CN107002113A - 脂肪肝病的生物标志物和其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了NASH、NAFLD、以及纤维化的生物标志物和用于诊断(或帮助诊断)NAFLD、NASH和/或纤维化的方法。此外,本文描述了辨别NAFLD与NASH的方法;将纤维化的分期分类的方法;确定肝脏疾病的严重程度的方法;确定肝脏疾病或纤维化的严重程度的方法;以及监测NASH、NAFLD、和/或纤维化的进展/消退的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年11月19日提交的美国临时专利申请号62/081,903和2015年4月1日提交的美国临时专利申请号62/141,494的权益,这些美国临时专利申请的全部内容在此以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明大体上涉及针对脂肪肝病的生物标志物和基于这些生物标志物的方法。
背景技术
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的发病率随着肥胖症的流行的同时而持续增加,所述非酒精性脂肪肝病涵盖了从单纯性良性肝性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)不等的整个组织学谱,特征在于脂质积聚、炎症、肝细胞气球样变、以及不同程度的纤维化。尽管对肥胖症相关肝脏疾病的认识越来越多,但是对NAFLD和NASH的发病机理知之甚少,并且不存在FDA批准的以NASH作为适应症的治疗。对NASH的诊断仍是复杂的并且由于需要进行侵入性肝活检而有显著的风险。因此,鉴定能够在患有或疑似患有肝脏疾病的患者中对NAFLD进行诊断和分期以实现预后目的(即有进展到更晚期的肝脏疾病阶段的风险)的基于血液的代谢物生物标志物的谱是一个显著的未得到满足的医疗需求。
肝脏中的脂肪变化是由脂质在肝细胞内过量积聚所引起。脂肪肝是甘油三酯和其它脂肪在肝细胞中的积聚。脂肪肝病可以从单独的脂肪肝(单纯性脂肪肝、脂肪变性)到与肝脏炎症相关的脂肪肝(脂肪性肝炎)不等。尽管在肝脏中有脂肪是不正常的,但是它本身很可能几乎不造成危害或永久性损伤。一般认为脂肪变性是一种良性病况,很少会进展到慢性肝病。相反,脂肪性肝炎可能进展到肝纤维化和肝硬化,可能与肝细胞癌有关并且可能导致肝脏相关的发病和死亡。
脂肪变性可以在饮酒(酒精相关脂肪肝)或不存在酒精(非酒精性脂肪肝病,NAFLD)的情况下发生。脂肪性肝炎可能与酒精诱发的肝损伤相关或可能与酒精无关。如果存在脂肪性肝炎,但是没有饮酒史,那么所述病况被称作非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
在不存在酒精的情况下,单纯性脂肪肝(NAFLD)和NASH的主要风险因素是肥胖症、糖尿病、以及高甘油三酯水平。在NASH中,脂肪在肝脏中积累并且最终导致瘢痕组织。这一类型的肝炎似乎与糖尿病、蛋白质营养不良、肥胖症、冠状动脉疾病、以及皮质类固醇药物的治疗相关。15%-50%患有NASH的患者存在肝脏中的纤维化或肝硬化。约30%的患有纤维化的患者在10年之后发展为肝硬化。
在美国,脂肪肝病现在是肝功能检查升高的最常见的原因。它现在很可能是造成转氨酶轻度升高的主要原因。脂肪变性影响了一般群体的约25%-35%。在超过80%的肥胖患者中发现NAFLD。NASH影响了2%至5%的美国人并且已经在1.2%-9%的接受常规肝活检的患者中检测到。超过50%的接受减肥手术的患者患有NASH。所述疾病侵袭男性和女性;早期研究报道>70%的病例是发生在女性,但是最近的研究报道50%的患者是女性。脂肪肝发生在所有年龄组。在美国,NASH是青少年当中最常见的肝脏疾病并且是成人的慢性肝病的第三大最常见的原因(继丙型肝炎和酒精之后)。
NASH和NAFLD这两者成为更常见的,这可能是因为有更大数目的美国人患有肥胖症。在过去的10年中,肥胖率已经在成人中加倍并且在儿童中增至三倍。肥胖症还导致糖尿病和高血胆固醇,这可能使患有NASH的人的健康进一步复杂化。糖尿病和高血胆固醇在美国人当中也成为更常见的。
NASH通常是一种有很少症状或没有症状的隐性疾病。患者一般在早期阶段感觉良好并且只有在疾病变得更晚期或发生肝硬化时,才开始有症状,如疲劳、体重减轻、以及虚弱。NASH的进展可能需要数年,甚至是数十年。所述过程可以停止,并且在一些情况下,在没有特定治疗的情况下,自行逆转。或NASH可以缓慢恶化,从而导致瘢痕形成或“纤维化”在肝脏中出现并且积聚。随着纤维化恶化,发生肝硬化;肝脏变得有严重的瘢痕形成、***、并且不能发挥正常功能。并不是每一个患有NASH的人都会发生肝硬化,但是一旦存在严重的瘢痕形成或肝硬化,就很少有治疗能够阻止进展。患有肝硬化的人经历体液潴留、肌肉消瘦、肠道出血、以及肝脏衰竭。肝脏移植是伴有肝脏衰竭的晚期肝硬化的唯一治疗,并且移植越来越多地在患有NASH的人中进行。NASH在美国被列为肝硬化的主要原因之一,位列丙型肝炎和酒精性肝脏疾病之后。
通常首先在被发现有被包括在常规血液检查组中的肝脏检查(如丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST))升高的人中怀疑NASH。当进一步评价显示没有明显的导致肝脏疾病的原因(如药物、病毒性肝炎、或过量饮酒)时以及当肝脏的X射线或成像研究显示脂肪时,怀疑是NASH。证实NASH的诊断并且将它与单纯性脂肪肝区分的唯一手段是肝活检。肝活检需要将针穿过皮肤***并且取出一小块肝脏。如果组织显示脂肪而没有炎症和损伤,那么诊断为单纯性脂肪肝或NAFLD。当组织的显微镜检查显示脂肪以及炎症和肝细胞损伤时,诊断为NASH。需要进行活检来确定瘢痕组织是否已经在肝脏中产生。目前,没有血液检查或扫描可以可靠地提供这一信息。因此,对侵入性较小的诊断方法(即不需要活检的方法)存在需要。
发明内容
在一个方面,本公开提供了诊断或帮助诊断受试者的肝脏疾病的方法,所述方法包括:分析来自所述受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表12、表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表14、表16和/或表18;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病阳性和/或肝脏疾病阴性参考水平相比较以诊断所述受试者是否患有肝脏疾病。
在另一个方面,本公开提供了诊断或帮助诊断受试者的NASH的方法,所述方法包括:分析来自所述受试者的生物样品以确定所述样品中针对NASH的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表7、表8、表10和/或表11;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的NASH阳性和/或NASH阴性参考水平相比较以诊断所述受试者是否患有NASH。
在另一个方面,本公开提供了诊断或帮助诊断受试者的NAFLD的方法,所述方法包括:分析来自所述受试者的生物样品以确定所述样品中针对NAFLD的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、和/或表11;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的NAFLD阳性和/或NAFLD阴性参考水平相比较以诊断所述受试者是否患有NAFLD。在这个方面的一个特征中,所述一种或多种生物标志物可以选自由以下各项组成的组:5-甲硫基腺苷(5-MTA)、甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、4-甲基-2-氧代戊酸盐、3-甲基-2-氧代戊酸盐、缬氨酸、3-甲基-2-氧代丁酸盐、2-羟基丁酸盐、脯氨酰脯氨酸、羊毛甾醇、牛磺-β-鼠胆酸盐、以及脱氧胆酸盐。
在另一个方面,本公开提供了在受试者中辨别NASH与NAFLD的方法,所述方法包括分析来自所述受试者的生物样品以确定所述样品中针对NASH和/或NAFLD的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、和/或表11;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的参考水平相比较以辨别NASH与NAFLD。
在另一个方面,本公开提供了诊断或帮助诊断受试者的肝纤维化的方法,所述方法包括分析来自所述受试者的生物样品以确定所述样品中针对纤维化的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表12、表10、表11、表14、表16、和/或表18;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的纤维化阳性和/或纤维化阴性参考水平相比较以诊断所述受试者是否患有纤维化。
在另一个方面,本公开提供了确定患有肝纤维化的受试者的纤维化的分期的方法,所述方法包括分析来自所述受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表12、表10、表11、表14、表16、和/或表18;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝纤维化分期参考水平相比较以确定所述肝纤维化的分期。
在另一个实施方案中,本公开提供了监测受试者的肝脏疾病的进展/消退的方法,所述方法包括分析来自所述受试者的第一生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表12、表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表14、表16、和/或表18,并且所述第一样品是在第一时间点从所述受试者获得的;分析来自所述受试者的第二生物样品以确定所述一种或多种生物标志物的水平,其中所述第二样品是在第二时间点从所述受试者获得的;以及将所述第一样品中一种或多种生物标志物的水平与所述第二样品中所述一种或多种生物标志物的水平相比较以监测所述受试者的肝脏疾病的进展/消退。
在另一个实施方案中,本公开提供了在患有肝脏疾病的受试者中辨别不太严重的肝脏疾病与更严重的肝脏疾病的方法,所述方法包括分析来自所述受试者的生物样品以确定所述样品中一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表12、表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表14、表16、和/或表18;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的不太严重和/或更严重参考水平相比较以确定所述受试者的肝脏疾病的严重程度。
在本发明的又另一个方面,一种诊断或帮助诊断受试者是否患有肝脏疾病的方法包括分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表19和表20;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病阳性和/或肝脏疾病阴性参考水平相比较以诊断所述受试者是否患有肝脏疾病。
在这个方面的一个特征中,所述肝脏疾病可以是NASH并且所述一种或多种生物标志物可以选自表19。在这个方面的另一个特征中,所述肝脏疾病可以是纤维化并且所述一种或多种生物标志物可以选自表20。在另外的特征中,所述诊断可以包括辨别NASH与NAFLD或辨别NASH与纤维化。
在本发明的另一个方面,一种确定患有肝纤维化的受试者的纤维化分期的方法包括分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表20;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的高分期肝纤维化和/或低分期肝纤维化参考水平相比较以确定肝纤维化的分期。
在本发明的另一个方面,一种监测受试者的肝脏疾病的进展/消退的方法包括分析来自受试者的第一生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表19和/或表20并且所述第一样品是在第一时间点从所述受试者获得的;分析来自受试者的第二生物样品以确定所述一种或多种生物标志物的水平,其中所述第二样品是在第二时间点从所述受试者获得的;以及将所述第一样品中一种或多种生物标志物的水平与所述第二样品中所述一种或多种生物标志物的水平相比较以监测所述受试者的肝脏疾病的进展/消退。
在本发明的另一个方面,一种在患有肝脏疾病的受试者中辨别不太严重的肝脏疾病与更严重的肝脏疾病的方法包括分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表19和/或表20;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的不太严重的肝脏疾病和/或更严重的肝脏疾病参考水平相比较以确定所述受试者的肝脏疾病的严重程度。
在又另一个方面,一种帮助在已经被诊断为患有肝脏疾病的受试者中辨别NASH与NAFLD的方法包括分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表19;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病参考水平相比较以在所述受试者中辨别NASH与NAFLD。
在另一个方面,一种帮助在已经被诊断为患有肝脏疾病的受试者中辨别NASH与纤维化的方法包括分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表19和/或表20;以及将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病参考水平相比较以在所述受试者中辨别NASH与纤维化。
在又另一个实施方案中,本公开提供了确定肝脏疾病分数的方法。
附图说明
图1是图表图示,示出了作为代谢物数目(X轴)的函数的MRI PDFF相关性的平均R平方值(Y轴)。
图2是图表图示,示出了通过拟合具有AUC>0.6663的八种代谢物的所有可能的模型组合所获得的用于将0期-1期纤维化与2期-4期纤维化相区分的计算曲线下面积(AUC)的范围。
图3是图表图示,示出了通过拟合具有AUC>0.7217的七种代谢物的所有可能的模型组合所获得的用于将0期-1期纤维化与3期-4期纤维化相区分的计算曲线下面积(AUC)的范围。
具体实施方式
本文描述了NASH、NAFLD、以及纤维化的生物标志物;用于诊断(或帮助诊断)NAFLD、NASH和/或纤维化的方法;辨别NAFLD与NASH的方法;将纤维化的分期分类的方法;确定肝脏疾病的严重程度的方法;确定肝脏疾病或纤维化的严重程度的方法;监测NASH、NAFLD、和/或纤维化的进展/消退的方法;以及基于肝脏疾病的生物标志物的其它方法。
然而,在更详细描述本发明之前,首先将定义以下术语。
定义:
“生物标志物”意指化合物,优选是代谢物,与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比,它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。生物标志物可以在任何水平上差异地存在,但是一般以如下的水平存在,所述水平增加了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、或更多;或一般以如下的水平存在,所述水平减少了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或100%(即不存在)。生物标志物优选地以具有统计显著性(即p值小于0.05和/或q值小于0.10,如使用韦尔奇氏T检验(Welch's T-test)或威氏秩和检验(Wilcoxon's rank-sum Test)所确定)的水平差异地存在。
一种或多种生物标志物的“水平”意指样品中所述生物标志物的绝对或相对量或浓度。
“样品”或“生物样品”意指从受试者分离的生物材料。所述生物样品可以含有适用于检测所期望的生物标志物的任何生物材料,并且可以包含来自受试者的细胞材料和/或非细胞材料。所述样品可以从任何合适的生物流体中分离,所述生物流体例如像血液、血浆、血清、尿液、或脑脊髓液(CSF)。
“受试者”意指任何动物,但优选是哺乳动物,例如像人类、猴、非人类灵长类动物、小鼠或兔。
生物标志物的“参考水平”意指所述生物标志物的水平,所述水平指示特定的疾病状态、表型、或对产生特定的疾病状态或表型的易感性、或没有它们、以及疾病状态、表型、或对产生特定的疾病状态或表型的易感性的组合、或没有它们。生物标志物的“阳性”参考水平意指指示特定的疾病状态或表型的水平。生物标志物的“阴性”参考水平意指指示没有特定的疾病状态或表型的水平。举例来说,生物标志物的“NASH阳性参考水平”意指指示受试者的NASH的阳性诊断的生物标志物的水平,并且生物标志物的“NASH阴性参考水平”意指指示受试者的NASH的阴性诊断的生物标志物的水平。生物标志物的“参考水平”可以是生物标志物的绝对或相对量或浓度、生物标志物的存在或不存在、生物标志物的量或浓度的范围、生物标志物的最小和/或最大量或浓度、生物标志物的平均量或浓度、和/或生物标志物的中值量或浓度;并且,此外,生物标志物的组合的“参考水平”还可以是两种或更多种生物标志物的绝对或相对量或浓度相对于彼此的比率。针对特定的疾病状态、表型、或没有它们的生物标志物的适当的阳性参考水平和阴性参考水平可以通过测量一个或多个适当的受试者的所期望的生物标志物的水平来确定,并且这样的参考水平可以针对受试者的特定群体来定制(例如,参考水平可以是年龄匹配的或性别匹配的以使得可以在来自具有一定年龄或性别的受试者的样品中的生物标志物水平与一定年龄或性别组中针对特定的疾病状态、表型、或没有它们的参考水平之间进行比较)。这样的参考水平也可以针对用于测量生物样品中生物标志物的水平的具体技术(例如LC-MS、GC-MS等)来定制,其中生物标志物的水平可能基于所使用的具体技术而不同。
“非生物标志物化合物”意指化合物,与来自具有第二表型(例如没有第一疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比,所述化合物在来自具有第一表型(例如患有第一疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中没有差异地存在。然而,这样的非生物标志物化合物可以是来自与第一表型(例如患有第一疾病)或第二表型(例如没有第一疾病)相比具有第三表型(例如患有第二疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中的生物标志物。
“代谢物”或“小分子”意指存在于细胞中的有机分子和无机分子。所述术语不包括大的高分子,如大的蛋白质(例如具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000的分子量的蛋白质)、大的核酸(例如具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000的分子量的核酸)、或大的多糖(例如具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000的分子量的多糖)。细胞的小分子一般被发现是在细胞质或其它细胞器,如线粒体中的溶液中游离的,其中它们形成可以被进一步代谢或用于产生被称作高分子的大分子的中间体池。术语“小分子”包括将源自于食物的能量转化成有用的形式的化学反应中的信号转导分子和中间体。小分子的实例包括糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、细胞过程期间形成的中间体、以及存在于细胞内的其它小分子。
“代谢谱”或“小分子谱”意指所靶向的细胞、组织、器官、生物体、或其部分(例如细胞区室)内小分子的完整或部分清单。所述清单可以包括存在的小分子的量和/或类型。“小分子谱”可以使用单一技术或多种不同的技术来确定。
“代谢组”意指存在于给定生物体中的所有小分子。
“脂肪变性”指的是没有炎症存在的脂肪肝病。所述病况可以在饮酒或不饮酒的情况下发生。
“非酒精性脂肪肝病”(NAFLD)指的是在受试者中,即使是在不以被认为对肝脏有害的量饮酒的情况下发生的脂肪肝病(脂肪变性)。
“脂肪性肝炎”指的是与炎症有关的脂肪肝病。脂肪性肝炎可能进展成肝硬化并且可能与肝细胞癌有关。所述病况可以在饮酒或不饮酒的情况下发生。
“非酒精性脂肪性肝炎”(NASH)指的是在受试者中,即使是在不以被认为对肝脏有害的量饮酒的情况下发生的脂肪性肝炎。NASH可能进展成肝硬化并且可能与肝细胞癌有关。
“纤维化”指的是由于持续的炎症所造成的细胞外基质蛋白在肝脏中的积聚。纤维化在肝活检样品中在组织学上分为五期,即0期-4期。0期意指没有纤维化,1期指的是轻度纤维化,2期指的是中度纤维化,3期指的是重度纤维化,并且4期指的是肝硬化。
如本文所用的“肝脏疾病”指的是NAFLD、NASH、纤维化、以及肝硬化。
“NAFLD活动性分数”或“NAS”指的是针对NAFLD的组织学评分***。所述分数包括评价组织学特征的变化,如脂肪变性、小叶炎症、不存在脂肪肉芽肿、以及肝细胞气球样变。纤维化是独立于NAS来评估的。
肝脏疾病的“严重程度”指的是在非酒精性肝脏疾病活动性谱上肝脏疾病的程度,该谱在以下范围内:与肝脏中的脂肪积聚相关的低严重程度疾病(NAFLD)、与除了脂肪积聚之外还存在低水平的炎症和/或纤维化相关的严重程度增加(即临界NASH)、以及与更高水平的炎症和纤维化相关的严重程度的进一步增加(即NASH)。严重程度可以是基于纤维化分期或也可以使用NAS来评估。
对于本文所用的所选脂肪酸脂质代谢物的命名法,用前缀“CE”、“DAG”、“FFA”、“PC”、“PE”、“LPC”、“LPE”、“O-PC”、“P-PE”、“PI”、“SM”、“TAG”、“CER”、“DCER”、“LCER”、或“TL”标记的脂肪酸分别指的是存在于样品中胆固醇酯、二酰基甘油(甘油二酯)、游离脂肪酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、1-醚连接的磷脂酰胆碱、1-乙烯基醚连接的磷脂酰乙醇胺(缩醛磷脂)、磷酸肌醇、鞘磷脂、三酰基甘油(甘油三酯)、神经酰胺、二氢神经酰胺、乳糖神经酰胺、以及总脂质内的所示脂肪酸。“TL”指的是存在于样品中总脂质内的所示脂肪酸。在一些实施方案中,所示脂肪酸组分被定量为总脂肪酸中在由前缀指示的脂质类别内的比例。举例来说,缩写“TL16:0”表示样品中的总脂质中在棕榈酸(16:0)上所包含的百分比。术语“TLTL”或“总脂质总量”表示样品中存在的总脂质的绝对量(例如以每克n摩尔表示)。在一些实施方案中,所示脂肪酸组分被定量为总脂肪酸中在由前缀指示的脂质类别内的比例。在没有前缀或对具体脂质类别的其它指示的情况下提到脂肪酸时,一般表示样品中总脂质内存在的脂肪酸。在前缀“CE”、“DAG”、“FFA”、“PC”、“PE”、“LPC”、“LPE”、“O-PC”、“P-PE”、“PI”、“SM”、“TAG”、“CER”、“DCER”、或“LCER”之后的术语“LC”指的是样品中由前缀指示的总脂质类别的量(例如以每克血清或血浆n摩尔表示的该类别的脂质的浓度)。举例来说,对于从血浆或血清采集的测量结果,缩写“PC 18:2n6”表示包含亚油酸(18:2n6)的血浆或血清磷脂酰胆碱的百分比,并且术语“TGLC”表示血浆或血清中存在的甘油三酯的绝对量(例如以每克n摩尔表示)。对于三酰基甘油,代谢物名称指的是化合物的母体物质(例如TAG53:6-FA18:2表示代谢物是具有总共53个碳和总共6个双键的连接有脂肪酸的三酰基甘油。-FA18:2指的是在质谱仪上所鉴定的片段(即,在这个实例中TAG的三个脂肪酸之一是18:2))。“MUFA”、“PUFA”、以及“SFA”分别指的是单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、以及饱和脂肪酸。
I.生物标志物
本文所述的NAFLD、NASH、以及纤维化生物标志物是使用代谢组学谱分析技术发现的。这样的代谢组学谱分析技术更详细地描述于下文所阐述的实施例以及美国专利号7,005,255;7,329,489;7,550,258;7,550,260;7,553,616;7,635,556;7,682,783;7,682,784;7,910,301;以及7,947,453中,这些美国专利的全部内容在此以引用的方式并入本文。
一般来说,确定来自被诊断为患有NAFLD、NASH、或纤维化的人类受试者以及来自一个或多个其它组的人类受试者(例如未被诊断为患有NAFLD、NASH或纤维化的对照受试者)的生物样品的代谢谱。将来自患有NAFLD、NASH、或纤维化的受试者的生物样品的代谢谱与来自一个或多个其它组的受试者的生物样品的代谢谱相比较。与另一组(例如未被诊断为患有NAFLD、NASH、或纤维化的对照受试者)相比,在来自患有NAFLD、NASH、或纤维化的受试者的样品的代谢谱中差异存在的那些分子,包括以具有统计显著性的水平差异存在的那些分子被鉴定为生物标志物以辨别那些组。此外,与另一组相比,来自患有NAFLD、NASH、或纤维化的受试者的样品的代谢谱中差异存在的那些分子,包括以具有统计显著性的水平差异存在的那些分子也被鉴定为生物标志物以辨别那些组。
所述生物标志物更详细地论述于本文中。所发现的生物标志物与以下一个或多个组相对应:
用于辨别患有NAFLD的受试者与未被诊断为患有NAFLD的受试者的生物标志物(参见表2、表3、表4、表5);
用于辨别患有NASH的受试者与患有NAFLD的受试者的生物标志物(参见表7、表8);
用于辨别患有纤维化的受试者与没有纤维化的对照受试者的生物标志物(参见表10、表11、表12、表14、表16、表18、表20);
用于辨别纤维化的分期的生物标志物(参见表10、表11、表12、表14、表16、表18)。
用于辨别患有NASH的受试者与没有NASH的对照受试者的生物标志物(参见表20)。
II.方法
A.肝脏疾病的诊断
鉴定针对NAFLD、NASH、以及纤维化的生物标志物允许诊断(或帮助诊断)表现出与存在肝脏疾病相符的一个或多个症状的受试者的肝脏疾病,并且包括对先前未被鉴定为患有肝脏疾病的受试者的肝脏疾病进行初步诊断以及对先前针对肝脏疾病接受治疗的受试者的肝脏疾病的复发进行诊断。一种诊断(或帮助诊断)受试者是否患有肝脏疾病的方法包括(1)分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平;以及(2)将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病阳性和/或肝脏疾病阴性参考水平相比较以诊断(或帮助诊断)所述受试者是否患有肝脏疾病。所使用的一种或多种生物标志物选自表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20以及其组合。当使用这样的方法来帮助诊断肝脏疾病时,所述方法的结果可以连同可用于临床确定受试者是否患有肝脏疾病的其它方法(或其结果)一起使用。
可以使用任何合适的方法来分析生物样品以确定所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平。合适的方法包括色谱(例如HPLC、气相色谱、液相色谱)、质谱分析(例如MS、MS-MS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、其它免疫化学技术、以及其组合。此外,可以间接地测量所述一种或多种生物标志物的水平,例如通过使用测量与期望被测量的一种或多种生物标志物的水平相关的一种化合物(或多种化合物)的水平的测定。
可以确定表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20中的生物标志物中的一种或多种的水平,包括表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20以及其组合或其任何部分中所有生物标志物的组合的水平,并且将所述水平用于帮助诊断受试者是否患有肝脏疾病的方法中。确定所述生物标志物的组合的水平可以允许在诊断肝脏疾病以及帮助诊断肝脏疾病时具有更大的灵敏度和特异性。举例来说,生物样品中某些生物标志物(和非生物标志物化合物)的水平的比率可以允许在诊断肝脏疾病以及帮助诊断肝脏疾病时具有更大的灵敏度和特异性。
在一个实施例中,在诊断或帮助诊断受试者是否患有NAFLD的方法中可以确定表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、和/或表11中的一种或多种生物标志物、以及其任何组合(包括所有生物标志物的组合)的水平。举例来说,以下生物标志物中的一种或多种可以单独或组合用于诊断或帮助诊断NAFLD:硫酸表雄酮、硫酸雄酮、I-***原、16-羟基棕榈酸盐、岩藻糖、牛磺酸、3-羟基癸酸盐、3-羟基辛酸盐、16a-羟基DHEA 3-硫酸酯、硫酸脱氢异雄酮(DHEA-S)、5-甲硫基腺苷(MTA)、γ-谷氨酰组氨酸、缬氨酰甘氨酸、3-羟基异丁酸盐、环(L-phe-L-pro)、2-氨基己二酸盐、4-甲基-2-氧代戊酸盐、2-羟基丁酸盐、脯氨酰脯氨酸、以及牛磺-β-鼠胆酸盐。在另一个实施例中,一种或多种另外的生物标志物可以任选地选自由以下各项组成的组:异亮氨酸、谷氨酸盐、α-酮戊二酸盐、TL16:1n7(16:1n7、棕榈油酸)、TL16:0(16:0、棕榈酸)、牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、脱氧胆酸盐、3-甲基-2-氧代戊酸盐、缬氨酸、3-甲基-2-氧代丁酸盐、以及羊毛甾醇,并且可以与所述一种或多种生物标志物组合使用。
在另一个实施例中,在诊断或帮助诊断受试者是否患有NASH的方法中可以确定表7、表8、表10、表11、和/或表20中的一种或多种生物标志物以及其任何组合(包括所有生物标志物的组合)的水平。举例来说,以下生物标志物中的一种或多种可以单独或组合用于诊断或帮助诊断NASH:硫酸表雄酮、硫酸雄酮、I-***原、16-羟基棕榈酸盐、3-羟基癸酸盐、3-羟基辛酸盐、16a-羟基DHEA 3-硫酸酯、硫酸脱氢异雄酮(DHEA-S)、5-甲硫基腺苷(MTA)、缬氨酰甘氨酸、环(L-phe-L-pro)、岩藻糖、牛磺酸、γ-谷氨酰组氨酸、3-羟基异丁酸盐、CE(24:1)、PE(P-16:0/14:1)、LPC(14:0)、SM(18:1)、PE(15:0/22:4)、FFA(20:0)、LPC(12:0)、LCER(26:0)、LPE(14:1)、PI(16:0/16:0)、LPE(20:4)、DCER(20:0)、LCER(14:0)、PE(15:0/18:4)、PI(18:0/16:1)、PE(16:0/22:2)、PE(P-14:1/18:1)、PC(16:0/14:1)、PE(18:0/17:0)、PE(P-16:0/18:0)、PE(P-18:0/16:1)、PE(O-18:0/18:0)、CER(26:0)、PE(16:0/16:0)、LPE(18:4)、以及PE(O-18:0/14:1)。一种或多种另外的生物标志物可以任选地选自由以下各项组成的组:TL16:1n7(16:1n7、棕榈油酸)、TL16:0(16:0、棕榈酸)、牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、谷氨酸盐、LPE(18:2)、LPE(20:3)、PE(14:0/14:1)、PC(14:0/22:4)、PC(15:0/16:1)、PC(20:0/14:1)、PC(17:0/22:6)、PE(15:0/18:3)、PE(17:0/20:2)、PE(18:2/20:2)、PE(18:2/20:3)、PC(18:1/22:6)、PC(18:1/22:5)、PC(14:0/18:4)、SM(16:0)、CE(24:0)、PC(14:0/20:2)、PC(14:0/20:3)、PC(18:1/18:4)、SM(18:0)、PC(14:0/18:2)、以及PC(14:0/16:1)。
在另一个实施例中,在受试者中辨别NASH与NAFLD的方法中可以确定表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、和/或表20中一种或多种生物标志物的水平。举例来说,以下生物标志物中的一种或多种可以单独或组合用于辨别NASH与NAFLD:硫酸表雄酮、硫酸雄酮、I-***原、16-羟基棕榈酸盐、岩藻糖、牛磺酸、3-羟基癸酸盐、3-羟基辛酸盐、16a-羟基DHEA3-硫酸酯、硫酸脱氢异雄酮(DHEA-S)、5-甲硫基腺苷(MTA)、γ-谷氨酰组氨酸、缬氨酰甘氨酸、3-羟基异丁酸盐、环(L-phe-L-pro)、2-氨基己二酸盐、4-甲基-2-氧代戊酸盐、2-羟基丁酸盐、脯氨酰脯氨酸、牛磺-β-鼠胆酸盐、CE(24:1)、PE(P-16:0/14:1)、LPC(14:0)、SM(18:1)、PE(15:0/22:4)、FFA(20:0)、LPC(12:0)、LCER(26:0)、LPE(14:1)、PI(16:0/16:0)、LPE(20:4)、DCER(20:0)、LCER(14:0)、PE(15:0/18:4)、PI(18:0/16:1)、PE(16:0/22:2)、PE(P-14:1/18:1)、PC(16:0/14:1)、PE(18:0/17:0)、PE(P-16:0/18:0)、PE(P-18:0/16:1)、PE(O-18:0/18:0)、CER(26:0)、PE(16:0/16:0)、LPE(18:4)、以及PE(O-18:0/14:1)。一种或多种另外的生物标志物可以任选地选自由以下各项组成的组:异亮氨酸、谷氨酸盐、α-酮戊二酸盐、TL16:1n7(16:1n7、棕榈油酸)、TL16:0(16:0、棕榈酸)、牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、脱氧胆酸盐、3-甲基-2-氧代戊酸盐、缬氨酸、3-甲基-2-氧代丁酸盐、羊毛甾醇、LPE(18:2)、LPE(20:3)、PE(14:0/14:1)、PC(14:0/22:4)、PC(15:0/16:1)、PC(20:0/14:1)、PC(17:0/22:6)、PE(15:0/18:3)、PE(17:0/20:2)、PE(18:2/20:2)、PE(18:2/20:3)、PC(18:1/22:6)、PC(18:1/22:5)、PC(14:0/18:4)、SM(16:0)、CE(24:0)、PC(14:0/20:2)、PC(14:0/20:3)、PC(18:1/18:4)、SM(18:0)、PC(14:0/18:2)、以及PC(14:0/16:1)。
在另一个实施例中,在诊断或帮助诊断受试者是否患有纤维化的方法中可以确定表10、表11、表12、表14、表16、表18、和/或表20中一种或多种生物标志物的水平。举例来说,以下生物标志物中的一种或多种可以单独或组合用于诊断或帮助诊断受试者是否患有纤维化:戊二酸盐(戊烷二酸盐)、硫酸表雄酮、硫酸雄酮、I-***原、16-羟基棕榈酸盐、岩藻糖、牛磺酸、3-羟基癸酸盐、3-羟基辛酸盐、16a-羟基DHEA 3-硫酸酯、硫酸脱氢异雄酮(DHEA-S)、2-氨基庚酸盐、5-甲硫基腺苷(MTA)、γ-谷氨酰组氨酸、缬氨酰甘氨酸、环(L-phe-L-pro)、CER(14:0)、DCER(14:0)、LPE(12:0)、DCER(18:0)、PE(18:0/22:2)、PE(P-18:0/18:3)、LPC(17:0)、LPC(22:0)、CER(18:1)、LCER(22:0)、PE(16:0/20:1)、CE(15:0)、PE(16:0/22:4)、PE(O-18:0/20:2)、LPC(20:0)、LPE(24:0)、PC(12:0/14:1)、PE(17:0/22:2)、SM(18:1)、CER(16:0)、LCER(24:0)、PE(O-18:0/20:3)、CE(17:0)、PE(P-16:0/18:3)、PE(P-16:0/16:1)、LPE(14:1)、FFA(24:0)、PE(O-16:0/18:4)、FFA(15:0)、SM(14:0)、LPC(20:2)、PE(P-14:1/18:1)、SM(24:1)、PI(18:0/20:2)、LPC(15:0)、PE(O-18:0/18:1)、PI(18:1/20:3)、PE(16:0/16:1)、DAG(18:1/20:3)X-19561、X-18889、X-21471、X-11871、以及X-12850。一种或多种另外的生物标志物可以任选地选自由以下各项组成的组:牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、谷氨酸盐、TL16:1n7(16:1n7、棕榈油酸酯)、TL16:0(16:0、棕榈酸)、异亮氨酸、α-酮戊二酸盐、PE(18:2/20:2)、PE(14:0/16:1)、PE(14:0/14:1)、PE(16:0/18:1)、PE(18:1/18:1)、PE(17:0/20:4)、PE(14:0/20:5)、PE(16:0/22:5)、PE(18:2/20:3)、PE(16:0/20:4)、PE(14:0/18:2)、PE(18:1/18:4)、PE(15:0/22:6)、PE(16:0/14:0)、LPC(18:3)、TAG55:7-FA20:3、TAG53:6-FA18:2、TAG55:7-FA20:4、TAG53:5-FA18:2、TAG53:7-FA18:3、TAG55:8-FA20:4、TAG53:5-FA18:1、TAG55:6-FA20:3、TAG57:9-FA22:6、TAG53:6-FA18:3、TAG55:6-FA18:1、TAG53:6-FA18:1、TAG53:4-FA18:1、TAG53:4-FA18:0、TAG51:4-FA16:0、TAG53:3-FA18:0、TAG51:3-FA16:0、TAG51:4-FA18:1、TAG56:5-FA20:4、TAG56:5-FA18:0、TAG56:4-FA20:4、PE(14:0/18:1)、PC(14:0/18:4)、PC(18:2/22:5)、PC(20:0/22:5)、SM(18:0)、CE(18:0)、PC(18:2/18:4)、以及PC(14:0/20:2)。
在另一个实施例中,在确定受试者的纤维化的分期的方法中可以确定表10、表11、表12、表14、表16、和/或表18中一种或多种生物标志物的水平。举例来说,以下生物标志物中的一种或多种可以单独或组合用于诊断或帮助诊断受试者是否患有纤维化:戊二酸盐(戊烷二酸盐)、硫酸表雄酮、硫酸雄酮、I-***原、16-羟基棕榈酸盐、岩藻糖、牛磺酸、3-羟基癸酸盐、3-羟基辛酸盐、16a-羟基DHEA 3-硫酸酯、硫酸脱氢异雄酮(DHEA-S)、2-氨基庚酸盐、5-甲硫基腺苷(MTA)、γ-谷氨酰组氨酸、缬氨酰甘氨酸、以及环(L-phe-L-pro)。一种或多种另外的生物标志物可以任选地选自由以下各项组成的组:牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、谷氨酸盐、TL16:1n7(16:1n7、棕榈油酸酯)、TL16:0(16:0、棕榈酸)、异亮氨酸、以及α-酮戊二酸盐。
在确定所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平之后,将所述水平与肝脏疾病阳性和/或肝脏疾病阴性参考水平相比较以诊断或帮助诊断所述受试者是否患有肝脏疾病。样品中所述一种或多种生物标志物的水平与肝脏疾病阳性参考水平相匹配(例如与参考水平相同、与参考水平基本上相同、高于和/或低于参考水平的最小值和/或最大值、和/或在参考水平的范围内的水平)指示了所述受试者有肝脏疾病的诊断。样品中所述一种或多种生物标志物的水平与肝脏疾病阴性参考水平相匹配(例如与参考水平相同、与参考水平基本上相同、高于和/或低于参考水平的最小值和/或最大值、和/或在参考水平的范围内的水平)指示了所述受试者没有肝脏疾病的诊断。此外,与肝脏疾病阴性参考水平相比,所述样品中差异存在(特别是以具有统计显著性的水平)的一种或多种生物标志物的水平指示了所述受试者有肝脏疾病的诊断。与肝脏疾病阳性参考水平相比,所述样品中差异存在(特别是以具有统计显著性的水平)的一种或多种生物标志物的水平指示了所述受试者没有肝脏疾病的诊断。
可以使用各种技术将所述一种或多种生物标志物的水平与肝脏疾病阳性和/或肝脏疾病阴性参考水平相比较,所述技术包括简单比较(例如手动比较)所述生物样品中所述一种或多种生物标志物的水平与肝脏疾病阳性和/或肝脏疾病阴性参考水平。还可以使用一种或多种统计分析(例如t检验、韦尔奇氏T检验、威氏秩和检验、随机森林(RandomForest)、T分数、Z分数)或使用数学模型(例如算法、统计模型、混合效应模型)将所述生物样品中所述一种或多种生物标志物的水平与肝脏疾病阳性和/或肝脏疾病阴性参考水平相比较。
举例来说,可以使用包括单个算法或多个算法的数学模型来确定受试者是否患有肝脏疾病。也可以使用数学模型来辨别肝脏疾病的类型(例如NASH和NAFLD)或纤维化分期。示例性数学模型可以使用来自受试者的任何数目的生物标志物(例如2种、3种、5种、7种、9种等)的测量水平以使用基于所测量的生物标志物的水平之间的数学关系的算法或一系列算法来确定受试者是否患有肝脏疾病、受试者的肝脏疾病是进展还是消退、受试者是患有更晚期还是不太晚期的肝脏疾病等。在一个实施例中,所述数学模型是逻辑回归建模。在另一个实施例中,所述数学模型是多重逻辑回归建模。
所述方法的结果可以连同可用于诊断受试者的肝脏疾病的其它方法(或其结果)一起使用。举例来说,所述方法的结果可以提供需要侵入性随访检查(例如肝活检)以确认NAFLD、NASH、纤维化或肝硬化的诊断的患者的指示。
在一个方面,本文提供的生物标志物可以用于向医师提供肝脏疾病分数(例如NASH分数、NAFLD分数、纤维化分数),所述肝脏疾病分数指示受试者的肝脏疾病的存在和/或严重程度。所述分数是基于生物标志物和/或生物标志物的组合的临床上显著改变的参考水平。所述参考水平可以由算法导出。所述分数可以用于将受试者置于从正常(即没有肝脏疾病)到重度的肝脏疾病严重程度范围内。所述分数可以通过多种方式使用:例如,可以通过定期确定和监测所述分数来监测疾病进展、消退、或缓解;可以通过监测所述分数来确定对治疗干预的响应;以及可以使用所述分数来评价药物功效。
用于确定受试者的肝脏疾病分数的方法可以使用生物样品中表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20中所标识的肝脏疾病生物标志物中的一种或多种来进行。所述方法可以包括将所述样品中所述一种或多种肝脏疾病生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病参考水平相比较以确定所述受试者的肝脏疾病分数。所述方法可以使用选自表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20中所列的那些标志物的任何数目的标志物,包括1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种标志物。可以通过任何方法,包括统计方法,如回归分析来使多种生物标志物与肝脏疾病具有相关性。
在确定所述一种或多种生物标志物的水平之后,可以将所述水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病参考水平或参考曲线相比较以确定对所述样品中所述一种或多种生物标志物中的每一种的评级。可以使用任何算法将所述一个或多个评级聚集以生成受试者的分数,例如肝脏疾病分数。所述算法可以考虑与肝脏疾病有关的任何因素,包括生物标志物的数目、生物标志物与肝脏疾病的相关性等。
在一个实施方案中,使用回归分析,例如多重线性回归建立含有一种或多种生物标志物作为变量的数学模型或数学公式。作为非限制性实例,所开发的公式可以包括以下:
A+B(生物标志物1)+C(生物标志物2)+D(生物标志物3)+E(生物标志物4)=R分数
A+B×ln(生物标志物1)+C×ln(生物标志物2)+D×ln(生物标志物3)+E×ln(生物标志物4)=lnR分数
其中A、B、C、D、E是常数;生物标志物1、生物标志物2、生物标志物3、生物标志物4是分析物(生物标志物)的测量值并且R分数是肝脏疾病存在或不存在或严重程度的量度。
所述公式可以包括一种或多种生物标志物作为变量,如1种、2种、3种、4种、5种、10种、15种、20种或更多种生物标志物。
B.监测肝脏疾病的进展/消退的方法
鉴定针对肝脏疾病的生物标志物还允许监测受试者的肝脏疾病的进展/消退。一种监测受试者的肝脏疾病的进展/消退的方法包括(1)分析来自受试者的第一生物样品以确定选自表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20的针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,所述第一样品是在第一时间点从所述受试者获得的;(2)分析来自受试者的第二生物样品以确定所述一种或多种生物标志物的水平,所述第二样品是在第二时间点从所述受试者获得的;以及(3)将所述第一样品中一种或多种生物标志物的水平与所述第二样品中所述一种或多种生物标志物的水平相比较以监测所述受试者的肝脏疾病的进展/消退。所述方法的结果指示了受试者的肝脏疾病的过程(即,进展或消退,如果有任何改变的话)。
可以确定表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20的生物标志物中的一种或多种的水平,包括表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20以及其组合或其任何部分中所有生物标志物的组合的水平,并且将所述水平用于监测受试者的肝脏疾病的进展/消退的方法中。举例来说,可以确定表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20或其任何部分中一种生物标志物、两种或更多种生物标志物、三种或更多种生物标志物、四种或更多种生物标志物、五种或更多种生物标志物、六种或更多种生物标志物、七种或更多种生物标志物、八种或更多种生物标志物、九种或更多种生物标志物、十种或更多种生物标志物等的水平,包括所有生物标志物的组合的水平,并且将所述水平用于监测受试者的肝脏疾病的进展/消退的方法中。
在一个实施例中,在监测受试者的NAFLD的进展/消退的方法中可以确定表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、和/或表11中一种或多种生物标志物的水平。举例来说,以下生物标志物中的一种或多种可以单独或组合用于监测NAFLD的进展/消退:硫酸表雄酮、硫酸雄酮、I-***原、16-羟基棕榈酸盐、岩藻糖、牛磺酸、3-羟基癸酸盐、3-羟基辛酸盐、16a-羟基DHEA3-硫酸酯、硫酸脱氢异雄酮(DHEA-S)、5-甲硫基腺苷(MTA)、γ-谷氨酰组氨酸、缬氨酰甘氨酸、3-羟基异丁酸盐、环(L-phe-L-pro)、2-氨基己二酸盐、4-甲基-2-氧代戊酸盐、2-羟基丁酸盐、脯氨酰脯氨酸、以及牛磺-β-鼠胆酸盐。一种或多种另外的生物标志物可以任选地选自由以下各项组成的组:异亮氨酸、谷氨酸盐、α-酮戊二酸盐、TL16:1n7(16:1n7、棕榈油酸)、TL16:0(16:0、棕榈酸)、牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、脱氧胆酸盐、3-甲基-2-氧代戊酸盐、缬氨酸、3-甲基-2-氧代丁酸盐、以及羊毛甾醇。
在另一个实施例中,在监测受试者的NASH的进展/消退的方法中可以确定表7、表8、表10、表11、和/或表20中的一种或多种生物标志物以及其任何组合(包括所有生物标志物的组合)的水平。举例来说,以下生物标志物中的一种或多种可以单独或组合用于诊断或帮助诊断NASH:硫酸表雄酮、硫酸雄酮、I-***原、16-羟基棕榈酸盐、3-羟基癸酸盐、3-羟基辛酸盐、16a-羟基DHEA 3-硫酸酯、硫酸脱氢异雄酮(DHEA-S)、5-甲硫基腺苷(MTA)、缬氨酰甘氨酸、环(L-phe-L-pro)、岩藻糖、牛磺酸、γ-谷氨酰组氨酸、3-羟基异丁酸盐、CE(24:1)、PE(P-16:0/14:1)、LPC(14:0)、SM(18:1)、PE(15:0/22:4)、FFA(20:0)、LPC(12:0)、LCER(26:0)、LPE(14:1)、PI(16:0/16:0)、LPE(20:4)、DCER(20:0)、LCER(14:0)、PE(15:0/18:4)、PI(18:0/16:1)、PE(16:0/22:2)、PE(P-14:1/18:1)、PC(16:0/14:1)、PE(18:0/17:0)、PE(P-16:0/18:0)、PE(P-18:0/16:1)、PE(O-18:0/18:0)、CER(26:0)、PE(16:0/16:0)、LPE(18:4)、以及PE(O-18:0/14:1)。一种或多种另外的生物标志物可以任选地选自由以下各项组成的组:TL16:1n7(16:1n7、棕榈油酸)、TL16:0(16:0、棕榈酸)、牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、谷氨酸盐、LPE(18:2)、LPE(20:3)、PE(14:0/14:1)、PC(14:0/22:4)、PC(15:0/16:1)、PC(20:0/14:1)、PC(17:0/22:6)、PE(15:0/18:3)、PE(17:0/20:2)、PE(18:2/20:2)、PE(18:2/20:3)、PC(18:1/22:6)、PC(18:1/22:5)、PC(14:0/18:4)、SM(16:0)、CE(24:0)、PC(14:0/20:2)、PC(14:0/20:3)、PC(18:1/18:4)、SM(18:0)、PC(14:0/18:2)、以及PC(14:0/16:1)。
在另一个实施例中,在监测受试者的纤维化的进展/消退的方法中可以确定表10、表11、表12、表14、表16、表18、和/或表20中一种或多种生物标志物的水平。举例来说,以下生物标志物中的一种或多种可以单独或组合用于监测受试者的纤维化的进展/消退:戊二酸盐(戊烷二酸盐)、硫酸表雄酮、硫酸雄酮、I-***原、16-羟基棕榈酸盐、岩藻糖、牛磺酸、3-羟基癸酸盐、3-羟基辛酸盐、16a-羟基DHEA 3-硫酸酯、硫酸脱氢异雄酮(DHEA-S)、2-氨基庚酸盐、5-甲硫基腺苷(MTA)、γ-谷氨酰组氨酸、缬氨酰甘氨酸、环(L-phe-L-pro)、CER(14:0)、DCER(14:0)、LPE(12:0)、DCER(18:0)、PE(18:0/22:2)、PE(P-18:0/18:3)、LPC(17:0)、LPC(22:0)、CER(18:1)、LCER(22:0)、PE(16:0/20:1)、CE(15:0)、PE(16:0/22:4)、PE(O-18:0/20:2)、LPC(20:0)、LPE(24:0)、PC(12:0/14:1)、PE(17:0/22:2)、SM(18:1)、CER(16:0)、LCER(24:0)、PE(O-18:0/20:3)、CE(17:0)、PE(P-16:0/18:3)、PE(P-16:0/16:1)、LPE(14:1)、FFA(24:0)、PE(O-16:0/18:4)、FFA(15:0)、SM(14:0)、LPC(20:2)、PE(P-14:1/18:1)、SM(24:1)、PI(18:0/20:2)、LPC(15:0)、PE(O-18:0/18:1)、PI(18:1/20:3)、PE(16:0/16:1)、DAG(18:1/20:3)X-19561、X-18889、X-21471、X-11871、以及X-12850。一种或多种另外的生物标志物可以任选地选自由以下各项组成的组:牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、谷氨酸盐、TL16:1n7(16:1n7、棕榈油酸酯)、TL16:0(16:0、棕榈酸)、异亮氨酸、α-酮戊二酸盐、PE(18:2/20:2)、PE(14:0/16:1)、PE(14:0/14:1)、PE(16:0/18:1)、PE(18:1/18:1)、PE(17:0/20:4)、PE(14:0/20:5)、PE(16:0/22:5)、PE(18:2/20:3)、PE(16:0/20:4)、PE(14:0/18:2)、PE(18:1/18:4)、PE(15:0/22:6)、PE(16:0/14:0)、LPC(18:3)、TAG55:7-FA20:3、TAG53:6-FA18:2、TAG55:7-FA20:4、TAG53:5-FA18:2、TAG53:7-FA18:3、TAG55:8-FA20:4、TAG53:5-FA18:1、TAG55:6-FA20:3、TAG57:9-FA22:6、TAG53:6-FA18:3、TAG55:6-FA18:1、TAG53:6-FA18:1、TAG53:4-FA18:1、TAG53:4-FA18:0、TAG51:4-FA16:0、TAG53:3-FA18:0、TAG51:3-FA16:0、TAG51:4-FA18:1、TAG56:5-FA20:4、TAG56:5-FA18:0、TAG56:4-FA20:4、PE(14:0/18:1)、PC(14:0/18:4)、PC(18:2/22:5)、PC(20:0/22:5)、SM(18:0)、CE(18:0)、PC(18:2/18:4)、以及PC(14:0/20:2)。
随时间推移,所述一种或多种生物标志物的水平的变化(如果有的话)可以指示所述受试者的肝脏疾病的进展或消退。为了对受试者的肝脏疾病的过程进行表征,可以将所述第一样品中所述一种或多种生物标志物的水平、所述第二样品中所述一种或多种生物标志物的水平、和/或所述第一样品和所述第二样品中所述生物标志物的水平的比较结果与肝脏疾病阳性参考水平和肝脏疾病阴性参考水平相比较。如果所述比较指示所述一种或多种生物标志物的水平随时间推移增加或减少(例如在所述第二样品中与所述第一样品相比)以变得更类似于肝脏疾病阳性参考水平(或不太类似于肝脏疾病阴性参考水平),则所述结果指示肝脏疾病进展。如果所述比较指示所述一种或多种生物标志物的水平随时间推移增加或减少以变得更类似于肝脏疾病阴性参考水平(或不太类似于肝脏疾病阳性参考水平),则所述结果指示肝脏疾病消退。
在一个实施方案中,所述评估可以基于肝脏疾病分数(例如NASH分数、NAFLD分数、纤维化分数),所述肝脏疾病分数指示所述受试者的肝脏疾病并且可以随时间推移来监测。通过比较来自第一时间点样品的肝脏疾病分数与来自至少第二时间点样品的肝脏疾病分数,可以确定肝脏疾病的进展或消退。这样的监测受试者的肝脏疾病的进展/消退的方法包括(1)分析来自受试者的第一生物样品以确定所述第一样品的肝脏疾病分数,所述第一样品是在第一时间点从所述受试者获得的;(2)分析来自受试者的第二生物样品以确定第二肝脏疾病分数,所述第二样品是在第二时间点从所述受试者获得的;以及(3)将所述第一样品的肝脏疾病分数与所述第二样品的肝脏疾病分数相比较以监测所述受试者的肝脏疾病的进展/消退。
本文所述的生物标志物和算法可以指导或帮助医师决定治疗途径,例如是实施诸如手术程序(例如全肾切除术或部分肾切除术)的程序、用药物疗法来治疗、还是使用观察等待方法。
如同本文所述的其它方法一样,在监测受试者的肝脏疾病的进展/消退的方法中所进行的比较可以使用各种技术来执行,所述技术包括简单比较、一种或多种统计分析、数学模型(算法)以及其组合。
所述方法的结果可以连同可用于临床监测受试者的肝脏疾病的进展/消退的其它方法(或其结果)一起使用。
如上文关于诊断(或帮助诊断)肝脏疾病的方法所述,可以使用任何合适的方法来分析生物样品以确定所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平。此外,可以确定表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20或其任何部分中一种或多种生物标志物的水平,包括所有生物标志物的组合的水平,并且将所述水平用于监测受试者的肝脏疾病的进展/消退的方法中。
可以进行这样的方法来监测患有肝脏疾病的受试者的肝脏疾病的过程或可以将这样的方法用于没有肝脏疾病的受试者(例如疑似易患肝脏疾病的受试者)以监测对肝脏疾病的易感性的水平。
C.对肝纤维化进行分期的方法
鉴定针对肝脏疾病的生物标志物还允许确定受试者的肝纤维化分期。一种确定纤维化的分期的方法包括(1)分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中表10、表11、表12、表14、表16、和/或表18中所列的一种或多种生物标志物的水平;以及(2)将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的高分期纤维化和/或低分期纤维化参考水平相比较以确定所述受试者的肝纤维化的分期。所述方法的结果可以连同可用于临床确定受试者的肝脏疾病的分期的其它方法(或其结果)一起使用。举例来说,当基于肝纤维化的分期,诊断是NAFLD或疑似NASH时,所述方法的结果可以提供需要侵入性随访检查(例如肝活检)的患者的指示。
如上文关于诊断(或帮助诊断)肝脏疾病的方法所述,可以使用任何合适的方法来分析生物样品以确定所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平。
在确定受试者的肝纤维化的分期的方法中可以确定表10、表11、表12、表14、表16、和/或表18中所列的一种或多种生物标志物和其组合的水平。举例来说,可以确定表10、表11、表12、表14、表16、和/或表18或其任何部分中一种生物标志物、两种或更多种生物标志物、三种或更多种生物标志物、四种或更多种生物标志物、五种或更多种生物标志物、六种或更多种生物标志物、七种或更多种生物标志物、八种或更多种生物标志物、九种或更多种生物标志物、十种或更多种生物标志物等的水平,包括所有生物标志物的组合的水平,并且将所述水平用于确定受试者的肝脏疾病的分期的方法中。举例来说,以下生物标志物中的一种或多种可以单独或组合用于诊断或帮助诊断受试者是否患有纤维化:戊二酸盐(戊烷二酸盐)、硫酸表雄酮、硫酸雄酮、I-***原、16-羟基棕榈酸盐、岩藻糖、牛磺酸、3-羟基癸酸盐、3-羟基辛酸盐、16a-羟基DHEA 3-硫酸酯、硫酸脱氢异雄酮(DHEA-S)、2-氨基庚酸盐、5-甲硫基腺苷(MTA)、γ-谷氨酰组氨酸、缬氨酰甘氨酸、以及环(L-phe-L-pro)。一种或多种另外的生物标志物可以任选地选自由以下各项组成的组:牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、谷氨酸盐、TL16:1n7(16:1n7、棕榈油酸酯)、TL16:0(16:0、棕榈酸)、异亮氨酸、以及α-酮戊二酸盐。
在确定样品中所述一种或多种生物标志物的水平之后,将所述水平与低分期肝纤维化和/或高分期肝纤维化参考水平相比较以预测受试者的肝纤维化的分期。样品中所述一种或多种生物标志物的水平与高分期肝纤维化参考水平相匹配(例如与参考水平相同、与参考水平基本上相同、高于和/或低于参考水平的最小值和/或最大值、和/或在参考水平的范围内的水平)指示了所述受试者患有高分期肝纤维化。样品中所述一种或多种生物标志物的水平与低分期肝纤维化参考水平相匹配(例如与参考水平相同、与参考水平基本上相同、高于和/或低于参考水平的最小值和/或最大值、和/或在参考水平的范围内的水平)指示了所述受试者患有低分期肝纤维化。此外,与低分期肝纤维化参考水平相比,所述样品中差异存在(特别是以具有统计显著性的水平)的一种或多种生物标志物的水平指示了所述受试者没有低分期肝纤维化。与高分期肝纤维化参考水平相比,所述样品中差异存在(特别是以具有统计显著性的水平)的一种或多种生物标志物的水平指示了所述受试者没有高分期肝纤维化。
进行研究以鉴定可以用于确定受试者的肝纤维化分期的一组生物标志物。在另一个实施方案中,本文所提供的生物标志物可以用于向医师提供纤维化分数,所述纤维化分数指示受试者的肝纤维化的分期。所述分数是基于生物标志物和/或生物标志物的组合的临床上显著改变的参考水平。所述参考水平可以由算法导出。所述纤维化分数可以用于确定受试者的从正常(即没有肝纤维化,0期)到高分期肝纤维化(即3期-4期)的肝纤维化分期。
如同上文所述的方法一样,可以使用各种技术将所述一种或多种生物标志物的水平与高分期肝纤维化和/或低分期肝纤维化参考水平相比较,所述技术包括简单比较、一种或多种统计分析、以及其组合。
D.辨别不太严重的肝脏疾病与更严重的肝脏疾病的方法
鉴定针对肝脏疾病的生物标志物还允许鉴定用于辨别不太严重的肝脏疾病与更严重的肝脏疾病的生物标志物。一种在患有肝脏疾病的受试者中辨别不太严重的肝脏疾病与更严重的肝脏疾病的方法包括(1)分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20中所列的一种或多种生物标志物的水平;以及(2)将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的不太严重的肝脏疾病和/或更严重的肝脏疾病参考水平相比较以确定所述受试者的肝脏疾病的严重程度。所述方法的结果可以连同可用于临床确定受试者的肝脏疾病的严重程度的其它方法(或其结果)一起使用。
如上文关于诊断(或帮助诊断)肝脏疾病的方法所述,可以使用任何合适的方法来分析生物样品以确定所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平。
在一个实施例中,在确定受试者的肝脏疾病的严重程度的方法中可以确定表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、表18、表19、和/或表20中所列的一种或多种生物标志物、以及其任何组合的水平,包括所有生物标志物的组合的水平。在一个实施例中,NAFLD是具有低严重程度的肝脏疾病,临界NASH是具有中度严重程度的肝脏疾病,并且NASH是具有高严重程度的肝脏疾病。在另一个实施例中,0期肝纤维化是具有低严重程度的肝脏疾病,1期-2期肝纤维化是具有中度严重程度的肝脏疾病,并且3期-4期纤维化是具有高严重程度的肝脏疾病。在另一个实施例中,NASH是具有高严重程度的肝脏疾病,并且非NASH是具有低严重程度的肝脏疾病。在另一个实施例中,纤维化是具有高严重程度的肝脏疾病,并且非纤维化是具有低严重程度的肝脏疾病。在另一个实施例中,NAFLD是比非NAFLD具有更高严重程度的肝脏疾病。
在确定所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平之后,将所述水平与不太严重的肝脏疾病和/或更严重的肝脏疾病参考水平相比较以确定受试者的肝脏疾病的侵袭性。样品中所述一种或多种生物标志物的水平与更严重的肝脏疾病参考水平相匹配(例如与参考水平相同、与参考水平基本上相同、高于和/或低于参考水平的最小值和/或最大值、和/或在参考水平的范围内的水平)指示了所述受试者患有更严重的肝脏疾病。样品中所述一种或多种生物标志物的水平与不太严重的肝脏疾病参考水平相匹配(例如与参考水平相同、与参考水平基本上相同、高于和/或低于参考水平的最小值和/或最大值、和/或在参考水平的范围内的水平)指示了所述受试者患有不太严重的肝脏疾病。此外,与不太严重的肝脏疾病参考水平相比,所述样品中差异存在(特别是以具有统计显著性的水平)的一种或多种生物标志物的水平指示了所述受试者没有不太严重的肝脏疾病。与更严重的肝脏疾病参考水平相比,所述样品中差异存在(特别是以具有统计显著性的水平)的一种或多种生物标志物的水平指示了所述受试者没有更严重的肝脏疾病。
进行研究以鉴定可以用于辨别不太严重的肝脏疾病与更严重的肝脏疾病的一组生物标志物。在另一个实施方案中,本文所提供的生物标志物可以用于向医师提供肝脏疾病分数,所述肝脏疾病分数指示受试者的肝脏疾病的严重程度。所述分数是基于生物标志物和/或生物标志物的组合的临床上显著改变的参考水平。所述参考水平可以由算法导出。所述肝脏疾病分数可以用于确定受试者从正常(即没有肝脏疾病)到更严重的肝脏疾病的肝脏疾病严重程度。
如同上文所述的方法一样,可以使用各种技术将所述一种或多种生物标志物的水平与更严重的肝脏疾病和/或不太严重的肝脏疾病参考水平相比较,所述技术包括简单比较、一种或多种统计分析、以及其组合。
如同诊断(或帮助诊断)受试者是否患有肝脏疾病的方法一样,确定受试者的肝脏疾病的严重程度的方法还可以包括分析生物样品以确定一种或多种非生物标志物化合物的水平。
III.其它方法
还考虑了使用本文所论述的生物标志物的其它方法。举例来说,美国专利号7,005,255、美国专利号7,329,489、美国专利号7,553,616、美国专利号7,550,260、美国专利号7,550,258、美国专利号7,635,556、美国专利申请号11/728,826、美国专利申请号12/463,690以及美国专利申请号12/182,828中所述的方法可以使用包括本文所公开的生物标志物中的一种或多种的小分子谱来进行。
在本文所列的方法中的任一种中,所使用的生物标志物可以选自表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、和/或表18中具有小于0.05的p值的那些生物标志物。本文所述的方法中的任一种中所使用的生物标志物还可以选自表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、和/或表18中在肝脏疾病中减少以下程度(与对照相比)或在高分期纤维化中减少以下程度(与对照或低分期纤维化相比)或在更严重的情况下减少以下程度(与对照或不太严重相比)的那些生物标志物:减少了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或100%(即不存在);和/或表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表12、表14、表16、和/或表18中在肝脏疾病中增加以下程度(与对照相比)或在高分期纤维化中增加以下程度(与对照或低分期纤维化相比)或在更严重的情况下增加以下程度(与对照或不太严重相比)的那些生物标志物:增加了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、或更多。
实施例
本发明将通过以下说明性实施例来进一步解释,所述实施例意图是非限制性的。
I.一般方法
A.样品制备。
使用来自汉密尔顿公司(Hamilton Company)的自动化MicroLab***制备样品。在提取过程中的第一步骤之前添加回收标准品以用于QC目的。使用甲醇提取来进行样品制备以去除蛋白质级分,同时允许最大限度地回收小分子。将所得的提取物分成五个部分:一个用于通过UPLC-MS/MS,以正离子模式电喷雾电离进行分析;一个用于通过UPLC-MS/MS,以负离子模式电喷雾电离进行分析;一个用于LC极性平台;一个用于通过GC-MS进行分析;以及保留一份样品以用于备份。将样品在氮气下短暂放置在(Zymark公司)上以去除有机溶剂。对于LC,将样品在氮气下储存过夜。对于GC,将样品在真空下干燥过夜。然后为适当的仪器(LC/MS或GC/MS)制备样品。
B.超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)。
LC/MS分析使用与加热电喷雾电离(HESI-II)源和以35,000质量分辨率操作的Orbitrap质量分析仪交接的Waters ACQUITY超高效液相色谱(UPLC)和Thermo ScientificQ-Exactive高分辨率/准确质谱仪。将样品提取物干燥,然后在酸性或碱性LC相容溶剂中复原,所述溶剂中的每一种含有固定浓度的8种或更多种进样标准品以确保进样和色谱一致性。在两次独立的进样中,使用单独的专用柱(Waters UPLC BEH C18-2.1mm×100mm,1.7μm),使用酸性正离子优化条件分析一个等分试样并且使用碱性负离子优化条件分析另一个等分试样。使用含有0.1%甲酸的水和甲醇将在酸性条件下复原的提取物从C18柱梯度洗脱。使用含有6.5mM碳酸氢铵的甲醇和水将碱性提取物类似地从C18洗脱。在使用由含有10mM甲酸铵的水和乙腈组成的梯度从HILIC柱(Waters UPLC BEH酰胺2.1mm×150mm,1.7μm)洗脱之后,经由负离子电离分析第三等分试样。MS分析在使用动态排除的MS扫描与数据依赖性MS2扫描之间交替,并且扫描范围是80m/z-1000m/z。
C.气相色谱/质谱(GC/MS)。
对于GC/MS分析,将样品在真空干燥下再干燥最少24小时,之后在干燥氮气下使用双三甲基-甲硅烷基-三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化。GC柱是20m×0.18mm ID,具有5%苯基;95%二甲基有机硅相。温度升温速率是在18分钟的时间内从60℃到340℃。在Thermo-Finnigan Trace DSQ快速扫描单四极杆质谱仪上,使用电子碰撞电离以单位质量分辨率来分析样品。每天对仪器的质量分辨率和质量精度进行调整和校准。
D.脂质分析。
GC-FID
在一些实施例中,通过Folch等(J Biol Chem 226:497-509)的方法,在可信内标存在下,使用氯仿:甲醇(2:1v/v)来提取脂质。在100℃在氮气气氛下在密封的小瓶中在于甲醇中1%的硫酸中将脂质进行酯交换45分钟。使用含有0.05%丁基化羟基甲苯的己烷从混合物中提取所得的脂肪酸甲酯并且通过将己烷提取物在氮气下密封来制备用于GC。通过装备有30m DB 88毛细管柱(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))和火焰电离检测器的毛细管GC(Agilent Technologies 6890系列GC)对脂肪酸甲酯进行分离和定量。通过将峰面积与内标的峰面积相比较来确定每一种脂质的绝对浓度。
TRUEMASS复合脂质组
在一些实施例中,在内标存在下在甲醇:二氯甲烷中从样品中提取脂质。将提取物在氮气下浓缩并且在0.25mL于二氯甲烷:甲醇(50:50)中的10MM乙酸铵中复原。将提取物转移到***物中并且放置在小瓶中以进行注入式MS分析,所述分析是在具有纳米PEEk管和Sciex SelexIon-5500 QTRAP的Shimazdu LC上进行的。经由正离子模式和负离子模式电喷雾来分析样品。以MRM模式,使用总共超过1,100个MRM来进行5500 QTRAP扫描。通过获取目标化合物与它们的指定内标的峰面积比,然后乘以被添加到样品中的内标的浓度来定量单独的脂质物质。由类别内所有分子物质的总和计算脂质类别浓度,并且通过计算单独的脂肪酸占每一类的比例来确定脂肪酸组成。
E.数据处理和分析。
对于每一个仪器(除GC-FID之外)上的每一个生物矩阵数据集,计算每一个内标的峰面积的相对标准偏差(RSD)以确认提取效率、仪器性能、柱完整性、色谱、以及质量校准。这些内标中的几个用作保留指数(RI)标记并且针对保留时间和对齐进行检查。使用UPLC-MS和GC-MS***附带的软件的修改版本进行峰检测和积分。来自这一处理的输出产生m/z比、保留时间以及曲线下面积值的列表。软件规定了用于峰检测的标准,包括信噪比、高度以及宽度的阈值。
基于利用被赋予固定RI值的内标的保留指数将包括QC样品的生物数据集以色谱方式对齐。通过假定值不发生改变的侧翼RI标记之间的线性拟合来确定实验峰的RI。RI的好处在于它纠正了由诸如样品pH值和柱龄的***误差所引起的保留时间漂移。每一种化合物的RI是基于与它的两个侧向保留标记的洗脱关系来指定的。使用内部软件包,将积分的对齐的峰与可信标准品和常规检测的未知化合物的内部文库(化学文库)相匹配,所述文库是所使用的正离子、负离子或GC-MS数据收集方法所特有的。匹配是基于LTQ数据和DSQ数据在0.4m/z内的文库可信标准品的前瞻性鉴定和实验前体质量匹配的150RI单位内的保留指数值。将实验MS/MS与可信标准品的文库光谱相比较并且指定正向分数和逆向分数。完美的正向分数将表明实验光谱中所有的离子将以正确的比率存在于可信标准品的文库中,并且完美的逆向分数将表明所有的可信标准品文库离子均存在于实验光谱中并且以正确的比率存在。比较正向分数和逆向分数并且给出所提出的匹配的MS/MS碎片光谱分数。然后由基于上述标准批准或拒绝每一个呼叫的分析人员手动审核所有匹配。然而,不需要由分析人员进行手动审核。在一些实施方案中,匹配过程是完全自动化的。
关于化学文库、用于匹配积分的对齐的峰以鉴定已命名的化合物和常规检测的未知化合物的方法、以及用于鉴定样品中的小分子的计算机可读代码的更多细节可以见于美国专利号7,561,975中,该美国专利以引用的方式整体并入本文。
F.质量控制。
从生物样品中,将单个样品中的每一个的等分试样组合以制备技术重复样品,如上文所述对它们进行提取。将这一汇集样品的提取物针对每一个仪器上的每一个数据集进样六次以评估过程变异性。作为另外的质量控制,还将五个水等分试样作为每一个仪器上的样品集的一部分进行提取以用作过程空白对照来进行伪迹鉴定。所有的QC样品均包括仪器内标以评估提取效率和仪器性能并且用作保留指数标记以用于进行离子鉴定。所述标准品是同位素标记的或另外所选择的外源性分子以免阻碍对内在离子的检测。
G.统计分析。
缺失值(如果有的话)是用该特定化合物的所观测到的最小值来估算的。使用混合效应模型来分析NAFLD组与非NAFLD组之间的差异,并且还使用混合效应模型来评估代谢物与临床参数之间的相关性。对自然对数转换数据进行统计分析。进行随机森林(RF)分析以确定全生化谱区分NAFLD组和非NAFLD组以及基于纤维化分期区分各组的能力。使用逻辑回归和曲线下面积(AUC)来评估单个代谢物生物标志物和几个临床参数用于辨别NAFLD与非NAFLD以及用于辨别纤维化分期的性能。使用逻辑回归以及卡方分析(Chi-squareanalysis)和AUC来评估单个代谢物生物标志物用于辨别纤维化与无纤维化以及NASH与无NASH的性能。进行多重逻辑回归建模来分析多个生物标志物的组合(生物标志物组)的性能。
实施例1:人类血清中NAFLD的代谢物生物标志物
使用四个全代谢谱分析质谱平台以及GC-FID分析,针对脂肪酸、胆固醇代谢脂质、以及维生素E来分析来自36名患有NAFLD(如由通过MRI成像观测到>5%脂肪变性所定义)的受试者和118名没有NAFLD的受试者的血清样品。在患者样品中检测到总共770种已命名的代谢物。提供受试者的临床参数,包括年龄、性别、种族、民族、身高/体重/身体质量指数(BMI)、吸烟史、糖尿病史、葡萄糖、白蛋白、胆红素、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、甘油三酯、铁蛋白、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、HBA1c、血白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、血小板计数、凝血酶原时间、国际标准化比率(INR)、胰岛素、以及肝脏成像参数,包括MRI质子密度脂肪分数(MRI PDFF)和MRE(弹性成像)。在临床确定NAFLD或非NAFLD中使用来自MRI PDFF的数据。
进行随机森林(RF)分析以确定全生化谱区分NAFLD组和非NAFLD组的能力。RF是一种基于大量决策树的无偏和监督分类技术。使用NAFLD和非NAFLD的分组,基于整个研究群组(n=154)的血清代谢谱的RF分类分析以83.1%的准确度区分这两个组。使用所有已命名的代谢物,83.9%(118名中的99名)非NAFLD受试者和80.6%(36名中的29名)NAFLD受试者被正确分类,总体预测准确度是83.1%。
使用逻辑回归和曲线下面积(AUC)来评估临床参数中的几个用于辨别NAFLD与非NAFLD的性能。结果示于表1中。由于使用MRI PDFF在这一患者群组中诊断NAFLD,因此该参数的AUC是1.000。
表1:所选临床参数的AUC值
临床参数 | AUC |
年龄 | 0.643 |
ALT | 0.734 |
AST | 0.627 |
BMI | 0.822 |
性别 | 0.612 |
葡萄糖 | 0.715 |
胰岛素 | 0.827 |
MRE | 0.821 |
MRI PDFF | 1.000 |
使用逻辑回归模型和曲线下面积(AUC)来评估单个代谢物区分NAFLD组和非NAFLD组的效果如何。使用对于在样品中检测到的所有770种已命名的代谢物所获得的测量值进行逻辑回归分析。用于辨别NAFLD患者样品与非NAFLD患者样品的具有AUC>0.700的代谢物呈现于表2中。
表2:用于辨别NAFLD与非NAFLD的单个代谢物的AUC
进行多重逻辑回归建模来分析生物标志物的各种组合(“生物标志物组”)的性能。使用留一交叉验证方法来确定许多变量(例如代谢物生物标志物)以包括在模型中。在这种方法中,从数据集中去除一个样本,将模型在剩余的数据上拟合,然后使用拟合模型来预测被省去的样本。所述方法提供了对未来性能的估计。在此,使用临床参数MRI质子密度脂肪分数(MRI PDFF)来评估随着更多的变量被添加到模型中相关性的变化。随着化合物数目的增加,相关性的平均R2值增加,直到达到最佳数值为止,这表明变量选择在不同程度上是稳定的。在这一分析中,具有至少2个变量的模型提高了相关性并且在五个变量时,相关性达到峰值。图1示出了相关性分析的结果的图表。标志物的数目绘制于X轴上并且与MRI PDFF的平均相关性绘制于y轴上。基于这一分析,评估了4变量模型和5变量模型的性能。使用4个和5个变量的模型在下文举例说明。从图1中所示的结果显而易见的是,模型可以包括多于5个变量。
在一个实施例中,使用对于用于辨别患有NAFLD的患者与没有NAFLD的个体的13种代谢物生物标志物所获得的测量值进行使用4变量模型和5变量模型的多重逻辑回归建模。这些生物标志物包括甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、4-甲基-2-氧代戊酸盐、3-甲基-2-氧代戊酸盐、缬氨酸、3-甲基-2-氧代丁酸盐、2-羟基丁酸盐、5-甲硫基腺苷、脯氨酰脯氨酸、羊毛甾醇、牛磺-β-鼠胆酸盐、以及脱氧胆酸盐。使用所列的13种代谢物产生了715个4变量模型。这些模型中的204个的AUC>0.800。使用13种所列的代谢物产生了1287个5变量模型。这些模型中的493个的AUC>0.800。表3示出了具有最高AUC的30个4变量模型。表4示出了前30个5变量模型。表5示出了4变量模型和5变量模型中所用的13种代谢物以及具有AUC>0.800的模型中给定代谢物的出现率(以百分比计)。举例来说,5-甲硫基腺苷(MTA)在具有AUC>0.800的所有204个4变量模型中的92.2%中被鉴定并且在具有AUC>0.800的所有493个5变量模型中的93.5%中被鉴定。
表3:前30个4变量模型
表4:前30个5变量模型
表5:具有AUC>0.800的4变量模型和5变量模型中代谢物的出现率。
化合物 | n=4 | n=5 |
5-甲硫基腺苷 | 92.2% | 93.5% |
羊毛甾醇 | 34.0% | 40.0% |
甘氨酸 | 33.0% | 39.6% |
3-甲基-2-氧代丁酸盐 | 29.6% | 35.9% |
脯氨酰脯氨酸 | 29.6% | 37.7% |
3-甲基-2-氧代戊酸盐 | 26.7% | 32.5% |
丝氨酸 | 25.2% | 35.3% |
4-甲基-2-氧代戊酸盐 | 23.3% | 32.3% |
缬氨酸 | 23.3% | 31.4% |
亮氨酸 | 21.8% | 31.4% |
牛磺-β-鼠胆酸盐 | 21.4% | 29.8% |
2-羟基丁酸盐 | 20.4% | 30.4% |
脱氧胆酸盐 | 19.4% | 30.2% |
实施例2:人类血清中NASH的代谢物生物标志物
使用四个全代谢谱分析质谱平台以及GC-FID分析,针对脂肪酸、胆固醇代谢脂质、以及维生素E来分析来自116名患有NASH的受试者、18名患有NAFLD的受试者、以及18名患有临界NASH的受试者的血清样品。所有诊断是由训练有素的病理学家,使用患者活检样品的组织学分析来确定的。在来自这一群组的样品中检测到总共721种已命名的代谢物。提供受试者的临床参数,包括年龄、性别、身高/体重/身体质量指数(BMI)、糖尿病史、葡萄糖、胰岛素、HBA1c、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、甘油三酯、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、脂肪变性、小叶炎症、肝门炎症、气球样变、以及NAFLD活动性分数(NAS)。
使用逻辑回归和曲线下面积(AUC)来评估临床参数中的几个用于辨别NASH与临界NASH和NAFLD的性能。结果示于表6中。
表6:所选临床参数的AUC值
临床参数 | AUC |
NAS | 0.905 |
AST | 0.706 |
胰岛素 | 0.671 |
ALT | 0.620 |
BMI | 0.611 |
HbA1c | 0.593 |
HDL | 0.589 |
GGT | 0.578 |
年龄 | 0.547 |
葡萄糖 | 0.539 |
胆固醇 | 0.529 |
LDL | 0.525 |
甘油三酯 | 0.520 |
使用混合效应模型分析所有721种已命名的代谢物。在NASH样品与NAFLD样品的比较中显著改变(p<0.05,q<0.1)的代谢物呈现于表7中。表7中所呈现的其它比较是基线(BL)NASH对比NAFLD,以及NASH对比BL NASH。对于每一种代谢物,表7包括代谢物的生化名称;可信标准品的内部化学文库中生物标志物化合物的内部标识号(CompID);每一次比较时生物标志物的倍数变化(FC),它是一种样品类型中生物标志物的平均水平相比于不同样品类型中的平均水平的比率(例如NASH相比于NAFLD);以及在关于生物标志物的数据的统计分析中确定的p值。
表7:NASH、BL NASH、以及NAFLD样品的比较中的代谢物生物标志物。
使用逻辑回归模型和曲线下面积(AUC)来评估单个代谢物辨别NASH组与临界NASH组和NAFLD组的效果如何。对所有721种已命名的代谢物进行逻辑回归分析。用于辨别NASH患者样品与临界NASH和NAFLD患者样品的具有AUC>0.620的代谢物呈现于表8中。与NAFLD患者样品相比,以粗体显示的代谢物在NASH患者样品中具有显著性(p<0.05,q<0.1)。
表8:用于辨别NASH与临界NASH和NAFLD的单个代谢物的AUC
实施例3:人类血清中纤维化的代谢物生物标志物
在所述分析中使用来自患有肝活检诊断的NASH或NAFLD的152名受试者的血清样品。所有诊断是由训练有素的病理学家,使用患者活检样品的组织学分析来确定的。根据疾病严重程度基于纤维化分期(0期:最不严重;1期-2期:中度严重程度;3期-4期:高严重程度)将患者样品分为三组。使用四个全代谢谱分析质谱平台以及GC-FID分析,针对脂肪酸、胆固醇代谢脂质、以及维生素E来分析所有样品。在样品群组中检测到总共721种已命名的代谢物。提供受试者的临床参数,包括年龄、性别、身高/体重/身体质量指数(BMI)、糖尿病史、葡萄糖、胰岛素、HBA1c、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、甘油三酯、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、脂肪变性、小叶炎症、肝门炎症、气球样变、以及NAFLD活动性分数(NAS)。
使用逻辑回归和曲线下面积(AUC)来评估临床参数中的几个用于辨别3期-4期(高严重程度)纤维化与1期-2期(中度严重程度)纤维化和0期(低严重程度)纤维化的性能。结果示于表9中。
表9:所选临床参数的AUC值
临床参数 | AUC | 临床参数 | AUC |
GGT | 0.712 | 甘油三酯 | 0.571 |
AST | 0.71 | 胰岛素 | 0.57 |
HbA1c | 0.663 | LDL | 0.57 |
年龄 | 0.66 | ALT | 0.537 |
BMI | 0.658 | 葡萄糖 | 0.534 |
NAS | 0.59 | HDL | 0.507 |
胆固醇 | 0.578 |
使用混合效应模型分析在样品中所检测到的721种已命名代谢物的测量水平。在3期+4期(高严重程度)纤维化样品与0期(低严重程度)纤维化样品的比较中显著改变(p<0.05,q<0.1)的代谢物呈现于表10中。表10中所呈现的其它比较是3期+4期(高严重程度)对比1期+2期(中度严重程度)以及1期+2期对比0期。对于每一种代谢物,表10包括代谢物的生化名称;可信标准品的内部化学文库中生物标志物化合物的内部标识号(CompID);每一次比较时生物标志物的倍数变化(FC),它是一种样品类型中该生物标志物的平均水平相比于不同样品类型中的平均水平的比率;以及在关于生物标志物的数据的统计分析中确定的p值。
表10:纤维化和纤维化分期的生物标志物。
使用逻辑回归模型和曲线下面积(AUC)来评估单个代谢物辨别3期-4期纤维化组与1期-2期和0期纤维化组的效果如何。对针对在样品中所检测到的所有721种已命名代谢物所获得的测量值进行逻辑回归分析。用于辨别3期-4期纤维化患者样品与1期-2期和0期纤维化患者样品的具有AUC>0.620的代谢物呈现于表11中。
表11:用于辨别纤维化的严重程度的单个代谢物的AUC
实施例4:人类血清中纤维化的代谢物生物标志物
在另一个实施例中,分析来自跨越非酒精性脂肪肝病谱的200名受试者的血清样品。根据疾病严重程度基于纤维化分期(0期:没有纤维化(N=12);1期:轻度严重程度(N=38);2期:中度严重程度(N=100);3期:高严重程度(N=42);4期:肝硬化(N=8))将患者样品分为五组。使用四个全代谢谱分析质谱平台以及GC-FID分析,针对脂肪酸、胆固醇代谢脂质、以及维生素E来分析所有样品。在样品群组中检测到总共790种已命名的代谢物和361种未命名的代谢物。提供受试者的临床参数,包括年龄、性别、种族、民族、身高/体重/身体质量指数(BMI)、吸烟史、糖尿病史、脂肪变性、纤维化、小叶炎症、肝门炎症、肝细胞气球样变、NAFLD活动性分数(NAS)、空腹血糖、空腹胰岛素、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、甘油三酯、HBA1c、以及血红蛋白(HGB)。
使用t检验、AUC计算、逻辑回归以及随机森林分析来评估在样品中所检测到的单独或组合使用的代谢物将这些受试者的纤维化分期的统计显著性和预测性能。为了比较,还单独地和组合地评价了年龄、2型糖尿病、BMI、HDL胆固醇、性别、果糖、以及既往饮酒史的性能,这些参数是通常测量的临床参数。这些分析的结果呈现于这个实施例中。这些结果显示许多代谢物单独具有比单独使用临床参数所获得的AUC更高的AUC,并且在一些情况下,优于临床参数的组合。此外,我们的分析鉴定了具有比临床参数的组合中的任一种更好的预测性能的代谢物组合。
使用韦尔奇氏双样本t检验来分析在样品中所检测到的1151种代谢物的测量水平以将在从患有更严重的纤维化的受试者采集的样品中所测量的水平与在从患有不太严重的纤维化或没有纤维化的受试者采集的样品中所测量的水平相比较。在所述研究中所检测到的代谢物呈现于表12中。表12中所呈现的比较是2期-4期对比0期-1期、3期-4期对比1期-2期、3期-4期对比0期-1期、4期对比0期、3期-4期对比0期、以及1期-2期对比0期、3期-4期对比1期-2期、3期-4期对比2期、以及2期对比0期-1期。对于每一种代谢物,表12包括代谢物的生化名称;可信标准品的内部化学文库中生物标志物化合物的内部标识号(CompID);每一次比较时生物标志物的倍数变化(FC),它是一种样品类型中该生物标志物的平均水平相比于不同样品类型中的平均水平的比率;以及在关于生物标志物的数据的统计分析中确定的p值。以粗体字显示的倍数变化值指示给定比较的p值小于0.05。
辨别0期-1期纤维化与2期-4期纤维化
为了评估几个通常测量的临床参数(年龄、2型糖尿病、BMI、HDL胆固醇、性别、果糖、以及既往饮酒史)用于辨别0期-1期纤维化样品与2期-4期样品的性能,进行逻辑回归和曲线下面积(AUC)分析。对于单个临床参数所计算的AUC从BMI的0.5079到2型糖尿病的0.6096不等。数据示于表13中。这七个临床参数的总共127种组合是可能的,并且评价了使用这些临床参数的所有127种可能的组合模型。所获得的最高AUC是0.6663,并且它源自于拟合所有七个临床参数的模型。
表13:用于辨别0期-1期纤维化患者样品与2期-4期纤维化患者样品的所选临床参数的AUC值
临床参数 | AUC |
年龄 | 0.5598 |
2型糖尿病 | 0.6096 |
BMI | 0.5079 |
HDL胆固醇 | 0.5984 |
性别 | 0.5454 |
果糖 | 0.5464 |
既往饮酒史 | 0.5221 |
还使用逻辑回归模型和曲线下面积(AUC)来评估单个代谢物用于辨别0期-1期纤维化样品与2期-4期纤维化样品的性能。对针对在样品中所检测到的所有1151种代谢物所获得的测量值进行逻辑回归分析。用于辨别0期-1期纤维化患者样品与2期-4期纤维化患者样品的具有AUC>0.600的代谢物被鉴定并且呈现于表14中。在这些当中,114种代谢物具有大于对于2型糖尿病(最高临床参数)所获得的0.6096的AUC的单个AUC。此外,八种代谢物,即X-14662、核糖、I-***原、X-12850、苹果酸盐、戊二酸盐(戊烷二酸盐)、2-氨基庚酸盐、以及X-15497具有大于0.6663的AUC,0.6663是由使用年龄、2型糖尿病、BMI、HDL胆固醇、性别、果糖以及既往饮酒史的所有7个临床参数的最佳模型所计算的AUC。代谢物和数据列于表14中。
使用X-14662、核糖、I-***原、X-12850、苹果酸盐、戊二酸盐(戊烷二酸盐)、2-氨基庚酸盐、以及X-15497(具有AUC>0.6663的八种代谢物)的总共255种组合是可能的并且评价了用于将0期-1期纤维化与2期-4期纤维化相区分的所有255种可能的组合模型。对于由拟合这八种代谢物的所有可能的模型组合所产生的每一个模型所计算的AUC在0.6523至0.7774的范围并且数据示于图2中。所有可能的模型组合的平均AUC是0.75,这高于使用仅由临床参数组成的任何模型所获得的最高AUC。
表14:用于辨别0期-1期纤维化患者样品与2期-4期纤维化患者样品的单个代谢物的AUC
还使用所述代谢物生物标志物来推导出可用于使用随机森林分析根据0期-1期纤维化或2期-4期纤维化将受试者分类的统计模型。随机森林结果显示以74%的准确度将样品分类。阳性预测值是84%,所述阳性预测值是在所有被分类为阳性的受试者当中真正阳性的受试者(即患有2期-4期纤维化的受试者)的比例。该随机森林的“袋外”(Out-of-Bag,OOB)误差率是26%,该误差率给出了可以使用随机森林模型预测新的观测(例如样品是来自患有0期-1期纤维化还是2期-4期纤维化的受试者)的准确程度的估计值。所述模型估计,当用于新的一组受试者时,0期-1期纤维化受试者的身份在54%的时间可以被正确预测,并且2期-4期纤维化受试者的身份在81%的时间可以被预测。
基于随机森林变量选择程序,鉴定出被认为对于构建用于预测0期-1期或2期-4期纤维化的模型或算法来说确实有意义的代谢物并且将它们按照重要性排序。根据该分析对于辨别各组最重要的代谢物是核糖、X-14662、异亮氨酸、I-***原、戊二酸盐(戊烷二酸盐)、X-12263、X-19561、2-氨基庚酸盐、X-18922、γ-谷氨酰异亮氨酸、X-12850、1-花生四烯酰甘油、X-17145、马来酸盐(顺丁烯二酸盐)、苹果酸盐、X-21892、N-甲基脯氨酸、X-12739、X-21474、苏糖酸盐、X-11871、谷氨酸盐、X-15497、1-硬脂酰甘油磷酸肌醇、X-21659、3-羟基辛酸盐、3-甲基戊烯二酸盐、X-14302、X-12812、以及反丁烯二酸盐。由随机森林分析所鉴定的除四种(X-21659、X-21474、3-甲基戊烯二酸盐、以及X-12812)以外所有的代谢物具有大于0.6096(临床参数2型糖尿病的AUC)的单个AUC值。
辨别0期-2期纤维化与3期-4期纤维化
通过确定曲线下面积(AUC)和逻辑回归来评估临床参数用于辨别0期-2期纤维化与3期-4期纤维化的性能。单个临床参数的AUC在0.5056(性别)到0.6183(2型糖尿病)的范围并且数据示于表15中。这七个临床参数的总共127种组合是可能的,并且评价了使用这些临床参数推导出的所有127个可能的组合模型。最高的AUC源自于拟合所有七个临床参数的模型,并且所述AUC是0.6686。
表15:用于辨别0期-2期纤维化患者样品与3期-4期纤维化患者样品的所选临床参数的AUC值
临床参数 | AUC |
年龄 | 0.5647 |
2型糖尿病 | 0.6183 |
BMI | 0.5043 |
HDL胆固醇 | 0.6079 |
性别 | 0.5056 |
果糖 | 0.6009 |
既往饮酒史 | 0.5571 |
还使用逻辑回归模型和曲线下面积(AUC)来评估单个代谢物辨别0期-2期纤维化样品与3期-4期纤维化样品的效果如何。对针对在样品中所检测到的所有1151种代谢物所获得的测量值进行逻辑回归分析。61种代谢物具有大于对于最高临床参数2型糖尿病所获得的0.6183的AUC的单个AUC。三种代谢物(γ-生育酚、牛磺胆酸盐、以及木糖醇)具有大于0.6686的单个AUC,0.6686是由使用所评价的所有七个临床参数所获得的模型计算的最高AUC。数据示于表16中。产生了使用这三种代谢物(γ-生育酚、牛磺胆酸盐以及木糖醇)将0期-2期纤维化与3期-4期纤维化相区分的所有可能的组合模型。在使用含有所有三种代谢物的模型时所计算的最高AUC是0.7131,这是相对于在仅使用临床参数的情况下的AUC 00.6183的改进。
表16:用于辨别0期-2期纤维化患者样品与3期-4期纤维化患者样品的单个代谢物的AUC
还使用所述代谢物生物标志物来推导出使用随机森林分析根据0期-2期纤维化或3期-4期纤维化将受试者分类的统计模型。随机森林结果显示以70%的准确度将样品分类。阴性预测值是79%,所述阴性预测值是在所有被分类为阴性的受试者当中真正阴性的受试者(即患有0期-2期纤维化的受试者)的数目。“袋外”(OOB)误差率是30%,该误差率给出了可以使用随机森林模型预测新的观测(例如样品是来自患有0期-2期纤维化还是3期-4期纤维化的受试者)的准确程度的估计值。所述模型估计,当用于新的一组受试者时,0期-2期纤维化受试者的身份在81%的时间可以被正确预测,并且3期-4期纤维化受试者的身份在36%的时间可以被预测。
基于随机森林变量选择程序,鉴定出被认为对于构建用于预测0期-2期或3期-4期纤维化的模型或算法来说确实有意义的生物标志物化合物并且将它们按照重要性排序。根据该分析对于辨别各组最重要的生物标志物是1,5-无水葡萄糖醇(1,5-AG)、甘氨胆酸盐、I-***原、cys-gly(氧化)、牛磺鹅脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、16-羟基棕榈酸盐、木糖醇、X-12812、γ-生育酚、X-12850、果糖、X-14662、葡萄糖、X-17453、岩藻糖、甘露糖、甘氨鹅脱氧胆酸盐、X-11871、棕榈酰基-棕榈酰基-甘油磷酸胆碱、X-14658、咪唑-丙酸盐、X-12093、X-14302、2-羟基戊二酸盐、X-12263、半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物、丙醇二酸盐(羟基丙二酸盐)、天冬氨酰亮氨酸、以及戊二酸盐(戊烷二酸盐)。由随机森林分析所鉴定的除四种(果糖、X-12093、2-羟基戊二酸盐、X-12263)以外所有的代谢物具有大于0.6183(临床参数2型糖尿病的AUC)的单个AUC值。
辨别0期-1期纤维化与3期-4期纤维化
为了评估临床参数(年龄、2型糖尿病、BMI、HDL胆固醇、性别、果糖、以及既往饮酒史)用于辨别0期-1期纤维化与3期-4期纤维化的性能,进行逻辑回归和曲线下面积(AUC)。单个临床参数的AUC在0.4939(BMI)到0.6698(2型糖尿病)的范围并且数据呈现于表17中。这七个临床参数的总共127种组合是可能的,并且评价了使用这些临床参数的所有127种可能的组合模型。最高AUC是0.7217,并且它源自于拟合所有七个临床参数的模型。
表17:用于辨别0期-1期纤维化患者样品与3期-4期纤维化患者样品的所选临床参数的AUC值
临床参数 | AUC |
年龄 | 0.6048 |
2型糖尿病 | 0.6698 |
BMI | 0.4939 |
HDL胆固醇 | 0.6474 |
性别 | 0.5302 |
果糖 | 0.537 |
既往饮酒史 | 0.5254 |
还使用逻辑回归模型和曲线下面积(AUC)来评估单个代谢物用于辨别0期-1期纤维化样品与3期-4期纤维化样品的性能。对针对在样品中所检测到的所有1151种代谢物所获得的测量值进行逻辑回归分析。所述分析鉴定出具有大于0.6689(它是最高临床参数2型糖尿病的AUC)的单个AUC的53种代谢物。七种代谢物(X-14662、I-***原、X-12850、戊二酸盐(戊烷二酸盐)、木糖醇、X-11871、X-11537)具有大于0.7217的AUC,0.7217是由使用年龄、2型糖尿病、BMI、HDL胆固醇、性别、果糖以及既往饮酒史的所有7个临床参数的模型所计算的AUC。数据示于表18中。产生了使用X-14662、I-***原、X-12850、戊二酸盐(戊烷二酸盐)、木糖醇、X-11871、X-11537(具有AUC>0.7217的七种代谢物)将0期-1期纤维化与3期-4期纤维化相区分的所有127种可能的组合模型。计算每一种模型的AUC,并且由拟合七种代谢物的所有可能的模型组合所获得的AUC在0.7296到0.8788的范围,并且所述模型中的89种具有大于0.8的AUC。数据示于图3中。
表18:用于辨别0期-1期纤维化患者样品与3期-4期纤维化患者样品的单个代谢物的AUC
实施例5:人类血清中NASH的脂质代谢物生物标志物
在另一个实施例中,分析了来自跨越从NAFLD到NASH的非酒精性脂肪肝病谱的200名受试者的血清样品,包括181名被分类为患有NASH的受试者和19名被分类为没有NASH的受试者(即非NASH受试者被分类为NAFLD或临界NASH)。使用TRUEMASS复合脂质组分析在样品中确定代谢物的水平(以μM测量)。
使用逻辑回归以及卡方分析和AUC计算来评估在样品中所检测到的单个代谢物确定这些受试者中存在或不存在NASH的统计显著性和预测性能。使用韦尔奇氏双样本t检验来比较从患有NASH的受试者采集的样品中的代谢物水平与在从没有NASH的受试者采集的样品中所测量的水平。逻辑回归模型和AUC评估了单个代谢物区分NASH组和非NASH组的效果如何。使用对于在所述样品中所检测到的所有脂质代谢物所获得的测量值进行统计分析。可用于辨别NASH患者样品与非NASH患者样品的代谢物呈现于表19中。所有代谢物的卡方p值<0.1并且AUC>0.5。对于每一种代谢物,表19包括代谢物的脂质类别;代谢物名称;在NASH样品相较于非NASH样品的逻辑回归和卡方分析中所确定的p值;AUC;以及与非NASH样品相比,NASH样品中代谢物水平的变化方向(DOC)。
表19:用于辨别NASH患者样品与非NASH患者样品的生物标志物
实施例6:人类血清中纤维化的脂质代谢物生物标志物
在另一个实施例中,分析了来自跨越从NAFLD到纤维化的非酒精性脂肪肝病谱的200名受试者的血清样品,包括150名被分类为患有纤维化的受试者和50名被分类为没有纤维化的受试者(即非纤维化受试者被分类为患有NAFLD、临界NASH、或NASH)。使用TRUEMASS复合脂质组分析在样品中确定代谢物的水平(以μM测量)。
使用逻辑回归以及卡方分析和AUC计算来评估在样品中所检测到的单个代谢物确定这些受试者中存在或不存在纤维化的统计显著性和预测性能。使用韦尔奇氏双样本t检验来比较从患有纤维化的受试者采集的样品中的代谢物水平与在从没有纤维化的受试者采集的样品中所测量的水平。使用逻辑回归模型和AUC来评估单个代谢物区分纤维化组和非纤维化组的效果如何。使用对于在所述样品中所检测到的所有脂质代谢物所获得的测量值进行逻辑回归和卡方分析。可用于辨别纤维化患者样品与非纤维化患者样品的代谢物呈现于表20中。所有代谢物的卡方p值<0.1并且AUC>0.5。对于每一种代谢物,表20包括代谢物的脂质类别;代谢物名称;在纤维化样品相较于非纤维化样品的逻辑回归和卡方分析中所确定的p值;AUC;以及与非纤维化样品相比,纤维化样品中代谢物水平的变化方向(DOC)。
表20:用于辨别纤维化患者样品与非纤维化患者样品的生物标志物
Claims (37)
1.一种诊断或帮助诊断受试者是否患有肝脏疾病的方法,所述方法包括:
分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表12、表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表14、表16、和/或表18,以及
将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病阳性和/或肝脏疾病阴性参考水平相比较以诊断所述受试者是否患有肝脏疾病。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述肝脏疾病是NAFLD。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述肝脏疾病是NAFLD并且所述一种或多种生物标志物选自由以下各项组成的组:5-甲硫基腺苷(5-MTA)、甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、4-甲基-2-氧代戊酸盐、3-甲基-2-氧代戊酸盐、缬氨酸、3-甲基-2-氧代丁酸盐、2-羟基丁酸盐、脯氨酰脯氨酸、羊毛甾醇、牛磺-β-鼠胆酸盐、以及脱氧胆酸盐。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述肝脏疾病是NASH并且所述一种或多种生物标志物选自表7、表8、表10、和/或表11。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述肝脏疾病是纤维化并且所述一种或多种生物标志物选自表12、表10、表11、表14、表16、和/或表18。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述诊断包括辨别NASH与NAFLD。
7.如权利要求1所述的方法,其中使用选自由以下各项组成的组的一种或多种技术分析所述样品:质谱、ELISA、以及抗体连接。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述方法包括使用包含选自表12、表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表14、表16、和/或表18的一种或多种生物标志物或测量结果的数学模型来分析所述受试者以及来自所述受试者的生物样品。
9.一种确定患有肝纤维化的受试者的纤维化分期的方法,所述方法包括:
分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表12、表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表14、表16、和/或表18,以及
将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的高分期肝纤维化和/或低分期肝纤维化参考水平相比较以确定所述肝纤维化的分期。
10.如权利要求9所述的方法,其中使用数学模型来确定患有肝纤维化的受试者的肝纤维化分期。
11.一种监测受试者的肝脏疾病的进展/消退的方法,所述方法包括:
分析来自受试者的第一生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表12、表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表14、表16、和/或表18,并且所述第一样品是在第一时间点从所述受试者获得的;
分析来自受试者的第二生物样品以确定所述一种或多种生物标志物的水平,其中所述第二样品是在第二时间点从所述受试者获得的;以及
将所述第一样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述第二样品中所述一种或多种生物标志物的水平相比较以监测所述受试者的肝脏疾病的进展/消退。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述方法还包括将所述第一样品中所述一种或多种生物标志物的水平、所述第二样品中所述一种或多种生物标志物的水平、和/或所述第一样品和所述第二样品中所述一种或多种生物标志物的水平的比较结果与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病阳性和/或肝脏疾病阴性参考水平相比较。
13.如权利要求11所述的方法,其中所述方法包括使用包含选自表12、表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表14、表16、和/或表18的一种或多种生物标志物或测量结果的数学模型来分析所述受试者以及来自所述受试者的生物样品。
14.一种在患有肝脏疾病的受试者中辨别不太严重的肝脏疾病与更严重的肝脏疾病的方法,所述方法包括:
分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表12、表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、表11、表14、表16、和/或表18,以及
将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的不太严重的肝脏疾病和/或更严重的肝脏疾病参考水平相比较以确定所述受试者的肝脏疾病的严重程度。
15.如权利要求14所述的方法,其中使用数学模型在患有肝脏疾病的受试者中辨别不太严重的肝脏疾病与更严重的肝脏疾病。
16.一种帮助在已经被诊断为患有肝脏疾病的受试者中辨别NASH与NAFLD的方法,所述方法包括:
分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表2、表3、表4、表5、表7、表8、表10、和/或表11,以及
将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病参考水平相比较以在所述受试者中辨别NASH与NAFLD。
17.如权利要求16所述的方法,其中使用数学模型来帮助在已经被诊断为患有肝脏疾病的受试者中辨别NASH与NAFLD。
18.如权利要求1、9、11、14、以及16所述的方法,其中确定肝脏疾病分数有助于其所述方法。
19.一种诊断或帮助诊断受试者是否患有肝脏疾病的方法,所述方法包括:
分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表19和表20,以及
将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病阳性和/或肝脏疾病阴性参考水平相比较以诊断所述受试者是否患有肝脏疾病。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述肝脏疾病是NASH并且所述一种或多种生物标志物选自表19。
21.如权利要求19所述的方法,其中所述肝脏疾病是纤维化并且所述一种或多种生物标志物选自表20。
22.如权利要求19所述的方法,其中所述诊断包括辨别NASH与NAFLD。
23.如权利要求19所述的方法,其中所述诊断包括辨别NASH与纤维化。
24.如权利要求19所述的方法,其中使用选自由以下各项组成的组的一种或多种技术分析所述样品:质谱、ELISA、以及抗体连接。
25.如权利要求19所述的方法,其中所述方法包括使用包含选自表19和/或表20的一种或多种生物标志物或测量结果的数学模型来分析所述受试者以及来自所述受试者的生物样品。
26.一种确定患有肝纤维化的受试者的纤维化分期的方法,所述方法包括:
分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表20,以及
将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的高分期肝纤维化和/或低分期肝纤维化参考水平相比较以确定所述肝纤维化的分期。
27.如权利要求26所述的方法,其中使用数学模型来确定患有肝纤维化的受试者的肝纤维化分期。
28.一种监测受试者的肝脏疾病的进展/消退的方法,所述方法包括:
分析来自受试者的第一生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表19和/或表20,并且所述第一样品是在第一时间点从所述受试者获得的;
分析来自受试者的第二生物样品以确定所述一种或多种生物标志物的水平,其中所述第二样品是在第二时间点从所述受试者获得的;以及
将所述第一样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述第二样品中所述一种或多种生物标志物的水平相比较以监测所述受试者的肝脏疾病的进展/消退。
29.如权利要求28所述的方法,其中所述方法还包括将所述第一样品中所述一种或多种生物标志物的水平、所述第二样品中所述一种或多种生物标志物的水平、和/或所述第一样品和所述第二样品中所述一种或多种生物标志物的水平的比较结果与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病阳性和/或肝脏疾病阴性参考水平相比较。
30.如权利要求28所述的方法,其中所述方法包括使用包含选自表19和/或表20的一种或多种生物标志物或测量结果的数学模型来分析所述受试者以及来自所述受试者的生物样品。
31.一种在患有肝脏疾病的受试者中辨别不太严重的肝脏疾病与更严重的肝脏疾病的方法,所述方法包括:
分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表19和/或表20,以及
将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的不太严重的肝脏疾病和/或更严重的肝脏疾病参考水平相比较以确定所述受试者的肝脏疾病的严重程度。
32.如权利要求31所述的方法,其中使用数学模型在患有肝脏疾病的受试者中辨别不太严重的肝脏疾病与更严重的肝脏疾病。
33.一种帮助在已经被诊断为患有肝脏疾病的受试者中辨别NASH与NAFLD的方法,所述方法包括:
分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表19,以及
将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病参考水平相比较以在所述受试者中辨别NASH与NAFLD。
34.如权利要求33所述的方法,其中使用数学模型来帮助在已经被诊断为患有肝脏疾病的受试者中辨别NASH与NAFLD。
35.一种帮助在已经被诊断为患有肝脏疾病的受试者中辨别NASH与纤维化的方法,所述方法包括:
分析来自受试者的生物样品以确定所述样品中针对肝脏疾病的一种或多种生物标志物的水平,其中所述一种或多种生物标志物选自表19和/或表20,以及
将所述样品中所述一种或多种生物标志物的水平与所述一种或多种生物标志物的肝脏疾病参考水平相比较以在所述受试者中辨别NASH与纤维化。
36.如权利要求35所述的方法,其中使用数学模型来帮助在已经被诊断为患有肝脏疾病的受试者中辨别NASH与纤维化。
37.如权利要求19、26、28、31、33、以及35所述的方法,其中确定肝脏疾病分数有助于其所述方法。
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