ES2837575T3

ES2837575T3 - Composiciones y procedimientos para la producción y administración de ARN

Info

Publication number: ES2837575T3
Application number: ES18176147T
Authority: ES
Inventors: James A Baum; Allen T Christian; Artem Evdokimov; Farhad Moshiri; Lisa Marie Weaver; Haitao Zhang
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2021-06-30
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: MX358744B; JP6935450B2; US10070652B2; EP3434777A1; AU2014233711B2; US20190380348A1; MX2015013118A; CN105164265A; KR20210116681A; US20170035056A1; US10334858B2; CA2905961C; CN110229815B; JP2019150036A; US10757947B2; JP2016517274A; US20190000089A1; KR102530901B1; KR20150131310A; US11647753B2

Abstract

Una secuencia de terminador de la transcripción que comprende una secuencia de ácido nucleico según lo representado en la SEQ ID NO: 13.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para la producción y administración de ARN

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense n.° 61/793.506 presentada el 15 de marzo de 2013.

Incorporación del listado de secuencias

La presente solicitud contiene un listado de secuencias, presentado con esta en forma electrónica a través del sistema EFS-Web, que contiene el archivo titulado “P34118WO00_59609_2014_03_10_v2ST25.txt”, cuyo tamaño es de 11.512 bytes (medido en Windows XP), creado el 10 de marzo de 2014.

Antecedentes

Campo

Se proporcionan construcciones de vectores útiles para la expresión de ARN in vitro e in vivo. También se proporcionan sistemas de expresión celular para producir ARN y proteínas in vivo. También se proporcionan procedimientos y composiciones para proporcionar ARNbc transcrito in vivo a organismos diana.

Descripción de la técnica relacionada

Las cosechas comerciales son a menudo los objetivos de ataque de virus o plagas como insectos o nematodos. La infestación por plagas y la infestación vírica pueden tener un efecto negativo importante en el rendimiento de los cultivos. Los pesticidas químicos han sido muy eficaces erradicando infestaciones por plagas; no obstante, hay desventajas en el uso de pesticidas químicos. Los agentes pesticidas químicos no son selectivos y pueden tener efecto en insectos beneficiosos y otros organismos, así como la plaga a la que se dirigen. Los agentes pesticidas químicos persisten en el ambiente y, de ser metabolizados, generalmente lo hacen lentamente. Se acumulan en la cadena alimenticia y, particularmente, en las especies depredadoras superiores, donde pueden tener efectos negativos. Las acumulaciones de agentes pesticidas químicos también dan como resultado el desarrollo de resistencia a los agentes. Por lo tanto, se necesitan procedimientos alternativos para controlar o erradicar la infestación por insectos en plantas; dichos procedimientos deben ser selectivos, ambientalmente inertes, no persistentes, biodegradables y ajustarse bien a los esquemas de control de la resistencia a plagas.

Se ha mostrado que las moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) median en la inhibición de genes diana específicos en diversos organismos a través de un mecanismo conocido como interferencia de ARN (iARN). El iARN utiliza vías celulares endógenas mediante las cuales un ARN de doble cadena que comprende secuencias de nucleótidos complementarias que corresponden sustancialmente a la secuencia diana con sentido y antisentido media en la degradación del ARNm de interés o disminuye la traducción de proteína del molde de ARNm. Las proteínas efectoras de la vía de iARN incluyen el complejo de proteína Dicer que genera ARN interferentes pequeños (ARNip) a partir del ARNbc original y el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que utiliza guías de ARNip para reconocer y degradar o bloquear la traducción a partir de los ARNm correspondientes. Solo se ven afectadas las transcripciones complementarias a los ARNip y, por lo tanto, la inactivación de la expresión de ARNm normalmente es específica para la secuencia. El efecto de silenciamiento génico de iARN puede persistir durante días y, en condiciones experimentales, puede llevar en algunos casos a una disminución de 90 % o más en la abundancia de la transcripción a la que se dirige, con una disminución consiguiente en los niveles de la proteína correspondiente. Los niveles de proteína también se pueden alterar bloqueando la traducción sin afectar de forma significativa a los niveles de transcripción de ARNm.

El documento EP 2530 159 proporciona nuevas secuencias señal de terminación de la transcripción, especialmente un polinucleótido que comprende al menos dos señales de transcripción consecutivas, caracterizadas por que dichas señales de terminación de la transcripción comprenden al menos una primera y una segunda señal de terminación de la transcripción que están, como máximo, a 1000 nucleótidos de distancia, y al menos una de las señales de terminación tiene o codifica una estructura en horquilla.

Wilson et al. (1995) en Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 92, n.° 19, páginas 8793-8797, describe terminación de la transcripción en terminadores intrínsecos y la función de la horquilla de ARN.

Lesnik (2001) en Nucleic Acids Research, Vol 29, n.° 17, páginas 3583-3594 describe la predicción de terminadores de la transcripción independiente de rho en Escheria coli.

Unniraman (2001) en Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, n.° 45, páginas 41850-41855 describe un paradigma alternativo para terminación de la transcripción intrínseca en eubacterias.

Quiagen (2003) obtenido de internet en http://www.quiagen.com/literature/handbooks/literature.aspx?id=1000182 proporciona técnicas para expresión a alto nivel y purificación de proteínas marcadas con 6xHis y describe un vector disponible en el mercado que comprende dos terminadores de la transcripción terminales fuertes t0 y T1.

Mientras que las moléculas de ARNbc son prometedoras como una alternativa selectiva y ambientalmente inerte a los agentes pesticidas químicos para controlar o erradicar la infestación de plantas por plagas, las limitaciones en la cantidad de ARNbc que se puede producir mediante procedimientos de expresión in vitro e in vivo tradicionales y los costes asociados con la producción y purificación de ARNbc presentan una barrera a su uso para controlar la enfermedad y la infestación por plagas en plantas de cultivo. Por lo tanto, se necesitan medios eficaces y rentables para producir cantidades de ARNbc a escala comercial.

Sumario

Diversas realizaciones descritas en la presente se relacionan con construcciones de vectores útiles para expresión in vitro e in vivo de ARN que comprende una secuencia terminadora de la transcripción representada en la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, el ARN es ARN bicatenario (ARNbc). En algunas realizaciones, el ARN codifica una proteína. En algunas realizaciones, el ARN es un ARN regulador. También se describen sistemas de expresión celular para producción eficaz y rentable de ARN en células vivas que comprenden dicha construcción de vector. También se describen sistemas de expresión celular para producción eficaz y rentable de proteínas en células vivas que comprenden dicha construcción de vector. También se describen sistemas de expresión celular para la producción eficaz y rentable de ARNbc en células vivas y procedimientos y composiciones para proporcionar el ARNbc expresado a organismos diana que comprenden dicha construcción de vector. Las composiciones y los procedimientos descritos se pueden usar para producir moléculas de ARN para formulaciones comerciales, para amplificar secuencias de ARN para análisis, clasificación y otros usos.

Diversas realizaciones se relacionan con composiciones y procedimientos para producir de forma eficaz cantidades comerciales de moléculas de ARN mediante cultivo celular, en los que las células comprenden una construcción de vector que comprende una secuencia terminadora de la transcripción de la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, el ARN es a Rn bicatenario (ARNbc). En algunas realizaciones, el ARN codifica una proteína. En algunas realizaciones, el ARN es un ARN regulador. Algunas realizaciones se relacionan con una construcción de expresión con modificación genética que comprende un promotor; una región que codifica ARN situada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor y un terminador de transcripción que comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 13 en la que la región codificante de ARN y el terminador de la transcripción están unidos operativamente al promotor.

Diversas realizaciones se relacionan con composiciones y procedimientos para producir de forma eficaz cantidades comerciales de proteínas mediante cultivo celular en el que las células comprenden una construcción de vector que comprende una secuencia terminadora de la transcripción de la SEQ ID NO: 13. Algunas realizaciones se relacionan con una construcción de expresión con modificación genética que comprende un promotor; una región que codifica proteínas situada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor; y un terminador de transcripción que comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 13.

Las presentes realizaciones se refieren adicionalmente a composiciones y procedimientos para producir cantidades comerciales de moléculas de ARNbc de forma eficaz mediante cultivo celular y administrar las moléculas de ARNbc expresadas a los organismos diana usando una construcción de vector que comprende una secuencia terminadora de la transcripción de la SEQ ID NO: 13. Algunas realizaciones se relacionan con una construcción de expresión de ARNbc con modificación genética que comprende un promotor; una región que codifica ARNbc ubicada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor, en la que la región que codifica el ARNbc comprende una primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido, que corresponde sustancialmente a una secuencia diana, una segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido, que es sustancialmente complementaria a la secuencia diana y una tercera secuencia de nucleótidos, que está flanqueada por la primera y la segunda secuencia de nucleótidos y que codifica uno o más nucleótidos de una región de bucle de una transcripción de ARN; una primera secuencia de terminación de transcripción que comprende la SEQ ID NO: 13, ubicada 3' respecto de la región que codifica el ARNbc; en la que la región que codifica el ARNbc y el terminador de transcripción están unidos de forma operativa al promotor. En algunas realizaciones, la primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido se encuentra 5' con respecto a la segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido. En algunas realizaciones, la primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido se encuentra 3' con respecto a la segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido. En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARNbc con modificación genética comprende adicionalmente uno o más sitios de restricción de nucleasa de dedos de zinc (ZFN), nucleasa efectora de TAL (TALEN) o meganucleasa ubicados 3' respecto de la segunda secuencia de terminación de transcripción. En algunas realizaciones, el sitio de restricción de meganucleasa se selecciona de un grupo que consiste en: I-Anil, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanM1, I-SceII, I PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeM 1, I-MsoI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII. En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARNbc con modificación genética comprende dos o más secuencias de terminación de transcripción independientes de Rho que son terminador de PTH y terminador de pET-T7, de forma que las secuencias promotoras y de terminación de transcripción forman una combinación funcional. En algunas realizaciones, la construcción de expresión con modificación genética comprende una región codificante de ARNbc que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones la construcción de expresión con modificación genética comprende un promotor de bacteriófago.

En algunas realizaciones, el vector es un vector plásmido.

Diversas realizaciones se relacionan con una construcción de expresión con modificación genética que comprende: un promotor, una primera secuencia de ácido nucleico ubicada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor, en la que la primera secuencia de ácido nucleico codifica un ARNbc, un ARN regulador o una proteína; y una segunda secuencia de ácido nucleico, ubicada 3' con respecto a la primera secuencia de ácido nucleico, en la que la segunda secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 13; en la que la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están unidas de forma operativa al promotor.

En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de bacteriófagos. En algunas realizaciones, el promotor se selecciona del grupo que consiste en T7, T3, SV40, SP6, T5, promotor de p-lactamasa, promotor de galactosa de E. coli, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptófano (trp), promotor de operón de lactosa (lac), promotor de lacUV5, promotor de trc y promotor de tac. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico comprende una primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido, que corresponde de forma sustancial a una secuencia diana, una segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido, que es sustancialmente complementaria a la secuencia diana y una tercera secuencia de nucleótidos, que está flanqueada por la primera y la segunda secuencia de nucleótidos y que codifica uno o más nucleótidos de una región bucle de una transcripción de ARN. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 14, 15 y 20.

Diversas realizaciones se relacionan con un vector que comprende una construcción de expresión de ARNbc con modificación genética que comprende un promotor, una región que codifica ARNbc ubicada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor, en la que la región que codifica el ARNbc comprende una primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido, que corresponde sustancialmente a una secuencia diana, una segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido, que es sustancialmente complementaria a la secuencia diana y una tercera secuencia de nucleótidos, que está flanqueada por la primera y la segunda secuencia de nucleótidos y que codifica uno o más nucleótidos de una región de bucle de una transcripción de ARN; una primera secuencia de terminación de transcripción que comprende la SEQ ID NO: 13, ubicada 3' respecto de la región que codifica el ARNbc; en la que la región que codifica el ARNbc y el terminador de transcripción están unidos de forma operativa al promotor. En algunas realizaciones, la primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido se encuentra 5' con respecto a la segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido. En algunas realizaciones, la primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido se encuentra 3' con respecto a la segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido. En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARNbc con modificación genética comprende adicionalmente uno o más sitios de restricción de nucleasa de dedo de zinc (ZFN), nucleasa efectora de TAL (TALEN) o meganucleasa ubicados 3' respecto de la secuencia de terminación de transcripción. En algunas realizaciones, el sitio de restricción de meganucleasa se selecciona de un grupo que consiste en I-Anil, I-Scel, I-Ceul, Pl-Pspl, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, I PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeM1, I-MsoI, I-TevI, I-TevII y I-TevIII. En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARNbc con modificación genética comprende dos secuencias terminadoras de transcripción independientes de Rho que son terminador de PTH y terminador de pET-T7, de modo que la secuencia promotora y terminadora de transcripción forman una combinación funcional. En algunas realizaciones, el vector es un vector plásmido.

Diversas realizaciones se relacionan con una célula hospedadora bacteriana que comprende un vector que comprende una construcción de expresión con modificación genética: un promotor, una primera secuencia de ácido nucleico ubicada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor, en la que la primera secuencia de ácido nucleico codifica un ARNbc, un ARN regulador o una proteína; y una segunda secuencia de ácido nucleico, ubicada 3' con respecto a la primera secuencia de ácido nucleico, donde la segunda secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 13; en la que la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están unidas de forma operativa al promotor. En algunas realizaciones, el vector es un promotor de bacteriófago. En algunas realizaciones, el promotor se selecciona de un grupo que consiste en T7, T3, SV40, SP6, T5, promotor de p-lactamasa, promotor de galactosa de E. coli, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptófano (trp), promotor de operón lactosa (lac), promotor de lacUV5, promotor de trc y promotor de tac. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico comprende una primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido, que corresponde de forma sustancial a una secuencia diana, una segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido, que es sustancialmente complementaria a la secuencia diana y una tercera secuencia de nucleótidos, que está flanqueada por la primera y la segunda secuencia de nucleótidos y que codifica uno o más nucleótidos de una región bucle de una transcripción de ARN. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 14, 15 y 20. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana no expresa RNasa A. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es una célula de E. coli. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana está inactiva y sin lisar. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana se puede usar en una composición para controlar una infestación por plagas de invertebrados o inhibir la propagación de una enfermedad vírica en una población de plantas. Diversas realizaciones se refieren a un procedimiento para controlar una infestación por plagas de invertebrados que comprende aplicar una bacteria inactiva y sin lisar a una planta. En algunas realizaciones, la bacteria inactiva y sin lisar de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente se aplica a una fuente de alimento de la planta para un vector vírico de nematodo o insecto en un procedimiento para inhibir la propagación de una enfermedad vírica en una población de plantas.

Diversas realizaciones se relacionan con una célula hospedadora bacteriana que comprende un vector que comprende una construcción de expresión de ARNbc con modificación genética que comprende un promotor; una región que codifica ARNbc ubicada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor, en la que la región que codifica ARNbc comprende una primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido, que corresponde sustancialmente a una secuencia diana, una segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido, que es sustancialmente complementaria a la secuencia diana y una tercera secuencia de nucleótidos, que está flanqueada por la primera y la segunda secuencia de nucleótidos y que codifica uno o más nucleótidos de una región de bucle de una transcripción de ARN; y una secuencia terminadora de transcripción, ubicada 3' respecto de la región que codifica el ARNbc que comprende la SEQ ID NO: 13; en la que la región que codifica el ARNbc y el terminador de transcripción están unidos de forma operativa al promotor. En algunas realizaciones, la primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido se encuentra 5' con respecto a la segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido. En algunas realizaciones, la primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido se encuentra 3' con respecto a la segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido.

En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana no expresa RNasa A. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es una célula de E. coli. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana está inactiva y sin lisar. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana se puede usar en una composición para controlar una infestación por plagas de invertebrados o inhibir la propagación de una enfermedad vírica en una población de plantas. Diversas realizaciones se refieren a un procedimiento para controlar una infestación por plagas de invertebrados que comprende aplicar una bacteria inactiva y sin lisar a una planta. En algunas realizaciones, la bacteria inactiva y sin lisar de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente se aplica a una fuente de alimento de la planta para un vector vírico de nematodo o insecto en un procedimiento para inhibir la propagación de una enfermedad vírica en una población de plantas.

Diversas realizaciones se relacionan con un sistema de cultivo celular para síntesis in vivo de ARN que comprende una célula hospedadora bacteriana y un medio de cultivo, en el que la célula hospedadora bacteriana comprende un vector que comprende una construcción de expresión con modificación genética que comprende un promotor; una primera secuencia de ácido nucleico ubicada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor, en el que la primera secuencia de ácido nucleico codifica un ARNbc, un ARN regulador o una proteína; y una segunda secuencia de ácido nucleico, ubicada 3' con respecto a la primera secuencia de ácido nucleico, en la que la segunda secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende 3,2 % de triptona, 2 % de extracto de levadura, 0,5 % de NaCl, 1 % de glicerol, 0,1 % de glucosa, 0,4 % de alfa-lactosa, 50 mM de (NH4)2SO4, 10 mM de KH2PO4, 40 mM de Na2HPO4, 2 mM de MgSO4.

Diversas realizaciones se relacionan con un sistema de cultivo celular para síntesis in vivo de proteínas que comprende una célula hospedadora bacteriana y un medio de cultivo, en el que la célula hospedadora bacteriana comprende un vector que comprende una construcción de expresión con modificación genética que comprende un promotor; una primera secuencia de ácido nucleico ubicada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor, en la que la primera secuencia de ácido nucleico codifica una proteína de interés; y una segunda secuencia de ácido nucleico, ubicada 3' con respecto a la primera secuencia de ácido nucleico, en la que la segunda secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende 3,2 % de triptona, 2 % de extracto de levadura, 0,5 % de NaCl, 1 % de glicerol, 0,1 % de glucosa, 0,4 % de alfa-lactosa, 50 mM de (NH4)2SO4, 10 mM de KH2PO4, 40 mM de Na2HPO4, 2 mM de MgSO4.

En algunas realizaciones, se proporciona un sistema de cultivo celular para síntesis in vivo de ARNbc que comprende una célula hospedadora bacteriana que comprende un vector que comprende una construcción de expresión de ARNbc con modificación genética que comprende un promotor; una región que codifica ARNbc ubicada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor, en el que la región que codifica ARNbc comprende una primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido, que corresponde sustancialmente a una secuencia diana, una segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido, que es sustancialmente complementaria a la secuencia diana y una tercera secuencia de nucleótidos, que está flanqueada por la primera y la segunda secuencia de nucleótidos y que codifica uno o más nucleótidos de una región de bucle de una transcripción de ARN; y una secuencia terminadora de transcripción que comprende la SEQ ID NO: 13, ubicado 3' respecto de la región que codifica el ARNbc; en el que la región que codifica ARNbc y el terminador de transcripción están unidos de forma operativa al promotor y un medio de cultivo.

En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende 3,2 % de triptona, 2 % de extracto de levadura, 0,5 % de NaCl, 1 % de glicerol, 0,1 % de glucosa, 0,4 % de alfa-lactosa, 50 mM de (NH4)2SO4, 10 mM de KH2PO4, 40 mM de Na2HPO4, 2 mM de MgSO4.

Diversas realizaciones se relacionan con un lisado de una célula hospedadora bacteriana que comprende un vector que comprende una construcción de expresión de ARN con modificación genética que comprende un promotor; una región que codifica ARN ubicada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor, en la que la región que codifica el ARN codifica un ARNbc, un ARN regulador o una proteína; y una secuencia terminadora de transcripción que comprende la SEQ ID NO: 13, ubicada 3' respecto de la región que codifica el ARNbc; en la que la región que codifica el ARN y el terminador de transcripción están unidos de forma operativa con el promotor para controlar una infestación por plaga de invertebrados o inhibir la propagación de una enfermedad vírica en una población de plantas. En algunas realizaciones, la región que codifica a Rn codifica un ARNbc y comprende una primera secuencia de nucleótidos en orientación con sentido, que corresponde de forma sustancial a una secuencia diana, una segunda secuencia de nucleótidos con orientación antisentido, que es sustancialmente complementaria a la secuencia diana y una tercera secuencia de nucleótidos, que está flanqueada por la primera y la segunda secuencia de nucleótidos y que codifica uno o más nucleótidos de una región bucle de una transcripción de ARN. Diversas realizaciones se refieren a un procedimiento para controlar una infestación por plaga de invertebrados que comprende aplicar un lisado bacteriano a una planta. En algunas realizaciones, el lisado bacteriano de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente se aplica a una fuente de alimento de la planta para un vector vírico de nematodo o insecto con un procedimiento para inhibir la propagación de una enfermedad vírica en una población de plantas.

Diversas realizaciones se relacionan con un terminador de transcripción que comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 13.

Diversas realizaciones se relacionan con un procedimiento para modular la producción de ARN a partir de un vector de expresión, que comprende proporcionar en el vector de expresión un terminador de transcripción unido de forma operativa a un promotor y una región que codifica ARN, en el que el terminador de transcripción comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 13.

Diversas realizaciones se relacionan con un procedimiento para modular la producción de proteínas a partir de un vector de expresión, que comprende proporcionar en el vector de expresión un terminador de transcripción unido de forma operativa a un promotor y una región que codifica proteínas, en el que el terminador de transcripción comprende la SEQ ID NO: 13, por el que la producción de proteínas aumenta al proporcionar un terminador de la transcripción que comprende la SEQ ID NO: 13.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A muestra una representación esquemática de una construcción de expresión de ARNbc con modificación genética que comprende en una dirección de 5' a 3', un promotor unido de forma operativa a un fragmento de ADN con sentido, una región que codifica bucles, un fragmento de ADN antisentido complementario, un primer terminador de transcripción y un segundo terminador de transcripción.

La figura 1B muestra una representación esquemática de una construcción de expresión de ARNbc con modificación genética que comprende en una dirección de 5' a 3', un promotor unido de forma operativa a un fragmento de ADN antisentido, una región que codifica bucles, un fragmento de ADN con sentido complementario, un primer terminador de transcripción y un segundo terminador de transcripción.

La figura 2A muestra una representación esquemática del vector pCPB-hp.

La figura 2B muestra una representación esquemática del vector pCPB-hp+2T.

La figura 2C muestra un mapa parcial del vector pCPB-hp+2T.

La figura 3A es una fotografía de un gel de Agarosa que muestra el ARN total aislado de 20 ul de cultivo cultivado durante la noche a 37 °C (filas a la izquierda) o 25 °C (filas a la derecha). Las filas marcadas con "1" muestran el ARN total aislado de las bacterias pUC19/HT115(DE3). Las filas marcadas con "2" muestran el ARN total aislado de las bacterias pCPB-hp/HT115(DE3). Las filas marcadas con "3" muestran el ARN total aislado de las bacterias pCPB-hp+2T/HT115(DE3). Las filas marcadas con "4" muestran el ARN total aislado de las bacterias pUC19/HT115(DE3)+pLac-T7. Las filas marcadas con "5" muestran el ARN total aislado de las bacterias pCPB-hp/HT115(DE3)+pLac-T7. Las filas marcadas con "6" muestran el ARN total aislado de las bacterias pCPB-hp+2T/HT115(DE3)+pLac-T7.

La figura 3B es una fotografía de un gel de Agarosa que muestra el ARN total tratado con RNasa A aislado de 20 ul de cultivo cultivado durante la noche a 37 °C (filas a la izquierda) o 25 °C (filas a la derecha). Las filas marcadas con "1" muestran el ARN total aislado de las bacterias pUC19/HT115(DE3). Las filas marcadas con "2" muestran el ARN total aislado de las bacterias pCPB-hp/HT115(DE3). Las filas marcadas con "3" muestran el ARN total aislado de las bacterias pCPB-hp+2T/HT115(DE3). Las filas marcadas con "4" muestran el ARN total aislado de las bacterias pUC19/HT115(DE3)+pLac-T7. Las filas marcadas con "5" muestran el ARN total aislado de las bacterias pCPB-hp/HT115(DE3)+pLac-T7. Las filas marcadas con "6" muestran el ARN total aislado de las bacterias pCPB-hp+2T/HT115(DE3)+pLac-T7.

La figura 4 es una fotografía de un gel de Agarosa que muestra el ARN bacteriano total sin inducción en la fila 1 y el ARN bacteriano total con inducción en la fila 2. M: marcador.

La figura 5A es una fotografía de un gel de Agarosa que muestra ARN transcrito de forma bacteriana (filas 5-8) y ARN transcrito in vitro (filas 9 y 10) sin digestión de RNasa A. La fila 4 muestra un marcador de tamaño. La fila 5 muestra una dilución de 10 veces de ARN purificado con SNAP modificado. La fila 6 muestra una dilución de 50 veces de ARN purificado con SNAP modificado. La fila 7 muestra una dilución de 10 veces de ARN purificado con SNAP modificado filtrado por centrifugado 30K. La fila 8 muestra una dilución de 50 veces de ARN purificado con SNAP modificado filtrado por centrifugado 30K. La fila 9 muestra una dilución de 100 veces de ARN transcrito in vitro a partir de un vector pCPB-hp+2T linealizado. La fila 10 muestra una dilución de 500 veces de ARN transcrito in vitro a partir de un vector pCPB-hp+2T linealizado.

La figura 5B es una fotografía de un gel de Agarosa que muestra los resultados de la digestión con RNasa A de ARN transcrito de forma bacteriana (filas 5-8) y ARN transcrito in vitro (filas 9 y 10). La fila 4 muestra un marcador de tamaño. La fila 5 muestra una dilución de 10 veces de ARN purificado con SNAP modificado. La fila 6 muestra una dilución de 50 veces de ARN purificado con SNAP modificado. La fila 7 muestra una dilución de 10 veces de ARN purificado con SNAP modificado filtrado por centrifugado 30K. La fila 8 muestra una dilución de 50 veces de ARN purificado con SNAP modificado filtrado por centrifugado 30K. La fila 9 muestra una dilución de 100 veces de ARN transcrito in vitro a partir de un vector pCPB-hp+2T linealizado. La fila 10 muestra una dilución de 500 veces de ARN transcrito in vitro a partir de un vector pCPB-hp+2T linealizado.

La figura 6 muestra microfotografía de células de E. coli después de la incubación a 37, 51, 62 o 72 °C durante 30 minutos.

La figura 7A es una fotografía de un gel de Agarosa que muestra el ARN total aislado a partir de bacterias pDV49 cultivadas en medio de autoinducción (AIM) (fila 5), medio de súper caldo+ AIM (fila 6) o medio de plásmido+ AIM (fila 7). La fila 4 muestra un marcador de tamaño. Las bandas de ARNbc de DV49 se indican con la flecha. La figura 7B es una fotografía de un gel de Agarosa que muestra el ARN total aislado de bacterias pCPB-hp+2T cultivadas en súper caldo medio (fila 5). La fila 4 muestra un marcador de tamaño. La banda de ARNbc de CPB se indica con la flecha.

La figura 8 muestra una representación esquemática del vector pDV49+2T.

La figura 9 muestra una representación esquemática de un vector plásmido que comprende un fragmento de ADN con sentido y un fragmento de ADN antisentido complementario insertados entre el extremo 3' de un promotor y un sitio de reconocimiento de nucleasa. La expresión de la nucleasa linealiza el vector.

La figura 10 es una fotografía de un gel de Agarosa que muestra el ARN total aislado de células de E. coli que contenían vectores de expresión de ARN con diferentes terminadores o combinaciones de terminadores. Se muestra un marcador de tamaño en la fila "M". La fila 1 muestra ARN aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-PET. La fila 2 muestra ARN aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-PTH1. La fila 3 muestra ARN aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-PTH2. La fila 4 muestra ARN aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-BT1. La fila 5 muestra ARN aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-BT2. La fila 6 muestra a Rn aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-CJ. La fila 7 muestra ARN aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-B1002. La fila 8 muestra ARN aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-B1006. La fila 9 muestra ARN aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-PTH+PET.

La figura 11 muestra las estructuras secundarias formadas por los terminadores PTH+PET (SEQ ID NO. 13); CJ (SEQ ID NO. 10); rrn BT2 (SEQ ID NO. 9); rrnBT1 (SEQ ID NO. 8); PTH (SEQ ID NO. 7); PET (SEQ ID NO. 13); B1006 (SEQ ID NO. 12) y B1002 (SEQ ID NO. 11) según se determinó usando CLC Main Workbench (versión 6.8.4). En la tabla 5 se puede ver la energía libre de las estructuras secundarias que se muestran.

La figura 12 muestra las estructuras secundarias formadas por horquillas de ARN de diferentes tamaños y terminadores de PTH+PET según se determinó usando CLC Main Workbench (versión 6.8.4). La figura 12A muestra la estructura secundaria formada por la horquilla de ARN 27mero y el terminador PTH+PET. La figura 12B muestra la estructura secundaria formada por la horquilla de ARN 240mero y el terminador PTH+PET. La figura 12C muestra la estructura secundaria formada por la horquilla de ARN 280mero y el terminador PTH+PET. La estructura formada por el terminador PTH+PET se encuentra en un círculo.

La figura 13 es una gráfica que muestra el rendimiento de ARN obtenido de cada una de las construcciones de expresión del bucle de ARN 27mero/terminador PTH+PET, horquilla de ARN 240mero/terminador PTH+PET y bucle de ARN 280mero/terminador PTH+PET.

La figura 14 es una fotografía de un gel de Agarosa que muestra el ARN total aislado de células de E. coli que contenían vectores de expresión de ARN con diferentes cantidades y combinaciones de terminadores. La fila 1 muestra ARN total aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUc19-PTH+PET 2. La fila 2 muestra ARN total aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET 4. La fila 3 muestra ARN total aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-PET+rrn BT2+PTH+PET 4 La fila 4 muestra ARN total aislado de bacterias HT115(DE3)/terminador pUC19-rrn BT2+PTH+PET 3.

La figura 15 muestra las estructuras secundarias formadas por diferentes cantidades y combinaciones de terminadores según se determinó usando CLC Main Workbench (versión 6.8.4). La figura 15A muestra la estructura secundaria formada por 2 terminadores, PTH+PET. La figura 15B muestra la estructura secundaria formada por 4 terminadores, rrn BT2+PET+PTH+PET. La Figura 15C muestra la estructura secundaria formada por 4 terminadores, PET+rrn BT2+PTH+PET. La Figura 15D muestra la estructura secundaria formada por 3 terminadores, rrn BT2+PTH+PET. Las estructuras de bucle de tamaño medio formadas por las combinaciones de terminadores se encuentran en círculos.

La figura 16 es una fotografía de un gel de SDS-PAGE que muestra proteína total aislada de células BL21(DE3) que contenían vectores de expresión de proteínas con diferentes cantidades y combinaciones de terminadores. La proteína expresada, Proteína A, tiene un peso molecular de 21 k. Se muestra un marcador de tamaño en la fila "M". La fila "A" contiene proteína aislada de células que contienen la construcción de expresión del terminador pUC+PET. La fila "B" contiene proteína aislada de células que contienen la construcción de expresión del terminador pUC+rrn BT2. La fila "C" contiene proteína aislada de células que contienen la construcción de expresión del terminador pUC+PTH+PET. La fila "D" contiene proteína aislada de células que contienen la construcción de expresión del terminador pUC+rrn BT2+PET+PTH+PET.

La figura 17 muestra las estructuras secundarias formadas por terminadores con modificación genética según se determinó usando CLC Main Workbench (versión 6.8.4). La figura 17A muestra la estructura secundaria formada por 4 terminadores, rrn BT2+PET+PTH+PET (SEQ ID No. 18). La figura 17B muestra la estructura secundaria formada por la SEQ ID 21. La figura 17C muestra la estructura secundaria formada por la SEQ ID 22. La figura 17D muestra la estructura secundaria formada por la SEQ ID 23.

Descripción detallada

La siguiente es una descripción detallada de la invención proporcionada para ayudar a los expertos en la técnica en la práctica de la presente invención.

A. Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica. Cuando un término se proporciona en la forma singular, también se contempla el término en plural salvo que se indique lo contrario. A menos que se establezca lo contrario, las secuencias de ácido nucleico en el texto de esta memoria descriptiva se dan en la dirección de 5' a 3' con relación al promotor.

En la descripción a continuación se utilizan de forma extensa varios términos. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de las presentes realizaciones.

Tal como se usa en la presente, "un" o "una" puede significar uno o más de uno.

Tal como usa en la presente, el término "alrededor" indica que un valor incluye la variación inherente de error para el procedimiento que se utiliza para determinar un valor o la variación que existe entre los experimentos.

Se comprenderá que, si bien los términos "primero/a", "segundo/a", etc. se pueden usar en la presente para describir diversos elementos, estos elementos no deberían estar limitados por estos términos. Estos términos se usan solamente para distinguir un elemento de otro.

Tal como se usa en la presente, la expresión "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a polímero de bases de ribonucleótido o desoxirribonucleótido mono o bicatenario. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas de monómeros que son nucleótidos de origen natural (como ADN o ARN) o análogos de nucleótidos de origen natural (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos de origen natural) o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de base de purina o pirimidina. Las modificaciones de azúcar incluyen, por ejemplo, el remplazo de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido o los azúcares se pueden funcionalizar como éteres o ésteres. Adicionalmente, todo el resto de azúcar se puede remplazar con estructuras estérica y electrónicamente similares, como análogos de azúcar carboxílico o aza-azúcares. Los ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico se pueden unir mediante enlaces de fosfodiéster o análogos de dichos enlaces. Los análogos de enlaces de fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares.

Una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un receptor que se ha separado del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo no taxativo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizada que no está integrada en el genoma de un organismo. Otro ejemplo no taxativo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico que se ha aislado de una especie particular que es más pequeña que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie.

El término "vector" se refiere a una molécula de ADN utilizada como vehículo para llevar de forma artificial material genético externo a una célula hospedadora, en la que se puede replicar y/o expresar. La secuencia de ADN de un vector generalmente comprende un inserto (transgén) y una secuencia más grande que sirve como la "estructura base". La estructura base del vector puede contener uno o más sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción que permiten la inserción de una molécula de ácido nucleico de forma determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador adecuado para su uso en la identificación y selección de células transducidas con el vector y un origen de replicación. Los vectores de expresión (construcciones de expresión) generalmente tienen una secuencia promotora que impulsa la expresión del transgén en la célula hospedadora. Los ejemplos de vectores adecuados para uso de acuerdo con las presentes realizaciones incluyen, a modo no taxativo, plásmidos, cósmidos, plastomas, cromosomas artificiales y bacteriófagos.

Las expresiones "promotor" o "secuencia promotora" se pueden usar de forma intercambiable y se refieren a una secuencia de ADN que, cuando se liga a una secuencia de nucleótidos de interés, puede controlar la transcripción de la secuencia de nucleótidos de interés en el ARN. Las expresiones "promotor" y "secuencia promotora" incluyen un promotor mínimo que es una secuencia de ADN corto compuesta por una caja TATA y otras secuencias de a Dn que sirven para especificar el sitio de inicio de la transcripción o están implicadas en la unión de factores de proteínas que controlan la efectividad del inicio de la transcripción en respuesta a condiciones fisiológicas. Los promotores pueden ser homólogos, derivados completamente de un gen natural de la célula hospedadora, o heterólogos, derivados por completo o en parte de otro organismo, o pueden estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza o estar compuestos de segmentos de ADN sintético. Tal como se usa en la presente, un promotor puede ser un promotor constitutivamente activo o un promotor regulado. En algunas realizaciones, el promotor puede ser represible. En algunas realizaciones, el promotor puede ser inducible.

Cuando la expresión de una secuencia de nucleótidos se coloca bajo el control de un promotor, se dice que tal secuencia de nucleótidos está "unida de forma operativa" al promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor de núcleo están "unidos de forma operativa" si el elemento regulador modula la actividad del promotor de núcleo.

La expresión "célula hospedadora" se refiere a cualquier célula capaz de replicar y/o transcribir un vector diseñado de acuerdo con las presentes realizaciones. Las células hospedadoras para uso en las presentes realizaciones pueden ser células procariotas, como E. coli, o células eucariotas, como células de hongos, plantas, insectos, anfibios, aves o mamíferos. La inserción de un vector en la célula diana se denomina a menudo transformación en el caso de células bacterianas, transfección en el caso de células eucariotas, aunque la inserción de un vector vírico se denomina con frecuencia transducción.

La expresión "expresión" o "expresión génica" se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un ARN funcional, la expresión génica implica la transcripción del gen en el ARN.

Tal como se usan en la presente, las frases "inhibición de la expresión génica" o "inhibición de la expresión de un gen diana" o "supresión génica" o "supresión de un gen diana" se refieren a la ausencia (o reducción observable) del nivel de proteína y/o producto de ARNm del gen diana.

Tal como se usa en la presente, la expresión "transcripción de ARN" se refiere al producto que resulta de la transcripción catalizada por polimerasa de ARN de una secuencia de ADN. Cuando la transcripción del ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN se denomina transcripción primaria o puede ser una secuencia de ARN derivada de procesamiento postranscripcional de la transcripción primaria y se denomina ARN maduro.

Tal como se usa en la presente, la expresión "ARN sentido" se refiere a una transcripción de ARN que corresponde a una secuencia o un segmento que, cuando se produce mediante el organismo diana, está en forma de un ARNm capaz de sertraducido en proteína por el organismo diana. En algunas realizaciones, el organismo diana es una plaga.

Tal como se usa en la presente, la expresión "ARN antisentido" se refiere a una transcripción de ARN complementaria a todo o parte de un ARNm que se produce normalmente en una célula de un organismo diana. La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte de la transcripción génica específica, es decir, en la secuencia no codificante 5', secuencia no traducida 3', intrones o la secuencia codificante. En algunas realizaciones, el organismo diana es una plaga.

La expresión "secuencia de referencia" se refiere a una secuencia utilizada como base para la comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de ADNc de longitud completa dada en un listado de secuencias o puede comprender una secuencia génica completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos, frecuentemente al menos 25 nucleótidos de longitud y a menudo al menos 50 nucleótidos de longitud.

Tal como se usa en la presente, la expresión "secuencia diana" se refiere a una secuencia de nucleótidos de un gen al que se dirige la supresión, que corresponde a una región de formación de estructuras dobles de un ARNbc. En este contexto, el término "gen" significa una región de secuencia genómica que se puede ubicar, que corresponde a una unidad de herencia, que incluye regiones reguladoras, regiones transcritas y/u otras regiones de secuencias funcionales. Dependiendo de las circunstancias, la expresión secuencia diana se puede referir a la secuencia de nucleótidos de longitud completa del gen al que se dirige la supresión o la secuencia de nucleótidos de una parte de un gen al que se dirige la supresión.

Se dice que una primera secuencia de nucleótidos cuando se observa en la dirección de 5' a 3' es un "complemento de" o "complementaria de" una segunda secuencia de nucleótidos de referencia observada en la dirección de 3' a 5' si la secuencia del primer nucleótido es el complemento inverso de la secuencia de nucleótido de referencia. A modo de ilustración, la secuencia de nucleótidos "CATTAG" corresponde a una secuencia de referencia "CATTAG" y es complementaria de una secuencia de referencia "GTAATC". Se dice que las moléculas de secuencias de ácido nucleico presentan "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las secuencias leídas de 5' a 3' es complementaria a cada nucleótido de la otra secuencia cuando se lee de 3' a 5'.

Tal como se usa en la presente, "bucle" se refiere a una estructura formada por una única cadena de un ácido nucleico, en la que las regiones complementarias que flanquean una región de nucleótidos monocatenaria particular se hibridan de manera que la región de nucleótidos monocatenaria entre las regiones complementarias queda excluida de la formación de estructuras dobles o el apareamiento de bases de Watson-Crick. Un bucle es una región de nucleótidos monocatenaria de cualquier longitud.

Tal como se usa en la presente, la expresión "identidad de secuencia", "similitud de secuencia" u "homología" se usa para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de nucleótidos. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, de modo que la parte de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando la cantidad de posiciones en la que el resto de aminoácido o la base de ácido nucleico idéntico aparece en ambas secuencias para proporcionar la cantidad de posiciones coincidentes, dividiendo la cantidad de posiciones coincidentes entre la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. Se dice que una secuencia idéntica en cada posición en comparación con una secuencia de referencia es idéntica a la secuencia de referencia y viceversa.

Tal como se usa en la presente, una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más normalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en el que una secuencia se compara con una secuencia de referencia de la misma cantidad de posiciones contiguas después de que se alineen de forma óptima las dos secuencias. La ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de aproximadamente 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Los expertos en la técnica deberían remitirse a los procedimientos detallados usados para la alineación de secuencias en el paquete de programas informáticos Wisconsin Genetics versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., EUA) o remitirse a Ausubel et ál. (1998) para ver un tratamiento más detallados del análisis de secuencias.

Tal como se usa en la presente, el término "que deriva de" se refiere a una secuencia de nucleótidos especificada que se puede obtener de una fuente o especie especificada particular, aunque no es necesario que sea directamente de la fuente o especie especificada.

La expresión "endonucleasa" o "endonucleasa de restricción" se refiere a enzimas que escinden el enlace de fosfodiéster dentro de una cadena de polinucleótidos.

El término "meganucleasa" se refiere a endodesoxirribonucleasas caracterizadas por un gran sitio de reconocimiento (secuencias de ADN bicatenario de 12 a 40 pares de bases) y que, como resultado del tamaño de su sitio de reconocimiento, generalmente aparece raramente, si es que aparece, en un genoma dado. Ejemplos de meganucleasas incluyen, de modo no taxativo, I-Anil, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, I PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeMI, I-MsoI, I-TevI, I-TevII y I-TevIII.

La expresión "nucleasa efectora de TAL" (TALEN) se refiere a una nucleasa que comprende un dominio de unión de ADN efector de TAL fusionado a un dominio de nucleasa. Los dominios de unión de a Dn efectores de TAL se pueden modificar genéticamente para unirse a un objetivo deseado y fusionarse a un dominio de nucleasa, como el dominio de nucleasa Fok1, para derivar una proteína de fusión de nucleasa-dominio efector de TAL.

La expresión "nucleasa de dedos de zinc" (ZFN) se refiere a una nucleasa que comprende un dominio de unión de ADN de dedo de zinc fusionado a un dominio de nucleasa, como el dominio de nucleasa Fok1. Los dominios de dedos de zinc se pueden modificar genéticamente para dirigirse a secuencias de ADN deseadas y esto permite que las nucleasas de dedos de zinc se dirijan a secuencias únicas dentro de genomas complejos.

El término "escindir" se refiere a la rotura de la estructura base covalente de una molécula de polinucleótido, como una molécula de ADN.

Tal como se usa en la presente, el término "plaga" se refiere a insectos, arácnidos, crustáceos, hongos, bacterias, virus, nematodos, platelmintos, ascárides, oxiuros, anquilostomas, tenias, tripanosomas, esquistosomas, éstridos, pulgas, garrapatas, ácaros y piojos y similares que son penetrantes en el ambiente humano y que pueden ingerir o entrar en contacto con uno o más células, tejidos o fluidos producidos por un simbionte u hospedador de plaga.

Tal como se usa en la presente, la expresión "resistencia a la plaga" se refiere a la capacidad de un simbionte u hospedador de plaga de resistir el ataque de una plaga que típicamente puede producir daño o pérdida en el simbionte u hospedador de plaga. Tal como se describe en la presente, tal resistencia a la plaga se puede lograr brindando a una superficie de un simbionte u hospedador de plaga una molécula de ARNbc compuesta en parte por un segmento de ARN idéntico a un segmento de ARN correspondiente codificado a partir de una secuencia de a Dn dentro de una plaga que prefiere alimentarse del simbionte u hospedador de plaga. La expresión del gen dentro de la plaga diana se suprime mediante el ARNbc y la supresión de la expresión del gen en la plaga diana da como resultado que el simbionte u hospedador de plaga sea resistente a la plaga.

B. Producción de ARN

La presente divulgación se relaciona con composiciones y procedimientos para la producción y administración eficaz y rentable de una molécula de ARN transcrita usando un terminador de la transcripción que comprende una secuencia de ácido nucleico representada en la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, la molécula de ARN con transcripción codifica una proteína. En algunas realizaciones, la molécula de ARN con transcripción codifica un ARN regulador. En algunas realizaciones, la molécula de ARN con transcripción es ARNbc. En algunas realizaciones, la molécula de ARN con transcripción comprende tanto segmentos en orientación con sentido como segmentos con orientación antisentido que forman una molécula de ARN al menos parcialmente bicatenaria (ARNbc) estabilizada que puede suprimir un gen diana. En algunas realizaciones, la molécula de ARN con transcripción codifica una proteína. En algunas realizaciones, la molécula de ARN con transcripción es un ARN regulador.

ARNbc

Diversas realizaciones descritas en la presente se relacionan con vectores y sistemas que comprenden un terminador de la transcripción que comprende una secuencia de ácido nucleico representada en la SEQ ID NO: 13 para la producción in vivo o in vitro de una molécula de ARN que comprende un primer segmento de ARN unido a un segundo segmento de ARN sustancialmente complementario mediante un tercer segmento de ARN. El primer y segundo segmento de ARN se encuentran dentro de la longitud de la molécula de ARN y son repeticiones sustancialmente invertidas del otro, de forma que la complementariedad entre el primer y el segundo segmento de ARN da como resultado la capacidad de los dos segmentos de hibridarse in vivo e in vitro para formar un tallo de ARN bicatenario unido en un extremo de cada uno del primer y segundo segmento mediante el tercer segmento de ARN, lo cual forma un bucle monocatenario. El primer y el segundo segmento corresponden al sentido y antisentido, respectivamente, de una secuencia que presenta una identidad sustancial con una secuencia de nucleótidos diana para la supresión. En algunas realizaciones, la molécula de ARN incluye adicionalmente al menos una segunda región de formación de bucle-tallo que suprime al menos una segunda secuencia diana.

En algunas realizaciones, la longitud de la cadena con sentido de la estructura doble de ARN puede ser de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900 o más nucleótidos. De manera similar, en algunas realizaciones, la longitud de la cadena antisentido de la estructura doble de ARN puede ser de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900 o más nucleótidos. Las cadenas con sentido y antisentido de la estructura doble de ARN no necesitan ser perfectamente complementarias y el ARN bicatenario puede contener regiones internas no complementarias. Las cadenas con sentido y antisentido solo necesitan ser estructuras dobles o ser sustancialmente complementarias para hibridarse en condiciones biológicas. En algunas realizaciones, cuando un ARN de doble cadena se forma a partir de apareamiento de bases complementarias de las cadenas con sentido y antisentido, la estructura doble resultante tiene extremos romos. En otras realizaciones, cuando un ARN bicatenario se forma a partir de apareamiento de bases complementarias de las cadenas con sentido y antisentido, el ARNbc tiene una estructura asimétrica. En algunas realizaciones, el ARNbc tiene un saliente 5' de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más nucleótidos en la cadena con sentido. En algunas realizaciones, el ARNbc tiene un saliente 5' de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más nucleótidos en la cadena antisentido. En algunas realizaciones, el ARNbc tiene un saliente 3' de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más nucleótidos en la cadena con sentido. En algunas realizaciones, el ARNbc tiene un saliente 3' de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más nucleótidos en la cadena antisentido.

El tercer segmento de ARN puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que facilite o permita que el primer segmento de ARN y el segundo segmento de ARN se hibriden y formen ARNbc. El tercer segmento de ARN puede comprender una secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente 1-5 nucleótidos de longitud, 5-10 nucleótidos de longitud, 10-15 nucleótidos de longitud, 15-20 nucleótidos de longitud, 20-25 nucleótidos de longitud, 25-30 nucleótidos de longitud, 30-35 nucleótidos de longitud, 35-40 nucleótidos de longitud, 40-45 nucleótidos de longitud, 45-50 nucleótidos de longitud, 50-55 nucleótidos de longitud, 55-60 nucleótidos de longitud, 60-65 nucleótidos de longitud, 65-70 nucleótidos de longitud, 70-75 nucleótidos de longitud, 75-80 nucleótidos de longitud, 80-85 nucleótidos de longitud, 85-90 nucleótidos de longitud, 90-95 nucleótidos de longitud, 95-100 nucleótidos de longitud, 100-150 nucleótidos de longitud, 150-200 nucleótidos de longitud, 200-250 nucleótidos de longitud, 250-400 nucleótidos de longitud o al menos aproximadamente 400-500 nucleótidos de longitud. Una variedad de secuencias diferentes puede servir como la secuencia de bucle. Ejemplos de secuencias de bucle específicas que han demostrado funcionar en ARNhc incluyen UUCAAGAGA, Cc Ac ACC, AAGCUU, CTCGAG, CCACC y Uu Cg . En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos del tercer segmento de ARN corresponde sustancialmente a una secuencia con sentido o antisentido de un segmento del gen diana para la supresión. Por ejemplo, el tercer segmento de ARN puede comprender una secuencia de nucleótidos que corresponden a los nucleótidos con sentido o antisentido ubicados en un extremo distal del segmento del gen al que se dirigen el primer y segundo segmento de ARN autocomplementarios. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos del tercer segmento de ARN corresponde sustancialmente a una secuencia con sentido o antisentido de un segmento de un gen que no es diana. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos del tercer segmento de ARN se deriva de la secuencia de nucleótidos de una región de bucle de un microARN (miARN). En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos del tercer segmento de ARN se deriva de la secuencia de nucleótidos de una región de bucle de un microARN (miARN) natural del organismo diana. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos del tercer segmento de ARN es una secuencia de nucleótidos con modificación genética. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos con modificación genética del tercer segmento de ARN se deriva de una secuencia de nucleótidos de un gen natural alterando el contenido de GC. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos del tercer segmento de ARN codifica un aptámero.

Se puede fijar como objetivo cualquier gen para supresión mediante una molécula de ARNbc producida de acuerdo con las presentes realizaciones. La inhibición de un gen diana usando una molécula de ARNbc como se describe en la presente es específica de la secuencia en el sentido de que las secuencias de nucleótidos que corresponden a una región formadora de estructuras dobles del ARNbc son objetivos para la inhibición mediada por íaRn . La región formadora de estructuras dobles del ARNbc puede corresponder a la secuencia de nucleótidos de longitud completa del producto de transcripción primaria o ARNm completamente procesado del gen diana o la región formadora de estructuras dobles del ARNbc puede corresponder a una porción del producto de transcripción primaria o el ARNm completamente procesado del gen diana. Una secuencia de nucleótidos de un gen diana para supresión, que corresponde a una región formadora de estructuras dobles del ARNbc se puede denominar "secuencia diana". La región formadora de estructuras dobles del ARNbc puede corresponder a una parte de un gen diana que tiene al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900 o 1000 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la región formadora de estructuras dobles del ARNbc puede corresponder a más de aproximadamente 20-25 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 25-50 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 50-75 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 75-100 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 100-125 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 125-150 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 150-175 nucleótidos del gen diana o una secuencia de más de aproximadamente 175-200 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 200-250 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 250-275 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 275-300 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 300-325 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 325-350 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 350-400 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 400-450 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 450-500 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 500-550 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 550-600 nucleótidos del gen diana, más de aproximadamente 600-700 nucleótidos del gen diana o más de aproximadamente 700-1000 nucleótidos del gen diana dependiendo del tamaño del gen diana. La longitud de la región formadora de estructuras dobles puede depender de la longitud de las moléculas de ARNbc que pueden ser captadas por el organismo diana, por ejemplo, un insecto, y la longitud del ARNbc que puede ser procesado dentro de una célula de un organismo diana en fragmentos que dirigen la interferencia del ARN. La longitud de la región formadora de estructuras dobles también puede estar influida por el procedimiento de síntesis del ARNbc.

En algunas realizaciones, una región formadora de estructuras dobles de una molécula de ARNbc tiene una complementariedad perfecta (100 %) con una secuencia diana. No obstante, la identidad de secuencia absoluta entre la región formadora de estructuras dobles de una molécula de ARNbc y la secuencia diana no es necesaria. Se toleran las variaciones de secuencia que se pueden esperar debido a mutación genética, polimorfismo de la cepa o divergencia de evolución y se puede usar ARNbc que contenga una secuencia de nucleótidos formadora de estructuras dobles con inserciones, eliminaciones y mutaciones puntuales con relación a la secuencia diana para inhibir un gen diana. Las secuencias de nucleótidos de una región formadora de estructuras dobles de un ARNbc como se describen en la presente y la parte correspondiente del gen diana pueden ser sustancialmente complementarias, por ejemplo, las secuencias pueden compartir al menos aproximadamente 80 % de identidad, al menos aproximadamente 90 % de identidad, al menos aproximadamente 95 % de identidad, al menos aproximadamente 96 % de identidad, al menos aproximadamente 97 % de identidad, al menos aproximadamente 98 % de identidad o al menos aproximadamente 99 % de identidad, a lo largo de la secuencia diana. La región formadora de estructuras dobles de un ARNbc como se describe en la presente también puede definirse funcionalmente como una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con una parte de una transcripción del gen diana. La mayor longitud puede compensar una menor homología entre una región formadora de estructuras dobles de una molécula de ARNbc y su secuencia diana. La longitud de las secuencias idénticas de nucleótidos puede ser de al menos aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 o al menos aproximadamente 1000 bases.

Se puede diseñar una región formadora de estructuras dobles de una molécula de ARNbc contra cualquier secuencia diana, incluyendo una o más secuencias diana seleccionadas de un gen natural de una plaga o un patógeno. La secuencia diana se puede seleccionar de un gen natural de un organismo eucariota o un organismo no eucariota. Una secuencia diana puede incluir cualquier secuencia de cualquier especie, incluyendo, de modo no taxativo, bacterias, virus, hongos, plantas, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas, como plantas de cultivo, plantas ornamentales y plantas salvajes o no domesticadas, invertebrados, como artrópodos, anélidos, nematodos y moluscos, y vertebrados, como anfibios, peces, aves o mamíferos.

La secuencia diana puede ser una secuencia que se puede traducir (codificante) o puede ser una secuencia no codificante (como una secuencia reguladora no codificante) o ambas. Ejemplos no taxativos de secuencias diana que no se pueden traducir (no codificantes) incluyen: regiones sin traducción 5', promotores, potenciadores u otras regiones de transcripción no codificantes, regiones sin traducción 3', terminadores e intrones. Las secuencias diana también pueden incluir genes que codifican microARN, ARN pequeños interferentes, componentes del ARN de ribosomas o ribozimas, ARN pequeños nucleolares y otros ARN no codificantes (véase, por ejemplo, las secuencias de ARN no codificante proporcionadas al público en rfam.wustl.edu; Erdmann et ál. (2001) Nucleic Acids Res., 29:189-193; Gottesman (2005) Trends Genet., 21:399-404; Griffiths-Jones et ál. (2005) Nucleic Acids Res., 33:121-124, que se incorporan mediante referencia). Ejemplos no taxativos de secuencias diana que se pueden traducir (codificantes) incluyen: genes que codifican factores de transcripción, genes que codifican receptores, genes que codifican hormonas, genes de mantenimiento y genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis o el catabolismo de moléculas de interés (como, de modo no taxativo, aminoácidos, ácidos grasos y otros lípidos, azúcares y otros carbohidratos, polímeros biológicos y metabolitos secundarios incluyendo alcaloides, terpenoides, policétidos, péptidos no ribosómicos y metabolitos secundarios de origen biosintético mixto). Adicionalmente, las secuencias de nucleótidos diana se pueden determinar a partir de cualquier gen de planta, insecto, vírico, bacteriano o fúngico cuya función se haya establecido en la bibliografía. Se contempla que se pueden emplear diversos criterios en la selección de los genes diana. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos diana se puede determinar a partir de genes que tienen papeles importantes en la viabilidad, el crecimiento, el desarrollo y la reproducción e infecciosidad. Estos genes se pueden identificar mediante mutaciones de inactivación letal en Drosophila, C. elegans u otros organismos. El gen también puede ser uno cuyo producto de proteína tenga una rápida velocidad de recambio, de forma que la inhibición del ARNbc da como resultado una rápida disminución en el nivel de proteínas. En algunas realizaciones es ventajoso seleccionar un gen para el cual una pequeña caída en el nivel de expresión da como resultado efectos perjudiciales para el organismo.

En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen natural de un insecto. En algunas realizaciones, la secuencia diana se puede seleccionar de un gen natural de cualquier especie de insecto que provoque daños a las plantas de cultivo y posteriores pérdidas en el rendimiento (una plaga de insecto). Ejemplos no taxativos de plagas de insectos incluyen: áfido de la hoja de maíz, gusano cogollero, gusano cortador africano, gusano del maíz, cicálida del maíz, minero de la roya del maíz, gusano de raíz de maíz occidental, gusano de raíz de maíz del norte, gusano de raíz de maíz mexicano, gusano de raíz de maíz del sur, gusano cortador, gusano de la semilla del maíz, gusano de elatérido, gusano del tallo del trigo, escarabajo del pepino manchado, chinche verde, chinche marrón, áfido del grano de soja y gusano barreno del grano de soja. Los genes en el insecto pueden atacarse en estado maduro (adulto), inmaduro (larva) o de huevo. En algunas realizaciones, el gen diana de la supresión puede codificar una proteína esencial, cuya función prevista se selecciona del grupo que consiste en formación de músculos, formación de la hormona juvenil, regulación de la hormona juvenil, regulación y transporte iónico, síntesis enzimática digestiva, mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de espermatozoides, síntesis de feromonas, percepción de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación desarrollo y diferenciación de patas, formación de huevos, maduración de larvas, formación enzimática digestiva, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo energético, respiración y apoptosis. Cuando la secuencia diana se deriva de un gen esencial para la viabilidad o la infecciosidad del insecto, su regulación negativa da como resultado una menor capacidad del insecto para sobrevivir e infectar a su hospedador. Por lo tanto, dicha regulación negativa da como resultado un "efecto perjudicial" sobre la viabilidad del mantenimiento y la infecciosidad del insecto, en el sentido de que evita o reduce la capacidad del insecto de alimentarse y sobrevivir a base de nutrientes derivados de las células hospedadoras. En virtud de esta reducción en la viabilidad e infecciosidad del insecto, se facilita la resistencia y/o la mejor tolerancia a la infestación por parte de un insecto. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen cuyo producto de proteína tiene una rápida velocidad de recambio, de forma que la inhibición del ARNbc da como resultado una rápida disminución en los niveles de proteína. En algunas realizaciones es ventajoso seleccionar un gen para el cual una pequeña caída en el nivel de expresión da como resultado efectos perjudiciales para el insecto.

En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen que se expresa en el intestino del insecto. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen que comparte homología sustancial con las secuencias de nucleótidos de genes expresados en el intestino conocidos que codifican componentes de proteína de la V-ATPasa de protón de membrana plasmática (Dow et ál., 1997, J. Exp. Biol., 200:237-245; Dow, Bioenerg. Biomemb., 1999, 31:75-83). Este complejo de proteína es el único energizante del transporte iónico epitelial y es responsable de la alcalinización del lumen del intestino medio. La V-ATPasa también se expresa en el túbulo de Malpighi, una extensión del intestino distal de insecto que funciona en equilibrio fluido y detoxificación de los compuestos externos de forma análoga a un órgano de riñón de un mamífero.

En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen diana que está implicado en el crecimiento, el desarrollo y la reproducción de un insecto. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen que codifica el gen CHD3. El gen CHD3 en Drosophila melanogaster codifica una proteína con actividad de helicasa de ADN dependiente de ATP implicada en el montaje/desmontaje de cromatina en el núcleo. Se han encontrado secuencias similares en diversos organismos como Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans y Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen que codifica el gen de 13-tubulina. La familia del gen de beta-tubulina codifica proteínas asociadas con microtúbulos que constituyen el citoesqueleto celular. Se encuentran secuencias relacionadas en diversos organismos como Caenorhabditis elegans y Manduca Sexta.

En algunas realizaciones, la secuencia diana se puede seleccionar de un gen natural de una plaga de nematodos. Los ejemplos no taxativos de plagas de nematodos incluyen: Nematodos de anquilosis de Columbia, nematodo de anquilosis del norte, nematodo de anguilosis del sur, nematodo de anguilosis, nematodo de anguilosis falsa, nematodo del quiste del maíz, nematodo del quiste del grano de soja, nematodo del quiste de la patata, nematodo del quiste de la remolacha, nematodo del aguijón, nematodo del anillo, nematodo espiral, nematodo lanza, nematodo daga, nematodo aguja, nematodo de lesión, nematodo de la atrofia radicular, nematodo achaparrado, nematodo dorado y nematodo de la pudrición de la patata. En algunas realizaciones, el gen diana de la supresión puede codificar una proteína esencial, cuya función prevista se selecciona del grupo que consiste en formación de músculos, regulación y transporte iónico, síntesis enzimática digestiva, mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación, desarrollo y diferenciación de espermatozoides, formación de huevos, formación enzimática digestiva, neurotransmisión, división celular, metabolismo energético, respiración y apoptosis. Mientras que la secuencia diana se deriva de un gen esencial para la viabilidad o la infecciosidad del nematodo, su regulación negativa da como resultado una menor capacidad del nematodo para sobrevivir e infectar su hospedador. Por lo tanto, dicha regulación negativa da como resultado un "efecto perjudicial" sobre la viabilidad del mantenimiento y la infecciosidad del nematodo, en el sentido de que evita o reduce la capacidad del nematodo de alimentarse y sobrevivir a base de nutrientes derivados de las células hospedadoras. En virtud de esta reducción en la viabilidad e infecciosidad del nematodo, se facilita la resistencia y/o la mejor tolerancia a la infestación por parte de un nematodo. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen cuyo producto de proteína tiene una rápida velocidad de recambio, de forma que la inhibición del ARNbc da como resultado una rápida disminución en los niveles de proteína. En algunas realizaciones es ventajoso seleccionar un gen para el cual una pequeña caída en el nivel de expresión da como resultado efectos perjudiciales para el nematodo.

En algunas realizaciones, la secuencia diana se puede seleccionar de un gen natural de un hongo. Los ejemplos no taxativos de hongos incluyen: Macrophomina phaseolini, Puccinia sorghi, Ustilago maydis, Exserohilum pedicellatum, Fusarium verticillioides, Fusarium verticillioides y Sphacelotheca reiliana. En algunas realizaciones, el gen diana para la supresión puede codificar una proteína esencial, cuya función prevista se selecciona del grupo que consiste en división celular, metabolismo energético, formación de paredes celulares, formación de esporas, formación de hifas y síntesis enzimática digestiva. Cuando la secuencia diana se deriva de un gen esencial para la viabilidad o la infecciosidad del hongo, su regulación negativa da como resultado una menor capacidad del hongo para sobrevivir e infectar a su hospedador. Por lo tanto, dicha regulación negativa da como resultado un "efecto perjudicial" sobre la viabilidad del mantenimiento y la infecciosidad del hongo, en el sentido de que evita o reduce la capacidad del hongo de alimentarse y sobrevivir a base de nutrientes derivados de las células hospedadoras. En virtud de esta reducción en la viabilidad e infecciosidad del hongo, se facilita la resistencia y/o la mejor tolerancia a la infestación por parte de un hongo. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen cuyo producto de proteína tiene una rápida velocidad de recambio, de forma que la inhibición del ARNbc da como resultado una rápida disminución en los niveles de proteína. En algunas realizaciones es ventajoso seleccionar un gen para el cual una pequeña caída en el nivel de expresión da como resultado efectos perjudiciales para el hongo.

En algunas realizaciones, se puede desear que el ARNbc inhiba la expresión de un gen diana en más de una especie. En algunas realizaciones, se puede desear inhibir la expresión de gen diana en dos o más especies de insectos, por ejemplo, especies de gusanos de raíz del maíz. En tales realizaciones, se puede seleccionar una secuencia diana de un gen o una parte de un gen que se conserva altamente en las especies seleccionadas. Por ejemplo, la secuencia diana se puede seleccionar de un gen o una parte de un gen que tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad, al menos aproximadamente 85 % de identidad, al menos aproximadamente 90 % de identidad, al menos aproximadamente 95 % de identidad, al menos aproximadamente 96 % de identidad, al menos aproximadamente 97 % de identidad, al menos aproximadamente 98 % de identidad o al menos aproximadamente 99 % de identidad en las especies seleccionadas.

En algunas realizaciones, se puede desear que el ARNbc presente actividad específica para la especie. En algunas realizaciones, una secuencia diana se puede seleccionar de un gen natural o una parte de un gen natural de la especie diana que tiene un bajo grado de identidad de secuencia con los genes correspondientes en otras especies. En algunas realizaciones, la secuencia diana se puede seleccionar de un gen o una parte de un gen donde el grado de identidad de secuencia con los genes correspondientes en otras especies es menos de aproximadamente 80 %. En otras realizaciones, la secuencia diana se puede seleccionar de un gen o una parte de un gen donde el grado de identidad de secuencia con los genes correspondientes en otras especies es menos de aproximadamente 70 %. En otras realizaciones, la secuencia diana se puede seleccionar de un gen o una parte de un gen donde el grado de identidad de secuencia con los genes correspondientes en otras especies es menos de aproximadamente 60 %. En algunas realizaciones, una secuencia diana se selecciona de un gen o una parte de un gen que se conserva escasamente entre las especies de insectos individuales o entre los insectos y otros organismos. En algunas realizaciones, una secuencia diana se puede seleccionar de un gen natural de la especie diana que no tiene homólogos conocidos en otros organismos. En algunas realizaciones, una secuencia diana se puede seleccionar de un gen natural de la especie diana que no tiene homólogos conocidos en una planta o un animal vertebrado.

Vectores y expresión

Diversas realizaciones descritas en la presente se refieren a una construcción de expresión con modificación genética para transcripción in vivo e in vitro de ARN que comprende un promotor unido de forma operativa a un elemento que codifica ARN y un terminador de la transcripción que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, el ARN puede ser ARNbc. En otras realizaciones, el ARN puede codificar una proteína o ser un ARN regulador. Las construcciones de expresión con modificaciones genéticas descritas en la presente pueden, ventajosamente, formar parte de un vector replicable. En las realizaciones descritas en la presente, la eficacia de la producción de ARN a partir de la construcción de expresión de ARN con modificación genética se mejora evitando o minimizando la trascripción de ARN no deseada de la estructura base del vector. En algunas realizaciones, el tamaño de la estructura base del vector se reduce para minimizar la transcripción no deseada.

En las realizaciones descritas en la presente, la construcción de expresión con modificación genética comprende un promotor unido de forma operativa a un elemento que codifica el ARNbc que comprende: una secuencia de nucleótidos en orientación con sentido, sustancialmente idéntica a una secuencia diana, una secuencia de nucleótidos con orientación antisentido, sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleótidos en orientación con sentido y una secuencia de nucleótidos flanqueada por las secuencias de nucleótidos con sentido y antisentido complementarias que codifica uno o más nucleótidos excluidos de la formación de estructuras dobles de las regiones complementarias en la transcripción del ARN. En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARN con modificación genética comprende un promotor unido de forma operativa al elemento que codifica el ARNbc que comprende, en una dirección de 5' a 3': una secuencia de nucleótidos en orientación con sentido, que es sustancialmente idéntica a una secuencia diana, una secuencia de nucleótidos que codifica una región de bucle de una molécula de ARNbc y una secuencia de nucleótidos con orientación antisentido, sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleótidos en orientación con sentido. En otras realizaciones, la construcción de expresión de ARN con modificación genética comprende un promotor unido de forma operativa a un elemento que codifica el ARNbc que comprende en una dirección de 5' a 3': una secuencia de nucleótidos con orientación antisentido, que es sustancialmente complementaria a una secuencia diana, una secuencia de nucleótidos que codifica una región de bucle de una molécula de ARNbc y una secuencia de nucleótidos en orientación con sentido, sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleótidos con orientación antisentido. La orientación de la secuencia de nucleótidos que codifica una región de bucle de una molécula de ARNbc puede ser con sentido o antisentido. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una región de bucle de una molécula de ARNbc es sustancialmente idéntica a una parte de una secuencia con sentido o antisentido de un gen diana para la supresión mediante la molécula de ARNbc. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una región de bucle de una molécula de ARNbc es sustancialmente idéntica a una parte de una secuencia con sentido o antisentido de un gen que no es el gen diana para la supresión mediante la molécula de ARNbc. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una región de bucle de una molécula de ARNbc es una secuencia de nucleótidos con modificación genética. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una región de bucle de una molécula de ARNbc codifica un aptámero.

En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARN con modificación genética comprende un promotor unido de forma operativa al elemento que codifica el ARNbc que comprende, en dirección de 5' a 3', una secuencia de nucleótidos de orientación con sentido, sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos de al menos una parte de un gen diana y una secuencia de nucleótidos con orientación antisentido, que es más corta que la secuencia de nucleótidos en orientación con sentido y es sustancialmente complementaria del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos en orientación con sentido. En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARN con modificación genética comprende un promotor unido de forma operativa al elemento que codifica el ARNbc que comprende, en dirección de 5' a 3', una secuencia de nucleótidos de orientación con sentido, sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos de una parte de un gen diana y una secuencia más larga de nucleótidos con orientación antisentido, que es sustancialmente complementaria de una secuencia de nucleótidos de al menos una parte de un gen diana y que comprende en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente complementaria de la secuencia de nucleótidos en orientación con sentido. En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARN con modificación genética comprende un promotor unido de forma operativa al elemento que codifica el ARNbc que comprende, en dirección de 5' a 3', una secuencia de nucleótidos de orientación antisentido, sustancialmente complementaria a al menos una parte de una secuencia de nucleótidos de un gen diana y una secuencia de nucleótidos en orientación con sentido, que es más corta que la secuencia de nucleótidos con orientación antisentido y que es sustancialmente complementaria del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos con orientación antisentido. En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARN con modificación genética comprende un promotor unido de forma operativa al elemento que codifica el ARNbc que comprende, en dirección de 5' a 3', una secuencia de nucleótidos de orientación antisentido, sustancialmente complementaria a una parte de una secuencia de nucleótidos de un gen diana y una secuencia más larga de nucleótidos en orientación con sentido, que es sustancialmente idéntica a al menos una parte de un gen diana y comprende en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente complementaria de la secuencia de 20 nucleótidos con orientación antisentido.

En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARN con modificación genética comprende un promotor unido de forma operativa a un elemento que codifica proteínas.

En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARN con modificación genética comprende un promotor unido de forma operativa a un elemento que codifica ARN regulador. En algunas realizaciones, el ARN regulador se selecciona del grupo que consiste en un ARN antisentido, un ARN CRISPR, un ARN largo no codificante, un microARN, ARN de interacción con piwi, un ARN pequeño interferente y un ARN que actúa en trans.

El promotor utilizado en la construcción de expresión de ARN con modificación genética se puede seleccionar según la naturaleza del sistema de expresión en el que se espera que funcione la construcción de expresión de ARN con modificación genética (por ejemplo, una célula hospedadora procariota o eucariota) siempre que el promotor y el terminador de transcripción que comprenden la secuencia de la SEQ ID NO: 13 estén en combinación funcional. El promotor puede ser un promotor constitutivo o inducible. En algunas realizaciones, se puede usar un promotor de bacteriófagos, por ejemplo T7, T3, SV40 o SP6, en la construcción de expresión de ARN con modificación genética, ya que estos proporcionan un alto nivel de transcripción que depende solamente de la unión de la polimerasa de ARN adecuada. Cuando la célula hospedadora no expresa la polimerasa de ARN adecuada, se puede proporcionar un transgén que codifique polimerasa de T7, T3, SV40 o SP6 unido de forma operativa a un promotor reconocido por la célula hospedadora en el mismo u otro vector que la construcción de expresión de ARN con modificación genética. El promotor reconocido por la célula hospedadora puede ser un promotor inducible o un promotor constitutivamente activo. En algunas realizaciones, se puede usar un promotor sinérgico, reconocido por polimerasas que expresa el genoma hospedador, en la construcción de expresión de ARN con modificación genética. Ejemplos de promotores adecuados para uso con hospedadores bacterianos incluyen, de modo no taxativo, T5, promotor de p-lactamasa, promotor de galactosa de E. coli, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptófano (trp), promotor de operón lactosa (lac), promotor de lacUV5, promotor de trc y promotor de tac. En algunas realizaciones, el promotor utilizado en la construcción de expresión de ARN con modificación genética puede ser un promotor ARN Pol I, ARN Pol II o ARN Pol III. En algunas realizaciones, el promotor utilizado en la construcción de expresión de ARN con modificación genética puede ser un promotor Pol III. Ejemplos de promotores Pol III incluyen, de modo no taxativo, promotor de U6, promotor de ARNt, promotor de LTR retrovírico, promotor de VA1 adenovirus, promotor de ARN 5SR, promotor de ARN 7SK, promotor de ARN 7SL y promotor de a Rn H1. En algunas realizaciones, se puede usar un promotor reconocido por levadura, por ejemplo, el promotor de ADR1, promotor del factor a de tipo salvaje o promotor de ADH2/GAPD híbrido, en la construcción de expresión de ARNbc con modificación genética.

En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARN con modificación genética puede comprender además secuencias de nucleótidos adicionales que afectan ventajosamente la transcripción del elemento que codifica el ARN y/o la estabilidad de una transcripción resultante. Por ejemplo, la construcción de expresión de ARN con modificación genética puede comprender además una o más secuencias potenciadoras o de poliadenilación.

Las secuencias de terminación transcripcional pueden ser específicas de la polimerasa o no específicas, sin embargo, los terminadores transcripcionales seleccionados para su uso en las realizaciones de la presente deberían formar una "combinación funcional" con el promotor seleccionado, lo que significa que la secuencia de terminación debería poder terminar la transcripción por el tipo de polimerasa de ARN que se inicia en el promotor. Por ejemplo, un promotor de ARN pol II eucariota y terminadores de ARN pol II eucariota, un promotor de t 7 y terminadores de T7, un promotor de T3 y terminadores de T3, un promotor reconocido por levadura y secuencias de terminación reconocidas por levadura, etc. formarían, en general, una combinación funcional.

Varias realizaciones se refieren a una construcción de expresión con modificación genética que comprende un promotor y dos o más terminadores transcripcionales en combinación funcional para la terminación eficaz de la transcripción. En algunas realizaciones, un promotor de T7, un terminador de PTH y un terminador de pET-T7 forman una combinación funcional.

Una secuencia de nucleótidos que codifica la endonucleasa específica de sitio puede proporcionarse en un vector que comprende la construcción de expresión de ARN con modificación genética o puede proporcionarse en un vector que codifica una ARN polimerasa, por ejemplo, polimerasa T7, T3, SV40 o SP6 y, opcionalmente, se puede unir operativamente a un promotor reconocido por la célula hospedadora. En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARN con modificación genética comprende uno o más sitios de escisión de endonucleasa específicos del sitio 3' respecto de una o más secuencias de terminación. En algunas realizaciones, la construcción de expresión de ARN con modificación genética comprende uno o más sitios de restricción de ZFN, sitios de restricción de TALEN o sitios de restricción de meganucleasa seleccionados del grupo que consiste en I-Anil, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanM1, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeM1, I-MsoI, I-TevI, I-TevII y I-TevIII, 3' respecto de la secuencia de terminación de la transcripción que comprende el terminador PTH y el terminador pET-T7.

Las construcciones de expresión del ARN con modificación genética que se describen en la presente, tales como las establecidas en las SEQ ID NO: 2, 4, 14, 15 y 20, se pueden construir a partir de elementos de secuencia de componentes y se pueden incorporar a un vector adecuado usando técnicas de ADN recombinante estándar conocidas en la técnica. Hay muchos vectores disponibles a estos efectos, y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico que se insertará en el vector y de la célula hospedadora particular que se transformará con el vector. Los ejemplos de vectores adecuados para su uso de acuerdo con las realizaciones de la presente incluyen, de modo no taxativo, plásmidos, cósmidos, plastomas, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura y bacteriófagos. La estructura principal del vector puede contener varios componentes dependiendo de la función del vector (amplificación de ADN o expresión de ADN) y de la célula hospedadora particular con la que es compatible. Por ejemplo, la estructura base del vector puede contener uno o más sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción que permiten la inserción de una molécula de ácido nucleico de forma determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a antibióticos, adecuado para su uso en la identificación y selección de células transducidas con el vector, una secuencia promotora que impulsa la expresión del transgén en la célula hospedadora, y un origen de replicación. Los ejemplos de vectores bacterianos disponibles incluyen, de modo no taxativo, los vectores pUC19, pUC18, pBluescript, pDEST, pBAD, pGEM, pGEX, pACYC184y pBR322.

En algunas realizaciones, se minimiza el tamaño de la estructura principal del vector para reducir la cantidad de molde disponible para la transcripción no deseada. En algunas realizaciones, un vector mínimo adecuado para su uso de acuerdo con las realizaciones de la presente no comprende uno o más marcadores seleccionables basados en proteínas, tales como marcadores de resistencia a antibióticos, espaciador no esencial y secuencias basura que no codifican una función definida. En algunas realizaciones, un vector mínimo adecuado para su uso de acuerdo con las realizaciones de la presente consiste básicamente en un sitio de clonación múltiple, un gen marcador seleccionable y un origen de replicación. Un vector mínimo adecuado para su uso de acuerdo con las realizaciones de la presente puede ser de menos de 3 kb. En algunas realizaciones, el vector es de menos de 2,7 kb. En algunas realizaciones, el vector es de menos de 2,6 kb. En algunas realizaciones, el vector es de menos de 2,5 kb. En algunas realizaciones, el vector es de menos de 2,4 kb. En algunas realizaciones, el vector es de menos de 2,3 kb. En algunas realizaciones, el vector es de menos de 2,2 kb. En algunas realizaciones, el vector es de menos de 2,1 kb. En algunas realizaciones, el vector es de menos de 2,0 kb. En algunas realizaciones, el vector es de menos de 1,9 kb. En algunas realizaciones, una o más construcciones de expresión de ARN con modificación genética y/o uno o más elementos que codifican el ARN se clonan en el vector mínimo para alcanzar un tamaño mínimo de al menos 3 kb.

Las moléculas de ARN codificadas por las construcciones de expresión con modificación genética descritas en la presente se pueden sintetizar in vitro o in vivo en una célula hospedadora. La polimerasa de ARN endógeno de la célula hospedadora puede mediar la transcripción in vivo, o polimerasa de ARN clonada, tales como, polimerasa de ARN bacteriófago (por ejemplo, T3, T7, SV40, SP6), se puede usar para la transcripción in vivo o in vitro.

Se pueden introducir uno o más vectores que comprenden una construcción de expresión con modificación genética, tal como se describe anteriormente, en una gran variedad de microorganismos hospedadores procariotas y eucariotas para producir las moléculas de ARN. Varias realizaciones descritas en la presente se refieren a una célula hospedadora que expresa el ARN de una construcción de expresión con modificación genética diseñada para minimizar la transcripción no productiva de la secuencia no funcional. Las células hospedadoras adecuadas incluyen, de modo no taxativo, hongos, hongos filamentosos, levadura, algas y bacterias. Para prevenir la degradación de las moléculas de ARNbc transcritas en la célula hospedadora, se puede usar un hospedador carente de RNasa III.

En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula eucariota. Las células hospedadoras eucariotas adecuadas incluyen, de modo no taxativo, células fúngicas, células de algas, células de insecto y células vegetales. Las células hospedadoras fúngicas adecuadas incluyen, de modo no taxativo, células de levadura y células fúngicas filamentosas.

En una realización, la célula hospedadora fúngica es una levadura. En una realización, la levadura es de uno de los siguientes géneros: Candida, Hansenula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces y Yarrowia. En algunas realizaciones, la célula de levadura es Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia quercuum, Pichia pijperi, Pichia stipitis, Pichia methanolica, Pichia angusta, Kluyveromyces lactis, Candida albicans o Yarrowia lipolytica.

En otras realizaciones, la célula hospedadora es una célula procariota. Las células procariotas adecuadas incluyen las células bacterianas gram positivas, gram negativas y gram variables. Las células hospedadoras procariotas adecuadas incluyen, de modo no taxativo, especies de: Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Acinetobacter Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacterium, Butyrivibrio, Buchnera, Campestris, Camplyobacter, Clostridium, Corynebacterium, Chromatium, Coprococcus, Escherichia, Enterococcus, Enterobacter, Erwinia, Fusobacterium, Faecalibacterium, Francisella, Flavobacterium, Geobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Ilyobacter, Microbacterium, Mesorhizobium, Methylobacterium, Methylobacterium, Mycobacterium, Neisseria, Pantoea, Pseudomonas, Prochlorococcus, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodopseudomonas, Roseburia, Rhodospirillum, Rhodococcus, Scenedesmun, Streptomyces, Streptococcus, Synnecoccus, Staphylococcus, Serratia, Salmonella, Shigella, Thermoanaerobacterium, Tropheryma, Tularensis, Temecula, Thermosynechococcus, Thermococcus, Ureaplasma, Xanthomonas, Xylella, Yersinia y Zymomonas. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana no es patógena en seres humanos.

En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es de la especie Bacillus, por ejemplo, B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, B. lentus, B. circulans, B. pumilus, B. lautus, B. coagulans, B. brevis, B. licheniformis, B. clausii, B. stearothermophilus y B. amyloliquefaciens. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es de la especie Clostridium, por ejemplo, C. acetobutylicum, C. tetani E88, C. lituseburense, C. saccharobutylicum, C. perfringens y C. beijerinckii. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es de la especie Corynebacterium, por ejemplo, C. glutamicum y C. acetoacidophilum. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es de la especie Escherichia, por ejemplo, E. coli. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es una cepa de E. coli carente de RNasa III, por ejemplo, E. coli HT115 (DE3). En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es de la especie Erwinia, por ejemplo, E. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herbicola, E. punctata y E. terreus. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es de la especie Pantoea, por ejemplo, P. citreay P. agglomerans. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es de la especie Pseudomonas, por ejemplo, P. pudita, P. mevalonii y P. sp. D-0110. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es de la especie Streptococcus, por ejemplo, S. equisimiles, S. pyogenes y S. uberis. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es de la especie Streptomyces, por ejemplo, S. ambofaciens, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus y S. lividans. En algunas realizaciones, la célula hospedadora bacteriana es de la especie Zymomonas, por ejemplo, Z. mobilis y Z. lipolytica.

En algunas realizaciones, los microorganismos, tales como bacterias, algas y hongos, que se sabe que habitan el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizosfera (la tierra que rodea las raíces de las plantas) de una gran variedad de cultivos importantes pueden ser células hospedadoras deseadas para la producción y administración de ARNbc. Para prevenir la degradación de las moléculas de ARNbc transcritas en los microorganismos hospedadores, se puede usar un hospedador carente de RNasa III. Son particularmente interesantes los microorganismos, como las bacterias, por ejemplo, de los géneros Bacillus (que incluyen las especies y subespecies B. thuringiensis kurstaki HD-1, B. thuringiensis kurstaki HD-73, B. thuringiensis sotto, B. thuringiensis berliner, B. thuringiensis thuringiensis, B. thuringiensis tolworthi, B. thuringiensis dendrolimus, B. thuringiensis alesti, B.

thuringiensis galleriae, B. thuringiensis aizawai, B. thuringiensis subtoxicus, B. thuringiensis entomocidus, B. thuringiensis tenebrionis y B. thuringiensis san diego); Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Zanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, particularmente la levadura, por ejemplo, de los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son particularmente interesantes dichas especies bacterianas de fitosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodobacter sphaeroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes eutrophus y Azotobacter vinlandii; y las especies de levadura de fitosfera como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans.

Varias realizaciones se refieren a un sistema de expresión celular para producir el ARNbc con mayor eficacia transcripcional de una construcción de expresión con modificación genética diseñada para minimizar la transcripción no productiva de la secuencia no funcional. En un aspecto, se proporciona un procedimiento para producir ARNbc mediante el cultivo de células hospedadoras que comprenden una construcción de expresión con modificación genética, tal como se describe en la presente. En algunas realizaciones, la célula hospedadora expresa el ARNbc de una construcción de expresión con modificación genética que comprende la SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la célula hospedadora expresa el ARNbc de construcción de expresión con modificación genética que comprende la SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones, la célula hospedadora expresa ARNbc de una construcción de expresión con modificación genética que comprende la SEQ ID NO: 14. En otras realizaciones, la célula hospedadora expresa ARNbc de una construcción de expresión con modificación genética que comprende la SEQ ID NO: 15. En otras realizaciones, la célula hospedadora expresa ARNbc de una construcción de expresión con modificación genética que comprende la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula bacteriana, por ejemplo, una célula E. coli, que carece de RNasa III.

Los procedimientos de empleo de tecnologías de ADN recombinante para preparar una construcción de ADN recombinante y un vector que codifica una molécula de ARN de interés y para transformar y generar células hospedadoras que transcriben la molécula de ARN están fácilmente disponibles en la técnica.

C. Aplicación de ARNbc

Varias realizaciones se refieren a composiciones y procedimientos para administrar el ARNbc transcrito de una construcción de expresión con modificación genética diseñada para minimizar la transcripción no productiva de la secuencia no funcional, tal como se describe anteriormente, a un organismo diana. En algunas realizaciones, el ARNbc se sintetiza in vitro a partir de la construcción de expresión con modificación genética y se proporciona al organismo diana. En otras realizaciones, el ARNbc proporcionado al organismo diana se transcribe en una célula hospedadora (in vivo) a partir de la construcción de expresión con modificación genética.

Determinadas realizaciones se refieren a un procedimiento para administrar ARNbc a un organismo diana, que comprende expresar el ARNbc de una construcción de expresión con modificación genética, tal como se describe anteriormente, en una célula hospedadora y proporcionar el ARNbc transcrito de la célula hospedadora al organismo diana. En algunas realizaciones, el ARNbc transcrito de la célula hospedadora se aísla de la célula hospedadora y se purifica antes de proporcionarse al organismo diana. Por ejemplo, el ARNbc se puede purificar a partir de un lisado de célula hospedadora por extracción con un solvente o resina, precipitación, electroforesis, cromatografía o una combinación de estos. De manera alternativa, el ARNbc se puede usar con mínima purificación o sin esta. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporciona una célula hospedadora que comprende ARNbc transcrito de una construcción de expresión con modificación genética o un lisado preparado a partir de la célula hospedadora que expresa el ARNbc al organismo diana. En algunas realizaciones, el ARNbc elimina un gen esencial del organismo diana. En otras realizaciones, el ARNbc elimina un gen esencial de una plaga o patógeno del organismo diana. Por ejemplo, el ARNbc puede eliminar un gen vírico.

Tal como se describe anteriormente, una célula hospedadora, tal como una bacteria o levadura, se puede modificar genéticamente para producir el ARNbc a partir de una construcción de expresión con modificación genética, tal como se describe en la presente. Estas células hospedadoras pueden ser consumidas por una plaga de insecto u otro organismo diana. Cuando se absorbe, el ARNbc puede iniciar una respuesta de iARN, provocando la degradación del ARNm diana y, cuando el ARNm diana codifica una proteína esencial, el debilitamiento o eliminación del organismo que se alimenta. Tal como se muestra en el Ejemplo 3, la alimentación in vitro de moléculas de ARNbc transcrito que comprenden secuencias de ARN de escarabajo de la patata (CPB), moléculas de ARNbc transcrito en bacterias que comprenden secuencias de ARN de CBP, o bacterias que expresan el ARNbc que comprenden secuencias de ARN de CPB transcritas a partir de una construcción de expresión de ARNbc con modificación genética a larvas de CPB dan como resultado la muerte o inhibición del desarrollo y diferenciación de las larvas que ingieren las composiciones de ARNbc. Todas las preparaciones de ARNbc de CPB mostraron una actividad significativa contra las larvas de CPB, en las que la menor concentración (0,00002 mg/ml) de la preparación de bacterias que expresan ARNbc de CPB inhibe el 87,5 % del crecimiento de CPB. La actividad de las bacterias que expresan ARNbc en la inhibición del crecimiento y desarrollo del organismo diana indica que las células hospedadoras con modificación genética para expresar eficazmente el ARNbc como se describe en la presente se pueden proporcionar directamente a un organismo diana, por ejemplo, mediante la alimentación, para eliminar la actividad de un gen diana sin la necesidad de pasos de purificación de ARN adicionales.

La célula hospedadora, que en muchas aplicaciones es una célula bacteriana, de levadura o de algas, se debería eliminar preferentemente antes de proporcionarse a un organismo diana o a una fuente de alimento de un organismo diana. Por ejemplo, cuando se usa una bacteria que expresa el ARNbc como pesticida biológico, u otra aplicación donde se usa una célula hospedadora que expresa ARNbc con modificación genética en un ambiente donde es probable el contacto con seres humanos u otros mamíferos. Las células hospedadoras que expresan el ARNbc pueden ser eliminadas por cualquier medio que no dé como resultado una degradación significativa del ARNbc. Por ejemplo, las células hospedadoras pueden ser eliminadas mediante tratamiento térmico, mediante tratamiento químico, por ejemplo, tratamiento con fenol o formaldehído, o mediante interrupción mecánica. En algunas realizaciones, las células hospedadoras se eliminan sin lisis considerable. En algunas realizaciones, las células hospedadoras, por ejemplo, células bacterianas, se calientan hasta una temperatura suficiente para eliminar las células sin provocar lisis. Por ejemplo, las células hospedadoras se pueden calentar hasta una temperatura de al menos 59 °C, 60 °C, 61 °C, 62 °C, 63 °C, 64 °C, 65 °C, 66 °C, 67 °C, 68 °C, 69 °C, 70 °C, 71 °C, 72 °C, 73 °C, 74 °C o al menos 75 °C.

En algunas realizaciones, la célula hospedadora que expresa el ARNbc con modificación genética se lisa y el lisado celular se proporciona a un organismo diana o a una fuente de alimento de un organismo diana. Las células hospedadoras que expresan el ARNbc pueden ser lisadas por cualquier medio que no dé como resultado una degradación significativa del ARNbc. Por ejemplo, las células hospedadoras se pueden lisar mediante congelacióndescongelación, mediante tratamiento con un producto químico, por ejemplo, un detergente, tolueno o hidróxido de sodio, mediante tratamiento enzimático o mediante interrupción mecánica, por ejemplo, mediante homogeneización. En algunas realizaciones, el lisado bruto se proporciona a un organismo diana o a una fuente de alimento de un organismo diana. En otras realizaciones, un lisado parcialmente purificado o ARNbc expresado en la célula hospedadora aislado se proporciona a un organismo diana o a una fuente de alimento de un organismo diana.

Otra realización se refiere a procedimientos y composiciones para prevenir o inhibir una enfermedad vírica en el organismo diana, por ejemplo, un mamífero, un pájaro, un artrópodo o un pez. Los ejemplos específicos de organismos diana incluyen, de modo no taxativo, cerdos, vacas, bisontes, caballos, cabras, pollos, codorniz, patos, gansos, pavos, camarón, langostinos, langosta, cangrejo, abejas melíferas, salmón, tilapia, róbalo, carpa y bagre. En una realización, un ARNbc que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos una parte de una transcripción de ARN de un gen vírico se administra a un organismo diana, de modo que se silencie la expresión del gen vírico diana. En una realización, una composición de ARNbc antivírico se incorpora a una fuente de alimento o se aplica a la superficie de una fuente de alimento, por ejemplo, una planta cultivada, para su consumo por un organismo diana. En un aspecto, la composición de ARNbc antivírico comprende las moléculas de ARNbc transcritas a partir de una construcción de expresión con modificación genética diseñada para minimizar la transcripción no productiva de una secuencia no funcional, tal como se describe anteriormente. En otro aspecto, la composición de ARNbc antivírico comprende células hospedadoras que expresan ARNbc eliminadas, tal como se describe anteriormente o un lisado de estas. En algunas realizaciones, una célula bacteriana eliminada por calor, no lisada, que comprende una construcción de expresión con modificación genética diseñada para minimizar la transcripción no productiva de una secuencia no funcional, tal como se describe anteriormente, se suministra a un organismo diana que se selecciona del grupo que consiste en mamíferos, pájaros, artrópodos o peces. En una realización, el organismo diana es una gamba o langostino y la construcción de expresión con modificación genética codifica un ARNbc que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria con al menos una parte de una transcripción de ARN de un gen del virus del síndrome de la mancha blanca, Monodon baculovirus, virus de la necrosis del hepatopáncreas baculovírica, virus de la necrosis hematopoyética, virus de la cabeza amarilla, virus del síndrome de Taura, virus de la mionecrosis infecciosa, Macrobrachium rosenbergii nodavirus, virus Laem-Singh o virus Mourilyan. En una realización, el organismo diana es un pez y la construcción de expresión con modificación genética codifica un ARNbc que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos una parte de una transcripción de ARN de un gen del virus de la necrosis hematopoyética epizoótica, Iridovirus de la dorada del Mar Rojo, herpesvirus de la carpa koi, virus de la necrosis hematopoyética infecciosa, virus de la septicemia hemorrágica vírica, virus de la viremia primaveral de la carpa, virus de la anemia infecciosa del salmón o virus de la necrosis nerviosa vírica.

Varias realizaciones se refieren a composiciones y procedimientos para controlar las infecciones por plagas de invertebrados. En algunas realizaciones, se proporciona un sistema de administración para la administración de composiciones pesticidas de ARNbc a plagas de invertebrados a través de su exposición a una dieta que contiene las composiciones pesticidas de ARNbc. En una realización, se incorporan composiciones pesticidas de ARNbc a una fuente de alimento de la plaga o se aplican a la superficie de una fuente de alimento de la plaga, por ejemplo, una planta cultivada, para su consumo por una plaga de invertebrado. En un aspecto, las composiciones pesticidas de ARNbc comprenden las moléculas de ARNbc purificado transcritas a partir de una construcción de expresión con modificación genética diseñada para minimizar la transcripción no productiva de una secuencia no funcional, tal como se describe anteriormente. En otro aspecto, las composiciones pesticidas de ARNbc comprenden células hospedadoras que expresan ARNbc eliminadas, no lisadas, tal como se describe anteriormente. En otro aspecto, las composiciones pesticidas de ARNbc comprenden el lisado no purificado o mínimamente purificado de las células hospedadoras que expresan ARNbc, tal como se describe anteriormente. Las composiciones pueden contener, además del ARNbc, las células hospedadoras o el lisado, excipientes, diluyentes o portadores adicionales.

Otra realización se refiere a los procedimientos y composiciones para inhibir la expansión de una enfermedad vírica en una población de plantas, por ejemplo, plantas cultivadas. Los virus de plantas en general se transmiten a una planta mediante un vector de artrópodo o nematodo. Por lo tanto, se puede inhibir la infestación de una planta por un virus mediante la eliminación de la expresión génica vírica en el vector de artrópodo o nematodo. Por lo tanto, se proporcionan las composiciones y procedimientos para inhibir la expresión génica vírica en un vector de artrópodo o nematodo. Una realización se refiere a un procedimiento que comprende administrar un ARNbc, en el que el ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos una parte de una transcripción de ARN de un gen del virus de la planta, a un vector de artrópodo o nematodo, de modo que se silencie la expresión del gen vírico diana. La transcripción de ARN diana puede ser de un virus del mosaico del abutilón, virus del mosaico de la yuca africana, virus del mosaico de la alfalfa, virus del mosaico del arabis, virus del mosaico leve de la cebada, virus del enanismo amarillo de la cebada, virus del mosaico amarillo de la cebada, virus de la copa rizada de la remolacha, virus del amarilleo occidental de la remolacha, virus del mosaico dorado de la judía, virus del rizado de la hoja de la remolacha, virus de la vena amarilla necrótica de la remolacha, virus de la remolacha transmitido por el suelo, virus del amarilleo occidental de la remolacha, virus del mosaico del bromo, begomovirus del mosaico de la yuca, virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del pepino, virus de la necrosis del pepino, virus del amarilleo de las cucurbitáceas transmitido por pulgones, virus del brote hinchado del cacao, virus de la hoja en abanico de la vid, virus asociados al enrollamiento de la hoja de la vid, virus A de la vid, virus B de la vid, virus del anillado del cacahuete, virus de la mancha amarilla del iris, virus del mosaico del pasto Johnson, virus amarillo infeccioso de la lechuga, virus del mosaico de la lechuga, virus del oscurecimiento precoz del guisante, virus del anillado de la pimienta, virus del enrollamiento de la hoja de la patata, virus de la copa rizada de la patata, virus del enanismo del arroz, virus del enanismo rugoso del arroz, virus del mosaico del trigo transmitido por el suelo, virus del mosaico del sur de la judía, virus latente de las manchas anulares de la fresa, virus del moteado suave de la batata, virus del mosaico del tabaco, virus del cascabeleo del tabaco, virus de las manchas anulares del tabaco, virus del anillo negro del tomate, virus de la mancha clorótica del tomate, virus del mosaico dorado del tomate, virus del rizado amarillo de la hoja del tomate, virus de marchitez manchada del tomate, virus del mosaico aterciopelado del tabaco o un virus del mosaico rayado del trigo. En una realización, una composición de ARNbc antivírico se incorpora a una fuente de alimento o se aplica a la superficie de una fuente de alimento, por ejemplo, una planta cultivada, para su consumo por un vector vírico. En un aspecto, la composición de ARNbc antivírico comprende las moléculas de ARNbc purificado transcritas a partir de una construcción de expresión con modificación genética diseñada para minimizar la transcripción no productiva de una secuencia no funcional, tal como se describe anteriormente. En otro aspecto, la composición de ARNbc antivírico comprende células hospedadoras que expresan ARNbc eliminadas, sin lisar, tal como se describe anteriormente. En otro aspecto, la composición de ARNbc antivírico comprende el lisado no purificado o mínimamente purificado de las células hospedadoras que expresan ARNbc, tal como se describe anteriormente. El vector de artrópodo puede ser un vector de insecto, por ejemplo, áfidos, escarabajos, saltahojas, chicharras, cochinillas de la harina, chinches, ácaros, arañuelas y mosquitas blancas. Las composiciones pueden contener, además del ARNbc, las células hospedadoras o el lisado, excipientes, diluyentes o portadores adicionales. Las composiciones que comprenden un microorganismo eliminado por calor que expresa ARNbc o un lisado de este deberían ser lo suficientemente estables como para que el ARNbc no se degrade y pueda mediar el ARNi, incluso cuando se expone a condiciones ambientales externas durante un período de tiempo, que puede ser un período de días o semanas.

En las realizaciones descritas en la presente, el ARNbc se puede expresar mediante microorganismos que comprenden una construcción de expresión con modificación genética diseñada para minimizar la transcripción no productiva de la secuencia no funcional, tal como se describe anteriormente, y los microorganismos o un lisado de estos se pueden aplicar a una superficie de una planta o semilla o se pueden introducir a una semilla, raíz, tallo u hoja por un medio físico, tal como una inyección, o en los casos de una semilla, mediante imbibición. Por ejemplo, la administración de microorganismos que comprenden una construcción de expresión con modificación genética tal como se describe en la presente a las superficies de una planta puede ser mediante una aplicación en aerosol. En una realización, se puede cultivar una bacteria o levadura con modificación genética para producir y acumular ARNbc y los productos del cultivo, tales como bacteria o levadura eliminadas por calor o un lisado de estas, se pueden formular como una composición compatible con las prácticas agrícolas comunes. La naturaleza de los excipientes y la forma física de la composición pueden variar dependiendo de la naturaleza del sustrato tratado. Por ejemplo, la composición puede ser un líquido que se cepilla o pulveriza o imprime en el sustrato que se va a tratar, o un recubrimiento o polvo que se aplica al sustrato que se va a tratar. Por lo tanto, en una realización, la composición se encuentra en forma de un recubrimiento en una superficie adecuada que se adhiere, y finalmente es ingerida por un organismo diana, tal como un insecto o nematodo, que entra en contacto con el recubrimiento.

Las formulaciones de aerosol para las plantas cultivadas pueden incluir adhesivos y humectantes adecuados para cubrir de forma eficaz las hojas, así como protectores UV para proteger los ARNbc del daño UV. Por ejemplo, puede ser deseable contar con una formulación de un microorganismo eliminado por calor que ayudaría a esparcir el microorganismo en una película sobre la superficie de la hoja, o a mover el microorganismo eliminado por calor hacia los espacios intercelulares de la hoja, y/o que ayudaría a proporcionar cierta capacidad al microorganismo para adherirse a la hoja en condiciones ambientales húmedas (resistencia a la lluvia). Dichos aditivos son utilizados comúnmente en la industria bioinsecticida y son conocidos por los expertos en la técnica. Asimismo, las formulaciones para aplicación a la tierra pueden incluir formulaciones granulares que son útiles como cebo para las larvas de plagas de insectos de tierra como el gusano de raíz del maíz. Dichas aplicaciones se podrían combinar con otras aplicaciones de insecticidas, basadas biológicamente o no, para potenciar la protección de las plantas del daño por consumo de los insectos. Por ejemplo, proporcionar proteínas Bacillus thuringiensis (Bt) en la dieta de plagas de insectos es un modo de acción para controlar la plaga de insectos. Por lo tanto, varias realizaciones se refieren a las combinaciones sinérgicas de las composiciones de ARNbc y procedimientos descritos en la presente con procedimientos y composiciones de Bt, que incluyen las formulaciones tópicas y los enfoques transgénicos para controlar la infestación de los insectos.

Los ejemplos de plantas a las cuales se pueden aplicar los procedimientos y composiciones descritos en la presente incluyen, de modo no taxativo, alfalfa, eneldo, manzano, albaricoque, alcachofa, rúcula, aspárrago, aguacate, plátano, cebada, judías, remolacha, mora, arándano, brócoli, coles de bruselas, repollo, colza, cantalupo, zanahoria, yuca, coliflor, apio, cerezo, cilantro, cítrico, clementina, café, maíz, algodón, pepino, abeto de Douglas, berenjena, endivia, escarola, eucalipto, hinojo, higos, calabaza, uva, pomelo, melón verde, jícama, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino taeda, mango, melón, champiñón, nuez, avena, quimbombó, cebolla, naranjo, una planta decorativa, papayo, perejil, guisante, melocotón, cacahuete, pera, pimienta, caqui, pino, piña, plátano macho, ciruela, granada, álamo, patata, calabaza común, membrillo, pino de california, achicoria roja, rábano, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, batata, liquidámbar, mandarina, té, tabaco, tomate, césped, vid, sandía, trigo, boniato y calabacín.

Los procedimientos y composiciones descritos en la presente se pueden aplicar a cualquier planta monocotiledónea o dicotiledónea, o se pueden aplicar a través de formulaciones farmacéuticamente aceptables a animales vertebrados o invertebrados para proporcionar cierto nivel de reducción de la expresión del gen diana. La inhibición de la expresión del gen diana se puede cuantificar midiendo el ARN diana endógeno o la proteína producida mediante la traducción del ARN diana y las consecuencias de la inhibición se pueden confirmar mediante la examinación del fenotipo externo del organismo o célula diana. Las técnicas para cuantificar el ARN y las proteínas son conocidas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la expresión del gen diana se inhibe en al menos un 10 %, al menos un 33 %, al menos un 50 % o al menos un 80 %. En algunas realizaciones, la expresión del gen diana se inhibe en al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % dentro de las células del organismo diana de modo que se produzca una inhibición significativa. Se puede decir que se produce la inhibición significativa cuando la administración de un ARNbc a un organismo diana da como resultado un fenotipo detectable (por ejemplo, cese del crecimiento, parálisis o muerte de la larva, etc.) o una disminución detectable en el ARN endógeno y/o proteína que corresponde al gen diana. Mientras en algunas realizaciones la inhibición se produce básicamente en todas las células del organismo diana, en algunas realizaciones, la inhibición se puede producir solamente en un subconjunto de células que expresan el gen. Por ejemplo, si el gen diana cumple una función esencial en las células del tubo digestivo de un insecto, la inhibición del gen diana dentro de estas células es suficiente para provocar un efecto perjudicial deseado en el insecto.

Ejemplo 1

Diseño del vector de producción de ARNbc

Se seleccionó una secuencia diana, nucleótidos 30-309 de la SEQ ID NO 1, del ortólogo del escarabajo de la patata (CPB) putativo del coatómero COPI.

SEQ ID NO: 1:

>Ld_F38E11.5 ortólogo putativo del coatómero COPI; Alias Ld248; 14810:1.379 CGTAACCGCGGTTTGTTTCCACCCTGAACTACCTGTGGCTCTCACAGGCAGCGAAGATGG TACCGTTAGAGTTTGGCATACGAATACACACAGATTAGAGAATTGTTTGAATTATGGGTT CGAGAGAGTGTGGACCATTTGTTGCTTGAAGGGTTCGAATAATGTTTCTCTGGGGTATGA CGAGGGCAGTATATTAGTGAAAGTTGGAAGAGAAGAACCGGCAGTTAGTATGGATGCCAG TGGCGGTAAAATAATTTGGGCAAGGCACTCGGAATTACAACAAGCTAATTTGAAGGCGCT GCCAGAAGGTGGAGAAATAAGAGATGGGGAGCGTTTACCTGTCTCTGTAAAAGATATGGG

AGCATGTGAAATATACCCT

Se diseñó un elemento de codificación de ARNbc que contiene una secuencia con sentido (nucleótidos 4-283 de la SEQ ID NO 2), que corresponden a la secuencia diana del coatómero COPI de CPB, una secuencia que codifica bucles de 150 nucleótidos (nucleótidos 284-433 de la SEQ ID NO 2), y una secuencia antisentido (nucleótidos 434 713 de la SEQ ID NO 2) que es el complemento inverso de la secuencia diana del coatómero COPI de CPB.

SEQ ID NO: 2

GGGTACCTGTGGCTCTCACAGGCAGCGAAGATGGTACCGTTAGAGTTTGGCATACGAATACACACAGATTAGAGA

ATTGTTTGAATTATGGGTTCGAGAGAGTGTGGACCATTTGTTGCTTGAAGGGTTCGAATAATGTTTCTCTGGGGT

ATGACGAGGGCAGTATATTAGTGAAAGTTGGAAGAGAAGAACCGGCAGTTAGTATGGATGCCAGTGGCGGTAAAA

TAATTTGGGCAAGGCACTCGGAATTACAACAAGCTAATTTGAAGGCGCTGCCAGAAGGaagtactgcgatcgcgt taacgctttatcacgataccttctaccacatatcactaacaacatcaacactcatcactctcgacgacatccact cgatcactactctcacacgaccgattaactcctcatccacgcggccgcctgcaggagcCCTTCTGGCAGCGCCTT

CAAATTAGCTTGTTGTAATTCCGAGTGCCTTGCCCAAATTATTTTACCGCCACTGGCATCCATACTAACTGCCGG

TTCTTCTCTTCCAACTTTCACTAATATACTGCCCTCGTCATACCCCAGAGAAACATTATTCGAACCCTTCAAGCA

ACAAATGGTCCACACTCTCTCGAACCCATAATTCAAACAATTCTCTAATCTGTGTGTATTCGTATGCCAAACTCT

AACGGTACCATCTTCGCTGCCTGTGAGAGCCACAGGTA

Se construyeron dos vectores plásmidos para producir ARNbc de CPB usando el vector de clonación pUC19, que contiene un gen de resistencia a la ampicilina, un fragmento del extremo N del gen lac Z de E. coli, un sitio de clonación múltiple y un origen de replicación. El vector CPB-hp se construyó de modo que un promotor T7 se una operativamente a la región que codifica el ARNbc de la SEQ ID No 2. Véase la Figura 2A que muestra un mapa esquemático del vector pCPB-hp. Para prevenir o minimizar la lectura completa de las regiones que no codifican el ARNbc mediante la polimerasa de ARN T7 y la producción de ARNmc de la estructura del plásmido, se construyó el vector pCPB-hp+2T colocando dos secuencias de terminación de T7 (terminador de PTH y terminador de pET-T7) en el extremo 3' de la región que codifica el ARNbc. Véase la Figura 2B y 2C que muestra mapas esquemáticos del vector pCPB-hp+2T.

Se adquirió la cepa E. coli HT115 (DE3) del Caenorhabditis Genetics Center, Universidad de Minnesota (el genotipo de HT115 (DE3) es: F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lisógeno: promotor lavUV5 - polimerasa T7) (RNasa III menos)). Se transformaron células E. coli HT115 (DE3) con pUC19 (control), pCPB-hp, o pCPB-hp+2T y se cultivaron durante la noche a 37 °C o 25 °C. Se aisló el ARN total a partir de 20 ul de cultivo y se ejecutó de forma directa en un gel de Agarosa (Fig. 3A, líneas marcadas con 1 (pUC19), 2 (pCPB-hp) y 3 (pCPB-hp+2T)) o se trató con RNasa antes de ejecutarse en un gel de Agarosa (Fig. 3B líneas marcadas con 1 (pUCl9), 2 (pCPB-hp) y 3 (pCPB-hp+2T)).

También se transformaron células E. coli HT115 (DE3) con dos plásmidos, uno que tiene una plantilla de ARNbc (pUC19 (control), pCPB-hp o pCPB-hp+2T) y el otro que tiene una polimerasa de ARN T7 controlada por un elemento inducible (polimerasa T7 inducible por IPTG). Las células transformadas se cultivaron durante la noche a 37 °C o 25 °C. Se aisló el ARN total a partir de 20 ul de cultivo y se ejecutó de forma directa en un gel de Agarosa (Fig. 3A, líneas marcadas con 4 (pUC19 y pLac-T7), 5 (pCPB-hp y pLac-T7) y 6 (pCPB-hp+2T y pLac-T7)) o se trató con RNasa antes de ejecutarse en un gel de Agarosa (Fig. 3B líneas marcadas con 4 (pUC19 y pLac-T7), 5 (pCPB-hp y pLac-T7) y 6 (pCPB-hp+2T y pLac-T7)).

Tal como se muestra en la Fig. 3A y Fig. 3B, las células transformadas cultivadas a 37 °C produjeron más ARN que las células cultivadas a 25 °C, el rendimiento del ARNbc se mejoró mediante la expresión de polimerasa T7 en las células hospedadoras, y la inclusión de dos secuencias de terminación 3' respecto de la plantilla de ARNbc dio como resultado mayores aumentos en el rendimiento del ARNbc. Se observó un rendimiento de 30-50 mg/l de ARNbc de las células E. coli que expresan la polimerasa de ARN T7 y la construcción de ARNbc pCPB-hp+2T. (No se muestran los datos).

Ejemplo 2

Producción in vivo de ARNbc del escarabajo de la patata (CPB)

1. Transformación

Los plásmidos pCPB-hp+2T y pLac-T7 se transformaron en la cepa E. coli HT115 (DE3) tal como se describe en el Ejemplo 1. Después de la transformación, las células E. coli se colocaron en placas y se seleccionaron colonias únicas.

2. Condición de cultivo

Las colonias únicas se cultivaron 6-8 horas a 37 °C en 3 ml de medio LB que contenía 100 ug/ml de ampicilina y 12,5 ug/ml de tetraciclina para producir un cultivo de semillas. Para inducir la expresión de ARNbc, se inocularon 200 ul del cultivo de semilla en un matraz de 250 ml con 50 ml de medio de autoinducción (AIM) (Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) que contenía 100 ug/ml de ampicilina y 12,5 ug/ml de tetraciclina y luego se incubó. Las células se cosecharon mediante centrifugación a 6.000 g durante 10 min a 4 °C.

3. Purificación de ARN

El ARN bacteriano se purificó usando un procedimiento adaptado del protocolo SNAP de Stead (Stead et ál, Nucleic Acids Res. 1 Nov2012; 40(20):e156.) con modificación del amortiguador de extracción de ARN, tal como se describe a continuación. Se centrifugó un mililitro de cultivo bacteriano (~108 células) a 16.000 g durante 30 s y el sobrenadante se retiró. El sedimento celular se almacenó en hielo seco hasta que estuvo listo para la extracción. Después, los sedimentos celulares se volvieron a suspender en 100 pl de solución de extracción de ARN modificado [18 mM de EDTA, 0,025 % de SDS, 5 mM de TCEP, 95 % formamida (grado ARN)] mediante agitación vigorosa en vórtex. El 1 % de 2-mercaptoetanol utilizado en la solución de extracción de ARN del protocolo SNAP de Stead se reemplazó con 5 mM de TCEP dado que TCEP tiene mucha menos toxicidad en comparación con el 2-mercaptoetanol e igual eficacia que el 2-mercaptoetanol (no se muestran los datos).

Después de la resuspensión en solución de extracción de ARN modificado, las células se lisaron incubando la muestra a 95 °C en un baño de agua durante 7 min. Los residuos celulares se sedimentaron centrifugando la muestra templada a 16.000 g durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se transfirió cuidadosamente a un tubo nuevo sin alterar el sedimento.

Se diluyó el ARN total de las células E. coli pCPB-hp+2T no inducidas (Fig. 4, línea 1) e inducidas (Fig. 4, línea 2) con H2O y se ejecutó en un gel de Agarosa. Tal como se muestra en la Fig. 4, se observó una banda que corresponde al ARNbc de CPB en las células E. coli pCPB-hp+2T inducidas pero no en las células E. coli pCPB-hp+2T no inducidas.

Ejemplo 3

Comparación del ARN transcrito in vivo e in vitro

El plásmido pCPB-hp+2T se linealizó y usó como plantilla para la transcripción de ARN in vitro. El ARN transcrito in vitro (Figura 5A, líneas 9 y 10) se ejecutó en un gel de Agarosa junto con el ARN transcrito por bacterias purificado de acuerdo con el protocolo SNAP modificado descrito en el Ejemplo 1 y se diluyó directamente en H2O (Figura 5A, líneas 5 y 6) o se filtró con una membrana de corte molecular de 30 K (Amicon) para retirar los reactivos, tales como EDTA, SDS, TCEP y formamida, antes de diluirlo con H²O (Figura 5A, líneas 5 y 6) para determinar el tamaño de los transcritos de ARN. Se observó que el ARN transcrito in vitro era más grande que el ARN transcrito por bacterias (véase la Fig. 5A).

El ARN transcrito (por bacterias) in vitro e in vivo se incubó con RNasa A, que digiere el ARN monocatenario pero no de bicatenario. Tal como se muestra en la Fig. 5B, tras la digestión de RNasa A, el tamaño de los productos de transcripción de ARN in vivo (líneas 5-8) e in vitro (líneas 9 y 10) es idéntico. Esto indicó que el aumento de tamaño del ARN transcrito in vitro se debió a la presencia del bucle en horquilla monocatenario; que se retira en la célula bacteriana mediante el procesamiento del ARN.

Ejemplo 4

Eliminación por calor de E. coli

El intervalo de temperatura para eliminar por calor las células E. coli HT115 (DE3) sin lisis celular se determinó experimentalmente. Se incubaron células E. coli HT115 (DE3) a distintas temperaturas, de 37 °C a 72 °C durante 30 minutos. Después, las células tratadas con calor se examinaron bajo el microscopio para determinar si había ocurrido lisis y diseminación en las placas de LB, y se incubaron durante una noche para determinar la capacidad de supervivencia después del tratamiento con calor. Tal como se muestra en la Tabla 1, el calentamiento a temperaturas de 59 °C y más eliminó todas las células, sin embargo, no se observó lisis celular para ninguna de las temperaturas analizadas, de hasta 72 °C (véase la Fig. 6).

TABLA 1: Lisis celular y capacidad de supervivencia después del tratamiento con calor

Ejemplo 5

Optimización del rendimiento del ARNbc bacteriano—Medio de cultivo

Se analizaron tres medios ricos, medio de autoinducción (AIM) (Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234), Super Broth (Atlas, R. M. Handbook of microbiological media. 1997. CRC Press, Nueva York, EUA) medio, y plásmido medio AIM, para determinar si se podría mejorar el rendimiento de la producción de ARN bacteriano mediante la elección del medio.

El medio de autoinducción (AIM) contiene: 1 % de N-Z-amina AS, 0,5 % de extracto de levadura, 0,5 % de glicerol, 0,05 % de glucosa, 0,2 % de alfa-lactosa, 25 mM de (NH4)2SO4, 5 mM de KH2PO4, 20 mM de Na2HPO4, 1 mM de MgSO4.

Super Broth medio AIM contiene: 3,2 % de triptona, 2 % de extracto de levadura, 0,5 % de NaCl, 1 % de glicerol, 0,1 % de glucosa, 0,4 % de alfa-lactosa, 50 mM de (NH4)2SO4, 10 mM de KH2PO4, 40 mM de Na2HPO4, 2 mM de MgSO4.

Plásmido medio AIM contiene: Plásmido medio (Thomson Instrument Co.), 25 mM de (NH4)2SO4, 5 mM de KH2PO4, 20 mM de Na2HPO4, 1 mM de MgSO4, 0,5 % de glicerol, 0,05 % de glucosa, 0,2 % de alfa-lactosa para la autoinducción.

Se prepararon los cultivos de siembra de las células E. coli DV49 HT115 (DE3) de acuerdo con las condiciones de cultivo descritas en el Ejemplo 2. Los 3 medios de producción distintos se inocularon con cantidades idénticas de cultivo de siembra y se incubaron de acuerdo con las condiciones descritas en el Ejemplo 2. Después de 16 horas de cultivo en matraz, las células se cosecharon para analizar el rendimiento.

Las células DV49 cultivadas en AIM proporcionaron 40 mg/l de ARN. Las células DV49 cultivadas en Super Broth medio proporcionaron 207 mg/l de ARN. Las células DV49 cultivadas en plásmido medio AIM proporcionaron 96 mg/l de ARN. En función del rendimiento del ARN DV49 bacteriano de 3 medios, Super broth+ proporcionó el rendimiento más alto del producto diana. Véase la Figura 7A.

El efecto del Super broth+ medio en la producción de ARNbc de CPB se analizó como se describe anteriormente. Las células E. coli pCPB-hp+2T HT115 (DE3) cultivadas en medio Super broth+ proporcionaron 66 mg/l de ARN. Véase la Figura 7B. El rendimiento en medio Super broth+ es una mejora sobre otros medios analizados.

Ejemplo 6

Bioeficacia del ARNbc en el escarabajo de la patata

Se produjeron tres muestras de ARNbc, E. coli pCPB-hp+2T HT115 (DE3) eliminadas por calor sin lisar, ARNbc de CBP transcrito purificado por bacterias y ARNbc de c Bp transcrito in vitro, como se describe anteriormente para analizar la bioeficacia de las preparaciones de ARNbc contra el escarabajo de la patata (CPB), Leptinotarsa decemlineata.

Se realizaron ensayos con las larvas de CPB usando una dieta artificial de 13,2 g/l de agar (Serva 11393), 140,3 g/l de premezcla de Bio-Serve (F9380B), 5 ml/l de KOH (18,3 % p/p) y 1,25 ml/l de formalina (37 %). La dieta se suministró en alícuotas de 200 uL en placas de 96 pocillos y se secaron rápidamente antes de la aplicación de la muestra. Se aplicaron alícuotas de veinte (20) uL de muestra de prueba (E. coli pCPB-hp+2T HT115 (DE3) eliminadas por calor sin lisar, ARNbc de CBP transcrito por bacterias purificado o ARNbc de CBP transcrito in vitro) por pocillo, con agua estéril que servía como el control sin tratar (UTC). Se dejaron secar las placas antes de agregar las larvas. Se agregó una larva de CPB neonata por pocillo con un pincel fino. Después, las placas se sellaron con mylar y se ventilaron usando un alfiler para insectos. Se analizaron treinta y dos (32) larvas por tratamiento.

Las placas de bioensayo se incubaron a 27 °C, 60 % de humedad relativa (HR), en oscuridad total durante 10 - 12 días. Después, las placas se evaluaron para determinar la mortalidad (Tabla 2) y la reducción del crecimiento de las larvas (Tabla 3). Los datos se analizaron usando el software estadístico JMP©4 (SAS Institute, 1995) y se llevó a cabo un ANOVA factorial completo con la prueba de Dunnet para observar los efectos del tratamiento en comparación con el control no tratado (P<0,05). Se realizó una prueba post hoc de Tukey-Kramer para comparar todos los pares de los tratamientos (P<0,05).

Tal como se muestra en las Tablas 2 y 3, todas las preparaciones de ARNbc de CPB mostraron una actividad significativa contra el escarabajo de la patata. Por ejemplo, el 87,5 % de los crecimientos de los escarabajos se inhibieron a la concentración más baja de E. coli eliminadas por calor sin lisar analizadas (0,00002 mg/ml).

TABLA 2: Bioensayo de mortalidad de ARNbc de CPB

continuación

TABLA 3: Bioensayo de debilitamiento de ARNbc de CPB

continuación

Ejemplo 7

Bioeficacia de ARNbc DV49

Se construyó un plásmido de estructura pUC con un promotor T7 que dirige la expresión de DV49 antisentido+bucle+DV49 con sentido+terminador de PTH+terminador de pET-T7. Véase la Figura 8. La secuencia de nucleótidos de la construcción de expresión de DV49 se proporciona en la SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 4:

T AAT ACG ACTC ACT AT AGGGATC C AT GAT AT CGT GAACAT C ATCTAC ATT C AAAT TCTTATGAGCTTTCTTAAGGGCATCTGCAGCATTTTTCATAGAATCTAATACAGCA GTATTTGTGCTAGCTCCTTCGAGGGCTTCCCTCTGCATTTCAATAGTTGTAAGGGT TCCATCTATTTGTAGTTGGGTCTTTTCCAATCGTTTCTTCTTTTTGAGGGCTTGGAG TGCAACTCTTTTATTTTTCGACGCATTTTTCTTTGCaagtactgcgatcgcgttaacgctttatcacgat accttctaccacatatcactaacaacatcaacactcatcactctcgacgacatccactcgatcactactctcacacgaccgattaactcct catccacgcggccgcctgcaggagcGC AAAG AAAAAT GCGT CGAAAAAT AA AAGAGTT GC AC TCCAAGCCCTCAAAAAGAAGAAACGATTGGAAAAGACCCAACTACAAATAGATG GAACCCTTACAACTATTGAAATGCAGAGGGAAGCCCTCGAAGGAGCTAGCACAA ATACTGCTGTATTAGATTCTATGAAAAATGCTGCAGATGCCCTTAAGAAAGCTCA T AAG AATTT GAAT GT AG AT GAT GTT C AC GAT AT C AT GGAT Aagcttgccatctgttttcttgcaag atcagctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccgga

Los nucleótidos 1-17 codifican el promotor T7; los nucleótidos 21-260 codifican una secuencia antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana de un gen del gusano de la raíz del maíz (Diabrotica virgifera); los nucleótidos 261-410 codifican una región que forma bucles; los nucleótidos 411-650 codifican una secuencia con sentido que es sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos diana de un gen del gusano de la raíz del maíz (Diabrotica virgifera); los nucleótidos 659-668 codifican el terminador de PTH; los nucleótidos 681-764 codifican el terminador de pET-T7.

Se transformaron células E. coli HT115 (DE3) con dos plásmidos, uno que tiene la construcción de expresión de ARNbc DV49 y el otro que tiene una polimerasa de ARN T7 controlada por un elemento inducible (polimerasa T7 inducible por iPt G). Las células se cultivan a una densidad celular deseada y se determina el rendimiento del ARNbc. Las células que expresan el ARNbc DV49 se calientan hasta una temperatura de al menos 59 °C durante 30 minutos para eliminar las células. Las células que expresan el ARNbc DV49 se titulan para proporcionar composiciones con mayores concentraciones de ARNbc, por ejemplo, 0,00002, 0,001 y 0,005 mg/ml, y composiciones que contienen las células que expresan el ARNbc DV49 eliminadas por calor o las células de control E. coli HT115 (DE3) eliminadas por calor se proporcionan en la dieta de las larvas de gusano de la raíz del maíz. Se evalúan la mortalidad y morbilidad de las larvas, y se determina la masa de las larvas que sobreviven. La muerte, reducción del crecimiento u otra inhibición de las larvas de gusano de la raíz del maíz después de la ingesta de las células que expresan el ARNbc DV49 eliminadas por calor en comparación con las células de control indica que la ingesta de las células que expresan el ARNbc DV49 eliminadas por calor es eficaz para controlar las infestaciones de gusanos de la raíz del maíz.

Ejemplo 8

Bioeficacia de las bacterias lisadas frente a no lisadas

Se prepara un cultivo de E. coli pCPB-hp+2T HT115 (DE3) y las células se eliminan por calor, tal como se describe en el Ejemplo 4. Después, se lisa una alícuota de las células E. coli pCPB-hp+2T HT115 (DE3) eliminadas por calor por medios químicos, enzimáticos, de congelación-descongelación o mecánicos para producir un lisado celular. Después, una alícuota del lisado celular se purifica parcialmente mediante centrifugación para retirar los residuos celulares. Después, se analizan tres muestras, células E. coli pCPB-hp+2T HT115 (DE3) eliminadas por calor sin lisar, lisado celular no purificado y lisado celular parcialmente purificado para determinar la bioeficacia contra el escarabajo de la patata (CPB), Leptinotarsa decemlineata, tal como se describe en el Ejemplo 6 que antecede. Se someten adicionalmente alícuotas de las tres muestras a distintas preparaciones, como liofilización o congelación, y las temperaturas, como la temperatura ambiente, 4 °C y 0 °C, para aumentar los períodos de tiempo y la bioeficacia de las muestras sometidas a las varias preparaciones y condiciones de almacenamiento se determinan realizando bioensayos, tal como se describe en el Ejemplo 6 que antecede. Se compara la bioeficacia de las distintas preparaciones de muestra y se selecciona una preparación que muestra un alto grado de bioeficacia y estabilidad.

Ejemplo 9

Optimización del rendimiento del ARNbc—cantidad y combinación de terminadores

Se construye un vector plásmido para la producción eficaz de ARNbc insertando en una posición 3' respecto de una secuencia que codifica el ARNbc, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de terminación de la transcripción, cada una de las cuales se selecciona, independientemente, de un grupo que consiste en: el terminador de PTH, el terminador de pET-T7, el terminador de T3-T9, el terminador de pBR322-P4, el terminador del virus de estomatitis vesicular, el terminador de rrnB-T1, el terminador de rrnC, el terminador transcripcional de TTadc, de modo que las secuencias de terminación de la transcripción formen una combinación funcional con el promotor.

Las células hospedadoras se transforman con los vectores con modificación genética y se induce la transcripción de la secuencia que codifica el ARNbc del promotor. Se determina la eficacia de terminación de cada cantidad y combinación de secuencias de terminación transcripcional. Se selecciona una cantidad y combinación mínima de secuencias de terminación que muestran la eficacia de terminación más alta, ya que una alta eficacia de terminación minimiza la lectura completa no productiva de la secuencia de vector y mejora el rendimiento del ARNbc en comparación con una baja eficacia de terminación.

Ejemplo 10

Optimización del rendimiento del ARNbc—tamaño del plásmido

Se construye un vector plásmido para la producción eficaz del ARNbc insertando una construcción de expresión de ARNbc con modificación genética, que comprende un promotor, un elemento que codifica el ARNbc, y dos o más secuencias de terminación, en un vector plásmido mínimo que no contiene un marcador seleccionable basado en la proteína y/o secuencias espaciadoras no esenciales. Cuando el tamaño esperado del vector que contiene la construcción de expresión de ARNbc con modificación genética sea inferior a un tamaño mínimo para la replicación eficaz del plásmido, se insertan una o más construcciones de expresión de ARNbc con modificación genética o elementos que codifican el ARNbc adicionales en el vector para alcanzar un tamaño mínimo para la replicación eficaz del vector de expresión resultante. Las células hospedadoras se transforman con el vector de expresión de ARNbc. Si fuera necesario, se cotransforma un vector que codifica una polimerasa de ARN que impulsa la transcripción de ARNbc a partir del vector de expresión de ARNbc. La estructura principal del vector mínimo proporciona una plantilla reducida para la lectura completa no productiva de la secuencia que no codifica el ARNbc, mejorando el rendimiento del ARNbc en comparación con un plásmido con un mayor porcentaje de estructura principal del vector.

Ejemplo 11

Optimización del rendimiento del ARNbc— Plantilla linealizada

Se construye un vector plásmido para la producción eficaz del ARNbc insertando un sitio de restricción para una endonucleasa que no corta el genoma de la célula hospedadora (por ejemplo, I-Sce1, que no tiene sitios en el genoma de E. coli, un sitio de restricción de ZFN o un sitio de restricción de TALEN) en una posición que está 3' respecto de una secuencia que codifica el ARNbc que se une operativamente a un promotor. Véase, por ejemplo, la Figura 9. Las células hospedadoras se cotransforman con el ARNbc el vector de producción de endonucleasa y un vector que codifica una endonucleasa que reconoce el sitio de restricción. En algunos casos, la expresión de la endonucleasa es inducible y la endonucleasa se puede codificar en un vector que codifica adicionalmente una polimerasa de ARN que impulsa la producción de ARNbc. La expresión de la endonucleasa linealiza el vector de producción de ARNbc, eliminando así la lectura completa no productiva de la secuencia del vector y mejorando el rendimiento del ARNbc en comparación con un plásmido no linealizado.

Ejemplo 12

Optimización del rendimiento de ARN - Comparación de combinaciones de terminación

Se realizó una comparación de la producción de ARN con diferentes terminadores clonados en el mismo plásmido de expresión.

1. Diseño de un vector de producción de ARN

Se construyeron nueve vectores plásmidos con diferentes terminadores o combinaciones de terminadores usando el vector de clonación pUC19 que contiene un gen de resistencia a ampicilina, un fragmento N-terminal del gen Z de E. coli lac, un sitio de clonación múltiple y un origen de replicación. Las secuencias de terminación como se muestran en la Tabla 4 a continuación se clonaron en el vector pUC19 corriente abajo del promotor T7 para producir 9 vectores diferentes con terminadores o combinaciones de terminadores diferentes. Se insertó en el vector una secuencia de ADN (SEQ ID NO 2) que codifica el CPB-hp corriente abajo del promotor de T7 y corriente arriba de la secuencia de terminación.

2. Condición de cultivo

Los vectores plásmidos se transformaron en células HT115 (DE3) de E. coli. Se seleccionaron colonias únicas para cada vector plásmido y se cultivaron 6-8 horas a 37 °C en 3 ml de medio LB con 100 ug/ml de ampicilina y 12,5 ug/ml de tetraciclina para producir un cultivo de siembra. Para inducir la expresión de ARNbc, se inocularon 200 ul de cultivo de siembra en matraces de 250 ml con 50 ml de medio de autoinducción (AIM) (Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) que contenía 100 ug/ml de ampicilina y 12,5 ug/ml de tetraciclina y después se incubaron. Las células se recogieron mediante centrifugación a 6000 g durante 10 min a 4 °C.

3. Purificación y medición de ARN

Se purificó el ARN total de las células bacterianas de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 2 y se procesó en un gel de Agarosa para medir la cantidad de ARN producido. Tal como se muestra en la Figura 10, se observaron niveles elevados de producción de ARN del vector de producción de ARN que contenía 2 terminadores en tándem (PTH y PET). La mayoría de los vectores de producción de ARN que contenían terminadores únicos no produjeron niveles detectables de ARN. Sin deseo de limitarse por ninguna teoría en particular, la imposibilidad de un único terminador de detener la transcripción de T7 puede dar como resultado una producción pobre de ARN. Los vectores de producción de ARN que contenían terminadores únicos PET o rrn BT2 produjeron cantidades detectables de ARN, sin embargo, los rendimientos de los vectores de producción PET y rrn BT2 fueron relativamente más bajos en comparación con el vector de producción de ARN que contenía 2 terminadores (16 % y 40 %, respectivamente). Véase la Figura 10.

4. Comparación estructural

Las estructuras secundarias formadas por los terminadores se analizaron usando CLC Main Workbench (versión 6.8.4). También se determinó la energía libre de las estructuras secundarias. Véase la Tabla 5. Tal como se muestra en la Figura 11, los terminadores que proporcionaron los rendimientos más altos de producción de ARN (PET, rrn BT2 y PTH;PET) tienen estructuras secundarias similares, que es una estructura de horquilla con un tallo de aproximadamente 10 a 20 pares de bases. Los terminadores asociados con una producción de ARN escasa o indetectable de los vectores de producción de ARN tenían horquillas muy cortas o muy largas para detener la transcripción. Se encontró que la construcción de 2 terminadores PTH;PET que proporcionó el mayor rendimiento con comparación con otras construcciones de terminador único tenía horquillas pequeñas y medianas adyacentes. Véase la Figura 11.

Tabla 5: Energía libre de las estructuras secundarias.

Ejemplo 13

Evaluación del efecto de la estructura secundaria en el rendimiento de ARN

Se realizó una comparación de la producción de ARN con secuencias de codificación de horquillas de diferentes longitudes clonadas en el mismo vector de producción de ARN.

Se insertaron secuencias de ADN que codificaban un ARN de horquilla 27mero (tallo de 27 pb más bucle de 8 pb) (SEQ ID NO. 14), 240mero (tallo de 240 pb con bucle de 150 pb) (SEQ ID NO. 15) o 280mero (tallo de 280 pb con bucle de 150 pb) (SEQ ID NO. 2) corriente arriba del terminador de PTH+PET y corriente abajo del promotor de T7 en el vector pUC19-PTH+PET. Las estructuras secundarias formadas por horquillas de ARN y terminadores se determinaron usando CLC Main Workbench (versión 6.8.4). Véase la Figura 12. Como se puede observar en la Figura 12A, la horquilla de ARN 27mero presenta una estructura secundaria similar a la formada por el terminador PTH+PET (con círculo). Las horquillas 240mero y 280mero no presentan una estructura secundaria tipo terminador. Véanse Figuras 12B y 12C.

Las construcciones de expresión de horquilla de ARN 27mero/terminador PTH+PET, horquilla de ARN 240mero/terminador PTH+PET y horquilla de ARN 280mero/terminador PTH+PET se transformaron en células HT115 (DE3) de E. coli y la producción de ARN se indujo como se describió en el Ejemplo 2. Como se puede observar en la Figura 13, el rendimiento de ARNbc fue notablemente más alto cuando era de la construcción de horquilla de ARN 27mero/terminador PTH+PET en comparación con las construcciones de horquilla de ARN más largas. Este resultado sugiere que la presencia de una estructura de horquilla de tamaño medio adicional en la construcción de horquilla de ARN 27mero/terminador PTH+PET puede ayudar en la terminación de la transcripción de T7 que da como resultado un mayor rendimiento de producción de ARN.

Ejemplo 14

Efecto de la cantidad de terminadores y la estructura secundaria en el rendimiento de ARN (solo para referencia)

Se realizó una comparación de la producción de ARN con múltiples terminadores diferentes clonados en el mismo vector de producción de ARN.

Tal como se describió en el ejemplo 12 anterior, se observó una mejor expresión de ARN a partir de un vector de producción de ARN que contenía la combinación de dos terminadores PTH+PET. Se clonaron secuencias de terminadores adicionales en el vector pUC19-PTH+PET para determinar si mejoraba el rendimiento de ARN con mayores cantidades de secuencias de terminadores. Dado que se observó que las secuencias terminadoras PET y rrn BT2 producían los mayores rendimientos de ARN para los vectores de producción de ARN con terminador único, se eligieron estas secuencias para clonar en el vector pUC19-PTH+PET. Se realizaron tres vectores de producción de ARN adicionales: UC19-rrn BT2+PET+ PTH+PET; pUC19-PET+rrn BT2+PTH+PET y pUC19-rrn BT2+PTH+PET. Se confirmó la secuencia de los plásmidos y se transformó en células HT115 (DE3). Las células se cultivaron y el ARN total se aisló y se describió en el Ejemplo 12. El ARN total se procesó en gel de Agarosa para medir la cantidad de ARN producido. Véase la Figura 14.

El ARN total producido a partir del vector pUC19-PTH+PET (Figura 14, línea 1) se usó como el rendimiento de ARN base (100 %) y los rendimientos de ARN total de los vectores de expresión pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET; pUC19-PET+nm BT2+PTH+PET y pUC19-mn BT2+PTH+PET se compararon con el rendimiento base. Sorprendentemente, un aumento en el rendimiento de ARN no tuvo una correlación estricta con la cantidad de terminadores, ya que el vector de expresión de 3 terminadores, pUC19-rrn BT2+PTH+PET, produjo 52% y el vector de expresión de 4 terminadores, pUC19-PET+rrn BT2+PTH+PET, produjo 40 % del ARN total producido por el rendimiento base de 2 terminadores. Véanse la Figura 14 y la Tabla 6. No obstante, el rendimiento de ARN total del vector de expresión de 4 terminadores, pUC19-rrn BT2+PET+ PTH+PET) fue 35 % mayor que el del rendimiento base de 2 terminadores. Véanse la Figura 14 y la Tabla 6.

Las estructuras secundarias formadas por los terminadores se determinaron usando CLC Main Workbench (versión 6.8.4). Véase la Figura 15. Como se puede observar en la Figura 15A, los 2 terminadores del vector de producción de ARN base pUC19-PTH+PET tienen una estructura secundaria con 2 horquillas de tamaño medio adyacentes (en círculos). El vector de expresión de 4 terminadores, pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET), que produjo el mayor rendimiento de ARN, presenta una estructura secundaria con 3 horquillas de tamaño medio adyacentes. Véase Figura 15B. Tal como se muestra en la Figura 15C y la Figura 15D, los vectores de producción de ARN con los rendimientos de ARN total más bajos presentan estructuras secundarias sin horquillas de tamaño medio adyacentes.

Tabla 6: Terminadores múltiples

Ejemplo 15 (solo para referencia)

Los terminadores rrn BT2+PET+PTH+PET adyacentes proporcionan mayor rendimiento de ARN

Se realizó una comparación del rendimiento de producción de ARN para las construcciones determinación PTH+PET y PET+rrn BT+PTH+PET para un gen adicional.

Se insertó una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 20) que codificaba una horquilla 397mero derivada del escarabajo de la patata de Colorado, corriente arriba de los terminadores y corriente abajo del promotor de T7 en los vectores pUC19-PTH+PET y pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET. Se confirmaron las secuencias de los plásmidos mediante secuenciación y se transformaron en células HT115 (DE3). Se realizaron cultivo celular y extracción de ARN total como se describió en el Ejemplo 12. Después de 18 horas de cultivo, la cepa con un vector de expresión que contenía los terminadores PTH+p Et alcanzó una DO⁶⁰⁰de 5,78 y produjo un rendimiento de ARN de 44 mg/l, mientras que la cepa con un vector de expresión que contenía los terminadores rrn BT2+PET+PTH+PET alcanzó una DO⁶⁰⁰de 5,55 y produjo un rendimiento de ARN de 132 mg/l. Este resultado sugiere que la presencia de una estructura de horquilla de tamaño medio adicional en la construcción del terminador rrn BT2+PET+PTH+PET puede ayudar en la terminación de la transcripción de T7 que da como resultado un mayor rendimiento de producción de ARN.

Ejemplo 16 (solo para referencia)

Los terminadores rrn BT2+PET+PTH+PET adyacentes proporcionan mayor rendimiento de proteína

Se clonó una secuencia de ADN que codificaba Proteína A (PM 21 k) en los vectores de terminador pUC19-PET, terminador pUC19-rrn BT2, terminadores pUC19-PTH+PET y terminadores pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET. Se confirmó la secuencia de los plásmidos y se transformó en células BL21 (DE3). Las células que contenían los plásmidos de expresión se seleccionaron y después se cultivaron en medio de LB con carbenicilina. Se agregó 1 mM de IPTG a cada cultivo cuando la DO⁶⁰⁰alcanzó 0,5. Las células se recogieron después de 4 horas de inducción. Se aisló la proteína total de las células hirviéndolas durante 5 minutos en amortiguador de carga SDS-PAGE 2X. Se cargaron 5 ul de cada muestra en un gel de SDS-PAGE. Tal como se muestra en la Figura 16, las células que contenían los plásmidos de expresión pUC19-PTH+PET y pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET produjeron los rendimientos más elevados de proteína diana.

25 Ejemplo 17 (solo para referencia)

Diseño de terminadores sintéticos para mayor expresión de ARN y proteína

La secuencia de terminación rrn BT2+PET+PTH+PET (SEQ ID NO. 18) se modificó para retirar la secuencia que no forma horquilla y los errores de emparejamiento de pares de bases dentro de las regiones formadoras de horquillas; se predijo mediante CLC Main Workbench (versión 6.8.4) que la secuencia sintética SEQ ID NO. 21 formaría una estructura secundaria con 3 horquillas de tamaño medio adyacentes sin errores de emparejamiento en las regiones formadoras de horquillas. Véase Figura 17B. Se sintetizó un polinucleótido de ADN que comprende la SEQ ID NO. 21. Se clonó un polinucleótido de ADN que comprende la SEQ ID NO. 21 en el vector pUC19 corriente abajo del promotor de T7.

Se identificaron cuatro secuencias de terminador putativas diferentes a partir de E. coli y se dispusieron en tándem, lo que dio como resultado una secuencia sintética, la SEQ ID NO. 22. Se predijo mediante CLC Main Workbench (versión 6.8.4) que la SEQ ID NO: 22 formaría una estructura secundaria con 4 horquillas de tamaño medio adyacentes con algunos errores de emparejamiento ("burbujas") en las regiones formadoras de horquillas. Véase la Figura 17C. Se sintetizó un polinucleótido de ADN que comprende la SEQ ID NO. 22 y clonó en el vector pUC19 corriente abajo del promotor de T7.

La SEQ ID NO: 22 se modificó para retirar la secuencia que no forma horquilla y los errores de emparejamiento de pares de bases dentro de las regiones formadoras de horquillas; se predijo mediante CLC Main Workbench (versión 6.8.4) que la secuencia sintética resultante, SEQ ID NO. 23, formaría una estructura secundaria con 4 horquillas de tamaño medio adyacentes sin errores de emparejamiento en las regiones formadoras de horquillas. Se hizo un intento de sintetizar químicamente un polinucleótido de ADN que comprende la SEQ ID NO. 23, sin embargo, no se obtuvo ningún producto. Sin deseo de limitarse por ninguna teoría en particular, la estructura secundaria de la SEQ ID NO.

23 puede haber interferido con la síntesis.

Tabla 7: Terminadores sintéticos

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una secuencia de terminador de la transcripción que comprende una secuencia de ácido nucleico según lo representado en la SEQ ID NO: 13.

2. Una construcción de expresión con modificación genética que comprende:

a. un promotor;

b. una primera secuencia de ácido nucleico ubicada corriente abajo con respecto a la transcripción del promotor, en la que la primera secuencia de ácido nucleico codifica un ARNbc, un ARN regulador o una proteína; y c. una segunda secuencia de ácido nucleico ubicada 3' con respecto a la primera secuencia de ácido nucleico, en la que la segunda secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de terminador de la transcripción de la reivindicación 1; y

d. en la que la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están operativamente unidas al promotor y en la que las secuencias de promotor y terminador de la transcripción están en combinación funcional.

3. La construcción de expresión con modificación genética de la reivindicación 2, en la que el promotor se selecciona del grupo que consiste en T7, T3, SV40, SP6, T5, promotor de p-lactamasa, promotor de galactosa de E. coli, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptófano (trp), promotor de operón lactosa (lac), promotor de lacUV5, promotor de trc y promotor de tac.

4. La construcción de expresión con modificación genética de la reivindicación 2, en la que el promotor se selecciona de un grupo que consiste en un promotor Pol I de ARN, un promotor Pol II de ARN y un promotor Pol III de ARN.

5. La construcción de expresión con modificación genética de la reivindicación 4, en la que el promotor Pol III de ARN se selecciona de un grupo que consiste en un promotor U6, un promotor de ARNt, un promotor LTR retrovírico, un promotor VA1 de adenovirus, un promotor de ARN 5Sr, un promotor de ARN 7SK, un promotor de ARN 7SL y un promotor de ARN H1.

6. La construcción de expresión con modificación genética de la reivindicación 2, en la que la construcción comprende además una o más secuencias de potenciador o poliadenilación.

7. La construcción de expresión con modificación genética de la reivindicación 2, en la que la transcripción de la construcción logra una eficacia de terminación de al menos 60 %.

8. La construcción de expresión con modificación genética de la reivindicación 2, en la que la primera secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 14, 15 y 20.

9. Una célula hospedadora bacteriana que comprende un vector que comprende la construcción de expresión con modificación genética de la reivindicación 2.

10. La célula hospedadora bacteriana de la reivindicación 9, en la que la célula hospedadora bacteriana no expresa RNasa A.

11. La célula hospedadora bacteriana de la reivindicación 9, en la que la célula hospedadora bacteriana es una célula de Escherichia coli.

12. La célula hospedadora bacteriana de la reivindicación 11, en la que dicha célula de Escherichia coli es deficiente en RNasa III.

13. La célula hospedadora bacteriana de la reivindicación 9, en la que la célula hospedadora bacteriana está inactiva y sin lisar.

14. Un procedimiento para mejorar la producción de ARN que comprende proporcionar la construcción de expresión con modificación genética de la reivindicación 2 a una célula huésped.

15. Un procedimiento para mejorar la producción de proteínas que comprende proporcionar la construcción de expresión con modificación genética de la reivindicación 2 a una célula huésped.