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Hintergrund der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft im Allgemeinen die Detektion von Erkrankungen
der Brust und sie betrifft insbesondere Reagenzien, wie z. B. Polynukleotidsequenzen,
und die dadurch kodierten Polypeptidsequenzen, sowie Verfahren,
die diese Sequenzen verwenden, die zum Detektieren, Diagnostizieren,
Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder zum Bestimmen einer
Prädisposition
gegenüber
Erkrankungen oder Zuständen
der Brust, wie z. B. Brustkrebs, nützlich sind.
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Brustkrebs
ist die bekannteste Form von Krebs, die bei Frauen in den Vereinigten
Staaten auftritt. Die Inzidenz von Brustkrebserkrankungen in den
Vereinigten Staaten wird auf 180.200 diagnostizierte Fälle und auf
43.900 eintretende Todesfälle,
die mit Brustkrebs in Verbindung stehen, während des Jahres 1997 hochgerechnet
(Statistik der American Cancer Society). Die Inzidenz von Brustkrebs
stieg weltweit von 700.000 in dem Jahr 1985 auf etwa 900.000 in
dem Jahr 1990 an. G. N. Hortobagyi et al., CA Cancer. J. Clin. 45:
199-226 (1995).
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Verfahren,
die zum Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren
oder zum Bestimmen einer Prädisposition
gegenüber
Erkrankungen oder Zuständen
der Brust, wie z. B. Brustkrebs, verwendet werden, sind von entscheidender
Bedeutung für
das Ergebnis des Patienten. Zum Beispiel haben Patienten, bei denen
ein früher
Brustkrebs diagnostiziert wurde, eine relative Fünf-Jahres-Überlebensrate von mehr als
90 im Vergleich zu einer Überlebensrate
von etwa 20 für
Patienten, bei denen distanziert metastasierte Brustkrebserkrankungen
diagnostiziert wurden. (Statistik der American Cancer Society).
Gegenwärtig sind
die besten Erstindikatoren von frühem Brustkrebs eine physische
Untersuchung der Brust und die Mammographie. J. R. Harris et al.,
in: Cancer: Principles and Practice of Oncology, Vierte Ausgabe,
S. 1264-1332, Philadelphia, PA: J/B. Lippincott Co. (1993). Die
Mammographie kann einen Brusttumor detektieren, bevor er über eine
physische Untersuchung detektiert werden kann, aber sie hat ihre
Grenzen. Zum Beispiel hängt
der Prognosewert der Mammographie von dem Fachkönnen des Ermittlers und der
Qualität
des Mammogramms ab. Außerdem
sind 80 bis 93 von verdächtigen
Mammogrammen fälschlich
positive Mammogramme und 10 bis 15 von Frauen mit Brustkrebs weisen
fälschlich
negative Mammogramme auf. C. J. Wright et al., Lancet 346: 29-32
(1995). Neue diagnostische Verfahren, die empfindlicher und spezifischer
für die
Detektion von frühem
Brustkrebs sind, werden eindeutig benötigt.
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Brustkrebspatienten
werden nach einer Ersttherapie und während einer adjuvanten Therapie
genau beobachtet, um das Ansprechen auf die Therapie zu bestimmen
und eine anhaltende oder rückläufige Erkrankung
oder eine frühe
distante Metastase zu detektieren. Gegenwärtige diagnostische Verfahren
für die
Beobachtung von Brustkrebs schließen die Mammographie, Skelettszintigraphie,
Bruströntgenaufnahmen,
Leberfunktionstests und Tests für
Serummarker ein. Die Serumtumormarker, die am gebräuchlichsten
für die
Beobachtung von Patienten verwendet werden, sind das karzinoembryonische
Antigen (CEA) und CA 15-3. Die Einschränkungen des CEA schließen das
Fehlen von erhöhten
Serumspiegeln in etwa 40 von Frauen mit einer metastatischen Erkrankung
ein. Zusätzlich
kann eine CEA-Erhöhung
während
der adjuvanten Therapie nicht mit einem erneuten Auftreten aber
mit anderen Faktoren in Verbindung gebracht werden, die klinisch
nicht von Bedeutung sind. Das CA 15-3 kann ebenfalls in einer signifikanten
Anzahl von Patienten mit progressiver Erkrankung negativ sein und
deshalb versagt es bei der Vorhersage einer Metastase. Sowohl das
CEA als auch CA 15-3 können
in nicht malignen, gutartigen Zuständen erhöht sein, die fälschlich
positive Ergebnisse zur Folge haben. Deshalb wäre es klinisch von Vorteil,
einen mit der Brust assoziierten Marker zu finden, der bei der Detektion
eines erneuten Auftretens von Krebs empfindlicher und spezifischer
ist. J. R. Harris, et al., vorstehend M. K. Schwartz, in: Cancer:
Principles and Practice of Oncology, Bd. 1, Vierte Ausgabe, S. 531-542,
Philadelphia, PA: J/B. Lippincott Co. 1993.
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Ein
weiterer wichtiger Schritt im Umgang mit Brustkrebs besteht darin,
das Stadium der Erkrankung des Patienten zu bestimmen, da es einen
potenziellen prognostischen Wert besitzt und Kriterien zur Gestaltung
einer optimale Therapie liefert. Gegenwärtig ist die pathologische
Einstufung von Brustkrebs gegenüber der
klinischen Einstufung vorzuziehen, da das Erstere zu einer genaueren
Prognose führt.
J. R. Harris, et al., vorstehend. Andererseits wäre die klinische Einstufung
bevorzugt, wenn sie mindestens so genau wie die pathologische Einstufung
wäre, da
sie nicht von einem invasiven Verfahren abhängig ist, um Gewebe für die pathologische
Untersuchung zu beschaffen. Die Einstufung von Brustkrebs könnte durch
die Detektion von neuen Markern im Serum oder Urin verbessert werden,
die zwischen unterschiedlichen Stadien der Invasion differenzieren
könnten.
Solche Marker könnten
mRNA- oder Proteinmarker sein, die von Zellen exprimiert werden,
die aus dem Primärtumor
in der Brust abstammen aber im Blut, Knochenmark oder den Lymphknoten
bleiben, und könnten
als empfindliche Indikatoren für
eine Metastase zu diesen distalen Organen dienen. Zum Beispiel sind
spezifische Proteinantigene und die mRNA, die mit Brustepithel-Zellen assoziiert
sind, über
immunohistochemische Verfahren bzw. RT-PCR in Knochenmark, Lymphknoten
und Blut von Brustkrebspatienten detektiert worden, die eine Metastase
nahe legen. K. Pantel, et al., Onkologie 18: 394-401 (1995).
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Solche
Verfahren könnten
ferner Assays einschließen,
die auf dem Vorkommen von verschiedenen Erkrankungsmarkern in Testproben,
wie z. B. Blut, Plasma, Serum oder Urin basieren, die über minimal
invasive Verfahren erhalten wurden, die über immunologische Verfahren
detektiert werden können.
Diese Verfahren würden
Information bereitstellen, um dem Arzt im Umgang mit dem brusterkrankten
Patienten bei niedrigen Kosten für
den Patienten zu helfen. Marker., wie z. B. das Prostata-spezifische
Antigen (PSA) und das menschliche Choriongonadotropin (hCG) existieren
und werden klinisch zum Screening von Patienten auf Prostatakrebs
bzw. Hodenkrebs verwendet. Zum Beispiel wird das PSA normalerweise
von der Prostata mit hohen Spiegeln in die Samenflüssigkeit
sezerniert, ist aber bei sehr niedrigen Spiegeln im Blut von Männern mit
normalen Prostatas vorhanden. Erhöhte Spiegel des PSA-Proteins
im Serum werden für
die frühe
Detektion von Prostatakrebs oder -erkrankung bei asymptomatischen
Männern
verwendet. Siehe zum Beispiel G. E. Ranks, et al., in: Cancer: Principles
and Practice of Oncology, Bd. 1, Vierte Ausgabe, S. 1073-1113, Philadelphia,
PA: J. B. Lippincott Co. 1993. M. K. Schwartz, et al., in: Cancer:
Principles and Practice of Oncology, Bd. 1, Vierte Ausgabe, S. 531-542,
Philadelphia, PA: J. B. Lippincott Co. 1993. Ebenso könnte der
Umgang mit Brusterkrankungen durch die Verwendung von neuen Markern
verbessert werden, die normalerweise in der Brust exprimiert aber
in erhöhten
Mengen in einem unpassenden Körperkompartiment
als Folge der Brusterkrankung gefunden werden.
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Ferner
wären neue
Marker, die das biologische Verhalten von frühen Brustkrebserkrankungen
vorhersagen könnten,
ebenfalls von signifikantem Wert. Frühe Brustkrebserkrankungen,
die das Leben der Patienten bedrohen oder bedrohen werden, sind
klinisch bedeutsamer als diejenigen, die nicht bedrohen oder keine
Bedrohung darstellen werden. G. E. Ranks, vorstehend. Solche Marker
sind erforderlich, um vorherzusagen, welche Patienten mit histologisch
negativen Lymphknoten ein erneutes Auftreten von Krebs durchmachen
werden, und um ebenfalls vorherzusagen, welche Fälle eines duktalen Karzinoms
in situ sich zu einem invasiven Brustkarzinom entwickeln. Genauere
prognostische Marker würden
es dem Kliniker gestatten, frühe
in der Brust befindliche Krebserkrankungen genau zu identifizieren,
die ohne eine aggressive Behandlung fortschreiten und metastasieren.
Zusätzlich
könnte
das Fehlen eines Markers für
einen aggressiven Krebs in dem Patienten eine kostspielige und nachteilige
Behandlung für
den Patienten ersparen. J. R. Harris, et al., vorstehend. E. R.
Frykberg, et al., Cancer 74: 350-361 (1994).
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Deshalb
wäre es
vorteilhaft, spezifische Verfahren und Reagenzien bereitzustellen,
die zum Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren
oder zum Bestimmen einer Prädisposition
gegenüber
Erkrankungen oder Zuständen
der Brust nützlich
sind. Solche Verfahren würden
das Durchführen
von Assays bei einer Testprobe auf Produkte eines Gens einschließen, die
bei mit der Brust assoziierten Erkrankungen und Zuständen, einschließlich Krebs, überexprimiert
werden. Solche Verfahren können
ferner das Durchführen
von Assays bei einer Testprobe auf Produkte eines Gens einschließen, die
durch die mit der Brust assoziierte Erkrankung oder den Zustand,
einschließlich
Krebs, verändert
worden sind. Solche Verfahren können
ferner das Durchführen
von Assays bei einer Testprobe auf Produkte eines Gens einschließen, deren
Verteilung unter den unterschiedlichen Geweben und Kompartimenten
des Körpers
durch eine mit der Brust assoziierte Erkrankung oder einen Zustand,
einschließlich
Krebs, verändert
worden ist. Solche Verfahren würden das
Erzeugen von cDNA aus mRNA in der Testprobe, das Amplifizieren,
je nach Erfordernis, von Teilen der cDNA, die dem Gen oder einem
Fragment davon entspricht, und das Detektieren des cDNA-Produkts
als ein Anzeichen für
das Vorhandensein der Erkrankung oder des Zustands, einschließlich Krebs,
oder das Detektieren von Translationsprodukten der mRNAs, die Gensequenzen
umfassen, als ein Anzeichen für
das Vorhandensein der Erkrankung umfassen. Nützliche Reagenzien schließen Polynukleotide
oder Fragmente davon ein, die in diagnostischen Verfahren verwendet
werden können,
wie z. B. reverse Transcriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR),
PCR oder Hybridisierungsassays von mRNA, die aus Biopsiegewebe,
Blut oder anderen Testproben extrahiert wurde; oder Proteine, die
die Translationsprodukte solcher mRNAs darstellen; oder Antikörper, die
gegen diese Proteine gerichtet sind. Solche Assays würden Verfahren
für das
Durchführen von
Assays bei einer Probe auf Produkte des Gens und das Detektieren
der Produkte als ein Anzeichen für die
Erkrankung der Brust einschließen.
Eine Arzneimittelbehandlung oder Gentherapie für Erkrankungen und Zustände der
Brust, einschließlich
Krebs, können
auf diesen identifizierten Gensequenzen oder ihren exprimierten
Proteinen basieren und die Wirksamkeit einer beliebigen bestimmten
Therapie kann beobachtet werden. Außerdem wäre es vorteilhaft, über verfügbare alternative,
nicht-chirurgische
diagnostische Verfahren zu verfügen,
die in der Lage sind, eine Brusterkrankung, wie z. B. Krebs, in
einem frühen
Stadium zu detektieren.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion eines BS106-Zielpolynukleotids
in einer Testprobe bereit, das das In-Kontakt-Bringen der Testprobe
mit mindestens einem BS106-spezifischen
Polynukleotid und das Detektieren des Vorhandenseins des BS106-Zielpolynukleotids
in der Testprobe umfasst. Das BS106-spezifische Polynukleotid ist
gewählt
aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer
2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4,
Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen
davon. Ferner kann das BS106-spezifische Polynukleotid an eine feste
Phase angeheftet werden, bevor das Verfahren durchgeführt wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Detektion
von BS106-mRNA in einer Testprobe bereit, das folgendes umfasst:
Durchführen
einer reversen Transkription (RT) mit mindestens einem Primer, um
cDNA zu erzeugen, Amplifizieren der cDNA, die so erhalten wurde,
unter Verwendung von BS106-Oligonukleotiden
als Sense- und Antisenseprimer, um ein BS106-Amplikon zu erhalten, und Detektieren
des Vorhandenseins des BS106-Amplikons als ein Anzeichen für das Vorhandensein
von BS106-mRNA in der Testprobe, wobei die BS106-Oligonukleotide
eine Sequenz haben, die gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1,
Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3,
Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5
und Fragmenten oder Komplementen davon. Das Amplifizieren kann über die
Polymerase-Kettenreaktion
durchgeführt
werden. Ferner kann die Testprobe mit einer festen Phase zur Reaktion
gebracht werden, bevor das Verfahren, bevor das Amplifizieren oder bevor
das Detektieren durchgeführt
wird. Diese Reaktion kann eine direkte oder eine indirekte Reaktion
sein. Ferner kann der Detektionsschritt die Verwendung eines detektierbaren
Markers umfassen, der in der Lage ist, ein messbares Signal zu erzeugen.
Der detektierbare Marker kann an eine feste Phase angeheftet werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Detektion
eines BS106-Zielpolynukleotids in einer Testprobe, von der vermutet
wird, dass sie BS106-Zielpolynukleotide enthält, bereit, das folgendes umfasst:
(a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit mindestens einem BS106-Oligonukleotid
als ein Senseprimer und mit mindestens einem BS106-Oligonukleotid
als ein Antisenseprimer und Amplifizieren desselben, um ein Reaktionsprodukt
erster Stufe zu erhalten; (b) In-Kontakt-Bringen des Reaktionsprodukts
erster Stufe mit mindestens einem anderen BS106-Oligonukleotid,
um ein Reaktionsprodukt zweiter Stufe zu erhalten, unter der Voraussetzung,
dass das andere BS106-Oligonukleotid
3' zu den BS106-Oligonukleotiden
angeordnet ist, die in Schritt (a) verwendet wurden, und komplementär ist zu
dem Reaktionsprodukt erster Stufe; und (c) Detektieren des Reaktionsprodukts
zweiter Stufe als ein Anzeichen für das Vorhandensein eines BS106-Zielpolynukleotids
in der Testprobe. Die BS106-Oligonukleotide, die in dem Verfahren
als Reagenzien gewählt
sind, haben eine Sequenz, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer
2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer
4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen
davon: Das Amplifizieren kann über
die Polymerasekettenreaktion durchgeführt werden. Die Testprobe kann
entweder direkt oder indirekt mit einer festen Phase zur Reaktion
gebracht werden, bevor das Verfahren oder bevor das Amplifizieren
oder bevor das Detektieren durchgeführt wird. Der Detektionsschritt
umfasst ferner die Verwendung eines detektierbaren Markers, der
in der Lage ist, ein messbares Signal zu erzeugen; ferner kann der
detektierbare Marker an eine feste Phase angeheftet werden. Testkits,
die zur Detektion von BS106-Zielpolynukleotiden
in einer Testprobe nützlich
sind, werden ebenfalls bereitgestellt, die einen Behälter umfassen,
der mindestens ein BS106-spezifisches Polynukleotid enthält, das
gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1,
Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3,
Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten
oder Komplementen davon. Diese Testkits umfassen ferner Behälter mit
Geräten,
die zur Probensammlung (wie zum Beispiel Blut, Urin, Speichel und
Stuhl) nützlich
sind. Solche Geräte
schließen
Lanzetten und Saugpapier oder Stoff zum Sammeln und Stabilisieren
von Blut; Tupfer zum Sammeln und Stabilisieren von Speichel; und
Becher zum Sammeln und Stabilisieren von Urin- oder Stuhlproben
ein. Die Sammelmaterialien, wie z. B. Papier, Stoff, Tupfer, Becher
und dergleichen können
wahlweise behandelt sein, um eine Denaturierung oder irreversible
Adsorption der Probe zu verhindern. Die Sammelmaterialien können auch
mit Konservierungsmitteln, Stabilisatoren oder antimikrobiellen
Mitteln behandelt sein oder diese enthalten, um bei der Erhaltung
der Integrität
der Proben zu helfen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein gereinigtes Polynukleotid oder
Fragment davon bereit, das von einem BS106-Gen abgeleitet ist. Das
gereinigte Polynukleotid ist in der Lage, selektiv an die Nukleinsäure des BS106-Gens
oder eines Komplements davon zu hybridisieren. Das Polynukleotid
ist gewählt
aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer
2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer
4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Frag menten oder Komplementen
davon. Ferner kann das gereinigte Polynukleotid durch rekombinante
und/oder synthetische Techniken erzeugt werden. Das gereinigte rekombinante
Polynukleotid kann in einem rekombinanten Vektor enthalten sein.
Die Erfindung um fasst ferner eine Wirtszelle, die mit dem Vektor
transfiziert wurde.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein rekombinantes. Expressionssystem
bereit, das eine Nukleinsäuresequenz
umfasst, die einen offenen von BS106 abgeleiteten Leserahmen einschließt. Die
Nukleinsäuresequenz
hat eine Sequenz, die gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1,
Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3,
Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5
und Fragmenten oder Komplementen davon. Die Nukleinsäuresequenz
ist operativ an eine Kontrollsequenz geknüpft, die mit einem gewünschten
Wirt kompatibel ist. Ferner wird eine Zelle bereitgestellt, die
mit diesem rekombinanten Expressionssystem transfiziert wurde.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner durch BS106 kodierte Polypeptide
bereit. Die Polypeptide können
durch rekombinante Technologie, unter Voraussetzung der gereinigten
Form, oder durch synthetische Techniken hergestellt werden. Die
Polypeptide umfassen Aminosäure-Sequenzen,
die eine Aminosäure-Sequenz
haben, die gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer
17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer
19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten von Sequenz-Identifikationsnummer
17-20.
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Ferner
wird ein Antikörper
bereitgestellt, der spezifisch an mindestens ein BS106-Epitop bindet.
Der Antikörper
kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein. Das Epitop ist von
einer Aminosäure-Sequenz
abgeleitet, die gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16,
Sequenz-Identifikationsnummer
17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Se quenz-Identifikationsnummer
19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon. Assaykits
zur Bestimmung des Vorhandenseins eines BS106-Antigens oder BS106-Antikörpers in
einer Testprobe sind ebenfalls eingeschlossen. In einer Ausführungsform
umfassen die Assaykits einen Behälter,
der mindestens ein BS106-Polypeptid enthält, das eine Aminosäure-Sequenz
hat, die gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer
17, Sequenz-Identifikationsnummer
18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer
20 und Fragmenten davon. Ferner kann der Testkit einen Behälter mit
Geräten
umfassen, die zur Probensammlung (wie z. B. Blut, Urin, Speichel
und Stuhl) nützlich
sind. Solche Geräte schließen Lanzetten
und Saugpapier oder Stoff zum Sammeln und Stabilisieren von Blut;
Tupfer zum Sammeln und Stabilisieren von Speichel; und Becher zum
Sammeln und Stabilisieren von Urin- oder Stuhlproben ein. Die Sammelmaterialien,
wie z. B. Papier, Stoff, Tupfer, Becher und dergleichen können wahlweise
behandelt sein, um eine Denaturierung oder irreversible Adsorption
der Probe zu verhindern. Diese Sammelmaterialien können auch
mit Konservierungsmitteln, Stabilisatoren oder antimikrobiellen
Mitteln behandelt sein oder diese enthalten, um bei der Erhaltung
der Integrität
der Proben zu helfen. Das Polypeptid kann ferner an eine feste Phase
angeheftet sein.
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Ein
weiteres Testkit zur Bestimmung des Vorhandenseins von BS106-Antigen
oder BS106-Antikörper in
einer Testprobe umfasst einen Behälter, der einen Antikörper enthält, der
spezifisch an ein BS106-Antigen bindet, wobei das BS106-Antigen
mindestens ein BS106-kodiertes Epitop umfasst. Das BS106-Antigen
hat eine Sequenz, die gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer
17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer
19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon. Diese
Testkits können
ferner Behälter
mit Geräten umfassen,
die zur Probensammlung (wie z. B. Blut, Urin, Speichel und Stuhl)
nützlich
sind. Solche Geräte schließen Lanzetten
und Saugpapier oder Stoff zum Sammeln und Stabilisieren von Blut;
Tupfer zum Sammeln und Stabilisieren von Speichel; Becher zum Sammeln
und Stabilisieren von Urin- oder Stuhlproben ein. Die Sammelmaterialien
Papier, Stoff, Tupfer, Becher und dergleichen können wahlweise behandelt sein,
um eine Denaturierung oder irreversible Adsorption der Probe zu
verhindern. Diese Sammelmaterialien können auch mit Konservierungsmitteln,
Stabilisatoren oder antimikrobiellen Mitteln behandelt sein oder
diese enthalten, um bei der Erhaltung der Integrität der Proben
zu helfen. Der Antikörper
kann ferner an eine feste Phase angeheftet sein.
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Ein
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das mindestens ein
Epitop von BS106 enthält,
wird bereitgestellt, wobei das Verfahren das Inkubieren von Wirtszellen
umfasst, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden. Dieser
Vektor umfasst eine Polynukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert,
worin das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz
umfasst, die gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16,
Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer
18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer
20 und Fragmenten davon.
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Ein
Verfahren zur Detektion eines BS106-Antigens in einer Testprobe,
von der vermutet wird, dass sie das BS106-Antigen enthält, wird
ebenfalls bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen
der Testprobe mit einem Antikörper
oder einem Fragment davon, der spezifisch an mindestens ein Epitop
eines BS106-Antigens bindet, und zwar für einen Zeitraum und unter
Bedingungen, die für
die Bildung von Antikörper/Antigen-Komplexen ausreichend
sind; und Detektieren des Vorhandenseins solcher Komplexe, die den Antikörper als
ein Anzeichen für
das Vorhandensein des BS106-Antigens in der Testprobe enthalten.
Der Antikörper
kann an eine feste Phase angeheftet werden und entweder ein monoklonaler
oder ein polyklonaler Antikörper
sein. Außerdem
bindet der Antikörper
spezifisch an mindestens ein BS106-Antigen, das gewählt ist aus
der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer
17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer
19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon.
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Ein
weiteres Verfahren wird bereitgestellt, das Antikörper detektiert,
die spezifisch an ein BS106-Antigen in einer Testprobe binden, von
der vermutet wird, dass sie diese Antikörper enthält. Das Verfahren umfasst das
In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einem Polypeptid, das mindestens
ein BS106-Epitop
enthält,
worin das BS106-Epitop eine Aminosäure-Sequenz umfasst, die mindestens
50 Identität
mit einer Aminosäure-Sequenz aufweist,
die von einem BS106-Polynukleotid oder einem Fragment davon kodiert
wird. Das In-Kontakt-Bringen wird für einen Zeitraum und unter
Bedingungen durchgeführt,
die für
die Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen
ausreichend sind. Das Verfahren umfasst ferner das Detektieren von
Komplexen, die das Polypeptid enthalten. Das Polypeptid kann an
eine feste Phase angeheftet werden. Ferner kann das Polypeptid ein
rekombinantes Protein oder ein synthetisches Peptid sein, das eine
Aminosäure-Sequenz hat, die
gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16,
Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer
18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20
und Fragmenten davon.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Zelle bereit, die mit einer BS106-Nukleinsäuresequenz
transfiziert wurde, die mindestens ein Epitop eines BS106-Antigens
oder ein Fragment davon kodiert. Die Nukleinsäuresequenz ist gewählt aus
der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer
2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz--Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer
5 und, Fragmenten oder Komplementen davon.
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Ein
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern auf BS106-Antigen wird
ferner bereitgestellt, wobei das Verfahren das Verabreichen eines
isolierten immunogenen Polypeptids oder Fragments davon an ein Individuum
umfasst, worin das isolierte immunogene Polypeptid mindestens ein
BS106-Epitop in einer Menge umfasst, die für die Erzeugung einer Immunantwort
ausreichend ist. Das isolierte immunogene Polypeptid umfasst eine
Aminosäure-Sequenz,
die gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16,
Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer
19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon.
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Ferner
wird eine Zusammensetzung aus einem Material bereitgestellt, das
ein BS106-Polynukleotid aus mindestens etwa 10-12 Nukleotiden umfasst,
die ein Polynukleotid haben, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer
2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer
4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen
davon. Das BS106-Polynukleotid
kodiert eine Aminosäure-Sequenz,
die mindestens ein BS106-Epitop aufweist. Eine weitere Zusammensetzung
aus einem Material wird von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt,
das ein Polypeptid mit mindestens einem BS106-Epitop aus etwa 8-10
Aminosäuren
umfasst. Das Polypeptid umfasst eine Aminosäure-Sequenz, das gewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer
17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer
19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten von Sequenz-Identifikationsnummer
17-20. Ferner wird ein Gen oder ein Fragment davon bereitgestellt,
das für
ein BS106-Polypeptid kodiert, das die Sequenz-Identifikationsnummer
16 hat; und ein Gen oder ein Fragment davon, das DNA umfasst, die
die Sequenz-Identifikationsnummer
4 oder Sequenz-Identifikationsnummer 5 umfasst.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
das Nukleotid-Alignment der Klone 1662885 (Sequenz-Identifikationsnummer
1), 893988 (Sequenz-Identifikationsnummer 2), 1209814 (Sequenz-Identifikationsnummer
3) und die davon abgeleitete Konsensussequenz (Sequenz-Identifikationsnummer
4). Ein G/T-Polymorphismus an der Position 54 der Konsensussequenz
ist mit "K" bezeichnet, und
ein C/T-Polymorphismus an der Position 312 der Konsensussequenz
ist mit "Y" bezeichnet.
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2 zeigt
die Contig-Karte, die die Bildung der Konsensus-Nukleotidsequenz (Sequenz-Identifikationsnummer
4) aus dem Nukleotid-Alignment der überlappenden Klone 1662885
(Sequenz-Identifikationsnummer
1), 893988 (Sequenz-Identifikationsnummer 2) und 1209814 (Sequenz-Identifikationsnummer
3) darstellt.
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3A ist eine Aufnahme eines Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegels
von RNA aus verschiedenen Geweben und der entsprechende Northern
Blot von RNA unter Verwendung einer BS106-radiomarkierten Sonde; 3B ist eine Aufnahme eines weiteren Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegels
von RNA aus normalem Brustgewebe und Brustkrebsgewebe und der entsprechende
Northern Blot von RNA unter Verwendung einer BS106-radiomarkierten Sonde.
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4A und 4B sind
Aufnahmen von gefärbten
Agarosegelen der mit BS106-spezifisch geprimeten PCR-Amplifizierungsprodukte.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Gen oder ein Fragment davon bereit,
das für
ein BS106-Polypeptid kodiert, das die Sequenz-Identifikationsnummer 16 hat. Die vorliegende
Erfindung umfasst ferner ein BS106-Gen oder ein Fragment davon,
das die DNA umfasst, die die Sequenz-Identifikationsnummer 4 oder die
Sequenz-Identifikationsnummer 5 hat.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren für das Durchführen von
Assays bei einer Testprobe auf Produkte eines Brustgewebegens bereit,
das als BS106 bezeichnet wird, wobei das Verfahren die Herstellung
von cDNA aus mRNA in der Testprobe und die Detektion der cDNA als
ein Anzeichen für
das Vorhandensein des Brustgewebegens BS106 umfasst. Das Verfahren
kann einen Amplifizierungsschritt einschließen, wobei ein oder mehrere
Teile der mRNA aus dem BS106, die dem Gen oder Fragmenten davon
entsprechen, amplifiziert werden. Verfahren werden ferner für das Durchführen von
Assays für
die Translationsprodukte von BS106 bereitgestellt. Die Testproben,
bei denen durch die hierin bereitgestellten Verfahren Assays durchgeführt werden können, schließen Gewebe,
Zellen, Körperflüssigkeiten
und -sekrete ein. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Reagenzien
bereit, wie z. B. Oligonukleotidprimer und Polypeptide, die bei
der Durchführung
dieser Verfahren nützlich
sind.
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Teile
der hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen
sind als Primer für
die reverse Transkription von RNA oder für die Amplifizierung von cDNA;
oder als Sonden nützlich,
um das Vorhandensein von bestimmten mRNA-Sequenzen in Testproben
zu bestimmen. Ferner werden Nukleinsäuresequenzen offenbart, die
die Herstellung von kodierten Polypeptidsequenzen gestatten, die
als Standards oder Reagenzien in diagnostischen Immunoassays, als
Ziele für
pharmazeutische Screeningassays und/oder als Komponenten oder als Zielstellen
für verschiedene
Therapien nützlich
sind. Monoklonale und polyklonale Antikörper, die gegen mindestens
ein in diesen Polypeptidsequenzen enthaltenes Epitop gerichtet sind,
sind als Abgabemittel für
therapeutische Mittel als auch für
diagnostische Tests und für
das Screening auf Erkrankungen oder Zuständen nützlich, die mit BS106, insbesondere
Brustkrebs, assoziiert sind. Die Isolierung von Sequenzen aus anderen Teilen
des Gens von Interesse kann unter Einsatz von Sonden oder PCR-Primern,
die von diesen Nukleinsäuresequenzen
abgeleitet sind, bewerkstelligt werden. Das gestattet, dass zusätzliche
Sonden der mRNA oder cDNA von Interesse sowie entsprechende kodierte
Polypeptidsequenzen etabliert werden. Diese zusätzlichen Moleküle sind
bei dem Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren
oder dem Bestimmen der Prädisposition
gegenüber Erkrankungen
und Zuständen
der Brust, wie z. B. Brustkrebs, der wie hierin offenbart durch
BS106 gekennzeichnet ist, nützlich.
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Verfahren
für die
Bestimmung der "Similarität" einer Aminosäure-Sequenz sind in dem
Fachgebiet wohl bekannt. Im Allgemeinen bedeutet "Similarität" den exakten Vergleich
von Aminosäure
zu Aminosäure von
zwei oder mehreren Polypeptiden an der entsprechenden Stelle, an
der Aminosäuren
identisch sind oder ähnliche
chemische und/oder physikalische Eigenschaften besitzen, wie z.
B. Ladung oder Hydrophobizität. Eine
so genannte "prozentuale
Similarität" kann danach zwischen
den verglichenen Polypeptidsequenzen bestimmt werden. Verfahren
zur Bestimmung der Identität
von Nukleinsäure-
und Aminosäure-Sequenz sind in dem
Fachgebiet ebenfalls wohl bekannt und schließen die Bestimmung der Nukleotidsequenz
der mRNA für dieses
Gen (gewöhnlich über ein
cDNA-Zwischenprodukt) und die Bestimmung der dadurch kodierten Aminosäure-Sequenz
und den Vergleich von dieser mit einer zweiten Aminosäure-Sequenz
ein. Im Allgemeinen bezieht sich die "Identität" auf eine exakte Entsprechung von Nukleotid
zu Nukleotid oder Aminosäure
zu Aminosäure
von zwei Polynukleotid- bzw. Polypeptidsequenzen. Zwei oder mehrere
Polynukleotidsequenzen können über die
Bestimmung ihrer "prozentualen
Identität" verglichen werden.
Zwei oder mehrere Aminosäure-Sequenzen
können
ebenfalls über
die Bestimmung ihrer "prozentualen
Identität" verglichen werden.
Die in dem Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (erhältlich von
Genetics Computer Group, Madison, WI) verfügbaren Programme, zum Beispiel
das GAP-Programm, sind in der Lage, sowohl die Identität zwischen
zwei Polynukleotiden als auch die Identität bzw. Similarität zwischen
zwei Polypeptidsequenzen zu berechnen. Andere Programme für die Berechnung
der Identität
oder Similarität
zwischen Sequenzen sind in dem Fachgebiet bekannt.
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Die
hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren ermöglichen
die Identifizierung von bestimmten Markern als ein Anzeichen für eine Brustgewebeerkrankung
oder einen Zustand; die daraus erhaltene Information hilft bei dem
Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren
oder dem Bestimmen von Erkrankungen oder Zuständen, die mit BS106, insbesondere
Brustkrebs, assoziiert sind. Die Testverfahren schließen zum
Beispiel Sondenassays ein, die die hierin bereitgestellte(n) Sequenz(en)
verwenden und die ferner Nukleinsäure-Amplifizierungsverfahren verwenden können, wie
zum Beispiel die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion
(LCR) und die Hybridisierung. Außerdem enthalten die hierin
bereitgestellten Nukleotidsequenzen offene Leserahmen, aus denen
ein immunogenes Epitop gefunden werden kann. Es wird geglaubt, dass
dieses Epitop auf das mit dem BS106 assoziierte Erkrankungsstadium oder
den Zustand eingeschränkt
ist. Es wird ferner geglaubt, dass die Polynukleotide oder Polypeptide
und Proteine, die durch das BS106-Gen kodiert werden, als ein Marker
nützlich
sind. Dieser Marker ist entweder bei einer Erkrankung, wie z. B.
Brustkrebs, erhöht,
bei einer Erkrankung, wie z. B. Brustkrebs, verändert, oder als ein normales
Protein vorhanden, das aber in einem unangebrachten Körperkompartiment
erscheint. Die Einzigartigkeit dieses Epitops kann über (i)
dessen immunologische Reaktivität
und Spezifität
mit Antikörpern, die
gegen Proteine und Polypeptide gerichtet sind, die von dem BS106-Gen
kodiert werden, und (ii) über
dessen Nicht-Reaktivität
mit sämtlichen
anderen Gewebe Markern bestimmt werden. Die Verfahren zur Bestimmung
der immunologischen Reaktivität
sind wohl bekannt und schließen
zum Beispiel Radioimmunoassay (RIA), Enzymverknüpftes Immunosorbensassay (ELISA),
Hämagglutination
(HA), Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay (FPIA), Chemilumineszenzimmunoassay
(CLIA) und weitere ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Mehrere
Beispiele für
geeignete Methoden sind hierin beschrieben.
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Solange
nicht anders angegeben ist, sollen die folgenden Ausdrücke die
folgenden Bedeutungen haben:
Ein Polynukleotid, das "abgeleitet von" oder "spezifisch für" eine bestimmte Sequenz
ist, bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, die eine zusammenhängende Sequenz
von ungefähr
mindestens etwa 6 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens etwa 8 Nukleotiden,
stärker
bevorzugt mindestens etwa 10-12. Nukleotiden und noch stärker bevorzugt
mindestens etwa 15-20 Nukleotiden umfasst, die entsprechen, d. h.
mit einer Region der bestimmten Nukleotidsequenz identisch oder
dazu komplementär
sind. Die Sequenz kann zu einer Sequenz, die auf eine bestimmte
Polynukleotidsequenz eingeschränkt
ist, komplementär
oder damit identisch sein, wie über
in dem Fachgebiet bekannte Verfahren bestimmt wurde. Vergleiche
mit Sequenzen in Datenbanken können
zum Beispiel als ein Verfahren zur Bestimmung der Einzigartigkeit
einer bestimmten Sequenz verwendet werden. Die Regionen, von denen
Sequenzen abgeleitet sein können,
schließen
Regionen ein, die spezifische Epitope als auch nicht translatierte
und/oder nicht transkribierte Regionen kodieren, sind aber nicht darauf
eingeschränkt
sind.
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Das
abgeleitete Polynukleotid wird nicht notwendigerweise physikalisch
von der in Untersuchung befindlichen Nukleotidsequenz von Interesse
abgeleitet, sondern kann auf eine beliebige Art und Weise erzeugt werden,
die die chemische Synthese, Replikation, reverse Transkription oder
Transkription, die auf der Information basiert, die durch die Rasensequenz
in der/den Region(en) geliefert wird, aus denen das Polynukleotid abgeleitet
ist, einschließt,
aber nicht darauf eingeschränkt
ist. Als solches kann es entweder eine Sense- oder Antisenseausrichtung
des ursprünglichen
Polynukleotids darstellen. Zusätzlich
können
Kombinationen von Regionen, die derjenigen der bestimmten Sequenz
entsprechen, auf einer in dem Fachgebiet bekannten Art und Weise
modifiziert werden, um mit der beabsichtigten Verwendung im Einklang
zu sein.
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Ein "Fragment" eines spezifizierten
Polynukleotids bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, die eine
zusammenhängende
Sequenz von ungefähr
mindestens etwa 6 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens etwa 8 Nukleotiden,
stärker
bevorzugt mindestens etwa 10-12 Nukleotiden und noch stärker bevorzugt
mindestens etwa 15- 20
Nukleotiden umfasst, die einer Region der spezifizierten Nukleotidsequenz
entsprechen, d. h. damit identisch oder dazu komplementär sind.
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Der
Ausdruck "Primer" bezeichnet eine
spezifische Oligonukleotidsequenz, die zu einer Zielnukleotidsequenz
komplementär
ist und zur Hybridisierung der Zielnukleotidsequenz verwendet wird.
Ein Primer dient als ein Initiierungspunkt für die Nukleotidpolymerisation,
die entweder durch die DNA-Polymerase, RNA-Polymerase oder reverse
Transkriptase katalysiert wird.
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Der
Ausdruck "Sonde" bezeichnet ein definiertes
Nukleinsäuresegment
(oder Nukleotid-analoges Segment, z. B. PNA wie hiernach definiert
wird), das verwendet werden kann, um ein in den Proben vorhandenes
spezifisches Polynukleotid zu identifizieren, das die komplementäre Sequenz
trägt.
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"Kodiert von" bezieht sich auf
eine Nukleinsäuresequenz,
die für
eine Polypeptidsequenz kodiert, wobei die Polypeptidsequenz oder
ein Teil davon eine Aminosäure-Sequenz
von mindestens 3 bis 5 Aminosäuren,
stärker
bevorzugt mindestens 8 bis 10 Aminosäuren und noch stärker bevorzugt
mindestens 15 bis 20 Aminosäuren
aus einem Polypeptid enthält,
das von der Nukleinsäuresequenz
kodiert wird. Ferner sind Polypeptidsequenzen umfasst, die mit einem
von der Sequenz kodierten Polypeptid immunologisch identifizierbar sind.
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Diese
Aminosäure-Sequenz
kann aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer
16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer
18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer
20 und Fragmenten davon gewählt
werden.
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Ein "rekombinantes Polypeptid", "rekombinantes Protein" oder "ein über rekombinante
Verfahren hergestelltes Polypeptid", wobei die Ausdrücke hierin austauschbar verwendet
werden können,
beschreibt ein Polypeptid, das auf Grund seines Ursprungs oder seiner
Manipulation nicht mit dem gesamten oder einem Teil des Polypeptids
assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist, und/oder
mit einem Polypeptid verknüpft ist,
das ein anderes ist als mit dem es in der Natur verknüpft ist.
Ein rekombinantes oder kodiertes Polypeptid oder Protein wird aus
einer vorgesehenen Nukleinsäuresequenz
nicht notwendigerweise translatiert. Es kann ebenfalls auf eine
beliebige Art und Weise erzeugt werden, die die chemische Synthese
oder Expression aus einem rekombinanten Expressionssystem einschließt.
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Der
Ausdruck "synthetisches
Peptid", wie hierin
verwendet ist, bedeutet eine polymere Form von Aminosäuren einer
beliebigen Länge,
die chemisch über
Verfahren synthetisiert werden können,
die dem Fachmann wohl bekannt sind. Diese synthetischen Peptide
sind bei verschiedenen Anwendungen nützlich.
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Der
Ausdruck "Polynukleotid", wie hierin verwendet
ist, bedeutet eine polymere Form von Nukleotiden einer beliebigen
Länge,
entweder Ribonukleotide oder Deoxyribonukleotide. Dieser Ausdruck
bezieht sich nur auf die Primärstruktur
des Moleküls.
Somit schließt
dieser Ausdruck doppel- und einzelsträngige DNA als auch doppel-
und einzelsträngige
RNA ein. Er schließt
auch Modifikationen ein, wie z. B. Methylierung oder Kappen und
unmodifizierte Formen des Polynukleotids ein. Die Ausdrücke "Polynukleotid", "Oligomer", "Oligonukleotid" und "Oligo" werden hierin austauschbar
verwendet.
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"Eine Sequenz entsprechend
einer cDNA" bedeutet,
dass die Sequenz eine Polynukleotidsequenz enthält, die zu einer Sequenz in
der bestimmten DNA identisch oder komplementär ist. Die Sequenz, die der identifizierten
cDNA entspricht, -ist mindestens etwa 50 Nukleotide lang, vorzugsweise
mindestens etwa 60 Nukleotide lang und stärker bevorzugt mindestens etwa
70 Nukleotide lang. Die Korrespondenz zwischen dem Gen oder Genfragment
von Interesse. und der cDNA kann über in dem Fachgebiet bekannte
Verfahren bestimmt werden und schließen zum Beispiel einen direkten
Vergleich des sequenzierten Materials mit den beschriebenen cDNAs
oder eine Hybridisierung und einen Verdau mit einzelsträngigen Nukleasen
ein, worauf eine Größenbestimmung
der verdauten Fragmente folgt.
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"Gereinigtes Polynukleotid" bezieht sich auf
ein Polynukleotid von Interesse oder Fragment davon, das im Wesentlichen
frei ist, z. B. weniger als etwa 50 bevorzugt weniger als etwa 70
und stärker
bevorzugt weniger als etwa 90 des Proteins enthält, mit dem das Polynukleotid
natürlich
assoziiert ist. Die Verfahren zur Reinigung der Polynukleotide von
Interesse sind in dem Fachgebiet wohl bekannt und schließen zum
Beispiel einen Aufschluss der das Polynukleotid enthaltenden Zellen
mit einem chaotropen Mittel und die Trennung des/der Polynukleotids(e)
und Proteine über
Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Sedimentierung
nach der Dichte ein.
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"Gereinigtes Polypeptid" oder "gereinigtes Protein" bedeutet ein Polypeptid
von Interesse oder Fragment davon, das im Wesentlichen, z. B. weniger
als etwa 50 bevorzugt weniger als etwa 70 und stärker bevorzugt weniger als
etwa 90 enthält,
frei von zellulären
Komponenten ist, mit denen das Polypeptid von Interesse natürlich assoziiert
ist. Die Verfahren zur Reinigung der Polypeptide von Interesse sind
in dem Fachgebiet bekannt.
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Der
Ausdruck "isoliert" bedeutet, dass das
Material aus dessen ursprünglicher
Umgebung entfernt wird (z. B. die natürliche Umgebung, falls es natürlich vorkommt).
Zum Beispiel ist ein natürlich
vorkommendes Polynukleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden
Tier vorhanden ist, nicht isoliert, aber das gleiche Polynukleotid
oder DNA oder Polypeptid, das von einigen oder sämtlichen der koexistierenden
Materialien in dem natürlichen
System separiert ist, ist isoliert. Ein solches Polynukleotid könnte Teil
eines Vektors sein und/oder ein solches Polynukleotid oder Polypeptid
könnte
Teil einer Zusammensetzung und dennoch isoliert sein, in dem der
Vektor oder die Zusammensetzung nicht Teil seiner natürlichen
Umgebung ist.
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"Polypeptid" und "Protein" werden hierin austauschbar
verwendet und zeigen an, dass mindestens eine Molekülkette von
Aminosäuren über kovalente
und/oder nicht kovalente Bindungen verknüpft ist. Die Ausdrücke beziehen
sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts. Somit sind
Peptide, Oligopeptide und Proteine in der Definition von Polypeptid
eingeschlossen. Die Ausdrücke
schließen
post-translationale Modifikationen des Polypeptids ein, zum Beispiel
Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen.
Zusätzlich
sind Proteinfragmente, Analoge, mutierte oder variante Proteine,
Fusionsproteine und dergleichen in der Bedeutung von Polypeptid
eingeschlossen.
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Ein "Fragment" eines spezifizierten
Polypeptids bezieht sich auf eine Aminosäure-Sequenz, die mindestens
etwa 3-5 Aminosäuren,
stärker
bevorzugt mindestens etwa 8-10 Aminosäuren und noch stärker bevorzugt
mindestens etwa 15-20 Aminosäuren
umfasst, die von dem spezifischen Polypeptid abgeleitet sind.
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"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zelllinien", "Zellkulturen" und weitere solche
Ausdrücke,
die Mikroorganismen oder höhere
eukaryotische Zelllinien bezeichnen, die als einzellige Entitäten kultiviert
wurden, beziehen sich auf Zellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder
andere transferierte DNA verwendet werden können oder worden sind, und
den ursprünglichen
Abkömmling
der ursprünglichen Zelle
einschließen,
die transfiziert worden ist.
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Wie
hierin verwendet ist, bedeutet "Replikon" ein beliebiges genetisches
Element, wie z. B. Plasmid, ein Chromosom oder ein Virus, das sich
als eine autonome Einheit der Polynukleotidreplikation in einer
Zelle verhält.
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Ein "Vektor" ist ein Replikon,
in dem ein weiteres Polynukleotidsegment angeheftet ist, um die
Replikation und/oder Expression des angehefteten Segments zu bewirken.
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Der
Ausdruck "Kontrollsequenz" bezieht sich auf
eine Polynukleotidsequenz, die notwendig ist, um die Expression
einer kodierenden Sequenz zu bewirken, mit dem sie ligiert ist.
Die Natur solcher Kontrollsequenzen unterscheidet sich in Abhängigkeit
von dem Wirtsorganismus. In Prokaryoten schließen solche Kontrollsequenzen
im Allgemeinen einen Promotor, eine ribosomale Bindungsstelle und
Terminatoren ein; in Eukaryoten schließen solche Kontrollsequenzen
im Allgemeinen Promotor, Terminatoren und, in manchen Fällen, Enhancer
ein. Der Ausdruck "Kontrollsequenz" soll somit zumindest
sämtliche
Komponenten einschließen,
deren Vorhandensein für
die Expression erforderlich ist, und kann ferner zusätzliche
Komponenten einschließen,
deren Vorhandensein vorteilhaft ist, wie zum Beispiel Führungssequenzen.
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"Operativ verknüpft" bezieht sich auf
eine Situation, in der die beschriebenen Komponenten sich in einer
Beziehung befinden, die es ihnen gestattet, in ihrer vorgesehenen
Art und Weise zu funktionieren. Somit ist zum Beispiel eine Kontrollsequenz,
die mit einer kodierenden Sequenz "operativ verknüpft" ist, auf eine solche Art und Weise
ligiert, dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen
erzielt wird, die mit der Kontrollsequenz kompatibel sind.
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Der
Ausdruck "offener
Leserahmen" oder "ORF" bezieht sich auf
eine Region einer Polynukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert.
Diese Region kann einen Teil einer kodierenden Sequenz oder eine
gesamte kodierende Sequenz darstellen.
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Eine "kodierende Sequenz" ist eine Polynukleotidsequenz,
die zu mRNA transkribiert und zu einem Polypeptid translatiert wird,
wenn sie unter die Kontrolle von entsprechenden regulatorischen
Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden
durch ein Translations-Startkodon an dem 5'-Ende und einem Translations-Stoppkodon
an dem 3'-Ende bestimmt.
Eine kodierende Sequenz kann mRNA, cDNA und rekombinante Polynukleotidsequenzen
einschließen,
ist aber nicht darauf eingeschränkt.
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Der
Ausdruck "immunologisch
identifizierbar mit/als" bezieht
sich auf das Vorhandensein eines Epitops (von Epitopen) und eines
Polypeptids (von Polypeptiden), die in dem vorgesehenen Polypeptid
(den vorgesehenen Polypeptiden) vorhanden und darauf eingeschränkt sind.
Die immunologische Identität
kann über Antikörperbindung
und/oder kompetitive Bindung bestimmt werden. Diese Verfahren sind
dem Fachmann bekannt und werden ferner hierin beschrieben. Die Einzigartigkeit
eines Epitops kann ferner über
Computer-Recherchen in bekannten Datenbanken, wie z. B. GenBank,
für die
Polynukleotidsequenz, die das Epitop kodiert, und über Vergleiche
der Aminosäure-Sequenz
mit anderen bekannten Proteinen bestimmt werden.
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Wie
hierin verwendet ist, bedeutet "Epitop" eine antigene Determinante
eines Polypeptids oder eines Proteins. Denkbarer Weise kann ein
Epitop drei Aminosäuren
in einer räumlichen
Konformation umfassen, die auf das Epitop eingeschränkt ist.
Im Allgemeinen besteht ein Epitop aus mindestens fünf solcher
Aminosäuren und
gewöhnlicher
besteht es aus mindestens acht bis zehn Aminosäuren. Die Verfahren zur Untersuchung
der räumlichen
Konformation sind in dem Fachgebiet bekannt und schließen zum
Beispiel Röntgenkristallographie und
zweidimensionale magnetische Kernresonanz ein.
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Ein "konformationelles
Epitop" ist ein
Epitop, das aus einer spezifischen Aneinanderreihung von Aminosäuren in
einer immunologisch erkennbaren Struktur besteht, wobei solche Aminosäuren auf
dem gleichen Polypeptid in einer zusammenhängenden oder nicht zusammenhängenden
Reihenfolge vorhanden sind oder auf verschiedenen Polypeptiden vorhanden
sind.
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Ein
Polypeptid ist mit einem Antikörper "immunologisch reaktiv", wenn es an einen
Antikörper
aufgrund der Antikörpererkennung
eines spezifischen Epitops bindet, das in dem Polypeptid ent halten
ist. Die immunologische Reaktivität kann über Antikörperbindung, insbesondere über die
Kinetik der Antikörperbindung, und/oder über kompetitive
Bindung. bestimmt werden, indem als Kompetitor(en) ein bekanntes
Polypeptid (bekannte Polypeptide) verwendet werden, das/die ein
Epitop enthält/enthalten,
gegen das der Antikörper
gerichtet ist. Die Verfahren zur Bestimmung, ob ein Polypeptid mit
einem Antikörper
immunologisch reaktiv ist, sind in dem Fachgebiet bekannt.
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Wie
hierin verwendet ist, bedeutet der Ausdruck "immunogenes Polypeptid enthaltend ein
Epitop von Interesse" natürlich vorkommende
Polypeptide von Interesse oder Fragmente davon sowie Polypeptide,
die über
andere Mittel zum Beispiel über
chemische Synthese oder die Expression des Polypeptids in einem
rekombinanten Organismus hergestellt wurden.
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Der
Ausdruck "Transfektion" bezieht sich auf
die Einführung
eines exogenen Polynukleotids in eine prokaryotische oder eukaryotische
Wirtszelle, ungeachtet des für
die Einführung
verwendeten Verfahrens. Der Ausdruck "Transfektion" bezieht sich sowohl auf stabile als
auch vorübergehende
Einführung
des Polynukleotids und umfasst die direkte Aufnahme von Polynukleotiden,
Transformation, Transduktion und f-Mating. Sobald es in der Wirtszelle
eingeführt
ist, kann das exogene Polynukleotid als ein nicht integriertes Replikon,
zum Beispiel ein Plasmid, aufrechterhalten werden oder alternativ
dazu in das Wirtsgenom integriert werden.
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"Behandlung" bezieht sich auf
Prophylaxe und/oder Therapie.
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Der
Ausdruck "Individuum", wie hierin verwendet
ist, bezieht sich auf Wirbeltiere, insbesondere auf Vertreter der
Säugetierspezies,
und schließt
Haustiere, für
den Sport vorgesehene Tiere, Primaten und Menschen ein, ist aber
nicht darauf eingeschränkt;
insbesondere bezieht sich der Ausdruck auf Menschen.
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Der
Ausdruck "Sense-
Strang" oder "plus-Strang" (oder "+"), wie hierin verwendet ist, bezeichnet
eine Nukleinsäure,
die die Sequenz enthält,
die das Polypeptid kodiert. Der Ausdruck "Antisense-Strang" oder "minus-Strang" (oder "–") bezeichnet eine
Nukleinsäure,
die eine Sequenz enthält,
die komplementär
ist zu der des "plus"-Strangs.
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Der
Ausdruck "Testprobe" bezieht sich auf
eine Komponente eines Körpers
von einem Individuum, das die Quelle für den Analyten ist (wie z.
B. Antikörper
von Interesse oder Antigene von Interesse). Diese Komponenten sind
in dem Fachgebiet wohl bekannt. Eine Testprobe ist typischerweise
alles, von dem vermutet wird, dass es eine Zielsequenz enthält. Die
Testproben können
unter Verwendung von in dem Fachgebiet wohl bekannten Verfahren
hergestellt werden, wie z. B. über
Beziehen einer Probe aus einem Individuum und, je nach Erfordernis,
Aufschließen
sämtlicher
darin enthaltener Zellen, um die Zielnukleinsäuren freizusetzen. Diese Testproben
schließen
biologische Proben ein, die durch die Verfahren der vorliegenden
Erfindung, die hierin beschrieben sind, getestet werden können, und
schließen
menschliche und tierische Körperflüssigkeiten ein,
wie z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit, Sputum, Bronchialspülung, Bronchialaspirate, Urin,
Lymphflüssigkeiten
und verschiedene externe Sekrete des Respirations-, Intestinal- und Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel,
Milch, weiße
Blutkörperchen,
Myelome und dergleichen; biologische Flüssigkeiten, wie z. B. Zellkulturüberstände; Gewebeproben,
die fixiert werden können;
und Zellproben, die fixiert werden können.
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"Gereinigtes Produkt" bezieht sich auf
eine Präparation
des Produkts, die aus den zellulären
Bestandteilen, mit denen das Produkt normalerweise assoziiert ist,
und aus anderen Zellarten isoliert worden ist, die in der Probe
von Interesse vorhanden sein können.
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"PNA" bezeichnet ein "Peptid-Nukleinsäure-Analog", das bei einer Prozedur
verwendet werden kann, wie z. B. ein hierin beschriebenes Assay,
um das Vorhandensein eines Ziels zu bestimmen. "MA" bezeichnet ein "Morpholino-Analog", das in einer Prozedur
verwendet werden kann, wie z. B. ein hierin beschriebenes Assay,
um das Vorhandensein eines Ziels zu bestimmen. Siehe zum Beispiel
das
US-Patent Nr. 5,378,841 .
PNAs stellen neutral geladene Gruppen dar, die gegen RNA-Ziele oder
DNA gerichtet sein können.
PNA-Sonden, die in Assays an Stelle von zum Beispiel den DNA-Sonden
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bieten Vorteile, die
bei der Verwendung von DNA-Sonden nicht erreicht werden können. Diese
Vorteile schließen Herstellbarkeit,
Maskierung im Großmaßstab, Reproduzierbarkeit,
Stabilität,
Unempfindlichkeit gegenüber Änderungen
der Innenstärke
und Beständigkeit
gegenüber
enzymatischen Abbau ein, das bei DNA oder RNA verwendenden Verfahren
vorhanden ist. Diese PNAs können
mit solchen Signalerzeugenden Verbindungen, wie z. B. Fluorescein,
Radionukleotiden, chemilumineszenten Verbindungen und dergleichen,
markiert ("angeheftet") werden. PNAs oder
andere Nukleinsäureanaloge,
wie z. B. MAs, können
somit bei Assayverfahren an Stelle von DNA oder RNA verwendet werden.
Obwohl hierin Assays beschrieben sind, die DNA-Sonden verwenden,
liegt es im Können
des Fachmannes, dass PNAs oder MAs an die Stelle von RNA oder DNA
gesetzt werden können,
mit entsprechenden Änderungen
je nach und gemäß dem Erfordernis
bei Assayreagenzien.
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"Analyt", wie hierin verwendet
ist, ist die zu detektierende Substanz, die in der Testprobe vorhanden sein
kann. Der Analyt kann eine beliebige Substanz sein, für die ein
natürlich
vorkommender spezifischer Bindungsvertreter (wie z. B. ein Antikörper) existiert
oder für
die ein spezifischer Bindungsvertreter hergestellt werden kann.
Somit ist ein Analyt eine Substanz, die an einen oder mehrere spezifische
Bindungsvertreter in einem Assay binden kann. "Analyt" schließt ferner beliebige antigene
Substanzen, Haptene, Antikörper
und Kombinationen davon ein. Als ein Vertreter eines spezifischen
Bindungspaares kann der Analyt mit Hilfe von natürlich vorkommenden spezifischen
Bindungspartnern (-paaren) detektiert werden, wie z. B. die Verwendung
des Proteins intrinsischer Faktor als ein Vertreter für ein spezifisches
Bindungspaar für
die Bestimmung von Vitamin B12, die Verwendung von Folatbindendem
Protein zur Bestimmung der Folsäure
oder die Verwendung eines Lectins als ein Vertreter für ein spezifisches
Bindungspaar für
die Bestimmung eines Kohlenhydrats. Der Analyt kann ein Protein,
ein Polypeptid, eine Aminosäure,
ein Nukleotidziel und dergleichen einschließen.
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"Erkrankungen der
Brust" oder "Brusterkrankung" oder "Zustand der Brust", wie hierin beschrieben, beziehen
sich auf eine beliebige Erkrankung oder einen beliebigen Zustand
der Brust, einschließlich
atypische Hyperplasie, Fibroadenom, zystische Brusterkrankung und
Krebs, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
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"Brustkrebs", wie hierin verwendet
ist, bezieht sich auf eine beliebige maligne Erkrankung der Brust, einschließlich duktales
Karzinom in situ, lobuläres
Karzinom in situ, infiltrierendes duktales Karzinom, medulläres Karzinom,
tubuläres
Karzinom, muzinöses
Karzinom, infiltrierendes lobuläres
Karzinom, infiltrierendes Komedokarzinom und entzündliches
Karzinom, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
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Ein "exprimierter Sequenzmarker" oder "EST" bezieht sich auf
die Teilsequenz einer cDNA-Insertion, die über reverse Transkription von
aus einem Gewebe extrahierter mRNA gefolgt von der Insertion in
einen Vektor hergestellt worden ist.
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Eine "Transkriptions-Abbildung" bezieht sich auf
eine Tabelle oder Liste, die die quantitative Verteilung von ESTs
in einer Bibliothek angibt und die aktiven Gene in dem Gewebe darstellt,
aus dem die Bibliothek erstellt wurde.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Assays bereit, die spezifische Bindungsvertreter
verwenden. Ein "spezifischer
Bindungsvertreter",
wie hierin verwendet ist, ist ein Vertreter eines spezifischen Bindungspaares.
Das heißt
zwei verschiedene Moleküle,
bei denen eines der Moleküle über chemische
oder physikalische Wege spezifisch an das zweite Molekül bindet.
Deshalb können
zusätzlich
zu Antigen- und Antikörperspezifischen Bindungspaaren
herkömmlicher
Immunoassays andere spezifische Bindungspaare Biotin und Avidin,
Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nukleotidsequenzen, Effektor-
und Rezeptormoleküle,
Cofaktoren und Enzyme, Enzyminhibitoren und Enzyme und dergleichen
einschließen.
Außerdem
können
spezifische Bindungspaare Vertreter einschließen, die Analoge der ursprünglichen
spezifischen Bindungsvertreter sind, zum Beispiel ein Analytanalog.
Immunoreaktive spezifische Bindungsvertreter schließen Antigene,
Antigenfragmente, Antikörper
und Antikörperfragmente,
sowohl monoklonale als auch polyklonale und Komplexe davon ein,
die diejenigen einschließen,
die durch rekombinante DNA-Moleküle
gebildet werden.
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Der
Ausdruck "Hapten", wie hierin verwendet
ist, bezieht sich auf einen bestimmten Antigen- oder Nicht-Proteinbindungsvertreter,
der in der Lage ist, an einen Antikörper zu binden, aber der nicht
in der Lage ist, eine Antikörperbildung
auszulösen,
so lange er nicht mit einem Trägerprotein
gekoppelt ist.
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Ein "Einfangsreagenz", wie hierin verwendet
ist, bezieht sich auf einen unmarkierten spezifischen Bindungsvertreter,
der entweder für
den Analyten wie in einem Sandwichassay, für das Indikatorreagenz oder Analyten
wie in einem kompetitiven Assay oder für einen ergänzenden spezifischen Bindungsvertreter,
der selbst für
den Analyten spezifisch ist, wie in einem indirekten Assay, spezifisch
ist. Das Einfangsreagenz kann direkt oder indirekt an ein Festphasenmaterial
vor der Durchführung
des Assays oder während
der Durchführung
des Assays gebunden werden, wodurch die Abtrennung von immobilisierten
Komplexen aus der Testprobe ermöglicht
wird.
-
Das "Indikatorreagenz" umfasst eine "Signal-erzeugende
Verbin dung" ("Marker"), die in der Lage
ist, ein über
externe Mittel detektierbares messbares Signal, das mit einem spezifischen
Bindungsvertreter konjugiert ("angeheftet") ist, zu erzeugen
und dieses erzeugt. Zusätzlich
dazu, dass es ein Antikörpervertreter
eines spezifischen Bindungspaares ist, kann das Indikatorreagenz
ferner ein Vertreter eines. beliebigen spezifischen Bindungspaares
sein, einschließlich
entweder Hapten-anti-Hapten-Systeme, wie z. B. Biotin oder anti-Biotin, Avidin
oder Biotin, ein Kohlenhydrat oder ein Lectin, eine komplementäre Nukleotidsequenz,
ein Effektor- oder ein Rezeptormolekül, ein Enzym-Cofaktor und ein
Enzym, ein Enzyminhibitor oder ein Enzym und dergleichen. Ein immunoreaktiver
spezifischer Bindungsvertreter kann ein Antikörper, ein Antigen oder ein
Antikörper/Antigen-Komplex sein, das
in der Lage ist, entweder an das Polypeptid von Interesse wie in
einem Sandwichassay, an das Einfangsreagenz wie in einem kompetitiven
Assay oder an den ergänzenden
spezifischen Bindungsvertreter wie in einem indirekten Assay zu
binden. Bei der Beschreibung von Sonden und Sondenassays kann der
Ausdruck "Reportermolekül" verwendet werden.
Ein Reportermolekül
umfasst eine wie hierin vorstehend beschriebene Signal-erzeugende
Verbindung, die mit einem spezifischen Bindungsvertreter eines spezifischen
Bindungspaares konjugiert ist, wie z. B. Carbazol oder Adamantan.
-
Die
vorgesehenen verschiedenen "Signal-erzeugenden
Verbindungen" (Marker)
schließen
Chromagene, Katalysatoren, wie z. B. Enzyme, lumineszente Verbindungen,
wie z. B. Fluorescein und Rhodamin, chemilumineszente Verbindungen,
wie z. B. Dioxetane, Acridiniume, Phenanthridiniume und Luminol,
radioaktive Elemente und direkt sichtbare Marker ein. Beispiele
für Enzyme
schließen
die alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, Betagalactosidase
und dergleichen ein. Die Auswahl eines bestimmten Markers ist nicht entscheidend,
aber er muss in der Lage sein, ein Signal entweder von selbst aus
oder in Verbindung mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen zu erzeugen.
-
"Feste Phasen" ("feste Träger") sind dem Fachmann
bekannt und schließen
die Wände
von Vertiefungen einer Reaktionsplatte, Teströhrchen, Polystyrolkügelchen,
magnetische oder nicht magnetische Kügelchen, Nitrocellulosestreifen,
Membrane, Mikroteilchen, wie z. B. Latex-Teilchen, rote Blutzellen
von Schafen (oder anderen Tieren) und Duracytes® (rote
Blutzellen, die über
Brenztraubenaldehyd und Formaldehyd "fixiert" sind, erhältlich von Abbott Laboratories,
Abbott Park, IL) und andere ein. Die "feste Phase" ist nicht entscheidend und kann von
einem Fachmann ausgewählt
werden. Somit stellen Latex-Teilchen, Mikroteilchen, magnetische
oder nicht magnetische Kügelchen,
Membrane, Plastikröhrchen,
Wände von
Mikrotitervertiefungen, Glas- oder Silicium-Chips, rote Blutzellen
von Schafen (oder von anderen geeigneten Tieren) und Duracytes® alle
geeignete Beispiele dar. Geeignete Verfahren für die Immobilisierung von Peptiden
auf festen Phasen schließen
ionische, hydrophobe, kovalente Wechselwirkungen und dergleichen
ein. Eine " feste
Phase", wie hierin
verwendet ist, betrifft ein beliebiges Material, das unlöslich ist
oder über
eine anschließende
Reaktion unlöslich
gemacht werden kann. Die feste Phase kann auf Grund ihrer intrinsischen
Fähigkeit,
das Einfangsreagenz anzuziehen und zu immobilisieren, ausgewählt werden.
Alternativ dazu kann die feste Phase einen zusätzlichen Rezeptor zurückhalten,
der über
die Fähigkeit
verfügt,
das Einfangsreagenz anzuziehen und zu immobilisieren. Der zusätzliche
Rezeptor kann eine geladene Substanz, die in Bezug auf das Einfangsreagenz
selbst entgegengesetzt geladen ist, oder eine geladene Substanz
einschließen,
die mit dem Einfangsreagenz konjugiert ist. Als eine noch weitere
Alternative kann das Rezeptormolekül ein beliebiger spezifischer Bindungsvertreter
sein, der auf der festen Phase immobilisiert (daran angeheftet)
ist und der über
die Fähigkeit verfügt, das
Einfangsreagenz über
eine spezifische Bindungsreaktion zu immobilisieren. Das Rezeptormolekül ermöglicht die
indirekte Bindung des Einfangsreagenz an ein Festphasenmaterial
vor der Durchführung
des Assays oder während
der Durchführung
des Assays. Die feste Phase kann somit ein Kunststoff, derivatisierter Kunststoff,
magnetisches oder nicht magnetisches Metall, eine Glas- oder Siliziumoberfläche eines
Teströhrchens,
einer Mikrotitervertiefung, Platte, eines Kügelchens, Mikroteilchens, Chips,
rote Blutzellen von Schafen (oder von anderen geeigneten Tieren),
Duracytes® und
andere Konfigurationen sein, die dem Durchschnittsfachmann bekannt
sind.
-
Es
ist vorgesehen und in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung,
dass die feste Phase ferner ein beliebiges geeignetes poröses Material
mit einer ausreichenden Porosität
umfassen kann, um einen Zugang über
Detektion zu Antikörpern
und eine geeignete Oberflächenaffinität zur Bindung
von Antigenen zu gestatten. Mikroporöse Strukturen sind im Allgemeinen
bevorzugt, aber Materialien mit einer Gelstruktur in dem hydratisierten
Zustand können
ebenfalls verwendet werden. Solche nützlichen festen Träger schließen Nitrocellulose
und Nylon ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Es ist vorgesehen, dass
solche hierin beschriebenen porösen
festen Träger
vorzugsweise in Form von Platten mit einer Dicke von etwa 0,01 bis
0,5 mm, bevorzugt etwa 0,1 mm sind. Die Porengröße kann innerhalb breiter Grenzen
variieren und beträgt
bevorzugt von etwa 0,025 bis 15 Mikrometer, insbesondere von etwa
0,15 bis 15 Mikrometer. Die Oberfläche von solchen Trägern kann über chemische
Prozesse aktiviert werden, die eine kovalente Verknüpfung des
Antigens oder Antikörpers
mit dem Träger
bewirken. Die irreversible Bindung des Antigens oder Antikörpers wird
jedoch im Allgemeinen über
Adsorption auf dem porösen
Material durch wenig verstandene hydrophobe Kräfte erreicht. Andere geeignete
feste Träger
sind auf dem Fachgebiet bekannt.
-
Reagenzien
-
Die
vorliegende Erfindung stellt Reagenzien bereit, wie z. B. Polynukleotidsequenzen,
die aus einem Brustgewebe von Interesse abgeleitet sind und als
BS106 bezeichnet werden, dadurch kodierte Polypeptide und für diese
Polypeptide spezifische Antikörper.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Reagenzien bereit, wie z.
B. aus den offenbarten Polynukleotiden abgeleitete Oligonukleotidfragmente
und zu diesen Polynukleotiden komplementäre Nukleinsäuresequenzen. Die Polynukleotide,
Polypeptide oder Antikörper
der vorliegenden Erfindung können
verwendet werden, um Information bereitzustellen, die zu dem Detektieren,
Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder dem
Bestimmen der Prädisposition
gegenüber
Erkrankungen und Zuständen
der Brust, wie z. B. Krebs, führt.
Die hierin offenbarten Sequenzen stellen einzigartige Polynukleotide
dar, die in Assays oder zur Herstellung eines spezifischen Profils
für die
Aktivität
der Gentranskription verwendet werden können. Solche Assays sind in
dem
Europäischen Patent
Nr. 0373203 B1 und der Internationalen Veröffentlichung
Nr.
WO 95/11995 offenbart.
-
Ausgewählte von
BS106 abgeleitete Polynukleotide können in den hierin beschriebenen
Verfahren für die
Detektion einer normalen oder veränderten Genexpression verwendet
werden. Solche Verfahren können BS106-Polynukleotide
oder -Oligonukleotide, Fragmente oder Derivate davon, oder dazu
komplementäre
Nukleinsäuresequenzen
verwenden.
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Die
hierin offenbarten Polynukleotide, ihre komplementären Sequenzen
oder Fragmente von beiden können
in Assays verwendet werden, um Gene, Nukleinsäuren, cDNAs oder mRNAs, die
mit Brustgewebe-Erkrankungen und damit assoziierten Zuständen in
Verbindung stehen, zu detektieren, zu amplifizieren oder zu quantifizieren.
Sie können
ferner verwendet werden, um eine gesamte oder unvollständige kodierende
Region eines BS106-Polypeptids
zu identifizieren. Sie können
ferner in einzelnen Behältern
in Form eines Kits für
Assays bereitgestellt werden oder als einzelne Zusammensetzungen
bereitgestellt werden. Falls sie in einem Kit für Assays bereitgestellt werden,
können
andere geeignete Reagenzien, wie z. B. Puffer, Konjugate und dergleichen,
eingeschlossen sein.
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Das
Polynukleotid kann in Form von RNA oder DNA vorliegen. Polynukleotide
in Form von DNA, cDNA, genomischer DNA, Nukleinsäureanalogen und synthetischer
DNA befinden sich in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Die DNA kann doppelsträngig
oder einzelsträngig
sein, und falls einzelsträngig,
kann sie der kodierende (Sense-)Strang oder der nicht kodierende
(Antisense-)Strang sein. Die kodierende Sequenz, die das Polypeptid
kodiert, kann mit der hierin bereitgestellten kodierenden Sequenz
identisch sein oder kann eine verschiedene kodierende Sequenz sein,
wobei die kodierende Sequenz als Folge der Redundanz oder Degenerierung
des genetischen Kodes dasselbe Polypeptid wie die ihren bereitgestellte
DNA kodiert.
-
Dieses
Polynukleotid kann nur die kodierende Sequenz für das Polypeptid oder die kodierende
Sequenz für
das Polypeptid und eine zusätzliche
kodierende Sequenz einschließen,
wie z. B. eine Führungs- oder
Sekretionssequenz oder eine Proproteinsequenz oder die kodierende
Sequenz für
das Polypeptid (und wahlweise eine zusätzliche kodierende Sequenz)
und eine nicht kodierende Sequenz, wie z. B. eine nicht kodierende
Sequenz 5' und/oder
3' von der kodierenden
Sequenz für
das Polypeptid.
-
Zusätzlich schließt die Erfindung
variante Polynukleotide ein, die Modifikationen enthalten, wie z.
B. Deletionen, Substitutionen oder Additionen an einem Polynukleotid;
und eine beliebige Polypeptidmodifikation, die aus der varianten
Polynukleotidsequenz resultiert. Ein Polynukleotid der vorliegenden
Erfindung kann ferner über
eine kodierende Sequenz verfügen,
die eine natürlich
vorkommende allelische Variante der hierin bereitgestellten kodierenden
Sequenz ist.
-
Zusätzlich kann
die kodierende Sequenz für
das Polypeptid in dem gleichen Leserahmen mit einer Polynukleotidsequenz
fusioniert sein, der bei der Expression und Sekretion eines Polypeptids
aus einer Wirtszelle, zum Beispiel eine Führungssequenz, die als eine
Sekretionssequenz zur Kontrolle des Transports- eines Polypeptids
aus der Zelle funktioniert, behilflich ist. Das Polypeptid mit einer
Führungssequenz
ist ein Präprotein
und die Führungssequenz
kann durch die Wirtszelle zur Bildung des Polypeptids gespalten
werden. Die Polynukleotide können
ferner für
ein Proprotein kodieren, das das Protein plus zusätzliche
5'-Aminosäurereste darstellt.
Ein Protein mit einer Prosequenz ist ein Proprotein und kann in
einigen Fällen
eine inaktive Form des Proteins sein. Sobald die Prosequenz abgespalten
ist, verbleibt ein aktives Protein. Somit kann das Polynukleotid
der vorliegenden Erfindung für
ein Protein oder für
ein Protein mit einer Prosequenz oder für ein Protein mit sowohl einer
Präsequenz
(Führungssequenz)
als auch einer Prosequenz kodieren.
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Bei
den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung kann ferner die kodierende
Sequenz in einem Rahmen mit einer Markersequenz fusioniert sein,
die die Reinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung gestattet.
Die Markersequenz kann eine Hexa-Histidin-Markierung sein, die von
einem pQE-9-Vektor geliefert wird, um für die Reinigung des mit dem
Marker fusionierten Polypeptids in dem Fall eines bakteriellen Wirtes
zu sorgen, oder die Markersequenz kann zum Beispiel eine Hämagglutinin-(HA)-Markierung
sein, wenn ein Säugerwirt,
z. B. eine COS-7-Zelllinie, verwendet wird. Die HA-Markierung entspricht
einem Epitop, das aus dem Influenza-Hämagglutinin-Protein abgeleitet wurde. Siehe zum
Beispiel I. Wilson et al., Cell 37: 767 (1984).
-
Es
ist vorgesehen, dass Polynukleotide in Erwägung gezogen werden, um die
hierin bereitgestellten Sequenzen zu hybridisieren, wenn eine Identität zu mindestens
50 bevorzugt mindestens 70 und stärker bevorzugt mindestens 90
zwischen dem Polynukleotid und der Sequenz besteht.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner einen Antikörper bereit, der unter Verwendung
eines gereinigten BS106-Polypeptids hergestellt wurde, von dem mindestens
ein Teil des Polypeptids durch ein BS106-Polynukleotid kodiert wird,
das aus den hierin bereitgestellten Polynukleotiden. gewählt ist.
Diese Antikörper
können in
den hierin bereitgestellten Verfahren für die Detektion von BS106-Antigen
in Testproben verwendet werden. Das Vorhandensein von BS106-Antigen
in den Testproben ist ein Anzeichen für das Vorhandensein einer Erkrankung
oder eines Zustandes der Brust. Der Antikörper kann -ferner für therapeutische
Zwecke verwendet werden, zum Beispiel bei der Neutralisierung der
Aktivität
von BS106-Polypeptid bei Zuständen,
die mit einer erhöhten
oder abnormalen Expression assoziiert sind.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner ein BS106-Polypeptid, das
die abgeleitete Aminosäure-Sequenz,
wie hierin bereitgestellt, sowie Fragmente, analoge und Derivate
von solchen Polypeptiden besitzt. Das Polypeptid der vorliegenden
Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürlich gereinigtes
Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein. Das Fragment,
Derivat oder Analog des BS106-Polypeptids kann eines sein, in dem
einer oder mehrere der Aminosäurereste
mit einem konservierten oder nicht konservierten Aminosäurerest
(vorzugsweise ein konservierter Aminosäurerest) substituiert ist und
ein solcher substituierter Aminosäurerest kann ein oder kein
Aminosäurerest
sein, der durch den genetischen Kode kodiert wird; oder er kann
einer sein, bei dem einer oder mehrere der Aminosäurereste
eine Substituentengruppe einschließen; oder er kann einer sein,
bei dem das Polypeptid mit einer weiteren Verbindung fusioniert
ist, wie z. B. eine Verbindung zur Steigerung der Halbwertzeit des
Polypeptids (zum Beispiel Polyethylenglycol); oder er kann einer sein,
bei dem die zusätzlichen
Aminosäuren
mit dem Polypeptid fusioniert sind, wie z. B. eine Führungs-
oder Sekretionssequenz, oder eine Sequenz, die für die Reinigung des Polypeptids
oder einer Proproteinsequenz verwendet wird. Solche Fragmente, Derivate
und Analoge befinden sich in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Die Polypeptide und Polynukleotide der vorliegenden Erfindung werden
vorzugsweise in einer isolierten Form und vorzugsweise gereinigt
bereitgestellt.
-
Somit
kann ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung über eine Aminosäure-Sequenz
verfügen,
die zu derjenigen des natürlich
vorkommenden Polypeptids identisch ist, oder die um geringfügige Variationen
aufgrund einer oder mehrerer Aminosäuresubstitutionen verschieden
ist. Die Variation kann eine "konservierende Änderung" typischerweise in
dem Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren sein, wobei die substituierte
Aminosäure ähnliche
strukturelle oder chemische Eigenschaften aufweist, z. B. Austausch
von Leucin durch Isoleucin oder von Threonin durch Serin. Im Gegensatz
dazu können
Variationen nicht konservierende Änderungen einschließen, z.
B. Austausch eines Glycins durch ein Tryptophan. Ähnliche
geringfügige
Variationen können ferner
Deletionen oder Insertionen einer Aminosäure oder beides einschließen. Ein
Leitfaden bei der Bestimmung, welche und wie viele Aminosäurereste
ohne die Veränderung
der biologischen oder immunologischen Aktivität substituiert, insertiert
oder deletiert werden können,
kann unter Verwendung von Computerprogrammen gefunden werden, die
in dem Fachgebiet wohl bekannt sind, zum Beispiel DNASTAR Software (DNASTAR
Inc., Madison WI).
-
Sonden,
die gemäß den Polynukleotidsequenzen
der vorliegenden Erfindung konstruiert wurden, können in verschiedenen Assayverfahren
verwendet werden, um verschiedene Arten der Analyse bereitzustellen. Zum
Beispiel können
solche Sonden in der Technologie der fluoreszierenden in situ Hybridisierung
(FISH) verwendet werden, um eine chromosomale Analyse durchzuführen, und
können
zur Identifizierung von Krebsspezifischen strukturellen Veränderungen
in den Chromosomen verwendet werden, wie z. B. Deletionen oder Translokationen,
die aus Chromosomenverteilungen sichtbar oder unter Verwendung von
PCR-erzeugten und/oder Allel-spezifischen Oligonukleotidsonden,
Allel-spezifischer Amplifizierung oder über direkte Sequenzierung detektierbar
sind. Die Sonden können
ferner mit Radioisotopen, direkt oder indirekt detektierbaren Haptenen
oder fluoreszenten Molekülen
markiert und für
in situ Hybridisierungsstudien verwendet werden, um die mRNA-Expression
des Gens zu untersuchen, das das Polynukleotid in Gewebeproben oder
Zellen umfasst.
-
Diese
Erfindung stellt ferner eine Lehre im Hinblick auf die Herstellung
der hierin bereitgestellten Polynukleotide und Polypeptide bereit.
-
Sondenassays
-
Die
hierin bereitgestellten Sequenzen können verwendet werden, um Sonden
zu erzeugen, die in Assays für
die Detektion von Nukleinsäuren
in Testproben verwendet werden können.
Die Sonden können
aus konservierten Nukleotidregionen der Polynukleotide von Interesse
oder aus nicht konservierten Nukleotidregionen der Polynukleotide
von Interesse konstruiert sein. Die Konstruktion von solchen Sonden
für die
Optimierung in Assays liegt im Können
des Fachmannes. Im Allgemeinen werden Nukleinsäuresonden aus nicht konservierten
oder einzigartigen Regionen entwickelt, wenn eine maximale Spezifität erwünscht ist,
und Nukleinsäuresonden
werden aus konservierten Regionen entwickelt, wenn ein Assay für Nukleotidregionen
durchgeführt
wird, die zum Beispiel mit verschiedenen Vertretern einer Multigenfamilie
oder in verwandten Spezies wie Maus und Mensch eng verwandt sind.
-
Die
Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Technik zum Amplifizieren
einer gewünschten
Nukleinsäuresequenz
(Ziel), die in einer Nukleinsäure
oder einem Gemisch davon enthalten ist. In der PCR wird ein Paar
von Primern im Überschuss
verwendet, um die komplementären
Stränge
der Zielnukleinsäure
zu hybridisieren. Die Primer werden jeweils durch eine Polymerase
unter Verwendung der Zielnukleinsäure als ein Templat verlängert. Die
Verlängerungsprodukte
werden ihrerseits zu Zielsequenzen, worauf die Dissoziation von
dem ursprünglichen
Zielstrang folgt. Neue Primer werden danach über eine Polymerase hybridisiert
und verlängert
und der Zyklus wird zur genetischen Steigerung der Anzahl von Zielsequenzmolekülen wiederholt. Die
PCR ist in den
US-Patenten 4,683,195 und
4,683,202 offenbart.
-
Die
Ligasekettenreaktion (LCR) ist ein alternatives Verfahren zur Nukleinsäureamplifizierung.
Bei der LCR werden Sondenpaare verwendet, die zwei primäre (erste
und zweite) und zwei sekundäre
(dritte und vierte) Sonden einschließen, von denen alle in einem
molaren Überschuss
gegenüber
dem Ziel verwendet werden. Die erste Sonde hybridisiert mit einem
ersten Segment des Zielstranges und die zweite Sonde hybridisiert mit
einem zweiten Segment des Zielstranges, wobei das erste und zweite
Segment zusammenhängend
ist, so dass die primären
Sonden in einer Beziehung von 5'-Phosphat-3'-Hydroxyl aneinander
angrenzen und so dass eine Ligase die beiden Sonden zu einem vereinigten
Produkt kovalent fusionieren oder ligieren kann. Zusätzlich kann
einen Dritte (sekundäre)
Sonde mit einem Teil der ersten Sonde hybridisieren und eine vierte
(sekundäre)
Sonde kann mit einem Teil der zweiten Sonde auf eine entsprechende
aneinander angrenzende Art und Weise hybridisieren. Wenn das Ziel
am Anfang doppelsträngig
ist, hybridisieren in erster Linie die zweiten Sonden selbstverständlich mit
dem Zielkomplement. Sobald der ligierte Strang von primären Sonden
von dem Zielstrang separiert wurde, hybridisiert er mit den dritten
und vierten Sonden, die ligiert werden können, um ein komplementäres, sekundäres ligiertes
Produkt zu bilden. Es ist wichtig zu erkennen, dass die ligierten
Produkte funktionell entweder zu dem Ziel oder zu dessen Komplement äquivalent
sind. Durch wiederholte Zyklen von Hybridisierung und Ligation,
wird die Amplifizierung der Zielsequenz erreicht. Diese Technik
ist vollständiger
in der
EP-A-320 308 ,
veröffentlicht
am 16. Juni 1989, und in der
EP-A-439
182 , veröffentlicht
am 31. Juli 1991, beschrieben.
-
Für die Amplifizierung
von mRNAs liegt es in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung,
die mRNA zu cDNA revers zu transkribieren, worauf eine Polymerasekettenreaktion
(RT-PCR) folgt; oder ein einziges Enzym für beide Schritte zu verwenden,
wie in dem
US-Patent Nr. 5,322,770 beschrieben
ist; oder die mRNA zu cDNA revers zu transkribieren, worauf eine
Asymmetric-Gap-Ligasekettenreaktion
(RT-AGLCR) folgt, wie durch R. L. Marshall et al., PCR Methods and
Applications 4: 80-84 (1994) beschrieben ist.
-
Weitere
bekannte Amplifizierungsverfahren, die hierin. verwendet werden
können,
schließen
die so genannte "NASBA"- oder "3SR"-Technik ein, die
von J. C. Guatelli, et al., PNAS USA 87: 1874-1878 (1990) beschrieben
ist und ferner von J. Compton, Nature 350 (Nr. 6313): 91-92 (1991)
beschrieben ist; die Q-beta-Amplifizierung,
wie in der veröffentlichten
Europäischen
Patentanmeldung (EPA) Nr. 4544610 beschrieben ist; die Strangverdrängungsamplifizierung
(wie in G. T. Walker et al., Clin. Chem. 42: 9-13 (1996) beschrieben ist)
und in der
Europäischen Patentanmeldung
Nr. 684315 ; und die Zielvermittelte Amplifizierung, wie
in der Internationalen Veröffentlichung
Nr.
WO 93/22461 beschrieben
ist, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
-
Die
Detektion von BS106 kann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten
Detektionsverfahrens, einschließlich
derjenigen Detektionsverfahren, die gegenwärtig in dem Fachgebiet wohl
bekannt sind, als auch durch Detektionsstrategien, die sich später entwickeln
können,
bewerkstelligt werden. Siehe zum Beispiel Caskey et al.,
US-Patent Nr. 5,582,989 ,
Gelfand et al.,
US-Patent Nr.
5,210,015 . Beispiele für
solche Detektionsverfahren schließen Verfahren der Zielamplifizierung
als auch Technologien der Signalamplifizierung ein. Ein Beispiel
für derzeit
bekannte Detektionsverfahren würde
die Technologien der Nukleinsäureamplifizierung
einschließen,
die als PCR, LCR, NASBA, SDA, RCR und TMA bezeichnet werden. Siehe
zum Beispiel Caskey et al.,
US-Patent
Nr. 5,582,989 , Gelfand et al.,
US-Patent
Nr. 5,210,015 . Die Detektion kann ferner unter Verwendung
der Signalamplifizierung bewerkstelligt werden, wie z. B. derjenigen,
die in Snitman et al.,
US-Patent
Nr. 5,273,882 offenbart ist. Während die Amplifizierung von
Ziel oder Signal gegenwärtig
bevorzugt ist, ist es vorgesehen und in dem Schutzumfang der vorliegenden
Erfindung, das ultraempfindliche Detektionsverfahren hierin verwendet
werden können,
die eine Amplifizierung nicht erfordern.
-
Sowohl
die amplifizierte als auch nicht amplifizierte Detektion kann unter
Verwendung einer Vielzahl an heterogenen und homogenen Detektionsformaten
(kombiniert) durchgeführt
werden. Beispiele für
heterogene Detektionsformate sind in Snitman et al.,
US-Patent Nr. 5,273,882 , Albarella
et al., in
EP-84114441.9 , Urdea
et al.,
US-Patent Nr. 5,124,246 ,
Ullman et al.,
US-Patent Nr.
5,185,243 und Kourilsky et al.,
US-Patent Nr. 4,581,333 offenbart.
Beispiele für
homogene Detektionsformate sind in Caskey et al.,
US-Patent Nr. 5,582,989 , Gelfand et
al.,
US-Patent Nr. 5,210,015 offenbart.
Ferner ist es vorgesehen und in dem Schutzumfang der vorliegenden
Erfindung, mehrfache Sonden in dem Hybridisierungsassay zu verwenden,
wobei die Verwendung die Sensitivität und Amplifizierung des BS106-Signals
verbessert. Siehe zum Beispiel das
US-Patent
Nr. 5,582,989 an Caskey et al. und das
US-Patent Nr. 5,210,015 an Gelfand
et al.
-
Bei
einer Ausführungsform
umfasst die vorliegende Erfindung im Allgemeinen die folgenden Schritte: In-Kontakt-Bringen
einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie eine Zielpolynukleotidsequenz
enthält,
mit Reagenzien für
die Amplifizierungsreaktion, die einen Amplifizierungsprimer umfassen,
und einer Detektionssonde, die mit einer inneren Region der Amplikonsequenzen
hybridisieren kann. Die gemäß dem hierin
bereitgestellten Verfahren verwendeten Sonden und Primer sind mit
Einfangs- und Detektionsmarkern markiert, wobei Sonden mit einer
Art von Markern markiert sind und Primer mit einer anderen Art von
Markern markiert sind. Zusätzlich
sind die Primer und Sonden derart gewählt, dass die Sondensequenz über eine
niedrigere Schmelztemperatur als die Primersequenzen verfügt. Die
Amplifizierungsreagenzien, Detektionsreagenzien und die Testprobe
werden unter Amplifizierungsbedingungen gesetzt, wobei in Gegenwart
der Zielsequenz Kopien der Zielsequenz (ein Amplikon) erzeugt werden.
In dem gewöhnlichen
Fall ist das Amplikon doppelsträngig,
da Primer bereitgestellt werden, um eine Zielsequenz und ihren komplementären Strang
zu amplifizieren. Das doppelsträngige
Amplikon wird danach thermisch denaturiert, um einzelsträngige Amplikonvertreter
zu erzeugen. Nach der Bildung der einzelsträngigen Amplikonvertreter -wird
das Gemisch gekühlt,
um die Bildung von Komplexen zwischen den Sonden und einzelsträngigen Amplikonvertretern
zu gestatten.
-
Während die
einzelsträngigen
Amplikonsequenzen und Sondensequenzen gekühlt werden, binden die Sondensequenzen
vorzugsweise die einzelsträngigen
Amplikonvertreter. Unter der Voraussetzung, dass die Sondensequenzen
im Allgemeinen kürzer
als die Primersequenzen gewählt
werden und deshalb über
eine niedrigere Schmelztemperatur als die Primer verfügen, ist
dieses Ergebnis nicht eingängig.
Dementsprechend sollte die Schmelztemperatur des durch die Primer
erzeugten Amplikons ebenfalls über
eine höhere
Schmelztemperatur als die Sonden verfügen. Während sich das Gemisch abkühlt, wäre somit
eine erneute Formation des doppelsträngigen Amplikons zur erwarten.
Wie zuvor festgestellt wurde, ist das jedoch nicht der Fall. Es wurde
festgestellt, dass die Sonden vorzugsweise die einzelsträngigen Amplikonvertreter
binden. Außerdem besteht
diese Präferenz
der Bindung von Sonde/einzelsträngiges
Amplikon sogar bei überschüssiger Zugabe der
Primersequenzen zu den Sonden.
-
Nachdem
die Hybride von Sonde/einzelsträngiger
Amplikonvertreter gebildet sind, werden sie detektiert. Standardmäßige heterogene
Assayformate sind zum Detektieren der Hybride unter Verwendung der
Detektionsmarker und der Einfangsmarker, die auf den Primern und
Sonden vorhanden sind, geeignet. Die Hybride können an ein Festphasenreagenz
mit Hilfe des Einfangsmarkers gebunden und mit Hilfe des Detektionsmarkers
detektiert werden. In Fällen,
in denen der Detektionsmarker direkt detektierbar ist, kann die
Gegenwart der Hybride an der festen Phase detektiert werden, indem
der Marker dazu veranlasst wird, ein detektierbares Signal, falls
erforderlich, zu erzeugen, und das Signal detektiert wird. In Fällen, in
denen der Marker nicht direkt detektierbar ist, können die
eingefangenen Hybride mit einem Konjugat in Kontakt gebracht werden,
das im Allgemeinen einen Bindungsvertreter umfasst, der an einen
direkt detektierbaren Marker gebunden ist. Das Konjugat wird an
die Komplexe gebunden und die auf den Komplexen vorhandenen Konjugate
können
mit dem direkt detektierbaren Marker detektiert werden. Somit kann
das Vorhandensein der Hybride auf dem Festphasenreagenz bestimmt
werden. Der Fachmann erkennt, dass Waschungsschritte verwendet werden
können, um
unhybridisiertes Amplikon oder Sonde als auch ungebundenes Konjugat
wegzuwaschen.
-
Obwohl
die Zielsequenz als einzelsträngig
beschrieben ist, ist es ferner vorgesehen, dass der Fall eingeschlossen
sein soll, in dem die Zielsequenz tatsächlich doppelsträngig ist
aber vor der Hybridisierung mit den Amplifizierungprimersequenzen
lediglich von ihrem Komplement getrennt wird. In dem Fall, in dem
in diesem Verfahren die PCR verwendet wird, sind die Enden der Zielsequenzen
gewöhnlich
bekannt. In Fällen,
in denen die LCR oder eine Modifikation davon bei dem bevorzugten
Verfahren verwendet wird, ist die gesamte Zielsequenz gewöhnlich bekannt.
Typischerweise ist die Zielsequenz eine Nukleinsäuresequenz, wie zum Beispiel
RNA oder DNA.
-
Das
hierin bereitgestellte Verfahren kann bei wohl bekannten Amplifizierungsreaktionen
verwendet werden, die Reaktionsgemische aus thermischen Zyklen einschließen, insbesondere
bei der PCR und der Gap-LCR (GLCR). Die Amplifizierungsreaktionen
verwenden typischerweise Primer für die wiederholte Erzeugung
von Kopien einer Zielnukleinsäuresequenz,
wobei die Zielsequenz gewöhnlich
eine kleine Region einer viel größeren Nukleinsäuresequenz
ist. Die Primer stellen ihrerseits Nukleinsäuresequenzen dar, die zu Regionen
einer Zielsequenz komplementär
sind. Unter Amplifizierungsbedingungen hybridisieren diese Primer oder
binden an die komplementären
Regionen der Zielsequenz. Die Kopien der Zielsequenz werden typischerweise über den
Prozess der Primerextension und/oder -ligation erzeugt, der Enzyme
mit Polymerase- oder Ligaseaktivität getrennt oder in Kombination verwendet,
um an die hybridisierten Primer und/oder die Ligatbenachbarten Sondenpaare
Nukleotide zu addieren. Die Nukleotide, die an die Primer oder Sonden
als Monomere oder vorgeformte Oligomere addiert werden, sind zu
der Zielsequenz ebenfalls komplementär. Sobald die Primer oder Sonden
ausreichend verlängert
und/oder ligiert worden sind, werden sie von der Zielsequenz separiert,
zum Beispiel in dem das Reaktionsgemisch auf eine "Schmelztemperatur" erwärmt wird,
die eine Schmelztemperatur ist, bei der komplementäre Nukleinsäurestränge dissoziieren.
Somit wird eine zu der Zielsequenz komplementäre Sequenz gebildet.
-
Ein
neuer Amplifizierungszyklus kann danach stattfinden, um die Anzahl
von Zielsequenzen durch Separation jeglicher doppelsträngiger Sequenzen
weiter zu amplifizieren, was es den Primern oder Sonden gestattet,
an ihre jeweiligen Ziele zu hybridisieren, die hybridisierten Primer
oder Sonden zu verlängern
und/oder zu ligieren und erneut zu separieren. Die komplementären Sequenzen,
die über
Amplifizierungszyklen erzeugt werden, können als das Templat für die Primerextension
dienen oder die Lücke
zwischen zwei Sonden füllen, um
die Anzahl von Zielsequenzen weiter zu amplifizieren. Typischerweise
wird ein Reaktionsgemisch zwischen 20 und 100 mal zyklisiert, typischer
wird ein Reaktionsgemisch zwischen 25 und 50 mal zyklisiert. Die Anzahl
von Zyklen kann von dem Fachmann bestimmt werden. Auf diese Art
und Weise werden mehrere Kopien der Zielsequenz und ihrer komplementären Sequenz
hergestellt. Somit initiieren Primer die Amplifizierung der Zielsequenz,
wenn sie unter Amplifizierungsbedingungen vorhanden ist.
-
Im
Allgemeinen werden bei der PCR zwei Primer, die zu einem Teil eines
Zielstranges komplementär sind,
und dessen Komplement verwendet. Für die LCR werden im Allgemeinen
vier Sonden verwendet, von denen zwei zu einer Zielsequenz komplementär sind und
von denen zwei zu dem Komplement des Ziels entsprechend komplementär sind.
Zusätzlich
zu den vorher erwähnten
Primersätzen
und Enzymen kann ferner ein Reaktionsgemisch für die Nukleinsäureamplifizierung
weitere Reagenzien umfassen, die wohl bekannt sind und die folgenden
einschließen:
Enzym-Cofaktoren
wie z. B. Mangan; Magnesium; Salze; Nicotinamidadenindinukleotid
(NAD); und Deoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) wie zum Beispiel Deoxyadenintriphosphat, Deoxyguanintriphosphat,
Deoxycytosintriphosphat und Deoxythymintriphosphat, sind aber nicht
darauf eingeschränkt.
-
Während die
Amplifizierungsprimer die Amplifizierung der Zielsequenz initiieren,
ist die Detektions- (oder Hybridisierungs-) Sonde an der Amplifizierung
nicht beteiligt. Die Detektionssonden sind im Allgemeinen Nukleinsäuresequenzen
oder ungeladene Nukleinsäureanaloge,
wie zum Beispiel Peptidnukleinsäuren,
die in der Internationalen Veröffentlichung
Nr.
WO 92/20702 offenbart
sind; Morpholino-Analoge, die in den
US-Patenten
Nrn. 5,185,444 ,
5,034,506 und
5,142,047 beschrieben sind;
und dergleichen. In Abhängigkeit
von der Art des Markers, der von der Sonde getragen wird, wird die
Sonde verwendet, um das durch die Amplifizierungsreaktion erzeugte
Amplikon einzufangen oder zu detektieren. Die Sonde ist an der Amplifizierung
der Zielsequenz nicht beteiligt und muss möglicherweise deshalb "nicht verlängerbar" gemacht werden,
indem zusätzliche
dNTPs nicht an die Sonde addiert werden können. In sich und von sich
selbst sind Analoge gewöhnlich
nicht-verlängerbar
und Nukleinsäuresonden
können
nicht verlängerbar
gemacht werden, indem das 3'-Ende
der Sonde modifiziert wird, so dass die Hydroxylgruppe nicht mehr
in der Lage ist, an der Verlängerung
teilzunehmen. Zum Beispiel kann das 3'-Ende der Sonde mit dem Einfangs- oder
Detektionsmarker funktionalisiert werden, um dadurch die Hydroxylgruppe
zu verbrauchen oder anderweitig zu blockieren. Alternativ dazu kann
die 3'-Hydroxylgruppe
einfach abgespalten, ersetzt oder modifiziert werden. Die
US-Patentanmeldung Serien-Nr. 07/049,061 ,
eingereicht am 19. April 1993, beschreibt Modifikationen, die verwendet
werden können,
um eine Sonde nicht verlängerbar
zu machen.
-
Das
Verhältnis
von Primern zu Sonden ist nicht von Bedeutung. Somit können entweder
die Sonden oder Primer dem Reaktionsgemisch im Überschuss zugegeben werden,
wodurch die Konzentration von einem größer wäre als die Konzentration des
anderen. Alternativ dazu können
Primer und Sonden in äquivalenten Konzentrationen
verwendet werden. Vorzugsweise werden jedoch die Primer dem Reaktionsgemisch
im Überschuss
gegenüber
den Sonden zugegeben. Somit sind Verhältnisse von Primer zu Sonde
von zum Beispiel 5:1 und 20:1 bevorzugt.
-
Während die
Länge der
Primer und Sonden variieren kann, sind die Sondensequenzen so gewählt, dass
sie über
eine niedrigere Schmelztemperatur als die Primersequenzen verfügen. Folglich
sind die Primersequenzen im Allgemeinen länger als die Sondensequenzen.
Typischerweise sind die Primersequenzen in dem Bereich von zwischen
20 und 50 Nukleotide lang, typischer in dem Bereich von zwischen
20 und 30 Nukleotide lang. Die typische Sonde ist in dem Bereich
von zwischen 10 und 25 Nukleotide lang.
-
Verschiedene
Verfahren zur Synthetisierung von Primern und Sonden sind in dem
Fachgebiet wohl bekannt. Entsprechend sind Verfahren zum Anbinden
von Markern an Primer oder Sonden in dem Fachgebiet ebenfalls wohl
bekannt. Es ist zum Beispiel eine Routineangelegenheit, gewünschte Primer
oder Sonden für eine
Nukleinsäure
unter Verwendung der herkömmlichen
Nukleotid-Phosphoramidit-Chemie
und Instrumente zu synthetisieren, die von Applied Biosystems, Inc.,
(Foster City, CA), DuPont (Wilmington, DE) oder Milligen (Bedford,
MA) erhältlich
sind. Viele Verfahren sind zur Markierung von Oligonukleotiden,
wie z. B. die Primer oder Sonden der vorliegenden Erfindung, beschrieben
worden. Enzo Biochemical (New York, NY) und Clontech (Palo Alto,
CA) haben beide Techniken zur Sondenmarkierung beschrieben und kommerzialisiert.
Zum Beispiel kann ein primäres
Amin an ein 3'-Oligo-Ende
unter Verwendung von 3'-Amine-ON
CPG
TM (Clontech, Palo Alto, CA) gebunden
werden. Entsprechend kann ein primäres Amin an ein 5'-Oligo-Ende unter
Verwendung von Aminomodifier Il
® (Clontech)
gebunden werden. Die Amine können
mit verschiedenen Haptenen unter Verwendung der herkömmlichen
Aktivierungs- und Verknüpfungschemie
umgesetzt werden. Zusätzlich
lehren die mit anhängigen
Anmeldungen
US-Serien-Nrn. 625,566 ,
eingereicht am 11. Dezember 1990, und
630,908 ,
eingereicht am 20. Dezember 1990, Verfahren zur Markierung von Sonden
an ihren 5'- bzw.
3'-Enden. Die Internationale
Veröffentlichung
Nrn.
WO 92/10505 , veröffentlicht
am 25. Juni 1992, und
WO 92/11388 , veröffentlicht
am 9. Juli 1992, lehren Verfahren zur Markierung von Sonden an ihren
5'- bzw. 3'-Enden. Gemäß einem
bekannten Verfahren zur Markierung eines Oligonukleotids wird ein
Marker-Phosphoramidit-Reagenz hergestellt
und verwendet, um den Marker an das Oligonukleotid während seiner
Synthese zu addieren. Siehe zum Beispiel N. T. Thuong et al., Tet.
Letters 29(46): 5905-5908 (1988); oder J. S. Cohen et al., veröffentlichte
US-Patentanmeldung 07/246,688 (NTIS
Bestell-Nr. PAT-APPL-7-246,688) (1989). Vorzugsweise werden die Sonden
an ihren 3'- und
5'-Enden markiert.
-
Ein
Einfangsmarker wird an den Primern oder Sonden gebunden und kann
ein spezifischer Bindungsvertreter sein, der ein Bindungspaar mit
dem spezifischen Bindungsvertreter des Festphasenreagenz bildet. Es
wird verstanden, dass der Primer oder die Sonde selbst als der Einfangsmarker
dienen können.
In dem Fall zum Beispiel, in dem der Bindungsvertreter eines Festphasenreagenz
eine Nukleinsäuresequenz
ist, kann es derart gewählt
werden, dass es einen komplementären
Teil des Primers oder der Sonde bindet, um dadurch den Primer oder
die Sonde an der festen Phase zu immobilisieren. In Fällen, in
denen die Sonde selbst als der Bindungsvertreter dient, erkennt
der Fachmann, dass die Sonde eine Sequenz oder einen "Schwanz" beinhaltet, die/der
mit den einzelsträngigen
Amplikonvertretern nicht komplementär ist. In dem Fall, in dem
der Primer selbst als der Einfangsmarker dient, ist mindestens ein
Teil des Primers frei, um mit einer Nukleinsäure an einer festen Phase zu
hybridisieren, da die Sonde derart gewählt ist, dass sie zu der Primersequenz
nicht vollständig komplementär ist.
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Im
Allgemeinen können
Komplexe aus Sonde/einzelsträngiger
Amplikonvertreter unter Verwendung von Technikern detektiert werden,
die herkömmlich
zur Durchführung
von heterogenen Immunoassays verwendet werden. Vorzugsweise wird
bei dieser Ausführungsform
die Detektion gemäß den Protokollen
durchgeführt,
die von der im Handel erhältlichen
Abbott LCx® Ausstattung
(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) verwendet werden.
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Die
hierin offenbarten Primer und Sonden sind bei typischen PCR-Assays nützlich,
bei denen die Testprobe mit einem Paar von Primern kontaktiert,
eine Amplifizierung durchgeführt,
die Hybridisierungssonde zugegeben und die Detektion durchgeführt wird.
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Ein
weiteres durch die vorliegende Erfindung bereitgestelltes Verfahren
umfasst das In-Kontakt-Bringen einer Testprobe mit einer Vielzahl
von Polynukleotiden, wobei mindestens ein Polynukleotid ein wie
hierin beschriebenes BS106-Molekül
ist, Hybridisieren der Testprobe mit der Vielzahl von Polynukleotiden
und Detektieren von Hybridisierungskomplexen. Die Hybridisierungkomplexe
werden identifiziert und quantifiziert, um ein Profil zu erstellen,
das ein Anzeichen für
eine Brustgewebe-Erkrankung ist, wie z. B. Brustkrebs. Die exprimierten
RNA-Sequenzen können
ferner durch die reverse Transkription und Amplifizierung des DNA-Produkts über in dem
Fachgebiet wohl bekannte Prozeduren detektiert werden, die die Polymerasekettenreaktion
(PCR) einschließen.
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Wirkstoff-Screening
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Screening
einer Vielzahl von Verbindungen auf eine spezifische Bindung mit
einem BS106-Polypeptid (BS106-Polypeptiden) oder einem beliebigen
Fragment davon bereit, um mindestens eine Verbindung zu identifizieren,
die das BS106-Polypeptid spezifisch bindet. Ein solches Verfahren
umfasst die folgenden Schritte: Bereitstellen mindestens einer Verbindung;
Kombinieren des BS106-Polypeptids mit jeder Verbindung unter geeigneten
Bedingungen für
eine ausreichende Zeit, um eine Bindung zu gestatten; und Detektieren
der BS106-Polypeptidbindung mit jeder Verbindung.
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Das
bei einem solchen Test verwendete Polypeptid- oder Peptidfragment
kann entweder frei in Lösung,
an einem festen Träger
befestigt, auf einer Zelloberfläche
sein oder sich intrazellulär
befinden. Ein Verfahren zum Screening verwendet eukaryotische oder
prokaryotische Wirtszellen, die mit rekombinanten Nukleinsäuren stabil
transfiziert sind, die das Polypeptid- oder Peptidfragment exprimieren
können.
Ein Wirkstoff, eine Verbindung oder ein beliebiges anderes Mittel
kann gegenüber
solchen transfizierten Zellen in kompetitiven Bindungsassays gescreent
werden. Zum Beispiel kann die Bildung von Komplexen zwischen einem
Polypeptid und dem im Test befindlichen Mittel entweder in entwicklungsfähigen oder
fixierten Zellen gemessen werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt somit Verfahren zum Screening auf Wirkstoffe,
Verbindungen oder auf ein beliebiges anderes Mittel bereit, die
für die
Behandlung von mit BS106 assoziierten Erkrankungen verwendet werden
können.
Diese Verfahren umfassen das In-Kontakt-Bringen des Mittels mit
einem Polypeptid oder Fragment davon und Durchführen eines Assays auf entweder
das Vorhandensein eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem Polypeptid
oder auf das Vorhandensein eines Komplexes zwischen dem Polypeptid
und der Zelle. Bei kompetitiven Bindungsassays ist das Polypeptid
typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies
(oder unkomplexiertes) Polypeptid oder Fragment davon von demjenigen
separiert, die in gebundener Form vorliegen, und die Menge an freiem
oder unkomplexiertem Marker wird als ein Maß für die Fähigkeit des bestimmten Mittels
verwendet, um an das. Polypeptid zu binden oder um mit dem Komplex
aus Polypeptid/Zelle zu Wechselwirken.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ferner die Verwendung von kompetitiven
Screeningassays, bei denen die Neutralisierung der Antikörper, die
in der Lage sind, Polypeptide spezifisch zu binden, mit einem Testmittel
um die Bindung an das Polypeptid oder Fragment davon konkurrieren.
Auf diese Art und Weise können die
Antikörper
verwendet werden, um das Vorhandensein von einem beliebigen Polypeptid
in der Testprobe zu detektieren, das ein oder mehrere antigene Determinanten
mit einem BS106-Polypeptid, wie hierin bereitgestellt ist, gemeinsam
verwendet.
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Eine
weitere Technik zum Mittel-Screening stellt ein Hochdurchsatz-Screening
für Verbindung
bereit, die über
eine geeignete Bindungsaffinität
zu mindestens einem hierin offenbarten Polypeptid von BS106 verfügen. Kurz
gefasst werden große
Zahlen von verschiedenen kleinen Peptid-Testverbindungen an einer
festen Phase synthetisiert, wie z. B. Kunststoffstifte oder irgendeine
andere Oberfläche.
Die Peptid-Testverbindungen werden mit Polypeptid umgesetzt und
gewaschen. Das so an die feste Phase gebundene Polypeptid wird über Verfahren
detektiert, die in dem Fachgebiet wohl bekannt sind. Das gereinigte
Polypeptid kann ferner direkt auf Platten für die Verwendung bei den hierin
beschriebenen Screeningtechniken aufgebracht werden. Zusätzlich können nicht
neutralisierende Antikörper
verwendet werden, um das Polypeptid einzufangen und es auf dem festen
Träger
zu immobilisieren. Siehe zum Beispiel die
EP 84/03564 , veröffentlicht am 13. September 1984.
-
Das
Ziel des rationalen Wirkstoff-Designs besteht darin, strukturelle
Analoge von biologisch aktiven Polypeptiden von Interesse oder von
den kleinen Molekülen
herzustellen, die Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren, mit
denen sie Wechselwirken, einschließen. Solche strukturellen Analoge
können
für die
Entwicklung von Wirkstoffen, die aktivere oder stabilere Formen
des Polypeptids darstellen, oder die die Funktion eines Polypeptids
in vivo verbessern oder damit Wechselwirken, verwendet werden. J.
Hodgson, Bio/Technology 9: 19-21 (1991).
-
Zum
Beispiel wird bei einem Ansatz die dreidimensionale Struktur eines
Polypeptids oder von einem Komplex aus Polypeptidinhibitor über Röntgenkristallographie, über Computermodellierung
oder am typischsten über
eine Kombination der beiden Ansätze
bestimmt. Sowohl die Gestalt als auch die Ladungen des Polypeptids
müssen
sichergestellt werden, um die Struktur aufzuklären und die aktive Stelle (aktiven
Stellen) des Moleküls
zu bestimmen. Weniger oft kann nützliche
Information hinsichtlich der Struktur eines Polypeptids über Modellierung
auf der Basis der Struktur von homologen Proteinen erhalten werden.
In beiden Fällen
wird relevante strukturelle Information verwendet, um analoge Polypeptid-ähnliche
Moleküle
zu entwickeln oder effiziente Inhibitoren zu identifizieren.
-
Nützliche
Beispiele für
rationales Wirkstoff-Design können
Moleküle
einschließen,
die eine verbesserte Aktivität
oder Stabilität
aufweisen, wie von S. Braxton et al., Biochemistry 31 :7796-7801
(1992) gezeigt, oder die als Inhibitoren, Agonisten oder Antagonisten
von nativen Peptiden wirken, wie von S. B. P. Athauda et al., J.
Biochem. (Tokyo) 113(6): 742-746 (1993) gezeigt wird.
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Es
ist ferner möglich,
einen durch ein Assay selektierten Zielspezifischen Antikörper, wie
hier vorstehend beschrieben, zu isolieren, und danach dessen Kristallstruktur
zu bestimmen. Im Prinzip ergibt dieser Ansatz ein Pharmacophor,
auf dem ein nachfolgender Wirkstoff-Design begründet werden kann. Es ist ferner möglich, die
Protein-Kristallographie insgesamt zu umgehen, indem anti-idiotypische
Antikörper
("anti-ids") gegen einen funktionalen,
pharmakologisch aktiven Antikörper
erzeugt werden. Als ein Spiegelbild eines Spiegelbilds ist die Bindungsstelle
des anti-id ein Analog des ursprünglichen
Rezeptors. Der anti-id kann danach verwendet werden, um Peptide
aus Banken von chemisch oder biologisch hergestellten Peptiden zu
identifizieren und zu isolieren. Die isolierten Peptide können danach
als das Pharmacophor wirken (das heißt ein Prototyp eines pharmazeutischen
Wirkstoffs).
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Eine
ausreichende Menge an einem rekombinanten Polypeptid der vorliegenden
Erfindung kann verfügbar
gemacht werden, um analytische Untersuchungen durchzuführen, wie
z. B. Röntgenkristallographie. Zusätzlich stellt
die Kenntnis der Aminosäure-Sequenz
des Polypeptids, die aus der hierin bereitgestellten Nukleinsäuresequenz
abgeleitet werden kann, einen Leitfaden für diejenigen bereit, die an
Stelle von oder zusätzlich
zu der Röntgenkristallographie
die Techniken der Computermodellierung verwenden.
-
Ferner
können
solche Antikörper
das Vorhandensein oder das Fehlen des BS106-Polypeptids in einer Testprobe
detektieren und sind deshalb als diagnostische Marker für die Diagnose
einer Gewebeerkrankung oder eines Zustandes der Brust, insbesondere
Brustkrebs, nützlich.
Solche Antikörper
können
ferner als ein diagnostischer Marker für Erkrankungszustände des
Brustgewebes, wie z. B. Brustkrebs, funktionieren.
-
Die
Antisense-Technologie kann verwendet werden, um die Genexpression
durch Bildung einer Dreifachhelix oder Antisense-DNA oder -RNA zu reduzieren, von denen
beide Verfahren auf der Bindung eines Polynukleotids an DNA oder
RNA basieren. Zum Beispiel wird der 5'-Kodierungsabschnitt der Polynukleotidsequenz,
der für
das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, für die Konstruktion
eines Antisense-RNA-Oligonukleotids
mit einer Länge
von 10 bis 40 Hasenpaaren verwendet. Ein DNA-Oligonukleotid wird derart
konstruiert, dass es zu einer Region des bei der Transkription beteiligten
Gens komplementär
ist, wodurch die Transkription und die Erzeugung des BS106-Polypeptids
verhindert werden. Für
die Dreifachhelix siehe zum Beispiel Lee et al., Nuc. Acids Res.
6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988); und Dervan
et al., Science 251: 1360 (1991). Das Antisense-RNA-Oligonukleotid
hybridisiert an die mRNA in vivo und blockiert die Translation eines
mRNA-Moleküls
in das BS106-Polypeptid. Für
Antisense siehe zum Beispiel Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991);
und "Oligodeoxynucleotides
as Antisense Inhibitors of Gene Expression", CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988).
Die Antisense-Oligonukleotide
wirken mit einer größeren Effizienz,
wenn sie modifiziert werden, um künstliche Internukleotid-Verknüpfungen
zu enthalten, die das Molekül gegenüber einer
nukleolytischen Spaltung widerstandsfähig machen. Solche künstlichen
Internukleotid-Verknüpfungen
schließen
die Internukleotid-Verknüpfungen
von Methylphosphonat, Phosphorothiolat und Phosphoroamydat ein,
sind aber nicht darauf eingeschränkt.
-
Rekombinante Technologie
-
Die
vorliegende Erfindung stellt Wirtszellen und Expressionsvektoren,
die BS106-Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, und
Verfahren für
die Herstellung von dem Polypeptid (den Polypeptiden), die sie kodieren,
bereit. Solche Verfahren umfassen die Kultivierung der Wirtszellen
unter Bedingungen, die für
die Expression des BS106-Polynukleotids geeignet sind, und die Gewinnung
des BS106-Polypeptids aus der Zellkultur.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ferner Vektoren, die BS106-Polynukleotide der
vorliegenden Erfindung einschließen, Wirtszellen, die im Allgemeinen
mit Vektoren der vorliegenden Erfindung gezüchtet werden, und die Herstellung
von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung über rekombinante Techniken
bereit.
-
Die
Wirtszellen werden mit den Vektoren dieser Erfindung, die Klonierungsvektoren
oder Expressionsvektoren sein können,
genetisch gezüchtet
(transfiziert, transduziert oder transformiert). Der Vektor kann
in Form eines Plasmids, eines viralen Teilchens, einer Phase usw.
vorliegen. Die gezüchteten
Wirtszellen können in
herkömmlichen
Nährmedien
kultiviert werden, die je nach Bedarf zur Aktivierung von Promotoren,
Auswahl von transfizierten Zellen oder Amplifizierung des BS106-Gens (der BS106-Gene)
modifiziert wurden. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Temperatur,
pH und dergleichen, sind diejenigen, die zuvor bei der zur Expression gewählten Wirtszelle
verwendet wurden, und sind dem Durchschnittsfachmann ersichtlich.
-
Die
Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung eines
Polypeptids über
rekombinante Techniken verwendet werden. Somit kann die Polynukleotidsequenz
in eine beliebige aus einer Vielzahl von Expressionsvehikeln, insbesondere
Vektoren oder Plasmide, zur Expression eines Polypeptids eingeschlossen
sein. Solche Vektor schließen
chromosomale, nicht chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen
ein, z. B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA;
Hefeplasmide; Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und
Phagen-DNA, virale DNA, wie z. B. Vaccinia, Adenovirus, Hühnerpockenvirus
und Pseudorabies abgeleitet sind. Jedoch kann ein beliebiges Plasmid
oder Vektor verwendet werden, solange es/er in dem Wirt replizierbar
und entwicklungsfähig
ist.
-
Die
entsprechende DNA-Sequenz kann in den Vektor über eine Vielzahl von Prozeduren
insertiert werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz in entsprechende
Stellen von Restriktionsendonukleasen über in dem Fachgebiet bekannte
Prozeduren insertiert. Solche Prozeduren und andere gelten für den Fachmann
als in dem Schutzumfang. Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor
ist mit (einer) entsprechenden Expressionskontrollsequenz (en) (Promotor)
operativ verknüpft,
um die mRNA-Synthese zu dirigieren. Repräsentative Beispiele für solche
Promotoren schließen
den LTR- oder den SV40-Promotor, den E. coli lac oder trp, den Page
lambda P sub L Promotor und andere Promotoren ein, sind aber nicht
darauf eingeschränkt,
die bekanntlich die Expression von Genen in prokaryotischen oder
eukaryotischen Zellen oder ihren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor
schließt
ferner eine Ribosom-Bindungsstelle für die Translationsinitiierung
und einen Transkriptionsterminator ein. Der Vektor kann ferner entsprechende
Sequenzen zur Amplifizierung der Expression einschließen. Zusätzlich enthalten
die Expresionsvektoren vorzugsweise ein Gen, um eine Phänotypmerkmal
für die
Auswahl von transfizierten Wirtszellen, wie z. B. Dihydrofolatreductase-
oder Neomycinresistenz für
eine eukaryotische Zellkultur oder wie z. B. Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz
in E. coli bereitzustellen.
-
Der
Vektor, der die wie hierin vorstehend beschriebene entsprechende
DNA-Sequenz als auch eine entsprechende Promotor- oder Kontrollsequenz enthält, kann
verwendet werden, um einen entsprechenden Wirt zu transfizieren,
damit dem Wirt die Expression des Proteins gestattet wird. Als repräsentative
Beispiele für
entsprechende Wirte können
folgende genannt werden: bakterielle Zellen, wie z. B. E. coli,
Salmonella typhimurium; Streptomyces sp; mykotische Zellen, wie
z. B. Hefe; Insektenzellen, wie z. B. Drosophila und Sf9; tierische
Zellen, wie z. B. CHO, COS oder Bowes Melanom; pflanzliche Zellen,
usw. Die Auswahl eines entsprechenden Wirts gilt für den Fachmann
aus der hierin bereitgestellten Lehre als in dem Schutzumfang.
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Im
Besonderen schließt
die vorliegende Erfindung ferner rekombinante Konstrukte ein, die
eine oder mehrere der wie vorstehend breit beschriebenen Sequenzen
umfassen. Die Konstrukte umfassen einen Vektor, wie z. B. einen
Plasmid- oder viralen Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung
in einer vorwärts
oder rückwärts Ausrichtung
insertiert worden ist. Bei einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform
umfasst das Konstrukt ferner regulatorische Sequenzen, die zum Beispiel
einen Promotor einschließen,
der operativ mit der Sequenz verknüpft ist. Eine große Anzahl
an geeigneten Vektoren und Promotoren ist dem Fachmann bekannt und
im Handel erhältlich.
Die folgenden Vektoren werden beispielhaft bereitgestellt. Bakterielle:
pINCY (Incyte Pharmaceuticals Inc., Palo Alto, CA), pSPORT1 (Life
Technologies, Gaithersburg, MD), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) pBs,
phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a,
pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5
(Pharmacia); Eukaryotische: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene),
PSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Jedoch kann ein beliebiges
weiteres Plasmid oder Vektor verwendet werden, solange es/er in
dem Wirt replizierbar und entwicklungsfähig ist.
-
Das
Plasmid pINCY ist im Allgemeinen mit dem Plasmid pSPORT1 (erhältlich von
Life Technologies, Gaithersburg, MD) mit der Ausnahme identisch,
dass es zwei Modifikationen in dem Polylinker (mehrfache Klonierungsstelle)
besitzt. Diese Modifikationen sind (1) eine fehlende HindIII-Restriktionsstelle
und (2) dessen EcoRI-Restriktionsstelle befindet sich an einer verschiedenen
Position. Der pINCY wird aus pSPORT1 über Spaltung von pSPORT1 mit
sowohl HindIII als auch EcoRI und Austausch des ausgeschnittenen
Fragments von dem Polylinker mit synthetischen DNA-Fragmenten (Sequenz-Identifikationsnummer
6 und Sequenz-Identifikationsnummer
7) erzeugt. Diese Austausch kann auf eine beliebige Art und Weise
vorgenommen werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt ist. Zum
Beispiel können
die beiden Nukleotidsequenzen, die Sequenz-Identifikationsnummer
6 und Sequenz-Identifikationsnummer 7, synthetisch mit 5'-terminalen Phosphaten
erzeugt, miteinander vermischt und danach unter standardmäßigen Bedingungen
zur Durchführung
von Ligationen mit versetzten Enden in das mit HindIII und EcoRI
geschnittene pSPORT1-Plasmid ligiert werden. Geeignete Wirtszellen
(wie z. B. E. coli DH5a Zellen) werden danach mit der ligierten
DNA transfiziert und rekombinante Klone werden für die Ampicillinresistenz ausgewählt. Die
Plasmid-DNA wird danach aus einzelnen Klonen hergestellt und einer
Restriktionsenzymanalyse oder DNA-Sequenzierung unterzogen, damit
das Vorhandensein von Insertionssequenzen in der passenden Ausrichtung
bestätigt
wird. Andere dem Durchschnittsfachmann bekannte Klonierungsstrategien
können
ebenfalls verwendet werden.
-
Die
Promotorregionen können
aus einem beliebigen gewünschten
Gen unter Verwendung von CAT (Chloramphenicol-Transferase) Vektoren
oder anderen Vektoren mit wählbaren
Markern ausgewählt
werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Bestimmte
benannte bakterielle Promotoren schließen lacI, lacZ, T3, SP6, T7,
gpt, lambda P sub R, P sub L und trp ein. Eukaryotische Promotoren
schließen
Cytomegalovirus (CMV) Immediate Early, Herpes Simplex Virus (HSV)
Thymidin-Kinase, Early und Late SV40, LTRs aus Retroviren und murines
Metallothionein-I ein. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors
liegt ohne weiteres in dem Können
des Durchschnittsfachmannes.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung Wirtszellen bereit, die das vorstehend
beschriebene Konstrukt enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryotische
Zelle, wie z. B. eine Säugetierzelle,
oder eine niedere eukaryotische Zelle sein, wie z. B. eine Hefezelle,
oder die Wirtszelle kann eine prokaryotische Zelle sein, wie z.
B. eine bakterielle Zelle. Die Einführung des Konstrukts in die
Wirtszelle kann über
Calciumphosphat-Transfektion, über
DEAE-Dextran vermittelte
Transfektion oder Elektroporation bewirkt werden (L. Davis et al., "Basic Methods in
Molecular Biology",
2. Ausgabe, Appleton und Lang, Paramount Publishing, East Norwalk,
CT (1994).
-
Die
Konstrukte in Wirtszellen können
auf eine herkömmliche
Art und Weise verwendet werden, um das Genprodukt herzustellen,
das von der rekombinanten Sequenz kodiert wird. Alternativ dazu
können
die Polypeptide der Erfindung über
herkömmliche
Peptid-Synthetisatoren
synthetisch hergestellt werden.
-
Die
rekombinanten Proteine können
in Säugetierzellen,
Hefe-, Bakterien- oder anderen Zellen unter Kontrolle der entsprechenden
Promotoren exprimiert werden. Zell-freie Translationssysteme können ebenfalls verwendet
werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs herzustellen,
die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet
sind. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung
mit prokaryotischen und eukaryotischen Wirten sind von Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe,
(Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) beschrieben.
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Die
Transkription von DNA, die das Polypeptid (die Polypeptide) der
vorliegenden Erfindung kodiert, durch höhere Eukaryoten wird durch
Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer
stellen cis-wirkende Elemente von DNA dar, gewöhnlich von etwa 10 bis 300
Bp, die auf einen Promotor wirken, um dessen Transkription zu steigern.
Beispiele schließen
den SV40-Enhancer an der späten
Seite des Replikationsursprungs (Bp 100 bis 270), einen Cytomegalovirus
frühen
Promotor-Enhancer, einen Polyoma-Enhancer
an der späten
Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer ein.
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Im
Allgemeinen schließen
rekombinante Expressionsvektoren Ursprünge der Replikation und wählbare Marker,
die die Transfektion der Wirtszelle gestatten, z. B. das Ampicillinresistenzgen
von E. coli und S. cerevisiae TRP1-Gen, und einem Promotor ein,
der von einem hochexprimierten Gen abgeleitet ist, um die Transkription
einer strukturellen Sequenz stromabwärts zu dirigieren. Solche Promotoren
können
von Operonen abgeleitet werden, die glycolytische Enzyme, wie z.
B. 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), Alpha Faktor, saure Phosphatase,
oder Hitzeschockproteine unter anderen kodieren. Die heterologe
strukturelle Sequenz wird in einer passenden Phase mit Sequenzen
der Translationsinitiierung und -terminierung und vorzugsweise einer Führungssequenz
zusammengestellt, die in der Lage ist, die Sekretion von translatiertem
Protein in den periplasmatischen Spalt oder das extrazelluläre Medium
zu dirigieren. Wahlweise kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein
kodieren, das ein N-terminales Identifikationspeptid einschließt, wobei
gewünschte
Charakteristika verliehen werden, wie z. B. Stabilisierung oder
vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
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Nützliche
Expressionsvektoren für
eine bakterielle Verwendung werden konstruiert, indem eine strukturelle
DNA-Sequenz, die ein gewünschtes
Protein kodiert, zusammen mit geeigneten Signalen für die Translationsinitiierung
und -terminierung in eine aktive Lesephase mit einem funktionellen
Promotor insertiert werden. Der Vektor umfasst einen oder mehrere
phänotype
wählbare
Marker und einen Ursprung der Replikation, um die Aufrechterhaltung
des Vektors sicherzustellen und, falls erwünscht, für die Amplifizierung in dem
Wirt zu- sorgen. Geeignete prokaryotische Wirte für die Transfektion
schließen
E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene
Spezies in der Gattung Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus
ein, obwohl andere ebenfalls als eine routinemäßige Materie der Wahl verwendet
werden können.
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Nützliche
Expressionsvektoren für
die bakterielle Verwendung umfassen einen wählbaren Marker und einen bakteriellen
Ursprung der Replikation, der aus Plasmiden abgeleitet ist, die
genetische Elemente des wohl bekannten Klonierungsvektors pBR322
(ATCC 37017) umfassen. Andere Vektoren schließen PKK223-3 (Pharmacia Fine
Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison,
WI) ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Diese pBR322 "Grundgerüst"-Abschnitte werden
mit einem passenden Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz
kombiniert.
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Nach
der Transfektion eines geeigneten Wirts und Anzucht des Wirts auf
eine angemessene Zelldichte, wird der ausgewählte Promotor über angemessene
Mittel (z. B. Temperaturverschiebung oder chemische Induktion) unterdrückt und
die Zellen werden für
eine zusätzliche
Zeitspanne kultiviert. Die Zellen werden typischerweise über Zentrifugierung
geerntet, über
physikalische oder chemische Mittel zerstört und der resultierende Rohextrakt
wird für
eine weitere Reinigung aufbewahrt. Die bei der Expression von Proteinen
verwendeten mikrobiellen Zellen können über ein beliebiges bequemes
Verfahren, einschließlich
der Durchführung von
Einfrier-Auftau-Zyklen, Ultraschallbehandlung, mechanische Zerstörung oder
die Verwendung von Zell-lysierenden Mitteln, zerstört werden;
solche Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt.
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Verschiedene
Kultursysteme aus Säugetierzellen
können
ferner verwendet werden, um ein rekombinantes Protein zu exprimieren.
Beispiele für
Säugetier-Expressionssysteme
schließen
die COS-7-Linien
von Affennieren-Fibroblasten, beschrieben von Gluzman, Cell 23:
175 (1981), und weitere Zelllinien ein, die in der Lage sind, einen
kompatiblen Vektor zu exprimieren, wie z. B. die Zelllinien C127,
HEK-293, 3T3, CHO, HeLa und BHK. Säugetier-Expressionsvektoren umfassen einen Ursprung
der Replikation, einen geeigneten Promotor und Enhancer und ferner
beliebige erforderliche Ribosom-Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Splice-Donor-
und Akzeptorstellen, transkriptionale Terminierungssequenzen und
5'-flankierende
nicht: transkribierte Sequenzen. Die von dem SV40-viralen Genom
abgeleiteten DNA-Sequenzen,
zum Beispiel SV40-Ursprungs-, frühe
Promotor-, Enhancer-, Splice- und Polyadenylierungsstellen können verwendet
werden, um die notwendigen nicht transkribierten genetischen Elemente
bereitzustellen. Repräsentative
nützliche
Vektoren schließen
pRc/CMV und pcDNA3 ein (erhältlich
von Invitrogen, San Diego, CA).
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Die
BS106-Polypeptide werden aus rekombinanten Zellkulturen über bekannte
Verfahren gewonnen und gereinigt, einschließlich Affinitätschromatographie,
Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung,
saure Extraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie,
Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie,
Hydroxyapatitchromatographie oder Lectinchromatographie. Es ist
bevorzugt, dass geringe Konzentrationen (ungefähr 0,1-5 mM) an Calciumionen
während
der Reinigung vorliegen (Price, et al., J. Biol. Chem. 244: 917
(1969)). Protein-Rückfaltungsschritte
können
bei der Vervollständigung der
Konfiguration des Polypeptids je nach Bedarf verwendet werden. Schließlich kann
die Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) für
die abschließenden
Reinigungsschritte verwendet werden.
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Somit
können
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung auf natürliche Weise
gereinigte Produkte, die von einer hochexprimierenden Zelllinie
exprimiert wurden, oder ein Produkt von chemisch-synthetischen Prozeduren
sein oder über
rekombinante Techniken aus einen prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirt (zum Beispiel Zellen von Bakterien, Hefen, höheren Pflanzen,
Insekten und Säugetieren
in Kultur) hergestellt werden. In Abhängigkeit von dem Wirt, der
bei einer rekombinanten Herstellungsprozedur verwendet wird, können die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit Säugetier- oder anderen eukaryotischen
Kohlenhydraten glycosyliert oder nicht-glycosyliert werden. Die Polypeptide
der Erfindung können
ferner einen anfänglichen
Methionin-Aminosäurerest
einschließen.
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Die
Startplasmide können
aus verfügbaren
Plasmiden in Übereinstimmung
mit veröffentlichten,
bekannten Prozeduren konstruiert werden. Zusätzlich sind zu den beschriebenen
Plasmiden äquivalente
Plasmide in dem Fachgebiet bekannt und dem Durchschnittsfachmann
ersichtlich.
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Das
Folgende ist die allgemeine Prozedur für die Isolierung und Analyse
von cDNA-Klonen. In einer besonderen hierin offenbarten Ausführungsform
wurde die mRNA aus Brustgewebe isoliert und für die Erzeugung der cDNA-Bibliothek
verwendet. Das Brustgewebe wurde aus Patienten über chirurgische Resektion
erhalten und von einem Pathologen als Tumor oder Nicht-Tumorgewebe
klassifiziert.
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Die
cDNA-Insertionen aus zufälligen
Isolaten der Brustgewebe-Bibliotheken
wurden teilweise sequenziert, im Detail analysiert, wie in den Beispielen
dargelegt ist und in dem Sequenzprotokoll als Sequenz-Identifikationsnummer
1, Sequenz-Identifikationsnummer
2 und Sequenz-Identifikationsnummer 3 offenbart sind. Die Konsensussequenz
dieser Insertionen ist als Sequenz-Identifikationsnummer 4 dargestellt.
Diese Polynukleotide können
einem gesamten offenen Leserahmen mit oder ohne assoziierte regulatorische
Sequenzen für ein
bestimmtes Gen enthalten, oder sie können nur einen Teil des Gens
von Interesse kodieren. Dies wird der Tatsache zugeschrieben, dass
viele Gene mit einer Länge
von mehreren Hundert und manchmal mehreren Tausend Basen vorliegen
und mit der gegenwärtigen
Technologie auf Grund von Vektor-Einschränkungen, unvollständiger reverser
Transkription des ersten Stranges oder unvollständiger Replikation des zweiten
Stranges nicht in ihrer Gesamtheit kloniert werden können. Zusammenhängende sekundäre Klone,
die zusätzliche Nukleotidsequenzen
enthalten, können
unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren erhalten werden, die dem
Fachmann bekannt sind.
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Verfahren
für die
DNA-Sequenzierung sind in dem Fachgebiet wohl bekannt. Herkömmliche
enzymatische Verfahren verwenden eine DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, Sequenase
(US Biochemical Corp, Cleveland, OH) oder Taq-Polymerase, um DNA-Ketten
von einem Oligonukleotidprimer zu verlängern, das an das DNA-Templat
von Interesse gehängt
ist. Verfahren wurden bereits für
die Verwendung von sowohl einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Templaten
entwickelt. Die Reaktionsprodukte der Kettenterminierung können auf
Gelen aus Harnstoff/Polyacrylamid elektrophoresiert werden und entweder über Autoradiographie (für Radionukleotid-markierte
Vorläufer)
oder über
Fluoreszenz (für
Fluoreszenz-markierte Vorläufer)
detektiert werden. Neueste Verbesserungen bei der mechanisierten
Reaktionsvorbereitung, Sequenzierung und Analyse unter Verwendung
des fluoreszenten Detektionsverfahrens haben die Ausweitung bei
der Anzahl von Sequenzen gestattet, die unter Verwendung von Maschinen,
wie z. B. die Applied Biosystems 377 DNA Sequenzierer (Applied Biosystems,
Foster City, CA), pro Tag bestimmt werden können.
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Der
Leserahmen der Nukleotidsequenz kann über verschiedene Arten von
Analysen sichergestellt werden. Zunächst können Leserahmen, die in der
kodierenden Sequenz enthalten sind, auf das Vorhandensein des Start-Kodons
ATG und des Stopp-Kodons TGA, TAA oder TAG analysiert werden. Typischerweise setzt
sich ein Leserahmen über
den größten Teil
einer cDNA-Sequenz fort, während
andere Leserahmen dazu neigen, zahlreiche Stopp-Kodons zu enthalten.
In solchen Fällen
erfolgt die Leserahmen Bestimmung- direkt. Bei anderen schwierigeren
Fällen
ist eine weitere Analyse erforderlich.
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Algorithmen
sind bereits erstellt worden, um das Auftreten von einzelnen Nukleotidbasen
an jedem mutmaßlichen
Kodontriplett zu analysieren. Siehe zum Beispiel J. W. Fickett,
Nuc. Acids Res. 10: 5303 (1982). Kodierende DNA für bestimmte
Organismen (Bakterien, Pflanzen und Tiere) neigt dazu, bestimmte
Nukleotide in bestimmten Triplett-Periodizitäten zu enthalten, wie z. B.
eine signifikante Präferenz
für Pyrimidine
in der dritten Kodonposition. Diese Präferenzen sind bereits in breit
verbreitet erhältlicher
Software aufgenommen worden, die für die Bestimmung des Kodierungspotenzials
(unter Rahmens) einen gegebenen Strecke von DNA verwendet werden
kann. Die von dem Algorithmus abgeleitete Information, die mit Start-/Stopp-Kodoninformation
kombiniert ist, kann für
die Bestimmung eines geeigneten Rahmens mit einem hohen Grad an
Sicherheit verwendet werden. Dies wiederum gestattet ohne weiteres
die Klonierung der Sequenz in dem richtigen Leserahmen in entsprechende
Expressionsvektoren.
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Die
hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen
können
mit einer Vielzahl von anderen Polynukleotidsequenzen und Vektoren
von Interesse mittels wohl etablierter rekombinanter DNA-Techniken
verknüpft
werden. Siehe J. Sambrook et al., vorstehend. Die Vektoren von Interesse
schließen
Klonierungsvektoren ein, wie z. B. Plasmide, Kosmide, Phagenderivate,
Phagemide als auch Sequenzierungs-, Replikations- und Expressionsvektoren
und dergleichen. Im Allgemeinen enthalten solche Vektoren einen
Ursprung der Replikation, der in mindestens einem Organismus, bequemen
Verdaustellen für
Restriktionsendonukleasen und wählbaren Markern,
die für
bestimmte Wirtszellen angemessen sind, funktional ist. Die Vektoren
können über eine
Vielzahl von Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, in geeignete
Wirtszellen transferiert werden, die danach die gewünschte DNA,
RNA oder Polypeptide erzeugen.
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Gelegentlich
maskieren Fehler der Sequenzierung oder der zufälligen reversen Transkription
das Vorhandensein des angemessenen Leserahmens oder des regulatorischen
Elements. Bei solchen Fällen
ist es möglich,
den richtigen Leserahmen zu bestimmen, indem die Expression des
Polypeptids unternommen und die Aminosäure-Sequenz über standardmäßige Techniken
für die
Kartierung und Sequenzierung bestimmt wird. Siehe F. M. Ausubel
et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York,
NY (1989). Zusätzlich
kann der tatsächliche
Leserahmen einer gegebenen Nukleotidsequenz über Transfektion von Wirtszellen
mit Vektoren bestimmt werden, die alle drei möglichen Leserahmen enthalten.
Nur diejenigen Zellen mit der Nukleotidsequenz in dem richtigen
Leserahmen erzeugen ein Peptid mit der vorhergesagten Länge.
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Die
hierin bereitgestellten Nukleotidsequenzen sind bereits über gegenwärtige automatisierte
Verfahren des Standes der Technik hergestellt worden und können als
solche nicht identifizierte Nukleotide enthalten. Diese stellen
für denjenigen
Fachmann, der die Erfindung ausführen
will, kein Problem dar. Mehrere Verfahren, die standardmäßige rekombinante
Techniken verwenden, die in J. Sambrook (vorstehend) oder periodischen Aktualisierungen
davon beschrieben sind, können
für die
Vervollständigung
der fehlenden Sequenzinformation verwendet werden. Die gleichen
Techniken, die verwendet werden, damit eine wie hierin beschriebene
Sequenz mit vollständiger
Länge erhalten
wird, können
verwendet werden, um die Nukleotidsequenzen zu erhalten.
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Die
Expression einer bestimmten cDNA kann durch Subklonieren der cDNA
in einen angemessenen Expressionsvektor und Transfektieren dieses
Vektors in einen angemessenen Expressionswirt bewerkstelligt werden.
Der für
die Erzeugung der BrustgewebecDNA-Bibliothek verwendete Klonierungsvektor
kann zum Transkribieren von mRNA einer bestimmten cDNA verwendet
werden, und enthält
einen Promotor für
Beta-galactosidase, ein Aminoterminales Met und die nachfolgenden
sieben Aminosäuregruppen
der Beta-galactosidase. Unmittelbar auf diese acht Gruppen folgen
ein gezüchteter
Bakteriophagenpromotor, der für
das künstliche
Priming und die Transkription nützlich
ist, als auch eine Anzahl von einzigartigen Restriktionsstellen,
einschließlich
EcoRI, für
die Klonierung. Der Vektor kann in einen angemessenen Wirtsstrang
von E. coli transfiziert werden.
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Die
Einführung
des isolierten bakteriellen Stranges mit Isopropylthiogalactosid
(IPTG) unter Verwendung von standardmäßigen Verfahren erzeugt ein
Fusionsprotein, das die ersten sieben Gruppen von Beta-galactosidase,
etwa 15 Gruppen an Linker und das Peptid in der cDNA kodiert enthält. Da die
cDNA-Kloninsertionen über einen
im Wesentlichen zufälligen
Prozess erzeugt werden, besteht eine Wahrscheinlichkeit von eins zu
drei, dass die beinhaltete cDNA in dem richtigen Rahmen für die passende
Translation liegt. Wenn sich die cDNA nicht in dem passenden Leserahmen
befindet, kann der richtige Rahmen über Deletion oder Insertion einer
entsprechenden Anzahl von Basen über
wohl bekannte Verfahren bezogen werden, einschließlich in
vitro Mutagenese, Verdau mit Exonuklease III oder Mungbohnen-Nuklease, oder Oligonukleotidlinker-Einschluss.
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Die
cDNA kann in andere Vektoren, von denen bekannt ist, dass sie für die Expression
von Proteinen in spezifischen Wirten nützlich sind, eingeschleust
werden. Die Oligonukleotidprimer, die Klonierungsstellen und Segmente
von DNA enthalten, die für
die Hybridisierung an Strecken an beiden Enden der Ziel-cDNA ausreichend
sind, können
chemisch über
standardmäßige Verfahren
synthetisiert werden. Diese Primer können danach verwendet werden,
um die gewünschten
Gensegmente über
die PCR zu amplifizieren. Die resultierenden neuen Gensegmente können mit
entsprechenden Restriktionsenzymen unter standardmäßigen Bedingungen
verdaut und über
Gelelektrophorese isoliert werden. Alternativ dazu können ähnliche
Gensegmente über
Verdau der cDNA mit entsprechenden Restriktionsenzymen und Füllen der
fehlenden Gensegmente mit chemisch synthetisierten Oligonukleotiden
erzeugt werden. Die Segmente der kodierenden Sequenz aus mehr als
einem Gen können
zusammen ligiert und in entsprechenden Vektoren geklont werden,
um die Expression der rekombinanten. Sequenz zu optimieren.
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Geeignete
Expressionswirte- für
solche chimären
Moleküle schließen Säugetierzellen,
wie z. B. Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) und menschliche
embryonische Nierenzellen (HEK) 293, Insektenzellen, wie z. B. Sf9-Zellen,
Hefezellen, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae, und Bakterien, wie
z. B. E. coli ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Für jede dieser
Zellsysteme kann eine nützlicher
Expressionsvektor ferner einen Ursprung der Replikation einschließen, um
die Propagierung in Bakterien zu gestatten, und einen wählbaren
Marker, wie z. B. das Beta-Lactamase-Antibiotika-Resistenzgen, um
eine Selektion in Bakterien zu gestatten. Zusätzlich können die Vektoren einen zweiten
wählbaren
Marker einschließen,
wie z. B. das Neomycin-Phosphotransferasegen, um die Selektion in
transfizierten eukaryotischen Wirtszellen zu gestatten. Die Vektoren
für die
Verwendung in eukaryotischen Expressionswirten können die Addition eines 3'-Poly-A-Schwanzes
erfordern, wenn es der Sequenz von Interesse an poly A fehlt.
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Zusätzlich kann
der Vektor Promotoren oder Enhancer beinhalten, die die Genexpression
steigern. Solche Promotoren sind Wirtsspezifisch und schließen MMTV-,
SV40- oder Metallothionin-Promotoren
für CHO-Zellen;
trp-, lac-, tac- oder T7-Promotoren für bakterielle Wirte; oder Alpha
Faktor-, Alkoholoxidase- oder PGH-Promotoren für Hefe ein, sind aber nicht
darauf eingeschränkt.
Die adenoviralen Vektoren mit oder ohne Transkriptionsenhancern,
wie z. B. der Rous-Sarkom-Virus (RSV) Enhancer, können verwendet
werden, um die Proteinexpression in säugetierischen Zelllinien anzutreiben.
Sobald homogene Kulturen an rekombinanten Zellen erhalten werden,
können
große
Mengen an rekombinant erzeugtem Protein aus dem konditionierten Medium
gewonnen und unter Verwendung von in dem Fachgebiet wohl bekannten
chromatographischen Verfahren analysiert werden. Ein alternatives
Verfahren für
die Herstellung von großen
Mengen an sezerniertem Protein beinhaltet die Transfektion von Säugetierembryonen
und die Gewinnung des rekombinanten Proteins aus Milch, die von
transgenen Kühen,
Ziegen, Schafen, usw., hergestellt wird. Polypeptide und eng verwandte Moleküle können rekombinant
auf eine solche Art und Weise exprimiert werden, um die Proteinreinigung
zu erleichtern. Ein Ansatz beinhaltet die Expression eines chimären Proteins,
das eine oder mehrere zusätzliche Polypeptiddomänen einschließt, die
auf menschlichen Polypeptiden nicht natürlich vorkommen. Solche die Reinigung
vereinfachenden Domänen
schließen
Metall-chelatisierende Peptide, wie z. B. Histidin-Tryptophan-Domänen, die
eine Reinigung auf immobilisierten Metallen gestatten, Protein A
Domänen,
die eine Reinigung auf immobilisiertem Immunoglobulin gestatten,
und die in dem FLAGS Extensions-/Affinitätsreinigungssystem (Immunex
Corp, Seattle, WA) verwendete Domäne ein, sind aber nicht darauf
eingeschränkt.
Der Einschluss einer abspaltbaren Linkersequenz, wie z. B. Faktor
XA oder Enterokinase von Invitrogen (San Diego, CA) zwischen der
Polypeptidsequenz und der Reinigungsdomäne, kann für die Gewinnung des Polypeptids nützlich sein.
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Immunoassays
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Die
BS106-Polypeptide, einschließlich
Fragmente, Derivate und Analoge davon, oder solche Polypeptide exprimierende
Zellen können
bei einer Vielzahl von Assays, von denen viele hierin beschrieben
sind, für die
Detektion von Antikörpern
gegen Brustgewebe verwendet werden. Sie können ferner als Immunogene
zur Erzeugung von Antikörpern
verwendet werden. Diese Antikörper
können
zum Beispiel polyklonale oder monoklonale Antikörper, chimäre, einkettige und humanisierte
Antikörper
als auch Fab-Fragmente
oder das Produkt einer Fab-Expressionsbibliothek sein. Verschiedene
in dem Fachgebiet bekannte Prozeduren können für die Herstellung von solchen
Antikörpern
und Fragmenten verwendet werden.
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Zum
Beispiel können
Antikörper,
die gegen ein Polypeptid erzeugt werden, das eine Sequenz der vorliegenden
Erfindung umfasst, über
die direkte Injizierung des Polypeptids in ein Tier oder durch Verabreichung des
Polypeptids an ein Tier, wie z. B. eine Maus, Kaninchen, Ziege oder
Mensch, erhalten werden. Eine Maus, ein Kaninchen oder eine Ziege
sind bevorzugt. Das Polypeptid wird gewählt aus der Gruppe bestehend
aus Sequenz-Identifikationsnummer
16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer
18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer
20 und Fragmenten davon. Der so erhaltene Antikörper bindet danach das Polypeptid
selbst. Auf diese Art und Weise kann sogar eine Sequenz, die nur
ein Fragment des Polypeptids kodiert, für die Erzeugung von Antikörpern verwendet
werden, die das native Polypeptid binden. Solche Antikörper können danach
verwendet werden, um das Polypeptid aus Testproben zu isolieren,
wie z. B. Gewebe, von dem vermutet wird, dass es dieses Polypeptid
enthält.
Für die
Herstellung von monoklonalen Antikörpern kann eine beliebige Technik
verwendet werden, die Antikörper
bereitstellt, die von kontinuierlichen Zelllinienkulturen hergestellt
wurden. Beispiele schließen
die Hybridoma-Technik, wie von Kohler und Milstein, Nature 256:
495-497 (1975) beschrieben, die Trioma-Technik, die menschliche B-Zellen-Hybridoma-Technik,
wie von Kozbor et al., Immun. Today 4: 72 (1983) beschrieben ist,
und die EBV-Hybridoma-Technik für
die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern, wie
von Cole et al., in: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan
R. Liss, Inc., New York, NY, S. 77-96 (1985) beschrieben ist. Für die Herstellung
von einkettigen Antikörpern
beschriebene Techniken können
angepasst werden, um einkettige Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte
dieser Erfindung zu erzeugen. Siehe zum Beispiel das
US-Patent Nr. 4,946,778 .
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Verschiedene
Assayformate können
die Antikörpern
der vorliegenden Erfindung, einschließlich "Sandwich"-Immunoassays und Sondenassays, verwenden.
Zum Beispiel können
die Antikörper
der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon in verschiedenen
Assaysystemen verwendet werden, um das Vorhandensein, falls überhaupt,
von BS106-Antigen in einer Testprobe zu bestimmen. Zum Beispiel
wird bei einem ersten Assayformat ein polyklonaler oder monoklonaler
Antikörper
oder Fragment davon oder eine Kombination dieser Antikörper, die
auf eine feste Phase aufgebracht wurden, mit einer Testprobe in
Kontakt gebracht, um ein erstes Gemisch zu bilden. Dieses erste
Gemisch wird für
eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Antigen/Antikörperkomplexen
ausreichend sind. Danach wird ein Indikatorreagenz, das einen monoklonalen
oder ein polyklonalen Antikörper
oder ein Fragment davon oder eine Kombination von diesen Antikörpern umfasst,
an die eine Signal-erzeugende Verbindung gebunden worden ist, mit
den Antigen/Antikörper-Komplexen in Kontakt
gebracht, um ein zweites Gemisch zu bilden. Dieses zweite Gemisch wird
danach für
eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexen
ausreichend sind. Das Vorhandensein von BS106-Antigen in der Testprobe
und der Einfang an der festen Phase, falls überhaupt, wird über Detektion
des messbaren Signals bestimmt, das von der Signal-erzeugenden Verbindung
erzeugt wird. Die Menge an BS106-Antigen, die in der Testprobe vorhanden
ist, ist zu dem erzeugten Signal proportional.
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Bei
einem alternativen Assayformat wird ein Gemisch durch In-Kontakt-Bringen von
folgendem gebildet: (1) ein polyklonaler Antikörper, monoklonaler Antikörper oder
Fragment davon, die spezifisch an das BS106-Antigen binden, oder
eine Kombination von solchen Antikörpern, gebunden an einen festen
Träger;
(2) die Testprobe; und (3) ein Indikatorreagenz, das einen monoklonalen
Antikörper,
polyklonalen Antikörper
oder Fragment davon umfasst, die spezifisch an ein verschiedenes
BS106-Antigen (oder eine Kombination von diesen Antikörpern) binden,
an die eine Signal-erzeugende Verbindung gebunden ist. Dieses Gemisch
wird für eine
Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexen
ausreichend sind. Das Vorhandensein, falls überhaupt, von BS106-Antigen,
das in der Testprobe vorhanden ist und an der festen Phase eingefangen
wurde, wird über
Detektion des messbaren Signals bestimmt, das von der Signal-erzeugenden
Verbindungen erzeugt wird. Die Menge an BS106-Antigen, die in der
Testprobe vorhanden ist, ist zu dem erzeugten Signal proportional.
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In
einem weiteren Assayformat kann ein oder eine Kombination von mindestens
zwei monoklonalen Antikörpern
der Erfindung als eine kompetitive Sonde für die Detektion von Antikörpern gegen
das BS106-Antigen verwendet werden. Zum Beispiel werden BS106-Polypeptide, wie
z. B. die hierin offenbarten rekombinanten Antigene, entweder allein
oder in Kombination auf eine feste Phase aufgebracht. Eine Testprobe,
von der vermutet wird, dass sie Antikörper gegen das BS106-Antigen
enthält,
wird danach mit einem Indikatorreagenz, das eine Signal-erzeugende
Verbindung umfasst, und mindestens einem monoklonalen Antikörper der Erfindung
für eine
Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen ausreichend
sind, wobei entweder die Testprobe und das Indikatorreagenz an die
feste Phase gebunden sind oder das Indikatorreagenz an die feste
Phase gebunden ist. Die Verringerung bei der Bindung des monoklonalen
Antikörpers
an die feste Phase kann quantitativ gemessen werden.
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In
einem noch weiteren Detektionsverfahren kann jeder der monoklonalen
oder polyklonalen Antikörper
der vorliegenden Erfindung bei der Detektion von BS106-Antigenen
in Gewebeabschnitten als auch in Zellen über immunohistochemische Analyse
verwendet werden. Die cytochemische Analyse, bei der diese Antikörper direkt
(mit zum Beispiel Fluorescein, kolloidalem Gold, Meerretich-Peroxidase,
alkalische Phosphatase, usw.) markiert sind oder unter Verwendung
von sekundär
markierten Anti-Spezies-Antikörpern
(mit verschiedenen Markern, wie hierin beispielhaft dargestellt)
markiert sind, um die Histopathologie einer Erkrankung zu verfolgen,
befinden sich ebenfalls in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
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Außerdem können diese
monoklonalen Antikörper
an Matrizen, ähnlich
zu CNBr-aktivierter Sepharose, gebunden und für die Affinitätsreinigung
von spezifischen BS106-Polypeptiden aus Zellkulturen oder biologischen
Geweben, wie z. B. für
die Reinigung von rekombinanten und nativen BS106-Proteinen, verwendet werden.
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Die
monoklonalen Antikörper
der Erfindung können
ferner für
die Erzeugung von chimären
Antikörpern zur
therapeutischen Verwendung oder anderen ähnlichen Anwendungen verwendet
werden.
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Die
monoklonalen Antikörper
oder Fragmente davon können
einzeln bereitgestellt werden, um BS106-Antigene zu detektieren.
Kombinationen der hierin bereitgestellten monoklonalen Antikörper (und
Fragmente davon) können
ferner zusammen als Komponenten in einem Gemisch oder "Cocktail" aus mindestens einem
BS106-Antikörper
der Erfindung zusammen mit Antikörpern
verwendet werden, die spezifisch an weitere BS106-Regionen binden,
wobei jeder Antikörper über verschiedene
Bindungsspezifitäten
verfügt.
Somit kann dieser Cocktail die monoklonalen Antikörper der
Erfindung einschließen,
die gegen hierin offenbarte BS106-Polypeptide und weitere monoklonale
Antikörper
gerichtet sind, die für
andere antigene Determinanten von BS106-Antigenen oder anderen verwandten
Proteinen spezifisch sind.
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Der
polyklonale Antikörper
oder Fragment davon, die bei den Assayformaten verwendet werden
können,
sollten spezifisch an ein BS106-Polypeptid oder an weitere BS106-Polypeptide,
die bei dem Assay zusätzlich
verwendet werden, binden. Der vorzugsweise verwendete polyklonale
Antikörper
stammt aus einem Säugetier,
wie z. B. ein polyklonaler Antikörper
aus Mensch, Ziege, Kaninchen oder Schaf, der das BS106-Polypeptid
bindet. Am stärksten
bevorzugt stammt der polyklonale Antikörper aus Kaninchen. Die bei
den Assays verwendeten polyklonalen Antikörper können entweder allein oder als
ein Cocktail aus polyklonalen Antikörpern verwendet werden. Da
die Cocktails, die bei den Assayformaten verwendet werden, entweder
monoklonale Antikörper
oder polyklonale Antikörper
mit einer unterschiedlichen Bindungsspezifität gegenüber BS106-Polypeptiden umfassen, sind sie zum
Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren
oder zum Bestimmen der Prädisposition
gegenüber
Erkrankungen und Zuständen
der Brust, wie z. B. Brustkrebs, nützlich.
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Es
ist vorgesehen und in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung,
dass das BS106-Antigen in Assays durch die Verwendung eines rekombinanten
Antigens als auch durch die Verwendung eines synthetischen Peptids
oder gereinigten Peptids detektierbar sein kann, wobei das Peptid
eine Aminosäure-Sequenz von
BS106 umfasst. Die Aminosäure-Sequenz
eines solchen Polypeptids wird gewählt aus der Gruppe bestehend
aus Sequenz-Identifikationsnummer
16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer
18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer
20 und Fragmenten davon. Es liegt ebenfalls in dem Schutzumfang
der vorliegenden Erfindung, dass verschiedene synthetische, rekombinante
oder gereinigte Peptide, die verschiedene Epitope von BS106 identifizieren,
in Kombination in einem Assay zum Detektieren, Diagnostizieren,
Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder zum Bestimmen der Prädisposition
gegenüber
Erkrankungen und Zuständen
der Brust, wie z. B. Brustkrebs, verwendet werden können. In
diesem Fall können
sämtliche
dieser Peptide auf eine feste Phase aufgebracht werden; oder jedes getrennte
Peptid kann auf getrennte feste Phasen, wie z. B. Mikroteilchen,
aufgebracht und danach zur Bildung eines Gemisches aus Peptiden
kombiniert werden, das später
bei Assays verwendet werden kann. Außerdem ist es vorgesehen, dass
mehrere Peptide, die Epitope von verschiedenen Antigenen definieren,
zum Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren
oder zum Bestimmen der Prädisposition
gegenüber
Erkrankungen und Zuständen
der Brust, wie z. B. Brustkrebs, verwendet werden können. Peptide,
die auf feste Phasen aufgetragen oder mit detektierbaren Markern
markiert sind, wird danach gestattet, mit denjenigen, die in einer
Patientenprobe (falls überhaupt)
vorhanden sind, um eine eingeschränkte Menge an Antikörper zu
konkurrieren. Eine Verringerung in der Bindung der synthetischen,
rekombinanten oder gereinigten Peptide an den Antikörper (oder
die Antikörper)
ist ein Anzeichen für
das Vorhandensein von BS106-Antigen in der Patientenprobe. Das Vorhandensein
von BS106-Antigen zeigt das Vorhandensein einer Brustgewebe-Erkrankung,
insbesondere Brust- krebs, in dem Patienten an. Variationen von
Assayformaten sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und viele werden
hierin nachstehend diskutiert.
-
In
einem weiteren Assayformat kann das Vorhandensein von anti-BS106-Antikörper und/oder BS106-Antigen
in einem simultanen Assay detektiert werden, wie folgt. Eine Testprobe
wird gleichzeitig mit einem Einfangsreagenz eines ersten Analyten
in Kontakt gebracht, wobei das erste Einfangsreagenz einen ersten
Bindungsvertreter, spezifisch für
einen ersten Analyten, an eine feste Phase gebunden, und ein Einfangsreagenz
für einen
zweiten Analyten umfasst, wobei das erste Einfangsreagenz einen
ersten Bindungsvertreter für
einen zweiten Analyten an eine zweite feste Phase gebunden umfasst,
um dadurch ein Gemisch zu bilden. Dieses Gemisch wird für eine Zeit
und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Komplexen aus
Einfangreagenz/erster Analyt und Einfangsreagenz/zweiter Analyt
ausreichend sind. Diese so gebildeten Komplexe werden danach mit
einem Indikatorreagenz, das einen Vertreter eines Bindungspaares,
spezifisch für
den ersten Analyten, markiert mit einer Signal-erzeugenden Verbindung,
umfasst, und mit einem Indikatorreagenz in Kontakt gebracht, das
einen Vertreter eines Bindungspaares, spezifisch für den zweiten
Analyten, markiert mit einer Signal-erzeugenden Verbindung, umfasst,
um ein zweites Gemisch zu bilden. Dieses zweite Gemisch wird für eine Zeit
und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Komplexen aus
Einfangsreagenz/erster Analyt/Indikatorreagenz und Komplexen aus
Einfangsreagenz/zweiter Analyt/Indikatorreagenz ausreichend sind.
Das Vorhandensein von einem oder mehreren Analyten wird über Detektion
eines Signals bestimmt, das in Verbindung mit den Komplexen, die
an entweder einer oder an beiden festen Phasen gebildet werden,
als ein Anzeichen für
das Vorhandensein von einem oder mehreren Analyten in der Testprobe
erzeugt wird. Bei diesem Assayformat können rekombinante Antigene,
die von den hierin offenbarten Expressionssystemen abgeleitet sind,
als auch monoklonale Antikörper
verwendet werden, die aus den Proteinen hergestellt werden, die
von den wie hierin offenbarten Expressionssystemen abgeleitet sind.
Zum Beispiel kann bei diesem Assaysystem das BS106-Antigen der erste
Analyt sein. Solche Assaysysteme sind in der
EP Veröffentlichung
Nr. 0473065 detaillierter beschrieben.
-
In
noch weiteren Assayformaten können
die hierin offenbarten Polypeptide verwendet werden, um das Vorhandensein
von einem Antikörper
gegen das BS106-Antigen in Testproben zu detektieren. Zum Beispiel wird
eine Testprobe mit einer festen Phase inkubiert, an die mindestens
ein Polypeptid, wie z. B. ein rekombinantes Protein oder synthetisches
Peptid, gebunden worden ist. Das Polypeptid ist gewählt aus
der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer
17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer
20 und Fragmenten davon. Diese werden für eine Zeit und unter Bedingungen
zur Reaktion gebracht, die zur Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen
ausreichend sind. Im Anschluss an die Inkubation wird der Antigen/Antikörper-Komplex detektiert.
Indikatorreagenzien können
verwendet werden, um in Abhängigkeit
von dem gewählten
Assaysystem die Detektion zu erleichtern. In einem weiteren Assayformat
wird eine Testprobe mit einer festen Phase in Kontakt gebracht,
an die ein wie hierin beschrieben hergestelltes rekombinantes Protein
gebunden ist, und ferner mit einem für das Protein spezifischen
monoklonalen oder polyklonalen Antikörper in Kontakt gebracht, der vorzugsweise
mit einem Indikatorreagenz markiert worden ist. Nach Inkubation
für einen
Zeit und unter Bedingungen, die zur Bildung von Antikörper/Antigen-Komplexen
ausreichend sind, wird die feste Phase von der freien Phase getrennt
und der Marker wird in entweder der festen oder der freien Phase
als ein Anzeichen für das
Vorhandensein von einem Antikörper
gegen das BS106-Antigen detektiert. Weitere Assayformate, die die hierin
offenbarten rekombinanten Antigene verwenden, sind vorgesehen. Diese
schließen
das In-Kontakt-Bringen einer Testprobe mit einer festen Phase ein,
an die mindestens ein Antigen aus einer ersten Quelle gebunden worden
ist, Inkubieren der festen Phase und der Testprobe für eine Zeit
und unter Bedingungen, die zur Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen
ausreichend sind, und danach In-Kontakt-Bringen der festen Phase
mit einem markierten Antigen, wobei das Antigen von einer zweiten
Quelle, die von der ersten Quelle verschieden ist, abgeleitet ist.
Zum Beispiel wird ein rekombinantes Protein, von einer ersten Quelle,
wie z. B. E. coli abgeleitet, als ein Einfangsantigen an einer festen
Phase verwendet, eine Testprobe wird der so präparierten festen Phase zugegeben
und nach einer standardmäßigen Inkubation
und Waschungsschritten, wie erachtet oder erforderlich, wird ein
rekombinantes Protein, das von einer verschiedenen Quelle abgeleitet
ist (d. h. nicht E. coli), als ein Teil eines Indikatorreagenz verwendet,
das anschließend
detektiert wird. Gleichermaßen sind
Kombinationen aus einem rekombinanten Antigen auf einer festen Phase
und einem synthetischen Peptid in der Indikatorphase ebenfalls möglich. Ein
beliebiges Assayformat, das ein für BS106 spezifisches Antigen, das
aus einer ersten Quelle hergestellt oder abgeleitet ist, als das
Einfangsantigen und ein für
BS106 spezifisches Antigen aus einer verschiedenen zweiten Quelle
verwendet, ist vorgesehen. Somit befinden sich verschiedene Kombinationen
von rekombinanten Antigen als auch die Verwendung von synthetischen
Peptiden, gereinigten Proteinen und dergleichen in dem Schutzumfang
dieser Erfindung. Assays, wie z. B. dieser, und andere sind in dem
US-Patent Nr. 5,254,458 beschrieben,
der mit diesem einen gemeinsamen Inhaber teilt.
-
Weitere
Ausführungsformen,
die zahlreiche andere feste Phasen verwenden, sind ebenfalls vorgesehen
und befinden sich in dem Schutzumfang dieser Erfindung. Zum Beispiel
können
Ioneneinfangsprozeduren zur Immobilisierung eines immobilisierbaren
Reaktionskomplexes mit einem negativ geladenen Polymer (beschrieben
in der
EP-Veröffentlichung Nr. 0326100 und
der
EP-Veröffentlichung Nr. 0406473 )
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, um eine schnelle immunochemische Reaktion
von Lösung-Phase
zu bewirken. Ein immobilisierbarer Immunkomplex wird von dem Rest
des Reaktionsgemisches über
ionische Wechselwirkungen zwischen dem negativ geladenen Poly Anion/Immun-Komplex
und der zuvor behandelten positiv geladenen porösen Matrix getrennt und unter
Verwendung von verschiedenen zuvor beschriebenen Signal-erzeugenden
Systemen detektiert, einschließlich
derjenigen, die bei chemilumineszenten Signalmessungen beschrieben
sind, wie in der
EPO-Veröffentlichung
Nr. 0 273,115 beschrieben ist.
-
Ferner
können
die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in Systemen
angepasst werden, die eine Mikroteilchen Technologie verwenden,
einschließlich
automatisierte und halbautomatisierte Systeme, in denen die feste
Phase ein Mikroteilchen (magnetisch oder nicht magnetisch) umfasst.
Solche Systeme schließen
diejenigen ein, die zum Beispiel in den veröffentlichten EPO-Anmeldungen
Nrn.
EP 0 425 633 bzw.
EP 0 424 634 beschrieben
sind.
-
Die
Verwendung von Raster-Sonden-Mikroskopie (SPM) für Immunoassays ist ebenfalls
eine Technologie, der die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung
ohne weiteres angepasst werden können. Bei
der Raster-Sonden-Mikroskopie, insbesondere bei der Raster-Kraft-Mikroskopie,
ist die Einfangsphase, zum Beispiel zumindest einer der monoklonalen
Antikörper
der Erfindung, an eine feste Phase angeheftet und ein Raster-Sonden-Mikroskop
wird für
die Detektion von Antigen/Antikörper-Komplexen
verwendet, die an der Oberfläche
der festen Phase vorhanden sein können. Die Verwendung von Raster-Tunnel-Mikroskopie
beseitigt die Notwendigkeit nach Markern, die normalerweise bei
vielen Immunoassaysystemen verwendet werden müssen, um Antigen/Antikörper-Komplexe
zu detektieren. Die Verwendung von SPM für die Verfolgung von spezifischen
Bindungsreaktionen kann auf viele Arten erfolgen. In einer Ausführungsform
ist ein Vertreter eines spezifischen Bindungspartners (Analyt-spezifische
Substanz, die der monoklonale Antikörper der Erfindung ist) an
eine zum Scannen geeignete Oberfläche gebunden. Die Anbindung
der Analytspezifischen Substanz kann über Adsorption an ein Teststück, das
eine feste Phase aus einer Kunststoff- oder Metalloberfläche umfasst,
gefolgt von Verfahren erfolgen, die dem Durchschnittsfachmann bekannt
sind. Oder eine kovalente Anbindung eines spezifischen Bindungspartners
(Analytspezifische Substanz) an ein Test Stück, wobei das Teststück eine
feste Phase aus derivatisiertem Kunststoff, Metall, Silizium oder
Glas umfasst, kann verwendet werden. Die Verfahren zur kovalenten
Anbindung sind dem Fachmann bekannt und schließen eine Vielzahl von Mitteln
ein, um spezifische Bindungspartner mit dem Teststück irreversibel
zu verknüpfen.
Wenn das Teststück Silizium
oder Glas ist, muss die Oberfläche
vor der Anbindung des spezifischen Bindungspartners aktiviert werden.
Ferner können
Polyelektrolyt-Wechselwirkungen verwendet werden, um einen spezifischen
Bindungspartner an einer Oberfläche
eines Teststücks
unter Verwendung von Techniken und Chemikalien zu immobilisieren.
Das bevorzugte Verfahren der Anbindung ist über kovalente Wege. Nach der
Anbindung eines spezifischen Bindungsvertreters kann die Oberfläche mit
Materialien, wie z. B. Serum, Proteine oder andere Blockierungsmittel,
zur Minimierung einer nicht spezifischen Bindung weiter behandelt
werden. Die Oberfläche kann
ferner entweder an der Stelle der Herstellung oder dem Punkt für die Verwendung
gescannt werden, um ihre Eignung für Assayzwecke zu verifizieren.
Der Scanprozess wird die spezifischen Bindungseigenschaften des
Teststücks
voraussichtlich nicht verändern.
-
Während die
vorliegende Erfindung die Präferenz
für die
Verwendung von festen Phasen offenbart, ist es vorgesehen, dass
die Reagenzien, wie z. B. Antikörper,
Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung, in Assaysystemen
ohne feste Phase verwendet werden können. Diese Assaysysteme sind
dem Fachmann bekannt und werden als in dem Schutzumfang der vorliegenden
Erfindung liegend betrachtet.
-
Es
ist vorgesehen, dass das für
den Assay verwendete Reagenz in Form eines Testkits mit einem oder mehreren
Behältern,
wie z. B. Fläschchen
oder Gläschen,
bereitgestellt werden kann, wobei jeder Behälter ein separates Reagenz
enthält,
wie z. B. eine Sonde, einen Primer, monoklonalen Antikörper oder
ein Cocktail aus monoklonalen Antikörpern, oder ein Polypeptid
(z. B. rekombinant, synthetisch hergestellt oder gereinigt), das in
dem Assay verwendet wird. Das Polypeptid wird gewählt aus
der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer
17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer
19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon. Weitere
Komponenten, wie z. B. Puffer, Kontrollen und dergleichen, die dem
Durchschnittsfachmann bekannt sind, können in solchen Testkits eingeschlossen
sein. Es ist ferner vorgesehen, Testkits bereitzustellen, die über Mittel
zum Sammeln von Testproben verfügen,
umfassend zugängliche
Körperflüssigkeiten,
z. B. Blut, Urin, Speichel und Stuhl. Solche zum Sammeln nützliche
Werkzeuge ("Sammelmaterialien") schließen Lanzetten
und Saugpapier oder Stoff zum Sammeln und Stabilisieren von Blut;
Tupfer zum Sammeln und Stabilisieren von Speichel; Becher zum Sammeln
und Stabilisieren von Urin- oder Stuhlproben ein. Die Sammelmaterialien,
wie z. B. Papier, Stoff, Tupfer, Becher und dergleichen können wahlweise
behandelt sein, um eine Denaturierung oder irreversible Adsorption
der Probe zu verhindern. Die Sammelmaterialien können auch mit Konservierungsmitteln,
Stabilisatoren oder antimikrobiellen Mitteln behandelt sein oder
diese enthalten, um bei der Erhaltung der Integrität der Proben
zu helfen. Testkits, die für
die Sammlung, Stabilisierung und Konservierung von Testproben ausgelegt
sind, die über
einen chirurgischen Eingriff oder Nadelbiopsie erhalten wurden,
sind ebenfalls nützlich. Es
ist vorgesehen, dass sämtliche
Kits in zwei Komponenten konfiguriert sein können, die getrennt bereitgestellt
werden können;
eine Komponente für
die Sammlung und den Transport der Probe und die andere Komponente
für die
Analyse der Probe. Die Sammelkomponente kann zum Beispiel dem Benutzer
des offenen Marktes bereitgestellt werden, während die Komponenten für die Analyse
anderen Benutzern, wie z. B. Laborpersonal, für die Bestimmung des Vorhandenseins,
Fehlens oder der Menge eines Analyten bereitgestellt werden können. Ferner
können
Kits für
die Sammlung, Stabilisierung und Konservierung der Testproben zur
Verwendung durch ungeübtes
Personal konfiguriert und auf dem offenen Markt für die private
Verwendung mit einem anschließenden
Transport in ein Labor zur Analyse der Testprobe erhältlich sein.
-
Das
E. coli Bakterium (Klon 1662885) ist bei der American Type Culture
Collection (A.T.C.C.), 12301 Parklaven Drive, Rockville, Maryland
20852, mit Datum 20-Nov-96, gemäß den Bestimmungen
des Budapester Abkommens, hinterlegt worden, und wird für einen
Zeitraum von dreißig
(30) Jahren ab dem Datum der Hinterlegung oder für fünf (5) Jahre nach der letzten
Anfrage nach der Hinterlegung oder für die durchsetzbare Dauer des
US-Patents aufbewahrt, je nachdem was länger dauert. Die Hinterlegung
und ein beliebiges anderes hinterlegtes Material, das hierin beschrieben
ist, werden ausschließlich
der Bequemlichkeit wegen bereitgestellt und sind für die Ausführung der
vorliegenden Erfindung angesichts der hierin bereitgestellten Lehre nicht
erforderlich. Die cDNA-Sequenz in sämtlichen der hinterlegten Materialien
ist hierin durch Bezugnahme aufgenommen. Dem Klon 1662885 wurde
die A.T.C.C. Hinterlegungs-Nr. 98256 zugeteilt.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen beschrieben,
die für
die Erläuterung
aber nicht für
die Einschränkung
des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1: Identifizierung von BS106-Gen-spezifischen
Klonen der Brustgewebe-Bibliothek
-
A. Bibliotheksvergleich von exprimierten
Sequenzabschnitten (ESTs) oder Transkript-Abbildungen.
-
Teilsequenzen
von cDNA-Kloninsertionen,
sogenannte "exprimierte
Sequenzabschnitte" (ESTs),
wurden von cDNA-Bibliotheken abgeleitet, die aus Tumorgeweben der
Brust, Nicht-Tumorgeweben der Brust und zahlreichen anderen Geweben,
und zwar sowohl. Tumor als auch Nicht-Tumor, erstellt wurden, und
in eine Datenbank (LIFESEQ
TM Datenbank,
erhältlich
von Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) als Gentranskript-Abbildungen
eingegeben. Siehe die Internationale Veröffentlichung Nr.
WO 95/20681 . (Eine Transkript-Abbildung ist
ein Protokoll der Anzahl von ESTs für jedes der dargestellten Gene
in einer gegebenen Gewebe-Bibliothek. Die
ESTs, die sich Regionen mit einer gegenseitigen Sequenzüberlappung
teilen, werden in Clustern eingeordnet. Einem Cluster wird eine
Klonnummer von einem repräsentativen
5'-EST zugewiesen.
Oft kann ein Cluster von Interesse ausgeweitet werden, indem dessen
Konsenssequenz mit Sequenzen von anderen ESTs verglichen wird, die
die Kriterien für
eine automatisierte Clusterung nicht erfüllt haben. Das Alignment von sämtlichen
verfügbaren
Clustern und einzelnen ESTs stellt ein Contig dar, von dem eine
Konsenssequenz abgeleitet wird.) Die Transkript-Abbildungen werden danach ausgewertet,
um die EST-Cluster zu identifizieren, die in erster Linie für die Brustgewebe-Bibliotheken repräsentativ
waren. Diese Ziel-Cluster wurden danach gemäß ihrer Abundanz (Auftreten
von EST-Vertretern) in den Ziel-Bibliotheken und ihrem Fehlen aus
Hintergrundbibliotheken eingeordnet. Hochabundanten Clustern mit
einem niedrigen Hintergrundauftreten wurde eine höhere Untersuchungspriorität gegeben.
Die überlappenden
Klone 1662885 (Sequenz-Identifikationsnummer 1), 893988 (Sequenz-Identifikationsnummer
2) und 1209814 (Sequenz-Identifikationsnummer
3) wurden für
eine weitere Untersuchung identifiziert. Diese repräsentierten
die minimale Anzahl an Klonen, die für die Bildung des BS106-Contigs
erforderlich waren unter aus denen die hierin bereitgestellte Konsenssequenz (Sequenz-Identifikationsnummer
4) abgeleitet wurde.
-
B. Erzeugung einer Konsenssequenz.
-
Die
Nukleotidsequenzen der EST-Klone, 1662885 (Sequenz-Identifikationsnummer
1), 893988 (Sequenz-Identifikationsnummer 2) und 1209814 (Sequenz-Identifikationsnummer
3), wurden in das SequencherTM Programm
(erhältlich
von Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) eingegeben, um ein Nukleotid-Alignment
(Contig-Karte) zu erzeugen, und danach ihre Konsenssequenz (Sequenz-Identifikationsnummer
4) zu erzeugen. Die 1 zeigt das Nukleotidsequenz-Alignment
von diesen Klonen und ihre resultierende Konsensus-Nukleotidsequenz
(Sequenz-Identifikationsnummer 4). Die 2 stellt
die Contig-Karte dar, die die Klone 1662885 (Sequenz-Identifikationsnummer
1), 893988 (Sequenz-Identifikationsnummer 2) und 1209814 (Sequenz-Identifikationsnummer
3), die überlappende
Regionen des BS106-Gens bilden, und die resultierende Konsensus-Nukleotidsequenz
(Sequenz-Identifikationsnummer 4) dieser Klone in einer grafischen
Darstellung abbildet. Im Anschluss hierauf wurde eine 3-Rahmen-Translation
an der Konsenssequenz (Sequenz-Identifikationsnummer 4) durchgeführt. Bei
dem ersten Vorwärts-Rahmen
wurde festgestellt, dass er einen offenen Leserahmen aufweist, der
eine Aminosäure-Sequenz mit 90 Gruppen
kodiert, die als Sequenz-Identifikationsnummer
16 dargestellt ist. Die 1 zeigt einen G/T-Polymorphismus
an der Position 54 in der Konsensussequenz (als "K" angegeben);
die entsprechenden zwei Nukleotide wurden mit einem ungefähr gleichen
häufigen Vorkommen
in der LIFESEQTM Datenbank festgestellt.
Es wird angenommen, dass der Polymorphismus an der Position 54,
die sich 10 Nukleotide stromaufwärts
von einer Methionin-Gruppe (die potenzielle translationale Startstelle)
befindet, bei der Regulierung des Expressionsniveaus dieses Proteins
beteiligt sein kann. Die 1 zeigt
ferner einen C/T-Polymorphismus an der Position 312 in der Konsensussequenz
(als "Y" angegeben). Das
Verhältnis
von C's zu T's, das in der LIFESEQTM Datenbank an der Position 312 festgestellt
wurde, war 3:1.
-
C. Spezifität der Expression von einer
Konsensussequenz entsprechenden ESTs.
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Die
Konsensussequenz, die in dem vorstehenden Abschnitt B erzeugt wurde,
wurde mit der gesamten aktualisierten LIFESEQTM Datenbank
(September 1997) unter Verwendung des BLAST Suchprogramms verglichen.
Die ESTs, die der Konsensussequenz entsprachen, wurden in 85,7 %
(24 von 28) von Brust-Bibliotheken und 0,2 % (1 von 455) von Nicht-Brust-Bibliotheken gefunden.
Deshalb wurde die Konsensussequenz oder Fragmente davon mehr als
389-mal häufiger
in Brust- als in Nicht-Brustgeweben gefunden.
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Beispiel 2: Sequenzierung von BS106-EST-spezifischen
Klonen
-
Die
DNA-Sequenz des Klons 1662885 (Sequenz-Identifikationsnummer 5),
die den 5'-äußersten
EST des BS106-Gen-Contigs umfasst, wurde unter Verwendung der Dideoxy-Terminationssequenzierung
mit Farbterminatoren gemäß bekannten
Verfahren bestimmt. (F. Sanger et al., PNAS U.S.A. 74:5463 (1977)).
Ein A/G-Polymorphismus an der Position 543 bei der Sequenz-Identifikationsnummer
5 ist als "R" angegeben.
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Da
der pINCY-Vektor (Life Technologies, Gaithersburg, MD) universelle
Priming-Stellen direkt benachbart zu den 3'- und 5'-Ligationsverbindungen der Insertionen
enthält,
wurden ungefähr
300 Basen der Insertion in beiden Richtungen unter Verwendung von
universellen Primern, und zwar die Sequenz-Identifikationsnummer 8 und die Sequenz-Identifikationsnummer
9 sequenziert (New England Biolabs, Beverly, MA bzw. Applied Biosystems
Inc., Foster City, CA). Die Sequenzierungsreaktionen wurden auf
einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und die Sequenzen
wurden über
einen Applied Biosystems 377 Sequenzierer (erhältlich von Applied Biosystems,
Foster City, CA) oder über
ein anderes Sequenzierungsgerät
bestimmt. Die zusätzlichen
Sequenzierungsprimer, BS106.F1 und BS106.R1 (Sequenz-Identifikationsnummer
10 bzw. Sequenz-Identifikationsnummer 11) wurden aus einer Sequenz
konstruiert, die über
die anfänglichen
Sequenzierungsreaktionen in der Nähe der 3'-Enden der beiden DNA-Stränge bestimmt
wurde. Diese Primer wurden danach für die Bestimmung der restlichen
DNA-Sequenz der klonierten Insertion aus jedem DNA-Strang verwendet,
wie zuvor beschrieben wurde.
-
Beispiel 3: Nukleinsäure-Herstellung
-
A. RNA-Extraktion aus Gewebe.
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Die
totale RNA wurde aus festen Geweben oder Zellen der Brust und aus
Nicht-Brustgeweben isoliert. Verschiedene Verfahren wurden verwendet,
die die Lithiumchlorid/Harnstoff-Technik, die in dem Fachgebiet bekannt und
beschrieben ist (Kato et al., J. Virol. 61:2182-2191, (1987)), UltraspecTM (Biotecx Laboratories, Inc., Houston Texas)
und TRIzolTM (Life Technologies, Inc., Gaithersburg,
MD), einschließen
aber nicht auf sie eingeschränkt
sind.
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Für die Northern
Blot Analyse wurde das Gewebe in ein steriles konisches Röhrchen auf
Eis gestellt und 10-15 Volumina 3 M LiCl, 6 M Harnstoff, 5 mM EDTA,
0,1 M β-Mercaptoethanol,
50 mM Tris-HCl (pH 7,5) wurden zugegeben. Das Gewebe wurde mit einem
Polytron® Homogenisator
(Brinkman Instruments, Inc., Westburg, NY) für 30-50 s auf Eis homogenisiert.
Die Lösung
wurde in ein 15 ml Kunststoff-Zentrifugenröhrchen überführt und über Nacht auf –20 °C gestellt.
Das Röhrchen
wurde für
90 min bei 9.000 × g
bei 0-4 °C zentrifugiert
und der Überstand
wurde unmittelbar dekantiert. Danach wurden 10 ml 3 M LiCl zugegeben,
das Röhrchen
wurde für
5 sec gevortext und für
45 min bei 11.000 × g
bei 0-4 °C zentrifugiert.
Diese Schritte der Dekantierung, Resuspendierung in LiCl und Zentrifugierung
wurden wiederholt. Das endgültige
Pellet wurde an Luft getrocknet und in 2 ml 1 mM EDTA, 0,5 SDS,
10 mM Tris (pH 7,5) resuspendiert. Danach wurde ein Volumen von
20 μl Proteinase
K (20 mg/ml) zugegeben und die resultierende Lösung wurde für 30 min
bei 37 °C
unter gelegentlichem Rühren
inkubiert. Ein Zehntel des Volumens (0,22- 0,25 ml) an 3 M NaCl wurde zugegeben
und die Lösung
wurde vor der Überführung in
ein anderes Röhrchen,
das 2 ml Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (PCI) enthielt, gevortext.
Das Röhrchen
wurde für
1-3 sec gevortext und für
20 min bei 3.000 × g
bei 10 °C
zentrifugiert. Die PCI-Extraktion wurde noch zweimal wiederholt,
worauf zwei ähnliche
Extraktionen mit Chloroform/Isoamylalkohol folgten. Die endgültige wässrige Lösung wurde
in ein vorgekühltes 15
ml Corex-Glasröhrchen,
das 6 ml 100 absolutes Ethanol enthielt, überführt, das Röhrchen wurde mit Parafilm abgedeckt
und über
Nacht auf –20 °C gestellt.
Das Röhrchen
wurde für
30 min bei 10.000 × g
bei 0-4 °C zentrifugiert
und der Ethanolüberstand
wurde unmittelbar dekantiert. Das RNA-Pellet wurde viermal mit 10
ml 75 eiskaltem Ethanol gewaschen, worauf jedes Mal eine Zentrifugierung
bei 10.000 × g
für 10
min folgte. Das endgültige
Pellet wurde an Luft für
15 min bei Raumtemperatur getrocknet. Die RNA wurde in 0,5 ml 10
mM Tris (pH 7,6), 1 mM EDTA suspendiert und ihre Konzentration wurde
spektrophotometrisch bestimmt. Die RNA-Proben wurden aliquotiert
und bei –70 °C als Ethanol-Fällungen
aufbewahrt.
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Die
Qualität
der RNA wurde über
Agarose-Gelelektrophorese (siehe Beispiel 5) und Anfärben mit
0,5 μg/ml
Ethidiumbromid für
1 Stunde bestimmt. Die RNA-Proben, die keine intakten 28S/18S rRNAs
enthielten, wurden von der Untersuchung ausgeschlossen.
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Alternativ
dazu wurde für
die RT-PCR-Analyse 1 ml Ultraspec RNA-Reagenz zu 120 mg pulverisiertem Gewebe
in einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen zugegeben,
mit einem Polytron® Homogenisator (Brinkman
Instruments, Inc., Westburg, NY) für 50 s homogenisiert und für 5 min
auf Eis belassen. Danach wurden jeder Probe 0,2 ml Chloroform zugegeben,
worauf für
15 sec gevortext wurde. Die Probe wurde für weitere 5 min in Eis belassen,
worauf Zentrifugierung bei 12.000 × g für 15 min bei 4 °C folgte.
Die obere Schicht wurde gesammelt und in ein anderes RNase-freies
2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Ein gleiches
Volumen an Isopropanol wurde jeder Probe zugegeben und die Lösung wurde
für 10
min auf Eis gestellt. Die Probe wurde bei 12.000 × g für 10 min
bei 4 °C
zentrifugiert und der Überstand
wurde verworfen. Das verbliebene Pellet wurde zweimal mit kaltem
75 Ethanol gewaschen, durch Vortexen resuspendiert und das resuspendierte
Material wurde danach durch Zentrifugierung bei 7.500 × g für 5 min
bei 4 °C
erneut pelletiert. Schließlich
wurde das RNA-Pellet in einem Speedvac für mindestens 5 min getrocknet
und in RNase-freiem Wasser wiederhergestellt.
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B. RNA-Extraktion aus einkernigen Blutzellen.
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Einkernige
Zellen werden aus Blutproben von Patienten über Zentrifugierung unter Verwendung
von Ficoll-Hypaque wie folgt isoliert. Ein Volumen von 10 ml Vollblut
wird mit einem gleichen Volumen an RPMI Medium (Life Technologies,
Gaithersburg, MD) vermischt. Dieses Gemisch wird danach mit 10 ml
Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) unterschichtet und für 30 Minuten
bei 200 × g
zentrifugiert. Der Leukozytenfilm, der die einkernigen Zellen enthält, wird
entfernt, mit PBS nach Dulbecco (Life Technologies, Gaithersburg,
MD) auf 50 ml verdünnt
und das Gemisch wird für
10 Minuten bei 200 × g
zentrifugiert. Nach zwei Waschungen wird das resultierende Pellet
in PBS nach Dulbecco auf ein Endvolumen von 1 ml resuspendiert.
-
Die
RNA wird aus den isolierten einkernigen Zellen präpariert,
wie vorstehend von N. Kato et al. beschrieben ist. Kurz gefasst,
werden die pelletierten einkernigen Zellen auf ein Endvolumen von
1 ml gebracht und danach in 250 μl
PBS resuspendiert und mit 2,5 ml 3 M LiCl, 6 M Harnstoff, 5 mM EDTA,
0,1 M 2-Mercaptoethanol,
50 mM Tris-HCl (pH 7,5) vermischt. Das resultierende Gemisch wird
homogenisiert und bei –20 °C über Nacht
inkubiert. Das Homogenisat wird bei 8.000 UPM in einem Beckman J2-21M
Rotor für
90 Minuten bei 0-4 °C
geschleudert. Das Pellet wird in 10 ml 3M LiCl über Vortexen resuspendiert
und danach bei 10.000 UPM in einer Beckman J2-21M Rotor Zentrifuge
für 45
Minuten bei 0-4 °C
geschleudert. Die Schritte der Resuspendierung und Pelletierung
werden danach wiederholt. Das Pellet wird in 2 ml 1 mM EDTA, 0,5
SDS, 10 mM Tris (pH 7,5) und 400 μg
Proteinase K mit Vortexen resuspendiert und danach wird es bei 37 °C für 30 Minuten
unter Schütteln
inkubiert. Ein Zehntel des Volumens an 3M NaCl wird danach zugegeben
und das Gemisch wird gevortext. Proteine werden über zwei Extraktionszyklen
mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, worauf eine Extraktion mit
Chloroform/Isoamylalkohol folgt, entfernt. Die RNA wird über den
Zusatz von 6 ml Ethanol gefällt,
worauf eine Inkubation bei –20 °C über Nacht
folgt. Nachdem die gefällte
RNA über
Zentrifugierung gesammelt wird, wird das Pellet 4 mal in 75 Ethanol
gewaschen. Die pelletierte RNA wird danach in 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl
(pH 7,5) gelöst.
-
Nicht-Brustgewebe
werden als negative Kontrollen verwendet. Die mRNA kann weiter aus
totaler RNA gereinigt werden, indem im Handel erhältliche
Kits, wie z. B. Oligo dT Cellulose Spinsäulen (RediColTM von Pharmacia,
Uppsala, Schweden), für
die Isolierung von polyadenylierter RNA verwendet werden. Die totale oder
mRNA kann in Lysepuffer (5 M Guanidinthiocyanat, 0,1 M EDTA, pH
7,0) für
die Analyse in dem Ribonuklease-Schutzassay gelöst werden.
-
C. RNA-Extraktion aus Polysomen.
-
Gewebe
wird in Salzlösung
bei 4 °C
zerkleinert und mit 2,5 Volumina an 0,8 M Saccharose in einer TK150M (150 mM KCl, 5 mM MgCl2,
50 mM Tris-HCl, pH 7,4) Lösung
vermischt, die 6 mM 2-Mercaptoethanol enthält. Das Gewebe wird in einem
Teflon-Glas Potter Homogenisator mit fünf Hüben bei 100- 200 upm homogenisiert, worauf sechs
Hübe in
einem Dounce Homogenisator folgen, wie von B. Mechler, Methods in
Enzymology 152: 241-248 (1987) beschrieben ist. Das Homogenisat
wird danach bei 12.000 × g
für 15
min bei 4 °C
zentrifugiert, um die Zellkerne zu sedimentieren. Die Polysomen
werden über
Vermischen von 2 ml des Überstandes
mit 6 ml 2,5 M Saccharose in TK150M und Überschichten
dieses Gemisches auf 4 ml 2,5 M Saccharose in TK150M
in einem 38 ml Polyallomer-Röhrchen
isoliert. Zwei zusätzliche
Saccharose TK150M Lösungen werden nacheinander
auf die Extraktfraktion überschichtet;
eine erste Schicht von 13 ml 2,05 M Saccharose, worauf eine zweite
Schicht von 6 ml 1,3 M Saccharose folgt. Die Polysomen werden über Zentrifugierung des
Gradienten bei 90.000 × g
für 5 h
bei 4 °C
isoliert. Die Fraktion wird danach mit einer silikonisierten Pasteur-Pipette
von der Grenzfläche
1,3 M Saccharose/2,05 M Saccharose entnommen und in einem gleichen
Volumen an TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA) verdünnt. Ein
gleiches Volumen an 90 °C
SDS-Puffer (1 SDS,
200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4) wird zugegeben und die Lösung wird
in einem kochenden Wasserbad für
2 min inkubiert. Als Nächstes
werden die Proteine über
einen Verdau mit Proteinase K (50 mg/ml) für 15 min bei 37 °C verdaut.
Die mRNA wird mit 3 gleichen Volumina von Phenol-Chloroform-Extraktionen gereinigt,
worauf eine Fällung
mit 0,1 Volumina an 2 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2 Volumina an
100 Ethanol bei –20 °C über Nacht
folgt. Die gefällte
RNA wird über
Zentrifugierung bei 12.000 × g
für 10
min bei 4 °C
gewonnen. Die RNA wird getrocknet und in TE (pH 7,4) oder destilliertem
Wasser resuspendiert. Die resuspendierte RNA kann danach in einem
Slot Blot oder Dot Blot Hybridisierungsassay für die Prüfung auf das Vorhandensein
von BS106-mRNA (siehe Beispiel 6) verwendet werden.
-
Die
Qualität
der Nukleinsäure
und der Proteine hängt
von dem verwendeten Verfahren zur Herstellung ab. Jede Probe kann
eine unterschiedliche Herstellungstechnik erfordern, um die Isolierungseffizienz
des Zielmoleküls
zu maximieren. Diese Herstellungstechniken liegen in dem Können des
Durchschnittsfachmannes.
-
Beispiel 4: Ribonuklease-Schutzassay
-
A. Synthese von markierter komplementärer RNA
(cRNA) Hybridisierungssonde und unmarkiertem Sensestrang.
-
Ein
pINCY-Plasmid, das
die BS106-Gen-cDNA-Sequenzinsertion (Klon 1662885) enthält, das
von entgegengerichteten SPE- und T7-Polymerase-Promotoren, wurde unter Verwendung des
Qiagen Plasmid Purification Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) gereinigt.
Danach wurden 10 μg
des Plasmids mit 10 U DdeI-Restriktionsenzym für 1 h bei 37 °C geschnitten.
Das geschnittene Plasmid wurde unter Verwendung von QIAprep Kits (Qiagen,
Chatsworth, CA) gereinigt und für
die Synthese von Antisense-Iranskript, das mit 6,3 μM (alpha32P) UTP (800 Ci/mmol) (Amersham Life Sciences,
Inc., Arlington Heights, IL) markiert war, von dem SP6-Promotor unter
Verwendung des Riboprobe® in vitro Transcription
System (Promega Corporation, Madison, WI) verwendet, wie durch die
Anweisungen des Lieferanten beschrieben ist. Um den Sensestrang
zu erzeugen, wurden 10 μg
des gereinigten Plasmids mit den Restriktionsenzymen 10 U XbaI und
10 U NotI geschnitten und wie vorstehend von dem T7-Promotor transkribiert.
Sowohl die Senseals auch Antisensestränge wurden über Spin-Säulenchromatographie isoliert.
Der unmarkierte Sensestrang wurde über UV-Absorption bei 260 nm quantifiziert.
-
B. Hybridisierung der markierten Sonde
an das Ziel.
-
Gefrorenes
Gewebe wurde unter flüssigem
Stickstoff zu einem Pulver pulverisiert und 100-500 mg wurden in
1 ml Lysepuffer gelöst,
der als eine Komponente des Direct ProtectSM Lysate
RNase Protection Kit (Ambion, Inc., Austin, TX) erhältlich ist.
Die weitere Auflösung
wurde unter Verwendung eines Gewebe-Homogenisators erzielt. Zusätzlich wurde
eine Verdünnungsreihe
mit einer bekannten Menge an Sensestrang in Mausleber-Lysat für die Verwendung
als eine positive Kontrolle hergestellt. Schließlich wurden 45 μl solubilisiertes
Gewebe oder verdünnter
Sensestrang direkt mit 1 × 105 cpm radioaktiv markierter Sonde (1,5 × 109 cpm/μg)
in 5 μl
Lysepuffer vermischt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37 °C fortgeführt.
-
C. RNase-Verdau.
-
Die
RNA, die nicht an die Sonde hybridisiert war, wurde gemäß dem Direct
ProtectTM Protokoll unter Verwendung einer
Lösung
von RNase A und RNase Ti für
30 min bei 37 °C
aus der Reaktion entfernt, worauf die Entfernung von RNase über Verdau
mit Proteinase K in Gegenwart von Natriumsarcosyl folgte. Die vor
Verdau geschützten
hybridisierten Fragmente wurden danach durch die Zugabe eines gleichen
Volumens an Isopropanol gefällt
und auf –70 °C für 3 h gestellt.
Die Fällungen
wurden über
Zentrifugierung bei 12.000 × g
für 20
min gesammelt.
-
D. Fragmentanalyse.
-
Die
Fällungen
wurden in denaturierendem Farbstoff (gel loading dye) (80 Formamid,
10 mM EDTA (pH 8,0), 1 mg/ml Xylencyanol, 1 mg/ml Bromphenolblau)
gelöst,
hitzedenaturiert und in 6 Polyacrylamid TBE, 8 M denaturierenden
Harnstoffgelen elektrophoresiert. Die Gele wurden abgebildet und
unter Verwendung des STORM
TM Storage Phosphor
Autoradiography System (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) analysiert.
Die Quantifizierung von geschützten
Fragmentbanden, die in Femtogramm (fg) exprimiert wurden, wurde über Vergleich
der Peakflächen,
die von den Testproben erhalten wurden, mit denjenigen aus den bekannten
Verdünnungen
des positiven Kontroll-Sensestranges erzielt (siehe vorstehenden
Abschnitt B). Zusätzlich
wurde die Konzentration an DNA in dem Lysat einem Assay unterzogen,
um die Anzahl von Zellen in den Lysaten der Testprobe abzuschätzen. Die
Ergebnisse sind in Molekülen
von BS106-RNA/Zelle und als eine Einstufungsbewertung der Abbildung
(Tabelle 1) ausgedrückt.
Eine hochgradige Expression von mRNA, die einer Sequenz entspricht,
die gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus der Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer
2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer
4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen
davon, zeigte das Vorhandensein von BS106-mRNA(s) an, das eine Diagnose
einer Erkrankung des Brustgewebes oder eines Zustandes, wie z. B. Brustkrebs,
nahe legte. Tabelle 1
Gewebe | ID-Nummer | BS106-RNA/Zelle | Bewertung* |
Normale
Brust | C157 | 10 | + |
| C007G | 7 | + |
| C027R | 8 | + |
| C016R | 2 | + |
| C135R | 0,2 | + |
Maligne
Brust | C011G | > 46 | 3+ |
| C023G | 0,3 | + |
| C012G | 0 | – |
| C033R | > 87 | 3+ |
| C030 | 0 | – |
Normale
Lunge | C005R | 0 | – |
Maligne
Lunge | C037G | 0 | – |
Normales
Kolon | C027G | 0 | – |
- * Proben ohne detektierbares geschütztes Fragment
wurden mit "–" bewertet; Proben
mit detektierbarem geschütztem
Fragment (von denen die fg-Werte innerhalb der std-Kurve lagen)
wurden mit "+" bewertet; Proben mit
detektierbarem geschütztem
Fragment, von denen die fg-Werte 2 bis 10fach über der std-Kurve lagen, wurden
mit "2+" bewertet; Proben
mit detektierbarem geschütztem
Fragment, von denen die fg-Werte 10fach oder mehr über der
std- Kurve lagen,
wurden mit "3+" bewertet.
-
Beispiel 5: Northern Blotting
-
Die
Northern Blot Technik wurde verwendet, um eine RNA-Spezies von spezifischer
Größe in einer komplexen
Population von RNA unter Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese
und Nukleinsäurehybridisierung
zu identifizieren. Kurz gefasst wurden 5 μg totale RNA (siehe Beispiel
3) in 15 μl
einer Lösung,
die 40 mM Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) (pH 7,0), 10 mM
Natriumacetat, 1 mM EDTA, 2,2 M Formaldehyd, 50 % V/V Formamid,
für 15
min bei 65 °C
inkubiert. Die denaturierte RNA wurde mit 2 Liter Beladungspuffer (50
% Glycerol, 1 mM EDTA, 0,4 % Bromphenolblau, 0,4 % Xylencyanol)
vermischt und auf ein denaturierendes 1,0 % Agarosegel geladen,
das 40 mM MOPS (pH 7,0), 10 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA und 2,2
M Formaldehyd enthielt. Das Gel wurde bei 60 V für 1,5 h elektrophoresiert und
in RNase-freiem Wasser gespült. Die
Gele wurden in RNase-freiem Wasser mit 0,5 g/ml Ethidiumbromid angefärbt und
mit UV-Licht belichtet, um die ribosomalen RNA-Banden sichtbar zu
machen. Die RNA wurde von dem Gel auf Nylonmembrane (Brightstar-Plus,
Ambion, Inc., Austin, TX) für
1,5 Stunden unter Verwendung des Verfahrens des abwärts gerichteten
alkalischen Kapillartransfers (Downward Alkaline Capillary Transfer)
(Chomczynski, Anal. Biochem. 201: 134-139, 1992) übertragen.
Der Filter wurde mit 1X SSC gespült
und die RNA wurde mit dem Filter unter Verwendung des Stratalinker
(Stratagene, Inc., La Jolla, CA) in dem Autovernetzungsmodus vernetzt
und für 15
min getrocknet. Die Membran wurde danach in ein Hybridisierungsröhrchen gestellt,
das 20 ml vorgewärmte
Vorhybridisierungslösung
(5X SSC, 50 % Formamid, 5X Lösung
nach Denhardt, 100 g/ml denaturierte Lachssperma-DNA) enthielt,
und in einem 42 °C
Hybridisierungsofen für
mindestens 3 h inkubiert. Während der
Blot vorhybridisierte, wurde eine 32P-markierte zufällig geprimete
Sonde unter Verwendung des BS106-Insertionsfragments (das durch
Verdau des Klons 1662885 mit XbaI und NotI erhalten wurde) unter
Verwendung des Random Primer DNA Labeling System (Life Technologies,
Inc., Gaithersburg, MD) gemäß den Anweisungen
des Herstellers erzeugt. Die Hälfte
der Sonde wurde für
10 min gekocht, auf Eis rasch abgekühlt und in das Hybridisierungsröhrchen gegeben.
Die Hybridisierung wurde bei 42 °C
für mindestens
12 h durchgeführt. Die
Hybridisierungslösung
wurde verworfen und der Filter wurde zweimal in 30 ml 3X SSC, 0,1
SDS bei 42 °C für 15 min
gewaschen, worauf zwei Waschungen mit 0,3X SSC, 0,1 % SDS bei 60 °C für 15 min
folgten. Der Filter wurde in Klarsichtfolie eingehüllt, einem
Kodak XAR-Omat Film für
24-96 h ausgesetzt und der Film wurde für die Analyse entwickelt. Die
Ergebnisse der Analyse der RNA-Qualität unter Verwendung eines Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegels
und der entsprechende Northern Blot unter Verwendung der BS106-Sonde, die
an RNAs aus Brustgeweben und Prostatageweben, und aus normalen Brust-
und Brustkrebsgeweben hybridisiert wurde, sind in den 3A bzw. 3B.
Die Positionen der RNA-Größenstandards
(in Kb) sind auf der linken Seite von jeder Tafel gezeigt. Wie in
der 3A gezeigt ist, hybridisierte
die BS106-Sonde an eine RNA-Bande von ungefähr 0,7 Kb bei 3 von 3 normalen
Brustgeweben und bei 1 von 3 Prostatakrebsgeweben; aber eine RNA-Bande
wurde bei 3 normalen Prostatageweben oder in einer Zelllinie von
Prostata- oder Brustkrebs nicht detektiert. Die 3B zeigt, dass die BS106-Sonde an eine RNA mit
ungefähr
0,7 Kb bei 5 von 6 normalen Brust-RNA-Proben und bei 2 von 6 Brustkrebs-RNA-Proben
hybridisierte.
-
Beispiel 6: Dot Blot/Slot Blot
-
Dot
und Slot Blot Assays stellen rasche Verfahren dar, um das Vorhandensein
einer spezifischen Nukleinsäuresequenz
in einem komplexen Gemisch von Nukleinsäuren zu beurteilen. Für die Durchführung von solchen
Assays werden bis zu 50 μg
RNA in 50 μl
50 Formamid, 7 Formaldehyd, 1X SSC vermischt, 15 min bei 68 °C inkubiert
und danach auf Eis gekühlt.
Danach werden 100 μl
20X SSC dem RNA-Gemisch zugegeben und unter Vakuum auf ein Mehrzweckgerät geladen,
das über
eine präparierte
Nitrocellulose- oder Nylonmembran verfügt. Die Membran wird in Wasser,
20X SSC für
1 Stunde getränkt,
auf zwei Blätter
von 20X SSC vorbenetztem Whatman Nr. 3 Filterpapier gegeben und
in ein Slot Blot oder Dot Blot Mehrzweckgerät geladen. Der Slot Blot wird
mit Sonden analysiert, die hergestellt und markiert werden, wie
vorstehend in Beispiel 4 beschrieben ist. Die Detektierung von mRNA,
die einer Sequenz gewählt
aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer
2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer
4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen
davon entspricht, ist ein Anzeichen für das Vorhandensein von BS106,
das eine Diagnose einer Brustgewebe-Erkrankung oder eines Zustandes, wie
z. B. Brustkrebs, nahe legt.
-
Weitere
Verfahren und Puffer, die bei den Verfahren, die in den Beispielen
5 und 6 beschrieben sind, verwendet werden können, aber hierin nicht spezifisch
detailliert sind, sind in dem Fachgebiet bekannt und zum Beispiel
vorstehend in J. Sambrook et al. beschrieben.
-
Beispiel 7: In situ Hybridisierung
-
Dieses
Verfahren ist nützlich,
um unter Verwendung von detektierbaren Nukleinsäure-Hybridisierungssonden spezifische
Ziel-Nukleinsäuresequenzen
in Zellen direkt zu detektieren.
-
Die
Gewebe werden mit vernetzenden Fixierungsmitteln, wie z. B. Paraformaldehyd
oder Glutaraldehyd, für
die maximale zelluläre
der RNA-Retention präpariert.
Siehe L. Angerer et al., Methods in Cell Biol. 35: 37-71 (1991).
Kurz gefasst wird das Gewebe in mehr als 5 Volumina 1 Glutaraldehyd
in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5 bei 4 °C für 30 min gestellt. Die Lösung wird
durch frische Glutaraldehyd-Lösung
(1 Glutaraldehyd in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5) für eine weitere
Fixierung von 30 min ersetzt. Die Fixierlösung sollte eine Osmolalität von ungefähr 0,375
NaCl besitzen. Das Gewebe wird einmal in isotonischer NaCl gewaschen,
um das Phosphat zu entfernen.
-
Die
fixierten Gewebe werden danach wie folgt in Paraffin eingebettet.
Das Gewebe wird über
eine Serie von Ethanolkonzentrationen für jeweils 15 min dehydratisiert:
50 % (zweimal), 70 % (zweimal), 85 %, 90 % und danach 100 % (zweimal).
Als Nächstes
wird das Gewebe in zwei Wechseln von Xylen für 20 min jeweils bei Raumtemperatur
getränkt.
Das Gewebe wird danach in zwei Wechseln eines 1:1 Gemisches von
Xylen und Paraffin für
20 min jeweils bei 60 °C;
und danach in drei endgültigen
Wechseln von Paraffin für
jeweils 15 min.
-
Als
Nächstes
wird das Gewebe in 5 μm
Abschnitte unter Verwendung eines standardmäßigen Mikrotoms geschnitten
und auf einen Objektträger
gegeben, der zuvor mit einem Gewebekleber, wie z. B. 3-Aminopropyltriethoxysilan,
behandelt wurde.
-
Das
Paraffin wird aus dem Gewebe über
zwei 10 min Tränkungen
mit Xylen entfernt und in einer Serie von Ethanolkonzentrationen
rehydratisiert: 99 % zweimal, 95 %, 85 %, 70 %, 50 %, 30 % und danach
zweimal destilliertes Wasser. Die Abschnitte werden mit 0,2 M HCl
für 10
min vorbehandelt und mit 2 μg/ml
Proteinase K bei 37 °C
für 15
min permeabilisiert.
-
Die
markierten Ribosonden, die von dem BS106-Genplasmid (siehe Beispiel
4) transkribiert wurden, werden an die präparierten Gewebeabschnitte
hybridisiert und über
Nacht bei 56 °C
in einem 3X standardmäßigen Salzlösungsextrakt
und 50 % Formamid inkubiert. Überschüssige Sonde
wird durch Waschen in 2X standardmäßige Salzlösung-Citrat und 50 % Formamid
entfernt, worauf der Verdau mit 100 μg/ml RNase A bei 37 °C für 30 folgt.
Die Fluoreszenzsonde wird über
Belichtung mit ultraviolettem (UV) Licht unter einem Mikroskop sichtbar
gemacht. Die Fluoreszenz in dem Zellplasma ist ein Anzeichen für BS106-mRNA.
Alternativ dazu können
die Abschnitte über
Autoradiographie sichtbar gemacht werden.
-
Beispiel 8: Reverse Transkriptions-PCR
-
A. Einstufiger RT-PCR-Assay.
-
Ziel-spezifische
Primer werden konstruiert, um die vorstehend beschriebenen Zielsequenzen über reverse
Transkriptions-PCR unter Verwendung von Verfahren zu detektieren,
die in dem Fachgebiet bekannt sind. Die einstufige RT-PCR ist eine
sequenzielle Prozedur, die sowohl RT als auch PCR in einem einzigen Reaktionsgemisch
durchführt.
Die Prozedur wird in einem 200 μl
Reaktionsgemisch durchgeführt,
das 50 mM (N,N-bis[2-Hydroxyethyl]glycin), pH 8, 15, 81,7 mM KOAc,
33,33 mM KOH, 0,01 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,02
mg/ml NaN3, 8 m/V Glycerol, jeweils 150 μM dNTP, jeweils
0,25 μM
Primer, 5U rTth-Polymerase, 3,25 mM Mn(OAc)2 und
5 μl der
Ziel-RNA (siehe Beispiel 3) enthält.
Da die RNA und das rTth-Polymeraseenzym in Gegenwart von Mn(OAc)2 instabil sind, sollte das Mn(OAc)2 erst kurz vor der Zugabe des Ziels zugegeben
werden. Die optimalen Bedingungen für die cDNA-Synthese und die
thermische Zyklisierung können
von einem Fachmann ohne weiteres bestimmt werden. Die Reaktion wird
in einem Perkin-Elmer Thermal Cycler 480 inkubiert. Die optimalen
Bedingungen für
die cDNA-Synthese und die thermische Zyklisierung können von
einem Fachmann ohne weiteres bestimmt werden. Die Bedingungen, die
als nützlich
befunden werden können,
schließen
die cDNA-Synthese bei 60-70 °C
für 15-45
min und 30-45 Amplifizierungszyklen bei 94 °C, 1 min; 55-70 °C, 1 min;
72 °C, 2
min ein. Die einstufige RT-PCR kann ferner unter Verwendung einer
zweifachen Enzymprozedur mit Taq-Polymerase
und einem reversen Transkriptaseenzym, wie z. B. MMLV oder AMV RT
Enzyme, durchgeführt
werden.
-
B. Herkömmliche RT-PCR.
-
Eine
herkömmliche
zweistufige RT-PCR-Reaktion
wurde durchgeführt,
wie von K. Q. Hu et al., Virology 181: 721-726 (1991) beschrieben
ist. Kurz gefasst wurden 0,5 μg.
extrahierte mRNA (siehe Beispiel 3) in einem 20 μl Reaktionsgemisch revers transkribiert,
das 1X PCR II Puffer (Perkin-Elmer), 5 mM MgCl2,
1 mM dNTP, 20 U RNasin, 2,5 μM
zufällige
Hexamere und 50 U MMLV (Moloney-Maus-Leukämievirus) reverse Transkriptase
(RT) enthielt. Die reverse Transkription wurde bei Raumtemperatur
für 10
min und bei 42 °C
für 60 min
in einem PE-480 Thermal Cycler durchgeführt, worauf eine weitere Inkubation
bei 95 °C
für 5 min
zur Inaktivierung der RT folgte. Die PCR wurde unter Verwendung
von 2 μl
der cDNA-Reaktion in einem endgültigen PCR-Reaktionsvolumen
von 50 μl
durchgeführt,
das 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2,
200 μM dNTP,
0,5 μM von
jedem Sense- und Antisenseprimer (Sequenz-Identifikationsnummer 12 bzw. Sequenz-Identifikationsnummer
13) und 2,5 U Taq-Polymerase enthielt. Die Reaktion wurde in einem
MJ Research Model PTC-200 wie folgt inkubiert: 40 Zyklen der Amplifizierung
(94 °C,
20 s; 58 °C,
30 s; 72 °C,
30 s); eine endgültige
Extension (72 °C,
10 min); und eine Tränkung
bei 4 °C.
-
C. PCR-Fragmentanalyse.
-
Die
richtigen Produkte wurden über
Größenbestimmung
unter Verwendung von Gelelektrophorese mit einem SYBR® Green
Gelfarbstoff für
Nukleinsäuren
(Molecular Probes, Eugene, OR) verifiziert. Die Gele wurden mit
SYBR Green I bei einer Verdünnung
von 1:10.000 in 1X TEE für
45 min angefärbt.
Die Gele wurden danach in 1X TEE für 30 min entfärbt und
unter Verwendung eines STORM Abbildungssystems (siehe die 4A und 4B)
abgebildet. Die 4A zeigt eine DNA-Bande bei
201 Basen aus RNA von sowohl normalen (Bahnen 1-5) als auch kanzerösen (Bahnen
6-10) Brustgeweben. Diese Bande ist ein Anzeichen für ein BS106-mRNA-spezifisches
RT-PCR-Produkt. Wie in der 4B gezeigt
ist, wurde das Produkt unter Verwendung von RNA, geht aus Geweben
von Lunge (Bahnen 1-5) oder Kolon (Bahnen 6-10) isoliert wurden,
nicht detektiert. Die Detektion eines Produkts, das eine Sequenz
gewählt
aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer
2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer
4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen
davon besteht, zeigte das Vorhandensein von BS106-mRNA an, das eine
Diagnose einer Brustgewebe-Erkrankung oder eines Zustandes, wie
z. B. Brustkrebs, nahe legte.
-
Beispiel 9: OH-PCR
-
A. Sondenauswahl und Markierung.
-
Ziel-spezifische
Primer und Sonden werden konstruiert, um die vorstehend beschriebenen
Zielsequenzen über
Oligonukleotidhybridisierungs-PCR zu detektieren. Die internationalen
Veröffentlichungen
Nrn.
WO 92/10505 , veröffentlicht
am 25. Juni 1992, und die
WO
92/11388 , veröffentlicht
am 9. Juli 1992, lehren Verfahren zur Markierung von Oligonukleotiden
an ihren 5'- bzw.
3'-Enden. Gemäß einem
bekannten Verfahren zur Markierung eines Oligonukleotids wird ein
Marker-Phosphoramiditreagenz hergestellt und für die Addition des Markers
an das Oligonukleotid während
seiner Synthese verwendet. Siehe zum Beispiel N. T. Thuong et al.,
Tet. Letters 29(46): 5905-5908 (1988); oder J. S. Cohen et al.,
veröffentlichte
US-Patentanmeldung 07/246,688 (NTIS
Bestell-Nr. PAT-APPL-7-246,688) (1989). Vorzugsweise werden die
Sonden an ihrem 3'-Ende
markiert, um eine Beteiligung an der PCR und die Bildung von unerwünschten
Extensionsprodukten zu verhindern. Für die einstufige OH-PCR sollte
die Sonde über
einen T
M von mindestens 15 °C unter dem
T
M der Primer verfügen. Die Primer und Sonden
werden als spezifische Bindungsvertreter mit oder ohne detektierbaren
Markern unter Verwendung von standardmäßiger Phosphoramidit-Chemie
und/oder post-synthetischen Markierungsverfahren verwendet, die
dem Fachmann wohl bekannt sind.
-
B. Einstufige Oligohybridisierungs-PCR.
-
Die
OH-PCR wird in einer 200 μl
Reaktion durchgeführt,
die 50 mM (N,N-bis[2-Hydroxyethyl] glycin), pH 8,15, 81,7 mM KOAc,
33,33 mM KOH, 0,01 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,1 mM Ethylendiaminetetraessigsäure, 0,02
mg/ml NaN3, 8 m/V Glycerol, jeweils 150 μM dNTP, jeweils
0,25 μM
Primer, 3,75 nM Sonde, 5U rTth-Polymerase, 3,25 mM Mn(OAc)2 und 5 μl
Blutäquivalente
des Ziels enthält
(siehe Beispiel 3). Da die RNA und das rTth-Polymeraseenzym in Gegenwart
von Mn(OAc)2 instabil sind, sollte das Mn(OAc)2 erst kurz vor der Zugabe des Ziels zugegeben
werden. Die Reaktion wird in einem Perkin-Elmer Thermal Cycler 480
inkubiert. Die optimalen Bedingungen für die cDNA-Synthese und die
thermische Zyklisierung können
von einem Fachmann ohne weiteres bestimmt werden. Die Bedingungen,
die als nützlich
befunden werden können, schließen die
cDNA-Synthese (60 °C
30 min), 30-45 Amplifizierungszyklen (94 °C, 40 s; 55-70 °C 60 s),
Oligohybridisierung (97 °C,
5 min; 15 °C,
5 min; 15 °C
Tränkung).
Das richtige Reaktionsprodukt enthält mindestens einen der Stränge des
PCR-Produkts und eine im Inneren hybridisierte Sonde.
-
C. OH-PCR-Produktanalyse.
-
Die
amplifizierten Reaktionsprodukte werden auf einem LCx® Analyzer
System (erhältlich
von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) detektiert. Kurz gefasst
wird das richtige Reaktionsprodukt von einem Antikörper-markierten
Mikroteilchen an einer einfangbaren Stelle an entweder dem PCR-Produktstrang oder
an der Hybridisierungssonde eingefangen und der Komplex wird über Bindung
eines detektierbaren Antikörperkonjugats
an entweder eine detektierbare Stelle an der Sonde oder an dem PCR-Strang
detektiert. Nur ein Komplex, der einen mit der inneren Sonde hybridisierten
PCR-Strang enthält,
kann detektiert werden. Die Detektion dieses Komplexes ist danach
ein Anzeichen für
das Vorhandensein von BS106-mRNA, das eine Diagnose einer Brusterkrankung
oder eines Zustandes, wie z. B. Brustkrebs, nahe legt.
-
Viele
andere Detektionsformate sind vorhanden, die von dem Fachmann verwendet
und/oder modifiziert werden können,
um das Vorhandensein von amplifizierten oder nicht amplifizierten
von BS106 abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen
zu detektieren, die folgendes einschließen aber nicht darauf eingeschränkt sind: Ligase-Kettenreaktion
(LCR, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL); Q-beta-Replicase (Gene-TrakTM, Naperville, Illinois), verzweigte Kettenreaktion
(Chiron, Emeryville, CA) und Strangverdrängungsassays (Becton Dickinson,
Research Triangle Park, NC).
-
Beispiel 10: Synthetische Peptidherstellung
-
Die
synthetischen Peptide, die jeweils durch die Sequenz-Identifikationsnummer
17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer
19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 dargestellt sind, wurden auf
der Basis der vorhergesagten Aminosäure-Sequenz des offenen Leserahmens
von BS106 (Sequenz-Identifikationsnummer
16) (siehe Beispiel 1) hergestellt. Sämtliche Peptide wurden in einem
Symphony Peptide Synthesizer (erhältlich von Rainin Instrument
Co, Emeryville California) synthetisiert, wobei Fmoc-Chemie, standardmäßige Zyklen
und in situ HBTU-Aktivierung verwendet wurden. Die Bedingungen für die Abspaltung
und Entschützung
waren wie folgt: ein Volumen von 2,5 ml Abspaltreagenz (77,5 V/V
Trifluoressigsäure,
15 V/V Ethandithiol, 2,5 V/V Wasser, 5 V/V Thioanisol, 1-2 m/V Phenol)
wurden dem Harz zugegeben und bei Raumtemperatur für 2-4 Stunden gerührt. Das
Filtrat wurde danach entfernt und das Peptid wurde aus dem Abspaltreagenz
mit kaltem Diethylether gefällt.
Jedes Peptid wurde danach filtriert, über präparative Umkehrphasen-HPLC
unter Verwendung eines Gradienten aus Wasser/Acetonitril/0,1 TFA
gereinigt und lyophilisiert. Das Produkt wurde über Massenspektrometrie bestätigt (Daten
nicht gezeigt).
-
Die
gereinigten Peptide wurden mit Adjuvans vermischt und in Kaninchen
injiziert (siehe Beispiel 14). Alternativ dazu können die gereinigten Peptide
an das Hämocyanin
der Schlüssellochschnecke
mit Glutaraldehyd konjugiert, mit Adjuvans vermischt und in Kaninchen
injiziert werden (siehe Beispiel 14).
-
Beispiel 11a: Expression von Protein in
einer Zelllinie unter Verwendung des Plasmids 577
-
A. Konstruktion eines BS106-Expressionsplasmids.
-
Das
Plasmid 577, das in der
US-Patentanmeldung
Serien-Nr. 08/478,073 , eingereicht am 7. Juni 1995, beschrieben
ist, ist für
die Expression von sezernierten Antigenen in einer permanenten Zelllinie
konstruiert worden. Dieses Plasmid enthält die folgenden DNA-Segmente:
(a) ein 2,3 Kb Fragment von pBR322, das eine bakterielle beta-Lactamase
und einen Ursprung der DNA-Replikation
enthält;
(b) eine 1,8 Kb Kassette, die die Expression eines Neomycin-Resistenzgens
unter Kontrolle des HSV-1
Thymidinkinase Promotors und poly-A-Additionssignalen dirigiert;
(c) eine 1,9 Kb Kassette, die die Genexpression eines Dihydrofolat-Reductase-Gens
unter der Kontrolle von einem SV-40-Promotor und poly-A-Additionssignalen
dirigiert; (d) eine 3,5 Kb Kassette, die die Expression einer Signalsequenz
der schweren Kette des Kaninchen-Immunoglobulins, das mit einem
modifizierten Hepatitis C Virus (HCV) E2-Protein fusioniert ist,
unter der Kontrolle des Simian Virus 40 T-Ag Promotors und Transkriptionsenhancers
dirigiert, wobei der Hepatitis B Virus Oberflächen-Antigen (HBsAg) Enhancer
I von einem Fragment von Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) Genom gefolgt wird,
das poly-A-Additionssignale
liefert; und (e) ein restliches 0,7 Kb Fragment der späten Region
des Simian Virus 40 Genoms ohne Funktion in diesem Plasmid. Sämtliche
der Segmente des Vektors wurden über
Standardverfahren zusammengestellt, die dem Fachmann auf dem Gebiet
der Molekularbiologie bekannt sind.
-
Die
Plasmide für
die Expression von sezernierbaren BS106-Proteinen werden konstruiert, indem
die kodierende Sequenz des Hepatitis C Virus E2-Proteins in dem
Plasmid 577 durch die einer BS106-Polynukleotidsequenz gewählt aus
der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer
2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer
4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen
davon wie folgt ersetzt wird. Der Verdau von Plasmid 577 mit XbaI
setzt das Hepatitis C Virus E2-Genfragment frei. Das resultierende
Plasmid-Grundgerüst
gestattet die Insertion der BS106-cDNA-Insertion stromabwärts der
Signalsequenz der schweren Kette des Kaninchen-Immunoglobulins,
die die exprimierten Proteine in den Sekretionsweg der Zelle dirigiert.
Das BS106-cDNA-Fragment wird über
die PCR unter Verwendung von standardmäßigen Prozeduren erzeugt. In
der Sense-PCR-Primersequenz
kodiert, befindet sich eine XbaI-Stelle, die unmittelbar von einer
12-Nukleotidsequenz gefolgt wird, die die Aminosäure-Sequenz Ser-Asn-Glu-Leu
("SNEL") kodiert, um die
Signalprotease-Prozessierung, effiziente Sekretion und endgültige Produktstabilität in Kulturflüssigkeiten
zu fördern.
Unmittelbar auf diese 12-Nukleotidsequenz folgend enthält der Primer
Nukleotide, die zu Templatsequenzen komplementär sind, die die Aminosäuren des
BS106-Gens kodieren. Der Antisenseprimer beinhaltet eine Sequenz,
die die folgenden acht Aminosäuren
kurz vor den Stopp-Kodons kodiert: Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(Sequenz-Identifikationsnummer 21). In dieser Sequenz ist eine Erkennungsstelle
beinhaltet, um die Analyse und Reinigung des BS106-Proteinprodukts
zu unterstützen.
Eine Erkennungsstelle (als "FLAG" bezeichnet), die
von einem im Handel erhältlichen
monoklonalen Antikörper,
der als anti-FLAG M2 (Eastman Kodak, Co., New Haven, CT) bezeichnet
ist, erkannt wird, als auch weitere vergleichbare Sequenzen und
ihre entsprechenden Antikörper können verwendet
werden. Zum Beispiel wird die PCR unter Verwendung von GeneAmp® Reagenzien,
die von Perkin-Elmer-Cetus
bezogen wurden, wie durch die Anweisungen des Lieferanten angegeben,
durchgeführt. Die
PCR-Primer werden mit einer Endkonzentration von 0,5 μM verwendet.
Die PCR wird an dem BS106-Plasmidtemplat in einer 100 μl Reaktion
für 35
Zyklen (94 °C,
30 Sekunden; 55 °C,
30 Sekunden; 72 °C,
90 Sekunden) durchgeführt,
worauf ein Extensionszyklus von 72 °C für 10 min folgt.
-
B. Transfektion von Eierstockzellen des
chinesischen Hamsters mit Dihydrofolat-Reductase-Defizienz.
-
Das
vorstehend beschriebene Plasmid wird in CHO/dhfr-Zellen (DXB-111,
Uriacio, et al., PNAS 77: 4451-4466 (1980)) transfiziert. Diese
Zellen sind von der A.T.C.C., 12301 Parklaven Drive, Rockville,
MD 20852 unter der Zugangs-Nr. CRL 9096 verfügbar. Die Transfektion wird
unter Verwendung der kationischen Liposom-vermittelten Prozedur
durchgeführt,
die von P. L. Felgner et al., PNAS 84: 7413-7417 (1987) beschrieben
ist. Im Besonderen werden CHO/dhfr-Zellen in F-12 Medium nach Ham
kultiviert, das mit 10 % fötalem Kälberserum,
L-Glutamin (1 mM) ergänzt
ist, und frisch in einem Gefäß bei einer
Dichte von 5 – 8 × 105 Zellen pro Gefäß angesetzt. Die Zellen werden
auf eine Konfluenz von zwischen 60 und 80 % für die Transfektion gezüchtet. Zwanzig
Mikrogramm (20 μg)
Plasmid-DNA werden 1,5 ml Opti-MEM I Medium zugegeben und 100 μl Lipofectin-Reagenz
(Gibco-BRL, Grand Island, NY) werden einer zweiten Portion von 1,5
ml Opti-MEM I Medium zugegeben. Die beiden Lösungen werden vermischt und
bei Raumtemperatur für
20 min inkubiert. Nach der Entfernung des Kulturmediums von den
Zellen werden die Zellen 3 mal mit 5 ml Opti-MEM I Medium gespült. Die
Opti-MEM I-Lipofectin-Plasmid-DNA-Lösung wird danach auf die Zellen
aufgegeben. Die Zellen werden für
3 h bei 37 °C
inkubiert, worauf nach dieser Zeit die Opti-MEM I-Lipofectin-DNA-Lösung durch
Kulturmedium für
weitere 24 h vor der Selektion ersetzt wird.
-
C. Selektion und Amplifizierung.
-
Einen
Tag nach der Transfektion werden die Zellen 1:3 passagiert und mit
dhfr/G418-Selektionsmedium
(hiernach "F-12
minus Medium G")
inkubiert. Das Selektionsmedium ist F-12 nach Ham mit L-Glutamin
und ohne Hypoxanthin, Thymidin und Glycin (JRH Biosciences, Lenexa,
Kansas) und 300 μg
pro ml G418 (Gibco-BRL, Grand Island, NY). Die Verhältnisse
des Mediumvolumens zu Oberfläche
von 5 ml pro 25 cm2 werden beibehalten.
Nach ungefähr
zwei Wochen werden die DHFR/G418-Zellen expandiert, um die Passage
und eine kontinuierliche Aufbewahrung in dem F-12 minus Medium G
zu gestatten.
-
Die
Amplifizierung von jeder der transfizierten BS106-cDNA-Sequenzen wird durch
stufenweise Selektion von DHFR+-, G418+-Zellen
mit Methotrexat (zusammengefasst von R. Schimke, Cell 37: 705-713 (1984))
erzielt. Die Zellen werden mit dem F-12 minus Medium G, das 150
nM Methotrexat (MTX) (Sigma, St. Louis, MO) enthält, für ungefähr zwei Wochen inkubiert, bis
resistente Kolonien auftreten. Die weitere Genamplifizierung wird
durch Selektion von 150 nM adaptierten Zellen mit 5 μM MTX erzielt.
-
D. Antigenherstellung.
-
F-12
minus Medium G, das mit 5 μM
MTX ergänzt
ist, wird auf gerade konfluente Monoschichten für 12 bis 24 h bei 37 °C in 5 CO2 aufgeschichtet. Das Wachstumsmedium wird
entfernt und die Zellen werden 3 mal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)
nach Dulbecco (mit Calcium und Magnesium) (Gibco-BRL, Grand Island,
NY) gespült,
um das verbliebene Medium/Serum, das vorhanden sein kann, zu entfernen.
Die Zellen werden danach mit VAS Gebrauchsmedium (VAS Gebrauchsformulierung
mit L-Glutamin mit HEPES ohne Phenolrot, erhältlich von JRH Bioscience;
Lenexa, KS, Produktnummer 52-08678P) für 1 h bei 37 °C in 5 CO2 inkubiert. Die Zellen werden danach mit
VAS zur Produktion mit 5 ml pro T-Gefäß überschichtet. Das Medium wird
nach sieben Tagen der Inkubation entfernt, aufbewahrt und danach
bis zur Reinigung mit den Ernten 2, 3 und 4 eingefroren. Die Monoschichten
werden mit VAS für
3 weitere Sieben-Tage-Ernten überschichtet.
-
E. Analyse der Antigenexpression des Brustgewebegens-BS106.
-
Aliquote
der VAS-Überstände von
den Zellen, die das BS106-Proteinkonstrukt
exprimieren, werden entweder über
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) unter Verwendung von standardmäßigen Verfahren und Reagenzien,
die in dem Fachgebiet bekannt sind (diskontinuierliche Laemmli-Gele),
oder über Massenspektrometrie
analysiert.
-
F. Reinigung.
-
Die
Reinigung des BS106-Proteins, das die FLAG-Sequenz enthält, wird über Immunoaffinitätschromatographie
unter Verwendung einer Affinitätsmatrix
durchgeführt,
die einen monoklonalen anti-FLAG M2 Antikörper umfasst, der über eine
Hydrazidverknüpfung
(Eastman Kodak Co., New Haven, CT) kovalent an Agarose gebunden
ist. Vor der Affinitätsreinigung
wird das Protein in vereinigten VAS-Mediumernten aus Rollerflaschen
in einen 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl-Puffer unter Verwendung
einer Sephadex G-25 Säule (Pharmacia
Biotech Inc.,, Uppsala, Schweden) gewechselt. Das Protein in diesem
Puffer wird auf die anti-FLAG M2 Antikörper-Affinitätssäule aufgetragen.
Das nicht bindende Protein wird über
Waschen der Säule mit
50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl-Puffer eluiert. Das gebundene
Protein wird unter Verwendung eines Überschusses an FLAG-Peptid
in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl eluiert. Das überschüssige FLAG-Peptid
kann von dem gereinigten BS106-Protein über Gelelektrophorese oder
HPLC entfernt werden.
-
Obwohl
in diesem Beispiel das Plasmid 577 verwendet wird, ist es dem Fachmann
bekannt, dass weitere vergleichbare Expressionssysteme, wie z. B.
CMV, hierin mit entsprechenden Modifikationen bei dem Reagenz und/oder
den Techniken verwendet werden können
und in dem Können
des Durchschnittsfachmannes liegen.
-
Die
größte geklonte
Insertion, die die kodierende Region des BS106-Gens enthält, wird
in folgendes subkloniert: entweder (i) ein eukaryotischer Expressionsvektor,
der zum Beispiel einen Cytomegalovirus (CMV) Promotor und/oder Protein-fusionierbare
Sequenzen enthalten kann, die die Proteinexpression und -detektion
unterstützen,
oder (ii) ein bakterieller Expressionsvektor, der ein Superoxid-Dismutase
(SOD) und CMP-KDO-Synthetase (CKS) oder ein anderes Protein-Fusionsgen
für die
Expression der Proteinsequenz enthält. Verfahren und Vektoren,
die für
die Produktion von Polypeptiden nützlich sind, die Fusionssequenzen von
SOD enthalten, sind in der
EPO
0196056 , veröffentlicht
am 1. Oktober 1986, beschrieben, und diejenigen, die Fusionssequenzen
von CKS enthalten, sind in der
EPO
Veröffentlichungs-Nr.
0331961 , veröffentlicht
am 13. September 1989, beschrieben. Dieses so gereinigte Protein
kann bei einer Vielzahl von Techniken verwendet werden, die tierische
Immunisierungsstudien, Festphasen-Immunoassays usw. einschließen aber
nicht darauf eingeschränkt
sind.
-
Beispiel 11b: Expression von Protein in
einer Zelllinie unter Verwendung von pcDNA3.1/Myc-His
-
A. Konstruktion eines BS106-Expressionsplasmids.
-
Das
Plasmid pcDNA3.1/Myc-His (Kat.-Nr. V855-20, Invitrogen, Carlsbad,
CA) ist in der Vergangenheit für
die Expression von sezernierten Antigenen über die meisten säugetierischen
Zelllinien konstruiert worden. Die exprimierten Proteininsertionen
werden mit einem myc-his-Peptidmarker fusioniert. Der myc-his-Marker (Sequenz-Identifikationsnummer
22) umfasst ein. c-myc-Oncoprotein-Epitop
und eine Polyhistidin-Sequenz, die für die Reinigung eines exprimierten
Fusionsproteins unter Verwendung von entweder anti-myc- oder anti-his-Affinitätssäulen oder
Metalloprotein-bindenden Säulen
nützlich
sind.
-
Ein
Plasmid für
die Expression von sezernierbarem BS106-Protein wurde durch Insertion
einer BS106-Polynukleotidsequenz aus dem Klon 1662885 in den pcDNA3.1/Myc-His-Vektor
konstruiert. Vor der Konstruktion des BS106-Expressionsplasmids
wurde die BS106-cDNA-Sequenz
zunächst
in einen pCR®-Blunt-Vektor
kloniert. Das BS106-cDNA-Fragment
wurde über
die PCR erzeugt, die unter Verwendung von Stratagene®-Reagenzien,
die von Stratagene bezogen wurden, wie durch die Anweisungen des
Lieferanten vorgeschrieben durchgeführt wurde. Die PCR-Primer werden
bei einer Endkonzentration von 0,5 μM verwendet. Die PCR wurde unter
Verwendung von 5 U pfu-Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) an
dem BS106-Plasmidtemplat (siehe Beispiel 2) in einer 50 μl Reaktion
für 30
Zyklen (94 °C,
1 min; 65 °C,
1,5 min; 72 °C,
3 min) durchgeführt,
worauf ein Extensionszyklus von 72 °C für 8 min folgte. Die Sense-PCR-Primersequenz
(Sequenz-Identifikationsnummer 14) umfasst Nukleotide, die mit dem
pINCY-Vektor unmittelbar stromaufwärts der BS106-Geninsertion
identisch sind. Der Antisenseprimer (Sequenz-Identifikationsnummer
15) beinhaltet eine 5'-NotI-Restriktionssequenz
und eine Sequenz, die zu dem 3'-Ende
der BS106-cDNA-Insertion unmittelbar stromaufwärts des 3'-äußersten,
rahmeninternen Stopp-Kodons komplementär ist. Fünf Mikroliter (5 μl) des resultierenden
an. den Enden abgestumpften PCR-Produkts wurden mit 25 ng linearisiertem pCR®-Blunt-Vektor
(Invitrogen, Carlsbad, CA) ligiert, wobei das letale ccdB-Gen des
Vektors unterbrochen wurde. Der resultierende ligierte Vektor wurde
in TOP10 E. coli (Invitro gen, Carlsbad, CA) unter Verwendung eines
One ShotTM Transformationskits (Invitrogen,
Carlsbad, CA) gemäß den Anweisungen
des Lieferanten transformiert. Die transformierten Zellen wurden
auf LB-Kan (50 μg/ml
Kanamycin) Selektionsplatten bei 37 °C gezüchtet. Nur Zellen, die ein
Plasmid mit einem unterbrochenen ccdB-Gen enthielten, wuchsen nach
der Transformation (Grant, S.G.N., PNAS 87: 4645-4649 (1990)). Die
transformierten Kolonien wurden geerntet und in 3 ml LB-Kann-Brühe bei 37 °C gezüchtet. Die
Plasmid-DNA wurde unter Verwendung einer QIAprep® (Qiagen
Inc., Santa Clarita, CA) Prozedur isoliert, wie durch die Anweisungen
des Lieferanten vorgeschrieben war. Die DNA wurde mit EcoRI- und
NotI-Restriktionsenzymen verdaut, um das BS106-Insertionsfragment freizusetzen. Das
Fragment wurde auf 1 Seakem® LE Agarose (FMC, Rockland,
ME)/0,5 μg/ml
Ethidiumbromid/TE-Gel elektrophoresiert, über UV-Belichtung sichtbar
gemacht, ausgeschnitten und unter Verwendung von QIAquickTM (Qiagen Inc., Santa Clarita, CA) Prozeduren
gereinigt, wie durch die Anweisungen des Lieferanten vorgeschrieben
war.
-
Die
pcDNA3.1/Myc-His-Plasmid-DNA wurde über Verdau mit EcoRI- und NotI-Stellen
linearisiert, die in der Polylinkerregion der Plasmid-DNA vorhanden
waren. Das vorstehende gereinigte BS106-Fragment wurde mit der resultierenden
Plasmid-DNA stromabwärts
von einem CMV-Promotor ligiert und in DH5-alphaTM-Zellen
(GibcoBRL, Gaithersburg, MD) transformiert, wie durch die Anweisungen
des Lieferanten vorgeschrieben war. Kurz gefasst wurden 10 ng pcDNA3.1/Myc-His,
die die BS106-Insertion enthielten, 50 μl kompetente DH5-alpha-Zellen
zugegeben und der Inhalt wurde vorsichtig vermischt. Das Gemisch
wurde auf Eis für
30 min inkubiert, für
20 s bei 37 °C
erwärmt
und für
zusätzliche
2 min auf Eis gestellt. Nach der Zugabe von 0,95 ml LB-Medium wurde
das Gemisch für
1 h bei 37 °C
unter Schütteln
bei 225 upm inkubiert. Die transformierten Zellen wurden danach
auf 100 mm LB/Amp (50 μg/ml
Ampicillin) Platten ausplattiert und bei 37 °C gezüchtet. Die Kolonien wurden
geerntet und in 3 ml. LB/Ampicillin-Brühe gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde
unter Verwendung eines QIAprep-Kits gereinigt. Das Vorhandensein
der Insertion wurde unter Verwendung von Restriktionsenzymverdau
und Gelanalyse bestätigt
(J. Sambrook et al., vorstehend).
-
B. Transfektion von 293 Zellen aus menschlichen
embryonischen Nierenzellen.
-
Das
vorstehend in Abschnitt A beschriebene BS106-Expressionsplasmid wurde in DH5-alpha-Zellen retransformiert,
auf LB/Ampicillin-Agar ausplattiert und in 10 ml LB/Ampicillin-Brühe gezüchtet, wie
hierin vorstehend beschrieben wurde. Das Plasmid wurde unter Verwendung
eines QIAfilterTM Maxi Kits (Qiagen, Chatsworth,
CA) gereinigt und in HEK293-Zellen (F. L. Graham et al., J. Gen.
Vir. 36: 59-72 (1977)) transfiziert. Diese Zellen sind von der A.T.C.C.,
12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20852, unter der Zugangs-Nr.
CRL 1573 erhältlich.
Die Transfektion wurde unter Verwendung der kationischen Lipofectamin-vermittelten
Prozedur durchgeführt,
die von P. Hawley-Nelson et al., Focus 15.73 (1993) beschrieben
wurde. Im Besonderen wurden die HEK293-Zellen in 10 ml DMEM-Medium
kultiviert, das mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS), L-Glutamin
(2 mM) ergänzt
war, und frisch auf 12 × 100
mm Kulturplatten mit einer Dichte von 8 × 106 Zellen
pro Platte ausgesetzt. Die Zellen wurden bei 37 °C auf eine Konfluenz von zwischen
70 % und 80 % für
die Transfektion gezüchtet.
Acht Mikrogramm (8 μg)
Plasmid-DNA wurden
800 μl Opti-MEM
I® Medium
(Gibco-BRL, Grand Island, NY) zugegeben, und 48-96 μl LipofectamineTM Reagenz (Gibco-BRL, Grand Island, NY)
wurden einer zweiten Portion von 800 μl Opti-MEM I Medium zugegeben. Die zwei Lösungen wurden
vermischt und bei Raumtemperatur für 15-30 min inkubiert. Nach
dem das Kulturmedium von den Zellen entfernt wurde, wurden die Zellen
einmal mit 10 ml Serum-freiem DMEM gewaschen. Die Opti-MEM I-Lipofectamin-Plasmid-DNA-Lösung wurde
mit 6,4 ml Serum-freiem DMEM verdünnt und danach über die
Zellen geschichtet. Die Zellen wurden für 5 h bei 37 °C inkubiert,
worauf nach dieser Zeit zusätzliche
8 ml DMEM mit 20 % FBS zugegeben wurden. Nach 18-24 h wurde das alte Medium aspiriert
und die Zellen wurden mit 5 ml frischem DMEM mit 5 % FBS überschichtet.
Die Überstände und Zellenextrakte
wurden 72 h nach der Transfektion auf die BS106-Genaktivität analysiert.
-
C. Analyse der Antigenexpression des Brustgewebegens
BS106.
-
Der
vorstehende Kulturüberstand
wurde in Kryoröhrchen überführt und
auf Eis gelagert. Die HEK293-Zellen wurden geerntet, indem zweimal
mit 10 ml kaltem PBS nach Dulbecco gewaschen wurde, und durch Zugabe
von 1,5 ml CAT-Lysepuffer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)
lysiert, worauf eine Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur
folgte. Das Lysat wurde in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen aus
Polypropylen überführt und
bei 1000 × g
für 10
min zentrifugiert. Der Überstand
wurde in neue Kryoröhrchen überführt und
auf Eis gelagert. Die Aliquote der Überstände von den Zellen und das
Lysat der Zellen, die das BS106-Proteinkonstrukt exprimierten, wurde
auf das Vorhandensein des rekombinanten BS106-Proteins analysiert.
Die Aliquote wurden in einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) unter Verwendung von standardmäßigen Verfahren und Reagenzien
gestartet, die in dem Fachgebiet bekannt sind (J. Sambrook et al., vorstehend).
Im Besonderen wurden die Proben auf die gewünschte Proteinkonzentration
mit Tricin-Puffer (Novex, San Diego, CA) eingestellt, mit einem
gleichen Volumen an 2X Tricin-Probenpuffer
(Novex, San Diego, CA) vermischt und für 5 min bei 100 °C in einem
Thermal Cycler erwärmt.
Die Proben wurden danach auf ein Novex 10-20 vorgefertigtes Tricin-Gel
(Novex, San Diego, CA) für
die Elektrophorese aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurden die
Proben von den Gelen auf Novex Nitrocellulosemembrane in Novex Tris-Glycin-Transferpuffer
elektrophoretisch überführt. Die
BS106-Proteinbande wurde unter Verwendung von Western Blotting mit
monoklonalen anti-myc-Epitop-Antikörpern (Invitrogen,
Carlsbad, CA) bei einer Verdünnung von
1 zu 5.000 sichtbar gemacht und mit den chemilumineszenten Detektionsreagenzien
Western Lights Plus (Tropix, Redford, MA) gekoppelt. Das Zellenlysat
zeigte die folgenden zwei intensiven Banden, die sich spezifisch
mit dem monoklonalen anti-myc-Antikörper färbten: eine scharfe Bande bei
etwa 20 kD; und eine breitere Bande von etwa 120-200 kD. Der Überstand
lieferte eine einzige intensive breite Bande von 30-45 kD, die Unterschiede
in der post-translationalen Modifikation zwischen der intrazellulären und
der sezernierten Form von BS106 anzeigte. Alternativ dazu kann das
polyklonale anti-BS106-Serum (siehe Beispiel 14) verwendet werden,
um das rekombinante BS106-Protein
zu detektieren, oder das exprimierte rekombinante BS106-Protein kann über Massenspektrometrie
analysiert werden (siehe Beispiel 12).
-
D. Reinigung.
-
Die
Reinigung des rekombinanten BS106-Proteins, das die myc-his-Sequenz
enthält,
wird unter Verwendung des Xpress® Affinitätschromatographie-Systems
(Invitrogen, Carlsbad, CA) durchgeführt, das ein mit Nickel beladenes
Agaroseharz enthält,
das spezifisch Polyhistidingruppen bindet. Die Überstände von 10 × 100 mm Platten, die wie vorstehend
beschrieben präpariert
wurden, werden vereinigt und über
die mit Nickel beladene Säule
gegeben. Das nicht bindende Protein wird durch Waschen der Säule mit
50 mM Tris-HCl (pH 7,5)/150 mM NaCl-Puffer eluiert, worauf nur die myc-his-Fusionsproteine
zurückbleiben.
Das gebundene rekombinante BS106-Protein wird danach unter Verwendung
entweder eines Überschusses
an Imidazol oder Histidin oder eines Puffers mit niedrigem pH von
der Säule
eluiert. Alternativ dazu kann ferner das rekombinante Protein über die
Bindung an der myc-his-Sequenz an eine Affinitätssäule gereinigt werden, die entweder
aus anti-myc oder anti-hystidin monoklonalen Antikörpern besteht,
die über
eine Hydrazid- oder eine andere Verknüpfung mit einem Agaroseharz
konjugiert sind, und mit einem Überschuss
an myc-Peptid bzw. Histidin eluiert werden.
-
Das
gereinigte rekombinante Protein kann danach mit einer festen Phase,
wie z. B. mit N-Hydroxysuccinimid aktivierte Sepharosesäulen (Pharmacia
Biotech, Piscataway, NJ), wie durch die Anweisungen des Lieferanten
vorgeschrieben ist, kovalent vernetzt werden. Diese Säulen, die
das kovalent verknüpfte
rekombinante BS106-Protein enthalten, können danach verwendet werden,
um die anti-BS106-Antikörper
aus Kaninchen- oder Maus- Sera
zu reinigen (siehe Beispiele 13 und 14).
-
E. Beschichtung von Mikrotiterplatten
mit exprimierten BS106-Proteinen.
-
Der Überstand
von einer 100 mm Platte, wie vorstehend beschrieben ist, wird in
einem angemessenen Volumen von PBS verdünnt. Danach werden 100 μl des resultierenden
Gemisches in jede Vertiefung einer Reacti-BindTM Metallchelat-Mikrotiterplatte
(Pierce, Rockford, IL) vorgelegt, bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert,
worauf drei Waschungen mit jeweils 200 μl PBS mit 0,05 Tween® 20
folgen. Die präparierte
Mikrotiterplatte kann danach verwendet werden, um polyklonale Antisera
auf das Vorhandensein von BS106-Antikörpern zu screenen (siehe Beispiel
17).
-
Obwohl
in diesem Beispiel pcDNA3.1/Myc-His verwendet wird, ist es dem Fachmann
bekannt, dass andere vergleichbare Expressionssysteme mit entsprechenden
Modifikationen bei dem Reagenz und/oder den Techniken hierin verwendet
werden können
und in dem Können
des Durchschnittsfachmannes liegen. Die größte geklonte Insertion, die
die kodierende Region des BS106-Gens enthält, wird in folgendes subkloniert: entweder
(i) ein eukaryotischer Expressionsvektor, der zum Beispiel einen
Cytomegalovirus (CMV) Promotor und/oder Protein-fusionierbare Sequenzen
enthalten kann, die die Proteinexpression und -detektion unterstützen, oder
(ii) ein bakterieller Expressionsvektor, der ein Superoxid-Dismutase
(SOD) und CMP-KDO-Synthetase
(CKS) oder ein anderes Proteinfusionsgen für die Expression der Proteinsequenz
enthält.
Verfahren und Vektoren, die für
die Produktion von Polypeptiden nützlich sind, die Fusionssequenzen
von SOD enthalten, sind in der veröffentlichten EPO-Anmeldung
Nr.
EP 0 196 056 , veröffentlicht
am 1. Oktober 1986, beschrieben, und Vektoren, die Fusionssequenzen
von CKS enthalten, sind in der veröffentlichten EPO-Anmeldung
Nr.
EP 0 331 961 , veröffentlicht
am 13. September 1989, beschrieben. Das gereinigte Protein kann
bei einer Vielzahl von Techniken verwendet werden, die tierische
Immunisierungsstudien, Festphasen-Immunoassays und dergleichen einschließen aber
nicht darauf eingeschränkt
sind.
-
Beispiel 12: Chemische Analyse von Brustgewebeproteinen
-
A. Analyse von tryptischen Peptidfragmenten
unter Verwendung von MS.
-
Sera
von Patienten mit einer Brusterkrankung, wie z. B. Brustkrebs, Sera
von Patienten ohne eine Brusterkrankung, Extrakte von Brustgeweben
oder Zellen von Patienten mit einer Brusterkrankung, wie z. B. Brustkrebs,
Extrakte von Brustgeweben oder Zellen von Patienten ohne eine Brusterkrankung
und Extrakte von Geweben oder Zellen von anderen nicht erkrankten
oder erkrankten Organen von Patienten werden auf einem Polyacrylamidgel
unter Verwendung von standardmäßigen Prozeduren
laufen gelassen und mit Coomassie Blau angefärbt. Die Abschnitte des Gels,
von dem vermutet wird, dass sie das unbekannte Polypeptid enthalten,
werden ausgeschnitten und einer In-Gel-Reduktion, Acetamidierung und einem
tryptischen Verdau unterzogen. P. Jeno et al., Anal. Bio. 224: 451-455
(1995) and J. Rosenfeld et al., Anal. Bio. 203: 173-179 (1992).
Die Gelabschnitte werden mit 100 mM NH4HCO3 und Acetonitril gewaschen. Die geschrumpften
Gelstücke
werden in Verdaupuffer (50 mM NH4HCO3, 5 mM CaCl2 und
12,5 μg/ml
Trypsin) bei 4 °C
für 45
min gequollen. Der Überstand
wird aspiriert und durch 5 bis 10 μl Verdaupuffer ohne Trypsin
ersetzt und die Inkubation wird über
Nacht bei 37 °C
gestattet. Die Peptide werden mit 3 Wechseln von 5 Ameisensäure und
Acetonitril extrahiert und bis zur Trockene abgezogen. Die Peptide
werden auf ungefähr
0,1 μl POROS
R2 Sorbens (Perseptive Biosystems, Framingham, Massachusetts) absorbiert,
das in der Spitze eines gezogen Gaschromatographie-Kapillarröhrchens
festgehalten wird, indem sie in 10 μl 5 Ameisensäure gelöst und sie durch die Kapillare
gegeben werden. Die absorbierten Peptide werden mit Wasser gewaschen
und mit 5 Ameisensäure in
60 Methanol eluiert. Der Eluent wird unmittelbar in die Sprühkapillare
eines API III Massenspektrometers (Perkin-Elmer Sciex, Thornhill,
Ontario, Canada) für
die Analyse über
Nano-Elektrospray-Massenspektro metrie gegeben. M. Wilm et al., Int.
J. Mass Spectrom. Ion Process 136: 167-180 (1994) and M. Wilm et
al., Anal. Chem. 66: 1-8 (1994). Die Massen der tryptischen Peptide
werden aus dem Massenspektrum bestimmt, das von dem ersten Quadrupol
erhalten wurde. Die Massen, die den vorhergesagten Peptiden entsprechen,
können
in dem MS/MS-Modus weiter analysiert werden, um die Aminosäure-Sequenz
des Peptids zu liefern.
-
B. Peptidfragmentanalyse unter Verwendung
von LC/MS.
-
Das
Vorhandensein von Polypeptiden, die aus mRNA-Sequenzen vorhergesagt
wurden, die in hyperplastischen Erkrankungsgeweben gefunden werden,
kann ferner unter Verwendung von Flüssigchromatographie/Tandem-Massenspektrometrie
(LC/MS/MS) bestätigt
werden. D. Hess et al., METHODS, A Companion to Methods in Enzymology
6: 227-238 (1994). Die Serumprobe oder der Tumorextrakt von dem
Patienten wird mit SDS denaturiert und mit Dithiothreitol (1,5 mg/ml)
für 30
min bei 90 °C
reduziert, worauf eine Alkylierung mit Iodacetamid (4 mg/ml) für 15 min
bei 25 °C
folgt. Nach der Acrylamidelektrophorese werden die Polypeptide auf
eine kationische Membran elektrogeblottet und mit Coomassie Blau
angefärbt.
Nach dem Anfärben werden
die Membrane gewaschen und die Abschnitte, von denen vermutet wird,
dass sie die unbekannten Polypeptide enthalten, werden herausgeschnitten
und in kleine Stücke
zerlegt. Die Membrane werden in 500 μl Mikrozentrifugenröhrchen gegeben
und in 10 bis 20 μl
proteolytischer Verdaupuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,2, enthaltend
0,1 M NaCl, 10 % Acetonitril, 2 mM CaCl2 und
5 μg/ml
Trypsin) (Sigma, St. Louis, MO) eingetaucht. Nach 15 h bei 37 °C werden
3 μl gesättigter
Harnstoff und 1 μl
100 μg/ml
Trypsin zugegeben und für
weitere 5 h bei 37 °C
inkubiert. Das Verdaugemisch wird mit 3 μl 10 % Trifluoressigsäure angesäuert und
zentrifugiert, um den Überstand
von der Membran zu trennen. Der Überstand
wird unmittelbar auf eine Microbore-Umkehrphasen-HPLC-Säule injiziert und mit einem
linearen Gradienten von Acetonitril in 0,05 % Trifluoressigsäure eluiert.
Das Eluat wird unmittelbar in ein Elektrospray-Massenspektrometer
gegeben, nachdem ein Stream Splitter, falls erforderlich, durchlaufen wurde,
um das Volumen an Material einzustellen. Die Daten werden gemäß den Prozeduren
analysiert, die in dem Beispiel 12, Abschnitt A, dargelegt sind.
-
Beispiel 13: Gen-Immunisierungsprotokoll
-
A. In vivo Antigenexpression.
-
Die
Gen-Immunisierung umgeht die Proteinreinigungsschritte, indem unmittelbar
ein Antigen in vivo nach der Impfung des entsprechenden Expressionsvektors
exprimiert wird. Ferner kann die Produktion von Antigen über dieses
Verfahren eine korrekte Proteinfaltung und Glycosylierung gestatten,
da das Protein in Säugetiergewebe
produziert wird. Das Verfahren verwendet die Insertion der Gensequenz
in ein Plasmid, das einen CMV-Promotor enthält, die Expansion und Reinigung
des Plasmids und die Injektion der Plasmid-DNA in das Muskelgewebe
eines Tieres. Bevorzugte Tiere schließen Mäuse und Kaninchen ein. Siehe
zum Beispiel H. Davis et al., Human Molecular Genetics 2: 1847-1851
(1993). Nach einer oder zwei verstärkenden Immunisierungen kann
danach das Tier ausgeblutet, die Aszitesflüssigkeit eingesammelt oder
die Milz des Tieres kann für
die Produktion von Hybridomen entnommen werden.
-
B. Plasmidherstellung und Reinigung.
-
Die
BS106-cDNA-Insertion wurde aus dem BS106-Vektor, der in Beispiel
11b beschrieben ist, über Verdau
mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI freigesetzt. Die verdauten
Plasmidfragmente wurden auf einem 1 Seakem KE Agarose/0,5 μg/ml Ethidiumbromid/TE
Gel elektrophoresiert und die Banden wurden über UV-Belichtung sichtbar
gemacht. Das Insertionsfragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten
und unter Verwendung der vorstehend beschriebenen QIAquick Prozedur
gereinigt. Das Fragment wurde in einen EcoRI/NotI-verdauten pcDNA3.1-Vektor
(Invitrogen, Carlsbad, CA) ligiert und in DH5-alpha-Zellen transformiert, wie
vorstehend beschrieben ist. Die Plasmid-DNA wurde von dem bakteriellen
Lysat unter Verwendung einer QIAprep Säule gereinigt. Sämtliche
dieser Techniken sind einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet
der Molekularbiologie vertraut.
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C. Immunisierungsprotokoll.
-
Anästhesierte
Tiere werden intramuskulär
mit 0,1-100 μg
des gereinigten Plasmids immunisiert, das in PBS oder anderen Enhancern
für die
DNA-Aufnahme (Cardiotoxin,
25 Saccharose) verdünnt
ist. Siehe zum Beispiel H. Davis et al., Human Gene Therapy 4: 733-740
(1993); und P. W. Wolff et al., Biotechniques 11: 474-485 (1991).
Nur zwei verstärkende
Injektionen werden in monatlichen Intervallen verabreicht.
-
D. Untersuchung und Verwendung von Antiserum.
-
Tiere
werden ausgeblutet und die resultierenden Sera werden unter Verwendung
von Peptiden, die aus der bekannten Gensequenz (siehe Beispiel 16)
unter Verwendung von in dem Fachgebiet bekannten Techniken, wie
z. B. Western Blotting oder EIA-Techniken synthetisiert wurden,
auf Antikörper
getestet. Die über
dieses Verfahren produzierten Antisera können danach verwendet werden,
um das Vorhandensein des Antigens in dem Gewebe oder Zellen Extrakt
eines Patienten oder in dem Serum eines Patienten über ELISA oder
Western Blotting Techniken zu detektieren, wie z. B. diejenigen,
die in den Beispielen 15 bis 18 beschrieben sind.
-
Beispiel 14: Herstellung von Antikörpern gegen
BS106
-
A. Herstellung von polyklonalen Antisera.
-
Das
Antiserum gegen BS106 wird über
Injizieren von Kaninchen mit Peptiden hergestellt, deren Sequenzen
von derjenigen der vorausgesagten Aminosäure-Sequenz der BS106-Konsensussequenz
(Sequenz-Identifikationsnummer
4) abgeleitet sind. Die Synthese der Peptide (Sequenz-Identifikationsnummer 17,
Sequenz-Identifikationsnummer
18, Sequenz-Identifikationsnummer 19 und Sequenz-Identifikationsnummer
20) ist in Beispiel 10 beschrieben.
-
1. Peptidkonjugation.
-
Das
Peptid wird an das Maleimid-aktivierte Hämocyanin der Schlüssellochschnecke
(KLH, im Handel erhältliches
Imject®,
erhältlich
von Pierce Chemical Company, Rockford, IL) konjugiert. Imject® enthält etwa
250 Mol an reaktiven Maleimidgruppen pro Mol Hämocyanin. Das aktivierte KLH
wird in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 8,4) bei einer
Konzentration von etwa 7,7 mg/ml aufgelöst. Das Peptid wird über Cysteine, die
in der Peptidsequenz auftreten, oder an ein Cystein konjugiert,
das zuvor an das synthetisierte Peptid addiert wurde, um einen Anbindungspunkt
bereitzustellen. Das Peptid wird in Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma Chemical
Company, St. Louis, MO) gelöst
und mit dem aktivierten KLH bei einem Molverhältnis von etwa 1,5 Mol Peptid
pro Mol reaktives Maleimid, das an das KLH gebunden ist, zur Reaktion
gebracht. Eine Prozedur für
die Konjugation des Peptids ist hierin nachstehend bereitgestellt.
Es ist dem Durchschnittsfachmann bekannt, dass die Menge, die Zeiten
und die Bedingungen für
eine solche Prozedur variiert werden können, um die Peptidkonjugation
zu optimieren.
-
Die
hierin nachstehend beschriebene Konjugationsreaktion basiert darauf,
3 mg KLH-Peptidkonjugat ("konjugiertes
Peptid") zu erhalten,
das etwa 0,77 μmol
reaktive Maleimidgruppen enthält.
Diese Menge an Peptidkonjugat ist gewöhnlich für eine primäre Injektion und vier verstärkende Injektionen
für die
Produktion von polyklonalen Antisera in einem Kaninchen ausreichend.
Kurz gefasst wird das Peptid in DMSO bei einer Konzentration von
1,16 μmol/100 μl DMSO gelöst. Einhundert
Mikroliter (100 μl)
der DMSO-Lösung
werden 380 μl
der aktivierten KLH-Lösung
zugegeben, wie hierin vorstehend beschrieben hergestellt, und 20 μl PBS (pH
8,4) werden zugegeben, um das Volumen auf 500 μl zu bringen. Die Reaktion wird über Nacht
bei Raumtemperatur unter Rühren
inkubiert. Das Ausmaß der
Reaktion wird durch Messen der Menge an nicht umgesetztem Thiol
in dem Reaktionsgemisch bestimmt. Die Differenz zwischen der Ausgangskonzentration
des Thiols und der Endkonzentration wird als die Konzentration des
Peptids angenommen, das an das aktivierte KLH gekoppelt wurde. Die
Menge an verbliebenem Thiol wird unter Verwendung von Reagenz nach
Ellman (5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure), Pierce
Chemical Company, Rockford, IL) bestimmt. Cystein-Standards werden
mit einer Konzentration von 0, 0, 1, 0, 5, 2, 5 und 20 mM durch
Lösen von
35 mg Cystein-HCl (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) in 10
ml PBS (pH 7,2) und Verdünnen
der Stammlösung
auf die gewünschte Konzentration
hergestellt. Die photometrische Bestimmung der Konzentration des
Thiols wird bewerkstelligt, indem 200 μl PBS (pH 8,4) in jede Vertiefung
einer Immulon 2® Mikrowellplatte
(Dynex Technologies, Chantilly, VA) gegeben werden. Als Nächstes werden
10 μl Standard
oder Reaktionsgemisch in jede Vertiefung gegeben. Schließlich werden
20 μl Reagenz
nach Ellman bei einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS (pH 8,4)
jeder Vertiefung zugegeben. Die Vertiefungen werden für 10 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert und die Extinktion von sämtlichen
Vertiefungen wird bei 415 nm mit einem Mikroplattenableser gemessen
(wie z. B. das BioRad Model 3550, BioRad, Richmond, CA). Die Extinktion
der Standards wird verwendet, um eine Standardkurve zu konstruieren,
und die Thiol-Konzentration
des Reaktionsgemisches wird aus der Standardkurve bestimmt. Eine
Abnahme in der Konzentration des freien Thiols ist ein Anzeichen
für eine
erfolgreiche Konjugationsreaktion. Zusätzlich gestattet die Berechnung
an freiem Thiol in der Peptidlösung
vor der Zugabe des Maleimid-aktivierten KLH und nach der Beendigung
der Reaktion die Bestimmung des Substitutionverhältnisses an Mol Peptid/Mol
KLH für
jedes Konjugat Peptid × KLH.
In sämtlichen
Fällen
wurde die Reaktion bis zur Vollständigkeit durchgeführt und
für jedes
Peptidkonjugat wurden ungefähr
250 Peptide/KLH-Molekül
hergestellt. Sämtliches
nicht umgesetztes Peptid wird über
Dialyse gegen PBS (pH 7,2) bei Raumtemperatur für 6 Stunden entfernt. Das Konjugat
wird bei 2-8 °C
gelagert, falls es unmittelbar verwendet werden soll; ansonsten
wird es bei –20 °C oder kälter gelagert.
-
2. Tierimmunisierung.
-
Weibliche
weiße
Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von 2 kg oder mehr wurden
für das
Anziehen von polyklonalem Antiserum verwendet. Ein Tier wurde pro
Peptid (Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer
18, Sequenz-Identifikationsnummer 19 bzw. Sequenz- Identifikationsnummer 20)
immunisiert. Eine Woche vor der ersten Immunisierung wurden 5 bis
10 ml Blut aus den Tier entnommen, um als eine nicht-immune vorentnommene
Probe zu dienen.
-
Jedes
der Peptide, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer
18, Sequenz-Identifikationsnummer 19 und Sequenz-Identifikationsnummer
20, wurde verwendet, um das primäre Immunogen über Emulgieren
von 0,5 ml des Peptids bei einer Konzentration von 2 mg/ml in PBS
(pH 7,2) mit 0,5 ml vollständigem
Adjuvans nach Freund (CFA) (Difco, Detroit, MI) herzustellen. Das
Immunogen wurde an mehreren Stellen des Tieres über subkutane, intraperitoneale
und/oder intramuskuläre
Wege der Verabreichung injiziert. Vier Wochen nach der primären Immunisierung
wurde eine verstärkende
Immunisierung verabreicht. Das Immunogen, das für die verstärkende Immunisierungsdosis
verwendet wurde, wurde über
Emulgieren von 0,5 ml des gleichen Peptids hergestellt, das für das primäre Immunogen
verwendet wurde, mit der Ausnahme, dass das Peptid nun auf 1 mg/ml
mit 0,5 ml unvollständigem
Adjuvans nach Freund (IFA) (Difco, Detroit, MI) verdünnt wurde.
Wiederum wurde die verstärkende
Dosis an mehreren Stellen verabreicht und subkutane, intraperitoneale
und intramuskuläre
Arten von Injektionen wurden verwendet. Dem Tier wurde zwei Wochen
nach der verstärkenden
Immunisierung Blut (5 ml) entnommen und das Serum wurde auf eine
Immunoreaktivität
gegenüber
dem Peptid getestet, wie nachstehend beschrieben ist. Der Ablaufplan
für die
Verstärkung
und die Blutentnahme wird in Intervallen von 4 Wochen wiederholt,
bis ein adäquater
Titer erhalten wird. Der Titer oder die Konzentration an Antiserum
wird über
Mikrotiter-EIA bestimmt, wie nachstehend in Beispiel 17 beschrieben
ist. Zusätzlich
werden apparente Affinitätswerte
[Kd(app)] für einige der Antisera bestimmt
(siehe Beispiel 17).
-
Ein
Antikörpertiter
von 1:500 oder größer wird
als ein adäquater
Titer für
die weitere Verwendung und Untersuchung betrachtet.
-
B. Herstellung von monoklonalem Antikörper
-
1. Immunisierungsprotokoll.
-
Mäuse werden
unter Verwendung von Immunogenen, die wie hierin vorstehend beschrieben hergestellt
wurden, mit der Ausnahme immunisiert, dass die Menge des unkonjugierten
oder konjugierten Peptids für
die monoklonale Antikörperproduktion
in Mäusen
ein Zehntel der Menge beträgt,
die für
die Produktion der polyklonalen Antisera in Kaninchen verwendet
wurde. Somit besteht das primäre
Immunogen aus 100 μg
unkonjugiertem oder konjugiertem Peptid in 0,1 ml CFA-Emulsion;
während
das für
verstärkende
Immunisierungen verwendete Immunogen aus 50 μg unkonjugiertem oder konjugiertem
Peptid in 0,1 ml IFA besteht. Die Hybridomas für die Erzeugung von monoklonalen
Antikörpern
werden unter Verwendung von standardmäßigen Techniken hergestellt
und gescreent. Die Verfahren, die für die Entwicklung von monoklonalen
Antikörpern verwendet
wurden, folgen in dem Fachgebiet bekannten Prozeduren, wie z. B.
denjenigen, die in Kohler und Milstein, Nature 256: 494 (1975) detailliert
und in J. G. R. Hurrel, Hrsg., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques
and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1982) zusammengefasst
sind. Ein weiteres Verfahren für
die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern, das auf dem Verfahren
von Kohler und Milstein basiert, ist das von L. T. Mimms et al.,
Virology 176: 604-619(1990).
-
Das
Immunisierungsregime (pro Maus) besteht aus einer primären Immunisierung
mit zusätzlichen verstärkenden
Immunisierungen. Das für
die primäre
Immunisierung verwendete primäre
Immunogen besteht aus 100 μg
unkonjugiertem oder konjugiertem Peptid in 50 μl PBS (pH 7,2), das zuvor in
50 μl CFA
emulgiert wurde. Die verstärkenden
Immunisierungen, die ungefähr
zwei Wochen und vier Wochen nach der primären Immunisierung durchgeführt wurden,
bestehen aus 50 μg
unkonjugiertem oder konjugiertem Peptid in 50 μl PBS (pH 7,2), das mit 50 μl IFA emulgiert
wurde. Eine Gesamtmenge von 100 μl
dieses Immunogens wird in jede Maus intraperitoneal und subkutan
geimpft. Einzelne Mäuse
werden über
einen Mikrotiterplatten-Enzym-Immunoassay (EIA), wie in Beispiel
17 beschrieben ist, ungefähr
vier Wochen nach der dritten Immunisierung auf eine Immunantwort
gescreent. Die Mäuse
werden entweder intravenös,
intrasplenisch oder intraperitoneal mit 50 μg unkonjugiertem oder konjugiertem
Peptid in PBS (pH 7,2) ungefähr
15 Wochen nach der dritten Immunisierung geimpft.
-
Drei
Tage nach dieser intravenösen
Verstärkung
werden die Splenocyten mit zum Beispiel Sp2/0-Ag14-Myelomazellen
(Nilstein Laboratories, England) unter Verwendung des Polyethylenglycol
(PEG) Verfahrens fusioniert. Die Fusionen werden in nach Iscove
modifiziertem Medium nach Dulbecco (IMDM) kultiviert, das 10 fetales
Kälberserum
(FCS), plus 1 Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthält. Die Massenkulturen
werden über
Mikrotiterplatten-EIA gemäß dem Protokoll
in Beispiel 17 gescreent. Die Klone, die mit dem Peptid reagierten,
das als Immunogen verwendet wurde, und mit anderen Peptiden (d.
h. Peptiden von BS106, die nicht als das Immunogen verwendet wurden)
nicht reagierten, werden für
die endgültige
Expansion ausgewählt.
Die so ausgewählten
Klone werden expandiert, aliquotiert und in IMDM eingefroren, das 10
FCS und 10 Dimethylsulfoxid enthält.
-
2. Herstellung von monoklonale Antikörper enthaltender
Aszitesflüssigkeit.
-
Gefrorene
Hybridomazellen, die wie hierin vorstehend beschrieben hergestellt
wurden, werden aufgetaut und in eine Expansionskultur gegeben. Entwicklungsfähige Hybridomazellen
werden intraperitoneal in mit Pristan behandelte Mäuse geimpft.
Aszitesflüssigkeit
wird aus den Mäusen
entnommen, vereinigt, durch ein 0,2 μ Filter filtriert und einer
Immunoglobulinklasse G (IgG) Analyse unterzogen, um das Volumen
der Protein A Säule
zu bestimmen, die für
die Reinigung erforderlich ist.
-
3. Reinigung von monoklonalen Antikörpern aus
Aszitesflüssigkeit.
-
Kurz
gefasst wird filtrierte und aufgetaute Aszitesflüssigkeit mit einem gleichen
Volumen an Protein A Sepharose Bindungspuffer (1,5 M Glycin, 3,0
M NaCl, pH 8,9) vermischt und durch ein 0,2 μ Filter erneut filtriert. Das
Volumen der Protein A Säule
wird über
die Menge an IgG bestimmt, die in der Aszitesflüssigkeit vorhanden ist. Das
Eluat wird danach gegen PBS (pH 7,2) über Nacht bei 2-8 °C dialysiert.
Der dialysierte monoklonale Antikörper wird steril filtriert
und in Aliquote aufgeteilt. Die Immunoreaktivität des gereinigten monoklonalen
Antikörpers
wird über
die Bestimmung seiner Fähigkeit,
spezifisch an das Peptid zu binden, das als das Immunogen verwendet
wurde, unter Verwendung der EIA-Mikrotiterplatten Assayprozedur
aus Beispiel 17 bestätigt.
Die Spezifität
des gereinigten monoklonalen Antikörpers wird durch Bestimmung
seiner fehlenden Bindung an irrelevante Peptide bestätigt, wie
z. B. die Peptide von BS106, die nicht als das Immunogen verwendet wurden.
Der so hergestellte und charakterisierte gereinigte anti-BS106 monoklonale
Antikörper
wird entweder auf 2-8 °C
für eine
kurzzeitige Lagerung oder auf –80 °C für eine langzeitige
Lagerung gestellt.
-
4. Weitere Charakterisierung des monoklonalen
Antikörpers.
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Der
Isotyp und Subtyp des wie hierin vorstehend beschrieben hergestellten
monoklonalen Antikörpers kann
unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits (erhältlich von
Amersham, Inc., Arlington Heights, IL) bestimmt werden. Die Stabilitätsuntersuchung
kann ferner an dem monoklonalen Antikörper durchgeführt werden,
indem eine Aliquote des monoklonalen Antikörpers kontinuierlich bei 2-8 °C gelagert
wird und die Messungen der optischen Dichte (OD) im Verlauf einer
gegebenen Zeitspanne untersucht werden.
-
C. Verwendung von rekombinanten Proteinen
als Immunogene.
-
Es
liegt in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, dass wie hierin
beschrieben hergestellte rekombinante Proteine, bei der Herstellung
von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern mit entsprechenden Änderungen
bei den Reagenzien und Techniken, die dem Fachmann bekannt sind,
als Immunogene verwendet werden können.
-
Beispiel 15: Reinigung von Serum-Antikörpern, die
spezifisch an BS106-Peptide binden
-
Immunsera,
die wie hierin vorstehend in den Beispielen 13 und/oder 14 beschrieben
erhalten wurden, werden unter Verwendung von immobilisierten synthetischen
Peptiden, die wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt wurden,
oder rekombinanten Proteinen, die wie in Beispiel 11 beschrieben
hergestellt wurden, affinitätsgereinigt.
Eine IgG-Fraktion des Antiserums wird erhalten, indem das verdünnte, rohe
Antiserum über
eine Protein A Säule
(Affi-Gel Protein A, Bio-Rad, Hercules, CA) gegeben wird. Die Flution
mit einem Puffer (Bindungspuffer, von dem Hersteller geliefert)
entfernt im Wesentlichen sämtliche
Proteine, die keine Immunoglobuline sind. Die Flution mit 0,1 M
gepuffertem Glycin (pH 3) ergibt eine Immunoglobulin-Präparation,
die im Wesentlichen von Albumin und anderen Serum-Proteinen frei ist.
-
Die
Immunoaffinitätschromatographie
wird durchgeführt,
um eine Präparation
mit einer höheren
Fraktion an spezifischem Antigenbindendem Antikörper zu erhalten. Das für die Erhöhung des
Antiserums verwendete Peptid wird auf einem Chromatographieharz
immobilisiert und die spezifischen Antikörper, die gegen dessen Epitope
gerichtet sind, werden an dem Harz adsorbiert. Nachdem nicht bindende
Komponenten weggewaschen wurden, werden die spezifischen Antikörper mit
0,1 M Glycinpuffer (pH 2,3) eluiert. Die Antikörperfraktionen werden sofort
mit 1,0 M Tris-Puffer (pH 8,0) neutralisiert, um die Immunoreaktivität zu bewahren. Das
gewählte
Chromatographieharz hängt
von den reaktiven Gruppen ab, die in dem Peptid vorhanden sind. Wenn
das Peptid über
eine Aminogruppe verfügt,
wird ein Harz, wie z. B. Affi-Gel 10 oder Affi-Gel 15 verwendet
(Bio-Rad, Hercules, CA). Wenn die Kopplung über eine Carboxygruppe an dem
Peptid gewünscht
ist, kann Affi-Gel
102 verwendet werden (Bio-Rad, Hercules, CA). Wenn das Peptid über eine
freie Sulfhydrylgruppe verfügt,
kann ein Organoquecksilber-Harz, wie z. B. Affi-Gel 501 (Bio-Rad,
Hercules, CA oder SulkfoLinkTM (Pierce,
Rockford, IL) verwendet werden. Die Menge an Peptid, das an dem
Harz immobilisiert wird, kann unter Verwendung von Nano OrangeTM (Molecular Probes, Eugene, OR) bestimmt
werden.
-
Alternativ
dazu können
die Milz entnommen und bei der Produktion von Hybridomas verwendet
werden, um monoklonale Antikörper
gemäß wie hierin
vorstehend beschriebenen Routineverfahren herzustellen, die in dem
Fachgebiet bekannt sind.
-
Beispiel 16: Western Blotting von Gewebeproben
-
Proteinextrakte
werden hergestellt, indem Gewebeproben in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5),
15 (m/V) Glycerol, 0,2 mM EDTA, 1,0 mM 1,4-Dithiothreitol, 10 μg/ml Leupeptin und 1,0 mM Phenylmethylsulfonylfluorid
(Kain et al., Biotechniques, 17: 982 (1994)) homogenisiert werden.
Nach der Homogenisierung werden die Homogenisate bei 4 °C für 5 Minuten
zentrifugiert, um den Überstand
von dem Brei zu trennen. Für
die Proteinquantifizierung werden 3-10 μl Überstand 1,5 ml Bicinchoninsäure-Reagenz
(Sigma, St. Louis, MO) zugegeben und die resultierende Extinktion
bei 562 nm wird gemessen.
-
Für die SDS-PAGE
werden die Proben auf die gewünschte
Proteinkonzentration mit Tricin-Puffer (Novex, San Diego, CA) eingestellt,
mit einem gleichen Volumen an 2X Tricin-Probenpuffer (Novex, San Diego, CA)
vermischt und für
5 Minuten bei 100 °C
in einem Thermal Cycler erwärmt.
Die Proben werden danach auf ein Novex 10-20 vorgeformtes Tricin-Gel
für die
Elektrophorese aufgetragen. Nach der Elektrophorese werden die Proben
aus den Gelen auf Nitrocellulosemembrane in Novex Tris-Glycin-Transferpuffer übertragen.
Die Membrane werden danach mit spezifischen anti-Peptid-Antikörpern unter
Verwendung der Reagenzien und Prozeduren getestet, die in den Western
Lights oder Western Lights Plus (Tropix, Redford, MA) chemilumineszenten
Detektionskits bereitgestellt sind. Die chemilumineszenten Banden
werden sichtbar gemacht, indem die entwickelten Membranen Hyperfilm
ECL (Amersham, Arlington Heights, IL) ausgesetzt werden.
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Konkurrenzexperimente
werden auf eine analoge Art und Weise wie vorstehend mit der folgenden Ausnahme
durchgeführt;
die primären
Antikörper
(polyklonale anti-Peptid-Antisera) werden für 30 Minuten bei Raumtemperatur
mit variieren den Konzentrationen an Peptid-Immunogen vor-inkubiert,
bevor sie dem Nitrocellulosefilter ausgesetzt werden. Die Entwicklung
des Western Blot wird wie vorstehend durchgeführt.
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Nach
der Sichtbarmachung der Banden auf Film, können die Banden ferner unmittelbar
auf den Membranen durch die Zugabe und Entwicklung eines chromogenen
Substrates, wie z. B. 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat
(BCIP), sichtbar gemacht werden. Diese chromogene Lösung enthält 0,016
BCIP in einer Lösung, die
100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 und 100 mM Tris-HCl
(pH 9,5) enthält.
Der Filter wird in der Lösung
bei Raumtemperatur inkubiert, bis sich die Banden zu der gewünschten
Intensität
entwickeln. Die Bestimmung der Molmasse wird auf der Basis der Mobilität von vorgefärbten Molmassenstandards
(Novex, San Diego, CA) oder biotinylierten Molmassenstandards (Tropix,
Redford, MA) vorgenommen.
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Beispiel 17: EIA-Mikrotiterplattenassay
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Die
Immunoreaktivität
von Antiserum, das vorzugsweise aus Kaninchen oder Mäusen erhalten
wurde, wie in Beispiel 13 oder Beispiel 14 beschrieben ist, wird
mit Hilfe einer Mikrotiterplatten-EIA wie folgt bestimmt. Die synthetischen
Peptide, die wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt wurden,
oder die rekombinanten Proteine, die wie in Beispiel 11 beschrieben
hergestellt wurden, werden in 50 mM Carbonatpuffer (pH 9,6) auf
eine Endkonzentration von 2 μg/ml
gelöst.
Als Nächstes
werden 100 μl
der Peptid- oder Proteinlösung
in jede Vertiefung einer Immulon 2® Mikrotiterplatte
(Dynex Technologies, Chantilly, VA) gegeben. Die Platte wird über Nacht
bei Raumtemperatur inkubiert und danach viermal mit entionisiertem
Wasser gewaschen. Die Vertiefungen werden durch die Zugabe von 125 μl eines geeigneten
Proteinblockierungsmittels, wie z. B.
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Superblock® (Pierce
Chemical Company, Rockford, IL), in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS,
pH 7,4) zu jeder Vertiefung blockiert und unmittelbar danach wird
die Lösung
verworfen. Diese Blockierungsprozedur wird dreimal durchgeführt. Das
Antiserum, das aus immunisierten Kaninchen oder Mäusen erhalten
wurde, die wie zuvor beschrieben präpariert wurden, wird in einem
Proteinblockierungsmittel (z. B. eine 3 Superblock® Lösung) in
PBS, das 0,05 Tween-20® (Monolauratpolyoxyethylenether)
enthält
(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), und 0,05 Natriumazid bei
Verdünnungen
von 1:500, 1:2.500, 1:12.500, 1:62.500 und 1:312.500 verdünnt und
in jede Vertiefung der beschichteten Mikrotiterplatte gegeben. Die
Vertiefungen werden danach für
drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Jede Vertiefung wird
viermal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Ein Hundert μl alkalische
Phosphatase-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG- oder Ziegen-anti-Maus-IgG-Antiserum
(Southern Biotech, Birmingham, AB), das 1:2.000 in 3 Superblock® Lösung in
Phosphat-gepufferter Salzlösung
verdünnt
ist, die 0,05 Tween 20® und 0,05 Natriumazid
enthält,
wird jeder Vertiefung zugegeben. Die Vertiefungen werden für zwei Stunden
bei Raumtemperatur inkubiert. Als Nächstes wird jede Vertiefung
viermal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Ein Hundert Mikroliter
(100 μl)
Paranitrophenylphosphat-Substrat (Kirkegaard and Perry Laboratories,
Gaithersburg, MD) werden danach jeder Vertiefung zugegeben. Die
Vertiefungen werden für
dreißig
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion bei 405 nm
wird für
jede Vertiefung gemessen. Die positiven Reaktionen werden über einen
Anstieg in der Extinktion bei 405 nm in der Testvertiefung oberhalb
derjenigen Extinktion bestimmt, die von einem nicht immunen Serum
(negative Kontrolle) geliefert wird. Eine positivere Reaktion ist
ein Anzeichen für
das Vorhandensein von detektierbaren anti-BS106-Antikörpern.
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Zusätzlich zu
den Titern können
ferner die apparenten Affinitäten
[K
d(app)] für einige der anti-Peptid-Antisera
bestimmt werden. Die Ergebnisse des EIA-Mikrotiterplattenassays
können verwendet
werden, um die apparenten Dissoziationskonstanten (Kd) auf der Basis
eines Analogons zu der Michaelis-Menten-Gleichung abzuleiten (V.
Van Heyningen, Methods in Enzymology, Bd. 121, S. 472 (1986), das
weiter in X. Qiu, et al., Journal of Immunology, Bd. 156, S. 3350
(1996)) beschrieben ist:
wobei [Ag – Ab] die
Konzentration des Antigen-Antikörperkomplexes,
[Ag – Ab]
max die maximale Komplexkonzentration, [Ab]
die Antikörperkonzentration
und K
d die Dissoziationskonstante darstellt.
Während
der Kurvenanpassung wird die [Ag – Ab] durch den abgezogen Wert
des Hintergrundes der OD
405nm bei der gegebenen Endkonzentration
von Ab ersetzt. Sowohl K
d als auch [OD
405nm]
max, die der
[Ag – Ab]
max entspricht, werden als angepasste Parameter
behandelt. Das Software-Programm Origin kann für die Kurvenanpassung verwendet werden.
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Beispiel 18: Beschichtung von Festphasenteilchen
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A. Beschichtung von Mikroteilchen mit
Antikörpern,
die spezifisch an das BS106-Antigen binden.
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Affinitätsgereinigte
Antikörper,
die spezifisch an das BS106-Protein (siehe Beispiel 15) binden,
werden auf Mikroteilchen aus Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol,
Polymethylacrylat oder ähnliche
Teilchen aufgebracht, die einen Radius in dem Bereich von etwa 0,1
bis 20 μm
aufweisen. Die Mikroteilchen können
entweder passiv oder aktiv beschichtet werden. Ein Beschichtungsverfahren
umfasst die Beschichtung von mit EDAC (1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid
(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) aktivierten carboxylierten
Latex-Mikroteilchen
mit Antikörpern,
die spezifisch an das BS106-Protein
binden, wie folgt. Kurz gefasst wird eine endgültige 0,375 Feststoffsuspension
an mit Harz gewaschenen carboxylierten Latexmikroteilchen (erhältlich von
Hangs Laboratories, Camel, IN oder Serodyn, Indianapolis, IN) in
einer Lösung,
die 50 mM MES-Puffer, pH 4,0 und 150 mg/l affinitätsgereinigten
anti-BS106-Antikörper
(siehe Beispiel 14) enthält, für 15 min
in einen angemessenen Behälter
vermischt. Das EDAC-Kopplungsagens wird dem Gemisch bis zu einer
Endkonzentration von 5,5 μg/ml
zugegeben und es wird für
2,5 h bei Raumtemperatur gerührt.
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Die
Mikroteilchen werden danach mit 8 Volumina eines Tween 20®/Natriumphosphat-Waschpuffers (pH
7,2) über
Tangentialflussfiltration unter Verwendung eines 0,2 μm Microgon
Filtrationsmoduls gewaschen. Die gewaschenen Mikroteilchen werden
in einem angemessenen Puffer aufbewahrt, der gewöhnlich ein verdünntes Tensid
und ein irrelevantes Protein als ein Blockierungsmittel enthält, bis
sie benötigt
werden.
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B. Beschichtung von 1/4-Zoll Kügelchen.
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Antikörper, die
spezifisch an das BS106-Antigen binden, können ferner auf die Oberfläche von
1/4-Zoll Polystyrolkügelchen über Routineverfahren
aufgebracht werden, die in dem Fachgebiet bekannt sind (
US-Patent Nr. 5,273,882 an
Snitman et al.) und bei kompetitiven Hindungs- oder EIA-Sandwichassays
verwendet werden.
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Die
Polystyrolkügelchen
werden zunächst über eine
Ultraschallbehandlung für
etwa 15 Sekunden in 10 mM NaHCO3-Puffer
bei pH 8,0 gereinigt. Die Kügelchen
werden danach in entionisiertem Wasser gewaschen, bis sämtliche
Feinstoffe entfernt sind. Die Kügelchen
werden danach in eine Antikörperlösung in
10 mM Carbonat-Puffer, pH 8 bis 9,5, eingetaucht. Die Antikörperlösung kann
so weit verdünnt
sein wie 1 μg/ml,
in dem Fall von monoklonalen Antikörpern mit hoher Affinität, oder
so konzentriert sein wie etwa 500 μg/ml für polyklonale Antikörper, die
noch nicht affinitätsgereinigt
worden sind. Die Kügelchen
werden für
mindestens 12 Stunden bei Raumtemperatur beschichtet und danach
werden sie mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die Kügelchen
können
an der Luft getrocknet oder nass (in PBS, pH 7,4) gelagert werden.
Sie können
ferner mit Proteinstabilisatoren (wie z. B. Saccharose) oder Proteinblockierungsmitteln überzogen
werden, die als nicht spezifische Bindungsblocker (wie z. B. irrelevante
Proteine, Carnation Magermilch, Superblock® oder
dergleichen) verwendet werden.
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Beispiel 19: Mikroteilchen-Enzym-Immunoassay
(MEIA)
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Die
BS106-Antigene werden in Patiententestproben über die Durchführung eines
standardmäßigen kompetitiven
Antigen-EIA oder Antikörper-Sandwich-EIA
und unter Verwendung einer festen Phase, wie z. B. Mikroteilchen
(MEIA), durchgeführt.
Der Assay kann auf einem automatisierten Analysator, wie z. B. der
IMx® Analysator
(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), durchgeführt werden.
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A. Antikörper-Sandwich-EIA.
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Kurz
gefasst werden Proben, von denen vermutet wird, dass sie BS106-Antigen
enthalten, in Gegenwart von mit anti-BS106-Antikörper beschichteten Mikroteilchen
(die wie in Beispiel 17 beschrieben hergestellt wurden) inkubiert,
damit Antigen/Antikörper-Komplexe
gebildet werden. Die Mikroteilchen werden danach gewaschen und ein
Indikatorreagenz, das einen Antikörper umfasst, der mit einer
Signal-erzeugenden Verbindung (d. h. Enzymen, wie z. B. alkalische
Phosphatase oder Meerretich-Peroxidase) konjugiert ist, wird den Antigen/Antikörper-Komplexen
oder den Mikroteilchen zugegeben und inkubiert. Die Mikroteilchen
werden gewaschen und die gebundenen Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexe werden über die
Zugabe eines Substrates (z. B. 4-Methylumbelliferylphosphat
(MUP) bzw. OPD/Peroxid) detektiert, das mit der Signal-erzeugenden
Verbindung reagiert, um ein messbares Signal zu erzeugen. Ein erhöhtes Signal
in der Testprobe, das mit dem von einer negativen Kontrolle erzeugten
Signal verglichen wird, detektiert das Vorhandensein von BS106-Antigen. Das Vorhandensein
von BS106-Antigen in der Testprobe ist ein Anzeichen für eine Diagnose einer
Brusterkrankung oder eines Zustandes, wie z. B. Brustkrebs.
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B. Kompetitiver Bindungsassay.
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Der
kompetitive Bindungsassay verwendet ein Peptid oder ein Protein,
das ein messbares Signal erzeugt, wenn das markierte Peptid mit
einem anti-Peptid-Antikörper-überzogenen
Mikroteilchen in Kontakt gebracht wird. Dieser Assay kann auf dem
IMx® Analysator
(erhältlich
von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) durchgeführt werden.
Das markierte Peptid wird den mit BS106-Antikörper beschichteten Mikroteilchen
(wie in Beispiel 17 beschrieben hergestellt) in Gegenwart einer
Testprobe zugegeben, von der vermutet wird, dass sie das BS106-Antigen
enthält,
und für
eine Zeitdauer und unter Bedingungen inkubiert, die für die Bildung
von markierten BS106-Peptid
(oder markierten Protein)/gebundene Antikörper-Komplexen und/oder Patienten-BS106-Antigen/gebundene
Antikörper-Komplexe
ausreichend sind. Das BS106-Antigen in der Testprobe konkurriert
mit dem markierten BS106-Peptid (oder BS106-Protein) um Bindungsstellen
auf dem Mikroteilchen. Das BS106-Antigen in der Testprobe führt zu einer
verringerten Bindung von markierten Peptid und Antikörper-beschichteten
Mikroteilchen in dem Assay, da das Antigen in der Testprobe und
das BS106-Peptid oder das BS106-Protein um Antikörperbindungsstellen konkurrieren.
Ein verringertes Signal (im Vergleich zu einer Kontrolle) zeigt
das Vorhandensein von BS106-Antigen in der Testprobe an. Das Vorhandensein
von BS106-Antigen legt die Diagnose einer Brusterkrankung oder eines
Zustandes, wie z. B. Brustkrebs, nahe.
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Die
BS106-Polynukleotide und die dadurch kodierten Proteine, die hierin
vorstehend bereitgestellt und diskutiert wurden, sind als Marker
für eine
Brustgewebe-Erkrankung, insbesondere Brustkrebs, nützlich.
Untersuchungen, die auf dem Erscheinen dieses Markers in einer Testprobe,
wie z. B. Blut, Plasma oder Serum, basieren, können eine kostengünstige,
nicht invasive, diagnostische Information bereitstellen, um den
Arzt bei der Erstellung einer Diagnose von Krebs zu unterstützen, bei
der Auswahl eines Therapieprotokolls zu helfen oder den Erfolg einer
gewählten
Therapie zu verfolgen. Dieser Marker kann in ohne weiteres zugänglichen Körperflüssigkeiten,
wie z. B. Blut, Urin oder Stuhl, als von dem erkrankten Gewebe abgeleitete
Antigene erscheinen, die über
immunologische Verfahren detektierbar sind. Dieser Marker kann bei
einem Erkrankungszustand erhöht
sein, bei einem Erkrankungszustand verändert sein oder ein normales
Protein der Brust darstellen, das in einem unangemessenen Körperkompartiment
erscheint.
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