ES2839514T3

ES2839514T3 - Métodos de diagnóstico basados en perfiles de lípidos

Info

Publication number: ES2839514T3
Application number: ES17735543T
Authority: ES
Inventors: Arranz Ibon Martinez; Sanchez Rebeca Mayo; Espido Azucena Castro; De La Paz José María Mato
Original assignee: One Way Liver S L
Current assignee: One Way Liver S L
Priority date: 2016-07-06
Filing date: 2017-07-06
Publication date: 2021-07-05
Anticipated expiration: 2037-07-06
Also published as: EP3267199A1; EP3482213A1; US20190219602A1; EP3482213B1; WO2018007511A1; US11899027B2

Abstract

Método in vitro para el diagnóstico de enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) en un sujeto que comprende (i) determinar los niveles de todos los marcadores metabólicos según la tabla 1 en una muestra del sujeto, y (ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia, en el que se diagnostica NAFLD en el sujeto según una puntuación que se obtiene introduciendo los valores de dicho(s) marcador(es) metabólico(s) en un modelo de regresión logística.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de diagnóstico basados en perfiles de lípidos

La presente invención se refiere a métodos para el diagnóstico no invasivo de enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD). La invención se refiere además a métodos de diagnóstico para esteatohepatitis no alcohólica (NASH) frente a hígado graso (esteatosis). Estos métodos se basan en la determinación de marcadores metabólicos lipídicos en una muestra biológica del paciente, en los que su expresión está regulada por incremento o por disminución en el paciente con NAFLD frente a pacientes sanos, y en pacientes con NASH frente a pacientes con esteatosis.

La enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) abarca una amplia gama de estados caracterizados por la acumulación de grasa en células hepáticas en ausencia de abuso de alcohol. En un extremo de la escala está el hígado graso simple relativamente inofensivo, o esteatosis, que no provoca daño hepático significativo. Si se deja sin atender, este estado puede progresar hasta estados más avanzados, algunos de los cuales pueden ser potencialmente mortales. La esteatohepatitis no alcohólica (NASH) es un desarrollo significativo de NAFLD, correspondiente a un estado agresivo caracterizado por hinchamiento y dolor a la palpación en el hígado. Con una inflamación intensa en curso puede formarse una acumulación de tejido cicatricial (fibrosis), conduciendo eventualmente a cirrosis cuando bultos irregulares, conocidos como nódulos, sustituyen al tejido hígado liso y el hígado se vuelve más duro. El efecto de esto, junto con la cicatrización continuada debido a fibrosis, significa que el hígado se quedará sin células sanas para soportar funciones normales. Esto puede conducir a insuficiencia hepática completa.

NAFLD es la causa más común de enfermedad hepática crónica en todo el mundo. Se considera una consecuencia directa de la epidemia mundial en crecimiento de la obesidad y el aumento asociado en la prevalencia de diabetes. La mayoría de las personas con hígado graso tienen sobrepeso o son obesas. A medida que cada vez más personas llevan vidas no activas y les sobra algo de peso, también aumenta el número de casos de hígado graso, en particular NASH.

Actualmente no hay ninguna prueba de laboratorio específica para determinar NASH, haciendo que sea extremadamente difícil de diagnosticar ya que es una enfermedad silenciosa e incluso las personas que pasan a desarrollar fibrosis y cirrosis pueden experimentar daño hepático durante muchos años antes de que los síntomas se vuelvan evidentes.

Puede sospecharse NAFLD en sujetos con uno o más componentes del síndrome metabólico, especialmente obesidad y diabetes tipo 2, y niveles de aminotransferasa sérica elevados [alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST)] en ausencia de abuso de alcohol u otra causa común de enfermedad hepática. La única prueba ampliamente aceptada para distinguir NASH de otras formas de enfermedad es una biopsia de hígado. Este procedimiento implica hacer pasar una aguja hueca fina a través de la piel y al interior del hígado, extraer un poco de tejido de muestra que se somete a examen histológico. Aparte de la molestia evidente inducida por este procedimiento invasivo, la evaluación es con frecuencia subjetiva y propensa a error de toma de muestras. El documento WO08021192 describe un método no invasivo para el diagnóstico y la monitorización de enfermedades hepáticas tales como NASH y esteatosis basándose en la determinación de niveles de ácidos grasos y eicosanoides en un líquido corporal del paciente. Sin embargo, este método se limita a la identificación de especies lipídicas y requiere etapas de fraccionamiento complejas de los líquidos corporales antes de poder detectar los metabolitos.

El documento WO12143514 se refiere a un método para el diagnóstico del daño hepático, entre este daño hepático está comprendida la NAFLD, en un sujeto que comprende determinar en una muestra biológica de dicho sujeto los niveles de un panel de marcadores metabólicos. Sin embargo, el método se ha realizado teniendo en cuenta los metabolitos detectados en extractos de suero de rata y comparando sus niveles con el grado de apoptosis presente en las células hepáticas. Por tanto, el daño hepático puede ser de cualquier naturaleza.

El documento WO2013113992 describe un método para determinar la cantidad de grasa hepática y diagnosticar NAFLD basándose en la determinación de determinados lípidos moleculares en una muestra de sangre, sin embargo, este documento no distingue entre NASH/esteatosis dentro de pacientes con NAFLD.

Claramente, existe una necesidad de métodos no invasivos, precisos, para diagnosticar NAFLD y NASH, con el fin de entender mejor dónde se encuentra ubicado el paciente dentro del espectro de fenotipos que pueden progresar hacia cirrosis.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han identificado una serie de marcadores metabólicos lipídicos presentes en las muestras de suero (recogidas en el momento de la biopsia de hígado) que comprenden muestras de sujetos de control en ausencia de NAFLD, y sujetos clasificados como con NAFLD. Entonces pueden usarse estos marcadores metabólicos en un método de diagnóstico rápido, no invasivo, para diagnosticar NAFLD.

Además se identifica un perfil metabólico de lípidos diferente para distinguir entre NASH y esteatosis que va a aplicarse opcionalmente a los pacientes positivos para NAFLD.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) en un sujeto que comprende

(i) determinar los niveles de todos los marcadores metabólicos según la tabla 1 en una muestra del sujeto, y

(ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,

en el que se diagnostica NAFLD en el sujeto según una puntuación que se obtiene introduciendo los valores de dicho(s) marcador(es) metabólico(s) en un modelo de regresión logística.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o esteatosis en un sujeto que padece NAFLD que comprende

(i) determinar los niveles de todos los marcadores metabólicos según la tabla 3 en una muestra del sujeto, y

(ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,

en el que se diagnostica NASH o esteatosis en el sujeto según una puntuación o factor predictivo que se obtiene cuando se introducen los valores de dicho(s) marcador(es) metabólico(s) en un modelo de regresión logística.

Figuras

Figura 1. Gráficos de diagramas de cajas que muestran niveles de marcadores metabólicos según la tabla 1 según se determinan en muestras de suero de pacientes sanos (primero), con esteatosis (segundo) y con NASH (tercero). A. TG(44:1). B. TG(46:0). C. TG(48:0). D. TG(48:1). E. TG(49:1). F. TG(50:2). G. TG(52:1). H. TG(53:0). I. TG(53:1). J. TG(54:5). K. TG(58:2).

Figura 2. Gráficos de diagramas de cajas que muestran niveles de marcadores metabólicos según la tabla 3 según se determinan en muestras de suero de pacientes sanos (primero), con esteatosis (segundo) y con NASH (tercero). A. TG(44:1). B. TG(48:2). C. TG(49:1). D. TG(50:1). E. TG(50:2). F TG(51:1). G. TG(51:2). H. TG(51:3). I. TG(52:0). J. TG(52:2). K. TG(52:3). L. TG(52:4). M. TG(53:3). N. TG(54:2). O. TG(54:3). P. TG(54:5). Q. TG(54:6). R. TG(56:3). S. TG(56:7). T. TG(56:8).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han encontrado que hay lípidos cuyos niveles son diferentes en sujetos que padecen NAFLD en comparación con sus niveles en sujetos sanos (véanse el ejemplo y la figura 1). De manera similar, los autores han identificado algunos marcadores metabólicos con niveles diferenciales en NASH frente a esteatosis (véase el ejemplo y la figura 2). Los inventores proporcionan con el presente documento métodos de diagnóstico no invasivos basándose en la determinación de niveles de dichos marcadores metabólicos.

Definiciones

El término “índice de masa corporal” o “IMC”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un valor derivado de la masa (peso) y la altura de un individuo, y definido como la masa corporal dividida entre el cuadrado de la altura corporal. Se expresa en unidades de kg/m2, resultante de la masa en kilogramos y la altura en metros. El término “diagnóstico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere tanto al procedimiento de intentar determinar y/o identificar una posible enfermedad en un sujeto, es decir el procedimiento de diagnóstico, como a la opinión a la que se llega mediante este procedimiento, es decir la opinión de diagnóstico. Como tal, también puede considerarse como un intento de clasificar el estado de un individuo en categorías separadas y diferenciadas que permiten tomar decisiones médicas sobre el tratamiento y el pronóstico. Debe entenderse que el método, en una realización preferida, es un método llevado a cabo in vitro, es decir, que no se pone en práctica en el cuerpo humano o animal. En particular, el término “diagnóstico de una enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD)” se refiere a la capacidad para identificar o detectar la presencia de NAFLD en un sujeto. En una realización particular, este término también se refiere a la capacidad para identificar o detectar la presencia de un determinado grado de estadio o progresión de NAFLD. En particular, el término “diagnóstico de esteatosis” se refiere a la capacidad para identificar o detectar la presencia de esteatosis en un sujeto. En una realización particular, este término también se refiere a la capacidad para identificar o detectar la presencia de un determinado grado de estadio o progresión de esteatosis. En particular, el término “diagnóstico de NASH” se refiere a la capacidad para identificar o detectar la presencia de NASH en un sujeto. En una realización particular, este término también se refiere a la capacidad para identificar o detectar la presencia de un determinado grado de estadio o progresión de NASH. Tal como lo entiende un experto en la técnica, no se reivindica que este diagnóstico sea correcto en el 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas se clasifiquen de manera correcta. La cantidad que es estadísticamente significativa puede establecerla un experto en la técnica por medio del uso de diferentes herramientas estadísticas; los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas herramientas estadísticas incluyen determinar intervalos de confianza, determinar el valor de p, la prueba de la t de Student o funciones discriminantes de Fisher, etc. Los intervalos de confianza son preferiblemente de al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. El valor de p es preferiblemente inferior a 0,1, inferior a 0,05, inferior a 0,01, inferior a 0,005 o inferior a 0,0001. Las enseñanzas de la presente invención permiten preferiblemente diagnosticar de manera correcta en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80% o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizado.

El término “nivel”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un biomarcador detectable en una muestra.

El término “modelo de regresión logística” usado en el presente documento, también conocido como “regresión logística”, “regresión logit” o “modelo logit”, se refiere a un modelo de regresión en el que la variable dependiente es categórica. La regresión logística mide la relación entre la variable dependiente categórica y una o más variables independientes mediante estimación de probabilidades usando una función logística, que es la distribución logística acumulativa.

El término “espectrometría de masas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una técnica analítica para identificar compuestos desconocidos que incluye: (1) ionizar los compuestos y posiblemente fraccionar el ion original de los compuestos formado para dar iones secundarios; y (2) detectar los compuestos cargados y calcular una razón de masa con respecto a carga (m/z). Los compuestos pueden ionizarse y detectarse mediante cualquier medio adecuado. Un “espectrómetro de masas” incluye medios para ionizar compuestos y para detectar compuestos cargados.

El término “marcador metabólico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos de molécula pequeña, tales como sustratos para enzimas de rutas metabólicas, productos intermedios de tales rutas o los productos obtenidos mediante una ruta metabólica, cuya aparición o cantidad es característica para una situación específica, por ejemplo NAFLD. Los marcadores metabólicos útiles para el primer método de diagnóstico de la invención son los definidos en la tabla 1, y para el segundo método de diagnóstico de la invención son los definidos en la tabla 3. Tal como se muestra en la tabla 1 y la tabla 3, los marcadores metabólicos pueden ser una única especie lipídica o una mezcla de diversos isómeros que comparten la misma razón de masa con respecto a carga (m/z) y tiempo de retención (TR). Los nombres abreviados de los metabolitos lipídicos corresponden a la familia de lípidos a la que pertenecen seguida por su número lipídico. La familia de lípidos se describe adicionalmente mediante el número de referencia de dicha familia de lípidos en la base de datos de estructuras LIPID MAPS (http://www.lipidmaps.org/data/databases.html) usando el sistema de clasificación LIPID MAPS (Fahy E. et al., Journal of Lipid Research 2009, 50: S9-S14). El “número lipídico”, como conoce el experto, es un número con el formato N:n, en el que “N” se corresponde al número de carbonos en las cadenas de ácido graso y “n” se corresponde al número de dobles enlaces en las cadenas de ácido graso. Se pretende que los marcadores metabólicos lipídicos de la tabla 1 y la tabla 3 se refieran a cualquier isómero de los mismos, incluyendo isómeros estructurales y geométricos. El término “isómero estructural”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquiera de dos o más compuestos químicos que tienen la misma fórmula molecular pero diferentes fórmulas estructurales. El término “isómero geométrico” o “estereoisómero” tal como se usa en el presente documento, se refiere a dos o más compuestos que contienen el mismo número y tipos de átomos y enlaces (es decir, la conexión entre átomos es la misma), pero que tienen diferentes disposiciones espaciales de los átomos, por ejemplo, isómeros cis y trans de doble enlace, enantiómeros y diastereómeros.

El término “enfermedad de hígado graso no alcohólico” o “NAFLD”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de estados que tienen en común la acumulación de grasa en los hepatocitos, la NAFLD oscila entre hígado graso simple (esteatosis), esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y cirrosis (cicatrización irreversible, avanzada, del hígado). El término “NAFLD” incluye cualquier estadio o grado de progresión de la enfermedad.

El término “esteatohepatitis no alcohólica” o “NASH”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una forma significativa de enfermedad hepática crónica caracterizada por infiltración inflamatoria y grasa del hígado que no está asociada con el consumo de alcohol.

El término “puntuación”, tal como se usa en el presente documento, y también conocido como factor predictivo, se refiere al resultado numérico de una prueba, y es una estimación de la probabilidad del estado del estado de un paciente.

El término “valor de referencia”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a unos criterios predeterminados usados como referencia para evaluar los valores o datos obtenidos a partir de las muestras recogidas de un sujeto. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior o uno inferior, un intervalo de valores, un valor promedio, una mediana de valor, un valor medio, o un valor en comparación con un control particular o valor de nivel inicial. Un valor de referencia puede basarse en un valor de muestra individual o puede basarse en un gran número de muestras, tal como de una población de sujetos del grupo de edad cronológica coincidente, o basarse en una combinación de muestras que incluyen o excluyen la muestra que va a someterse a prueba.

El término “muestra”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a material biológico aislado de un sujeto y, por tanto, incluye muestras biológicas. Dicha muestra puede contener cualquier material biológico adecuado para detectar el marcador deseado y puede comprender células y/o material no celular del sujeto. En general, una muestra puede aislarse de cualquier líquido o tejido biológico adecuado. Las muestras particulares según la invención incluyen, sin limitación, de sangre, plasma, suero, saliva, orina y líquido cefalorraquídeo (CSF). En una realización particular de la invención, la muestra se selecciona de sangre, suero o plasma. En una realización preferida de la invención, la muestra es una muestra de plasma.

Los términos “sujeto”, “paciente” o “individuo” se usan en el presente documento de manera intercambiable para hacer referencia a todos los animales clasificados como mamíferos e incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos y de granja, primates y seres humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano hombre o mujer de cualquier edad o raza.

El término “esteatosis”, tal como se usa en el presente documento, también conocido como cambio graso, degeneración grasa o degeneración adiposa, se refiere al proceso que describe la retención anómala de lípidos dentro de una célula.

Método de diagnóstico de NAFLD (primer método de diagnóstico de la invención)

Los inventores han identificado varios metabolitos séricos lipídicos cuya expresión está aumentada en aquellos sujetos que padecen NAFLD en comparación con la expresión en sujetos sanos (véanse la tabla 5 y la figura 1 en la sección de ejemplos). Por tanto, el diagnóstico de NAFLD puede realizarse basándose en la determinación de los niveles de los marcadores metabólicos identificados por los inventores siguiendo un modelo de regresión logística. Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) en un sujeto que comprende

(i) determinar los niveles de todos los marcadores metabólicos según la tabla 1 en una muestra del sujeto, y (ii) compararlos niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,

En el contexto de la presente invención, el diagnóstico de NAFLD según el primer método de la invención se refiere a la capacidad para identificar o detectar la presencia de NAFLD en un sujeto. Tal como lo entiende un experto en la técnica, no se reivindica que este diagnóstico sea correcto en el 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas se clasifiquen correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede establecerla un experto en la técnica mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas; los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas herramientas estadísticas incluyen determinar intervalos de confianza, determinar el valor de p, la prueba de la t de Student o funciones discriminantes de Fisher, etc. Los intervalos de confianza son preferiblemente de al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. El valor de p es preferiblemente inferior a 0,1, inferior a 0,05, inferior a 0,01, inferior a 0,005 o inferior a 0,0001. Las enseñanzas de la presente invención permiten preferiblemente diagnosticar de manera correcta en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80% o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizado.

En una primera etapa del primer método de la invención, se determinan los niveles de todos los marcadores metabólicos según la tabla 1 en una muestra de un sujeto cuyo diagnóstico de NAFLD debe determinarse.

Tabla 1: Metabolitos lipídicos séricos que muestran expresión diferencial en muestras con NAFLD frente a muestras de hígado sano. El nombre de familia para todos ellos es triacilgliceroles [GL0301] (referencia de LIPID MAPS).

El “nombre abreviado” se corresponde a la adición del número de átomos de carbono y dobles enlaces de los triglicéridos correspondientes, todos ellos con la misma razón de masa con respecto a carga (m/z) y tiempo de retención (TR). En la columna de “analitos”, los triglicéridos (TG) en los que las cadenas de ácidos grasos están separadas por “/” se corresponden a aquellos TG en los que los inventores han identificado completamente las posiciones de cadenas de ácidos grasos. Los triglicéridos (TG) en los que las cadenas de ácidos grasos están separadas por “+” se corresponden a TG con las cadenas de ácidos grasos indicadas, en cualquier orden.

Se entenderá que la muestra biológica puede analizarse como tal o, alternativamente, pueden extraerse en primer lugar los metabolitos de la muestra antes del análisis y después se analiza el extracto de metabolitos. Si se extraen los metabolitos antes del análisis, hay diferentes métodos de extracción disponibles para el experto. La selección de uno u otro método de extracción dependerá de la clase de metabolitos/moléculas pequeñas que se seleccionan como diana a partir de un análisis particular. Los métodos de extracción adecuados incluyen “extracción de combinaciones de metabolitos libres”, “extracción en fase de vapor” y “extracción de metabolitos totales”. El primer tipo de extracción, “extracción de combinaciones de metabolitos libres”, se usa principalmente en investigación metabolómica. En este caso, se obtienen combinaciones de metabolitos intracelulares libres de una muestra biológica mediante extracción en metanol-agua para metabolitos polares, o extracción en cloroformo, metanol, cloroformo/metanol para metabolitos no polares. El segundo tipo de extracción, “extracción en fase de vapor”, se refiere a la extracción de metabolitos que son volátiles a temperatura ambiente. Los metabolitos se expulsan de la muestra biológica en fase de vapor. Estos metabolitos o bien se miden directamente conectando el matraz o reactor en el que se generan los vapores al instrumento analítico o bien absorbiendo en primer lugar los vapores en carbón/disolvente y después analizando la disolución adquirida. El tercer tipo de extracción, “extracción de metabolitos totales”, se refiere a la extracción de las combinaciones de metabolitos libres con los metabolitos que se han incorporado en macromoléculas celulares, por ejemplo lípidos, proteínas, etc. La presente invención proporciona la extracción de una clase particular de metabolitos a partir de macromoléculas (por ejemplo aminoácidos de proteínas o azúcares de componentes de la pared celular). La presente invención también proporciona un método de alto rendimiento combinado que extrae todos los metabolitos simultáneamente.

Alternativamente, la cuantificación de metabolito puede llevarse a cabo directamente en la muestra biológica. En este caso, la muestra puede prepararse para potenciar la capacidad de detección de los marcadores. Por ejemplo, para aumentar la capacidad de detección de los marcadores, puede fraccionarse preferiblemente una muestra de suero sanguíneo del sujeto, por ejemplo, mediante cromatografía con agarosa azul de Cibacron y cromatografía de afinidad de ADN monocatenario, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de afinidad (por ejemplo, con anticuerpos) y similares. El método de fraccionamiento depende del tipo de método de detección usado. Puede usarse cualquier método que enriquece el metabolito de interés. Normalmente, la preparación implica el fraccionamiento de la muestra y la recogida de fracciones que se determina que contienen los biomarcadores. Los métodos de fraccionamiento previo incluyen, por ejemplo, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de heparina, cromatografía de afinidad, extracción secuencial, electroforesis en gel y cromatografía de líquidos. Los analitos también pueden modificarse antes de la detección. Estos métodos son útiles para simplificar la muestra para su análisis adicional. Por ejemplo, puede ser útil eliminar las proteínas con alta abundancia, tales como albúmina, de la sangre antes del análisis.

En aún otra realización, una muestra puede fraccionarse previamente eliminando proteínas que están presentes en una alta cantidad o que pueden interferir con la detección de marcadores en una muestra. Pueden eliminarse proteínas en general usando técnicas convencionales tales como precipitación usando disolventes orgánicos tales como precipitación con metanol, etanol, acetonitrilo, acetona o combinaciones de los mismos, en particular, combinación de metanol, acetona y acetonitrilo, precipitación con ácido usando, por ejemplo, ácido tricloroacético o ácido perclórico, desnaturalización térmica y cualquier combinación de disolvente orgánico, ácido y precipitación térmica. En el caso de una muestra de sangre, plasma o suero, la albúmina sérica u otras proteínas abundantes en el suero tales como apolipoproteínas, glicoproteínas, inmunoglobulinas, pueden oscurecer el análisis de marcadores ya que están presentes en una alta cantidad. Por tanto, puede ser suficiente eliminar una o más de las proteínas anteriores, albúmina, con el fin de detectar los metabolitos o proteínas secundarias. Con este fin, la muestra de plasma o suero sanguíneo puede fraccionarse previamente eliminando albúmina sérica. La albúmina sérica puede eliminarse usando un sustrato que comprende adsorbentes que se unen específicamente a albúmina sérica. Por ejemplo, puede usarse una columna que comprende, por ejemplo, agarosa azul de Cibacron (que tiene una alta afinidad por albúmina sérica) o anticuerpos anti-albúmina sérica. En aún otra realización, una muestra puede fraccionarse previamente aislando proteínas que tienen una característica específica, por ejemplo están glicosiladas. Por ejemplo, una muestra de plasma o suero sanguíneo puede fraccionarse haciendo pasar la muestra sobre una columna de cromatografía de lectina (que tiene una alta afinidad por azúcares). Existen muchos tipos de adsorbentes de afinidad que son adecuados para fraccionar previamente muestras de plasma o suero sanguíneo. Un ejemplo de otro tipo de cromatografía de afinidad disponible para fraccionar previamente una muestra es una columna de centrifugación de ADN monocatenario. Estas columnas se unen a proteínas que son básicas o tienen carga positiva. Después se eluyen las proteínas unidas de la columna usando eluyentes que contienen desnaturalizantes o un pH alto. Por tanto hay muchas maneras de reducir la complejidad de una muestra basándose en las propiedades de unión de las proteínas en la muestra, o las características de las proteínas en la muestra.

En aún otra realización, una muestra puede fraccionarse usando un protocolo de extracción secuencial. En la extracción secuencial, se expone una muestra a una serie de adsorbentes para extraer diferentes tipos de biomoléculas de una muestra.

En una realización particular, la determinación del nivel de uno o más marcadores metabólicos se lleva a cabo mediante espectrometría de masas. Preferiblemente, se usa espectrometría de masas, en particular cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM), cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (CL-EM), espectrometría de masas por infusión directa o espectrometría de masas con resonancia por ciclotrón de iones con transformada de Fourier (FT-ICR-EM), electroforesis capilar acoplada a espectrometría de masas (EC-EM), cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (HPLC-EM), cromatografía de líquidos de ultraalta resolución acoplada a espectrometría de masas (UHPLC-EM), cromatografía de fluido supercrítico acoplada a espectroscopía de masas (CFS-EM), análisis por inyección de flujo con espectrometría de masas (FIA-EM), incluyendo espectrometría de masas con cuadrupolo, cualquier espectrometría de masas acoplada secuencialmente, tal como EM-EM o EM-EM-EM, espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-EM), espectrometría de masas con pirólisis (Py-EM), espectrometría de masas de movilidad de iones o espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF), espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI-EM), ESI-EM/EM, espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionizacióndesorción por láser asistida por matriz (MALDI-TOF-EM), espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser potenciada en superficie (SELDI-TOFMS), desorción/ionización sobre silicio (DIOS), espectrometría de masas de iones secundarios (EMIS), tiempo de vuelo de cuadrupolo (Q-TOF), espectrometría de masas con ionización química a presión atmosférica (APCI-EM), APCI-EM/EM, APCI-(EM)n, espectrometría de masas con fotoionización a presión atmosférica (APPI-EM), APPI-EM/EM, y APPI-(EM)n, espectrometría de masas de cuadrupolo, espectrometría de masas con transformada de Fourier (FT-EM), y espectrometría de masas con trampa de iones, en las que n es un número entero mayor que cero. Lo más preferiblemente, se usa CL-EM tal como se describe en detalle a continuación. Dichas técnicas se dan a conocer, por ejemplo, en Nissen, Journal of Chromatography A, 703, 1995: 37- 57, documento US 4.540.884 o documento US 5.397.894.

Los métodos de ionización anteriormente mencionados producen generalmente un ion resultante de la adición de uno o más átomos o mediante escisión de la molécula. Entonces pueden usarse estos iones como marcadores sustitutos para los metabolitos usados en el método de la invención. El término “marcador sustituto”, tal como se usa en el presente documento, significa un parámetro biológico o clínico que se mide en lugar del parámetro biológicamente definitivo o clínicamente más significativo.

Normalmente, los iones resultan de la adición de un protón o un núcleo de hidrógeno, [M+H]<+> en los que M significa la molécula de interés, y H significa el ion de hidrógeno, que es lo mismo que un protón. Algunos métodos de ionización también producirán iones análogos. Los iones análogos pueden surgir mediante la adición de un catión de metal alcalino, en lugar del protón comentado anteriormente. Una especie típica puede ser [M+Na]<+>, [M+NH4]<+> o [M+K]<+>. El análisis de las moléculas ionizadas es similar independientemente de si se trata de un ion protonado tal como se comentó anteriormente o se trata de un catión de metal alcalino añadido. La principal diferencia es que la adición de un protón añade una unidad de masa (denominada normalmente un Dalton), en el caso del ion de hidrógeno (es decir, protón), 23 Dalton en el caso de sodio, 18 Dalton en el caso de amoniaco o 39 Dalton en el caso de potasio. Estos pesos o masas adicionales se añaden simplemente al peso molecular de la molécula de interés y el pico de EM se produce en el punto para el peso molecular de la molécula de interés más el peso del ion que se ha añadido. Estos métodos de ionización también pueden producir iones negativos. La señal molecular más común es la molécula desprotonada [M-H]<->, en este caso la masa es un Dalton inferior al peso molecular de la molécula de interés. Además, para algunos compuestos se producirán múltiples iones cargados. Estos son del tipo de identificación general de [M+nH]<n+>, en el que n identifica el número de protones adicionales que se han añadido.

Preferiblemente, la muestra (o el eluyente cuando la muestra se ha fraccionado antes de la espectrometría de masas) puede introducirse en un espectrómetro de masas de alta resolución (por ejemplo, un instrumento LCT Premier™, Waters Corp., Milford, EE.U^u.) mediante ionización por electropulverización, con tensiones de capilares y cono fijadas en los modos de iones positivos y negativos a 3200 V y 30 V, y 2800 V y 50 V, respectivamente. Puede analizarse una mezcla de prueba apropiada de compuestos patrones antes y después del conjunto completo de inyecciones aleatorizadas con el fin de examinar la estabilidad del tiempo de retención, precisión de masas y sensibilidad del sistema a lo largo del transcurso de la serie.

En otra realización particular, la muestra biológica se fracciona mediante cromatografía de líquidos antes de la determinación del/de los nivel(es) del/de los marcador(es) metabólico(s). El término “cromatografía”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un método para la separación de componentes de una mezcla que se basa en diferencias en el comportamiento de flujo de los diversos componentes de una mezcla/disolución transportada por una fase móvil a través de un soporte/columna recubierto con una determinada fase estacionaria. Específicamente, algunos componentes se unen fuertemente a la fase estacionaria y pasan más tiempo en el soporte, mientras que otros componentes permanecen predominantemente en la fase móvil y pasa más rápido a través del soporte. El criterio en base al cual se separan los diversos compuestos a través de la columna se define por el problema particular que está investigándose y lo impone la estructura, composición y capacidad de unión de la fase estacionaria. Por ejemplo, puede construirse una fase estacionaria de tal manera que las moléculas lineales y de bajo peso molecular eluyen más rápido que las aromáticas y de alto peso molecular. A medida que los componentes eluyen del soporte, pueden analizarse inmediatamente mediante un detector o recogerse para su análisis adicional. Actualmente se dispone de un amplio número de métodos de separación, y en particular métodos de cromatografía, incluyendo cromatografía de gases (CG), cromatografía de líquidos (CL), cromatografía iónica (IC), cromatografía de exclusión molecular (SEC), cromatografía de fluido supercrítico (CFS), cromatografía de capa fina (CCF), cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), cromatografía de líquidos de ultraalta resolución (UHPLC), y electroforesis capilar (CE). Puede usarse CG para separar compuestos volátiles o compuestos derivatizados que, de lo contrario, son compuestos no volátiles. La CL es una técnica cromatográfica alternativa útil para separar iones o moléculas que están disueltos en un disolvente. El principio de la separación mediante CG y CL es el mismo, su principal diferencia se encuentra en la fase en la que se produce la separación (fase gaseosa frente a líquida). Además, la CG se usa principalmente para separar moléculas con un peso de hasta 650 unidades atómicas, mientras que, en principio, una CL puede separar compuestos de cualquier peso molecular. Los tipos adecuados de cromatografía de líquidos que pueden aplicarse en el método de la invención incluyen, sin limitación, cromatografía de fase inversa, cromatografía de fase normal, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de líquidos de interacción hidrófila (HILIC), cromatografía de exclusión molecular y cromatografía quiral. Estas técnicas se conocen bien en la técnica y puede aplicarlas el experto en la técnica sin más dificultades.

Una vez que se ha procesado la muestra, el primer método de diagnóstico de la invención implica la determinación de los niveles de los metabolitos según la tabla 1 en la muestra. La expresión “determinar los niveles de un metabolito”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a establecer la cantidad o concentración absoluta o relativa del metabolito en la muestra. Hay muchas maneras de recopilar datos cuantitativos o relacionales sobre metabolitos, y la metodología analítica no afecta a la utilidad de las concentraciones de metabolitos en la predicción del fenotipo o la evaluación del metabolismo. Los métodos adecuados para determinar los niveles de un metabolito dado incluyen, sin limitación, espectroscopía de índice de refracción (RI), espectroscopía de ultravioleta (UV), análisis fluorescente, análisis radioquímico, espectroscopía de infrarrojos (IR), espectroscopía por resonancia magnética nuclear (RMN), análisis de dispersión de la luz (LS), espectrometría de masas, espectrometría de masas con pirólisis, nefelometría, espectroscopía de Raman dispersiva, cromatografía de gases combinada con espectroscopía de masas, cromatografía de líquidos combinada con espectroscopía de masas, cromatografía de fluido supercrítico combinada con espectroscopía de masas, MALDI combinada con espectroscopía de masas, espectroscopía de pulverización iónica combinada con espectroscopía de masas, electroforesis capilar combinada con espectrometría de masas, RMN combinada con espectrometría de masas e IR combinada con espectrometría de masas.

En una realización particular, los niveles de los marcadores metabólicos se determinan mediante espectrometría de masas. En una realización todavía más particular, la muestra biológica se fracciona mediante cromatografía de líquidos antes de la determinación de los niveles de los marcadores metabólicos.

En una realización todavía más particular, la cromatografía de líquidos se realiza con una columna C18 a 60°C. La columna se eluye con un gradiente lineal de 17 min de disolventes A (agua, acetonitrilo y formiato de amonio 10 mM), y B (acetonitrilo, isopropanol y formiato de amonio 10 mM). La fase móvil, a una velocidad de flujo de 400 pl/min, consistía inicialmente en el 40% de disolvente B, aumentando hasta el 100% a los 10 minutos. Tras 5 minutos se restablece la fase móvil a la composición inicial en preparación para la inyección posterior a la que precede un tiempo de recirculación del sistema de 45 s.

En una segunda etapa del primer método de la invención, los niveles de marcadores metabólicos según la tabla 1 que se determinan en una muestra de un sujeto cuyo diagnóstico de NAFLD debe determinarse según la etapa (i) del método se comparan con un valor de referencia. Se diagnostica NAFLD en el sujeto según una puntuación o factor predictivo que se obtiene introduciendo los valores de marcador(es) metabólico(s) según la tabla 1 en un modelo de regresión logística.

Por tanto, el primer método de diagnóstico de la invención comprende comparar el/los nivel(es) del/de los marcador(es) metabólico(s) según la tabla 1 con un valor de referencia.

En una realización particular del primer método de diagnóstico de la invención, el valor de referencia se determina en una muestra obtenida de uno o más sujetos sanos, o en una muestra de uno o más sujetos que no padecen NAFLD.

En una realización particular del primer método de diagnóstico de la invención, la aplicación de una puntuación o factor predictivo obtenido introduciendo los valores de al menos un marcador metabólico según la tabla 1 en un modelo de regresión logística se basa en la fórmula (I):

1

NAFLD (puntuación) (I)

1 e-z

donde

ci es el coeficiente estimado para el modelo para el parámetro i, en el que cada fila representada en la tabla 2 es un parámetro del modelo, y ^{Ta 1 !}y ^{Ta z 1}son los valores de marcadores metabólicos. Estos valores de marcadores metabólicos se introducen como valores relativos con respecto al valor de referencia.

En una realización más particular del primer método de diagnóstico de la invención, la aplicación de una puntuación o factor predictivo obtenido introduciendo los valores de, al menos, un marcador metabólico según la tabla 1 y el valor del índice de masa corporal (IMC) (kg/m2) en un modelo de regresión logística, se basa en la fórmula (I) anterior.

En una realización particular, la aplicación de la puntuación o factor predictivo obtenido introduciendo los valores de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, de al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, de al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de los marcadores metabólicos según la tabla 1 en un modelo de regresión logística se basa en la fórmula (I) anterior.

En una realización particular, la aplicación de la puntuación o factor predictivo obtenido introduciendo los valores de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, de al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, de al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de los marcadores metabólicos según la tabla 1 y el valor de IMC en un modelo de regresión logística, se basa en la fórmula (I) anterior.

En una realización más particular, la aplicación de una puntuación o factor predictivo obtenido introduciendo los valores de todos los marcadores metabólicos según la tabla 1 en un modelo de regresión logística, se basa en la fórmula (I) anterior. En una realización incluso más particular, la aplicación de una puntuación o factor predictivo obtenido introduciendo los valores de todos los marcadores metabólicos según la tabla 1 y el valor de ⁱM^cen un modelo de regresión logística se basa en la fórmula (I) anterior.

Tabla 2. Parámetros del modelo de regresión logística para el método in vitro para el diagnóstico de enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD).

En una realización particular, se diagnostica NAFLD en el sujeto si NAFLD(puntuación) > 0,5 según la fórmula (I) anterior. Si la puntuación es < 0,5, entonces no se diagnostica NAFLD en los sujetos.

Método de diagnóstico de NASH/esteatosis (segundo método de diagnóstico de la invención)

Los inventores han identificado marcadores metabólicos cuya expresión varía entre sujetos con NAFLD que padecen NASH y sujetos con NAFLD que padecen esteatosis. Por tanto, puede realizarse un diagnóstico diferencial de NASH o esteatosis para un sujeto que padece NAFLD basándose en los marcadores metabólicos identificados por los inventores y mostrados en la tabla 3.

Por tanto, en un segundo aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o esteatosis en un sujeto que padece NAFLD que comprende

(i) determinar los niveles de todos los marcadores metabólicos según la tabla 3 en una muestra del sujeto, y (ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,

En una realización particular, el sujeto que padece NAFLD cuyo diagnóstico se pretende realizar mediante el segundo método de diagnóstico de la invención, es un sujeto al que se le ha diagnosticado anteriormente NAFLD mediante el primer método de diagnóstico de la invención.

En el contexto de la presente invención, el diagnóstico de NASH o esteatosis según el segundo método de la invención se refiere a la capacidad para identificar o detectar la presencia de NASH o de esteatosis en un sujeto. Tal como entiende un experto en la técnica, no se reivindica que este diagnóstico sea correcto en el 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas se clasifiquen de manera correcta. La cantidad que es estadísticamente significativa puede establecerla un experto en la técnica mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas; los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas herramientas estadísticas incluyen determinar intervalos de confianza, determinar el valor de p, la prueba de la t de Student o funciones discriminantes de Fisher, etc. Los intervalos de confianza son preferiblemente de al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. El valor de p es preferiblemente inferior a 0,1, inferior a 0,05, inferior a 0,01, inferior a 0,005 o inferior a 0,0001. Las enseñanzas de la presente invención permiten preferiblemente diagnosticar de manera correcta en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80% o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizado.

En una primera etapa del segundo método de la invención, se determinan los niveles de todos los marcadores metabólicos según la tabla 3 en una muestra de un sujeto que padece NAFLD cuyo diagnóstico de NASH o esteatosis debe determinarse.

Tabla 3. Metabolitos lipídicos séricos reducidos en muestras con NASH frente a muestras con esteatosis. El nombre de familia para todos ellos es triacilgliceroles [GL0301] (referencia de LIPID MAPS).

Se entenderá que la muestra biológica puede analizarse como tal o, alternativamente, los metabolitos pueden extraerse en primer lugar de la muestra antes del análisis y después se analiza el extracto de metabolitos, tal como se describió anteriormente en el contexto del primer método de la invención. Si se extraen los metabolitos antes del análisis, hay diferentes métodos de extracción disponibles para el experto. La selección de uno u otro método de extracción dependerá de la clase de metabolitos/moléculas pequeñas que se seleccionan como diana a partir de un análisis particular. Anteriormente se han descrito métodos de extracción adecuados en el contexto del primer método de diagnóstico de la invención. Alternativamente, la cuantificación de metabolitos puede llevarse a cabo directamente en la muestra biológica, tal como se describió anteriormente en el contexto del primer método de diagnóstico de la invención. En aún otra realización, puede fraccionarse previamente una muestra retirando proteínas que están presentes en una alta cantidad o que pueden interferir con la detección de marcadores en una muestra, tal como se describió anteriormente en el contexto del primer método de diagnóstico de la invención.

En una realización particular, la determinación del nivel de uno o más marcadores metabólicos se lleva a cabo mediante espectrometría de masas. Anteriormente se han descrito técnicas y protocolos basados en espectrometría de masas adecuados en el contexto del primer método de diagnóstico de la invención. En otra realización particular, se fracciona la muestra biológica mediante cromatografía de líquidos antes de la determinación del/de los nivel(es) del/de los marcador(es) metabólico(s), tal como se describió anteriormente en el contexto del primer método de diagnóstico de la invención.

Una vez procesada la muestra, el segundo método de diagnóstico de la invención implica la determinación de los niveles de los metabolitos según la tabla 2 en la muestra. Se han descrito métodos adecuados para determinar el nivel de un metabolito en el contexto del primer método de diagnóstico de la invención. En una realización particular, los niveles de los marcadores metabólicos se determinan mediante espectrometría de masas. En una realización todavía más particular, la muestra biológica se fracciona mediante cromatografía de líquidos antes de la determinación de los niveles de los marcadores metabólicos.

En una segunda etapa del segundo método de la invención, los niveles de marcadores metabólicos según la tabla 3 que se determinan en una muestra de un sujeto cuyo diagnóstico de NASH o esteatosis debe determinarse según la etapa (i) del método, se comparan con un valor de referencia. Al sujeto que padece NAFLD se le diagnostica NASH o esteatosis según una puntuación o factor predictivo que se obtiene cuando se introducen los valores de dicho(s) marcador(es) metabólico(s) según la tabla 3 en un modelo de regresión logística.

Por tanto, el segundo método de diagnóstico de la invención comprende comparar el/los nivel(es) del/de los marcador(es) metabólico(s) según la tabla 3 con un valor de referencia.

En una realización particular del segundo método de diagnóstico de la invención, el valor de referencia se determina en una muestra obtenida de uno o más sujetos sanos, o en una muestra de uno o más sujetos que no padecen NAFLD.

Según el segundo método de diagnóstico de la invención, la aplicación de puntuación o factor predictivo obtenido introduciendo los valores de al menos un marcador metabólico según la tabla 1 en un modelo de regresión logística se basa en la fórmula (II):

1

NASH (puntuación) (II)

1 e-z

donde

c¡ es el coeficiente estimado para el modelo para el parámetro i, en el que cada fila representada en la tabla 4 es un parámetro del modelo, y L‘f lU y son los valores de marcadores metabólicos. Estos valores de marcadores metabólicos se introducen como valores relativos con respecto al valor de referencia.

En una realización más particular del segundo método de diagnóstico de la invención, la aplicación de una puntuación o factor predictivo obtenido introduciendo los valores de, al menos, un marcador metabólico según la tabla 3 y el valor del índice de masa corporal (IMC) (kg/m2) en un modelo de regresión logística, se basa en la fórmula (II) anterior.

En una realización particular, la aplicación de la puntuación o factor predictivo obtenido introduciendo los valores de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, de al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, de al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de los marcadores metabólicos según la tabla 3 en un modelo de regresión logística, se basa en la fórmula (II) anterior.

En una realización más particular, la aplicación de una puntuación o factor predictivo obtenido introduciendo los valores de todos los marcadores metabólicos según la tabla 3 en un modelo de regresión logística, se basa en la fórmula (II) anterior. En una realización incluso más particular, la aplicación de una puntuación o factor predictivo obtenido introduciendo los valores de todos los marcadores metabólicos según la tabla 3 y valor de IMC en un modelo de regresión logística, se basa en la fórmula (II) anterior.

Tabla 4. Parámetros del modelo de regresión logística para el método in vitro para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o esteatosis en un sujeto que padece NAFLD.

(*) El primer coeficiente en la tabla 4 no se multiplica por el valor de nivel de ninguno de los marcadores según la tabla 3, por tanto en la tabla se muestra un valor de 1.

En una realización particular, al sujeto que padece NAFLD se le diagnostica NASH según el segundo método de la invención si NASH(puntuación) > 0,5.

En una realización particular, al sujeto que padece NAFLD se le diagnostica esteatosis según el segundo método de la invención si NASH(puntuación) < 0,5.

En una realización particular, al sujeto que padece NAFLD se le ha diagnosticado NAFLD por medio del primer método de la invención. Por tanto, se diagnostica NASH en el sujeto según el segundo método de la invención si:

- NAFLD(puntuación) > 0,5 (tal como se describió anteriormente en el contexto del primer método de la invención), y

- NASH(puntuación) > 0,5,

y se diagnostica esteatosis en el sujeto según el segundo método de la invención si:

- NASH(puntuación) < 0,5.

A continuación se describe en detalle la invención por medio de los siguientes ejemplos, que deben interpretarse como meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención.

Ejemplos

Materiales y métodos

Los datos de los pacientes incluidos en el estudio son los siguientes (los valores se facilitan como media ± desviación estándar de la media):

- N: 467

- Etnia: Blanca

- Sexo (H/M): 24,63% de H / 75,37% de M

- Edad: 43,8±12,0

- IMC (índice de masa corporal) (kg/m2): 43,1±11,9

- Diagnóstico: hígado sano (90); esteatosis (246); NASH (131)

- Biopsia (Sí/No): Sí

Preparación de muestras

Se preparó suero mediante incubación de sangre venosa del paciente en tubos con separador de suero antes de la centrifugación (2500xg, 15 min); se extrajeron alícuotas de los sobrenadantes en microtubos y se almacenaron a -80°C hasta el análisis metabolómico.

Se dividieron las muestras de suero en alícuotas y se analizaron en la siguiente plataforma metabolómica:

Plataforma - Extracto en cloroformo/metanol. Se precipitaron las proteínas a partir de las muestras de suero descongeladas (10 jl) añadiendo 10 pl de cloruro de sodio (50 mM) y 110 pl de cloroformo/metanol (2:1) en microtubos de 1,5 ml en hielo. Al disolvente de extracción se le añadió TG(13:0/13:0/13:0), no detectado en extractos de suero humano sin adiciones. Tras un breve mezclado con vórtex, se incubaron las muestras durante 1 h a -20°C. Tras la centrifugación a 16000*g durante 15 min, se recogieron 70 pl de la fase orgánica inferior y se eliminó el disolvente. Después se reconstituyeron los extractos secados en 100 pl de acetonitrilo/isopropanol (50:50), se centrifugaron (16000*g, 5 min) y se transfirieron a viales para el análisis mediante UPLC-EM.

Cromatografía - Plataformas de espectrometría de masas

- Cromatografía

Se realizó la cromatografía con una columna ACQUITY 1,7 jm C18 BEH de 2,1 mm de d.i. * 100 mm (Waters Corp., Milford, MA) usando un sistema ACQUITY UPLC (Waters Corp., Milford, MA). Se mantuvo la columna a 60°C y se eluyó con un gradiente lineal de 10 min. La fase móvil, a una velocidad de flujo de 400 pl/min, consistía inicialmente en el 60% de disolvente A (agua acetonitrilo formiato de amonio 10 mM) y el 40% de disolvente B (acetonitrilo isopropanol formiato de amonio 10 mM), aumentando hasta el 100% de disolvente B a lo largo de 10 minutos. Tras 5 minutos se restableció la fase móvil a la composición inicial en preparación para la inyección posterior a la que precedía un tiempo de recirculación del sistema de 45 s. El volumen de muestra inyectado en la columna fue de 3 pl. - Espectrometría de masas

El eluyente se introdujo en el espectrómetro de masas, Xevo G2 QTof o Synapt G2 QTof (Waters Corp., Milford, MA) mediante ionización por electropulverización, con tensiones de capilares y cono fijadas en el modo de iones positivos a 3200 y 30 V, respectivamente. Se fijó el gas de nebulización a 1000 l/h a una temperatura de 500°C. Se fijó el gas de cono a 30 l/h, y se fijó la temperatura de fuente a 120°C. Se adquirieron datos de centroides a partir de m/z 50 1200 usando un tiempo de acumulación de 0,2 s por espectro. Se corrigió la masa de todos los espectros en tiempo real mediante referencia a leucina-encefalina, infundida a 10 jl/min mediante una electropulverización de referencia independiente, de la que se tomaron muestras cada 10 s. Puede analizarse una mezcla de prueba apropiada de compuestos patrones antes y después del conjunto completo de inyecciones de muestras aleatorizadas con el fin de examinar la estabilidad del tiempo de retención, la precisión de masas y la sensibilidad del sistema a lo largo de todo el transcurso de la serie que duró un máximo de 48 h por lote de muestras inyectadas.

Se realizaron experimentos de espectrometría de masas en tándem en línea (EM/EM) para la identificación de metabolitos con un sistema Acquity-Synapt G2 QTof (Waters Corp., Milford, MA), funcionando el instrumento tanto en modo de electropulverización de iones positivos como negativos; los parámetros de fuente fueron idénticos a los empleados en los experimentos de determinación de perfil, excepto por la tensión de cono que se aumentó (30-70 V) cuando se requerían datos de pseudo-EM/EM/EM. Durante los intervalos de tiempo de retención correspondientes a la elución de los compuestos que estaban investigándose, se fijó el cuadrupolo para resolver y transmitir iones con valores de masa con respecto a carga apropiados. Entonces los iones seleccionados atravesaron una célula con presión de argón, con una tensión de energía de colisión (normalmente entre 5 y 50 V) aplicada según el grado de fragmentación de iones requerido. El análisis mediante TOF posterior de los iones de fragmentos generó espectros de EM/EM o pseudo-EM/EM/EM con una precisión de masa generalmente <3 ppm, corregidos en tiempo real mediante referencia a leucina-encefalina, infundida a 10 jl/min mediante una electropulverización de referencia independiente, de la que se tomaron muestras cada 10 s.

Procesamiento de datos

Todos los datos se procesaron usando el gestor de aplicaciones TarkerLynx para el software MassLynx 4.1 (Waters Corp., Milford, MA). Se alimento el conjunto completo de pares de TR-m/z predefinidos al software, que generó cromatogramas de iones extraídos asociados (intervalo de tolerancia de masas = 0,05 Da), con detección de picos y reducción de ruido en los dominios tanto de CL como de EM. Después se generó una lista de intensidades (áreas de picos cromatográficos) para cada inyección de muestra, usando los pares de TR-m/z (tolerancia de tiempo de retención = 6 s) como identificadores. La normalización intra e inter-lotes siguió el procedimiento resumido en el artículo de Martínez-Arranz et al. Este procedimiento implicó (i) corrección de respuesta de patrón interno (normalización intralote) y (ii) calibración externa de puntos individuales interlotes específicos variables usando extractos repetidos de una muestra de suero comercial (normalización interlotes).

Análisis estadístico

Se aplicó análisis de múltiples variables para la creación de modelos predictivos. En resumen, se trataron datos metabolómicos e IMC como variable continua con transformación de Box-Cox y después se realizó un modelo de regresión logística para identificar una firma predictiva que podía distinguir, en primer lugar, entre hígado sano y NAFLD y, en segundo lugar, entre NASH y esteatosis simple. Se usó un método gradual directo como criterio de selección de variables, en el que los análisis comenzaron con un modelo vacío y se añadieron variables de una en una mientras merecieran la pena estas inclusiones. Una vez añadida una variable, se evaluó el modelo para garantizar su capacidad de distinción. Este procedimiento terminó cuando no pudieron añadirse más variables. En el análisis no se incluyeron variables en las que faltasen valores, ya que proporcionarían información inútil en este método de clasificación. La inclusión de IMC como variable continua en un modelo de regresión logística evita posibles discrepancias en diagnósticos cuando se tiene en cuenta el punto de corte límite. Se usó análisis de curva de rendimiento diagnóstico (ROC) para evaluar la potencia de distinción. Se determinó la precisión de diagnóstico global para una comparación de dos clases dada mediante el área bajo la curva ROC (AUROC) con su error estándar asociado. Se calcularon la sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos. Una vez creados los modelos, se validaron de manera enmascarada usando una cohorte independiente de pacientes, diferente de la empleada para crear los primeros modelos.

Todos los cálculos se realizaron usando R v.2.14.1 (R Development Core Team, 2011) con los paquetes caret, caTools y receiver operating characteristic R (ROCR) para producir curvas ROC y estimación de AUROC, y el paquete MASS para generar los modelos de regresión logística.

La tabla 5 muestra los valores de p específicos (prueba de la t de Student), cambio en veces, aducto, tiempo de retención y masa con respecto a carga, para los metabolitos séricos lipídicos aumentados en los pacientes con NAFLD frente a pacientes con hígado sano.

Las siguientes tablas muestran los parámetros de curvas ROC según los métodos primero y segundo de la invención.

Tabla 7. Tabulación cruzada de clases observadas y predichas con datos estadísticos asociados para el primer método de la invención basándose en parámetros de la tabla 2 y metabolitos según la tabla 5.

Tabla 8. Tabulación cruzada de clases observadas y predichas con datos estadísticos asociados para el segundo método de la invención basándose en parámetros de la tabla 4 y metabolitos según la tabla 6.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método in vitro para el diagnóstico de enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) en un sujeto que comprende

(i) determinar los niveles de todos los marcadores metabólicos según la tabla 1 en una muestra del sujeto, y (ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,

2. Método según la reivindicación anterior, en el que el valor de referencia se determina en una muestra de uno o más sujetos sanos o de uno o más sujetos que no padecen NAFLD.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se introduce el valor de índice de masa corporal (IMC) en el modelo de regresión logística.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 to 3, en el que se calcula una puntuación o factor predictivo basándose en los niveles de todos los marcadores metabólicos según la tabla 1, y en el que dicha puntuación se calcula utilizando los parámetros definidos en la Tabla 2 según el modelo de regresión logística basado en la formula (I):

1

NAFLD (puntuación) (I)

1 e-z

donde

.in

Z = X i ce| ’ I -1 L " [ a .

c¡ es el coeficiente estimado para el modelo para el parámetro i, en el que cada fila representada en la tabla 2 es un parámetro del modelo, y ^£1-I ' ^r _yA son los valores de marcadores metabólicos.

5. Método in vitro para el diagnóstico de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o esteatosis en un sujeto que padece NAFLD que comprende

6. Método según la reivindicación anterior, en el que el valor de referencia se determina en una muestra de uno o más sujetos sanos o de uno o más sujetos que no padecen NAFLD.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en el que se introduce el valor de índice de masa corporal (IMC) en el modelo de regresión logística.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 to 7, en el que se calcula una puntuación o factor predictivo basándose en los niveles de todos los marcadores metabólicos según la tabla 3, y en el que dicha puntuación se calcula utilizando los parámetros definidos en la tabla 4 según el modelo de regresión logística basado en la fórmula (II):

1

NASH (puntuación) (II)

1 e-z

donde

ci es el coeficiente estimado para el modelo para el par metro i, en el que cada fila representada en la tabla 4 es un parámetro del modelo, y i j iJ V r LA? L -iI son los valores de marcadores metabólicos.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que al sujeto que padece NAFLD se le ha diagnosticado NAFLD mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra es una muestra de suero.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se determinan niveles de metabolitos mediante espectrometría de masas.

12. Método según la reivindicación anterior, en el que la muestra se fracciona mediante cromatografía de líquidos antes de la determinación de los niveles de los marcadores metabólicos.