DE69737788T2

DE69737788T2 - Reagenzien und methoden zum nachweis von erkrankungen der brust

Info

Publication number: DE69737788T2
Application number: DE69737788T
Authority: DE
Inventors: Patricia A. Gurnee BILLING-MEDEL; Maurice Highland Park COHEN; Tracey L. Round Lake COLPITTS; Paula N. Deerfield FRIEDMAN; Julian Lake Bluff Gordon; Edward N. Vernon Hills GRANADOS; Steven C. Buffalo Grove HODGES; Michael R. Libertyville KLASS; Jon D. Kenosha KRATOCHVIL; Lisa Gurnee ROBERTS-RAPP; John C. Kenosha RUSSELL; Steven D. Libertyville STROUPE
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2017-11-01
Also published as: DE69737788D1; EP0939824A1; WO1998018945A1; ATE364089T1; EP0939824B1; JP2010075188A; CA2269634C; CA2269634A1; JP2001503980A; JP4614472B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen die Detektion von Erkrankungen der Brust und sie betrifft insbesondere Reagenzien, wie z. B. Polynukleotidsequenzen, und die dadurch kodierten Polypeptidsequenzen, sowie Verfahren, die diese Sequenzen verwenden, die zum Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder zum Bestimmen einer Prädisposition gegenüber Erkrankungen oder Zuständen der Brust, wie z. B. Brustkrebs, nützlich sind.
Brustkrebs ist die bekannteste Form von Krebs, die bei Frauen in den Vereinigten Staaten auftritt. Die Inzidenz von Brustkrebserkrankungen in den Vereinigten Staaten wird auf 180.200 diagnostizierte Fälle und auf 43.900 eintretende Todesfälle, die mit Brustkrebs in Verbindung stehen, während des Jahres 1997 hochgerechnet (Statistik der American Cancer Society). Die Inzidenz von Brustkrebs stieg weltweit von 700.000 in dem Jahr 1985 auf etwa 900.000 in dem Jahr 1990 an. G. N. Hortobagyi et al., CA Cancer. J. Clin. 45: 199-226 (1995).
Verfahren, die zum Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder zum Bestimmen einer Prädisposition gegenüber Erkrankungen oder Zuständen der Brust, wie z. B. Brustkrebs, verwendet werden, sind von entscheidender Bedeutung für das Ergebnis des Patienten. Zum Beispiel haben Patienten, bei denen ein früher Brustkrebs diagnostiziert wurde, eine relative Fünf-Jahres-Überlebensrate von mehr als 90 im Vergleich zu einer Überlebensrate von etwa 20 für Patienten, bei denen distanziert metastasierte Brustkrebserkrankungen diagnostiziert wurden. (Statistik der American Cancer Society). Gegenwärtig sind die besten Erstindikatoren von frühem Brustkrebs eine physische Untersuchung der Brust und die Mammographie. J. R. Harris et al., in: Cancer: Principles and Practice of Oncology, Vierte Ausgabe, S. 1264-1332, Philadelphia, PA: J/B. Lippincott Co. (1993). Die Mammographie kann einen Brusttumor detektieren, bevor er über eine physische Untersuchung detektiert werden kann, aber sie hat ihre Grenzen. Zum Beispiel hängt der Prognosewert der Mammographie von dem Fachkönnen des Ermittlers und der Qualität des Mammogramms ab. Außerdem sind 80 bis 93 von verdächtigen Mammogrammen fälschlich positive Mammogramme und 10 bis 15 von Frauen mit Brustkrebs weisen fälschlich negative Mammogramme auf. C. J. Wright et al., Lancet 346: 29-32 (1995). Neue diagnostische Verfahren, die empfindlicher und spezifischer für die Detektion von frühem Brustkrebs sind, werden eindeutig benötigt.
Brustkrebspatienten werden nach einer Ersttherapie und während einer adjuvanten Therapie genau beobachtet, um das Ansprechen auf die Therapie zu bestimmen und eine anhaltende oder rückläufige Erkrankung oder eine frühe distante Metastase zu detektieren. Gegenwärtige diagnostische Verfahren für die Beobachtung von Brustkrebs schließen die Mammographie, Skelettszintigraphie, Bruströntgenaufnahmen, Leberfunktionstests und Tests für Serummarker ein. Die Serumtumormarker, die am gebräuchlichsten für die Beobachtung von Patienten verwendet werden, sind das karzinoembryonische Antigen (CEA) und CA 15-3. Die Einschränkungen des CEA schließen das Fehlen von erhöhten Serumspiegeln in etwa 40 von Frauen mit einer metastatischen Erkrankung ein. Zusätzlich kann eine CEA-Erhöhung während der adjuvanten Therapie nicht mit einem erneuten Auftreten aber mit anderen Faktoren in Verbindung gebracht werden, die klinisch nicht von Bedeutung sind. Das CA 15-3 kann ebenfalls in einer signifikanten Anzahl von Patienten mit progressiver Erkrankung negativ sein und deshalb versagt es bei der Vorhersage einer Metastase. Sowohl das CEA als auch CA 15-3 können in nicht malignen, gutartigen Zuständen erhöht sein, die fälschlich positive Ergebnisse zur Folge haben. Deshalb wäre es klinisch von Vorteil, einen mit der Brust assoziierten Marker zu finden, der bei der Detektion eines erneuten Auftretens von Krebs empfindlicher und spezifischer ist. J. R. Harris, et al., vorstehend M. K. Schwartz, in: Cancer: Principles and Practice of Oncology, Bd. 1, Vierte Ausgabe, S. 531-542, Philadelphia, PA: J/B. Lippincott Co. 1993.
Ein weiterer wichtiger Schritt im Umgang mit Brustkrebs besteht darin, das Stadium der Erkrankung des Patienten zu bestimmen, da es einen potenziellen prognostischen Wert besitzt und Kriterien zur Gestaltung einer optimale Therapie liefert. Gegenwärtig ist die pathologische Einstufung von Brustkrebs gegenüber der klinischen Einstufung vorzuziehen, da das Erstere zu einer genaueren Prognose führt. J. R. Harris, et al., vorstehend. Andererseits wäre die klinische Einstufung bevorzugt, wenn sie mindestens so genau wie die pathologische Einstufung wäre, da sie nicht von einem invasiven Verfahren abhängig ist, um Gewebe für die pathologische Untersuchung zu beschaffen. Die Einstufung von Brustkrebs könnte durch die Detektion von neuen Markern im Serum oder Urin verbessert werden, die zwischen unterschiedlichen Stadien der Invasion differenzieren könnten. Solche Marker könnten mRNA- oder Proteinmarker sein, die von Zellen exprimiert werden, die aus dem Primärtumor in der Brust abstammen aber im Blut, Knochenmark oder den Lymphknoten bleiben, und könnten als empfindliche Indikatoren für eine Metastase zu diesen distalen Organen dienen. Zum Beispiel sind spezifische Proteinantigene und die mRNA, die mit Brustepithel-Zellen assoziiert sind, über immunohistochemische Verfahren bzw. RT-PCR in Knochenmark, Lymphknoten und Blut von Brustkrebspatienten detektiert worden, die eine Metastase nahe legen. K. Pantel, et al., Onkologie 18: 394-401 (1995).
Solche Verfahren könnten ferner Assays einschließen, die auf dem Vorkommen von verschiedenen Erkrankungsmarkern in Testproben, wie z. B. Blut, Plasma, Serum oder Urin basieren, die über minimal invasive Verfahren erhalten wurden, die über immunologische Verfahren detektiert werden können. Diese Verfahren würden Information bereitstellen, um dem Arzt im Umgang mit dem brusterkrankten Patienten bei niedrigen Kosten für den Patienten zu helfen. Marker., wie z. B. das Prostata-spezifische Antigen (PSA) und das menschliche Choriongonadotropin (hCG) existieren und werden klinisch zum Screening von Patienten auf Prostatakrebs bzw. Hodenkrebs verwendet. Zum Beispiel wird das PSA normalerweise von der Prostata mit hohen Spiegeln in die Samenflüssigkeit sezerniert, ist aber bei sehr niedrigen Spiegeln im Blut von Männern mit normalen Prostatas vorhanden. Erhöhte Spiegel des PSA-Proteins im Serum werden für die frühe Detektion von Prostatakrebs oder -erkrankung bei asymptomatischen Männern verwendet. Siehe zum Beispiel G. E. Ranks, et al., in: Cancer: Principles and Practice of Oncology, Bd. 1, Vierte Ausgabe, S. 1073-1113, Philadelphia, PA: J. B. Lippincott Co. 1993. M. K. Schwartz, et al., in: Cancer: Principles and Practice of Oncology, Bd. 1, Vierte Ausgabe, S. 531-542, Philadelphia, PA: J. B. Lippincott Co. 1993. Ebenso könnte der Umgang mit Brusterkrankungen durch die Verwendung von neuen Markern verbessert werden, die normalerweise in der Brust exprimiert aber in erhöhten Mengen in einem unpassenden Körperkompartiment als Folge der Brusterkrankung gefunden werden.
Ferner wären neue Marker, die das biologische Verhalten von frühen Brustkrebserkrankungen vorhersagen könnten, ebenfalls von signifikantem Wert. Frühe Brustkrebserkrankungen, die das Leben der Patienten bedrohen oder bedrohen werden, sind klinisch bedeutsamer als diejenigen, die nicht bedrohen oder keine Bedrohung darstellen werden. G. E. Ranks, vorstehend. Solche Marker sind erforderlich, um vorherzusagen, welche Patienten mit histologisch negativen Lymphknoten ein erneutes Auftreten von Krebs durchmachen werden, und um ebenfalls vorherzusagen, welche Fälle eines duktalen Karzinoms in situ sich zu einem invasiven Brustkarzinom entwickeln. Genauere prognostische Marker würden es dem Kliniker gestatten, frühe in der Brust befindliche Krebserkrankungen genau zu identifizieren, die ohne eine aggressive Behandlung fortschreiten und metastasieren. Zusätzlich könnte das Fehlen eines Markers für einen aggressiven Krebs in dem Patienten eine kostspielige und nachteilige Behandlung für den Patienten ersparen. J. R. Harris, et al., vorstehend. E. R. Frykberg, et al., Cancer 74: 350-361 (1994).
Deshalb wäre es vorteilhaft, spezifische Verfahren und Reagenzien bereitzustellen, die zum Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder zum Bestimmen einer Prädisposition gegenüber Erkrankungen oder Zuständen der Brust nützlich sind. Solche Verfahren würden das Durchführen von Assays bei einer Testprobe auf Produkte eines Gens einschließen, die bei mit der Brust assoziierten Erkrankungen und Zuständen, einschließlich Krebs, überexprimiert werden. Solche Verfahren können ferner das Durchführen von Assays bei einer Testprobe auf Produkte eines Gens einschließen, die durch die mit der Brust assoziierte Erkrankung oder den Zustand, einschließlich Krebs, verändert worden sind. Solche Verfahren können ferner das Durchführen von Assays bei einer Testprobe auf Produkte eines Gens einschließen, deren Verteilung unter den unterschiedlichen Geweben und Kompartimenten des Körpers durch eine mit der Brust assoziierte Erkrankung oder einen Zustand, einschließlich Krebs, verändert worden ist. Solche Verfahren würden das Erzeugen von cDNA aus mRNA in der Testprobe, das Amplifizieren, je nach Erfordernis, von Teilen der cDNA, die dem Gen oder einem Fragment davon entspricht, und das Detektieren des cDNA-Produkts als ein Anzeichen für das Vorhandensein der Erkrankung oder des Zustands, einschließlich Krebs, oder das Detektieren von Translationsprodukten der mRNAs, die Gensequenzen umfassen, als ein Anzeichen für das Vorhandensein der Erkrankung umfassen. Nützliche Reagenzien schließen Polynukleotide oder Fragmente davon ein, die in diagnostischen Verfahren verwendet werden können, wie z. B. reverse Transcriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), PCR oder Hybridisierungsassays von mRNA, die aus Biopsiegewebe, Blut oder anderen Testproben extrahiert wurde; oder Proteine, die die Translationsprodukte solcher mRNAs darstellen; oder Antikörper, die gegen diese Proteine gerichtet sind. Solche Assays würden Verfahren für das Durchführen von Assays bei einer Probe auf Produkte des Gens und das Detektieren der Produkte als ein Anzeichen für die Erkrankung der Brust einschließen. Eine Arzneimittelbehandlung oder Gentherapie für Erkrankungen und Zustände der Brust, einschließlich Krebs, können auf diesen identifizierten Gensequenzen oder ihren exprimierten Proteinen basieren und die Wirksamkeit einer beliebigen bestimmten Therapie kann beobachtet werden. Außerdem wäre es vorteilhaft, über verfügbare alternative, nicht-chirurgische diagnostische Verfahren zu verfügen, die in der Lage sind, eine Brusterkrankung, wie z. B. Krebs, in einem frühen Stadium zu detektieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion eines BS106-Zielpolynukleotids in einer Testprobe bereit, das das In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit mindestens einem BS106-spezifischen Polynukleotid und das Detektieren des Vorhandenseins des BS106-Zielpolynukleotids in der Testprobe umfasst. Das BS106-spezifische Polynukleotid ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen davon. Ferner kann das BS106-spezifische Polynukleotid an eine feste Phase angeheftet werden, bevor das Verfahren durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Detektion von BS106-mRNA in einer Testprobe bereit, das folgendes umfasst: Durchführen einer reversen Transkription (RT) mit mindestens einem Primer, um cDNA zu erzeugen, Amplifizieren der cDNA, die so erhalten wurde, unter Verwendung von BS106-Oligonukleotiden als Sense- und Antisenseprimer, um ein BS106-Amplikon zu erhalten, und Detektieren des Vorhandenseins des BS106-Amplikons als ein Anzeichen für das Vorhandensein von BS106-mRNA in der Testprobe, wobei die BS106-Oligonukleotide eine Sequenz haben, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen davon. Das Amplifizieren kann über die Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt werden. Ferner kann die Testprobe mit einer festen Phase zur Reaktion gebracht werden, bevor das Verfahren, bevor das Amplifizieren oder bevor das Detektieren durchgeführt wird. Diese Reaktion kann eine direkte oder eine indirekte Reaktion sein. Ferner kann der Detektionsschritt die Verwendung eines detektierbaren Markers umfassen, der in der Lage ist, ein messbares Signal zu erzeugen. Der detektierbare Marker kann an eine feste Phase angeheftet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Detektion eines BS106-Zielpolynukleotids in einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie BS106-Zielpolynukleotide enthält, bereit, das folgendes umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit mindestens einem BS106-Oligonukleotid als ein Senseprimer und mit mindestens einem BS106-Oligonukleotid als ein Antisenseprimer und Amplifizieren desselben, um ein Reaktionsprodukt erster Stufe zu erhalten; (b) In-Kontakt-Bringen des Reaktionsprodukts erster Stufe mit mindestens einem anderen BS106-Oligonukleotid, um ein Reaktionsprodukt zweiter Stufe zu erhalten, unter der Voraussetzung, dass das andere BS106-Oligonukleotid 3' zu den BS106-Oligonukleotiden angeordnet ist, die in Schritt (a) verwendet wurden, und komplementär ist zu dem Reaktionsprodukt erster Stufe; und (c) Detektieren des Reaktionsprodukts zweiter Stufe als ein Anzeichen für das Vorhandensein eines BS106-Zielpolynukleotids in der Testprobe. Die BS106-Oligonukleotide, die in dem Verfahren als Reagenzien gewählt sind, haben eine Sequenz, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen davon: Das Amplifizieren kann über die Polymerasekettenreaktion durchgeführt werden. Die Testprobe kann entweder direkt oder indirekt mit einer festen Phase zur Reaktion gebracht werden, bevor das Verfahren oder bevor das Amplifizieren oder bevor das Detektieren durchgeführt wird. Der Detektionsschritt umfasst ferner die Verwendung eines detektierbaren Markers, der in der Lage ist, ein messbares Signal zu erzeugen; ferner kann der detektierbare Marker an eine feste Phase angeheftet werden. Testkits, die zur Detektion von BS106-Zielpolynukleotiden in einer Testprobe nützlich sind, werden ebenfalls bereitgestellt, die einen Behälter umfassen, der mindestens ein BS106-spezifisches Polynukleotid enthält, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen davon. Diese Testkits umfassen ferner Behälter mit Geräten, die zur Probensammlung (wie zum Beispiel Blut, Urin, Speichel und Stuhl) nützlich sind. Solche Geräte schließen Lanzetten und Saugpapier oder Stoff zum Sammeln und Stabilisieren von Blut; Tupfer zum Sammeln und Stabilisieren von Speichel; und Becher zum Sammeln und Stabilisieren von Urin- oder Stuhlproben ein. Die Sammelmaterialien, wie z. B. Papier, Stoff, Tupfer, Becher und dergleichen können wahlweise behandelt sein, um eine Denaturierung oder irreversible Adsorption der Probe zu verhindern. Die Sammelmaterialien können auch mit Konservierungsmitteln, Stabilisatoren oder antimikrobiellen Mitteln behandelt sein oder diese enthalten, um bei der Erhaltung der Integrität der Proben zu helfen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein gereinigtes Polynukleotid oder Fragment davon bereit, das von einem BS106-Gen abgeleitet ist. Das gereinigte Polynukleotid ist in der Lage, selektiv an die Nukleinsäure des BS106-Gens oder eines Komplements davon zu hybridisieren. Das Polynukleotid ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Frag menten oder Komplementen davon. Ferner kann das gereinigte Polynukleotid durch rekombinante und/oder synthetische Techniken erzeugt werden. Das gereinigte rekombinante Polynukleotid kann in einem rekombinanten Vektor enthalten sein. Die Erfindung um fasst ferner eine Wirtszelle, die mit dem Vektor transfiziert wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein rekombinantes. Expressionssystem bereit, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die einen offenen von BS106 abgeleiteten Leserahmen einschließt. Die Nukleinsäuresequenz hat eine Sequenz, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen davon. Die Nukleinsäuresequenz ist operativ an eine Kontrollsequenz geknüpft, die mit einem gewünschten Wirt kompatibel ist. Ferner wird eine Zelle bereitgestellt, die mit diesem rekombinanten Expressionssystem transfiziert wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner durch BS106 kodierte Polypeptide bereit. Die Polypeptide können durch rekombinante Technologie, unter Voraussetzung der gereinigten Form, oder durch synthetische Techniken hergestellt werden. Die Polypeptide umfassen Aminosäure-Sequenzen, die eine Aminosäure-Sequenz haben, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten von Sequenz-Identifikationsnummer 17-20.
Ferner wird ein Antikörper bereitgestellt, der spezifisch an mindestens ein BS106-Epitop bindet. Der Antikörper kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein. Das Epitop ist von einer Aminosäure-Sequenz abgeleitet, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Se quenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon. Assaykits zur Bestimmung des Vorhandenseins eines BS106-Antigens oder BS106-Antikörpers in einer Testprobe sind ebenfalls eingeschlossen. In einer Ausführungsform umfassen die Assaykits einen Behälter, der mindestens ein BS106-Polypeptid enthält, das eine Aminosäure-Sequenz hat, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon. Ferner kann der Testkit einen Behälter mit Geräten umfassen, die zur Probensammlung (wie z. B. Blut, Urin, Speichel und Stuhl) nützlich sind. Solche Geräte schließen Lanzetten und Saugpapier oder Stoff zum Sammeln und Stabilisieren von Blut; Tupfer zum Sammeln und Stabilisieren von Speichel; und Becher zum Sammeln und Stabilisieren von Urin- oder Stuhlproben ein. Die Sammelmaterialien, wie z. B. Papier, Stoff, Tupfer, Becher und dergleichen können wahlweise behandelt sein, um eine Denaturierung oder irreversible Adsorption der Probe zu verhindern. Diese Sammelmaterialien können auch mit Konservierungsmitteln, Stabilisatoren oder antimikrobiellen Mitteln behandelt sein oder diese enthalten, um bei der Erhaltung der Integrität der Proben zu helfen. Das Polypeptid kann ferner an eine feste Phase angeheftet sein.
Ein weiteres Testkit zur Bestimmung des Vorhandenseins von BS106-Antigen oder BS106-Antikörper in einer Testprobe umfasst einen Behälter, der einen Antikörper enthält, der spezifisch an ein BS106-Antigen bindet, wobei das BS106-Antigen mindestens ein BS106-kodiertes Epitop umfasst. Das BS106-Antigen hat eine Sequenz, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon. Diese Testkits können ferner Behälter mit Geräten umfassen, die zur Probensammlung (wie z. B. Blut, Urin, Speichel und Stuhl) nützlich sind. Solche Geräte schließen Lanzetten und Saugpapier oder Stoff zum Sammeln und Stabilisieren von Blut; Tupfer zum Sammeln und Stabilisieren von Speichel; Becher zum Sammeln und Stabilisieren von Urin- oder Stuhlproben ein. Die Sammelmaterialien Papier, Stoff, Tupfer, Becher und dergleichen können wahlweise behandelt sein, um eine Denaturierung oder irreversible Adsorption der Probe zu verhindern. Diese Sammelmaterialien können auch mit Konservierungsmitteln, Stabilisatoren oder antimikrobiellen Mitteln behandelt sein oder diese enthalten, um bei der Erhaltung der Integrität der Proben zu helfen. Der Antikörper kann ferner an eine feste Phase angeheftet sein.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das mindestens ein Epitop von BS106 enthält, wird bereitgestellt, wobei das Verfahren das Inkubieren von Wirtszellen umfasst, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden. Dieser Vektor umfasst eine Polynukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, worin das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz umfasst, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon.
Ein Verfahren zur Detektion eines BS106-Antigens in einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie das BS106-Antigen enthält, wird ebenfalls bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einem Antikörper oder einem Fragment davon, der spezifisch an mindestens ein Epitop eines BS106-Antigens bindet, und zwar für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die für die Bildung von Antikörper/Antigen-Komplexen ausreichend sind; und Detektieren des Vorhandenseins solcher Komplexe, die den Antikörper als ein Anzeichen für das Vorhandensein des BS106-Antigens in der Testprobe enthalten. Der Antikörper kann an eine feste Phase angeheftet werden und entweder ein monoklonaler oder ein polyklonaler Antikörper sein. Außerdem bindet der Antikörper spezifisch an mindestens ein BS106-Antigen, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon.
Ein weiteres Verfahren wird bereitgestellt, das Antikörper detektiert, die spezifisch an ein BS106-Antigen in einer Testprobe binden, von der vermutet wird, dass sie diese Antikörper enthält. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einem Polypeptid, das mindestens ein BS106-Epitop enthält, worin das BS106-Epitop eine Aminosäure-Sequenz umfasst, die mindestens 50 Identität mit einer Aminosäure-Sequenz aufweist, die von einem BS106-Polynukleotid oder einem Fragment davon kodiert wird. Das In-Kontakt-Bringen wird für einen Zeitraum und unter Bedingungen durchgeführt, die für die Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen ausreichend sind. Das Verfahren umfasst ferner das Detektieren von Komplexen, die das Polypeptid enthalten. Das Polypeptid kann an eine feste Phase angeheftet werden. Ferner kann das Polypeptid ein rekombinantes Protein oder ein synthetisches Peptid sein, das eine Aminosäure-Sequenz hat, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zelle bereit, die mit einer BS106-Nukleinsäuresequenz transfiziert wurde, die mindestens ein Epitop eines BS106-Antigens oder ein Fragment davon kodiert. Die Nukleinsäuresequenz ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz--Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und, Fragmenten oder Komplementen davon.
Ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern auf BS106-Antigen wird ferner bereitgestellt, wobei das Verfahren das Verabreichen eines isolierten immunogenen Polypeptids oder Fragments davon an ein Individuum umfasst, worin das isolierte immunogene Polypeptid mindestens ein BS106-Epitop in einer Menge umfasst, die für die Erzeugung einer Immunantwort ausreichend ist. Das isolierte immunogene Polypeptid umfasst eine Aminosäure-Sequenz, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon.
Ferner wird eine Zusammensetzung aus einem Material bereitgestellt, das ein BS106-Polynukleotid aus mindestens etwa 10-12 Nukleotiden umfasst, die ein Polynukleotid haben, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen davon. Das BS106-Polynukleotid kodiert eine Aminosäure-Sequenz, die mindestens ein BS106-Epitop aufweist. Eine weitere Zusammensetzung aus einem Material wird von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, das ein Polypeptid mit mindestens einem BS106-Epitop aus etwa 8-10 Aminosäuren umfasst. Das Polypeptid umfasst eine Aminosäure-Sequenz, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten von Sequenz-Identifikationsnummer 17-20. Ferner wird ein Gen oder ein Fragment davon bereitgestellt, das für ein BS106-Polypeptid kodiert, das die Sequenz-Identifikationsnummer 16 hat; und ein Gen oder ein Fragment davon, das DNA umfasst, die die Sequenz-Identifikationsnummer 4 oder Sequenz-Identifikationsnummer 5 umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Nukleotid-Alignment der Klone 1662885 (Sequenz-Identifikationsnummer 1), 893988 (Sequenz-Identifikationsnummer 2), 1209814 (Sequenz-Identifikationsnummer 3) und die davon abgeleitete Konsensussequenz (Sequenz-Identifikationsnummer 4). Ein G/T-Polymorphismus an der Position 54 der Konsensussequenz ist mit "K" bezeichnet, und ein C/T-Polymorphismus an der Position 312 der Konsensussequenz ist mit "Y" bezeichnet.
2 zeigt die Contig-Karte, die die Bildung der Konsensus-Nukleotidsequenz (Sequenz-Identifikationsnummer 4) aus dem Nukleotid-Alignment der überlappenden Klone 1662885 (Sequenz-Identifikationsnummer 1), 893988 (Sequenz-Identifikationsnummer 2) und 1209814 (Sequenz-Identifikationsnummer 3) darstellt.
3A ist eine Aufnahme eines Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegels von RNA aus verschiedenen Geweben und der entsprechende Northern Blot von RNA unter Verwendung einer BS106-radiomarkierten Sonde; 3B ist eine Aufnahme eines weiteren Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegels von RNA aus normalem Brustgewebe und Brustkrebsgewebe und der entsprechende Northern Blot von RNA unter Verwendung einer BS106-radiomarkierten Sonde.
4A und 4B sind Aufnahmen von gefärbten Agarosegelen der mit BS106-spezifisch geprimeten PCR-Amplifizierungsprodukte.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Gen oder ein Fragment davon bereit, das für ein BS106-Polypeptid kodiert, das die Sequenz-Identifikationsnummer 16 hat. Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein BS106-Gen oder ein Fragment davon, das die DNA umfasst, die die Sequenz-Identifikationsnummer 4 oder die Sequenz-Identifikationsnummer 5 hat.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für das Durchführen von Assays bei einer Testprobe auf Produkte eines Brustgewebegens bereit, das als BS106 bezeichnet wird, wobei das Verfahren die Herstellung von cDNA aus mRNA in der Testprobe und die Detektion der cDNA als ein Anzeichen für das Vorhandensein des Brustgewebegens BS106 umfasst. Das Verfahren kann einen Amplifizierungsschritt einschließen, wobei ein oder mehrere Teile der mRNA aus dem BS106, die dem Gen oder Fragmenten davon entsprechen, amplifiziert werden. Verfahren werden ferner für das Durchführen von Assays für die Translationsprodukte von BS106 bereitgestellt. Die Testproben, bei denen durch die hierin bereitgestellten Verfahren Assays durchgeführt werden können, schließen Gewebe, Zellen, Körperflüssigkeiten und -sekrete ein. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Reagenzien bereit, wie z. B. Oligonukleotidprimer und Polypeptide, die bei der Durchführung dieser Verfahren nützlich sind.
Teile der hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen sind als Primer für die reverse Transkription von RNA oder für die Amplifizierung von cDNA; oder als Sonden nützlich, um das Vorhandensein von bestimmten mRNA-Sequenzen in Testproben zu bestimmen. Ferner werden Nukleinsäuresequenzen offenbart, die die Herstellung von kodierten Polypeptidsequenzen gestatten, die als Standards oder Reagenzien in diagnostischen Immunoassays, als Ziele für pharmazeutische Screeningassays und/oder als Komponenten oder als Zielstellen für verschiedene Therapien nützlich sind. Monoklonale und polyklonale Antikörper, die gegen mindestens ein in diesen Polypeptidsequenzen enthaltenes Epitop gerichtet sind, sind als Abgabemittel für therapeutische Mittel als auch für diagnostische Tests und für das Screening auf Erkrankungen oder Zuständen nützlich, die mit BS106, insbesondere Brustkrebs, assoziiert sind. Die Isolierung von Sequenzen aus anderen Teilen des Gens von Interesse kann unter Einsatz von Sonden oder PCR-Primern, die von diesen Nukleinsäuresequenzen abgeleitet sind, bewerkstelligt werden. Das gestattet, dass zusätzliche Sonden der mRNA oder cDNA von Interesse sowie entsprechende kodierte Polypeptidsequenzen etabliert werden. Diese zusätzlichen Moleküle sind bei dem Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder dem Bestimmen der Prädisposition gegenüber Erkrankungen und Zuständen der Brust, wie z. B. Brustkrebs, der wie hierin offenbart durch BS106 gekennzeichnet ist, nützlich.
Verfahren für die Bestimmung der "Similarität" einer Aminosäure-Sequenz sind in dem Fachgebiet wohl bekannt. Im Allgemeinen bedeutet "Similarität" den exakten Vergleich von Aminosäure zu Aminosäure von zwei oder mehreren Polypeptiden an der entsprechenden Stelle, an der Aminosäuren identisch sind oder ähnliche chemische und/oder physikalische Eigenschaften besitzen, wie z. B. Ladung oder Hydrophobizität. Eine so genannte "prozentuale Similarität" kann danach zwischen den verglichenen Polypeptidsequenzen bestimmt werden. Verfahren zur Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- und Aminosäure-Sequenz sind in dem Fachgebiet ebenfalls wohl bekannt und schließen die Bestimmung der Nukleotidsequenz der mRNA für dieses Gen (gewöhnlich über ein cDNA-Zwischenprodukt) und die Bestimmung der dadurch kodierten Aminosäure-Sequenz und den Vergleich von dieser mit einer zweiten Aminosäure-Sequenz ein. Im Allgemeinen bezieht sich die "Identität" auf eine exakte Entsprechung von Nukleotid zu Nukleotid oder Aminosäure zu Aminosäure von zwei Polynukleotid- bzw. Polypeptidsequenzen. Zwei oder mehrere Polynukleotidsequenzen können über die Bestimmung ihrer "prozentualen Identität" verglichen werden. Zwei oder mehrere Aminosäure-Sequenzen können ebenfalls über die Bestimmung ihrer "prozentualen Identität" verglichen werden. Die in dem Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (erhältlich von Genetics Computer Group, Madison, WI) verfügbaren Programme, zum Beispiel das GAP-Programm, sind in der Lage, sowohl die Identität zwischen zwei Polynukleotiden als auch die Identität bzw. Similarität zwischen zwei Polypeptidsequenzen zu berechnen. Andere Programme für die Berechnung der Identität oder Similarität zwischen Sequenzen sind in dem Fachgebiet bekannt.
Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren ermöglichen die Identifizierung von bestimmten Markern als ein Anzeichen für eine Brustgewebeerkrankung oder einen Zustand; die daraus erhaltene Information hilft bei dem Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder dem Bestimmen von Erkrankungen oder Zuständen, die mit BS106, insbesondere Brustkrebs, assoziiert sind. Die Testverfahren schließen zum Beispiel Sondenassays ein, die die hierin bereitgestellte(n) Sequenz(en) verwenden und die ferner Nukleinsäure-Amplifizierungsverfahren verwenden können, wie zum Beispiel die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion (LCR) und die Hybridisierung. Außerdem enthalten die hierin bereitgestellten Nukleotidsequenzen offene Leserahmen, aus denen ein immunogenes Epitop gefunden werden kann. Es wird geglaubt, dass dieses Epitop auf das mit dem BS106 assoziierte Erkrankungsstadium oder den Zustand eingeschränkt ist. Es wird ferner geglaubt, dass die Polynukleotide oder Polypeptide und Proteine, die durch das BS106-Gen kodiert werden, als ein Marker nützlich sind. Dieser Marker ist entweder bei einer Erkrankung, wie z. B. Brustkrebs, erhöht, bei einer Erkrankung, wie z. B. Brustkrebs, verändert, oder als ein normales Protein vorhanden, das aber in einem unangebrachten Körperkompartiment erscheint. Die Einzigartigkeit dieses Epitops kann über (i) dessen immunologische Reaktivität und Spezifität mit Antikörpern, die gegen Proteine und Polypeptide gerichtet sind, die von dem BS106-Gen kodiert werden, und (ii) über dessen Nicht-Reaktivität mit sämtlichen anderen Gewebe Markern bestimmt werden. Die Verfahren zur Bestimmung der immunologischen Reaktivität sind wohl bekannt und schließen zum Beispiel Radioimmunoassay (RIA), Enzymverknüpftes Immunosorbensassay (ELISA), Hämagglutination (HA), Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay (FPIA), Chemilumineszenzimmunoassay (CLIA) und weitere ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Mehrere Beispiele für geeignete Methoden sind hierin beschrieben.
Solange nicht anders angegeben ist, sollen die folgenden Ausdrücke die folgenden Bedeutungen haben:
Ein Polynukleotid, das "abgeleitet von" oder "spezifisch für" eine bestimmte Sequenz ist, bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, die eine zusammenhängende Sequenz von ungefähr mindestens etwa 6 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens etwa 8 Nukleotiden, stärker bevorzugt mindestens etwa 10-12. Nukleotiden und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 15-20 Nukleotiden umfasst, die entsprechen, d. h. mit einer Region der bestimmten Nukleotidsequenz identisch oder dazu komplementär sind. Die Sequenz kann zu einer Sequenz, die auf eine bestimmte Polynukleotidsequenz eingeschränkt ist, komplementär oder damit identisch sein, wie über in dem Fachgebiet bekannte Verfahren bestimmt wurde. Vergleiche mit Sequenzen in Datenbanken können zum Beispiel als ein Verfahren zur Bestimmung der Einzigartigkeit einer bestimmten Sequenz verwendet werden. Die Regionen, von denen Sequenzen abgeleitet sein können, schließen Regionen ein, die spezifische Epitope als auch nicht translatierte und/oder nicht transkribierte Regionen kodieren, sind aber nicht darauf eingeschränkt sind.
Das abgeleitete Polynukleotid wird nicht notwendigerweise physikalisch von der in Untersuchung befindlichen Nukleotidsequenz von Interesse abgeleitet, sondern kann auf eine beliebige Art und Weise erzeugt werden, die die chemische Synthese, Replikation, reverse Transkription oder Transkription, die auf der Information basiert, die durch die Rasensequenz in der/den Region(en) geliefert wird, aus denen das Polynukleotid abgeleitet ist, einschließt, aber nicht darauf eingeschränkt ist. Als solches kann es entweder eine Sense- oder Antisenseausrichtung des ursprünglichen Polynukleotids darstellen. Zusätzlich können Kombinationen von Regionen, die derjenigen der bestimmten Sequenz entsprechen, auf einer in dem Fachgebiet bekannten Art und Weise modifiziert werden, um mit der beabsichtigten Verwendung im Einklang zu sein.
Ein "Fragment" eines spezifizierten Polynukleotids bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, die eine zusammenhängende Sequenz von ungefähr mindestens etwa 6 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens etwa 8 Nukleotiden, stärker bevorzugt mindestens etwa 10-12 Nukleotiden und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 15- 20 Nukleotiden umfasst, die einer Region der spezifizierten Nukleotidsequenz entsprechen, d. h. damit identisch oder dazu komplementär sind.
Der Ausdruck "Primer" bezeichnet eine spezifische Oligonukleotidsequenz, die zu einer Zielnukleotidsequenz komplementär ist und zur Hybridisierung der Zielnukleotidsequenz verwendet wird. Ein Primer dient als ein Initiierungspunkt für die Nukleotidpolymerisation, die entweder durch die DNA-Polymerase, RNA-Polymerase oder reverse Transkriptase katalysiert wird.
Der Ausdruck "Sonde" bezeichnet ein definiertes Nukleinsäuresegment (oder Nukleotid-analoges Segment, z. B. PNA wie hiernach definiert wird), das verwendet werden kann, um ein in den Proben vorhandenes spezifisches Polynukleotid zu identifizieren, das die komplementäre Sequenz trägt.
"Kodiert von" bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, wobei die Polypeptidsequenz oder ein Teil davon eine Aminosäure-Sequenz von mindestens 3 bis 5 Aminosäuren, stärker bevorzugt mindestens 8 bis 10 Aminosäuren und noch stärker bevorzugt mindestens 15 bis 20 Aminosäuren aus einem Polypeptid enthält, das von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird. Ferner sind Polypeptidsequenzen umfasst, die mit einem von der Sequenz kodierten Polypeptid immunologisch identifizierbar sind.
Diese Aminosäure-Sequenz kann aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon gewählt werden.
Ein "rekombinantes Polypeptid", "rekombinantes Protein" oder "ein über rekombinante Verfahren hergestelltes Polypeptid", wobei die Ausdrücke hierin austauschbar verwendet werden können, beschreibt ein Polypeptid, das auf Grund seines Ursprungs oder seiner Manipulation nicht mit dem gesamten oder einem Teil des Polypeptids assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist, und/oder mit einem Polypeptid verknüpft ist, das ein anderes ist als mit dem es in der Natur verknüpft ist. Ein rekombinantes oder kodiertes Polypeptid oder Protein wird aus einer vorgesehenen Nukleinsäuresequenz nicht notwendigerweise translatiert. Es kann ebenfalls auf eine beliebige Art und Weise erzeugt werden, die die chemische Synthese oder Expression aus einem rekombinanten Expressionssystem einschließt.
Der Ausdruck "synthetisches Peptid", wie hierin verwendet ist, bedeutet eine polymere Form von Aminosäuren einer beliebigen Länge, die chemisch über Verfahren synthetisiert werden können, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Diese synthetischen Peptide sind bei verschiedenen Anwendungen nützlich.
Der Ausdruck "Polynukleotid", wie hierin verwendet ist, bedeutet eine polymere Form von Nukleotiden einer beliebigen Länge, entweder Ribonukleotide oder Deoxyribonukleotide. Dieser Ausdruck bezieht sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit schließt dieser Ausdruck doppel- und einzelsträngige DNA als auch doppel- und einzelsträngige RNA ein. Er schließt auch Modifikationen ein, wie z. B. Methylierung oder Kappen und unmodifizierte Formen des Polynukleotids ein. Die Ausdrücke "Polynukleotid", "Oligomer", "Oligonukleotid" und "Oligo" werden hierin austauschbar verwendet.
"Eine Sequenz entsprechend einer cDNA" bedeutet, dass die Sequenz eine Polynukleotidsequenz enthält, die zu einer Sequenz in der bestimmten DNA identisch oder komplementär ist. Die Sequenz, die der identifizierten cDNA entspricht, -ist mindestens etwa 50 Nukleotide lang, vorzugsweise mindestens etwa 60 Nukleotide lang und stärker bevorzugt mindestens etwa 70 Nukleotide lang. Die Korrespondenz zwischen dem Gen oder Genfragment von Interesse. und der cDNA kann über in dem Fachgebiet bekannte Verfahren bestimmt werden und schließen zum Beispiel einen direkten Vergleich des sequenzierten Materials mit den beschriebenen cDNAs oder eine Hybridisierung und einen Verdau mit einzelsträngigen Nukleasen ein, worauf eine Größenbestimmung der verdauten Fragmente folgt.
"Gereinigtes Polynukleotid" bezieht sich auf ein Polynukleotid von Interesse oder Fragment davon, das im Wesentlichen frei ist, z. B. weniger als etwa 50 bevorzugt weniger als etwa 70 und stärker bevorzugt weniger als etwa 90 des Proteins enthält, mit dem das Polynukleotid natürlich assoziiert ist. Die Verfahren zur Reinigung der Polynukleotide von Interesse sind in dem Fachgebiet wohl bekannt und schließen zum Beispiel einen Aufschluss der das Polynukleotid enthaltenden Zellen mit einem chaotropen Mittel und die Trennung des/der Polynukleotids(e) und Proteine über Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Sedimentierung nach der Dichte ein.
"Gereinigtes Polypeptid" oder "gereinigtes Protein" bedeutet ein Polypeptid von Interesse oder Fragment davon, das im Wesentlichen, z. B. weniger als etwa 50 bevorzugt weniger als etwa 70 und stärker bevorzugt weniger als etwa 90 enthält, frei von zellulären Komponenten ist, mit denen das Polypeptid von Interesse natürlich assoziiert ist. Die Verfahren zur Reinigung der Polypeptide von Interesse sind in dem Fachgebiet bekannt.
Der Ausdruck "isoliert" bedeutet, dass das Material aus dessen ursprünglicher Umgebung entfernt wird (z. B. die natürliche Umgebung, falls es natürlich vorkommt). Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynukleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorhanden ist, nicht isoliert, aber das gleiche Polynukleotid oder DNA oder Polypeptid, das von einigen oder sämtlichen der koexistierenden Materialien in dem natürlichen System separiert ist, ist isoliert. Ein solches Polynukleotid könnte Teil eines Vektors sein und/oder ein solches Polynukleotid oder Polypeptid könnte Teil einer Zusammensetzung und dennoch isoliert sein, in dem der Vektor oder die Zusammensetzung nicht Teil seiner natürlichen Umgebung ist.
"Polypeptid" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet und zeigen an, dass mindestens eine Molekülkette von Aminosäuren über kovalente und/oder nicht kovalente Bindungen verknüpft ist. Die Ausdrücke beziehen sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts. Somit sind Peptide, Oligopeptide und Proteine in der Definition von Polypeptid eingeschlossen. Die Ausdrücke schließen post-translationale Modifikationen des Polypeptids ein, zum Beispiel Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen. Zusätzlich sind Proteinfragmente, Analoge, mutierte oder variante Proteine, Fusionsproteine und dergleichen in der Bedeutung von Polypeptid eingeschlossen.
Ein "Fragment" eines spezifizierten Polypeptids bezieht sich auf eine Aminosäure-Sequenz, die mindestens etwa 3-5 Aminosäuren, stärker bevorzugt mindestens etwa 8-10 Aminosäuren und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 15-20 Aminosäuren umfasst, die von dem spezifischen Polypeptid abgeleitet sind.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zelllinien", "Zellkulturen" und weitere solche Ausdrücke, die Mikroorganismen oder höhere eukaryotische Zelllinien bezeichnen, die als einzellige Entitäten kultiviert wurden, beziehen sich auf Zellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere transferierte DNA verwendet werden können oder worden sind, und den ursprünglichen Abkömmling der ursprünglichen Zelle einschließen, die transfiziert worden ist.
Wie hierin verwendet ist, bedeutet "Replikon" ein beliebiges genetisches Element, wie z. B. Plasmid, ein Chromosom oder ein Virus, das sich als eine autonome Einheit der Polynukleotidreplikation in einer Zelle verhält.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, in dem ein weiteres Polynukleotidsegment angeheftet ist, um die Replikation und/oder Expression des angehefteten Segments zu bewirken.
Der Ausdruck "Kontrollsequenz" bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, die notwendig ist, um die Expression einer kodierenden Sequenz zu bewirken, mit dem sie ligiert ist. Die Natur solcher Kontrollsequenzen unterscheidet sich in Abhängigkeit von dem Wirtsorganismus. In Prokaryoten schließen solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen einen Promotor, eine ribosomale Bindungsstelle und Terminatoren ein; in Eukaryoten schließen solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen Promotor, Terminatoren und, in manchen Fällen, Enhancer ein. Der Ausdruck "Kontrollsequenz" soll somit zumindest sämtliche Komponenten einschließen, deren Vorhandensein für die Expression erforderlich ist, und kann ferner zusätzliche Komponenten einschließen, deren Vorhandensein vorteilhaft ist, wie zum Beispiel Führungssequenzen.
"Operativ verknüpft" bezieht sich auf eine Situation, in der die beschriebenen Komponenten sich in einer Beziehung befinden, die es ihnen gestattet, in ihrer vorgesehenen Art und Weise zu funktionieren. Somit ist zum Beispiel eine Kontrollsequenz, die mit einer kodierenden Sequenz "operativ verknüpft" ist, auf eine solche Art und Weise ligiert, dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erzielt wird, die mit der Kontrollsequenz kompatibel sind.
Der Ausdruck "offener Leserahmen" oder "ORF" bezieht sich auf eine Region einer Polynukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert. Diese Region kann einen Teil einer kodierenden Sequenz oder eine gesamte kodierende Sequenz darstellen.
Eine "kodierende Sequenz" ist eine Polynukleotidsequenz, die zu mRNA transkribiert und zu einem Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von entsprechenden regulatorischen Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Translations-Startkodon an dem 5'-Ende und einem Translations-Stoppkodon an dem 3'-Ende bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann mRNA, cDNA und rekombinante Polynukleotidsequenzen einschließen, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
Der Ausdruck "immunologisch identifizierbar mit/als" bezieht sich auf das Vorhandensein eines Epitops (von Epitopen) und eines Polypeptids (von Polypeptiden), die in dem vorgesehenen Polypeptid (den vorgesehenen Polypeptiden) vorhanden und darauf eingeschränkt sind. Die immunologische Identität kann über Antikörperbindung und/oder kompetitive Bindung bestimmt werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt und werden ferner hierin beschrieben. Die Einzigartigkeit eines Epitops kann ferner über Computer-Recherchen in bekannten Datenbanken, wie z. B. GenBank, für die Polynukleotidsequenz, die das Epitop kodiert, und über Vergleiche der Aminosäure-Sequenz mit anderen bekannten Proteinen bestimmt werden.
Wie hierin verwendet ist, bedeutet "Epitop" eine antigene Determinante eines Polypeptids oder eines Proteins. Denkbarer Weise kann ein Epitop drei Aminosäuren in einer räumlichen Konformation umfassen, die auf das Epitop eingeschränkt ist. Im Allgemeinen besteht ein Epitop aus mindestens fünf solcher Aminosäuren und gewöhnlicher besteht es aus mindestens acht bis zehn Aminosäuren. Die Verfahren zur Untersuchung der räumlichen Konformation sind in dem Fachgebiet bekannt und schließen zum Beispiel Röntgenkristallographie und zweidimensionale magnetische Kernresonanz ein.
Ein "konformationelles Epitop" ist ein Epitop, das aus einer spezifischen Aneinanderreihung von Aminosäuren in einer immunologisch erkennbaren Struktur besteht, wobei solche Aminosäuren auf dem gleichen Polypeptid in einer zusammenhängenden oder nicht zusammenhängenden Reihenfolge vorhanden sind oder auf verschiedenen Polypeptiden vorhanden sind.
Ein Polypeptid ist mit einem Antikörper "immunologisch reaktiv", wenn es an einen Antikörper aufgrund der Antikörpererkennung eines spezifischen Epitops bindet, das in dem Polypeptid ent halten ist. Die immunologische Reaktivität kann über Antikörperbindung, insbesondere über die Kinetik der Antikörperbindung, und/oder über kompetitive Bindung. bestimmt werden, indem als Kompetitor(en) ein bekanntes Polypeptid (bekannte Polypeptide) verwendet werden, das/die ein Epitop enthält/enthalten, gegen das der Antikörper gerichtet ist. Die Verfahren zur Bestimmung, ob ein Polypeptid mit einem Antikörper immunologisch reaktiv ist, sind in dem Fachgebiet bekannt.
Wie hierin verwendet ist, bedeutet der Ausdruck "immunogenes Polypeptid enthaltend ein Epitop von Interesse" natürlich vorkommende Polypeptide von Interesse oder Fragmente davon sowie Polypeptide, die über andere Mittel zum Beispiel über chemische Synthese oder die Expression des Polypeptids in einem rekombinanten Organismus hergestellt wurden.
Der Ausdruck "Transfektion" bezieht sich auf die Einführung eines exogenen Polynukleotids in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, ungeachtet des für die Einführung verwendeten Verfahrens. Der Ausdruck "Transfektion" bezieht sich sowohl auf stabile als auch vorübergehende Einführung des Polynukleotids und umfasst die direkte Aufnahme von Polynukleotiden, Transformation, Transduktion und f-Mating. Sobald es in der Wirtszelle eingeführt ist, kann das exogene Polynukleotid als ein nicht integriertes Replikon, zum Beispiel ein Plasmid, aufrechterhalten werden oder alternativ dazu in das Wirtsgenom integriert werden.
"Behandlung" bezieht sich auf Prophylaxe und/oder Therapie.
Der Ausdruck "Individuum", wie hierin verwendet ist, bezieht sich auf Wirbeltiere, insbesondere auf Vertreter der Säugetierspezies, und schließt Haustiere, für den Sport vorgesehene Tiere, Primaten und Menschen ein, ist aber nicht darauf eingeschränkt; insbesondere bezieht sich der Ausdruck auf Menschen.
Der Ausdruck "Sense- Strang" oder "plus-Strang" (oder "+"), wie hierin verwendet ist, bezeichnet eine Nukleinsäure, die die Sequenz enthält, die das Polypeptid kodiert. Der Ausdruck "Antisense-Strang" oder "minus-Strang" (oder "–") bezeichnet eine Nukleinsäure, die eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu der des "plus"-Strangs.
Der Ausdruck "Testprobe" bezieht sich auf eine Komponente eines Körpers von einem Individuum, das die Quelle für den Analyten ist (wie z. B. Antikörper von Interesse oder Antigene von Interesse). Diese Komponenten sind in dem Fachgebiet wohl bekannt. Eine Testprobe ist typischerweise alles, von dem vermutet wird, dass es eine Zielsequenz enthält. Die Testproben können unter Verwendung von in dem Fachgebiet wohl bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z. B. über Beziehen einer Probe aus einem Individuum und, je nach Erfordernis, Aufschließen sämtlicher darin enthaltener Zellen, um die Zielnukleinsäuren freizusetzen. Diese Testproben schließen biologische Proben ein, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung, die hierin beschrieben sind, getestet werden können, und schließen menschliche und tierische Körperflüssigkeiten ein, wie z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit, Sputum, Bronchialspülung, Bronchialaspirate, Urin, Lymphflüssigkeiten und verschiedene externe Sekrete des Respirations-, Intestinal- und Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, weiße Blutkörperchen, Myelome und dergleichen; biologische Flüssigkeiten, wie z. B. Zellkulturüberstände; Gewebeproben, die fixiert werden können; und Zellproben, die fixiert werden können.
"Gereinigtes Produkt" bezieht sich auf eine Präparation des Produkts, die aus den zellulären Bestandteilen, mit denen das Produkt normalerweise assoziiert ist, und aus anderen Zellarten isoliert worden ist, die in der Probe von Interesse vorhanden sein können.
"PNA" bezeichnet ein "Peptid-Nukleinsäure-Analog", das bei einer Prozedur verwendet werden kann, wie z. B. ein hierin beschriebenes Assay, um das Vorhandensein eines Ziels zu bestimmen. "MA" bezeichnet ein "Morpholino-Analog", das in einer Prozedur verwendet werden kann, wie z. B. ein hierin beschriebenes Assay, um das Vorhandensein eines Ziels zu bestimmen. Siehe zum Beispiel das US-Patent Nr. 5,378,841 . PNAs stellen neutral geladene Gruppen dar, die gegen RNA-Ziele oder DNA gerichtet sein können. PNA-Sonden, die in Assays an Stelle von zum Beispiel den DNA-Sonden der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bieten Vorteile, die bei der Verwendung von DNA-Sonden nicht erreicht werden können. Diese Vorteile schließen Herstellbarkeit, Maskierung im Großmaßstab, Reproduzierbarkeit, Stabilität, Unempfindlichkeit gegenüber Änderungen der Innenstärke und Beständigkeit gegenüber enzymatischen Abbau ein, das bei DNA oder RNA verwendenden Verfahren vorhanden ist. Diese PNAs können mit solchen Signalerzeugenden Verbindungen, wie z. B. Fluorescein, Radionukleotiden, chemilumineszenten Verbindungen und dergleichen, markiert ("angeheftet") werden. PNAs oder andere Nukleinsäureanaloge, wie z. B. MAs, können somit bei Assayverfahren an Stelle von DNA oder RNA verwendet werden. Obwohl hierin Assays beschrieben sind, die DNA-Sonden verwenden, liegt es im Können des Fachmannes, dass PNAs oder MAs an die Stelle von RNA oder DNA gesetzt werden können, mit entsprechenden Änderungen je nach und gemäß dem Erfordernis bei Assayreagenzien.
"Analyt", wie hierin verwendet ist, ist die zu detektierende Substanz, die in der Testprobe vorhanden sein kann. Der Analyt kann eine beliebige Substanz sein, für die ein natürlich vorkommender spezifischer Bindungsvertreter (wie z. B. ein Antikörper) existiert oder für die ein spezifischer Bindungsvertreter hergestellt werden kann. Somit ist ein Analyt eine Substanz, die an einen oder mehrere spezifische Bindungsvertreter in einem Assay binden kann. "Analyt" schließt ferner beliebige antigene Substanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen davon ein. Als ein Vertreter eines spezifischen Bindungspaares kann der Analyt mit Hilfe von natürlich vorkommenden spezifischen Bindungspartnern (-paaren) detektiert werden, wie z. B. die Verwendung des Proteins intrinsischer Faktor als ein Vertreter für ein spezifisches Bindungspaar für die Bestimmung von Vitamin B12, die Verwendung von Folatbindendem Protein zur Bestimmung der Folsäure oder die Verwendung eines Lectins als ein Vertreter für ein spezifisches Bindungspaar für die Bestimmung eines Kohlenhydrats. Der Analyt kann ein Protein, ein Polypeptid, eine Aminosäure, ein Nukleotidziel und dergleichen einschließen.
"Erkrankungen der Brust" oder "Brusterkrankung" oder "Zustand der Brust", wie hierin beschrieben, beziehen sich auf eine beliebige Erkrankung oder einen beliebigen Zustand der Brust, einschließlich atypische Hyperplasie, Fibroadenom, zystische Brusterkrankung und Krebs, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
"Brustkrebs", wie hierin verwendet ist, bezieht sich auf eine beliebige maligne Erkrankung der Brust, einschließlich duktales Karzinom in situ, lobuläres Karzinom in situ, infiltrierendes duktales Karzinom, medulläres Karzinom, tubuläres Karzinom, muzinöses Karzinom, infiltrierendes lobuläres Karzinom, infiltrierendes Komedokarzinom und entzündliches Karzinom, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
Ein "exprimierter Sequenzmarker" oder "EST" bezieht sich auf die Teilsequenz einer cDNA-Insertion, die über reverse Transkription von aus einem Gewebe extrahierter mRNA gefolgt von der Insertion in einen Vektor hergestellt worden ist.
Eine "Transkriptions-Abbildung" bezieht sich auf eine Tabelle oder Liste, die die quantitative Verteilung von ESTs in einer Bibliothek angibt und die aktiven Gene in dem Gewebe darstellt, aus dem die Bibliothek erstellt wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt Assays bereit, die spezifische Bindungsvertreter verwenden. Ein "spezifischer Bindungsvertreter", wie hierin verwendet ist, ist ein Vertreter eines spezifischen Bindungspaares. Das heißt zwei verschiedene Moleküle, bei denen eines der Moleküle über chemische oder physikalische Wege spezifisch an das zweite Molekül bindet. Deshalb können zusätzlich zu Antigen- und Antikörperspezifischen Bindungspaaren herkömmlicher Immunoassays andere spezifische Bindungspaare Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nukleotidsequenzen, Effektor- und Rezeptormoleküle, Cofaktoren und Enzyme, Enzyminhibitoren und Enzyme und dergleichen einschließen. Außerdem können spezifische Bindungspaare Vertreter einschließen, die Analoge der ursprünglichen spezifischen Bindungsvertreter sind, zum Beispiel ein Analytanalog. Immunoreaktive spezifische Bindungsvertreter schließen Antigene, Antigenfragmente, Antikörper und Antikörperfragmente, sowohl monoklonale als auch polyklonale und Komplexe davon ein, die diejenigen einschließen, die durch rekombinante DNA-Moleküle gebildet werden.
Der Ausdruck "Hapten", wie hierin verwendet ist, bezieht sich auf einen bestimmten Antigen- oder Nicht-Proteinbindungsvertreter, der in der Lage ist, an einen Antikörper zu binden, aber der nicht in der Lage ist, eine Antikörperbildung auszulösen, so lange er nicht mit einem Trägerprotein gekoppelt ist.
Ein "Einfangsreagenz", wie hierin verwendet ist, bezieht sich auf einen unmarkierten spezifischen Bindungsvertreter, der entweder für den Analyten wie in einem Sandwichassay, für das Indikatorreagenz oder Analyten wie in einem kompetitiven Assay oder für einen ergänzenden spezifischen Bindungsvertreter, der selbst für den Analyten spezifisch ist, wie in einem indirekten Assay, spezifisch ist. Das Einfangsreagenz kann direkt oder indirekt an ein Festphasenmaterial vor der Durchführung des Assays oder während der Durchführung des Assays gebunden werden, wodurch die Abtrennung von immobilisierten Komplexen aus der Testprobe ermöglicht wird.
Das "Indikatorreagenz" umfasst eine "Signal-erzeugende Verbin dung" ("Marker"), die in der Lage ist, ein über externe Mittel detektierbares messbares Signal, das mit einem spezifischen Bindungsvertreter konjugiert ("angeheftet") ist, zu erzeugen und dieses erzeugt. Zusätzlich dazu, dass es ein Antikörpervertreter eines spezifischen Bindungspaares ist, kann das Indikatorreagenz ferner ein Vertreter eines. beliebigen spezifischen Bindungspaares sein, einschließlich entweder Hapten-anti-Hapten-Systeme, wie z. B. Biotin oder anti-Biotin, Avidin oder Biotin, ein Kohlenhydrat oder ein Lectin, eine komplementäre Nukleotidsequenz, ein Effektor- oder ein Rezeptormolekül, ein Enzym-Cofaktor und ein Enzym, ein Enzyminhibitor oder ein Enzym und dergleichen. Ein immunoreaktiver spezifischer Bindungsvertreter kann ein Antikörper, ein Antigen oder ein Antikörper/Antigen-Komplex sein, das in der Lage ist, entweder an das Polypeptid von Interesse wie in einem Sandwichassay, an das Einfangsreagenz wie in einem kompetitiven Assay oder an den ergänzenden spezifischen Bindungsvertreter wie in einem indirekten Assay zu binden. Bei der Beschreibung von Sonden und Sondenassays kann der Ausdruck "Reportermolekül" verwendet werden. Ein Reportermolekül umfasst eine wie hierin vorstehend beschriebene Signal-erzeugende Verbindung, die mit einem spezifischen Bindungsvertreter eines spezifischen Bindungspaares konjugiert ist, wie z. B. Carbazol oder Adamantan.
Die vorgesehenen verschiedenen "Signal-erzeugenden Verbindungen" (Marker) schließen Chromagene, Katalysatoren, wie z. B. Enzyme, lumineszente Verbindungen, wie z. B. Fluorescein und Rhodamin, chemilumineszente Verbindungen, wie z. B. Dioxetane, Acridiniume, Phenanthridiniume und Luminol, radioaktive Elemente und direkt sichtbare Marker ein. Beispiele für Enzyme schließen die alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, Betagalactosidase und dergleichen ein. Die Auswahl eines bestimmten Markers ist nicht entscheidend, aber er muss in der Lage sein, ein Signal entweder von selbst aus oder in Verbindung mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen zu erzeugen.
"Feste Phasen" ("feste Träger") sind dem Fachmann bekannt und schließen die Wände von Vertiefungen einer Reaktionsplatte, Teströhrchen, Polystyrolkügelchen, magnetische oder nicht magnetische Kügelchen, Nitrocellulosestreifen, Membrane, Mikroteilchen, wie z. B. Latex-Teilchen, rote Blutzellen von Schafen (oder anderen Tieren) und Duracytes^® (rote Blutzellen, die über Brenztraubenaldehyd und Formaldehyd "fixiert" sind, erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) und andere ein. Die "feste Phase" ist nicht entscheidend und kann von einem Fachmann ausgewählt werden. Somit stellen Latex-Teilchen, Mikroteilchen, magnetische oder nicht magnetische Kügelchen, Membrane, Plastikröhrchen, Wände von Mikrotitervertiefungen, Glas- oder Silicium-Chips, rote Blutzellen von Schafen (oder von anderen geeigneten Tieren) und Duracytes^® alle geeignete Beispiele dar. Geeignete Verfahren für die Immobilisierung von Peptiden auf festen Phasen schließen ionische, hydrophobe, kovalente Wechselwirkungen und dergleichen ein. Eine " feste Phase", wie hierin verwendet ist, betrifft ein beliebiges Material, das unlöslich ist oder über eine anschließende Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Die feste Phase kann auf Grund ihrer intrinsischen Fähigkeit, das Einfangsreagenz anzuziehen und zu immobilisieren, ausgewählt werden. Alternativ dazu kann die feste Phase einen zusätzlichen Rezeptor zurückhalten, der über die Fähigkeit verfügt, das Einfangsreagenz anzuziehen und zu immobilisieren. Der zusätzliche Rezeptor kann eine geladene Substanz, die in Bezug auf das Einfangsreagenz selbst entgegengesetzt geladen ist, oder eine geladene Substanz einschließen, die mit dem Einfangsreagenz konjugiert ist. Als eine noch weitere Alternative kann das Rezeptormolekül ein beliebiger spezifischer Bindungsvertreter sein, der auf der festen Phase immobilisiert (daran angeheftet) ist und der über die Fähigkeit verfügt, das Einfangsreagenz über eine spezifische Bindungsreaktion zu immobilisieren. Das Rezeptormolekül ermöglicht die indirekte Bindung des Einfangsreagenz an ein Festphasenmaterial vor der Durchführung des Assays oder während der Durchführung des Assays. Die feste Phase kann somit ein Kunststoff, derivatisierter Kunststoff, magnetisches oder nicht magnetisches Metall, eine Glas- oder Siliziumoberfläche eines Teströhrchens, einer Mikrotitervertiefung, Platte, eines Kügelchens, Mikroteilchens, Chips, rote Blutzellen von Schafen (oder von anderen geeigneten Tieren), Duracytes^® und andere Konfigurationen sein, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
Es ist vorgesehen und in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, dass die feste Phase ferner ein beliebiges geeignetes poröses Material mit einer ausreichenden Porosität umfassen kann, um einen Zugang über Detektion zu Antikörpern und eine geeignete Oberflächenaffinität zur Bindung von Antigenen zu gestatten. Mikroporöse Strukturen sind im Allgemeinen bevorzugt, aber Materialien mit einer Gelstruktur in dem hydratisierten Zustand können ebenfalls verwendet werden. Solche nützlichen festen Träger schließen Nitrocellulose und Nylon ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Es ist vorgesehen, dass solche hierin beschriebenen porösen festen Träger vorzugsweise in Form von Platten mit einer Dicke von etwa 0,01 bis 0,5 mm, bevorzugt etwa 0,1 mm sind. Die Porengröße kann innerhalb breiter Grenzen variieren und beträgt bevorzugt von etwa 0,025 bis 15 Mikrometer, insbesondere von etwa 0,15 bis 15 Mikrometer. Die Oberfläche von solchen Trägern kann über chemische Prozesse aktiviert werden, die eine kovalente Verknüpfung des Antigens oder Antikörpers mit dem Träger bewirken. Die irreversible Bindung des Antigens oder Antikörpers wird jedoch im Allgemeinen über Adsorption auf dem porösen Material durch wenig verstandene hydrophobe Kräfte erreicht. Andere geeignete feste Träger sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Reagenzien
Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien bereit, wie z. B. Polynukleotidsequenzen, die aus einem Brustgewebe von Interesse abgeleitet sind und als BS106 bezeichnet werden, dadurch kodierte Polypeptide und für diese Polypeptide spezifische Antikörper. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Reagenzien bereit, wie z. B. aus den offenbarten Polynukleotiden abgeleitete Oligonukleotidfragmente und zu diesen Polynukleotiden komplementäre Nukleinsäuresequenzen. Die Polynukleotide, Polypeptide oder Antikörper der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Information bereitzustellen, die zu dem Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder dem Bestimmen der Prädisposition gegenüber Erkrankungen und Zuständen der Brust, wie z. B. Krebs, führt. Die hierin offenbarten Sequenzen stellen einzigartige Polynukleotide dar, die in Assays oder zur Herstellung eines spezifischen Profils für die Aktivität der Gentranskription verwendet werden können. Solche Assays sind in dem Europäischen Patent Nr. 0373203 B1 und der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 95/11995 offenbart.
Ausgewählte von BS106 abgeleitete Polynukleotide können in den hierin beschriebenen Verfahren für die Detektion einer normalen oder veränderten Genexpression verwendet werden. Solche Verfahren können BS106-Polynukleotide oder -Oligonukleotide, Fragmente oder Derivate davon, oder dazu komplementäre Nukleinsäuresequenzen verwenden.
Die hierin offenbarten Polynukleotide, ihre komplementären Sequenzen oder Fragmente von beiden können in Assays verwendet werden, um Gene, Nukleinsäuren, cDNAs oder mRNAs, die mit Brustgewebe-Erkrankungen und damit assoziierten Zuständen in Verbindung stehen, zu detektieren, zu amplifizieren oder zu quantifizieren. Sie können ferner verwendet werden, um eine gesamte oder unvollständige kodierende Region eines BS106-Polypeptids zu identifizieren. Sie können ferner in einzelnen Behältern in Form eines Kits für Assays bereitgestellt werden oder als einzelne Zusammensetzungen bereitgestellt werden. Falls sie in einem Kit für Assays bereitgestellt werden, können andere geeignete Reagenzien, wie z. B. Puffer, Konjugate und dergleichen, eingeschlossen sein.
Das Polynukleotid kann in Form von RNA oder DNA vorliegen. Polynukleotide in Form von DNA, cDNA, genomischer DNA, Nukleinsäureanalogen und synthetischer DNA befinden sich in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und falls einzelsträngig, kann sie der kodierende (Sense-)Strang oder der nicht kodierende (Antisense-)Strang sein. Die kodierende Sequenz, die das Polypeptid kodiert, kann mit der hierin bereitgestellten kodierenden Sequenz identisch sein oder kann eine verschiedene kodierende Sequenz sein, wobei die kodierende Sequenz als Folge der Redundanz oder Degenerierung des genetischen Kodes dasselbe Polypeptid wie die ihren bereitgestellte DNA kodiert.
Dieses Polynukleotid kann nur die kodierende Sequenz für das Polypeptid oder die kodierende Sequenz für das Polypeptid und eine zusätzliche kodierende Sequenz einschließen, wie z. B. eine Führungs- oder Sekretionssequenz oder eine Proproteinsequenz oder die kodierende Sequenz für das Polypeptid (und wahlweise eine zusätzliche kodierende Sequenz) und eine nicht kodierende Sequenz, wie z. B. eine nicht kodierende Sequenz 5' und/oder 3' von der kodierenden Sequenz für das Polypeptid.
Zusätzlich schließt die Erfindung variante Polynukleotide ein, die Modifikationen enthalten, wie z. B. Deletionen, Substitutionen oder Additionen an einem Polynukleotid; und eine beliebige Polypeptidmodifikation, die aus der varianten Polynukleotidsequenz resultiert. Ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kann ferner über eine kodierende Sequenz verfügen, die eine natürlich vorkommende allelische Variante der hierin bereitgestellten kodierenden Sequenz ist.
Zusätzlich kann die kodierende Sequenz für das Polypeptid in dem gleichen Leserahmen mit einer Polynukleotidsequenz fusioniert sein, der bei der Expression und Sekretion eines Polypeptids aus einer Wirtszelle, zum Beispiel eine Führungssequenz, die als eine Sekretionssequenz zur Kontrolle des Transports- eines Polypeptids aus der Zelle funktioniert, behilflich ist. Das Polypeptid mit einer Führungssequenz ist ein Präprotein und die Führungssequenz kann durch die Wirtszelle zur Bildung des Polypeptids gespalten werden. Die Polynukleotide können ferner für ein Proprotein kodieren, das das Protein plus zusätzliche 5'-Aminosäurereste darstellt. Ein Protein mit einer Prosequenz ist ein Proprotein und kann in einigen Fällen eine inaktive Form des Proteins sein. Sobald die Prosequenz abgespalten ist, verbleibt ein aktives Protein. Somit kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung für ein Protein oder für ein Protein mit einer Prosequenz oder für ein Protein mit sowohl einer Präsequenz (Führungssequenz) als auch einer Prosequenz kodieren.
Bei den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung kann ferner die kodierende Sequenz in einem Rahmen mit einer Markersequenz fusioniert sein, die die Reinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung gestattet. Die Markersequenz kann eine Hexa-Histidin-Markierung sein, die von einem pQE-9-Vektor geliefert wird, um für die Reinigung des mit dem Marker fusionierten Polypeptids in dem Fall eines bakteriellen Wirtes zu sorgen, oder die Markersequenz kann zum Beispiel eine Hämagglutinin-(HA)-Markierung sein, wenn ein Säugerwirt, z. B. eine COS-7-Zelllinie, verwendet wird. Die HA-Markierung entspricht einem Epitop, das aus dem Influenza-Hämagglutinin-Protein abgeleitet wurde. Siehe zum Beispiel I. Wilson et al., Cell 37: 767 (1984).
Es ist vorgesehen, dass Polynukleotide in Erwägung gezogen werden, um die hierin bereitgestellten Sequenzen zu hybridisieren, wenn eine Identität zu mindestens 50 bevorzugt mindestens 70 und stärker bevorzugt mindestens 90 zwischen dem Polynukleotid und der Sequenz besteht.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Antikörper bereit, der unter Verwendung eines gereinigten BS106-Polypeptids hergestellt wurde, von dem mindestens ein Teil des Polypeptids durch ein BS106-Polynukleotid kodiert wird, das aus den hierin bereitgestellten Polynukleotiden. gewählt ist. Diese Antikörper können in den hierin bereitgestellten Verfahren für die Detektion von BS106-Antigen in Testproben verwendet werden. Das Vorhandensein von BS106-Antigen in den Testproben ist ein Anzeichen für das Vorhandensein einer Erkrankung oder eines Zustandes der Brust. Der Antikörper kann -ferner für therapeutische Zwecke verwendet werden, zum Beispiel bei der Neutralisierung der Aktivität von BS106-Polypeptid bei Zuständen, die mit einer erhöhten oder abnormalen Expression assoziiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein BS106-Polypeptid, das die abgeleitete Aminosäure-Sequenz, wie hierin bereitgestellt, sowie Fragmente, analoge und Derivate von solchen Polypeptiden besitzt. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürlich gereinigtes Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein. Das Fragment, Derivat oder Analog des BS106-Polypeptids kann eines sein, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste mit einem konservierten oder nicht konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise ein konservierter Aminosäurerest) substituiert ist und ein solcher substituierter Aminosäurerest kann ein oder kein Aminosäurerest sein, der durch den genetischen Kode kodiert wird; oder er kann einer sein, bei dem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe einschließen; oder er kann einer sein, bei dem das Polypeptid mit einer weiteren Verbindung fusioniert ist, wie z. B. eine Verbindung zur Steigerung der Halbwertzeit des Polypeptids (zum Beispiel Polyethylenglycol); oder er kann einer sein, bei dem die zusätzlichen Aminosäuren mit dem Polypeptid fusioniert sind, wie z. B. eine Führungs- oder Sekretionssequenz, oder eine Sequenz, die für die Reinigung des Polypeptids oder einer Proproteinsequenz verwendet wird. Solche Fragmente, Derivate und Analoge befinden sich in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Die Polypeptide und Polynukleotide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in einer isolierten Form und vorzugsweise gereinigt bereitgestellt.
Somit kann ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung über eine Aminosäure-Sequenz verfügen, die zu derjenigen des natürlich vorkommenden Polypeptids identisch ist, oder die um geringfügige Variationen aufgrund einer oder mehrerer Aminosäuresubstitutionen verschieden ist. Die Variation kann eine "konservierende Änderung" typischerweise in dem Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren sein, wobei die substituierte Aminosäure ähnliche strukturelle oder chemische Eigenschaften aufweist, z. B. Austausch von Leucin durch Isoleucin oder von Threonin durch Serin. Im Gegensatz dazu können Variationen nicht konservierende Änderungen einschließen, z. B. Austausch eines Glycins durch ein Tryptophan. Ähnliche geringfügige Variationen können ferner Deletionen oder Insertionen einer Aminosäure oder beides einschließen. Ein Leitfaden bei der Bestimmung, welche und wie viele Aminosäurereste ohne die Veränderung der biologischen oder immunologischen Aktivität substituiert, insertiert oder deletiert werden können, kann unter Verwendung von Computerprogrammen gefunden werden, die in dem Fachgebiet wohl bekannt sind, zum Beispiel DNASTAR Software (DNASTAR Inc., Madison WI).
Sonden, die gemäß den Polynukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung konstruiert wurden, können in verschiedenen Assayverfahren verwendet werden, um verschiedene Arten der Analyse bereitzustellen. Zum Beispiel können solche Sonden in der Technologie der fluoreszierenden in situ Hybridisierung (FISH) verwendet werden, um eine chromosomale Analyse durchzuführen, und können zur Identifizierung von Krebsspezifischen strukturellen Veränderungen in den Chromosomen verwendet werden, wie z. B. Deletionen oder Translokationen, die aus Chromosomenverteilungen sichtbar oder unter Verwendung von PCR-erzeugten und/oder Allel-spezifischen Oligonukleotidsonden, Allel-spezifischer Amplifizierung oder über direkte Sequenzierung detektierbar sind. Die Sonden können ferner mit Radioisotopen, direkt oder indirekt detektierbaren Haptenen oder fluoreszenten Molekülen markiert und für in situ Hybridisierungsstudien verwendet werden, um die mRNA-Expression des Gens zu untersuchen, das das Polynukleotid in Gewebeproben oder Zellen umfasst.
Diese Erfindung stellt ferner eine Lehre im Hinblick auf die Herstellung der hierin bereitgestellten Polynukleotide und Polypeptide bereit.
Sondenassays
Die hierin bereitgestellten Sequenzen können verwendet werden, um Sonden zu erzeugen, die in Assays für die Detektion von Nukleinsäuren in Testproben verwendet werden können. Die Sonden können aus konservierten Nukleotidregionen der Polynukleotide von Interesse oder aus nicht konservierten Nukleotidregionen der Polynukleotide von Interesse konstruiert sein. Die Konstruktion von solchen Sonden für die Optimierung in Assays liegt im Können des Fachmannes. Im Allgemeinen werden Nukleinsäuresonden aus nicht konservierten oder einzigartigen Regionen entwickelt, wenn eine maximale Spezifität erwünscht ist, und Nukleinsäuresonden werden aus konservierten Regionen entwickelt, wenn ein Assay für Nukleotidregionen durchgeführt wird, die zum Beispiel mit verschiedenen Vertretern einer Multigenfamilie oder in verwandten Spezies wie Maus und Mensch eng verwandt sind.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Technik zum Amplifizieren einer gewünschten Nukleinsäuresequenz (Ziel), die in einer Nukleinsäure oder einem Gemisch davon enthalten ist. In der PCR wird ein Paar von Primern im Überschuss verwendet, um die komplementären Stränge der Zielnukleinsäure zu hybridisieren. Die Primer werden jeweils durch eine Polymerase unter Verwendung der Zielnukleinsäure als ein Templat verlängert. Die Verlängerungsprodukte werden ihrerseits zu Zielsequenzen, worauf die Dissoziation von dem ursprünglichen Zielstrang folgt. Neue Primer werden danach über eine Polymerase hybridisiert und verlängert und der Zyklus wird zur genetischen Steigerung der Anzahl von Zielsequenzmolekülen wiederholt. Die PCR ist in den US-Patenten 4,683,195 und 4,683,202 offenbart.
Die Ligasekettenreaktion (LCR) ist ein alternatives Verfahren zur Nukleinsäureamplifizierung. Bei der LCR werden Sondenpaare verwendet, die zwei primäre (erste und zweite) und zwei sekundäre (dritte und vierte) Sonden einschließen, von denen alle in einem molaren Überschuss gegenüber dem Ziel verwendet werden. Die erste Sonde hybridisiert mit einem ersten Segment des Zielstranges und die zweite Sonde hybridisiert mit einem zweiten Segment des Zielstranges, wobei das erste und zweite Segment zusammenhängend ist, so dass die primären Sonden in einer Beziehung von 5'-Phosphat-3'-Hydroxyl aneinander angrenzen und so dass eine Ligase die beiden Sonden zu einem vereinigten Produkt kovalent fusionieren oder ligieren kann. Zusätzlich kann einen Dritte (sekundäre) Sonde mit einem Teil der ersten Sonde hybridisieren und eine vierte (sekundäre) Sonde kann mit einem Teil der zweiten Sonde auf eine entsprechende aneinander angrenzende Art und Weise hybridisieren. Wenn das Ziel am Anfang doppelsträngig ist, hybridisieren in erster Linie die zweiten Sonden selbstverständlich mit dem Zielkomplement. Sobald der ligierte Strang von primären Sonden von dem Zielstrang separiert wurde, hybridisiert er mit den dritten und vierten Sonden, die ligiert werden können, um ein komplementäres, sekundäres ligiertes Produkt zu bilden. Es ist wichtig zu erkennen, dass die ligierten Produkte funktionell entweder zu dem Ziel oder zu dessen Komplement äquivalent sind. Durch wiederholte Zyklen von Hybridisierung und Ligation, wird die Amplifizierung der Zielsequenz erreicht. Diese Technik ist vollständiger in der EP-A-320 308 , veröffentlicht am 16. Juni 1989, und in der EP-A-439 182 , veröffentlicht am 31. Juli 1991, beschrieben.
Für die Amplifizierung von mRNAs liegt es in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, die mRNA zu cDNA revers zu transkribieren, worauf eine Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) folgt; oder ein einziges Enzym für beide Schritte zu verwenden, wie in dem US-Patent Nr. 5,322,770 beschrieben ist; oder die mRNA zu cDNA revers zu transkribieren, worauf eine Asymmetric-Gap-Ligasekettenreaktion (RT-AGLCR) folgt, wie durch R. L. Marshall et al., PCR Methods and Applications 4: 80-84 (1994) beschrieben ist.
Weitere bekannte Amplifizierungsverfahren, die hierin. verwendet werden können, schließen die so genannte "NASBA"- oder "3SR"-Technik ein, die von J. C. Guatelli, et al., PNAS USA 87: 1874-1878 (1990) beschrieben ist und ferner von J. Compton, Nature 350 (Nr. 6313): 91-92 (1991) beschrieben ist; die Q-beta-Amplifizierung, wie in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung (EPA) Nr. 4544610 beschrieben ist; die Strangverdrängungsamplifizierung (wie in G. T. Walker et al., Clin. Chem. 42: 9-13 (1996) beschrieben ist) und in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 684315 ; und die Zielvermittelte Amplifizierung, wie in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 93/22461 beschrieben ist, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Die Detektion von BS106 kann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Detektionsverfahrens, einschließlich derjenigen Detektionsverfahren, die gegenwärtig in dem Fachgebiet wohl bekannt sind, als auch durch Detektionsstrategien, die sich später entwickeln können, bewerkstelligt werden. Siehe zum Beispiel Caskey et al., US-Patent Nr. 5,582,989 , Gelfand et al., US-Patent Nr. 5,210,015 . Beispiele für solche Detektionsverfahren schließen Verfahren der Zielamplifizierung als auch Technologien der Signalamplifizierung ein. Ein Beispiel für derzeit bekannte Detektionsverfahren würde die Technologien der Nukleinsäureamplifizierung einschließen, die als PCR, LCR, NASBA, SDA, RCR und TMA bezeichnet werden. Siehe zum Beispiel Caskey et al., US-Patent Nr. 5,582,989 , Gelfand et al., US-Patent Nr. 5,210,015 . Die Detektion kann ferner unter Verwendung der Signalamplifizierung bewerkstelligt werden, wie z. B. derjenigen, die in Snitman et al., US-Patent Nr. 5,273,882 offenbart ist. Während die Amplifizierung von Ziel oder Signal gegenwärtig bevorzugt ist, ist es vorgesehen und in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, das ultraempfindliche Detektionsverfahren hierin verwendet werden können, die eine Amplifizierung nicht erfordern.
Sowohl die amplifizierte als auch nicht amplifizierte Detektion kann unter Verwendung einer Vielzahl an heterogenen und homogenen Detektionsformaten (kombiniert) durchgeführt werden. Beispiele für heterogene Detektionsformate sind in Snitman et al., US-Patent Nr. 5,273,882 , Albarella et al., in EP-84114441.9 , Urdea et al., US-Patent Nr. 5,124,246 , Ullman et al., US-Patent Nr. 5,185,243 und Kourilsky et al., US-Patent Nr. 4,581,333 offenbart. Beispiele für homogene Detektionsformate sind in Caskey et al., US-Patent Nr. 5,582,989 , Gelfand et al., US-Patent Nr. 5,210,015 offenbart. Ferner ist es vorgesehen und in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, mehrfache Sonden in dem Hybridisierungsassay zu verwenden, wobei die Verwendung die Sensitivität und Amplifizierung des BS106-Signals verbessert. Siehe zum Beispiel das US-Patent Nr. 5,582,989 an Caskey et al. und das US-Patent Nr. 5,210,015 an Gelfand et al.
Bei einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung im Allgemeinen die folgenden Schritte: In-Kontakt-Bringen einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie eine Zielpolynukleotidsequenz enthält, mit Reagenzien für die Amplifizierungsreaktion, die einen Amplifizierungsprimer umfassen, und einer Detektionssonde, die mit einer inneren Region der Amplikonsequenzen hybridisieren kann. Die gemäß dem hierin bereitgestellten Verfahren verwendeten Sonden und Primer sind mit Einfangs- und Detektionsmarkern markiert, wobei Sonden mit einer Art von Markern markiert sind und Primer mit einer anderen Art von Markern markiert sind. Zusätzlich sind die Primer und Sonden derart gewählt, dass die Sondensequenz über eine niedrigere Schmelztemperatur als die Primersequenzen verfügt. Die Amplifizierungsreagenzien, Detektionsreagenzien und die Testprobe werden unter Amplifizierungsbedingungen gesetzt, wobei in Gegenwart der Zielsequenz Kopien der Zielsequenz (ein Amplikon) erzeugt werden. In dem gewöhnlichen Fall ist das Amplikon doppelsträngig, da Primer bereitgestellt werden, um eine Zielsequenz und ihren komplementären Strang zu amplifizieren. Das doppelsträngige Amplikon wird danach thermisch denaturiert, um einzelsträngige Amplikonvertreter zu erzeugen. Nach der Bildung der einzelsträngigen Amplikonvertreter -wird das Gemisch gekühlt, um die Bildung von Komplexen zwischen den Sonden und einzelsträngigen Amplikonvertretern zu gestatten.
Während die einzelsträngigen Amplikonsequenzen und Sondensequenzen gekühlt werden, binden die Sondensequenzen vorzugsweise die einzelsträngigen Amplikonvertreter. Unter der Voraussetzung, dass die Sondensequenzen im Allgemeinen kürzer als die Primersequenzen gewählt werden und deshalb über eine niedrigere Schmelztemperatur als die Primer verfügen, ist dieses Ergebnis nicht eingängig. Dementsprechend sollte die Schmelztemperatur des durch die Primer erzeugten Amplikons ebenfalls über eine höhere Schmelztemperatur als die Sonden verfügen. Während sich das Gemisch abkühlt, wäre somit eine erneute Formation des doppelsträngigen Amplikons zur erwarten. Wie zuvor festgestellt wurde, ist das jedoch nicht der Fall. Es wurde festgestellt, dass die Sonden vorzugsweise die einzelsträngigen Amplikonvertreter binden. Außerdem besteht diese Präferenz der Bindung von Sonde/einzelsträngiges Amplikon sogar bei überschüssiger Zugabe der Primersequenzen zu den Sonden.
Nachdem die Hybride von Sonde/einzelsträngiger Amplikonvertreter gebildet sind, werden sie detektiert. Standardmäßige heterogene Assayformate sind zum Detektieren der Hybride unter Verwendung der Detektionsmarker und der Einfangsmarker, die auf den Primern und Sonden vorhanden sind, geeignet. Die Hybride können an ein Festphasenreagenz mit Hilfe des Einfangsmarkers gebunden und mit Hilfe des Detektionsmarkers detektiert werden. In Fällen, in denen der Detektionsmarker direkt detektierbar ist, kann die Gegenwart der Hybride an der festen Phase detektiert werden, indem der Marker dazu veranlasst wird, ein detektierbares Signal, falls erforderlich, zu erzeugen, und das Signal detektiert wird. In Fällen, in denen der Marker nicht direkt detektierbar ist, können die eingefangenen Hybride mit einem Konjugat in Kontakt gebracht werden, das im Allgemeinen einen Bindungsvertreter umfasst, der an einen direkt detektierbaren Marker gebunden ist. Das Konjugat wird an die Komplexe gebunden und die auf den Komplexen vorhandenen Konjugate können mit dem direkt detektierbaren Marker detektiert werden. Somit kann das Vorhandensein der Hybride auf dem Festphasenreagenz bestimmt werden. Der Fachmann erkennt, dass Waschungsschritte verwendet werden können, um unhybridisiertes Amplikon oder Sonde als auch ungebundenes Konjugat wegzuwaschen.
Obwohl die Zielsequenz als einzelsträngig beschrieben ist, ist es ferner vorgesehen, dass der Fall eingeschlossen sein soll, in dem die Zielsequenz tatsächlich doppelsträngig ist aber vor der Hybridisierung mit den Amplifizierungprimersequenzen lediglich von ihrem Komplement getrennt wird. In dem Fall, in dem in diesem Verfahren die PCR verwendet wird, sind die Enden der Zielsequenzen gewöhnlich bekannt. In Fällen, in denen die LCR oder eine Modifikation davon bei dem bevorzugten Verfahren verwendet wird, ist die gesamte Zielsequenz gewöhnlich bekannt. Typischerweise ist die Zielsequenz eine Nukleinsäuresequenz, wie zum Beispiel RNA oder DNA.
Das hierin bereitgestellte Verfahren kann bei wohl bekannten Amplifizierungsreaktionen verwendet werden, die Reaktionsgemische aus thermischen Zyklen einschließen, insbesondere bei der PCR und der Gap-LCR (GLCR). Die Amplifizierungsreaktionen verwenden typischerweise Primer für die wiederholte Erzeugung von Kopien einer Zielnukleinsäuresequenz, wobei die Zielsequenz gewöhnlich eine kleine Region einer viel größeren Nukleinsäuresequenz ist. Die Primer stellen ihrerseits Nukleinsäuresequenzen dar, die zu Regionen einer Zielsequenz komplementär sind. Unter Amplifizierungsbedingungen hybridisieren diese Primer oder binden an die komplementären Regionen der Zielsequenz. Die Kopien der Zielsequenz werden typischerweise über den Prozess der Primerextension und/oder -ligation erzeugt, der Enzyme mit Polymerase- oder Ligaseaktivität getrennt oder in Kombination verwendet, um an die hybridisierten Primer und/oder die Ligatbenachbarten Sondenpaare Nukleotide zu addieren. Die Nukleotide, die an die Primer oder Sonden als Monomere oder vorgeformte Oligomere addiert werden, sind zu der Zielsequenz ebenfalls komplementär. Sobald die Primer oder Sonden ausreichend verlängert und/oder ligiert worden sind, werden sie von der Zielsequenz separiert, zum Beispiel in dem das Reaktionsgemisch auf eine "Schmelztemperatur" erwärmt wird, die eine Schmelztemperatur ist, bei der komplementäre Nukleinsäurestränge dissoziieren. Somit wird eine zu der Zielsequenz komplementäre Sequenz gebildet.
Ein neuer Amplifizierungszyklus kann danach stattfinden, um die Anzahl von Zielsequenzen durch Separation jeglicher doppelsträngiger Sequenzen weiter zu amplifizieren, was es den Primern oder Sonden gestattet, an ihre jeweiligen Ziele zu hybridisieren, die hybridisierten Primer oder Sonden zu verlängern und/oder zu ligieren und erneut zu separieren. Die komplementären Sequenzen, die über Amplifizierungszyklen erzeugt werden, können als das Templat für die Primerextension dienen oder die Lücke zwischen zwei Sonden füllen, um die Anzahl von Zielsequenzen weiter zu amplifizieren. Typischerweise wird ein Reaktionsgemisch zwischen 20 und 100 mal zyklisiert, typischer wird ein Reaktionsgemisch zwischen 25 und 50 mal zyklisiert. Die Anzahl von Zyklen kann von dem Fachmann bestimmt werden. Auf diese Art und Weise werden mehrere Kopien der Zielsequenz und ihrer komplementären Sequenz hergestellt. Somit initiieren Primer die Amplifizierung der Zielsequenz, wenn sie unter Amplifizierungsbedingungen vorhanden ist.
Im Allgemeinen werden bei der PCR zwei Primer, die zu einem Teil eines Zielstranges komplementär sind, und dessen Komplement verwendet. Für die LCR werden im Allgemeinen vier Sonden verwendet, von denen zwei zu einer Zielsequenz komplementär sind und von denen zwei zu dem Komplement des Ziels entsprechend komplementär sind. Zusätzlich zu den vorher erwähnten Primersätzen und Enzymen kann ferner ein Reaktionsgemisch für die Nukleinsäureamplifizierung weitere Reagenzien umfassen, die wohl bekannt sind und die folgenden einschließen: Enzym-Cofaktoren wie z. B. Mangan; Magnesium; Salze; Nicotinamidadenindinukleotid (NAD); und Deoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) wie zum Beispiel Deoxyadenintriphosphat, Deoxyguanintriphosphat, Deoxycytosintriphosphat und Deoxythymintriphosphat, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Während die Amplifizierungsprimer die Amplifizierung der Zielsequenz initiieren, ist die Detektions- (oder Hybridisierungs-) Sonde an der Amplifizierung nicht beteiligt. Die Detektionssonden sind im Allgemeinen Nukleinsäuresequenzen oder ungeladene Nukleinsäureanaloge, wie zum Beispiel Peptidnukleinsäuren, die in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 92/20702 offenbart sind; Morpholino-Analoge, die in den US-Patenten Nrn. 5,185,444 , 5,034,506 und 5,142,047 beschrieben sind; und dergleichen. In Abhängigkeit von der Art des Markers, der von der Sonde getragen wird, wird die Sonde verwendet, um das durch die Amplifizierungsreaktion erzeugte Amplikon einzufangen oder zu detektieren. Die Sonde ist an der Amplifizierung der Zielsequenz nicht beteiligt und muss möglicherweise deshalb "nicht verlängerbar" gemacht werden, indem zusätzliche dNTPs nicht an die Sonde addiert werden können. In sich und von sich selbst sind Analoge gewöhnlich nicht-verlängerbar und Nukleinsäuresonden können nicht verlängerbar gemacht werden, indem das 3'-Ende der Sonde modifiziert wird, so dass die Hydroxylgruppe nicht mehr in der Lage ist, an der Verlängerung teilzunehmen. Zum Beispiel kann das 3'-Ende der Sonde mit dem Einfangs- oder Detektionsmarker funktionalisiert werden, um dadurch die Hydroxylgruppe zu verbrauchen oder anderweitig zu blockieren. Alternativ dazu kann die 3'-Hydroxylgruppe einfach abgespalten, ersetzt oder modifiziert werden. Die US-Patentanmeldung Serien-Nr. 07/049,061 , eingereicht am 19. April 1993, beschreibt Modifikationen, die verwendet werden können, um eine Sonde nicht verlängerbar zu machen.
Das Verhältnis von Primern zu Sonden ist nicht von Bedeutung. Somit können entweder die Sonden oder Primer dem Reaktionsgemisch im Überschuss zugegeben werden, wodurch die Konzentration von einem größer wäre als die Konzentration des anderen. Alternativ dazu können Primer und Sonden in äquivalenten Konzentrationen verwendet werden. Vorzugsweise werden jedoch die Primer dem Reaktionsgemisch im Überschuss gegenüber den Sonden zugegeben. Somit sind Verhältnisse von Primer zu Sonde von zum Beispiel 5:1 und 20:1 bevorzugt.
Während die Länge der Primer und Sonden variieren kann, sind die Sondensequenzen so gewählt, dass sie über eine niedrigere Schmelztemperatur als die Primersequenzen verfügen. Folglich sind die Primersequenzen im Allgemeinen länger als die Sondensequenzen. Typischerweise sind die Primersequenzen in dem Bereich von zwischen 20 und 50 Nukleotide lang, typischer in dem Bereich von zwischen 20 und 30 Nukleotide lang. Die typische Sonde ist in dem Bereich von zwischen 10 und 25 Nukleotide lang.
Verschiedene Verfahren zur Synthetisierung von Primern und Sonden sind in dem Fachgebiet wohl bekannt. Entsprechend sind Verfahren zum Anbinden von Markern an Primer oder Sonden in dem Fachgebiet ebenfalls wohl bekannt. Es ist zum Beispiel eine Routineangelegenheit, gewünschte Primer oder Sonden für eine Nukleinsäure unter Verwendung der herkömmlichen Nukleotid-Phosphoramidit-Chemie und Instrumente zu synthetisieren, die von Applied Biosystems, Inc., (Foster City, CA), DuPont (Wilmington, DE) oder Milligen (Bedford, MA) erhältlich sind. Viele Verfahren sind zur Markierung von Oligonukleotiden, wie z. B. die Primer oder Sonden der vorliegenden Erfindung, beschrieben worden. Enzo Biochemical (New York, NY) und Clontech (Palo Alto, CA) haben beide Techniken zur Sondenmarkierung beschrieben und kommerzialisiert. Zum Beispiel kann ein primäres Amin an ein 3'-Oligo-Ende unter Verwendung von 3'-Amine-ON CPG^TM (Clontech, Palo Alto, CA) gebunden werden. Entsprechend kann ein primäres Amin an ein 5'-Oligo-Ende unter Verwendung von Aminomodifier Il^® (Clontech) gebunden werden. Die Amine können mit verschiedenen Haptenen unter Verwendung der herkömmlichen Aktivierungs- und Verknüpfungschemie umgesetzt werden. Zusätzlich lehren die mit anhängigen Anmeldungen US-Serien-Nrn. 625,566 , eingereicht am 11. Dezember 1990, und 630,908 , eingereicht am 20. Dezember 1990, Verfahren zur Markierung von Sonden an ihren 5'- bzw. 3'-Enden. Die Internationale Veröffentlichung Nrn. WO 92/10505 , veröffentlicht am 25. Juni 1992, und WO 92/11388 , veröffentlicht am 9. Juli 1992, lehren Verfahren zur Markierung von Sonden an ihren 5'- bzw. 3'-Enden. Gemäß einem bekannten Verfahren zur Markierung eines Oligonukleotids wird ein Marker-Phosphoramidit-Reagenz hergestellt und verwendet, um den Marker an das Oligonukleotid während seiner Synthese zu addieren. Siehe zum Beispiel N. T. Thuong et al., Tet. Letters 29(46): 5905-5908 (1988); oder J. S. Cohen et al., veröffentlichte US-Patentanmeldung 07/246,688 (NTIS Bestell-Nr. PAT-APPL-7-246,688) (1989). Vorzugsweise werden die Sonden an ihren 3'- und 5'-Enden markiert.
Ein Einfangsmarker wird an den Primern oder Sonden gebunden und kann ein spezifischer Bindungsvertreter sein, der ein Bindungspaar mit dem spezifischen Bindungsvertreter des Festphasenreagenz bildet. Es wird verstanden, dass der Primer oder die Sonde selbst als der Einfangsmarker dienen können. In dem Fall zum Beispiel, in dem der Bindungsvertreter eines Festphasenreagenz eine Nukleinsäuresequenz ist, kann es derart gewählt werden, dass es einen komplementären Teil des Primers oder der Sonde bindet, um dadurch den Primer oder die Sonde an der festen Phase zu immobilisieren. In Fällen, in denen die Sonde selbst als der Bindungsvertreter dient, erkennt der Fachmann, dass die Sonde eine Sequenz oder einen "Schwanz" beinhaltet, die/der mit den einzelsträngigen Amplikonvertretern nicht komplementär ist. In dem Fall, in dem der Primer selbst als der Einfangsmarker dient, ist mindestens ein Teil des Primers frei, um mit einer Nukleinsäure an einer festen Phase zu hybridisieren, da die Sonde derart gewählt ist, dass sie zu der Primersequenz nicht vollständig komplementär ist.
Im Allgemeinen können Komplexe aus Sonde/einzelsträngiger Amplikonvertreter unter Verwendung von Technikern detektiert werden, die herkömmlich zur Durchführung von heterogenen Immunoassays verwendet werden. Vorzugsweise wird bei dieser Ausführungsform die Detektion gemäß den Protokollen durchgeführt, die von der im Handel erhältlichen Abbott LCx^® Ausstattung (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) verwendet werden.
Die hierin offenbarten Primer und Sonden sind bei typischen PCR-Assays nützlich, bei denen die Testprobe mit einem Paar von Primern kontaktiert, eine Amplifizierung durchgeführt, die Hybridisierungssonde zugegeben und die Detektion durchgeführt wird.
Ein weiteres durch die vorliegende Erfindung bereitgestelltes Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen einer Testprobe mit einer Vielzahl von Polynukleotiden, wobei mindestens ein Polynukleotid ein wie hierin beschriebenes BS106-Molekül ist, Hybridisieren der Testprobe mit der Vielzahl von Polynukleotiden und Detektieren von Hybridisierungskomplexen. Die Hybridisierungkomplexe werden identifiziert und quantifiziert, um ein Profil zu erstellen, das ein Anzeichen für eine Brustgewebe-Erkrankung ist, wie z. B. Brustkrebs. Die exprimierten RNA-Sequenzen können ferner durch die reverse Transkription und Amplifizierung des DNA-Produkts über in dem Fachgebiet wohl bekannte Prozeduren detektiert werden, die die Polymerasekettenreaktion (PCR) einschließen.
Wirkstoff-Screening
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Screening einer Vielzahl von Verbindungen auf eine spezifische Bindung mit einem BS106-Polypeptid (BS106-Polypeptiden) oder einem beliebigen Fragment davon bereit, um mindestens eine Verbindung zu identifizieren, die das BS106-Polypeptid spezifisch bindet. Ein solches Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Bereitstellen mindestens einer Verbindung; Kombinieren des BS106-Polypeptids mit jeder Verbindung unter geeigneten Bedingungen für eine ausreichende Zeit, um eine Bindung zu gestatten; und Detektieren der BS106-Polypeptidbindung mit jeder Verbindung.
Das bei einem solchen Test verwendete Polypeptid- oder Peptidfragment kann entweder frei in Lösung, an einem festen Träger befestigt, auf einer Zelloberfläche sein oder sich intrazellulär befinden. Ein Verfahren zum Screening verwendet eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die mit rekombinanten Nukleinsäuren stabil transfiziert sind, die das Polypeptid- oder Peptidfragment exprimieren können. Ein Wirkstoff, eine Verbindung oder ein beliebiges anderes Mittel kann gegenüber solchen transfizierten Zellen in kompetitiven Bindungsassays gescreent werden. Zum Beispiel kann die Bildung von Komplexen zwischen einem Polypeptid und dem im Test befindlichen Mittel entweder in entwicklungsfähigen oder fixierten Zellen gemessen werden.
Die vorliegende Erfindung stellt somit Verfahren zum Screening auf Wirkstoffe, Verbindungen oder auf ein beliebiges anderes Mittel bereit, die für die Behandlung von mit BS106 assoziierten Erkrankungen verwendet werden können. Diese Verfahren umfassen das In-Kontakt-Bringen des Mittels mit einem Polypeptid oder Fragment davon und Durchführen eines Assays auf entweder das Vorhandensein eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem Polypeptid oder auf das Vorhandensein eines Komplexes zwischen dem Polypeptid und der Zelle. Bei kompetitiven Bindungsassays ist das Polypeptid typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies (oder unkomplexiertes) Polypeptid oder Fragment davon von demjenigen separiert, die in gebundener Form vorliegen, und die Menge an freiem oder unkomplexiertem Marker wird als ein Maß für die Fähigkeit des bestimmten Mittels verwendet, um an das. Polypeptid zu binden oder um mit dem Komplex aus Polypeptid/Zelle zu Wechselwirken.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner die Verwendung von kompetitiven Screeningassays, bei denen die Neutralisierung der Antikörper, die in der Lage sind, Polypeptide spezifisch zu binden, mit einem Testmittel um die Bindung an das Polypeptid oder Fragment davon konkurrieren. Auf diese Art und Weise können die Antikörper verwendet werden, um das Vorhandensein von einem beliebigen Polypeptid in der Testprobe zu detektieren, das ein oder mehrere antigene Determinanten mit einem BS106-Polypeptid, wie hierin bereitgestellt ist, gemeinsam verwendet.
Eine weitere Technik zum Mittel-Screening stellt ein Hochdurchsatz-Screening für Verbindung bereit, die über eine geeignete Bindungsaffinität zu mindestens einem hierin offenbarten Polypeptid von BS106 verfügen. Kurz gefasst werden große Zahlen von verschiedenen kleinen Peptid-Testverbindungen an einer festen Phase synthetisiert, wie z. B. Kunststoffstifte oder irgendeine andere Oberfläche. Die Peptid-Testverbindungen werden mit Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Das so an die feste Phase gebundene Polypeptid wird über Verfahren detektiert, die in dem Fachgebiet wohl bekannt sind. Das gereinigte Polypeptid kann ferner direkt auf Platten für die Verwendung bei den hierin beschriebenen Screeningtechniken aufgebracht werden. Zusätzlich können nicht neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Polypeptid einzufangen und es auf dem festen Träger zu immobilisieren. Siehe zum Beispiel die EP 84/03564 , veröffentlicht am 13. September 1984.
Das Ziel des rationalen Wirkstoff-Designs besteht darin, strukturelle Analoge von biologisch aktiven Polypeptiden von Interesse oder von den kleinen Molekülen herzustellen, die Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren, mit denen sie Wechselwirken, einschließen. Solche strukturellen Analoge können für die Entwicklung von Wirkstoffen, die aktivere oder stabilere Formen des Polypeptids darstellen, oder die die Funktion eines Polypeptids in vivo verbessern oder damit Wechselwirken, verwendet werden. J. Hodgson, Bio/Technology 9: 19-21 (1991).
Zum Beispiel wird bei einem Ansatz die dreidimensionale Struktur eines Polypeptids oder von einem Komplex aus Polypeptidinhibitor über Röntgenkristallographie, über Computermodellierung oder am typischsten über eine Kombination der beiden Ansätze bestimmt. Sowohl die Gestalt als auch die Ladungen des Polypeptids müssen sichergestellt werden, um die Struktur aufzuklären und die aktive Stelle (aktiven Stellen) des Moleküls zu bestimmen. Weniger oft kann nützliche Information hinsichtlich der Struktur eines Polypeptids über Modellierung auf der Basis der Struktur von homologen Proteinen erhalten werden. In beiden Fällen wird relevante strukturelle Information verwendet, um analoge Polypeptid-ähnliche Moleküle zu entwickeln oder effiziente Inhibitoren zu identifizieren.
Nützliche Beispiele für rationales Wirkstoff-Design können Moleküle einschließen, die eine verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen, wie von S. Braxton et al., Biochemistry 31 :7796-7801 (1992) gezeigt, oder die als Inhibitoren, Agonisten oder Antagonisten von nativen Peptiden wirken, wie von S. B. P. Athauda et al., J. Biochem. (Tokyo) 113(6): 742-746 (1993) gezeigt wird.
Es ist ferner möglich, einen durch ein Assay selektierten Zielspezifischen Antikörper, wie hier vorstehend beschrieben, zu isolieren, und danach dessen Kristallstruktur zu bestimmen. Im Prinzip ergibt dieser Ansatz ein Pharmacophor, auf dem ein nachfolgender Wirkstoff-Design begründet werden kann. Es ist ferner möglich, die Protein-Kristallographie insgesamt zu umgehen, indem anti-idiotypische Antikörper ("anti-ids") gegen einen funktionalen, pharmakologisch aktiven Antikörper erzeugt werden. Als ein Spiegelbild eines Spiegelbilds ist die Bindungsstelle des anti-id ein Analog des ursprünglichen Rezeptors. Der anti-id kann danach verwendet werden, um Peptide aus Banken von chemisch oder biologisch hergestellten Peptiden zu identifizieren und zu isolieren. Die isolierten Peptide können danach als das Pharmacophor wirken (das heißt ein Prototyp eines pharmazeutischen Wirkstoffs).
Eine ausreichende Menge an einem rekombinanten Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann verfügbar gemacht werden, um analytische Untersuchungen durchzuführen, wie z. B. Röntgenkristallographie. Zusätzlich stellt die Kenntnis der Aminosäure-Sequenz des Polypeptids, die aus der hierin bereitgestellten Nukleinsäuresequenz abgeleitet werden kann, einen Leitfaden für diejenigen bereit, die an Stelle von oder zusätzlich zu der Röntgenkristallographie die Techniken der Computermodellierung verwenden.
Ferner können solche Antikörper das Vorhandensein oder das Fehlen des BS106-Polypeptids in einer Testprobe detektieren und sind deshalb als diagnostische Marker für die Diagnose einer Gewebeerkrankung oder eines Zustandes der Brust, insbesondere Brustkrebs, nützlich. Solche Antikörper können ferner als ein diagnostischer Marker für Erkrankungszustände des Brustgewebes, wie z. B. Brustkrebs, funktionieren.
Die Antisense-Technologie kann verwendet werden, um die Genexpression durch Bildung einer Dreifachhelix oder Antisense-DNA oder -RNA zu reduzieren, von denen beide Verfahren auf der Bindung eines Polynukleotids an DNA oder RNA basieren. Zum Beispiel wird der 5'-Kodierungsabschnitt der Polynukleotidsequenz, der für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, für die Konstruktion eines Antisense-RNA-Oligonukleotids mit einer Länge von 10 bis 40 Hasenpaaren verwendet. Ein DNA-Oligonukleotid wird derart konstruiert, dass es zu einer Region des bei der Transkription beteiligten Gens komplementär ist, wodurch die Transkription und die Erzeugung des BS106-Polypeptids verhindert werden. Für die Dreifachhelix siehe zum Beispiel Lee et al., Nuc. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science 251: 1360 (1991). Das Antisense-RNA-Oligonukleotid hybridisiert an die mRNA in vivo und blockiert die Translation eines mRNA-Moleküls in das BS106-Polypeptid. Für Antisense siehe zum Beispiel Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); und "Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression", CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988). Die Antisense-Oligonukleotide wirken mit einer größeren Effizienz, wenn sie modifiziert werden, um künstliche Internukleotid-Verknüpfungen zu enthalten, die das Molekül gegenüber einer nukleolytischen Spaltung widerstandsfähig machen. Solche künstlichen Internukleotid-Verknüpfungen schließen die Internukleotid-Verknüpfungen von Methylphosphonat, Phosphorothiolat und Phosphoroamydat ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Rekombinante Technologie
Die vorliegende Erfindung stellt Wirtszellen und Expressionsvektoren, die BS106-Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, und Verfahren für die Herstellung von dem Polypeptid (den Polypeptiden), die sie kodieren, bereit. Solche Verfahren umfassen die Kultivierung der Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Expression des BS106-Polynukleotids geeignet sind, und die Gewinnung des BS106-Polypeptids aus der Zellkultur.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Vektoren, die BS106-Polynukleotide der vorliegenden Erfindung einschließen, Wirtszellen, die im Allgemeinen mit Vektoren der vorliegenden Erfindung gezüchtet werden, und die Herstellung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung über rekombinante Techniken bereit.
Die Wirtszellen werden mit den Vektoren dieser Erfindung, die Klonierungsvektoren oder Expressionsvektoren sein können, genetisch gezüchtet (transfiziert, transduziert oder transformiert). Der Vektor kann in Form eines Plasmids, eines viralen Teilchens, einer Phase usw. vorliegen. Die gezüchteten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien kultiviert werden, die je nach Bedarf zur Aktivierung von Promotoren, Auswahl von transfizierten Zellen oder Amplifizierung des BS106-Gens (der BS106-Gene) modifiziert wurden. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Temperatur, pH und dergleichen, sind diejenigen, die zuvor bei der zur Expression gewählten Wirtszelle verwendet wurden, und sind dem Durchschnittsfachmann ersichtlich.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung eines Polypeptids über rekombinante Techniken verwendet werden. Somit kann die Polynukleotidsequenz in eine beliebige aus einer Vielzahl von Expressionsvehikeln, insbesondere Vektoren oder Plasmide, zur Expression eines Polypeptids eingeschlossen sein. Solche Vektor schließen chromosomale, nicht chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen ein, z. B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Hefeplasmide; Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA, virale DNA, wie z. B. Vaccinia, Adenovirus, Hühnerpockenvirus und Pseudorabies abgeleitet sind. Jedoch kann ein beliebiges Plasmid oder Vektor verwendet werden, solange es/er in dem Wirt replizierbar und entwicklungsfähig ist.
Die entsprechende DNA-Sequenz kann in den Vektor über eine Vielzahl von Prozeduren insertiert werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz in entsprechende Stellen von Restriktionsendonukleasen über in dem Fachgebiet bekannte Prozeduren insertiert. Solche Prozeduren und andere gelten für den Fachmann als in dem Schutzumfang. Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist mit (einer) entsprechenden Expressionskontrollsequenz (en) (Promotor) operativ verknüpft, um die mRNA-Synthese zu dirigieren. Repräsentative Beispiele für solche Promotoren schließen den LTR- oder den SV40-Promotor, den E. coli lac oder trp, den Page lambda P sub L Promotor und andere Promotoren ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt, die bekanntlich die Expression von Genen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder ihren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor schließt ferner eine Ribosom-Bindungsstelle für die Translationsinitiierung und einen Transkriptionsterminator ein. Der Vektor kann ferner entsprechende Sequenzen zur Amplifizierung der Expression einschließen. Zusätzlich enthalten die Expresionsvektoren vorzugsweise ein Gen, um eine Phänotypmerkmal für die Auswahl von transfizierten Wirtszellen, wie z. B. Dihydrofolatreductase- oder Neomycinresistenz für eine eukaryotische Zellkultur oder wie z. B. Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz in E. coli bereitzustellen.
Der Vektor, der die wie hierin vorstehend beschriebene entsprechende DNA-Sequenz als auch eine entsprechende Promotor- oder Kontrollsequenz enthält, kann verwendet werden, um einen entsprechenden Wirt zu transfizieren, damit dem Wirt die Expression des Proteins gestattet wird. Als repräsentative Beispiele für entsprechende Wirte können folgende genannt werden: bakterielle Zellen, wie z. B. E. coli, Salmonella typhimurium; Streptomyces sp; mykotische Zellen, wie z. B. Hefe; Insektenzellen, wie z. B. Drosophila und Sf9; tierische Zellen, wie z. B. CHO, COS oder Bowes Melanom; pflanzliche Zellen, usw. Die Auswahl eines entsprechenden Wirts gilt für den Fachmann aus der hierin bereitgestellten Lehre als in dem Schutzumfang.
Im Besonderen schließt die vorliegende Erfindung ferner rekombinante Konstrukte ein, die eine oder mehrere der wie vorstehend breit beschriebenen Sequenzen umfassen. Die Konstrukte umfassen einen Vektor, wie z. B. einen Plasmid- oder viralen Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung in einer vorwärts oder rückwärts Ausrichtung insertiert worden ist. Bei einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt ferner regulatorische Sequenzen, die zum Beispiel einen Promotor einschließen, der operativ mit der Sequenz verknüpft ist. Eine große Anzahl an geeigneten Vektoren und Promotoren ist dem Fachmann bekannt und im Handel erhältlich. Die folgenden Vektoren werden beispielhaft bereitgestellt. Bakterielle: pINCY (Incyte Pharmaceuticals Inc., Palo Alto, CA), pSPORT1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) pBs, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eukaryotische: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), PSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Jedoch kann ein beliebiges weiteres Plasmid oder Vektor verwendet werden, solange es/er in dem Wirt replizierbar und entwicklungsfähig ist.
Das Plasmid pINCY ist im Allgemeinen mit dem Plasmid pSPORT1 (erhältlich von Life Technologies, Gaithersburg, MD) mit der Ausnahme identisch, dass es zwei Modifikationen in dem Polylinker (mehrfache Klonierungsstelle) besitzt. Diese Modifikationen sind (1) eine fehlende HindIII-Restriktionsstelle und (2) dessen EcoRI-Restriktionsstelle befindet sich an einer verschiedenen Position. Der pINCY wird aus pSPORT1 über Spaltung von pSPORT1 mit sowohl HindIII als auch EcoRI und Austausch des ausgeschnittenen Fragments von dem Polylinker mit synthetischen DNA-Fragmenten (Sequenz-Identifikationsnummer 6 und Sequenz-Identifikationsnummer 7) erzeugt. Diese Austausch kann auf eine beliebige Art und Weise vorgenommen werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt ist. Zum Beispiel können die beiden Nukleotidsequenzen, die Sequenz-Identifikationsnummer 6 und Sequenz-Identifikationsnummer 7, synthetisch mit 5'-terminalen Phosphaten erzeugt, miteinander vermischt und danach unter standardmäßigen Bedingungen zur Durchführung von Ligationen mit versetzten Enden in das mit HindIII und EcoRI geschnittene pSPORT1-Plasmid ligiert werden. Geeignete Wirtszellen (wie z. B. E. coli DH5a Zellen) werden danach mit der ligierten DNA transfiziert und rekombinante Klone werden für die Ampicillinresistenz ausgewählt. Die Plasmid-DNA wird danach aus einzelnen Klonen hergestellt und einer Restriktionsenzymanalyse oder DNA-Sequenzierung unterzogen, damit das Vorhandensein von Insertionssequenzen in der passenden Ausrichtung bestätigt wird. Andere dem Durchschnittsfachmann bekannte Klonierungsstrategien können ebenfalls verwendet werden.
Die Promotorregionen können aus einem beliebigen gewünschten Gen unter Verwendung von CAT (Chloramphenicol-Transferase) Vektoren oder anderen Vektoren mit wählbaren Markern ausgewählt werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Bestimmte benannte bakterielle Promotoren schließen lacI, lacZ, T3, SP6, T7, gpt, lambda P sub R, P sub L und trp ein. Eukaryotische Promotoren schließen Cytomegalovirus (CMV) Immediate Early, Herpes Simplex Virus (HSV) Thymidin-Kinase, Early und Late SV40, LTRs aus Retroviren und murines Metallothionein-I ein. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors liegt ohne weiteres in dem Können des Durchschnittsfachmannes.
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Wirtszellen bereit, die das vorstehend beschriebene Konstrukt enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryotische Zelle, wie z. B. eine Säugetierzelle, oder eine niedere eukaryotische Zelle sein, wie z. B. eine Hefezelle, oder die Wirtszelle kann eine prokaryotische Zelle sein, wie z. B. eine bakterielle Zelle. Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle kann über Calciumphosphat-Transfektion, über DEAE-Dextran vermittelte Transfektion oder Elektroporation bewirkt werden (L. Davis et al., "Basic Methods in Molecular Biology", 2. Ausgabe, Appleton und Lang, Paramount Publishing, East Norwalk, CT (1994).
Die Konstrukte in Wirtszellen können auf eine herkömmliche Art und Weise verwendet werden, um das Genprodukt herzustellen, das von der rekombinanten Sequenz kodiert wird. Alternativ dazu können die Polypeptide der Erfindung über herkömmliche Peptid-Synthetisatoren synthetisch hergestellt werden.
Die rekombinanten Proteine können in Säugetierzellen, Hefe-, Bakterien- oder anderen Zellen unter Kontrolle der entsprechenden Promotoren exprimiert werden. Zell-freie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs herzustellen, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit prokaryotischen und eukaryotischen Wirten sind von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, (Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) beschrieben.
Die Transkription von DNA, die das Polypeptid (die Polypeptide) der vorliegenden Erfindung kodiert, durch höhere Eukaryoten wird durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer stellen cis-wirkende Elemente von DNA dar, gewöhnlich von etwa 10 bis 300 Bp, die auf einen Promotor wirken, um dessen Transkription zu steigern. Beispiele schließen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (Bp 100 bis 270), einen Cytomegalovirus frühen Promotor-Enhancer, einen Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer ein.
Im Allgemeinen schließen rekombinante Expressionsvektoren Ursprünge der Replikation und wählbare Marker, die die Transfektion der Wirtszelle gestatten, z. B. das Ampicillinresistenzgen von E. coli und S. cerevisiae TRP1-Gen, und einem Promotor ein, der von einem hochexprimierten Gen abgeleitet ist, um die Transkription einer strukturellen Sequenz stromabwärts zu dirigieren. Solche Promotoren können von Operonen abgeleitet werden, die glycolytische Enzyme, wie z. B. 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), Alpha Faktor, saure Phosphatase, oder Hitzeschockproteine unter anderen kodieren. Die heterologe strukturelle Sequenz wird in einer passenden Phase mit Sequenzen der Translationsinitiierung und -terminierung und vorzugsweise einer Führungssequenz zusammengestellt, die in der Lage ist, die Sekretion von translatiertem Protein in den periplasmatischen Spalt oder das extrazelluläre Medium zu dirigieren. Wahlweise kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein kodieren, das ein N-terminales Identifikationspeptid einschließt, wobei gewünschte Charakteristika verliehen werden, wie z. B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Nützliche Expressionsvektoren für eine bakterielle Verwendung werden konstruiert, indem eine strukturelle DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein kodiert, zusammen mit geeigneten Signalen für die Translationsinitiierung und -terminierung in eine aktive Lesephase mit einem funktionellen Promotor insertiert werden. Der Vektor umfasst einen oder mehrere phänotype wählbare Marker und einen Ursprung der Replikation, um die Aufrechterhaltung des Vektors sicherzustellen und, falls erwünscht, für die Amplifizierung in dem Wirt zu- sorgen. Geeignete prokaryotische Wirte für die Transfektion schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies in der Gattung Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl andere ebenfalls als eine routinemäßige Materie der Wahl verwendet werden können.
Nützliche Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung umfassen einen wählbaren Marker und einen bakteriellen Ursprung der Replikation, der aus Plasmiden abgeleitet ist, die genetische Elemente des wohl bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Andere Vektoren schließen PKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI) ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Diese pBR322 "Grundgerüst"-Abschnitte werden mit einem passenden Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert.
Nach der Transfektion eines geeigneten Wirts und Anzucht des Wirts auf eine angemessene Zelldichte, wird der ausgewählte Promotor über angemessene Mittel (z. B. Temperaturverschiebung oder chemische Induktion) unterdrückt und die Zellen werden für eine zusätzliche Zeitspanne kultiviert. Die Zellen werden typischerweise über Zentrifugierung geerntet, über physikalische oder chemische Mittel zerstört und der resultierende Rohextrakt wird für eine weitere Reinigung aufbewahrt. Die bei der Expression von Proteinen verwendeten mikrobiellen Zellen können über ein beliebiges bequemes Verfahren, einschließlich der Durchführung von Einfrier-Auftau-Zyklen, Ultraschallbehandlung, mechanische Zerstörung oder die Verwendung von Zell-lysierenden Mitteln, zerstört werden; solche Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt.
Verschiedene Kultursysteme aus Säugetierzellen können ferner verwendet werden, um ein rekombinantes Protein zu exprimieren. Beispiele für Säugetier-Expressionssysteme schließen die COS-7-Linien von Affennieren-Fibroblasten, beschrieben von Gluzman, Cell 23: 175 (1981), und weitere Zelllinien ein, die in der Lage sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, wie z. B. die Zelllinien C127, HEK-293, 3T3, CHO, HeLa und BHK. Säugetier-Expressionsvektoren umfassen einen Ursprung der Replikation, einen geeigneten Promotor und Enhancer und ferner beliebige erforderliche Ribosom-Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Splice-Donor- und Akzeptorstellen, transkriptionale Terminierungssequenzen und 5'-flankierende nicht: transkribierte Sequenzen. Die von dem SV40-viralen Genom abgeleiteten DNA-Sequenzen, zum Beispiel SV40-Ursprungs-, frühe Promotor-, Enhancer-, Splice- und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die notwendigen nicht transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen. Repräsentative nützliche Vektoren schließen pRc/CMV und pcDNA3 ein (erhältlich von Invitrogen, San Diego, CA).
Die BS106-Polypeptide werden aus rekombinanten Zellkulturen über bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt, einschließlich Affinitätschromatographie, Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, saure Extraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Hydroxyapatitchromatographie oder Lectinchromatographie. Es ist bevorzugt, dass geringe Konzentrationen (ungefähr 0,1-5 mM) an Calciumionen während der Reinigung vorliegen (Price, et al., J. Biol. Chem. 244: 917 (1969)). Protein-Rückfaltungsschritte können bei der Vervollständigung der Konfiguration des Polypeptids je nach Bedarf verwendet werden. Schließlich kann die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) für die abschließenden Reinigungsschritte verwendet werden.
Somit können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung auf natürliche Weise gereinigte Produkte, die von einer hochexprimierenden Zelllinie exprimiert wurden, oder ein Produkt von chemisch-synthetischen Prozeduren sein oder über rekombinante Techniken aus einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt (zum Beispiel Zellen von Bakterien, Hefen, höheren Pflanzen, Insekten und Säugetieren in Kultur) hergestellt werden. In Abhängigkeit von dem Wirt, der bei einer rekombinanten Herstellungsprozedur verwendet wird, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit Säugetier- oder anderen eukaryotischen Kohlenhydraten glycosyliert oder nicht-glycosyliert werden. Die Polypeptide der Erfindung können ferner einen anfänglichen Methionin-Aminosäurerest einschließen.
Die Startplasmide können aus verfügbaren Plasmiden in Übereinstimmung mit veröffentlichten, bekannten Prozeduren konstruiert werden. Zusätzlich sind zu den beschriebenen Plasmiden äquivalente Plasmide in dem Fachgebiet bekannt und dem Durchschnittsfachmann ersichtlich.
Das Folgende ist die allgemeine Prozedur für die Isolierung und Analyse von cDNA-Klonen. In einer besonderen hierin offenbarten Ausführungsform wurde die mRNA aus Brustgewebe isoliert und für die Erzeugung der cDNA-Bibliothek verwendet. Das Brustgewebe wurde aus Patienten über chirurgische Resektion erhalten und von einem Pathologen als Tumor oder Nicht-Tumorgewebe klassifiziert.
Die cDNA-Insertionen aus zufälligen Isolaten der Brustgewebe-Bibliotheken wurden teilweise sequenziert, im Detail analysiert, wie in den Beispielen dargelegt ist und in dem Sequenzprotokoll als Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2 und Sequenz-Identifikationsnummer 3 offenbart sind. Die Konsensussequenz dieser Insertionen ist als Sequenz-Identifikationsnummer 4 dargestellt. Diese Polynukleotide können einem gesamten offenen Leserahmen mit oder ohne assoziierte regulatorische Sequenzen für ein bestimmtes Gen enthalten, oder sie können nur einen Teil des Gens von Interesse kodieren. Dies wird der Tatsache zugeschrieben, dass viele Gene mit einer Länge von mehreren Hundert und manchmal mehreren Tausend Basen vorliegen und mit der gegenwärtigen Technologie auf Grund von Vektor-Einschränkungen, unvollständiger reverser Transkription des ersten Stranges oder unvollständiger Replikation des zweiten Stranges nicht in ihrer Gesamtheit kloniert werden können. Zusammenhängende sekundäre Klone, die zusätzliche Nukleotidsequenzen enthalten, können unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Verfahren für die DNA-Sequenzierung sind in dem Fachgebiet wohl bekannt. Herkömmliche enzymatische Verfahren verwenden eine DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, Sequenase (US Biochemical Corp, Cleveland, OH) oder Taq-Polymerase, um DNA-Ketten von einem Oligonukleotidprimer zu verlängern, das an das DNA-Templat von Interesse gehängt ist. Verfahren wurden bereits für die Verwendung von sowohl einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Templaten entwickelt. Die Reaktionsprodukte der Kettenterminierung können auf Gelen aus Harnstoff/Polyacrylamid elektrophoresiert werden und entweder über Autoradiographie (für Radionukleotid-markierte Vorläufer) oder über Fluoreszenz (für Fluoreszenz-markierte Vorläufer) detektiert werden. Neueste Verbesserungen bei der mechanisierten Reaktionsvorbereitung, Sequenzierung und Analyse unter Verwendung des fluoreszenten Detektionsverfahrens haben die Ausweitung bei der Anzahl von Sequenzen gestattet, die unter Verwendung von Maschinen, wie z. B. die Applied Biosystems 377 DNA Sequenzierer (Applied Biosystems, Foster City, CA), pro Tag bestimmt werden können.
Der Leserahmen der Nukleotidsequenz kann über verschiedene Arten von Analysen sichergestellt werden. Zunächst können Leserahmen, die in der kodierenden Sequenz enthalten sind, auf das Vorhandensein des Start-Kodons ATG und des Stopp-Kodons TGA, TAA oder TAG analysiert werden. Typischerweise setzt sich ein Leserahmen über den größten Teil einer cDNA-Sequenz fort, während andere Leserahmen dazu neigen, zahlreiche Stopp-Kodons zu enthalten. In solchen Fällen erfolgt die Leserahmen Bestimmung- direkt. Bei anderen schwierigeren Fällen ist eine weitere Analyse erforderlich.
Algorithmen sind bereits erstellt worden, um das Auftreten von einzelnen Nukleotidbasen an jedem mutmaßlichen Kodontriplett zu analysieren. Siehe zum Beispiel J. W. Fickett, Nuc. Acids Res. 10: 5303 (1982). Kodierende DNA für bestimmte Organismen (Bakterien, Pflanzen und Tiere) neigt dazu, bestimmte Nukleotide in bestimmten Triplett-Periodizitäten zu enthalten, wie z. B. eine signifikante Präferenz für Pyrimidine in der dritten Kodonposition. Diese Präferenzen sind bereits in breit verbreitet erhältlicher Software aufgenommen worden, die für die Bestimmung des Kodierungspotenzials (unter Rahmens) einen gegebenen Strecke von DNA verwendet werden kann. Die von dem Algorithmus abgeleitete Information, die mit Start-/Stopp-Kodoninformation kombiniert ist, kann für die Bestimmung eines geeigneten Rahmens mit einem hohen Grad an Sicherheit verwendet werden. Dies wiederum gestattet ohne weiteres die Klonierung der Sequenz in dem richtigen Leserahmen in entsprechende Expressionsvektoren.
Die hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen können mit einer Vielzahl von anderen Polynukleotidsequenzen und Vektoren von Interesse mittels wohl etablierter rekombinanter DNA-Techniken verknüpft werden. Siehe J. Sambrook et al., vorstehend. Die Vektoren von Interesse schließen Klonierungsvektoren ein, wie z. B. Plasmide, Kosmide, Phagenderivate, Phagemide als auch Sequenzierungs-, Replikations- und Expressionsvektoren und dergleichen. Im Allgemeinen enthalten solche Vektoren einen Ursprung der Replikation, der in mindestens einem Organismus, bequemen Verdaustellen für Restriktionsendonukleasen und wählbaren Markern, die für bestimmte Wirtszellen angemessen sind, funktional ist. Die Vektoren können über eine Vielzahl von Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, in geeignete Wirtszellen transferiert werden, die danach die gewünschte DNA, RNA oder Polypeptide erzeugen.
Gelegentlich maskieren Fehler der Sequenzierung oder der zufälligen reversen Transkription das Vorhandensein des angemessenen Leserahmens oder des regulatorischen Elements. Bei solchen Fällen ist es möglich, den richtigen Leserahmen zu bestimmen, indem die Expression des Polypeptids unternommen und die Aminosäure-Sequenz über standardmäßige Techniken für die Kartierung und Sequenzierung bestimmt wird. Siehe F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (1989). Zusätzlich kann der tatsächliche Leserahmen einer gegebenen Nukleotidsequenz über Transfektion von Wirtszellen mit Vektoren bestimmt werden, die alle drei möglichen Leserahmen enthalten. Nur diejenigen Zellen mit der Nukleotidsequenz in dem richtigen Leserahmen erzeugen ein Peptid mit der vorhergesagten Länge.
Die hierin bereitgestellten Nukleotidsequenzen sind bereits über gegenwärtige automatisierte Verfahren des Standes der Technik hergestellt worden und können als solche nicht identifizierte Nukleotide enthalten. Diese stellen für denjenigen Fachmann, der die Erfindung ausführen will, kein Problem dar. Mehrere Verfahren, die standardmäßige rekombinante Techniken verwenden, die in J. Sambrook (vorstehend) oder periodischen Aktualisierungen davon beschrieben sind, können für die Vervollständigung der fehlenden Sequenzinformation verwendet werden. Die gleichen Techniken, die verwendet werden, damit eine wie hierin beschriebene Sequenz mit vollständiger Länge erhalten wird, können verwendet werden, um die Nukleotidsequenzen zu erhalten.
Die Expression einer bestimmten cDNA kann durch Subklonieren der cDNA in einen angemessenen Expressionsvektor und Transfektieren dieses Vektors in einen angemessenen Expressionswirt bewerkstelligt werden. Der für die Erzeugung der BrustgewebecDNA-Bibliothek verwendete Klonierungsvektor kann zum Transkribieren von mRNA einer bestimmten cDNA verwendet werden, und enthält einen Promotor für Beta-galactosidase, ein Aminoterminales Met und die nachfolgenden sieben Aminosäuregruppen der Beta-galactosidase. Unmittelbar auf diese acht Gruppen folgen ein gezüchteter Bakteriophagenpromotor, der für das künstliche Priming und die Transkription nützlich ist, als auch eine Anzahl von einzigartigen Restriktionsstellen, einschließlich EcoRI, für die Klonierung. Der Vektor kann in einen angemessenen Wirtsstrang von E. coli transfiziert werden.
Die Einführung des isolierten bakteriellen Stranges mit Isopropylthiogalactosid (IPTG) unter Verwendung von standardmäßigen Verfahren erzeugt ein Fusionsprotein, das die ersten sieben Gruppen von Beta-galactosidase, etwa 15 Gruppen an Linker und das Peptid in der cDNA kodiert enthält. Da die cDNA-Kloninsertionen über einen im Wesentlichen zufälligen Prozess erzeugt werden, besteht eine Wahrscheinlichkeit von eins zu drei, dass die beinhaltete cDNA in dem richtigen Rahmen für die passende Translation liegt. Wenn sich die cDNA nicht in dem passenden Leserahmen befindet, kann der richtige Rahmen über Deletion oder Insertion einer entsprechenden Anzahl von Basen über wohl bekannte Verfahren bezogen werden, einschließlich in vitro Mutagenese, Verdau mit Exonuklease III oder Mungbohnen-Nuklease, oder Oligonukleotidlinker-Einschluss.
Die cDNA kann in andere Vektoren, von denen bekannt ist, dass sie für die Expression von Proteinen in spezifischen Wirten nützlich sind, eingeschleust werden. Die Oligonukleotidprimer, die Klonierungsstellen und Segmente von DNA enthalten, die für die Hybridisierung an Strecken an beiden Enden der Ziel-cDNA ausreichend sind, können chemisch über standardmäßige Verfahren synthetisiert werden. Diese Primer können danach verwendet werden, um die gewünschten Gensegmente über die PCR zu amplifizieren. Die resultierenden neuen Gensegmente können mit entsprechenden Restriktionsenzymen unter standardmäßigen Bedingungen verdaut und über Gelelektrophorese isoliert werden. Alternativ dazu können ähnliche Gensegmente über Verdau der cDNA mit entsprechenden Restriktionsenzymen und Füllen der fehlenden Gensegmente mit chemisch synthetisierten Oligonukleotiden erzeugt werden. Die Segmente der kodierenden Sequenz aus mehr als einem Gen können zusammen ligiert und in entsprechenden Vektoren geklont werden, um die Expression der rekombinanten. Sequenz zu optimieren.
Geeignete Expressionswirte- für solche chimären Moleküle schließen Säugetierzellen, wie z. B. Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) und menschliche embryonische Nierenzellen (HEK) 293, Insektenzellen, wie z. B. Sf9-Zellen, Hefezellen, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae, und Bakterien, wie z. B. E. coli ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Für jede dieser Zellsysteme kann eine nützlicher Expressionsvektor ferner einen Ursprung der Replikation einschließen, um die Propagierung in Bakterien zu gestatten, und einen wählbaren Marker, wie z. B. das Beta-Lactamase-Antibiotika-Resistenzgen, um eine Selektion in Bakterien zu gestatten. Zusätzlich können die Vektoren einen zweiten wählbaren Marker einschließen, wie z. B. das Neomycin-Phosphotransferasegen, um die Selektion in transfizierten eukaryotischen Wirtszellen zu gestatten. Die Vektoren für die Verwendung in eukaryotischen Expressionswirten können die Addition eines 3'-Poly-A-Schwanzes erfordern, wenn es der Sequenz von Interesse an poly A fehlt.
Zusätzlich kann der Vektor Promotoren oder Enhancer beinhalten, die die Genexpression steigern. Solche Promotoren sind Wirtsspezifisch und schließen MMTV-, SV40- oder Metallothionin-Promotoren für CHO-Zellen; trp-, lac-, tac- oder T7-Promotoren für bakterielle Wirte; oder Alpha Faktor-, Alkoholoxidase- oder PGH-Promotoren für Hefe ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Die adenoviralen Vektoren mit oder ohne Transkriptionsenhancern, wie z. B. der Rous-Sarkom-Virus (RSV) Enhancer, können verwendet werden, um die Proteinexpression in säugetierischen Zelllinien anzutreiben. Sobald homogene Kulturen an rekombinanten Zellen erhalten werden, können große Mengen an rekombinant erzeugtem Protein aus dem konditionierten Medium gewonnen und unter Verwendung von in dem Fachgebiet wohl bekannten chromatographischen Verfahren analysiert werden. Ein alternatives Verfahren für die Herstellung von großen Mengen an sezerniertem Protein beinhaltet die Transfektion von Säugetierembryonen und die Gewinnung des rekombinanten Proteins aus Milch, die von transgenen Kühen, Ziegen, Schafen, usw., hergestellt wird. Polypeptide und eng verwandte Moleküle können rekombinant auf eine solche Art und Weise exprimiert werden, um die Proteinreinigung zu erleichtern. Ein Ansatz beinhaltet die Expression eines chimären Proteins, das eine oder mehrere zusätzliche Polypeptiddomänen einschließt, die auf menschlichen Polypeptiden nicht natürlich vorkommen. Solche die Reinigung vereinfachenden Domänen schließen Metall-chelatisierende Peptide, wie z. B. Histidin-Tryptophan-Domänen, die eine Reinigung auf immobilisierten Metallen gestatten, Protein A Domänen, die eine Reinigung auf immobilisiertem Immunoglobulin gestatten, und die in dem FLAGS Extensions-/Affinitätsreinigungssystem (Immunex Corp, Seattle, WA) verwendete Domäne ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Der Einschluss einer abspaltbaren Linkersequenz, wie z. B. Faktor XA oder Enterokinase von Invitrogen (San Diego, CA) zwischen der Polypeptidsequenz und der Reinigungsdomäne, kann für die Gewinnung des Polypeptids nützlich sein.
Immunoassays
Die BS106-Polypeptide, einschließlich Fragmente, Derivate und Analoge davon, oder solche Polypeptide exprimierende Zellen können bei einer Vielzahl von Assays, von denen viele hierin beschrieben sind, für die Detektion von Antikörpern gegen Brustgewebe verwendet werden. Sie können ferner als Immunogene zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Diese Antikörper können zum Beispiel polyklonale oder monoklonale Antikörper, chimäre, einkettige und humanisierte Antikörper als auch Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsbibliothek sein. Verschiedene in dem Fachgebiet bekannte Prozeduren können für die Herstellung von solchen Antikörpern und Fragmenten verwendet werden.
Zum Beispiel können Antikörper, die gegen ein Polypeptid erzeugt werden, das eine Sequenz der vorliegenden Erfindung umfasst, über die direkte Injizierung des Polypeptids in ein Tier oder durch Verabreichung des Polypeptids an ein Tier, wie z. B. eine Maus, Kaninchen, Ziege oder Mensch, erhalten werden. Eine Maus, ein Kaninchen oder eine Ziege sind bevorzugt. Das Polypeptid wird gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon. Der so erhaltene Antikörper bindet danach das Polypeptid selbst. Auf diese Art und Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment des Polypeptids kodiert, für die Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die das native Polypeptid binden. Solche Antikörper können danach verwendet werden, um das Polypeptid aus Testproben zu isolieren, wie z. B. Gewebe, von dem vermutet wird, dass es dieses Polypeptid enthält. Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern kann eine beliebige Technik verwendet werden, die Antikörper bereitstellt, die von kontinuierlichen Zelllinienkulturen hergestellt wurden. Beispiele schließen die Hybridoma-Technik, wie von Kohler und Milstein, Nature 256: 495-497 (1975) beschrieben, die Trioma-Technik, die menschliche B-Zellen-Hybridoma-Technik, wie von Kozbor et al., Immun. Today 4: 72 (1983) beschrieben ist, und die EBV-Hybridoma-Technik für die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern, wie von Cole et al., in: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., New York, NY, S. 77-96 (1985) beschrieben ist. Für die Herstellung von einkettigen Antikörpern beschriebene Techniken können angepasst werden, um einkettige Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu erzeugen. Siehe zum Beispiel das US-Patent Nr. 4,946,778 .
Verschiedene Assayformate können die Antikörpern der vorliegenden Erfindung, einschließlich "Sandwich"-Immunoassays und Sondenassays, verwenden. Zum Beispiel können die Antikörper der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon in verschiedenen Assaysystemen verwendet werden, um das Vorhandensein, falls überhaupt, von BS106-Antigen in einer Testprobe zu bestimmen. Zum Beispiel wird bei einem ersten Assayformat ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper oder Fragment davon oder eine Kombination dieser Antikörper, die auf eine feste Phase aufgebracht wurden, mit einer Testprobe in Kontakt gebracht, um ein erstes Gemisch zu bilden. Dieses erste Gemisch wird für eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Antigen/Antikörperkomplexen ausreichend sind. Danach wird ein Indikatorreagenz, das einen monoklonalen oder ein polyklonalen Antikörper oder ein Fragment davon oder eine Kombination von diesen Antikörpern umfasst, an die eine Signal-erzeugende Verbindung gebunden worden ist, mit den Antigen/Antikörper-Komplexen in Kontakt gebracht, um ein zweites Gemisch zu bilden. Dieses zweite Gemisch wird danach für eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexen ausreichend sind. Das Vorhandensein von BS106-Antigen in der Testprobe und der Einfang an der festen Phase, falls überhaupt, wird über Detektion des messbaren Signals bestimmt, das von der Signal-erzeugenden Verbindung erzeugt wird. Die Menge an BS106-Antigen, die in der Testprobe vorhanden ist, ist zu dem erzeugten Signal proportional.
Bei einem alternativen Assayformat wird ein Gemisch durch In-Kontakt-Bringen von folgendem gebildet: (1) ein polyklonaler Antikörper, monoklonaler Antikörper oder Fragment davon, die spezifisch an das BS106-Antigen binden, oder eine Kombination von solchen Antikörpern, gebunden an einen festen Träger; (2) die Testprobe; und (3) ein Indikatorreagenz, das einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper oder Fragment davon umfasst, die spezifisch an ein verschiedenes BS106-Antigen (oder eine Kombination von diesen Antikörpern) binden, an die eine Signal-erzeugende Verbindung gebunden ist. Dieses Gemisch wird für eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexen ausreichend sind. Das Vorhandensein, falls überhaupt, von BS106-Antigen, das in der Testprobe vorhanden ist und an der festen Phase eingefangen wurde, wird über Detektion des messbaren Signals bestimmt, das von der Signal-erzeugenden Verbindungen erzeugt wird. Die Menge an BS106-Antigen, die in der Testprobe vorhanden ist, ist zu dem erzeugten Signal proportional.
In einem weiteren Assayformat kann ein oder eine Kombination von mindestens zwei monoklonalen Antikörpern der Erfindung als eine kompetitive Sonde für die Detektion von Antikörpern gegen das BS106-Antigen verwendet werden. Zum Beispiel werden BS106-Polypeptide, wie z. B. die hierin offenbarten rekombinanten Antigene, entweder allein oder in Kombination auf eine feste Phase aufgebracht. Eine Testprobe, von der vermutet wird, dass sie Antikörper gegen das BS106-Antigen enthält, wird danach mit einem Indikatorreagenz, das eine Signal-erzeugende Verbindung umfasst, und mindestens einem monoklonalen Antikörper der Erfindung für eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen ausreichend sind, wobei entweder die Testprobe und das Indikatorreagenz an die feste Phase gebunden sind oder das Indikatorreagenz an die feste Phase gebunden ist. Die Verringerung bei der Bindung des monoklonalen Antikörpers an die feste Phase kann quantitativ gemessen werden.
In einem noch weiteren Detektionsverfahren kann jeder der monoklonalen oder polyklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung bei der Detektion von BS106-Antigenen in Gewebeabschnitten als auch in Zellen über immunohistochemische Analyse verwendet werden. Die cytochemische Analyse, bei der diese Antikörper direkt (mit zum Beispiel Fluorescein, kolloidalem Gold, Meerretich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, usw.) markiert sind oder unter Verwendung von sekundär markierten Anti-Spezies-Antikörpern (mit verschiedenen Markern, wie hierin beispielhaft dargestellt) markiert sind, um die Histopathologie einer Erkrankung zu verfolgen, befinden sich ebenfalls in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Außerdem können diese monoklonalen Antikörper an Matrizen, ähnlich zu CNBr-aktivierter Sepharose, gebunden und für die Affinitätsreinigung von spezifischen BS106-Polypeptiden aus Zellkulturen oder biologischen Geweben, wie z. B. für die Reinigung von rekombinanten und nativen BS106-Proteinen, verwendet werden.
Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können ferner für die Erzeugung von chimären Antikörpern zur therapeutischen Verwendung oder anderen ähnlichen Anwendungen verwendet werden.
Die monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon können einzeln bereitgestellt werden, um BS106-Antigene zu detektieren. Kombinationen der hierin bereitgestellten monoklonalen Antikörper (und Fragmente davon) können ferner zusammen als Komponenten in einem Gemisch oder "Cocktail" aus mindestens einem BS106-Antikörper der Erfindung zusammen mit Antikörpern verwendet werden, die spezifisch an weitere BS106-Regionen binden, wobei jeder Antikörper über verschiedene Bindungsspezifitäten verfügt. Somit kann dieser Cocktail die monoklonalen Antikörper der Erfindung einschließen, die gegen hierin offenbarte BS106-Polypeptide und weitere monoklonale Antikörper gerichtet sind, die für andere antigene Determinanten von BS106-Antigenen oder anderen verwandten Proteinen spezifisch sind.
Der polyklonale Antikörper oder Fragment davon, die bei den Assayformaten verwendet werden können, sollten spezifisch an ein BS106-Polypeptid oder an weitere BS106-Polypeptide, die bei dem Assay zusätzlich verwendet werden, binden. Der vorzugsweise verwendete polyklonale Antikörper stammt aus einem Säugetier, wie z. B. ein polyklonaler Antikörper aus Mensch, Ziege, Kaninchen oder Schaf, der das BS106-Polypeptid bindet. Am stärksten bevorzugt stammt der polyklonale Antikörper aus Kaninchen. Die bei den Assays verwendeten polyklonalen Antikörper können entweder allein oder als ein Cocktail aus polyklonalen Antikörpern verwendet werden. Da die Cocktails, die bei den Assayformaten verwendet werden, entweder monoklonale Antikörper oder polyklonale Antikörper mit einer unterschiedlichen Bindungsspezifität gegenüber BS106-Polypeptiden umfassen, sind sie zum Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder zum Bestimmen der Prädisposition gegenüber Erkrankungen und Zuständen der Brust, wie z. B. Brustkrebs, nützlich.
Es ist vorgesehen und in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, dass das BS106-Antigen in Assays durch die Verwendung eines rekombinanten Antigens als auch durch die Verwendung eines synthetischen Peptids oder gereinigten Peptids detektierbar sein kann, wobei das Peptid eine Aminosäure-Sequenz von BS106 umfasst. Die Aminosäure-Sequenz eines solchen Polypeptids wird gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon. Es liegt ebenfalls in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, dass verschiedene synthetische, rekombinante oder gereinigte Peptide, die verschiedene Epitope von BS106 identifizieren, in Kombination in einem Assay zum Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder zum Bestimmen der Prädisposition gegenüber Erkrankungen und Zuständen der Brust, wie z. B. Brustkrebs, verwendet werden können. In diesem Fall können sämtliche dieser Peptide auf eine feste Phase aufgebracht werden; oder jedes getrennte Peptid kann auf getrennte feste Phasen, wie z. B. Mikroteilchen, aufgebracht und danach zur Bildung eines Gemisches aus Peptiden kombiniert werden, das später bei Assays verwendet werden kann. Außerdem ist es vorgesehen, dass mehrere Peptide, die Epitope von verschiedenen Antigenen definieren, zum Detektieren, Diagnostizieren, Einstufen, Beobachten, Prognostizieren oder zum Bestimmen der Prädisposition gegenüber Erkrankungen und Zuständen der Brust, wie z. B. Brustkrebs, verwendet werden können. Peptide, die auf feste Phasen aufgetragen oder mit detektierbaren Markern markiert sind, wird danach gestattet, mit denjenigen, die in einer Patientenprobe (falls überhaupt) vorhanden sind, um eine eingeschränkte Menge an Antikörper zu konkurrieren. Eine Verringerung in der Bindung der synthetischen, rekombinanten oder gereinigten Peptide an den Antikörper (oder die Antikörper) ist ein Anzeichen für das Vorhandensein von BS106-Antigen in der Patientenprobe. Das Vorhandensein von BS106-Antigen zeigt das Vorhandensein einer Brustgewebe-Erkrankung, insbesondere Brust- krebs, in dem Patienten an. Variationen von Assayformaten sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und viele werden hierin nachstehend diskutiert.
In einem weiteren Assayformat kann das Vorhandensein von anti-BS106-Antikörper und/oder BS106-Antigen in einem simultanen Assay detektiert werden, wie folgt. Eine Testprobe wird gleichzeitig mit einem Einfangsreagenz eines ersten Analyten in Kontakt gebracht, wobei das erste Einfangsreagenz einen ersten Bindungsvertreter, spezifisch für einen ersten Analyten, an eine feste Phase gebunden, und ein Einfangsreagenz für einen zweiten Analyten umfasst, wobei das erste Einfangsreagenz einen ersten Bindungsvertreter für einen zweiten Analyten an eine zweite feste Phase gebunden umfasst, um dadurch ein Gemisch zu bilden. Dieses Gemisch wird für eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Komplexen aus Einfangreagenz/erster Analyt und Einfangsreagenz/zweiter Analyt ausreichend sind. Diese so gebildeten Komplexe werden danach mit einem Indikatorreagenz, das einen Vertreter eines Bindungspaares, spezifisch für den ersten Analyten, markiert mit einer Signal-erzeugenden Verbindung, umfasst, und mit einem Indikatorreagenz in Kontakt gebracht, das einen Vertreter eines Bindungspaares, spezifisch für den zweiten Analyten, markiert mit einer Signal-erzeugenden Verbindung, umfasst, um ein zweites Gemisch zu bilden. Dieses zweite Gemisch wird für eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die zur Bildung von Komplexen aus Einfangsreagenz/erster Analyt/Indikatorreagenz und Komplexen aus Einfangsreagenz/zweiter Analyt/Indikatorreagenz ausreichend sind. Das Vorhandensein von einem oder mehreren Analyten wird über Detektion eines Signals bestimmt, das in Verbindung mit den Komplexen, die an entweder einer oder an beiden festen Phasen gebildet werden, als ein Anzeichen für das Vorhandensein von einem oder mehreren Analyten in der Testprobe erzeugt wird. Bei diesem Assayformat können rekombinante Antigene, die von den hierin offenbarten Expressionssystemen abgeleitet sind, als auch monoklonale Antikörper verwendet werden, die aus den Proteinen hergestellt werden, die von den wie hierin offenbarten Expressionssystemen abgeleitet sind. Zum Beispiel kann bei diesem Assaysystem das BS106-Antigen der erste Analyt sein. Solche Assaysysteme sind in der EP Veröffentlichung Nr. 0473065 detaillierter beschrieben.
In noch weiteren Assayformaten können die hierin offenbarten Polypeptide verwendet werden, um das Vorhandensein von einem Antikörper gegen das BS106-Antigen in Testproben zu detektieren. Zum Beispiel wird eine Testprobe mit einer festen Phase inkubiert, an die mindestens ein Polypeptid, wie z. B. ein rekombinantes Protein oder synthetisches Peptid, gebunden worden ist. Das Polypeptid ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon. Diese werden für eine Zeit und unter Bedingungen zur Reaktion gebracht, die zur Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen ausreichend sind. Im Anschluss an die Inkubation wird der Antigen/Antikörper-Komplex detektiert. Indikatorreagenzien können verwendet werden, um in Abhängigkeit von dem gewählten Assaysystem die Detektion zu erleichtern. In einem weiteren Assayformat wird eine Testprobe mit einer festen Phase in Kontakt gebracht, an die ein wie hierin beschrieben hergestelltes rekombinantes Protein gebunden ist, und ferner mit einem für das Protein spezifischen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper in Kontakt gebracht, der vorzugsweise mit einem Indikatorreagenz markiert worden ist. Nach Inkubation für einen Zeit und unter Bedingungen, die zur Bildung von Antikörper/Antigen-Komplexen ausreichend sind, wird die feste Phase von der freien Phase getrennt und der Marker wird in entweder der festen oder der freien Phase als ein Anzeichen für das Vorhandensein von einem Antikörper gegen das BS106-Antigen detektiert. Weitere Assayformate, die die hierin offenbarten rekombinanten Antigene verwenden, sind vorgesehen. Diese schließen das In-Kontakt-Bringen einer Testprobe mit einer festen Phase ein, an die mindestens ein Antigen aus einer ersten Quelle gebunden worden ist, Inkubieren der festen Phase und der Testprobe für eine Zeit und unter Bedingungen, die zur Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen ausreichend sind, und danach In-Kontakt-Bringen der festen Phase mit einem markierten Antigen, wobei das Antigen von einer zweiten Quelle, die von der ersten Quelle verschieden ist, abgeleitet ist. Zum Beispiel wird ein rekombinantes Protein, von einer ersten Quelle, wie z. B. E. coli abgeleitet, als ein Einfangsantigen an einer festen Phase verwendet, eine Testprobe wird der so präparierten festen Phase zugegeben und nach einer standardmäßigen Inkubation und Waschungsschritten, wie erachtet oder erforderlich, wird ein rekombinantes Protein, das von einer verschiedenen Quelle abgeleitet ist (d. h. nicht E. coli), als ein Teil eines Indikatorreagenz verwendet, das anschließend detektiert wird. Gleichermaßen sind Kombinationen aus einem rekombinanten Antigen auf einer festen Phase und einem synthetischen Peptid in der Indikatorphase ebenfalls möglich. Ein beliebiges Assayformat, das ein für BS106 spezifisches Antigen, das aus einer ersten Quelle hergestellt oder abgeleitet ist, als das Einfangsantigen und ein für BS106 spezifisches Antigen aus einer verschiedenen zweiten Quelle verwendet, ist vorgesehen. Somit befinden sich verschiedene Kombinationen von rekombinanten Antigen als auch die Verwendung von synthetischen Peptiden, gereinigten Proteinen und dergleichen in dem Schutzumfang dieser Erfindung. Assays, wie z. B. dieser, und andere sind in dem US-Patent Nr. 5,254,458 beschrieben, der mit diesem einen gemeinsamen Inhaber teilt.
Weitere Ausführungsformen, die zahlreiche andere feste Phasen verwenden, sind ebenfalls vorgesehen und befinden sich in dem Schutzumfang dieser Erfindung. Zum Beispiel können Ioneneinfangsprozeduren zur Immobilisierung eines immobilisierbaren Reaktionskomplexes mit einem negativ geladenen Polymer (beschrieben in der EP-Veröffentlichung Nr. 0326100 und der EP-Veröffentlichung Nr. 0406473 ) gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine schnelle immunochemische Reaktion von Lösung-Phase zu bewirken. Ein immobilisierbarer Immunkomplex wird von dem Rest des Reaktionsgemisches über ionische Wechselwirkungen zwischen dem negativ geladenen Poly Anion/Immun-Komplex und der zuvor behandelten positiv geladenen porösen Matrix getrennt und unter Verwendung von verschiedenen zuvor beschriebenen Signal-erzeugenden Systemen detektiert, einschließlich derjenigen, die bei chemilumineszenten Signalmessungen beschrieben sind, wie in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0 273,115 beschrieben ist.
Ferner können die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in Systemen angepasst werden, die eine Mikroteilchen Technologie verwenden, einschließlich automatisierte und halbautomatisierte Systeme, in denen die feste Phase ein Mikroteilchen (magnetisch oder nicht magnetisch) umfasst. Solche Systeme schließen diejenigen ein, die zum Beispiel in den veröffentlichten EPO-Anmeldungen Nrn. EP 0 425 633 bzw. EP 0 424 634 beschrieben sind.
Die Verwendung von Raster-Sonden-Mikroskopie (SPM) für Immunoassays ist ebenfalls eine Technologie, der die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung ohne weiteres angepasst werden können. Bei der Raster-Sonden-Mikroskopie, insbesondere bei der Raster-Kraft-Mikroskopie, ist die Einfangsphase, zum Beispiel zumindest einer der monoklonalen Antikörper der Erfindung, an eine feste Phase angeheftet und ein Raster-Sonden-Mikroskop wird für die Detektion von Antigen/Antikörper-Komplexen verwendet, die an der Oberfläche der festen Phase vorhanden sein können. Die Verwendung von Raster-Tunnel-Mikroskopie beseitigt die Notwendigkeit nach Markern, die normalerweise bei vielen Immunoassaysystemen verwendet werden müssen, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu detektieren. Die Verwendung von SPM für die Verfolgung von spezifischen Bindungsreaktionen kann auf viele Arten erfolgen. In einer Ausführungsform ist ein Vertreter eines spezifischen Bindungspartners (Analyt-spezifische Substanz, die der monoklonale Antikörper der Erfindung ist) an eine zum Scannen geeignete Oberfläche gebunden. Die Anbindung der Analytspezifischen Substanz kann über Adsorption an ein Teststück, das eine feste Phase aus einer Kunststoff- oder Metalloberfläche umfasst, gefolgt von Verfahren erfolgen, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Oder eine kovalente Anbindung eines spezifischen Bindungspartners (Analytspezifische Substanz) an ein Test Stück, wobei das Teststück eine feste Phase aus derivatisiertem Kunststoff, Metall, Silizium oder Glas umfasst, kann verwendet werden. Die Verfahren zur kovalenten Anbindung sind dem Fachmann bekannt und schließen eine Vielzahl von Mitteln ein, um spezifische Bindungspartner mit dem Teststück irreversibel zu verknüpfen. Wenn das Teststück Silizium oder Glas ist, muss die Oberfläche vor der Anbindung des spezifischen Bindungspartners aktiviert werden. Ferner können Polyelektrolyt-Wechselwirkungen verwendet werden, um einen spezifischen Bindungspartner an einer Oberfläche eines Teststücks unter Verwendung von Techniken und Chemikalien zu immobilisieren. Das bevorzugte Verfahren der Anbindung ist über kovalente Wege. Nach der Anbindung eines spezifischen Bindungsvertreters kann die Oberfläche mit Materialien, wie z. B. Serum, Proteine oder andere Blockierungsmittel, zur Minimierung einer nicht spezifischen Bindung weiter behandelt werden. Die Oberfläche kann ferner entweder an der Stelle der Herstellung oder dem Punkt für die Verwendung gescannt werden, um ihre Eignung für Assayzwecke zu verifizieren. Der Scanprozess wird die spezifischen Bindungseigenschaften des Teststücks voraussichtlich nicht verändern.
Während die vorliegende Erfindung die Präferenz für die Verwendung von festen Phasen offenbart, ist es vorgesehen, dass die Reagenzien, wie z. B. Antikörper, Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung, in Assaysystemen ohne feste Phase verwendet werden können. Diese Assaysysteme sind dem Fachmann bekannt und werden als in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.
Es ist vorgesehen, dass das für den Assay verwendete Reagenz in Form eines Testkits mit einem oder mehreren Behältern, wie z. B. Fläschchen oder Gläschen, bereitgestellt werden kann, wobei jeder Behälter ein separates Reagenz enthält, wie z. B. eine Sonde, einen Primer, monoklonalen Antikörper oder ein Cocktail aus monoklonalen Antikörpern, oder ein Polypeptid (z. B. rekombinant, synthetisch hergestellt oder gereinigt), das in dem Assay verwendet wird. Das Polypeptid wird gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 und Fragmenten davon. Weitere Komponenten, wie z. B. Puffer, Kontrollen und dergleichen, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, können in solchen Testkits eingeschlossen sein. Es ist ferner vorgesehen, Testkits bereitzustellen, die über Mittel zum Sammeln von Testproben verfügen, umfassend zugängliche Körperflüssigkeiten, z. B. Blut, Urin, Speichel und Stuhl. Solche zum Sammeln nützliche Werkzeuge ("Sammelmaterialien") schließen Lanzetten und Saugpapier oder Stoff zum Sammeln und Stabilisieren von Blut; Tupfer zum Sammeln und Stabilisieren von Speichel; Becher zum Sammeln und Stabilisieren von Urin- oder Stuhlproben ein. Die Sammelmaterialien, wie z. B. Papier, Stoff, Tupfer, Becher und dergleichen können wahlweise behandelt sein, um eine Denaturierung oder irreversible Adsorption der Probe zu verhindern. Die Sammelmaterialien können auch mit Konservierungsmitteln, Stabilisatoren oder antimikrobiellen Mitteln behandelt sein oder diese enthalten, um bei der Erhaltung der Integrität der Proben zu helfen. Testkits, die für die Sammlung, Stabilisierung und Konservierung von Testproben ausgelegt sind, die über einen chirurgischen Eingriff oder Nadelbiopsie erhalten wurden, sind ebenfalls nützlich. Es ist vorgesehen, dass sämtliche Kits in zwei Komponenten konfiguriert sein können, die getrennt bereitgestellt werden können; eine Komponente für die Sammlung und den Transport der Probe und die andere Komponente für die Analyse der Probe. Die Sammelkomponente kann zum Beispiel dem Benutzer des offenen Marktes bereitgestellt werden, während die Komponenten für die Analyse anderen Benutzern, wie z. B. Laborpersonal, für die Bestimmung des Vorhandenseins, Fehlens oder der Menge eines Analyten bereitgestellt werden können. Ferner können Kits für die Sammlung, Stabilisierung und Konservierung der Testproben zur Verwendung durch ungeübtes Personal konfiguriert und auf dem offenen Markt für die private Verwendung mit einem anschließenden Transport in ein Labor zur Analyse der Testprobe erhältlich sein.
Das E. coli Bakterium (Klon 1662885) ist bei der American Type Culture Collection (A.T.C.C.), 12301 Parklaven Drive, Rockville, Maryland 20852, mit Datum 20-Nov-96, gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens, hinterlegt worden, und wird für einen Zeitraum von dreißig (30) Jahren ab dem Datum der Hinterlegung oder für fünf (5) Jahre nach der letzten Anfrage nach der Hinterlegung oder für die durchsetzbare Dauer des US-Patents aufbewahrt, je nachdem was länger dauert. Die Hinterlegung und ein beliebiges anderes hinterlegtes Material, das hierin beschrieben ist, werden ausschließlich der Bequemlichkeit wegen bereitgestellt und sind für die Ausführung der vorliegenden Erfindung angesichts der hierin bereitgestellten Lehre nicht erforderlich. Die cDNA-Sequenz in sämtlichen der hinterlegten Materialien ist hierin durch Bezugnahme aufgenommen. Dem Klon 1662885 wurde die A.T.C.C. Hinterlegungs-Nr. 98256 zugeteilt.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen beschrieben, die für die Erläuterung aber nicht für die Einschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind.
BEISPIELE
Beispiel 1: Identifizierung von BS106-Gen-spezifischen Klonen der Brustgewebe-Bibliothek
A. Bibliotheksvergleich von exprimierten Sequenzabschnitten (ESTs) oder Transkript-Abbildungen.
Teilsequenzen von cDNA-Kloninsertionen, sogenannte "exprimierte Sequenzabschnitte" (ESTs), wurden von cDNA-Bibliotheken abgeleitet, die aus Tumorgeweben der Brust, Nicht-Tumorgeweben der Brust und zahlreichen anderen Geweben, und zwar sowohl. Tumor als auch Nicht-Tumor, erstellt wurden, und in eine Datenbank (LIFESEQ^TM Datenbank, erhältlich von Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) als Gentranskript-Abbildungen eingegeben. Siehe die Internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/20681 . (Eine Transkript-Abbildung ist ein Protokoll der Anzahl von ESTs für jedes der dargestellten Gene in einer gegebenen Gewebe-Bibliothek. Die ESTs, die sich Regionen mit einer gegenseitigen Sequenzüberlappung teilen, werden in Clustern eingeordnet. Einem Cluster wird eine Klonnummer von einem repräsentativen 5'-EST zugewiesen. Oft kann ein Cluster von Interesse ausgeweitet werden, indem dessen Konsenssequenz mit Sequenzen von anderen ESTs verglichen wird, die die Kriterien für eine automatisierte Clusterung nicht erfüllt haben. Das Alignment von sämtlichen verfügbaren Clustern und einzelnen ESTs stellt ein Contig dar, von dem eine Konsenssequenz abgeleitet wird.) Die Transkript-Abbildungen werden danach ausgewertet, um die EST-Cluster zu identifizieren, die in erster Linie für die Brustgewebe-Bibliotheken repräsentativ waren. Diese Ziel-Cluster wurden danach gemäß ihrer Abundanz (Auftreten von EST-Vertretern) in den Ziel-Bibliotheken und ihrem Fehlen aus Hintergrundbibliotheken eingeordnet. Hochabundanten Clustern mit einem niedrigen Hintergrundauftreten wurde eine höhere Untersuchungspriorität gegeben. Die überlappenden Klone 1662885 (Sequenz-Identifikationsnummer 1), 893988 (Sequenz-Identifikationsnummer 2) und 1209814 (Sequenz-Identifikationsnummer 3) wurden für eine weitere Untersuchung identifiziert. Diese repräsentierten die minimale Anzahl an Klonen, die für die Bildung des BS106-Contigs erforderlich waren unter aus denen die hierin bereitgestellte Konsenssequenz (Sequenz-Identifikationsnummer 4) abgeleitet wurde.
B. Erzeugung einer Konsenssequenz.
Die Nukleotidsequenzen der EST-Klone, 1662885 (Sequenz-Identifikationsnummer 1), 893988 (Sequenz-Identifikationsnummer 2) und 1209814 (Sequenz-Identifikationsnummer 3), wurden in das Sequencher^TM Programm (erhältlich von Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) eingegeben, um ein Nukleotid-Alignment (Contig-Karte) zu erzeugen, und danach ihre Konsenssequenz (Sequenz-Identifikationsnummer 4) zu erzeugen. Die 1 zeigt das Nukleotidsequenz-Alignment von diesen Klonen und ihre resultierende Konsensus-Nukleotidsequenz (Sequenz-Identifikationsnummer 4). Die 2 stellt die Contig-Karte dar, die die Klone 1662885 (Sequenz-Identifikationsnummer 1), 893988 (Sequenz-Identifikationsnummer 2) und 1209814 (Sequenz-Identifikationsnummer 3), die überlappende Regionen des BS106-Gens bilden, und die resultierende Konsensus-Nukleotidsequenz (Sequenz-Identifikationsnummer 4) dieser Klone in einer grafischen Darstellung abbildet. Im Anschluss hierauf wurde eine 3-Rahmen-Translation an der Konsenssequenz (Sequenz-Identifikationsnummer 4) durchgeführt. Bei dem ersten Vorwärts-Rahmen wurde festgestellt, dass er einen offenen Leserahmen aufweist, der eine Aminosäure-Sequenz mit 90 Gruppen kodiert, die als Sequenz-Identifikationsnummer 16 dargestellt ist. Die 1 zeigt einen G/T-Polymorphismus an der Position 54 in der Konsensussequenz (als "K" angegeben); die entsprechenden zwei Nukleotide wurden mit einem ungefähr gleichen häufigen Vorkommen in der LIFESEQ^TM Datenbank festgestellt. Es wird angenommen, dass der Polymorphismus an der Position 54, die sich 10 Nukleotide stromaufwärts von einer Methionin-Gruppe (die potenzielle translationale Startstelle) befindet, bei der Regulierung des Expressionsniveaus dieses Proteins beteiligt sein kann. Die 1 zeigt ferner einen C/T-Polymorphismus an der Position 312 in der Konsensussequenz (als "Y" angegeben). Das Verhältnis von C's zu T's, das in der LIFESEQ^TM Datenbank an der Position 312 festgestellt wurde, war 3:1.
C. Spezifität der Expression von einer Konsensussequenz entsprechenden ESTs.
Die Konsensussequenz, die in dem vorstehenden Abschnitt B erzeugt wurde, wurde mit der gesamten aktualisierten LIFESEQ^TM Datenbank (September 1997) unter Verwendung des BLAST Suchprogramms verglichen. Die ESTs, die der Konsensussequenz entsprachen, wurden in 85,7 % (24 von 28) von Brust-Bibliotheken und 0,2 % (1 von 455) von Nicht-Brust-Bibliotheken gefunden. Deshalb wurde die Konsensussequenz oder Fragmente davon mehr als 389-mal häufiger in Brust- als in Nicht-Brustgeweben gefunden.
Beispiel 2: Sequenzierung von BS106-EST-spezifischen Klonen
Die DNA-Sequenz des Klons 1662885 (Sequenz-Identifikationsnummer 5), die den 5'-äußersten EST des BS106-Gen-Contigs umfasst, wurde unter Verwendung der Dideoxy-Terminationssequenzierung mit Farbterminatoren gemäß bekannten Verfahren bestimmt. (F. Sanger et al., PNAS U.S.A. 74:5463 (1977)). Ein A/G-Polymorphismus an der Position 543 bei der Sequenz-Identifikationsnummer 5 ist als "R" angegeben.
Da der pINCY-Vektor (Life Technologies, Gaithersburg, MD) universelle Priming-Stellen direkt benachbart zu den 3'- und 5'-Ligationsverbindungen der Insertionen enthält, wurden ungefähr 300 Basen der Insertion in beiden Richtungen unter Verwendung von universellen Primern, und zwar die Sequenz-Identifikationsnummer 8 und die Sequenz-Identifikationsnummer 9 sequenziert (New England Biolabs, Beverly, MA bzw. Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Die Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und die Sequenzen wurden über einen Applied Biosystems 377 Sequenzierer (erhältlich von Applied Biosystems, Foster City, CA) oder über ein anderes Sequenzierungsgerät bestimmt. Die zusätzlichen Sequenzierungsprimer, BS106.F1 und BS106.R1 (Sequenz-Identifikationsnummer 10 bzw. Sequenz-Identifikationsnummer 11) wurden aus einer Sequenz konstruiert, die über die anfänglichen Sequenzierungsreaktionen in der Nähe der 3'-Enden der beiden DNA-Stränge bestimmt wurde. Diese Primer wurden danach für die Bestimmung der restlichen DNA-Sequenz der klonierten Insertion aus jedem DNA-Strang verwendet, wie zuvor beschrieben wurde.
Beispiel 3: Nukleinsäure-Herstellung
A. RNA-Extraktion aus Gewebe.
Die totale RNA wurde aus festen Geweben oder Zellen der Brust und aus Nicht-Brustgeweben isoliert. Verschiedene Verfahren wurden verwendet, die die Lithiumchlorid/Harnstoff-Technik, die in dem Fachgebiet bekannt und beschrieben ist (Kato et al., J. Virol. 61:2182-2191, (1987)), Ultraspec^TM (Biotecx Laboratories, Inc., Houston Texas) und TRIzol^TM (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), einschließen aber nicht auf sie eingeschränkt sind.
Für die Northern Blot Analyse wurde das Gewebe in ein steriles konisches Röhrchen auf Eis gestellt und 10-15 Volumina 3 M LiCl, 6 M Harnstoff, 5 mM EDTA, 0,1 M β-Mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) wurden zugegeben. Das Gewebe wurde mit einem Polytron^® Homogenisator (Brinkman Instruments, Inc., Westburg, NY) für 30-50 s auf Eis homogenisiert. Die Lösung wurde in ein 15 ml Kunststoff-Zentrifugenröhrchen überführt und über Nacht auf –20 °C gestellt. Das Röhrchen wurde für 90 min bei 9.000 × g bei 0-4 °C zentrifugiert und der Überstand wurde unmittelbar dekantiert. Danach wurden 10 ml 3 M LiCl zugegeben, das Röhrchen wurde für 5 sec gevortext und für 45 min bei 11.000 × g bei 0-4 °C zentrifugiert. Diese Schritte der Dekantierung, Resuspendierung in LiCl und Zentrifugierung wurden wiederholt. Das endgültige Pellet wurde an Luft getrocknet und in 2 ml 1 mM EDTA, 0,5 SDS, 10 mM Tris (pH 7,5) resuspendiert. Danach wurde ein Volumen von 20 μl Proteinase K (20 mg/ml) zugegeben und die resultierende Lösung wurde für 30 min bei 37 °C unter gelegentlichem Rühren inkubiert. Ein Zehntel des Volumens (0,22- 0,25 ml) an 3 M NaCl wurde zugegeben und die Lösung wurde vor der Überführung in ein anderes Röhrchen, das 2 ml Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (PCI) enthielt, gevortext. Das Röhrchen wurde für 1-3 sec gevortext und für 20 min bei 3.000 × g bei 10 °C zentrifugiert. Die PCI-Extraktion wurde noch zweimal wiederholt, worauf zwei ähnliche Extraktionen mit Chloroform/Isoamylalkohol folgten. Die endgültige wässrige Lösung wurde in ein vorgekühltes 15 ml Corex-Glasröhrchen, das 6 ml 100 absolutes Ethanol enthielt, überführt, das Röhrchen wurde mit Parafilm abgedeckt und über Nacht auf –20 °C gestellt. Das Röhrchen wurde für 30 min bei 10.000 × g bei 0-4 °C zentrifugiert und der Ethanolüberstand wurde unmittelbar dekantiert. Das RNA-Pellet wurde viermal mit 10 ml 75 eiskaltem Ethanol gewaschen, worauf jedes Mal eine Zentrifugierung bei 10.000 × g für 10 min folgte. Das endgültige Pellet wurde an Luft für 15 min bei Raumtemperatur getrocknet. Die RNA wurde in 0,5 ml 10 mM Tris (pH 7,6), 1 mM EDTA suspendiert und ihre Konzentration wurde spektrophotometrisch bestimmt. Die RNA-Proben wurden aliquotiert und bei –70 °C als Ethanol-Fällungen aufbewahrt.
Die Qualität der RNA wurde über Agarose-Gelelektrophorese (siehe Beispiel 5) und Anfärben mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid für 1 Stunde bestimmt. Die RNA-Proben, die keine intakten 28S/18S rRNAs enthielten, wurden von der Untersuchung ausgeschlossen.
Alternativ dazu wurde für die RT-PCR-Analyse 1 ml Ultraspec RNA-Reagenz zu 120 mg pulverisiertem Gewebe in einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen zugegeben, mit einem Polytron^® Homogenisator (Brinkman Instruments, Inc., Westburg, NY) für 50 s homogenisiert und für 5 min auf Eis belassen. Danach wurden jeder Probe 0,2 ml Chloroform zugegeben, worauf für 15 sec gevortext wurde. Die Probe wurde für weitere 5 min in Eis belassen, worauf Zentrifugierung bei 12.000 × g für 15 min bei 4 °C folgte. Die obere Schicht wurde gesammelt und in ein anderes RNase-freies 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Ein gleiches Volumen an Isopropanol wurde jeder Probe zugegeben und die Lösung wurde für 10 min auf Eis gestellt. Die Probe wurde bei 12.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das verbliebene Pellet wurde zweimal mit kaltem 75 Ethanol gewaschen, durch Vortexen resuspendiert und das resuspendierte Material wurde danach durch Zentrifugierung bei 7.500 × g für 5 min bei 4 °C erneut pelletiert. Schließlich wurde das RNA-Pellet in einem Speedvac für mindestens 5 min getrocknet und in RNase-freiem Wasser wiederhergestellt.
B. RNA-Extraktion aus einkernigen Blutzellen.
Einkernige Zellen werden aus Blutproben von Patienten über Zentrifugierung unter Verwendung von Ficoll-Hypaque wie folgt isoliert. Ein Volumen von 10 ml Vollblut wird mit einem gleichen Volumen an RPMI Medium (Life Technologies, Gaithersburg, MD) vermischt. Dieses Gemisch wird danach mit 10 ml Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) unterschichtet und für 30 Minuten bei 200 × g zentrifugiert. Der Leukozytenfilm, der die einkernigen Zellen enthält, wird entfernt, mit PBS nach Dulbecco (Life Technologies, Gaithersburg, MD) auf 50 ml verdünnt und das Gemisch wird für 10 Minuten bei 200 × g zentrifugiert. Nach zwei Waschungen wird das resultierende Pellet in PBS nach Dulbecco auf ein Endvolumen von 1 ml resuspendiert.
Die RNA wird aus den isolierten einkernigen Zellen präpariert, wie vorstehend von N. Kato et al. beschrieben ist. Kurz gefasst, werden die pelletierten einkernigen Zellen auf ein Endvolumen von 1 ml gebracht und danach in 250 μl PBS resuspendiert und mit 2,5 ml 3 M LiCl, 6 M Harnstoff, 5 mM EDTA, 0,1 M 2-Mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) vermischt. Das resultierende Gemisch wird homogenisiert und bei –20 °C über Nacht inkubiert. Das Homogenisat wird bei 8.000 UPM in einem Beckman J2-21M Rotor für 90 Minuten bei 0-4 °C geschleudert. Das Pellet wird in 10 ml 3M LiCl über Vortexen resuspendiert und danach bei 10.000 UPM in einer Beckman J2-21M Rotor Zentrifuge für 45 Minuten bei 0-4 °C geschleudert. Die Schritte der Resuspendierung und Pelletierung werden danach wiederholt. Das Pellet wird in 2 ml 1 mM EDTA, 0,5 SDS, 10 mM Tris (pH 7,5) und 400 μg Proteinase K mit Vortexen resuspendiert und danach wird es bei 37 °C für 30 Minuten unter Schütteln inkubiert. Ein Zehntel des Volumens an 3M NaCl wird danach zugegeben und das Gemisch wird gevortext. Proteine werden über zwei Extraktionszyklen mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, worauf eine Extraktion mit Chloroform/Isoamylalkohol folgt, entfernt. Die RNA wird über den Zusatz von 6 ml Ethanol gefällt, worauf eine Inkubation bei –20 °C über Nacht folgt. Nachdem die gefällte RNA über Zentrifugierung gesammelt wird, wird das Pellet 4 mal in 75 Ethanol gewaschen. Die pelletierte RNA wird danach in 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) gelöst.
Nicht-Brustgewebe werden als negative Kontrollen verwendet. Die mRNA kann weiter aus totaler RNA gereinigt werden, indem im Handel erhältliche Kits, wie z. B. Oligo dT Cellulose Spinsäulen (RediCol^TM von Pharmacia, Uppsala, Schweden), für die Isolierung von polyadenylierter RNA verwendet werden. Die totale oder mRNA kann in Lysepuffer (5 M Guanidinthiocyanat, 0,1 M EDTA, pH 7,0) für die Analyse in dem Ribonuklease-Schutzassay gelöst werden.
C. RNA-Extraktion aus Polysomen.
Gewebe wird in Salzlösung bei 4 °C zerkleinert und mit 2,5 Volumina an 0,8 M Saccharose in einer TK₁₅₀M (150 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4) Lösung vermischt, die 6 mM 2-Mercaptoethanol enthält. Das Gewebe wird in einem Teflon-Glas Potter Homogenisator mit fünf Hüben bei 100- 200 upm homogenisiert, worauf sechs Hübe in einem Dounce Homogenisator folgen, wie von B. Mechler, Methods in Enzymology 152: 241-248 (1987) beschrieben ist. Das Homogenisat wird danach bei 12.000 × g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Zellkerne zu sedimentieren. Die Polysomen werden über Vermischen von 2 ml des Überstandes mit 6 ml 2,5 M Saccharose in TK₁₅₀M und Überschichten dieses Gemisches auf 4 ml 2,5 M Saccharose in TK₁₅₀M in einem 38 ml Polyallomer-Röhrchen isoliert. Zwei zusätzliche Saccharose TK₁₅₀M Lösungen werden nacheinander auf die Extraktfraktion überschichtet; eine erste Schicht von 13 ml 2,05 M Saccharose, worauf eine zweite Schicht von 6 ml 1,3 M Saccharose folgt. Die Polysomen werden über Zentrifugierung des Gradienten bei 90.000 × g für 5 h bei 4 °C isoliert. Die Fraktion wird danach mit einer silikonisierten Pasteur-Pipette von der Grenzfläche 1,3 M Saccharose/2,05 M Saccharose entnommen und in einem gleichen Volumen an TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA) verdünnt. Ein gleiches Volumen an 90 °C SDS-Puffer (1 SDS, 200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4) wird zugegeben und die Lösung wird in einem kochenden Wasserbad für 2 min inkubiert. Als Nächstes werden die Proteine über einen Verdau mit Proteinase K (50 mg/ml) für 15 min bei 37 °C verdaut. Die mRNA wird mit 3 gleichen Volumina von Phenol-Chloroform-Extraktionen gereinigt, worauf eine Fällung mit 0,1 Volumina an 2 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2 Volumina an 100 Ethanol bei –20 °C über Nacht folgt. Die gefällte RNA wird über Zentrifugierung bei 12.000 × g für 10 min bei 4 °C gewonnen. Die RNA wird getrocknet und in TE (pH 7,4) oder destilliertem Wasser resuspendiert. Die resuspendierte RNA kann danach in einem Slot Blot oder Dot Blot Hybridisierungsassay für die Prüfung auf das Vorhandensein von BS106-mRNA (siehe Beispiel 6) verwendet werden.
Die Qualität der Nukleinsäure und der Proteine hängt von dem verwendeten Verfahren zur Herstellung ab. Jede Probe kann eine unterschiedliche Herstellungstechnik erfordern, um die Isolierungseffizienz des Zielmoleküls zu maximieren. Diese Herstellungstechniken liegen in dem Können des Durchschnittsfachmannes.
Beispiel 4: Ribonuklease-Schutzassay
A. Synthese von markierter komplementärer RNA (cRNA) Hybridisierungssonde und unmarkiertem Sensestrang.
Ein pINCY-Plasmid, das die BS106-Gen-cDNA-Sequenzinsertion (Klon 1662885) enthält, das von entgegengerichteten SPE- und T7-Polymerase-Promotoren, wurde unter Verwendung des Qiagen Plasmid Purification Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) gereinigt. Danach wurden 10 μg des Plasmids mit 10 U DdeI-Restriktionsenzym für 1 h bei 37 °C geschnitten. Das geschnittene Plasmid wurde unter Verwendung von QIAprep Kits (Qiagen, Chatsworth, CA) gereinigt und für die Synthese von Antisense-Iranskript, das mit 6,3 μM (alpha³²P) UTP (800 Ci/mmol) (Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, IL) markiert war, von dem SP6-Promotor unter Verwendung des Riboprobe^® in vitro Transcription System (Promega Corporation, Madison, WI) verwendet, wie durch die Anweisungen des Lieferanten beschrieben ist. Um den Sensestrang zu erzeugen, wurden 10 μg des gereinigten Plasmids mit den Restriktionsenzymen 10 U XbaI und 10 U NotI geschnitten und wie vorstehend von dem T7-Promotor transkribiert. Sowohl die Senseals auch Antisensestränge wurden über Spin-Säulenchromatographie isoliert. Der unmarkierte Sensestrang wurde über UV-Absorption bei 260 nm quantifiziert.
B. Hybridisierung der markierten Sonde an das Ziel.
Gefrorenes Gewebe wurde unter flüssigem Stickstoff zu einem Pulver pulverisiert und 100-500 mg wurden in 1 ml Lysepuffer gelöst, der als eine Komponente des Direct Protect^SM Lysate RNase Protection Kit (Ambion, Inc., Austin, TX) erhältlich ist. Die weitere Auflösung wurde unter Verwendung eines Gewebe-Homogenisators erzielt. Zusätzlich wurde eine Verdünnungsreihe mit einer bekannten Menge an Sensestrang in Mausleber-Lysat für die Verwendung als eine positive Kontrolle hergestellt. Schließlich wurden 45 μl solubilisiertes Gewebe oder verdünnter Sensestrang direkt mit 1 × 10⁵ cpm radioaktiv markierter Sonde (1,5 × 10⁹ cpm/μg) in 5 μl Lysepuffer vermischt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37 °C fortgeführt.
C. RNase-Verdau.
Die RNA, die nicht an die Sonde hybridisiert war, wurde gemäß dem Direct Protect^TM Protokoll unter Verwendung einer Lösung von RNase A und RNase Ti für 30 min bei 37 °C aus der Reaktion entfernt, worauf die Entfernung von RNase über Verdau mit Proteinase K in Gegenwart von Natriumsarcosyl folgte. Die vor Verdau geschützten hybridisierten Fragmente wurden danach durch die Zugabe eines gleichen Volumens an Isopropanol gefällt und auf –70 °C für 3 h gestellt. Die Fällungen wurden über Zentrifugierung bei 12.000 × g für 20 min gesammelt.
D. Fragmentanalyse.

Die Fällungen wurden in denaturierendem Farbstoff (gel loading dye) (80 Formamid, 10 mM EDTA (pH 8,0), 1 mg/ml Xylencyanol, 1 mg/ml Bromphenolblau) gelöst, hitzedenaturiert und in 6 Polyacrylamid TBE, 8 M denaturierenden Harnstoffgelen elektrophoresiert. Die Gele wurden abgebildet und unter Verwendung des STORM^TM Storage Phosphor Autoradiography System (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) analysiert. Die Quantifizierung von geschützten Fragmentbanden, die in Femtogramm (fg) exprimiert wurden, wurde über Vergleich der Peakflächen, die von den Testproben erhalten wurden, mit denjenigen aus den bekannten Verdünnungen des positiven Kontroll-Sensestranges erzielt (siehe vorstehenden Abschnitt B). Zusätzlich wurde die Konzentration an DNA in dem Lysat einem Assay unterzogen, um die Anzahl von Zellen in den Lysaten der Testprobe abzuschätzen. Die Ergebnisse sind in Molekülen von BS106-RNA/Zelle und als eine Einstufungsbewertung der Abbildung (Tabelle 1) ausgedrückt. Eine hochgradige Expression von mRNA, die einer Sequenz entspricht, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen davon, zeigte das Vorhandensein von BS106-mRNA(s) an, das eine Diagnose einer Erkrankung des Brustgewebes oder eines Zustandes, wie z. B. Brustkrebs, nahe legte. Tabelle 1

Gewebe	ID-Nummer	BS106-RNA/Zelle	Bewertung*
Normale Brust	C157	10	+
	C007G	7	+
	C027R	8	+
	C016R	2	+
	C135R	0,2	+
Maligne Brust	C011G	> 46	3+
	C023G	0,3	+
	C012G	0	–
	C033R	> 87	3+
	C030	0	–
Normale Lunge	C005R	0	–
Maligne Lunge	C037G	0	–
Normales Kolon	C027G	0	–

* Proben ohne detektierbares geschütztes Fragment wurden mit "–" bewertet; Proben mit detektierbarem geschütztem Fragment (von denen die fg-Werte innerhalb der std-Kurve lagen) wurden mit "+" bewertet; Proben mit detektierbarem geschütztem Fragment, von denen die fg-Werte 2 bis 10fach über der std-Kurve lagen, wurden mit "2+" bewertet; Proben mit detektierbarem geschütztem Fragment, von denen die fg-Werte 10fach oder mehr über der std- Kurve lagen, wurden mit "3+" bewertet.

Beispiel 5: Northern Blotting
Die Northern Blot Technik wurde verwendet, um eine RNA-Spezies von spezifischer Größe in einer komplexen Population von RNA unter Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese und Nukleinsäurehybridisierung zu identifizieren. Kurz gefasst wurden 5 μg totale RNA (siehe Beispiel 3) in 15 μl einer Lösung, die 40 mM Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) (pH 7,0), 10 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, 2,2 M Formaldehyd, 50 % V/V Formamid, für 15 min bei 65 °C inkubiert. Die denaturierte RNA wurde mit 2 Liter Beladungspuffer (50 % Glycerol, 1 mM EDTA, 0,4 % Bromphenolblau, 0,4 % Xylencyanol) vermischt und auf ein denaturierendes 1,0 % Agarosegel geladen, das 40 mM MOPS (pH 7,0), 10 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA und 2,2 M Formaldehyd enthielt. Das Gel wurde bei 60 V für 1,5 h elektrophoresiert und in RNase-freiem Wasser gespült. Die Gele wurden in RNase-freiem Wasser mit 0,5 g/ml Ethidiumbromid angefärbt und mit UV-Licht belichtet, um die ribosomalen RNA-Banden sichtbar zu machen. Die RNA wurde von dem Gel auf Nylonmembrane (Brightstar-Plus, Ambion, Inc., Austin, TX) für 1,5 Stunden unter Verwendung des Verfahrens des abwärts gerichteten alkalischen Kapillartransfers (Downward Alkaline Capillary Transfer) (Chomczynski, Anal. Biochem. 201: 134-139, 1992) übertragen. Der Filter wurde mit 1X SSC gespült und die RNA wurde mit dem Filter unter Verwendung des Stratalinker (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) in dem Autovernetzungsmodus vernetzt und für 15 min getrocknet. Die Membran wurde danach in ein Hybridisierungsröhrchen gestellt, das 20 ml vorgewärmte Vorhybridisierungslösung (5X SSC, 50 % Formamid, 5X Lösung nach Denhardt, 100 g/ml denaturierte Lachssperma-DNA) enthielt, und in einem 42 °C Hybridisierungsofen für mindestens 3 h inkubiert. Während der Blot vorhybridisierte, wurde eine 32P-markierte zufällig geprimete Sonde unter Verwendung des BS106-Insertionsfragments (das durch Verdau des Klons 1662885 mit XbaI und NotI erhalten wurde) unter Verwendung des Random Primer DNA Labeling System (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) gemäß den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Die Hälfte der Sonde wurde für 10 min gekocht, auf Eis rasch abgekühlt und in das Hybridisierungsröhrchen gegeben. Die Hybridisierung wurde bei 42 °C für mindestens 12 h durchgeführt. Die Hybridisierungslösung wurde verworfen und der Filter wurde zweimal in 30 ml 3X SSC, 0,1 SDS bei 42 °C für 15 min gewaschen, worauf zwei Waschungen mit 0,3X SSC, 0,1 % SDS bei 60 °C für 15 min folgten. Der Filter wurde in Klarsichtfolie eingehüllt, einem Kodak XAR-Omat Film für 24-96 h ausgesetzt und der Film wurde für die Analyse entwickelt. Die Ergebnisse der Analyse der RNA-Qualität unter Verwendung eines Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegels und der entsprechende Northern Blot unter Verwendung der BS106-Sonde, die an RNAs aus Brustgeweben und Prostatageweben, und aus normalen Brust- und Brustkrebsgeweben hybridisiert wurde, sind in den 3A bzw. 3B. Die Positionen der RNA-Größenstandards (in Kb) sind auf der linken Seite von jeder Tafel gezeigt. Wie in der 3A gezeigt ist, hybridisierte die BS106-Sonde an eine RNA-Bande von ungefähr 0,7 Kb bei 3 von 3 normalen Brustgeweben und bei 1 von 3 Prostatakrebsgeweben; aber eine RNA-Bande wurde bei 3 normalen Prostatageweben oder in einer Zelllinie von Prostata- oder Brustkrebs nicht detektiert. Die 3B zeigt, dass die BS106-Sonde an eine RNA mit ungefähr 0,7 Kb bei 5 von 6 normalen Brust-RNA-Proben und bei 2 von 6 Brustkrebs-RNA-Proben hybridisierte.
Beispiel 6: Dot Blot/Slot Blot
Dot und Slot Blot Assays stellen rasche Verfahren dar, um das Vorhandensein einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einem komplexen Gemisch von Nukleinsäuren zu beurteilen. Für die Durchführung von solchen Assays werden bis zu 50 μg RNA in 50 μl 50 Formamid, 7 Formaldehyd, 1X SSC vermischt, 15 min bei 68 °C inkubiert und danach auf Eis gekühlt. Danach werden 100 μl 20X SSC dem RNA-Gemisch zugegeben und unter Vakuum auf ein Mehrzweckgerät geladen, das über eine präparierte Nitrocellulose- oder Nylonmembran verfügt. Die Membran wird in Wasser, 20X SSC für 1 Stunde getränkt, auf zwei Blätter von 20X SSC vorbenetztem Whatman Nr. 3 Filterpapier gegeben und in ein Slot Blot oder Dot Blot Mehrzweckgerät geladen. Der Slot Blot wird mit Sonden analysiert, die hergestellt und markiert werden, wie vorstehend in Beispiel 4 beschrieben ist. Die Detektierung von mRNA, die einer Sequenz gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen davon entspricht, ist ein Anzeichen für das Vorhandensein von BS106, das eine Diagnose einer Brustgewebe-Erkrankung oder eines Zustandes, wie z. B. Brustkrebs, nahe legt.
Weitere Verfahren und Puffer, die bei den Verfahren, die in den Beispielen 5 und 6 beschrieben sind, verwendet werden können, aber hierin nicht spezifisch detailliert sind, sind in dem Fachgebiet bekannt und zum Beispiel vorstehend in J. Sambrook et al. beschrieben.
Beispiel 7: In situ Hybridisierung
Dieses Verfahren ist nützlich, um unter Verwendung von detektierbaren Nukleinsäure-Hybridisierungssonden spezifische Ziel-Nukleinsäuresequenzen in Zellen direkt zu detektieren.
Die Gewebe werden mit vernetzenden Fixierungsmitteln, wie z. B. Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd, für die maximale zelluläre der RNA-Retention präpariert. Siehe L. Angerer et al., Methods in Cell Biol. 35: 37-71 (1991). Kurz gefasst wird das Gewebe in mehr als 5 Volumina 1 Glutaraldehyd in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5 bei 4 °C für 30 min gestellt. Die Lösung wird durch frische Glutaraldehyd-Lösung (1 Glutaraldehyd in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5) für eine weitere Fixierung von 30 min ersetzt. Die Fixierlösung sollte eine Osmolalität von ungefähr 0,375 NaCl besitzen. Das Gewebe wird einmal in isotonischer NaCl gewaschen, um das Phosphat zu entfernen.
Die fixierten Gewebe werden danach wie folgt in Paraffin eingebettet. Das Gewebe wird über eine Serie von Ethanolkonzentrationen für jeweils 15 min dehydratisiert: 50 % (zweimal), 70 % (zweimal), 85 %, 90 % und danach 100 % (zweimal). Als Nächstes wird das Gewebe in zwei Wechseln von Xylen für 20 min jeweils bei Raumtemperatur getränkt. Das Gewebe wird danach in zwei Wechseln eines 1:1 Gemisches von Xylen und Paraffin für 20 min jeweils bei 60 °C; und danach in drei endgültigen Wechseln von Paraffin für jeweils 15 min.
Als Nächstes wird das Gewebe in 5 μm Abschnitte unter Verwendung eines standardmäßigen Mikrotoms geschnitten und auf einen Objektträger gegeben, der zuvor mit einem Gewebekleber, wie z. B. 3-Aminopropyltriethoxysilan, behandelt wurde.
Das Paraffin wird aus dem Gewebe über zwei 10 min Tränkungen mit Xylen entfernt und in einer Serie von Ethanolkonzentrationen rehydratisiert: 99 % zweimal, 95 %, 85 %, 70 %, 50 %, 30 % und danach zweimal destilliertes Wasser. Die Abschnitte werden mit 0,2 M HCl für 10 min vorbehandelt und mit 2 μg/ml Proteinase K bei 37 °C für 15 min permeabilisiert.
Die markierten Ribosonden, die von dem BS106-Genplasmid (siehe Beispiel 4) transkribiert wurden, werden an die präparierten Gewebeabschnitte hybridisiert und über Nacht bei 56 °C in einem 3X standardmäßigen Salzlösungsextrakt und 50 % Formamid inkubiert. Überschüssige Sonde wird durch Waschen in 2X standardmäßige Salzlösung-Citrat und 50 % Formamid entfernt, worauf der Verdau mit 100 μg/ml RNase A bei 37 °C für 30 folgt. Die Fluoreszenzsonde wird über Belichtung mit ultraviolettem (UV) Licht unter einem Mikroskop sichtbar gemacht. Die Fluoreszenz in dem Zellplasma ist ein Anzeichen für BS106-mRNA. Alternativ dazu können die Abschnitte über Autoradiographie sichtbar gemacht werden.
Beispiel 8: Reverse Transkriptions-PCR
A. Einstufiger RT-PCR-Assay.
Ziel-spezifische Primer werden konstruiert, um die vorstehend beschriebenen Zielsequenzen über reverse Transkriptions-PCR unter Verwendung von Verfahren zu detektieren, die in dem Fachgebiet bekannt sind. Die einstufige RT-PCR ist eine sequenzielle Prozedur, die sowohl RT als auch PCR in einem einzigen Reaktionsgemisch durchführt. Die Prozedur wird in einem 200 μl Reaktionsgemisch durchgeführt, das 50 mM (N,N-bis[2-Hydroxyethyl]glycin), pH 8, 15, 81,7 mM KOAc, 33,33 mM KOH, 0,01 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,02 mg/ml NaN₃, 8 m/V Glycerol, jeweils 150 μM dNTP, jeweils 0,25 μM Primer, 5U rTth-Polymerase, 3,25 mM Mn(OAc)₂ und 5 μl der Ziel-RNA (siehe Beispiel 3) enthält. Da die RNA und das rTth-Polymeraseenzym in Gegenwart von Mn(OAc)₂ instabil sind, sollte das Mn(OAc)₂ erst kurz vor der Zugabe des Ziels zugegeben werden. Die optimalen Bedingungen für die cDNA-Synthese und die thermische Zyklisierung können von einem Fachmann ohne weiteres bestimmt werden. Die Reaktion wird in einem Perkin-Elmer Thermal Cycler 480 inkubiert. Die optimalen Bedingungen für die cDNA-Synthese und die thermische Zyklisierung können von einem Fachmann ohne weiteres bestimmt werden. Die Bedingungen, die als nützlich befunden werden können, schließen die cDNA-Synthese bei 60-70 °C für 15-45 min und 30-45 Amplifizierungszyklen bei 94 °C, 1 min; 55-70 °C, 1 min; 72 °C, 2 min ein. Die einstufige RT-PCR kann ferner unter Verwendung einer zweifachen Enzymprozedur mit Taq-Polymerase und einem reversen Transkriptaseenzym, wie z. B. MMLV oder AMV RT Enzyme, durchgeführt werden.
B. Herkömmliche RT-PCR.
Eine herkömmliche zweistufige RT-PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wie von K. Q. Hu et al., Virology 181: 721-726 (1991) beschrieben ist. Kurz gefasst wurden 0,5 μg. extrahierte mRNA (siehe Beispiel 3) in einem 20 μl Reaktionsgemisch revers transkribiert, das 1X PCR II Puffer (Perkin-Elmer), 5 mM MgCl₂, 1 mM dNTP, 20 U RNasin, 2,5 μM zufällige Hexamere und 50 U MMLV (Moloney-Maus-Leukämievirus) reverse Transkriptase (RT) enthielt. Die reverse Transkription wurde bei Raumtemperatur für 10 min und bei 42 °C für 60 min in einem PE-480 Thermal Cycler durchgeführt, worauf eine weitere Inkubation bei 95 °C für 5 min zur Inaktivierung der RT folgte. Die PCR wurde unter Verwendung von 2 μl der cDNA-Reaktion in einem endgültigen PCR-Reaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt, das 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 200 μM dNTP, 0,5 μM von jedem Sense- und Antisenseprimer (Sequenz-Identifikationsnummer 12 bzw. Sequenz-Identifikationsnummer 13) und 2,5 U Taq-Polymerase enthielt. Die Reaktion wurde in einem MJ Research Model PTC-200 wie folgt inkubiert: 40 Zyklen der Amplifizierung (94 °C, 20 s; 58 °C, 30 s; 72 °C, 30 s); eine endgültige Extension (72 °C, 10 min); und eine Tränkung bei 4 °C.
C. PCR-Fragmentanalyse.
Die richtigen Produkte wurden über Größenbestimmung unter Verwendung von Gelelektrophorese mit einem SYBR^® Green Gelfarbstoff für Nukleinsäuren (Molecular Probes, Eugene, OR) verifiziert. Die Gele wurden mit SYBR Green I bei einer Verdünnung von 1:10.000 in 1X TEE für 45 min angefärbt. Die Gele wurden danach in 1X TEE für 30 min entfärbt und unter Verwendung eines STORM Abbildungssystems (siehe die 4A und 4B) abgebildet. Die 4A zeigt eine DNA-Bande bei 201 Basen aus RNA von sowohl normalen (Bahnen 1-5) als auch kanzerösen (Bahnen 6-10) Brustgeweben. Diese Bande ist ein Anzeichen für ein BS106-mRNA-spezifisches RT-PCR-Produkt. Wie in der 4B gezeigt ist, wurde das Produkt unter Verwendung von RNA, geht aus Geweben von Lunge (Bahnen 1-5) oder Kolon (Bahnen 6-10) isoliert wurden, nicht detektiert. Die Detektion eines Produkts, das eine Sequenz gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen davon besteht, zeigte das Vorhandensein von BS106-mRNA an, das eine Diagnose einer Brustgewebe-Erkrankung oder eines Zustandes, wie z. B. Brustkrebs, nahe legte.
Beispiel 9: OH-PCR
A. Sondenauswahl und Markierung.
Ziel-spezifische Primer und Sonden werden konstruiert, um die vorstehend beschriebenen Zielsequenzen über Oligonukleotidhybridisierungs-PCR zu detektieren. Die internationalen Veröffentlichungen Nrn. WO 92/10505 , veröffentlicht am 25. Juni 1992, und die WO 92/11388 , veröffentlicht am 9. Juli 1992, lehren Verfahren zur Markierung von Oligonukleotiden an ihren 5'- bzw. 3'-Enden. Gemäß einem bekannten Verfahren zur Markierung eines Oligonukleotids wird ein Marker-Phosphoramiditreagenz hergestellt und für die Addition des Markers an das Oligonukleotid während seiner Synthese verwendet. Siehe zum Beispiel N. T. Thuong et al., Tet. Letters 29(46): 5905-5908 (1988); oder J. S. Cohen et al., veröffentlichte US-Patentanmeldung 07/246,688 (NTIS Bestell-Nr. PAT-APPL-7-246,688) (1989). Vorzugsweise werden die Sonden an ihrem 3'-Ende markiert, um eine Beteiligung an der PCR und die Bildung von unerwünschten Extensionsprodukten zu verhindern. Für die einstufige OH-PCR sollte die Sonde über einen T_M von mindestens 15 °C unter dem T_M der Primer verfügen. Die Primer und Sonden werden als spezifische Bindungsvertreter mit oder ohne detektierbaren Markern unter Verwendung von standardmäßiger Phosphoramidit-Chemie und/oder post-synthetischen Markierungsverfahren verwendet, die dem Fachmann wohl bekannt sind.
B. Einstufige Oligohybridisierungs-PCR.
Die OH-PCR wird in einer 200 μl Reaktion durchgeführt, die 50 mM (N,N-bis[2-Hydroxyethyl] glycin), pH 8,15, 81,7 mM KOAc, 33,33 mM KOH, 0,01 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,1 mM Ethylendiaminetetraessigsäure, 0,02 mg/ml NaN₃, 8 m/V Glycerol, jeweils 150 μM dNTP, jeweils 0,25 μM Primer, 3,75 nM Sonde, 5U rTth-Polymerase, 3,25 mM Mn(OAc)₂ und 5 μl Blutäquivalente des Ziels enthält (siehe Beispiel 3). Da die RNA und das rTth-Polymeraseenzym in Gegenwart von Mn(OAc)₂ instabil sind, sollte das Mn(OAc)₂ erst kurz vor der Zugabe des Ziels zugegeben werden. Die Reaktion wird in einem Perkin-Elmer Thermal Cycler 480 inkubiert. Die optimalen Bedingungen für die cDNA-Synthese und die thermische Zyklisierung können von einem Fachmann ohne weiteres bestimmt werden. Die Bedingungen, die als nützlich befunden werden können, schließen die cDNA-Synthese (60 °C 30 min), 30-45 Amplifizierungszyklen (94 °C, 40 s; 55-70 °C 60 s), Oligohybridisierung (97 °C, 5 min; 15 °C, 5 min; 15 °C Tränkung). Das richtige Reaktionsprodukt enthält mindestens einen der Stränge des PCR-Produkts und eine im Inneren hybridisierte Sonde.
C. OH-PCR-Produktanalyse.
Die amplifizierten Reaktionsprodukte werden auf einem LCx^® Analyzer System (erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) detektiert. Kurz gefasst wird das richtige Reaktionsprodukt von einem Antikörper-markierten Mikroteilchen an einer einfangbaren Stelle an entweder dem PCR-Produktstrang oder an der Hybridisierungssonde eingefangen und der Komplex wird über Bindung eines detektierbaren Antikörperkonjugats an entweder eine detektierbare Stelle an der Sonde oder an dem PCR-Strang detektiert. Nur ein Komplex, der einen mit der inneren Sonde hybridisierten PCR-Strang enthält, kann detektiert werden. Die Detektion dieses Komplexes ist danach ein Anzeichen für das Vorhandensein von BS106-mRNA, das eine Diagnose einer Brusterkrankung oder eines Zustandes, wie z. B. Brustkrebs, nahe legt.
Viele andere Detektionsformate sind vorhanden, die von dem Fachmann verwendet und/oder modifiziert werden können, um das Vorhandensein von amplifizierten oder nicht amplifizierten von BS106 abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen zu detektieren, die folgendes einschließen aber nicht darauf eingeschränkt sind: Ligase-Kettenreaktion (LCR, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL); Q-beta-Replicase (Gene-Trak^TM, Naperville, Illinois), verzweigte Kettenreaktion (Chiron, Emeryville, CA) und Strangverdrängungsassays (Becton Dickinson, Research Triangle Park, NC).
Beispiel 10: Synthetische Peptidherstellung
Die synthetischen Peptide, die jeweils durch die Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20 dargestellt sind, wurden auf der Basis der vorhergesagten Aminosäure-Sequenz des offenen Leserahmens von BS106 (Sequenz-Identifikationsnummer 16) (siehe Beispiel 1) hergestellt. Sämtliche Peptide wurden in einem Symphony Peptide Synthesizer (erhältlich von Rainin Instrument Co, Emeryville California) synthetisiert, wobei Fmoc-Chemie, standardmäßige Zyklen und in situ HBTU-Aktivierung verwendet wurden. Die Bedingungen für die Abspaltung und Entschützung waren wie folgt: ein Volumen von 2,5 ml Abspaltreagenz (77,5 V/V Trifluoressigsäure, 15 V/V Ethandithiol, 2,5 V/V Wasser, 5 V/V Thioanisol, 1-2 m/V Phenol) wurden dem Harz zugegeben und bei Raumtemperatur für 2-4 Stunden gerührt. Das Filtrat wurde danach entfernt und das Peptid wurde aus dem Abspaltreagenz mit kaltem Diethylether gefällt. Jedes Peptid wurde danach filtriert, über präparative Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradienten aus Wasser/Acetonitril/0,1 TFA gereinigt und lyophilisiert. Das Produkt wurde über Massenspektrometrie bestätigt (Daten nicht gezeigt).
Die gereinigten Peptide wurden mit Adjuvans vermischt und in Kaninchen injiziert (siehe Beispiel 14). Alternativ dazu können die gereinigten Peptide an das Hämocyanin der Schlüssellochschnecke mit Glutaraldehyd konjugiert, mit Adjuvans vermischt und in Kaninchen injiziert werden (siehe Beispiel 14).
Beispiel 11a: Expression von Protein in einer Zelllinie unter Verwendung des Plasmids 577
A. Konstruktion eines BS106-Expressionsplasmids.
Das Plasmid 577, das in der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/478,073 , eingereicht am 7. Juni 1995, beschrieben ist, ist für die Expression von sezernierten Antigenen in einer permanenten Zelllinie konstruiert worden. Dieses Plasmid enthält die folgenden DNA-Segmente: (a) ein 2,3 Kb Fragment von pBR322, das eine bakterielle beta-Lactamase und einen Ursprung der DNA-Replikation enthält; (b) eine 1,8 Kb Kassette, die die Expression eines Neomycin-Resistenzgens unter Kontrolle des HSV-1 Thymidinkinase Promotors und poly-A-Additionssignalen dirigiert; (c) eine 1,9 Kb Kassette, die die Genexpression eines Dihydrofolat-Reductase-Gens unter der Kontrolle von einem SV-40-Promotor und poly-A-Additionssignalen dirigiert; (d) eine 3,5 Kb Kassette, die die Expression einer Signalsequenz der schweren Kette des Kaninchen-Immunoglobulins, das mit einem modifizierten Hepatitis C Virus (HCV) E2-Protein fusioniert ist, unter der Kontrolle des Simian Virus 40 T-Ag Promotors und Transkriptionsenhancers dirigiert, wobei der Hepatitis B Virus Oberflächen-Antigen (HBsAg) Enhancer I von einem Fragment von Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) Genom gefolgt wird, das poly-A-Additionssignale liefert; und (e) ein restliches 0,7 Kb Fragment der späten Region des Simian Virus 40 Genoms ohne Funktion in diesem Plasmid. Sämtliche der Segmente des Vektors wurden über Standardverfahren zusammengestellt, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind.
Die Plasmide für die Expression von sezernierbaren BS106-Proteinen werden konstruiert, indem die kodierende Sequenz des Hepatitis C Virus E2-Proteins in dem Plasmid 577 durch die einer BS106-Polynukleotidsequenz gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Fragmenten oder Komplementen davon wie folgt ersetzt wird. Der Verdau von Plasmid 577 mit XbaI setzt das Hepatitis C Virus E2-Genfragment frei. Das resultierende Plasmid-Grundgerüst gestattet die Insertion der BS106-cDNA-Insertion stromabwärts der Signalsequenz der schweren Kette des Kaninchen-Immunoglobulins, die die exprimierten Proteine in den Sekretionsweg der Zelle dirigiert. Das BS106-cDNA-Fragment wird über die PCR unter Verwendung von standardmäßigen Prozeduren erzeugt. In der Sense-PCR-Primersequenz kodiert, befindet sich eine XbaI-Stelle, die unmittelbar von einer 12-Nukleotidsequenz gefolgt wird, die die Aminosäure-Sequenz Ser-Asn-Glu-Leu ("SNEL") kodiert, um die Signalprotease-Prozessierung, effiziente Sekretion und endgültige Produktstabilität in Kulturflüssigkeiten zu fördern. Unmittelbar auf diese 12-Nukleotidsequenz folgend enthält der Primer Nukleotide, die zu Templatsequenzen komplementär sind, die die Aminosäuren des BS106-Gens kodieren. Der Antisenseprimer beinhaltet eine Sequenz, die die folgenden acht Aminosäuren kurz vor den Stopp-Kodons kodiert: Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (Sequenz-Identifikationsnummer 21). In dieser Sequenz ist eine Erkennungsstelle beinhaltet, um die Analyse und Reinigung des BS106-Proteinprodukts zu unterstützen. Eine Erkennungsstelle (als "FLAG" bezeichnet), die von einem im Handel erhältlichen monoklonalen Antikörper, der als anti-FLAG M2 (Eastman Kodak, Co., New Haven, CT) bezeichnet ist, erkannt wird, als auch weitere vergleichbare Sequenzen und ihre entsprechenden Antikörper können verwendet werden. Zum Beispiel wird die PCR unter Verwendung von GeneAmp^® Reagenzien, die von Perkin-Elmer-Cetus bezogen wurden, wie durch die Anweisungen des Lieferanten angegeben, durchgeführt. Die PCR-Primer werden mit einer Endkonzentration von 0,5 μM verwendet. Die PCR wird an dem BS106-Plasmidtemplat in einer 100 μl Reaktion für 35 Zyklen (94 °C, 30 Sekunden; 55 °C, 30 Sekunden; 72 °C, 90 Sekunden) durchgeführt, worauf ein Extensionszyklus von 72 °C für 10 min folgt.
B. Transfektion von Eierstockzellen des chinesischen Hamsters mit Dihydrofolat-Reductase-Defizienz.
Das vorstehend beschriebene Plasmid wird in CHO/dhfr-Zellen (DXB-111, Uriacio, et al., PNAS 77: 4451-4466 (1980)) transfiziert. Diese Zellen sind von der A.T.C.C., 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20852 unter der Zugangs-Nr. CRL 9096 verfügbar. Die Transfektion wird unter Verwendung der kationischen Liposom-vermittelten Prozedur durchgeführt, die von P. L. Felgner et al., PNAS 84: 7413-7417 (1987) beschrieben ist. Im Besonderen werden CHO/dhfr-Zellen in F-12 Medium nach Ham kultiviert, das mit 10 % fötalem Kälberserum, L-Glutamin (1 mM) ergänzt ist, und frisch in einem Gefäß bei einer Dichte von 5 – 8 × 10⁵ Zellen pro Gefäß angesetzt. Die Zellen werden auf eine Konfluenz von zwischen 60 und 80 % für die Transfektion gezüchtet. Zwanzig Mikrogramm (20 μg) Plasmid-DNA werden 1,5 ml Opti-MEM I Medium zugegeben und 100 μl Lipofectin-Reagenz (Gibco-BRL, Grand Island, NY) werden einer zweiten Portion von 1,5 ml Opti-MEM I Medium zugegeben. Die beiden Lösungen werden vermischt und bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert. Nach der Entfernung des Kulturmediums von den Zellen werden die Zellen 3 mal mit 5 ml Opti-MEM I Medium gespült. Die Opti-MEM I-Lipofectin-Plasmid-DNA-Lösung wird danach auf die Zellen aufgegeben. Die Zellen werden für 3 h bei 37 °C inkubiert, worauf nach dieser Zeit die Opti-MEM I-Lipofectin-DNA-Lösung durch Kulturmedium für weitere 24 h vor der Selektion ersetzt wird.
C. Selektion und Amplifizierung.
Einen Tag nach der Transfektion werden die Zellen 1:3 passagiert und mit dhfr/G418-Selektionsmedium (hiernach "F-12 minus Medium G") inkubiert. Das Selektionsmedium ist F-12 nach Ham mit L-Glutamin und ohne Hypoxanthin, Thymidin und Glycin (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas) und 300 μg pro ml G418 (Gibco-BRL, Grand Island, NY). Die Verhältnisse des Mediumvolumens zu Oberfläche von 5 ml pro 25 cm² werden beibehalten. Nach ungefähr zwei Wochen werden die DHFR/G418-Zellen expandiert, um die Passage und eine kontinuierliche Aufbewahrung in dem F-12 minus Medium G zu gestatten.
Die Amplifizierung von jeder der transfizierten BS106-cDNA-Sequenzen wird durch stufenweise Selektion von DHFR⁺-, G418⁺-Zellen mit Methotrexat (zusammengefasst von R. Schimke, Cell 37: 705-713 (1984)) erzielt. Die Zellen werden mit dem F-12 minus Medium G, das 150 nM Methotrexat (MTX) (Sigma, St. Louis, MO) enthält, für ungefähr zwei Wochen inkubiert, bis resistente Kolonien auftreten. Die weitere Genamplifizierung wird durch Selektion von 150 nM adaptierten Zellen mit 5 μM MTX erzielt.
D. Antigenherstellung.
F-12 minus Medium G, das mit 5 μM MTX ergänzt ist, wird auf gerade konfluente Monoschichten für 12 bis 24 h bei 37 °C in 5 CO₂ aufgeschichtet. Das Wachstumsmedium wird entfernt und die Zellen werden 3 mal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) nach Dulbecco (mit Calcium und Magnesium) (Gibco-BRL, Grand Island, NY) gespült, um das verbliebene Medium/Serum, das vorhanden sein kann, zu entfernen. Die Zellen werden danach mit VAS Gebrauchsmedium (VAS Gebrauchsformulierung mit L-Glutamin mit HEPES ohne Phenolrot, erhältlich von JRH Bioscience; Lenexa, KS, Produktnummer 52-08678P) für 1 h bei 37 °C in 5 CO₂ inkubiert. Die Zellen werden danach mit VAS zur Produktion mit 5 ml pro T-Gefäß überschichtet. Das Medium wird nach sieben Tagen der Inkubation entfernt, aufbewahrt und danach bis zur Reinigung mit den Ernten 2, 3 und 4 eingefroren. Die Monoschichten werden mit VAS für 3 weitere Sieben-Tage-Ernten überschichtet.
E. Analyse der Antigenexpression des Brustgewebegens-BS106.
Aliquote der VAS-Überstände von den Zellen, die das BS106-Proteinkonstrukt exprimieren, werden entweder über SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung von standardmäßigen Verfahren und Reagenzien, die in dem Fachgebiet bekannt sind (diskontinuierliche Laemmli-Gele), oder über Massenspektrometrie analysiert.
F. Reinigung.
Die Reinigung des BS106-Proteins, das die FLAG-Sequenz enthält, wird über Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung einer Affinitätsmatrix durchgeführt, die einen monoklonalen anti-FLAG M2 Antikörper umfasst, der über eine Hydrazidverknüpfung (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) kovalent an Agarose gebunden ist. Vor der Affinitätsreinigung wird das Protein in vereinigten VAS-Mediumernten aus Rollerflaschen in einen 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl-Puffer unter Verwendung einer Sephadex G-25 Säule (Pharmacia Biotech Inc.,, Uppsala, Schweden) gewechselt. Das Protein in diesem Puffer wird auf die anti-FLAG M2 Antikörper-Affinitätssäule aufgetragen. Das nicht bindende Protein wird über Waschen der Säule mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl-Puffer eluiert. Das gebundene Protein wird unter Verwendung eines Überschusses an FLAG-Peptid in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl eluiert. Das überschüssige FLAG-Peptid kann von dem gereinigten BS106-Protein über Gelelektrophorese oder HPLC entfernt werden.
Obwohl in diesem Beispiel das Plasmid 577 verwendet wird, ist es dem Fachmann bekannt, dass weitere vergleichbare Expressionssysteme, wie z. B. CMV, hierin mit entsprechenden Modifikationen bei dem Reagenz und/oder den Techniken verwendet werden können und in dem Können des Durchschnittsfachmannes liegen.
Die größte geklonte Insertion, die die kodierende Region des BS106-Gens enthält, wird in folgendes subkloniert: entweder (i) ein eukaryotischer Expressionsvektor, der zum Beispiel einen Cytomegalovirus (CMV) Promotor und/oder Protein-fusionierbare Sequenzen enthalten kann, die die Proteinexpression und -detektion unterstützen, oder (ii) ein bakterieller Expressionsvektor, der ein Superoxid-Dismutase (SOD) und CMP-KDO-Synthetase (CKS) oder ein anderes Protein-Fusionsgen für die Expression der Proteinsequenz enthält. Verfahren und Vektoren, die für die Produktion von Polypeptiden nützlich sind, die Fusionssequenzen von SOD enthalten, sind in der EPO 0196056 , veröffentlicht am 1. Oktober 1986, beschrieben, und diejenigen, die Fusionssequenzen von CKS enthalten, sind in der EPO Veröffentlichungs-Nr. 0331961 , veröffentlicht am 13. September 1989, beschrieben. Dieses so gereinigte Protein kann bei einer Vielzahl von Techniken verwendet werden, die tierische Immunisierungsstudien, Festphasen-Immunoassays usw. einschließen aber nicht darauf eingeschränkt sind.
Beispiel 11b: Expression von Protein in einer Zelllinie unter Verwendung von pcDNA3.1/Myc-His
A. Konstruktion eines BS106-Expressionsplasmids.
Das Plasmid pcDNA3.1/Myc-His (Kat.-Nr. V855-20, Invitrogen, Carlsbad, CA) ist in der Vergangenheit für die Expression von sezernierten Antigenen über die meisten säugetierischen Zelllinien konstruiert worden. Die exprimierten Proteininsertionen werden mit einem myc-his-Peptidmarker fusioniert. Der myc-his-Marker (Sequenz-Identifikationsnummer 22) umfasst ein. c-myc-Oncoprotein-Epitop und eine Polyhistidin-Sequenz, die für die Reinigung eines exprimierten Fusionsproteins unter Verwendung von entweder anti-myc- oder anti-his-Affinitätssäulen oder Metalloprotein-bindenden Säulen nützlich sind.
Ein Plasmid für die Expression von sezernierbarem BS106-Protein wurde durch Insertion einer BS106-Polynukleotidsequenz aus dem Klon 1662885 in den pcDNA3.1/Myc-His-Vektor konstruiert. Vor der Konstruktion des BS106-Expressionsplasmids wurde die BS106-cDNA-Sequenz zunächst in einen pCR^®-Blunt-Vektor kloniert. Das BS106-cDNA-Fragment wurde über die PCR erzeugt, die unter Verwendung von Stratagene^®-Reagenzien, die von Stratagene bezogen wurden, wie durch die Anweisungen des Lieferanten vorgeschrieben durchgeführt wurde. Die PCR-Primer werden bei einer Endkonzentration von 0,5 μM verwendet. Die PCR wurde unter Verwendung von 5 U pfu-Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) an dem BS106-Plasmidtemplat (siehe Beispiel 2) in einer 50 μl Reaktion für 30 Zyklen (94 °C, 1 min; 65 °C, 1,5 min; 72 °C, 3 min) durchgeführt, worauf ein Extensionszyklus von 72 °C für 8 min folgte. Die Sense-PCR-Primersequenz (Sequenz-Identifikationsnummer 14) umfasst Nukleotide, die mit dem pINCY-Vektor unmittelbar stromaufwärts der BS106-Geninsertion identisch sind. Der Antisenseprimer (Sequenz-Identifikationsnummer 15) beinhaltet eine 5'-NotI-Restriktionssequenz und eine Sequenz, die zu dem 3'-Ende der BS106-cDNA-Insertion unmittelbar stromaufwärts des 3'-äußersten, rahmeninternen Stopp-Kodons komplementär ist. Fünf Mikroliter (5 μl) des resultierenden an. den Enden abgestumpften PCR-Produkts wurden mit 25 ng linearisiertem pCR^®-Blunt-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) ligiert, wobei das letale ccdB-Gen des Vektors unterbrochen wurde. Der resultierende ligierte Vektor wurde in TOP10 E. coli (Invitro gen, Carlsbad, CA) unter Verwendung eines One Shot^TM Transformationskits (Invitrogen, Carlsbad, CA) gemäß den Anweisungen des Lieferanten transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf LB-Kan (50 μg/ml Kanamycin) Selektionsplatten bei 37 °C gezüchtet. Nur Zellen, die ein Plasmid mit einem unterbrochenen ccdB-Gen enthielten, wuchsen nach der Transformation (Grant, S.G.N., PNAS 87: 4645-4649 (1990)). Die transformierten Kolonien wurden geerntet und in 3 ml LB-Kann-Brühe bei 37 °C gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung einer QIAprep^® (Qiagen Inc., Santa Clarita, CA) Prozedur isoliert, wie durch die Anweisungen des Lieferanten vorgeschrieben war. Die DNA wurde mit EcoRI- und NotI-Restriktionsenzymen verdaut, um das BS106-Insertionsfragment freizusetzen. Das Fragment wurde auf 1 Seakem^® LE Agarose (FMC, Rockland, ME)/0,5 μg/ml Ethidiumbromid/TE-Gel elektrophoresiert, über UV-Belichtung sichtbar gemacht, ausgeschnitten und unter Verwendung von QIAquick^TM (Qiagen Inc., Santa Clarita, CA) Prozeduren gereinigt, wie durch die Anweisungen des Lieferanten vorgeschrieben war.
Die pcDNA3.1/Myc-His-Plasmid-DNA wurde über Verdau mit EcoRI- und NotI-Stellen linearisiert, die in der Polylinkerregion der Plasmid-DNA vorhanden waren. Das vorstehende gereinigte BS106-Fragment wurde mit der resultierenden Plasmid-DNA stromabwärts von einem CMV-Promotor ligiert und in DH5-alpha^TM-Zellen (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) transformiert, wie durch die Anweisungen des Lieferanten vorgeschrieben war. Kurz gefasst wurden 10 ng pcDNA3.1/Myc-His, die die BS106-Insertion enthielten, 50 μl kompetente DH5-alpha-Zellen zugegeben und der Inhalt wurde vorsichtig vermischt. Das Gemisch wurde auf Eis für 30 min inkubiert, für 20 s bei 37 °C erwärmt und für zusätzliche 2 min auf Eis gestellt. Nach der Zugabe von 0,95 ml LB-Medium wurde das Gemisch für 1 h bei 37 °C unter Schütteln bei 225 upm inkubiert. Die transformierten Zellen wurden danach auf 100 mm LB/Amp (50 μg/ml Ampicillin) Platten ausplattiert und bei 37 °C gezüchtet. Die Kolonien wurden geerntet und in 3 ml. LB/Ampicillin-Brühe gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines QIAprep-Kits gereinigt. Das Vorhandensein der Insertion wurde unter Verwendung von Restriktionsenzymverdau und Gelanalyse bestätigt (J. Sambrook et al., vorstehend).
B. Transfektion von 293 Zellen aus menschlichen embryonischen Nierenzellen.
Das vorstehend in Abschnitt A beschriebene BS106-Expressionsplasmid wurde in DH5-alpha-Zellen retransformiert, auf LB/Ampicillin-Agar ausplattiert und in 10 ml LB/Ampicillin-Brühe gezüchtet, wie hierin vorstehend beschrieben wurde. Das Plasmid wurde unter Verwendung eines QIAfilter^TM Maxi Kits (Qiagen, Chatsworth, CA) gereinigt und in HEK293-Zellen (F. L. Graham et al., J. Gen. Vir. 36: 59-72 (1977)) transfiziert. Diese Zellen sind von der A.T.C.C., 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20852, unter der Zugangs-Nr. CRL 1573 erhältlich. Die Transfektion wurde unter Verwendung der kationischen Lipofectamin-vermittelten Prozedur durchgeführt, die von P. Hawley-Nelson et al., Focus 15.73 (1993) beschrieben wurde. Im Besonderen wurden die HEK293-Zellen in 10 ml DMEM-Medium kultiviert, das mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS), L-Glutamin (2 mM) ergänzt war, und frisch auf 12 × 100 mm Kulturplatten mit einer Dichte von 8 × 10⁶ Zellen pro Platte ausgesetzt. Die Zellen wurden bei 37 °C auf eine Konfluenz von zwischen 70 % und 80 % für die Transfektion gezüchtet. Acht Mikrogramm (8 μg) Plasmid-DNA wurden 800 μl Opti-MEM I^® Medium (Gibco-BRL, Grand Island, NY) zugegeben, und 48-96 μl Lipofectamine^TM Reagenz (Gibco-BRL, Grand Island, NY) wurden einer zweiten Portion von 800 μl Opti-MEM I Medium zugegeben. Die zwei Lösungen wurden vermischt und bei Raumtemperatur für 15-30 min inkubiert. Nach dem das Kulturmedium von den Zellen entfernt wurde, wurden die Zellen einmal mit 10 ml Serum-freiem DMEM gewaschen. Die Opti-MEM I-Lipofectamin-Plasmid-DNA-Lösung wurde mit 6,4 ml Serum-freiem DMEM verdünnt und danach über die Zellen geschichtet. Die Zellen wurden für 5 h bei 37 °C inkubiert, worauf nach dieser Zeit zusätzliche 8 ml DMEM mit 20 % FBS zugegeben wurden. Nach 18-24 h wurde das alte Medium aspiriert und die Zellen wurden mit 5 ml frischem DMEM mit 5 % FBS überschichtet. Die Überstände und Zellenextrakte wurden 72 h nach der Transfektion auf die BS106-Genaktivität analysiert.
C. Analyse der Antigenexpression des Brustgewebegens BS106.
Der vorstehende Kulturüberstand wurde in Kryoröhrchen überführt und auf Eis gelagert. Die HEK293-Zellen wurden geerntet, indem zweimal mit 10 ml kaltem PBS nach Dulbecco gewaschen wurde, und durch Zugabe von 1,5 ml CAT-Lysepuffer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) lysiert, worauf eine Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur folgte. Das Lysat wurde in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen überführt und bei 1000 × g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Kryoröhrchen überführt und auf Eis gelagert. Die Aliquote der Überstände von den Zellen und das Lysat der Zellen, die das BS106-Proteinkonstrukt exprimierten, wurde auf das Vorhandensein des rekombinanten BS106-Proteins analysiert. Die Aliquote wurden in einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung von standardmäßigen Verfahren und Reagenzien gestartet, die in dem Fachgebiet bekannt sind (J. Sambrook et al., vorstehend). Im Besonderen wurden die Proben auf die gewünschte Proteinkonzentration mit Tricin-Puffer (Novex, San Diego, CA) eingestellt, mit einem gleichen Volumen an 2X Tricin-Probenpuffer (Novex, San Diego, CA) vermischt und für 5 min bei 100 °C in einem Thermal Cycler erwärmt. Die Proben wurden danach auf ein Novex 10-20 vorgefertigtes Tricin-Gel (Novex, San Diego, CA) für die Elektrophorese aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurden die Proben von den Gelen auf Novex Nitrocellulosemembrane in Novex Tris-Glycin-Transferpuffer elektrophoretisch überführt. Die BS106-Proteinbande wurde unter Verwendung von Western Blotting mit monoklonalen anti-myc-Epitop-Antikörpern (Invitrogen, Carlsbad, CA) bei einer Verdünnung von 1 zu 5.000 sichtbar gemacht und mit den chemilumineszenten Detektionsreagenzien Western Lights Plus (Tropix, Redford, MA) gekoppelt. Das Zellenlysat zeigte die folgenden zwei intensiven Banden, die sich spezifisch mit dem monoklonalen anti-myc-Antikörper färbten: eine scharfe Bande bei etwa 20 kD; und eine breitere Bande von etwa 120-200 kD. Der Überstand lieferte eine einzige intensive breite Bande von 30-45 kD, die Unterschiede in der post-translationalen Modifikation zwischen der intrazellulären und der sezernierten Form von BS106 anzeigte. Alternativ dazu kann das polyklonale anti-BS106-Serum (siehe Beispiel 14) verwendet werden, um das rekombinante BS106-Protein zu detektieren, oder das exprimierte rekombinante BS106-Protein kann über Massenspektrometrie analysiert werden (siehe Beispiel 12).
D. Reinigung.
Die Reinigung des rekombinanten BS106-Proteins, das die myc-his-Sequenz enthält, wird unter Verwendung des Xpress^® Affinitätschromatographie-Systems (Invitrogen, Carlsbad, CA) durchgeführt, das ein mit Nickel beladenes Agaroseharz enthält, das spezifisch Polyhistidingruppen bindet. Die Überstände von 10 × 100 mm Platten, die wie vorstehend beschrieben präpariert wurden, werden vereinigt und über die mit Nickel beladene Säule gegeben. Das nicht bindende Protein wird durch Waschen der Säule mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)/150 mM NaCl-Puffer eluiert, worauf nur die myc-his-Fusionsproteine zurückbleiben. Das gebundene rekombinante BS106-Protein wird danach unter Verwendung entweder eines Überschusses an Imidazol oder Histidin oder eines Puffers mit niedrigem pH von der Säule eluiert. Alternativ dazu kann ferner das rekombinante Protein über die Bindung an der myc-his-Sequenz an eine Affinitätssäule gereinigt werden, die entweder aus anti-myc oder anti-hystidin monoklonalen Antikörpern besteht, die über eine Hydrazid- oder eine andere Verknüpfung mit einem Agaroseharz konjugiert sind, und mit einem Überschuss an myc-Peptid bzw. Histidin eluiert werden.
Das gereinigte rekombinante Protein kann danach mit einer festen Phase, wie z. B. mit N-Hydroxysuccinimid aktivierte Sepharosesäulen (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), wie durch die Anweisungen des Lieferanten vorgeschrieben ist, kovalent vernetzt werden. Diese Säulen, die das kovalent verknüpfte rekombinante BS106-Protein enthalten, können danach verwendet werden, um die anti-BS106-Antikörper aus Kaninchen- oder Maus- Sera zu reinigen (siehe Beispiele 13 und 14).
E. Beschichtung von Mikrotiterplatten mit exprimierten BS106-Proteinen.
Der Überstand von einer 100 mm Platte, wie vorstehend beschrieben ist, wird in einem angemessenen Volumen von PBS verdünnt. Danach werden 100 μl des resultierenden Gemisches in jede Vertiefung einer Reacti-Bind^TM Metallchelat-Mikrotiterplatte (Pierce, Rockford, IL) vorgelegt, bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert, worauf drei Waschungen mit jeweils 200 μl PBS mit 0,05 Tween^® 20 folgen. Die präparierte Mikrotiterplatte kann danach verwendet werden, um polyklonale Antisera auf das Vorhandensein von BS106-Antikörpern zu screenen (siehe Beispiel 17).
Obwohl in diesem Beispiel pcDNA3.1/Myc-His verwendet wird, ist es dem Fachmann bekannt, dass andere vergleichbare Expressionssysteme mit entsprechenden Modifikationen bei dem Reagenz und/oder den Techniken hierin verwendet werden können und in dem Können des Durchschnittsfachmannes liegen. Die größte geklonte Insertion, die die kodierende Region des BS106-Gens enthält, wird in folgendes subkloniert: entweder (i) ein eukaryotischer Expressionsvektor, der zum Beispiel einen Cytomegalovirus (CMV) Promotor und/oder Protein-fusionierbare Sequenzen enthalten kann, die die Proteinexpression und -detektion unterstützen, oder (ii) ein bakterieller Expressionsvektor, der ein Superoxid-Dismutase (SOD) und CMP-KDO-Synthetase (CKS) oder ein anderes Proteinfusionsgen für die Expression der Proteinsequenz enthält. Verfahren und Vektoren, die für die Produktion von Polypeptiden nützlich sind, die Fusionssequenzen von SOD enthalten, sind in der veröffentlichten EPO-Anmeldung Nr. EP 0 196 056 , veröffentlicht am 1. Oktober 1986, beschrieben, und Vektoren, die Fusionssequenzen von CKS enthalten, sind in der veröffentlichten EPO-Anmeldung Nr. EP 0 331 961 , veröffentlicht am 13. September 1989, beschrieben. Das gereinigte Protein kann bei einer Vielzahl von Techniken verwendet werden, die tierische Immunisierungsstudien, Festphasen-Immunoassays und dergleichen einschließen aber nicht darauf eingeschränkt sind.
Beispiel 12: Chemische Analyse von Brustgewebeproteinen
A. Analyse von tryptischen Peptidfragmenten unter Verwendung von MS.
Sera von Patienten mit einer Brusterkrankung, wie z. B. Brustkrebs, Sera von Patienten ohne eine Brusterkrankung, Extrakte von Brustgeweben oder Zellen von Patienten mit einer Brusterkrankung, wie z. B. Brustkrebs, Extrakte von Brustgeweben oder Zellen von Patienten ohne eine Brusterkrankung und Extrakte von Geweben oder Zellen von anderen nicht erkrankten oder erkrankten Organen von Patienten werden auf einem Polyacrylamidgel unter Verwendung von standardmäßigen Prozeduren laufen gelassen und mit Coomassie Blau angefärbt. Die Abschnitte des Gels, von dem vermutet wird, dass sie das unbekannte Polypeptid enthalten, werden ausgeschnitten und einer In-Gel-Reduktion, Acetamidierung und einem tryptischen Verdau unterzogen. P. Jeno et al., Anal. Bio. 224: 451-455 (1995) and J. Rosenfeld et al., Anal. Bio. 203: 173-179 (1992). Die Gelabschnitte werden mit 100 mM NH₄HCO₃ und Acetonitril gewaschen. Die geschrumpften Gelstücke werden in Verdaupuffer (50 mM NH₄HCO₃, 5 mM CaCl₂ und 12,5 μg/ml Trypsin) bei 4 °C für 45 min gequollen. Der Überstand wird aspiriert und durch 5 bis 10 μl Verdaupuffer ohne Trypsin ersetzt und die Inkubation wird über Nacht bei 37 °C gestattet. Die Peptide werden mit 3 Wechseln von 5 Ameisensäure und Acetonitril extrahiert und bis zur Trockene abgezogen. Die Peptide werden auf ungefähr 0,1 μl POROS R2 Sorbens (Perseptive Biosystems, Framingham, Massachusetts) absorbiert, das in der Spitze eines gezogen Gaschromatographie-Kapillarröhrchens festgehalten wird, indem sie in 10 μl 5 Ameisensäure gelöst und sie durch die Kapillare gegeben werden. Die absorbierten Peptide werden mit Wasser gewaschen und mit 5 Ameisensäure in 60 Methanol eluiert. Der Eluent wird unmittelbar in die Sprühkapillare eines API III Massenspektrometers (Perkin-Elmer Sciex, Thornhill, Ontario, Canada) für die Analyse über Nano-Elektrospray-Massenspektro metrie gegeben. M. Wilm et al., Int. J. Mass Spectrom. Ion Process 136: 167-180 (1994) and M. Wilm et al., Anal. Chem. 66: 1-8 (1994). Die Massen der tryptischen Peptide werden aus dem Massenspektrum bestimmt, das von dem ersten Quadrupol erhalten wurde. Die Massen, die den vorhergesagten Peptiden entsprechen, können in dem MS/MS-Modus weiter analysiert werden, um die Aminosäure-Sequenz des Peptids zu liefern.
B. Peptidfragmentanalyse unter Verwendung von LC/MS.
Das Vorhandensein von Polypeptiden, die aus mRNA-Sequenzen vorhergesagt wurden, die in hyperplastischen Erkrankungsgeweben gefunden werden, kann ferner unter Verwendung von Flüssigchromatographie/Tandem-Massenspektrometrie (LC/MS/MS) bestätigt werden. D. Hess et al., METHODS, A Companion to Methods in Enzymology 6: 227-238 (1994). Die Serumprobe oder der Tumorextrakt von dem Patienten wird mit SDS denaturiert und mit Dithiothreitol (1,5 mg/ml) für 30 min bei 90 °C reduziert, worauf eine Alkylierung mit Iodacetamid (4 mg/ml) für 15 min bei 25 °C folgt. Nach der Acrylamidelektrophorese werden die Polypeptide auf eine kationische Membran elektrogeblottet und mit Coomassie Blau angefärbt. Nach dem Anfärben werden die Membrane gewaschen und die Abschnitte, von denen vermutet wird, dass sie die unbekannten Polypeptide enthalten, werden herausgeschnitten und in kleine Stücke zerlegt. Die Membrane werden in 500 μl Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und in 10 bis 20 μl proteolytischer Verdaupuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,2, enthaltend 0,1 M NaCl, 10 % Acetonitril, 2 mM CaCl₂ und 5 μg/ml Trypsin) (Sigma, St. Louis, MO) eingetaucht. Nach 15 h bei 37 °C werden 3 μl gesättigter Harnstoff und 1 μl 100 μg/ml Trypsin zugegeben und für weitere 5 h bei 37 °C inkubiert. Das Verdaugemisch wird mit 3 μl 10 % Trifluoressigsäure angesäuert und zentrifugiert, um den Überstand von der Membran zu trennen. Der Überstand wird unmittelbar auf eine Microbore-Umkehrphasen-HPLC-Säule injiziert und mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in 0,05 % Trifluoressigsäure eluiert. Das Eluat wird unmittelbar in ein Elektrospray-Massenspektrometer gegeben, nachdem ein Stream Splitter, falls erforderlich, durchlaufen wurde, um das Volumen an Material einzustellen. Die Daten werden gemäß den Prozeduren analysiert, die in dem Beispiel 12, Abschnitt A, dargelegt sind.
Beispiel 13: Gen-Immunisierungsprotokoll
A. In vivo Antigenexpression.
Die Gen-Immunisierung umgeht die Proteinreinigungsschritte, indem unmittelbar ein Antigen in vivo nach der Impfung des entsprechenden Expressionsvektors exprimiert wird. Ferner kann die Produktion von Antigen über dieses Verfahren eine korrekte Proteinfaltung und Glycosylierung gestatten, da das Protein in Säugetiergewebe produziert wird. Das Verfahren verwendet die Insertion der Gensequenz in ein Plasmid, das einen CMV-Promotor enthält, die Expansion und Reinigung des Plasmids und die Injektion der Plasmid-DNA in das Muskelgewebe eines Tieres. Bevorzugte Tiere schließen Mäuse und Kaninchen ein. Siehe zum Beispiel H. Davis et al., Human Molecular Genetics 2: 1847-1851 (1993). Nach einer oder zwei verstärkenden Immunisierungen kann danach das Tier ausgeblutet, die Aszitesflüssigkeit eingesammelt oder die Milz des Tieres kann für die Produktion von Hybridomen entnommen werden.
B. Plasmidherstellung und Reinigung.
Die BS106-cDNA-Insertion wurde aus dem BS106-Vektor, der in Beispiel 11b beschrieben ist, über Verdau mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI freigesetzt. Die verdauten Plasmidfragmente wurden auf einem 1 Seakem KE Agarose/0,5 μg/ml Ethidiumbromid/TE Gel elektrophoresiert und die Banden wurden über UV-Belichtung sichtbar gemacht. Das Insertionsfragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung der vorstehend beschriebenen QIAquick Prozedur gereinigt. Das Fragment wurde in einen EcoRI/NotI-verdauten pcDNA3.1-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) ligiert und in DH5-alpha-Zellen transformiert, wie vorstehend beschrieben ist. Die Plasmid-DNA wurde von dem bakteriellen Lysat unter Verwendung einer QIAprep Säule gereinigt. Sämtliche dieser Techniken sind einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie vertraut.
C. Immunisierungsprotokoll.
Anästhesierte Tiere werden intramuskulär mit 0,1-100 μg des gereinigten Plasmids immunisiert, das in PBS oder anderen Enhancern für die DNA-Aufnahme (Cardiotoxin, 25 Saccharose) verdünnt ist. Siehe zum Beispiel H. Davis et al., Human Gene Therapy 4: 733-740 (1993); und P. W. Wolff et al., Biotechniques 11: 474-485 (1991). Nur zwei verstärkende Injektionen werden in monatlichen Intervallen verabreicht.
D. Untersuchung und Verwendung von Antiserum.
Tiere werden ausgeblutet und die resultierenden Sera werden unter Verwendung von Peptiden, die aus der bekannten Gensequenz (siehe Beispiel 16) unter Verwendung von in dem Fachgebiet bekannten Techniken, wie z. B. Western Blotting oder EIA-Techniken synthetisiert wurden, auf Antikörper getestet. Die über dieses Verfahren produzierten Antisera können danach verwendet werden, um das Vorhandensein des Antigens in dem Gewebe oder Zellen Extrakt eines Patienten oder in dem Serum eines Patienten über ELISA oder Western Blotting Techniken zu detektieren, wie z. B. diejenigen, die in den Beispielen 15 bis 18 beschrieben sind.
Beispiel 14: Herstellung von Antikörpern gegen BS106
A. Herstellung von polyklonalen Antisera.
Das Antiserum gegen BS106 wird über Injizieren von Kaninchen mit Peptiden hergestellt, deren Sequenzen von derjenigen der vorausgesagten Aminosäure-Sequenz der BS106-Konsensussequenz (Sequenz-Identifikationsnummer 4) abgeleitet sind. Die Synthese der Peptide (Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19 und Sequenz-Identifikationsnummer 20) ist in Beispiel 10 beschrieben.
1. Peptidkonjugation.
Das Peptid wird an das Maleimid-aktivierte Hämocyanin der Schlüssellochschnecke (KLH, im Handel erhältliches Imject^®, erhältlich von Pierce Chemical Company, Rockford, IL) konjugiert. Imject^® enthält etwa 250 Mol an reaktiven Maleimidgruppen pro Mol Hämocyanin. Das aktivierte KLH wird in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 8,4) bei einer Konzentration von etwa 7,7 mg/ml aufgelöst. Das Peptid wird über Cysteine, die in der Peptidsequenz auftreten, oder an ein Cystein konjugiert, das zuvor an das synthetisierte Peptid addiert wurde, um einen Anbindungspunkt bereitzustellen. Das Peptid wird in Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) gelöst und mit dem aktivierten KLH bei einem Molverhältnis von etwa 1,5 Mol Peptid pro Mol reaktives Maleimid, das an das KLH gebunden ist, zur Reaktion gebracht. Eine Prozedur für die Konjugation des Peptids ist hierin nachstehend bereitgestellt. Es ist dem Durchschnittsfachmann bekannt, dass die Menge, die Zeiten und die Bedingungen für eine solche Prozedur variiert werden können, um die Peptidkonjugation zu optimieren.
Die hierin nachstehend beschriebene Konjugationsreaktion basiert darauf, 3 mg KLH-Peptidkonjugat ("konjugiertes Peptid") zu erhalten, das etwa 0,77 μmol reaktive Maleimidgruppen enthält. Diese Menge an Peptidkonjugat ist gewöhnlich für eine primäre Injektion und vier verstärkende Injektionen für die Produktion von polyklonalen Antisera in einem Kaninchen ausreichend. Kurz gefasst wird das Peptid in DMSO bei einer Konzentration von 1,16 μmol/100 μl DMSO gelöst. Einhundert Mikroliter (100 μl) der DMSO-Lösung werden 380 μl der aktivierten KLH-Lösung zugegeben, wie hierin vorstehend beschrieben hergestellt, und 20 μl PBS (pH 8,4) werden zugegeben, um das Volumen auf 500 μl zu bringen. Die Reaktion wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert. Das Ausmaß der Reaktion wird durch Messen der Menge an nicht umgesetztem Thiol in dem Reaktionsgemisch bestimmt. Die Differenz zwischen der Ausgangskonzentration des Thiols und der Endkonzentration wird als die Konzentration des Peptids angenommen, das an das aktivierte KLH gekoppelt wurde. Die Menge an verbliebenem Thiol wird unter Verwendung von Reagenz nach Ellman (5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure), Pierce Chemical Company, Rockford, IL) bestimmt. Cystein-Standards werden mit einer Konzentration von 0, 0, 1, 0, 5, 2, 5 und 20 mM durch Lösen von 35 mg Cystein-HCl (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) in 10 ml PBS (pH 7,2) und Verdünnen der Stammlösung auf die gewünschte Konzentration hergestellt. Die photometrische Bestimmung der Konzentration des Thiols wird bewerkstelligt, indem 200 μl PBS (pH 8,4) in jede Vertiefung einer Immulon 2^® Mikrowellplatte (Dynex Technologies, Chantilly, VA) gegeben werden. Als Nächstes werden 10 μl Standard oder Reaktionsgemisch in jede Vertiefung gegeben. Schließlich werden 20 μl Reagenz nach Ellman bei einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS (pH 8,4) jeder Vertiefung zugegeben. Die Vertiefungen werden für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Extinktion von sämtlichen Vertiefungen wird bei 415 nm mit einem Mikroplattenableser gemessen (wie z. B. das BioRad Model 3550, BioRad, Richmond, CA). Die Extinktion der Standards wird verwendet, um eine Standardkurve zu konstruieren, und die Thiol-Konzentration des Reaktionsgemisches wird aus der Standardkurve bestimmt. Eine Abnahme in der Konzentration des freien Thiols ist ein Anzeichen für eine erfolgreiche Konjugationsreaktion. Zusätzlich gestattet die Berechnung an freiem Thiol in der Peptidlösung vor der Zugabe des Maleimid-aktivierten KLH und nach der Beendigung der Reaktion die Bestimmung des Substitutionverhältnisses an Mol Peptid/Mol KLH für jedes Konjugat Peptid × KLH. In sämtlichen Fällen wurde die Reaktion bis zur Vollständigkeit durchgeführt und für jedes Peptidkonjugat wurden ungefähr 250 Peptide/KLH-Molekül hergestellt. Sämtliches nicht umgesetztes Peptid wird über Dialyse gegen PBS (pH 7,2) bei Raumtemperatur für 6 Stunden entfernt. Das Konjugat wird bei 2-8 °C gelagert, falls es unmittelbar verwendet werden soll; ansonsten wird es bei –20 °C oder kälter gelagert.
2. Tierimmunisierung.
Weibliche weiße Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von 2 kg oder mehr wurden für das Anziehen von polyklonalem Antiserum verwendet. Ein Tier wurde pro Peptid (Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19 bzw. Sequenz- Identifikationsnummer 20) immunisiert. Eine Woche vor der ersten Immunisierung wurden 5 bis 10 ml Blut aus den Tier entnommen, um als eine nicht-immune vorentnommene Probe zu dienen.
Jedes der Peptide, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19 und Sequenz-Identifikationsnummer 20, wurde verwendet, um das primäre Immunogen über Emulgieren von 0,5 ml des Peptids bei einer Konzentration von 2 mg/ml in PBS (pH 7,2) mit 0,5 ml vollständigem Adjuvans nach Freund (CFA) (Difco, Detroit, MI) herzustellen. Das Immunogen wurde an mehreren Stellen des Tieres über subkutane, intraperitoneale und/oder intramuskuläre Wege der Verabreichung injiziert. Vier Wochen nach der primären Immunisierung wurde eine verstärkende Immunisierung verabreicht. Das Immunogen, das für die verstärkende Immunisierungsdosis verwendet wurde, wurde über Emulgieren von 0,5 ml des gleichen Peptids hergestellt, das für das primäre Immunogen verwendet wurde, mit der Ausnahme, dass das Peptid nun auf 1 mg/ml mit 0,5 ml unvollständigem Adjuvans nach Freund (IFA) (Difco, Detroit, MI) verdünnt wurde. Wiederum wurde die verstärkende Dosis an mehreren Stellen verabreicht und subkutane, intraperitoneale und intramuskuläre Arten von Injektionen wurden verwendet. Dem Tier wurde zwei Wochen nach der verstärkenden Immunisierung Blut (5 ml) entnommen und das Serum wurde auf eine Immunoreaktivität gegenüber dem Peptid getestet, wie nachstehend beschrieben ist. Der Ablaufplan für die Verstärkung und die Blutentnahme wird in Intervallen von 4 Wochen wiederholt, bis ein adäquater Titer erhalten wird. Der Titer oder die Konzentration an Antiserum wird über Mikrotiter-EIA bestimmt, wie nachstehend in Beispiel 17 beschrieben ist. Zusätzlich werden apparente Affinitätswerte [K_d(app)] für einige der Antisera bestimmt (siehe Beispiel 17).
Ein Antikörpertiter von 1:500 oder größer wird als ein adäquater Titer für die weitere Verwendung und Untersuchung betrachtet.
B. Herstellung von monoklonalem Antikörper
1. Immunisierungsprotokoll.
Mäuse werden unter Verwendung von Immunogenen, die wie hierin vorstehend beschrieben hergestellt wurden, mit der Ausnahme immunisiert, dass die Menge des unkonjugierten oder konjugierten Peptids für die monoklonale Antikörperproduktion in Mäusen ein Zehntel der Menge beträgt, die für die Produktion der polyklonalen Antisera in Kaninchen verwendet wurde. Somit besteht das primäre Immunogen aus 100 μg unkonjugiertem oder konjugiertem Peptid in 0,1 ml CFA-Emulsion; während das für verstärkende Immunisierungen verwendete Immunogen aus 50 μg unkonjugiertem oder konjugiertem Peptid in 0,1 ml IFA besteht. Die Hybridomas für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern werden unter Verwendung von standardmäßigen Techniken hergestellt und gescreent. Die Verfahren, die für die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern verwendet wurden, folgen in dem Fachgebiet bekannten Prozeduren, wie z. B. denjenigen, die in Kohler und Milstein, Nature 256: 494 (1975) detailliert und in J. G. R. Hurrel, Hrsg., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1982) zusammengefasst sind. Ein weiteres Verfahren für die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern, das auf dem Verfahren von Kohler und Milstein basiert, ist das von L. T. Mimms et al., Virology 176: 604-619(1990).
Das Immunisierungsregime (pro Maus) besteht aus einer primären Immunisierung mit zusätzlichen verstärkenden Immunisierungen. Das für die primäre Immunisierung verwendete primäre Immunogen besteht aus 100 μg unkonjugiertem oder konjugiertem Peptid in 50 μl PBS (pH 7,2), das zuvor in 50 μl CFA emulgiert wurde. Die verstärkenden Immunisierungen, die ungefähr zwei Wochen und vier Wochen nach der primären Immunisierung durchgeführt wurden, bestehen aus 50 μg unkonjugiertem oder konjugiertem Peptid in 50 μl PBS (pH 7,2), das mit 50 μl IFA emulgiert wurde. Eine Gesamtmenge von 100 μl dieses Immunogens wird in jede Maus intraperitoneal und subkutan geimpft. Einzelne Mäuse werden über einen Mikrotiterplatten-Enzym-Immunoassay (EIA), wie in Beispiel 17 beschrieben ist, ungefähr vier Wochen nach der dritten Immunisierung auf eine Immunantwort gescreent. Die Mäuse werden entweder intravenös, intrasplenisch oder intraperitoneal mit 50 μg unkonjugiertem oder konjugiertem Peptid in PBS (pH 7,2) ungefähr 15 Wochen nach der dritten Immunisierung geimpft.
Drei Tage nach dieser intravenösen Verstärkung werden die Splenocyten mit zum Beispiel Sp2/0-Ag14-Myelomazellen (Nilstein Laboratories, England) unter Verwendung des Polyethylenglycol (PEG) Verfahrens fusioniert. Die Fusionen werden in nach Iscove modifiziertem Medium nach Dulbecco (IMDM) kultiviert, das 10 fetales Kälberserum (FCS), plus 1 Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthält. Die Massenkulturen werden über Mikrotiterplatten-EIA gemäß dem Protokoll in Beispiel 17 gescreent. Die Klone, die mit dem Peptid reagierten, das als Immunogen verwendet wurde, und mit anderen Peptiden (d. h. Peptiden von BS106, die nicht als das Immunogen verwendet wurden) nicht reagierten, werden für die endgültige Expansion ausgewählt. Die so ausgewählten Klone werden expandiert, aliquotiert und in IMDM eingefroren, das 10 FCS und 10 Dimethylsulfoxid enthält.
2. Herstellung von monoklonale Antikörper enthaltender Aszitesflüssigkeit.
Gefrorene Hybridomazellen, die wie hierin vorstehend beschrieben hergestellt wurden, werden aufgetaut und in eine Expansionskultur gegeben. Entwicklungsfähige Hybridomazellen werden intraperitoneal in mit Pristan behandelte Mäuse geimpft. Aszitesflüssigkeit wird aus den Mäusen entnommen, vereinigt, durch ein 0,2 μ Filter filtriert und einer Immunoglobulinklasse G (IgG) Analyse unterzogen, um das Volumen der Protein A Säule zu bestimmen, die für die Reinigung erforderlich ist.
3. Reinigung von monoklonalen Antikörpern aus Aszitesflüssigkeit.
Kurz gefasst wird filtrierte und aufgetaute Aszitesflüssigkeit mit einem gleichen Volumen an Protein A Sepharose Bindungspuffer (1,5 M Glycin, 3,0 M NaCl, pH 8,9) vermischt und durch ein 0,2 μ Filter erneut filtriert. Das Volumen der Protein A Säule wird über die Menge an IgG bestimmt, die in der Aszitesflüssigkeit vorhanden ist. Das Eluat wird danach gegen PBS (pH 7,2) über Nacht bei 2-8 °C dialysiert. Der dialysierte monoklonale Antikörper wird steril filtriert und in Aliquote aufgeteilt. Die Immunoreaktivität des gereinigten monoklonalen Antikörpers wird über die Bestimmung seiner Fähigkeit, spezifisch an das Peptid zu binden, das als das Immunogen verwendet wurde, unter Verwendung der EIA-Mikrotiterplatten Assayprozedur aus Beispiel 17 bestätigt. Die Spezifität des gereinigten monoklonalen Antikörpers wird durch Bestimmung seiner fehlenden Bindung an irrelevante Peptide bestätigt, wie z. B. die Peptide von BS106, die nicht als das Immunogen verwendet wurden. Der so hergestellte und charakterisierte gereinigte anti-BS106 monoklonale Antikörper wird entweder auf 2-8 °C für eine kurzzeitige Lagerung oder auf –80 °C für eine langzeitige Lagerung gestellt.
4. Weitere Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers.
Der Isotyp und Subtyp des wie hierin vorstehend beschrieben hergestellten monoklonalen Antikörpers kann unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits (erhältlich von Amersham, Inc., Arlington Heights, IL) bestimmt werden. Die Stabilitätsuntersuchung kann ferner an dem monoklonalen Antikörper durchgeführt werden, indem eine Aliquote des monoklonalen Antikörpers kontinuierlich bei 2-8 °C gelagert wird und die Messungen der optischen Dichte (OD) im Verlauf einer gegebenen Zeitspanne untersucht werden.
C. Verwendung von rekombinanten Proteinen als Immunogene.
Es liegt in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, dass wie hierin beschrieben hergestellte rekombinante Proteine, bei der Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern mit entsprechenden Änderungen bei den Reagenzien und Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, als Immunogene verwendet werden können.
Beispiel 15: Reinigung von Serum-Antikörpern, die spezifisch an BS106-Peptide binden
Immunsera, die wie hierin vorstehend in den Beispielen 13 und/oder 14 beschrieben erhalten wurden, werden unter Verwendung von immobilisierten synthetischen Peptiden, die wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt wurden, oder rekombinanten Proteinen, die wie in Beispiel 11 beschrieben hergestellt wurden, affinitätsgereinigt. Eine IgG-Fraktion des Antiserums wird erhalten, indem das verdünnte, rohe Antiserum über eine Protein A Säule (Affi-Gel Protein A, Bio-Rad, Hercules, CA) gegeben wird. Die Flution mit einem Puffer (Bindungspuffer, von dem Hersteller geliefert) entfernt im Wesentlichen sämtliche Proteine, die keine Immunoglobuline sind. Die Flution mit 0,1 M gepuffertem Glycin (pH 3) ergibt eine Immunoglobulin-Präparation, die im Wesentlichen von Albumin und anderen Serum-Proteinen frei ist.
Die Immunoaffinitätschromatographie wird durchgeführt, um eine Präparation mit einer höheren Fraktion an spezifischem Antigenbindendem Antikörper zu erhalten. Das für die Erhöhung des Antiserums verwendete Peptid wird auf einem Chromatographieharz immobilisiert und die spezifischen Antikörper, die gegen dessen Epitope gerichtet sind, werden an dem Harz adsorbiert. Nachdem nicht bindende Komponenten weggewaschen wurden, werden die spezifischen Antikörper mit 0,1 M Glycinpuffer (pH 2,3) eluiert. Die Antikörperfraktionen werden sofort mit 1,0 M Tris-Puffer (pH 8,0) neutralisiert, um die Immunoreaktivität zu bewahren. Das gewählte Chromatographieharz hängt von den reaktiven Gruppen ab, die in dem Peptid vorhanden sind. Wenn das Peptid über eine Aminogruppe verfügt, wird ein Harz, wie z. B. Affi-Gel 10 oder Affi-Gel 15 verwendet (Bio-Rad, Hercules, CA). Wenn die Kopplung über eine Carboxygruppe an dem Peptid gewünscht ist, kann Affi-Gel 102 verwendet werden (Bio-Rad, Hercules, CA). Wenn das Peptid über eine freie Sulfhydrylgruppe verfügt, kann ein Organoquecksilber-Harz, wie z. B. Affi-Gel 501 (Bio-Rad, Hercules, CA oder SulkfoLink^TM (Pierce, Rockford, IL) verwendet werden. Die Menge an Peptid, das an dem Harz immobilisiert wird, kann unter Verwendung von Nano Orange^TM (Molecular Probes, Eugene, OR) bestimmt werden.
Alternativ dazu können die Milz entnommen und bei der Produktion von Hybridomas verwendet werden, um monoklonale Antikörper gemäß wie hierin vorstehend beschriebenen Routineverfahren herzustellen, die in dem Fachgebiet bekannt sind.
Beispiel 16: Western Blotting von Gewebeproben
Proteinextrakte werden hergestellt, indem Gewebeproben in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 15 (m/V) Glycerol, 0,2 mM EDTA, 1,0 mM 1,4-Dithiothreitol, 10 μg/ml Leupeptin und 1,0 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Kain et al., Biotechniques, 17: 982 (1994)) homogenisiert werden. Nach der Homogenisierung werden die Homogenisate bei 4 °C für 5 Minuten zentrifugiert, um den Überstand von dem Brei zu trennen. Für die Proteinquantifizierung werden 3-10 μl Überstand 1,5 ml Bicinchoninsäure-Reagenz (Sigma, St. Louis, MO) zugegeben und die resultierende Extinktion bei 562 nm wird gemessen.
Für die SDS-PAGE werden die Proben auf die gewünschte Proteinkonzentration mit Tricin-Puffer (Novex, San Diego, CA) eingestellt, mit einem gleichen Volumen an 2X Tricin-Probenpuffer (Novex, San Diego, CA) vermischt und für 5 Minuten bei 100 °C in einem Thermal Cycler erwärmt. Die Proben werden danach auf ein Novex 10-20 vorgeformtes Tricin-Gel für die Elektrophorese aufgetragen. Nach der Elektrophorese werden die Proben aus den Gelen auf Nitrocellulosemembrane in Novex Tris-Glycin-Transferpuffer übertragen. Die Membrane werden danach mit spezifischen anti-Peptid-Antikörpern unter Verwendung der Reagenzien und Prozeduren getestet, die in den Western Lights oder Western Lights Plus (Tropix, Redford, MA) chemilumineszenten Detektionskits bereitgestellt sind. Die chemilumineszenten Banden werden sichtbar gemacht, indem die entwickelten Membranen Hyperfilm ECL (Amersham, Arlington Heights, IL) ausgesetzt werden.
Konkurrenzexperimente werden auf eine analoge Art und Weise wie vorstehend mit der folgenden Ausnahme durchgeführt; die primären Antikörper (polyklonale anti-Peptid-Antisera) werden für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit variieren den Konzentrationen an Peptid-Immunogen vor-inkubiert, bevor sie dem Nitrocellulosefilter ausgesetzt werden. Die Entwicklung des Western Blot wird wie vorstehend durchgeführt.
Nach der Sichtbarmachung der Banden auf Film, können die Banden ferner unmittelbar auf den Membranen durch die Zugabe und Entwicklung eines chromogenen Substrates, wie z. B. 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat (BCIP), sichtbar gemacht werden. Diese chromogene Lösung enthält 0,016 BCIP in einer Lösung, die 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ und 100 mM Tris-HCl (pH 9,5) enthält. Der Filter wird in der Lösung bei Raumtemperatur inkubiert, bis sich die Banden zu der gewünschten Intensität entwickeln. Die Bestimmung der Molmasse wird auf der Basis der Mobilität von vorgefärbten Molmassenstandards (Novex, San Diego, CA) oder biotinylierten Molmassenstandards (Tropix, Redford, MA) vorgenommen.
Beispiel 17: EIA-Mikrotiterplattenassay
Die Immunoreaktivität von Antiserum, das vorzugsweise aus Kaninchen oder Mäusen erhalten wurde, wie in Beispiel 13 oder Beispiel 14 beschrieben ist, wird mit Hilfe einer Mikrotiterplatten-EIA wie folgt bestimmt. Die synthetischen Peptide, die wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt wurden, oder die rekombinanten Proteine, die wie in Beispiel 11 beschrieben hergestellt wurden, werden in 50 mM Carbonatpuffer (pH 9,6) auf eine Endkonzentration von 2 μg/ml gelöst. Als Nächstes werden 100 μl der Peptid- oder Proteinlösung in jede Vertiefung einer Immulon 2^® Mikrotiterplatte (Dynex Technologies, Chantilly, VA) gegeben. Die Platte wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und danach viermal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die Vertiefungen werden durch die Zugabe von 125 μl eines geeigneten Proteinblockierungsmittels, wie z. B.
Superblock^® (Pierce Chemical Company, Rockford, IL), in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) zu jeder Vertiefung blockiert und unmittelbar danach wird die Lösung verworfen. Diese Blockierungsprozedur wird dreimal durchgeführt. Das Antiserum, das aus immunisierten Kaninchen oder Mäusen erhalten wurde, die wie zuvor beschrieben präpariert wurden, wird in einem Proteinblockierungsmittel (z. B. eine 3 Superblock^® Lösung) in PBS, das 0,05 Tween-20^® (Monolauratpolyoxyethylenether) enthält (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), und 0,05 Natriumazid bei Verdünnungen von 1:500, 1:2.500, 1:12.500, 1:62.500 und 1:312.500 verdünnt und in jede Vertiefung der beschichteten Mikrotiterplatte gegeben. Die Vertiefungen werden danach für drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Jede Vertiefung wird viermal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Ein Hundert μl alkalische Phosphatase-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG- oder Ziegen-anti-Maus-IgG-Antiserum (Southern Biotech, Birmingham, AB), das 1:2.000 in 3 Superblock^® Lösung in Phosphat-gepufferter Salzlösung verdünnt ist, die 0,05 Tween 20^® und 0,05 Natriumazid enthält, wird jeder Vertiefung zugegeben. Die Vertiefungen werden für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Als Nächstes wird jede Vertiefung viermal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Ein Hundert Mikroliter (100 μl) Paranitrophenylphosphat-Substrat (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) werden danach jeder Vertiefung zugegeben. Die Vertiefungen werden für dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion bei 405 nm wird für jede Vertiefung gemessen. Die positiven Reaktionen werden über einen Anstieg in der Extinktion bei 405 nm in der Testvertiefung oberhalb derjenigen Extinktion bestimmt, die von einem nicht immunen Serum (negative Kontrolle) geliefert wird. Eine positivere Reaktion ist ein Anzeichen für das Vorhandensein von detektierbaren anti-BS106-Antikörpern.
Zusätzlich zu den Titern können ferner die apparenten Affinitäten [K_d(app)] für einige der anti-Peptid-Antisera bestimmt werden. Die Ergebnisse des EIA-Mikrotiterplattenassays können verwendet werden, um die apparenten Dissoziationskonstanten (Kd) auf der Basis eines Analogons zu der Michaelis-Menten-Gleichung abzuleiten (V. Van Heyningen, Methods in Enzymology, Bd. 121, S. 472 (1986), das weiter in X. Qiu, et al., Journal of Immunology, Bd. 156, S. 3350 (1996)) beschrieben ist:
wobei [Ag – Ab] die Konzentration des Antigen-Antikörperkomplexes, [Ag – Ab]_max die maximale Komplexkonzentration, [Ab] die Antikörperkonzentration und K_d die Dissoziationskonstante darstellt. Während der Kurvenanpassung wird die [Ag – Ab] durch den abgezogen Wert des Hintergrundes der OD_405nm bei der gegebenen Endkonzentration von Ab ersetzt. Sowohl K_d als auch [OD_405nm]_max, die der [Ag – Ab]_max entspricht, werden als angepasste Parameter behandelt. Das Software-Programm Origin kann für die Kurvenanpassung verwendet werden.
Beispiel 18: Beschichtung von Festphasenteilchen
A. Beschichtung von Mikroteilchen mit Antikörpern, die spezifisch an das BS106-Antigen binden.
Affinitätsgereinigte Antikörper, die spezifisch an das BS106-Protein (siehe Beispiel 15) binden, werden auf Mikroteilchen aus Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol, Polymethylacrylat oder ähnliche Teilchen aufgebracht, die einen Radius in dem Bereich von etwa 0,1 bis 20 μm aufweisen. Die Mikroteilchen können entweder passiv oder aktiv beschichtet werden. Ein Beschichtungsverfahren umfasst die Beschichtung von mit EDAC (1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) aktivierten carboxylierten Latex-Mikroteilchen mit Antikörpern, die spezifisch an das BS106-Protein binden, wie folgt. Kurz gefasst wird eine endgültige 0,375 Feststoffsuspension an mit Harz gewaschenen carboxylierten Latexmikroteilchen (erhältlich von Hangs Laboratories, Camel, IN oder Serodyn, Indianapolis, IN) in einer Lösung, die 50 mM MES-Puffer, pH 4,0 und 150 mg/l affinitätsgereinigten anti-BS106-Antikörper (siehe Beispiel 14) enthält, für 15 min in einen angemessenen Behälter vermischt. Das EDAC-Kopplungsagens wird dem Gemisch bis zu einer Endkonzentration von 5,5 μg/ml zugegeben und es wird für 2,5 h bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mikroteilchen werden danach mit 8 Volumina eines Tween 20^®/Natriumphosphat-Waschpuffers (pH 7,2) über Tangentialflussfiltration unter Verwendung eines 0,2 μm Microgon Filtrationsmoduls gewaschen. Die gewaschenen Mikroteilchen werden in einem angemessenen Puffer aufbewahrt, der gewöhnlich ein verdünntes Tensid und ein irrelevantes Protein als ein Blockierungsmittel enthält, bis sie benötigt werden.
B. Beschichtung von 1/4-Zoll Kügelchen.
Antikörper, die spezifisch an das BS106-Antigen binden, können ferner auf die Oberfläche von 1/4-Zoll Polystyrolkügelchen über Routineverfahren aufgebracht werden, die in dem Fachgebiet bekannt sind ( US-Patent Nr. 5,273,882 an Snitman et al.) und bei kompetitiven Hindungs- oder EIA-Sandwichassays verwendet werden.
Die Polystyrolkügelchen werden zunächst über eine Ultraschallbehandlung für etwa 15 Sekunden in 10 mM NaHCO₃-Puffer bei pH 8,0 gereinigt. Die Kügelchen werden danach in entionisiertem Wasser gewaschen, bis sämtliche Feinstoffe entfernt sind. Die Kügelchen werden danach in eine Antikörperlösung in 10 mM Carbonat-Puffer, pH 8 bis 9,5, eingetaucht. Die Antikörperlösung kann so weit verdünnt sein wie 1 μg/ml, in dem Fall von monoklonalen Antikörpern mit hoher Affinität, oder so konzentriert sein wie etwa 500 μg/ml für polyklonale Antikörper, die noch nicht affinitätsgereinigt worden sind. Die Kügelchen werden für mindestens 12 Stunden bei Raumtemperatur beschichtet und danach werden sie mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die Kügelchen können an der Luft getrocknet oder nass (in PBS, pH 7,4) gelagert werden. Sie können ferner mit Proteinstabilisatoren (wie z. B. Saccharose) oder Proteinblockierungsmitteln überzogen werden, die als nicht spezifische Bindungsblocker (wie z. B. irrelevante Proteine, Carnation Magermilch, Superblock^® oder dergleichen) verwendet werden.
Beispiel 19: Mikroteilchen-Enzym-Immunoassay (MEIA)
Die BS106-Antigene werden in Patiententestproben über die Durchführung eines standardmäßigen kompetitiven Antigen-EIA oder Antikörper-Sandwich-EIA und unter Verwendung einer festen Phase, wie z. B. Mikroteilchen (MEIA), durchgeführt. Der Assay kann auf einem automatisierten Analysator, wie z. B. der IMx^® Analysator (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), durchgeführt werden.
A. Antikörper-Sandwich-EIA.
Kurz gefasst werden Proben, von denen vermutet wird, dass sie BS106-Antigen enthalten, in Gegenwart von mit anti-BS106-Antikörper beschichteten Mikroteilchen (die wie in Beispiel 17 beschrieben hergestellt wurden) inkubiert, damit Antigen/Antikörper-Komplexe gebildet werden. Die Mikroteilchen werden danach gewaschen und ein Indikatorreagenz, das einen Antikörper umfasst, der mit einer Signal-erzeugenden Verbindung (d. h. Enzymen, wie z. B. alkalische Phosphatase oder Meerretich-Peroxidase) konjugiert ist, wird den Antigen/Antikörper-Komplexen oder den Mikroteilchen zugegeben und inkubiert. Die Mikroteilchen werden gewaschen und die gebundenen Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexe werden über die Zugabe eines Substrates (z. B. 4-Methylumbelliferylphosphat (MUP) bzw. OPD/Peroxid) detektiert, das mit der Signal-erzeugenden Verbindung reagiert, um ein messbares Signal zu erzeugen. Ein erhöhtes Signal in der Testprobe, das mit dem von einer negativen Kontrolle erzeugten Signal verglichen wird, detektiert das Vorhandensein von BS106-Antigen. Das Vorhandensein von BS106-Antigen in der Testprobe ist ein Anzeichen für eine Diagnose einer Brusterkrankung oder eines Zustandes, wie z. B. Brustkrebs.
B. Kompetitiver Bindungsassay.
Der kompetitive Bindungsassay verwendet ein Peptid oder ein Protein, das ein messbares Signal erzeugt, wenn das markierte Peptid mit einem anti-Peptid-Antikörper-überzogenen Mikroteilchen in Kontakt gebracht wird. Dieser Assay kann auf dem IMx^® Analysator (erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) durchgeführt werden. Das markierte Peptid wird den mit BS106-Antikörper beschichteten Mikroteilchen (wie in Beispiel 17 beschrieben hergestellt) in Gegenwart einer Testprobe zugegeben, von der vermutet wird, dass sie das BS106-Antigen enthält, und für eine Zeitdauer und unter Bedingungen inkubiert, die für die Bildung von markierten BS106-Peptid (oder markierten Protein)/gebundene Antikörper-Komplexen und/oder Patienten-BS106-Antigen/gebundene Antikörper-Komplexe ausreichend sind. Das BS106-Antigen in der Testprobe konkurriert mit dem markierten BS106-Peptid (oder BS106-Protein) um Bindungsstellen auf dem Mikroteilchen. Das BS106-Antigen in der Testprobe führt zu einer verringerten Bindung von markierten Peptid und Antikörper-beschichteten Mikroteilchen in dem Assay, da das Antigen in der Testprobe und das BS106-Peptid oder das BS106-Protein um Antikörperbindungsstellen konkurrieren. Ein verringertes Signal (im Vergleich zu einer Kontrolle) zeigt das Vorhandensein von BS106-Antigen in der Testprobe an. Das Vorhandensein von BS106-Antigen legt die Diagnose einer Brusterkrankung oder eines Zustandes, wie z. B. Brustkrebs, nahe.
Die BS106-Polynukleotide und die dadurch kodierten Proteine, die hierin vorstehend bereitgestellt und diskutiert wurden, sind als Marker für eine Brustgewebe-Erkrankung, insbesondere Brustkrebs, nützlich. Untersuchungen, die auf dem Erscheinen dieses Markers in einer Testprobe, wie z. B. Blut, Plasma oder Serum, basieren, können eine kostengünstige, nicht invasive, diagnostische Information bereitstellen, um den Arzt bei der Erstellung einer Diagnose von Krebs zu unterstützen, bei der Auswahl eines Therapieprotokolls zu helfen oder den Erfolg einer gewählten Therapie zu verfolgen. Dieser Marker kann in ohne weiteres zugänglichen Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut, Urin oder Stuhl, als von dem erkrankten Gewebe abgeleitete Antigene erscheinen, die über immunologische Verfahren detektierbar sind. Dieser Marker kann bei einem Erkrankungszustand erhöht sein, bei einem Erkrankungszustand verändert sein oder ein normales Protein der Brust darstellen, das in einem unangemessenen Körperkompartiment erscheint.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins eines BS106 Zielpolynukleotids in einer Testprobe, das folgendes umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit mindestens einem BS106-spezifischen Polynukleotid, welches in der Lage ist an das BS106-Zielpolynukleotid zu hybridisieren; und (b) Detektieren des Vorhandenseins des BS106-Zielpolynukleotids in der Testprobe, worin das BS106-spezifische Polynukleotid eine Sequenz hat, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5, und Fragmenten und Komplementen davon, worin die Fragmente Sequenzen aus mindestens 15 Nukleotiden sind, die identisch oder komplementär sind zu einer Region der Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin das Zielpolynukleotid an eine feste Phase angeheftet wird, bevor Schritt (a) durchgeführt wird.
Ein Verfahren zur Detektion von BS106 mRNA in einer Testprobe, das folgendes umfasst: (a) Durchführen einer reversen Transkription mit mindestens einem Primer, um cDNA zu erzeugen; (b) Amplifizieren der cDNA, die aus Schritt (a) erhalten wurde, unter Verwendung von BS106-spezifischen Oligonukleotiden, die in der Lage sind, als Sense- und Antisenseprimer der cDNA zu wirken, um ein BS106-Amplikon zu erhalten; und (c) Detektieren des Vorhandenseins des BS106-Amplikons in der Testprobe, worin die Oligonukleotide, die in Schritten (a) und (b) verwendet wurden, eine Sequenz haben, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5, und Fragmenten und Komplementen davon, worin die Fragmente Sequenzen aus mindestens 15 Nukleotiden sind, die identisch oder komplementär sind zu einer Region der Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5.
Das Verfahren von Anspruch 3, worin die Testprobe mit einer festen Phase reagiert wird, bevor einer der Schritte (a), (b) oder (c) durchgeführt wird.
Das Verfahren von Anspruch 3, worin der Detektionsschritt die Verwendung eines detektierbaren Markers umfasst, der in der Lage ist ein meßbares Signal zu erzeugen.
Ein Verfahren zur Detektion eines BS106-Zielpolynukleotids in einer Testprobe, das folgendes umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit mindestens einem Oligonukleotid, das in der Lage ist als ein Senseprimer für das BS106-Zielpolynukleotid zu wirken, und mit mindestens einem Oligonukleotid, das in der Lage ist als ein Antisenseprimer für das BS106-Zielpolynukleotid zu wirken, und Amplifizieren, um ein Reaktionsprodukt erster Stufe zu erhalten; (b) In-Kontakt-Bringen des Reaktionsprodukts erster Stufe mit mindestens einem anderen Oligonukleotid, um ein Reaktionsprodukt zweiter Stufe zu erhalten, unter der Voraussetzung, daß das andere Oligonukleotid 3' zu den Oligonukleotiden angeordnet ist, die in Schritt (a) verwendet wurden, und komplementär ist zu dem Reaktionsprodukt erster Stufe; und (c) Detektieren des Reaktionsprodukts zweiter Stufe als ein Anzeichen für das Vorhandensein des Zielpolynukleotids, worin die Oligonukleotide, die in Schritten (a) und (b) verwendet wurden, eine Sequenz haben, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5, und Fragmenten und Komplementen davon, worin die Fragmente Sequenzen aus mindestens 15 Nukleotiden sind, die identisch oder komplementär sind zu einer Region der Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5.
Das Verfahren von Anspruch 6, worin die Testprobe mit einer festen Phase reagiert wird, bevor einer der Schritte (a), (b) oder (c) durchgeführt wird.
Das Verfahren von Anspruch 6, worin der Detektionsschritt die Verwendung eines detektierbaren Markers umfasst, der in der Lage ist ein meßbares Signal zu erzeugen.
Das Verfahren von Anspruch 8, worin der detektierbare Marker mit einer festen Phase reagiert wird.
Ein gereinigtes Polynukleotid mit einer Sequenz, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5, und Fragmenten und Komplementen davon, worin die Fragmente Sequenzen mit einer Länge von 15 bis 50 Nukleotiden sind, die identisch oder komplementär sind zu einer Region der Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5.
Ein Testkit, der nützlich ist zur Detektion von BS106-Polynukleotiden in einer Testprobe, welcher einen Behälter umfasst, der mindestens ein Polynukleotid gemäß Anspruch 10 enthält.
Das gereinigte Polynukleotid von Anspruch 10, worin das Polynukleotid durch rekombinante Techniken oder synthetische Techniken erzeugt wird.
Das gereinigte Polynukleotid von Anspruch 10, worin das Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die mindestens ein Epitop kodiert.
Ein rekombinantes Expressionssystem, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die einen offenen Leserahmen einschließt, der operativ an eine Kontrollsequenz geknüpft ist, die mit einem gewünschten Wirt kompatibel ist, worin die Nukleinsäuresequenz eine Sequenz hat, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5 und Komplementen davon.
Eine isolierte Zelle, die mit dem rekombinanten Expressionssystem von Anspruch 14 transfiziert wurde.
Ein Polypeptid, das eine Aminosäure-Sequenz hat, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20.
Das Polypeptid von Anspruch 16, worin das Polypeptid durch rekombinante Techniken oder synthetische Techniken hergestellt wird.
Ein Antikörper, welcher spezifisch an mindestens ein BS106-Epitop bindet, worin das BS106-Epitop gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20.
Ein Assaykit zur Bestimmung des Vorhandenseins eines BS106-Antigens oder Antikörpers in einer Testprobe, der einen Behälter umfasst, der ein Polypeptid gemäß Anspruch 16 enthält.
Der Assaykit von Anspruch 19, worin das Polypeptid an eine feste Phase angeheftet ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das mindestens ein Epitop umfasst, wobei das Verfahren das Inkubieren von Wirtszellen umfasst, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der eine Polynukleotidsequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, worin das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz umfasst, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20.
Ein Verfahren zur Detektion eines BS106-Antigens in einer Testprobe, von der vermutet wird, daß sie das BS106-Antigen enthält, das folgendes umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einem Antikörper, welcher spezifisch an mindestens ein Epitop eines BS106-Antigens bindet, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20, worin das In-Kontakt-Bringen für einen Zeitraum und unter Bedingungen ausgeführt wird, die ausreichend sind für die Bildung von Antikörper/Antigenkomplexen; und (b) Detektieren des Vorhandenseins der Komplexe als ein Anzeichen für das Vorhandensein des Antigens.
Das Verfahren von Anspruch 22, worin der Antikörper an eine feste Phase angeheftet wird.
Ein Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins von Antikörpern, die spezifisch sind für ein BS106-Antigen, in einer Testprobe, von der vermutet wird, daß sie die Antikörper enthält, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einem Polypeptid, worin das Polypeptid mindestens ein BS106-Epitop enthält, das eine Sequenz hat, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20, und worin weiter das In-Kontakt-Bringen für einen Zeitraum und unter Bedingungen ausgeführt wird, die ausreichend sind, um die Bildung von Antigen/Antikörperkomplexen zu erlauben; und (b) Detektieren der Komplexe.
Das Verfahren von Anspruch 24, worin das Polypeptid an eine feste Phase angeheftet ist.
Eine isolierte Zelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz transfiziert wurde, die mindestens ein Epitop kodiert, worin die Nukleinsäuresequenz gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 1, Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5, und Komplementen davon.
Verwendung eines isolierten immunogenen Polypeptids zur Herstellung von Antikörpern zur Verwendung in in vitro BS106 Antigen-Detektionsverfahren, worin die Antikörper spezifisch an BS106-Antigen binden, wobei die Verwendung das Verabreichen des immunogenen Polypeptids an ein nicht-menschliches Säugetier einschließt, worin das immunogene Polypeptid mindestens ein BS106-Epitop umfasst, und gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20.
Verwendung eines Plasmids, das eine Sequenz umfasst, die mindestens ein BS106-Epitop kodiert, abgeleitet von einem Polypeptid, das eine Aminosäure-Sequenz hat, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-Identifikationsnummer 16, Sequenz-Identifikationsnummer 17, Sequenz-Identifikationsnummer 18, Sequenz-Identifikationsnummer 19, Sequenz-Identifikationsnummer 20, zur Herstellung eines Produkts zur Erzeugung von Antikörpern zur Verwendung in in vitro BS106-Antigen-Detektionsverfahren, worin die Antikörper spezifisch an BS106-Antigen binden, wobei die Verwendung das Verabreichen des Produkts an ein nicht-menschliches Säugetier einschließt.
Eine Zusammensetzung aus einem Material, das ein Polynukleotid gemäß Anspruch 11 umfasst.
Eine Zusammensetzung aus Material, das ein Polypeptid umfasst, das mindestens ein Epitop gemäß Anspruch 17 enthält.
Der Testkit von Anspruch 11 oder 19, der weiter einen Behälter mit Geräten umfasst, die zur Probensammlung nützlich sind, worin die Geräte gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Lanzetten, Saugpapier, Stoff, Tupfern und Bechern.
Ein Gen, welches für ein Protein kodiert, das die Aminosäure-Sequenz von Sequenz-Identifikationsnummer 16 umfasst.
Ein Gen, das DNA mit der Sequenz von Sequenz-Identifikationsnummer 4 oder Sequenz-Identifikationsnummer 5 umfasst.