluyendo variantes de SNP de los mismos. Los polipéptidos CRBN relacionados incluyen variantes alélicas (p. ej., variantes de SNP); variantes de corte y empalme; fragmentos; derivados; variantes de sustitución, deleción e inserción; polipéptidos de fusión; y homólogos interespecie, que, en determinadas realizaciones, retienen la actividad de CRBN y/o son suficientes como para generar una respuesta inmune anti-CRBN.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "proteína asociada a cereblon” o “proteína asociada a CRBN” se refiere a una proteína que interacciona con o se une a CRBN directamente o indirectamente. En determinadas realizaciones, una ''protema asociada a cereblon” o “proteína asociada a CRBN” es un sustrato de CRBN, por ejemplo, un sustrato proteico del complejo de ubiquitina ligasa E3 que implica CRBN, o los sustratos aguas abajo del mismo. En una realización, la proteína asociada a CRBN es un sustrato de CRBN tal como IKZF3, también conocido como “Aiolos,” y/o IKZF1, también conocido como “Ikaros”. En determinadas realizaciones, una “proteína asociada a cereblon” o “proteína asociada a CRBN” es una proteína de unión de CRBN.

Tal y como se usa en la presente memoria, y a no ser que se indique otra cosa, el término ''cocristal” significa una forma cristalina que contiene más de un compuesto en una red de cristal. Los cocristales incluyen complejos moleculares cristalinos de dos o más compuestos no volátiles unidos conjuntamente en una red de cristal a través de interacciones no iónicas. Tal y como se usa en la presente memoria, los cocristales incluyen cocristales farmacéuticos en donde los complejos moleculares cristalinos que contienen un compuesto terapéutico y uno o más compuestos no volátiles adicionales (referidos en la presente memoria como contramolécula(s)). Una contramolécula en un cocristal farmacéutico es típicamente una molécula no tóxica farmacéuticamente aceptable, tal como, por ejemplo, aditivos alimentarios, conservantes, excipientes farmacéuticos, u otros API. En algunas realizaciones, los cocristales farmacéuticos aumentan determinadas propiedades físico-químicas de los productos farmacéuticos (p. ej., solubilidad, tasa de disolución, biodisponibilidad y/o estabilidad) sin comprometer la integridad de la estructura química del ingrediente farmacéutico activo (API). Véase, p. ej., Jones et a/.,“Pharmaceutical Cocrystals: An Emerging Approach to Physical Property Enhancement”, MRS Bulletin, 2006, 31, 875-879; Trask,“An Overview of Pharmaceutical Cocrystals as Intellectual Property”, Molecular Pharmaceutics, 2007, 4(3), 301-309; Schultheiss y Newman,“Pharmaceutical Cocrystals and Their Physicochemical Properties”, Crystal Growth & Design, 2009, 9(6), 2950-2967; Shan y Zaworotko,“The Role of Cocrystals in Pharmaceutical Science”, Drug Discovery Today, 2008, 13(9/10), 440-446; y Vishweshwar et a/.,“Pharmaceutical Co-Crystals”, J. Pharm. Sci., 2006, 95(3), 499-516.

El término "complementario” se refiere a la unión específica entre polinucleótidos sobre la base de las secuencias de los polinucleótidos. Tal y como se usa en la presente memoria, un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido son complementarios si se unen entre sí en un ensayo de hibridación en condiciones astringentes, p. ej., si producen un nivel de señal dado o detectable en un ensayo de hibridación. Las porciones de polinucleótidos son complementarias entre sí si siguen las reglas convencionales del emparejamiento de bases, p. ej., A se empareja con T (o U) y G se empareja con C, aunque pueden estar presentes pequeñas regiones (p. ej., menos de aproximadamente 3 bases) de discordancia, inserción, o deleción de secuencia.

Una mejora en el cáncer o enfermedad relacionada con el cáncer puede caracterizarse como una respuesta completa o parcial. “Respuesta completa” se refiere a una ausencia de enfermedad clínicamente detectable con la normalización de cualquier estudio radiográfico previamente anormal, mediciones de médula ósea, y líquido cefalorraquídeo (CSF) o de proteínas monoclonales anormales. “Respuesta parcial” se refiere a una disminución de al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o 90 % en toda la carga tumoral mensurable (es decir, el número de células malignas presentes en el sujeto, o el volumen medido de las masas tumorales o la cantidad de proteína monoclonal anormal) en ausencia de nuevas lesiones. El término "tratamiento” contempla tanto una respuesta completa como una parcial.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "composición” se pretende que englobe un producto que contiene los ingredientes especificados (p. ej., un anticuerpo) y, opcionalmente, en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que se produce, directamente o indirectamente, a partir de la combinación de los ingredientes especificados, opcionalmente, en las cantidades especificadas.

El término "número de ciclos” o “CT” cuando se usa en la presente memoria en referencia a métodos de PCR, se refiere al número de ciclos de una PCR en los que el nivel de fluorescencia supera un nivel umbral establecido dado. La medición de CT puede usarse, por ejemplo, para aproximar los niveles de ARNm en una muestra original. La medición de CT se usa frecuentemente en términos de “dCT” o la “diferencia en la puntuación de CT”, cuando el CT de un ácido nucleico se sustrae del CT de otro ácido nucleico.

Los términos "determinar”, “medir”, “evaluar”, “valorar” y “ensayar” tal y como se usan en la presente memoria generalmente se refieren a cualquier forma de medición, e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones cuantitativas y/o cualitativas. La evaluación puede ser relativa o absoluta. La "evaluación de la presencia de" puede incluir determinar la cantidad de algo presente, así como determinar si está presente o ausente.

El término "cantidad efectiva”, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la cantidad de una terapia (p. ej., una composición) que es suficiente para reducir y/o mejorar la gravedad y/o duración de una enfermedad, trastorno o afección dado y/o un síntoma relacionado con los mismos. Este término también engloba una cantidad necesaria para la reducción o mejora del avance o progresión de una enfermedad, trastorno o afección dado, la reducción o mejora de la recurrencia, desarrollo o inicio de una enfermedad, trastorno o afección dado, y/o mejorar o aumentar el o los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia. En algunas realizaciones, “cantidad efectiva”, tal y como se usa en la presente memoria, también se refiere a la cantidad de terapia proporcionada en la presente memoria para conseguir un resultado especificado.

Tal y como se usa en la presente memoria, una “respuesta efectiva del tumor del paciente” se refiere a cualquier incremento en el beneficio terapéutico del paciente. Una “respuesta efectiva del tumor del paciente” puede ser, por ejemplo, una disminución del 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, o 100 % en la velocidad del progreso del tumor. Una “respuesta efectiva del tumor del paciente” puede ser, por ejemplo, una disminución del 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, o 100 % en los síntomas físicos de un cáncer. Una “respuesta efectiva del tumor del paciente” también puede ser, por ejemplo, un incremento del 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 100 %, 200 %, o más en la respuesta del paciente, como se mide por cualquier medio adecuado, tal como expresión génica, recuentos celulares, resultados de ensayos, etc.

El término "expresado” o “expresión”, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la transcripción a partir de un gen para proporcionar una molécula de ácido nucleico ARN al menos complementaria en parte a una región de una de las dos cadenas de ácido nucleico del gen. El término "expresado” o “expresión”, tal y como se usa en la presente memoria, también se refiere a la traducción de la molécula de ARN para proporcionar una proteína, un polipéptido o una porción de los mismos.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "compuesto inmunomodulador” o “fármaco inmunomodulador” se refiere generalmente a una molécula o agente capaz de alterar la respuesta inmune de alguna forma. Los ejemplos no limitativos de compuestos inmunomoduladores incluyen los descritos en la Sección 5.8 más adelante.

Los términos "aislado” y “purificado” se refieren al aislamiento de una sustancia (tal como ARNm, anticuerpo o proteína) de manera que la sustancia comprenda una porción sustancial de la muestra en la que reside, es decir, mayor que la sustancia que se encuentra típicamente en su estado natural o no aislado. Típicamente, una porción sustancial de la muestra comprende, p. ej., más del 1 %, más del 2 %, más del 5 %, más del 10 %, más del 20 %, más del 50 %, o más, habitualmente hasta aproximadamente el 90 %-100 % de la muestra. Por ejemplo, una muestra de ARNm aislado puede comprender típicamente al menos aproximadamente un 1 % de ARNm total. Las técnicas para purificar polinucleótidos son muy conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, electroforesis en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, separación por flujo, y sedimentación de acuerdo con la densidad.

Un “marcador” o un “resto detectable” en referencia a un ácido nucleico, se refiere a una composición que, cuando se une a un ácido nucleico, hace que el ácido nucleico sea detectable, por ejemplo, por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, o químicos. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no están limitados a, isótopos radiactivos, perlas magnéticas, perlas metálicas, partículas coloidales, tintes fluorescentes, enzimas, biotina, digoxigenina, haptenos, y similares. Un "ácido nucleico o sonda de oligonucleótido marcado” es generalmente uno que se une, bien covalentemente, a través de un conector o un enlace químico, o no covalentemente, a través de enlaces iónicos, fuerzas de van der Waals, atracciones electrostáticas, interacciones hidrófobas, o enlaces de hidrógeno, a un marcador de manera que la presencia del ácido nucleico o sonda puede detectarse mediante la detección de la presencia del marcador unido al ácido nucleico o sonda.

El término "probabilidad” generalmente se refiere a un incremento en la probabilidad de un evento. El término "probabilidad” cuando se usa en referencia a la efectividad de la respuesta del tumor de un paciente contempla generalmente una probabilidad incrementada de que la tasa del progreso del tumor o del crecimiento de las células tumorales disminuirá. El término "probabilidad” cuando se usa en referencia a la efectividad de la respuesta del tumor de un paciente también puede significar generalmente el incremento de indicadores, tales como expresión de ARNm o proteínas, que pueden poner de manifiesto un incremento en el progreso en el tratamiento del tumor.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "gestiona”, “que gestiona”, y “gestión” se refieren a los efectos beneficiosos que obtiene un sujeto de una terapia, que no da lugar a la cura de la enfermedad, trastorno o afección. En determinados ejemplos, se administran a un sujeto una o más terapias para “gestionar” una enfermedad, trastorno o afección, o uno o más síntomas de los mismos, de manera que se prevenga la progresión o empeoramiento de la enfermedad, trastorno o afección.

El término "monitorizar”, tal y como se usa en la presente memoria, generalmente se refiere al control, supervisión, regulación, observación, seguimiento, o vigilancia de una actividad. Por ejemplo, el término "monitorizar la efectividad de un compuesto” se refiere a seguir la efectividad en el tratamiento de un cáncer en un paciente o en un cultivo de células tumorales. De manera similar, la “monitorización”, cuando se usa en conexión con el cumplimiento del paciente, bien individualmente, o en un ensayo clínico, se refiere al seguimiento o confirmación de que el paciente está tomando realmente un fármaco que se está ensayando como se ha prescrito. La monitorización puede realizarse, por ejemplo, siguiendo la expresión de biomarcadores de ARNm o proteínas.

Los términos "ácido nucleico” y “polinucleótido” se usan indistintamente en la presente memoria para describir un polímero de cualquier longitud compuesto por nucleótidos, p. ej., desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o compuestos producidos sintéticamente, que pueden hibridar con ácidos nucleicos naturales de una manera específica de secuencia de forma análoga a la de dos ácidos nucleicos naturales, p. ej., pueden participar en interacciones de emparejamiento de bases de Watson-Crick. Tal y como se usa en la presente memoria en el contexto de una secuencia de polinucleótido, el término "bases” (o “base”) es sinónimo de “nucleótidos” (o “nucleótido”), es decir, la subunidad monomérica de un polinucleótido. Los términos “nucleósido” y “nucleótido” se pretende que incluyan aquellos restos que contienen no solo las bases púricas y pirimidínicas conocidas, sino también otras bases heterocíclicas que han sido modificadas. Dichas modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas, ribosas alquiladas u otros heterociclos. Además, los términos "nucleósido” y “nucleótido” incluyen aquellos restos que contienen no solo azúcares convencionales de ribosa y desoxirribosa, sino también otros azúcares. Los nucleósidos o nucleótidos modificados también incluyen modificaciones en el resto de azúcar, p. ej., en donde uno o más de los grupos hidroxilo se reemplazan con átomos de halógeno o grupos alifáticos, o se funcionalizan como éteres, aminas, o similares. “Análogos” se refiere a moléculas que tienen características estructurales que se reconocen en la bibliografía como miméticos, derivados, que tienen estructuras análogas, u otros términos similares, e incluyen, por ejemplo, polinucleótidos que incorporan nucleótidos no naturales, miméticos de nucleótidos tales como nucleósidos modificados en 2 ’, ácidos nucleicos peptídicos, fosfonatos de nucleósidos oligoméricos, y cualquier polinucleótido que tiene grupos sustituyentes añadidos, tales como grupos protectores o restos conectores.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "nucleótido", "ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “polinucleótido,” y otros términos similares se usan indistintamente e incluyen ADN, ARN, ARNm y similares.

El término "ácido nucleico” o “sonda de oligonucleótido” se refiere a un ácido nucleico capaz de unirse a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria, tal como los biomarcadores de ARNm, a través de uno o más tipos de enlaces químicos, habitualmente a través del emparejamiento de bases complementarias, habitualmente a través de la formación de enlaces de hidrógeno. Tal y como se usa en la presente memoria, una sonda puede incluir bases naturales (p. ej., A, G, C, o T) o modificadas (7-deazaguanosina, inosina, etc.). Además, las bases en una sonda pueden estar unidas por una unión distinta de un enlace fosfodiéster, siempre que no interfiera con la hibridación. Un experto en la técnica entenderá que las sondas pueden unirse a secuencias diana que carecen de una complementariedad completa con la secuencia de la sonda dependiendo de la astringencia de las condiciones de la hibridación. Las sondas se marcan preferiblemente directamente con isótopos, por ejemplo, cromóforos, lumíforos, cromógenos, o se marcan indirectamente con biotina a la que se puede unir posteriormente un complejo de estreptavidina. Mediante el ensayo de la presencia o ausencia de la sonda, se puede detectar la presencia o ausencia de un biomarcador de ARNm diana de interés.

Tal y como se usa en la presente memoria, y a no ser que se indique otra cosa, el término "ópticamente puro” significa una composición que comprende un isómero óptico de un compuesto y que carece sustancialmente de otros isómeros de ese compuesto. Por ejemplo, una composición ópticamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral carecerá sustancialmente del enantiómero opuesto del compuesto. Una composición ópticamente pura de un compuesto que tiene dos centros quirales carecerá sustancialmente de los otros diastereómeros del compuesto. Un compuesto típico ópticamente puro comprende más de aproximadamente el 80 % en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente el 20 % en peso de otros enantiómeros del compuesto, más preferiblemente más de aproximadamente el 90 % en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente el 10 % en peso de los otros enantiómeros del compuesto, incluso más preferiblemente más de aproximadamente el 95 % en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente el 5 % en peso de los otros enantiómeros del compuesto, más preferiblemente más de aproximadamente el 97 % en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente el 3 % en peso de los otros enantiómeros del compuesto, y lo más preferiblemente más de aproximadamente el 99 % en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente el 1 % en peso de los otros enantiómeros del compuesto.

Los términos "opcional” u “opcionalmente”, tal y como se usan en la presente memoria, significan que el evento o circunstancia descrito posteriormente puede ocurrir o no, y que la descripción incluye, sin limitación, casos en los que dicho evento o circunstancia ocurre y casos en los que no ocurre.

El término "farmacéuticamente aceptable”, tal y como se usa en la presente memoria, significa que está aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o listada en la Farmacopea de EE. UU., Farmacopea Europea u otras Farmacopeas reconocidas generalmente para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos.

Tal y como se usa en la presente memoria, y a no ser que se indique otra cosa, el término "sal farmacéuticamente aceptable” engloba sales de adición a ácido y base no tóxicas del compuesto al que se refiere el término. Las sales de adición a ácido no tóxicas aceptables incluyen aquellas derivadas de ácidos o bases orgánicos e inorgánicos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido metanosulfónico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido maleico, ácido sórbico, ácido aconítico, ácido salicílico, ácido ftálico, ácido embólico, ácido enántico, y similares.

Los compuestos que tienen naturaleza ácida son capaces de formar sales con diversas bases farmacéuticamente aceptables. Las bases que pueden usarse para preparar sales de adición a base farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos ácidos son aquellas que forman sales de adición a base no tóxicas, es decir, sales que contienen cationes farmacológicamente aceptables tales como, pero no limitado a, sales de metales alcalinos o metales alcalinotérreos y las sales de calcio, magnesio, sodio o potasio en particular. Las bases orgánicas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, N,N-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumaína (N-metilglucamina), lisina, y procaína.

Los términos "reacción en cadena de la polimerasa”, o “PCR”, tal y como se usan en la presente memoria, se refieren generalmente a un procedimiento en donde pequeñas cantidades de un ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican como se describe, por ejemplo, en la Pat. de EE. UU. No. 4.683.195 de Mullis. Generalmente, es necesario que esté disponible la información de la secuencia de los extremos de la región de interés o más allá, de manera que puedan diseñarse cebadores oligonucleotídicos; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas del molde que se va a amplificar. Los nucleótidos terminales en 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede usarse para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas de ADN genómico total, y ADNc transcrito de ARN celular total, secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Véase, generalmente, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).

Tal y como se usan en la presente memoria los términos "polipéptido” y “proteína” como se usan indistintamente en la presente memoria, se refieren a un polímero de aminoácidos de tres o más aminoácidos en una matriz en serie, unidos a través de enlaces peptídicos. El término "polipéptido” incluye proteínas, fragmentos de proteínas, análogos de proteínas, oligopéptidos y similares. El término polipéptido, tal y como se usa en la presente memoria, también puede referirse a un péptido. Los aminoácidos que componen el polipéptido pueden ser naturales o pueden ser sintéticos. El polipéptido puede purificarse a partir de una muestra biológica.

El término "predecir” significa generalmente determinar o decir de antemano. Cuando se usa para "predecir" la efectividad de un tratamiento para el cáncer, por ejemplo, el término "predecir" puede significar que la probabilidad del resultado del tratamiento para el cáncer puede determinarse al principio, antes de que el tratamiento haya empezado, o antes de que el periodo de tratamiento haya progresado sustancialmente.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "agente profiláctico” se refiere a cualquier agente que pueda inhibir parcialmente o totalmente el desarrollo, recurrencia, inicio o velocidad de una enfermedad, trastorno o afección y/o síntomas relacionados con los mismos en un sujeto. En determinadas realizaciones, el término "agente profiláctico” se refiere a un compuesto descrito en la presente memoria. En determinadas otras realizaciones, el término "agente profiláctico” se refiere a un agente distinto de un compuesto descrito en la presente memoria. En determinadas realizaciones, un agente profiláctico es un agente que se sabe que es útil o que se está usando actualmente para prevenir una enfermedad, trastorno o afección y/o un síntoma relacionado con los mismos o impedir el inicio, desarrollo, progresión y/o gravedad de una enfermedad, trastorno o afección y/o un síntoma relacionado con los mismos.

El término "sonda”, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un agente de captura que está dirigido a una secuencia de biomarcador de ARNm diana específica. Por consiguiente, cada sonda de un conjunto de sondas tiene un biomarcador de ARNm diana respectivo. Un dúplex sonda /ARNm diana es una estructura formada por la hibridación de una sonda a su biomarcador de ARNm diana.

El término "refractario o resistente” se refiere a una circunstancia en la que los pacientes, incluso después de un tratamiento intensivo, tienen células cancerosas residuales (p. ej., células de leucemia o linfoma) en su sistema linfático, sangre y/o tejidos formadores de la sangre (p. ej., médula).

El término "regular”, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a controlar la actividad de una molécula o función biológica, tal como aumentar o disminuir la actividad o función.

El término "muestra”, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un material o mezcla de materiales, típicamente, aunque no necesariamente, en forma fluida, que contiene uno o más componentes de interés.

El término "sensibilidad” y “sensible” cuando hace referencia al tratamiento con un compuesto es un término relativo que se refiere al grado de efectividad del compuesto para reducir o disminuir el progreso de un tumor o la enfermedad que se está tratando. Por ejemplo, el término "sensibilidad incrementada” cuando se usa en referencia al tratamiento de una célula o tumor en conexión con un compuesto se refiere a un incremento de al menos un 5 %, o más, en la efectividad del tratamiento para el tumor.

“Identidad de secuencia” o “identidad” en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia sobre una ventana de comparación especificada, y puede tener en cuenta adiciones, deleciones y sustituciones.

Tal y como se usa en la presente memoria, y a no ser que se indique otra cosa, el término "solvato” significa un compuesto o una sal del mismo, que incluye además una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de disolvente unida por fuerzas intermoleculares no covalentes. Cuando el disolvente es agua, el solvato es un hidrato.

Tal y como se usa en la presente memoria, y a no ser que se indique otra cosa, el término "estereoméricamente puro” significa una composición que comprende un estereoisómero de un compuesto y que carece sustancialmente de otros estereoisómeros de ese compuesto. Por ejemplo, una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral carecerá sustancialmente del enantiómero opuesto del compuesto. Una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene dos centros quirales carecerá sustancialmente de otros diastereómeros del compuesto. Un compuesto estereoméricamente puro típico comprende más de aproximadamente el 80 % en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 20 % en peso de otros estereoisómeros del compuesto, más preferiblemente más de aproximadamente el 90 % en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 10 % en peso de los otros estereoisómeros del compuesto, incluso más preferiblemente más de aproximadamente el 95 % en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 5 % en peso de los otros estereoisómeros del compuesto, y lo más preferiblemente más de aproximadamente el 97 % en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 3 % en peso de los otros estereoisómeros del compuesto. Tal y como se usa en la presente memoria, y a no ser que se indique otra cosa, el término "estereoméricamente enriquecido” significa una composición que comprende más de aproximadamente el 60 % en peso de un estereoisómero de un compuesto, preferiblemente más de aproximadamente el 70 % en peso, más preferiblemente más de aproximadamente el 80 % en peso de un estereoisómero de un compuesto. Tal y como se usa en la presente memoria, y a no ser que se indique otra cosa, el término "enantioméricamente puro” significa una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral. De manera similar, el término "estereoméricamente enriquecido” significa una composición estereoméricamente enriquecida de un compuesto que tiene un centro quiral.

El término "condiciones de ensayo astringentes” se refiere a condiciones que son compatibles para producir pares de unión de ácidos nucleicos, p. ej., sondas y ARNm diana, con una complementariedad suficiente como para proporcionar el nivel de especificidad deseado en el ensayo, mientras es generalmente incompatible para la formación de pares de unión entre miembros de unión con una complementariedad insuficiente como para proporcionar la especificidad deseada. El término condiciones de ensayo astringentes generalmente se refiere a la combinación de condiciones de hibridación y lavado.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "sujeto” y “paciente” se usan indistintamente. Tal y como se usa en la presente memoria, un sujeto puede ser un mamífero tal como un no primate (p. ej., vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) o un primate (p. ej., mono y ser humano). En realizaciones específicas, el sujeto es un ser humano. En una realización, el sujeto es un mamífero (p. ej., un ser humano) que tiene una enfermedad, trastorno o afección. En otra realización, el sujeto es un mamífero (p. ej., un ser humano) que presenta riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.

El término "identidad sustancial” u “homólogo” en sus diversas formas gramaticales en el contexto de polinucleótidos significa generalmente que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene una identidad deseada, por ejemplo, al menos un 60 % de identidad, preferiblemente al menos un 70 % de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos un 80 %, aún más preferiblemente al menos un 90 % e incluso más preferiblemente al menos un 95 %, en comparación con una secuencia de referencia. Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas hibridan entre sí en condiciones astringentes.

Tal y como se usa en la presente memoria, y a no ser que se especifique otra cosa, el término "cantidad terapéuticamente efectiva” de un compuesto es una cantidad suficiente como para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento o gestión de un cáncer, o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con la presencia del cáncer. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto significa una cantidad del agente terapéutico, solo o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o gestión del cáncer. El término "cantidad terapéuticamente efectiva” puede englobar una cantidad que mejora la terapia global, reduce o evita los síntomas o causas del cáncer, o aumenta la eficacia terapéutica de otro agente terapéutico.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "terapia” se refiere a cualquier protocolo, método y/o agente que puede usarse en la prevención, gestión, tratamiento y/o mejora de una enfermedad, trastorno o afección dado. En determinados ejemplos, los términos "terapias” y “terapia” se refieren a una terapia con fármacos, terapia biológica, terapia paliativa, y/u otras terapias útiles en la prevención, gestión, tratamiento y/o mejora de una enfermedad, trastorno o afección dado conocidas para un experto en la técnica tal como el personal médico.

Tal y como se usan en la presente memoria, y a no ser que se especifique otra cosa, los términos "tratar”, “tratando” y “tratamiento” se refieren a una acción que se produce mientras el paciente padece de la enfermedad, trastorno o afección especificado. Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "tratar”, “tratamiento” y “tratando” se refieren a la reducción o mejora de la progresión, gravedad, y/o duración de una enfermedad, trastorno o afección como resultado de la administración de una o más terapias.

“Tumor”, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a todo crecimiento y proliferación celulares neoplásicos, ya sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. “Neoplásico”, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier forma de crecimiento celular desrregulado o no regulado, ya sea maligno o benigno, que da como resultado un crecimiento tisular anormal. Así, las “células neoplásicas” incluyen células malignas y benignas que tienen un crecimiento celular desrregulado o no regulado.

Un ARNm que está “regulado al alza” se incrementa generalmente después de un tratamiento o afección dado. Un ARNm que está “regulado a la baja” se refiere generalmente a una disminución en el nivel de expresión del ARNm en respuesta a un tratamiento o afección dado. En algunas situaciones, el nivel de ARNm puede permanecer inalterado después de un tratamiento o afección dado. Un ARNm de una muestra de un paciente puede estar “regulado al alza” cuando se trata con un fármaco, en comparación con un control no tratado. Esta regulación al alza puede ser, por ejemplo, un incremento de aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 500 %, 1.000 %, 5.000 % o más del nivel del ARNm control comparativo. Alternativamente, un ARNm puede estar “regulado a la baja”, o expresado a un nivel menor, en respuesta a la administración de determinados compuestos u otros agentes. Un ARNm regulado a la baja puede, por ejemplo, estar presente a un nivel de aproximadamente un 99 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 1 % o menos del nivel del ARNm control comparativo. De manera similar, el nivel de un biomarcador de polipéptido o proteína de una muestra de un paciente puede incrementarse cuando se trata con un fármaco, en comparación con un control no tratado. Este incremento puede ser aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 500 %, 1.000 %, 5.000 % o más del nivel de la proteína control comparativo. Alternativamente, el nivel de un biomarcador de proteína puede disminuirse en respuesta a la administración de determinados compuestos u otros agentes. Esta disminución puede estar, por ejemplo, presente a un nivel de aproximadamente un 99 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 1 % o menos del nivel de la proteína control comparativo.

Debe indicarse que, si hay una discrepancia entre una estructura representada y un nombre dado a esa estructura, debe darse más peso a la estructura representada. Además, si la estereoquímica de una estructura o una porción de una estructura no se indica, por ejemplo, con negrita o líneas punteadas, debe interpretarse que la estructura o porción engloba todos sus estereoisómeros.

La práctica de las realizaciones proporcionadas en la presente memoria empleará, a no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, e inmunología, que están dentro de la capacidad de los expertos en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Los ejemplos de textos particularmente adecuados para la consulta incluyen los siguientes: Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; A Laboratory M anual(2a ed.); D.N Glover, ed. (1985) DNA Cloning, Volúmenes I y II; M.J. Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; B.D. Hames y SJ. Higgins, eds. (1984) Nucleic AcidHybridization; B.D. Hames y S.J. Higgins, eds. (1984) Transcription and Translation; R.I. Freshney, ed. (1986) Animal Cell Culture; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres); Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practice (2a ed.; Springer Verlag, N.Y.); y D.M. Weir y C. C. Blackwell, eds. (1986) Handbook o f Experimental Immunology, Volúmenes I-IV.

5.2 Métodos para identificar compuestos

En la presente memoria se proporcionan, por ejemplo, métodos para cribar o identificar de otra forma un compuesto, que se une a una ubiquitina ligasa E3. En determinadas realizaciones, el compuesto induce un cambio conformacional en el bolsillo de unión a ligando de la ubiquitina ligasa E3. En otras realizaciones, el compuesto altera las propiedades de la superficie de la ubiquitina ligasa E3. En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, el compuesto altera la superficie de la ubiquitina ligasa E3 adyacente al bolsillo de unión a ligando de la ubiquitina ligasa E3. En otras realizaciones, el compuesto altera uno o más bucles circundantes u otra superficie del bolsillo de unión a ligando de la ubiquitina ligasa E3. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de la ubiquitina ligasa E3 se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En una realización específica, el compuesto es un CMA.

Aunque los métodos ejemplares descritos más adelante y en otro lugar se refieren a cambios conformacionales en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA) u otras alteraciones en las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína, tal como una región adyacente al bolsillo de unión a CMA), se entiende que el CRBN es meramente ilustrativo y que los métodos proporcionados en la presente memoria pueden utilizarse con otras ubiquitina ligasas E3.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para identificar un compuesto de ensayo que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinadas realizaciones, el método comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En algunas realizaciones, el primer conjunto de coordenadas atómicas y/o dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas define un dominio de unión a CMA. En determinadas realizaciones, la diferencia en las coordenadas atómicas se determina evaluando diferencias en las distancias atómicas. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN.

En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un método para identificar un compuesto de ensayo que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el método comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para identificar un compuesto de ensayo que tiene una actividad biológica específica aguas abajo que comprende: (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN y que tiene la actividad biológica específica aguas abajo; y en donde dicho cambio conformacional o alteración tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN; tiene un efecto en E377 de CRBN; o tiene un efecto en V388 de CRBN. En algunas realizaciones, el primer conjunto de coordenadas atómicas y/o dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas define un dominio de unión a CMA. En determinadas realizaciones, la diferencia en las coordenadas atómicas se determina evaluando diferencias en las distancias atómicas. En algunas realizaciones, el método comprende además ensayar la actividad biológica específica. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En determinados ejemplos, el método comprende además administrar dicho compuesto a un paciente, en donde dicha actividad biológica se modula en dicho paciente. En determinados ejemplos, el paciente tiene una enfermedad, y en donde uno o más síntomas de dicha enfermedad se alivian después de dicha administración. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN.

En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un método para identificar un compuesto de ensayo que tiene una actividad biológica específica aguas abajo que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que tiene la actividad biológica específica aguas abajo. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la actividad biológica es un efecto tumoricida. En otras realizaciones, la actividad biológica es un efecto en la apoptosis. En algunas realizaciones, la actividad biológica es antiproliferación. En otras realizaciones más, la actividad biológica es viabilidad de las PBMC. En algunas realizaciones, la actividad biológica es toxicidad. En determinadas realizaciones, la actividad biológica es degradación de sustrato. En una realización, la actividad biológica es degradación de Aiolos. En otras realizaciones, la actividad biológica es degradación de Ikaros. En otras realizaciones, la actividad biológica es un efecto mediado por inmunidad. En otra realización, la actividad biológica es inducción de IL-2. En algunas realizaciones, la actividad biológica es represión de IL-2. En otras realizaciones más, la actividad biológica es un efecto en HbF. También se contempla cualquier combinación de una, dos, tres o más de las actividades biológicas mencionadas anteriormente. En determinadas realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías específicas de tipos celulares. En otras realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías específicas de tipos tisulares. En otras realizaciones más, la actividad biológica se basa en tumores sólidos o categorías de tumores sólidos. En algunas realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías de tumores no sólidos.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para identificar un compuesto de ensayo que tiene una eficacia terapéutica específica que comprende: (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN y que tiene la eficacia terapéutica específica; y en donde dicho cambio conformacional o alteración tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN; tiene un efecto en E377 de CRBN; o tiene un efecto en V388 de CRBN. En algunas realizaciones, el primer conjunto de coordenadas atómicas y/o dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas define un dominio de unión a CMA. En determinadas realizaciones, la diferencia en las coordenadas atómicas se determina evaluando diferencias en las distancias atómicas. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En determinadas realizaciones, el método comprende además administrar dicho compuesto a un paciente que tiene una enfermedad, trastorno o afección, en donde uno o más síntomas de dicha enfermedad, trastorno o afección se alivian después de dicha administración. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN.

En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un método para identificar un compuesto de ensayo que tiene una eficacia terapéutica específica aguas abajo que comprende: (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que tiene la actividad biológica específica aguas abajo. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

5.2.1. Diseño basado en ordenador de los compuestos

En la presente memoria se describen métodos para diseñar compuestos sobre la base del ajuste en el bolsillo de unión a CMA de CRBN. En algunos ejemplos, los métodos son métodos basados en ordenador.

En un ejemplo, en la presente memoria se describe un método para diseñar un compuesto de ensayo sobre la base del ajuste en el bolsillo de unión a CMA de CRBN, que comprende: (a) generar en un ordenador, características estructurales tridimensionales de un CRBN que tiene un cambio conformacional o alteración en el bolsillo de unión a CMA, (b) diseñar un compuesto de ensayo capaz de unirse selectivamente a dicho bolsillo de unión a CMA, (c) sintetizar dicho compuesto de ensayo, (d) poner en contacto el CRBN con dicho compuesto de ensayo sintetizado, y (e) determinar si dicho compuesto de ensayo se une a dicho CRBN. En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN.

En un ejemplo, el método comprende (i) generar (p. ej., en un ordenador) características estructurales tridimensionales de un CRBN que tiene un cambio conformacional o alteración en el bolsillo de unión a CMA, (ii) diseñar un compuesto capaz de unirse selectivamente a dicho bolsillo de unión a CMA, (iii) sintetizar dicho compuesto, (iv) poner en contacto un CRBN con dicho compuesto sintetizado, e (v) identificar un compuesto sintetizado que se una a dicho bolsillo de unión a CMA. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en el bolsillo de unión a CMA del CRBN se define por coordenadas atómicas como se muestra en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7; o una estructura tridimensional como se muestra en una cualquiera de las FIG. 12-18 o 20. En algunas realizaciones, el bolsillo de unión a CMA comprende W380, W386 y/o W400. Los bolsillos de unión a CMA ejemplares se describen en las FIG. 12-20 y 22; y en las Tablas 3-5.

En determinadas realizaciones, los compuestos de ensayo se sintetizan y ensayan para determinar una actividad biológica como se describe en otro lugar de la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la actividad biológica es un efecto tumoricida, efecto en la apoptosis, antiproliferación, proliferación incrementada, viabilidad de las PBMC, toxicidad, degradación de sustrato (p. ej., degradación de Aiolos o Ikaros), un efecto mediado por inmunidad, inducción de IL-2, o represión de IL-2.

En otras realizaciones, los compuestos de ensayo se sintetizan y ensayan para determinar una actividad terapéutica como se describe en otro lugar de la presente memoria.

5.3 CRBN cristalino

En la presente memoria se describen formas cristalinas de CRBN, por ejemplo, CRBN no unido o CRBN formando un complejo con un CMA. En una realización, la forma cristalina tiene las coordenadas atómicas como se muestra en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7. En algunas realizaciones, la forma cristalina tiene una estructura tridimensional como se muestra en una cualquiera de las FIG. 12-18 o 20. En determinadas realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) DDB1. En otras realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) un CMA. En determinadas realizaciones, el CMA es talidomida, pomalidomida o lenalidomida. En otras realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) a DDB y un CMA.

5.3.1. CRBN cristalino - No unido

En la presente memoria se describe un CRBN cristalino. En determinadas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, el CRBN tiene una estructura tridimensional. En el contexto de la presente invención, la estructura tridimensional se determina por difracción de rayos x. En una realización específica, la estructura tridimensional tiene las siguientes coordenadas atómicas. En una realización, la forma cristalina tiene las coordenadas atómicas como se muestran en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7. En algunas realizaciones, la forma cristalina tiene una estructura tridimensional como se muestra en una cualquiera de las FIG. 12-18 o 20. En determinadas realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) DDB1. En otras realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) un CMA. En determinadas realizaciones, el CMA es talidomida, pomalidomida o lenalidomida. En otras realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) DDB y un CMA.

En una realización específica, la forma cristalina tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 4. En otras realizaciones, la forma cristalina tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 5. En otras realizaciones, la forma cristalina tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 6. En otras realizaciones, la forma cristalina tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 7.

En algunas realizaciones, la forma cristalina comprende un fragmento de CRBN. En otras realizaciones, la forma cristalina comprende un fragmento de CRBN, bien solo o en combinación con DDB1 y/o un CMA descrito en la presente memoria.

5.3.2. CRBN cristalino - Unido

En la presente memoria se describe un cristal de un complejo que comprende CRBN y un CMA. En una realización, el CMA es un compuesto inmunomodulador descrito en la presente memoria (véase, p. ej., la Sección 5.8 más adelante). En otras realizaciones, el CMA es CC-885 o un análogo del mismo. En determinadas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, el cristal del complejo tiene una estructura tridimensional. En determinadas realizaciones, la estructura tridimensional se determina por difracción de rayos x. En una realización, el cristal tiene las coordenadas atómicas como se muestran en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7. En algunas realizaciones, el cristal tiene una estructura tridimensional como se muestra en una cualquiera de las FIG. 12-18 o 20. En determinadas realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) DDB1. En otras realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) un CMA. En determinadas realizaciones, el CMA es talidomida, pomalidomida o lenalidomida. En otras realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) DDB y un CMA.

En una realización, el cristal tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 3. En una realización específica, el cristal tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 4. En otras realizaciones, el cristal tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 5. En otras realizaciones, el cristal tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 6. En otras realizaciones, el cristal tiene las coordenadas atómicas mostradas en la Tabla 7.

Hablando en general, los expertos en la técnica entenderán que el término “coordenadas” o "coordenadas de estructura" se refiere a las coordenadas cartesianas derivadas de ecuaciones matemáticas relacionadas con los patrones obtenidos en la difracción de un haz monocromático de rayos X por los átomos (centros de dispersión) de un polipéptido en forma de cristal. Los datos de difracción se usan para calcular un mapa de densidad electrónica de la unidad de repetición del cristal. Los mapas de densidad electrónica se usan entonces para estimar las posiciones de los átomos individuales del polipéptido para construir un modelo del polipéptido. Los expertos en la técnica también entenderán que un conjunto de coordenadas de estructura para un modelo de polipéptido es un conjunto relativo de puntos que define una estructura en tres dimensiones.

Los expertos en la técnica entienden que un conjunto de coordenadas de estructura determinado por cristalografía de rayos x es aproximado y no carece de error estándar. Debido a las limitaciones inherentes de la resolución de los datos de difracción, las posiciones de los átomos individuales en un modelo de polipéptido son necesariamente aproximadas. Las ligeras variaciones en la posición atómica en un modelo de polipéptido tendrán un efecto pequeño en la forma y estructura globales del modelo de polipéptido. Si dichas variaciones están dentro de un error estándar aceptable en comparación con las coordenadas originales, se considera que la forma y estructura tridimensional resultante es estructuralmente equivalente. A modo de ejemplo, los expertos en la técnica entienden que un conjunto de coordenadas de estructura para un modelo de polipéptido dado tiene una desviación cuadrática media de átomos distintos de hidrógeno menor de aproximadamente 1,5 Á cuando se superpone en las posiciones de átomos distintos de hidrógeno de un segundo conjunto de coordenadas de estructura para un segundo modelo de polipéptido se considera típicamente que son sustancialmente idénticos u homólogos.

También es posible que un conjunto de coordenadas completamente diferentes pueda definir una forma similar o idéntica. Las ligeras variaciones en las coordenadas de estructura también pueden generarse manipulando matemáticamente las coordenadas de un modelo de polipéptido. Por ejemplo, las coordenadas de estructura mostradas en la presente memoria podrían manipularse por permutaciones cristalográficas de las coordenadas de la estructura, fraccionalización de las coordenadas de la estructura, adiciones o sustracciones de números enteros a conjuntos de las coordenadas de la estructura, inversión de las coordenadas de la estructura, o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, la modificación en la estructura de cristal debida a mutaciones, adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoácidos, u otros cambios en cualquiera de los componentes que constituyen el cristal, también podría representar variaciones en las coordenadas de la estructura. Si dichas variaciones están dentro de un error estándar aceptable en comparación con las coordenadas originales, se considera que la forma tridimensional resultante es la misma que la de la estructura de cristal no modificada.

En algunas realizaciones, el cristal comprende un fragmento de CRBN. En otras realizaciones, el cristal comprende un fragmento de CRBN, bien solo o en combinación con DDB1 y/o un CMA descrito en la presente memoria.

En determinadas realizaciones, la estructura tridimensional es indicativa de un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN es en comparación con un CRBN no unido. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN es en comparación con un complejo que comprende el CRBN y un análogo del CMA. En otras realizaciones más, el cambio conformacional o alteración en CRBN es en comparación con un complejo que comprende CRBN y un CMA diferente.

En la presente memoria también se describe un cristal de un complejo que comprende CRBN y un CMA, o un análogo del mismo. En la presente memoria también se proporciona un método para obtener el cristal, que comprende concentrar un complejo purificado del CRBN y el CMA, o análogo del mismo, y obtener el cristal.

En la presente memoria también se describe un cristal de un complejo que comprende CRBN y un compuesto, en donde dicho cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x que tiene las siguientes coordenadas atómicas En una realización, el cristal tiene las coordenadas atómicas como se muestra en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7. En algunas realizaciones, el cristal tiene una estructura tridimensional como se muestra en una cualquiera de las FIG. 12-18 o 20. En determinadas realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) DDB1. En otras realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) un CMA. En determinadas realizaciones, el CMA es talidomida, pomalidomida o lenalidomida. En otras realizaciones, el CRBN está formando un complejo con (o está unido de otra forma a) DDB y un CMA.

En la presente memoria también se describe un cristal de un complejo que comprende un CRBN y un compuesto, en donde dicho cristal tiene una estructura tridimensional como se determina por difracción de rayos x, en donde dicha estructura tridimensional tiene las coordenadas atómicas como se muestran en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7 indicativas de cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN es en comparación con un complejo que comprende CRBN y compuesto de referencia. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN.

En determinadas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, el CRBN está unido a DDB1. En algunas realizaciones, el CRBN está unido a Cul4. En otras realizaciones, el CRBN está unido a Roc1. En algunas realizaciones, el CRBN está unido a DDB1 y Cul4. En otras realizaciones, el CRBN está unido a DDB1 y Roc1. En otras realizaciones más, el CRBN está unido a Cul4 y Roc1. En algunas realizaciones, el CRBN está unido a DDB1, Cul4 y Roc1. En determinadas realizaciones, el CRBN que está unido a DDB1, Cul4 y/o Roc1 es un complejo con DDB1, Cul4 y/o Roc1, respectivamente.

En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, el CMA es un compuesto inmunomodulador descrito en la presente memoria (véase, p. ej., la Sección 5.8 más adelante). En determinadas realizaciones, el CMA es talidomida. En otras realizaciones, el CMA es pomalidomida. En algunas realizaciones, el CMA es CC-220. En otras realizaciones, el CMA es CC-885. En determinadas realizaciones, el CMA es un análogo de talidomida. En otras realizaciones, el CMA es un análogo de pomalidomida. En algunas realizaciones, el CMA es un análogo de CC-220. En otras realizaciones, el CMA es un análogo de CC-885. En otras realizaciones, el CMA no es talidomida. En otras realizaciones, el CMA no es pomalidomida. En algunas realizaciones, el CMA no es CC-220. En otras realizaciones, el CMA no es CC-885. En otras realizaciones, el CMA no es un análogo de talidomida. En otras realizaciones, el CMA no es un análogo de pomalidomida. En algunas realizaciones, el CMA no es un análogo de CC-220. En otras realizaciones, el CMA no es un análogo de CC-885.

En la presente memoria también se describen métodos para identificar un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) que comprenden: (i) obtener un cristal que comprende un complejo que comprende el CRBN y el compuesto, (ii) determinar la estructura tridimensional del cristal por difracción de rayos x para obtener coordenadas atómicas, y (iii) comparar dichas coordenadas atómicas con las coordenadas atómicas proporcionadas en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7, en donde un cambio o desplazamiento en las coordenadas atómicas es indicativo de un compuesto que induce dicho cambio conformacional o alteración en CRBN. En determinadas realizaciones, las coordenadas atómicas definen el dominio de unión a CMA. En la presente memoria también se describen compuestos identificados por estos métodos. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie del CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie del CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína.

5.4 Métodos para inducir un cambio conformacional o alteración en CRBN

En la presente memoria se describen métodos para inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alterar de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), comprendiendo dicho método poner en contacto el CRBN con un CMA.

En determinadas realizaciones, se induce un cambio conformacional en el bolsillo de unión a CMA. En otras realizaciones, se induce una alteración en las propiedades de la superficie del CRBN. En algunas realizaciones, se altera una superficie del CRBN adyacente al bolsillo de unión a CMA. En otras realizaciones, se alteran uno o más bucles circundantes que están adyacentes o rodean de otra forma el bolsillo de unión a CMA. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie del CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En una realización específica, el compuesto es un CMA.

En algunas realizaciones, el cambio conformacional en CRBN da como resultado una especificidad por el sustrato, actividad biológica y/o utilidad terapéutica alteradas en comparación con el CRBN en ausencia del CMA. En algunas realizaciones, el cambio conformacional en CRBN da como resultado una especificidad por el sustrato, actividad biológica y/o utilidad terapéutica alteradas en comparación con el CRBN en presencia de un CMA diferente. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN.

En la presente memoria se describe, en determinadas realizaciones, un método para inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alterar de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), que comprende poner en contacto el CRBN con un compuesto de ensayo, en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN comprende un cambio conformacional o alteración en el bolsillo de unión a CMA del CRBN que es diferente del cambio conformacional o alteración en el bolsillo de unión a CMA de un CRBN que se pone en contacto con un compuesto de referencia. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una actividad biológica diferente. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una utilidad terapéutica diferente. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una especificidad por el sustrato diferente. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a c Ma tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En la presente memoria también se describe una composición que comprende un CRBN y un compuesto de ensayo, en donde dicho CRBN tiene un cambio conformacional o alteración en comparación con un compuesto de referencia. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En la presente memoria también se describe un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) después de ponerse en contacto con dicho CRBN, en comparación con el cambio conformacional o alteración en comparación con un compuesto de referencia. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una actividad biológica diferente. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una utilidad terapéutica diferente. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una especificidad por el sustrato diferente. En algunas realizaciones, el compuesto induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto altera las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En la presente memoria también se describe un complejo que comprende un CRBN y compuesto de ensayo, en donde dicho CRBN tiene un cambio conformacional o alteración en comparación con un cambio conformacional o alteración de dicho CRBN en contacto con un compuesto de referencia. En algunas realizaciones, el CRBN tiene un cambio conformacional o alteración. En otras realizaciones, el CRBN tiene una alteración de las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En diversas realizaciones de los métodos proporcionados en la presente memoria, el compuesto es un compuesto descrito en la presente memoria (véase, p. ej., la Sección 5.8 más adelante). En otras realizaciones, el compuesto no es un compuesto descrito en la presente memoria. En diversas realizaciones de los métodos proporcionados en la presente memoria, el compuesto es un CMA. En determinadas realizaciones, el CMA es talidomida, lenalidomida, pomalidomida, 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (Compuesto A) o 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1 -oxoisoindolin-2-il)piperidina-2 ,6-diona, un estereoisómero del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En determinadas realizaciones de los métodos proporcionados en la presente memoria, el CMA no es talidomida, lenalidomida, pomalidomida, 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (Compuesto A) o 3-(4-((4-(morfolinometil)bencil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona, un estereoisómero del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización, el compuesto es lenalidomida. En otra realización, el compuesto es el Compuesto A. En algunas realizaciones, el compuesto no es talidomida. En otras realizaciones, el compuesto no es lenalidomida. En otras realizaciones, el compuesto no es el Compuesto A. En algunas realizaciones, el compuesto no es talidomida, lenalidomida, Compuesto A, o cualquier análogo de los mismos.

En determinadas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, el sustrato es una proteína asociada a CRBN.

En algunas realizaciones, la proteína asociada a CRBN es Ikaros. En otras realizaciones, la proteína asociada a CRBN es Aiolos. En algunas realizaciones, la proteína asociada a CRBN es Ikaros y Aiolos. En determinadas realizaciones, la proteína asociada a CRBN es interferón. En otras realizaciones, la proteína asociada a CRBN es una proteína de la ruta del interferón. En algunas realizaciones, la proteína de la ruta del interferón es la proteína transmembrana 3 inducida por interferón (IFITM3) y/o el factor regulador de interferón 7 (IRF7). En una realización de los métodos proporcionados en la presente memoria, la proteína asociada a CRBN es IKZF3 (Aiolos) que tiene un peso molecular de 58 kDa. En otra realización de los métodos proporcionados en la presente memoria, la proteína asociada a CRBN es IKZF3 (Aiolos) que tiene un peso molecular de 42 kDa. También se contemplan en la presente memoria otras isoformas de Ikaros y/o Aiolos. En diversas realizaciones de los métodos proporcionados en la presente memoria, la proteína asociada a CRBN es interferón, una proteína de la ruta del interferón, caseína quinasa 1, alfa 1 (CSNK1A1), o una combinación de las mismas. En otras realizaciones, la proteína asociada a CRBN es DDB1, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 o NF^kB. En diversas realizaciones de los métodos proporcionados en la presente memoria, la proteína asociada a CRBN es DDB1, PABPC1, HNRNPR, RPL19, SYNCRIP, H2AFX, HSPA8, ALDOA, HIST1H2AA, HSPA1A, XRCC6, RPL12, RPL18A, RPL4, HNRNPA2B1, HNRNPC, RPS2, SEC24C, RPL9, USP15, SEC24A, CTPS, ABCE1, EEF1A1, IPO5, CPSF6, KCNAB2, C7ORF42, SMC4, GNB3, H2AFZ, HIST1H1C, HIST1H1D, HIST1H1E, ACTB, CSNK2A1, CRBN, DDX21, DHX9, DNAJC1, G3BP1, HSPA1B, IGF2BP2, RPL10A, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL21, RPL3, RPL30, RPL7, RPL7A, RPLP1, RPLP2, MYH10, ILF3, NCL, RPS13, RPS16, RPS19, RPS6, SND1, EIF2S2, HNRNPH2, UBB, EEF1G, TBL1XR1, NACA, EIF4A1, FASN, PPAT, G3BP2, TUBA1A, UBAP2L, MCM2, UAP1, TUBA1C, EIF2S1, EIF3J, PRKDC, MCM7, RPL11, TUBA1B, STAT3, PTRH2, PABPC4, PTPRC, MACF1, UBE2O, DUT, GNB2L1, NUP88, H2AFJ, SEC23B, PDXK, ACLY, ARID1A, GBE1, HSPA9, DDX17, FUBP1, FBXO21, EWSR1, IFI16, YWHAE, UBA52, COPS6, GNAS, UBE2Q1, FERMT3, NAP1L2, TPD52, VAPA, EEF1AL3, DDIT4, NEDD8, HIST1H1A, HIST1H1B, o PCM1. También se contemplan en la presente memoria otras isoformas de las proteínas asociadas a CRBN mencionadas anteriormente.

5.4.1. Inducción de un cambio conformacional en CRBN para alterar la especificidad por el sustrato

En la presente memoria también se describen métodos para inducir un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), comprendiendo dicho método poner en contacto el CRBN con un CMA, en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una especificidad por el sustrato alterada. En determinadas realizaciones, la especificidad por el sustrato alterada es en comparación con un CRBN en ausencia del CMA. En otras realizaciones, la especificidad por el sustrato alterada es en comparación con un CRBN en presencia de un CMA diferente. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN.

En la presente memoria se describe un método para inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alterar de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), que comprende poner en contacto el CRBN con un compuesto de ensayo, en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una especificidad por el sustrato diferente en comparación con la especificidad por el sustrato de un CRBN que se pone en contacto con un compuesto de referencia. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

La especificidad por el sustrato puede evaluarse usando cualquier método conocido por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la especificidad por el sustrato se evalúa usando UbiScan. En otras realizaciones, la especificidad por el sustrato se evalúa cuantificando el nivel de una proteína o ARNm de una proteína asociada a CRBN como se describe en otra parte de la presente memoria.

5.4.2. Inducción de un cambio conformacional en CRBN para modular una actividad biológica o eficacia terapéutica

En algunas realizaciones, los cambios conformacionales en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) después del contacto con un CMA da como resultado una especificidad por el sustrato alterada, en donde la especificidad por el sustrato alterada, a su vez, modula una actividad biológica aguas abajo.

En la presente memoria se describen métodos para inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alterar de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), comprendiendo dicho método poner en contacto el CRBN con un CMA, en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado la modulación de una actividad biológica en una célula o sujeto. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN.

En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en el bolsillo de unión a CMA del CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración se evalúa usando uno cualquiera de los métodos proporcionados en la presente memoria. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína.

En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un método para identificar un compuesto de ensayo que induce una actividad biológica específica, que comprende poner en contacto el compuesto de ensayo con CRBN, inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alterar de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), y evaluar el cambio conformacional o alteración en el bolsillo de unión a CMA del CRBN, en donde el cambio conformacional o alteración es indicativo de una actividad biológica específica. En algunas realizaciones, el método comprende además ensayar la actividad biológica específica. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En determinados ejemplos, el método comprende además administrar dicho compuesto a un paciente, en donde dicha actividad biológica se modula en dicho paciente. En determinados ejemplos, el paciente tiene una enfermedad, y en donde uno o más síntomas de dicha enfermedad se alivian después de dicha administración. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie del CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie del CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la actividad biológica es un efecto tumoricida. En una realización, la actividad biológica es la modulación de la apoptosis. En otra realización, la actividad biológica es la modulación de la proliferación, p. ej., un efecto antiproliferativo. En algunas realizaciones, la actividad biológica es la modulación de la viabilidad de las PBMC. En determinadas realizaciones, la actividad biológica es la modulación de la toxicidad. En otras realizaciones, la actividad biológica es la degradación del sustrato. En determinadas realizaciones, la actividad biológica es la degradación de Aiolos y/o Ikaros. En determinadas realizaciones, la actividad biológica es una prevención de la degradación del sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato es una proteína asociada a CRBN. En algunas realizaciones, la actividad biológica es un efecto mediado por inmunidad. En determinadas realizaciones, el efecto biológico es la modulación de IL-2. En otras realizaciones más, el efecto biológico es un efecto en la hemoglobina fetal (HbF). En algunas realizaciones, el efecto es un efecto en una proteína asociada a CRBN.

En determinadas realizaciones, se observa una actividad biológica en un tipo celular, pero no en otro tipo celular. En una realización específica, la actividad biológica se correlaciona directamente con un desplazamiento conformacional en CRBN observado en el o los tipos celulares. En una realización, el desplazamiento conformacional en CRBN es en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. Dichos desplazamientos conformacionales pueden evaluarse usando cualquiera de los diversos métodos proporcionados en otro lugar de la presente memoria.

En algunas realizaciones, se observa una actividad biológica en un tipo tisular, pero no en otro tipo tisular. En una realización específica, la actividad biológica se correlaciona directamente con un desplazamiento conformacional en CRBN observado en el o los tipos tisulares. En una realización, el desplazamiento conformacional en CRBN es en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. Dichos desplazamientos conformacionales pueden evaluarse usando cualquiera de los diversos métodos proporcionados en otro lugar de la presente memoria.

En determinadas realizaciones, se observa una actividad biológica en un tipo de tumor (o cáncer), pero no en otro tipo de tumor (o cáncer). En una realización específica, la actividad biológica se correlaciona directamente con un desplazamiento conformacional en CRBN observado en el o los tipos de tumor (cáncer). En una realización, el desplazamiento conformacional en CRBN es en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. Dichos desplazamientos conformacionales pueden evaluarse usando cualquiera de los diversos métodos proporcionados en otro lugar de la presente memoria.

En algunas realizaciones, se observa una actividad biológica en un tumor sólido (o cáncer), pero no en un tumor no sólido (o cáncer) (p. ej., un tumor hematológico). En una realización específica, la actividad biológica se correlaciona directamente con un desplazamiento conformacional en CRBN observado en el o los tumores (o cánceres). En una realización, el desplazamiento conformacional en CRBN es en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. Dichos desplazamientos conformacionales pueden evaluarse usando cualquiera de los diversos métodos proporcionados en otro lugar de la presente memoria.

En algunas realizaciones, se observa una actividad biológica en un tumor no sólido (o cáncer) (p. ej., un tumor hematológico), pero no en un tumor sólido (o cáncer). En una realización específica, la actividad biológica se correlaciona directamente con un desplazamiento conformacional en CRBN observado en el o los tumores (o cánceres). En una realización, el desplazamiento conformacional en CRBN es en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. Dichos desplazamientos conformacionales pueden evaluarse usando cualquiera de los diversos métodos proporcionados en otro lugar de la presente memoria.

En determinadas realizaciones, el tumor sólido o cáncer es un tumor o cáncer de mama, riñón, ovario, colon, vejiga, cerebro, hígado o próstata. En algunas realizaciones, el tumor no sólido es un cáncer de la sangre (hematológico).

En algunas realizaciones, los tumores o cánceres ejemplares incluyen, sin limitación, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, sarcoma de Ewing, carcinoma trofoblástico gestacional, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfoma de células grandes difuso, linfoma mixto folicular, linfoma linfoblástico, rabdomiosarcoma, carcinoma testicular, tumor de wilms, carcinoma anal, carcinoma de la vejiga, carcinoma de mama, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia de células pilosas, carcinoma de cabeza y cuello, meningioma, neurofibrosoma, angiofibrosoma, carcinoma de pulmón (células pequeñas), mieloma múltiple, linfoma no de Hodgkin, linfoma folicular, carcinoma de ovario, tumores cerebrales (astrocitoma), carcinoma de cuello uterino, carcinoma colorrectal, carcinoma hepatocelular, carcinoma hepatocelular grande humano, sarcoma de Kaposi, carcinoma de pulmón (células no pequeñas), melanoma, carcinoma pancreático, carcinoma de próstata, sarcoma de tejido blando, carcinoma de mama, carcinoma colorrectal (estadio Il), tumores óseos, sarcoma osteogénico, carcinoma de ovario, fibroides uterinos, carcinoma testicular, o combinaciones de los mismos.

En la presente memoria se describe un método para inducir una actividad biológica en una célula que comprende CRBN, que comprende poner en contacto dicha célula con un compuesto de ensayo, en donde dicho compuesto induce un cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) de dicho CRBN, y en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN es en comparación con un compuesto de referencia, y en donde el cambio conformacional o alteración da como resultado dicha actividad biológica. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional o alteración en el CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie del CRBN. En algunas realizaciones, la actividad biológica es un efecto tumoricida. En otras realizaciones, la actividad biológica es un efecto en la apoptosis. En algunas realizaciones, la actividad biológica es antiproliferación. En otras realizaciones más, la actividad biológica es viabilidad de las PBMC. En algunas realizaciones, la actividad biológica es toxicidad. En determinadas realizaciones, la actividad biológica es degradación de sustrato. En una realización, la actividad biológica es degradación de Aiolos. En otras realizaciones, la actividad biológica es degradación de Ikaros. En otras realizaciones, la actividad biológica es un efecto mediado por inmunidad. En otra realización, la actividad biológica es inducción de IL-2. En algunas realizaciones, la actividad biológica es represión de IL-2. En otras realizaciones más, la actividad biológica es un efecto en la HbF. También se contempla cualquier combinación de una, dos, tres o más de las actividades biológicas mencionadas anteriormente. En determinadas realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías específicas de tipos celulares. En otras realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías específicas de tipos tisulares. En otras realizaciones más, la actividad biológica se basa en tumores sólidos o categorías de tumores sólidos. En algunas realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías de tumores no sólidos. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En el contexto de la invención, el cambio conformacional se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el compuesto de referencia es un compuesto inmunomodulador descrito en la presente memoria.

En determinadas realizaciones, la actividad biológica que se está modulando por el CMA tiene un efecto directo en la utilidad terapéutica del CMA en un sujeto.

En la presente memoria se describe un método para inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alterar de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), que comprende poner en contacto el CRBN con un compuesto, en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una utilidad terapéutica específica. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional o alteración en el CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie del CRBN. En algunas realizaciones, la utilidad terapéutica se basa en tumores sólidos o categorías de tumores sólidos. En otras realizaciones, la utilidad terapéutica se basa en categorías de tumores no sólidos. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un método para identificar un compuesto de ensayo que tiene una utilidad terapéutica específica, que comprende poner en contacto el compuesto de ensayo con CRBN, inducir un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alterar de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), y evaluar el cambio conformacional o alteración en el bolsillo de unión a CMA del CRBN, en donde un cambio conformacional o alteración es indicativo de la utilidad terapéutica específica. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En la presente memoria también se describe un compuesto de ensayo identificado por este método. En algunos ejemplos, el método comprende además administrar dicho compuesto a un paciente que tiene una enfermedad, en donde uno o más síntomas de dicha enfermedad se alivian después de dicha administración. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En determinados ejemplos de los métodos descritos en la presente memoria, el contacto en la etapa (a) se realiza in vitro. En otros ejemplos, el contacto en la etapa step (a) se realiza in vivo. En una realización, el CRBN se pone en contacto con el compuesto durante un periodo de tiempo, p. ej., de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o 55 minutos, o de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, o 24 horas, o de 2 o 3 o más días.

En algunos ejemplos de los diversos métodos descritos en la presente memoria, la utilidad terapéutica es la gestión o tratamiento de una enfermedad, trastorno asociado a CRBN o un síntoma del mismo. En otros ejemplos, la utilidad terapéutica es la gestión o tratamiento de un cáncer o tumor, o un síntoma del mismo. En algunos ejemplos, el tumor o cáncer es un cáncer de hígado, cáncer de riñón, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, sarcoma de Ewing, carcinoma trofoblástico gestacional, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfoma de células grandes difuso, linfoma mixto folicular, linfoma linfoblástico, rabdomiosarcoma, carcinoma testicular, tumor de wilms, carcinoma anal, carcinoma de la vejiga, carcinoma de mama, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia de células pilosas, carcinoma de cabeza y cuello, meningioma, neurofibrosoma, angiofibrosoma, carcinoma de pulmón (células pequeñas), mieloma múltiple, linfoma no de Hodgkin, linfoma folicular, carcinoma de ovario, tumores cerebrales (astrocitoma), carcinoma de cuello uterino, carcinoma colorrectal, carcinoma hepatocelular, carcinoma hepatocelular grande humano, sarcoma de Kaposi, carcinoma de pulmón (células no pequeñas), melanoma, carcinoma pancreático, carcinoma de próstata, sarcoma de tejido blando, carcinoma de mama, carcinoma colorrectal (estadio Il), tumores óseos, sarcoma osteogénico, carcinoma de ovario, fibroides uterinos, carcinoma testicular, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el cáncer o tumor es un linfoma, leucemia, mieloma múltiple, tumor sólido, linfoma no de Hodgkin, DLBCL, linfoma de las células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, MDS o melanoma.

En la presente memoria se describe un método para tratar o aliviar uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno mediado por CRBN en un paciente, que comprende administrar un compuesto de ensayo al sujeto, en donde dicho compuesto induce un cambio conformacional o alteración de dicho CRBN, y en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN es en comparación con un compuesto de referencia, y en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado el tratamiento o alivio de uno o más síntomas de dicha enfermedad o trastorno. En determinados ejemplos, la enfermedad o trastorno es un cáncer o tumor. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo induce un cambio conformacional o alteración en el CRBN. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo altera las propiedades de la superficie del CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones en la presente memoria se describe un compuesto (de ensayo) para su uso en un método para tratar o aliviar uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno mediado por CRBN en un paciente, en donde el método comprende administrar el compuesto (de ensayo) a un paciente, en donde dicho compuesto es como se ha descrito anteriormente.

En la presente memoria se describe un método para aliviar uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno asociado a CRBN, o un síntoma de los mismos, en un paciente, que comprende administrar un compuesto al sujeto, en donde dicho compuesto induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína) en una célula de dicho sujeto. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en el CRBN se evalúa usando un método proporcionado en otra parte de la presente memoria. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN comprende las coordenadas atómicas como se describen en una cualquiera de las Tablas 3-5, o en las FIG. 12-18 o 20. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado el alivio de uno o más síntomas de dicha enfermedad o trastorno mediado por CRBN en el paciente. En algunas realizaciones en la presente memoria se describe un compuesto para su uso en un método para aliviar uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno asociado a CRBN, o un síntoma de los mismos, en un paciente, comprendiendo el método administrar un compuesto al sujeto.

En algunas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, la enfermedad o trastorno asociado a CRBN es un cáncer o tumor. En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno asociado a CRBN no es un cáncer o tumor. En algunas realizaciones, el tumor o cáncer es un cáncer de hígado, cáncer de riñón, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, sarcoma de Ewing, carcinoma trofoblástico gestacional, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfoma de células grandes difuso, linfoma mixto folicular, linfoma linfoblástico, rabdomiosarcoma, carcinoma testicular, tumor de wilms, carcinoma anal, carcinoma de la vejiga, carcinoma de mama, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia de células pilosas, carcinoma de cabeza y cuello, meningioma, neurofibrosoma, angiofibrosoma, carcinoma de pulmón (células pequeñas), mieloma múltiple, linfoma no de Hodgkin, linfoma folicular, carcinoma de ovario, tumores cerebrales (astrocitoma), carcinoma de cuello uterino, carcinoma colorrectal, carcinoma hepatocelular, carcinoma hepatocelular grande humano, sarcoma de Kaposi, carcinoma de pulmón (células no pequeñas), melanoma, carcinoma pancreático, carcinoma de próstata, sarcoma de tejido blando, carcinoma de mama, carcinoma colorrectal (estadio Il), tumores óseos, sarcoma osteogénico, carcinoma de ovario, fibroides uterinos, carcinoma testicular, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el cáncer o tumor es un linfoma, leucemia, mieloma múltiple, tumor sólido, linfoma no de Hodgkin, DLBCL, linfoma de las células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, MDS o melanoma.

5.4.3. Métodos para ensayar una actividad biológica específica

En determinadas realizaciones de los métodos proporcionados en la presente memoria, el método comprende ensayar una actividad biológica específica. En determinadas realizaciones, la actividad biológica es degradación de sustrato. En determinadas realizaciones, el sustrato es una proteína asociada a CRBN. En algunas realizaciones, la proteína asociada a CRBN se detecta y/o cuantifica. En algunas realizaciones, los métodos comprenden: (a) poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a la proteína asociada a CRBN; (b) poner en contacto la muestra unida al primer anticuerpo con un segundo anticuerpo con un marcador detectable, en donde el segundo anticuerpo se une inmunoespecíficamente a la proteína asociada a CRBN, y en donde el segundo anticuerpo se une inmunoespecíficamente a un epítopo diferente en la proteína asociada a CRBN que el primer anticuerpo; (c) detectar la presencia del segundo anticuerpo unido a la muestra; y (d) determinar el nivel de proteína de la proteína asociada a CRBN sobre la base de la cantidad de marcador detectable en el segundo anticuerpo. En una realización, la proteína asociada a CRBN es Ikaros. En otra realización, la proteína asociada a CRBN es Aiolos. En otra realización más, la proteína asociada a CRBN es Ikaros y Aiolos. En otras realizaciones más, la proteína asociada a CRBN es interferón. En otras realizaciones, la proteína asociada a CRBN es una proteína de la ruta del interferón. En otras realizaciones, la proteína de la ruta del interferón es la proteína transmembrana 3 inducida por interferón (IFITM3) y/o el factor regulador de interferón 7 (IRF7). En otras realizaciones más, la proteína asociada a CRBN es caseína quinasa 1, alfa 1 (CSNK1A1).

En otras realizaciones, el método comprende: (a) obtener ARN de la muestra; (b) poner en contacto el ARN con un cebador que comprende una secuencia que se une específicamente a una secuencia en el ARN para generar una primera molécula de ADN que tiene una secuencia complementaria a dicho ARN; (c) amplificar el ADN correspondiente a un segmento de un gen que codifica la proteína asociada a CRBN; y (d) determinar el nivel de ARN de la proteína asociada a CRBN sobre la base de la cantidad del ADN amplificado. En una realización, la proteína asociada a CRBN es Ikaros. En otra realización, la proteína asociada a CRBN es Aiolos. En otra realización más, la proteína asociada a CRBN es Ikaros y Aiolos. En otras realizaciones más, la proteína asociada a CRBN es interferón. En otras realizaciones, la proteína asociada a CRBN es una proteína de la ruta del interferón. En otras realizaciones, la proteína de la ruta del interferón es la proteína transmembrana 3 inducida por interferón (IFITM3) y/o el factor regulador de interferón 7 (IRF7). En otras realizaciones más, la proteína asociada a CRBN es caseína quinasa 1, alfa 1 (CSNK1A1).

En determinadas realizaciones, la proteína asociada a CRBN es DDB1, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, ^aM^pK, IRF4 o NF^kB. En determinadas realizaciones, la proteína asociada a ^cR^bN es DDB1, PABPC1, HNRNPR, RPL19, SYNCRIP, H2AFX, HSPA8, ALDOA, HIST1H2AA, HSPA1A, XRCC6, RPL12, RPL18A, RPL4, HNRNPA2B1, HNRNPC, RPS2, SEC24C, RPL9, USP15, SEC24A, CTPS, ABCE1, EEF1A1, IPO5, CPSF6, KCNAB2, C7ORF42, SMC4, GNB3, H2AFZ, HIST1H1C, HIST1H1 D, HIST1H1 E, ACTB, CSNK2A1, CRBN, DDX21, DHX9, DNAJC1, G3BP1, HSPA1B, IGF2BP2, RPL10A, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL21, RPL3, RPL30, RPL7, RPL7A, RPLP1, RPLP2, MYH10, ILF3, NCL, RPS13, RPS16, RPS19, RPS6, SND1, EIF2S2, HNRNPH2, UBB, EEF1G, TBL1XR1, NACA, EIF4A1, FASN, PPAT, G3BP2, TUBA1A, UBAP2L, MCM2, UAP1, TUBA1C, EIF2S1, EIF3J, PRKDC, MCM7, RPL11, TUBA1B, STAT3, PTRH2, PABPC4, PTPRC, MACF1, UBE2O, DUT, GNB2L1, NUP88, H2AFJ, SEC23B, PDXK, ACLY, ARID1A, GBE1, HSPA9, DDX17, FUBP1, FBXO21, EWSR1, IFI16, YWHAE, UBA52, COPS6, GNAS, UBE2Q1, FERMT3, NAP1L2, TPD52, VAPA, EEF1AL3, DDIT4, NEDD8, HIST1H1A, HIST1H1B, PCM1. En algunas realizaciones, estas proteínas asociadas a CRBN se evalúan en combinación con otras proteínas asociadas a CRBN descritas en la presente memoria, tales como Ikaros, Aiolos, interferón, una proteína de la ruta del interferón, y/o caseína quinasa 1, alfa 1.

En determinadas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, las dos o más de las etapas se realizan secuencialmente. En otras realizaciones de los métodos proporcionados en la presente memoria, dos o más de las etapas se realizan en paralelo (p. ej., al mismo tiempo).

Los ensayos ejemplares proporcionados en la presente memoria para los métodos para detectar y cuantificar el nivel de proteína de la proteína asociada a CRBN son inmunoensayos tales como análisis por transferencia western, y un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) (p. ej., un ELISA en sándwich). Un ensayo ejemplar proporcionado en la presente memoria para los métodos para detectar y cuantificar el nivel de ARN de una proteína asociada a CRBN es la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), p. ej., PCR cuantitativa o qPCR.

5.4.4. Tipos de células

En determinadas realizaciones, la actividad biológica se basa en categorías específicas de tipos celulares. Dichas células pueden incluir cualquier tipo de células, p. ej., células madre, células de la sangre (p. ej., células mononucleares de sangre periférica), linfocitos, células B, células T, monocitos, granulocitos, células inmunes, o células tumorales o cancerosas.

Por ejemplo, las células B (linfocitos B) incluyen células B plasmáticas, células B de memoria, células B1, células B2, células B de la zona marginal, y células B foliculares. Las células B pueden expresar inmunoglobulinas (anticuerpos, receptor de células B). En una realización, las células son Karpas 422, TMD8, WSU-DLCL2, OCI-LY10, Karpas 1106P, HT, SUDHL-10, Riva, OCI-LY19, SUDHL-4, SUDHL-6, OCI-LY3, y Farage.

Las poblaciones de células específicas pueden obtenerse o evaluarse usando una combinación de anticuerpos disponibles comercialmente (p. ej., Quest Diagnostic (San Juan Capistrano, Calif.); Dako (Dinamarca)).

En determinadas realizaciones, la línea celular es una línea celular WSU-DLCL2 o TMD8 resistente a lenalidomida. En determinadas realizaciones, la línea celular es una línea celular de DLBCL. En algunas realizaciones, la línea celular es una línea celular de ABC-DLBCL (DLBCL similar a células B activadas), por ejemplo, la línea celular TMD8, OCI-LY10, Riva, o OCI-LY3. En otras realizaciones, la línea celular es una línea celular GCB-DLBCL (DLBCL similar a células B del centro germinal), por ejemplo, la línea celular Karpas 422, WSU-DLCL2, Karpas 1106P, HT, SUDHL-10, OCI-LY19, SUDHL-4, o SUDHL-6.

En algunas realizaciones, el número y tipo de células puede monitorizarse, por ejemplo, midiendo cambios en la morfología y en los marcadores de la superficie celular usando técnicas estándar de detección celular tales como citometría de flujo, separación celular, inmunocitoquímica (p. ej., tinción con anticuerpos específicos de tejido o específicos de marcadores celulares) separación celular activada por fluorescencia (FACS), separación celular activada por magnetismo (MACS), mediante el examen de la morfología de las células usando microscopía óptica o confocal, y/o midiendo los cambios en la expresión génica usando técnicas muy conocidas en la técnica, tales como PCR y perfilado de la expresión génica. Estas técnicas también pueden usarse para identificar células que son positivas para uno o más marcadores particulares. La separación celular activada por fluorescencia (FACS) es un método muy conocido para separar partículas, incluyendo células, sobre la base de las propiedades fluorescentes de las partículas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). La excitación con láser de restos fluorescentes en las partículas individuales da como resultado una pequeña carga eléctrica que permite la separación electromagnética de partículas positivas y negativas de una mezcla. En una realización, los anticuerpos o ligandos específicos de marcadores de la superficie celular se marcan con marcadores fluorescentes distintos. Las células se procesan a través del separador celular, permitiendo la separación de las células sobre la base de su capacidad para unirse a los anticuerpos usados. Las partículas separadas por FACS pueden depositarse directamente en pocillos individuales de placas de 96 pocillos o de 384 pocillos para facilitar su separación y clonación.

En determinadas realizaciones, se usan o detectan subconjuntos de células en los métodos proporcionados en la presente memoria. Los métodos para separar y aislar poblaciones específicas de células son muy conocidos en la técnica y pueden basarse en el tamaño, morfología celular, o en marcadores intracelulares o extracelulares. Dichos métodos incluyen, pero no están limitados a, citometría de flujo, separación por flujo, FACS, separación basada en perlas tal como separación celular magnética, separación basada en tamaño (p. ej., un tamiz, una matriz de obstáculos, o un filtro), separación en un dispositivo microfluídico, separación basada en anticuerpos, sedimentación, adsorción por afinidad, extracción por afinidad, centrifugación en gradiente de densidad, microdisección por captura con láser, etc.

En una realización, el ARN (p. ej., ARNm) o proteína se purifica y se mide la presencia o ausencia de un biomarcador por análisis de la expresión génica o de proteínas. En determinadas realizaciones, la presencia o ausencia de un biomarcador se mide por PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR), micromatrices, citometría de flujo o inmunofluorescencia. En otras realizaciones, la presencia o ausencia de un biomarcador se mide por metodologías basadas en ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) o u otros métodos similares conocidos en la técnica.

5.4.5. Métodos para detectar los niveles de ARNm en una muestra

En la técnica se conocen varios métodos para detectar o cuantificar los niveles de ARNm. Los métodos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, transferencias northern, ensayos de protección de ribonucleasa, métodos basados en PCR, y similares. La secuencia de ARNm, p. ej., el ARNm de CRBN o proteínas asociadas a CRBN, o un fragmento de la mismas, puede usarse para preparar una sonda que sea al menos parcialmente complementaria. La sonda puede usarse entonces para detectar la secuencia de ARNm en una muestra, usando cualquier ensayo adecuado, tal como métodos basados en PCR, transferencia Northern, un ensayo de tira reactiva, y similares.

En otras realizaciones, puede prepararse un ensayo de ácido nucleico para ensayar la actividad inmunomoduladora en una muestra biológica. Un ensayo contiene típicamente un soporte sólido y al menos un ácido nucleico en contacto con el soporte, donde el ácido nucleico corresponde al menos a una porción de un ARNm que tiene la expresión alterada durante el tratamiento con un inmunomodulador en un paciente, tal como el ARNm de CRBN o proteínas asociadas a CRBN. El ensayo también puede tener un medio para detectar la expresión alterada del ARNm en la muestra.

El método de ensayo puede variar dependiendo del tipo de información deseada del ARNm. Los métodos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, transferencias Northern y métodos basados en PCR (p. ej., qRT-PCR). Los métodos tales como qRT-PCR también pueden cuantificar de forma precisa la cantidad del ARNm en una muestra.

Puede usarse cualquier plataforma de ensayo adecuada para determinar la presencia del ARNm en una muestra. Por ejemplo, un ensayo puede estar en la forma de una tira reactiva, una membrana, un chip, un disco, una tira de ensayo, un filtro, una microesfera, un portaobjetos, una placa con múltiples pocillos, o una fibra óptica. Un sistema de ensayo puede tener un soporte sólido al que se une un ácido nucleico correspondiente al ARNm. El soporte sólido puede comprender, por ejemplo, un plástico, silicio, un metal, una resina, vidrio, una membrana, una partícula, un precipitado, un gel, un polímero, una lámina, una esfera, un polisacárido, un capilar, una película, una placa o un portaobjetos. Los componentes del ensayo pueden prepararse y envasarse conjuntamente como un kit para detectar un ARNm.

El ácido nucleico puede marcarse, si se desea, para preparar una población de ARNm marcados. En general, una muestra puede marcarse usando métodos que son muy conocidos en la técnica (p. ej., usando ADN ligasa, transferasa terminal, o marcando el esqueleto del ARN, etc.; véase, p. ej., Ausubel, et al., Short Protocols in MolecularBiology, 3a ed., Wiley & Sons 1995 y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, 2001 Cold Spring Harbor, N.Y.). En algunas realizaciones, la muestra se marca con un marcador fluorescente. Los colorantes fluorescentes ejemplares incluyen, pero no están limitados a, colorantes de xanteno, colorantes de fluoresceína, colorantes de rodamina, isotiocianato de fluoresceína (FITC), 6 carboxifluoresceína (FAM), 6 carboxi-2’,4’,7’,4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 6 carboxi 4’,5’ dicloro 2’,7’ dimetoxifluoresceína (JOE o J), N,N,N’,N’ tetrametil 6 carboxirodamina (TAMRA o T), 6 carboxi X rodamina (ROX o R), 5 carboxirodamina 6G (R6G5 o G5), 6 carboxirodamina 6G (R6G6 o G6), y rodamina 110; colorantes de cianina, p. ej., colorantes Cy3, Cy5 y Cy7; colorantes de Alexa, p. ej., Alexa-fluor-555; cumarina, Dietilaminocumarina, umbeliferona; colorantes de bencimida, p. ej., Hoechst 33258; colorantes de fenantridina, p. ej., Rojo Texas; colorantes de etidio; colorantes de acridina; colorantes de carbazol; colorantes de fenoxazina; colorantes de porfirina; colorantes de polimetina, colorantes BODIPY, colorantes de quinolina, Pireno, Fluoresceína Clorotriazinilo, R110, Eosina, JOE, R6G, Tetrametilrodamina, Lisamina, ROX, Naptofluoresceína, y similares.

En algunas realizaciones, las secuencias de ARNm comprenden al menos un ARNm seleccionado del grupo que consiste en el ARNm de DDB1, PABPC1, HNRNPR, RPL19, SYNCRIP, H2AFX, HSPA8, ALDOA, HIST1H2AA, HSPA1A, XRCC6, RPL12, RPL18A, RPL4, HNRNPA2B1, HNRNPC, RPS2, SEC24C, RPL9, USP15, SEC24A, CTPS, ABCE1, EEF1A1, IPO5, CPSF6, KCNAB2, C7ORF42, SMC4, GNB3, H2AFZ, HIST1H1C, HIST1H1D, HIST1H1 E, ACTB, CSNK2A1, CRBN, DDX21, DHX9, DNAJC1, G3BP1, HSPA1B, IGF2BP2, RPL10A, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL21, RPL3, RPL30, RPL7, RPL7A, RPLP1, RPLP2, MYH10, ILF3, NCL, RPS13, RPS16, RPS19, RPS6, SND1, EIF2S2, HNRNPH2, UBB, EEF1G, TBL1XR1, NACA, EIF4A1, FASN, PPAT, G3BP2, TUBA1A, UBAP2L, MCM2, UAP1, TUBA1C, EIF2S1, EIF3J, PRKDC, MCM7, RPL11, TUBA1B, STAT3, PTRH2, PABPC4, PTPRC, MACF1, UBE2O, DUT, GNB2L1, NUP88, H2AFJ, SEC23B, PDXK, ACLY, ARID1A, GBE1, HSPA9, DDX17, FUBP1, FBXO21, EWSR1, IFI16, YWHAE, UBA52, COPS6, GNAS, UBE2Q1, FERMT3, NAP1L2, TPD52, VAPA, EEF1AL3, DDIT4, NEDD8, HIST1H1A, HIST1H1B, PCM1, IKZF1, IKZF3, IFITM3, o CSNK1A1, o un fragmento de los mismos. En una realización, el ARNm es ARNm de Ikaros. En otra realización, el ARNm es ARNm de Aiolos. En otra realización, el ARNm es ARNm de IFITM3. En otra realización, el ARNm es ARNm de CSNK1A1. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en localizaciones accesibles específicas en un soporte sólido; cada una correspondiendo al menos a una porción de las secuencias de ARNm que se expresan diferencialmente después del tratamiento de un compuesto inmunomodulador en una célula o un paciente.

Un método de ensayo típico de ARNm puede contener las etapas de 1) obtención de sondas objeto unidas a una superficie; 2) hibridación de una población de ARNm a las sondas unidas a la superficie en condiciones suficientes como para proporcionar una unión específica (3) lavados posteriores a la hibridación para eliminar los ácidos nucleicos no unidos en la hibridación; y (4) detección de los ARNm hibridados. Los reactivos usados en cada una de estas etapas y sus condiciones de uso pueden variar dependiendo de la aplicación particular.

La hibridación puede llevarse a cabo en condiciones de hibridación adecuadas, que pueden variar en astringencia según se desee. Las condiciones típicas son suficientes para producir complejos sonda/diana en una superficie sólida entre miembros que se unen de forma complementaria, es decir, entre las sondas objeto unidas a la superficie y los ARNm complementarios en una muestra. En determinadas realizaciones, pueden emplearse condiciones de hibridación astringentes.

La hibridación se realiza típicamente en condiciones de hibridación astringentes. Las técnicas estándar de hibridación (p. ej., en condiciones suficientes como para proporcionar una unión específica de los ARNm diana en la muestra a las sondas) se describen en Kallioniemi et al., Science 258:818-821 (1992) y WO 93/18186. Están disponibles varias guías respecto a las técnicas generales, p. ej., Tijssen, Hybridization with Acid Nucleic Probes, Partes I y II (Elsevier, Amsterdam 1993). Para descripciones de las técnicas adecuadas para las hibridaciones in situ, véase Gall et al. Meth. Enzymol., 21:470-480 (1981); y Angerer et al. en Genetic Engineering: Principles and Methods (Setlow y Hollaender, Eds.) Vol 7, pág 43-65 (Plenum Press, Nueva York 1985). La selección de las condiciones apropiadas, incluyendo temperatura, concentración de sal, concentración de polinucleótido, tiempo de hibridación, astringencia de las condiciones de lavado, y similares dependerá del diseño experimental, incluyendo la fuente de la muestra, la identidad de los agentes de captura, el grado de complementariedad esperado, etc., y puede determinarse como parte de la experimentación rutinaria de los expertos en la técnica.

Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que pueden utilizarse condiciones alternativas, pero comparables, de hibridación y lavado para proporcionar condiciones con una astringencia similar.

Después del procedimiento de hibridación del ARNm, los polinucleótidos unidos a la superficie se lavan típicamente para eliminar los ácidos nucleicos no unidos. El lavado puede realizarse usando cualquier protocolo de lavado conveniente, donde las condiciones de lavado son típicamente astringentes, como se ha descrito anteriormente. La hibridación de los ARNm diana a las sondas se detecta entonces usando técnicas estándar.

También pueden usarse otros métodos, tales como métodos basados en PCR, para seguir la expresión de CRBN o proteínas asociadas a CRBN. Los ejemplos de métodos de PCR pueden encontrarse en la bibliografía. Los ejemplos de ensayos de PCR pueden encontrarse en la Patente de EE. UU. No. 6.927.024. Los ejemplos de métodos de RT-PCR pueden encontrarse en la Patente de EE. UU. No. 7.122.799. Un método de PCR fluorescente in situ se describe en la Patente de EE. UU. No. 7.186.507.

En algunas realizaciones, puede usarse PCR en tiempo real con transcripción inversa (qRT-PCR) tanto para la detección como para la cuantificación de dianas de ARN (Bustin, et al., 2005, Clin. Sci., 109:365-379). Los resultados cuantitativos obtenidos por qRT-PCR generalmente son datos más informativos que cualitativos. Así, en algunas realizaciones, los ensayos basados en qRT-PCR pueden ser útiles para medir los niveles de ARNm durante los ensayos basados en células. El método de qRT-PCR también es útil para monitorizar la terapia en un paciente. Los ejemplos de métodos basados en qRT-PCR pueden encontrarse, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. No. 7.101.663.

A diferencia de la PCR con transcriptasa inversa regular y el análisis por geles de agarosa, la PCR en tiempo real proporciona resultados cuantitativos. Una ventaja adicional de la PCR en tiempo real es la facilidad relativa y la conveniencia de su uso. Los instrumentos para la PCR en tiempo real, tales como el Applied Biosystems 7500, están disponibles comercialmente, como lo están los reactivos, tales como la química de detección de secuencias TaqMan. Por ejemplo, pueden usarse los ensayos de expresión génica TaqMan®, siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos kits son ensayos de expresión génica preformulados para la detección y la cuantificación rápida y fiable de transcritos de ARNm humanos, de ratón y de rata. Un programa de PCR ejemplar es, por ejemplo, 50 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 10 minutos, 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos, después 60 °C durante 1 minuto.

Para determinar el número de ciclos al que la señal de fluorescencia asociada con la acumulación de un amplicón particular cruza el umbral (referido como el CT), los datos pueden analizarse, por ejemplo, usando un software v1.3 de detección de secuencias del sistema de PCR en tiempo real 7500 usando el método de cálculo de la cuantificación relativa de CT comparativo. Usando este método, los resultados se expresan como veces de cambio de los niveles de expresión. En algunas realizaciones, el nivel de umbral puede seleccionarse para que sea determinado automáticamente por el software. En algunas realizaciones, el nivel de umbral se establece para que sea superior a la línea base, pero lo suficientemente bajo como para que esté en la región de crecimiento exponencial de una curva de amplificación.

5.4.6. Métodos para detectar niveles de polipéptidos o proteínas en una muestra

Pueden usarse varios métodos para la detección y cuantificación de proteínas para medir el nivel de las proteínas asociadas a CRBN. Puede usarse cualquier método adecuado para la cuantificación de proteínas. En algunas realizaciones, se usan métodos basados en anticuerpos. Los métodos ejemplares que pueden usarse incluyen, pero no están limitados a, inmunotransferencia (transferencia western), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunohistoquímica, citometría de flujo, matriz de perlas citométricas, espectroscopía de masa, y similares. Comúnmente, se usan varios tipos de ELISA, incluyendo ELISA directo, ELISA indirecto, y ELISA en sándwich. En una realización, la proteína asociada a CRBN es Ikaros. En otra realización, la proteína asociada a CRBN es Aiolos. En otra realización, la proteína asociada a CRBN es interferón o una proteína de la ruta del interferón. En otra realización, la proteína asociada a CRBN es caseína quinasa 1, alfa 1.

5.5 Agentes modificadores del CRBN sustrato como puente al sustrato

En la presente memoria también se describen métodos para usar CMA como un puente o “pegamento molecular” entre CRBN, o un complejo con CRBN del mismo, y un sustrato.

Se ha mostrado previamente que las moléculas pequeñas, tales como las auxinas de plantas, promueven las interacciones proteína-proteína en ubiquitina ligasas. Véase, p. ej., Tan et al. (2007) “Mechanism of auxin perception by the TIR1 ubiquitin ligase” Nature 446:640-645. Las auxinas, tal como el ácido indol-3-acético (IAA), son hormonas de plantas que controlan muchos aspectos del crecimiento de las plantas. Los estudios genéticos y moleculares recientes en Arabidopsis revelaron una ruta de señalización de auxinas intracelular crucial en la que un sistema proteolítico dependiente de ubiquitina tiene un papel clave en la detección y transducción de la señal hormonal a programas transcripcionales. En el centro de la cascada de señalización está el complejo de la ubiquitina-ligasa, SCFTIR1, que promueve la proteólisis dependiente de ubiquitina de una familia de reguladores transcripcionales conocidos como Aux/IAA de una manera dependiente de auxina. TIR1, la subunidad proteica de la caja F de SCFTIR1 funciona como el verdadero receptor de auxina. Se ha mostrado que la auxina se une directamente a SCFTIR1 y promueve la interacción entre TIR1 y Aux/IAA. Usando análisis cristalográfico, Tan et al. mostraron que TIR1 tiene un bolsillo de unión a auxina y sustrato, análogo a una habitación con tres paredes con un techo abierto. La auxina natural, IAA, se une y se conecta a la parte inferior del bolsillo de TIR1. El péptido IAA7 degron es el sustrato natural y se acopla al TIR1 unido a auxina, encerrando el bolsillo de TIR1 de tres paredes. Aunque la unión de auxina no induce cambios conformacionales significativos en el receptor hormonal TIR1, la auxina sirve para aumentar la actividad de unión a sustrato de TIR1 rellenado una cavidad entre las dos proteínas y extendiendo la interfaz de interacción de las proteínas. Después de interaccionar tanto con TIR1 como con el polipéptido sustrato, la auxina media la formación de un núcleo hidrófobo continuo entre las tres proteínas, y actúa como un “pegamento molecular” en lugar de un cambio alostérico.

Las jasomonitas son otra familia de hormonas de plantas que regulan el crecimiento, desarrollo y respuesta de las plantas al estrés. Véase, p. ej., Shears et al. (2010) “Jasmonate perception by inositol-phosphate-potentiated COI1-JAZ co-receptor” Nature 468:400-407. COI1 comparte una alta homología con TIR1 y es una proteína con la caja F que funciona como el módulo de reclutamiento del sustrato del complejo de la proteína Skp1-Cul1-caja-F (SCF) ubiquitina ligasa E3. La familia del dominio zim de jasmonato (JAZ) de represores transcripcionales son dianas sustrato de SCFCQI1, que se asocian con COI1 de una manera dependiente de hormona. Los estudios cristalográficos revelan que la interacción directa de las hormonas jasmonita tanto con COI1 como con la proteína JAZ es otro ejemplo de la utilización de un mecanismo de “pegamento molecular” para aumentar la actividad de unión al sustrato del receptor.

5.6 Reclutamiento de sustrato por los agentes modificadores de CRBN

En determinados ejemplos, en la presente memoria se describen métodos para reclutar un sustrato para la ubiquitinación por un complejo de ubiquitinación ligasa E3 que comprende CRBN. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto un CRBN con un CMA, dando lugar a un cambio tridimensional del CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA) como se describe en otra parte de la presente memoria. En algunas realizaciones, el método da como resultado un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, el método da como resultado una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En una realización específica, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado el reclutamiento y la ubiquitinación del sustrato. En determinadas realizaciones, el sustrato no se ubiquitina por el complejo de ubiquitinación ligasa E3 en ausencia del CMA. En una realización, el compuesto induce un cambio conformacional o alteración que tiene las coordenadas atómicas como se muestran en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7; o una estructura tridimensional como se muestra en una cualquiera de las FIG. 12-18 o 20. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración es en comparación con la que tiene las coordenadas atómicas como se muestran en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 5, 6 o 7; o una estructura tridimensional como se muestra en una cualquiera de las FIG. 12-18 o 20. En determinadas realizaciones, se expone un anillo de isoindolinona en la superficie de un complejo CRBN-CMA. En algunas realizaciones, el anillo de isoindolinona del complejo CRBN-CMA forma parte de una interfaz neomórfica en el reclutamiento del sustrato. En determinadas realizaciones, el potencial de enlace hidrófobo y/o polar no usado del CMA y la superficie adyacente de la proteína altera el reclutamiento del sustrato. En otras realizaciones, el potencial de enlace hidrófobo y/o polar no usado del CMA y la superficie adyacente de la proteína aumenta el reclutamiento del sustrato.

En un ejemplo, en la presente memoria se describe un método para reclutar un sustrato para la ubiquitinación por un complejo de ubiquitinación ligasa E3 que comprende CRBN, comprendiendo dicho método poner en contacto dicho CRBN con un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado el reclutamiento y ubiquitinación de dicho sustrato; y en donde dicho sustrato no se ubiquitina por dicho complejo de ubiquitinación ligasa E3 en ausencia de dicho compuesto. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración es en comparación con el bolsillo de unión a CMA cuando el CRBN se pone en contacto con un compuesto de referencia. En algunas realizaciones, se induce un cambio conformacional en CRBN. En otras realizaciones, se induce una alteración de las propiedades de una superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

En la presente memoria se describe un método para identificar un sustrato ubiquitinado por un complejo de ubiquitinación ligasa E3 que comprende CRBN, comprendiendo dicho método: (i) poner en contacto dicho CRBN con un compuesto que induce un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), en donde dicho cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado la ubiquitinación de dicho sustrato, (ii) ensayar la ubiquitinación de uno o más sustratos, e (iii) identificar dicho uno o más sustratos ubiquitinados; en donde dicho sustrato no se ubiquitina por dicho complejo de ubiquitinación ligasa E3 en ausencia de dicho compuesto. En algunas realizaciones, el compuesto induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En otras realizaciones, el compuesto altera las propiedades de la superficie de CRBN. En determinadas realizaciones, las propiedades de la superficie de CRBN se alteran por el posicionamiento de apéndices de compuesto. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en W380, W386 y/o W400 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en E377 de CRBN. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en V388 de CRBN. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración en dicho bolsillo de unión a CMA tiene un efecto en una región adyacente de la proteína. También se describe un sustrato identificado por este método. En algunas realizaciones, el cambio conformacional o alteración es en comparación con el bolsillo de unión a CMA cuando el CRBN se pone en contacto con un compuesto de referencia. En determinadas realizaciones, el cambio conformacional o alteración ocurre en un bolsillo de unión a CMA del CRBN. En el contexto de la invención, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y (c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de cambio conformacional (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) o alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína). En determinados ejemplos, el cambio conformacional o alteración se evalúa por un método que comprende (a) (i) obtener una primera estructura tridimensional de CRBN y un compuesto de referencia; (b) (i) obtener una segunda estructura tridimensional de CRBN y el compuesto de ensayo; y (c) comparar dicha primera estructura tridimensional con dicha segunda estructura tridimensional; en donde una diferencia en la primera y segunda estructuras tridimensionales es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda estructuras tridimensionales incluyen un dominio de unión a CMA del CRBN. En otros ejemplos, la estructura tridimensional se evalúa usando espectroscopía de RMN, interferometría de polarización dual, espectroscopía vibracional, o microscopía crioelectrónica. En algunas realizaciones, el CRBN se une además a DDB1, Cul4, Roc1, o cualquier combinación de los mismos.

5.7 Cambios en la distribución y abundancia del sustrato

En la presente memoria se describen métodos para modular el patrón de distribución y/o abundancia de un sustrato en una célula. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto un CRBN con un CMA, dando lugar a un cambio conformacional en CRBN (p. ej., en el bolsillo de unión a CMA del CRBN) u otra alteración de las propiedades de una superficie de CRBN (p. ej., en una región adyacente de la proteína), como se describe en otra parte de la presente memoria. En algunas realizaciones, el CRBN tiene un cambio conformacional. En otras realizaciones, el CRBN tiene una alteración de las propiedades de la superficie de CRBN. En una realización específica, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una modulación del patrón de distribución de un sustrato en una célula. En otras realizaciones, el cambio conformacional o alteración en CRBN da como resultado una modulación de la abundancia de un sustrato en una célula. En algunas realizaciones, la modulación es un incremento. En otras realizaciones, la modulación es una disminución. En determinadas realizaciones, el sustrato es una proteína asociada a CRBN.

5.8 Compuestos

Los compuestos para los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen, pero no están limitados a, los compuestos inmunomoduladores, incluyendo compuestos conocidos como "IMiD®" (Celgene Corporation), un grupo de compuestos que pueden ser útiles para tratar varios tipos de enfermedades humanas, incluyendo determinados cánceres.

Tal y como se usa en la presente memoria, y a no ser que se indique otra cosa, el término "compuesto inmunomodulador” puede englobar determinadas moléculas orgánicas pequeñas que inhiben la producción por monocitos inducida por LPS de TNF-a, IL-1B, IL-12, IL-6, MIP-1a, ^mC^p-1, GM-CSF, G-CSF, y COX-2. Estos compuestos pueden prepararse sintéticamente, o pueden obtenerse comercialmente.

Los compuestos inmunomoduladores ejemplares incluyen, pero no están limitados, a N-{[2-(2,6-dioxo(3-piperidil)-1,3-dioxoisoindolin-4-il]metil}ciclopropil-carboxamida; 3-[2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-4-ilmetil]-1,1-dimetil-urea; (-)-3-(3,4-Dimetoxi-fenil)-3-(1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-propionamida; (+)-3-(3,4-Dimetoxifenil)-3-(1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-propionamida; (-)-{2-[1 -(3-etoxi-4-metoxifenil)-2-metilsulfoniletil]-4-acetilaminoisoindolina-1,3-diona}; (+)-{2-[1-(3-etoxi-4-metoxifenil)-2-metilsulfoniletil]-4-acetilaminoisoindolina-1,3-diona}; Difluoro-metoxi SelCID; 1-ftalimido-1-(3,4-dietoxifenil)etano; 3-(3,4-dimetoxifenil)-3-(3,5-dimetoxifenil)acrilonitrilo; 1 -oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-aminoisoindolina; 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-aminoisoindolina; 4-amino-2-(3-metil-2,6-dioxo-piperidina-3-il)-isoindol-1,3-diona; 3-(3-acetoamidoftalimido)-3-(3-etoxi-4-metoxifenil)-N-hidroxipropionamida; 1 -oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-metilisoindolina; Ciclopropil-N-{2-[(1 S)-1-(3-etoxi-4-metoxifenil)-2-(metilsulfonil)etil]-3-oxoisoindolina-4-il}carboxamida; 2-(3-hidroxi-2,6-dioxopiperidin-5-il) isoindolina sustituida; N-[2-(2,6-Dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-5-ilmetil]-4-trifluorometoxibenzamida; (S)-4-cloro-N-((2-(3-metil-2,6-dioxopiperidin-3-il)-1,3-dioxoisoindolin-5-il)metil) benzamida;

[2-[(3S)-3-metil-2,6-dioxo-piperidin-3-il]-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-5-ilmetil]-amida del ácido piridina-2-carboxílico; (S)-N-((2-(3-metil-2,6-dioxopiperidin-3-il)-1,3-dioxoisoindolin-5-il)metil)-4- (trifluorometil)benzamida; 3-(2,5-dimetil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona, y similares.

La citoquina inflamatoria TNF-a, que es producida por los macrófagos y monocitos durante la inflamación aguda, causa un rango diverso de eventos de señalización en las células. Sin estar limitado a ninguna teoría particular, uno de los efectos biológicos ejercidos por los compuestos inmunomoduladores descritos en la presente memoria es la reducción de la producción de TNF-a por las células mieloides. Los compuestos inmunomoduladores descritos en la presente memoria pueden aumentar la degradación del ARNm del TNF-a.

Además, sin estar limitado por teoría, los compuestos inmunomoduladores descritos en la presente memoria también pueden ser potentes coestimuladores de las células T e incrementar la proliferación celular dramáticamente de una manera dependiente de la dosis. Los compuestos inmunomoduladores descritos en la presente memoria también pueden tener un efecto coestimulador mayor en el subconjunto de células T CD8+ que en el subconjunto de células T CD4+. Además, los compuestos pueden tener propiedades antiinflamatorias frente a respuestas de células mieloides, y además coestimulan eficientemente a las células T para producir mayores cantidades de IL-2 , IFN-^y, y aumentar la proliferación de las células T y la actividad citotóxica de las células T CD8+. Además, sin estar limitado por una teoría particular, los compuestos inmunomoduladores descritos en la presente memoria pueden ser capaces de actuar tanto indirectamente a través de la activación de citoquinas como directamente en las células asesinas naturales (“NK”) y células T asesinas naturales (“NKT”), e incrementar la capacidad de las células NK de producir citoquinas beneficiosas tales como, pero no limitadas a, IFN-y, y aumentar la actividad citotóxicas de las células NK y NKT.

Los ejemplos específicos de compuestos inmunomoduladores incluyen derivados ciano y carboxi de estirenos sustituidos tales como los descritos en la Patente de EE. UU. No. 5.929.117; 1-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-il) isoindolinas y 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidina-3-il) isoindolinas tales como las descritas en las Patentes de EE. UU. No. 5.874.448 y 5.955.476; las 2-(2,6-dioxopiperdin-3-il)-1-oxoisoindolinas tetra sustituidas descritas en la Patente de EE. UU. No. 5.798.368; 1-oxo y 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) isoindolinas (p. ej., derivados 4-metilo de talidomida), 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) ftalimidas sustituidas y 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindoles sustituidos incluyendo, pero no limitado a, los descritos en las Patentes de EE. UU. No. 5.635.517, 6.281.230, 6.316.471, 6.403.613, 6.476.052 y 6.555.554; 1 -oxo y 1,3-dioxoisoindolinas sustituidas en la posición 4 o 5 del anillo indolina (p. ej., ácido 4-(4-amino-1,3-dioxoisoindolina-2-il)-4-carbamoilobutanoico) descritas en la Patente de EE. UU. No.

6.380.239; isoindolina-1-ona e isoindolina-1,3-diona sustituida en la posición 2 con 2,6-d ioxo-3-hidroxipiperidin-5-ilo (p. ej., 2-(2,6-dioxo-3-hidroxi-5-fluoropiperidin-5-il)-4-aminoisoindolin-1-ona) descrita en la Patente de EE. UU. No.

6.458.810; una clase de amidas cíclicas no polipeptídicas descrita en las Patentes de EE. UU. No. 5.698.579 y 5.877.200; y compuestos isoindol-imida tales como los descritos en la Publicación de EE. UU. No. 2003/0045552 publicada el 6 de marzo, 2003, Publicación de EE. UU. No. 2003/0096841 publicada el 22 de mayo, 2003, y Solicitud Internacional No. PCT/US01/50401 (Publicación Internacional No. WO 02/059106). La Publicación de EE. UU. No.

2006/0205787 describe composiciones de 4-amino-2-(3-metil-2,6-dioxopiperidin-3-il)-isoindol-1,3-diona. La Publicación de EE. UU. No. 2007/0049618 describe compuestos isoindol-imida. En una realización, los compuestos inmunomoduladores no incluyen talidomida.

Diversos compuestos inmunomoduladores descritos en la presente memoria contienen uno o más centros quirales, y pueden existir como mezclas racémicas de enantiómeros o mezclas de diastereómeros. Así, en la presente memoria también se describe el uso de formas estereoméricamente puras de dichos compuestos, así como el uso de mezclas de estas formas. Por ejemplo, pueden usarse las mezclas que comprenden cantidades iguales o no iguales de los enantiómeros de un compuesto inmunomodulador particular. Estos isómeros pueden sintetizarse asimétricamente o resolverse usando técnicas estándar tales como columnas quirales o agentes de resolución quirales. Véase, p. ej., Jacques, J., et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, Nueva York, 1981); Wilen, S. H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E. L., Stereochemistry o f Carbón Compounds (McGraw-Hill, n Y, 1962); y Wilen, S. H., Tables o f Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972).

Los compuestos inmunomoduladores descritos en la presente memoria incluyen, pero no están limitados a, 1-oxo y 1,3 dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) isoindolinas sustituidas con amino en el anillo benzo como se describe en la Patente de EE. UU. no. 5.635.517.

Estos compuestos tienen la estructura I:

en la que uno de X e Y es C=O, el otro de X e Y es C=O o CH2, y R2 es hidrógeno o alquilo inferior, en particular metilo. Los compuestos inmunomoduladores específicos incluyen, pero no están limitados a:

-dioxo-2-(3-metil-2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-aminoisoindol,

e isómeros ópticamente puros de los mismos.

Los compuestos pueden obtenerse mediante métodos sintéticos estándar (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos No. 5.635.517). Los compuestos también están disponibles en Celgene Corporation, Warren, NJ.

Otros compuestos inmunomoduladores específicos pertenecen a una clase de 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) ftalimidas sustituidas y 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindoles sustituidos, tales como los descritos en las Patentes de EE. UU. No. 6.281.230; 6.316.471; 6.335.349; y 6.476.052, y en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US97/13375 (Publicación Internacional No. WO 98/03502).

Los compuestos representativos tienen la fórmula:

en la que:

uno de X e Y es C=O y el otro de X e Y es C=O o CH2;

(i) cada uno de R1, R2, R3, y R4, independientemente de los otros, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R1, R2, R3, y R4 es -NHR5 y el resto de R1, R2, R3, y R4 son hidrógeno; R5 es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono;

R6 es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, bencilo, o halo;

siempre que R6 sea distinto de hidrógeno si X e Y son C=O y (i) cada uno de R1, R2, R3, y R4 es flúor o (ii) uno de R1, R2, R3, o R4 es amino.

Los compuestos representativos de esta clase tienen las fórmulas:

en donde R1 es hidrógeno o metilo. En una realización separada, en la presente memoria se describe el uso de formas enantioméricamente puras (p. ej., enantiómeros (R) o (S) ópticamente puros) de estos compuestos.

Otros compuestos inmunomoduladores específicos adicionales descritos en la presente memoria pertenecen a una clase de isoindol-imidas descrita en la Patente de EE. UU. No. 7.091.353, Publicación de Patente de EE. UU. No.

2003/0045552, y Solicitud Internacional No. PCT/US01/50401 (Publicación Internacional No. WO 02/059106). Los compuestos representativos tienen la fórmula II:

y sales, hidratos, solvatos clatratos, enantiómeros, diastereómeros, racematos, y mezclas de estereoisómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde:

uno de X e Y es C=O y el otro es CH2 o C=O;

R1 es H, alquilo(C1-C8), cicloalquilo(C3-C7), alquenilo(C2-C8), alquinilo(C2-C8), bencilo, arilo, alquil(C0-C4)-heterocicloalquilo(C1-C6), alquil(C0-C4)-heteroarilo(C2-C5), C(O)R3, C(S)R3, ^c(^o)OR4, alquil(C1-C8)-N(R6)2 , alquil(C1-C8)-OR5, alquil(C1-C8)-C(O)OR5, C(O)NHR3, C(S)NHR3, C(O)NR3R3’, C(S)NR3R3’ o alquil(C1-C8)-O(CO)R5;

R2 es H, F, bencilo, alquilo(C1-C8), alquenilo(C2-C8), o alquinilo(C2-C8);

R3 y R3’ son independientemente alquilo(C1-C8), cicloalquilo(C3-C7), alquenilo(C2-C8), alquinilo(C2-C8), bencilo, arilo, alquil(C0-C4)-heterocicloalquilo(C1-C6), alquil(Co-C4)-heteroarilo(C2-C5), alquil(Co-C8)-N(R6)2 , alquil(C1-C8)-OR5, alquil(C1-C8)-C(O)OR5, alquil(C1-C8)-O(CO)R5, o C(O)OR5;

R4 es alquilo(C1-C8), alquenilo(C2-C8), alquinilo(C2-C8), alquil(C1-C4)-OR5, bencilo, arilo, alquil(Co-C4)-heterocicloalquilo(C1-C6), o alquil(Co-C4)-heteroarilo(C2-C5);

R5 es alquilo(C1-C8), alquenilo(C2-C8), alquinilo(C2-C8), bencilo, arilo, o heteroarilo(C2-C5);

cada aparición de R6 es independientemente H, alquilo(C1-C8), alquenilo(C2-C8), alquinilo(C2-C8), bencilo, arilo, heteroarilo(C2-C5), o alquil(Co-C8)-C(O)O-R5 o los grupos R6 pueden unirse para formar un grupo heterocicloalquilo; n es 0 o 1 ; y

* representa un centro de carbono quiral.

En compuestos específicos de fórmula II, cuando n es 0 entonces R1 es cicloalquilo(C3-C7), alquenilo(C2-C8), alquinilo(C2-C8), bencilo, arilo, alquil(C0-C4)-heterocicloalquilo(C1-C6), alquil(C0-C4)-heteroarilo(C2-C5), C(O)R3, C(O)OR4, alquil(C1-C8)-N(R6)2, alquil(C1-C8)-OR5, alquil(C1-C8)-C(O)OR5, C(S)NHR3, o alquil(C1-C8)-O(CO)R5; R2 es H o alquilo(C1-C8); y

R3 es alquilo(C1-C8), cicloalquilo(C3-C7), alquenilo(C2-C8), alquinilo(C2-C8), bencilo, arilo, alquil(C0-C4)-heterocicloalquilo(C1-C6), alquil(C0-C4)-heteroarilo(C2-C5), alquil(C5-C8)-N(R6)2 ; alquil(C0-C8)-NH-C(O)O-R5; alquil(C1-C8)-OR5, alquil(C1-C8)-C(O)OR5, alquil(C1-C8)-O(CO)R5, o C(O)OR5; y las demás variables tienen las mismas definiciones.

En otros compuestos específicos de fórmula II, R2 es H o alquilo(C1-C4).

En otros compuestos específicos de fórmula II, R1 es alquilo(C1-C8) o bencilo.

En otros compuestos específicos de fórmula II, R1 es H, alqu¡lo(Ci-C8), bencilo, CH2OCH3, CH2CH2OCH3, o

En otra realización de los compuestos de fórmula II, R1 es

en donde Q es O o S, y cada aparición de R7 es independientemente H, alquilo(Ci-C8), cicloalquilo(C3-C7), alquenilo(C2-C8), alquinilo(C2-C8), bencilo, arilo, halógeno, alquil(C0-C4)-heterocicloalquilo(C1-C6), alquil(Cü-C4)-heteroarilo(C2-C5), alquil(C0-C8)-N(R6)2, alquil(C1-C8)-OR5, alquil(C1-C8)-C(O)OR5, alquil(C1-C8)-O(CO)R5, o C(O)OR5, o las apariciones adyacentes de R7 pueden tomarse conjuntamente para formar un anillo alquilo o arilo bicíclico.

En otros compuestos específicos de fórmula II, R1 es C(O)R3.

En otros compuestos específicos de fórmula II, R3 es alquil(C0-C4)-heteroarilo(C2-C5), alquilo(C1-C8), arilo, o alquil(Cü-C4)-OR5.

En otros compuestos específicos de fórmula II, el heteroarilo es piridilo, furilo, o tienilo.

En otros compuestos específicos de fórmula II, R1 es C(O)OR4.

En otros compuestos específicos de fórmula II, el H de C(O)NHC(O) puede reemplazarse con alquilo(C1-C4), arilo, o bencilo.

Los ejemplos adicionales de compuestos en esta clase incluyen, pero no están limitados a: [2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-4-ilmetil]-amida; éster ferc-butílico del ácido (2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-4-ilmetil)-carbámico; 4-(aminometil)-2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-isoindolina-1,3-diona; N-(2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-4-ilmetil)-acetamida; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil)-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}ciclopropil-carboxamida; 2-cloro-N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}acetamida; N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)-3-piridilcarboxamida; 3-{1 -oxo-4-(bencilamino)isoindolin-2-il}piperidina-2,6-diona; 2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-4-(bencilamino)isoindolina-1,3-diona; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}propanamida; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}-3-piridilcarboxamida; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}heptanamida; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}-2-furilcarboxamida; acetato de {N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)carbamoil}metilo; N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)pentanamida; N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)-2-tienilcarboxamida; N-{[2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il]metil}(butilamino)carboxamida; N-{[2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il]metil}(octilamino)carboxamida; y N-{[2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il]metil}(bencilamino)carboxamida.

Otros compuestos inmunomoduladores específicos adicionales descritos en la presente memoria pertenecen a una clase de isoindol-imidas descrita en las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2002/0045643, Publicación Internacional No. WO 98/54170, y Patente de los Estados Unidos No. 6.395.754. Los compuestos representativos tienen la fórmula III:

uno de X e Y es C=O y el otro es CH2 o C=O;

R es H o CH2OCOR';

(i) cada uno de R1, R2, R3, o R4, independientemente de los otros, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R1, R2, R3, o R4 es nitro o -NHR5 y el resto de R1, R2, R3, o R4 son hidrógeno;

R5 es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 carbonos

R6 hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, benzo, cloro, o flúor;

R' es R7-CHR10-N(R8R9);

R7 es m-fenileno o p-fenileno o -(CnH2n)- en el que n tiene un valor de 0 a 4;

cada uno de R8 y R9 tomado independientemente del otro es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, o R8 y R9 tomados conjuntamente son tetrametileno, pentametileno, hexametileno,

o -CH2CH2X1CH2CH2- en el que X1 es -O-, -S-, o -NH-;

R10 es hidrógeno, alquilo de a 8 átomos de carbono, o fenilo; y

* representa un centro de carbono quiral.

Otros compuestos representativos tienen la fórmula:

en donde:

uno de X e Y es C=O y el otro de X e Y es C=O o CH2;

(i) cada uno de R1, R2, R3, o R4, independientemente de los otros, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R1, R2, R3, y R4 es -NHR5 y el resto de R1, R2, R3, y R4 son hidrógeno; R5 es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono;

R6 es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, benzo, cloro, o flúor;

R7 es m-fenileno o p-fenileno o -(CnH2n)- en el que n tiene un valor de 0 a 4;

cada uno de R8 y R9 tomado independientemente del otro es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, o R8 y R9 tomados conjuntamente son tetrametileno, pentametileno, hexametileno, o -CH2CH2X1CH2CH2- en el que X1 es -O-, -S-, o -NH-; y

R10 es hidrógeno, alquilo de a 8 átomos de carbono, o fenilo.

Otros compuestos representativos tienen la fórmula:

en la que

uno de X e Y es C=O y el otro de X e Y es C=O o CH2;

cada uno de R1, R2, R3, y R4, independientemente de los otros, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R1, R2, R3, y R4 es nitro o amino protegido y el resto de R1, R2, R3, y R4 son hidrógeno; y

R6 es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, benzo, cloro, o flúor.

Otros compuestos representativos tienen la fórmula:

en la que:

uno de X e Y es C=O y el otro de X e Y es C=O o CH2;

(i) cada uno de R1, R2, R3, y R4, independientemente de los otros, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R1, R2, R3, y R4 es -NHR5 y el resto de R1, R2, R3, y R4 son hidrógeno; R5 es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, o CO-R7-CH(R10)NR8R9 en el que cada uno de R7, R8, R9, y R10, es como se define en la presente memoria; y

R6 es alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, benzo, cloro, o flúor.

en la que:

uno de X e Y es C=O y el otro de X e Y es C=O o CH2;

R6 es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, bencilo, cloro, o flúor;

R7 es m-fenileno, p-fenileno o -(CnH2n)- en el que n tiene un valor de 0 a 4;

cada uno de R8 y R9 tomado independientemente del otro es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, o R8 y R9 tomados conjuntamente son tetrametileno, pentametileno, hexametileno, o -CH2CH2X1CH2CH2- en el que X1 es -O-, -S- o -NH-; y

R10 es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, o fenilo.

Otros compuestos inmunomoduladores específicos son 1-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-il) isoindolinas y 1,3 dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidina-3-il) isoindolinas tales como las descritas en las Patentes de EE. UU. No.

5.874.448 y 5.955.476. Los compuestos representativos tienen la fórmula:

en donde:

Y es oxígeno o H2 y

cada uno de R1, R2, R3, y R4, independientemente de los otros, es hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, o amino.

Otros compuestos inmunomoduladores específicos son las 2-(2,6-dioxopiperdin-3-il)-1 -oxoisoindolinas tetrasustituidas descritas en la Patente de EE. UU. No. 5.798.368. Los compuestos representativos tienen la fórmula:

en donde cada uno de R1, R2, R3, y R4, independientemente de los otros, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono.

Otros compuestos inmunomoduladores específicos son 1-oxo y 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il) isoindolinas descritas en la Patente de EE. UU. No. 6.403.613. Los compuestos representativos tienen la fórmula:

en la que

Y es oxígeno o H2,

un primero de R1 y R2 es halo, alquilo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, ciano, o carbamoílo, el segundo de R1 y R2, independientemente del primero, es hidrógeno, halo, alquilo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, ciano, o carbamoílo, y R3 es hidrógeno, alquilo, o bencilo.

Los ejemplos específicos de los compuestos tienen la fórmula:

en donde

un primero de R1 y R2 es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, dialquilamino en el que cada alquilo tiene de 1 a 4 átomos de carbono, ciano, o carbamoílo; el segundo de R1 y R2, independientemente del primero, es hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquilamino en el que alquilo tiene de 1 a 4 átomos de carbono, dialquilamino en el que cada alquilo tiene de 1 a 4 átomos de carbono, ciano, o carbamoílo; y

R3 es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o bencilo. Los ejemplos específicos incluyen, pero no están limitados a, 1 -oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4-metilisoindolina.

Otros compuestos representativos tienen la fórmula:

en donde:

R3 es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o bencilo.

Otros compuestos inmunomoduladores específicos descritos en la presente memoria son 1-oxo y 1,3-dioxoisoindolinas sustituidas en la posición 4 o 5 del anillo indolina descritas en la Patente de EE. UU. No. 6.380.239 y Patente de EE. UU. No. 7.244.759. Los compuestos representativos tienen la fórmula:

en la que el átomo de carbono designado C* constituye un centro de quiralidad (cuando n no es cero y R1 no es el mismo que R2); uno de X1 y X2 es amino, nitro, alquilo de uno a seis carbonos, o NH-Z, y el otro de X1 o X2 es hidrógeno; cada uno de R1 y R2 independiente del otro, es hidroxi o NH-Z; R3 es hidrógeno, alquilo de uno a seis carbonos, halo, o haloalquilo; Z es hidrógeno, arilo, alquilo de uno a seis carbonos, formilo, o acilo de uno a seis carbonos; y n tiene un valor de 0, 1, o 2;

siempre que, si X1 es amino, y n es 1 o 2, entonces R1 y R2 no son ambos hidroxi; y las sales de los mismos.

Los compuestos representativos adicionales tienen la fórmula:

en la que el átomo de carbono designado C* constituye un centro de quiralidad cuando n no es cero y R1 no es R2; uno de X1 y X2 es amino, nitro, alquilo de uno a seis carbonos, o NH-Z, y el otro de X1 o X2 es hidrógeno; cada uno de R1 y R2 independiente del otro, es hidroxi o NH-Z; R3 es alquilo de uno a seis carbonos, halo, o hidrógeno; Z es hidrógeno, arilo o un alquilo o acilo de uno a seis carbonos; y n tiene un valor de 0, 1, o 2.

Los ejemplos específicos incluyen, pero no están limitados a, ácido 2-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-4-carbamoil-butírico y ácido 4-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-4-cabamoil-butírico, que tienen las siguientes estructuras, respectivamente, y sales, solvatos, profármacos, y estereoisómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos:

Otros compuestos representativos tienen la fórmula:

en la que el átomo de carbono designado C* constituye un centro de quiralidad cuando n no es cero y R1 no es R2; uno de X1 y X2 es amino, nitro, alquilo de uno a seis carbonos, o NH-Z, y el otro de X1 o X2 es hidrógeno; cada uno de R1 y R2 independiente del otro, es hidroxi o NH-Z; R3 es alquilo de uno a seis carbonos, halo, o hidrógeno; Z es hidrógeno, arilo, o un alquilo o acilo de uno a seis carbonos; y n tiene un valor de 0, 1, o 2; y las sales de los mismos.

Los ejemplos específicos incluyen, pero no están limitados a, ácido 4-carbamoil-4-{4-[(furan-2-il-metil)-amino]-1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il}-butírico, ácido 4-carbamoil-2-{4-[(furan-2-il-metil)-amino]-1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il}-butírico, ácido 2-{4-[(furan-2-il-metil)-amino]-1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il}-4-fenilcarbamoil-butírico, y ácido 2-{4-[(furan-2-il-metil)-amino]-1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il}-pentanodioico, que tienen las siguientes estructuras, respectivamente, y las sales, solvato, profármacos, y estereoisómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos:

Otros ejemplos específicos de los compuestos tienen la fórmula:

en donde:

uno de X1 y X2 es nitro, o NH-Z, y el otro de X1 o X2 es hidrógeno;

cada uno de R1 y R2, independiente del otro, es hidroxi o NH-Z;

R3 es alquilo de uno a seis carbonos, halo, o hidrógeno;

Z es hidrógeno, fenilo, un acilo de uno a seis carbonos, o un alquilo de uno a seis carbonos; y

n tiene un valor de 0, 1, o 2; y

si -COR2 y -(CH2)nCOR1 son diferentes, el átomo de carbono designado C* constituye un centro de quiralidad. Otros compuestos representativos tienen la fórmula:

en donde:

uno de X1 y X2 es alquilo de uno a seis carbonos;

cada uno de R1 y R2, independiente del otro, es hidroxi o NH-Z;

R3 es alquilo de uno a seis carbonos, halo, o hidrógeno;

n tiene un valor de 0, 1, o 2; y

si -COR2 y -(CH2)nCOR1 son diferentes, el átomo de carbono designado C* constituye un centro de quiralidad. Otros compuestos inmunomoduladores específicos adicionales son isoindolina-1-ona e isoindolina-1,3-diona sustituida en la posición 2 con 2,6-dioxo-3-hidroxipiperidin-5-ilo descritos en la Patente de EE. UU. No. 6.458.810. Los compuestos representativos tienen la fórmula:

en donde:

los átomos de carbono designados * constituyen centros de quiralidad;

X es -C(O)- o -CH2-;

R1 es alquilo de 1 a 8 átomos de carbono o -NHR3;

R2 es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, o halógeno; y

R3 es hidrógeno,

alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, no sustituido o sustituido con alcoxi de 1 a 8 átomos de carbono, halo, amino, o alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono,

cicloalquilo de 3 a 18 átomos de carbono,

fenilo, no sustituido o sustituido con alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 8 átomos de carbono, halo, amino, o alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono,

bencilo, no sustituido o sustituido con alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 8 átomos de carbono, halo, amino, o alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono, o -COR4 en el que

R4 es hidrógeno,

cicloalquilo de 3 a 18 átomos de carbono,

fenilo, no sustituido o sustituido con alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 8 átomos de carbono, halo, amino, o alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono, o

bencilo, no sustituido o sustituido con alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 8 átomos de carbono, halo, amino, o alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono.

Otros compuestos específicos descritos en la presente memoria tienen la fórmula:

y sales, solvatos y estereoisómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde:

R1 es: hidrógeno; halo; -(CH2)nOH; alquilo(C1-C6), sustituido opcionalmente con uno o más halo;

alcoxi(C1-C6), sustituido opcionalmente con uno o más halo; o

-(CH2)nNHRa, en donde Ra es:

hidrógeno;

alquilo(C1-C6), sustituido opcionalmente con uno o más halo;

-(CH2)n-(arilo de 6 a 10 miembros);

-C(O)-(CH2)n-(arilo de 6 a 10 miembros) o -C(O)-(CH2)n-(heteroarilo de 6 a 10 miembros), en donde el arilo o heteroarilo está sustituido opcionalmente con uno o más de: halo; -SCF3; alquilo(C1-C6), en sí mismo sustituido opcionalmente con uno o más halo; o alcoxi(C1-C6), en sí mismo sustituido opcionalmente con uno o más halo;

-C(O)-alquilo(C1-C8), en donde el alquilo está sustituido opcionalmente con uno o más halo;

-C(O)-(CH2)n-(cicloalquilo-C3-C1ü);

-C(O)-(CH2)n-NRbRc, en donde Rb y Rc son cada uno independientemente:

hidrógeno;

alquilo(C1-C6), sustituido opcionalmente con uno o más halo;

alcoxi(C1-C6), sustituido opcionalmente con uno o más halo; o

arilo de 6 a 10 miembros, sustituido opcionalmente con uno o más de: halo;

alquilo(C1-C6), en sí mismo sustituido opcionalmente con uno o más halo; o alcoxi(C1-C6), en sí mismo sustituido opcionalmente con uno o más halo;

-C(O)-(CH2)n-O-alquilo(C1-C6); o

-C(O)-(CH2)n-O-(CH2)n-(arilo de 6 a 10 miembros);

R2 es: hidrógeno; -(CH2)nOH; fenilo; -O-alquilo(C1-C6); o alquilo(C1-C6), sustituido opcionalmente con uno o más halo; R3 es: hidrógeno; o alquilo(Ci-C6), sustituido opcionalmente con uno o más halo; y

n es 0, 1, o 2.

Los ejemplos específicos incluyen, pero no están limitados a, 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (“Compuesto A”), que tiene la siguiente estructura:

El Compuesto A puede prepararse como se describe en la Pat. de EE. UU. No. 7.635.700. El compuesto también puede sintetizarse según otros métodos evidentes para los expertos en la técnica sobre la base de la enseñanza de la presente memoria. En determinadas realizaciones, el Compuesto A está en una forma cristalina descrita en US2012232100. En algunas realizaciones, se usa la sal hidrocloruro del Compuesto A en los métodos proporcionados en la presente memoria. Los métodos para tratar, prevenir y/o gestionar cánceres y otras enfermedades usando el Compuesto A se describen en US2012230983.

Los ejemplos específicos incluyen, pero no están limitados a lenalidomida, que tiene la siguiente estructura:

La lenalidomida puede prepararse como se describe en WO2012/149299. El compuesto también puede sintetizarse según otros métodos evidentes para los expertos en la técnica sobre la base de la enseñanza de la presente memoria. Otros compuestos específicos descritos en la presente memoria tienen la fórmula:

o una sal, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde:

X es C=O o CH2;

R1 es -Y-R3;

R2 es H o alquilo(C1-C6);

Y es: arilo, heteroarilo o heterociclo de 6 a 10 miembros, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente con uno o más halógeno; o un enlace;

R3 es: -(CH2)n-arilo, -O-(CH2)n-arilo o -(CH2)n-O-arilo, en donde el arilo está sustituido opcionalmente con uno o más: alquilo(C1-C6), en sí mismo sustituido opcionalmente con uno o más halógenos; alcoxi(C1-C6), en sí mismo sustituido con uno o más halógenos; oxo; amino; carboxilo; ciano; hidroxilo; halógeno; deuterio; arilo o heteroarilo de 6 a 10 miembros, sustituido opcionalmente con uno o más alquilo(Ci-C6), alcoxi(Ci-C6) o halógeno; -CONH2; o -COO-alquilo(Ci-C6), en donde el alquilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más halógenos;

-(CH2)n-heterociclo, -O-(CH2)n-heterociclo o -(CH2)n-O-heterociclo, en donde el heterociclo está sustituido opcionalmente con uno o más: alquilo(C1-C6), en sí mismo sustituido opcionalmente con uno o más halógenos; alcoxi(C1-C6), en sí mismo sustituido con uno o más halógenos; oxo; amino; carboxilo; ciano; hidroxilo; halógeno; deuterio; arilo o heteroarilo de 6 a 10 miembros, sustituido opcionalmente con uno o más alquilo(C1-C6), alcoxi(C1-C6) o halógeno; -CONH2; o -COO-alquilo(C1-C6), en donde el alquilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más halógenos; o -(CH2)n-heteroarilo, -O-(CH2)n-heteroarilo o -(CH2)n-O-heteroarilo, en donde el heteroarilo está sustituido opcionalmente con uno o más: alquilo(C1-C6), en sí mismo sustituido opcionalmente con uno o más halógenos; alcoxi(C1-C6), en sí mismo sustituido con uno o más halógenos; oxo; amino; carboxilo; ciano; hidroxilo; halógeno; deuterio; arilo o heteroarilo de 6 a 10 miembros, sustituido opcionalmente con uno o más alquilo(C1-C6), alcoxi(C1-C6) o halógeno; -CONH2; o -COO-alquilo(C1-C6), en donde el alquilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más halógenos; y n es 0, 1,2 o 3.

Todos los compuestos descritos pueden bien adquirirse comercialmente o prepararse según los métodos descritos en las patentes o publicaciones de patente descritas en la presente memoria. Además, los compuestos ópticamente puros pueden sintetizarse asimétricamente o resolverse usando agentes de resolución o columnas quirales conocidos, así como otras técnicas estándar de química orgánica sintética. La información adicional sobre compuestos inmunomoduladores, su preparación, y uso puede encontrarse, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2006/0188475, 2006/0205787, y 2007/0049618.

Los compuestos pueden ser moléculas orgánicas pequeñas que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 1.000 g/mol, y no son proteínas, péptidos, oligonucleótidos, oligosacáridos u otras macromoléculas.

En determinadas realizaciones de los diversos métodos proporcionados en la presente memoria, un CMA es un compuesto inmunomodulador descrito en la presente memoria. En otras realizaciones, un CMA no es un compuesto inmunomodulador descrito en la presente memoria.

Debe indicarse que, si hay una discrepancia entre una estructura representada y un nombre dado a esa estructura, debe darse más peso a la estructura representada. Además, si la estereoquímica de una estructura o una porción de una estructura no se indica, por ejemplo, con negrita o líneas punteadas, debe interpretarse que la estructura o porción de la estructura engloba todos sus estereoisómeros.

5.9 Tratamiento para pacientes con una enfermedad mediada por CRBN.

La Sección 5.9 se describe solo como referencia. El término "proporcionado" en esta sección significa "descrito". El término "realización o realizaciones" en esta sección significa "ejemplo o ejemplos". En la presente memoria también se proporciona un método para tratar y prevenir una enfermedad mediada por CRBN, que comprende administrar a un paciente un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En determinadas realizaciones, la enfermedad o trastorno mediado por CRBN es un cáncer. En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un compuesto proporcionado en la presente memoria para su uso en un método para tratar y prevenir una enfermedad mediada por CRBN, comprendiendo el método administrar a un paciente el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra realización, en la presente memoria se proporciona un método para gestionar una enfermedad mediada por CRBN, que comprende administrar a un paciente un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En determinadas realizaciones, la enfermedad o trastorno mediado por CRBN es un cáncer. En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un compuesto proporcionado en la presente memoria para su uso en un método para gestionar una enfermedad mediada por CRBN, comprendiendo el método administrar a un paciente el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo.

En la presente memoria se proporcionan métodos para tratar o gestionar linfoma, particularmente linfoma no de Hodgkin. En algunas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan métodos para el tratamiento o gestión de linfoma no de Hodgkin (NHL), incluyendo, pero no limitado a, linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), usando factores de pronóstico. En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un compuesto proporcionado en la presente memoria para su uso en un método para tratar o gestionar linfoma, particularmente linfoma no de Hodgkin.

En la presente memoria también se proporcionan métodos para tratar pacientes que han sido tratados previamente para una enfermedad o trastorno mediado por CRBN (p. ej., un cáncer) per que no responden a las terapias estándar, así como aquellos que no han sido tratados previamente. En la presente memoria también se proporcionan métodos para tratar pacientes independientemente de la edad del paciente, aunque algunas enfermedades o trastornos son más comunes en determinados grupos de edad. En la presente memoria también se proporcionan métodos para tratar pacientes que han sido sometidos a cirugía en un intento de tratar la enfermedad o afección en cuestión, así como aquellos que no han sido sometidos a cirugía. En algunas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan compuestos proporcionados en la presente memoria para su uso en métodos para tratar pacientes como se ha mencionado anteriormente.

Debido a que los pacientes con cáncer tienen manifestaciones clínicas heterogéneas y diversos resultados clínicos, el tratamiento proporcionado a un paciente puede variar, dependiendo de su pronóstico. El médico experto será capaz de determinar fácilmente sin experimentación excesiva los agentes secundarios específicos, tipos de cirugía, y tipos de terapia estándar no basada en fármacos que pueden usarse de manera efectiva para tratar a un paciente individual con cáncer.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "cáncer” incluye, pero no está limitado a, tumores sólidos y tumores hemáticos. El término "cáncer” se refiere a una enfermedad de los tejidos de la piel, órganos, sangre, y vasos, incluyendo, pero no limitado a, cánceres de la vejiga, huesos, sangre, cerebro, mama, cuello uterino, pecho, colon, endometrio, esófago, ojo, cabeza, riñón, hígado, nodos linfáticos, pulmón, boca, cuello, ovarios, páncreas, próstata, recto, estómago, testículos, garganta, y útero. Los cánceres específicos incluyen, pero no están limitados a, malignidad avanzada, amiloidosis, neuroblastoma, meningioma, hemangiopericitoma, metástasis cerebrales múltiples, glioblastoma multiforme, glioblastoma, glioma del tronco cerebral, tumor cerebral maligno con mal pronóstico, glioma maligno, glioma maligno recurrente, astrocitoma anaplásico, oligodendroglioma anaplásico, tumor neuroendocrino, adenocarcinoma rectal, cáncer colorrectal C y D de Dukes, carcinoma colorrectal no reseccionable, carcinoma hepatocelular metastásico, sarcoma de Kaposi, leucemia mieloblástica aguda con cariotipo, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma de células T cutáneo, linfoma de células B cutáneo, linfoma de células B grandes difuso, linfoma folicular de grado bajo, melanoma maligno, mesotelioma maligno, síndrome de mesotelioma con efusión pleural maligna, carcinoma peritoneal, carcinoma seroso papilar, sarcoma ginecológico, sarcoma de tejido blando, escleroderma, vasculitis cutánea, histiocitosis de células de Langerhans, leiomiosarcoma, fibrodisplasia osificante progresiva, cáncer de próstata refractario a hormonas, sarcoma de tejido blando de alto riesgo reseccionado, carcinoma hepatocelular no reseccionable, macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma quiescente, mieloma indolente, cáncer de las trompas de falopio, cáncer de próstata independiente de andrógenos, cáncer de próstata no metastásico en estadio IV dependiente de andrógenos, cáncer de próstata insensible a hormonas, cáncer de próstata insensible a quimioterapia, carcinoma de tiroides papilar, carcinoma de tiroides folicular, carcinoma de tiroides medular, y leiomioma.

En determinadas realizaciones, el cáncer es un tumor hemático. En determinadas realizaciones, el tumor hemático es metastásico. En determinadas realizaciones, el tumor hemático es resistente a fármacos. En determinadas realizaciones, el cáncer es mieloma o linfoma.

En determinadas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido. En determinadas realizaciones, el tumor sólido es metastásico. En determinadas realizaciones, el tumor sólido es resistente a fármacos. En determinadas realizaciones, el tumor sólido es carcinoma hepatocelular, cáncer de próstata, cáncer de ovario, o glioblastoma.

En una realización, en la presente memoria se proporcionan métodos para prevenir el mieloma múltiple recidivante/refractario en pacientes con la función renal deteriorada o un síntoma del mismo, que comprende administrar una cantidad efectiva de un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, tautómero o mezclas racémicas farmacéuticamente aceptables del mismo a un paciente que presenta riesgo de tener mieloma múltiple recidivante/refractario con la función renal deteriorada. En una realización, en la presente memoria se proporcionan compuestos proporcionados en la presente memoria para su uso en los métodos mencionados anteriormente.

En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan métodos para tratar, prevenir, y/o gestionar el mieloma múltiple recidivante/refractario en pacientes con la función renal deteriorada. En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan compuestos proporcionados en la presente memoria para su uso en métodos para tratar, prevenir, y/o gestionar el mieloma múltiple recidivante/refractario en pacientes con la función renal deteriorada.

En determinadas realizaciones, una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva del compuesto es de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 1.000 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 500 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 250 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente

100 mg por día, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg por día, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 mg por día, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 25 mg por día, o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 10 mg por día.

En determinada realización, una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva es de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 1.000 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 500 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 250 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg por día, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg por día, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 mg por día, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg por día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg por día, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 25 mg por día, o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 10 mg cada dos días.

En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva es aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,2, aproximadamente 0,3, aproximadamente 0,5, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, o aproximadamente 150 mg por día.

En una realización, el rango de dosis diario recomendado de un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, para las afecciones descritas en la presente memoria se encuentra en el rango de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg por día, preferiblemente proporcionado como una única dosis una vez por día, o en dosis divididas a lo largo de un día. En algunas realizaciones, la dosificación varía de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg por día. En otras realizaciones, la dosificación varía de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 mg por día. Las dosis específicas por día incluyen 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0. 3, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 mg por día.

En una realización específica, la dosificación de partida recomendada puede ser 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 o 50 mg por día. En otra realización, la dosificación de partida recomendada puede ser 0,5, 1, 2, 3, 4, o 5 mg por día. Se puede aumentar la escala de la dosis hasta 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 y 50 mg/día. En una realización específica, el compuesto puede administrarse en una cantidad de aproximadamente 25 mg/día a pacientes con NHL (p. ej., DLBCL). En una realización particular, el compuesto puede administrarse en una cantidad de aproximadamente 10 mg/día a pacientes con NHL (p. ej., DLBCL).

En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva es de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg/día, de aproximadamente

0,01 a aproximadamente 25 mg/kg/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 9 mg/kg/día, 0,01 a aproximadamente 8 mg/kg/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 7 mg/kg/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 6 mg/kg/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 4 mg/kg/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 3 mg/kg/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2 mg/kg/día, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 mg/kg/día.

La dosis administrada también puede expresarse en unidades distintas de mg/kg/día. Por ejemplo, las dosis para la administración parenteral pueden expresarse como mg/m2/día. Un experto en la técnica sabría fácilmente como convertir dosis de mg/kg/día a mg/m2/día para una altura o peso dado de un sujeto o ambos (véase, www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm). Por ejemplo, una dosis de 1 mg/kg/día para un ser humano de 65 kg es aproximadamente igual a 38 mg/m2/día.

En determinadas realizaciones, la cantidad del compuesto administrada es suficiente para proporcionar una concentración plasmática del compuesto en estado estacionario, que varía de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 500 pM, aproximadamente 0,002 a aproximadamente 200 pM, aproximadamente 0,005 a aproximadamente 100 pM, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 pM, aproximadamente 0,02 a aproximadamente 25 pM, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 pM, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 pM.

En otras realizaciones, la cantidad del compuesto administrada es suficiente para proporcionar una concentración plasmática del compuesto en estado estacionario, que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nM, aproximadamente 5 a aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nM, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nM o de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nM.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "concentración plasmática en estado estacionario” es la concentración alcanzada después de un periodo de administración de un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. Una vez se alcanza el estado estacionario, hay picos y valles menores en la curva dependiente del tiempo de la concentración plasmática del compuesto.

En determinadas realizaciones, la cantidad del compuesto administrada es suficiente para proporcionar una concentración plasmática máxima (concentración pico) del compuesto, que varía de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 500 pM, aproximadamente 0,002 a aproximadamente 200 pM, aproximadamente 0,005 a aproximadamente 100 pM, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 pM, aproximadamente 0,02 a aproximadamente 25 pM, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 pM, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 pM.

En determinadas realizaciones, la cantidad del compuesto administrada es suficiente para proporcionar una concentración plasmática mínima (concentración valle) del compuesto, que varía de aproximadamente 0,001 a aproximadamente

500 pM, aproximadamente 0,002 a aproximadamente 200 pM, aproximadamente 0,005 a aproximadamente 100 pM, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 pM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 pM, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 25 pM, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 20 pM, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 20 pM, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 pM.

En determinadas realizaciones, la cantidad del compuesto administrada es suficiente para proporcionar un área bajo la curva (AUC) del compuesto, que varía de aproximadamente 100 a aproximadamente 100.000 ng*hr/mL, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 50.000 ng*hr/mL, de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 25.000 ng*hr/mL, o de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 10.000 ng*hr/mL.

En determinadas realizaciones, el paciente que se va a tratar con uno de los métodos proporcionados en la presente memoria no ha sido tratado con una terapia anticancerosa antes de la administración de un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En determinadas realizaciones, el paciente que se va a tratar con uno de los métodos proporcionados en la presente memoria ha sido tratado con una terapia anticancerosa antes de la administración de un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En determinadas realizaciones, el paciente que se va a tratar con uno de los métodos proporcionados en la presente memoria ha desarrollado resistencia a fármacos a la terapia anticancerosa.

Los métodos proporcionados en la presente memoria engloban el tratamiento de un paciente independientemente de la edad del paciente, aunque algunas enfermedades o trastornos son más comunes en determinados grupos de edad. Además, en la presente memoria se proporciona un método para tratar un paciente que ha sido sometido a cirugía en un intento de tratar la enfermedad o afección en cuestión, así como aquellos que no han sido sometidos a cirugía. Debido a que los sujetos con cáncer tienen manifestaciones clínicas heterogéneas y diversos resultados clínicos, el tratamiento proporcionado a un sujeto particular puede variar, dependiendo de su pronóstico. El médico experto será capaz de determinar fácilmente sin experimentación excesiva los agentes secundarios específicos, tipos de cirugía, y tipos de terapia estándar no basada en fármacos que pueden usarse de manera efectiva para tratar a un sujeto individual con cáncer

Dependiendo de la enfermedad que se va a tratar y de la condición del sujeto, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, puede administrarse por las rutas de administración oral, parenteral (p. ej., inyección o infusión intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, CIV, intracistemal, inyección o implante subcutáneo), inhalación, nasal, vaginal, rectal, sublingual, o tópica (p. ej., transdérmica o local). Un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, puede formularse solo o conjuntamente, en una unidad de dosificación adecuada con excipientes, transportadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables, apropiados para cada ruta de administración.

En una realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra oralmente. En otra realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra parenteralmente. En otra realización más, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra intravenosamente.

Un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, puede administrarse como una única dosis tal como, p. ej., una única inyección en bolo, o comprimidos o píldoras orales; o durante el tiempo, tal como, p. ej., infusión continua en el tiempo o dosis en bolo divididas en el tiempo. El compuesto puede administrarse repetidamente, si es necesario, por ejemplo, hasta que el paciente experimente enfermedad estable o regresión, o hasta que el paciente experimente progresión de la enfermedad o toxicidad inaceptable. Por ejemplo, la enfermedad estable para los tumores sólidos significa generalmente que el diámetro perpendicular de las lesiones mensurables no se ha incrementado un 25 % o más desde la última medición. Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) Guidelines, Journal o f the National Cáncer Institute 92(3): 205-216 (2000). La enfermedad estable o ausencia de la misma se determina por métodos conocidos en la técnica tales como la evaluación de los síntomas del paciente, examen físico, visualización del tumor del que se han obtenido imágenes usando rayos X, CAT, PET, o escaneo MRI y otras modalidades de evaluación aceptadas comúnmente.

Un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, puede administrarse una vez al día (QD), o puede dividirse en múltiples dosis diarias tal como dos veces al día (BID), tres veces al día (TID), y cuatro veces al día (QID). Además, la administración puede ser continua (es decir, diariamente durante días consecutivos o cada día), intermitente, p. ej., en ciclos (es decir, incluyendo días, semanas, o meses de descanso sin el fármaco). Tal y como se usa en la presente memoria, el término "diariamente" se pretende que signifique que un compuesto terapéutico se administra una vez o más de una vez cada día, por ejemplo, durante un periodo de tiempo. El término "continuo" se pretende que signifique que un compuesto terapéutico se administra diariamente durante un periodo ininterrumpido de al menos 10 días a 52 semanas. El término "intermitente” o "intermitentemente", tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que signifique parar y empezar a intervalos bien regulares o irregulares. Por ejemplo, la administración intermitente de un compuesto proporcionado en la presente memoria es la administración durante uno a seis días por semana, la administración en ciclos (p. ej., administración diaria durante dos a ocho semanas consecutivas, después un periodo de descanso sin administración durante hasta una semana), o la administración en días alternos. El término "ciclado", tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que signifique que un compuesto terapéutico se administra diariamente o continuamente pero con un periodo de descanso.

En algunas realizaciones, la frecuencia de la administración está en el rango de aproximadamente una dosis diaria a aproximadamente una dosis mensual. En determinadas realizaciones, la administración es una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día, una vez cada dos días, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez cada cuatro semanas. En una realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra una vez al día. En otra realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra dos veces al día. En otra realización más, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra tres veces al día. En otra realización más, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra cuatro veces al día.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra una vez al día de un día a seis meses, de una semana a tres meses, de una semana a cuatro semanas, de una semana a tres semanas, o de una semana a dos semanas. En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra una vez al día durante una semana, dos semanas, tres semanas, o cuatro semanas. En una realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra una vez al día durante una semana. En otra realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra una vez al día durante dos semanas. En otra realización más, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra una vez al día durante tres semanas. En otra realización más, un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra una vez al día durante cuatro semanas.

5.10 Terapia de combinación con un segundo agente activo

La Sección 5.10 se describe solo como referencia. El término "proporcionado" en esta sección significa "descrito". El término "realización o realizaciones" en esta sección significa "ejemplo o ejemplos". Un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, también puede combinarse o usarse en combinación con otros agentes terapéuticos útiles en el tratamiento y/o prevención del cáncer descritos en la presente memoria.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "en combinación” incluye el uso de más de una terapia (p. ej., uno o más agentes profilácticos y/o terapéuticos). Sin embargo, el uso del término "en combinación” no restringe el orden en el que se administran las terapias (p. ej., agentes profilácticos y/o terapéuticos) a un paciente con una enfermedad o trastorno. Una primera terapia (p. ej., un agente profiláctico o terapéutico tal como un compuesto proporcionado en la presente memoria, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo) puede administrarse antes de (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas antes de), concomitantemente con, o posteriormente a (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas después de) la administración de una segunda terapia (p. ej., un agente profiláctico o terapéutico) al sujeto. En la presente memoria también se contempla la triple terapia.

La administración de un compuesto proporcionado en la presente memoria y uno o más segundos agentes activos a un paciente puede ocurrir simultáneamente o secuencialmente por la misma o diferentes rutas de administración. La idoneidad de una ruta de administración particular empleada para un agente activo particular dependerá del agente activo en sí mismo (p. ej., si puede administrarse oralmente sin descomponerse antes de entrar en la corriente sanguínea) y del cáncer que se está tratando.

La ruta de administración de un compuesto proporcionado en la presente memoria es independiente de la ruta de administración de una segunda terapia. En una realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria se administra oralmente. En otra realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria se administra intravenosamente. Así, según estas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria se administra oralmente o intravenosamente, y la segunda terapia puede administrarse oralmente, parenteralmente, intraperitonealmente, intravenosamente, intraarterialmente, transdérmicamente, sublingualmente, intramuscularmente, rectalmente, transbucalmente, intranasalmente, liposomalmente, mediante inhalación, vaginalmente, intraocularmente, mediante administración local por catéter o estent, subcutáneamente, intraadiposamente, intraarticularmente, intratecalmente, o en una forma de dosificación de liberación lenta. En una realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria y una segunda terapia se administran por el mismo modo de administración, oralmente o por IV. En otra realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria se administra por un modo de administración, p. ej., por IV, mientras el segundo agente (un agente anticanceroso) se administra por otro modo de administración, p. ej., oralmente.

En una realización, el segundo agente activo se administra intravenosamente o subcutáneamente y una o dos veces diariamente en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 mg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 350 mg, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 mg. La cantidad específica del segundo agente activo dependerá del agente específico usado, del tipo de enfermedad que se está tratando o gestionando, de la gravedad y estadio de la enfermedad, y de la cantidad de un compuesto proporcionado en la presente memoria proporcionado en la presente memoria y cualesquiera agentes activos adicionales opcionales administrados concurrentemente al paciente. En determinadas realizaciones, el segundo agente activo es oblimersen (GENASENSE®), GM-CSF, G-CSF, SCF, EPO, taxotere, irinotecán, dacarbazina, ácido transretinoico, topotecán, pentoxifilina, ciprofloxacina, dexametasona, vincristina, doxorrubicina, inhibidor de COX-2, IL2, IL8, IL18, IFN, Ara-C, vinorelbina, o una combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, se administra GM-CSF, G-CSF, SCF o EPO subcutáneamente durante aproximadamente cinco días en un ciclo de cuatro o seis semanas en una cantidad que varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 750 mg/m2/día, de aproximadamente 25 a aproximadamente 500 mg/m2/día, de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 mg/m2/día, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 mg/m2/día. En determinadas realizaciones, el GM-CSF puede administrarse en una cantidad de aproximadamente 60 a aproximadamente 500 mcg/m2 intravenosamente durante 2 horas o de aproximadamente 5 a aproximadamente 12 mcg/m2/día subcutáneamente. En determinadas realizaciones, el G-CSF puede administrarse subcutáneamente en una cantidad de aproximadamente 1 mcg/kg/día inicialmente y puede ajustarse dependiendo de la elevación en los recuentos de granulocitos totales. La dosis de mantenimiento del G-CSF puede administrarse en una cantidad de aproximadamente 300 (en pacientes más pequeños) o 480 mcg subcutáneamente. En determinadas realizaciones, la EPO puede administrarse subcutáneamente en una cantidad de 10.000 Unidades 3 veces a la semana.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra con melfalán y dexametasona a pacientes con amiloidosis. En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, y esteroides pueden administrarse a pacientes con amiloidosis.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra con gemcitabina y cisplatino a pacientes con cáncer de vejiga de células transicionales localmente avanzado o metastásico.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con un segundo ingrediente activo como sigue: temozolomida a pacientes pediátricos con tumores cerebrales recidivantes o progresivos o neuroblastoma recurrente; celecoxib, etopósido y ciclofosfamida para cáncer del SNC recidivante o progresivo; temodar a pacientes con meningioma recurrente o progresivo, meningioma maligno, hemangiopericitoma, metástasis cerebrales múltiples, tumores cerebrales recidivantes, o glioblastoma multiforme recién diagnosticado; irinotecán a pacientes con glioblastoma recurrente; carboplatino a pacientes pediátricos con glioma del tronco cerebral; procarbazina a pacientes pediátricos con gliomas malignos progresivos; ciclofosfamida a pacientes con tumores cerebrales malignos con mal pronóstico, glioblastoma multiforme recién diagnosticado o recurrente; Gliadel® para gliomas malignos recurrentes de alto grado; temozolomida y tamoxifeno para astrocitoma anaplásico; o topotecán para gliomas, glioblastoma, astrocitoma anaplásico u oligodendroglioma anaplásico.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra con metotrexato, ciclofosfamida, taxano, abraxano, lapatinib, herceptina, inhibidores de aromatasa, moduladores selectivos de estrógenos, antagonistas del receptor de estrógeno, y/o PLX3397 (Plexxikon) a pacientes con cáncer de mama metastásico.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra con temozolomida a pacientes con tumores neuroendocrinos.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra con gemcitabina a pacientes con cáncer de cabeza o cuello recurrente o metastásico.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra con gemcitabina a pacientes con cáncer pancreático.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a pacientes con cáncer de colon en combinación con ARISA®, avastatina, taxol, y/o taxotere.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra con capecitabina y/o PLX4032 (Plexxikon) a pacientes con cáncer colorrectal refractario o a pacientes en los que ha fracasado la terapia de primera línea o tienen un mal rendimiento en adenocarcinoma de colon o rectal.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con fluorouracilo, leucovorina, e irinotecán a pacientes con cáncer colorrectal C y D de Dukes o a pacientes que han sido tratados previamente para cáncer colorrectal metastásico.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a pacientes con cáncer colorrectal refractario en combinación con capecitabina, xeloda, y/o CPT-11.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra con capecitabina e irinotecán a pacientes con cáncer colorrectal refractario o a pacientes con carcinoma colorrectal no reseccionable o metastásico.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra solo o en combinación con interferón alfa o capecitabina a pacientes con carcinoma hepatocelular no reseccionable o metastásico; o con cisplatino y tiotepa a pacientes con cáncer de hígado primario o metastásico.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con interferón alfa pegilado a pacientes con sarcoma de Kaposi.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con fludarabina, carboplatino, y/o topotecán a pacientes con leucemia mielógena refractaria o recidivante o con alto riesgo de agudización.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con daunorrubicina liposomal, topotecán y/o citarabina a pacientes con leucemia mieloblástica aguda con cariotipo desfavorable.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con gemcitabina, abraxano, erlotinib, geftinib, y/o irinotecán a pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con carboplatino e irinotecán a pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra con doxetaxol a pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas que han sido tratados previamente con carbo/VP 16 y radioterapia.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con carboplatino y/o taxotere, o en combinación con carboplatino, pacilitaxel y/o radioterapia torácica a pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con taxotere a pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas de estadio IIIB o IV.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con oblimersen (Genasense®) a pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con ABT-737 (Abbott Laboratories) y/o obatoclax (GX15-070) a pacientes con linfoma y otros cánceres de la sangre.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra solo o en combinación con un segundo ingrediente activo tal como vinblastina o fludarabina a pacientes con diversos tipos de linfoma, incluyendo, pero no limitado a, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma de células T cutáneo, linfoma de células B cutáneo, linfoma de células B grandes difuso o linfoma folicular de grado bajo recidivante o refractario.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con taxotere, IL-2, IFN, GM-CSF, PLX4032 (Plexxikon) y/o dacarbazina a pacientes con diversos tipos o estadios de melanoma.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra solo o en combinación con vinorelbina a pacientes con mesotelioma maligno, o cáncer de pulmón de células no pequeñas de estadio IIIB con implantes pleurales o síndrome de mesotelioma con efusión pleural maligna.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a pacientes con diversos tipos o estadios de mieloma múltiple en combinación con dexametasona, ácido zoledrónico, palmitronato, GM-CSF, biaxina, vinblastina, melfalán, busulfán, ciclofosfamida, IFN, palmidronato, prednisona, bisfosfonato, celecoxib, trióxido arsénico, PEG INTRON-A, vincristina, o una combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a pacientes con mieloma múltiple recidivante o refractario en combinación con doxorrubicina (Doxil®), vincristina y/o dexametasona (Decadron®).

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a pacientes con diversos tipos o estadios de cáncer de ovario tal como carcinoma peritoneal, carcinoma seroso papilar, cáncer de ovario refractario o cáncer de ovario recurrente, en combinación con taxol, carboplatino, doxorrubicina, gemcitabina, cisplatino, xeloda, paclitaxel, dexametasona, o una combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a pacientes con diversos tipos o estadios de cáncer de próstata, en combinación con xeloda, 5 FU/LV, gemcitabina, irinotecán más gemcitabina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona, GM-CSF, celecoxib, taxotere, ganciclovir, paclitaxel, adriamicina, docetaxel, estramustina, Emcyt, denderon o una combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a pacientes con diversos tipos o estadios de cáncer de células renales, en combinación con capecitabina, IFN, tamoxifeno, IL-2, GM-CSF, Celebrex®, o una combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a pacientes con diversos tipos o estadios de cáncer ginecológico, de útero o sarcoma de tejido blando en combinación con IFN, un inhibidor de COX-2 tal como Celebrex®, y/o sulindac.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a pacientes con diversos tipos o estadios de tumores sólidos en combinación con celebrex, etopósido, ciclofosfamida, docetaxel, apecitabina, IFN, tamoxifeno, IL-2, GM-CSF, o una combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a pacientes con escleroderma o vasculitis cutánea en combinación con celebrex, etopósido, ciclofosfamida, docetaxel, apecitabina, IFN, tamoxifeno, IL-2, GM-CSF, o una combinación de los mismos.

La presente memoria también engloba un método para incrementar la dosificación de un fármaco o agente anticanceroso que puede administrarse de forma segura y efectiva a un paciente, que comprende administrar al paciente (p. ej., un ser humano) o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. Los pacientes que pueden beneficiarse por este método son aquellos propensos a padecer un efecto adverso asociado con fármacos anticancerosos para tratar un cáncer específico de la piel, tejido subcutáneo, nodos linfáticos, cerebro, pulmón, hígado, huesos, intestino, colon, corazón, páncreas, adrenal, riñón, próstata, mama, colorrectal, o combinaciones de los mismos. La administración de un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, alivia o reduce los efectos adversos que son de tal gravedad que de otra forma limitarían la cantidad de fármaco anticanceroso.

En una realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra oralmente y diariamente en una cantidad que varía de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 150 mg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 25 mg, antes de, durante, o después de la aparición del efecto adverso asociado con la administración de un fármaco anticanceroso a un paciente. En determinadas realizaciones, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con agentes específicos tales como heparina, aspirina, cumadina, o G-CSF para evitar los efectos adversos que están asociados con fármacos anticancerosos tales como, pero no limitados a, neutropenia o trombocitopenia.

En una realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a pacientes con enfermedades y trastornos asociados con o caracterizados por, angiogénesis no deseada en combinación con ingredientes activos adicionales, incluyendo, pero no limitados a, fármacos anticancerosos, antiinflamatorios, antihistamínicos, antibióticos, y esteroides.

En otra realización, la presente memoria engloba un método para tratar, prevenir y/o gestionar el cáncer, que comprende administrar un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, en conjunción con (p. ej., antes, durante, o después de) una terapia convencional incluyendo, pero no limitada a, cirugía, inmunoterapia, terapia biológica, terapia de radiación, u otra terapia no basada en fármacos usada actualmente para tratar, prevenir o gestionar el cáncer. El uso combinado del compuesto proporcionado en la presente memoria y la terapia convencional puede proporcionar un régimen de tratamiento único que es inesperadamente efectivo en determinados pacientes.

Sin estar limitado por teoría, se cree que un compuesto proporcionado en la presente memoria puede proporcionar efectos aditivos o sinérgicos cuando se proporciona concurrentemente con la terapia convencional. En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un compuesto proporcionado en la presente memoria para su uso en un método para tratar, prevenir y/o gestionar el cáncer, en donde el método comprende la etapa de administración definida anteriormente.

Como se discute en otra parte de la presente memoria, la presente memoria engloba un método para reducir, tratar y/o prevenir los efectos adversos o no deseados asociados con la terapia convencional incluyendo, pero no limitada а, cirugía, quimioterapia, terapia de radiación, terapia hormonal, terapia biológica e inmunoterapia. La presente memoria también engloba un compuesto proporcionado en la presente memoria para su uso en un método para reducir, tratar y/o prevenir los efectos adversos o no deseados asociados con la terapia convencional incluyendo, pero no limitada a, cirugía, quimioterapia, terapia de radiación, terapia hormonal, terapia biológica e inmunoterapia. Un compuesto proporcionado en la presente memoria, p. ej., un compuesto proporcionado en la presente memoria, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato, o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, y otro ingrediente activo pueden administrarse a un paciente antes de, durante, o después de la aparición del efecto adverso asociado con la terapia convencional.

En una realización, un compuesto proporcionado en la presente memoria puede administrarse en una cantidad que varía de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 150 mg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mg, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mg oralmente y diariamente solo, o en combinación con un segundo agente activo descrito en la presente memoria (véase, p. ej., la sección 5.4), antes de, durante, o después del uso de la terapia convencional.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, y no a modo de limitación.

б. Ejemplos

6.1 Preparación de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina-2,6-diona (lenalidomida) (descrito como referencia)

2-Bromometil-3-nitrobenzoato de metilo

Una mezcla agitada de 2-metil-3-nitrobenzoato de metilo (14,0 g, 71,7 mmoles) y N-bromosuccinimida (15,3 g, 86.1 mmoles) en tetracloruro de carbono (200 mL) se calentó bajo reflujo suave durante 15 horas mientras el matraz se alumbraba con un bulbo de 100W situado a 2 cm de distancia. La mezcla se filtró y el sólido se lavó con cloruro de metileno (50 mL). El filtrado se lavó con agua (2 x 100 mL), salmuera (100 mL) y se secó. El disolvente se eliminó en vacío y el residuo se purificó por cromatografía flash (hexano/acetato de etilo, 8/2) para rendir 19 g (96 %) del producto como un sólido amarillo: pf 70,0-71,5 °C; 1H RMN (CDCls) 58,12-8,09 (dd, J=1,3 y 7,8 Hz, 1H), 7,97-7,94 (dd, J=1,3 y 8,2 Hz, 1H), 7,54 (t, J=8,0 Hz, 1H), 5,15 (s, 2H), 4,00 (s, 3H); 13C RMN (CDCla) 5 165,85, 150,58, 134,68, 132,38, 129,08, 127,80, 53,06, 22,69; HPl C, Waters Nove-Pak/C18, 3,9x150 mm, 4 micrómetros, 1mL/min, 240 nm, 40/60 CH3CN/H3PO4 al 0,1 % (ac) 7,27 min (98,92 %); Anal. Caled para C gH e l^B r: C, 39,44; H, 2,94; N, 5,11; Br, 29,15, Encontrado: C, 39,46; H, 3,00; N, 5,00; Br, 29,11.

f-Butil N-(1 -oxo-4-nitroisoindolin-2-il)-L-glutamina

Se añadió gota a gota trietilamina (2,9 g, 28,6 mmoles) a una mezcla agitada de 2-bromometil-3-nitrobenzoato de metilo (3,5 g, 13,0 mmoles) e hidrocloruro de éster t- butílico de L-glutamina (3,1 g, 13,0 mmoles) en tetrahidrofurano (90 mL). La mezcla se calentó a reflujo durante 24 horas. A la mezcla enfriada se añadió cloruro de metileno (150 mL) y la mezcla se lavó con agua (2 x 40 mL), salmuera (40 mL) y se secó. El disolvente se eliminó en vacío y el residuo se purificó por cromatografía flash (CH3OH al 3 % en cloruro de metileno) para rendir 2,84 g (60 %) de producto crudo que se usó directamente en la siguiente reacción: 1H RMN (CDCh) 58,40 (d, J=8,1 Hz, 1H), 8,15 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,71 (t, J=7,8 Hz, 1H), 5,83 (s, 1H), 5,61 (s, 1H), 5,12 (d, J=19,4 Hz, 1H), 5,04-4,98 (m, 1H), 4,92 (d, J=19,4 Hz, 1H), 2,49-2,22 (m, 4H), 1,46 (s, 9H); HpLC, Waters Nova-Pak C18, 3,9x150 mm, 4 micrómetros, 1 mL/min, 240 nm, 25/75 CH3CN/H3PO4 al 0,1 % (ac) 6,75 min(99,94 %).

N-(1-oxo-4-nitroisoindolin-2-il)-L-glutamina

Se burbujeó gas de cloruro de hidrógeno en una disolución agitada a 5 °C de t-butil N-(1 -oxo-4- nitro-isoindolin-2-il)-L-glutamina (3,6 g, 9,9 mmoles) en cloruro de metileno (60 mL) durante 1 hora. La mezcla se agitó entonces a temperatura ambiente durante otra hora. Se añadió éter (40 mL) y la mezcla resultante se agitó durante 30 minutos. La suspensión de sólidos se filtró, se lavó con éter y se secó para rendir 3,3 g del producto: 1H RMN (DMSO-d6) 5 8,45 (d, J=8,1 Hz, 1H), 8,15 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,83 (t, J=7,9 Hz, 1H), 7,24 (s, 1H), 6,76 (s, 1H), 4,93 (s, 2H), 4,84-4,78 (dd, J=4,8amd 10,4 Hz, 1H), 2,34-2,10 (m, 4H); 13C RMN (DMSO-ds) 5173,03, 171,88, 165,96, 143,35, 137,49, 134,77, 130,10, 129,61, 126,95, 53,65, 48,13, 31,50, 24,69; Anal. Calcd para C13H13N3O6: C, 50,82; H, 4,26; N, 13,68. Encontrado: C, 50,53; H, 4,37; N, 13,22.

(S)-3-(1-oxo-4-nitroisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona

Una mezcla de suspensión agitada de N-(1-oxo-4-nitroisoindolin-2-il)-L-glutamina (3,2 g, 10,5 mmoles) en cloruro de metileno anhidro (150 mL) se enfrió hasta -40 °C con un baño de isopropanol/hielo seco. Se añadió gota a gota cloruro de tionilo (0,82 mL, 11,3 mmoles) a la mezcla enfriada seguido de piridina (0,9 g. 11,3 mmoles). Después de 30 min, se añadió trietilamina (1,2 g, 11,5 mmoles) y la mezcla se agitó a -30 a -40 °C durante 3 horas. La mezcla se vertió en agua helada (200 mL) y la capa acuosa se extrajo con cloruro de metileno (40 mL). La disolución de cloruro de metileno se lavó con agua (2 x 60 mL), salmuera (60 mL) y se secó. El disolvente se eliminó en vacío y el residuo sólido se suspendió con acetato de etilo (20 mL) para proporcionar 2,2 g (75 %) del producto como un sólido blanco: pf 285 °C; 1H RMN (DMSO-ds) 5: 1,04 (s, 1H), 8,49-8,45 (dd, J=0,8 y 8,2 Hz, 1H), 8,21-8,17 (dd, J=7,3 Hz, 1H), 7,84 (t, J=7,6 Hz, 1H), 5,23-5,15 (dd, J=4,9 y 13,0 Hz, 1H), 4,96 (dd, J=19,3 y 32,4 Hz, 2H), 3,00-2,85 (m, 1H), 2,64-2,49 (m, 2H), 2,08-1,98 (m, 1H);13C RMN (DMSO- de) 5 172,79, 170,69, 165,93, 143,33, 137,40, 134,68, 130,15, 129,60, 127,02, 51,82, 48,43, 31,16, 22,23; HPLC, Waters Nove-Pak/C18, 3,9x150 mm, 4 micrómetros, 1 mL/min, 240 nm, 20/80 CH3CN/H3PO4 al 0,1 % (ac) 3,67 min (100 %); Anal. Calcd para C13HnN3Os: C, 53,98; H, 3,83; N, 14,53. Encontrado: C, 53,92; H, 3,70; N, 14,10.

3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina-2,6-diona

Una mezcla de (S)-3-(1-oxo-4-nitroisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona (1,0 g, 3,5 mmoles) y Pd/C al 10 % (0,3 g) en metanol (600 mL) se hidrogenó en un aparato Parr-Shaker a 50 psi de hidrógeno durante 5 horas. La mezcla se filtró a través de Celite y el filtrado se concentró en vacío. El sólido se suspendió en acetato de etilo caliente durante 30 min, se filtró y se secó para rendir 0,46 g (51 %) del producto como un sólido blanco: pf 235,5-239 °C; 1H RMN (DMSO-d6) 5 11,01 (s, 1H), 7,19 (t, J=7,6 Hz, 1H), 6,90 (d, J=7,3 Hz, 1H), 6,78 (d, J=7,8 Hz, 1H), 5,42 (s, 2H), 5,12 (dd, J=5,1 y 13,1 Hz, 1H), 4,17 (dd, J=17,0 y 28,8 Hz, 2H), 2,92-2,85 (m, 1H), 2,64-2,49 (m, 1H), 2,34-2,27 (m, 1H), 2,06-1,99 (m, 1 H);13C RMN (DMSO-d6) 5 172,85, 171,19, 168,84, 143,58, 132,22, 128,79, 125,56, 116,37, 110,39, 51,48, 45,49, 31,20, 22,74; H^pLC. Waters Nova-Pak/C18, 3,9x150 mm, 4 micrómetros, 1 mL/min, 240 nm, 10/90 CH3CN/H3PO4 al 0,1 % (ac) 0,96 min (100 %); Análisis quiral, Daicel Chiral Pak AD, 40/60 Hexano/IPA, 6,60 min (99,42 %); Anal. Calcd para C13H13N3O3: C, 60,23; H, 5,05; N, 16,21. Encontrado: C, 59,96; H, 4,98; N, 15,84.

También puede prepararse la 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina-2,6-diona por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Drugs o f fhe Fufure, 2003, 28(5): 425-431.

6.2 Preparación de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (Compuesto A) (descrito como referencia)

A una disolución de hidróxido de potasio (16,1 g, 286 mmoles) en agua (500 mL), se añadió 3-nitroftalimida (25,0 g, 130 mmoles) en porciones a 0 °C. La suspensión se agitó a 0 °C durante 3 hrs, y después se calentó hasta 30 °C durante 3 hrs. A la disolución, se añadió HCl (100 mL, 6N). La suspensión resultante se enfrió hasta 0 °C durante 1 hr. La suspensión se filtró y se lavó con agua fría (2 x 10 mL) para proporcionar ácido 3-nitro-ftalámico como un sólido blanco (24,6 g, 90 % de rendimiento): 1H RMN (DMSO-d6) 57,69 (brs, 1H, NHH), 7,74 (t, J = 8 Hz, 1H, Ar), 7,92 (dd, J = 1,8 Hz, 1H, Ar), 8,13 (dd, J = 1, 8 Hz, 1H, Ar), 8,15 (brs, 1H, NHH), 13,59 (s, 1H, OH); 13C RMN (DMSO-d6) 5 125,33, 129,15, 130,25, 132,54, 136,72, 147,03, 165,90, 167,31.

A una mezcla de ácido 3-nitro-ftalámico (24,6 g, 117 mmoles) e hidróxido de potasio (6,56 g, 117 mmoles) en agua (118 mL), se añadió una mezcla de bromo (6 mL), hidróxido de potasio (13,2 g, 234 mmoles) en agua (240 mL) a 0 °C, seguido de la adición de una disolución de hidróxido de potasio (19,8 g, 351 mmoles) en agua (350 mL). Después de

5 minutos a 0 °C, la mezcla se calentó en un baño de aceite a 100 °C durante 1 hr. La disolución de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, y después, en un baño de hielo-agua durante 30 minutos. A la mezcla, se añadió gota a gota una disolución de HCl (240 mL, 2N) a 0 °C, y la mezcla resultante se mantuvo durante 1 hr. La suspensión se filtró y se lavó con agua (5 mL) para proporcionar ácido 2-amino-6-nitro-benzoico como un sólido amarillo (15,6 g, 73 % de rendimiento): HPLC: Waters Symmetry C18, 5 gm, 3,9 x 150 mm, 1 mL/min, 240 nm, CH3CN/H3PO4 al 0,1 %, grad. del 5 % al 95 % durante 5 min, 5,83 min (85 %); 1H RMN (DMSO-ds) 56,90 (dd, J = 1,8 Hz, 1H, Ar), 7,01 (dd, J = 1,9 Hz, 1H, Ar), 7,31 (t, J = 8 Hz, 1H, Ar), 8,5-9,5 (brs, 3H, OH, NH2); 13C RMN (DMSO-ds) 5 105,58, 110,14, 120,07, 131,74, 149,80, 151,36, 166,30; LCMS: MH = 183.

Una mezcla de ácido 2-amino-6-nitro-benzoico (1,5 g, 8,2 mmoles) en anhídrido acético (15 mL) se calentó a 200 °C durante 30 minutos en un horno microondas. La mezcla se filtró y se lavó con acetato de etilo (20 mL). El filtrado se concentró en vacío. El sólido se agitó en éter (20 mL) durante 2 hrs. La suspensión se filtró y se lavó con éter (20 mL) para proporcionar 2-metil-5-nitro-benzo[d][1,3]oxazin-4-ona como un sólido marrón claro (1,4 g, 85 % de rendimiento): HPLC: Waters Symmetry C18, 5 gm, 3,9 x 150 mm, 1 mL/min, 240 nm, CH3CN/H3PO4 al 0,1 %, grad. del 5 % al 95 % en 5 min, 5,36 min (92 %); 1H RMN (DMSO-d6) 52,42 (s, 3H, CH3), 7,79 (dd, J = 1,8 Hz, 1H, Ar), 7,93 (dd, J = 1,8 Hz, 1H, Ar), 8,06 (t, J = 8 Hz, 1H, Ar); 13C RMN (DMSO-d6) 5 20,87, 107,79, 121,54, 128,87, 137,19, 147,12, 148,46, 155,18, 161,78; LCMS: MH = 207.

Dos viales cada uno con una suspensión de 5-nitro-2-metil-benzo[d][1,3]oxazin-4-ona (0,60 g, 2,91 mmoles) y hidrógenocloruro de 3-amino-piperidina-2,6-diona (0,48 g, 2,91 mmoles) en piridina (15 mL) se calentaron a 170 °C durante 10 minutos en un horno microondas. La suspensión se filtró y se lavó con piridina (5 mL). El filtrado se concentró en vacío. La mezcla resultante se agitó en HCl (30 mL, 1N), acetato de etilo (15 mL) y éter (15 mL) durante 2 hrs. La suspensión se filtró y se lavó con agua (30 mL) y acetato de etilo (30 mL) para proporcionar un sólido marrón oscuro, que se agitó con metanol (50 mL) a temperatura ambiente toda la noche. La suspensión se filtró y se lavó con metanol para proporcionar 3-(2-metil-5-nitro-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona como un sólido negro (490 mg, 27 % de rendimiento). El sólido se usó en la siguiente etapa sin más purificación.

Una mezcla de 3-(2-metil-5-nitro-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (250 mg) y Pd(OH)2 en carbón (110 mg) en DMF (40 mL) se agitó bajo hidrógeno (50 psi) durante 12 hrs. La suspensión se filtró a través de una almohadilla de Celite y se lavó con DMF (10 mL). El filtrado se concentró en vacío y el aceite resultante se purificó por cromatografía en columna flash (gel de sílice, metanol/cloruro de metileno) para proporcionar 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona como un sólido blanco (156 mg, 69 % de rendimiento): HPLC: Waters Symmetry C18, 5 gm, 3,9 x 150 mm, 1 mL/min, 240 nm, 10/90 CH3CN/H3PO4 al 0,1 %, 3,52 min (99,9 %); pf: 293-295 C; 1H RMN (DMSO-d6) 52,10-2,17 (m, 1H, CHH), 2,53 (s, 3H, CH3), 2,59-2,69 (m, 2H, CH2), 2,76-2,89 (m, 1H, CHH), 5,14 (dd, J = 6,11 Hz, 1H, NCH), 6,56 (d, J = 8 Hz, 1H, Ar), 6,59 (d, J = 8 Hz, 1H, Ar), 7,02 (s, 2H, NH2), 7,36 (t, J = 8 Hz, 1H, Ar), 10,98 (s, 1H, NH); 13C RMN (DMSO-de) 5 20,98, 23,14, 30,52, 55,92, 104,15, 110,48, 111,37, 134,92, 148,17, 150,55, 153,62, 162,59, 169,65, 172,57; LCMS: MH = 287; Anal. Calcd para C14H14N4O3 0,3 H2O: C, 57,65; H, 5,05; N, 19,21. Encontrado: C, 57,50; H, 4,73; N, 19,00.

6.3 Estructura del cristal de CRBN no unido

Este ejemplo describe la preparación de un cristal de CRBN. El dominio de unión a IMiD® de cereblon puede purificarse como sigue: el gen que codifica el dominio de unión a talidomida (TBD) del CRBN humano (aminoácidos 319-427) o CRBN de ratón (aminoácidos 322-430) se optimiza por codones y se inserta en un vector pGEX6P-3 para la expresión como una proteína de fusión con GST en E. coli. Las células BL21 (DE3) Star transformadas con el plásmido se crecen hasta una DO de 0,6 en medio TB suplementado con acetato de cinc 50 gM, y se inducen con IPTG 0,5 mM durante 4 horas a 37 C. Las células se resuspenden en tampón de lisis que contiene Tris 50 mM pH 7, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, TeCP 2 mM, DTT 1 mM, 100 U/mL de benzonasa (Novagen), 1X mezcla de inhibidores de proteasas sin EDTA (SD Biosciences), 0,5 mg/mL de lisozima (Sigma), y se sonican durante 30 s antes de la ultracentrifugación durante 30 min a 100.000 x g. El CRBN fusionado con GST se une entonces a una resina de afinidad de glutatión, se lava en Tris 50 mM pH 7, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, TCEP 2 mM, DTT 1 mM, y se eluye en el mismo tampón con la adición de glutatión reducido 40 mM. La etiqueta de GST se elimina por escisión durante toda la noche a 4 C con proteasa PreScission™ (1 U/mg de proteína, GE Healthcare). El TBD de CRBN se purifica adicionalmente con cromatografía de intercambio iónico diluyendo la proteína escindida a NaCl 75 mM usando Tris 50 mM pH 7, TCEP 2mM y DTT 1 mM, y uniéndola bien a una columna Mono S (TBD de ratón) o columna de heparina (TBD humano). La proteína se eluye usando un gradiente de NaCl 90 mM a 1 M y se combina para la cromatografía de exclusión por tamaño. El TBD de CRBN de ratón puede purificarse por exclusión de tamaño sobre una S75 16/600 en acetato de sodio 5 mM pH 6, TECP 10 mM, y DTT 5 mM. El TBD de CRBN humano puede purificarse sobre una S75 16/600 en MES 20 mM pH 6, NaCl 200 mM, TCEP 10 mM y DTT 1 mM. La proteína humana o de ratón puede concentrarse hasta 17 mg/mL. Alternativamente, los residuos de 321-429 murinos fusionados a GST pueden expresarse en E. coli. Las células se lisan por sonicación y la fracción soluble se purifica usando una trampa de GST, cromatografía de intercambio iónico y de exclusión por tamaño. La proteína puede concentrarse hasta 28 mg/ml en tampón acetato 50mM, pH 6,0, DTT 1mM, TCEP 10mM. Los cristales pueden obtenerse por formación de gotas por difusión de vapor mezclando el tampón de la proteína 1:1 con y equilibrándolo frente a un licor madre de tampón de cristalización. Para el TBD de ratón no unido, el tampón de cristalización contiene acetato de sodio 100mM pH 5, sulfato de amonio 600-800 mM. Los cristales pueden crecerse a 4 grados centígrados y crioprotegerse por la adición de glicerol al 20 % y congelarse en nitrógeno líquido.

6.4 Estructuras de cristal de complejo CRBN-fármaco

Este ejemplo describe la preparación de un cristal de CRBN formando un complejo con un segundo compuesto usado para estudiar las relaciones estructura-actividad.

Se preparó un cristal de CRBN formando un complejo con un Apo y se usó como un control negativo. Además, se preparó un cristal de CRBN formando un complejo con talidomida, pomalidomida, CC-220, o CC-885.

La FIG. 2 representa proyecciones idénticas de determinadas superficies de unión a CMA de CRBN y muestra los cambios conformacionales de la proteína.

La FIG. 3A representa la estructura de cristal de CRBN antes de la unión de CC-220, y la FIG. 3B representa la estructura del cristal de CC-220 en CRBN, en el que el fármaco puede actuar como un “pegamento molecular” o puente con un sustrato, tal como una proteína asociada a CRBN.

La FIG. 4 representa un complejo de CRBN y CC-220 o talidomida. Se observa una rotación de 50° del anillo “ftalimida” en CC-220 en relación con talidomida o pomalidomida. Dicha rotación puede permitir diferentes efectos biológicos aguas abajo, así como los efectos terapéuticos resultantes.

6.5 Ensayo de degradación de Aiolos para la identificación de CMA

El ejemplo describe un método ejemplar para ensayar una actividad biológica mediada por CRBN, y específicamente la degradación de Aiolos.

Se realiza inmunohistoquímica usando métodos estándar. Por ejemplo, la inmunohistoquímica se realiza en el equipo de tinción automático de portaobjetos Bond-Max® (Leica Microsystems) usando el kit de detección asociado Bond Polymer Refine®. Se desparafinan en el instrumento secciones FFPE de cuatro micrómetros de espesor. La recuperación de antígenos se realiza con Epitope Retrieval™ 2 (pH 9,0) durante 20 minutos a 100 °C. Los portaobjetos se bloquean para la actividad peroxidasa endógena con bloqueo de peróxido durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se incuban entonces con anticuerpo policlonal de conejo frente a Aiolos (Santa Cruz, sc-101982) a una dilución 1/1.000 durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de incubación con polímero marcado con HRP durante 8 minutos a temperatura ambiente. La detección enzimática del anticuerpo anti-Aiolos se consigue con sustrato de peróxido de hidrógeno y cromógeno de tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB) a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los portaobjetos se contratiñen con hematoxilina durante 5 minutos a temperatura ambiente.

6.6 Producción de análogos de CC-885 (descrito como referencia)

Este ejemplo describe la producción de CC-885, y análogos del mismo.

1-(3-Cloro-4-metil-fenil)-3-[2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1-oxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-5-ilmetil]-urea.

Etapa 1: una mezcla agitada mecánicamente de ácido 4-bromo-2-metil-benzoico (100 g, 465 mmoles), yodometano (95 g, 670 mmoles) y bicarbonato de sodio (112 g, 1.340 mmoles) en DMF (325 mL) se calentó a 80 °C toda la noche. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se repartió entre agua (1.500 mL) y 4:1 hexanos:acetato de etilo (1.500 mL). La capa orgánica se lavó con agua y se secó (Na2SÜ4). El disolvente se eliminó en vacío para proporcionar 110 g de éster metílico del ácido 4-bromo-2-metil-benzoico como un aceite, con un rendimiento del 100 %; 1H RMN (DMSO-ds) 52,51 (s, 3H), 3,84 (s, 3H), 7,40-7,78 (m, 3H).

Etapa 2: una mezcla agitada mecánicamente de éster metílico del ácido 4-bromo-2-metil-benzoico (115 g, 500 mmoles), N-bromosuccinimida (90 g, 500 mmoles) y AIBN (3,1 g) en acetonitrilo (700 mL) se calentó durante 45 minutos a un reflujo suave, y se mantuvo a reflujo durante 21 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, se diluyó con bisulfito de sodio acuoso saturado, y se concentró en vacío. El residuo se repartió entre agua y 1:1 hexanos:acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua, salmuera, y se filtró a través de una almohadilla de gel de sílice. El disolvente se eliminó en vacío para proporcionar una mezcla de aceite/sólido, que se digirió en éter y se filtró. El filtrado se cromatografió en gel de sílice usando un gradiente de hexanos-acetato de etilo, eluyendo el producto a 4:1 hexanos-acetato de etilo y proporcionando 102 g de éster metílico del ácido 4-bromo-2-bromometilbenzoico, con un rendimiento del 66 %; 1H RMN (DMSO-d6) 53,87 (s, 3H), 4,99 (s, 2H), 7,67-7,97 (m, 3H).

Etapa 3: una mezcla agitada mecánicamente de éster metílico del ácido 4-bromo-2-bromometil-benzoico (121 g, 390 mmoles) e hidrocloruro de 3-amino-piperidina-2,6-diona (64,2 g, 390 mmoles) en DMF (400 mL) se trató gota a gota con trietilamina (98,5 g, 980 mmoles) durante 75 minutos. Después de completar la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla se paró secuencialmente con ácido acético (50mL), agua (2.500mL) y una mezcla 1:1 de acetato de etilo y hexanos (600 mL). Después de agitar la mezcla durante 20 minutos, el sólido se filtró, se lavó con agua y se secó al aire toda la noche. El sólido se agitó en ácido acético (200 mL) y se puso a reflujo durante 2 horas. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y se filtró. El sólido se lavó con ácido acético adicional, hexanos y se secó al aire toda la noche para proporcionar 25,4 g de 3-(5-bromo-1-oxo-1,3-dihidroisoindol-2-il)-piperidina-2,6-diona como un sólido gris, con un rendimiento del 20 %; 1H RMN (DMSO-d6) 5 1,97-2,04 (m, 1H), 2,32-2,46 (m, 1H), 2,56-2,63 (m, 1H), 2,85-2,97 (m, 1H), 4,34 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 4,47 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 5,11 (dd, J = 13,2 Hz, J = 5,1 Hz, 1H), 7,67 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,72 (dd, J = 8,1 Hz, J = 1,5 Hz, 1H), 7,89 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 11,00 (s, 1H).

Etapa 4: una mezcla agitada mecánicamente de 3-(5-bromo-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol- 2-il)-piperidina-2,6-diona (25,2 g, 78 mmoles), bis(difenilfosfino)ferroceno (2,0 g), tris(dibencilidenacetona)dipaladio (2,0 g) y cianuro de cinc (9,4 g, 80 mmoles) en DMF (300 mL) se calentó hasta 120 °C y se agitó a esa temperatura durante 19 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta 40 °C, y se añadieron otros 9,4 g de cianuro de cinc, 2 g de bis(difenilfosfino)ferroceno y 2 g de tris(dibencilidenacetona)dipaladio. La mezcla se agitó a 120 °C durante 2 horas, se enfrió hasta temperatura ambiente y se paró con agua (900 mL). El sólido se filtró, se lavó con agua adicional y se secó al aire toda la noche. El sólido se agitó en ácido acético caliente (200 mL) durante 20 minutos. El sólido se filtró, se lavó con ácido acético adicional, acetato de etilo y hexanos, y se secó al aire para proporcionar 30,8 g de 2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1-oxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-5-carbonitrilo crudo como un sólido gris; 1H RMN (DMSO-d6) 5 1,99-2,06 (m, 1H), 2,35-2,45 (m, 1H), 2,57-2,63 (m, 1H), 2,86-2,98 (m, 1H), 4,42 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 4,55 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 5,15 (dd, J = 13,2 Hz, J = 5,1 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,99 (dd, J = 7,8 Hz, J = 0,9 Hz, 1H), 8,16 (s, 1H), 11,03 (s, 1H).

Etapa 5: una mezcla de 2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1 -oxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-5-carbonitrilo (9,2 g, 34 mmoles), Pd-C al 10 % (1,7 g) y HCl concentrado (5,3 g) en N-metilpirrolidona (300 mL) se hidrogenó a 58 psi toda la noche. La mezcla de reacción cruda se filtró a través de Celite, y el catalizador se lavó con agua. El filtrado combinado se concentró en vacío, y el producto, hidrocloruro de 3-(5-aminometil-1 -oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina-2,6-diona, se aisló por cristalización fraccionada del residuo de isopropanol-agua (1,9 g, 18 %); 1H RMN (DMSO-d6) 5 1,85-2,20 (m, 1H), 2,35-2,45 (m, 1H), 2,58-2,80 (m, 1H), 2,87-2,99 (m, 1H), 4,16 (s, 2H), 4,35 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 4,49 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 5,13 (dd, J = 13,2 Hz, J = 4,8 Hz, 1H), 7,63 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,72 (s, 1H), 7,79 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,43 (br, 3H), 11,01 (s, 1H).

Etapa 6: una mezcla de hidrocloruro de 3-(5-aminometil-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina-2,6-diona (0,50 g, 1.6 mmoles), isocianato de 3-cloro-4-metilfenilo (0,27 g, 1,6 mmoles) y TEA (0,32 g, 3,2 mmoles) en THF (25 mL) se calentó hasta 40 °C con agitación bajo N2. Después de 3 horas, se añadió una porción adicional de isocianato de 3-cloro-4-metilo (0,17 g, 1,1 mmoles), y la agitación se continuó durante 2 horas. La mezcla se filtró, y el filtro se lavó con acetato de etilo. El sólido se trituró con 10 mL de 1:1 acetona-DMF y se filtró. El filtro se lavó con acetona, y el sólido se secó en vacío, proporcionando 430 mg del producto, con un rendimiento del 60 %; pf 258-260 °C; HPLC, Waters Symmetry C-18, 3,9 x 150 mm, 5 gm, 1 mL/min, 240 nm, 40/60 CH3CN/H3PO4 al 0,1 %, 4,49 (98,75 %); 1H RMN (DMSO-ds) 5 1,90-1,96 (m, 1H), 2,16 (s, 3H), 2,25-2,39 (m, 1H), 2,50-2,55 (m, 1H), 2,78-2,91 (m, 1H), 4,24 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 4,33-4,41 (m, 3H), 5,04 (dd, J = 13,5 Hz, J = 4,5 Hz, 1H), 6,73 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 7,04-7,13 (m, 2H), 7,36-7,44 (m, 2H), 7,59-7,44 (m, 2H), 8,69 (s, 1H), 10,92 (s, 1H); 13C RMN (DMSO-ds) 5 18,7, 22,5, 31,2, 42,8, 47,1, 51,5, 116,4, 117,6, 121,9, 122,9, 126,9, 127,4, 130,3, 131,0, 133,0, 139,6, 142,4, 144,7, 155,1, 167,9, 171,0, 172,9; Anal. Calcd para C22H21ClN4O4: C, 59,93; H, 4,80; N, 12,71. Encontrado: C, 59,77; H, 4,61; N, 12,69.

6.7 El CRBN se requiere para el efecto antiproliferativo de CC-885 en tumores hematológicos y sólidos

La lenalidomida compite con el Compuesto A y CC-885 por CRBN

Las células TMD8 (ABC) o Karpas 422 (GCB) se trataron bien con lenalidomida; Compuesto A; CC-122 y lenalidomida 100 gM, 1-(3-cloro-4-metilfenil)-3-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-5-il)metil)urea (CC-885); o CC-885 y lenalidomida 100 gM. Las células se cultivaron y las células se subcultivaron a largo plazo en lenalidomida o Compuesto A. Las células se analizaron entonces para determinar su proliferación usando un ensayo de incorporación de 3H-timidina.

La FIG. 5 muestra que la lenalidomida compite con el Compuesto A y CC-885 por CRBN. La FIG. 5A muestra que el cotratamiento con el Compuesto A y lenalidomida 10 gM bloquea los efectos antiproliferativos del Compuesto A, a través de la competición por la unión al complejo de CRBN. Asimismo, la FIG. 5B muestra que el cotratamiento con CC-885 y lenalidomida 10 gM bloquea los efectos antiproliferativos de CC-885, a través de la competición por la unión al complejo de CRBN. El cocultivo de Lenalidomida bien con CC-122 o CC-885 disminuye la actividad de estos compuestos ya que están dirigidos al mismo bolsillo de unión con afinidad relativa.

6.8 Efecto de los análogos de CC-885 en los sustratos de CRBN

Este ejemplo muestra los efectos de los análogos de CC-885 en los sustratos de CRBN.

6.8.1. CC-885 induce la apoptosis temprana en la línea celular de MM H929

La línea celular de mieloma múltiple, H929, se cultivó y se trató con CC-885 u otros análogos de CMA a diversas concentraciones de 0,01 nM a 1.000 nM. La apoptosis se evaluó 24 hrs. después.

Como se muestra en la FIG. 6, CC-885 indujo la apoptosis temprana en la línea celular de mieloma múltiple (MM) H929, mientras otros CMA no lo hicieron.

6.8.2. CC-885 es potente en un panel de líneas de tumores sólidos

La potencia de CC-885 se evaluó en un panel de líneas celulares tumorales, incluyendo linfoma B, de mama, SNC, colon, riñón, leucemia, pulmón, melanoma, mieloma múltiple, ovario y próstata.

Como se muestra en la FIG. 7, CC-885 es potente en un panel de líneas tumorales. Aunque se observó una citotoxicidad diferencial en el panel de células cancerosas, CC-885 tuvo un índice terapéutico global bajo (es decir, efectos tóxicos a dosis bajas). Debe indicarse que los IMiD® tradicionales no tienen actividad en líneas celulares de tumores sólidos.

6.8.3. El CRBN se requiere para la actividad antiproliferativa de CC-885 en células de MM

A continuación, se determinó si CC-885 se unía a CRBN en las células de mieloma múltiple U266, y si CRBN se requería para la actividad de CC-885 en estas células.

Como se muestra en la FIG. 8, CC-885 se une a extractos de células de MM con proteína CRBN. Los análisis por inmunotransferencia de extractos preparados de células de mieloma múltiple U266 y preincubados con vehículo DMSO (D), Pomalidomida (Pom) o CC-885 a las concentraciones indicadas, y unidos a perlas de afinidad de análogo de talidomida, lavados y eluidos con tampón SDS como se ha descrito previamente (Ito et al, 2010; Lopez-Girona et al, 2012). Las muestras se sometieron a análisis por SDS-PAGE e inmunotransferencia usando anti-CRBN 65-76 (dilución 1:10.000; señal roja) y anti-DDB1 (Cell Signaling) (dilución 1:2.000; señal verde). Se usó un sistema LI-COR Odissey para cuantificar la densidad de las bandas de CRBN y las cantidades relativas de CRBN se determinaron promediando al menos tres controles de DMSO y expresando CRBN en cada muestra de competición como porcentaje de inhibición de la proteína CRBN en relación con los controles promediados como 100 % de unión. Además, las FIG.

9 y 10 muestran que se requiere CRBN para la actividad antiproliferativa de CC-885 en células de mieloma. La FIG 9 muestra que las inmunotransferencias de CRBN de extractos de DF15, DF15R muestran la ausencia de la expresión de la proteína CRBN en células DF15R. La inmunotransferencia de p-tubulina se usó como control de carga. Ensayo de proliferación celular de células DF15 (sensibles), DF15R (resistentes; CRBNnulo) tratadas con una respuesta a la dosis de CC-885. Los ensayos se hicieron en triplicado y las barras de error representan s.d. Los datos para cada línea celular se normalizaron respecto al tratamiento con vehículo (DMSO). La FIG 10 muestra la inmunotransferencia de CRBN de extractos de células DF15, DF15R y DF15R que reexpresan CRBN de tipo salvaje de longitud completa (CRBNWT) o que reexpresan control de RFP. La inmunotransferencia de p-tubulina se usó como control de carga. Ensayo de proliferación celular de células DF15 (sensibles), DF15R (resistentes; CRBNnulo), DF15R-hCRBNWT (CRBN humano), DF15R-RFP tratadas con una respuesta a la dosis de CC-885. Los datos muestran que la reexpresión de CRBN humano en las células DF15R rescata la actividad antiproliferativa de CC-885. Los ensayos se hicieron en triplicado y las barras de error representan s.d. Los datos para cada línea celular se normalizaron respecto al tratamiento con vehículo (DMSO).

6.8.4. El CRBN se requiere para la actividad antiproliferativa en células de cáncer de mama

Las células de cáncer de mama (MDA-MB-231) se trataron con ARNsi de CRBN o un control negativo. Se añadió CC-885 a una concentración entre 0 y 100 pM, y se evaluaron los niveles de CRBN a las 48 horas después del tratamiento. El CRBN se redujo significativamente en las células tratadas, en comparación con un control negativo que no recibió ARNsi (datos no mostrados).

También se evaluaron la inhibición del crecimiento y actividad proapoptótica mediadas por CC-885. Como se muestra en la FIG. 11, se requiere CRBN tanto para la inhibición como para la actividad proapoptótica de CC-885 en las células de cáncer de mama MDA-MB-213.

6.9 Base estructural para la capacidad de respuesta diferenciada a los fármacos de la clase de la talidomida (IMiD®) definida por la estructura de cristal de un complejo de Lenalidomida:Cereblon humano:DDB1

La ruta de la ubiquitina-proteasoma (UPP) es el mecanismo principal por el que las proteínas son marcadas para su degradación lo que contribuye a las homeostasis de proteínas intracelular. La desrregulación de este mecanismo clave de la homeostasis de proteínas está implicada en la etiología de enfermedades incluyendo cáncer, afecciones neurológicas y enfermedades metabólicas (Petroski et al. BMC Biochem, 2008. 9Supl1 :S7. Los fármacos que modulan la ruta de la ubiquitina-proteasoma tienen, por lo tanto, el potencial de impactar en un amplio rango de procesos biológicos y enfermedades incluyendo el cáncer. Se ha mostrado que la talidomida (THAL) y agentes inmunomoduladores IMiD® relacionados, tales como lenalidomida (LEN) y pomalidomida (POM), tienen efectos anticancerosos en diferentes indicaciones por la inhibición directa de la proliferación de las células cancerosas, la modulación del microentorno tumoral, y la inmunomodulación o estimulación (Ramsay et al., Blood, 2012. 120(7):1412-21; Quach et al., Leukemia, 2010. 24(1):22-32; Ramsay et al., Blood, 2013. 121(14): p. 2704-14; Eve et al, Br J Haematol., 2012. 159(2):154-63).

El cereblon (CRBN), identificado en primer lugar como una causa genética del retraso mental autosómico recesivo congénito, es un componente de un complejo ubiquitina ligasa E3 culina4-ring (CRL4), y es la diana directa de THAL y otros fármacos IMiD®. Las CRL4 ubiquitina ligasas están formadas por una proteína Culina (CUL4), que actúa como un factor de ensamblaje que proporciona un soporte para el ensamblaje de una proteína con dominio de caja RING (RBX1) y la proteína adaptadora proteína 1 de unión al ADN dañado (DDB1) (Angers et al., Nature, 2006.

443(7111):590-3). RBX1 es el sitio de anclaje para la proteína E2 activada, y DDB1 recluta receptores con especificidad de sustrato o DCAF (factores asociados a DDB1-culina4) para formar el lado de presentación de sustrato del complejo CRL4 (Angers et al., Nature, 2006. 443(7111):590-3; He et al., Genes Dev, 2006. 20(21 ):2949-54; Higa et al. Nat Cell Biol, 2006. 8(11): p. 1277-83). Se han identificado aproximadamente 60 DCAF. Estos DCAF se caracterizan por la presencia de un dominio de repetición WD (Higa et al. Nat Cell Biol, 2006. 8(11):1277-83). La evidencia bioquímica y genética ha mostrado que CRBN es un DCAF para CRL4 (Angers et al., Nature, 2006.

443(7111) :590-3, Ito et al., Science, 2010. 327(5971):1345-50), y que la unión de los compuestos IMiD® a CRBN afecta la actividad de la CRL4CRBN ubiquitina ligasa E3, mediando así los efectos antiproliferativos en células de mieloma múltiple (MM) y los efectos inmunomoduladores en células T (Ito et al., Science, 2010. 327(5971 ):1345-50; Lopez-Girona et al., Leukemia, 2012. 26(11):2326-35; Zhu et al., Blood. 2011. 118(18):4771 -9).

Recientemente, varios grupos han identificado los factores de trascripción Ikaros y Aiolos como sustratos del complejo CRL4CRBN-fármaco IMiD®, explicando así muchos de los efectos terapéuticos de los compuestos IMiD® en las células inmunes y tumorales. Estos informes describen que la unión de los compuestos IMiD® a CRBN promueve el reclutamiento de Ikaros o Aiolos en CRL4crbn, dando lugar a una ubiquitilación incrementada y a la degradación dependiente del proteasoma de estos factores de transcripción tanto en células de MM como T. En las células de mieloma, la inactivación dirigida de Ikaros y Aiolos mimetiza la disminución del factor de supervivencia de mieloma, IRF4, así como la disminución en la viabilidad celular observada con el tratamiento con IMiD®. En las células T, Ikaros y Aiolos son represores conocidos de la transcripción de la interleuquina-2 (IL-2), y la inactivación de cualquiera de estas proteínas produce un incremento en IL-2 similar al tratamiento con fármacos IMiD® (Gandhi et al., Br J Haematol.; Lu et al., Science; Kronke, et al., Science, 2014. 343(6168):301-5.). Estos descubrimientos demostraron que la unión de IMiD® confiere una nueva funcionalidad a los complejos CRL4CRBN, lo que sugiere la posibilidad de que esté implicada una estructura neomórfica conferida por IMiD®.

Una característica adicional importante desde el punto de vista histórico y de desarrollo en la farmacología de la lenalidomida y fármacos relacionados es la especificidad de especie que presentan estos compuestos. Por ejemplo, se ha mostrado que los ratones y ratas son insensibles a los efectos teratogénicos de la talidomida y lenalidomida (Newman et al., Reprod Toxicol, 1993.7(4):359-90), mientras que los primates, incluyendo los seres humanos, son sensibles. Consistente con las diferencias en la farmacología entre especies, demostramos que los esplenocitos de ratón son resistentes a los efectos inductores de IL-2 de la pomalidomida y que en la línea celular A20 de ratón preparada por ingeniería para expresar cereblon humano y Aiolos humano, el Aiolos de ratón no se degrada en presencia de lenalidomida mientras sí lo hace el Aiolos humano.

6.9.1. Resumen

El complejo Cul4:Rbx1 :DDB1 :Cereblon ubiquitina ligasa E3 se ha identificado como la diana molecular de una clase terapéuticamente importante de moléculas conocida como fármacos IMiD® o fármacos inmunomoduladores. Los fármacos IMiD® se unen directamente a Cereblon (CRBN) y en el proceso modulan la actividad de la ubiquitina ligasa E3 y la estabilidad resultante de sus proteínas diana. El reclutamiento mediado por la lenalidomida de los factores de transcripción Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3) en el complejo de E3 descrito recientemente que promueve una ubiquitinación y degradación aumentadas proporciona información acerca de la base molecular de la actividad terapéutica de los fármacos IMiD® en el mieloma múltiple y otras malignidades de las células B.

En la presente memoria describimos la estructura de cristal de CRBN humano unido a DDB1 y al fármaco IMiD® lenalidomida. El CRBN se une a DDB1 en la misma hendidura utilizada por otros DDB1 y factores asociados a culina (DCAF); sin embargo, las interacciones no son canónicas e implican interacciones más extensas con los dominios de hélice de láminas beta A y C. El sitio de unión a IMiD® está comprendido por un bolsillo hidrófobo anular de triptófano que se une al resto glutarimido común a la lenalidomida, talidomida, y pomalidomida. Esta conformación de unión orienta el anillo de isoindolinona de la lenalidomida hacia el disolvente con la consecuencia funcional de alterar las propiedades de reconocimiento del sustrato de la E3 ligasa.

Usando mutaciones puntuales guiadas por la estructura y activación lentiviral en células de mieloma, mostramos que los residuos clave del sitio de unión a los fármacos IMiD® son críticos para los efectos antiproliferativos en las células de mieloma medados por fármacos. Importantemente, un polimorfismo de CRBN específico de especie en roedores próximo al sitio de unión a lenalidomida proporciona una explicación para la capacidad de respuesta específica de especie apreciada desde hace tiempo en los seres humanos y primates en comparación con los redores.

6.9.2. Materiales y métodos

6.9.2.1 Determinación estructural

El dominio de unión a IMiD® del cereblon se purificó como sigue: el gen que codifica el dominio de unión a talidomida (TBD) de CRBN humano (aminoácidos 319-427) o CRBN de ratón (aminoácidos 322-430) se optimizó por codones y se insertó en un vector pGEX6P-3 para la expresión como una proteína de fusión con GST en E. coli. Las células BL21 (DE3) Star transformadas con el plásmido se crecieron hasta una DO de 0,6 en medio TB suplementado con acetato de cinc 50 gM, y se indujeron con IPTG 0,5 mM durante 4 horas a 37 C. Las células se resuspendieron en tampón de lisis que contenía Tris 50 mM pH 7, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, TECP 2 mM, DTT 1 mM, 100 U/mL de benzonasa (Novagen), 1X mezcla de inhibidores de proteasas sin EDTA (SD Biosciences), 0,5 mg/mL de lisozima (Sigma), y se sonicaron durante 30 s antes de la ultracentrifugación durante 30 min a 100.000 x g. El CRBN fusionado con GST se unió entonces a una resina de afinidad de glutatión, se lavó en Tris 50 mM pH 7, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, TCEP 2 mM, DTT 1 mM, y se eluyó en el mismo tampón con la adición de glutatión reducido 40 mM. La etiqueta de GST se eliminó por escisión durante toda la noche a 4 C con proteasa PreScission™ (1 U/mg de proteína, GE Healthcare). El TBD de CRBN se purificó adicionalmente con cromatografía de intercambio iónico diluyendo la proteína escindida a NaCl 75 mM usando Tris 50 mM pH 7, TCEP 2 mM y DTT 1 mM, y uniéndola bien a una columna Mono S (TBD de ratón) o columna de heparina (TBD humano). La proteína se eluyó usando un gradiente de NaCl 90 mM a 1 M y se combinó para la cromatografía de exclusión por tamaño. El TBD de CRBN de ratón se purificó por exclusión de tamaño sobre una S75 16/600 en acetato de sodio 5 mM pH 6, TECP 10 mM, y DTT 5 mM. El TBD de CRBN humano se purificó sobre una S75 16/600 en MES 20 mM pH 6, NaCl 200 mM, TCEP 10 mM y DTT 1 mM. Ya sea la proteína humana o de ratón se concentró hasta 17 mg/mL. Alternativamente, los residuos de 321-429 murinos fusionados a GST se expresaron en E. coli. Las células se lisaron por sonicación y la fracción soluble se purificó usando una trampa de GST, cromatografía de intercambio iónico y de exclusión por tamaño. La proteína se concentró hasta 28 mg/ml en tampón acetato 50 mM, pH 6,0, DTT 1 mM, TCEP 10 mM. Los cristales se obtuvieron por la formación de gotas por difusión de vapor mezclando el tampón de la proteína 1:1 con y equilibrándolo frente a un licor madre de tampón de cristalización. Para el TBD de ratón no unido, el tampón de cristalización contenía acetato de sodio 100 mM pH 5, sulfato de amonio 600-800 mM. Los cristales se crecieron a 4 grados centígrados y se crioprotegieron por la adición de glicerol al 20 % y se congelaron en nitrógeno líquido. El TBD humano cristalizó en cacodilato de sodio 100 mM pH 6,5, sulfato de amonio 200 mM, y PEG 8,000 al 30 %, y cacodilato de sodio 100 mM pH 6,5, sulfato de litio 200 mM, PEG 2000 MME al 25 % a 4 grados centígrados. Los cristales se crioprotegieron por la adición de etilen glicol al 20 % antes de la congelación. Los cristales de TBD murino en complejo con CC-220 se formaron por la formación de gotas por difusión de vapor. Se añadió CC-220 a la proteína hasta una concentración final de 1 mM, y la gotita de la proteína se mezcló 1:1 con, y posteriormente se equilibró frente a, una disolución de reservorio de MES 100 mM pH 6,5, heptahidrato de sulfato de cinc 10 mM, PEG MME 550 al 25 % y se incubó a 4 grados centígrados. Los cristales se crioprotegieron por la adición de glicerol al 20 % y se congelaron en nitrógeno líquido.

La estructura del dominio de unión a thal de cereblon murino se resolvió por dispersión anómala de longitud de onda única usando iones cinc unidos intrínsecamente. Brevemente, se recogieron 480 grados de datos de un único cristal a 1,0A de longitud de onda. Los datos se integraron y se escalaron usando HKL2000 (Otwinowski et al., Methods in Enzymology, 1997. 276:307-326). La obtención de fases y la construcción automatizada de modelos se realizaron con Crank en c Cp4 í, usando los siguientes subprogramas: AFRO/CRUNCH2/BP3/SOLOMON/Buccaneer (Abrahams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1996. 52(Pt 1):30-42; de Graaff, R.A., et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2001. 57(Pt 12):1857-62; Pannu et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004. 60(Pt 1): 22-7; Pannu et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011.67(Pt 4):331-7). La construcción manual posterior de los modelos y el refinamiento se realizaron usando Coot y Refmac5, respectivamente (Murshudov et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011.

67(Pt 4):355-67; Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 4):486-501). Las estructuras posteriores se resolvieron por reemplazo molecular usando Phaser (McCoy et al., J Appl Crystallogr, 2007. 40(Pt 4): 658-674).

El CRBN humano (aminoácidos 40-442) fusionado a una etiqueta N-terminal de ZZ-6xHis con un sitio de escisión de trombina y DDB1 humano de longitud completa son o sin una etiqueta C-terminal de estrep se coexpresaron en células de insecto SF9 usando medio ESF921 suplementado con acetato de cinc 50 pM. Las células se suspendieron en 8 volúmenes de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 10 %, imidazol 10 mM, TCEP 1 mM) más 1X mezcla de inhibidores de proteasas y 2.000 Unidades de TurboNucleasa durante 1hora a 4 °C. El lisado se centrifugó a 105.000xg durante 1 hora y el sobrenadante se cargó en 5 mL de Ni-NTA, preequlibrada en tampón de lisis. El CRBN-DDB1 se eluyó usando un método por etapas con tampón de elución (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 10 %, imidazol 500 mM, TCEP 1 mM). Las fracciones del pico se combinaron y la etiqueta de ZZ-6XHis se escindió por incubación con trombina toda la noche a 4 C (1 mg de trombina/100 mg de proteína diana, Enzyme Research). La proteína se diluyó posteriormente hasta NaCl 200 mM. El complejo diluido se aplicó inmediatamente en una columna HiTrap™ ANX de 5 mL (GE Lifesciences). La muestra se cargó en un entorno de Tris pH 7,5 y se cambió en la columna a Bis-Tris pH 6,0. La proteína se eluyó usando un gradiente lineal de NaCl de 200 mM a 1 M. La proteína del complejo CRBN-DDB1 se pulió por purificación por filtración en gel en S-400 (GE Lifesciences). La proteína en complejo, como se identificó por SDS- PAGe , se combinó y se dispuso en cristalización o se almacenó a -80 °C en tampón de proteína (MES 10 mM pH 6,0, NaCl 200 mM, TCEP 5 mM). El CRBN-DDB1 a 30,2 mg/ml en tampón de almacenamiento que consistía en Mes 10 mM pH 6,0, NaCl 200 mM, TCEP 5 mM, o en un tampón alternativo de HEPES 10 mM pH 7, NaCl 250 mM, TCEP 3 mM. El CRBN-DDB1 se cristalizó por la formación de gotas por difusión de vapor. Se añadió lenalidomida 1 mM a la mezcla de CRBN-DDB1 -Lenalidomida mezclado 1:1 con, y se equilibró posteriormente frente а, una disolución de reservorio que contenía PEG 10K al 18 % (p/v) (Hampton Research, Aliso Viejo, CA) y HEPES 100 mM pH 7,5 (Hampton Research, Aliso Viejo, CA). Las condiciones iniciales de la cristalización se identificaron por cribado de matrices dispersas. Los cocristales aparecieron en siete días y alcanzaron dimensiones de 0,10 mm x 0,025 mm x 0,025 mm a los 21 días. Antes de la recogida de datos, los cristales se crioprotegieron en la disolución de reservorio suplementada con etilen glicol al 20 % y se congelaron en nitrógeno líquido. La estructura de cereblon humano:DDB1 se resolvió por reemplazo molecular usando Phaser (McCoy et al., J Appl Crystallogr, 2007. 40(Pt 4): 658-674), con DDB1 (código PDB 3EOC) y el TBD de cereblon murino como modelos de búsqueda. La construcción y refinamiento manual del modelo posterior se realizaron usando Coot y Refmac5, respectivamente (Murshudov et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011. 67(Pt 4):355-67; Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010.

66(Pt 4):486-501). Para la estructura de CRBN humano-DDB1-CC-220, se añadió CC-220 a la proteína a 1 mM y se mezcló 1:1 con tampón que contenía fluoruro de sodio 200 mM y PEG 3350 al 20 % y se equilibró frente a un licor madre que contenía el mismo tampón a 20C. Los cristales se crioprotegieron por la adición de etilen glicol al 20 %.

б. 9.2.2 Líneas celulares

La línea celular DF15R, que se ha mostrado previamente que carece de proteína CRBN detectable, se creció y cultivó como se ha descrito previamente (Lopez-Girona et al., Leukemia, 2012. 26(11):2326-35).

6.9.2.3 Plásmidos de CRBN de tipo salvaje y muíante

Los vectores de expresión lentiviral se produjeron en el propio laboratorio. Las partículas lentivirales se generaron usando células HEK-293T y la infección se hizo utilizando la metodología de inoculación por centrifugación. La selección se realizó 1 semana después de la infección inicial. Las células DF15 y DF15R se transdujeron y se seleccionó y cribó un combinado de células resistentes a puromicina por análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-CRBN (Lopez-Girona et al., Leukemia, 2012. 26(11 ):2326-35). Confirmamos la presencia de las versiones mutantes de CRBN correspondientes por secuenciación genómica de ADN en todas las líneas celulares.

6.9.2.4 Construcciones de ARN corto en horquilla (ARNsh) de CRBN

Se transdujeron construcciones de ARNsh inducible dirigidas a CRBN o una construcción control (Open Biosystems) usando la metodología de la inoculación por centrifugación en las líneas celulares de mieloma múltiple H929 y U266. Las células transducidas de forma estable se seleccionaron con puromicina. La expresión de ARNsh inducible (marcado con RFP) se monitorizó por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo usando 1 pg/mL de doxiciclina. La expresión de la proteína CRBN se cuantificó por transferencia Western. La proliferación y viabilidad de las células se evaluaron por ensayos de 7AAD/citometría de flujo.

6.9.2.5 Inmunotransferencia e inmunohistoquímica

La transferencia Western se realizó con anticuerpos frente a Aiolos (Santa Cruz) IRF4, c- Myc, p21, p27, y ppRb (Ser608). El anticuerpo frente a CRBN65 se usó para la detección de la proteína CRBN (Lopez-Girona et al., Leukemia, 2012. 26(11):2326-35). La inmunohistoquímica (IHC) de cereblon se realizó en el equipo de tinción automática de portaobjetos Bond-Max® (Leica Microsystems, Buffalo Grove, Illinois) usando el sistema de detección Bond Polymer Refine®. Los sedimentos celulares incluidos en parafina fijados con formalina (FFPE) se seccionaron a un espesor de cuatro micrómetros y se desparafinaron en el instrumento Bond-Max. La recuperación de antígenos se realizó con Epitope Retrieval™ 2 (ER2, pH 9,0) durante 20 minutos a 100 °C. Los portaobjetos se bloquearon para la actividad peroxidasa endógena con bloqueo de peróxido durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron entonces con anticuerpo monoclonal de conejo CRBN65 a una dilución 1:4.000 durante 15 minutos a temperatura ambiente. El polímero postprimario y marcado con peroxidasa de rábano (HRP) se incubaron a las condiciones por defecto del instrumento. El complejo antígeno-anticuerpo se visualizó entonces con sustrato de peróxido de hidrógeno y cromógeno de tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB). Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina.

6.9.2.6 Ensayo de perlas de análogo de talidomida para medir la unión del compuesto a CRBN endógeno

El acoplamiento del análogo de talidomida a perlas de nanopartículas magnéticas FG (Tamagawa Seiko Co. Tokio, Japón) se llevó a cabo como se ha descrito (Ito et al., Science, 2010.327(5971):1345- 50), y los ensayos de unión del extracto celular a estas perlas se realizaron con modificaciones menores. Los extractos de las líneas celulares DF15, DF15R o derivada de DF15R se prepararon en tampón de lisis NP 40 (NP40 al 0,5 %, Tris HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM, PMSF 0,25 mM, 1x mezcla de inhibidores de proteasas (Roche, Indianapolis, IN) a aproximadamente 2 x 108 células por ml (20 mg de proteína/ml). Los restos celulares y los ácidos nucleicos se aclararon por centrifugación (14.000 rpm 30 min 4oC). En los experimentos de competición, se preincubaron partes alícuotas de 0,5 ml (3-5 mg de proteína) de los extractos resultantes (15 min temp. ambiente) con 5 pl de DMSO (control) o 5 pl de compuesto a concentraciones variadas en DMSO. Las perlas acopladas al análogo de talidomida (0,3-0,5mg) se añadieron a los extractos de proteína y las muestras se rotaron (2 horas, 4 oC). Las perlas se lavaron tres veces con 0,5 ml de tampón NP40, y después las proteínas unidas se eluyeron con tampón de muestra de SDS-PAGE. Las muestras se sometieron a análisis por SDS-PAGE e inmunotransferencia, realizado usando anti-CRBN 65-76 (Lopez-Girona et al., Leukemia, 2012. 26(11):2326-35) (dilución 1:10.000) para todos los estudios; otras diluciones de antisuero fueron DDB1 (dilución 1:2.000) o p-actina (dilución 1:10.000). En los ensayos de competición de perlas de afinidad de talidomida, se usó un sistema LI-COR Odessey™ para cuantificar la densidad de las bandas de CRBN y las cantidades relativas de CRBN se determinaron promediando al menos tres controles de DMSO y expresando el CRBN en cada muestra de competición como un porcentaje de inhibición de la proteína CRBN en relación con los controles promediados como 100 % de unión.

6.9.3. Resultados

6.9.3.1 Estructura de cristal de CRBN formando un complejo con DDB1 y lenalidomida

La estructura de CRBN revela que CRBN es un DCAF que no presenta una arquitectura de repetición WD típica de la clase. la estructura del CRBN (FIG. 12) revela dos dominios distintos: un dominio N-terminal semejante a Lon (LLD), y un TBD C-terminal. La estructura revela que los sitios de unión a DDB1 e IMiD® se encuentran en lados opuestos de la superficie de cereblon. Se ha encontrado un polimorfismo humano en CRBN ligado al retraso mental que da lugar al truncamiento prematuro de CRBN en el aminoácido 419. La región delecionada se encuentra en el dominio de unión a IMiD®, con la eliminación de una región helicoidal corta y una cadena p (región delecionada mostrada en rojo en la FIG. 12). La región delecionada se encuentra en la interfaz entre el LLD y TBD, y podría esperarse que el truncamiento de estos residuos afecte de manera perjudicial la estructura y la estabilidad del dominio de CRBN.

El dominio semejante a Lon de CRBN (LLD) abarca los residuos 76-318 y contiene el resto de unión a DDB1. El alineamiento estructural con el dominio N-terminal Lon de Bacillus subtilis rinde una RMSD de 2,4 Angstroms sobre 165 residuos alineados (FIG. 13) (Duman et al., J Mol Biol, 2010. 401(4): p. 653-70). Sin embargo, como se muestra en la FIG. 13, el resto de unión a DDB1 y el sitio de unión a IMiD® no presentan ninguna homología con los dominios Lon examinados. Cuando se compara con Lon de B. subtilis, el resto de unión a DDB1 parece que está insertado en el dominio semejante a Lon, y está compuesto por una serie de hélices entre los residuos de CRBN 188 y 248. El CRBN se une entre los dominios de hélice de láminas beta A (BPA) y hélice de láminas beta C (BPC) de DDB1 en una localización similar a otros DCAF (p. ej., DDB2 o DCAF9), así como a las proteínas de unión a DDB1 virales Hbx y SV5V (Li et al., Nat Struct Mol Biol, 2010. 17(1): p. 105-11). Sin embargo, aunque el CRBN se une a DDB1 en la misma región, la naturaleza de la interacción con DDB1 presenta diferencias en comparación con DDB2, SV5V o Hbx. Los DCAF previamente estudiados, sitúan un resto hélice-giro-hélice en el sitio de unión a DDB1 que forma predominantemente interacciones con el dominio BPC (FIG. 14, hélices c y d) (Li et al., Nat Struct Mol Biol, 2010.

17(1): p.105-11). El CRBN interacciona con DDB1 a través de una serie de hélices; sin embargo, estas no se superponen con los DCAF que se han caracterizado estructuralmente (FIG. 14). En CRBN, los residuos 221-248 forman hélices que interaccionan con el dominio BPC de DDB1 (hélice a y b, FIG. 14). Los residuos de CRBN 191 197 también interaccionan con BPC de DDB1 en una región próxima a DDB2 (FIG. 13). Sin embargo, a la vez que interacciona con el dominio BPC, el CRBN también sitúa una hélice compuesta por los residuos 198 a 209 para que interaccione con el dominio BPA de DDB1, el primer ejemplo de una interacción de este tipo (hélice e, FIG. 14). Después del resto de unión a DDB1, la homología estructural con el dominio Lon se restaura entre los residuos 249 y 318 que forman un haz de 4 hélices, dando lugar así al dominio de unión a IMiD®, o dominio de unión a talidomida (TBD) en los residuos 319-428.

El TBD está localizado en la cara del CRBN que está orientada fuera del sitio de unión a DDB1. El TBD está compuesto por un núcleo de lámina p antiparalelo de seis cadenas, con un ion cinc estructural, coordinado por cuatro residuos de cisteína, localizados a ~18 Á del sitio de unión a IMiD® (FIG. 18). El bolsillo de unión a IMiD® en sí mismo está formado por tres residuos de triptófano, Trp380, Trp386, y Trp400, con un residuo de fenilalanina en la base (Phe402) (FIG.

18). Estos residuos forman un pequeño bolsillo hidrófobo (bolsillo tri-Trp) en el que se acomoda la parte de glutarimida de la lenalidomida. En el bolsillo tri-Trp hay dos enlaces de hidrógeno entre el anillo glutarimida y el esqueleto de la proteína en los residuos His378 y Trp380 (FIG. 13), y un enlace de hidrógeno adicional con la cadena lateral de His378. El anillo isoindolinona de la lenalidomida no está incluido en el bolsillo hidrófobo, y en su lugar se presenta en la superficie de la proteína que interacciona con un giro beta que engloba los residuos 351 -353 (indicado por el símbolo symbol p en la FIG 13). El oxígeno del carbonilo del anillo isoindolinona está orientado hacia la cadena lateral de His357; sin embargo, la distancia es ligeramente demasiado larga para que se forme un enlace de hidrógeno (4,1 Á). De manera similar, el grupo amino de la anilina de la lenalidomida está orientado hacia Glu377, pero a una distancia demasiado grande para que se produzca una interacción (5,5 Á).

En la determinación de si la interacción del fármaco CMA con CRBN puede servir para alterar la especificidad del complejo Cul4 ubiquitina ligasa por el reclutamiento de nuevos compañeros o alterar la afinidad por el sustrato de sus sustratos diana, es intrigante que el anillo de isoindolinona esté expuesto en la superficie del complejo CRBN-IMiD®, lo que indica que esta parte de la molécula de IMiD® estaría disponible para formar parte de una interfaz "neomórfica" en el reclutamiento del sustrato. En este caso, el potencial de enlace hidrófobo y polar no usado del IMiD® y la superficie de la proteína adyacente podrían jugar un papel clave en la alteración/aumento del reclutamiento de compañeros de unión.

El TBD puede expresarse y purificarse en aislamiento, y hemos usado este sistema para obtener estructuras de cristal del TBD de CRBN murino formando un complejo con talidomida y pomalidomida. La estructura del TBD se resolvió inicialmente aprovechando el sitio de unión a cinc predicho en un experimento de dispersión anómala de longitud de onda única a una longitud de onda de sincrotrón normal de 1,0 Á. Observamos que la densidad electrónica favorece el enantiómero S de la talidomida, que se cristalizó como una mezcla racémica. Posteriormente, confirmamos que la S-talidomida se une a CRBN de forma más fuerte que el enantiómero R por competición por las perlas con talidomida inmovilizada (FIG. 21) lo que es consistente con resultados previos usando los análogos conformacionalmente estables R y S metil-pomalidomida (Lopez-Girona et al., Leukemia. 26(11):2326-35). Las características centrales del sitio de unión a IMiD® que interaccionan con el anillo glutarimida están bien conservadas entre las estructuras de la lenalidomida, talidomida y pomalidomida, con los tres triptófanos proporcionando las interacciones clave al anillo glutarimida. También se conservan los dos enlaces de hidrógeno con His378 y Trp380; sin embargo, no se produce el tercer enlace de hidrógeno con la cadena lateral de His378. Existe una diferencia llamativa entre la estructura de la lenalidomida y las otras: las dos cadenas beta compuestas por los residuos 346-363 están ausentes en las estructuras tanto de la talidomida como de la pomalidomida (FIG. 15, 16 y 17). Hay cuatro pares proteína-fármaco en la unidad asimétrica en las estructuras tanto de la talidomida como de la pomalidomida. En todas las proteínas en la unidad asimétrica en la estructura de la pomalidomida, la región de cadena beta está completamente desordenada (FIG. 17). Los mismo es cierto para una proteína (cadena A) en la estructura de la talidomida (FIG. 16); sin embargo, en las cadenas B y D, las cadenas beta han adoptado una conformación alternativa donde estos residuos se unen al anillo ftalimida de la talidomida de una molécula adyacente en la unidad asimétrica (FIG. 20). Esta disposición recíproca forma un dímero en la red de cristal, con la acumulación de Tyr355 frente a la superficie accesible del IMiD®. No hay evidencia de dimerización en presencia o ausencia de IMiD® (datos no mostrados). El cambio en la conformación proporciona un cambio sustancial en la superficie de CRBN en la proximidad del sitio de unión a IMiD®, con el potencial intrigante de influir en el reclutamiento del compañero de unión. Se desconoce el grado en el que diferentes conformaciones se ven influidas por el truncamiento de la proteína o el entorno de la red.

Las sustituciones alternativas en el anillo isoindolinona/ftalimida proporcionan un segundo mecanismo potencial por el que se reclutan selectivamente compañeros de unión en el complejo Cul4:DDB1 :CRBN E3 ligasa. La lenalidomida y la pomalidomida se diferencian de la talidomida por poseer una sustitución en NH2 en el anillo isoindolinona/ftalimida. En la estructura de la lenalidomida este resto NH2 está orientado hacia Glu377, donde en la estructura de la pomalidomida este grupo parece ser capaz de orientarse en cualquier dirección ya que la densidad electrónica apoya diferentes orientaciones en las diferentes cadenas en la unidad asimétrica (datos no mostrados).

Adicionalmente, buscamos confirmar que el bolsillo de unión a IMiD está presente en ausencia de ligando mediante la determinación de la estructura de TBD de apo. Esta estructura muestra claramente que el bolsillo puede existir en una conformación similar en ausencia de ligando (Tabla 2).

Tabla 2. Estudios cristalográficos

* Los números entre paréntesis son para la capa de mayor resolución.

La Tabla 3 siguiente muestra las coordenadas atómicas para CRBN:DDB1 lenalidomida.

La Tabla 4 siguiente muestra las coordenadas atómicas para CRBN (TBD):Pomalidomida.

La Tabla 5 siguiente muestra las coordenadas atómicas para CRBN (TBD):Talidomida.

La Tabla 6 siguiente muestra las coordenadas atómicas para CRBN:DDB1 :CC-220.

La Tabla 7 siguiente muestra las coordenadas atómicas para CRBN (TBD):CC-220.

La Tabla 8 siguiente muestra las coordenadas atómicas para CRBN no unido-CRBN (TBD) (Apo).

Tabla 3. Coordenadas atómicas para CRBN:DDB1 lenalidomida (proteína humana)

ENCABEZAM IENTO XS“ 3C5CX-‘9-COMPUESTO O B SERVA CIÓN O B SERVA CIÓN 3 REFINAMIENTO.

O B SERVA CIÓN 3 P R O G R A M A R E F M A C 5 .6 .013 .7

O B SERVA CION 3 A U TO R ES

O B SERVA CIÓN 3

O B SERVA CIÓN j D A N A DE R EFIN A M EN TO : M A X IM A P RO BABIILIDAD

O B SERVA CIÓN -O B SERVA CIÓN i D A TO S U S A D O S EN EL R EFINAM ENTO.

O B SERVA CIÓN 3 R A N G O DE RESOLUCIÓN A LTO ( A T íG S T R O M S ) 3.0 J L O B SERVA CIÓN 3 R A N G O DE RESOLUCIÓN BAJO ( A N G S T R O M 5 ) 50,00 O B SERVA CION i PUNTO DE CORTE DE D A TO S ( S T G M r t ( T } ) NINGUNO O B SERVA CIÓN COMPLECIÓN PARA R A N G O { $5} 99.40 O B SERVA CIÓN i: NÚMERO DE REFLEXIONES 35336 O B SERVA CIÓN 3

O B SERVA CIÓN 3 A J U S T A R A D A TO S U S A D O S EN EL REFINAMIENTO.

O B SERVA CIÓN 3 MÉTODO DE V A LID A C IÓ N C R U Z A D A DE PRINCIPIO A FIN _{O B SERVA CIÓN} ; SELECCIÓN DE CO NJUNTO DE E N SA YO V A L O R R LIBRE A LE A TO R IA O B SERVA CIÓN 3 V A L O R R (CONJUNTO T R A B A 10 ♦ E N S A Y O ) 0.20710 O B SERVA CIÓN 3 V A L O R R (CONJUNTO T R A B A J O ) 0 , 20340 O B SERVA CIÓN 3 V A L O R R LIBRE ü .27777 O B SERVA CIÓN TA M A Ñ O DEL CONJUNTO DE E N SA YO V A L O R R LIBREí '&> 5.0

O B SERVA CIÓN 3 RECUENTO CO NJUNTO DE E N SA YO V A L O R R LIBRE 1$!>7

O B SERVA CION 3

O B SERVA CIÓN 3 A JU S T A R EN LA CLASE DE M A Y O R RESOLUCION.

O B SERVA CIÓN NÚMERO TO T A L DE C LA S ES U SA D O 20 O B SERVA CIÓN : R A N G O DE RESOLUCIÓN ALTA DE CLASE 3.01 0 O B SERVA CION 3 R A N G O DE RESOLUCIÓN B A JA DE CLASE 3.03$ O B SERVA CIÓN i REFLEXIÓN DE CLA SE (C O NJUNTO T R A B A J O ) 222 ?, O B SERVA CIÓN 3 COMPLECIÓN DE CLA SE (T R A B A 10 E N S A Y O ) (% > i2. Si O B SERVA CIÓN 3 V A L O R R DE CLASE (CONJUNTO T R A B A J O ) 0 - ■: ■ 3 O B SERVA CION RECUENTO DE CONJUNTO DE V A O R R DE CLASE : i :

O B SERVA CIÓN V A L O R R LIBRE DE CLASE 0. O B SERVA CIÓN ^"

O B SERVA CIÓN j NUMERO DE A T O M O S DISTIN TOS DE H DRO GENO U S A D O EN EL REFINAMIENTO. O B SERVA CION 3 T O D O S L O S Á T O M O S : I 1 C 9 S

O B SERVA CIÓN -O B SERVA CIÓN 3 V A L O R E S B.

O B SERVA CIÓN : DE G R Á F IC A DE W ILS O N ( A * * 2 } NULO O B SERVA CION V A L O R B MEDIO (G L O B A L , A * * 2 ) 3! . & 8 O B SERVA CION ' V A L O R B A N IS O TR Ó P IC O G LO B A L.

OBSERVACIÓN TEíJSQE

OBSERVACIÓN L1L : O. - : . ' . : ' :32 : i . ' 350

OBSERVACIÓN L 33 : n .. r,a: -i L t 2 : . .1373

OBSERVACÓN r . i 3 : - A .0003 T J11 - C . 35116

OBSERVACION ?S13£CB s

OB5SRVACÓN ) C i : L-.U. ■ l G i l : 0 , Cu lio i- i M M .C O tü OBSERVACION : Z 21 : - D . U P 4 £ 32 : - a . C J Ó Í £2 3 : -0.0 G 5 G OBSERVACION á 3¿ : J j . f ü j ; Í r 32 : - o . o o í :' £ii i - . - f i .D Ó ÍE

O B s tR v A ü Ó rj ;

OBSERVACIÓN ' GRUPO TVS i

OBSERVACIÓN ü «UVERO DE COMPONENTES tJÉl. GRUPO i

OBSERVACION ■ COMPONENTES s rs^::c!; A

OBSERVACIÓN i RAHGD Di RESCUCS ; A 70 i* A 1200

OBSERVACION 1 OREEN RWAiC ORUPO 1*3 : -,7! 4 - - 0 ?9.B 4 '.‘ S -47.2Í OBSERVACIÓN ■ " e iiíía ? r

OBSÉRVACBN i 7 - ^ t 0.1333 . . 2 : o . m ’

CBSERVACÓIÍ 1 : 3 í ¡ D . n & l T i 2 : - a . c u s

CBSERVACCr; C U ; a .C I’ NB 3. C .Ó 1S 3

OBSERVACIÓN 3 TEUSGP. 1

OBSERVACÓN 5 L i l i 0 ,6961 1,:.1 : G .49 ÍJ

CS5ERVAC1ÓÍÍ ■ L 3 J : D .50 & 7 L 12 : C .2 SSS

OBSERVACÓN i U j ¡ 'N . ^ R - t w v , - í l . C M l

OBSERVACÓN 'i ra u s o n a

OBSERVACIÓN ■ D i . : - 0.Q 211 -T - 2 ; - o . c us & 013 : U .C Ín i l OBSERVACIÓN '■ s ; í : n . o u c S ¿ Í I P .C .1 R& £ 23 : O .G 062 OBSERVACION ; S 31 ; - i . 041-6 S 33 ' ■'Q-02 Ó; 733 ; -0 -G 117 OBSÉRVACÓFl 3

OBSERVACIÓN i GRUPO TLS : H

OBSÉRVACÓFl i NÜUE RO DE COU PONEVTIS DEL GRUPO ;

OBSERVACÓN ■ COMPONENTES A r0 7 ST13BQT OS5ERVACIÓN 2 RANGO DE RESDUOS : c 167 c 2 se

^{o b s e r v a c ió n}¡ ORCEN PARA EL GRUPO IR Í : * 11 74 13. f . 121 ■ ■ í í . ' s - í OBSERVACÓN 3 rErtBCft t

OBSERVACION : l l ¡ U - j ó b í - ..2 ; 0.1 SL 'J

OBSERVACIÓN i ■73 i : 0.152 7 T I 2 : 0.0117

OBSERVACIÓN ; r i S ; -o.-ÓfiSS- T i l : Í2 C 171

OBSÉRVACÓFl rfia s c w i

OBSERVACIÓN J t i : f l . y : - * 3 .0 U 3

OBSERVACIÓN 3 133 : £1.7357 i . l 2 : -Ü .S rT IQ

OBSERVACIÓN : 213 : ó ... u-ió l . i : * 0.2416

OBSERVACIÓN i r e u g c a 5

OBSERVACION ! E l i ; [1.1361, £ 12 : 0 .0 B2 Ó 51 í : -0.11142 OBSERVACION 3 S í l ; - 0.0897 S i 2 : - S . Ó t J l £ 73 : ó , i 833 OBSERVACIÓN ; s a i * n . 2257 £ 30 : -C . 011:6 £ 33 í - f M S ’ S OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN GfcuPa TLS ; 8

OBSERVACION i HÚMERO ES COMPONENTES DEL GRUPO :

OBSERVACÓll I COUPONEIÍTT3 c jS - lE O i A

OBSERVACIÓN 3 RANGO 0£ PESCOOS ; 1 C IRC

OeSEHVACÓN ■ rango de resecos ; c 25? C 500

OB5ERVACÓN ORÍSEN PARA El CRU*Ü ÍA > : -36 430.: 4 T .C 4 S 3 -S7.00 ífl OBSERVACIÓN i “ El C lip 7

OSSÉRVACÓN i m ¡ t t . u j L ■p 2 ^ j 0.1255

OBSERVACION ' 733 : 0.119 J 1121 0.0123

OBSERVACIÓN ! C I i : - 0.01 : 7 j 0 ,01 -14

OBSERVACIÓN 7FWSÓ9 1

OBSERVACIÓN 1,11; I . i a & Q : O .E b i?

OB5ERVACÓN - i V i : 1. -ilri- ir . 2 ; * 0.4253

OBSERVACIÓN 1 : . i 2 : Ú . -3 J S 1 ■■ i : - 0.9160

035ERVACÓN ' "PÍJGOfT 2

OBSERVACIÓN - 2 ¡ ! i : Í1.ÜL1G S i 2 : -C.ÓÓ-1'J S i l : 0.0 *501 OBSERVACION S i i r i!. O l ió C 7J , - 0.1114 G 21 : - 0.0520 OBSERVACIÓN * S ó i: -a . lÁ T Ó £ 32 : - 0.0247 E 3 j í 0.1225 OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN 1

035ERVACFON uCOE LATO OE L DSOLVE MCE A GRANE L

OBSERVACIÓN i M É ÍO B O USAEO I E N D A S C A R A líÉ irtO

OBSERVACIÓN ‘ PARJ^iIfTROS PARAEC CÁLCULO M L ENMASCARAME UTO

OBSERVACIÓN 3 RADIO c e SONDA vtm : 1.2 C

OBSERVACION i H A D Ó DE SONDA Ü R : 0 BC-OBSERVACIÓN í H A D Ó CE ENCOGUIEríTO : Q - 30

OBSERVACION ■

OBSERVACION i OTRAS OBSERVACIONES CEU R -E fiA M ÍfíT C

OBSERVACIÓN v HIDROGENOS QUE SE HAN USADO SI ESTAN PRESENTES EN LA ENTRADA

ÁTOMO 1296 : g T - O 2- : 77: 9.6 V , - <: 41 3..0I 2 1 .

_ÁTOMO ^{12 y}CD ^:■ ^{A 176 ;. ¡ 40 .1 . S3C S i . 721 . , 0 0}24^{. ga ■;} _ÁTOMO ^{1193 ■; ■ FRG A [16 - g ., i} $4 ^{- 83 . 53.1 , . 0 0 .7 r, .71 c} _ÁTOMO ^{.. 2 ■ 8 O FRO A 176 i .} 7 ^{- 0 . 499 84.6 90 i .}00 22 ^{.92 O ÁTOMO 1 303 V THR A : ■ ■ -9 . 465 - 1 . 144 - S 2 . 7 /3 ¡ ,}00 ^■3^{.o. lí}ÁTOMO 1501 CA THR A :l 77 " 10 , 654 - 1.1 59 33.131 _{1 . 0 0} ^{2 3}....

ÁTOMO ] ÍÍ13 c e THR A ¡ ■ ^{- 1 1}1 ■ •} -2 ₆. ₂33 4 7,0 ¹.^{0 0}3:2. 7 i c ÁTOMO 1 )3 • . TKR A 177 _{- 1 0}374 - 3 ^{2 0}:: ¡ • 52 i 1 ^{0 0 2 2}„ ^{5 9}■■ ÁTOMO l í Ü 4 CG ²THR A 177 ^{1 2}5_{2 2}_ ²£3 ⁸14 i 1 ^{0 0}22 .98 c ÁTOMO ] 305 c THR A ^{, :}- i 5 i 4 _{- 0}575 - K ' " ^{1 . 0 0}3 i . ^{6 8}c ÁTOMO ^{1 2}3 0 THR u 177 j. i ::. 5 _{- 1 0}7 SO : ■..■ _{1 , 0 0} ²:. ^{0 2}G ÁTOMO ■ 30 V N I !'■ k I ! í ¡ ; .. ²4 a ₀82 ■: :■■■.: ^{1 . 0 0 ; y t}ÁTOMO 1303 CA I L E A 178 7. :■ _{1 0 6 6}K.. 350 r>^¡ÁTOMO , 303 CS .: I,Jl ■■■ 178 - i ; . ¹í 2 ; 6 -81 . j ¿ , ijO ¡81 . : i c. ÁTOMO ¹:13 I L E A ^.1■' a - 13 4:': 3 243 32 5 ’ S ^{1 . 0 0 2 1}. 50 c ÁTOMO ¹31 i c o i I L E A ^{1 ' 0} _{- 1}: ; i : 4 ■ '■■I ■ >3 : ¹■ :.. ²- ^{2 1}, ⁸c ÁTOMO ¹.^{3 . 1 2}TLE A 17Í3 : '. ■ ₈' ₀■ 9 30 ■ ■ 3 : . • ^{2 1}+ 50

ÁTOMO ₁31 ! 2 I L E A ¹78 _{- 1} i _{6 8}; r> ~ 7.' 81 5 1C ^{1 , 0 0}22.74 ^•ÁTOMO 13 i 1 0 .; : r .. 178 15 07 7 \J 47 ■ .1 ⁶■' 5 i , ^{0 0}. , . ^{-2 0}ÁTOMO .. ■; 5 t; CYS A 179 i . \ ^{2 0}i : 3 30 4 .4 ¹.. 06 22.61 R ÁTOMO 1 : 7 07 CT A 179 - i 582 ^{- 0}0 : - B0 96 i .^{0 0} 22 , ■5S ■ ■ ÁTOMO ■ 3 ¡ 7 c ?. i ■■ í< - i ⁶863 - I . ■' - 79 ■ - : 1 .06 2278 c ÁTOMO ¹. í¡ ₆• ' A 179 l a ■503 -1 H 53 :: ■: 606 .. oo 24 . 30 ■■ ÁTOMO : ■ 13 c C Y S k 17 9 ■■ i 415 fj 971 ■■ '■ ■: 542 ^{1 . 0 0 2 2}.36 e ÁTOMO • • • 0 OY O ^T.1 1 \> : 0 ■ ; ¹166 - : o 330 ¹06! 24 , Í J ⁰ÁTOMO .. • 2.. ■' P H E A 18 0 i ₈434 I ₆i(l 8:0 806 1.06 22 r 45 R ÁTOMO 1 Y . : CA PH E A 1 80 ~ i í • S4 5 7 j ;i ■ ;; 405 _{1 . 0 0}7².. y c ÁTOMO 1 . - C'B PH E ¡C^l! 80 - i :: 4 ' ⁰4 05: - ■ ; ². 1.06 7 ².^{2 2}. y ÁTOMO 1 :■ : : C G F H E A 1 8 0 18 7⁰; 4 411 31 165 . ₀? ^{2 2}. ⁰

ÁTOMO 1 . : . i T H E 6 130 -1 7 9 3 ¿57 - s ■: ■! ■ .06 72 . ■ i i.’ ÁTOMO :. ■: ¡ : s :. _b. i f . k 130 ; 4 : 83 4 : 64 G3 ⁰" I . oc 24.5: . c ÁTOMO 1327 e s * FH E A ' S O - 19.204 5.042 - 83.929 i . • 24 , . c ÁTOMO 1 ? 5 S T H E > 1 80 - 19.972 5 . ' : . ; .. 3..00 23 . 30 c ÁTOMO : ^{c d}2 F H E A 18 0 - 15.71 5 5 .281 - 81.60 5 ^{1 . 0 0 2}: ..: i c ÁTOMO ■ y F H E A I S O - 20.520 3.7 ^{4 3}- 75 , 642 _{1 . 0 0} 22 . 13 c ÁTOMO i - ■■. o PH E A 130 2 1.073 ².35 d 80 , 704 _{1 . 0 0}3:2 . 7 ■7 ÁTOMO . :: 2 V i V A L A 1 s .. - 21.32 1 3. 216 - 78.63 8 ¹.^{0 0 2 2 , 1 0} l i ÁTOMO 1 i i i ■:... V A L A ■18 - i , ^{0 0}21 ,34 ⁶ÁTOMO .. 3 34 C E V A L A 18.1 75.524 3.0 63 •. ' . Oí ^{2 2}j ⁰c ÁTOMO ] 335 C G l A l , A 18 . 5 . 1 . 0 0 ^{2 1}. íO c ÁTOMO ■ 336 : ^g: V A L A 137 ' ' 1 , 551 - 77 , 446 ₁, 06 27 ,25 r ÁTOMO : ¡ 18 : 22 .942 4. 575 75.031 . ü< ■■ . .^{2 1}c ÁTOMO .. 3 : 3 0 V A L h 182 - 22.263 5.83 8 - 78.501 ¹ f i f i u ■ ÁTOMO 13 3 9 W TYR A 1 82 - 23.8 25 5 .262 - 80.02 3 i . ^{0 0 2 1}.03 w ÁTOMO 13 40 CA TYR A 13 2 - 24.100 6.618 - 80.458 ■ . ü< 20.46 ’ . ÁTOMO I . T Y R A 18 2 - 23.277 6.560 - 61.706 : . í - 19.53

ÁTOMO ■ 342 O S T Y R A ! 8 23.7 63 6 ,335 8 2. 7SO ^{1 . 0 0}19 , 3 i c ÁTOMO 1 3 C DI : ■ P A, :• - 1 . ' 5 . 0 3 3 - 83 , 3 ⁶.5 ^{1 . 0 0}i. , l o c ÁTOMO .. ? 4 4 C H l TYR A 132 - 83 ,393 4 . 453 64 . 623 • .^{0 0 ■7}ÁTOMO 1 45 C Z T Y R A ! 3. -2 4 ■■ SCI 5 , i 60 - : .334 i .^{0 0 1}' ⁶c ÁTOMO 1 • : 6 OH T Y R A 18 ¿r -J :. ’ h 4 ,.638 - ■ 6 .4S2 1.06i 17 . ■ ■ ■ _ÁTOMO ^{.. 3} i ^{7 • - TYR A 1 8 2}- 25 .1 SI 5..447 - 3 i . 9 ^S i . y 18 ^{1 1}c ÁTOMO 1 343 COI: T Y R £ 18 2 -84 706 7 o • S i . r. ¹.. ^{0 0}y . í c ÁTOMO 1 3 4 : C TYR A : 8 '. .¿S' l 6..720 ñO . ¡ : _{1 . 0 0 2 0}. ■ : ,■ ■ ÁTOMO 1 350 O T Y R A 18 - 26 . !73 15..707 -SO .9 J_{. . 0 0}26. y ■7 ÁTOMO 1251 V i G L N A .i.:-’ 3 26 .052 ^y.955 u.:. 765 . .^{0 0}22.25 K ÁTOMO 1 3 5 ' y G l i i A i 5 - 3 7 . ¡85 8,, 2 ' ■ - 8 ■ .733 i .^{0 0} 7 ², i 4 c ÁTOMO 1 35 3 c ■■ S U A ! 3 3 b . ■ 1 -1 8 .665 79 .56.3 ₁. _{0 ( 1}2 j .57 í ÁTOMO :. 354 CG G L R A 1.3 3 - .3 7 45 6. ■; ;■ - SO . r.l 7 i . oo ¡ i c ÁTOMO ■ G ! *. 133 - y . ) . ¡87 9.,1 M fi 5 ■ ■ .^{0 0} 25 r l . B

ÁTOMO O KI 0 . i A i 3 ; - :¡-ü . : ’7 g 10.,; 88 -78 , . • ■ ¹. ^{0 0} 2 i .2 ' i ⁰ÁTOMO i 1 A 1.33 - 3 i Í57 e. 37S - . 330 i .₀: ²i y n ÁTOMO 1 3 5 3 O G L N A : 8 ■ -7 7 .610 9..3 i b - 0 . 1 0 ¹.^{0 0}24.62 c ÁTOMO ■ ■ .• :■ G ! A l 8 ■ .8 U 10.,: ■ ^{. . . . . .}

⁷32 , .^{0 0}24 , y ⁰ÁTOMO 13 50 f? : v ; r A 134 2.0 , c. 8..0 37 83. ^2;5 ₁._{0 0}25. y , R ÁTOMO 1 351 CA :■ ■: P . i 34 0 ' : 5..94 ■; o i . ü S 9 . ._{0 0}7 ; . £■ ^y;ÁTOMO .1.562 C B A S P A 13 4 -23 .: 9.. 4 Ki Sfi .433 ¹. ^{0 0 2 0}. ? ^{1 C}ÁTOMO 1 • ú 3 ¡- .■■. ! 34 - 76 - -- - 8. 3 ■ 8 fi . :: ’ - ₁. _{0 ( 1}25. SO c ÁTOMO 1 364 O D 1 A S P A 1.34 ■ O'' • 23 7 .79 1 ■ 3 : . 723 ₁._{0 0}7 - . 5¹ _■2ÁTOMO ■ i 6 5 O í'/. £ P A .13 ■ - 73 . ■: ¡7 H , 367 - 2o. , S5C ■ ^{. 0 0}■■:, y ,

ÁTOMO 1366 ■ ^'- ■ ' r- 5 ^{1 84}■o. , 566 9.. . JV ^{o ! .}¡ 9: ■

ÁTOMO 135 7 0 jftlíi? A 134 ... ₁. ₀- 27 . íé c .210 9.■ 2 ⁷83. : y ■ .. ^{0 0}27 , 28 C _ÁTOMO ^{1 3 6 3 e}: ^{PRO A}1^{8 '•}- 3: .275 : rt , ;; :. - 5 , : ².06 3 í , : 5 tí ÁTOMO 1 3 6 9 CA P R O A 1 85 ■ o: .1: 4.2 10., 7.. 0 85 . 35 : ^{1 . 0 0}29 . 34 c ^ÁTOMO1^{3 CB P R O} A ⁱ 3 :■ -72 .7 ó ; .11., 522 - S6 , 4²‘ _.1._{0 0}28.73 c _ÁTOMO ^I3 ^■■ _CG ^{T> A 187 ,}31 . " ' i 12.. : 34 : . ^{0 0}' y 42

^{Á T O M O} ^{1855 » I L E A}248 ^{- 3 0 . Í -} .; "■. ■: ^ ⁵ ^{- - - 2} ■ . ^{00 M . 96}c ^{Á T O M O} ■ ^{3 5 8}C : 0, :■ ^{i i . 1 6 9 5}..: ³ ⁴ n . ^{1 4 7} _{i . Ül} ⁴⁵ c ^{Á T O M O} , . v : : 0 ^{I L E A 248} ....... • s . ; 6; ⁷.. , : ⁵" . , ^{00 2 5 .} 7 _{Á T O M O} ^{1 S 53} ^V. ^{A L A A} ■■; :■ - 3 ' - :,! -9. i 42 ^{- 7 0 . 6} ¹² ,. ^{00 2 4 . 5 5}

_{Á T O M O} .. • - ^{C A A L A A 2} , ^í¡ ■ ; ; . i - ' - ^{9 . > 17} ••. ^{Ü 40 i} . ^{00 2 3} . ³⁸ ^c Á T O M O 1335 C 3 A L A A >4 e 1. 93 - : . c .3 - ro. 9 ■ 3 ■ , o c 23. 47 c Á T O M O 133 : "■ A L A A 24 - 73 _íí . :: 25 ’ ■ $ 8 ^^ ^ 7 1 . 00 22 . >e

ÁTOMO ] ' ' ' 0 A L A A 2 ■ 9 - . v .. -S 02 • 2. 14 3 .00 2:2. ,7 o ÁTOMO 1 ■■■:; tí PRO A 2 SO : . ' í 1.2 65 -- 67 * 694 3 .00 22. y K ÁTOMO 1 o 51 CA PRO A .. >0 i ' i .87 ; - 9 , 70c . .425 i . 00 2... 33 C ÁTOMO i y . ' : CB “F 7 A ¡50 - i - . : - .1 ■ - g . ■ 07 - 6 :■. ⁷:7 1 . ' i - 75 c ÁTOMO i . CG PRO p. :::: o “ • i . • 56 -2 ..163 -■ 66.2 48 1*00 21 ,66 ; ÁTOMO ■ 35T CD FRO k !>Ú : ... ■ - 3. 886 - 67.648 1 .00 : 2. 03 ■-ÁTOMO ..3 y 7 :■ PRO A : j o - 3 ■:. i 75 3 23;. - 69 , 604 ... 00 22 y ■ ■ ÁTOMO , : 63 0 PF.O , .: 40 - 54.4 O t -7 . ' ■ • . , 774 i , 00 21.78 0 ÁTOMO 1 -70 N PRO A : 5.. “ 35.5 S I - 9.160 T j . 31 .. .00 22 . .4 N ÁTOMO í s n CA PRO A - ;■■■, ;■ - 3 .243 83.86 ? 3 . Ü! :■ 7. ¡ j c ÁTOMO 7 ■ í ’■ CH PRO A 2 •: - 2 ■ . 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Í .25 - 63 . 332 2 .00 2 : , ;6 c ÁTOMO 1333 ■ ■ I L E A y . : - 2 .2.-7 - 6.6 -61 . 455 1.0 0 .43.28 r ÁTOMO 133 i O I L E A 252 - : : . ■ i - 6-L 36 ■ 80.503 22.56 ■ ' ÁTOMO i • ÍT 3 K 4 3 - .7 .7 44 -¡ 7 ¡2 ■■ 63.717 ■ y.-; 23*77 V: ÁTOMO :... .i ,,16 • . 4 , 5 . - 6.3.0 :5 . .00 24 , ! c ÁTOMO 13S' CB I L E A 5 :■ ! '. . 97 7 ■1.1 92 64 . 5 i i .00 7 . SO 7 ÁTOMO ] 00.1 I L E > ■; - 3 : ^.■ : ^.275 ■■ 65.474 3 .00 24 . :■ -. ■■ ÁTOMO : y ; C D l I L E A . : 3 - 30.577 - 4.711 - 66 .557 i .00 24.4 5 c ÁTOMO ■ I L E A 34 . 94 ¡ - 6.6 6 - 65.577 1 .00 27 . í ; c ÁTOMO 1 ■.5 . í : I L E A 2 >3 -.2 4.21.7 l .3 ■ -8 • 7: 1*00 24 . ! i ' ‘ ÁTOMO i s :■ 2 0 j.XiE A 75³.843 2.7S Í¡ ■I.. , 965 ... ^{0 0}24. _{. 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A 3 ■.4 - 36 .2 ' 9 1. 22.3 “ 58. 150 ^{1 . 0 0}34. ⁰? c ÁTOMO ■ i 0,2 CD GLN A ■. i ^{- 3}.7 27 1. 7. 58.118 3 .^{0 0}¡ y .03 c ÁTOMO l ... ⁰E ¹ G I - V i - : V . ⁸' - 2.7 - 57 , 379 ^{1 . 0 0}3 :■ .. ¡ ⁰ÁTOMO ..904 HE 2 G.liJ'T A ²i ⁶38. ¡20 1 223 58 ,947 ■ .^{0 0}■■ ■ ^{6 8}K ÁTOMO ^{1 . 1}3 : GLW A ■ T; 4 - 34 .^.27 . ■j . ^{0 0 1}- 60 „ 58c i .^{0 0}30, ⁶c ÁTOMO ¹304 ⁰■■ ! p. . 5 j 3-. ,83 ? ; ,063 -60. :■ : ^{1 , 0 0}50 , ^{6 6}- ■1 ÁTOMO 1.307 M SER A 25*3 - 33 .1 v 4 - Ó . Ifc,3 - 61.255 i . oo 77 S í Í3 ÁTOMO ₁• 3 CA SEF- A 256 - 32.4 - 36.3 “ 61 ,332 ■3,»00 7 . 08 ■ ÁTOMO ¹•. CB SER A ■ .4 -3.1 . ₆? l , ^{2 1 0}- 60 .1 . ¹.^{0 0 2}: . y ■ ÁTOMO i 9 : ⁰OG SER A 256 -3: .056 2.47 c ■■60. 109 3^{. 0 0 8 8}.04 ■ •. ÁTOMO 1911 ■■ SER A ²; : , ... .^{2 8}o . e i - í ' • . .^{0 0} ₂■■. _{6 8}C ÁTOMO ^{i . - 1 ■)}SER A 256 ^-31.6 ? 7 ^{0 , 1}32 - 63 .497 i ^{. 0 0}87 ^{, g ;}0 ÁTOMO i 3 i ■: tí THR A 67 - .30.543 1. f . ■ ⁶: -54.3 í . o o ^{2 8}.53 Í3 ÁTOMO :.5; 4 CA THR A 257 -21 .7 ..; 7 068 - 63. ó S í •. ^{0 0}73. : c ÁTOMO ■ ■ i 3 CB ■ - ¹-. ?. .4" ■■ ’ S.TSí .. 2 . 553 ■■ 64 , (192 ^{1 . 0 0}. y r ÁTOMO ¹3¹4 ₀G ₁THR A . y - 3 ' ,. 53 í . ².'7 - 84. 7²3 .^{0 0 2}; . SO ■ ÁTOMO ) 97 ■ CG ^-2TKR 7 ■ ■ ^{- 2 1}.0 ¡I .3 - 55 .404 ; .₀? 27 i ⁸c ÁTOMO 1313 ■: THR A ■' , V - 28.28 i .⁶■ - ⁶3 ; ^{1 . 0 0}82 ,34 c ÁTOMO 13 i i :■ THR r. 57 27.7 p 2 .040 y .7 35 ■ .0 0 87. 53 0 ÁTOMO 1323 ri I L E A 258 27 .858 ] . ; 13 ⁸i . 302 ■. ^{0 0 2 1}.^{8 8} n ÁTOMO ¹•. CA ¿ LE . 258 26 .303 0 . -.97 S-í .031 . .^{0 0}7 . .03 r ÁTOMO ^.1• CB I L E A ²„7> - 26.010 “ 0 .837 - 64 . 763 ^{1 . 0 0}.71 . ? 7 c ÁTOMO 13 ! i CG1 I L E A 58 -7 ^{. 0}i 5 “ 1.5 ti 3 - 64 . j ¡ <; ^{1 . 0 0}1 ■; . SO c ÁTOMO ¹92 i C D l I L E A ²7 26. ■ ^{2 2}. •• ■ 5 : . ■■ o '■ 3 .^{0 0 1}. 70 ■: ÁTOMO ‘ • • I L E A 58 . • 25 - 1.2 71 - 54 .479 ^{. 0 0}20 , 39 C ÁTOMO ■ 926 c : £ ².-.4 3 '.. 553 1 .554 ⁶! .5 - 3 ].. Oí ^{2 1}. ⁰c _ÁTOMO ^{.. 92 7 0 ¿LE A 248 2.5. 3} S ^\ _{.1 ■ 227} ^{6 5 . 7 J? . . 0 0 2 1}. ..... ^■2ÁTOMO 15 i; V A L A ¡54 - ²5 . ^{• 2 2 . 0}3 «i - 63 .610 i .^{0 0 2 0}.^{6 6}K ÁTOMO ..323 CA V A L A ²i 9 ■ ^{2 2}-. 665 3.¹31 ” 63.96 l i . 0 0 ^{2 0}. y c ^{ÁTOMO 1933 CB V A L A - ..}9 ^{- 2 4 . 05 i 4 , 22 7 - 6 7. i .; 3 ■ . .y : 7 8 6 c}ÁTOMO i -)3: V A L A 2 ■ ■ - 25.480 4 .⁸” 63.454 . .^{0 0}19*61 r

ÁTOMO : - CG L E U A ?8 . " .327:8 - 3 .73 ' 3 . . •’ 1 i - 7.: c ÁTOMO : 7 7 í CD1 L E U p. 2 ( 7 _ . .3 3 -i - 37 . ! . _. 1 .. . 777 c ÁTOMO . m C D 2 L E U A 387 - 8 0 . ; a 11 7 : 40 . ¡ 57 ; . - i . : >. c ÁTOMO C L E U A 38 ■ ... T i l . 7 ... 00 ... 16 ' ■ ^ÁTOMO Z 7 T J 0 ^{L E U}A 'i 87 ^{. 7 . 7} 1Z - i í - ^{3 2 9}. . ⁰.: 5 . 57 0 ÁTOMO ; 7 3 " H ARG A 383 - 21 .7 44 .. 4 . 7 • • ■ 4 0 . 0 3 8 .. . :■(: .77.. ■ 2 N ÁTOMO ; ■ 3 1 CA ARG A ;&S ■ 1. 35 ■; 2.4 . :■ 2(3: 9 . 6 5 8 3 . Ü( 12. 7.'

ÁTOMO ^{■ . :}C B ARG A 88 ? - 1 9 . 3 ' 74.6 80 4 0 , 8 39 7 . Oí! 1.2 17

^ÁTOMO::: 3 ■ CG A R G A 333 ! ^S. ^{S 7 7}13 .65S 7⁷, 7:: 1.00 ^.7.. . ^{7 7}• ÁTOMO . '.'3 i CD A R G ■ . - 383 : 7: , ; 7 3 27 , - .3 4 . 510 i , 00 5 . .48 C ÁTOMO ' .■ ■ KE A R G A ■ 3 8 - 2 0 .0 • 7..1.77 J :. 4 0 . 402 1 . 0 0 3.1 . ..>■ R ÁTOMO : 7 ¡i i C Z ARG A ; H S - i 9 . <350 1 0 . 2 9 : - 4 5 . ■ <-:s I . 00 . . . . . C ÁTOMO 2 ^rs\' ^{MH1 ARG A 3 8 3 - 1 8 . 1 7 2 ] 0 . t 9 ■ - "7 . 9 53 ] . 0<7 2 1. i l}R ÁTOMO a ⁵ U R 2 A R G A 338 .73. ..34 3 5 . 45 7 ^3 . B 51 . . o o 3 1 ..7:7 R ÁTOMO ; C ARG A 383 - 1 9 . 9 8 ■ 1 5 . 678 - . 61 3 1 . 0 0 1 . .372 ; ÁTOMO ■ ■ o 0 A R G ^X388 ...47 : 87: - 3 5 , 8 58 1 00 14 . -.7 0 ÁTOMO o.. ■ I L E A 38 9 - 17 . .. j . 3...., - 3 ■ . 4 53 i .0 < ' ' R ÁTOMO : rí i : : CA I L E A _{j k}y - 1 8 . í ' : ■ ■ . O í : -3<5 Ü : ■ .-•• : í . C ÁTOMO : 7 ■: í C'B I L E A 38 ■ - 1 9 . 5 5 3 1 5 . 7 , 56 37 . ( 102 i .00 i 7 . 8. r-ÁTOMO : r o í I L E A 3488 7.7 .0 2 . ■ 2 . 5 7 4 - . : 7. - . 0 ! 1 6 - Ti

ÁTOMO 2 ■ 3 i . i I L E A 3 a y - 2 1 . 5 4 7 14 . 36 1 - 55 .5 56 • . 0<7 : 3>. .■ i i.’ ÁTOMO . ^t:,ⁱ¡^sI L E A .38 1 9 . i 4 G ' .7 ' 3 3 . 9 92 I . OC 7 c ÁTOMO ; ■ s c I L E A .8 9 - 1 7 . 4 5 2 i 1 , . 81 3t í , '02 i .00 1 .7 , . '7: c ÁTOMO i ^{7 5 ?} _y ^{I L E}A ^{38 y}-4 ' 4 ^{3 4 , 8 7}■ ^{i r .} ³. ! "■ . 1 '7 0 ÁTOMO K I L E A 3 0 - 1 6 . 7 7 7. 1 7 . 1 17 - 3 6 .5 2 • .00 i 72 w ÁTOMO 1 *w .fV I L E A . - 1 5 . 2 . ' . ■.1 - 36 77 8 . >7». ■ 5. 5 c ÁTOMO 70. I L E A 39 0 : ¡ _ í ; 1 7 . 7 7 4 ■ ,28 . : 4 : 3 . 0 ( : 8 - í 7 : ' ÁTOMO L ^j 2 3 G1 I L E A 370 : . O I S 16 . 7.22 , 2 62 1 . 00 1 , ... c ÁTOMO .. ■: 5 i I L E A 3 ( 0 ' - .. , 58 8 40 , 6 1 3 .. . : : 1 6 , 0 3 c ÁTOMO 2804 003 I L E A 5 90 - 17 - • - 3.7 83 ■ 3 8 . 2 9 1 3. . ; ■ 15 46 c ÁTOMO ■: I L E A ••• - 1 4 , . 36 C -:: 35 . " 32 1 .00 3. j- 33 c ÁTOMO : ■■ 0 I L E A 3 * • ^J- . - .0 77 i ■ . 14 : ' ' 3 , 00 i t í , ■■ 0 ÁTOMO 2 33 ■ . A R G Á 3 91 i • 2.7 . 8 ■ ! . 82 4 2 . Oí - - l i ÁTOMO :■■■ 3 ARG A 77. - 1 3 . 0 5 2 ....... : " 3 3 7 .. 9 14 c ÁTOMO : s o 3 i ■ B ARG A ■ - 1 5 . 457 17 - ^sí2 - i : . c ; ■ . 00 : 7 . 7-ÁTOMO 2 ;. ; 0 A R G A 3: 91 - 11 . 1 7 . 7 8 ■' ! 05 ( 1 3. . 0< ;. 7.. ' . ÁTOMO , '• . 0 ARG A 39 3 ' . : ; 7 7 í .617 ,4 . 2 , 93 : . í - 3 0 ÁTOMO 2 3 : 2 ;; AgW A ■ 7 ■ - • 0 . 7 73 1 8 . 7 5 8 ■ 5 . 92 5 i . o o 720, 37i w ÁTOMO . 3 1 .: C 1 A s n A 38 - 7 . 4 Í 3 .3.51 í; - 7.7... ; 40 3 . 00 2 1 . 3 2 c ÁTOMO ^{.. ■■ ; 4 ' ‘ I ASI S A 29 2 3. . - 3 r : 34 i .07 3 . 0 0 l . ¿ 6}c ÁTOMO ^{7 : 315 ;G ASM A 7 7. - 7 . 1 3 1 • 7: , 5 6 3 - 34 . 7 50 •. 00 2}c ÁTOMO _h: :>, ■ :." o: ; ] . A S U A J , ./ ■ • , 7 77 1 8 , 4 0 6 - 3 4 . 9 68 1 . 00 -.. : -i ■' ÁTOMO • ' 1 D .7 AS M A 3 7.; 1 ¡V c 25 7 10 - 7 ¡ . ] . 00 7: ' .77 R ÁTOMO 2 ■ i 3 c A 3 N ^Sj3 3: ^{8 . 9 4 8}i .8. 17 8 3 ■ . .. ^{i . 00}2 2 . 4 c ÁTOMO 3 ¡ 9 V ^aS ^uA ■ 3; 3 5 . 557 1 3 . 7 ^{3 5}33 . .6 7 1 . 00 3 . ; 5 0 ÁTOMO 2 S >0 Vi G L Y A 3 ) 3 - í . ! . 77 1 7 . 2 5 . - 3 0 . 1 -■■■ i . . 2 2 . . : R ÁTOMO .. - .21 CA G L Y A 2 :: 7 - . • .. - ■ : 6 : Í 0 . 8 0 S . . i ;; . i . . . Q ÁTOMO 2 i i 2 : G L Y A ' 7 - 6 , 8 .1 15 , 1 1. - 30 . >757 1 . o í ; . 90 •: ÁTOMO i 32 i 0 G L Y A 3 7 -3 ■■ . : 1 4 . 9 5 ■ ■ 3 . . 5 5. 5 1 . 0 0 2 7 .7 7 0 ÁTOMO ^{4 ■■ I L E A 394 - 6 . 3 4 1 7 . : .: 7 - .. 9 . ■; 1} i ^. oo ¹⁶ _RÁTOMO a , I L E A 37 ■! 7 . SC 14 , -3 j«J - ; y . ( i n .i . 00 . 57

ÁTOMO i j i CB I L E A 734 - 4 . 6 177 3 . : , 908 3 . 00 2 i , y-j C ÁTOMO ■ Cv : I L E A 394 - -.. • . : • - 8 , 3 5 4 3 2 ■ I T i ' ÁTOMO 2333 1 I L E A 77 i 2 1 5 . 955 - 2 7 1 . 00 77 ■ . ■ : c ÁTOMO ■ s 7 i ■3 G 2 I L E A 394 7 , .. í 9 1 3 . ; 5 2 7 . 5 0 3 . 00 5 -7 > c ÁTOMO ^{■T 33 I L E}A ^{39 4 ' . S 9 3 72}2 8 . 6 7.7 ^{1 .07 . 2 5 . 1 : ;}c ÁTOMO . i 3 0 ¿ L E A 33:4 - 7 ... 23 . ; . 4 33 - 27 . 654 . . 7 : 7. 9 0 ÁTOMO 2 Ü 32 í: G L Y A 7 ■ -i7 . : 12 . I C O - 2 6 . 3 4 4 J . 00 26 . o : R ÁTOMO ^{: 3 3}< G L Y A 3 7 3 ^{- . :. í}- ^j! ^. ■ ■■:■ - 9 . ( 158 1 . 0 0 25 . 55 c ÁTOMO ^{22 774} _C ^{G L Y A} _{3 2 >} ^{- 7 .}; ¹■; ^{3 . 0 .0 9 0}■ 2 3 , O I S ¡ . 00 ^{.7 - . 9 7}c ÁTOMO 3 3 0 G L Y A 3.75 - i , : 12 ■ 0 . ;; ^-1: ■ . ■ 7 . 9 ' 0 ÁTOMO 2 3 3 6 i- I L E A 3 7 . 065 5 . 3 .4 77 . 4 6 ■: ].. Üí 2 7 .4 6 R ÁTOMO ³³³³⁷CA I L E A 73: tí ^{- 7 .}■ J¿ ^{8 . ..};; ^ú. 6 . ■; '■ . . . o c 2 " . : i c ÁTOMO : S 33 CU I L E A 37 tí i . ; -78 ^{3 , 7 7 5}- 7 . 7 6 3 , . •:>. ^{2 7 , 71}c ÁTOMO _{2 3 3 9} ■■■ _{I L E A}: 76 ■ ■_{... 2};. _{! ,} V _.79 _{- 7 4 . 6 1 1 1 . 0 0 27}■'■O c ÁTOMO 2 345 COI I L E A 77 tí , . 3.7 .18 , 4 .77: - 2 3 . 2 4 3 ■ . • 2 8 . 6 4 c ÁTOMO 2343 ^{I L E A 7 1 7 7 ■6} i . oo ^{2 7 .}

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ÁTOMO 4 3 32 C:" L E U A 602 5 . 6 ■■ . 0 7 4 - 3 . :■■■' ¡, l .00 5 8 . 37 Q ÁTOMO c; ¡ ; L E U A 60 : 4 . 3 6 4 .1 . . - 0 - 5 6 5 1 . 00 4 7 . 4 4 r-ÁTOMO _a3 3 i f D1 L E U A s o ' ' . ' 4 : 7 ¡ . 3 2 7 5 . 3 . ■■ ■ , 0 ; ■ 7 . . í . :-ÁTOMO 433 3 ■3 i ^j2 L E U A 00 63 ■■ 0 . 4 8 4 1 . o c 34 . 3 1 c ÁTOMO v : i 6 :. L E U A 6 o ; 4 . : 03 7 7 . 3 1 íi 1 .3 . ! 37 1 . 00 6 0 . : - ¡

ÁTOMO i ..37 Ü L E U A ■: 0 ' : , o .: 2 3 . 2 4 J 4 . 3 5 i . 00 S I . O ÁTOMO ■ ■ • : L E U A 60 ' i . : " ■ 2 6 . 4 y>. - 1 3 . 1 33 1 . 00 5 ¡ í . ¡ . Ii ÁTOMO 1_rv L E U s. 60 3 1 . 8 3 3 2 6 . 4 5(5 - .. 5. 2 i 8 1 . 00 57 . 58 c ÁTOMO 5 C B L E U A 6 0 3 ' . i M 2 5 . ' i - 1 . 3 5 7 ' . o c 4 4 . c ÁTOMO ¡i : . C G L E U A 60.3 ! 36 2 4 . ' 2 2 - 1 8 . i l 1 . Oí '■4 . 01 ’ ' ÁTOMO ⁱ ^{:: i 2 C ' D l L E U}A ^{0 0 : o 31 . 7 2 j 16 . 21 ... 00 2 6}

ÁTOMO 4 3 43 CD.3 L E U A 60 i .1 . . 4 . 2 5 , 4 4 1 . 8 . 1 6 . i , 00 47 , Í Ü c ÁTOMO 4 • í 4 C L E U rt 60 2 : . O 54 26 6 3 ? 1 2 . 5 1 3 1 , i' ■' 62 ^j2 c ÁTOMO ^{4 • 4 • 0 L E U}A ^{6 0 ' o . ■ . 2 5 4 i. ■ 1 1 . 4 95 i . 00 61 . 14}O ÁTOMO 4 34 6 N C Y S A 60 4 C . 0 4 4 7 7 . 8 9 3 - 1 9 . 6 7 3 1 , 0 0 50 . 60 t? ÁTOMO ^{A x} ^{' CA. C Y 3}A ^{. 0 4 i . i ... ■; 2 ■. 7 1 . 7 0 4 i . Ü( 6 .......... c}ÁTOMO 4 í 43 C B C Y S A 60 4 0 . 8 6 5 28 9 Í 5 10 ■ 34 ... 00 61 i 9 c ÁTOMO ■j.? ■; • S G C Y S A 6 0 ; - .1 . ; . .<. 2 . • 5 '■ ■■ 9 . 3 1 i 1 . 00 4 - . 1 s r> ÁTOMO 4 35 ; C C Y S A 60 4 3 . i i 7 7 . 8 3 4 - 1 2 . 3 6 4 ... Oí 4 . . 4 i , - . ÁTOMO 4 ■ ■■ . 0 c r . s A 60 4 ‘- 2 .6561 2 í . 7 f ; 5 ' 3 . 2 32 1 . ! ¡Ü 6 " . 46 . ■ ÁTOMO 435 2 N A L A A 6 0 , . 3 6 3 .16. 1 3 - . . . ' 3 6 i . 00 6 . 4 ; t í ÁTOMO ^{■ . 3 i CA A L A}A ^{5 0 5 . ' i 2 6 . 8 8 ■ - 1 2 . : v i : i . 00 4 . S S -■}ÁTOMO 4 ? 54 C B A L A A 60 5 - 5 . 0 2 0 25 - 4 2 ........4 42 1 . 00 62 08 c ÁTOMO ■: 5 3 C A L A A 6 0 5 - 5 . 7 5 ■ 7 7 . 4 i - 1 1 ■ 537 1 . 00 6 ' . 59 c ÁTOMO 3 56 0 - ^V T ⁱ V ^V -U ^íÍ^kt A ■ 0 3 * 5 , 7 o 7 77 - . -3 .7 ; . 0 i , 00 65 , i : ^•- ^■■ ÁTOMO 4 357 t í LEO- A 60 6 - S S S 20 i 37 - 1 2 . 0 3 1 . . o o 4 7 S I I í ÁTOMO 4 353 C A L E U A 60 ■ - 3 . ." 75 28 8 Í 3 - U . 2 0 S : . 00 S O - : c ÁTOMO 4 5 . ■: C B L E U A 60 6 ' V . : 3 7 1 2 . ■ o?; - 1 3 v 6 ': i . 00 6 ■ . . 9 ■ ÁTOMO 4 C G L E U A 6 0 Í! - 7 . 1 1 3 3 1 . 4 12 - 11 . :-,l : , 00 6 7 . 52 c ÁTOMO 4 ' c o i L E U A 70 6 . 6 ¿ 3 32 . :: 15 .. . , 0 1 4 . . 00 6 - . 87 c ÁTOMO 4 352 C B 2 L E U A 50 6 ■■ " . :. 5 3 1 . 9 7 5 - 9 . 8 3 5 1 . 00 60 . : 5 C ÁTOMO ^{4 . íi i C}LEU A ^{6 i 2 B 2 . 0 . 0 2 .. i ■ 11 . 4. 4 i , o c 5 3 . ¡ i c}ÁTOMO i : 4 i Ü L E U ñ £ 0 6 - ‘ . 04 2 7 . 3 4 1 - 1 .. . 4 ! 7 1.. 00 •y¿ 09 O ÁTOMO 4 35 = N G L Y A 0 0 - 5 , 7 ; 1 3 . 5 í ■ 9 . 9 3 9 .1 . 00 7 1 . 98 t'S ÁTOMO '■ S 68 CA G L Y A '. 6 3 . . . 2 7 . i 4 1 - 5 . 5 0 ? i . 00 7 c ÁTOMO 4 3 ■ ■ c G L Y A 60 ■ - 1 2 . .145 2 ; . 4 14 - ■ 0 - 4 82 1 , 0 i ■: 23 c ÁTOMO 553 0 G L Y A 60 ? - 1 . 5 . 2 77 77 . 7 77 - 0 . 8 6 7 1 , 00 4: . • O ÁTOMO - i 6 9 VI A S P r. ■: 03 2 ■ , 4 5 4 í i . 4 1 8 ^{. . / í r}■ . 00 7 4 . 2 0 II ......

ÁTOMO C A A ñ p A 60 8 12 , S ?.! • . - 1 1 . 3 12 1. . 00 7 1 . 5 4 c ÁTOMO ^{S j ' f i C B A S E 1}A ^{6 OS i . . :. ' .31 . -. i . : . . 4 60 . . 00 7.. . 5 ; r}ÁTOMO 4 3 ■ • C G A S P A 60 0 - 1.1 . 6 32 3 1 . 9 02 - 1 3 . 1 9 6 . . 00 7 2 . 2 1 C ÁTOMO 37 ; O C X A C P A S O S : .0 r ; 3 1 . 2 8 5 - 1 4 - 4 44 4 , 0 0 71 .22 0 ÁTOMO 4 1 f 4 0 D 3 A S P A 6 ' 08 1 J . .1 ■ :■ 3 3 . 1 9 6 3 . 2 0 1 : . 00 4" . 14 Q ÁTOMO 4 c A S P A 6 06. - 1 7 , 5 6 3 ' I . 21 8 - ' 4 . 4 97 ' . 00 4 : . ¡ : C ÁTOMO 4 3 ■ 0 A G P A ■ OS i r , - . 4 - : • . 1 ■1 . 58 0 i . , Oí 64 . . 0 ......

ÁTOMO i í G L Y 6 0 6 i ..... 13 2 8 . ¿ 9 6 . . . 8 14 . . 00 4 : i H ÁTOMO 437 3 CA G L Y A. ⁷o - 1.1 , 0 5 .: ■ ■ j - 5 . 0 H . . 00 4 . 9 S c ÁTOMO ^{4 3 ■ ■= C G L Y}A ^{6 0 e 6 . 8 8 3 2 1 .. - . 4 . ¡ 3 6 i . 0 0 6 2 . 3 5 c}ÁTOMO 4 3 S 3 0 G L Y A 60 5 - í . . O i ^{í v}. ; - i - 6 . 8 5 3 ■ . 20 6 2 . 4 7' O ÁTOMO 4 - N A L A A 61 0 4 . . • 2 9 . 4 3 9 , . ¡ 10 1 . 00 4 7 . 44 K

ÁTOMO ■: : ' 0 I L E A 6 . 16 ■ ? >7 26 77 7 . 66 ¿ 7 .00 7 L . 27 0 ÁTOMO 4 1 tr GLU A 6 i :■ l ’J .5 . . 73.4 3 : ' ' . i .00 72 . ■ 1 K ÁTOMO 4 i 54 o GLU A • • 36 . .37 26 .7.: 3 S . ' • i . 00 o í . 14 c ÁTOMO 4 155 C 3 GLU A > : 4: i 9. £ 77 7 7 .1- 37 - . 95S 1 . [•• 68 K c ÁTOMO 4 -156 r- GLU %. 61 • 17 : - 30.1 27 7 .108 _ .00 7 . 12 ; ÁTOMO ■■■i Tí J GLU A Ó1 ‘i! 1 . .7 7 30.1 16 6.6 36 1 . 00 6 ó. 45 0 ÁTOMO 4456 tí THE A 620 7 ' .733 31 062 3 ,733 ... 00 ■ ■ 7 K ÁTOMO 1 i 53 CA THE A 620 : i . i 4 . . 377 -8 , 25S . . • . 7 i C ÁTOMO 4 ■; SC ■ . THR A 620 i = . ■ i : 33 . 7 2 “ . í 93 .. .00 “ 7 . \ í c ÁTOMO ■¡ ■; 6 2 THR A 620 i ■: .56 ■ 1;' .326 -7 .3 94 3 . Ü! 67.6 c ÁTOMO 44 ■ ■ O THR A 4 ? 0 : 7 . - 4 , 32.6 75 6 ,407 . .00 62 7, 0 ÁTOMO ■: i S í 2 GLY A. 521 : : .7 17: .. i .556 3 , 3 67 1. 00 ■72 .70 N ÁTOMO 4 -i S i C . GLY A 62 : 7 . i ■- 1 31 . L1 -7 .838 1 , 00 60. : 1 c ÁTOMO 44 V, GLY A 6 1 , .171 ? 1 .7- ■ 3 . “ 73 7..00 60.77 c ÁTOMO 4 i O GLY A 62 - - r - 32.£ 67 -7 , ' 7 i .00 58.25 0 ÁTOMO ■ ] SV i-T LEU A 62 ' i 2 . b -13 33.7 4 £ -S . [79 J . V ". ó i . i : tí ÁTOMO 4453 CA LEU A 322 . 12 2 34.776 . £55 . .00 6 0 .19

ÁTOMO 1 _ LEU A 622 i ...4 00 .: . .054 - 1 0 . : 57 1 . 00 60. 76 c ÁTOMO 4 ■:7 ■: LEU £ 627 :■ .6 73 34 .7 • • - . 0 .8 ■... 1 00 58, -7 r ÁTOMO ] : ; j 0 LEU A £2.2 ........1 35■7 65 - .....608 l . 0 < “ 7. ..3 0 ÁTOMO 4 tí LEU A '-77 í 7-s ■ ■: . C J ;i -- 1 , ( 197 5 .00 5 >. 5 b w ÁTOMO 44 ■■ i CA LEU A 623 6.7 30 34 .. : • -1.7. : 60 1. 00 5 S .00 r ÁTOMO 44 ■■■! OB LEU A 62 7 " 7 : - 31.■ 46 - i l .5 63 “ • ■ 6 - -7 :-ÁTOMO 4175 c LEU A C 77 . - sa 35.4 67 - 13. : . ■ .06 -56 . ■ : ;.' ÁTOMO 44 ■■ 0 LEU A 623 e .: 3.7 .36 , 6 ■ 2 . 33 . .00 5.26 0 ÁTOMO 4 ! 77 ■ S e r A ■: 7 : í . LOO 2:3.098 ■i . 39-: i .00 56 . 30 H ÁTOMO 4 178 : :.v SER A 624 7 . ?f .067 - b .460 3 .00 7 ■ ' " C ÁTOMO 4 7 : ■ _i SER A 62 4 S . i 43 36. 355 - 16.134 I . V 5 í . 7 :. c ÁTOMO 4330 o s SER A 624 3.7 ' 35.1 ■ - 6.702 ' . - 5 ■ ge, • , ÁTOMO 4431 ■i SER A 624 • ' 33.5,62 - 16 , : 4.': 7 . Oí 31 '' ÁTOMO ■i ) 82 O SER A 62 4 0 . " 7 i 34. ...5 ..6 . 857 ... 00 5 :! , 5 0 ÁTOMO 448 3 . A S P A 52b ! .067 36 . Si i 3 . i . • 37 .. .00 :, -i . 74 tí ÁTOMO 44S4 CA A S F A 625 4 . 2 2 - 3 c .: 7 ' 13.0 .33 1 . i ■ 50 15 c ÁTOMO 4485 A S F A 673 '3. ¡ 35.£ :4 -■ ' S . !i 5 7.00 7 , b c ÁTOMO 4 4 a s C G A o ? A ■77 •' • 36 ,348 - : !- . •- j 3 i . 00 ■, 3. c ÁTOMO 4 ■: 3 ■ O ü l A S ? A 625 7 , 120 3 '. í 19.5 77 j .0 ( : . . 0 ÁTOMO 1433 i"'!...; A S F A 7 1: ■ 7 . 376 36 468 ..9.9 í "' ... 00 : 80 0 ÁTOMO ■J i 8 ■ c A £ P A 63 r". 3.7 .;■> . . .. S - 17 . • 0 i J .00 ; 7 .7 ! c ÁTOMO 445 ; ⁰ A SP A 1 í ²: :■ 2.7 3i 3 6.270 .. .. 7 74 i . Oí ²■: . ¹ -j O ÁTOMO 449 . ■: LYS A 63 ■ ■ .--43 35 . - “ 30 , 717 7 . • SO 60. 7 ? n ÁTOMO ■ i 32 ^aLYS A 677 1 .2: 7 34 . - .7: 20 . 19! 1 .00 6 i . ■ ■ c ÁTOMO 419 ^í C B LYS A 67 I .. : .. ' 33.5 7 -■ ,Tj,3 54 i .00 ■: . 9 ; c ÁTOMO 4434 c LYS A 63 ■ . .743 33 .761 18 ,702 7 .00 65. 77 c ÁTOMO 4335 0 LYS A 627 3 .: 35 53 , 256 -■ S ■ 589 i .00 6 :■. 5 0 ÁTOMO 43 ■: S í-: LYS A - . o ■ ■ , i 15 33.804 -■ 0.296 1,00 ■■ :.. u ÁTOMO 4457 - LYS A 528 - 7 . 775 33 318 - - • 60 ] . •• 6 ■" 5.7 c ÁTOMO 4133 CI LYS 6 77 - 3 , 0 S3 34 ,4 7-í ■ 8 . 973 ■ ■ ' :: 64 77 c ÁTOMO ■ : c e LYS ^A 628 .:. • ' 34 . ■ - . O . . •• i .00 63. 07 ' ÁTOMO 4500 0 D LYS ^A 628 ■ ■ .-.-i: . 1.123 . 73 : s ^{. 00}“ 2. , i c ÁTOMO LYS ^A 628 ^{■- .} i 44 - .6 fe • . .00 6. . 96 c ÁTOMO 45-1)2 HS LYS A 377 - ^{7 , 7}7 » -- 6.6 70 i .00 61 , L J ^tí ÁTOMO 4503 í LYS A 628 - 3.310 32.668 - 0 .6: 7 1 .00 58. Ol c ÁTOMO ■ O LYS _A £28 - . .: 47 ¡2 : 3 : --.....882 7.. 00 67 0 ÁTOMO 4 ■: m ^A 3 : : - 4 . i 70 : i .7 64 .. ■ () ;; ² i .00 67 , S ■ ^tí ÁTOMO í :■ 0 i CA V A L A 620 - b . j 57 5 i .058 - 2 1 . 2 i 5 i .00 ■I 7 .15 c ÁTOMO 4 C - V A L 6 > 9 -- 7. ■ S ^l 30 - ' -21 . “ ; 8 7 .Oí 69 70 c ÁTOMO 4503 ::a V A L A 6 ’ ■■ - 3 .6Í 3 7:: ,071 -21 .15 s 1.00 • ' . • c ÁTOMO ■ 50 i ■ .■■ ■ V AL r. 620 1 ,7 77 L : .22- 2 2 . ' 64 ■ .00 63 . 33 c ÁTOMO : 5 : O V A L /- 629 l . 77 13.500 2 0. 230 •. 00 67 . 56

ÁTOMO : 0 V A L A 67 3 ^{6 . 0 10} . .6 -- i 9 . : -J .. ⁰⁰70. 2 0 ÁTOMO 4 . i ÍT THR A 6.30 -7 34 30.1 .3 - 2C^j. ■ 3 : s .00 7 . . 58 tí ÁTOMO 45 i i THR A 630 -6. . . - 78 ■ 0.085 ^{1 . 0 0}6-1. Sn c ÁTOMO 4 ■ i ■: THR ^A 630 •' : ■ • 30.91 : ■ 20 ,018 •. 00 £.: . c ÁTOMO 45 ! • 4X71 THR A 330 - ■ 7 . -: 7 i .05■ - 75.57 C ^{. 00}6 :. 80 ⁰ ÁTOMO 4516 G2 THR A ■ 30 ■9,5 5 ■ 3; : 7 5. 4 ].. Oí 62. .3 c ÁTOMO . 17 c THR A e ;;. £ .0 . i ... . 675 2 0.772 . .00 i " n u ÁTOMO 4513 0 THR & 530 : ' ; , 5 ü - 23 , ³⁵.. ⁰⁰60 . 5 ! 0 ÁTOMO 3 i i 5 Í-T LEU A 6 ).. ■ 7.562 ^{2 .} íü-c - I ' : . O0Í.7 i . 00 4 . 31 r? ÁTOMO 45 ' : c LEU A 63 -£ . 77 77. 327 - 70.482 .] . :1 77, VJ. c ÁTOMO 4 Í7B LEU A 631 8. 7 14 25. : 5. 8 >C . .00 62.36 r

ÁTOMO ■ ■ : '' u T Y R A ■ . >. - 2 5 . 1 . . 7 , 134 : 3 , 2 ! 1 1 . 7"7 . 2 , 1 3 f? ÁTOMO i . 53 ■■■ 7 T Y R A 72 7 - . : . . 5 7 . 1 - 4 4 . 2 51 1 . 00 1 2 . :■ ■7 ÁTOMO C B T Y R A ■ l o í l 6 . 1 1 2 4 3 . 6 12 1 . 0 0 l ... Í S 7-ÁTOMO : 55 e s T Y R a. 7 : 7 - 3 0 . : 5 ■; 5 . 3 : ^b- 4 . 7 8 6 i . 0 t 1 '■ . 70

ÁTOMO 5 1 5 6 C D 1 T Y R ü. 7 1 8 - 2 9 . ' 04 4 , 7 66 - ■ 4 3 , 3 36 1 * 0 0 1 .. . l O f' ÁTOMO i T i F 71 S - 2 5 . ■ S>1 4 . 0 r; ■; 42 . 3 5 5 i . 00 1 i . ■ 1 ■■ ÁTOMO .. 153 72 T Y R A . 18 - 1 7 1 3 722 4 1 . 2 2 2 1 . 00 ... , 7 '■ -ÁTOMO OH T Y R 7 1 8 " 2 7 . 4 5 ■ : .. ^m- 4 0 . 0 _i 1 1 , 0 0 1 1 . 65 0 ÁTOMO 3 - : ■ "17. T Y R A 7 1 8 - 2 9 . 4 6 7 4 . ■■: 71 ■ 40 . ' i , 00 i .. . 5 S c ÁTOMO 5 1 61 C r.T T Y R A 71 8 ■■ 30 . 36 : 5 . 1 7 5 ■ 1 , 4 2 1 . : ■' 11 , 55 i ’ ÁTOMO ■ : ■ '■ c T Y R A 7 1 8 - 3 1 . - . : 3 , 1 6 3 4 3 , 1 77 i . 0 Ó 1.2 03

ÁTOMO 5 1 6 3 0 T Y R A 71 6 3 1 . 3 6 : 7 . & 2 7 1 6 - 6 7 6 1 , 0 0 1 . . .7 7 V, ÁTOMO 5 Si-I . .. Ü ■ i 7 i . i o : 8 , 4 B Ú ■■ 4 S i j. 6 6 í . o o 1 . 1 9 ! ■ ÁTOMO ... C A GLTJ A 7 9 - 3J . . 7 3 ? 1 0 . 4 2 ■ 4 6 . 0 9 1 1 . 0 0 1 J . .79 c ÁTOMO D . ■ 5 CE G2.U A " : ■' - 3 . 2 0 0 i 0 , 8 4 3 - i 7 . : 17 1 . 0 0 ; Í . C i ■ ■ _ÁTOMO5 1 6 7 CG _{G Ü}5, ^{7 1 9} _{- 3 3 . 3 2 3} ^{] 0 , 7 * i}- 1 4 , íl i : 1 . 0 f 1 5 . 4 5 c ÁTOMO 53 c e o , . ! A 7 1 9 . ' 4 . ! . 7 77 - - 43 , r>l 4 . . o o 1 $ . $ 7 c ÁTOMO 5 16 & 0 E 1 71. '■ A 7 1 5 - . 7 . . 1 2 . 7 3 8 - i 57 ... 00 17 . 60 ü ÁTOMO 5 i .7 0 C JE A ■í í j - 3 5 , .. 1 0 . 844 Í .-■ . 2 02 .. 00 17 . 0 ÁTOMO .■.. - i 7 • A 19 3C . 944 .. i . e .. ? 13 . 105 .13 * 18 -ÁTOMO • 0 7 . i; A ' : 7 - 2 Í . 5 o : 3.1 8 18 - 1 3 . : - i . 1 . 00 1 2 . ¡ 3 <: ÁTOMO 5 1 7 3 14 ■ ' A 77 Q - 3 1 , 2 7 6 1 "■ . 4 ' : 4 " . • : 7 : . 00 1 3 . 0 3 \‘í ÁTOMO S ; ¡ CA S E R 7^ . 720 ■:íí ■ 5 . 6 3 9 4 ; . S I a ' , 0 : 1 2 . 13

ÁTOMO i 7 5 C B G-'.K A 7 2 0 - 3 0 . 3 4 : i 4 . 1 4 7 - 4 3 , ':■:■■' ■ 7 , ^y; 1 2 . 5 4 c . o e

ÁTOMO . . ■ 5 0 0 5 • l i o 3 0 . ■ 3 ■ 13 4 9 , 5 9 2 1 3 . 2 1 0 _ÁTOMO ^{6 i 7 7}c ^{S E R A 7 2 0} _{i í}l ^{i ' ! , 7 7 i 1 6 , 5 9 5 1 , 0 0 1 3 . 1 6 7}ÁTOMO 5 . 7 8 0 S £ R ■: ■) 0 - 3 J . 0 3 : 1 5 . 3 4 7 - 4 6 , 5 7 7 ■¡ . o o : 3 . 2 7 O ÁTOMO _ ? 7 N P R O A 72 2 - 2 5 . . 15 . 17 - i ■. 8 52 .. . 00 1 3 . 3 ü N ÁTOMO 5 :J -7 C A P R O A 7 2 71 ■ 6 . V '. ■ - - 15.1 ) 30 ■ . o e ' 1: . 50 C ÁTOMO 5 . ■ . . Í .Í PRO A 2 . 2 6 . : ■ 3 7 6 . 1 5 2 ! 4 . 7 ' 7 i . O í : 7 . ,;7 i:' ÁTOMO 51 S 2 CG P R O A 7 21 2 7 . 5 3 2 . 727 M . 8 41 ... 00 1 5 . 6 3

ÁTOMO CD P R O A 2 6 . 4 5 8 i 4 . 34 : 4 5 . 3 ' i . 00 1 r v

_ÁTOMO5. 84 c ^{P R O ; . ■J21 •4 *7 IT 5 . 9 7 5 1 . c ■ 1 3 . 7 5 ■}ÁTOMO i . 35 0 p ■.. > A 77 . - 17 4 55 4 i . 8 54 1 . 0 0 a o

ÁTOMO 32 S 6 K ARG A ■ 7 2 - 3 C ■' 3 i a . . 45 1 , 00 : , . 25 Tí ÁTOMO : ■. 3 ■ O.'i 7 7 7 22 3 : . 0 ■ 1 5 , ' 7 7 ' :■■ - 62 i j . 01 14 . ;:■■

ÁTOMO i 1.3 3 C E : A 7 22 - - . . . 2 1 15 02 7 4 ■ . 8 01 ... 00 17 .97 c ÁTOMO 7 : 7 A R G A - 7.1 - 7 63 1 5 . - 7 5 - 4 $ - 2 3 6 I - 00 1 5 , 2 i . ■ ÁTOMO i . 3 J CD A R O A 7 2 2 - 3 1 . >■ 1 9 . 2 1 7 - 4 9 , a • 2 ... 0 ! 1 6 , f 5

ÁTOMO 21 5 . A R C A 7 2 2 - 3 0 . 37 3 . ' .0 .7 - - 7 0 . 2 7,1 1 . ! ¡Ó 7 ■■ . : ■ 7: n ÁTOMO ■ S 2 7 7 A R O A 7 ' - 2 5 . 73 1 5 , 0 12 71 . ; 09 . . 00 ■15, 99

ÁTOMO 3 ! ■ - r í - ■ : ■■ .. . 72 1 £ . Y - i , 3 3 7 1 . 0 0 1 5 . 3 ; i ÁTOMO ÍI4 A R O A 73 3 ........... 20 81 7 5 1 . 6 0 3 ■¡ . 00 .16 * 0 1 K ÁTOMO 5 1 9 5 : ARG A 7 2 : - 2 ? . ■: 45 : ; i . o 7 -- - i 5 . 9 72 1 . 00 i í . 5 i c _ÁTOMO5 : 5 0 ■, ^{7 2 9 't* 2 1 1 . ‘ 47 -■ : ■ i : . 7}1 , 0 0 1 5 , 1 7 c ÁTOMO s i s ? ti L Y S í\ 72 '■ - V . 0 6 5 21 33 0 - 4 ! . 7 65 i . Cií 1 1 . 10 íl ÁTOMO • ; l -A L Y S ?, 7 ' l - 2 5 . 2 1 . 4 7 0 4 i . 9 9 i : . 00 ; ■ 80 ‘ ÁTOMO 7 2 ! . : C B L Y S A ■7 3 • . 4 52 23 470 1 :■; . ; 02 1 . 00 1 4 . 0 5

ÁTOMO v V L'i E A - 2 í -V . . 8 3 6 : ; . 1 17 - 1 5 . 5 1 3 : . 00 ' i ■: . OS

ÁTOMO CD L Y S A ' 2 ; 2 S . 7 0 a 24 , “ 0-4 4 6 . 1 ■':■' . . 00 1 i . 24 c ÁTOMO ■i . ■ ■ o í ; L Y S A 7 23 - 7 5 , 3 3 2 2 4 , 7 4. - 4 7 . 6 . i i , 00 1 4 , 5 6 , • ÁTOMO ■2 0 * : 17 5 A ' . : 55 2 5 . 6 " ■ * 4 3 , 4 2 6 i , 00 14 ■ SO í-3 ÁTOMO : ■ c L Y E A ■ 7 : - 2 1 .... ' 22 03 7 - 4 .. . 5 35 i , o o i 2 ... 1 Y ÁTOMO 5. . 0 ¡ jY E ■ - 3 0 , 0 7 6 11 . S 3 - ! . ( 147 . 70 ; . 64 O ÁTOMO ■ •' ¡G I i-. A 7 24 ■ l : 2 2 . 5 . : ■ !.. . 8 j 7 1 . 00 1 3 . 1 1 1. ÁTOMO ^{. : V ;} 7.7 I L E ¡—l 7 14 . 5 60 21 .3 . - ; ; - 4 0 . 4 4 1 .1 00 ¡ í 39 ■'1 ÁTOMO i C B I L E A ■ - l - 26 . ■: 3 2 1 . 7 4 5 - 1 0 . 1 i: i 1 . 00 1 3 . 2 5 C ÁTOMO 5 0 ; C GI I L E A 724 26 . 8 5 7 2. i . -- 7 7 . 7 0 2 ■ . 00 i 1.. 05 ^cÁTOMO 52 ! ■; C o l I L E A 724 2 c . 78 20 * 0 52 ¡ 3 . 353 1 . s o ; 7 ¡

ÁTOMO 52 21 c g ; í L E . ■ :■:! - 2 5 . 7 3 2 2. . - .77 4 ü , 631 . .00 1 ... 77 .

ÁTOMO 5 2 22 C I L E A 7 24 - : e .. . o ■ : 3 . 9 3 .i - 7 9 . 32 ? . . 00 1 :: . 51 c ÁTOMO i í 0 : LfL .7 -^j. o l e : 4 - 10 . i 91 i , _{c e}: ; . ?,2 • ¹ ÁTOMO 1 : w C Y S A ■ 7 ■ ■ • . ;,;is 1 - . 0 B '■ ■ 77 . !: ' 5 7 . Y. ! í , 55 1-3 ÁTOMO 5 2 1 5 C A ₀Y :. A 7 35 ■ 77 , 7:.- 2 5 . 3 6 2 - 3 7 . 8 1 2 ■ .50 : í , 54 ■7 ^{ÁTOMO 52 1 . 6} : ^{c •' =2 7 2 5 ■33 Y 7 7 2 6 . 3 3 1 7 . 31 i 4 . ■; 7}

ÁTOMO ¹ 1 7 : ■ 2 5 3 0 . ; g s ■ . i ; ¡ 7 . 3 '■ 1 7 , 50 ; 4 ■ 7 7- s ÁTOMO 5. - X 3 7 C Y S A 72 5 - 2 8 , i 78 1 4 , 8 1 4 - 3 6 , 3 30 7 .50 i 5 .23 . ' ÁTOMO 2 21 6 ⁰ C Y 5 A ¡2 i ■ > . 7 6 i 2 3 . 7 8 8 - ? e . 0 6 i 7 . 5 0 1 i . . 4 ; ' ÁTOMO ■y.?r o 17 T Y R A ■ ² ti - 2 7 , . 3 7 5 , 5 ? 0 - 35 . .1 ■ 1 , O í : -- , ■ - 1-3 ÁTOMO CA . T Y R A 2.2 - 2 ? . 2 ; 9 2 5 . 15 ■: - 3 4 . 1 , 7 1 . 00 l S . 93

ÁTOMO . 6 '■ e s A 744 - .7. 33: 3 3 12 7 1,231 1 .00 42. 7. c ÁTOMO ; i ■1 A £P A 744 -■i 0.41 " 2 , 057 ■■535.7: ■: J .00 46.16 c ÁTOMO í¡4 J A S P A i 44 I . - ■: ■ 53.0 32 i . o o ■i í . -i 8 Q ÁTOMO 7357 u THR A 7 : h - ‘ 8 . . ■; ■ 6 . L 5 - 50.7 34 ; .03 4 ■ - 78 íí ÁTOMO 336 i ■ THE A. 74 ■ ••■ . • c .4 S i 50.5 '2 . .00 43.25 , ; ÁTOMO £ =¡SV C B THR ■ n 8 , 0 v 0 . • I; 1 .00 45. v i

ÁTOMO .. QG1 THR A .43 ! • e ■ 23:. 902 ... 00 4. ,7; ■ ÁTOMO 33íi ' i THR A 749 ■ ■ 34 ' ; 7 . ; 87 - i :■ , 53 ■' 1 ,00 i 2.01 C ÁTOMO 5 : 15 O THR A J45 í .4 57 £ .955 - 49.489 .. .00 43. . ? 4 C ÁTOMO :> 3 ’ i O THR A ■■ 7 ■ ,510 6 , i 11 ■ 18 . ; 3 1 .0! ■3,3 7! 0 ÁTOMO . ■ : THR A -.c - 45 - 254 ' i 448 - ■ ■ 2 7 .00 ..0 • n ÁTOMO í . ; " i .".i. THR A 7 L5Ü . . . V V 4.056 1 8 .77 i . 00 y . .; i ÁTOMO £ 3 ■ i C : THR A ?S0 ■ 4.8 57 3 , ■ n 48.8 : i . oo 37.86 c ÁTOMO .. 3 ;s 1 THR A 50 - 44 . ' j 4 ?. .758 5 0.200 1.00 . 3 i 0 ÁTOMO 5 ' 7 Ó ^{0 2} ; : THE A 750 •• .2 -I : 2 . ■ L-í - 48. i 72 1 .00 37 . ¡7 c ÁTOMO : 3 ■ " c THR A ■JÓ -42 . ; ■' 4 , 1 - 48 . y 63 ] .06 J .: , 5 í c ÁTOMO '■ 78 o THR A 7 >0 42. 45 ' 4 . H 5 ' 50.087 . . oo ' í . 58 0 ÁTOMO £ : 3 A L A A ' 3.. • 1- 4.741 - 47.7 45 1.00 32.07 l'i ÁTOMO £.530 \ .. A L A A ■' ... -4 fJ .7 93 4 . R 77 47.82 4 .. 00 2 . . g c ÁTOMO 530 i 2 2 A LA A J- - s e . •• • . .. i 7 16 . 00 ... Oí 03 . ' ' -ÁTOMO .. . c A L A A ' 53 - ... . O l í ■ . í 53 ■ 16 ,3 r¿ 1 .00 : . 1 . c ÁTOMO ₅ m Cl A L A A - 40 .533 ■ -,;. 46 .447 i .00 21.72 0 ÁTOMO 5334 t; LEU A "32 - 33.744 3 -27 8 48 . ■ 17 ■ ■ 2-3. n ÁTOMO .■.553 ■ LEU A . 1. 2.3 62 - 45.737 ■ , 77 - . 67 c ÁTOMO 533$ Orí LEU A 36 -<.33 1 , 50.2 92 ^{. o e}24.64 c ÁTOMO V i S ' C G LEU A v J ' .' i . i 9 . 1 , . 7 j 51 .626 i , 00 23 , 30' c ÁTOMO £ ?38 LEU A 73. - .: =5,27 ■ 4 ■ - 7 , 1 ; .0 o 24 . ; 5 c ÁTOMO 3 s ; ■ D2 LEO A 5 2 . 1 • 3.. 865 - 52 .636 . o o 27. y 7 c ÁTOMO v . c LEU A 72 - 17 , ú 2 ^{. . . . ,}-48 . : :: . • 23.55 c ÁTOMO ^{5 ~ 7 .}0 LEU A ^{■ 3 y . !}.172 ^{1 8 . M 3}1 .77 ^{2 7}.. ² 0 ÁTOMO 3 3 y i ARG A . i.. J.O . ■ . 2 . S ..7 17 .95 : ... 00 2 2 . i 3 ti ÁTOMO ■ 3 ■:... ARG A ■ i 3 • . ..5. : . : ⁴v 4*3. ■ .. .00 ..... .6 c ÁTOMO 5304 ■ B ARG ¿4. 53 - 31. 33 1 .02.3 46.0 85 i . i ■ 23 55 c ÁTOMO £ 135 CG ARG A 75 :. • i . - ■ ■ 3.256 4 '3 ,743 1.00 23 ' 3 ^cÁTOMO t D ARG A ■ .7 - 37 .; •; 1 ,397 :■ OS ; , 00 2 7.43 c ÁTOMO ; ' .. : ARG A 75 i .3.5 , 119 ■í. c • C 47.9 54 : .0 ( ' .15 ti ÁTOMO .: 303 L- ¿* ARG A 7 ■. ■ • . 347 • •■ 49 ,175 ... 00 24 . ■ c ÁTOMO KH1 ARG A “ 7.-. - - .2 3 ; 2 . " y ;. - y - .. - : ! - J .00 .5 L . : 8 T'i ÁTOMO i o ; UH2 ARG A ■ j : - 33.412 4 , 1 :■:: ■ 50.2 30 1 . Oí 24 . 3 ;: R ÁTOMO • : C ARG A -.'■■ - 36 , 4 S ■ - .17 ' 44 . r --.7 ■¡ ."i': 20 . ';; c ÁTOMO ■ i..:; o ARG A .7- - 3C .22 ■ 4 ,32 ■ ; i . 14 1 .00 20 ,7 9 0 ÁTOMO S i 0 3 K PRO A '24 ■ .2 16 :, i . í ■ 43 ,3 67 ; ■ . i s .; ■ tí ÁTOMO £404 CA PRO A .54 36 ... 3 l 4 ■ 4 .. . L ■ i l .00 .1.3. Í0 c ÁTOMO = 'i i £ CB PRO A ■ :■ ■; - 25. 20 2 .5 ' "7 - 1 .044 ■. 00 i S . 7:: c ÁTOMO 105 CG PRO A 7 :4 - 32 , 4 1 : .: : ; - 4 . .7 J.0 .00 I S . 53 c ÁTOMO T CL) PRO A 754 - 3 '■ ... >: 3 L 3. - 42.015 ] .00 IS 7,0 c ÁTOMO £3 3 C PRO A 734 -.33.. 4 - 4 664 4 .2 66 : .00 ; o ; .; ■ ÁTOMO 3 i 09 0 PRO A ; , ; - 34. 2- 4 .4S 1 • .7 35 1 .00 1 J . ■ ■ 7 0 ÁTOMO £410 rí SER A 7 ; 5 33 - 71 : 5.5Í5 ; -41 .896 1 .00 17, 15 H ÁTOMO :: 41 _ SER A ■ /■: 34. 92 - 7 .0 '■ 4 j 2.U 27 _ .00 17 ! ■, c ÁTOMO . C B SER A ^{._ -}- 3 7-5 5 8 , 0 7- ' - : .395 ; , oo .17,70 c ÁTOMO ” i ; * OG ¡SEP A 7 £ 5 •• .', 7 ■ . - 38 ■ i -i . 364 J , 00 ..53 0 ÁTOMO 53; 4 c SER A 777 - .37 7. 75 2. - 40 ,6 52 i , oo : : 1

ÁTOMO £ 3 ; O SER > 152 ■ ■ .J 7 .' ■ 3 S ■ . ■ -39. (159 .1.00 j 5 . 90 0 ÁTOMO : 3 : 3 tT A LA A 736 -33 . i 1 8.654 ■ 40 , 314 i .00 : . : 3 B ÁTOMO . ■ 1 CA A L A ■ £ - -.1.5 Sí! S 1 - 39 , 4 i-. '! - Oí : - 16 '' ÁTOMO CB A LA A ■ , 3 - 3.5.071 10. • - 39 , ! i 1 .00 : .: . S ■ c ÁTOMO £4 i 3 C A LA A 736 32.42 2 ■ 3:. ■ 53 V i .2 30 . 00 16.7 3 c ÁTOMO 5320 0 A L A A 73.- 35.9 37 ■i.;. o i;.: ÍS . : : ; ! . Sí) : i 0 ÁTOMO 43 K SER A ■ : ■ 3 6.0 V i .0 .662 4Ü .305 . .00 7 : K ÁTOMO £ 33:2 CA SER A i v - 2 .3..9 i l . 373: 40'. 3: ..4 1 .00 1 ■■■. 4 c ÁTOMO £423 CB s m A 7 y- - . r -; . 514 i - '■ :.⁴- 41 - 43 Í 1 , 00 : . Ofi c ÁTOMO : 524 OG SER A ■ ;7 ■ . ■ 1 1 : ,464 ■ 17.:: 7' '• . 00 17. y 1 0 ÁTOMO 5425 C SER A - 77 - 36 . ■ 57 .3. 357 - 10.053 ■ . 00 : i . 35 c ÁTOMO : 12 £ 0 SER A ■ y ■ 10 . S 5 ■ i 9.9 o: 3., Oí 1 S . : O ' ÁTOMO 3 ¿27 u THE ■ 5S 38 , i 3 . Ü85 40.1 OS . , 00 ; s . l o ti ÁTOMO 5 1 ■ CA THE A 758 - 39.3 1.: S.,1 :5 - 39 , 21 ' ! i . 00 i ■, 94 c ÁTOMO v 420 C B THR A / _{í s}■ 19.4 62 7.1 0 41.062 1.0 0 13 . 59 c ÁTOMO 3 : 30 OG.l THR A ■ 5S - 18 , ■ -- 3 , ■ 53 -4 .115 .1 , 00 ¡ 3 , 63 0 ÁTOMO >43: CG2 THR A ■ :3 - 39.67²7 . 83 :. . 737 1.00 I S . 36 f _{ÁTOMO c} ^{THR A ■} _{- 3 9 . ¡ S ,} ^{7.3 5: ■} _{3 8 . (2}1^.00 ^{2 ¡7 o c ÁTOMO • m}0 ^{TtiR A 758 ■}E . -55 ^{- 38.208}1^.00 1^{.. .}68 ^O _ÁTOMO ^{: m 11 GLE A ■ i 9 r:- .165 7 .551 - . .85:.} _{i ,}00 21^{. N}ÁTOMO ^{: : 35 CPi SLR A 77}6 ^{- . 7. 74 ■ 7 . i 03 - '■: ■ .557 i . Ot 7 : . 17 C} _ÁTOMO5 ^{• • es}GLW ^{p. 75T' - 36 . i}6^{. ...75 - ,5 : ’ •}1*00 2 ^{v .}c _{ÁTOMO íi-nv}CG GLE _A■ , 5 .635 6 ^{, ' 54} _{- 3 7 .8 ' S}i .00 4 .38

_ÁTOMO..⁴² _{CP GLE} ^A.59 -55 .324 ^{i 3 7}6 ^17.9.57...00 ^{28 13} _-ÁTOMO ^{i i v y OE1 G i l í k 756 -34 .4 5' i :}1 ^{' - 38,3/4}1,00 ^30.070 _{ÁTOMO 44 c NE2 GLE}A ₅₅₅ ^{- 35.125 J . ;}6 -37.07 /: _{.. .}00 _{30.04 w ÁTOMO} ^{5441 C GLE A ■ 55} _{-3 " . 35}8 ^{. i S i s.-i ?:■:}1^{. ;■■ 22 . 15}

ÁTOMO ^>44.20 ^{GLE A}■ 35 -..6 ^{. 55 , 7.7 .5 34,5 ;5. 7 .00 22 : i}0 _ÁTOMO ^{■: j :}1 ^N _ALAA _{750 7 .7} ^{3.2 58 35.5 V :}1.00 _{..... .7 w ÁTOMO} ^{5 :4}1 ^{CA ALA A /SO 37.848 15 5 3 7-i .462}1,00 20^{. ■ 4 r■-} _ÁTOMO ^{i 445 CB M.LiA A}.50 ^{- 33. 764}1.1^{.54 ' 34.855}1.00 ^{2 0 .63 c} _ÁTOMO ⁵i : - _CALA A ^{- 50}1 ^•3. 7 - 3 > .25 1.00 2 1. ' 0 c _ÁTOMO ^{5 ! i 7}0 ^{ALA A .'60 • : ' ' '}8^{.51* - 3i .421}1^{. Oí ' 4 . "}0 0 _ÁTOMO ^{ií LEU A '■ 5.5}3^{ñ ..: yo . . 503 .. . 5 -5}. .00 ^{2 . . 64 ñ} _{ÁTOMO 5}i ^{CA LEO A - ...} _{- 39.00 " ?. 6B4 - 30.4 52} ^...00 ^{2.. .34 •; ÁTOMO 54 50 CB LEO i - í í ,266}10_, ^{79 .616 ..}00 22. 6 ^{!■ -ÁTOMO :}1 _LG ^{LE 0 A} _{■:. -3 ■.509} ^{:i . 508 28,831 ... ot}22 ^{. .. i}

_ÁTOMO ^{■: i : . COI LEU A} _{■ =: -36 . ? i i} ^{■ . r}8^{(i - !}6^{,: ■ ■;} _i.00 ⁷2^.$0 _{c ÁTOMO} ^{54 " i}CüZ ^{LEU A "}6^{: -57..} _{3 .}8₀₄ ^{>7.4; ■: * .}00 ^{27 .70 ■ -}ÁTOMO 54 i i ■ LEU A ■ i í .4lf i 0-463 - 30.92: ■ 77 22. V. c _ÁTOMO ¹⁵⁵0 ^{LEU A ■ 5 ■ -41 . 3SO 5.7 5 - >}0^{. -44 i . Oí}22. _S0 _ÁTOMO ^{..4 .6 N SER A 7. 40, . . /}1 ^{i , í SO 30.9 i i .}00 21.68 ^ti _{ÁTOMO V ! 5'} ^{CA SER} _Ay _{s '} ^{ú L .7}8⁵ _{13.4 7}í _{31 . i 54}1 ^.00 21.20 ^c _ÁTOMO515S ^{CE SER}7 ^í:-41 .5 6 ti ⁱ.7.61! -30 , ; y7 1^.00 ^{! * . 4 !}c _{ÁTOMO :::; C SER}2ⁱ _{7 1} ^{- 41 .7 f}12^{. * e i} _{- 32 .603}1. 00 _{21.32 c ÁTOMO}5 SáO D SER A ⁷6 ^{. , ..}• : 58 -77.. i 68 ■ . ce 3 ' . i ^{■ .} _{ÁTOMO 5 : s .} ^{U SER A} _.5.7 ^{- 41 .562 12.65 !} _{■ i}1^{. Oí 2 7' ti} _ÁTOMO ^{5 ]}6²LA SER A ^{7 j} _43.052...7. 358 . . 56' ... 00 ^{■ 1 '}

_ÁTOMO ^{5467 CB SER A ■}6^{5 43 .}7^{.14 i}2^{. >:.v; ■■■■■■.}6⁵⁰ _{i ,}00 10_{, 38}

_ÁTOMO ^{5464 OG SER ¡\ ; 7 -45. . •}11 ^{544 35,754}1 ^{, i t 20 33 i}1 _ÁTOMO ^{■ 4 - 5 C SER k ■■ 5 - • . '' ■ 14.363 34,75}1,00 ^{71 . : 7- c} _ÁTOMO ^{5466 0 SER A ■ 53 - 4 6 . J 81 ; • 34.223}1, 00 ⁴³

_ÁTOMO ^{5467 tí SER A 764 •: • ..55 3 :7.3 .5 - .. .- i . oí}2 ^{. . :I tí} _{ÁTOMO ¿463 CA SER A} ^{- ,}6^{. '} _{16 5 • 36,951} ^...00 _{22 i b c ÁTOMO}v j : ■ _CB ^{£ E P.} _A ⁷6 ^;- 7,6. i ? 17 . <i 77 - ; =, .214 1.00 ^.9s ^.4; _ÁTOMO ^{■; ■ ; □G SER J4_ : = :, . 3 - 4} _18.219 ^{- .35 . S • 3 .. .}0^!22^{. ■;}6 ^{i '} _ÁTOMO ^{547.; C SER A - 4 -46. 504 16.151 77 . -7.7}1^.!¡0 ^{34 . 78 c} _ÁTOMO ^{■ :}0 ^{SER A} _{5 i} ^{-44 . ' :} _15.612 ^{38 . i}21 ^{. .}00 ^24.76 0 _ÁTOMO ^{i : ■ tT VAL A ■'}6^{3 . | i & .55 O -3 ■ . 7 i .}00 2 ^{. '}w _ÁTOMO ^{..4 ;4 CA VAL A 15 47 .0¡;8 17 7.5 • i .}00 2 ^{■ i} _{c ÁTOMO} ^{5475 CB VAL A ■ ■; 5}- ¡8^{.6 J 15 .852 - 39.733 i .}00 ^{27 . 54 c} _ÁTOMO ^{■: ; :*>}VAL ^{A 755}-46 . ^{i 6 . 54 - íS . j}0^?1,00 27 . -:- ^■■ _ÁTOMO ^{" -¡}77 _{■ g ; VAL A 7 • ■ .0S5 ] 5 774 - 4.. . 7 i i . oo 2E 25 c}ÁTOMO ¿1 4: ■1 VAL Á ■; - 47. > 54 13 383 39,5 ; i .00 4 , 73 c ÁTOMO 5 : ■ 9 0 VAL A ■ 5 - S3.000 i S , 17 ■ 35 . i ' 1. 00 2 .. 42 ■ ' _{ÁTOMO ■ SER A 75: 6 - 4" . 7 .I '} ^{: 7}.77 ^> _{■ 10.7&S : .75' OO. l i I-i}ÁTOMO 54 CA SER A ■ =6 477 - - ⁷i . 7' . 7 41,84$ . .00 l i . $4

ÁTOMO 7 ■ CB SER ñ 76 S - . ■ 55 ^{5 5 ,}4 • - i .07S 1. 00 31.06 , ' ÁTOMO ■ 43 ■: OG SEP. A ? ■: 6 -46.7 ;C: 11 .545 41-5 5.3 i , oo 2 ; . -i 1 0 ÁTOMO 1334 ■V SER 1 ' 5(5 -80. . .8 3.S '.35 -4 ...432 3.. 00 77. 69 c ÁTOMO 5536 0 SER A • -5.1 , o: 3 :Q .461 - i .855 . 45 .... . 15 0 ÁTOMO : 45 ¡3 SER A 7 S'i -50.351 i 8.52 ? - i , . i os i .00 15. 35 K ÁTOMO . ^q.. ■ CA SER ■■ J ■ -51.715 i 1 -42, 'I,-,' ,0t >7 1$

ÁTOMO i 133 CB SER A ■5 : - 5.218 17 , 15 [ -4 .201 1 , 00 13.;: c ÁTOMO :: ÜG SER r. 767 57 , ; 0 ■. 1 r .565 ■ .00 35.! 3 0 ÁTOMO 5.390 SER ■: 52,7 . • 13.155 • 2,74 1.00 74 ,06

ÁTOMO 345 0 SER A ■ ; ■ 53.06 18.983 1 , :■ n . .00 3 ir-, O ÁTOMO 54'2 N GLü A ■84 -4 : .45 6.25 8 - 59.466 . .00 41.57 tí ÁTOMO " i 9 i CA GLD A 784 -43 .087 7.454 ■ 55. 355 1,00 40.70 c ÁTOMO : 594 CE GLU A ■ 04 ■ 44.464 ■ . 5!} : ■ 58,631 3. 00 -16.57 c ÁTOMO 5556 C GLü A 73 í ■■ ■" . • • S .118 -58 .7 ' ■ .00 7: .74 c ÁTOMO 5496 0 GLÜ A 734 - 7 , ■ 4- 3,024 57 ,01 - 1,01 : ! 0 ÁTOMO ; 5 s - ¡í GLÜ 7^ ' 3 '5 : ... 3.. . ' : 7 . .3 52 . , 00 77 62 H ÁTOMO v 153 CA GLU A 786 - 40 . :33 9. o 3 -58,758 i ■ 65 75.31 . ■ ÁTOMO ..[, ¿ CB GLD A /8 i ■ 77-... !;3 ■ .006 - 58.893 i .00 15.23 c ÁTOMO 3603 CG GLÜ A . ¡a ■ - .:: . . s o 7 . i 55: -56.353 ■i . Oí 7 ■ , 6 i

ÁTOMO : .DI CD GLü A Í8Í5 - ■. ■. i - i . 941 ■ 5 , 2 -4 1 .00 40. 11 f

_{Á T O M O} 5.17 _{O H TYR A 887 27} ^{......... . . .. .} _" _{35 6 :} ^{. . .} _{00 20. 02 7} Á T O M O 5918- ; p. & 833 ^-45.7 72 .8S2 _{- 5 5 . 0 7 . .}00 25_.0 ^ c Á T O M O 5315 CD2 TYR A 3 * 48^.Ü19 27. Í.S6 ^{5 7 . 0 6 ,}i . 00 2 ^{, . 32}c Á T O M O 55 ‘ 3 C TYR A 837 - 4 ' - , í ü i ? : .459 - 60 .010 .] . :8 36 . 06 c Á T O M O ^: 0 ^{T Y R A 837 - 4 4 . 7 70}2 ^{2 * 2 82 “ 6 0 - 4 S 3 . . 00 2 6 . 0:3} 0

ATOMO L E U A ■■ T - - 1 6 . 5 1 1 í o 1 ■ 5 5 . " ¡ T l . 00 ^t: T . ■" ^{ÁTOMO i.. ■7 L E U A •**. - 1 7 , ; 13 4 5 . ' - 6 0 . Ü 5 6 l . 0 0} 2 ^{(1. 30 O ÁTOMO V 1 .L -i . G L E A ¿ 1 . 7 3 7 « 6 . 2 7 5 5 3 . 2 4 6} 1.00 ^{3 0 . OS 13}ÁTOMO 71 ¡ 5 CA G L E A V i 3 - i i . 495 i • : - 5 5 . 3 3 i : . o t 10 . 7 S C ^ÁTOMO ^{7 .. i 6 CLi G L E A ■: 2}. .12 ^{■I7 . 5 7 4 5 ? T | .: 7 . . 0 0 3 4 . ... f' ÁTOMO u n C'ü G L E} ^{A 9 7 .3 - 1 3 . t : i 4 3 T 5 9 . 3 i i . 0 0 : í .}0 ÁTOMO ■.. ^í. i CD G L E A V.l - 1 2 . ?GG 43 ' - 6 0 , 0 0.3 i . . 00 4 _ ;■ ■ .7 ÁTOMO O K I G L E A V S 3 - i . .4 'i ■' ■i 7 . i 56 - i O . 7 64 . , 00 i3 . 35

ÁTOMO LTrJS T i 1 A 9 ■: 3 - 1 3 . T '< 4 i - ■ v. .9 4 ? i . 00 4 • . T r ^{ÁTOMO V L ■ i ! A v ; 3 - 1 3 . 3 5 3 : ■ , I T T ■ 5 5 . 5 6} 1 ^{. Ü( 2 5 , 2 4} ^{7 ÁTOMO ■■: 2. ■}0 ^{! A ■' 11. - 1 4 . 0 3 4 i . 0 3 3 • , 4 .7 8 i . 0 0 3 0 1 1} 0 ^{ÁTOMO " i < r; T I . U A S 1 : - 1 3 . 3 I T 4 . ; . 3.. 2 . 5 9 , 6 0 5} 1.00 ^{.. 5 , 7 6} ^{T ÁTOMO H M . .. U A V i l : 3 , i . 6 ¡9 5 9 . 4 5 . ¿ . ú o 2 5 . 2 6}0 ^{ÁTOMO i . : s C P} _G.V.T ^{A 7 34 - 1 3 . ■ ■ í 1 . S S ;. - 6 0 . 7 74}1.00 ^{2 7 . . 0 7 ÁTOMO 7 2 6}C^{a í G 1 U}A ^{- l o . ■ •• T . 1 7 4 - 6 0 . 5 2 -} 1.00 ^{3 0 . ' 0 ■ ■}

ÁTOMO 7 ! ■ ■' C K .1 t í T S A .......... - . 1 . I T . O . - T . k l , o ¿ T 00 c ÁTOMO 7 1 6 3 f u s A 30 - 1 0 . S 73 2 5 . 2 3 ■ - 6 , T 8 i . 00 : - . ÜÜ T ÁTOMO - ■ , ... C 0 H I S A 5 i 5 1 i .4 54 ¡ 6 . 6 1 1

... . 7 ¡ , 6 2 . 1 7 6 ■ . 00 i i . 7 ' c ÁTOMO c E I S A ■■T,| o . S T 2 7 . 0 5 i 5 8 . • : 1 . Oí) ■; 2 . o 1 7 ÁTOMO 71 V i 0 H I S A :■ 13 - 7 . ■ T 2 v . 0 5 ' 3 8 . 4 i . . . 00 i .. . T O ÁTOMO 1 12 r? L E U .41 000 9 , 3 ■ 2 7 , 7 ' 7 - 5 7 , 8 14 . . 00 i 2 , i 7 r .. . .. j

ÁTOMO í h L E U «.15 00 - 5 . ' 5 1 2 6 . 43 0 - 5 6 . 62 9 1 , 0 0 1 1 . 82 ( ^ÁTOMO ^{7 1 14 ■T. L E U t i s o n ■ T . . V 3 3 V . 6 6 S ■ 3 > , 6 5 ' • . 00 1 1 , 69}c ÁTOMO 7 17 5 L E U ?■ ■ o o o ■■ ; 3 , : .1 3 5 . 9 i í - 5 4 . ", 0 . 00 : ' , 54 ■7 ÁTOMO 71 76 T T L E U =V : 00 5 , 6 5 2 2 6 . 1 - : 5 0 . 5 1 : 5. , Oí 1 i . 61 ¡ i . . . ..

ÁTOMO C ü . L E U m o c o 13 , .. 03 i . 307 5 3 . 4 9 0 . , 00 11 . 1S 7 ^ÁTOMO ^{7 ¿ 7 3} c ^{L E U 51 0 0 0 - 5 . : ¿ i ¿ 4 , 9 5 5} _{- 5 6}, s :. i ^{, . 00 i 1 . 5 3 ■7} ÁTOMO .. ÍS ■ L E D : o o o T .7 50 2 4 . 2 75 - v ; . v .. . 00 l i . 3 7 ; .

ÁTOMO 7 : SO i-T G LY 5 1 0 0 i - 1 0 . 4 1 i 24 , 5 : v - 57 , 8 2 1 , 06 1 1 . 7 4 13 ÁTOMO 71 7- C7A G L Y s i ¡ o : - 1 0 . 5 5 1 2 2 . 9 ! ; !i - 5 8 - i 05 1 . 0 0 1 1 . 7 3 ■f

_ATOMO' _{OG i}I LE 7 ^{:■ ■>:} _{3. 8 ' . 31 0 ' 9 S O ,439 : . 00}.2. 1 r. ^{ÁTOMO ■} i ^{;:: I L E 7 : :¡}; : ^{2 9 , ¡717 - 4} 1 ^{. 6 1}3 .00 ^{12 .70} C ^{ÁTOMO •i 'i}7 ^{I L E : 7. 7 2 . c... 4 .7 ...... ■J 3 . 4 i 7}1.00 ^{12 . : .. 57 ÁTOMO ' S ;}0 ^"ILE ;■ ^{J. G j -í}4 . 737 ^{37 . ■ - a s . i ¡}3 ^{; . - ¡ 2 .31 5}ÁTOMO " s 1 i tí GLU A i 7-: 2 2 . ■ 5 2 c .294 -■ 4 - . S 45 i . 00 - : ... i 1 ÁTOMO Y 31'.’ c ■ GLU 77 i.;.- 3.7 4 : i 6 ,7 . . 4 O . i .00 13. -o C ÁTOMO ■ a i 72 GLÜ A i r í"- 2 . 53.4 24 s a i 4 6 , 184 ... 00 ■.5 ■ 2 c ^{ÁTOMO ' : ;} 'i ^{C'.q G Lü}. - 03^{5 i , : íi ’ b .5 .. -}55 , 132 ^{i . 00 7 ; . 66 c} _ÁTOMO ^{' • GLÜ .■.. 7 ■:5 ■}3^{.o r a 7 :.. 4 ’ 5 ■ 44 . 8 :<7: .. . 00}17.8 8 ^{■: ÁTOMO}P E I ^{GLÜ - .; ■ - 0 .2} ?i ^{24 .272 ■ !4 ,6 02 J . 0! 18 , 12 O ÁTOMO :■ 32 ■ 5} _GLÜ ^{■■. ; ■: , ■ 7:.}.47 ²⁶ A ^{5 44 . "■ 9 i}7 .00 ^{■; ■ 57} ₀ ^{ÁTOMO í 7 G Lü}7:77 ^{a 24 .277 r}, 4 1 ^.0^c13.1 2 ^{5, ÁTOMO * a a i} 0 ^{GLÜ ■ 7 :,:;i 5.001 1 : ,} i : : ^{46 .3 ■'}7^{: i .}00 ^{i . . 96 C ÁTOMO ■■::: s}ÍT ^{SER .}7. .2 ^{A .}301 ^{2 7 .04 ;. 43 .49 7!}i .00 ^J.2.341^:ÁTOMO O', SEIS; a ' : -7-. 5.7 ■ 22 . ■ -57 - ■: g . 9 b 7 I .00 12 .56 ■ ' ^{ÁTOMO í S 2 v ■53 SER ?.¡ L :':4 ■■, 97 9 '■ ■ , ■: 9 ■} 20 ^{.350 ] . os 1 , 7, i} 7 ^{ÁTOMO 32 8 : • SER 4 L0 55 "• ' 77 2 7. 7:77 17. . 2 99 ..}00 1 ■ ^.20 í; ÁTOMO 112 i c SER A i .7 :, í .5 12 23.81 1 - 48 . SL5Ü 1.00 12 . 34 ■: ^ÁTOMO _{¡ $ 39}0 ^{SER . . G 6 .7 73 17. 5.7:7 48 .910 ..}00 ^{13 . 7f. 3. ÁTOMO :■ - ■■.. :T PHE} í ^{..77 ■ G . .. S 2 ¡ . 322 IB , -7 .7}1^.O1 ^{:. 5. .7. 5} _{ÁTOMO 32}i7A _PHE ^{7 ■ 7 ■:} i _{7.2 40 7- . 392 - 13 ,428 : ••• 13.13 C ÁTOMO 7833} ^■77 _PHE"■■77 _{4-1 40}7': 74 - _{43 . 0 :}i .00 11_. m _CÁTOMO ' 334 CG PHE A1 77' 0.4 34 2 7.4 !7 ■ : ■ .522 ■ •• 12.76 ■r ^{ÁTOMO 17 5 COI PHE -}7^::4 ^{77 .423 27 . - 4 8 , 41} 3 ^{■ . Oí 12. i ! c} _{ÁTOMO 53 j 6 í i . PHE} ^,7.0⁷⁴ _{i 4 33.4 O í} ^{4 ' . 7 . oc} _{.: .. 3 b} ^{. ÁTOMO} ₅₈₃₇ ^{í : FKE A 77 Y}i l . 8 3 ^{73, 777 :} a ^{, s}0^{.: i . •• 1 ■ , 7.5 c}ÁTOMO 53 j 8 7 . PHE ¡- 734" 12.84 3 7 .186 - 45 . . • ; . 00 i . 3 c ÁTOMO 5 i 33 ■ Di PHE .7 4 S . 659 27 .6 " - 4 6 .148 1 . 00 12 . 76 ' ÁTOMO 3 c FHE 7: ; " : 1 7 : , 677 - 47 .3Ét! . • ! 7: . 7. O c ^{ÁTOMO • a 4 .i 0 PHE i ' 1 ; 7 .2 0 1 2 4 . 51 7 r ; . 4 o s ;}7 ^{13. • 0} _ÁTOMO 1 ^{2 i 2 7 LEU Ai 038 8 . 23 3 2 4 , 04 4 1 6 . 4' Jü i . 00 1 4 . 2 7}1^:ÁTOMO m i ■:... LEU 7.7 >$ ■■ .829 i i . Y N f j 4"- ■■ 1 i:'' .. .00 i >.0.1 5 ÁTOMO ^{■"44 ■ B LEU . va 7 .598 2. : 143 I . i bS 1. i ■ 3.4 b} 1 ^CÁTOMO ■ - 45 CG LEU .- : 748 7 . 4 3 24 4 33 4 - .53 i 1. 00 !.4 60 C _{ÁTOMO ' 84 S} ^{C DI}LEU 77^{. 7 :í.} _{Sí - V} iv ^{24 . . 4 i 4 ; . 5)5 i . 00 ; , . . 8}C ÁTOMO S-í ■ C 1-7 LEU :■ 78 7 , 299 2 b . i -10 ■!, .7 ; 7 i . • 14 . : C ÁTOMO 5843 '■ LEU íi ..7 73 3 . 445 22 00 4 ■ . ■■.. 9 ... 00 I b 80 c ÁTOMO 0 LEU Al 473 i a : l i ■ :: 7- - 44. ■ 27 J . ;:í ■ -. . =■■; ■■ ÁTOMO 35 ; 4; A E F A i r í 0 ; . ■ 32 21.4 7' , - 4 ( 5.5 : . O- 1 6 . 18 !. ÁTOMO CA A S P A 7>:4 9.4 Gil 2 0. U . a 4 5 .053 . . ¡ ¡0 17.. : 0 c ÁTOMO 852 7V: AGP "7. ' 7 ■) 8. v i 7 19 , 3 ' i - ! . 18 : . 00 ' 36 3 ÁTOMO ' 331 t G AGP - ■ i, 39 ■. ■ 19.1 22 - 46 , 4 7 1 . 00 5. :. , 7 1 c ÁTOMO ■ í 4 -i ODI AS P : 7 43 ■i .521 i S . 5 > ■ 48.291 ■ . 00 20 26

ÁTOMO 58.53 OD2 Afi F i ' 07 ? ■i . í '■ 1 -4. 262 - - i 7 . - ' : i . 00 17 . 95 (7 ÁTOMO 5355 ; A S P 4. 747 ■ 0 , 6 7 20 , 07S - 1 .00 17 . 56 5 ÁTOMO 5557 0 A S P A i 743 i. .. ; ■:: ;.s - 48 .2 36 i . 00 1S 09 ■: ■ ÁTOMO 1853 7 I L E 7. 100 i l . O KJ 7 i .224 4B . 5 ;■ i . 00 ; J 6 ; i; ÁTOMO ■ 3 .3 r I L E 71 .100 : . . I S O 21 .3 • . T, . 505 3 . 00 18.52 c ÁTOMO SúG 2 B I L E A1100 12. 09 i ' 2.441 - 50 ■ b ib i , 00 18. .i. c ÁTOMO ; ■>._ O : l I L E . i i 00 12.205 2 3 . S ü 2 4 « .856 . . 00 - . 13 -ÁTOMO 52S2 701 I L E ■ i 00 ¡ 3 , 186 24 , 58 i 7 . 536 i . 00 18 , 72 c ÁTOMO - a 5 ■: Y ■" I L E ■ 100 ■ .5 65 22 ... . 4 ■ 51 - 327 1 , 00 18 . 01 5 ÁTOMO 1864 I L E A i i r x i 15 , 877 2.1 260 ■■ 4.3 . 7. . 00 19. 17 r ÁTOMO ■ , , 9 ::. 0 I L E ?■. 100 i ; . -2.-.V 11.8 19 - 4 7 . • : 1.00 i :. , 64 0 ÁTOMO 4365 l-I S E R 4. ^{l o}; ■ 4 . ■ . 20.967 - 42 . • ■ ' i . 00 22 . • ti ÁTOMO ■■■■■ CA S E R Ai J.0.1 78 . 4 : 20 <■ . 3 - 4 3 ■ 8 ; .Oí 21. 82 c ÁTOMO 4863 ■; 7 S e r h L01 : 7 . c 7 ■ 22 , 17 : - 17 , i: • •; i . 00 22 , 6 c ÁTOMO 4368 77. s e r V. i 10 i 15. 446 ■ i . 07 i bü .581 .00 22 . ; 0 ÁTOMO 73 i7 S E R A; 105; I t - 0 71 .13 i 48. . . 00 22 . 23 0 ÁTOMO V i 0 SER . ' i 0 i i 6. ; 77, 2 3 . i bb 49.3 4 . . 00 Y:.,'. :4 0 ÁTOMO 53 ÍT ARG Al 107: J.5 . 504 237.1-77 47 , 401 i . 00 22 , é l ti ÁTOMO - a 5 5 Y h ARG ■ 102 : 23 . 475 - 4 fi . p 5 : 1 , 00 2 j . 06 5 ÁTOMO ■ - ■■■; ARG 7. 1 i 5 • .916 23 , 111 ■ 3! j , 784 '• . 00 2 : . 5 >7 ÁTOMO 5 7 4 ’G A R G 5 i 02 1 LT ■ ' , 7777 - 45 . (175 .00 ' 7. 56 ■7 ÁTOMO ^{' 3 ' i}C 0 ^{ARG A ' : C 7 r , 4 ■a 4C . i : ! . : . : ' ■:}1^{, i - : 9 ¡7}ÁTOMO ■ 37 7 :: 2. ARO 7 102 i s , ■ ' 37 . 352 4 . 73 . . . 00 28 . S6 i; ÁTOMO 5 S 7 3 ■77 A R G 7. ^{l o}:; .: g . 5.73 3' , 597 .26.3 i . 00 .77 . 9.7 C ÁTOMO 3 ?6 7T .. ARG 71 : 0 1 ■ . 57 i .7.5 . i 5:7. 41.827 i. . 00 28 . a i ti ÁTOMO 5. ' ; i. - ' ARG • 103 74 , 0 77 , 53 b - 1 , 6 ■ ■ .1 . 00 29.8 1 i: ÁTOMO " ARG 7. 101; i 8.4 : 24 . ' 78 1 > .953 1.00 : : 2. ¡ ;,

ÁTOMO ^{3 30}■ ^{e s T Y R}0 : 9 .36 . ' i ■ 48..1 30 . , 61 1 .00 2 S 31 c ÁTOMO í • ! 3 Olí T Y R : 59 -36 , ■ :■■■: 4$..₀S ₆- _{0 0}..53)7 - .41 O í . „-o 0 ÁTOMO S í 04 C E 2 T Y R c >9 ■i " . : .. i 47.^{, 0 2 1}9¹..7 :■ 1 , 00 23 .2 ? c ÁTOMO ^{íi 3 0 5}007 ^{T Y R}0 ^{5 6}- '.... ⁸93 47.. L i5 - .913 ; , o : 78 . 11 c ÁTOMO $ 3 0 á r* T Y R i. 59 35. : D i 43.. .182 . A '■ 1.00 25. SÉ Q ÁTOMO 3Ü T o TI !■ c 39 la ...4 1 49,. 60 ■■ . -. .637 1 .00 30. 37 0 ÁTOMO ' LEU 6 ^{5 0 .2}3. ■517 4 f ■ISO ¹' .,4_{0 1}... 00 32 45 13 ÁTOMO B ^{• C A L E U}0 60 -37 . ²41 48.. 58.3"■ ' a .5 !i i . , 'J i • . i c ÁTOMO » 31 3 ^{c; b}L E U 60 30 . 3 í Sí .r . 3 '4 ..^{0. 1}.73.7 .. .00 32 .8S c ÁTOMO :■ ^{3 11}CG LEÜ 0 so - .009 48.. ■ ¹: ■- i ^{0 0}. í ü :: ]. . Oí 72.. : i c ÁTOMO 3 31 ■ CD1 LEO i 30 35. ' 94 Sb ? ..31 5 - i 9 .. . ■": 7 .00 32 34 r ÁTOMO 8313 c d : L E U c 60 35 . lo ; ■: ■. í 58 ..^{0 0 . 1 2}: . o : .; 2 . . 6 -ÁTOMO ; ^{8 ; 4}6 L£Ü ^{c 6 0}i i , , 4:1 , ⁶o . ¡14 .6 3 1. 00 38. o ; c ÁTOMO 3 3 1 S □ L E U c 30 3 É ... 5 ? 4? .40:: ^{- 1}04..512 7. .06 40.1 i O ÁTOMO ⁵■ ! ⁵1 61 i .34 3 ■17; . ■ • : - 104 . 797 1.00 33 . S4 w ÁTOMO ■ ■ ■ c ■ 'í c S I .. ; ■ . ..... 4 . ■ ■■ ■ . '■ 38 i .06 ■: '■ .08 c ÁTOMO '. ^{i s}e ^{G L Y}0 ^{3 i}3:0.43 S 40 .3.18 ^{.1 0 0}. 742 . .00 43.05 c ÁTOMO S 319 0 c ... - 36. 1335 ¡» ** . -:. os .572 i . 00 .. - .00 ü ÁTOMO 5 3 3 0 :■ .i. c JO-...9 i 46 ..¹.. . 08 .845 .. 00 50. 45 Í í ÁTOMO 6 32.. O h A L A c 35 . .: ó 43.. i .. .7 ₁. .., Oí 6 í , 15

ÁTOMO - ■ C E A L A : i i -34 . ,... . ■í : . >62-■ _{1 0}. ₈■) 1.00 52 . 4 Q ÁTOMO ■ - i ^{r -} 0 62 54 . - - ⁰44 ^{. 0 0}., : 07 .5 ' ■ i .06 34 . 15 c ÁTOMO 3 3 24 0 A LA. € ■. ■ 3! . 3 : i 4 ) ^{. 2 1 1 1 0}: .2 7⁰■ , 0: : . V ■.' ÁTOMO _.ÍT c _■53- 33, 47 : .¹17- ' _{8 8}■.:.: ' , Oí ' 4 . . 1 í:

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ÁTOMO . : o ■ - 63 Oic j í ³.₁- 7 .₀;.4 ' 7 . i c ÁTOMO i 327 C 3 A S ? c ■S :■ ¡ : ,40 i 41,. . 30 ■IOS .4 ' i , 00 b 8 , :: 8 c ÁTOMO í ? 58 :: 0 .3 ? - 3: .: 5 s ■.600-- ■ - . 1 .00 58 . -3'i c ÁTOMO 8 3 2 S5 0 A S F c 63 ~ 7. 5 S 5 44 .4 ^{1 0}-■ ..07 .o:.;: 1 . 00 57 . • • 0 ÁTOMO s .■ i,-. K Ü 5 T C - i i .77 : : i . : 78- ■' i O ^{. 8}7.5 ' . o c 55.30 I? ÁTOMO s • ■. C-5 LíK™ 0 .34 : ₆7 A ? ._{0 3 2 1},.. i :■■■ 1 ■ 54. 32 ’ ’ ÁTOMO s 3 e s M E T :: 64 29 .g i í²44..⁰62 ..0... o :.: .. .00 0.. , b0 c ÁTOMO ^{í í i i í}0 ^{M E T}c ⁶⁴M . A I 4 1 , • .. , 06 . ?2 c ÁTOMO 6 • 34 s e M E T c 34 - 3 1 . 2 9 2 4 5 . 5 7 C - 1 0 2 . 0 8 1 7. , O í 50 ¿ 5 £ ÁTOMO ■i 335 07:1 . : 64 - 3 2 . 8 7 2 4 1?. 7 7 1 - 1 0 2 . 3 2 0 1.00 45 4:7 C ÁTOMO $ 3 3 6 c ^{m e t}54 - 2 0 . 3 6 7 4 2 . 0 5 7 - 1 0 5 . 2 9 8 1 , o : 04 , 4 3 •' ÁTOMO í ¡ 33 ■ 0 M E T c S 4 ■>Í. . 5 61 41 . : ■ 5 . 0 36 . 0( 55.10 o ÁTOMO _{S 3 : 1}0^{L 1 J} _- - 2 7 . 1 9 5 4 3 . 3 6 8 - 1 0 5 . 6 2 7 ... 00 54 : l í ÁTOMO $ 3 3 9 07 , G L D e 1 5 - 2 5 . 9 5 3 4 2 . 5 8 2 - 1 0 5 . 5 6 3 1.00 5 : . 12 c ÁTOMO ■ i i ; C B G L D c 65 - 2 4 . 7 5 2 4 3 . 4 2 7 - 1 0 6 . 0 0 4 1 .0! 50. ■. ÁTOMO i - . : " c - * - 2 5 . 7 4 2 4 2 . 0 6 9 - 1 0 4 . 1 3 9 7 .00 54. . ■-ÁTOMO ^{» í ■: :}0 ^{G L IJ c 5 ■} - 2 5 . 6 8 8 4 2 . 8 2 5 - 1 0 3 . 1 8 0 3.00 68.1 ;• 7-ÁTOMO 1 ^{!-T G i € i :} - 2 5 . 4 ' : : ¡ 0 . f 6 5 - 1 0 3 . 9 9 9 i . 00 55. f¡ I ÁTOMO S ? 4 4 c : . O L Í ■ : : 7 40. i 56 102 , 6 ■J..00 52 . .

ÁTOMO 83 4 3 G L U y*.* 56 - 2 6 . 1 5 4 3 G . 8 6 2 - 1 0 2 . 6 2 7 i ■ 00 52 . 71 C ÁTOMO ^{: 3 : 5 r5+. O f*í}0 ^{i. ■ :}66 - 2 7 . 5 0 9 3 8 . 9 5 7 - 1 0 3 . 30 - í 1 .00 5 -.. :■ 5

ÁTOMO - 3 4 7 CD G I ^jU c 36 - 3 3 . 5 6 2 ' . : i .. oo r - ÍQ c ÁTOMO ^{3 3 4 8 •; i o l í ;}c ⁶⁶ - 3 8 . 8 7 0 ■■■■ 0 3 7 - 1 0 3 . 0 5 3 s..00 ¡ Í L ■ ■ ■ ^{.... , .}

ÁTOMO : 3 4 ■: Ü E 1 0 66 2 5 . 1 3 6 3 3 . 6 6 9 5 3 .00 6 ⁷ . :■ ' ÁTOMO ^{í 3 5 0 s c u}c 66 - 73 - 3 .: : 0- .830 : o ,.2 >8 1 , 00 32 . O 1

ÁTOMO ^{3 3 5 1}0 ^{C- LU}c 66 .. -. .04 í! : , . 5 ■ 3 103..663 _ .00 52 . 32 O ÁTOMO 8 ^{■ ' ■ Tí P H E e V}- 5 1. ■: 4 i 1:' . 0 13-- ' 00 , i; 3 , 06 51 , 56 l í ÁTOMO ;■ • 5 3 i h íi. j"• 37 'J'í .3 'O >■■:■. 022 . ■■) . 506 1 , 00 54 .50 c ÁTOMO ^{3 : 4} CB ^{P K E}c ³⁷-21 .7 .4 7 i .143 - 59.. 8 S 8 7. , Oí' ' ' ■

ÁTOMO » i 53 o c c .. > ■, 53:5 ■ 0 : .3 ■ 00..9 b ■ .00 5 . .05

ÁTOMO 356 C C l S U IÍ e 57 - . i j .363 ■L i . 9 S -i ■, 0 , .953 i . 00 7 ó , 7 í C ÁTOMO ■ ■ c s i P K E : i ' -20 .56 i ■ 26 -^.....-20 .:..9 50 i , 0) ■ - i 6 ’ ’ ÁTOMO 2 _j . a P H E /•« ¡3 V ^-: ^{.103 I . o - 0 ' .}1 .00 5 . . 57 c ÁTOMO ^•!c ^e; ^{F H E}c ⁶⁷. 23 ! ! . : 7 ■ ■' ■ .9 96 ■ .00 55 , í£. c ÁTOMO 5 ' . c e : PHF- 37 _{22 .1132}1_.525 ^{■ ¡'¡.'¡} _{.9 98}1.0.7 55.54

ÁTOMO ^{3 3 61 c :■■■ ; e}c ^{: 7}... .3 O 4 : .7 t í-í 38..■■6 ? . .00 5 i . 38

ÁTOMO S 36 2 0 P H E e : , 044 30 . S ! 9 - OS .306 1.00 53 .05 O ÁTOMO ;■ • 6 s i - t i 5 : 58 - 2 : . ■.7 S 37 . 7 18 . I B . i 58 1 , 00 58 .27 t í ÁTOMO 3 364 c.= . H i r ; c 50 ■ .77 .52 > 36 . 679 ■ S 8..464 • .00 57 . 3S c ÁTOMO : C B C 68 ■7:". , 634 35 . ■ 4-1 - 59 . 099 ■ .00 5 1. 7' c ÁTOMO 3 3 6 6 c t¡ G £ 68 , .55 ' 3 ' . ; - 3 ...- J .. Üí !: .-. i 8 c ÁTOMO ^{. 3 6} 7 ^{0 H .í}c ^{5 8}i ; _Pi7_-í.G ¡PCiJ¡ .0. : i s 55 .. . L S . .00 .54.66 0 ÁTOMO 53 S S íi O L I c 59 - 2 : , 238 37 . 479 - 96 . i 56 i .00 57 .27 i í ÁTOMO : 36 9 C A GLY c i 9 ■ 20 , 667 38 .222 - 05 . Ü ■ • 1.00 i ; . 51 c ÁTOMO ^{■: ¡ 5}c G L Y ^{t '} ^{3 7}_ ; .: . 7S7 i ; . h : - 5 i .. i ■ i . . : 54 . c ÁTOMO 3 3 0 G L Y € i ■ - 20 ,258 ■■ . ■ ?<! 05..392 7 .00 7. 4)7 ⁰

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ÁTO M O i 504 C A L A ■ i 4 : 2 7 . 2 4 3 Ü U ¡ 1 0 0 . 4 64 ■ . 00 ■■ ■ 30 ■:■ ÁTO M O ■: . - o s 0 A L A ^■. ^•.143 - 2 7 . . 3 ? 4 5 . 7 4 6 - - 9 9 . 5 0 7 • . 00 35 . i 5 tí ÁTO M O : S ü á E-r T Y R ■ : 1 14 - 2 7 . 0 91 4 5 . 4 5 4 ^ 1 0 2 . 7 1 0 1 . 00 36 . i. n ÁTO M O ■ C A T Y R "■ 144 - 2 6 . ' Í 5 .: . j . oo 4 0 i 7 c ÁTO M O 33 o C B TYF- 14 i 4 7 .278 0 .■■■■■■■ s . 00 - ■ ■: tí ■ • ÁTO M O : 5..-: c e T Y R £ 1 . : - 2 4 . 8 2 0 13 .338 .. V . : .7 t í 1 . 00 4 J . 25 i ■- ■ ÁTO M O .■V : 0 C D 1 T Y R ■■ 144 - 2 4 , 1 17 : . .. 7 - - 1 33 . ó 93 : . 00 4 6. i '

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ÁTOMO §2% 6 Q 1 i 4 - 26 .5 ■ ■ 21 .. t i l 5 í i . 00 .20. 1 i V' ÁTOMO ?, - V- ! 34 - 2 5 . i 35 20.■ 30 6 4. 54 3 ; . ^{0 0}; ú .40

ÁTOMO ; 7 0 MET 184 - 2 2 . S E ■ 1.5 Í59 - 63.003 ... 7-7 20 ... O ÁTOMO : 2. V i eso. c 1 S 5 - 22 .901 : 2.537 - 55.7 ü i. . 'j0 20 . : 7 M ÁTOMO 92 50 CA SER c .1 ■: 5 - 4 20 .^.1SI - 56.259 ... ^{0 0}70. ... C ÁTOMO : ' . c o SEP. c ¡ ; 5 - 21. ¿ 5 ; 20 ,..■ ■ - 67.5 15 J .0f 3 0 , 61 i-ÁTOMO :■ ; 5 ■ 00 5SR : i ■: ■ - 20 .4.9 22.2 :SO - 5 ,2 5 ■■. • 20 , 7L ■■ ÁTOMO 5 ■ c Í151R c i 5 20 . ...V 20 ,328 65.255 1 ,00 20. Í1

ÁTOMO ; í í í 0 ^€! 32 15.372 19, 65.4 60 i , ^{0 0}20, 33 0 ÁTOMO K A J A c J.96 - 20 . - • 2.1 . .. 3:. - 64.2 21 •. ^{0 0}20. 7 H ÁTOMO ■ 86 o s ■ ; i 3 G - ^:5 - ■ 7 2 ! . ■■■.■■>. - 6 >.0 57 ^{1 . 0 0}21 .49, ^■■ ÁTOMO ■ 25V ■1 B ■ ■ € i 36 - : 9 . ÓÉ9 23.343 - 6 ¿ . 3 ] . Ü< 20.99 . ÁTOMO ■ s ⁵0 A J A 0 !.96 ; • . 7 20 .426 - f ¡ 2 t 107 1 .00 21 ^.59 ^V.ÁTOMO 0 c 13 ■; ^{; .}.7 3 1, .076 - S i .5 53 1 .00 22 ^.06 0 ÁTOMO s- í í 0 ÍT VAL 11" - 20 , 720 ..5 .52⁰- 61 . 6 : .. 00 2 1 . í; ÁTOMO i 30 i CA V A L ^■■19 ■ . .52 ■ .. s ... a ⁹- 60 , 560 ^.• ². ^{. . o .}

ÁTOMO 53 ^{■ ■ ■}CE V A L c ■i 3 ; - ^{. .}:: v ¡ 13 .955 - 59 , ~¡ 24 ¹.00 _{2 0 . 5 4}c ÁTOMO 5 .■ 3 C o l c ! ■: 7 - ^{2 3 . 3 7}6 19 ^..27 58^.7 S i 1 ^.00 20. L, ^■-ÁTOMO ' V A L c 1 O -21 . $2 ' ' 3.837 ^-55 . 18 ^■.7- 20 _.68 ■r ÁTOMO ■ .30 i ^cC i 5 ■ ^-■ i. ^.: :. i 17^.? ^{1 0}■■ 60.8 50 ■ ^.oc 31.43 ^cÁTOMO 0 ^{- .}AL ^C: r 3: ^.i 7 ^..6 SS .& 3S ^{. .}00 ^{. . .}30 0 ÁTOMO [ 307 w GLM c 13 s 2 ^{L .}i ' ; ^.4 • ^:.- 62^.: 96 i ^{. 0 0 2} i ^.62 H ÁTOMO - ?0S : G.I.1-! 0 ! -.8 - 21 . SS9 16 .15 7 ,7 04 •. ^{0 0} 2 , ..: ' ■ ■ ÁTOMO 5 :3 : CE GLM c 1 ■ 8 - 22.065 15.2 31 - 54 .228 ^{1 . 0 0}25.7 4 C ÁTOMO : 31 CG ^{.. t;}c : 3 o - 2 ' A V i ;, ? 53 ■ 61. e i ; . - 2 4 . sr c ÁTOMO ■ 31 .L . : .T c ; 98 -21 ..145 1.4.70 - 6 . ' i 6 ¹,0 í 25.8 3 i: ’ ÁTOMO 5312 0111 GLM c 133 2 1.2 52 . i c o - ^5,205 . 00 27.24 ü ÁTOMO 9313 ...... GLM c ^.1>s . . .22 . ..2. 7 :1 64 . ... ^{0 0}2 -i . ; Tí ÁTOMO ■ 3 i 4 G GLM c J.58 -.. . 5 M 1.5.010 - 62 . 3 ■ 4 ■. ¡: ■ 7. 77 ■ ÁTOMO 931 S 0 GLM , ! 58 - :■ .7 23 15 1 ■ 52.1 33 ¹. 00 27 03 ! ÁTOMO 5336 N LEU :l 35 - 21. .43 13 , 5 ' 0 - 61 . 65 i . ^{0 0}77, • Tí ÁTOMO 9317 c.'i 12 D CI 139 .31 ■ 10. ' 42 61 .50 ■ ] . 7- 23*03 .■■ ÁTOMO v 313 CE i c r ; c 1.9 :■ “ 21 ,706 ...L.700 - 50. 74 ■ i 00 22 58 c ÁTOMO 5313 o ; LEU c [ C^i - ^{2 . 1}• ²..1 . " 76 - 59 .208 1 ,00 • • ^.: =,

ÁTOMO ■ 32 1 CD1 LED c 15 5 -2 1.2 2 10 ,934 ■ 58.554 J. .7- 20 . S8 C ÁTOMO : 32 _.i.-'.f _ci 39 - 33 , 056 1 1_.326 ^{- : ,}2^{. v ■ ■;} _{: . ; so}2 i .7 í C ÁTOMO 5 122 c LEU c í 9 - 7 2 - 12 ^.1 33 ■■ s o . a ' ⁴1 . 00 2 i . 38 c ÁTOMO ^:■3 ^:3 0 ^{¡ -ó .}c :i 39 - 21 _{. 1 2}1 ^{: . r.¡ tú -}62^{- . '}6-1 I . 00 23. ^¡5 ^OÁTOMO í ? : 4 u G.U ■ i i , 0 S 3 1 l .76'7 ...... : 5 < ; •. 00 24 K ÁTOMO ■. 123 CA GLD c 2¡;o - 16 .523 i l ,071 ■■ 54 . ■ ¡ 8 i . 00 25 ,01 c ÁTOMO 53 16 : ■■ i. c : o o : : ,07.5 3.0, v - 63. ■ 77 L . 00 27 . • ! ■■ ÁTOMO 5327 CG GLD c 200 - 16 .04.2 ] 1 602 - 64 , 737 ] .07 30 7.7 c ÁTOMO • 323 ■i 0 200 i - . i3 ! ! 9'JS ⁵; ^.- ^{4 1}J. * 00 12. ■! C ^{. . . . , .}

ÁTOMO 532 ■: 0E1 c 300 • '. . 30 i 2 ⁺? H 2 -62 . . ⁷1*00 32, 7 r ■ . ■ ÁTOMO i QE2 7 u V 200 ■■:. . S 5 ¡ 11.3 ! a - 63.401 i ^{. 0 0}7 i . S i ^•ÁTOMO c G-M c 200 i $ .22 0 . $ 2 I' - $ 4 , 4 44 . .00 24 . 26

ÁTOMO S 3 ■ ■ ■ - G l.U c 100 - i 9 ^.' 2 ^.562 - 65 ^.6 ^{1 . 0 0}2 ^{; .}7 ¡, 0 ÁTOMO 31 ■: £T SEP r 20 ■ - i 5 . ⁷ a > ■I .070 ■ 6 ^.. ■; ^-1 _{1 . 0 0}2 -.^.80 Í'S ÁTOMO : i j 4 C h s a n o 203 ^{- 2 0 .}:: ^{. 1}7 : ^:i í l - 63.7 I i ³.^{. 0 0}24 17

ÁTOMO 33 i 3 .■■■■: C-.K c 201 ■■ ■ ■ . OES . : 02 ^{1 . 0 0}. : : .00

ÁTOMO i i 36 0G e ¿ í s c ^{2 0}; - 21.352 7 2 : 1 - 6.. . 4 ⁱ: i .^{0 0}21.53 .• ■ ÁTOMO i' 33 ■ c SER : 207 -21 .9- 4 : í ! -27 - 54.4 9 i 1 .0¿ 24 32 ' ' ÁTOMO 53 i 3 0 SER 10 - 22.275 1 1 - 61.23 ' 1 .00 - . ^{5 3 ■7}ÁTOMO í 335 M LED 1 201 2 : .456 2 .2 0- 61.327 ■ .00 23. 37 K ÁTOMO 1345 CA _{LE D} ■ 202 25 . “ 56 0 , : ■7 i .9 , 3 ! .00 22 .52 c ÁTOMO : 34 Cíí :■ ¡rj 202 3 . 42 . 0.094 52 .9 ••• .. 00 22 ,04 .

ÁTOMO 5.342 CG LED c 302 - 24 , 3 -OS 3 . 6.2 -52 .50? ; .00 71, Vi

ÁTOMO 934.í í DI 15Ü : 202 - 35 , :.1: ^{1 0} . i - - S i - 806 1 ,00 21. 77

ÁTOMO 9 ■ 4 : CD5 _{L S D} 4- ■- 202 20.4 1 ? . 136 ■ 51.34 1 .00 21. 54 c ÁTOMO 33-15 C LEU c IOS - 23.650 .7 , 74 : - 6 ^{. 7 4 1}. ^{0 0}, 37 _cÁTOMO : 3 í 6 0 ISO c 20 ■ 27 :31 ] 7.5S7 66.8 5 ■ ]., Ü< 22 , ■ ⁷

ÁTOMO i 347 U ASW c 20 3 . 2 , , 21 . 2 .21 ; 66. S50 .. ^{0 0}22 . 67 H ÁTOMO 5.3 ■; 3 ■■■A' c 20 3 - 22 , x 64 11,1 1: - 67 .560 , . ^{0 0} 22 . SE c ÁTOMO 3 í 5 CE ASM c 205 ■ 20.666 11 ,161 - . 757 i .^{0 0}22 . 52

ÁTOMO 33.50 CG ASM 205 - i 1 ,626 12 , i 2 ; - 6 . , 6 ; .1.06 21 , 7 ) c ÁTOMO 3 2 ' OE1 c 203 - 18. ■ 12.0 :c 5 -409 i .00 20 .30

ÁTOMO ; 604 T R F ■ 24 0 : ... . ' ... ... :■ ................... ■ ¡ . 00 l i 80 7 ÁTOMO r ü 5 : : : T R F ■■ : ; o - 2 ? . ■: 45 27 . ; - 54 . 3 58 1 . 00 1 :■. 0 7 c ÁTOMO S í i ü 6 ; ^kT R F c : ¿ o ■■■;■. J 4 4 . 59 - 5 4 . 767 1 , 00 1 5 . 0 6 c ÁTOMO : SO 7 c :■ 5 T R F ■" 24 0 - 3 7 . 7 ! 4 ■ ■ 654 - 5 4 . 2 1 5 j . 00 15 ' ' c ÁTOMO 9 60 & CMÍ T R F c 2 4 0 - 3 6 . 3 5 ; 2 5 . 3 3 0 - 5 3 , 2 7 2 : . 00 ; 6 . 3 0 ■7 ÁTOMO 5 - 609 r 5 T R F - . ¡ ^j- 2 9 . 5 ' 25 25 . . ; . l l . 3 34 1 * 00 l : . 55 ^{; '}ÁTOMO 5 5 1 0 - T R P 5 24 0 - 3 1 . 7 ? : 12. ~ 3 - 5 5 t ■ ■ : . 00 1 3 * 7 5 c ÁTOMO : 61 i 0 T R F 24 0 3 0 . o : . 2 1 . 473 3 6 . 7 9 0 . . 00 i ■;. '■ ÁTOMO 5 5- i ' V P R O 0 ' 4 i - : ■ . " 77 , 73 , 9 ¡ S -- 55 . " 0 4 1 . 00 .; 7 .8 j tí ÁTOMO 9613 - h - 2 4 1 - 3 3 . 4 0 3 2 ¡ . 56 . •• . 1 .00 1 5 . 37 £ ÁTOMO 5 ■■: 4 C B F E O ^ ^{i y}- 3 4 . í 2 2 . 3 3 6 - 5 5 . 9 " . 1 .00 ! ¡ 3 c ÁTOMO 5 5 ! 5 CG 30 ■- 3 - ■ - 3 4 , 6 7 7 1 - 5 5 . ( 1 1 1 . 00 1 5 * 0 5 r ÁTOMO 9 6 1 6 CD : 2 ■■■ 2 : ; - 3 3 . 3 & 3 2 4 . 1 2 4 - 5 5 . 3 9 5 i , 00 14 . J J c ÁTOMO ■ ■■ : ' C 5 5- 5 24 5 - • : . 3 1 i 21 02 ‘ - ■ / . f>, ■ s ■ . O í i - c ÁTOMO 56 : 3 0 P R O 2 41 • .. 31 2 2 . 2 94 ■■ 5 í . ■ 58 1 , 2 C 10 . 7 7 ÁTOMO : 5 1 9 11 AEG- ; . . 7 5 - ;: 2 0 . . '• - 5 0 * Ü? 6 ■ . 00 i 6 . 4 7 K ÁTOMO 56 2 5 C A A R G .5 2 42 3 3 , 0 5 7 20 . ! &4 5 5 , a 71 1 .00 1 - . 35

ÁTOMO :■ píIí ¡y . c 2 4 , - 3 4 . 5 5 7 . 5 . i 1 • S O . 123 . . 00 : . 30 r ÁTOMO 5 62 2 CG A R G 24 2 - ; 3 . S i 17 . -O - S O . 0 06 . . 00 iS>. ■■ 9 C ÁTOMO 9 6 2 5 CD A R G : ¿ 4 3 - 3 s . ' ■:: J 6 . 5 59 ■ i 0 . 2 9.7 1 , 00 2 7 . 7 5 c ÁTOMO 5 M i ^{m e}ARG - 745 ■ 3 4 . ¡ 36 13 . ' ■ 4 , ! . 00 21 . "•** 13 ÁTOMO y 62 5 e s A R G ■ 2 4 2 - 3 6 , i C ' 77 , - 5 8 , 6 6 5 ■ , 00 6 C ÁTOMO : ■; i ■' < ■ '7 2 i ' 3 6 , 9 ■■■ J É . 164 6 5 . 4 2 0 l , 0 í 1 . 77 ¡ ÁTOMO , 62 7 HK2 o 2 42 36 . 313 1 5 . 3 1 ; 0 . .5 0 8 . . 00 2 2 , 3 1 H ÁTOMO 56 : s c A R G ■5 ¿ 4 3 - 3 -i , 6 2 6 - 6 0 , 5 :. 8 , . 00 : 5 . SO ■2 ÁTOMO 53 2 5 0 A R G 2 , 3 « 34 _ ^ ¡ 5.4 2 2 . i 0 ■ ” 61 - ü b S i . 00 1 7 . 5 3 O ÁTOMO 56 3 N T R F ■■ 74 - o . i ■ 2 : . 0 7 7 - 5 5 . 3 3 3 . Oí : : . 2 S 13 ÁTOMO 5 5 y CA T R F ■ 3 4 3 - 3 6 . 6 ; 7 2 3 . 0 14 - 5 0 . : : :< l . 00 1 ;1 . 41 f

_{ÁTOMO oo 5 '} ^i;r;S7 _{■.55 - 2 8 . P} Í4 ^{¡4 .784 • 5 . .} _{! . 00} ^{> L . 72} r ^{ÁTOMO ¡ c I--.!. C 2 : : ' -27 ,1 - :} i ^{J . 653 - ¡ . • 1 . 00 2 8 . 8S ■3 ÁTOMO :■ L ilU}C 299 ^{26 . '■ 45 4 4 .2 IC 7 5 . t i l ! 1 .00 27 .64 C} _{ÁTOMO i : o s s ¡i I,/ S c 700 - J S . : '} i _{5 .44 (1 - 7 3 . 197 : .}oí 7 ^{. :}5 ⁴ _{ÁTOMO i 005 6 170 L. 300 - 2 7 . 1 ü 7 4 f. . .570} -12. _{• -]} 4 _{_.}00 ^{• . ■} /- _ÁTOMO ^{jo o} y! ^{t'B i: ' 4 4 200 45 .: .. 5 1.242 ; .}00 ^{6. v? c} _ÁTOMO ^I ■'■■ ^{CG L 'iG 4 500 12 47 728 71 ,338 í .}00 ^{03 72 c} _ÁTOMO ^{i 0059 CP 0 500 -57 .310 ■! 7 . ■... 3 - 70 ,35' 3 i ,}00 ^{. L ? ■5} _ÁTOMO ^{15 ISO 7 •• " 500 - • ■ 3 49 . • 22 ■ ' 0.5.51 i .}00 ^{53. 6 4 ■:} _ÁTOMO: : O b i r " L 77 r 100 ■■■■,■■ ³50 ^,71 i ^■68^.8 3^.o¡ ^.: ^.0 ⁴ _ÁTOMO: 0 ■ ■ ■ _c ^{. !} _{: 500 -26 ? 4 . í 15 -} ^{■7 . '7:5 :}1.00 ^■7^{. , 3}17 _ÁTOMO ^{í 00 S í} 0 ^{' •• - .00 25 .72 5} _{4 3 .6} ü ₇ ^{-73 . 465}1,00 ^{5 . . 6} ₀ÁTOMO : ^jO b i . E *2 JÜ . 2 ' • . 4 5 , 033 7. . 5 9 . 1 . 0 0 24 . 4. 1; ÁTOMO i 0005 ■ I L E c 305 - 2 7 .6 G ? - : 7 1 . 6 3 0 1 . 0 0 2 3 . 75 ■" ÁTOMO i 006 5 C E i ; 50 . - 2 <?.( ■: :. . 64 7 - ^{t i}■■ ■ i . 00 2 . ' . ■:> ■ ■ ÁTOMO i 00 ó'.' CG] ! E c 50 - 2 9 . 97 ■: 41 , . 6 2 - 3 ' 0 . 5 7 ? ] . Oí ? :■. :. 7 9 ÁTOMO i 0053 C 01 i L^jE c 501 1 . 4 2 5 i 1 . 168 7 0 . 756 . . 00 2 7 .3 8 c ÁTOMO 10 055 • •: I L E c :o._ ■■ 2 8 . 8 2 5 19 .4 12 - 73 . 205 1 . 0 0 23 . 63 ■: ÁTOMO " 0 0 ■: .71E 7 3 0 - - 2 6 ■ 6 5 :- 4 0 , 8 2 8 - , 486 .. 00 2 9 . í 4 C ÁTOMO 100 7 i y i L E 505 - 2 6 . S S 15 .7 3 ^ , ' 31 .. .5". 2 .. _VÁTOMO ; t: 7 . 5 c s o : - Li l i . 7 4 ■. 7 7 , 1 7 2 - 3 . 8 ■ ■. 00 2 3 . 6 1 ÁTOMO i 007 7 C.h G i . r c - 17.5 7 9 . 4 5 3 -3-.? .51.1 1 . 00 4 . 91 C ÁTOMO ; ^j0 ■■■; c G L Y 7 301 - 24 . 014 3 7 . 9 7 C . S ' 9 ■ , 0 : 2 ! . ¡56 c ÁTOMO i 007 5 0 G L Y c 3 0 ' - ■ ! .2SCI 3 J .5.73 - ■ 3 , 5 ' : . Oí :> i . , : 0

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ÁTOMO i :: o ■ s .. S E R , 1 503 2 6 , 3 2 4 .37 , 455 5 . 8 8 ! 4 L. 13 1 ÁTOMO I ! 0 77 Í3R S E R c 70 :■ 2 6 . 0 5 3 3 6 .0 1 ? 5 ' .5 i i i . 00 2 0 . 9 i c ÁTOMO : 0 0 7 s Cñ S E R 7 30 ■; - 3 . 0 44 ¡ : .55 : 7 - 7 0 , 4 37 3 . 00 2 0 . G, c ÁTOMO 10 075 OLÍ S E R c 30 3 - 2 6 . 2 7 4 34 .. : 5 - - 70 . 706 1 . 0 0 2G . 30 ■: ÁTOMO 1 0030 c S E R 4; : 0 3 - 7 7 . . 5 7 55 . O".- - 7 : . ' i 5 i ■ . o c 31 . 3 • C ÁTOMO : 00 Í ! . : y S E R 30.7 - 36 . ' 02 3 6 . 2 4 3 • 4.5 3 . Oí 2 1 . 7 4 0 ÁTOMO o : A L A 2 30 4 2 7 . 2 7 3 3 4 . 5 1 7 70 . . ... 00 2 1 . 0 6 1: ÁTOMO A L A : V04 7 ■■ .4 4 - 3 .■ . 8 7 , ■■: . s i s i , 00 10 . v 4 3 ÁTOMO i 034 ■ B A L A c 50 ■ - 2 3 . 0 52 32 7 4 ■ • 1. - 5 7 1 , í 19 . S I C ÁTOMO : 0035 ■: A L A í 304 .-■■■' 3 3 . 56 7 ■ , 85 2 1 . 0 0 : 3 : ■ 4 C ÁTOMO : J 33 6 0 A L A ■ 504 - 3 Í .647 3 3 .863 - 5 . 5 : 4 1 , 00 40 . 67 0 ÁTOMO 00 ' ^■ I L E : 5 C 5 ..7 .0 56 55 . : 7.¡ . 7 3 ' 3 . Oí 1 9 ... i t ÁTOMO 10 133 L-A I L E c 3 OS - 2 9 .9 i 2 3 ............4 70 . 11 ... 00 Í S C ÁTOMO : 0 G S 3 CE I L E c .0 7 - 2 6 .2 7 ; 71 . 7 7 : - ■■ 7 ■ ' ' : . 00 : 8 . 5 S C ÁTOMO o 05 ; G1 I L E c 50 5 - 2 6 . 2 6 : 5 5 . 7 .:<■. ■ ' 0 . 0 2 4 ... 0! 1 3 .40 C ÁTOMO : 7. ; COI I L E c 305 - 2 8 . 9 4 5 ■0. , : . ! ¡ 0 1 3 . 4 8 C ÁTOMO : I L E :■ 50 3 - 3 0 . 1 31 3 1 , 2 W • 168 ! .00 : : 5. 74 5 ÁTOMO : .0 ■.3 c I L E c 30 3 ■■ ÍC .7 07 3 1 . ¿ 7 J - 7 0 - Ú -2 1 .00 i 3 . 4 t 4 ÁTOMO ; 0034 y I L E - 500 3 1 .922 33 652 6 8 . 9 i ' ¡ ! . 00 .! í 5 ÁTOMO LO GLK V 50 <3 - 2 ? . :■ S 3 34 .7 : 8 - 6 9 .707 ; . 00 18 . 57 1 ■ ÁTOMO : 0036 ; ■■ GLlv C 506 . 35 : 35 . 561 - 6 9 . ; 5 6 i . 00 1 9 . 2 7 t ÁTOMO 10057 CB GLEr 305 - 2 5 . S i l 3G 5 ' 5 - 4.3. 51 7 ! . ÚC :. ; s C ÁTOMO ::: i s s CG GLN ;■ 506 ■■ J 6 . 7 . 3 3 6 . 4 54 - 6 7 , 28 4 ^{: .} 00 ; 9 .4 ■4 ÁTOMO : : • fj 9 CD GLt' j ;■ 506 - 2 ¡ .7 2 9 3 7 . 5 6 6 5 ‘ : ! * i .00 1 : . 7- , ■ ÁTOMO ;: ■ oo O E 1 GLí-T 3 506 .913 5 . 7 ' 7 - 67 . ó : .00 1 9 .1 6 ■ ■ ÁTOMO 101 1 GLM C 30 6 27 . i ■ .403 .5 . ■ 4 . .00 i 3 .3 4 1. ÁTOMO i ::: o í : GLFT 0 306 - 3 i , : 15 3 6 . 38■ - 7 0 . i 39 } . 00 13 . 90 c ÁTOMO : : i d i 0 GLW : 50 5 . 37 37 . : • ■ 4 <2. 8 L .4 1 , 0 0 2 4 . 2 2 c ÁTOMO .04 ■■ ARG 2 J 0 i......... ; :r J O ? - :■... 4 68 1 .00 20 23 1: ÁTOMO ; :: ■ 05 C ?! ARG C 307 - 31 : ■ . 046 - 7 2 , 5 5 4 .1 . 00 3 0 . 2 1

ÁTOMO : i o s CB ARG C y y : - 3 1 . J 13 5 6 , 95 8 7 j , 8 :■ S i , 00 24 . 5, ■3 ÁTOMO i 0 CG ARG : 30 ■ - 5 1 - ■ ■■ : 3 Í i 7F - " 4 , 8 6 i 1 r í 5 2 0 . ! 0 C ÁTOMO i 0 LOS c : ARG .7 30 ■■ > 0 . 51 5 ' 5 . ' ' ■■ 3 , 00 3 ! . 9 C ÁTOMO I 9 ■ E ARG ; 307 7 5 , ■ 61 3 8 . 4 9 8 7 V .7 02 ■ .00 24 . ■ .• 4 ÁTOMO ; : ; C " A R G 0 5 0 " 5.7.4 S 8 1 7 . 7 ' 5: 7 5 , 9 0 2 3. . 00 21 . 30 C ÁTOMO i 0111 ■LHl A R G C 50 7 5 6 . 1 5 3 .56 .569 11 . - ■ 6 . . 00 2 0 . . i t: ÁTOMO .10112 : , ; i ARG C 307 - 2 6 , 3 7 ; 3 3 . 2 22 ■ . .4 ? . .00 41 . ?2 t: ÁTOMO : : i i .i ( A R G : . ¡: ■ - 5 3 . ' 66 36 .5 . 7; ■ ^{7 :}.^{6 :}1 , 0 0 24 . 4 í ÁTOMO 1 0 : 1 4 o ARG c 307 ■ 3 4 .3 7 6 36 .95 = ■ 5 .00 • . *:4 ■■ ÁTOMO i :: ‘ i N LEU ⁷3 0 ■■ 3 3 , 2 ¡ 7 5 ■ , 99 ■ - . 747 ■ .00 . ■ 7 1 ■ ÁTOMO : 11.6 c ■ LEU 7 3 0 6 - .5 7 3 4 . 165 78 .7 5 ? i . Oí ■4. .2 c ÁTOMO 10 . 1 7 C S LEU 7 3 OS .. s . o 7 >2 . 5 7 5 • . 831 . . 00 2 0 . í ü ■5 ÁTOMO . i 3 CG LE U C ; 0 S - 3 3 .5 '58 3 ■ ^{. 5 4}■; •• i , 099 i . 00 3 1 . 0 9 ■4 ÁTOMO L 0115 ■ DI LED c 3 OS ■ 52 .7 3 í 3 5 .903 7 :■ .8 6 4 i . 00 2 ? ; . 4 7 c ÁTOMO i o • C 05 LEU c 30 ? - > 4 . 6 G 5 : . I 59 - . 32 3 .3 . 06 52 . 5

ÁTOMO í :: 12 : - l e u 7 5 OS - > 5 . 320 34 . ; 16 - 4 . : 32 J .00 2 0 . 1 3

ATOMO : 0 . 2 '■ 0 L E U 10 : 1 - . 36 . ■ 3 4 . 4 3 7 ' 1 . 6 ■ ' 1 . 00 20 , 2 ÁTOMO _{l o i}: 3 t: A R G c 30 9 ■ . 3 O- ' : .. 3-1 . 315 - 1 0 . 3 7 : i . 00 1 .. . 30 r ÁTOMO L " . Zh A R G c ; c y 1 ........... .. 1 . i . 00 2 0 . 1 .: C

ÁTOMO : 0 ■■■■: o u : : A G P ;■ 3 13 - 3 5 . 6 2 ■ 33 . > 54 ..........- 1 13 1 . 00 2 7 , ü ÁTOMO : ■;' i i c A S P o 313 - 4 1 .7 ¡ 3 -i 7 5 . 53 1 - 38 . 9 4 . 5 1 . 00 8 6 , ■ 0 c ÁTOMO i ¡ 4 0 A S ? - 3 í 4 2 . 1 t ■ 3 9 . 9 6 5 5 8 . 6 0 6 i . 00 2 ■ .

ÁTOMO i j 165 I L E 0 514 - 41 .1 5 ’■ 33 . 5 .17 - 3 9 . 3 18 i . 00 2 ■ . 55 r ÁTOMO : ■ ■ 66 ; I L E 0 314 ■■■3 , 0 .1 4 0 , 4 8 6 - 7 0 . 72 ::. 1 . 00 27 . ... í ÁTOMO 18 157 C B I L E 3 1 - 4 1 ... 11 í l 135 - 7 í . B 1 i i . V 25 78 c ÁTOMO : 0 . 63 c a l I L E 7 : : í ■■ , 2 . . 4 2 . 2 2 2 .' . : s e 1 . 00 02 -ÁTOMO ; 6 C D I I L E C j i : - - - .63 .3 : 7 . 3 5 3 ■ . . 3 . ” i . 00 2 5 . i c ÁTOMO ; : ■ ■ 0 e c o I L E V 314 - 4 ] . 9 9 2 5 1 . 7 14 - 7 2 . 9 : Si i . 00 2 7 . 0 3 c ÁTOMO 1 01 7 1 c I L E c 31 4 4 - . . J 3 3 2 . 6 63 7 - . 3 4 i . . 00 . 40 z ÁTOMO 101 7 ?. ■ ■ I L E 0 ; - • 1 : Í 0 . 5 53 ■ ■ . 5 9 5 i . 00 8 i , 5 í ó ÁTOMO i J 1 7 .i ET 3>ííST : 3 ■ 3 - 4 5 . : 62 3 6 . 6 7 4 . . 8 54 1 . 0 0 25 . 55 !. ÁTOMO 1 . 74 Ch M E T '■ 1 i. 0 - 4 4 . 2 6 6 Í 7 : 36 - 7 .. . 5 >9 1 . 0 0 2 9 . S I

ÁTOMO 131 ■ 5 C B H E ! C ; i 5 ■ ■ 7 3 6 . 7 .■■ - 7 2 . ! 55 1 . 00 3 0 . 3 i.

ÁTOMO : i 16 CG H E ! c : i 5 - 45 Y : , 0 2 ¡ - 7 4 .6 i b i . 00 3 1 . 0 0 c ÁTOMO : . ■ ■' s i ; H E ! .■ ■:: 5 - 4 2 . ■ . 7 3 5 . 4 4 ■ - I- . . « i , 0 í i 0 „ 75

ÁTOMO i 3 3 M E T c 315 - 4 0 . ; 76 3; . 1 1 3 - ' 1 . 8 ' 5 i . o c i 1 . 3 3 c ÁTOMO i 73 c H E T ; : 1 0 4 5 . 4 2 7 37 , ■; 45 7 3 . 5 8 8 ■ . 00 89 , 96 c ÁTOMO i ; i : s o 0 H E ? 0 3 7 • . • 3 7 . 65 1 . 5 05 • . 00 5 6 , 75 c ÁTOMO 1 0 ' i . A S M 3 6 4 5 , 1 3 1 5 ■ . 3 6 7 ■ ' 0 , 75 5 . . 00 3 0 . Oí 1. ÁTOMO ■ 01 ¿ 2 o o A S M c 31 6 - 4 6 . 1 2 7 3 7 . 2 5 6 - 5 9 . 3 0 4 j . o c 3 í . 54 c ÁTOMO : : ' i ; ^eA S E : 31 6 - 4 5 . 6 1 7 2 6 . 7 5 i : - í 5 . 1 4 1 1 . 0 0 2 9 . í 6 í ÁTOMO 10 10 4 CG A 5 W c : i ■ ...:. . ■- ■ 6 '■ . 1 2 7 5 8 , 6 0 5 . . 00 .5 . 04 >7 ÁTOMO i 3 . ' GDI A S M c ; : 6 - 4 5 . L S S 3 4 , 0 i : - 5 9 . 7 05 . 00 5 . 75. O ÁTOMO i 36 6 1.72 ASLÍ z . i 6 4 3 , 9 ; 7 - . 1 43 - 67 . 7 76 ] .. Oí 93 i ÁTOMO 1 .. . 3 1 C A U U r 3 6 16 . . ..1 3 b . 65 í 58 . 3 . . . 00 2 1 . 7 4 ■ 2 ÁTOMO ; 0 ¿ 33 0 A S E c : : 6 - 1 . . 8 5 3 , “ 6 i - 5 8 , 7 i, 3 i . 00 3 2 , 50 O ÁTOMO L 0 1 3 5 ET L Y S • : 4 6 . - 31 . ... 4 5 - 6 3 . 4 53 i . 00 3 3 . 1 5 Vi ÁTOMO : 0 30 " L Y S c 31 7 - 5 . 5 5 3 Í 0 . 6 87 - 6 . . 7 ; . : .1 . .. 34 . 5 5

ÁTOMO í " ¿ 31 C B L Y 3 c 317 - ¿14 . " 7 6 41 .1 ! j 3 5 6 - 8 0 0 I . 00 3 2 . 4 4

ATOMO : 032 ■ GLY 0 097 -< i? .054 - 3 , 5 ; 0 i, . 3 1 .00 22.6 6 c ^{ÁTOMO i o} r. ¿ ^{■■ GLY ;■ ; • 53 53.5 51 • . 1 1}1 ^{. 00 :: 3. Oí}

^ÁTOMO i ^{. .. ■ i ■ GLY c , : ; :■ - • - ; i ,}00 ^{2 . : 8 Q ÁTOMO}s; TRF ^{c 400}- 50. 455 ^{53.3 73 -815.8 36 . . ¡)í 2 7.:}0 ^Ji _{ÁTOMO i ::} si-i _{■ TRP c i r □ - ...... 5 2 . ... -::í a o . se i . 00 21 . 4 2} f~ ÁTOMO 1 oa ■■■ e s TRP 40Ü 50 62 .0 ■ 93.29 : 1 .00 ' 3 .8 ú C ^{ÁTOMO 10323 TRP 400 - c .28} r- 1 ^{:..Í 0 45 S I .4 65 ... 00 23 i 3 c} _{ÁTOMO i 0320 CD l TRP : 00 54.267 - 9 . U S . . 00 23 .} 11 c ÁTOMO 0 K E .. TRP v. 400 - .162 54 .916 - 52.0 66 .. .00 23. >8 M ÁTOMO LOS 31 c e : TRP 400 . i 55 5-1.181 - S I . 388 1 . : :■ 3. 56 c ÁTOMO ::: ■ ■ ■ C DO TRP : 400 - 47.93 5 52.044 - 90.97 5 i .00 23 72 c ÁTOMO : oso í CE 3 TRP c 400 57 . .. 51. 995 S O .261 1 .00 23. Í0

^{ÁTOMO : jí} ¡ ^{3-1 C} Vi ^{TRP c 400 52 .2 E 9 Í9.96 G i , 00 23, SI C ÁTOMO ; :: OJIO TRP c 400 - - ,242 53 .45 :. 90 ,3 •. 00} 2 ¡ . ^{5 i C} _ÁTOMO ^{: o--.--.-} _{c í :}TRP _; ⁴⁰⁽⁾ _{-- 45 - - ' -} ^..2 =3 ^{. ( i:;:}1 .00 _{2 3 . 62 c}ÁTOMO : 0357 c TRP c 400 - i 2. ‘ ■ 3 31.111 • - . - - 5 .0< ' 3 . 35 c ÁTOMO : o-':-: 0 TRP o 400 : . 531 58 .1147 89 ,417 1 .00 22.27 O ^{ÁTOMO i 0} V.-i ^{1YS c 40.. - i . . . 5 31 .3 35 - 50 .004 1 . 00 2 i . ■ 9}M ^ÁTOMO " ^{34 0} _{t .o LYS C 40.. - .36 ¡ 5 0 ,252 90.9 17}.. 00 _{.74 . SC C}ÁTOMO 10 741 0 E LYS c 40 . - . . S i 6 50.688 50.7 60 i . Oí 21. .: c ^{ÁTOMO ¡: : :} -'~ ^{CC LYS C 40: - 45 .613 - • 3 . 1 96}1^{.00 23. 3 G}ÁTOMO i “ 34 i CE LYS C 40 : 44 5 0.012 - 90 - 34 $ 1 .00 27 .72 c ^{ÁTOMO 10344 CE LYS c}4 ^{o: '} i 1 ^{48 -7 54 n _ 043 ■ • 22.41 c}ÁTOMO ¡ 41 O : LYS C 40 ■ - I C .G ÍC 45. Ó70 - 50.600 ■ . !X 22.30 I! ÁTOMO i 0346 C LYS c 40 i - : 3 ■ 45.3 77 92.3 6$ .. 00 25. ; 0 ■; ^{ÁTOMO 10347 0 LYS} c ^{■ 0 04.076 5 : . 579 33.3 06 j . • 21 . 7 i O ÁTOMO : 03 íS : PHE} c ^{102 - : ■; .3 - 3 .527}i .00 ^{26.7 1}1^: _ÁTOMO ^{10 3-15 - PHE} c ^{10 i ■■ 53.828 47 .878 -9 :5.844 1 .00 27 . SS ■:} _{ÁTOMO : 03 30 CS PHE} c _{40 ■ .655 ! 6 . ? 3 S -9 E. 8 5.5 . -}23 , 10 _C ^{ÁTOMO ■70: PHE} c ⁴⁰² _{- >1.303} i _{t .552 - 52. :■ 3}1^{. 01 2 9.07 C}ÁTOMO 10302 .LO PHE c 102 . .578 47 .856 34.50 2 . 00 2 . .62 c ÁTOMO ₀₃₀₀ ^{. .... PHE}c 40 .. . i 2 ^{4 3 . 4 Í 0 94.810 ...}00 ^{.79. . .} _{í ÁTOMO 1 OS 54} ^{: i PHE c 402 -.} me ^{4 8.748 3 5 . ESE}1^{. ü ■' ' 5 2 1 c} _ÁTOMO ^{: 0 ? OS CC.l PHE c 402} . ^{«50 • 5 .4 13} l ^{. 00 2:- 34 c}ÁTOMO ! OSí 6 ^{1 DI PHE}c 402 - ' . 1 4 ^.24^{: 92.51.0 1 . 0 0 ■}75^{. ■:} _cÁTOMO i : 35 ' C PHE c 40 . 18 i i • ' 3-1.2 E l j . • ■ . 64 c ÁTOMO i 0853 0 ^{PHE c}402 ^{- .5 . 692} _{46 433 53.456} ^{... 00} 21 ³¹ _{< ÁTOMO ; ~S59}I-: THR _{c 40}- 5 . : 2 " 47 .411 - 95.434 j .00 ^::7^{. i g}[ _ÁTOMO ^{i se}1 ¹ ^{THE? c 40 3 - .} 11 ^{] 46 ,771 - 96 . 026 J.. 0< • • . 27 c} _ÁTOMO ^{; .:■■. m}CR Jim c 400 ^{- 57 , ' S ::} i ^{7. ¿05 56,7.34 : . : ;ü 2 ■■ .67 e} _ÁTOMO ¹ ⁰³⁶² _{K Ü} ^THRc ^{40 3 - 57 . 47 16 ,885 9 .1 09}i .00 ^{2 0} ^{, ■■■■} 0 ÁTOMO : 036 i 0 THP. c 403 - ... . 45 . . 1 • - 90.114 i .00 2 5. 92 c _ÁTOMO ^{; 03 ¡4 C TKR c 40 í 56.} ¡21 ^{45 ,694 57 ,2 65 I . 00 2 ■ c} _ÁTOMO 10 ₃₆₅ ^ÜTHR c 40 - 55. ^{46 .}>75 i .00 28 . 37 (7 _ÁTOMO ^{; 0366}:■* ^{A LA c 404} _{- P . O !2} ^{44 ,890 -57.51.5}1. 00 ^{2 3 . 74 ti}ÁTOMO i o s a 7 A L A c 404 - • c e ; 14 i73.1 - 96 , 705 i . - 23 0 c ÁTOMO : 0863 ■c A L A c ■i 1.14 - 57....: 6 42 .7 22 2 1 3 , 5 - 00 28 84 ■7 ÁTOMO : 036? C A LA c 40 : - 57.587 : ■, 75 i ' 95 . 7 - i .00 30, 60 ,■ 1 _ÁTOMO ^{l : 3 0 A LA} c ^{404 ■7. . : . ■: - -}55^{. e: ti 3}.00 ² ^{-.. - i ■'.} _{ÁTOMO L OS i i} ^THR _c ^■10 _{■: - 44 . 450 i O i - U58} ^{. .}00 ^{3 2} ^{. .7 K}ÁTOMO ] o 3 ■ ■ CA THR c 405 - 5 " .519 14 ,575 - 10 .352 i .00 34 , L J , ■ _ÁTOMO ^{i 037} i ; ■■ ^THRc 40 > - 56.211 45 ^{. - . • ■. :.}1.00 32.82 C ÁTOMO Lí S74 í.VCl THR c U.:5 - 34.936 15 .276 - 102.7?1 •. 00 80 39 O _ÁTOMO ^{; 33 ■ 3 . : : THR € 405 -56 ...55}? 1 -1.03.2 2 1.00 ^{3; . 9;}

^ÁTOMO _13S760 ^{THR c 405 - 5 6 .003 43 . - . i ,-3.153 i .}00 35.6 4 ^{c ÁTOMO : ■ ■ ■ : ! TKR G}10^{-■ - 18 . ; 44.121 - i 7 1. >0} i 1 ^,0^{t i íj M O ÁTOMO i}08 ^{3 O LYS c -406 ■: 1 2}.6^{3 «i- 02.7 23 3 .}00 ^{38 . 71}w ^{ÁTOMO I 087}0 C - ^{LYS c 406} _{58 •} ^{11.4 7“ 103 .326 .}00 43^.:7 ^{c ÁTOMO 80 Cfi LYS ■ 106 . . 4 Si;}4^;,1^{67 (}53^.7^{: ;} 1 _{. 00} ^{47 ,30 o ÁTOMO L CG LYS € ■i 0 fj 56 . : E :■} _{40 .703 i 04 . : ¡} ^..00 ^-í i .12

_ÁTOMO ^{'■ 8 á} 2 ^{CE LYS c 406 - 55.542} _{39 .668 *05.101} ^{j .}00 ^{49. 17; c ÁTOMO :: g j í E LYS c 40 3} _{-5 á ,} ^{35. - 15- i a, .}79^-:1,00 ^{50. ' c ÁTOMO ; 0 - ■: L;::. LYS c 4:36 ■ >5.316 3 S . 661 L ¡77 , [;39 •.}00 ^{; 0 . 5 • II} _{ÁTOMO i 3 . . ' LYS c 406}- 55 , T ¡7 _{- 7 , 875-1 OI . i 10 .}00 1 ^{, v.} _cÁTOMO i ' 336 0 LYS c 406 55,1 ■ ■ 40. ! : 7 • 51 ,133 ]., Oí 44 . 35 O ^{ÁTOMO 1.. 337 :: LYS} Q ¹⁰¹ _{SO . S 58}40^,102^{. s as . .}00 _{; 5 . 2} : _HÁTOMO ! 3S33 Cít LYS c - ; : , “ 27 39.8 48 - 103.036 i .00 ■i 5 .5 r c ÁTOMO L '033? C B LYS c 407 ■ i : ,088 4 5.024 ■ 102 . .'28 i .00 47 . as c ÁTOMO i 0.350 CG L Y S c 40 ¡ - 63 . i: 3 i 51.135 - . ' • .] . Oí. 45 , SS c ^{ÁTOMO ¡ 08 ■■ LY$ c 407 - •• . 55 41 .019 ■ 00 - ' . 9}1 ^{. 00 51.04 ■}

A T O M O ¿ 1 0 3 2 N T H E c ■ 3 ■ - 4 ' . F. . 3 i ; .747 ■. ., 230 1 .00 y . r5 Á T O M O 1 1 0 3 3 C A T U R c - ■3:..317 930 - ■s e .. 9 35 1 .00 3 1 . 30 C Á T O M O 1 1 0 3 1 C B T H E c 4 25 . ■: 1 ^ 8 < • ■ .. - V .5 5 : . 1 .09 . 1 C Á T O M O ¿ 1 0 3 5 : ' S í T H R c 425 ... ■ c , 2 7 6 5 C , ■ 7 : - 7 0 . G 33 i , O í ; 7 . : -. 0 Á T O M O 1 1 0 3 5 C G £ THE c ? I 25 . 4 2 ... 7 fi . • .: 5 _ .00 . y . 52 , ■ Á T O M O .1.1037 . • F 4 35 . 64 3 46 V ■ - S S . 1 .00 3 Ó . :. 7 ■ Á T O M O 1 1 0 3 8 0 T H E 6 425 45 ..0 OS i : : 625 6 í l .. 933 ... 00 3 ? 46

Á T O M O 1 1 0 3 9 1 L l í c ■■46 . 4 ■!■. 55 3 - 67 , 9 7 5 - , 25 J . i 6 t i Á T O M O : 1 j - '• C A T L E c 4 2 6 .93 ■ 45 G ■ 6 ' . 1 2 1 i . 00 45 . 55 C Á T O M O 110 - 11 C B I L E c 426 - 7 .. 13 i : ■ . 21 ■ ■ 7. . Oí ■>. Yi c A T O M O : 7 í - ■ c a í T L E : - 1 43 ..33 i 44 .390 64 .. s ; i 1 .00 45 . 69 c Á T O M O I I f ¡ 4 j m .. I L E c 126 .636 42 , 91 6 64 , S 7 7 _{1 , 0 0 4 K , 62}i Á T O M O 1 1 0 41 CG3: :■ c 4 26 46 ., 6 .6" 45 . 9 : : - 66 . 00 1 .06 4 .. . ■ 0 c Á T O M O 1 1 0 4 5 C T L E c 4 2 6 .: 0 . .: G 7 4 . ■ 35 - 66. ^■■ . 00 4 . . • c Á T O M O 1 1 0 4 6 O I U i 126 .. ■: - .625 ■■ ... 3 0 3 I .00 ■: : . 3¡5 O Á T O M O 1 1 0 47 rr F E O c 42 - 5 1 ., ; 66 ■ 5 . 7 3 1 - 66 , y 6 i . O í 66.61 n Á T O M O 1 1 0 4 6 C A P R O 42 ■ S 5 7 4 3 3 ' ■ .. 482 . .0 ü 50 . S í ' Á T O M O 1 1 0 4 5 C B • . c 127 - 5 3 . 45 7 12 - 6 7 . 4 66 1 , 00 50. M c A T O M O ■: i , F E O c 42 ' - 5 3 .0 33 44 ■■ ■ . 3 3 ' .. ⁰⁰4 .. y c A T O M O 1 10 51 v D ^ • V " 42. ■ . ’ Gl i 4 í>6 G ■ , 960 15. - I.. V Á T O M O 1 1 0 5 2 c P R O c 4 2 7 - r .7 . ; 'i íj ■ 42 - : :: .. o 5 : 1 .00 5 : . 38 c Á T O M O • : • i 0 • • . c 4 2 7 5 . 54 3 4 4 4 44 .52.7 i .00 50 . 10 O A T O M O 1 1 0 54 ^N A S E c 428 í ; 46 ■■ 43 64 . 163 ■ , 0 : 34.1 -1 H Á T O M O 1 1 0 5 5 C A ñ C P c t > s - i ■ .4 : i 4G :.:■■■ - 6 3 . . ■ 5 ■; . O í c;4 i.' Á T O M O 1 1 0 5 6 C B . £ 8 c 42 Í Í 34 ., ü , 3 47 4 - 62 .45 ( 1 . í 0 :.- ■■■. 0.7 c Á T O M O 1 10 57 í G A S E £ ■ 28 54 ., 5 3 : ¡ ¡J 5 6 - 6 5 . 0 5 G i .00 5 ■■■. 71 c Á T O M O ¿ 1 G 5 S O B I S =■: f 1 2 8 - ?, . : ; í ;>5 - 6 ' .. 064 3 .00 =17. y ü Á T O M O 1 1 0 5 5 o b £ A S P c 128 - 54 . ■: 21 42 971 - 62 . r: 'i 7 1 .00 55 .01 O Á T O M O 1 1 0 S 0 • A S P £ 128 - 3 3 . 8 7 3 i ■ 7 33 - S í . ; :. 7 ' . CC 54. ; 5 c Á T O M O 11 06 1 0 i \ & P c 428 . : . .■ V: 4 S n o 4 , 752 r . o í '■ 5. , ! '■' Á T O M O 1 1 0 6 2 Z l t EN £ 1 52 ,. : i 57 1 31 7 - , 5 0 7 ... 00 81. EN Á T O M O 1 063 M O L B .. 44 .033 904 9 :- .3 84 i , 00 40. 45 O Á T O M O 1 1 0 64 C 2 M O L B . ■;. 4 S f¡ .. 70 S 4.. 6 -¡ =: I , O í 3 : .. i c Á T O M O 1 1 0 6 5 C 6 ' . t. t í 1 ., 945 ;j 7 4 -;4 . 330 1 .00 35 30 c Á T O M O : 366 6 5 M C I . B ^‘4 3 . 6 4 53 , Í G 0 94 . SOC i , ⁰⁰3 : .. : c Á T O M O 1 1 0 6 7 C ■■ 1401 B i .0 3 6 55 ■ 72 ■ ■ -. . 6 33 . Oí J 7 , . :¡

Á T O M O 1 1 0 6 3 C 1 3 ; 44 . - 21 35 668 36 . 353 ... 00 37 55 c Á T O M O ! I G f i S C I O MQX. B -1 - 5 ■ l i s FiS ■ - 9 7 . ?, 2 5 1. OO 67.0 - 3 -Á T O M O 1 1 0 7 0 M i M O L B i . ■ ■ 5 S .32. ; : ■ 98.. 52 4 .. .0 ! y .. l í !.

_{Á TO M O 1 1 0 7 1 c ■ M O L &■} x 0 ' 3 5 ■ j 3'" 56 .. - 8 ■ ■¡ . ' ¡0 o s . 40 c ^{Á T O M O 1 1 0 7 2}r. ^{i B i}■ 45 . . , 37: 55 , 9 34 56 .717 1 .00 37 , 65 6 Á T O M O ; • MC'L ES I . 0 :54 55 i -■ 95 . 4 74 i . 00 33 .. 3 I Á T O M O 1 1 0 7 4 M O L B . 45 , .3 60 53 859 : .■.. 112 x .00 ■ ■ 75

Á T O M O 1 1 0 7 5 : 5 ^{W .} i. B - 4 6 . “ 4 6 5 558 - 34 . 9 ’■ ¡ i .00 ' . 76 C Á T O M O 1 1 0 7 6 ; 8 : : : E ⁱ . 5 7.3 :. I , , 0 S S - 54 . i: ■ 5 1 . 00 38. t Á T O M O 1 1 0 7 7 o l í M O L B - ~ ti . ' ' I 5 i 2 2 2 - - . 747 i .. y 35 l í C Á T O M O ¡ .1073 03 S-ÍOl. n J ■■ 96 .. 7 7 3 50 . 1 í ■■I . 9 55 .00 0 .19 0 Á T O M O : • ■ ■: '■ M O L B i - 4 6 . . 3 Í 61 , 6 f 5 96 . 419 ; . 00 3 S .55 1' Á T O M O 1 1 0 8 0 c ; M O L B 1 - 4 4 .. ; 3 ; 5 ¡ .. 5 : - 96 .184 1 , 00 3 7. , i ;;

Á T O M O 1 1 0 81 02 ¿ B 1 4 -. ..634 32 223 - 6..7 55 . . 00 3 - . 34 ■ Á T O M O 1 .1032 ■■ .1-, ^O ■ 2 ., 3 5 i ¿ 5 4 76 - 5 7 . 3 50 i .00 17. . 6 0 Á T O M O i I O S 3 0 K O Ü v> 2 ¡ , - : 15 ( i - ■ .5 5 : 1 . 00 15. 50 0 Á T O M O 1 1 0 84 Ü fl T^j- 2 , f 7 3 - 1 0 - 7 .. F.136 1 .00 .15. i t f.

Á T O M O ; ‘ 083 0 HOH ■ -i 5 . ' 14 , ■■■ . ■ - 3 3 . . i 5 ■' ■ .00 i í . ; 6 0 A T O M O 1 1 0 8 6 0 H OB . 5 1 . 7 4 7 , . •. .. r r 1 0 4 i . 66 i 5 .6

A T O M O i .. 08 ’ 0 MOR & € _{- 2 5 .} ¡ _{2 7 , i í 3 - 36 ..4 61}1 .O í 1 ■: ;■ i Á T O M O 1 1 0 8 8 0 HOH E> ■ ■■: ■ .. 4 41 2 , - 4 1 . . 642 1 , 00 22. 0

..... ■6 Á T O M O 1 1 0 8 9 :■ í-lOH 3 r . ^{' ■ ■j -■ , 5} 22 ■ .00 26. i 6 0 Á T O M O 1 1 0 9 0 0 SO R t) 9 ^{- 4 3 . “ 1 8} u ^{i Si (i , 5 i 8}1 .00 3 E ........ 0 Á T O M O 1 1 0 91 0 ÍIO H : 10 6 , 3 7 2 27 , .26 49 .. .. 00 34 .08 6 Á T O M O .1.10 ■ 2 Ü ROE. D i i , o n 23 . . 5 - 2 6 . S : : . .00 2 Í . c Á T O M O 1 1 0 9 3 0 k O H £> 12 ■■ 50 . ' 55 5 i ■ 5 ■ ■ i . 0 1 2 1 , 00 17 . í - 0 Á T O M O 1 1 0 94 0 HQH D i ■ . í: . 433 4 60 = ■ ■■■. 1 .00 30 .39 ■■ Á T O M O 1 1 0 9 5 0 HOH D 14 .. 45 • - 57. , 57 ■ , 00 ■ 6.50

A T O M O : ‘ 056 0 i-iOtt Vj 1 5 - : . 0 24 ■ 40 53 .5 15 i . Oí 18. ■ v ^r ^-1A T O M O ¿ 1 0 9 7 0 HO H E> l v . • 52.09 S 105.83(1 . . 00 22 . í . c Á TO M O .11098 0 f iO K D ¡ ” - 55.48 3 51.29 2 - 103.345 i .00 ■;:. . 75 0 Á TO M O 1 1 0 9 $ 0 H O H 1 S - 5 S .085 4 9.218 - 95.665 i . 00 41. 37 C:

FINAL

Tabla 4. Coordenadas atómicas para CRBN (TBD):Pomalidomida (Proteína murina) ENCABEZAMENTO XX-XIOÍ-XX COMPUESTO OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN REFINA!.! ENTO.

OBSERVACIÓN PROGRAMA : R E ffH ftC 5.6.013.7

OBSERVACION AUTORES OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN DIANA DE REFINAMENTO : MAXIMA PROBABILIDAD

OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN DATOS USADOS EN EL REFINAMENTO.

OBSERVACIÓN RANGO DE RESOLUCIÓN ALTO (A N G S T R O M S ) 2,00

OBSERVACIÓN RANGO DE RESOLUCIÓN BAJO {¿ ttiG S T R O H S } 30 .00

OBSERVACION PUNTO DE CORTE DE DATOS ( S IG M A < ? } ) NINGUNO

OBSERVACIÓN COMPLECIÓN PARA RANGO 91 .37

OBSERVACIÓN NÚMERO DE REFLEXIONES 287 SC

OBSERVACIÓN OBSERVACION AJUSTARA DATOS USADOS EN EL REFINAMENTO.

OBSERVACIÓN MÉTODO DE VALDACIÓN CRUZADA DE PRINCIPIO A FIN OBSERVACIÓN SELECCIÓN DE CONJUNTO DE ENSAYO VALOR R LIBRE ALEATORIA OBSERVACIÓN VALOR R (CONJUNTO TRABAJO ENSAYO) 0.19383

OBSERVACION V A LO R R (CONJUNTO TRABAJO) 0 , 19656

OBSERVACIÓN VALOR R LIBRE 0 , 2 40 OQ

OBSERVACIÓN TAMAÑO DEL CONJUNTO DE ENSAYO V A LO R R LIBRE1' * ) 5 .1

OBSERVACIÓN RECUENTO CONJUNTO DE ENSAYO VALOR R LIBRE 1536

OBSERVACION OBSERVACIÓN AJUSTAR EN LA CLASE DE MAYOR RESOLUCION.

OBSERVACIÓN ERROR DE COORDENADAS GLOBAL ESTIMADO.

OBSERVACIÓN ESU BASADO EN VALOR R (A) : 0 .182 OBSERVACION ESU BASADO EN VALOR R LIBRE W ■ 0 .167 OBSERVACIÓN ESU BASADO EN PRBABILIDAD MÁXIMA W ^: 0 , 105 OBSERVACIÓN ESU PARA VALORES B BASADO EN PROBABILIDAD MÁXIMA < A * * £ ) : 6,738 OBSERVACIÓN OBSERVACION COEFICIENTES DE CORRELACIÓN.

OBSERVACIÓN COEFICIENTE DE CORRELACIÓN FO-FC : 0,947

OBSERVACIÓN COEFICIENTE DE CORRELACIÓN FO-FC LIBRE : 0 , 930

OBSERVACIÓN OBSERVACION DESVIACIONES RMS DE VALORES DEALES RECUENT OBSERVACION LONGÍTUDES DE ENLACE ÁTOM OS REFINADOS ( * ) 3057 OBSERVACIÓN ÁNGULOS DE ENLACE ÁTOMOS REFINADOS (GRADOS) 4163 OBSERVACION ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERIODO 1 (GRADOS) 356 OBSERVACIÓN ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERIODO 2 (GRADOS) 105 OBSERVACION ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERIODO 3 (GRADOS) 516

OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERIODO 4 (G R A D O S) : *4$C ■15,000 OBSERVACIÓN 3 RESTRICCIONES CENTRO QUIRAL (A**3> : 465 } 0 - 112 ; 0.2Q0

OBSERVACIÓN 3 PLANOS GENERALES ÁTO M OS REFINADOS (A) : 2184 ; 0 * 019 ; 0 , 021

OBSERVACION OBSERVACIÓN 3 RESTRUCCIONES DE FACTOR TERMICO ISOTROPICO. RECUENTO RMS

OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN ESTADISTICA DE RESTRICCIONES NCS OBSERVACIÓN TIPO NCS : LOCAL

OBSERVACIÓN NÚMERO DE DIFERENTES PARES NCS OBSERVACIÓN GRUPO CADENA1 RANGO CADENA2 RANGO RECUENTO R M 5 PESO OBSERVACION i D 426 A 33 3 426 13: ■ 0 , 06 Í I . O S OBSERVACIÓN D . i 2 ; B 321 122 12 . 0 * 07 0 . (55 OBSERVACIÓN í D .i .. i. í C .. i : : 5 120 0 * 07 C , 0 i OBSERVACIÓN ■ü A ¡ : i 42': ■ _í: ■C-5 12~ 0 .06 '!

OBSERVACION 5 A ; i 2 i ■i 25 c ¡2 i , ¡ :~ 0 , 07 _{í í}. _o; OBSERVACIÓN 6 B 321 c i '■ i 12 : i ■ ■ 0 * 07 í .03 OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN DETALLES DE GEMELOS OBSERVACION NUMERO DE DOMINIOS GEMELOS í NULO

OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN DETALLES TLS OBSERVACION NÚMERO DE GRUPOS TLS : 4

OBSERVACIÓN REGISTRO DE RESTRICCIONES DE ÁTO M OS SOLO FACTORES B RESIDUALES OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN GRUPO TLS i 1

OBSERVACION NÚMERO DE COMPONENTES DEL GRUPO *. 1

OBSERVACIÓN COMPONENTES c . A C SSS S Q I

OBSERVACIÓN RANGO DE RESIDUOS : ■■ .. ; 0 Oh • 1 •

- 9 * 1355

OBSERVACIÓN OBSERVACION OBSERVACIÓN NUMERO DE COMPONENTES DEL GRUPO : l

OBSERVACIÓN COMPONENTES c ... . A C El ■!'

OBSERVACIÓN RANGO DE RESDUOS : : ■: 0 A 5 ■ ■

OBSERVACIÓN ORIGEN PARA EL GRUPO : - 43 , 1674 - S : . S 511 -17 * 2067

OBSERVACIÓN t& tS S O fc T

OBSERVACIÓN T i l 0*0261 T 22 ; 0,

OBSERVACION T33 0.0433 T 12 : 0, 0667

OBSERVACIÓN TI 3 '0*0355 “0, 0218

OBSERVACIÓN 7

OBSERVACIÓN L l l ,2102 L22 *0632

OBSERVACION L3á 6053 .7697

OBSERVACIÓN L13 0 * 6016 L 23 * 1 378

OBSERVACIÓN T S H 30 R C

OBSERVACIÓN S i l ^{: 0 . 1 4 ü 5} s : 2 ^: _{3 . 0 5 5 € 5 1 3 :} -0, 0496

OBSERVACION 821. . 2 . 3 2 5 7 5 22 : 0 , 0 5 . 1 5 3 : -0, 0591

OBSERVACIÓN S31 _{: C . 0 3 S 5} .... ^: 533 : —ft , 0890

OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN GRUPO TLS OBSERVACION NUMERO DE COMPONENTES DEL GRUPO : L

OBSERVACIÓN COMPONENTES c £ ; S B C i A c S S 53 Q I

OBSERVACIÓN RANGO DE RESIDUOS : B : n B

OBSERVACIÓN ORIGEN RARA EL GRUPO : A i 5.. . 105 - 54 , 8717 - 27 * 4056

OBSERVACION . R H S Í F ■"

OBSERVACIÓN T i l : 0 .0535 T22. g . ■■ v e ..

OBSERVACIÓN T 33 : 5.3 050 T 1 ° C .033 ■

OBSERVACIÓN .. - 2.0700 T 23 : - i

Á T O M O 572 0 L T S ... 108 3 0.90 : ) 4 5 . 2 7 4 - 1 6 , 4 3 7 . Oí) 1. S . i 2 0 Á T O M O ^{Jí *? -s}. ^{L Y S}tí ^{■103 4 5}.^{0 74 — ¿ 8 * ¿ 1 (J . . 0 0 2 0 . 5 5 1.}Á T O M O C A L Y S D 4 0 -J - 3 8 , 0 0 í 4 7 . 1 1 0 - . e . a 57 . . 0 0 2 4.08 c Á T O M O 5 75 : ^eL I S 4) 40 9 - . T . i S S - 4 7 . I - ■; . 522 1 , 00 24 . 35 c _{Á T O M O} ^{■■ ■■■■■ CG L Y S}tí ^{4 0 ? ■ 3 ' i . 7 57 - 4}. ^{B S - 2 1 , 2 1 6}..^{0 0 4 2}.^{36 c}Á T O M O ^{5 7 ? : d LY¿3}tí ^{0 i - 3 5 , 1 6 7 - í ! í}. ^{' 77 - ' ' . 7 7 0 ■ . 0 0 4 3 , 7 5 c Á T O M O 5 ■ ■; : ■ L I S 0 4 0 9 5 9 , : . 4}. ^{3 7 7}■ : ■ . ^{! i .. Oí 5 7 , 30}

^{Á T O M O 5 7 $ i í £ L Y S}tí ^{1 09 1 0}...^{23 45}...¹².. ⁱ. ^{o e s}. . ^{0 0 ¡3 !?}* ^{61 H} _{Á T O M O} ^{5 3 c}• ■ .VI ^Xtí ^{4 0 $ -} ₃ ^-. ^: _{7 3} - ^{■; 7}, ^{5 3} ₁ ^{- 6 . 2 3 2 i}.^{0 0 i :}, ^{36 c} _{Á T O M O 5 8 1 0 L Y S}-■ _{4 0 ■; ■ i S . 7 ! : ■ - 4 9 . 2 < i 2 - 1 3 . 6 3 ! ; 1}._{0 0} ^{2 7 . Y.}- ■ ^{Á T O M O V 3 ■}tí ^{D 4 : 0 - : . 0 1 3 - 4 8 . ¿ 2 4 - 1 7 . 3 8 8 3 . 00 2 5 , 13}Á T O M O ^{£ 33 CA A .S P}tí ^{4 i 0 - 3 6 . 0 5 -}- 50 . ^{1 . 0 0 3 3 . 6 1}

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ÁT O M O . 743 0 3 IR V ^■. ■ : 12 8 ; . : 1Í0 v .550 5: , '■ . . 00 : . . ■ 9 <: _{ÁT O M O} ⁷⁴⁴N ^{P R O 7 4 13 - 3 4 , 7 5 ? 44. i 64 - 5 1 . 0 4 5}1.00 ^{. ; . . . 6}

_{ÁT O M O} ^{27 i}5 _{< >1 : 413 - 8 5 . 3 . ■ V V 3 “ 5 0 - 3 9 4 1 . 0 0 1 ó . f 3 c ÁT O M O} ^{y~7 A £}C E PRO c _{4 : 7}■ 83 . 14 _{- 4 6 . •. ' ■ 1 0 , 3 0 : • . 00 :< - . ■ 3}■ 7 _{ÁT O M O}C G ^{V ,}C 4 : 3 ^{- 8 4 , ■ 87}- 4 £ . S6<! ^{- s o , ■■:■■■■}■ . 00 : V 55 c ^{ÁT O M O 5 ■ ■: 3}C D ^{- ? 0 l 4 i i 3 5 , 3142 4 5 . ■ 3 I - 5 0 , 7 9 9 1 . Oí}12^.55

ÁT O M O : 749 C F-5 : i 3 “ 8 6 . 36 jL 4 4 . ¡a:; 49 .0 91 . . 00 ; 7 - '... c _{Á T O M O} ^{ti- i J 0}PRO c 413 ^{- 8 5 . 5 2 0 - 4 4 . 07 S - 4 8 . 306 . . 00 : . 78 0}Á T O M O 2751 N GL13 7 414 « 87 .669 “ 4 4 . 463 - 4 5 . 8 ¡ I 1 .00 1 . . .. 4 r? Á T O M O ^{i 7}? C A GJ M 4 ! ■: - 83 . 5 - 44 . í 6 ■ - 47 . 513 .1.06 ; 4 . i 1 c Á T O M O : f 3 C B GLÍ7 ■ ■4^{: 4}- 3 9 . 6 ■ : 4 3 . 8 3 : 4 .1 I i . 00 21 . 1 f ■

Tabla 5. Coordenadas atómicas para CRBN (TBD):Talidomida (proteína murina)

ENCABEZAMIENTO COMPUESTO OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 REFINAMIENTO.

OBSERVACIÓN 3 PROGRAMA : R E f K A C 5 .5 .013 .7

OBSERVACION 3 AUTORES :

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 DIANA DE REFINAMENTO : MÁXIMA PROBABILIDAD

OBSERVACIÓN

OBSERVACIÓN DATOS USADOS EN EL REFINAMENTO.

OBSERVACIÓN RANGO DE RESOLUCIÓN ALTO C A N G S T R O M S ) I*S8

OBSERVACION RANGO DE RESOLUCIÓN BAJO (A N G S T R O H S ) 50 .00

OBSERVACIÓN PUNTO DE CORTE DE DATOS ( S IG M A ( ? ) J NINGUNO

OBSERVACIÓN COMPLECIÓN PARA RANGO í } 99 ,94

OBSERVACIÓN NÚMERO DE REFLEXIONES 37534

OBSERVACIÓN V A LO R B ANISOTROPICO GLOBAL.

OBSERVACION OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN OBSERVACION OBSERVACION

OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN ERROR DE COORDENADAS GLOBAL ESTIMADO.

OBSERVACION ESU BASADO EN V A LO R R LIBRE ■ 0 i ! : OBSERVACIÓN ESU BASADO EN PRBABILIDAD MÁXIMA ( A ) ; 0. S ; OBSERVACIÓN ESU PARA VALO R ES B BASADO EN PROBABILDAD MÁXIMA < A * : ■ OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN COEFICIENTES DE CORRELACION.

OBSERVACIÓN COEFICIENTE DE CORRELACIÓN FO-FC 0, 963

OBSERVACIÓN COEFICIENTE DE CORRELACIÓN FO-FC LIBRE 0 , 9 40

OBSERVACION

OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN RESTRUCCIONES DE FACTOR TÉRMICO ISOTRÓPICO RECUENTO R M S PESO OBSERVACION OBSERVACIÓN ESTADISTICA DE RESTRICCIONES NCS OBSERVACIÓN NÚMERO DE GRUPOS NCS : NULO

OBSERVACIÓN OBSERVACION DETALLES DE GEMELOS OBSERVACIÓN NÚMERO DE DOMINIOS GEMELOS NULO OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN

OBSERVACION T , 13 ; 3 .000 0 L 23 ; c o s o o

OBSERVACIÓN 'EESOR 5

OBSERVACIÓN c i 1 . O.OOOÜ S 12 : 0 . OilüO i 3 : í i .OOOü

OBSERVACION j . ; 3 , 0 ^jOO . c o c o 533 : 0

OBSERVACIÓN c:5 i : 6. Oí!00 £ 32 : c . o : : 5 : . 000 '

OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN MODELADO DEL DISOLVENTE A G R A N EL OBSERVACIÓN MÉTODO USADO : ENMASCARAMIENTO

OBSERVACIÓN PARÁMETROS PARA EL CÁLCULO DEL ENMASCARAMIENTO OBSERVACION RADIO DE SONDA V D W J $ l . £ 0

OBSERVACIÓN RADIO DE SON DA ION U S 0*80

OBSERVACIÓN RADIO DE ENCOGIMIENTO 0..80

OBSERVACIÓN OBSERVACION OTRAS OBSERVACIONES DEL REFINAMIENTO OBSERVACIÓN HIDRÓGENOS QUE SE HAN USADO SI ESTÁN PRESENTES EN LA ENTRADA OBSERVACIÓN VALORES U : REFINADOS INDIVIDUALMENTE

OBSERVACIÓN CONECTOR S ER C 341 VAL C 356 h u e c o

ÁTOMO i . .13 H T H R t 33 j 71.1 Oh - 1.1 C-í V i 50 .1 . 00 : ■ . S 7 R _ÁTOMO _{n i CA TH R C 3 3 7} ^{I< a},993 _{” 10. - V 52 . 8 .2 i . o c} : ⁷ . ³? ^Y-

ATOMO AR ^Q2 315 3 .90 ■. - . , I 52: 16,123 1 .00 26 39 ■' ÁTOMO 776 0 ARG C _{"i •} .2.3: :.: - 1 -1.111 - 46.263 1.00 31.26 O ÁTOMO -.2 '' M PRO c ^■"6 • • .697 15.443 ■i 3.538 1,00 -O:. 11 K ÁTOMO 3 ’ CA FRO c 378) 32.233 ■ . 7 S - 45. i : - i . ¡7t 28.39 C ÁTOMO 32 <i r*g PRO 376 3 -L .6 ■ 14 - 44.5 65 1.00 26.54 , ■ ÁTOMO i ■;,: CG PRO c 3 ■ 4 34.2 57 - 5..Vi:. 45. Ü9É i .00 i: . : c ÁTOMO 33 i CB PRO c 376 36.023 -16 712 45. i 5:. ... 00 30 00 ■ ÁTOMO 332 ^c PRO c 3.7 íj 86. :L';‘ ■ 13.4 15 -44 . : . , 00 3 . L 6 c ÁTOMO : 3 ■; ⁰ PRO ' 376 ' .. . ..4.0.. ■ 43.15 < .. .00 .3G.1 S G ÁTOMO 331 R SER c ■ ■ ' , 2 - 13 ,132 -44 .84.7 3. 0( :■ . V H ÁTOMO n s _{C K} SER c V ■ 36.9.2:: 1 i 23 43. n ^■! 7 '. .0ó 2 ■ 1 ^! r ÁTOMO CB S^erc 38.149 10. .9:8 13.5 i2 1.00 ... 72 .■ ÁTOMO 3 _i V OG SER c ^.....36.432 5 .5 .4 ,8 93 i .oo 29. •: O ÁTOMO 335 C SER c 37 : 7. .84? - 10.2.. ' 42.671 1.00 ^2~>. 55 c ÁTOMO 0 SER c 377 35 -C : 5 .. 8 .7 - 48. ■: 31 1.00 28. 9 > 0 ÁTOMO 3 iO Tí THR c r -s V ,¿33 -9 , 794 ■ 1 . 5 ] .0f 31.03 ⁿ ÁTOMO 34.; C A. THR c 378 ;:4. f.' " 8 .768 42.993 . .00 ■; 5 ; ;

ÁTOMO ; CB THR c 37:7. .4.2 55 - :. 073 - 59.515 ... 00 24. 36 •; ÁTOMO .343 O G l THR c 378 35.303 “S.S ..5 - 36 .657 .. 00 27.37 0 ÁTOMO 341 THR c 378 33 ... - 10. .66 . i .0¿ 2 : ...:. _{'■ ■} ÁTOMO 343 C THR c 378 35 2 -7. 347 - ¡0.9 ^{¡ ■}2.00 _{20 .}¡0 c ÁTOMO 346 0 THR c *7$ 34. í 44 - 6.846 40 -646 i .00 23. i 9 0 ÁTOMO 34 ' H VAL c 36 ' 7. 58 47.352 ■ , 0; 29. .-. H ÁTOMO 34 a CA VAL c 379 37.Ü17 -.5,: -4 , ■ , Oí 2 .37 V ÁTOMO .349 CB VAL ■ - T; T ¿i 39,0 LO 6 .147 41 , 8.: 5 ^{. ....} 8.. . :. c ÁTOMO 3 i CGi VAL C i - ‘j ^{I b .} 7 IG - •) ' 4 11.552 i .00 3 ' . i i c ÁTOMO 35. CG2 VAL c i 73 .706 -7 . ..7 - 40 , 844 4.00 7 ■ . ' 3 C ÁTOMO 35 : C VAL c 575 36.824 -4.986 -42.155 .. .00 2 ':. 11 c ÁTOMO _■ i 3 0 VAL c : 79 i( .67,7 - 6. ■.5 -47.368 ■ .06 27. 70 ■ . ÁTOMO 3 : : ^u HIB c 380 36.388 : ,51:i ■! -75;7 377 : 4. 68 ti ÁTOMO 35: CA ñ l $ £ ¹ 80 . 2.7 73 12... 18 ... 00 22.1.. c ÁTOMO CB HIS Tw 38 ti .6 52 -2 ,168 4 : .325 i , 00 2 í , 7. c ÁTOMO . CG HIS c 380 3 ' .972 ■J 679 48. 772 3. , i t 30 37 c ÁTOMO 3‘83 ND1 BIS c 811 37 . '■0.644 4. . " ;:7' 1.00 38 03 H ÁTOMO 3 . ■- CE1 HIS c 380 39. ; 32 3. ‘ i 3 41.520 1,00 28.04 ■ ÁTOMO 36 tÜ32 HIS c 380 32 ,777 5. : . . i .01 2 : . ⁱ 4 ^{l i} ÁTOMO 361 CD 2 HIS c 380 3 9...43 . 756 43.141 ...00 70. 10 C ÁTOMO 3fi ² C' HIS c ■: s o " 4. i .. v - ^{3 . 1} 77 - 1. . S 3 '■ j .00 25.0.3 . ■ ÁTOMO 365 0 BIS c 530 32.987 -2.4 38 - 43.851 ... ¡7 19. ■ ÁTOMO 3 : 4 tí SER c 33. 33. 22 4 . -76 42.498 . . ! ¡Ó ² - . V ⁿ ÁTOMO 565 CA SER c 58 i ; ..• •. ' 4. ' 17 13. : 1 ? 1.00 22.02

ÁTOMO 366 CB SER c 38 .065 5 ^: 5 -4 .606 i .00 8 . '

ÁTOMO '■ ¡ 'I CG SER c 33 . 3Í .957 - í 314 4 .29 i ■; .00 36 0 ÁTOMO C SER /*.■ 383 3 .2 6. - 3. í í f; - 4 : .847 a . oo 24.58 c ÁTOMO 16 ■ 0 SER c 38 - 3.0 ¡ - 4. .8 • : 1 .00 23,96 7 • -■ ' ÁTOMO ■'5 ^u TRP c 333 31.0 83 -5 : ^Ib - 44.555 3. GE :. s : ÍÍ ÁTOMO 3 ;i CA TRP c 7 ■; 30.0Ü3 2,4 80 44 .765 : .00 ; r? .;' ÁTOMO 3 CB TRP ^Q 58 . 35.8 ?6 - 2,1 -7 ; 6. '. , ³ 4.00 2 i . Í5 , ■■ 1 ÁTOMO ■ i pr* TRP c 58 : 5: 6 : -IV: 3 - -16.86 : : .00 25.7 i

ÁTOMO ■ ; 4 ct 1 TRP c 582 32 , 1 ::, -0 ,754 46.266 . .00 26. 49

ÁTOMO .3 ■ 5 sel TRP c 38 ■ 33 , i 5 S -: . 3-0 - 47.147 ⁾ .00 80. :i" 15 ÁTOMO :: _ce; TRP ' 532 3: -:7 1.147 4$ - >47 1,00 23-75 C ÁTOMO ^...• r TRP c u*; ..1.658 -.1 74 -4B.823 3..00 _{22 '■} 5 c ÁTOMO 3 -3 CB 3 TRP '■ ;;;■ 3.1,214 -7. 21 i - i9.lili .1.00 .: . :■

ÁTOMO 3 ■' c :; TRP c .3. 5 , i 3 : -2 , .47 ■ V ■ ,508 i , 00 ^{2 i .} Cr ÁTOMO 3 ■ 0 C H 2 TRP c 332 8. .2. :, -1 ■ 17 -30.592 43.7 2: 17 ' ' ÁTOMO ⁸ ■: ■" ² TRF c 332 38.6 39 ■ i . 2 ■ ■ 39.32 i a , oc 88.73 c ÁTOMO 332 ^r TRP c : 8 2S .6"? 4 3. : ■ G 34.2 r.: ■ .00 2 . c ÁTOMO 38.3 0 TRP c 281 87.775 -.7.1 77 44.1 OS 1. 00 ■ . ⁱ1 0 ÁTOMO : 84 . PHE c 333 ... L8 4 . ÜJ 43.991 .. 00 2 .. 47 K ÁTOMO .3615 PHE c 383 27,224 4. 43. 51.1 . .00 21.44 c ÁTOMO 38 S ( E PHE c 33 ■; 36.618 -7. ■70 -44 .77 i 1,00 21.-.5 '■ ÁTOMO 3?-! v : PHE c 33 26.430 - 5.02-1 ■ 36.905 .. 00 20. V. c ÁTOMO :..;j ¡r PHE c 83 56. r " -4 ..15 - ! 6.138 ■ .00 ■ i .94 c ÁTOMO 33 S ■: ■: FHE c 33 ; 39,1 7 i ■ 3.07 G 47.364 1, 0( ■■6. 33 c ÁTOMO 3S5 c PHE c 333 LIS ...20 : .2.. : 46. . .00 20. io

ÁTOMO .39. C:;2 FHE c 333 27.1 57 -4. V -43 . i 3.1 , .00 2f,.7 i c ÁTOMO 3 ; . _cd FHE c 385 . . ^: ■ 5.2 64 46. j 36 i .00 14. £S c ÁTOMO 333 c PHE c 33 27.4 90 -5. - 25 - : 3.303 .1. O í 31 .11 ^c ÁTOMO 3 ¡4 ^■■ PHE C 587 2 V .3 : _i ■ >65 43.2.17 ■ .00 19.4 ;

ÁTOMO 1. - ' 0 TRP A 388 24.0 10 33 56S - 50 - 517 7 .00 7:2. 71 0 ÁTOMO 1. í t tí THE. A oso 22 ,215 -34 . 7. ‘ - 50.5 : : . .00 22. K ÁTOMO 115'.' CA THR A 339 21 . ■13 - 35^ 5£1 i , 00 i i . os c ÁTOMO ]. » Cí5 THE A ■■35 2 ‘ . X 7;5 ■■ 37 .27-: - 5 S . 356 3.. GO 8 : .34 f ÁTOMO 11 59 OGl THR A 535 22 . 1- ■ 35. i ■:s “ 57 ,705 i . 00 15 ,75 0 _{ÁTOMO ■ ■ ■ :c} ^{: : F} _{A 385} ^{: 7 . .27-} _{- ■ : 46 7 7.663 i . 00 ■0 . 77}c _ÁTOMO ^{.... ? i 7 THE A 389 i 5 . 5 Ó3 • . • ' - 6 0 , 6 03}i * 00 ^{1S : ■}c ÁTOMO , ..7.: O THE 389 75-. 8 U :■ “ 34 , 360 - 50,37 3 ¿j j. DO .: 2 . C8 0 ÁTOMO l i 13 H I L E A : 30 I & .424 - 3 S . 60 ”? - 50.338 .. .00 .; í . 5 ■ lí ÁTOMO 11 ■ CA I L E A v 30 1 8 ,071 - ! , ■ ■ ■ 6 .6 8 3 .0! 18 , 21 c ÁTOMO 7 . -‘ I CH I L E A 390 : . = :■ 3 ■ ; ■' 73 — 61, 7: ■ 7: 7 .00 23 n r ÁTOMO i " & fí ís l I L E A 700 1 . 77 ? ...-■. 6 3.173 1.0 0 22 . 70 ■ ÁTOMO i i n 72. .; :■ r . .: 30 :5 ,560 - 4ü * 013 — 63 j.336 i . oo .7:. , 33 C ÁTOMO ... f s CG2 I L E A ■ 50 1 É ... 33 - 7 ■ - 60.56 ; : 7. .00 2 J . .77 c ÁTOMO 1. 77 c 17, li A -770 i T . O O 7 7 . ■ 7 - 50.691 1 .00 16.7 9 ■ ■ ÁTOMO 1180 0 : E ?. 230 : 6 , 5 5 £ - 36.231 -65 , -0 i .06 16» 80 '7: ÁTOMO i . i "... Lí A L A A 75.1 1 6 . , 48 '3,. 089 61. 2 SO . .00 .17,09 Ñ ÁTOMO : . LY-. 7.27:. Á 707 15.031 ■ : 86 - 50 . i2 ... 00 18 ... 2 c ÁTOMO I i 33 CB ... A 37.. 75 ..3 .-3 - 32 , 872 - 60 .: . : .. 00 17 . OS c ÁTOMO ....31 A L A A 73 . 1 : . :: 0 ? ■,. : 6 - - 61 ,214 ... Oí 19 , *56 ' ■ ÁTOMO 11 ' , 0 A L A A 39: : 7 . ■ ■.■.■; - 34 . , 7 ° - :> ■ .00 : ■■. S 6 ■■ ÁTOMO ¡¡ Ol.lv: A 352 i - i: : - 35 . ■ : S - 60.465 i .00 1 5. 55 K ÁTOMO 1 ■ 3 ' CA CLM A 377 11 .58 ; - 35 - í 46 - 77 .7: 34 ■ ■ ■ ■■■:■. 64

ÁTOMO i ; s C G 17 ■- 23 11 .2 77 - 7 7 73' - 61.835 ■. oc 84. ) :■

ÁTOMO 03 .: ,i >■. 7 : ■ ; : , 366 ■ ■,: ..■ 59.6837 ^{. oc}24. CS c _ÁTOMO ^{1 ‘ 50 CD GLH A : 3 7 11 . i 373 - i 9 .; 59 . ■ 37. 1 . 00 3 7 79}c ÁTOMO 71 57 • i 777.11 :■ m 17.6 ■ 7 ■ ;S . - 3 - 50 ,67^ 7 .00 2 -y ¡5 0 ÁTOMO .1192 GLM A y 2 1.7 . 7 -1 ■■ - 3 & . 754 ■■ 5S 3 .. .00 33. i l K ÁTOMO ■ ■ 53 ■ ■ GL17 A 35 ::;. .. 37 - 3-1.7 - 60 , 367 1 .00 í 5. 37. C ÁTOMO 115 1 o .■..I' A 302 70. : ■ ? 34 ,524 7 ■■■ : . . 7 i ■' ÁTOMO . 155 H CYE A 9 .2 76 23 . 1.37 50.5 48 .. .00 1.7. , .. l i ÁTOMO 1 i ^{1 6}■:... :. A 3 Ti ■- .703 .■.7^.9 & i --S0 *31.9 i , 00 1 ; . 7 S c _ÁTOMO ^{. . .} _{5 ■}CB ^{C Y E} _{A 37 7; 6 .943 ■ 3 7 Es i: - ■} ^{. . .} _{■ 76 7. , : ( 7.7 75}c ÁTOMO ). . i;: : ■■ • A 35 ; 5 , fi 35 53 c , . :.;■., 1.00 : ■ 09 E _ÁTOMO ^{■ ■ ■-}c ^{CYS A 7 73 7.6 25 - 34 , FOLS - 55 . j 36 1 , 00 : 6 . ." 5}c ÁTOMO 0 CYS :■ 35 i 7.4 ■ ■ 36. C23 65.2 30 í .0( 16*38 o ÁTOMO 12 .. LYÍ A 35 i ■■. ,337. 34 .7:' 9 7 ... 00 77: K _ÁTOMO 1202 _■77 ^{7.v £ A 394 6 .33 2 - ■: : . • . .}- 5 € - T 42 1 , 00 ^{i 8 . iS C}ÁTOMO 1202 CB LYS A 7:94 1 .007 - 35. ! 46 - 55.520 ... ü< 1S . . -J ■. ÁTOMO 1.204 CG LYS A 394 & .707 - 35 .7)05 - 85 , 367 3 . !¡0 7S.Ó2 c ÁTOMO ■ . ■ CD v . :. A 303 5 . i : 7 ■ ?,?.. 7 1 e - 7 ! 7 36 . .00 2 i . SO C ÁTOMO 1 06 i l \ : A 354 ■ ^.773 - .7 . 71 • - 73 ^,íi 4 t: 1 „ 00 14 . ■ 2. ^cÁTOMO 120'? l íS ^{.. . .}■ A 774 4.7 42 7, 43 ^{. . . .3}7 .00 .75. 38 R ÁTOMO 1 ■ i 3 : ^A: 77 ■;^..765 ■ 35 ^.■.-:■■■. - 56^.565 i ■ 00 I V .37 ■7 ÁTOMO 1 0 i.vS 354 5 ,1 - 36 ,4 35 “ 56 , 159 i ,00 : : . :■ 3 ^{.- ■ V ■}ÁTOMO 1210 E-í I L E A 355 4 . ■ :o - 34 527 - 57 , 754 i . 00 17 SO li ÁTOMO 72 i ■i^.338 35 - 5'? ^{.;' .}CA I L E A _{1 9 5} ^,í) ^{■! ■}3.^,00 70.88

ÁTOMO 1172 CB I L E A _{J 3 7.}2 ^.478 - 34 , 85 ^{. -};- 7^.397 7 ^.00 20 , -O

ÁTOMO 72 ^{; :}COI I L E A ^{3 : 5 2 . 7 3 8 -}27 ,152 ^-57.3 ^{; ■ : . ,}2 ^{. . / ■}

ÁTOMO 127 4 CD1 I L E A 399 ^{.. . ■}7 _{- - I} ^{. .}00 .2-7 19 ^{i ' ;} _ÁTOMO ^{7 .}i 5 ^{: g '} _{I L E}A ₃₉₅ ^.;, t 54 - 34 ^{. >}1 ^-7" ^{. T ¡}2 i ^.00 ^{? .} ₁ ^. ₇₆c ÁTOMO 1 ^{< : ..!■■}A 37 ^{; ; ■ .}755 36^.578 - 55 ^.5 ^:i , 00 2 i . 60 ^íÁTOMO i ^{: ;}7 ^ÜI L E ^Ai 97 2 ^.77 ^{■ ... i 7 ; -}7.3: ^{. ■■■}ü f¡ 7.^.00 ^{• . ¡ i}ÁTOMO I 3 i 3 ⁱOYE ^?■.79 :7 ^;3. 74 - 56. ^■7 ^-60^.i 5 ^:1 ^.00 i 7^.:7 ⁱ _ÁTOMO ¹ ^{i i ; C A CYE A 356 5 , 6 7} _{- 5 7 .} ^. -J ^{■■ v... , : 50 7 , 00 „ S i}c ÁTOMO 7220 ^{e s ;}í!7 396 7.0 -36 á's-C - , 3,4 52 1 ^*00 19+13 ' 1 ÁTOMO 1 ■ SG CYS A 377- 4.2 2 - 35 ^,527 ■ i) 3. 7 :)5 1 ^,00 17 ,12 ■7 _ÁTOMO ^- c _{CYE A : 5 7 4 .8 36 ■ • 61 .677}. 00 ^{: 3 . 70}c ÁTOMO 122.1 0 ^.396 4 ,747 Í9 ^,.7.77: 8.., ' i 5 1. .00 77 . 60 0 ÁTOMO .. . 4 ^..■ . A ^.3^{7 ■ .}■ ^{■ .}- 7 :: . ' -■ SQ c . .00 777 i-ÁTOMO 1225 CA A L A A 7 ■ 1 , 273 73 . ' ' -53! , 2.37 1 , 00 .33 .9 S c ÁTOMO U 16 ( _bA LA A 397 1 .222 - L 7 . ■77- - í ■ j .907 1 ,00 21 ^.29 c ÁTOMO i .:: ■< c A L A 397 ■: ^. - 33. 7 ■ “ 62 ^,6 l 3 7 .00 : i ^. 2 -7 r ÁTOMO ■ ■■7 0 A LA A 357 £ .7 15 - 3 S »957 -■73.7 ■ V ■ .00 17, 36 0 ^{ÁTOMO 122.9 í¡}sep ^{7, 790 7.35 ■ 7 7 3.7 3 6 3 . 3 37 ]. , 0( 7 .' . -16 ¡}ÁTOMO ^{. . .}.7 CA SER A ; :7:: 7 ^.: 7. ^{. . . ■}6 1.6 4.7 ^{. .}00 17.7 0

ÁTOMO 1.: 3 ^{. C f l . . . ! . A}3573 - ^.03 : - 55 ^.0 - 55 ^.334 ^{, .}00 20 ,22 ^Í7ÁTOMO ^..23^.OG SER A ^:OS í ,SÜ7 ■ 36. 4 ¡i 3 - 65. ^{. 7 -}1 ^.00 27 ^.S i ^OÁTOMO 1233 C SER A 398 7 ^.770 ^-7 .^.418 - 64. ^■r - 1 ^.00 ?1 ^.7: 1 c ÁTOMO 1234 0 A 3 37 9. 42 -35 . 613L 5 43 1 . 00 13. 2:

Á T O M O 1 72 3 .. T H R B 3 61 5 2 ............ - 4 2 , 231 6 9 . 9 ■ 6 . , 00 V 3 . 08 Á T O M O 1 C G 2 THR. E 3 S i 5 ■ . 13 - ■; 3 . ■ : i - 6 7 . 83 0 . . 00 ; . ? ? c Á T O M O 1 7 2 2 c T H R g : ¡ i 56 . : “ 4 ! 5 . 6 1 6 - 6 6 . 0 4 8 j. . 00 4 0 . .. 7 c Á T O M O 1 723 0 T H R B i ; 3 3 , S, i 8 - ! C . 317 - 69 , 4 6 3 ■i , o c 3 3 , 1 1 0 Á T O M O I 724 t í L E U 3 : : : 5 5 . 4 ■ 7 7: . . 7 57 - 5 8 . 1 3 2 l . 0 0 3 5 . O S M

A T O M O i. S é 5 ' " I .......... r= 3 S O ... : . F. ■ 2 : ■■ - : - o , f i 73 . 7:7 24 V . c

ÁTOMO :. 950 CCíS-t TLE B 355 ⁵ ■ . 046 - 3 i . 46® : -7 >0 , 0 i 2 - 13 c ÁTOMO 155 ¹ I L E 3 ; ^jÍÍS.Í 80 -36. £ iA " 53. ( 15 " ¹. 00 11. 34

ÁTOMO ■ 332 ¹ I L E B : 9 5 7C .26'í - 35 , 903 :: v . ■ , : ■ . 00 37 . 01 c ÁTOMO 739.0 :.. I L E ■5= 59 7 55 . 977 ■ 4.1 79 56. . 75 7. 00 35.20 c ÁTOMO 1594 0 ¿ L E ;■ 335 3. .4 ( 7 3 5 . i 12 55.817 . .00 3 ■ . 7 0 ÁTOMO 7 5 ' M CYE B 3 ■ 6 ■ : 7 - 34. 345 - 5 7 . .33 j .00 32. 30' II ÁTOMO 7596 < i i E k 396 . - .816 - ; . 23 tí ■ 56 .5 : í 1 .0 0 2 7.52 c ÁTOMO 1997 CB C Y 0 B ■: 9 55.364 33.963 ^■39 , 6 7 •. 00 .32 * 72 c _ÁTOMO ^{■ 553 s s CYS 3 6 56 • . Es 5 - 34 . 75 : - s 0 . 7 5 tí .} 00 ^{: . 64 s}ÁTOMO - íjtj3 6 C ■ EJ 53 ft 66.562 3; . : 23 ' ' j .. Üí ■ ' . 67 c ÁTOMO 2000 0 B 536 6 6 . ro !T_s. 3.1 . "■ ..5 59.8 11 . . 00 30. : . G ÁTOMO : 00 . ₇ ; ALA £ 3 $ 7 55 , 55 - 33.0 55 - 56.5 53 . . 00 ' . 30 I'l ^{ÁTOMO .: qg} ^{2 CA ALÁ B : V 6 4 . 0&9 ■ 3 2 , 4} 1 ^{- 53 . ES 6 1 . 00 2 6 . 2 . c}ÁTOMO 2003 CB ALA B i 9 ■ :■ ■ , 036 - 3 0 . S &S - 5 c . 5 10 .! . Otí 28.56 c ÁTOMO 2004 "■ ALA B 397 5. r . - 12.681 ■ - 2 .734 ■ . 00 26. .

. . . ... .

ÁTOMO : ‘ 33 CB FHE r* : 35 ■'■t.0O í - • t -7,: - 76 .601. 1 .00 ; 3 . 91 c ÁTOMO t: 1 ■ ; OG PF.E P^j ■■:33 46. i l ;>4 - 25.457 ■ 75, 965 7 ,0< : 3 .. 3 V ÁTOMO 7 : l ’ D l PÍIE 0 16 .333 24. 732 75 : .. . 00 21*99

ÁTOMO .. 736 CE i. FUE D '¿83 -:■ ■, 2 ÍS2 - 23 ,821 74.6 ■ y i , 00 i i .39 c ÁTOMO ? 3 ■ e s PHE D 38 ? 43 . i .11 -24 1 • - 71, " 36 1., i c 22 42 c ÁTOMO : v 33 PITE D ÍS 48 , ■ ■ . 872 ■ ■: ,404 1.00 21 . 97 c ÁTOMO ; ■ CT52 PKE D : 82 - ■ .4 31 - • .7 n - 6 .111 S 1 , 00 : 6.1 0 c ÁTOMO _.- í c Eiits D j 85 4 5 a 26. S : ■ 76.2 52 _{í .} 0( 20. . _ó c ÁTOMO 74 i 0 PKE ■■ 7M 3 i ... 621 2 ■ 26 - 78 , 3 .. . Oí ! I S U ■ ÁTOMO K PRO D 384 f l l .551 -2 G . S55 ■■ ■ 5 . 5 O S 1.00 24 . i =, 1'4 ÁTOMO 2 ■ i .3 CA PRO D 334 . ' .2 37 - 27.104 - ' 5.968 ... ü< 25. ,0 -. ÁTOMO 2 '744 PRO 3B4 I:-- . 26.541 - 74 , 8 9(1 1 . ! ¡Ó 33.1 1 c ÁTOMO 2745 PRO D 38 i 4 0 . ¡ 37 ■ I - . ' - 72.6 i 9 . , 00 3 £ . ■■ : c ÁTOMO 2 ■ ■ 6 C :: PRO ■ 884 41 > ; 8£ - :6.r;3£ " 4 . : 12 1 00 27 , ■ i c ÁTOMO 2 7 4 7 ■' PRO D 334 3 ; . 010 26 4 ?2 . 3 1 6 1 .00 2 J 10

ÁTOMO 2745 0 EHÍ 5.5 58 -1 -10 T ■ : - . ' • ■ - 77.526 i .00 80 ,74 0 ÁTOMO ^í ' ^' ■ ^v Z ^t M ^* -ü ^j 0 58 i 80 ,4 0 - . : 75 - 78.047 i ,00 2 - .. S 6 l i ÁTOMO CA Gli Y D D ñ B : 31 - 25 82.1 - 7 9 . 5 1 8 i . V 30 37 c ÁTOMO 2 ■ 4 . C ■ • ;■ 33;. 40. 3 Ü 0 2 : . ; 851 - 30 ,55 3. , 00 ; 9 .7 : ■ .......

ÁTOMO .■ 7 . ■; 0 D 385 40. - '7 ,H41 - B U 2 1 .00 23 , ;4 r-, ■ ÁTOMO 2 ■ i rí TYR D 381> ■31 d 445 - : . ' ■. C - .007 : , 00' 2'.:. ; i re ÁTOMO .. T j i CA TYR D 23<5 2.5 36 2 - .134 30. £27 . .00 ■¡ -■. 04

ÁTOMO ?. 7 ‘ 5 >. TYR ü 43 ,347 - 27 .348 - 30 . ■: :■ i 1 .00 : , 73 c ÁTOMO ¿TP. :: < ■ : í p : 5 ■■ 5 43 - 25 . £ 86 • s o .6 s 3 1 ,00 ■ 6. 50 í ÁTOMO 2737 CD2 TYR B Í8 f.i 4 4. I 78 - 472 - 32. i ÍO 3.. 00 .18* 88

ÁTOMO 2 733 c s ^{T Y R}■ 386 ■ ■■■, Ü 0 ■' - 24. ■ 1 -3 ; , 5 ' v .i , 00 i . , 8 i r ÁTOMO . ‘ : c s TYR 386 48 , : 12 - 23 :• - S I - 629 4 , 00 i 7 , 04 C ÁTOMO : ■ ■ o OH TYR r> ^{■: ■} . ■ 4 -21 t 3 S 1 * 00 19 56

ÁTOMO 2 ?6 i TYR D ¿ c ■ } .177 0 -. ■ 30.26C i , 00 17.79 c ÁTOMO ■ 7ji2 CB Í TYR D 386 43. t'V: - 1 - 1. 7 í ■ 75 . V 94 .00 i 3.35 c ÁTOMO 2753 • ’ TYR ... 3 as ¿ 2 ,979 2 6 , i 77 80 , 57 i I. .00 13 .53 r ÁTOMO 37 g 4 0 : ■ R : ■.'22 1j 2 , 6S8 - 80 . i • -■79c4g7 . , 00 1 s . a 2 0 ÁTOMO 2 ?So N A L A D 23' 43 . j 3? 30 . : •• - S i , 633 1 , 0 0 17 .. 4 re ÁTOMO 2 ■ ó 6 í Ai-i A £> £ 3.977 - 31.6 3:' - 81.5 52 1 ,00 20 . i i c ÁTOMO : ? s f CB A L A D 337 43 . ; 5 ■ ■ ' . . .1.7 ■ 8 2 . 7 0 » i . 00 : ■■ . 5 r ÁTOMO ^: ^{7 S 3}c A L A i ) ;37 ■■5 , i 11 -31 , 545 - 3 ' . 5 5 i 1 , 0 0 ■■i , 36 c ÁTOMO 2 763 0 S ■ ■ ¡ i ¿3 ' , ■. ■ . 30 . 13 . 0 0 6 1 , 0 ( 1 c ÁTOMO 2 ; 70 i í TRP D 398 4 6. QSS 32 . ; t 3 S O . 9 3 ' 7 . , 00 : ' 0 H ÁTOMO ; 'i - . CA ; ^r; 1 0 388 ■ ■ ■ . : 38 - 3 - . i ; - 3 0 , S 3 S , . 00 ¿ 8 - 1 5 í ; ÁTOMO 2 7 7 2 C B TRP -■ 38 S 4 S . 0 2 2 ■ 32, O l í - 7 <J . ■; .. 1 . 0 0 2 0 . 1 6 c ÁTOMO 2 ? 7 3 C G T R P r..1 3 38 4 7 . : - 3 3 , U S - 7 3 . 65 C 1 , O í 21 , S c ÁTOMO 21 i C e l T R P 0 388 - 3 3 . 326 - 7 7 . 0 >7 1 . 0 0 l y * 1 7

ÁTOMO 3333 HOH I, j.33 : ... 3 S 3 : : L . £ :. .......... ' . .00 32 -74 0 ÁTOMO = 33 . 0 HOR X ! 3 : 5 " , 260 -16 . 566 - S S .7 13 , . 00 2 \ . ;9 0 ÁTOMO • 332 ^■HOH L 1 i i ; 4 .2 ü -. ■ . 31 í - 60 .809 .. .00 30. 48

ÁTOMO 3333 ■2 HOH L i 3 tí ¿ t í .433 - : . 36 - y . ’ i ⁰X .00 76. 11

ÁTOMO : ¡34 HOH L 137 32 -210 2 . 12 ■•75-8 47 ₁. o c 36.0

FINAL

Tabla 6. Coordenadas atómicas para CRBN:DDB1 :CC-220 (proteína humana)

ENCABEZAMENTO KK --X X X -X X

COMPUESTO OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 REFINAMENTO.

OBSERVACIÓN 3 PROGRAMA : REFMAC 5.8.0107

OBSERVACIÓN :: AUTORES : MURSBODGY,SKCEAK,LBBEDBV,PAHNU,

OBSERVACIÓN 2 STBIlíERrl'íICHOLLS, WINN,LONG, VAG1H

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN DIANA DE REFINAMENTO : MAXIMA PROBABILIDAD

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 DATOS USADOS EN EL REFINAMENTO.

OBSERVACIÓN 3 RANGO DE RESOLUCIÓN ALTO (ANGSTR0M5) 3,05

OBSERVACIÓN .3 RANGO DE RESOLUCIÓN BAJO (ANGSTROM53 50,01

OBSERVACIÓN 3 PUNTO DE CORTE DE DATOS íGTGMA ( ? ) } NINGUNO

OBSERVACIÓN 3 COMPLECIÓN PARA RANGO (%} 99.38

OBSERVACION 3 NÚMERO DE REFLEXIONES 44722

OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN ■ AJUSTARA DATOS USADOS EN EL REFINAMENTO.

OBSERVACIÓN 3 MÉTODO DE VALDACIÓN CRUZADA DE PRINCIPIO A FIN

OBSERVACION "í SELECCIÓN DE CONJUNTO DE ENSAYO VALOR R LIBRE ALEATORIA

OBSERVACIÓN 3 VALOR R (CONJUNTO TRABAJO ENSAYO) 0.19939

OBSERVACIÓN 3 VALOR R (CONJUNTO TRABAJO) 0.19552

OBSERVACIÓN j VALOR R LIBRE 0.27388

OBSERVACION 7 TAMAÑO DEL CONJUNTO DE ENSAYO VA LO R R L IB R E É ) 5.0

OBSERVACIÓN : RECUENTO CONJUNTO DE ENSAYO VALOR R LIBRE 2360

OBSERVACIÓN j

OBSERVACIÓN 3 AJUSTAR EN LACLASE DE MAYOR RESOLUCION.

OBSERVACIÓN 3 NÚMERO TOTAL DE CLASES USADO 20

OBSERVACION ■ RANGO DE RESOLUCIÓN ALTA DE CLASE 3 ,050

OBSERVACIÓN 3 RANGO DE RESOLUCIÓN BAJA DE CLASE 3.129

OBSERVACIÓN '3 REFLEXIÓN DE CLASE (CONJUNTO TRABAJO) 32.17

OBSERVACION COMPLECION DE CLASE (TRABAJO E NSAYO) (% > 99 » 2 4

OBSERVACION PARAMETROS PARA EL CALCULO DEL ENMASCARAMIENTO

OBSERVACIÓN RADIO DE SONDA V D W ; 1 .20

OBSERVACIÓN RADIO DE SO NDA ION : 0 . 80

OBSERVACION RADIO DE ENCOGIMIENTO í O .S C

OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN OTRAS OBSERVACIONES DEL RE FIN AM ENTO:

OBSERVACIÓN HIDRÓGENOS QUE SE HAN USADO SI ESTÁN PRESENTES EN LA ENTRADA OBSERVACIÓN VALORES U SOLO RESIDUALES

CONECTOR LYS ^A1 .í 9 c i i? A 784 h u e c o

CONECTOR A£P A 5 f! () G- 0 Í S4i ₈87 h u e c o

CONECTOR ' í.LC'I-i R IO 24 h u e c o

CONECTOR IR IA i L i ; 78 L ÍS Al. Gñl h u e c o

CONECTOR A L11 ^{i : : : :} AL i 21 h u e c o

CONECTOR ■■ '.i' .i:: e .117 c : h u e c o

CONECTOR VAL 31. ■■ ^í;^{e í}? c ¹..:. h u e c o

CONECTOR A.CP 24 5 c i7 ¡ ; h u e c o

CONECTOR 39 : ^{. i A} 707 h u e c o

CONECTOR 46 LEU A . h u e c o

CONECTOR : i! 53 SSR A 57 h u e c o

CONECTOR . £1 .3.3' ^S .0 A I h u e c o

CONECTOR ü U : S 8 i: o A 37 ; h u e c o

CONECTOR ■ -. ; 35 . ¹ ^{K ' J} A ■ : 0 h u e c o

CONECTOR SER 7 . :• : s. 784 h u e c o

CONECTOR \- - .T .- T - ü 4 h u e c o

CONECTOR P K > ■■ 417 T !! A 4 1 h u e c o

CONECTOR f l i 8 h 530 ■ .1.1 A 55 h u e c o

Á T O M O 5 ¡ 5 C I L E A : 3 5 ' 7. 24 5 , 0 i . 3 U 1 . 00 7 ■ . " 3 '

..T .3.1.

Á T O M O 8 11 ^{I L E} ^{A i . : 3 i l .4 63} ■i .4. V ^{¡ 5 1 . 0 0 5 0 . 2 8 c}Á T O M O c I L E A 1 2 i ü , 4 3 $ 4 . 6 8 -í - $ , 9 8 7 . . 00 • • 11 I Á T O M O 5113 ■' I L E A ! 2 3 ; 1 .5 ! 5. 7 25 - 5 . : i. o J . 00 0 i . 5 ; 0 Á T O M O 5 i l ST : ..!'■ A i 2 4 U .0 44 ■5 _ ^ 72 5 . 5 9 : 1 . 0 0 60 . '• Ií Á T O M O 5 : 5 CA I L E A i . : . - i i 1 . 0 4 3! 3 2 S 3 - 4 . ■ S S 1 . 00 6 1 . 0 6 c Á T O M O :: ! 6 C B T i-. ?: 1 : l ' 2 . 1 62 ■ 3 . 7 ¡ .7 1 . 0Ü ..... i

_{Á T O M O} ^{3 1 71 ; E A}i ^{24 8 . 8 4 1 , 4 2 1 - 4 , 0 51 i . 0 0 6 3 , c}Á T O M O S C D l I L E A 124 7 - 5 1 i 4 - 3 , 3 ¡ i ¡ , 0 í 6 3 * 2 3 ' Á T O M O 913 CG5 I L E A : ’ i 5 . 5 l í i ■ . - 2 . 2 1 1 1 . o c 6 ■ . 50 c _{Á T O M O} ^{5 c I L E A l 24 1 1 . 7 66}i ^{. : ■: 6 4 , 5 . 00 6 4 . 9 S c}Á T O M O 321 0 I L E A 1.24 11 . 4 75 ! . 0 3C 1 . 743 i . 00 67 . 0 _{Á T O M O} ^{9 2 2} ^{. :■ ■: P .}i ^{2 5 1 2 . 6 7 1 1 . 8 64 3 . 0 5 5 . . 0 0 ' 2 . 94 1.}Á T O M O ■■:r< CA ^{A G P A}13 : . : - y 0 . 6 4 i - 1 . s ;• 4 1 . 00 o s . s e c _{Á T O M O} ^{3 M} _{< -1} ^{¡- ! j 1 4 , 5 6 í : : . F < i 4 - 1 - 8 57 1 , 0 0 8-1 . ■■!} c _{Á T O M O} ^{9 2 5 C G A 1 2 i 1 4 . 6 SO 0 . - 1 2 ■ 0 . 4 1 7 • . 0 0 3 5 . 23} c Á T O M O O B I ■■ C P A .1 37- 1 3 , 7 3 3 \ . O S í 0 . i 3C . 00 56 , U 0

.

Á T O M O ^{0 D 2 : p}¡5 i ^{25 ! ■■■, 6 6 ■: . ■ ■ í 0 , 0 52}1 , Oí ^{8 0 . 40}

Á T O M O ^{9 2 8}c ^{A 3 P 12 5 1 2 . 1 4 "'' 3 ■ ; 5 s - 2 . 3 3 9 . . 0 0 7 9 - 1 S}7 Á T O M O S ■ 3 0 =.: ;p !>_ ! 7 • 1 1 . 5 7 0 - o , i c-e - 1 . 6 30 . . 00 7 3 , 1 3 0. Á T O M O • ' N PRO A 12 6 : . : - - 1 . 7 44 . 667 i . 00 71 . 11 r? Á T O M O 5 3 .; C A F,= 8: 4. : 2 6 i i , . 5 ; ^{- 2} . 7 8,1 - 1 . 3 J í .1 . 00 S 2 , 11 c _{ÁT O M O} ■•32 ^{C B} _{P R O} ^Ai ^{2 f ,} _{1 2 . £ 43 4 . 0 55}■ 2 ; - 053 i . 00 ^{3 1 . 0 6 f ■} _{Á T O M O 1 X I 3} ^{C A L E U A i 3 .1} _{1 4 v . 5 ,} ^{1 V 7 1 3 - 0 , 5 2 4} _{1 . 0 0 Í 0 ■ •}c Á T O M O 1 ! 0 « c a L E U A i . ' :■ 1 4 , 3 2 ■ 1 • , : T : ■ : . 3 2' i - , \ '0 6 0 . 08 c Á T O M O C G L E U A 1 3 :> 1 3 . 377 1 5 , 8 0 1 ' . 4 i j. , : ' ■■ i . 4 7 c Á T O M O I 0 08 CD. l L E U A 1 .! i i • • i i. . 6 r 7 - 7 . 77,.■ i , ¡ x i - - . 8(1 c Á T O M O 1 L! " C D £ L E U p . 1 35 1 2 . 1 5 5 _ f........4 B . 1 V 5 _ . 00 ... 1 i c _{Á T O M O} ^{' C¡ 03 c L E U A i ■: :■ ■ 3 . 6 75 : • - 1 1 . 4 1 : 1 . 0 0 ■2 i . 5 3}c ÁTOMO .. (10 & ü L E U A 1.7 5 17 . 5 6 3 1.6 2 1 : ...2 .2 . .. ... 00 55 7 3 ' ■' ÁTOMO , 0 ; ü V T Y R A ; :: o i 5 . . i O I - i l . 05 4 1 , 0 0 6 7 . i 7 K ÁTOMO l ' j i i C A T Y R A i . v ; : 7 ■: ■: .. . 4 4 3 ■ 12 . 7 53 .. . 00 6 5 . 1 2 c _{ÁTOMO 1 01. 2} ^{C B T Y R A 1 3 :•} _{i 8 . 1 5 5} ^{3. Í . í ÍC - ! í i . 8 2 ' - ’ 1 . ■ ■i 5 . 50}c ÁTOMO 7 01 3 C G T Y R A 1 3 77 1 6 - 9 9 2 1 7 . 5 4 - - 0 2 2 - 2 . 00 ■7 ■ 2 2

ÁTOMO 101 i C D 1 T Y R A i ñ 1 6 . 2 2 2 2 3 . 2 0 3 . o , i . . 1 . 0 0 ■22. 72 : ÁTOMO 10 : :; C E 1 T Y R ■ . - ' 3 :■ 2 . 5 . 27 7 2 1 . 2 7 . ü . 4 75 i , 00 ■ : . 8 1 c ÁTOMO 1.0 : ¡& C S T Y R A i. ! 6 1 4 . S 45 í i . : 98 1 . 0 0 ■: — . 36 c _{ÁTOMO 1 Í U 7 OH T Y R A}i ⁷⁶ _{1 3 . 7 5 0} ^{2 ; . 5 7 1 - 8 , 3 0 1} _{1 . 0 0} ^{72 . 0} ₀ÁTOMO ■ ó ¡ 3 C E ^ T Y R A 1 36 • ■ V i . 7 ,| £ - £ , 5 : 2 ] . 0 ( Ó 0 , 5 S c _{ÁTOMO 1.01} ^{C B 2 T Y R A}i.^{3 6 i ■ 5 5 4 1 9 . 1 3 3 8 . 9 1 7 1 . 0 0 ■70}. _{i '}ÁTOMO : 0 20 C T Y R A i 3 ¡ 1 5 . 1 O i i . 60 "3 - 1 2 . ^ 2 ' :: 1 . 0 0 ■ . 64 c ÁTOMO 1 02 : 0 T Y R T 1 ,36 : • . 4 3 ? . .. . .. V i - 1 1 ' .. 00 ■2 . . .¡ 0 ÁTOMO ..0 22 ■ A $ i > A 13 7 • ' 1 7 . 2 3 3 ■■.. i: , 1 1 7 ! , 0 ( ■7 ■: . .. 2 í i _{ÁTOMO l ■. 3} ^{C A A 3 P A}i ⁷: _{52 . 3 S ■} ^{1 ■ . - 4 7} _{- . . 1 16 ■ . 0 0} ^{6 ■ . ¡} _{c ÁTOMO 1 0 2 4 C'B A S P} ^p _{! 3 7} ^{2 1 . 7 ■ 3} _{1 “}. ^r1 _{“ 1 4 . 7 32 i . 0 0} ^{■!: 7}. ^{57 ú}ÁTOMO 1 0 2 ri C G A S ? A i y . 9 2 2 ■ 7 . 2 26 ■ 2 6 . :: . 2 ■ , Oí 6 5 . 6 0

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_ÁTOMO1053 ^!■: ^z L Y S ^A 14 ₁ ^{: . .} 28 ^{V i' . 6 ' 7} - 3.7 ¡ 6 _ÁTOMO ^{■ ' : t} L Y S A 14 ^{:■ , ; . U} 2 ^{. 0} 7 i ^{■ ■} _ÁTOMO105.1 _{L T S} ^{A ¡ i. ;} i l ^. 25.1 1 ^! .116 ^{• v} _ÁTOMO1 _{ü :■} ^. V A L A 142 16 ^{. : • ..} .13 3 ^{: .} 3 -i 7 _ÁTOMO1053 _{r: 7} V A L A 142 111,242 10 . S 25 ^{- 1} .135

_ÁTOMOI 054 ^{7 B} V A L A ^! 42 i .4 5 1 j 5 . i - 11 - 0 - 582 1.0 0 5 8 .51 c _ÁTOMO1053 • ** * 1 ^{V A L A 1} I ' ' .033 ^{7 .} 0 ^{S :} 0 , 356 ^! ^.00 : 5.55 c _ÁTOMO ^' ^{- ; U} V A L A ^{u ; 1 '} ^{, 7 '}5. W ^{■ '} V O S ^■ ^{. 0 0}58. i ^{c ÁTOMO} _' 06 _' ^{■ ■.}V A L _A ^{i i ■ V . ; , : .■• n . v í 4 0 . 7 i}j . , Oí 62. 3 ^c _ÁTOMO1 ^{i :: B 0}V A L A ^{i ....}15 ^.311 ^{... .}269 ⁰ ^{, ‘2 ¡2 . . , 0 0 6 0 .} ₀ _ÁTOMO1 V : 3 V I L E A ¹ 4 :■ .: <i - 2 .3 .2 .1 S ^{i 0} . ^{0 5 6 i} . ^{0 0 6} -1.23 ^tí _ÁTOMO ^{.. 0 70 CA I L E}A :_l4 i ¹ ^{: . .. fi 3 1 0 . - : 2 .. . : ■}5 ⁱ ^{. ■ 6 7 . i. 8 c ÁTOMO ] O' ' ! C B I L E}A ^{¡ ■ .-}11 , 2 ^{¡ .1 i , 1 3 o . ■ ■;} _.1 , ₀₀ ⁶ ^{: , i 7 c}ÁTOMO ^{I 7}031 ^{I L E} ^{A :i - o}11 - í 13 22.2 72 O. 123 _{1 . 0 0} 61.69

A T O M O 3.2 : 0 5 L U A ! S . 2 4 O í ■ 1 7 . 1 0 : ■ - 1 3 . 7 72 1 . 00 S í 4 3 0 Á T O M O ■ . . ' 14 l í L E U A i 7 0 1 3 . 2 5 7 - 1 5 . 1 0 8 . . 00 . : : K Á T O M O I 2 C A L E U A 1 s 2 5- . 307 1 4 , 5 3 0 _ 3 . ! , 1 : . 1 , 0 0 • - . • V Á T O M O ] 7 i 5 C B L E U A ! i : ? 2 0 . 0 1 ¡ : 5 . 4 5 7 - - 6 . 0 J : : . o í 3 7 . 3 0 e-^{Á T O M O 1 2 1 -} _{C í= L E U} ^ÍL _{1 i 2} ^{2 7 . 0 5 7} _{_ B . ... 15} ^{.. 5 . 1 S i _ .}00 ^{■ ■■ ■ ... ;} _c ^{Á T O M O} _{C T l} ^{L S U}A ^{; •; • . : . í 2 1 7 . ■. S} _{S . 6 3 9} ^{i .}00 ^{3 ■ . . 3 ■■} _{Á T O M O} ^{¿ 2 1 Sí} _{L E U} ^{A i ->2 2 6 . 5 2 1 . 3 J. 5;}5 ^{- . . 3 . 7 3 3}1 .00 ^{6 . ■ 0} _■ ^{Á T O M O}, 2 2 0 ^{c L E U}A ^{3 5 2 2 1 . 5 3 •}„ : . i 13 ^{- 5 i . 5 5 . .}00 ^{i . r c} _{Á T O M O} ^{i :. 1 1 0 L E U A .1 <52}2 _{V . 5 0} ^{.. . 6 4 7 ■ . . 2 2 i ,}00 ^{■5 i . 0 7 O Á T O M O 1 2 ■ 2 t í H I S A ! .: 3 ' 1 . 2 5 ■ 3 .2 . í . 7 - - 1 7 . 1 15 3 . ; ■} 9 ^{. ■ 5 H Á T O M O i : ?.}3 ^{C A} _{H T S} ^A7 3 ^{7 • 5 2 . 3 0 0 - 8 . 1 8 5}5 . 00 ^{7 8 - 7 4} _cÁ T O M O i . . ¡ C B f l ! 3 A i i 3 . : . i 7 a 1 2 , 1 r: . ¡ . 2 , 5 G 4 1 , 0 C i 7 . ' i Á T O M O 1 ■ .29 C G H I S A ! 3 ; i • i 1 3 . : . 7 . i , 00 3 5 . 93 c Á T O M O 4 2 2 6 Í Í B . Í H I S A 7. .i 3 2 3 . 8 ! I 1 4 . 0 3 6 - . 7 , 4 4 1 7. . 0 0 3 . 08 . -5 s H Á T O M O j .■ " C 2 1 B I S A ¡ 55 2 2 . 1 5 3 I S . 0 -7 . - 9 . i 3 7 1 . 0 0 L Í M . ■■ 9 C Á T O M O ■ 2 33 K E 2 H I S A i 6 3 3 7 . 301 1 3 . : 5 i - 2 0 . S ! 8 ] . O í L C 6 . 1 ! I? Á T O M O 1 .229 C B 2 H I S A i . : 3 27. . 35 ; 3 4 . ' 2 0 . 8 53 . . 0 0 3756 . 2 7 c Á T O M O 1 2 3 0 c H I S A i : i 2 2 . 0 3 5 3., . 5 - 3 - 1 0 . ( U C .. . 00 7 5 . 5.2 c ^{Á T O M O} _{I i . i .. O H I S A} ^{.i ■: 5 3 . i 2 ;} _{1 0 , 1 - 4 - 1 0 . 3 2 0 .. 0 0}7 ^{. .} _O ^{Á T O M O • ■■ V A L A} _{1 id} ^{2 2 . 0 4 5 .. . , 7 ¡ ' . i - 1 6 , 8 5 8 . . . o t ■}0^{. . . í i Á T O M O} _{1 . 2 3 3} ^{C A V A L A 7 '.d 2 1 . 3 2 3 ■ . 7 7 - .. . ■ .}1^{. 0 0} _{Í 3 .} ^{Q Á T O M O 1 . - 1 f ’ 3 V A L A ! '54 ■ 7 . 2 >6 3 . 4 t í - 5 . 8 3 7}1^{. n o ■7 7 . ' 7 c Á T O M O 1 1 W í. W 1 V A L A 1 Í 4 2 C . 2 0 4 7 . 5 : . :5 - 1 4 . 7 7 . . ■}.77 ^{5 - 5 . 7.5 ■■}Á T O M O ] > 30 V A L A : . i ■ ■ . 5 4 : 3 . 2 ¡-5 - 1 4 . 1 .7 , '! . O í • 2 .. '

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_ÁTOMO.11 ^{■ 3} _{r :} ^{b P H E A i i J. , 2 J 0 . 4 0 5}6 ^{. ! > 5 C . .}00 ^{7 5 . 9 1 .■■ ■ ÁTOMO ü 7 1 ; . , P H E A : : ; o i 5}.6 ^{13 ¡ ■ 3 - 5 . 7}1 ,00 20 ^■■ _ÁTOMO11⁷5 ^{c r ¡ i P H E A} _{J ; ?} ^{i ' ¿ . : 1 5 5 , S 7 Í} _{•■ 3 8} ^{• .}00 ⁷3^{. 5 0} _c ^{ÁTOMO : e i P H E A i 1 5 , i 5 2 ' .}0⁴8 _{- 4 . 9 3 8} ^.00 ^{7 5 . 9 4} c ^{ÁTOMO ■ . 7 7} _{C :} ^{P H E A i 5 9 i ' . ; v -i . ü : - 3 . 9 3 2}3^{. .}01 ^{7 2 . n c}ÁTOMO ^{1 7 7 8 ■ ’}1 ^{P H E 3. u 3}1 ^{'. , S 7 ‘ 2}.8³ _{. 7} ^{. .}00 ^{'■ • . i .. c ÁTOMO 1 3 7 9 C D P H E & ! 5 2 ; 6 . : 2 7 ! . - 4 . 1 3 7 . .}00 ^{" ¡ 1 . 7 5 . ■} _{ÁTOMO .. 2 3 0 O P H E A}1 _{■ í i i ■ ■ ■ . .. 0C1 ~ 1 , 3 - 5 4 ■ 7 , 6 0 6 .. .}00 0^.84

^{ÁTOMO 7.7 7} _O ^{P H E A i 5 7 1 5 . 0 5 3 - : , ;■ - S , 5}:6 ⁱ1 ^{. o e}68 ^{. 5 6 O ÁTOMO I . 3 í i} _{L E U}3^. _{7 7 0}1 _{■ 6 3 -}2.0 _{i :} ^{■ ' 7 . 1 . 7 7} _{5 . 0 0} ^{7 1 . 9 5} _M

ÁTOMO 1 Í 2 S 0 S R Í j A 1.83 : 7 : . n o : 2 , 0 5 7 - 2 2 , 4 8 1 . 00 9 : , 08 0 ÁTOMO 1 : 24 t í El 15 A 7 3 / 2 6 , 8 2 1 '¿ , ■■ 2 0 . 5 ; 7 1 . 00 3 . , 14 K ^{ÁTOMO CA} _{M I S} ^{A .13-; 2 7 . 1 1 1 2 . 5 1 1 , - I B ♦ 6 3 8 i . o o 8 6 * 7 4} c ÁTOMO ] i Ci3 H I S A ! S S 4 3 5 : = .7. ;■ i - . 9 . 000 i . Ot 9 a . 7 ? í-ÁTOMO 1427 C S E l 2 í .13 ■ 2 & . 4 7 i 3 * 7 9 9 - 1 9 . 7 7 3 . . 00 S 4. . 7 4. f ÁTOMO ■ -i 01 H : A 1 s; í : 3 . 6 6 7 4 . , 50 ? ! . j 8 .2 . 00 5 3 . ■ 0 1. ÁTOMO .. i2 ': i C E i HIJ3 A i 8 7 y . 4 , 6 6C ... ..320 1 , 0 0 94 .7 -ÁTOMO . i 33 . 1 S i : .- 189 . . . . 4 . 4 56 - 2 0 , 5 0 3 1 , 0 0 9 3 . 4 9 H ÁTOMO 1 43 .. ' L'j 5 í í l l i A .18 7 3 0 . 0 27 i . 7 35 - 1 9 . 3 91 i . 00 = 9 . ■■■■; C ÁTOMO 14 33 ;■ H I S A i 8 7 33 2 , 24 4: ■■ ■■ . 158 2 . Üi 80 , 16 0 ÁTOMO 7 4 3 :■ 0 fíT A 1 ¡! 5 2 ; . ' i 3 , 4:44 - 7 , 141 1 . Oü 7 ? /, 0 ÁTOMO 1 33 i N V A L A .1 Oí) 2 ! .2 35 1 . 4 36 . ‘ . 0.4: : 1 . 0 0 7 7 , 54 TI ÁTOMO 1 i i 5 c . V AL k ! 90 ./. . 36 0 , 3: 3 6 . ó . : 1 . 0 0 74 * 57 C ÁTOMO ..1 3 i C B V A L A 1. 30 2 , . 4 3 í - 0 . 7 L' : - . 6 . 6 60 1 . 0 0 7 ¡ . 17 c ÁTOMO 1 ¡ 57 C O I V A L A i 30 2 4 . 4 ■■ i . ! • ■■ 7 . ! 2 7 1 . 0 0 7 7 . i 7 ■ ■ _ÁTOMO' 138 ^{CG2 V ■ !}H ^{i 50 2 4 . 0 5 2 - 0 . 7 6 3 ■■■ 7 , \ i . Oí}■ 2 .1 7 c ÁTOMO 1.43 ? c V A L A i.30 7 3 . 4 8 5 : 4. ' 4 9 15 . 4 1 5 . . 00 1 ' . 37

ÁTOMO 1 1 0 V A L A 100 2~¡ . 0 5 5 ■1 . ¿ 87 - 1 7 . 58 ... n o 12 . t i ü ÁTOMO 144 i 7 I. Vi. A : .. .7: . ■ 7 1 . S . S 4 - 1 4 . 2 3 . .. 00 7 . . ■■ G Yi ÁTOMO .. : : j C h L .7 A 1 3 . i.'. .1, : 4 3 - i 5 . 2 : I 1 , 0 0 ■ 4; ■ .. i ■ ÁTOMO 1 CE A 7 34 27 . 1 ■ 7 2 . g 89 - 1 2 , 9 ' 3 2 . 00 7 8 08 c ÁTOMO 1444 00 í A ' 3 : - 7 . 0 . 7 3 . 7 4 8 - .11 - 806 1 . 00 2 7 . 0 8 c ÁTOMO 1 4 3 CD L Y $ A 1 / 7.3 . 454 , ■ 11 . : : ■ , 0i 3 1 . 33 7 ÁTOMO 74 0 C E T.Vg ■- i 5 ' ■ : . Í i 73 i • 7 - 1 1 . : ‘ : 1 , 0 t 57 . 62: c . o e

ÁTOMO U 4 7 .... 1A t : 'i i . 3 . . 4 3 6 . 440 1 1 , i Í 6 3 ■ .74 1 ÁTOMO 1 i 13 c L ' E A ! 5 2 t , 662 1 , 2 4 8 - 1 1 , 9 2 4 i , 00 7 3 , 5 i c ÁTOMO 1 7 O 7/178 ! 3 . 23 . ■ S 5 , 1 .172 - 1 ? 1 7 6 1 . 0 0 íí ■ . ■ ! y ' £ j rr ¡\

ÁTOMO t í T U R A i < : 2 6 . 1 3 ? 1 . 4 4:5 - 1 0 . ( S 5 i ... n o 74 . 10 K ÁTOMO ■ i 3 CA T H R A : i 25 . 30 0 , 9 5 3 ■ 3 .562 ■ . 06 7 ;. , 45 c ÁTOMO : - .. T H R A ; 2 i . 875 - 0 . 4 5 0 &. .195 1 .37 71 64 i: ’ ÁTOMO 1 ! S 3 . T H E A 132 2 2 . 543 1 . 08 6 - 8 , 5 9 4 ... n o 7 . : . i,.. 3 ÁTOMO 1 4 $ 4 : 7,.. T H R A .1 : .. 7 . . 7 . ; . .173 - 1 0 , 5 7 7 i . 00 . 0.7

ÁTOMO . c T H R ¡■á 162 25 . >■ 58 1 :. S 7 1. ' 42 1 . C ■' ■ 0 :■ 1

ÁTOMO : A ! "./ ' . 055 i '■ 27 8 , ' 75 1 / 33 7 7 1 ; ÁTOMO 437 N T Y R A ! 77 71 > .27 7 I . • ' - 7 . 3 47 1 , 00 70 , 44 Tí ÁTOMO : i 5 i ■ j- : . i ■ i! 13 ; . 558 2 , 3 3 2 6 . 0 4 5 . 0( ■/ . 28

ÁTOMO l i b ' J CE T Y R A i. 3 ■ 4 0 3 ! 6 , ! i 6 ... 00 71 5 i c ÁTOMO 1 J S í ) 00 T Y R A 1 3 3 2 $ . 2 3 9 4 • : 3 - S . :: 96 I - 00 81 . ? ! C ÁTOMO 1 4 S i CD1 T Y R A 135 2 i . 351 4 . 3 1 ; . 7 .. . 0 ! 8 6 . 2 2 ■-. ÁTOMO 1 7 c . ; CK.1 T Y R A i 33 2 8 . 0 7 7 5 . ó 6:1 8 . - ■ 0 1 . ! i Ó 9 1 . 7 3 ■ ’ ÁTOMO ■ ¡ f i T c z T Y R A ! 4 7. 2 , 734 6 , 3 5 4 i . . l : .. n o 3 i . 0

ÁTOMO 1 76-1 OH ; \ p - 1 9 , : 53 7 . ' - 5 . 6 7 1 . 0 0 2 . 5 O ÁTOMO ..7 T Y R A i.3 ! . . í . S 8 6 . i 4 3 1 .3:3 9 48 ■/ ÁTOMO 1 3 S í .: : T Y R A ! 3 2 5 .602 5 , 137 - 7 ■ ■■■ - 1 . 33 7 i , 7 ” ■4 _ÁTOMO ^{1 367 c T Y R ■, i 7 3 4 4 , 7 5 4 ; . • ■■■! . / : 0 1 , 0 0 1 ■-. 55} c ÁTOMO 1.4 S í 0 T Y R A 1 3 '■ 2 3 . 7 4 7 i ' 7 “ - 5 . 1 27 i . Úi. 80 70 G ÁTOMO 7 9 7 A i 4 i 2 5 . ; 72 2 . 2 4 8 1 . 7 64 ; . 00 ' ■ 52 H .... , .

ÁTOMO 170 CA A i 7 : 2 4 . 4 3 5 1 , F..18 - 2 . 3 34: 1 . 0Q ■ : . 3v

ÁTOMO 1471 C B 3 • A i 54 7' : . 378 1 . 0 2 1 - 1 ■6 68 : . 33 8 7 . 5 0

ÁTOMO 14 72 : C- M ! A 134 ........... - 2.. 4 7.3 ■ 2 , 0 ■ ■ . . 00 :■ 1 . 7 9

ÁTOMO 1 I T T : n G 7 A i 3 ; 7 5 . ■ 6 - i , 3 55 - 0 . 9 0 7 i , 00 i i , 7 7 , • ÁTOMO 1 4 • 4 0 E 1 ■ A 194 3 5 . í 55 3 . 65 6 0 - 2 52 i , 00 8 7 .08 0 ÁTOMO 375 DE.? A i. 94 2 6 , 189 - 7 . 4 0 / - 1 . i .. i: 1 , 3-3 3 ; 1 ^í. ÁTOMO ' 16 c G '.. ?. i 4 1 • , 055 Í . O 53 - 7 , 4 2 . 00 75 58

ÁTOMO 1477 0 .: u A i 44 44 . 257 1 . 15 4 -4 . i 52 1 . 00 : 3 . ■ .■ ■ ÁTOMO :. 37 8- t í V A L f-i. ; 95 :. 3 . 0 . i .3. í 7 : - 1 , 7 1 2 .1 00 7 f Ií ÁTOMO '! 4 CA V A L A : 4 i : 4 .37 5 4 . 2 4 - Ü . ■ 5 ■ i . n o : . 6 ?

... s ...

ÁTOMO ' ¡ 30 C B V A L A : 4 '7 2 1 . 0 3 3 1 . í 2 6 ■ . • 7 ■ . 00 {■ ÁTOMO .. 33.1 CG1 V A L A i. 77 .. .. . 527 5 , IC 0 . 305 1 . 0 0 82 . c ÁTOMO 1 73 ■ c g ; ■ A L . i 4 '4 2 1 . 1 74 4 . 96 1 ■2, i 07 .. 00 74. .1

ÁTOMO .1 48 3 C V A L A 1 2.7 .4 35 4 . .151 1 . 0 36 . . n o 7 . . 06

ÁTOMO 1 334 0 ■ ■ i : 4 1 7 : . 5> 1 :•. • • 1 . i- /: 1 , 0 0 ■■ 4 . -7. • ■ ÁTOMO 1 ! '■> t í ; ¡EF. T 7 36 7 7 . 28 1 ' . ■ 52 1 , 71 5 ! . 00 72 . ■ '! M ÁTOMO ' 136 CA S E R A i 47 2 3 , ¿ 7 3 T , 0 4 ÍJ 7. . 16 7 . 00 79 27 , ■ ÁTOMO ' 43 ■: : ■ ■ =7 : 46 2 4 , 7 ■ : •i . . 62 5 . 7 14 1 . 0( 80 . : 3

ÁTOMO .. ¡ 38 o s E S E A i. 4 ü . . ; . •• 4 ■ 4 ' 7 5 . 1 6 5 . . 00 8 0 . 0 0

ÁTOMO 1 13 3 c S & R A 1 9 6 22. .f. 43 S , 358 3 . 5 7 4 2 . 00 . , 94 ■7 ÁTOMO .. 4 ; 0 0 S E R A 1 7 e 47 . • ■ 7 . 7 2 3 . 3 86 ... 0 0 7 ' S . 44 O Á T O M O 1491 t í L E U A i 3 ■ 2 1 . 4 1 " 6 . ¿ 30 4 . 1 6 “? 1 . 3/ 8 9 . 4 1 ]-3 Á T O M O I 4 ¡ 2 CA L E U A i :■ 7 3 . ■44 7.. - 57 4 . 8 . 7 4 . 00 8 0 . 9 !

ATOMO : s : : 0 .3 L A A . 4 2 3 . 3 12: 4 7 4 - 21 , : 33 i . 00 " i 3 0 ÁTOMO 1 i 3 i t í G L U A 2 1 5 2 2 , 1 0 1 2 . 0 58 - 2 7 . 1 . 00 8 1 . 0 ; K ^{ÁTOMO 1 6 3 5 Clíí} _{GL U} ^{A 2 0 . 7 7 4 3 . 4 1 0 . , 7 .-. ■ i , 0 0} c ÁTOMO ; s j í e s C L P A 3 i ■i 2 0 . 0 7 3 5 - 5 . i 39 i , ¡'Á 3 ; . 31 C ÁTOMO 1 s •" CG COLO i, : : : ■; j. & 1 4 . 5 58 - 2 9 , 3 5 8 1 * 0 0 5 1 , 6 4 c ÁTOMO ■ $ 33 C B o u A : :■ : 7 . 5 . : 44 ? S . i , 0 0 1 0 0 , 4 3

ÁTOMO .. í j í i O B I A U S 1 3 . 4 6 , 3 6 4 2 5 , 9 0 ? 1 , 0 0 1 0 7 .7 '■ ■ ÁTOMO I 64 D o s : G L U : $ 2 , • 7 . 6 .1 38 - 30 , 7 1 , 0 0 5 7 . 50 0 ÁTOMO 1 $ 4 _j c C L P A : i 5 17 . c :. ■< 2 . 5 ?S - 2 6 . S 7 J .. . 00 4 5 . ■; ¡ c ÁTOMO 0 : I U A ■ i 5 1 9 . 0 5 2 . 7 5 : - 6 . 7 7 3 3 . ;■■■ ■C . ' L O ÁTOMO 7 64 3 tí A L A A 31 2 0 . 6 84 2 , 1 37 - - , . 7 a . 00 7 1 . 4 ^jH ÁTOMO 1 $ ; i A L A A 2 1 6 1 9 . 9 9 6 i . 55 2 ! , 41 5 1 . 0 0 ■ 2 9 .-ÁTOMO 1 S 43 C i A 7 k 2 1 6 i 7 i : . : . -16 22 . ' 3 9 1 , 0 0 ■■.. ? ; r ^{ÁTOMO .. . •, c A 2 5 15 , 7 21 .2 . 7 2 2 “ 2 3 . í , ? 3 1 . 0 0 7 S . ■ ;} c ÁTOMO 154 7 0 ■■ A 2 : ñ i 9 - 7 53 5 . 7 63 - ■ 5 . 3 1 . 0 0 V 5 . 2 2 0 ... ...

ÁTOMO ‘ $ : 3 [7 ' 7 H 2 1 '? 17 , - 1.02 ■ - 2 3 , 2 7 5 i . Oí !. ÁTOMO 34 ? CK S E R A 21.7 1 7 . 0 6 4 ■3 . . ... .. 4 72 . . 00 72 . .11. i ' ÁTOMO : e s S E R A 2 1 7 1 i . 0 7 7 3 . 7 . : 7 - 213 . ü i : ... 00 1 i . 10 •; ÁTOMO i $ .... •• S E R 7, 2 1 7 : 7 . - - 2 . R ■ 27 . 9 :: : .. 00 ■71 . 44 0 ÁTOMO 1652 ■ S E R A 23.7 i Ó . 2 65 2 . 9 11 ........ 360 .. , o t 6 82 ■ ÁTOMO i • 0 S E R A ■;: 1 $ , 1 8 4 3 . 517 - 1 . 0 0 4 9 . 1 6

ÁTOMO 15 " 7 ti M E S A .7 i 3 ; r : . ■. 1 , 7 2 4 ■ : .39 . 5 1 . 00 4 ■ . I ? w ÁTOMO 1 $ 5 $ O_aí - íET A ■ 1 s : 4 . 0 0 5 i _ : 30 10 . ' • ■ , !■! 6 0 - 2 2

ÁTOMO 1 Í 5 0 e s ■- : i S : 3 . i -i 5 0 . 4 58 - 7 0 . 9 i c

. , , , .

ÁTOMO !. i v 2 Í E i’ h ; i , $ 3 5 0 . 0 ! $ ..5 . S 32 30 c ÁTOMO : s i 8 £ D M S T A 2 : 8 1 1 . 7 8 5 ~ ü , 6 SO - 2 0 , 7 6 G i . 00 ' & . £ ÁTOMO : 5 $ ? C E H E ? A ' i 5 1 0 . 5 .13 0 . 4 7 7 - 2 2 , 0 0 8 1 . 00 7 4 . 3 ! ■ ■ _ÁTOMO 166 D _C ^{H E T A 2 i E i . 3 . 3 7 5 0 . 3 5 6 - 1 9 . 2 9 1 i . 0 0 6 ' . : c}

A T O M O : : ■ ; i V A L A V i - ■ 6 . . 10 3 , i 12 - 2 5 . 2 V i i . o o í ; . r ¡ ^í; Á T O M O ;■ r . ¡ 4 c g : V A L A 33 3 - 4 - ■ V - i . 7 ? 1 - 2 3 . í V : 1 . 00 4 i- . 15 C Á T O M O .. i • • c V A L A 5 34 K . ■■ 2 7 S . ; . 4 ■' 22 . 7 ! 0 1 . 0 0 4 6 . 3 2 c Á T O M O ; 0 V A L A ■ V: ■ : 35 - 7 . 33 - 21 . 6 5 4 : •■■■ 4 Í - 5 Í J

Á T O M O : -177 !■; L Y S A ■V - 7 . 7 7 5 - 9 . 4 1S 2 1 . íííi 'C 1 . 0 0 ■ 13 Á T O M O - • C' ■ LYS A . ■: :■ - 7 . 1 4 3 - 0 . 8 : 2 2 . 8 9 0 1 . 0 0 6 0 . 1 9 c Á T O M O :. i ’ s L Y S A 3 15 ■ 3 . .743 ..1 7 3 9 2 3 . 0 ;37 1 . 0 0 V : 02 c Á T O M O .. i 35 CG L Y S A :: 3 - 6 . ,14 ' - 1 3 . 1 . : ■ .. . 5 9 ■■ 1 . 0 0 7 5 . 2 6 ■5 Á T O M O : •• • ^{c d}L Y S A .33 5 ■<: . i: 72 1 3 . 9 0 4 ■ 22 . ' • .. . 00 7 5 . 0 6 ■:

....

Á T O M O ; - l a . ; L Y S A ; 5 ■: . A 52 - 1 . 5 . ? V ■■ 20 . ü 17 1 . : , 15

Á T O M O : - - } y L Y S A 3 1 i ' : 7 2 - j 4 4 ¡ j g - 9 - 9 8 ■J . 00 ■ . ■ 7 ¡' Á T O M O :: i s i L Y S A : 15 .. 19 1 1 , 4 2 4 2-3 - S 14 1 . 0 0 5 7 . 9 1 ■;, Á T O M O . i 0 L Y S A 2 5 -b .S¡14 - 1 1 . 1 7 5 2 -i . 7 ! :: i . 00 :. 5 . .. í Á T O M O -i ÍT L E U A 3 16 - 5 . 0 S ■ - 1 2 . i. 70 - : 1 . 9 0 3 1 . 0 0 6 0 . Ü 0 i: Á T O M O ^{. j S 7}a . L E U A i 3 ¿¡ - 4 . 0 1 1 ■ 1 2 . 9 7 1 - . : 5 1 . 0 0 6 2 . 7 2 ■' Á T O M O ■ 133 c L E U A 3 i 6 ■ 2 . 7 8 4 - V V - 5 - V . 6 3 ? i . O í . 5 . :. 6 c Á T O M O 1 4 8 9 CG L E U A :¡ 3 í 2 . 4 2 S . 1. 2 2 . 3 2 5 i . o o '■:..:■■■■ v ÁTOMO , : C D 1 L E U A í m , - I . i . 17 - 1 1 . 377 - 2 1 . i. 35 1 . 0 0 6 0 . 0 6 ■: ÁTOMO -j 5 i ■: ^d: L E U A 33 f i - 4 1 0 , 5 5 2 2 3 .6.. J .. 00 6 1 , 0 3 C ÁTOMO 192 V L E U A i 3 i- ■ ! . , ; ! 33 - 1 4 , ! 5 ■ .. 3 . 5 g . i . O i 6 9 - 8 ' i V ÁTOMO : l í i 0 L E U A - v . - 5 . V - i - .4 . ■ ;V . . . . . : 1 . 0 0 7 0 . 1 6 6 ÁTOMO : 4 \ 4 A S W A 337 “ 3 . 5 7 9 - 1 5 . 3 5 3 ■4 . Vi 1 . 0 0 S .3 .01 1 ÁTOMO : •. r A S M A 33 ' 0 . 7 1 S ■ v ' : -1 . 517 , 0 _í9 7 . 9 8 c ÁTOMO : : • e s A S U A 33 ■ - 4 . V V - 1 5 . : : : 0 - í i . V S Ü 1 . O í 10 7 . 7 A

ÁTOMO . - ; v r: es A S M A 33 ' ■■5. i. 1 6 . , . ' 2 ^{í j}. 7 2 5 . . 00 n o . 22 c ÁTOMO : ¡ 53 O C l A S M A ; i ' ■ ¡ 5 .055 1 5 . ? 5 0 1S . 1 9 3 i . 00 3 . 2 0 0 ÁTOMO : : : í A S M A ? 37 “ 6 . 34 4 - . 7 . 5 ; - 6 . V V ! . 0 0 1 U V 13 f ! ÁTOMO :: 5 . '■ ■ A S M A : : r . : - 2 . 3 1 - 1 7 . 2 08 - : 4 . í 2 4 1 . 0 0 3 8 . 1 6 C ÁTOMO :■ 3 en. 0 A S M A 3 V - 1 . 3 ? 8 - ' 5 . . 70 - ■ i . - 32 ■ 0 7 . 3 0 c ÁTOMO : : : ■ tí V A L A i 38 - 2 . 2 75 - .7 . j -1 : - 1 3 . 7 >6 1 . Oí 10 5 . i ti ÁTOMO 5 :: 3 l ’A VAL A 33 S ... u 2 : 1 0 . 0 V ........:: ; .v ... 0 0 1 1 0 . .. 6 C ÁTOMO .. , 04 ■ B V A L A 338 - . 1 . i 00 - 2 0 , : s i 22 . 6 94 1 . 0 0 9 7 , 7 3 c ÁTOMO C V A L A 3 I S - 0 . ■ .: - 1 S 527 :. 1 . 922 4 . i ■ 1 ; .:■ ■ .. c ÁTOMO : ■ ■ ■ A V A L A 33 ? - 1 , 5 4 2 • 19 i 07 ■V 3 , 8 0 0 1 . 0 0 1 1 0 55 0 ÁTOMO ; _{k t}? ;■ A SP A 35 0 . 5 2 7 - 2 0 , 0 1 1 2 ■.. 31 v 1 . 0 0 ! 1 , 4 : M ÁTOMO - 5 0 3 CJ* A S ? A :■ .i o : , 8 6 8 20 . - V : 6 - 4 36 i .:■■■ U 30 C ÁTOMO C E A S P A 53 a ... 7 73 20 7 67 6 . ! , .. 1 . 0 0 1 0 8 í !> c ÁTOMO s i s r: A S P i. ■: .1 ■■ 0 . i 17 - .: 1 . “ ■■■- - . S . í! .5 i ■■■■'■: . 9 7 c ÁTOMO 2 311 C1 A S P A 3 10 í> . i ¡ .: - 2 2 . E 35 ■ .. c; . 'i ¡ 8 i . o < l e a . 0 ÁTOMO : - n : IT S E R A 340 - 1 . 1 .'■■ 2 1 . 5 í 8 - 1 6 . 6.53 . . 0 0 1 2 4 . s : n ÁTOMO > 13 S E R A 5 - 10 - 2 . 1 5 0 - 2 2 . , y i 2 0 . 6 V 1 , 0 0 1 2 0 . 03

ÁTOMO 3 1 1 i fí S E R A V 0 - 1 . 3 2 3 - ■ : . 0 74 ■■ 27 . 8 1 . 0 0 1 .. C ÁTOMO ^a- ; : . ■' S E R A 340 .. . 7 0 1 .: ' 154 V . 7 10 4 . 0 0 1.4 4 01 c ÁTOMO :: o : ■ Ú S E R A 340 - 1 . 1 1 4 - 58 - 0 . 6 9 4 i . 0 0 126 . 84 0 ÁTOMO 5517 Eí A S U A 54 1 ■ . ■ Vi - 2 4 , ; 42 - 27 . ! V i 1 . 0 01 C ■ w ÁTOMO 3 7 i 8 ■... A S M A 3 4 . - . ⁴5 ■ - 2 5 817 - I S . 435 4 . 0 6 ■• 03 c ÁTOMO 2 ■ ¡ 5 A S N A 5-í . - 1 .554 2 ; . i 9 6 ■ 2 7 . 9 ' 0 i .00 7 : : c ÁTOMO : i 20 r; ASM A 341 •: : v - 2 5 . ■ - i - 2 9 . 802 i . 00 S . V , c ÁTOMO : s u 0 A S M A 54 1 - 1 . ■ • - . ■ 0 - i V , . 7 91 ] . 0 0 S I . 73 0 ÁTOMO .. - 22 ;■ GLU A 24 2 3 . 30 0 2 5 . i 05 2 9 . 8 5 1 . .0 0 --y . ... K ÁTOMO ; 5 i 3 C ñ G L U A 342 . ■ 4 1 - 3 4 , ' : .' i 1 i . 00 8 0 . 3 -ÁTOMO ; 5 ^mí t> C L O A 3 42 ■■ 5 .452 - 2 4 . g 40 ■ 3 0 . 9 ¡ 2 1 . 0 ( i 8 0 . ÍES c ÁTOMO 2 5 25 C GLU A 141 - . . 4 50 - 2 3 ■:-■■ - J ... 7 i 1 1 . 0 0 6 .24 r ÁTOMO ; 51 s 0 G L U A ;■■■ - - ■•■■. =. ■ - 3 3 . ( 1 19 i . 0 0 5 0 . .■■■ O ÁTOMO . 527 íí G L U A : i S - i . j 7 3 - 2 2 , : V ■ - . . > ¡ 3 1 . 0 0 . . .

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ÁTOMO . 53 ■ 0 21 G L U A 343 5 .0 i . 7 .4 76 3-3 . b -i i . . o o ■; : .. ü ü O ÁTOMO A . ■ ' r i : G L M A 343 “ 5 . 4 12 - 1 3 . 0 4 3 - 3. : . i 48 j .. 0 ‘ . ? 3 M ÁTOMO : 5 3 i ; G L U A 34 o - : .6 i-; - 2 0 . 0 1 4 ■ 31 .0 V : 1 . 0 0 9 . 11 C ÁTOMO 0 5 L M A 543 - 1 . 7 - V ■ V. , 0 1 = ' 9 , 8 54 4 . 0 0 8 8 , 8 9 O ÁTOMO ■ 5 :■: 1: G L Y A 34 1 - ,: se ■ . 19 , 741 - 31 . 3 0 0 .00 8 8 , 37 1'5 ÁTOMO : 53 ■ ■: ■ G L Y A 1 -V , .0 ■ i - 1 8 . : ■- 7 7. . 4 . >• 5 3 . .5 c ÁTOMO ■ c G L Y A 344 0 . £: 0 . S .0 85 í ü . 328 .. o o i : . : . .... ■■; ÁTOMO ; o 3 ■ 0 G L Y A 34 ; - 1 . 0 ■ - 1 7 , s v ■■ 3 0 . 3 51 i . 00 ! i .. , ■ O ÁTOMO .: i ^ía ÍT SER A : , i 0 .05 - 0 - 1 7 . 82 i - E 9 . 2 .. 4 i . 0 0 1 0 4 . v ; K ÁTOMO 1 541 r . SER A 14 ; - 0 . 3 0 3 - 1 5 . : S - 28. 3. - 3 i .06 9 - . ■ ■ c ÁTOMO 2 ¡ 42 C 3 SER A i - - . 0 . 5 7 3 - V . 526 2 . 1 97 I .0 0 84. ■ ■

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ÁTOMO 34 0 H1E c 18 40.333 • • • - . 3.743 1.00 84. 28 O ÁTOMO • i • " GLY ; ■: - ' - i 56 -> . . -■ 3.995 1.0 0 i 35.35 l‘j ÁTOMO r ¡ :•: c ■ GLY c 67 ; í 57 5 6 . v i s 6 , i 06 ] .0( 213. ■ v c ÁTOMO 8439 0 GL¥ .- 43 3 7. 71 i 75 .764 1 :3. 47 .. 0011 6.41 c _ÁTOMO: ^{0 GLY c i J7 .7 Í0 .. 551 5 . : 50 1 .0011 i .70 ü}ÁTOMO 7 ARG 7 ■'0 í í -7 57 56.4 50 - 14 ,8 94 .. 00120 ,06 I'í ÁTOMO 3 : i 2 ARG 35. : : • 35.752 - i i , 2 ' 2 1.0 Í ¡7.7- J l ' ■ ÁTOMO 3 i - '■ CE ARG c ■jn .3 67 .7 67 - i , : 9 ¡ 1 .0012 ■ . 64 c ÁTOMO ■ 444 CG ARG 7 ■í 7 _ 1 : 5 55.4 21 “ 12 - 137 J .00129 . -5 r-ÁTOMO 344 CD ^{a r g}o 70 í f i ,424 35 -353 ■ : 0 _ 815 ■ .0: 133.10 c ÁTOMO 3 ; ■ 5 A P*G 70 36. ' I - 33. : • - 0. 416 ■ . Oí i “ O . Sí: R ÁTOMO §44 ' ARG ■' 70 :?4 -. ¡>5 33. .* ' ■0.0 6 : .00 ¡ 7 :....■ C ÁTOMO 3 I : 3 7 ( i i ARG c '■'0 í . .637 i ! .312 9 .9 ' 6 i .0 0110.2 7. H ÁTOMO 33 : ■; :h ; ARG c 7 0 34, T S ■: 57 . 1 7Í - 5 ,7 00 1. 00 94.55

ÁTOMO $ J r fi IJ ARG c l ü 34.527 36 .533 - .. ¡ .52 S 1. 00105 .06 C ÁTOMO 3451 0 ARG c 70 7 . : : : 5. : ¡35 - ? .211 1.0C 33 .46 •, ÁTOMO S : i " : THE ■ ?. 7 :. (J 3 3 7 3 v i - 15 , 403 ■ 6 3.7 R ÁTOMO ; ] . L-i THE c 7 .. _ J . ■; 1" 32 . v .. C 12.544 1. 00 7 7 :.

ÁTOMO ;.4!>4 : b THE c ■'.. ?4 , i.42 - . . L.J , .. .2 . 9 . 1 , 00 84 , 04 C ÁTOMO •: • - O'.ll THE c 71 :■ . i ". .07 12.2 ■i 4 1. . i ■ 3 ■: J .. ■■1 ÁTOMO 54■■ THE c 'I ' i 7 . 11 ■ 12 ,016 1. 00 83 33 c ...

ÁTOMO 3457 c THE L 3 / .7 ■ 33. :: 2S - 13 .2 .. i , 00 8: ,25 c ÁTOMO b 455 0 THE c ■■7 2. ■ 3 - 7.38 .. - i . i .■ 3..01 81.9-1

ÁTOMO 9 i 79 LEU f- ' ......... 35 164 .... .6 >3 1 ,00 1 56 K ÁTOMO j s a ■ - ■ LEU c T ' <j . ?, .■ 7 7 -057 - .2 . O 1. 00 55.85 C ÁTOMO ■ 4 s i C E LEU c 72 .2 .5 24 3 6.614 - 12 .543 1.0 ! 57.22 C ÁTOMO 3452 00 LEU c 77 .•7 : 36 -2Q2 14 ,964 1 . : ¡0 " 7 ■ V c ÁTOMO 5 i - n m LEU c 7 ' 74 .116 34 . 1 ?;! ■■ j ; . 346 1 , 00 57 , 15 c ÁTOMO ■: 3 S í CD2 LEU ■C ■' :> i. 3 . v i - 6 , 0 3;; 1 .00 3 : .03 c ÁTOMO 34 0 LEU c 73 i í , ■■-:7 ?S - 2 .....105 1 ■00 i ■ ■ 4 c ÁTOMO ■: 3 S i 0 LEU . 2 Í . Í73 37.7 99 - i i . i 70 ¿ .00 6 2.9 0 ÁTOMO s 36? u H IS c 77 ,’ S . Ü 3 ■7 .579 . . . . 3 ■ i , 00 5 ,20 ti ÁTOMO 5458 73 H IS c 7 '■ :.7.1 s 4 7 13" - ..... i i 6 Y .C ií 50 ;¡ c ÁTOMO 3 J 65 ■ 7 H IS ¡r> ;■ 6 .4 : ■; ⁱ6 1 ' " 11 , 7 í ¡ : ( .00 60 96 c ÁTOMO H IS c 34 12, _í83 -11 ,5 i 0 1 , 00 7. 7 7 :■ ' ÁTOMO ■í-jTL :■ d i H IS c i :7. - 725 12. 3 ■' - '.7: . : --A 1 .00' 5 i . i R ÁTOMO 3472 i H IS ■' J . ■ ••• 45.428 10.3 25 1.00 51 .89

ÁTOMO 3473 i-ir; FUS 0 7.i ? S , 8 9 ! 3 . S 93 58 1 .00 ■ 9.50 R ÁTOMO ;■ 4 i ; lC H IS 73 1 -s ,8 ;4 4 ■ : . 7 ■ 12 -316 i , 00 50.45 C ÁTOMO 3375 C H IS c ’’ 3 25. ! 74 12 .~87 - 11.523 1.0 0 5- 77

ÁTOMO 3 5 0 H IS '■ 73 ■;, -7 3 ¡ 3. 7 V - ' , 554 i . 00 47.53 0 ÁTOMO •.477 7 A S ? c : 5 . j 13 5: . • ■ , 0 , ". , 3 i .00 . .00 R ÁTOMO 3475 CA A S E .■ 74 :. ■.. 542 3Í 554 - 10 , 26 i l . O t 66 7(j

ÁTOMO 33 ;; :-. A S P /*« ' 1 : 5.4 38 33.597 - 8.750 1 .00 7: . 36 c ÁTOMO i:.:,: CG AGP c 24 .435 57. -■ 1 7 , ' 98 ' , 00 SÍ7 54 c ÁTOMO S 331 Oí.:.: AGP ■ 74 23.. ••7 ¡ 7 7 . ! ! ■■' 1. .73 78.16 0 ÁTOMO 348 ' OI 1 AGP \rf- f ‘71 24 . LUI 3s .77 : ■' 7 ■ 1.0 0 54. 33 0 ÁTOMO ■’ 3 s • 0 A S P c ?4 2.3.36(2 39.2 43 - 11 .304 1.00 63.2 6 c ÁTOMO ;■ 33-3 0 AGP c 74 33 ,8 62 í - *77 - 11.522 1 , 00 55■ ■ • ■' ÁTOMO J 3 í ■* O _vt (' A S P ■- ■ 7 ■. 21 . ' 3 ? .1 " i 1 ,6 9 ■ 1 .00 6'. ■ • 13 ÁTOMO 3436 ” t AGP V- 77. í l . .76 -: - 7 ,55 3 .00 71.2 7 ' ÁTOMO - 43 ■ C : A SP i 5 , 1 K) 37.73■ 3 .24.■ 3., 0( 75. 65 c ÁTOMO 3 i 23 A S F 7 7 Si 2.0.6 20 36.8(37 .. 1.065 ( .00 ■ c ÁTOMO 3133 ODl AGP 7 75 2 : ,4 35 7' . ■■ 01 - 4 , 808 i . 00 75.53 0 ÁTOMO - 4 ' S I:.. A S P ■' i 20.2 6 -. 35.691 - 14. .:. ■ i . 00 72.06 O ÁTOMO ■: 33 ü A S P t' ■ :■ i : .535 V; , 7 .' : - i . 1.800 .1.0C 12.9 c ÁTOMO 34 i2 0 A SP c 10.451 35.4 7: ■ 0 - 7 3 1.00 76 . n A

ÁTOMO 3 ■' ■' 3 O ARG 7 i .. . 44.35 . 50.55 ■ - 0.806 : .00 ¡ 0 ÁTOMO 3 m tr ASM c 11 ; ■12 5 : . 371 -11.1 31 i .00 7 .. 14 K ÁTOMO - : -7 CA ASM c 1 i .: .084 52. .1 • 10 . ti 93 i . 00 :. 28 c ÁTOMO C'ES ASM c 1!.? SI..01 5 3'i - i 77 - S - e 72 1 , 0'.' 55. J 3 c ÁTOMO *7-7 T¡ _{a s m}- .li..: 1 .:. ’. a 52 .970 8 .5 Cj 3 . .00 59. 76 c ÁTOMO 3 ■ ■ 3 'i 01 ASM .. 112 ■■■: .. =: 33.7 35 - v . - i 7 i .00 7.5.30 0 ÁTOMO 3 ■ ÍTD2 ASM 112 .. .017 .. .• . 3.554 ... 00 55 OS Íí ÁTOMO 6733 C ASM c 1 i 2 41.35 i 57-. i ..3 - 10.21 "í i .00 5 : .19 c ÁTOMO 3 ■' 3. O ASM c 1 1 1 . 1 50.0 5. i 08 .. .00 62 . 35 ü ÁTOMO ¿ s.: ['! LEU 11 3 40. 10 50.05 ' - 11.3 i-': : . O^í5 S .01 i? ÁTOMO 3 ■ - 3 CA LEU : 113 35.93■: 49 4 73 - 1 ,638 7 .00 ' 'I

ÁTOMO 73 i Cu LEU - i 13 ; s ..'iíO : ■. ■ i! . , .772 1.00 7.. . 7

ÁTOMO ■. '.'33 t G LEU c : 13 37.814 -2. : 51 5.2 35 1 ,00 : . : . C ÁTOMO 3 , ¡7 D.l LEU C 1.:. • i ■ .1..3 :o .273 - .2. 027 i .00 64 ..73 C ÁTOMO 3737 O-: LEU í i : 3 37-57 • b. .3 .9 - '¡.I 35 i .00 57 . 3 ■: c ÁTOMO i 733 c LEU c i 13 .707 i S .. ' C 5 -12 .7 ! 5 ] .0( 5 S .51 c ÁTOMO ti 0 LEU .- 1!.3 40.184 i 7.2 78 10.532 . .00 61 .35 G ÁTOMO £750 2 LE c 114 15 4 s ... <1 - .....355 ... 00 67 . i 2 i-i ÁTOMO ■ í S i ■: i. I L E c .1 i 4 .. .714 4 O' 2 ó - 1 1 . ñ ■ i .. 00 60. 47 c ÁTOMO í C :: I LE .7 i.14 ......70 17.346 ■■..:.. ;■ i . i .0 ¿ i ! c ÁTOMO ; COI ILE c i : 4 44 .? ! j i i í , i 22 - 3.540 : .00 69.16 c ÁTOMO ■ 7 g 4 O H I L E 0 : : 4 44.0 ; . 4 7 ,271 - 4 .757 i .00 77 .50 c ÁTOMO 3 ■ cg : ILE e 1 ■ 4 ■■, .35 46-0 Vi - . 3 . ■ .0; 57-:;5 ■r ÁTOMO 3 ■ 36 ■2 ILE c : ! ■: 42.7 ;; 46 .5 :: íj - 0 .4 n ■J. Ot 63. 5

ÁTOMO T:n 0 ILE . i : : ,713 47 . i 10. :53 ^{. 00}6 ..70

ÁTOMO i 75 S ■7 GLM j 1 ¡ 3 42 .8 14 : ' . : 7: 5 9 .352 i .00 S í .20 1? ÁTOMO J 793 :... GLM 1 i ? .. : 7. '12 . . ; ; ? 1. 00 ■■■ .00 c ÁTOMO ^,......■ i. GLM c i i 5 43 . Ü 74 ib .-..'C ■" .342 ... 00 71. TI c ÁTOMO 33 en. CG GLM c : ! 3 ? > 3 i i . ' 15 - 7 .362 ' .0;;. ? b . V c ÁTOMO 3 '0 - co CLÍJ i : 5 4 5. S 15 40.136 . 6 ;e 1.04 7b . 6 c ÁTOMO e .:: 3 O’C l GLM 2 1 i 3 ." ^{5 2}47 ,576 •:. 7 o i ... 00 6Si, '.. G ÁTOMO ...... GLM : l i . , ■:■■ ,172 4 . t: >; 7 8.340 i . 00 1 .. 43 íí ÁTOMO 3805 c GLM CJ i. j 4 j .. :■ 7 46 36 -7 .71 3 i . C '■ ⁰ 81 c ÁTOMO 0 GLM í ¹ : 5 - .. .350 45 7. 3 6 . ü 3 : i , 00 5 i . v; ⁰ ÁTOMO 3-80'? ⁷ I:YS c : l; 6 .4 62 4 ,057 S .7 i 6 1 , 00 84, 66 tí ÁTOMO 3303 LY3 ⁰ 1 i 6 i i , : . 4■■ 46. 13 ■ -7.8 53 3 .0( Ú á . ,7 c ÁTOMO SO v CE LYS c 11 8 38. 4 ■ -.73 6 .7 i 6 ... 00 84 ,4 c ÁTOMO 3813 ⁰ L Y G e ¹1 e 38.2 ... ■ ..8 - 8 . 5 S 1 .00 SO .07 c ÁTOMO ■ SI i O LYS c J. i 6 i f .684 46 .34 : -9.7 7 ■ ...0 ! 94 . T: O ÁTOMO ; ■ K ASP c : ! ■ i; 7. ' .5 i , .356 3 .932 : .; ^{¡ 0}60- 34 n ÁTOMO S 3 : 3 A S F 1 i ■ 36 .722 : .. i 40 5. 6! ¹ .00 '■■5. ■ c ÁTOMO 33 ¡ 1 i tí A S ? ; U ' " J í .480 ¡3.341 -5 . ; ¹ .00 5 c ÁTOMO 3 ■ ■ : 3 CQ AS? - i.:. ‘ 34.7 48 44.964 0 - 14 ¹ .00 74 10 c ÁTOMO 3 i ■ ^ijDI ASF 7 .1 i 7 35 . . S i 1.151 -7 . ¹ .00 70, ' 6 0 ÁTOMO : S i ? OC¡: A S ? c i i 7 33 ,f . ;73 43 ,475 :. .127 ₁ .00 ■6.7-1 ₀ ÁTOMO '■ S i 7, C ASP 1 17 37.078 Í 4.442 - ..... i 76 ] . O^í. 60 i ! c ÁTOMO 3 ■ ■ i ? 0 A S P i 1 : 30.8 60 ■i - .425 - i 2 .: -!" : .00 6 ■ 2) 0 ÁTOMO í 830 V ARG .1 • b 32. 635 : .4 S i -12.7 ‘ 0 ¹ .00 5?. ■ Vi ÁTOMO 8321 C i A RG 3 ¹¹ 37 .125 ¡5.343 -13 .3 -i : .00 76 . SO c ÁTOMO ; --32 CE ARG C ^{1 1 8} 38. 5 j O 44.064 ..2.3 48 . .00 5- . s¡.: c ÁTOMO í i ■ 3 .0 ARG C i : s 40 ,2 i ¡4 .0 55 - 1,3.8 4 ? ¹ .00 6 b .98 c ÁTOMO : 3 M í □ ARG : ! ■ S 41 .261 42.5 i ■ . .285 ^{1 , 0 0}54 ..54 c ÁTOMO 3 i ARG 2 i. •' 40.4 50 : .1.744 - i'3 . 5'' 7 1..00 34 ^{I I}ÁTOMO s Ü iS e s ARG C i ¹;■ 39 ,8 3 tí 40. 75 7 - . •: 1. 00 ^■7:■.51 -■ ÁTOMO 327 : -n ARG c i 18 7. .. 32 ■L i . , .'7 ■ ... .387 i .00 6 i . : 7 w ÁTOMO :T28 ¡^th: ARG : ¡ : fi .11)0 35 ■ 77 - .13. nv'i 1 , Ot 6? 09 ¹; ÁTOMO ■: " i r ARG 0 1 : 37 .( ⁷¹45 . i 66 - 4.456 i .00 53 . 53

ÁTOMO s 30 7 ARG ; ¹ ¡ 3 37 .455 13. £ ' 6 ' 3. 63 í ■ .00 : . 77 ⁰ÁTOMO 33 3.1 !■; THR ■ 1.:.9 35.7 75 45.52 i 14.150 ■j.. Oí) 57 , í ¡ n ÁTOMO 333 ■ OJ . THR C i 9 34.7 '3 45 ,87 J ¡5.158 . .00 '? . . 7.7

ÁTOMO 9 i 3 '. i THR c i i :1 33 .-... 4 . l ! í i - 14.152 . .00 63. ;o c ÁTOMO ;■ ^{3 3 1}Oí ■! THR : ■ ... 53.17 4 45.5 6 - 15 - ¡ _{1 , 0 0} 55. • O ÁTOMO C02 THR C 1 : ? 3 3.4 PC i ó . 7 i) i ■ . 91 i . .00 66. ,6 Q ÁTOMO i ■ THR c 5 : i 34 ,4 n • r .78 ■ -15.328 ■ .00 56 . : 0 C ÁTOMO 333 ■ ⁰ THR C ! : i' 54 ,6 i- i 47. .135 ■1.464 ¹ ,0( 7 T jé 0 ÁTOMO ¿3 ;S FHE c i.20 33. 65S .; .761 ..6.4 36 . .00 ■5 v ■ £0 H ÁTOMO 5833 O’t FHE c ! 20 35 . : 33 77.1 . G - 6 . - 22 , .00 6 i . OS C ÁTOMO ; 3 í 0 ■' i FHE ■’ ^{1 2} Ú ¡ 4 . i ■■'■i i ;' . - - 17.263 i .00 ^{V .}. ^T.c ÁTOMO 334.i CG FHE c ¡ 20 .: ⁷. : : . .53 ■ - 3.555 ^.1 . Oí ■b i , .7 b c ÁTOMO 8342 c c l PHE 7 i 20 ; 7 4 :. 6 : - ' S . 77 i .00 66. 54 f*

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ÁT O M O 337.1 e T Y R :: 1. Í 2 170 4.1 .1 5 " .. 0. G : r 1 . Oí) 5 - . c ÁT O M O 3 3 i ■ 0 T Y R C i 4 , ■■■ . 0 S1 40 .162 ¡ 8 .338 . . 00 ■ . / i 0 ÁT O M O ' 0 ■ 3 FT A L A c 14 4 : , 327 4.7. 2 71 - ■ : 0.5 J . c . .00 57 .50 Tí ÁT O M O ;■ O--.! í h A L A : 14 j 7 í 4 2 . 5 4 - i- 5 i 1 , 00 6 1 . 38 c ÁT O M O 3975 e s A L A C I 4 4 5 .7 ■ . ■i i .673 ■ 20. S I ■' 3 . 00 11 , c ^{ÁT O M O}c ^{A L A}C ^{.1 ■: V- ■ , ' 52 í ' . 0 -1G - ' '■ . 5 i 5 ■ , 00 65. ' 3 c}ÁT O M O 1 ■ V 77 0 A L A i ; : 1 4 - i . í i ! 3 : 0 . L i e 1.. Oí á i ■ 1 ■ 0 ÁT O M O . ■■. ¡; T Y R C j. .OI 16 . ?2S 44 ... r ; 1 8 . 73 . . , 00 7 0 . 28 H ÁT O M O 357 3 e s T Y R C 1 i _{4 7 .} - 38 4 5 , 7 52 - 6 .4 ! i . 00 7g , í ; c ÁT O M O í 530 C B T Y R " 1 i 4 Í 6 43 .020 - 1 6 . á .. J .. 00 7 7 . •„ c ÁT O M O 3 0 ' T Y R _ci 44 47 . S 3 - ■■. 335 - 6 . ■ 1 _{J . OC J 0 5 , 2}c ÁT O M O o 332 e D i T Y R ^-i ■■ ■■ 4 ' 0 43. >85 6 .363 1 . 0012 0 .38 ■f

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ÁT O M O ' 32 7 N í í E T V 254 22 . • 2 25 .232 • : .. 1 . 00 54 * 36 fí ÁT O M O ?24 C A K E T c 2 31 277.16 , - 9 . ' 4 - 2 i .61.7 i . 00 5-1. 30 c ÁT O M O : 823 C B M E T c 2 44 21 7 26 , 2 5 S ' 3 .16 9 i , 00 02 c ÁT O M O : 8 \ : CG S íE T c 254 2 3 . 645 87 . 2 81 - 3 4. 492 Y ^,00 ■7: : . 53 V ÁT O M O ■ S 2 " £ D H E T V Í S 4 24 .247 26. - 6 67 « 30 , 55 2 1 * 00 63. 77. c ÁT O M O ;3 : 2 .4 23 . .22! 5 6 . 9 2 . ■113 ; , o o 66. : c ÁT O M O ; 82 & :■ : s 4 2 7. .. 65 2 6 ó 37 - 7.5 , 7 7,7 ... 79.7 57 (■ ÁT O M O ■ : 72 0 M E T c 254 .97.57 ■ : . i ■■ 36 , ■: J 2 1 * 00 : 7 . i ; 0 ÁT O M O 9831 N A S P ' : s . :.: . s ;. o 24 .787 ■ - . S 3 ■ .. . 00 56 . -O l i ÁT O M O , C A a L P ■ 5 :■ 14.4 51 'i-i . i 46 - 3 1 .05 ; 1 . :■ 3 . 4 ■ c ÁT O M O ■ ■ ■ :■ CH A S P c ' ■ ■ 2 4 . o c n ::.7.2 39 -7: , 0 73 . . 00 51 . 75 r ÁT O M O i Ofi : . : :c 2 75 2 i . S 2 5 i. i . 754 ■5 , >4 1 , 00 6 7 .64 ■ ÁT O M O 9836 ODi ■ r Q 2 3 S .77 ^{. -}.... 21 .8 ^■:.7 .38 ^.9 7 i . 479 ^{6 4 . :} O ÁT O M O ^■:: 3S OD 2 A S P ^"2 5 2 7 . 335 2.1 ^..........-- 3 5 . 2 6 6 I. .00 6 ^{7 . 8 7}O

Á T O M O i v i : .2 i . 1 L E U C 29 5 .........- ■ 4 - 0 , :: 77 ■■ ' 7 . . 00 6 7 . 0 0

Á T O M O e n : L E U C 29 Í 3 0 , 4 4 í ■' 3 . 8 1 7 - 3 >. >. 5 "i i . 00 ■i i . 80

Á T O M O : : ■ 5- i í L E U : 2 3 8 : 2. . í i ¡ 3 4 2 . 0 4 0 ■ ■•■. 182 i , 00 6 i . 91 c Á T O M O K . 55 o L E U -- 2 9 F.¡ i . 9 S C ¡ 1 0 33 - 2 9 . 7 18 1 . 00 7 8 15 O Á T O M O ; : : ' s o ■: L E U C 2 y o S C 4 3 . 0 -53 - 2 9 . 8 65 1 . 00 67 , H Á T O M O i 57 C.6 L E U C ¿ 3 9 . ■ , . 1. 4 3 . 1 - ; s , i . 00 . 52 c Á T O M O C- J L E U i .......... ■. 054 4 4 i 9 i - ' i 1 , 0 t 6 ? 12 c Á T O M O I i L 53 G L E U c i- . ' 2.3 . 5 '■ S i . 1 4 1 - 2 8 . 9 6 5 1 . 00 7 1 . L1 c Á T O M O i v ' 50 c n i L E U ; 2 3 7 2 3 . ..07 : : . 0 5 2 6 . 3 9 4 ■ . 00 8 0 . 11 c Á T O M O .. : s i e n : L E U .2- 2: :i 9 2 S . 07 4 . 7 . 9 l ; ¿ 8 . a c e 1. . 00 72 ■:" Á T O M O ; c L E U C 2: 93 2 0 . 0 24 4 5 . 0 6 0 - 27 , :: -j 1 . . 00 6 ■' . 34

Á T O M O .1 '■ i 5 ‘ 0 L E U C 2 ■ 9 . 0 , C 2. 7: v i : . 361 - 2 C .5.7 “ . . 0 0 6 . . ? C O Á T O M O : : --i i : I Y S : 50 0 1 9 . 0 ; í¡ i • i: 7 ■ 7 . 9 5 (: 1 , 0 0 69 ■ 80 í ¡ Á T O M O : 2 . . ' 3 L Y 5 ■2 ■:::n 17 . ■■ '■ J 4 3 . 76 - > 7 , 1 6 7 1 . 00 7 5 , 0 0 c Á T O M O i j • •. '■i L Y S C ' 500 : : 7 “ . ' 4 ■ - 3 7 . 6 66 . 00 7 5 . 5 3 c Á T O M O ! ■ ■ 5 ■ ■: o L Y S i O O 1 7 , 5 ; ; ■ 4 6 . 8 1 2 ■ 7 ' , 2 39 3. , O- 7 5 . I - ^■•■Á T O M O : .. . 0 S C D L Y S i 20 0 15 . , : ; .v 4 " . 4 31 .. 6 . a 2 2. . . 00 S O . 3 . ■i Á T O M O • i 5 3 e s ; L Y S C ; 0 0 : 5 - 7 •: v ; . i ■ 8 - 2 7 , 2 1 , . 00 8 7 , i ? í ; Á T O M O : ^{o í}; o i" 22 L Y 5 ■’ 300 i 'V . 2: ■■ 3 4 ¡ . S ■ 4 - 2 6 . 9 3 1 ... 0 0 50 . 324 1 : Á T O M O : : 7 1 0 L Y S c 30 0 i ' . 05 " - 1 - 12':' . 9 6 i, .1 . 00 7 ■ , : 9

Á T O M O ^íO L Y G c 30 0 16 ■■ 42 . 7 : 6 ’ ! . 9 4 3 i . 00 7 7 , 34 ^A

ATOMO i S ‘ tTE LYS IV: 3$ ■ 15 }. .437 56.4 3,5 : .00 55 i 2 rí ÁTOMO i O í s i ‘ ’ LYS ■ 05 i . ■'.1 S : ¡: . c u ? - - 4 1 .00 í 1. 04 C ÁTOMO i " íáí¡2 0 LY£ c »4 l í ■ i í i; ;... -:. i 31. £44 1.00 5? . í ü Q ÁTOMO j. ■ ' 6 U A L A í; ? 5 O 37.8 4 ? ■■ : .; - 5 .9 ? 0 1 . Oí 57 . 60 H ÁTOMO i 36 - - CA a l a c o i s 37.0 S 4 45 , 136 5 2.79 7 . . Í'O 5 :..66 r: ÁTOMO : O í 53 CB A L A ■r i 513 1 V 504 . e ... ■ .6 6? 1 .00 36. ■ 7 c ÁTOMO i .. V '.i -J c 0 fl 5 37.1 ■ 7 4 b 016 54.006 ... 00 5 ■ 14 ; ■ ÁTOMO • - ■ '■ : 0 A L A c 3 ' : 5.0 7 i ■] v .56 ^j- 54 .' 1 , 00 64 . £8 ■-ÁTOMO i.OÍ i N C Y E 1 <3 je •. .5 : = ■ 54. i 56 .. .00 59. ■ '■ N ÁTOMO _i:_íü- CA CYS c 5 5 r 5.1 14 . ■; ■ 55 ,373 1 .0: s 5 ..: i c ÁTOMO : 06 ■ :■ CB CY.B c " :':- 3 4.5 65 - i 30 56,1 65 7 .00 6 Ü'j r ÁTOMO ; 06" i s s Cy S c : ■; f, 35 . . : 45 .632 .56 . SI :: 1 .00 ' 0. 80 vi ÁTOMO i V ■ 5 ■ CYS € :: :■ . V 55 . 51 i . 00 6 . ■ . c ÁTOMO ; ; / i Ü CYS c 31 :5 5 ..85 4 • : . .. 35 , i . 905 .00 60. 5 : O ÁTOMO i 0577 ASM c := 36 - i t í í i 5. . . 1 -■ 56. : 04 1 .00 5 ' . 92 w ÁTOMO 10573 c ■ ASE c y o ■' , a 01 . 1 • ■ 36.022 ] .0( 53 . L 7 c ÁTOMO : 5 7 ? C :■ A S E c :¡ i ■ .34.440 r ! .735 5:7. 9 ■ 6 . .00' .:. . i

ÁTOMO i 0683 c a ASM c : 57 33.4,0 5 5, .913 -■ 56.1 'i 1.0 0 . 35 c ÁTOMO 058 i. ASM Q O í? V ,7 45 :-5 .2..2 - 56 .: • .. 00 4 ? . ; s 0 ÁTOMO iOSÍiO :ÍD2 A S E ■ -■ 3 ■: ■ 34.023 55 .: 5.2 58. 1 SS ... Of ■;S. • H ÁTOMO i 06 ■ c ASM c 35 r 36.■ . ■ • .122 ■ 34 . . • ■ .00 • .27 C ÁTOMO 1 "584 0 ASE c 3 V 3¡ .0 >6 5 3.041 54 . i ; ; . 00 31.29 0 ÁTOMO : 0685 LEO c o :í 8 3 .7 ■ 51.32 a - 54.5 1 S ' . 0: 36- M ÁTOMO j. CA LEO v v . .0 ■£ 32.139 - 5 . 41 ti ■ . OC 56. 09

ÁTOMO : i ' : - - CB LEU c .. fi.fi 2 51.01 0 52.4 ¡6 . .00 : 4.24 £ ÁTOMO i . s S 3 CG LEU £ : : " . 7 , i 60 . 0 : I-' .7 36 1 .00 5 i . 0 ; c ÁTOMO : - - v CB.l LEO c : ^{í í}> 38 . ' V: • -527. 7.73 •. 00 53.04 c ÁTOMO 10 ; u CD¿ LEU c : v. 36 . ’ 57 " .1. 31 - _{s í}.: i 5 :.. 00 52. 49 c ÁTOMO 10551 LEU c OÍS . . . 5 2.7 01 - 5 i .6 7 ■ . OC 51. 03 c ÁTOMO : OS<5 - 0 LEO c 3 0;- 40.3 01 52 . i .52 i . ' 7 .Oí i . . ' 0 ÁTOMO i 0 i 5 J K ASM c r 5 o 10.171 • . . ' 3.. , 6 10 .. .00 ^í. tí ÁTOMO O í !4 CA ASM c V i ' 41 ,404 .. . Í6 4 ..:. .1 .. .00 3 >. 1.3 c ÁTOMO 10155 CE ^{A SM} c 355 4 j. . I ^g; 55.9 2 ■ - 4. 615 1.. C '■ ' c ÁTOMO : CG ASM c - 40. :4á 50 '51 55.9 7 : 1 .00 57 i-: c ÁTOMO : 06 '■ ? OBI ASM ■' 355 4 C .668 55.0 40 - 56. 64 i . 00 ' 0 ÁTOMO !.: ; ! HD2 ASM ■c :■ 65 35 .£ 53 57. ( ■ ■; 56.30 ' i . Oí ti ÁTOMO 13 SUS C ASM c 3 j ...... ;25 34 33-Í - 52.925 /.y 54 OS c ÁTOMO ; o ASM c ■: 5 ■■ 41 .7. 1? '. : . ■, 5 c -51 . “ 1 “ ■ .00 6 . C^e O ÁTOMO i V 0 i tí LEU c 570 4 ' .6.. 6 S4.0 70 - 53.201 J. .0! 5. ...5 K ÁTOMO ; CA LEU c 370 44.6 42 53.ÓQ3 . i 78 7 . ! ¡0 40. . ■' c ÁTOMO : 0 7 CB LEU c 3 70 43.0 : 5 52.6 1 í 51.601 1 .00 4 .. Oí c ÁTOMO 10 nV.n V2? LEU c 0 •• ■ ■ ■ ■. ■ 5 'i 51. 552 : . ' : 9 ' 1 .00 41 . 36 c ÁTOMO i .. CD1 LEU c 570 -7. . -,::1 :V . • 5 3.763 7 .00 42 c ÁTOMO 107 j¿ CD2 LEU Vi- 570 44 .500 50.7 - 5 .4 32 • .00 4 . 30 c ÁTOMO 1 í'j’ywh ^t c LEU c 070 40 ,330 :. :. 9 SS -5: .0 á 7 .00 5 !. 36 c ÁTOMO 107061 O LEU c 570 . 037 5 5.478 - 53.0 51 1 .0 : “ 05 O ÁTOMO : 0 ■' 5 tí I L E c 57 . 40.72 ? 35. ¿3 ? ■ 50.9 00 : .00 • 1 i H ÁTOMO 5 CA I LE c 5 1 46.¿ 11 56. 13 - 50 . £ 63 1 .00 6 .. 22 1 : ÁTOMO i : t 11 CB I L E c 07 .7 ::: á S .O ' í •' - 50 .7 : .00 s . s 1 c ÁTOMO 10 !12 CGI I L E c 3 y 2. .. .. r 5S . : 1 49.2 . . 00 . 09 c ÁTOMO ; o : ■ CB I I L E c 57 ■ 46 ,370 55.3 42 - 4E .544 1 .00 S í ; . 19 c ÁTOMO :: ■ : i CGC I L E r- 07 ■ 44 ,4 36.052 . 656 i . 00 ÍÍS. ; 5 c ÁTOMO i ■ 7 : 5 c I L E c }7? , SOS -¡ : - 49 , 82 1 7. .00 ■ i . Í0

ÁTOMO ;: 7 i 6 0 I L E c y- ■ 17 ,077 • . & . ■ - i i - , fi 5 ■' i .00 6 .03 0 ÁTOMO ■L -J 1 Jm i tí GLY 071 , 755 57 .11 6 - 30 ,0 52 1 .00 ■) 7.6 M ÁTOMO : ■ i i CA GLY c 372 I r i - 45 , : 10 7 ,0 t 62. ■ 2 i ' ÁTOMO 1071 o c GLY ¿K 3 "■ 30 .612 55 . : 68 - 19.560 1 .00 6 í . 51 C ÁTOMO 10:7 Ü GLY c : ? ■ V. ,05.: 54 . £ 6■ 30 ,504 .00 54 . 0 ÁTOMO 10721 tí AEG ■ 37 S 51.6 73 5 .2 S 4 8.766 ;.. Oí) 62 . 3? R ÁTOMO i i) ' CA ARG 573 ¿o .4 n 34.1 1 19. 0 34 . .00 6 r ÁTOMO 1072 Ti ^c;^bARG c 573 ¡ : . £ 46 54. oes 49.51.6 1 .00 ? ^{L .}Í0 C ÁTOMO : : ■ M r+r* ARG c ?7 34 .0 i 5 5 ; .2 - 51 - 002 1.00 80. 59 c ÁTOMO i 0 ■ 20 CD ARG c 573 ¿ 1.0 J 4 : . 3 i a ■ 3. . ■■ ■ S 1 .00 ^ •' .37 _c ÁTOMO i : • • KE ARG c 373 : : . ¡ r ■ .057 - 5 ; . i ■ .00 i . 39 w ÁTOMO i ■ 727 C'á ARG c 07 . 56 ,555 53.■ . ■ 62.0 • . j .. Oí 1.C7.67 c ÁTOMO : .. ■ 2 ■ ÍÍHl AEG c 37 3 57 . : V 7 : . : ." 53. . . . 00 i e v . ¿o K ÁTOMO ;07 ■ 3 m z ARG c 373 55 ,610 52 ,916 - 53 , 42 . .00106.17 K ÁTOMO L 0 ■ 33 c ARG c : ■' ; i . ..: 53 .015 4 ■ . ■' 5 S 1 .00 i ? .91 C ÁTOMO i 0 ■ 31 ⁰ ^{A E G} 3 3 3 ‘ .15 ■ 53. ' 16 - 16. 7 S'7 .1.00 57. ■ 9 O ÁTOMO í o ^{V i} PRO c 5 4 ¿ 2.443 51 .7 •• 4 £ . 3 ■ ■. 00 52. ■ i tí

ATOMO í.0303 ₀382 , 1.4 42 •i ' - 35 - 467 I .⁰£) 52 * 39 c ÁTOMO 10804 e s PRO C 381 52 ,059 ■i-: , 4 i i - 37.21.5 I ._{0 0}51.1 5 c ÁTOMO 10S0Ü CG PRO í 382 ¹¹r i ²⁰4 0.511 - 6.159 _{1 , 0 0}:.... 04 c ÁTOMO 10805 CO PRO <; _{? 8}? 49. 769 : ; ^{7 . 7}- 36.7 ¹ fj i . Ot 50- -,7 c ÁTOMO 1080 ? r~ PRO ■i 51 £ • _■1...... ₁₂ " 35 , _ .^{0 0}51...⁷c ÁTOMO 1.0808 ₀FS ■ ■ 3 So! 51.22 3 5 ] ' .3 51 ^{1 . 0 0 66 0}ÁTOMO 10809 GI,Y 383 ^{. 2}. :■ 24 i ": 713 -40 ' , 3 :: ... ^{0 0}7- 47 íí ÁTOMO 10810 i_A GL“ c 'i ⁸3 53.2 31 40.1-12 -41 .65í _{1 , 0 0}5⁸. 57 c ÁTOMO 10811 C GLY c 3 -I .633 40 . 219 ■ 42 . ' 35 .. .^{0 0}57.15 c ÁTOMO 10912 O .... i ₈3 57 .₁3 ■ ! 5_{. 8} f S I . Üt 50. • ₀ÁTOMO 10813 N TYR : 334 7. 5 • 41.6 76 - 42 , 504 ■.. ^{0 0}9- ^{0 2} n ÁTOMO 10314 .■.i TYR ;■ : 50. í l i 42.4 78 1 3.4 SC ; . • 5 ^ .05

ÁTOMO 10815 C 3 ; v : 3⁸4 . J ■ i: ,ü 53 ' • 534 i . 58 .31

ÁTOMO 10816 CG TYR c 334 í í .^.153 42 .713. - 44. : 50 ¹.⁰(j ⁶7. i i c ÁTOMO 1081 ? COI I 4 K ; 384 .9.9 O ,4 63 - 45.499 ^{1 . 0 0} _{6 6}' . i " ■ ■ ÁTOMO 1081⁸CE1 p 384 4 9. i ^{; 2}39. IE S - 16. Ü 32 ] . Ü( 63.00 c ÁTOMO 10819 O ■ TYR 334 4 8. 72 i 3fi .129 45.204 .. oo 9. . ¹²V ÁTOMO 10823 Olí XYT. c 3".: ■ . ■ : 5 . .836 - : . 7. 7 ^{1 . 0 0}.-. i ? ü ÁTOMO .1,0821 ■: • TYR 7 o 84 48 - 558 38 ¹3⁶ X - 47 . B ₆; .. ^{0 0}7.. .⁶c ÁTOMO 10822 ₀D₂TYR c 334 48.30 2 3 S . : :;. ■ !.:■. : 16 ₁, Q₀61.37

ÁTOMO 10823 C TYR c 334 51. 193 4 5 - • ' fj i l .00 ²■ . '

ÁTOMO 10824 O ! i !-. ■o 384 81 - 56 j 4 . 4 4⁶“ 4.7.(109 : .^{0 0}53.77 ₀ÁTOMO 10825 M ALA c 38 > . ■■■. ¹44.7 -.2 ~ 44^{. 5 0 6}■ , ₀¡ 5₁.83 lí ÁTOMO 10826 CA -■ .: r- 385 i ■ .36 1 46.159 - 44.222 ■. oc 52.93

ÁTOMO 10827 CB . ....'. ■- - 385 32 ,4 46 * $ 36 46.236 ^{. ....}■ S C ÁTOMO 10828 c ALA o i 33 5C .2 : ⁶. 97 14.7Í) 3 i .^{0 0}- - . - c ÁTOMO 10829 V ■: T.A ■: i 33 41 ,314 :: . 12 -- 45 - 563 5 .^{0 0}55. 77 i-ÁTOMO 10833 tí TRP 386 i S .7²: : 47.889 - 44 .3 ⁶■ ^{1 . 0 0}5 í . 32 M ÁTOMO 10831 CA TRP •; : íi ⁶í. .4 53 : 3 , 7 ■ - 44 , i ²²■ . oc 5 i .. 0

ÁTOMO 1083 ' o TP P o 336 .. ; . 7 £ I : ⁸.9 ■:: ^{- 4 3}^ 32 ^{1 2 2}5 i - • ’ ’ ÁTOMO 10833 CG TRP 386 '.-2.2-2 49 . : 9: ■I .²37 ... ^{0 0}: ... 5 t

ÁTOMO 10834 C _{0 1}TRP c 386 49 . ..60 4: ,11(3 41 ,5.. ¹... ^{0 0}52 , 93 C ÁTOMO 108.35 tíEl TRP ■ 3⁸• 45 .. ²50 133 - 40.60 9 I . i ■' 53 a I! ÁTOMO 10836 ■ TRP í 336 . 83 v ¡ . 41 , 151 ^{1 . 0 0}53 47 c ÁTOMO 1.0837 c ^d: TRP ■' 3_{8 6}- • 61 _{, 0 2 0}-44 .296 i , _{0 0}c ÁTOMO 10835 r*r«» TRP c 3_{8 6}45 , 157 57 ■ - ? 4 43.0 ■ ! j . Oí 50. ;5 o ÁTOMO 10839 CZ¿ TRP r-' 386 ,548 35 ' 42 , 725 ... ^{0 0}50.56 c ÁTOMO 10840 CHA ; ^{r p} c 386 - ,5.3 17 Fi . s ⁷- 41 .Sí* 9 _{1 , 0 0}5:.. 77 c ÁTOMO 10841 ^{C Z 2} TRP " 336 4Í .77. : 52 . «18 - 40.82 E J. .⁰! 50. c ÁTOMO 10842 '■' TRP c 386 43 , 6.5 49.79-- “ 45 , 44 ? : . : ¡ü 5 ’■ . i ? c ÁTOMO 10843 0 TRP "■ 186 ■ 9.555 50 , ■ > - 45.27 3 ) .^{0 0} _{6 0}, ⁰ÁTOMO 10844 [T ; • p c 33 4 7.645 ₁i , 553 - 46 , 380 ^{1 . 0 0}5 . ;¡7 i ÁTOMO 10845 ■ ^{T K R}■ 33 ■ 47 , 5 : 9 51 , 137 - 47 , 148 ! .^{0 0} ₆- 60 c ÁTOMO 10846 CB THR ■. :37 47.6 7¿. 50. 9 5 - 48.6 ' . i .^{0 0}53.67 c ÁTOMO 1084 ? OGl THR c 58? 45 ,1 5 0 , : 79 - 48 , 9 - A . ^{0 0}5 ? . V ^{2 ■ ■}■ ÁTOMO 10840 ■ g : THR " 58? ¿ 1.496 52 - - i 5 . 43²] .⁰⁰5^{0 7 7}c ÁTOMO Í08.49 c TÜP- 387 46 ,1 60 31 ¡ - 46 ,9.50 : ._{0 0}50 . i l ■ • ÁTOMO 10850 ₀ ^{TH R}'■ ₈■ 4 5.2 56 60 ,354 - 46 , ' >: ^{1 . 0 0}55 , 44 r -. ■ ÁTOMO 10851 VI VAL : 588 .97 : 5 ' . , 53 - 46.81 5 4 .^{0 0}4⁶. ²- B ÁTOMO 10852 ¹VAL ■ 333 44 , 650 33.5 15 • 9. ¹59 . .^{0 0}; - . i $

ÁTOMO 10853 ^{C B}VAL c 44 , 854 54. 17 íi - 4⁶. i ²7 i .^{0 0}: . : c ÁTOMO 10354 < i ■ AL ■ 538 4 3 , 5 ■: 5 35. 7E7 - 46. : 2 i , _{0 0}44.74 ( ÁTOMO 1085 S CG2 VAL 383 99. i 5 :i : : . - 44.7 i ^{6 1 . 0 0}4 : : 4 C ÁTOMO .10856 c . M - ■ j .7 77 53 . ' 5 í : - i ■,653 ¹.^{0 0}■ 7. ■ ⁶r¹ÁTOMO 10857 0 i c 336 44. : 14 5 3.5 3 - 48 :• . i .00 45 .1 ■ ■ ÁTOMO 10358 tí ALA -■ 339 42. ■ ¡ 3 Ó13 ^{- 4 7 .}701 ■i , ₀( -43.15 i; ÁTOMO 10856 CA ALA ■■ 389 .565 52,. 960 - l í ^. ⁸7 ■ I .^{0 0}Sí . 92 c ÁTOMO 10860 CB ALA : 3 .• 4C .098 51. 5 ■: 3 48.91 i ■ .^{0 0}51. 52 c ÁTOMO 10851 c ALA ■ 389 . ^, :í¡ :i i ^. 9 l - ^. • • • _. oo -52. 9,:

ÁTOMO 10852 ⁰ALA 339 3 S , i ⁶i ^. : .9 : ' 4' .4 75 ^{. .} ^{0 0}53. 57 ⁰ÁTOMO 10863 ^HGLtJ ^{1 10}40.0 SO 84. 7 1(1 - 4 S .637 ¹.^{0 0}5 C . .2 B ÁTOMO 10864 < h ^{O H :} 590 3 9 ^. 858 55 ^. ^{5 5 2 '•}5 ^’ 2 i , ^{0 0}50- i 5 ⁹ ÁTOMO 10365 C E 5LW ^■ 390 ^{3 9 . 1 S I ■} .056 ⁱ S ^, 5 ⁱ! .00 50.2 0 £ ÁTOMO .1.0866 CG GLN _■ 390 _' o _{, •;} s 57 . 1 ^- i ^{5 .2 2 ‘} . 00 55. o; c ÁTOMO 1086 ? _{C P} ^{G il¡} 3 90 ^{» , , 5 'T;} 58. Í 58 4 5 , 380 j.. Oí 54 ^{- JÜ} c ÁTOMO 10858 ÜE¹GLN c 390 _{1 1 .}159 56 _■ 563 ^- 48 ^, 132 . ^. ^{0 0 5 1.} ' i ’¿

ÁTOMO 10863 ^. OiA¡ c ^; 9^{0 4}o 5 ^i. .5-15 ^- 50 ,03 ^■' , . ^{0 0}5 B ^{6 5}

ÁTOMO ^{1 0 8 7 0} c GL13 ^{■■ :} 9⁰í ^! .871 ^{5 • . 2 • 2 - 5 0 . (31 1 .0 0} 51. -.. c ÁTOMO ^{1 0 8 7 1} 0 _{GT 11} ^• .i 50 3 _{. 2 20 5}i . _{S ‘? ■} - 51. 736 _■ .₀i ₅ 2 _{. £ 1}

ÁTOMO 10872 ^M _{• ••} c 16 - _"'. 9 5 ₅ . 50 _{- !} Vi I ._{0 0}50.35 ^K

Tabla 7. Coordenadas atómicas para CRBN (TBD):CC-220 (proteína murina)

E N C A B E Z A M IE N T O aXXX C O M P U E S T O ^{O B S E R V A C IÓ N} 3

O B S E R V A C IÓ N : R E FIN A M IE N T O .

^{O B S E R V A C IÓ N} 3 P R O G R A M A : R E F M A C 5 . 6 , 0 1 1 7

^{O B S E R V A C IO N} ■ ^{A U T O R E S}: H U RSK UD OV, VAGIW , DODSOIT

O B S E R V A C IÓ N 3

O B S E R V A C IÓ N ■ D IA N A DE R EFIN A M IEN TO : M Á X IM A P R O B A B IIL ID A D

O B S E R V A C IÓ N 3

O B S E R V A C IÓ N 2 D A T O S U S A D O S EN E L R E F IN A M E N T O .

O B S E R V A C IÓ N 3 R E G IS T R O DE Á T O M O S CONTIENE S O L O F A C T O R E S B R E S ID U A L E S

OBSERVACIÓN RANGO DE RESOLUCIÓN BAJA DE CLASE i . Í50 OBSERVACIÓN REFLEXIÓN DE CLASE (CONJUNTO TRABAJO) üí i OBSERVACIÓN COMPLECÓN DE CLASE (TRABAJO ⁺ENSAYO) ^{( fe}}

OBSERVACION ^;VALOR R DE CLASE (CONJUNTO TRABAJO) 0 _{. ', :: '}OBSERVACIÓN ³RECUENTO DE CONJUNTO DE VAOR R DE CLASE 35 OBSERVACIÓN VALOR R LIBRE DE CLASE ^{0 . ■}OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN _•NÚMERO DE ÁTOMOS DISTINTOS DE HDRÓGENO USADO EN EL REFINAMENTO.

OBSERVACIÓN TODOS LOS ÁTOMOS ^{: 1 Í 1 C}

OBSERVACIÓN ^JOBSERVACION ^:VALORES B

OBSERVACIÓN _JDE GRÁFICA DE WILSON ^{C A * * 2 ) ;}NULO

OBSERVACIÓN ^:VALOR B MEDIO (GLOBAL, ^{A *}* 2 ) ^{: $2 >954}

OBSERVACIÓN ^■VALOR BANISOTROPICO GLOBAL

OBSERVACION OBSERVACIÓN ^JOBSERVACIÓN OBSERVACIÓN ³

OBSERVACION ³

OBSERVACIÓN .3

OBSERVACION OBSERVACIÓN ERROR DE COORDENADAS GLOBAL ESTIMADO OBSERVACION i ESU BASADO EN VALOR R 0 3' OBSERVACIÓN 3 ESU BASADO EN VALOR R LIBRE : o . i ■ OBSERVACIÓN ■ ESU BASADO EN PRBABILDAD MÁXIMA ■ : 9.20.3 OBSERVACIÓN 3 ESU PARA VALORES B BASADO EN PROBABILIDAD MÁXIMA 8. " 10 OBSERVACION OBSERVACIÓN COEFICIENTES DE CORRELACIÓN.

OBSERVACIÓN 3 COEFICIENTE DE CORRELACIÓN FO-FC 0 . >13

OBSERVACIÓN j COEFICIENTE DE CORRELACIÓN FO-FC LIBRE 0 . i

OBSERVACION OBSERVACIÓN -_í DESVIACIONES RMS DE VALORES IDEALES RECUENTO ^{R M S} PESO OBSERVACIÓN - LONGÍTUDES DE ENLACE ÁTOMOS REFINADOS !A) i 3 :2 ; í . 01 . .1. :

OBSERVACIÓN ÁNGULOS DE ENLACE ÁTOMOS REFINADOS (GRADOS) 22 ! 4 : 1. ? . ó ? l . . ::-i OBSERVACION 3 ÁNGULOS DETORSIÓN. PERIODO 1 (GRADOS) : 23 . g í C : ; 3.0Ü 0 OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERIODO 2 (GRADOS) ^{.. 6 . .}...i :■ ; 23 - 750 OBSERVACIÓN : ÁNGULOS DE TORSIÓN. PERIODO 3 (GRADOS) 213 2 ^,; 1 CU OBSERVACIÓN ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERIODO 4 (GRADOS) ^4a ^.: 7 :>0 ■ 15. OQ0 OBSERVACION RESTRICCIONES CENTRO QUIRAL (A** 3} ² : ; r .122 : 0.200 OBSERVACION PLANOS GENERALES ÁTOMOS REFINADOS (A) ;-L ; ■! (i ^: 0.0.14 ^,0.021 OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 RESTRUCCIONES DE FACTOR TÉRMICO ISOTRÓPICO. RECUENTO ^{R M S} PESO OBSERVACIÓN ^:■

OBSERVACION _: ESTADÍSTICA DE RESTRICCIONES NCS

OBSERVACIÓN 3 TIPO NCS ^{; L O C A L}

OBSERVACIÓN _■ NÚMERO DE DIFERENTES PARES NCS ^{. :}

OBSERVACION OBSERVACIÓN DETALLES DE GEMELOS OBSERVACION NÚMERO DE DOMINIOS GEMELOS • NULO

OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN DETALLES TLS OBSERVACION NÚMERO DE GRUPOS TLS OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN MODELADO DEL DISOLVENTE A GRANEL OBSERVACION MÉTODO USADO : ENMASCARAMENTO

OBSERVACIÓN PARÁMETROS PARA EL CÁLCULO DEL ENMASCARAMIENTO OBSERVACIÓN RADIO DE SONDAVDWJS : 1.20

OBSERVACIÓN RADIO DE SONDA ION US ^{: 0 . 8 0}

OBSERVACION RADIO DE ENCOGIMENTO : Ü .8C

OBSERVACIÓN OBSERVACIÓN OTRAS OBSERVACIONES DEL REFINAMENTO:

OBSERVACIÓN HIDRÓGENOS QUE SE HAN USADO SI ESTÁN PRESENTES EN LA ENTRADA OBSERVACION VALORES U : REFINADOS INDIVIDUALMENTE

OBSERVACIÓN C I3 F E F S E R D 413 n \ C . íjC

C I S F E P SER A 4 13 F P . O ■: I -i 0 - í¡ o

ÁTOMO 925 ti 7.7 :; A - 1 - 31 . 7 -. 7 g . 555 7: , 7 . 3 1 . 00 <7 : ■. f? _{ÁTOMO s! ; ;} ^{CA LY A}: _{- 3 5 , 1 1 i s . n ■ 55 . 1 S i l . 00 50 . L-:;}

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ÁTOMO ... (7B A3N h . , :o • .7 : 22 . í 51 34 . 3 3:: 1. 00 4 ; . 73

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ÁTOMO 8.5 ■ : PHE A 341 - 36 . 33 21 . 260 24.435 i . 00 38 .21 c ÁTOMO v i i 0 - ■ ¡i ■, 34 * 20 , 7 : : 3 24.0 67 1 . 00 ■: 1. :■ ij ■ ■ ■ ■ _ÁTOMO ^{• ' ■ tí SER A 542 - 3 7 . 8 5 2 21 63} 4 ^{27: . 704 1 .00 4 8 ;..} n ÁTOMO 35: ' • ;. s r A 7- 1 - 3 7 . : 73 - 2 277. ■: 85 : . 00 a l .38 ;' ÁTOMO 3 .4 CB SER A 3. : - 39.610 20 , 535 22 . 3 .-7 1*00 0 ■ . ■ 9 ,■■ ■ _ÁTOMO95 OG ^{SER A 54 7;}. 159 ^{: 9 . 2 ? S 25 . t 33}: .o o ■b^. ^{2 S • -.}ÁTOMO 933 C SER A 342 • • • 21. 7 1.2 21 , 241 . . 00 48.74 c ÁTOMO 559 ■) SER A ■■ 13 . ■ 55 ,72 , 7 0 . 953 i . 00 ■ 5.0 77: 0 _ÁTOMO ⁹ i ^: ^{¡2 'LiL G A 343 ■ .1 . i ■ 21 . 6 10 1 ■ j . 52 3 1 . 0 0 4 7 . 7 5 íi} _ÁTOMO ^■j ^{... C h A 1.; :■ - 3 6 . : .3 7 2 . 4} ib ^{19 . ¡ 52 i . oo 5 0 , 1 9 '}ÁTOMO : .9 : CB l e í : 7, . - 3 5 , “59 13. 62 i 8. f i : 1 . 00 - 5 . OS r ÁTOMO 36 í V. “J L£U A J i J - 3 4 .648 22. 130 , 7.750 i . 00 49 , 41

ÁTOMO 3 .14 CD.l 343 - !. : 22 ■ . 0 1 É .2 j f i ♦ 00 ■ É ' ' ÁTOMO 365 CD2 LEU A 3 3 - 34. : 77 24 , 6 1 16 . !36f i 1 . 70 45 .09

ÁTOMO 366 LEU •- 345 3 . 1. 22 , 155 7- . 3 5 . 00 ^■7^.. r ¿ á ÁTOMO 557 0 LEU A 34 5 33. .. : 2 3.113 17 . 6 i 7 i . s o O ■ ■ - 0 ÁTOMO 3 13 . G !R . 544 30 .346 20.9413 i 6 . 183 . . 00 55 . 08 t: ÁTOMO 663 CA SER A 34 1 - 3 9 , EOS 20 , $ 41 37 .3 65 J . 00 72. -¡ ■ c ÁTOMO 37 ;■ < £* .-. £(> _....344 - 36 , l i < ¡ ■ 7 .16 i S - 9 :5 i , se 67 . - 2 ■ ÁTOMO 9 í l OG SER 7, 244 ■ 39.92 ' 39 . I O S 15.51 i 3 .00 : ■ . 7 . ■■ _ÁTOMO ^{• ■ S e r A 77 i - -■ ■ 5. í 7- ' 7 . 755 ■ . 00 í í . 17}'2 ^{ÁTOMO 9}■ i 0 r. ^{=7 34.4 15 .9 ■'! 16 , G'.'}1 18.5 : ■ ^{1 , 0 ( 70 ■ ; ó}

_{ÁTOMO 97 L} il _{A L A}345 _{- 4 1 . $ 74 . 5 . 8 39}12 _,0 _{v i . . 00 62 ■ 09 l i ÁTOMO $ 75 .. A LA A ; 7 :■} ^:77 _{, 7 , 1 -13}6 _{. 7 , . 00 6 S , 73 c ÁTOMO} ^{97 fe CB A LA A : i i - 4 3 . 9 4 8 19 . 7 /} i ^{.7 .}68 ^{i . Ü0 6 3 . 20}

ÁTOMO 977 A LA A 34 :■ - 47 . 37 ,7 3 ? 17 . 656 1 .06 :7 ■ . SO c _ÁTOMO ^{'■ ¡ 3} ₀ ^{A LA A 145 ■■ , 5.61 ■} _{7 í . 856} ^{■ 77. (1} i ^{7 7 . 00 62. 78 A}

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ÁTOMO u Giiia A .. ¡ - 30 .7 !¡3 31.43 i i Í ' . 9 ■ 3 .00 tí ■ 06 r? ÁTOMO i ■!"'i C'A GLK A 415 - 2 « f , ( tí . ¡ . 5 Í 7 j 8. tí 56 : .00 3 :■. so

ÁTOMO 1471 CB GLK 7, 4 i ' ó .2 96 32.900 1 $ . o s o i . O O , 20 c ÁTOMO ] 17 ■ e s GLJ4 A 415 - 28 .8 O í 34 . i í 4 18 .185 ¡ .01 4 i .31 c ÁTOMO • CD GLt.3 p. 415 ■.. S . ■ S 7 34 , 1 g(j .. tí; . : -]■■ 1 * 00 41.34 , ■ ÁTOMO i - m o i. r; i p. 4 : :■ - 29.992 3 i . •: tí 6 ¡ o . :o<¡ i .00 43. 0 ÁTOMO ¿ 475 MJE2 G U I A 415 34 331 .. í . : 62 j . , 00 7 ¡ ■ a í? ÁTOMO , r \ C G L l í .- ! : 5 - 28 .11 . Vi . Í 8 .7 S í 1 * 00 32 . 50 Q ÁTOMO 1477 C^jGLL‘3 A ■= 15 “ 27.3 S2 .30.1 13 1 ~ . S 23 i . 00 .34.1 ■ O ÁTOMO : ■; K s A 416 ■ :> .2¡K ¡ . ^í:■ J íi .8 S tí 3 .0i 39. ■!; R ÁTOMO 74 ■ ■: CA L 70 A o - 27 • 28.527 20 , 09 “? : .00

ÁTOMO 1580 CB LYS A 116 2 ‘5. Ü 23 20 .9 r- 1 20 , tí 3 tí 1 , 00 ÁTOMO 1 ■: a .. CG L i :: 416 ■ t . o o e 23 .133 . Vi i : 1.00 ÁTOMO CD LYS A - t :. tí - 24 .3.15 25.049 22 , 676 .00 ÁTOMO ; ■I:'. L * í-} A i i -■ - 2 ;; . ; 17 30 . n 68 ■ j .83 9 1 .00 ÁTOMO ■ !¿ i ¿ - LYS ?. 43 3 - 25.911 32 . C i ? ¡ i . ■' 8 ^j1 * 00

ÁTOMO 1.485 c CÍO A 4 :. tí 2 a . i .. a 27.553 2.. .02 5 .. 00 41.06 c ÁTOMO 1 i 0 T í : ; A 416 ' 27 .944 21 . tí S 3 1 . no 39. 1 ü ÁTOMO I -1 i) ! L1: FHE A 417 - : 7 , a a ; .'.■tí..: 20 .3 3 ■ .. 00 4... 50 tí ÁTOMO .. i ; ;; CA FHE A 41. ■ - 2 a . 221 2 - . : . i ■; ......75 (! í ..0 ( ■; 7. 51 tí ÁTOMO i 1 Vi FHE A. 417 . -v ■ 24.617 ■: . ' 23 1 .00 - i .

ÁTOMO : 440 CG FHE C^l41 “ : - ' 34.1 tío 20 - 207 1 .00 37. 43 r-ÁTOMO 14 < n COI FHE A 417 - 25.56 2 ■■.733 ■o.05 : ■ , 0: 34 . ;.7 ■-ÁTOMO : ;v : CF ' :--:^k A 11 - - 30.21 S . . ; t:> S .835 ¡ , Oí 35 , 79 tí.’ ÁTOMO u n .'... ÍHLI k ■ 30 , . . . 22.9 4 ■ : ■ 0 1 .00 33 . SO c ÁTOMO ; : 9 i c ; 2 FHE A ■■ 17 ¡ í , i 67 21 .345 ■ 7.852 i .00 3 ' . tí i c ÁTOMO : e n : ? 4. 417 . ; O í 24. - : ^í1 >; , 08 5 .00 7 , . . I ■-ÁTOMO 1 c FHE A 117 • ' ' • 24.011 21.5 7.: 1 . no 38 . 34 c ÁTOMO ■ !S7 0 FHE A ■■!. " - 2 t í . - 2 ] :■ i . c 3 • ■ 77 ■ . oc 42 ..55 O ÁTOMO : i 5 s u TR P A 4 : 8 - 2 ' . - 72 22. ■ . i 22. J68 ¡ , o ¡ 33 * 60 H ÁTOMO 1 t s s CA TR P A i 18 - 26.664 21.745 ... : . 22 S ... 00 37 , M

ÁTOMO 1 , 00 ■: ^bTR P A 418 ■.1 .. a a 21 , 492 2 5 , 663 i , 00 0 ÁTOMO 1.80.; CG ^{T P . P}A 418 - 25 . . 12 22 628 24.1.3 : I. . i ( 33 ■.-'. c ÁTOMO ; 5 .. ■::.l : t p A 4 .1.8 - 3 ' j . - 23 753 ; 4.8 4 ■' l .00 40.5 : c ÁTOMO ■ ¡ 03 ME1 TR P A 4 : 8 - 74.492 34.555 .095 1 , 00 3 . . ■ i- R ÁTOMO : C : ■■ 2 £ 410 23 .332 24. ( /■ : ! . • tí . Ü( ■::.. ,.■ c ÁTOMO ¿5 TR P A 418 ••... ' ... 22 &1S 2 . tí..: 0 ■ J 00 42 89 c ÁTOMO :. s o s CE 3 ; ^{r f}A 418 - 27 . 22 , 069 23 - 237 i - 00 42 G 54 c ÁTOMO 73:': 7 c TR P A 418 - 21 .371 22.5 tí 5 .. .254 .. .0! 44 .20 c ÁTOMO 7 e ; tí f F A 4 i 8 - 21 .057 2.3 .1 i ' 33.93 (3 . . ! ¡0 45. c ÁTOMO ■ c :. . TR P A 418 - 22 , ir . a 24 , ■ 7.3 24.57 ! 1 . no .38. ■ 3 c ÁTOMO : 3 ¡ o ; - 1 A 4 ; u •. . ::.7 i 0 . . ■.0 ■■ 1.00 8:. . c ÁTOMO i S . l l O TR P A 4 ¡ í .... • ?s 20 ■ . . ... 4 ' 3 3.00 ■■■ .... tí-ÁTOMO : : : ■ ¡I O’LY A 410 - :: 6 . : 77 13.64 tí 21.197 ■. 00 43.31 H ÁTOMO l ü í < h r*tJ-i * J ^j - p. 415 ■ -C ; • 6 i 3 , 4 1 20 , 74 - 1 . 00 40 , 7 c ÁTOMO 1.3 I- i c GIj Y A 41. v • .857 17 . 29.1 2... 3 tí - . .00 33 tí..:, c ÁTOMO ; ■ i : 0 : L ¥ Á ■í; ■ ■■ 2 Lj . ” 2 i 1.7 20 , 930 : .00 .. . ■ É tí. ÁTOMO I S I S M LEU A 420 - 77. . 1 i 6. ¡ tí 4 21.3 . tí 1 * 00 4 ; ; . 03 t í ÁTOMO : 5 : ■ CA L : . i A 420 - 20 .73 : j 5 .57 tí ¡ 3.063 : .00' < 3. . : ■ c ÁTOMO • • • CB LEU A ■120 - ■ -■■¡.'.tí tí . .00 4 . . SO c ÁTOMO : 31 ■:> :ü LEU A 420 - 26 . : 8 : i 7.2 76 i - i . o ; o 3 . DO ■ i - . 9 ; c ÁTOMO i 8 ' : ; e l L ü ü A 420 - : 6 . : j 7 .2 :■ ■ 20.54 1 , 00 45. 57 tí. ÁTOMO :. • i CD2 7.T I " A 120 - 24 . 7 ■ 7.7 620 .. ! . - ..; ¡ . , 00 4-; ■..■

ÁTOMO 1500 ?■, ■1 U) . 3 14. S í ■ ■ , :i 14 1 .00 ■■, - i - r 1 ÁTOMO 1 :■ ' í 0 ILÜtJ p. 420 13.93 i . t í . ; . : i .00 47.85 ■ ÁTOMO :■■: 4 i í TK R 1 - 26 . ■ !)i 13.7 7 ' 22 , 475 tí , 0 t 4 ■' ' 5 ¡ ■ ÁTOMO 1505 c - THR A ■ ■: ■■ 26.7 5 ó 11.673 21.1 ■ ⁵i , no 5 ( .41 c ÁTOMO ■ :■ ¡6 CB THR A 42 25.53 : 11.141 t í - . t í t í - ■ .00 57 , 5£. c ÁTOMO 1527 i THR A 12 : 25.0 S S i. ! .720 70.3 5!; 1.00 5 3.64 0 ÁTOMO 15 ; s c g : : IR . ■ :■:■ . 0 ¡3 5.7 35 0 , tí.- 9 .. 00 59 , 0 : . ÁTOMO 1520 C THR A 42 i - 27.133 11.1 :3.. I .4 :33 . . no 47. 5 ! C ÁTOMO 15 ■; i 0 ■: ap A 12 ' .315 ; : .072 1 i . 382 1 , 00 42.69 ■ ■ ÁTOMO 1 ■ 3 .. ÍT A'RQ A 422 • .403 • o .630 ' 3 , 61 v 3 .00 : 0.09 13 ÁTOMO ■ :. CA ARG ^A42-2 - 76 , i ■ 0 . 74 i- i . :7 — 5 ■ , 00 37 . 90 c ÁTOMO ■ 533 c : ■ ■<■ £ 42 > , 553 5.7 43 ■ ! .6 ■ ■ 1 , i.-- 5 :. . ■!■) c ÁTOMO .. : j ¡ U v ARG A 122 ............... : . : , . 6 a 3 ..I... 351 .. 00 . a< C ÁTOMO 1535 CP ARG A 4ZZ - 3 : , 75 s 5 . &8S 35 , 5 0 ■' , . 00 7 í , VI C ÁTOMO ..334 ^{H E}J-.RG A 422 ■ ; B i 10 . IO S 24.4 .. 3 i . Ü0 S i . 31 13 ÁTOMO : 5 ■ L ■> ARG A 122 - l l . / O C 3 1.405 34 .135 tí .00 89.80 C ÁTOMO I ..-ó HH1 AR.G A 422 - .5. :■ • 2 ■ 2.4 tí 4 ' 4 .5 . 3 1 . n o S2 . ⁴ K

Á TO M O 1602 O HO K E 2 0.054 4. 032 - 2.775 3.00 36.31

Á TO M O I C I O O HOH E 3 ^{4 , 5 3 1 2 . 0 1 G}- 4 .6 ^{1.3 1 . 0 0 3 6 . 1 i}O F INAL

Una búsqueda de homólogos estructurales del TBD revela que, a pesar de una baja identidad de secuencia (<14 %), se encuentra el mismo plegamiento en otras proteínas incluyendo metionina sulfóxido reductasa (MSR), una enzima implicada en la reparación de proteínas oxidadas, proteínas de unión a ARNds RIG-I, MDA5 y LGP2 que están implicadas en detectar los ARN virales como parte de la respuesta inmune innata (Lu etal. Structure, 2010.18(8):1032-43; Li et al. J Biol Chem, 2009. 284(20): 13881-91). A pesar de compartir el mismo plegamiento, los residuos del bolsillo tri-T rp no están conservados en ninguna de estas proteínas estructuralmente similares, lo que indica que estas no pueden unirse a los fármacos IMiD® de la misma manera que CRBN. Sin embargo, pueden identificarse ortólogos de CRBN en los reinos animal y vegetal, y estas proteínas presentan una conservación de la secuencia del 100 % en el bolsillo de unión a los fármacos IMiD® (FIG. 19). Este nivel de conservación de la secuencia es indicativo de restricciones funcionales fuertes, lo que sugiere que puede haber un ligando endógeno con el que compiten los fármacos IMiD®. Los residuos de triptófano 380 (w 380), 386 (W386) y 400 (W400) están completamente conservados en los ortólogos de CRBN (FIG. 19). El bolsillo de unión a glutarimida formado por estos tres residuos de triptófano es reminiscente de los bolsillos aromáticos usados para la unión de lisina y/o arginina metilada encontrados en proteínas de la familia real que contienen cromodominios, dominios tudor, dedos de homeodominio de plantas (PHD) y repeticiones de tumor cerebral maligno (MBT), así como bromodominios para la unión a lisinas acetiladas y la caja de triptófano de las proteínas de unión a betaína tales como ProX31 y BetP32. Sin embargo, nuestro análisis por calorimetría de titulación isotérmica (ITC) no mostró una afinidad de unión significativa a lisinas, argininas o betaínas modificadas (datos no mostrados).

Se ha informado que una combinación de mutaciones tanto en la tirosina 384 (Y384) como W386 causa una pérdida de los efectos de los fármacos IMiD®. Como se muestra en la FIG. 15, W386 es parte del sitio de unión a lenalidomida y se esperaría que la mutación de ese residuo tendría consecuencias para la unión de los fármacos IMiD®. Sin embargo, Y384 no presenta ninguna interacción directa con la lenalidomida, y podría esperarse que tuviera un efecto más general en la estabilidad del dominio.

6.9.3.2 Análisis mutacional de los residuos próximos al sitio de unión a IMiD®

Para entender mejor el papel de los residuos implicados en las interacciones CRBN-IMiD en un contexto celular, realizamos la mutagénesis de los residuos W386 o W400 a alanina y usamos vectores de expresión lentivirales para reexpresar las versiones de tipo salvaje de longitud completa (Cr Bn wt), mutantes W386A (CRBNW386A) o W400A (CRBNW400A) de CRBN en una línea celular de mieloma deficiente en Cr Bn (DF15R) (Lopez-Girona et al., Leukemia.

26(11):2326-35). La transducción de las construcciones lentivirales en células DF15R y la selección con puromicina generó líneas celulares que expresaban de forma estable las formas de tipo salvaje o mutantes de CRBN a niveles similares a la línea celular DF15 sensible a IMiD® concordante (Lopez-Girona et al., Leukemia. 26(11):2326-35) (FIG.

24A-24B). El análisis por inmunoprecipitación-transferencia Western confirmó que, de manera similar al CRBN recombinante de tipo salvaje, los mutantes CRBNW386A y CRBNW400A interaccionaban con DDB1, lo que indica que estas proteínas estaban plegadas apropiadamente y eran competentes para formar complejos CRL4CRBN en las células (FIG. 24C) (Ito et al., Science, 2010. 327(5971 ):1345-50). Los extractos celulares de estas líneas se usaron entonces para ensayar la capacidad de CRBN de unirse a un compuesto IMiD®. Usamos el ensayo de perlas de afinidad acopladas a análogo de talidomida (Ito et al., Science, 2010. 327(5971):1345-50; Lopez-Girona et al., Leukemia.

26(11):2326-35) (FIG. 24D) para demostrar la unión de CRBN recombinante a compuestos IMiD® en extractos celulares. De manera similar a la proteína endógena en los extractos de células DF15, el CRBNWT recombinante expresado en DF15R fue capaz de unirse a perlas de análogo de talidomida (FIG. 22A), y la preincubación de los extractos celulares con talidomida o pomalidomida libre compitió para la unión a las perlas. Por el contrario, los mutantes de triptófano CRBNW386A y CRBNW400A fueron incapaces de unirse a las perlas de análogo de talidomida (FIG. 22A), lo que es consistente con la información estructural de que ambos residuos de triptófano en CRBN son necesarios para la interacción con compuestos IMiD®.

El efecto antiproliferativo de los compuestos IMiD® en células de mieloma está mediado a través de la proteína CRBN. Así, las células preparadas por ingeniería (FIG. 25) (Lopez-Girona et al., Leukemia. 26(11):2326-35; Zhu et al., Blood.

2011. 118(18):4771-9) o células que se hicieron resistentes a los fármacos IMiD® (Lopez-Girona et al., Leukemia.

26(11):2326-35) que carecían de niveles detectables de CRBN, p. ej., DF15R, se vuelven insensibles a los efectos antiproliferativos de los compuestos IMiD® (FIG, 22B; FIG. 25). De manera significativa, la reexpresión de una única proteína recombinante, CRBNWT, es suficiente para restaurar la sensibilidad a los compuestos IMiD® en la línea resistente DF15R (FIG. 22B), así como en otras líneas celulares (datos no mostrados). En estas células, la reexpresión de CRBNWT también restaura la degradación de aiolos inducida por IMiD®, y, como se esperaba, restaura la inhibición de la expresión de c-Myc, IRF4, y pRB fosforilado (FIG. 22C). Todos estos efectos aguas abajo son consistentes con el efecto antiproliferativo recuperado de la pomalidomida (Gandhi et al., Br J Haematol.; Lu et al., Science; Kronke, et al., Science, 2014. 343(6168):301-5; Lopez-Girona et al. Br J Haematol, 2011. 154(3):325-36). Por el contrario, la expresión de los mutantes defectuosos en la unión a IMiD®, CRBNW386A o CRBNW400A, no resensibiliza a las células DF15R respecto a los efectos antiproliferativos de los fármacos IMiD® (FIG. 22B y 22C). Estos datos celulares son consistentes con los datos estructurales, lo que indica que ambos residuos W386 y W400 median la unión de CRBN a los IMiD®, y que CRBN media los efectos antiproliferativos característicos de los compuestos IMiD® en las células de mieloma.

6.9.3.3 Mutación de residuos variables en el sitio de unión a IMiD® de CRBN

Como planteamos la hipótesis de que los IMiD® son esenciales para alterar la interacción entre CRBN y el sustrato, también investigamos el papel de otros residuos proximales. Se sabe que los roedores no responden a los fármacos IMiD® de la misma manera que lo hacen los seres humanos. Parece que los roedores son resistentes a la inducción de IL-2 (FIG. 26), efectos antiproliferativos y también a la teratogenicidad inducida por los compuestos IMiD® (Newman e ta l., Reprod Toxicol, 1993. 7(4):359-90). Una etapa clave en la comprensión de la biología de los IMiD® y finalmente para la preparación por ingeniería de análogos de IMiD® sin teratogenicidad puede provenir de hecho de localizar las características clave que subyacen a las diferencias biológicas observadas entre roedores y seres humanos. Dentro del dominio de unión a IMiD® hay cuatro diferencias entre las proteínas de roedores y seres humanos. Dos de los residuos variables están próximos al sitio de unión a IMiD® (FIG. 19). Uno de estos residuos presenta un cambio sustancial en sus propiedades de un residuo ácido (glutamato 377) en los seres humanos a un residuo hidrófobo (valina) en los ratones y ratas.

Para demostrar la función de los residuos próximos al fármaco IMiD® unido, realizamos mutagénesis del residuo E377 a valina en la secuencia del CRBN humano y reexpresamos la proteína usando un sistema lentiviral en células DF15R. Los extractos celulares de esta línea se usaron para ensayar la capacidad de CRBNE377V de unirse a un compuesto IMiD®. De manera similar al CRBNWT recombinante, pero a diferencia de los mutantes CRBNW386A o CRBNW400A, el mutante CRBNE377V fue capaz de unirse a las perlas de análogo de talidomida, y la preincubación de los extractos celulares con talidomida o pomalidomida libre compitió con esta unión de manera comparable a CRBNWT (FIG. 23A). Esto es consistente con la estructura que muestra que E377V está próximo a, pero no interacciona directamente con, la lenalidomida unida. La reexpresión de CRBNE377V en DF15R fue incapaz de rescatar la sensibilidad a pomalidomida o rescatar la degradación de Aiolos (FIG. 23B e inserto de la FIG. 23B). Se ha mostrado que la unión de IMiD® a CRBN aumenta tanto el reclutamiento a CRL4crbn como la degradación de Ikaros y Aiolos Gandhi et al., Br J Haematol.; Lu et al., Science; Kronke, et al., Science, 2014. 343(6168):301-5). Para determinar si la unión de Aiolos se había alterado, realizamos ensayos de sedimentación para comparar la capacidad de CRBNWT o CRBNE377V de interaccionar con Aiolos en presencia o ausencia de compuestos IMiD®.

Se estudió la función de los residuos próximos al fármaco IMiD® unido en la degradación de los sustratos de CRBN inducida por el fármaco IMiD®. Las células 293FT CRBN-/- se transfectaron transitoriamente con plásmidos que expresaban IKZF1 etiquetado con V5, IKZF3 etiquetado con FLAG, Sustrato X etiquetado con Myc, GFP, CRNB humano (hCRBN) o variantes del mismo, o CRBN de ratón (mCRBN) o variantes del mismo. Treinta y seis horas después de la transfección, las células se trataron con DMSO, lenalidomida 10 pM o CC-885 1 pM durante 12 horas adicionales. Las células se lavaron entonces dos veces con 1 x PBS enfriado en hielo, se lisaron en tampón A [T ris. Cl 50 mM, NaCl 150 mM, triton-x 100 al 1 %, comprimido de inhibidores de proteasas completo (roche), comprimido de inhibidores de fosfatasas (roche)]. Los extractos celulares completos se recogieron entonces y se sometieron a análisis por inmunotransferencia. Los resultados se muestran en la FIG. 27. Como se muestra, V388 es esencial para la destrucción de Ikaros (IKZF1) o Aiolos (IKZF3) por la lenalidomida. Este resultado indica que el residuo 388 de CRBN juega un papel importante en la degradación de los sustratos de CRBN, p. ej., Ikaros o Aiolos, inducida por el fármaco IMiD®.

6.9.4. Discusión

Ito et al. fueron los primeros en informar de que CRBN era la diana molecular principal de la talidomida, y a través de la mutagénesis demostraron que el dominio C-terminal englobaba el dominio de unión a talidomida (Ito et al., Science, 2010. 327(5971):1345-50).

En la presente memoria, hemos presentado la estructura de cristal de CRBN formando un complejo con DDB1 y lenalidomida, proporcionando así la primera descripción estructural de la unión de los fármacos IMiD®. El sitio de unión a IMiD® es un bolsillo hidrófobo poco profundo en la superficie de CRBN: tres residuos de triptófano forman el sitio de unión para el anillo glutarimida del fármaco IMiD®, con 3 enlaces de hidrógeno observados entre CRBN y el anillo glutarimida. El anillo glutarimida es una característica que define la clase IMiD® de moléculas y todas las estructuras IMiD®-CRBN resueltas hasta la fecha replican la interacción de unión de CRBN-IMiD descrita en la presente memoria.

Hemos demostrado que la unión de IMiD® y su función celular dependen de estas interacciones clave de triptófanos comparando mutantes con inserciones génicas de CRBN de tipo salvaje en una línea celular de mieloma deficiente en CRBN, DF15R. Además, usamos el sistema de inserciones génicas para estudiar un residuo de glutamato, E377, que, aunque está próximo a la lenalidomida unida, no interacciona directamente con el ligando. E377 tiene un gran interés ya que este residuo es una valina en las especies de roedores, que son resistentes a los efectos teratogénicos y otros efectos celulares del fármaco IMiD®. Observamos que la inserción génica de un CRBN mutante E377V humano se comporta de una manera idéntica a la inserción génica de CRBN murino en nuestra línea celular de mieloma humano: ni el CRBN de ratón, ni el CRBN mutante E377V humano son capaces de rescatar la respuesta de IMiD® aunque la unión de IMiD® es claramente evidente (FIG. 23). Además, encontramos que el residuo 388 de CRBN es esencial para la destrucción de Aiolos e Ikaros por la lenalidomida. Debe indicarse que no hemos detectado una mutación E377V en el entorno de la resistencia clínica, pero nuestro trabajo aquí implica que el cambio de un único aminoácido podría mediar la resistencia a los fármacos IMiD®. La regulación a la baja de CRBN es ciertamente un modo de resistencia a IMiD® como se pone de manifiesto por nuestros experimentos in vitro y ha sido sugerido por varios informes como un mecanismo para la resistencia innata o adquirida a los fármacos IMiD® en el entorno clínico.

Establecimos que la unión de los fármacos IMiD® solos, aunque necesaria para inducir la degradación de Aiolos e Ikaros mediada por la E3 ligasa, puede no ser suficiente, como se demuestra aquí con el mutante E377V. Interesantemente, el grupo isoindolinona de la lenalidomida se presenta en la superficie de la proteína CRBN. Este modo de unión genera una superficie con un número de enlaces de hidrógeno disponibles tanto de la proteína como de la lenalidomida en la proximidad de un grupo hidrófobo expuesto. Se ha demostrado que la unión del fármaco IMiD® a CRBN incrementa el reclutamiento de sustratos (p. ej., Ikaros y Aiolos) al complejo de la ubiquitina ligasa y aumenta su degradación Gandhi et al., Br J Haematol.; Lu etal., Science; Kronke, et al., Science, 2014. 343(6168):301-5.). Un descubrimiento interesante realizado por nosotros es que V388 de CRBN es esencial para la degradación de Ikaros y Aiolos inducida por el fármaco IMiD® (p. ej., lenalidomida). El potencial de enlace no satisfecho alrededor del fármaco IMiD® unido podría formar, por lo tanto, la base de un punto caliente de interacción introducido artificialmente, confiriendo de esta manera una función "neomórfica" inducida farmacológicamente a esta E3 ligasa.

Sin embargo, en el caso de CRBN, hemos mostrado que el bolsillo de unión a IMiD® está extremadamente conservado a lo largo de los ortólogos conocidos, lo que indica que los fármacos IMiD® pueden unirse en lugar de un ligando endógeno, que todavía tiene que identificarse. Hay varios ejemplos de ligandos endógenos que se ha demostrado que regulan el reclutamiento del sustrato en los complejos de ubiquitina ligasa en sistemas de plantas. Por ejemplo, la auxina y el jasmonato son moléculas pequeñas reguladoras de ligasas en plantas (Tan et al. Nature, 2007.

446(7136):640-5; Chini et al., Nature, 2007. 448(7154):666-71). De manera similar, varios productos naturales presentan una actividad farmacológica mediante el apoyo de interacciones macromoleculares (Thiel et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2012. 51(9):2012-8).

La capacidad de una molécula pequeña para apoyar una interacción macromolecular específica con una ubiquitina ligasa E3 tiene implicaciones particularmente excitantes para el descubrimiento de fármacos. Hemos observado varias categorías de variación próximas al sitio de unión a los fármacos IMiD®: variaciones en el patrón de presentación y sustitución de los grupos del ligando expuestos al disolvente, diferencias conformacionales en la proteína, y diferencias en la secuencia entre especies. Para racionalizar completamente el papel de estas en la bilogía de los fármacos IMiD®, se anticipan varios avances adicionales, tales como la identificación del o de los ligandos endógenos y el modo de unión de las proteínas sustrato, tales como Aiolos, cuando se reclutan en el complejo Cul4:Rbx1 :DDB1 :CRBN después del tratamiento con fármacos IMiD®. Mediante la descripción de la estructura de cristal de un IMiD® unido a CRBN, un adaptador de sustrato para una ubiquitina ligasa E3, se progresa hacia el diseño racional de los moduladores de la ubiquitina ligasa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar un compuesto de ensayo que induce un cambio conformacional en cereblon (CRBN) o altera de otra forma las propiedades de una superficie de CRBN, que comprende

(a) (i) obtener una primera estructura de cristal de CRBN y un compuesto de referencia, y (ii) determinar una estructura tridimensional del primer cristal por difracción de rayos x para obtener un primer conjunto de coordenadas atómicas; (b) (i) obtener un segundo cristal que comprende CRBN y el compuesto de ensayo, y (ii) determinar una estructura tridimensional del segundo cristal por difracción de rayos x para obtener un segundo conjunto de coordenadas atómicas; y

(c) comparar dicho primer conjunto de coordenadas atómicas con dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas; en donde una diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de un compuesto que induce un cambio conformacional o alteración en CRBN; y

2. El método de la reivindicación 1, en donde el conformacional o alteración ocurre en el bolsillo de unión a un agente modificador de CRBN (CMA) del CRBN, o en una región adyacente del mismo.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho primer conjunto de coordenadas atómicas y/o dicho segundo conjunto de coordenadas atómicas define un dominio de unión a CMA.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la diferencia en las coordenadas atómicas se determina evaluando las diferencias en las distancias atómicas.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el compuesto de ensayo tiene una actividad biológica específica aguas abajo y en donde la diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de que el compuesto de ensayo tiene la actividad biológica específica aguas abajo.

⁶. El método de la reivindicación 5, en donde el método comprende además ensayar la actividad biológica específica aguas abajo.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el compuesto de ensayo tiene una eficacia terapéutica específica y en donde la diferencia en las coordenadas atómicas es indicativa de que el compuesto de ensayo tiene la eficacia terapéutica específica.

⁸. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el CRBN se une además a la proteína 2 de unión al ADN dañado (DDB1), Culina-4 (Cul-4), proteína de cremallera de leucina homeótica ROC1 (Roc1), o cualquier combinación de las mismas.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el CRBN se une además a DDB1.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el CRBN es CRBN humano o CRBN murino.