ES2837400T3 - Adenovirus sintético con tropismo para los tejidos dañados para su uso en la promoción de la reparación de heridas y regeneración tisular - Google Patents

Adenovirus sintético con tropismo para los tejidos dañados para su uso en la promoción de la reparación de heridas y regeneración tisular Download PDF

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Abstract

Un adenovirus sintético que comprende: un transgén que codifica al menos un factor heterólogo que promueve la reparación de las heridas o la regeneración tisular; una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado; y una proteína fibra quimérica que comprende un dominio de eje del adenovirus tipo (Ad5) y un dominio knob del adenovirus tipo 34 (Ad34), para su uso en la promoción de la reparación de heridas o la regeneración tisular en un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN
Adenovirus sintético con tropismo para los tejidos dañados para su uso en la promoción de la reparación de heridas y regeneración tisular
Campo
Esta descripción se refiere a adenovirus sintéticos que se alojan en sitios de tejido dañado. Esta descripción se refiere además al uso de adenovirus sintéticos para expresar transgenes para diagnóstico o terapéuticos, para detectar tejido dañado y/o promover la cicatrización de la herida y la regeneración tisular.
Antecedentes
La adecuada cicatrización de la herida y la recuperación de las lesiones es esencial para la salud humana. El fallo en la reparación del tejido puede resultar en una infección oportunista, sepsis, pérdida irreparable de la función del tejido y dolor. Además, la inflamación crónica del sitio herido también predispone al tejido para el desarrollo de cáncer (Coussens y Werb, Nature 420:860-867, 2002). En general, el proceso de reparación de las heridas ocurre en casi todos los tejidos. Por lo tanto, la secuencia de eventos que sigue al daño renal, por ejemplo, es similar a una quemadura o herida de bala, a pesar de los diferentes tipos de agresión y los diferentes órganos afectados. Sin embargo, la reparación tisular aberrante (tal como la fibrosis excesiva) resultará en la disfunción del órgano e incluso la discapacidad de por vida. La fibrosis es un proceso que se activa en respuesta a una lesión para mantener la arquitectura original del tejido y la integridad funcional (Schieppati y Remuzzi, Kidney Int Suppl, S7-S10, 2005). Sin embargo, los estímulos crónicos prolongados pueden causar la desregulación de los procesos normales y dar como resultado un depósito excesivo de matriz extracelular (Hirschberg, J Am Soc Nephrol 16:9-11, 2005). El depósito continuo de matriz extracelular resulta en cicatrices fibrosas, lo que conduce a la pérdida de la función del tejido. Por lo tanto, existe la necesidad de un medio para acelerar el cierre de la herida y promover la regeneración de la función del tejido.
La identificación de los factores de reprogramación Oct4, Sox2, Klf4 y c-myc fue un hallazgo científico importante. Sin embargo, la expresión estable de estos factores puede dar lugar al cáncer (Abad y otros., Nature 502:340-345, 2013). También, la manipulación ex vivo de las células de un paciente consume mucho tiempo y es ineficiente. Las alteraciones epigenéticas en cultivo también excluyen su utilidad funcional en la reparación tisular aguda y crónica. Otro medio potencial para promover la reparación de las heridas es utilizar la vía clave en el proceso de cicatrización de la herida, tal como la vía Wnt. Las proteínas Wnt son una familia de 19 glicoproteínas secretadas que tienen funciones críticas en la reparación y cicatrización de las heridas. La inhibición o falta de señalización de Wnt en una fractura ósea evita la unión del hueso lesionado (Secreto y otros., Curr Osteoporos Rep 7:64-69, 2009). En las lesiones cutáneas, la falta de Wnt da como resultado cicatrices permanentes (Lim y Nusse, Cold Spring Harb Perspect Biol 5, 2013). En los infartos de miocardio, la falta de señalización de Wnt empeora los síntomas y el resultado es la rotura del miocardio. La elevación de Wnt en el momento de la lesión puede llevar a la amputación de una extremidad completamente funcional en ranas posmetamórficas. La elevación de Wnt en las heridas de la piel de los mamíferos también reduce las cicatrices y resulta en una epidermis funcional (Whyte y otros., Cold Spring Harb Perspect Biol 4:a008078, 2012). Sin embargo, la advertencia es que la señalización incontrolada y constitutiva de Wnt conduce al cáncer (Arwert y otros., Nat Rev Cancer 12:170-180, 2012). Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema de vector que se dirija específicamente al tejido lesionado y medie la expresión transciente de proteínas heterólogas. Por lo tanto, la identificación de un vector no replicante (tal como un adenovirus de replicación defectuosa), que se aloje y transduzca específicamente a células en el sitio de la lesión, permitiría la expresión regulada y transciente de proteína(s) de diagnóstico y/o terapéutica(s). Tal vector podría usarse para detectar y/o tratar una variedad de afecciones humanas en donde un proceso de reparación aberrante resulta en la pérdida de la función del tejido y una discapacidad a largo plazo.
Resumen
En la presente descripción se describen vectores de adenovirus sintéticos que infectan específicamente células en los sitios heridos o en regiones de tejido dañado, donde los vectores impulsan la expresión transciente de transgenes. Los adenovirus sintéticos codifican uno o múltiples transgenes, tales como transgenes que codifican sondas de diagnóstico (por ejemplo, marcadores fluorescentes o enzimáticos), factores de regeneración tisular, proteínas de cicatrización de la herida y/o factores de reparación.
En la presente descripción se proporciona un método para expresar al menos un transgén en células en el sitio de una herida o tejido dañado en un sujeto. En algunas modalidades, el método incluye administrar un adenovirus sintético al sujeto, que comprende el (los) transgén(es), una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado, y una proteína fibra quimérica que incluye un dominio de eje del adenovirus tipo 5 (Ad5) y un dominio knob del adenovirus tipo 34 (Ad34). En algunos ejemplos, el(los) transgén(es) es un gen reportero. En otros ejemplos, el(los) transgén(es) codifican al menos un factor que promueve la reparación de las heridas o la regeneración tisular. En algunos ejemplos, el método incluye además seleccionar un sujeto con una herida o tejido dañado.
También se proporciona en la presente descripción un método para promover la reparación de las heridas o la regeneración tisular en un sujeto. En algunas modalidades, el método incluye administrar al sujeto un adenovirus sintético que comprende un transgén que codifica al menos un factor heterólogo que promueve la reparación de las heridas o la regeneración tisular, una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado, y una proteína fibra quimérica que incluye un dominio de eje del Ad5 y un dominio knob del Ad34. En algunos ejemplos, el método incluye además seleccionar un sujeto con una herida o tejido dañado.
También se proporciona en la presente descripción un método para detectar una herida o tejido dañado en un sujeto. En algunas modalidades, el método incluye administrar al sujeto un adenovirus sintético que incluye un gen reportero, una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado, y una proteína fibra quimérica que incluye un dominio de eje del Ad5 y un dominio knob del Ad34.
Genomas sintéticos de adenovirus que comprenden la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1­ 8, 10 y 11 se proporcionan además en la presente descripción.
Lo anterior y otros objetos y características de la descripción resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, la cual procede con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un esquema que muestra modificaciones introducidas en adenovirus sintéticos ilustrativos descritos en la presente descripción. Un virus de replicación defectuosa se ingenieriza mediante el reemplazo de la región E1 con un gen reportero o un factor terapéutico. La proteína hexona se muta para prevenir la unión de la cápside del adenovirus al factor X (fX), de esta manera no se dirige el virus al hígado (Bradshaw y otros, Blood 114(5):965-971, 2009). Se insertan sitios de unión para el miR122 específico del hígado para prevenir la expresión del gen del virus en el hígado (Leja y otros., PLoS ONE 5(1):e8916, 2010). El dominio knob del Ad5 se reemplaza con el dominio knob del Ad34. El AdSyn-CO176 (SEQ ID n O: 6) y el AdSyn-CO877 (SEQ ID NO: 10) son virus sintéticos ilustrativos que comprenden estas modificaciones.
Las Figuras 2A-2B: Un adenovirus sintético con el dominio knob de fibra del Ad34 exhibe tropismo a los sitios heridos. (Figura 2A) Los adenovirus AdSyn-CO171 (AE1-EF1a-[luc-GFP]-miR122, hexona E451Q; SEQ ID NO: 1), AdSyn-CO172 (AE1-EF1a-[luc-GFP]-miR122; fibra quimérica Ad5/5/3, hexona E451Q; SEQ ID NO: 2), AdSyn-CO174 (AE1-EF1a-[luc-GFP]-miR122; fibra quimérica Ad5/5/11, hexona E451Q; SEQ ID NO: 4), AdSyn-CO176 (AE1-EF1a-[luc-GFP]-miR122; fibra quimérica Ad5/5/34, hexona E451Q; SEQ ID NO: 6) se inyectaron en ratones Fv B/NJ a través de la vena de la cola. El ratón que recibió solución salina sirvió como el control. El ratón que recibió el AdSyn-CO171 se marcó con un broche en la oreja izquierda. El ratón que recibió el AdSyn-C0172 se marcó con un broche en la oreja y la pata delantera izquierda. Los ratones que recibieron el AdSyn-CO174 se marcaron con broches en la oreja y la pata delantera derecha. Los ratones que recibieron el AdSyn-CO176 se marcaron con broches en ambas orejas y ambas patas delanteras. Se realizaron imágenes IVIS™ 48 horas después de la inyección. El tiempo de exposición fue de 1 minuto. Las señales de luciferasa de los sitios heridos se indican con un rectángulo. (Figura 2B) Antes de realizar la herida, se inyectó el AdSyn-CO176 en el ratón FVB/NJ por la vena de la cola. Se realizaron imágenes IVIS™ 72 horas después de la inyección. A continuación, los ratones se cortaron en ambas orejas y las dos patas delanteras y se realizaron las imágenes IVIS™ 72 horas después de la colocación del broche (6 días después de la inyección). El tiempo de exposición fue de 1 minuto. Se indican las señales de luciferasa de los sitios heridos.
Las Figuras 3A-3B: La infección específica del AdSyn-CO176 en el riñón dañado. En los ratones FVB/NJ se indujo una lesión de isquemia-reperfusión en un riñón mediante operación quirúrgica. El adenovirus quimera AdSyn-CO176 se inyectó en los ratones 24 horas después. Se realizaron imágenes IVIS™ a los 2 días (Figura 3A) y a los 7 días (Figura 3B) después de la inyección. El tiempo de exposición fue de 1 minuto.
Las Figuras 4A-4B: Una inyección de dosis más alta del AdSyn-CO176 conduce a la expresión específica de adenovirus en el riñón dañado por lesión de isquemia-reperfusión. (Figura 4A) Diagrama de flujo del experimento. La cirugía se realizó en el riñón izquierdo de ratones para inducir daño por lesión de isquemia-reperfusión. Cuarenta y ocho horas después de la cirugía, se inyectó en los ratones una dosis 10 veces mayor del AdSyn-CO176 (en comparación con el experimento mostrado en las Figuras 3A-3B) mediante inyección por la vena de la cola. Se realizaron imágenes IVIS™ 48 horas después de la inyección, y ambos riñones se separaron y seccionaron para observar la señal de GFP. (Figura 4B) Imagen IVIS™ de un ratón infectado que muestra la expresión del AdSyn-CO176 concentrada en la parte del riñón dañada.
Las Figuras 5A-5C: El Ad34 salvaje no muestra tropismo a los sitios heridos. El virus sintético AdSyn-CO721 se generó mediante el reemplazo de los genes de la región E1 del Ad34 salvaje con el reportero EF1a-[luc-GFP]-miR122. Ratones FVB/NJ se inyectaron por la vena de la cola con el AdSyn-C0171 (Figura 5A), el AdSyn-CO176 (Figura 5B) o el AdSyn-CO721 (Figura 5C). Se perforaron ambas orejas de los ratones al mismo tiempo que se inyectó el virus. Se realizaron imágenes IVIS™ 48 horas después de la inyección. El tiempo de exposición fue de 1 minuto.
Las Figuras 6A-6B: El adenovirus sintético que codifica PDFG-p promueve la cicatrización de la herida en un modelo de herida por raspado. Los fibroblastos de pulmón fetal humano (IMR-90) se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 18 horas hasta casi el 100% de confluencia. El WoundMaker de 96 pines INCUCYTE™ se usó para crear una herida por raspado en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Las células se dejaron sin tratar o se infectaron inmediatamente con el AdSyn-CO877 (que expresa PDFG-p) a un MOI de 1. La migración celular y la cicatrización de la herida se evaluaron mediante la medición de la confluencia de la herida (Figura 6A) y la densidad relativa de la herida (Figura 6B).
Las Figuras 7A-7B: La administración de un adenovirus sintético que codifica PDFG-p, dirigido a las heridas, promueve la recuperación del daño renal en un modelo de ratón con lesión por isquemia-reperfusión (IRI). Se indujo una lesión por isquemia-reperfusión en ambos riñones al pinzar los pedículos renales durante 30 minutos. A continuación, los ratones inmediatamente se inyectaron intravenosamente a través de la vena de la cola con 200 pl de solución salina (Z337L), 109 partículas del virus AdSyn-CO876 (Z338R) que no se dirigen a las heridas o 109 partículas del virus AdSyn-CO877 (Z340R y Z341L) que se dirigen a las heridas. Los controles incluyeron un ratón con daño renal inducido que no recibió ninguna inyección (Z336L), un ratón operado de forma simulada (el mismo procedimiento quirúrgico excepto que no se aplicó la pinza) que no recibió inyección (Z342R), y un ratón sin daño renal que no recibió una inyección (tipo salvaje). Se colectó sangre en el momento de la inyección (0 h) y después de 18 horas, para medir el nitrógeno ureico en sangre (BUN; Figura 7A) y la creatinina (Figura 7B).
Las Figuras 8A-8C: El miR142-3p específico del bazo silencia la expresión del virus en el bazo. Se generó un virus sintético (AdSyn-CO338) que contiene cuatro sitios de unión de miR142-3p en 3' UTR de E1A para probar si el miR142-3p puede silenciar la expresión del virus en el bazo. AdSyn-C0171 (AE1-EF1a-[luc-GFP]-miR122, hexona E451Q), AdSyn-CO338 (AE1-EF1a-[luc-GFP]-miR142-3p, hexona E451Q, AE3A/E3B) y AdSyn-CO339 AE1-EF1a-[luc-GFP], hexona E451Q, AE3A/E3B) se inyectaron en la vena de la cola de ratones y se detectó la expresión de la luciferasa después de 48 horas mediante imágenes IVIS™. El tiempo de exposición fue de 1 minuto. (Figura 8A) Señal de luciferasa relativa en el hígado y el bazo después de la inyección con el AdSyn-CO171. (Figura 8B) Señal de luciferasa relativa en el hígado después de la inyección del AdSyn-CO338 o el AdySyn-CO339. (Figura 8C) Señal de luciferasa relativa en el bazo tras la infección del AdSyn-CO338 o el AdySyn-CO339.
LISTADO DE SECUENCIAS
Las secuencias de aminoácidos que se relacionan en el listado de secuencias adjunto se muestran mediante el uso de las abreviaturas de letras estándares para las bases de nucleótidos, y el código de tres letras, como se define en 37 C.F.R. § 1.822. Se muestra solamente una hebra de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria se incluye mediante cualquier referencia a la cadena que se muestra. La lista de secuencias se envía como un archivo de texto ASCII, creado el 5 de octubre de 2016, 499 KB. En el listado de secuencias adjunto:
SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos del adenovirus sintético AdSyn-CO171.
SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos del adenovirus sintético AdSyn-CO172.
SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos del adenovirus sintético AdSyn-CO173.
SEQ ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos del adenovirus sintético AdSyn-CO174.
SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos del adenovirus sintético AdSyn-CO175.
SEQ ID NO: 6 es la secuencia de nucleótidos del adenovirus sintético AdSyn-CO176.
SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleótidos del adenovirus sintético AdSyn-CO199.
SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de hexona en Ad5.
SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos de hexona E451Q en Ad5.
SEQ ID NO: 10 es la secuencia de nucleótidos del adenovirus sintético AdSyn-CO877.
SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleótidos del adenovirus sintético AdSyn-CO338.
Descripción detallada
I. Abreviaturas:
Ad adenovirus
BUN nitrógeno ureico en sangre
CAR receptor de adenovirus coxsackie
GFP proteína verde fluorescente
IRI lesión por isquemia-reperfusión
miR microARN
PDGF factor de crecimiento derivado de plaqueta
UTR región no traducida
WT salvaje
II. Términos y métodos
A menos que se indique de cualquier otra manera, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Pueden encontrarse definiciones de términos comunes en biología molecular en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew y otros. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569­ 8).
Para facilitar la revisión de las diversas modalidades de la descripción, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:
Adenovirus: Un virus sin envoltura con un genoma de ADN de doble hebra lineal y una cápside icosaédrica, Actualmente se conocen 68 serotipos de adenovirus humano, las cuales se dividen en siete especies (especies A, B, C, D, E, F y G). Los diferentes serotipos de adenovirus se asocian con diferentes tipos de enfermedad, y algunos serotipos causan enfermedades respiratorias (principalmente especies B y C), conjuntivitis (especies B y D) y/o gastroenteritis (especies F y G).
Administración: Para proporcionar o dar a un sujeto un agente, tal como un agente terapéutico (por ejemplo un virus recombinante), mediante cualquier ruta efectiva. Las vías de administración ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, rutas de inyección (tales como vías subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e intravenosa), oral, intraductal, sublingual, rectal, transdérmica, intranasal, vaginal y de inhalación. En algunos ejemplos, los adenovirus recombinantes descritos en la presente descripción se administran directamente a un sitio herido, por ejemplo, en la piel.
Quimérico: Compuesto por al menos dos partes de diferente origen. En el contexto de la presente descripción, un "adenovirus quimérico" es un adenovirus que tiene material genético y/o proteínas derivadas de al menos dos serotipos diferentes (tal como de Ad5 y de un segundo serotipo de adenovirus). En este contexto, un adenovirus "cápside-intercambiada" se refiere a un adenovirus quimérico en el que las proteínas de la cápside se derivan a partir de un serotipo de adenovirus y las proteínas restantes se derivan de otro serotipo de adenovirus. De manera similar, una "fibra quimérica" es una proteína fibra que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de al menos dos serotipos diferentes de adenovirus. Por ejemplo, una fibra quimérica puede estar compuesta por una fibra de eje del Ad5 y una fibra knob de un segundo serotipo de adenovirus.
Contacto: Colocación en asociación física directa; incluye tanto en forma sólida como en forma líquida.
Variante degenerada: En el contexto de la presente descripción, una "variante degenerada" se refiere a un polinucleótido que codifica un péptido que incluye una secuencia que está degenerada como resultado del código genético. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón, Por tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican un péptido están incluidas, siempre que la secuencia de aminoácidos del péptido codificado por la secuencia de nucleótidos no cambie.
No dirigido: En el contexto de la presente descripción, un adenovirus "no dirigido" es un adenovirus recombinante o sintético que comprende una o más modificaciones que alteran el tropismo del virus de manera que ya no infecta, o ya no infecta sustancialmente, una célula o tipo de tejido particular. En algunas modalidades, el adenovirus recombinante o sintético comprende una mutación de la cápside, tal como una mutación en la proteína hexona (por ejemplo, E451Q). En algunas modalidades, el adenovirus recombinante o sintético comprende una cápside nativa de un adenovirus que naturalmente no infecta, o no infecta sustancialmente, una célula o tipo de tejido particular. En algunas modalidades en la presente descripción, el adenovirus recombinante o sintético no se dirige al hígado y/o el bazo.
E1A: La región temprana del adenovirus 1A (E1A) y el polipéptido que se expresa a partir del gen. La proteína E1A juega un papel en la replicación del genoma viral mediante el impulso de las células al ciclo celular. Como se usa en la presente, el término "proteína E1A" se refiere a las proteínas expresadas del gen E1A y el término incluye proteínas E1A producidas por cualquier serotipo de adenovirus.
Fibra: La proteína fibra del adenovirus es una proteína trimérica que media la unión a los receptores de la superficie celular. La proteína fibra se compone de un eje N-terminal largo y un knob globular C-terminal.
Proteína de fusión: Una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos de al menos dos proteínas o péptidos diferentes (heterólogos). Las proteínas de fusión pueden generarse, por ejemplo, mediante la expresión de una secuencia de ácido nucleico ingenierizada a partir de secuencias de ácido nucleico que codifican al menos una porción de dos proteínas diferentes (heterólogas). Para crear una proteína de fusión, las secuencias de ácido nucleico deben estar en el mismo marco de lectura y no contener codones de parada internos. Las proteínas de fusión, particularmente las proteínas de fusión cortas, también pueden generarse mediante síntesis química.
Heterólogo: Una proteína o gen heterólogo se refiere a una proteína o gen derivado de una fuente o especie diferente.
Hexon: Una proteína principal de la cápside del adenovirus. Una secuencia de hexona ilustrativa de Ad5 se expone más adelante en la presente descripción como SEQ ID NO: 8. Una secuencia de hexona mutante que comprende una sustitución en E451Q se expone más adelante en la presente descripción como SEQ ID NO: 9.
Aislado: Un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, una proteína, un virus o una célula) ha sido sustancialmente separado o purificado de otros componentes biológicos en la célula o tejido del organismo, o del propio organismo, en el cual el componente de existe de forma natural, tal como otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y células. Las moléculas de ácido nucleico y las proteínas que se han "aislado" incluyen las purificadas mediante métodos de purificación estándar. El término también abarca moléculas de ácido nucleico y proteínas preparadas mediante la expresión recombinante en una célula huésped, así como también moléculas de ácido nucleico y proteínas sintetizadas químicamente.
MicroARN (miARN o miR): Molécula de ARN monocatenario que regula la expresión génica en plantas, animales y virus. Un gen que codifica un microARN se transcribe para formar un microARN de transcripción primaria (pri-miARN), el cual se procesa para formar una molécula corta de tallo-bucle, denominada microARN precursor (pre-miARN), seguida de la escisión endonucleolítica para formar el microARN maduro. Los microARN maduros tienen aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud y son parcialmente complementarios a la 3'UTR de uno o más ARN mensajeros diana (ARNm). Los microARN modulan la expresión génica al promover la escisión de los ARNm diana o mediante el bloqueo de la traducción del transcrito celular. En el contexto de la presente descripción, un "microARN específico del hígado" es un microARN que se expresa preferentemente en el hígado, tal como un microARN que se expresa solo en el hígado, o un microARN que se expresa significativamente más en el hígado en comparación con otros órganos o tipos de tejidos. En algunas modalidades, el microARN es miR-122.
Modificación: Un cambio en la secuencia de una secuencia de ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos incluyen, por ejemplo, sustituciones, inserciones y deleciones, o sus combinaciones. Las inserciones incluyen fusiones terminales amino y/o carboxilo así como también inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Las deleciones se caracterizan por la eliminación de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de proteína. En algunas modalidades en la presente descripción (tal como una sustitución, inserción o deleción) resulta en un cambio en la función, tal como una reducción o mejora de una actividad particular de una proteína. Como se usa en la presente, "A" o "delta" se refieren a una deleción. Las modificaciones sustitutivas son aquellas en las cuales se ha eliminado al menos un residuo y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden ocurrir en varios lugares diferentes a la vez. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas pueden combinarse para llegar a una secuencia mutante final. Estas modificaciones pueden prepararse mediante la modificación de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína, lo que produce de esta manera el ADN que codifica la modificación. Las técnicas para realizar las mutaciones de inserción, deleción y sustitución en sitios predeterminados del ADN con una secuencia conocida se conocen bien en la técnica. Una proteína, ácido nucleico o virus "modificado", es uno que tiene una o más modificaciones, como se indica anteriormente.
Operativamente vinculado: Una primera secuencia de ácido nucleico está operativamente vinculada con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está operativamente vinculado a la secuencia codificadora si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia codificadora. Generalmente, las secuencias de ADN operativamente vinculadas son contiguas y, donde es necesario se unen dos regiones codificantes de proteína, en el mismo marco de lectura.
Portador farmacéuticamente aceptable: Los portadores farmacéuticamente aceptables (vehículos) útiles en esta descripción son convencionales. Ciencias Farmacéuticas de Remington, por EW Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para el suministro farmacéutico de uno o más compuestos, moléculas o agentes terapéuticos (porejemplo un virus sintético descrito en la presente descripción).
En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales usualmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol, o similares como vehículo. Para las composiciones sólidas (por ejemplo, en forma de polvo, píldora, tableta o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores neutrales biológicos, las composiciones farmacéuticas administradas pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservantes, y agentes amortiguadores del pH y similares, por ejemplo acetato de sodio o monolaurato de sorbitano.
Polipéptido, péptido o proteína: Un polímero en el cual los monómeros son residuos de aminoácidos que se unen mediante enlaces amida. Cuando los aminoácidos son alfa aminoácidos, pueden usarse tanto el isómero óptico L o el isómero óptico D. Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína”, se usan indistintamente en la presente descripción. Estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácido es un mimético químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como también a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. El término "residuo" o "residuo de aminoácido" incluye la referencia a un aminoácido que se incorpora en una proteína, polipéptido o péptido.
Una sustitución conservadora en un polipéptido es una sustitución de un residuo de aminoácido en una secuencia de proteína por un residuo de aminoácido diferente que tiene propiedades bioquímicas similares. Típicamente, las sustituciones conservadoras tienen poco o ningún impacto sobre la actividad de un polipéptido resultante. Por ejemplo, una proteína o péptido que incluye una o más sustituciones conservadoras (por ejemplo, no más de 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones) retiene la estructura y función de la proteína o péptido salvaje. Puede producirse un polipéptido para que contenga una o más sustituciones conservadoras mediante la manipulación de la secuencia de nucleótidos que codifica ese polipéptido mediante el uso, por ejemplo, de procedimientos estándar tales como mutagénesis dirigida al sitio o PCR. En un ejemplo, tales variantes pueden seleccionarse fácilmente al probar la reactividad cruzada de anticuerpo o su capacidad para inducir una respuesta inmune. Más abajo se muestran ejemplos de sustituciones conservadoras.
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Las sustituciones conservadoras generalmente mantienen (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral.
Las sustituciones que en general se espera que produzcan los mayores cambios en las propiedades de las proteínas serán no conservativas, por ejemplo cambios en los cuales (a) un residuo hidrofílico, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por (o mediante) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o mediante) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histadilo, se sustituye por (o mediante) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o mediante) uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina.
Prevenir, tratar o mejorar una enfermedad: "Prevenir" una enfermedad se refiere a inhibir el desarrollo completo de una enfermedad. "Tratamiento" se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o condición patológica después que esta ha comenzado a desarrollarse. "Mejoramiento" se refiere a la reducción del número o la gravedad de los signos o síntomas de una enfermedad.
Promotor: Una región de ADN que dirige/inicia la transcripción de un ácido nucleico (por ejemplo un gen). Un promotor incluye las secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción. Típicamente, los promotores se encuentran cerca de los genes que transcriben. Un promotor también incluye opcionalmente los elementos potenciadores o represores distales, los cuales pueden localizarse hasta varios miles de pares de bases a partir del sitio de inicio de la transcripción. Un "promotor constitutivo" es un promotor que está continuamente activo y no está sujeto a regulación por señales o moléculas externas. Por el contrario, la actividad de un "promotor inducible" está regulada por una señal o molécula externa (por ejemplo, un factor de transcripción o tetraciclina). Un "promotor específico de tejido" es un promotor que es sustancialmente activo solo en un tejido o tejidos particulares.
Proteína IX (pIX): Un componente menor de la cápside del adenovirus que se asocia con la proteína hexona
Purificado: El término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, está considerado como un término relativo. Por lo tanto, por ejemplo, un péptido, proteína, virus u otro compuesto activo purificado es uno que se aísla total o en parte de proteínas y otros contaminantes asociados naturalmente. En ciertas modalidades, el término "sustancialmente purificado" se refiere a un péptido, proteína, virus u otro compuesto activo que se ha aislado de una célula, medio de cultivo celular u otra preparación cruda y sometido a fraccionamiento para eliminar varios componentes de la preparación inicial, tal como proteínas, restos celulares y otros componentes.
Recombinante: Una molécula de ácido nucleico, una proteína o un virus recombinante es uno que tiene una secuencia que no se produce de forma natural o tiene una secuencia que se produce mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de cualquier otra manera. Esta combinación artificial puede lograrse mediante síntesis química o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de moléculas de ácido nucleico, tal como mediante técnicas de ingeniería genética. El término "recombinante" también incluye ácidos nucleicos, proteínas y virus que se han alterado únicamente por adición, sustitución o deleción de una porción de la molécula de ácido nucleico natural, proteína o virus.
Identidad de secuencia: La identidad o similitud entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos, o dos o más secuencias de aminoácidos, se expresa en términos de identidad o similitud entre las secuencias. La identidad de secuencia puede medirse en términos de porcentaje de identidad; cuanto mayor es el porcentaje, más idénticas son las secuencias. La similitud de secuencia puede medirse en términos de porcentaje de similitud (el cual tiene en cuenta las sustituciones conservadoras de aminoácidos); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las secuencias. Los homólogos u ortólogos de secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos poseen un grado relativamente alto de identidad/similitud de secuencia cuando se alinean mediante el uso de métodos estándar. Esta homología es más significativa cuando las proteínas ortólogas o los ADNc se derivan de especies que están más estrechamente relacionadas (tal como secuencias humanas y de ratón), en comparación con especies más distantes (tal como secuencias de seres humanos y C. elegans).
Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet y otros., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang y otros. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; y Pearson y otros., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990, presenta una consideración detallada de los métodos de alineación de secuencias y los cálculos de homología.
La herramienta de búsqueda de alineación local básica de NCBI (BLAST) (Altschul y otros., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) está disponible en varias fuentes, incluido el Centro Nacional de Información Biológica (NCBI) y en Internet, para usarse en relación con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Puede encontrarse información adicional en el sitio web de NCBI.
Serotipo: Un grupo de microorganismos estrechamente relacionados (tal como virus) que se distinguen mediante un conjunto característico de antígenos.
Sujeto: Organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoría que incluye mamíferos humanos y no humanos, tales como sujetos veterinarios, por ejemplo, ratones, perros, gatos, conejos, vacas, caballos, ovejas y cerdos. Sintético: Producido por medios artificiales en un laboratorio, por ejemplo, un ácido nucleico sintético o una proteína pueden sintetizarse químicamente en un laboratorio.
Agente terapéutico: Un compuesto químico, molécula pequeña, virus recombinante u otra composición, tal como un compuesto antisentido, anticuerpo, péptido o molécula de ácido nucleico capaz de inducir un efecto terapéutico o profiláctico deseado cuando se administra adecuadamente a un sujeto.
Cantidad terapéuticamente efectiva: Una cantidad de un agente terapéutico o farmacéutico especificado (por ejemplo un virus recombinante) suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto, o en una célula, que está tratándose con el agente. La cantidad efectiva del agente puede depender de varios factores, que incluyen, entre otros, el sujeto o las células que están tratandose y la forma de administración de la composición terapéutica.
Daño tisular: Se refiere a cualquier daño o lesión en un tejido que puede resultar de, por ejemplo, una lesión física o una enfermedad o condición patológica. En algunos casos, el daño tisular es causado por isquemia, isquemia/reperfusión, cirrosis o fibrosis anormal.
Regeneración tisular: En el contexto de la presente descripción, "regeneración tisular" se refiere al crecimiento de tejido nuevo o a la curación del tejido dañado.
Transgén: Un gen que se ha insertado en el genoma de un organismo diferente (tal como un virus). Los transgenes también pueden denominarse como genes heterólogos.
Uexon: Un marco de lectura abierto ubicado en la l hebra (transcripción hacia la izquierda) entre la región E3 temprana y el gen de la fibra (Tollefson y otros., J Virol 81(23):12918-12926).
Vector: Una molécula de ácido nucleico que permite la inserción de ácido nucleico extraño sin interrumpir la capacidad del vector para replicarse y/o integrarse en una célula huésped. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permitan replicarse en una célula huésped, como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos. Un vector de expresión es un vector que contiene las secuencias reguladoras necesarias para permitir la transcripción y traducción del gen o los genes insertados.
Herida: Una lesión o daño a los tejidos vivos.
Reparación de las heridas: El proceso de reemplazar estructuras celulares o capas de tejido dañadas o faltantes. La reparación de las heridas (o cicatrización de la herida) se caracteriza por las etapas de hemostasis (coagulación de la sangre), inflamación, proliferación (crecimiento de nuevos tejidos) y remodelación.
III. Descripción general de varias modalidades
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un adenovirus sintético que comprende:
un transgén que codifica al menos un factor heterólogo que promueve la reparación de las heridas o la regeneración tisular;
una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado; y
una proteína fibra quimérica que comprende un dominio de eje del adenovirus tipo 5 (Ad5) y un dominio knob del adenovirus tipo 34 (Ad34), para su uso en la promoción de la reparación de las heridas o la regeneración tisular en un sujeto.
En una modalidad preferida dicha herida es una herida cutánea.
En una modalidad preferida, dicho tejido dañado es tejido de riñón, corazón, hígado o pulmón, opcionalmente en donde el adenovirus sintético comprende una cápside modificada que no dirige el virus al hígado, opcionalmente en donde el adenovirus sintético comprende una proteína hexona modificada, opcionalmente la proteína hexona modificada comprende una mutación E451Q.
En una modalidad preferida, dicho adenovirus sintético comprende además uno o más sitios de unión para un microARN específico del hígado, opcionalmente el microARN específico del hígado es miR-122 opcionalmente en donde uno o más sitios de unión están en 3'UTR de la región E1 del adenovirus.
En una modalidad preferida, dicho transgén codifica al menos un factor que promueve la reparación de las heridas, opcionalmente, el al menos un factor que promueve la reparación de las heridas se selecciona del grupo que consiste en:
i) un miembro de la vía de señalización Wnt o la vía de señalización TGF-p;
ii) se selecciona del grupo que consiste en Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16, TGF-pi, TGF-J32, TGF-03, PDGF-a, PDGF-p, PDGF-c, PDGF-d, y TNF-a;
iii) PDGF-p.
En una modalidad preferida, dicho transgén codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el riñón, opcionalmente el al menos un factor se selecciona del grupo que consiste en: Wt1, Pax2, Foxc1, Foxd1, Bmp4, Sall1, Fgf7, Gdnf, Notch2, Sox y progranulin (PGRN).
En una modalidad preferida adicional, dicho transgén codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el corazón, opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en: Mef2c, Tbx20, Hand2, Foxhl y Bop.
En una modalidad preferida adicional, dicho transgén codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el hígado, opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en; Hex, Gata4, Gata6, Tbx3, Cebp-a, Hnf1-a, Hnf1-p, Foxa1, Foxa2, Foxa3, Hnf4-a y Hnf6.
En una modalidad preferida, dicho transgén codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el pulmón, opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en factor de células madre (SCF), Hnf3-p, Shh, Nkx2.1, Foxf1, Gli, FGF-10, GATA y VEGF.
En una modalidad preferida, dicha expresión de al menos un factor heterólogo que promueve la reparación de las heridas o la regeneración tisular está regulada por un promotor específico de tejido, en donde opcionalmente el promotor específico de tejido se selecciona del grupo que consiste en:
i) un promotor específico de tejido activo en el tejido de riñón, corazón, pulmón, hígado o páncreas.
ii) un promotor específico de tejido seleccionado de:
el promotor específico del páncreas que comprende Pdx1;
el promotor específico del hígado que comprende albúmina o a1-antitripsina;
el promotor específico del corazón que comprende MLC-2v;
el promotor específico de pulmón que comprende las proteínas surfactantes A, B o C; o
el promotor específico de riñón que comprende Sglt2, nefrina y cadherina específica de riñón.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un adenovirus sintético que comprende:
un gen reportero;
una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado; y
una proteína fibra quimérica que comprende un dominio de eje del adenovirus tipo 5 (Ad5) y un dominio knob del adenovirus tipo 34 (Ad34), para su uso en la detección de una herida o tejido dañado en un sujeto
En una modalidad preferida, dicho adenovirus sintético se genera del genoma de vector Ad5 o Ad2.
En una modalidad preferida adicional, dicho adenovirus sintético comprende además uno o más sitios de unión para un microARN específico del bazo, opcionalmente en 3'UTR de la región E1 del adenovirus.
En una modalidad preferida, dicho microARN específico de bazo es miR142-3p.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un genoma de adenovirus sintético que comprende la SEQ ID NO: 6 para su uso en la detección del tejido herido o dañado en un sujeto.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un genoma de adenovirus sintético que comprende la SEQ ID NO: 10.
El adenovirus (Ad) es un vehículo natural de expresión de múltiples genes. Ciertas regiones codificantes del virus (E1, E3 y E4) no son necesarias para la replicación en cultivo o pueden complementarse con líneas celulares disponibles. Por tanto, cada una de estas regiones puede reemplazarse con genes no virales para impulsar la expresión de múltiples productos génicos terapéuticos de un solo virus. Los genomas de adenovirus no se integran en los genomas de células humanas y se pierden con la división celular y la ruptura de la envoltura nuclear. Hay 68 serotipos de adenovirus humanos diferentes, cada uno de los cuales tiene propiedades diferentes. El Ad5 ha sido el vector de Ad predominante usado en la investigación básica, la terapia génica y la terapia con virus oncolíticos. Sin embargo, el Ad5 tiene un tropismo limitado y solo infecta las células epiteliales que tienen el receptor CAR para la captación viral. Además, cuando se inyecta por vía intravenosa, el Ad5 se une a factores sanguíneos que provocan su secuestro en el hígado, donde puede desencadenar una inflamación y toxicidad potencialmente limitantes. Para superar estos problemas, la presente descripción proporciona adenovirus sintéticos con modificaciones genómicas en la región E1 y módulos de cápside que evitan la captación y la expresión en el hígado, y permiten dirigirse específicamente a los sitios de heridas y daño tisular cuando se inyectan por vía intravenosa.
En la presente descripción se describen adenovirus sintéticos que comprenden una proteína fibra quimérica que incluye un dominio de eje del Ad5 y un dominio knob del Ad34. Los virus descritos también incluyen una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado. Los adenovirus sintéticos son capaces de infectar específicamente sitios heridos y regiones de daño o lesión tisular. En la presente descripción se describe que los vectores de adenovirus sintéticos que infectan específicamente células en sitios heridos o en regiones de tejido dañado son capaces de expresar proteínas heterólogas en estas células. Pueden usarse adenovirus sintéticos que expresan genes reporteros, por ejemplo, para permitir la detección temprana de un sitio herido o tejido dañado, lo que de esta manera permite las decisiones de tratamiento apropiadas. Los adenovirus sintéticos que expresan reguladores clave de la reparación de las heridas o la regeneración tisular pueden usarse para promover la reparación de las heridas y/o estimular la regeneración tisular en órganos como el riñón, el corazón, el hígado, los pulmones y la piel, por ejemplo, para restaurar la homeostasis de los tejidos, reducir la fibrosis o las cicatrices, y mejorar la capacidad regenerativa sin aumentar el riesgo de los efectos fuera de la diana en otros tejidos (tal como en el hígado) o de transformación celular.
Nosotros describimos un método para expresar al menos un transgén (tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 transgenes) en el sitio de una herida o tejido dañado en un sujeto. En algunas modalidades, el método incluye administrar al sujeto un adenovirus sintético que comprende el(los) transgén(es); una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado; y una proteína fibra quimérica que comprende un dominio de eje del Ad5 y un dominio knob del Ad34, de esta manera expresa al menos un transgén en el sitio de la herida o tejido dañado. En algunos ejemplos, al menos un transgén codifica al menos un factor (tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 factores) que promueve la reparación de las heridas o la regeneración tisular. En algunos ejemplos, el método incluye además la etapa de detectar la expresión de al menos un transgén en el sitio de la herida o tejido dañado.
Nosotros describimos un método para promover la reparación de las heridas o la regeneración tisular en un sujeto. En algunos ejemplos, el método incluye administrar al sujeto un adenovirus sintético que comprende un transgén que codifica al menos un factor heterólogo que promueve la reparación de las heridas o la regeneración tisular; una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado; y una proteína fibra quimérica que comprende un dominio de eje del Ad5 y un dominio knob del Ad34, de esta manera promueve la reparación de las heridas o la regeneración tisular en el sujeto.
En algunos ejemplos el método incluye además seleccionar un sujeto con una herida o tejido dañado. En algunos ejemplos, el método incluye además medir la reparación de las heridas o la regeneración tisular, o detectar un aumento en la reparación de las heridas o la regeneración tisular.
En algunos ejemplos, la herida es una herida cutánea. En ejemplos particulares, la herida cutánea comprende una incisión, una laceración, una abrasión, una herida punzante, una herida cerrada, una quemadura, una lesión infectada, un sitio quirúrgico, una úlcera, una cicatriz, un queloide, una ampolla, sepsis, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, o sus combinaciones.
En algunos ejemplos, el tejido se daña como resultado de una lesión, enfermedad o condición patológica. En algunos ejemplos, el daño o lesión tisular es una lesión isquémica, una lesión por isquemia/reperfusión, una lesión microvascular, inflamación, fibrosis anormal, cirrosis o sus combinaciones. En algunos ejemplos, el tejido dañado es tejido de riñón, corazón, hígado o pulmón.
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético comprende una cápside modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado. En algunos ejemplos, la cápside modificada incluye una o más modificaciones que no dirigen el virus al hígado. En algunos ejemplos, el adenovirus sintético comprende una proteína hexona modificada. En un ejemplo no limitante, la proteína hexona modificada comprende una mutación E451Q, tal como la proteína hexona de s Eq ID NO: 9. En otro ejemplo, la proteína hexona modificada comprende regiones hipervariables de un serotipo de adenovirus diferente.
Alternativamente, el adenovirus sintético comprende una cápside nativa que no dirige el adenovirus sintético al hígado. En algunos ejemplos, la cápside nativa es una cápside Ad11, Ad34 o Ad35.
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético comprende además uno o más sitios de unión para un microARN específico del hígado. En algunos ejemplos, el microARN específico del hígado es miR-122, miR-30 o miR-192. En ejemplos particulares, el uno o más (tal como 1, 2, 3 o 4) sitios de unión de miR están en 3' UTR de la región E1 del adenovirus.
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético comprende además uno o más sitios de unión para un microARN específico del bazo. En algunos ejemplos, el microARN específico del bazo es miR142-3p. En ejemplos particulares, el uno o más (tal como 1, 2, 3 o 4) sitios de unión de miR están en 3' UTR de la región E1 del adenovirus.
Nosotros describimos un método para detectar una herida o tejido dañado en un sujeto. En algunos ejemplos, el método incluye administrar al sujeto un adenovirus sintético que comprende un gen reportero; una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado; y una proteína fibra quimérica que comprende un dominio de eje del Ad5 y un dominio knob del Ad34.
En algunos ejemplos de los métodos descritos en la presente descripción, el adenovirus sintético codifica al menos un gen reportero (tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 genes reporteros) para detectar un sitio herido o tejido dañado. En ejemplos específicos no limitativos, al menos un gen reportero que comprende un fluoróforo, tal como luciferasa, GFP, proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente roja (RFP), proteína fluorescente azul (BFP) y/o proteína fluorescente naranja (por ejemplo, mOrange), un factor soluble secretado o una sonda de MRI/PET/CT.
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético codifica al menos un factor que promueve la reparación de las heridas. En algunos ejemplos, el factor o factores que promueven la reparación de las heridas es un miembro de la vía de señalización de Wnt o la vía de señalización de TGF-p. En ejemplos específicos no limitantes, al menos un factor que promueve la reparación de las heridas se selecciona del grupo que consiste en Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b , Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16, TGF-01, TGF-p2, TGF-p3, PDGF-a, PDGF-p, PDGF-c, PDGF-d y TNF-a. En unos ejemplos no limitantes, el factor es PDGF-p.
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el riñón. En algunos ejemplos, al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el riñón se selecciona del grupo que consiste en Wt1, Pax2, Foxc1, Foxd1, Bmp4, Sall1, Fgf7, Gdnf, Notch2, Sox y progranulina (PGRN).
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el corazón. En algunos ejemplos, al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el corazón se selecciona del grupo que consiste en Mef2c, Tbx20, Hand2, Foxhl y Bop.
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el hígado. En algunos ejemplos, al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el hígado se selecciona del grupo que consiste en Hex, Gata4, Gata6, Tbx3, Cebp-a, Hnf1-a, Hnf1-p, Foxa1, Foxa2, Foxa3, Hnf4-a y Hnf6.
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el pulmón. En algunos ejemplos, el al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el pulmón se selecciona del grupo que consiste en factor de células madre (s Cf ), Hnf3-p, Shh, Nkx2.1, Foxfl, Gli, FGF-10, GATA y VEGF.
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el páncreas. En algunos ejemplos, al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el páncreas se selecciona del grupo que consiste en Glul, Lgmn, Reg3a, Ngn3, Pdx1 y Mafa.
En algunos ejemplos, la expresión de al menos un factor heterólogo que promueve la reparación de las heridas o la regeneración tisular está regulada por un promotor específico de tejido. En algunos ejemplos, el promotor específico de tejido está activo en el tejido de riñón, corazón, pulmón, hígado o páncreas. En ejemplos no limitantes particulares, el promotor específico del páncreas comprende Pdx1; el promotor específico del hígado comprende albúmina o a1-antitripsina; el promotor específico del corazón comprende MLC-2v; el promotor específico de pulmón comprende las proteína surfactantes A, B o C; o el promotor específico de riñón que comprende Sglt2, nefrina y cadherina específica de riñón.
En algunos ejemplos de los métodos descritos en la presente descripción, el adenovirus sintético se genera de un genoma de vector Ad5. En otras modalidades, el adenovirus sintético se genera de un genoma del vector Ad2.
Alternativamente, el adenovirus sintético comprende una proteína fibra quimérica que incluye un dominio de eje del Ad2 (en lugar de un dominio de eje del Ad5) y un dominio knob del Ad34.
En la presente descripción se proporcionan además genomas de adenovirus sintéticos que incluyen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.
IV. Adenovirus Sintéticos
Las tecnologías Adsembly, AdSLICr y RapAD permiten el diseño modular y la producción de adenovirus con capacidades únicas (ver Publicaciones PCT Nos. WO2012/024351 y WO2013/138505). La capacidad de diseñar virus personalizados con funciones y propiedades novedosas abre el potencial para expandir la utilidad del adenovirus como vehículo para suministrar proteínas terapéuticas mediante la persuasión del huésped para que produzca proteínas in situ. Esto proporciona la capacidad única de usar proteínas humanas que son difíciles de fabricar con fines terapéuticos y permite el suministro flexible de casi cualquier proteína a los tejidos enfermos.
Las modificaciones específicas descritas en la presente descripción se describen con referencia a la secuencia del genoma del adenovirus 5 (Ad5), pero pueden usarse con cualquier serotipo de adenovirus. El adenovirus es un vehículo natural de expresión de múltiples genes. Las regiones E1, E3 y E4 no son necesarias para la replicación en cultivo o pueden complementarse con líneas celulares disponibles. Cada una de estas regiones tiene elementos promotores independientes que pueden reemplazarse con promotores celulares si es necesario para impulsar la expresión de múltiples productos génicos a través del empalme alternativo.
Como se describe en la presente descripción, para crear vectores de expresión Ad5 para el uso y suministro de genes in vivo, los genes E1A/E1 se eliminaron y reemplazaron con al menos un transgén. En algunas modalidades, el transgén es una fusión de luciferasa-GFP impulsada por EF1a.
Los adenovirus sintéticos descritos en la presente descripción pueden incluir además modificaciones que no dirijan el virus al hígado. La hexona Ad5 puede unirse al factor X en la sangre, lo cual puede llevar a su absorción por las células de Kuppfer en el hígado que previenen la diseminación sistémica y limitan la inflamación. Para superar esto, se diseñaron adenovirus sintéticos para incluir modificaciones genómicas adicionales en el E1 y los módulos centrales que evitan la captación y expresión en el hígado, como se describe más abajo.
A. La fibra AD34 y las proteínas fibra quimérica para redirigir
Mientras que se ha mostrado que las proteínas fibra de Ad5 y muchos otros serotipos se unen al receptor de adenovirus coxsackie (CAR) para la unión celular, otros serotipos han mostrado usar CD46 (Gaggar y y otros., Nat Med 9:1408-1412, 2003.), desmogleína 2 (Wang y otros., Nat Med 17:96-104, 2011), ácido siálico (Nilsson y otros., Nat Med 17:105-109, 2011), u otras (Arnberg, Trends Pharmacol Sci 33:442-448, 2012). El uso de receptores de muchos serotipos no se ha examinado a fondo y no se cree que CD46 se exprese en ratones maduros. Dado que knob globular en el extremo C-terminal de la proteína fibra es típicamente responsable de la unión al receptor, las quimeras se crearon mediante el reemplazo de la fibra knob del Ad5 con las de Ad3, Ad9, Ad11, Ad12 o Ad34 (ver el Ejemplo 1 más abajo). Cada virus se creó con el mismo módulo E1 que contiene una deleción E1A/E1B y una fusión luciferasa-GFP impulsada por un promotor EF1a. El panel se usó para transducir la línea de células madre H9 y se midió la expresión de la luciferasa. En comparación con las fibras Ad5, se observó una expresión de luciferasa-GFP significativamente más alta en casi todas las células mediante el uso de quimeras, tanto con Ad3, Ad9, Ad12 como Ad34. Por el contrario, la expresión de luciferasa-GFP fue casi universalmente menor en las células transducidas con la fibra quimérica Ad11. Estos datos demuestran la capacidad de combinar partes modificadas de otros serotipos para mejorar los vectores basados en Ad5. En este caso, permite un ensamblaje rápido de virus que están optimizados para entrar en tipos de células específicos.
B. Modificaciones para no dirigirlos al hígado
Los vectores tipo 5 de adenovirus naturales solo infectarán los pulmones (a través de inhalación) o el hígado (a través de administración intravenosa). La hexona Ad5 se une al factor X en la sangre, lo que conduce a su absorción por las células de Kuppfer en el hígado, lo que previene la diseminación sistémica e induce una inflamación por el virus limitada. Para superar esto y permitir el suministro intravenoso de virus que podrían viajar a los sitios de heridas/lesiones de manera sistémica, se diseñaron adenovirus sintéticos para incluir modificaciones genómicas adicionales en el E1 y los módulos centrales que evitan la captación y expresión en el hígado.
Para evitar la captación y el secuestro del virus en el hígado a través de la unión de la hexona Ad5 al factor X, los virus se diseñaron con una mutación adicional en la hexona (E451Q) que previene la captación en el hígado. Por ejemplo, el AdSyn-CO171 no se acumula en el hígado y, en cambio, es capaz de dirigirse a otros órganos, como el bazo y los ganglios linfáticos. Por lo tanto, en algunas modalidades en la presente descripción, el adenovirus sintético comprende una proteína hexona modificada con una sustitución E451Q.
Para evitar la expresión fuera de la diana en el hígado, los virus se diseñaron para incluir sitios de unión en la región 3' no traducida (UTR) de la región E1 para los microARN que se expresan específicamente en el hígado. En ejemplos particulares, miR122 se seleccionó como el microARN específico del hígado ya que su expresión y sitios de unión se conservan en células hepáticas, tanto humanas como de ratón. En algunos ejemplos, se insertaron dos sitios de unión de micro-ARN para miR122 específico de hígado en el 3'UTR de E1A para prevenir cualquier captación de virus residual en el hígado que induzca la expresión génica viral y respuestas inflamatorias celulares.
En la presente descripción se describe que un adenovirus sintético con el sitio de unión de miR-122 y la mutación en hexona no se acumula en el hígado y, en cambio, es capaz de dirigirse a otros órganos, tales como el bazo y los ganglios linfáticos (ver Ejemplo 1). En algunos ejemplos, uno o más sitios de unión para el microARN específico del hígado están ubicados en el 3'-UTR de E1A. En algunos ejemplos, el microARN específico del hígado es miR-122, miR-30 o miR-192.
En la presente descripción se contemplan otras mutaciones en el gen de hexona del adenovirus para prevenir la acumulación del adenovirus en el hígado. Por ejemplo, un adenovirus sintético podría no dirigirse al hígado mediante el reemplazo de las nueve regiones hipervariables de la hexona con aquellas de diferentes serotipos.
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético comprende una proteína hexona o que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.
Hexona en Ad5 (SEQ ID NO: 8)
MATPSMMPQWSYY1HISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTFJDVTT
DRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYS
GTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPY
SGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCY
GSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPK.VVLYSEDVD
IETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQ
ASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFS1VIWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDE
LPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANL
W RNFL Y SNI AL YLPDKLK Y SP SN VKISDNPNT YD YMNKRWAPGL VDC YINLGARW SL
DYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFfflQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWN
FRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGAS1KFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQS
FNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTY
SGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFE1KRSVDGEGYNVAQCN
MTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQ
VGILHQFTNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPF
SSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVFLRPH
RG VIETV YLRTPF S AGN ATT
Hexona E451Q en AdS (SEQ ID NO: 9)
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTT
DRSQRLTLRFEPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYS
GTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPY
SGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCY
GSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPKVVLYSEDVD
IETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQ
ASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDE
LPN YCFPLGGVINTETLTK VKPK.T GQENGWEKD ATEFSDKNQIRVGNNF AMEINLN AN
LWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWS
LDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEW
NFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQ
SFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYT
YSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQC
NMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQ
QVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIP
FSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRP
HRGVIETVYLRTPFSAGNATT (la sustitución E451Q se muestra en negrita y subrayado)
C. Intercambios de cápside para evadir anticuerpos neutralizantes
La mayoría de la población humana ya tiene anticuerpos que reconocen Ad5, el serotipo más usado en investigación y aplicaciones terapéuticas. Además, una vez que se usa un serotipo de adenovirus particular en un paciente, se generarán nuevos anticuerpos que reconocen la cápside viral, lo que hace que la administración repetida del mismo vector sea problemática. Por tanto, la presente descripción contempla además explotar la modularidad del adenovirus natural para crear virus quiméricos capaces de evadir los anticuerpos neutralizantes existentes. Por ejemplo, los adenovirus sintéticos descritos en la presente descripción pueden tener además intercambios completos de módulos de "cápside" (casi el 60% del genoma), lo cual los hacen "invisibles" para los anticuerpos preexistentes y permiten inoculaciones repetidas.
En algunos ejemplos, las regiones E1, E3 y E4 del genoma se derivan de un primer serotipo de adenovirus y las regiones E2B, L1, L2, L3, E2A y L4 del genoma se derivan de un segundo serotipo de adenovirus, tal como Ad34. En algunos ejemplos, la región E1 del primer serotipo de adenovirus se modifica para codificar una proteína pIX del segundo serotipo de adenovirus; y/o la región E3 del primer serotipo de adenovirus se modifica para codificar proteínas Uexon y fibra del segundo serotipo de adenovirus. En ejemplos particulares, el primer serotipo de adenovirus es Ad5 y el segundo serotipo de adenovirus es Ad34.
D. Expresión de transgenes para investigación y aplicaciones terapéuticas
En la presente descripción se describe que los adenovirus sintéticos que comprenden una proteína fibra quimérica que tiene un dominio knob del Ad34 y mutaciones que no lo dirigen al hígado son capaces de infectar específicamente sitios de tejido herido o dañado. Se describe además que los adenovirus sintéticos son capaces de expresar transgenes en células de heridas/tejido lesionado. En un ejemplo, el transgén es un reportero, tal como un reportero de luciferasa-GFP que permite la detección de la expresión del virus. La presente descripción contempla adenovirus sintéticos que codifican genes reporteros para detectar los sitios heridos y/o el tejido dañado. La presente descripción contempla además factores que codifican transgenes que promueven la reparación de las heridas y/o la regeneración tisular. Dichos vectores sintéticos podrían usarse para una variedad de aplicaciones terapéuticas.
La presente descripción proporciona adenovirus sintéticos que codifican genes reporteros para detectar los sitios heridos y/o el tejido dañado. Es conveniente la detección y el tratamiento tempranos de una herida o del daño tisular para prevenir o limitar las consecuencias potencialmente graves de una herida, particularmente la sepsis. La sepsis es un estado de respuesta inmunitaria sistémica intensificada y la undécima causa principal de muerte (Murphy y otros., Natl Vital Stat Rep 61:1-117, 2013). En algunos ejemplos, los adenovirus sintéticos codifican uno o más genes reporteros seleccionados de luciferasa, GFP, proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente roja (RFP), proteína fluorescente azul (BFP) y proteína fluorescente naranja (tal como mOrange).
Se han investigado las principales vías de señalización implicadas en la reparación de las heridas cutáneas, incluidas, por ejemplo, las vías Wnt y TGF-p (Bielefeld y otros., Cell Mol Life Sci 70:2059-2081,2013). Los adenovirus sintéticos descritos en la presente descripción son capaces de infectar específicamente sitios heridos. En algunos ejemplos, los adenovirus sintéticos codifican al menos un factor implicado en la reparación de las heridas, como un miembro de la vía Wnt o TGF-p. En algunos ejemplos, el al menos un factor incluye uno o más de (tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 de) Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b , Wnt6, Wnt7a, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16, TGF-01, TGF-02, TGF-03, PDGF-a, PDGF-p, PDGF-c, PDGF-d y TNF-a.
En otros ejemplos, los factores implicados en la reparación de las heridas pueden incluir factores de crecimiento, citocinas, proteínas terapéuticas, hormonas, fragmentos de péptidos de hormonas, inhibidores de citocinas, factores de diferenciación y crecimiento de péptidos, interleucinas, quimiocinas, interferones, factores estimulantes de colonias y factores angiogénicos. En algunos ejemplos, al menos un factor involucrado en la reparación de las heridas incluye, pero no se limita a, un miembro de la superfamilia TGF-p, como una de las cinco isoformas de TGF-p, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) o proteínas de unión a TGF-p latente (LTBP); factor de crecimiento de queratinocitos (KGF); factor de crecimiento de hepatocitos (HGF); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento similar a la insulina (IGF); los factores básicos de crecimiento de fibroblastos (FGF-1, FGF-2, etc.), factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF); Factor VIII y Factor IX; eritropoyetina (EPO); activador de plasminógeno tisular (TPA); y activinas e inhibinas. En algunos ejemplos, al menos un factor involucrado en la reparación de las heridas es una hormona, como la hormona del crecimiento (GH) o la hormona paratiroidea (PTH). Al menos un factor implicado en la reparación de las heridas también puede incluir proteínas extracelulares, tales como proteínas de la matriz extracelular, por ejemplo, colágeno, laminina y fibronectina. En otros ejemplos, al menos un factor implicado en la reparación de las heridas incluye moléculas de adhesión celular (por ejemplo, integrinas, selectinas, miembros de la familia de Ig, tales como N-CAM y L1, y cadherinas); receptores de señalización de citocinas, tales como los receptores de TGF-p de tipo I y tipo II y el receptor de FGF; y correceptores no señalizadores tales como betaglicano y sindecano. En otros ejemplos más, al menos un factor implicado en la reparación de las heridas incluye proteínas citoesqueléticas, tales como talina y vinculina; proteínas de unión a citocinas, tales como la familia de proteínas de unión a TGF-p latentes y proteínas nucleares que actúan en trans, tales como factores de transcripción y factores potenciadores.
Aunque los tejidos dañados comparten un proceso de reparación similar después de casi cualquier estímulo destructivo, los factores de crecimiento específicos del tejido, especialmente los genes que juegan un papel clave en el desarrollo del tejido, pueden jugar un papel en la recuperación de la lesión y evitar la fibrosis. En algunos ejemplos, el adenovirus sintético codifica al menos un factor para promover la regeneración tisular o la curación del tejido de riñon dañado. En algunos ejemplos, al menos un factor se selecciona de Wt1, Pax2, Foxc1, Foxd1, Bmp4, Sall1, Fgf7, Gdnf, Notch2 y Sox9 (Vainio y Lin, Nat Rev Genet 3:533-543, 2002).
La presente descripción también contempla el uso de los adenovirus sintéticos descritos para promover la regeneración/reparación tisular después de un infarto de miocardio, cirrosis del hígado, fibrosis del pulmón y fibrosis del páncreas. El infarto de miocardio puede conducir a la formación de un tejido cicatricial, lo que finalmente da como resultado insuficiencia cardíaca congestiva. La insuficiencia congestiva del corazón es responsable de más de 100.000 muertes cada año en los Estados Unidos. La cirrosis del hígado y la fibrosis de los pulmones también son afecciones potencialmente mortales (2012 NHLBI Morbidity and Mortality Chart Book). La fibrosis en el páncreas es causada por el consumo de alcohol, tabaquismo, mutaciones genéticas o destrucción autoinmune. La necrosis/apoptosis, la inflamación o la obstrucción de los conductos en los procesos de fibrosis dan como resultado una insuficiencia exocrina y endocrina y, en última instancia, diabetes.
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético descrito en la presente descripción codifica al menos un factor para promover la regeneración tisular en el corazón o la curación del tejido del corazón dañado. En algunos ejemplos, el al menos un factor se selecciona de Mef2c, Tbx20, Hand2, Foxhl y Bop (Chen y Fishman, Trends Genet 16: 383-388, 2000).
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético descrito en la presente descripción codifica al menos un factor para promover la regeneración tisular en el hígado o la curación del tejido del hígado dañado. En algunos ejemplos, al menos un factor se selecciona de Hex, Gata4, Gata6, Tbx3, Cebp-a, Hnf1-a, Hnf1-p, Foxa1, Foxa2, Foxa3, Hnf4-a y Hnf6 (Gordillo y otros., Development 142:2094-2108, 2015).
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético descrito en la presente descripción codifica al menos un factor para promover la regeneración tisular en el pulmón o la curación del tejido del pulmón dañado. En algunos ejemplos, al menos un factor se selecciona de factor de células madre (SCF), Hnf3-p, Shh, Nkx2.1, Foxfl, Gli, FGF-10, GATA y VEGF (Kumar y otros., Adv Clin Chem 40:261-316, 2005).
En algunos ejemplos, el adenovirus sintético descrito en la presente descripción codifica al menos un factor para promover la regeneración tisular en el páncreas o la curación del tejido del páncreas dañado. En algunos ejemplos, al menos un factor se selecciona de Glul, Lgmn, Reg3a, Ngn3, Pdx1 y Mafa (Choi y otros., Bio Chem 391:1019-1029, 2010.; Zhou y otros., Nature 455:627-632, 2008).
En algunos ejemplos, el(los) casete(s) de expresión/transgén(es) se insertan y reemplazan la(s) región(es) E1 y/o E3 y/o E4. Los sitios de inserción de transgén apropiados se conocen bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Publicación PCT No. WO2012/024351).
El transgén (o ácido nucleico que codifica el factor que promueve la reparación de las heridas y/o la regeneración tisular) está operativamente ligado a un promotor. En algunos ejemplos, el promotor es un promotor heterólogo. En algunos ejemplos, el promotor es el promotor EF1a. La selección del promotor está dentro de las capacidades de un experto en la técnica. En algunos casos, el promotor es un promotor inducible o un promotor específico de tejido. Para los casos en los que se usa un promotor específico de tejido para regular la expresión del transgén, los promotores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, Pdx1 (páncreas), albúmina (hígado), al-antitripsina (hígado), MLC-2v (corazón), proteínas surfactantes A, B o C (pulmón), Sglt2 (riñón), nefrina (riñón) y cadherina específica de riñón (riñón).
En algunos casos, se usa un solo promotor para regular la expresión de múltiples genes, lo que puede lograrse mediante el uso de un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) o péptido 2A.
V. Composiciones Farmacéuticas y Métodos de Administración
En la presente descripción se proporcionan composiciones que comprenden un adenovirus sintético (o uno o más ácidos nucleicos o vectores que codifican el adenovirus sintético). Las composiciones son, opcionalmente, adecuadas para la formulación y la administración in vitro o in vivo. Opcionalmente, las composiciones comprenden uno o más de los agentes proporcionados y un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: La ciencia y la práctica de la farmacia, 22a edición, Loyd V. Allen y otros., editores, Pharmaceutical Press (2012). Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen materiales que no son biológicamente o de cualquier otra manera no deseables, es decir, el material se administra al sujeto sin causar efectos biológicos no deseables o interactuar en una manera perjudicial con los demás componentes de la composición farmacéutica en la cual está contenido. Si se administra a un sujeto, el portador se selecciona opcionalmente para minimizar la degradación del ingrediente activo y minimizar los efectos secundarios adversos en el sujeto.
Los virus sintéticos (o uno o más ácidos nucleicos o vectores que codifican el adenovirus sintético) se administran de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, intratumoral o inhalación. La administración puede ser local o sistémica y, en algunos ejemplos, directamente en el sitio de la herida. Las composiciones pueden administrarse mediante cualquiera de varias vías de administración, que incluyen tópica, oral, parenteral, intravenosa, intraarticular, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavitaria, transdérmica, intrahepática, intracraneal, nebulización/inhalación o mediante instalación a través de broncoscopia. Por lo tanto, las composiciones se administran de varias formas en dependencia de si se desea un tratamiento local o sistémico, y del área a tratarse.
Nosotros describimos que las composiciones para la administración incluirán un adenovirus sintético (o genoma sintético) como se describe en la presente descripción, disuelto en un portador farmacéuticamente aceptable, preferentemente un portador acuoso. Puede usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, solución salina amortiguada y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de materia indeseable. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales muy conocidas Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes amortiguadores y de ajuste del pH, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico y similares. La concentración del agente activo en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente en base a los volúmenes de fluido, viscosidades, peso del cuerpo y similares, de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado y las necesidades del sujeto.
Las formulaciones farmacéuticas, particularmente, de los virus sintéticos pueden prepararse mediante la mezcla del adenovirus sintético (o uno o más ácidos nucleicos que codifican el adenovirus sintético) que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables. Tales formulaciones pueden ser formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.
Los portadores, excipientes, o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los beneficiarios en las dosis y concentraciones usadas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables pueden ser acetato, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantespor ejemplo., ácido ascórbico) conservantes, polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como seroalbúmina o gelatina, o polímeros hidrófilos tal como polivinilpirrolidona; y aminoácidos, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes; y surfactantes iónicos y no iónicos (porejemplo, polisorbato); contraiones formadores de sal tal como sodio; complejos metálicospor ejemplo complejos de Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos. El adenovirus sintético (o uno o más ácidos nucleicos que codifican el adenovirus sintético) puede formularse en cualquier concentración apropiada de unidades infecciosas.
Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden consistir de (a) soluciones líquidas, tal como una cantidad efectiva del adenovirus sintético suspendido en diluyentes, tales como agua, solución salina o PEG 400; (b) cápsulas, bolsitas o comprimidos, cada uno que contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como líquidos, sólidos, gránulos o gelatina; (c) suspensiones en un líquido adecuado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de comprimidos pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidón de maíz, almidón de papa, celulosa microcristalina, gelatina, dióxido de silicio coloidal, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico, y otros excipientes, colorantes, rellenos, aglutinantes, diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes, agentes saborizantes, tintes, agentes desintegrantes, y portadores farmacéuticamente compatibles. Las formas de pastillas pueden comprender el ingrediente activo en un sabor, por ejemplo, sacarosa, así como también pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tales como gelatina y glicerina o sacarosa y emulsiones de acacia, geles, y similares que contienen, además del ingrediente activo, portadores conocidos en la técnica.
El adenovirus sintético (o uno o más ácidos nucleicos que codifican el adenovirus sintético), solo o en combinación con otros componentes adecuados, puede convertirse en formulaciones de aerosol (es decir, pueden "nebulizarse") para administrar a través de la inhalación. Las composiciones de aerosol pueden formularse en propulsores presurizados aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.
La formulación adecuada para la administración tal como, por ejemplo, las vías intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, y subcutánea, incluye soluciones de inyección isotónicas estériles acuosas y no acuosas, las cuales pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del beneficiario previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. En los métodos proporcionados, las composiciones pueden administrarse, por ejemplo, mediante infusión intravenosa, por vía oral, tópica, intraperitoneal, intravesical intratumoral o intratecal. La administración parenteral, la administración intratumoral y la administración intravenosa son los métodos de administración preferentes. Las formulaciones de compuestos pueden presentarse en envases sellados de dosis unitaria o multidosis, como ampollas y viales.
Las soluciones y suspensiones de inyección pueden prepararse de polvos, gránulos y tabletas estériles del tipo que se describió previamente. Células transducidas o infectadas por adenovirus o transfectadas con ácidos nucleicos para terapia ex vivo también puede administrarse intravenosa o parenteralmente como se describió anteriormente.
La preparación farmacéutica está preferentemente en la forma de dosis unitaria. En tal forma la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una variedad de formas de dosificación unitaria en dependencia del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración oral incluyen, pero no se limitan a, polvo, comprimidos, píldoras, cápsulas y pastillas.
En algunos ejemplos, las composiciones incluyen al menos dos adenovirus sintéticos diferentes, tales como adenovirus sintéticos que codifican diferentes transgenes. En algunos ejemplos, la composición incluye dos, tres, cuatro, cinco o seis adenovirus sintéticos diferentes.
En aplicaciones terapéuticas, los adenovirus sintéticos o composiciones de los mismos se administran a un sujeto en una cantidad o dosis terapéuticamente efectiva. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la enfermedad y del estado general de salud del paciente. La administraciones únicas o múltiples de las composiciones pueden administrarse en dependencia de la dosificación y la frecuencia, según lo requiera y tolere el paciente. Un "paciente" o "sujeto" incluye tanto humanos como otros animales, particularmente mamíferos. Por lo tanto, los métodos son aplicables tanto para la terapia en humanos como aplicaciones veterinarias.
La cantidad efectiva de un adenovirus sintético se determina de forma individual y se basa, al menos en parte, en el adenovirus sintético particular usado; el tamaño, la edad, el sexo y la salud general del individuo. Por ejemplo, para el tratamiento de un ser humano, se usan al menos 103 unidades formadoras de placa (PFU) de un virus sintético, tal como al menos 104, al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108, al menos 109, al menos 1010, al menos 1011, o al menos 1012PFU, por ejemplo se usan aproximadamente 103 a 1012 PFU de un virus sintético, en dependencia del tipo, tamaño y número de células proliferantes o neoplasmas presentes. La cantidad efectiva puede ser de aproximadamente 1,0 pfu/kg de peso del cuerpo a aproximadamente 1015 pfu/kg de peso del cuerpo (porejemplo., de aproximadamente 102 pfu/kg de peso del cuerpo a aproximadamente 1013 pfu/kg de peso del cuerpo). Un adenovirus sintético se administra en una sola dosis o en múltiples dosis (porejemplo., dos, tres, cuatro, seis o más dosis). Pueden administrarse varias dosis simultáneamente o consecutivamente (por ejemplo., durante un período de días o semanas).
En algunos ejemplos, los métodos proporcionados incluyen administrar al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como uno o más agentes que promueven la cicatrización de la herida o la regeneración tisular.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas características y/o modalidades particulares. Estos ejemplos no deben interpretarse para limitar la divulgación a las características o modalidades particulares descritas.
EJEMPLOS
Mediante el uso de tecnologías de ensamblaje del genoma y el diseño basado en la estructura, se generó una biblioteca de vectores de adenovirus sintéticos que expresan GFP-luciferasa y tienen múltiples combinaciones diferentes de modificaciones de la proteína de la cápside. Para prevenir la captación por el hígado y limitar la inflamación, se diseñaron casetes de expresión virales y transgénicos con sitios de unión para microARN específicos del hígado y modificaciones en las hexonas que evitan la unión al factor X y la captación a través de receptores tipo toll en las células de Kupffer. Estas modificaciones impidieron el secuestro del vector sintético Ad5 en el hígado. Los virus Ad5 no dirigidos se usaron como plataforma genómica para detectar nuevos tropismosin vivo mediante el intercambio de regiones de la fibra knob y eje del Ad5 con las de otros serotipos de Ad humanos. Estos virus se examinaron in vivo mediante el uso de bioluminiscencia de luciferasa e imágenes IVIS.
Ejemplo 1: Adenovirus sintéticos que expresan proteínas fibra quiméricas y modificaciones para no dirigirlos al hígado
Este ejemplo describe adenovirus sintéticos que expresan proteínas fibra quiméricas y modificaciones para no dirigirlos al hígado para dirigir la infección a tipos celulares específicos.
Mientras que se ha mostrado que las proteínas fibra de Ad5 y muchos otros serotipos se unen al CAR para la unión celular, otros serotipos han mostrado que usan CD46 (Gaggar y otros., Nat Med 9:1408-1412, 2003), desmogleína 2 (Wang y otros., Nat Med 17:96-104, 2011), ácido siálico (Nilsson y otros., Nat Med 17:105-109, 2011), u otros (Arnberg, Trends Pharmacol Sci 33:442-448, 2012). El uso de receptores de muchos serotipos no se ha examinado a fondo y no se cree que CD46 se exprese en ratones maduros. Dado que Adsembly/AdSLIC (ver Publicación PCT No. WO 2012/024351) permite la creación rápida de virus quiméricos, se generó un panel inicial de seis virus quiméricos de fibra con el fin de examinar las capacidades de direccionamiento celular alternativo de varios serotipos. Dado que el knob globular en el extremo C-terminal de la proteína de fibra es típicamente responsable de la unión al receptor, las quimeras se crearon mediante el reemplazo de la fibra knob del Ad5 con la fibra knob del Ad3, Ad9, Ad11, Ad12 o Ad34 (Tabla 1). Cada virus se creó con el mismo módulo E1 que contiene una deleción E1A/E1B y una fusión luciferasa-GFP impulsada por un promotor EF1a. El panel se uso para transducir la línea de células madre H9 y se midió la expresión de la luciferasa. En comparación con las fibras Ad5, se observó una expresión de luciferasa-GFP significativamente más alta en casi todas las células mediante el uso de quimeras, tanto con Ad3, Ad9, Ad12 como Ad34. Por el contrario, la expresión de luciferasa-GFP fue casi universalmente menor en las células transducidas con la fibra quimérica Ad11. Estos datos demuestran un uso poderoso para poder combinar partes modificadas de otros serotipos con el fin de mejorar los vectores basados en Ad5 y optimizar los virus sintéticos para su entrada en tipos celulares específicos.
Los virus sintéticos listados en la Tabla 1 también incluyen modificaciones para no dirigirlos al hígado. Los vectores tipo 5 de adenovirus naturales solo infectarán los pulmones (a través de inhalación) o el hígado (a través de administración intravenosa). La hexona Ad5 se une al factor X en la sangre, lo que conduce a su absorción por las células de Kuppfer en el hígado, lo que evita la diseminación sistémica e induce una inflamación limitada. Para superar esto y permitir la administración intravenosa de virus que pueden viajar a sitios de heridas/lesiones sistémicamente, los adenovirus sintéticos se diseñaron para incluir modificaciones genómicas adicionales en las regiones E1 y centrales que evitan la captación y expresión en el hígado. Estos virus incluyen sitios de unión en el 3'UTR del módulo de expresión E1 para un microARN que se expresa específicamente en el hígado (miR-122) y una mutación E451Q en la hexona.
Para evaluar el efecto de las modificaciones para no dirigirlos al hígado sobre el tropismo del adenovirus, se inyectaron el AdSyn-CO171 (con las modificaciones para no dirigirlos al hígado) y el AdSyn-CO199 (un virus control) en la cola de los ratones FVB/NJ. Se realizaron imágenes IVIS™ 72 horas después de la inyección para detectar la expresión de la luciferasa. Por el contrario al virus control AdSyn-CO199, el virus AdSyn-CO171 no dirigido al hígado no se acumuló en el hígado y, en cambio, pudo dirigirse a otros órganos, incluidos el bazo y los ganglios linfáticos.
Tabla 1. Adenovirus con proteínas fibra quiméricas y modificaciones para no dirigirlos al hígado
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Ejemplo 2: Modelos de heridas agudas en piel/oreja y extremidades
Para identificar los virus sintéticos que viajan a los sitios de las heridas en la piel, los adenovirus sintéticos AdSyn-CO171 (fibra salvaje), AdSyn-CO172 (fibra knob del Ad3), AdSyn-CO174 (fibra knob del Ad11) o AdSyn-CO176 (fibra knob del Ad34) se inyectaron en ratones FVB/NJ a través de inyección en la vena de la cola. Al mismo tiempo, se cortaron las orejas y las patas delanteras de los ratones. Mediante la detección de luciferasa (imágenes IVIS) y GFP (imágenes de fluorescencia), se determinó que el adenovirus sintético AdSyn-CO176, con la fibra knob del adenovirus tipo 34, transduce células en los sitios de la herida específicamente, mientras que la inyección de otros adenovirus sintéticos, incluidos el AdSyn-C0171, el AdSyn-CO172 y el AdSyn-CO174, no resultaron en actividad de luciferasa en las partes de la herida (Figura 2A). La detección de GFP por sección de tejido también mostró el mismo resultado. En particular, solo se cortaron las patas delanteras en este experimento y la señal solo pudo detectarse de patas delanteras, no de las patas traseras, lo cual indica que la señal representa la infección específica en los sitios de la herida en las patas delanteras. Además, el adenovirus quimérico AdSyn-CO176 no viajó a las orejas y las patas delanteras si no había daño en estos tejidos. Además, incluso 3 días después de la inyección, la inducción del daño cutáneo (a través del corte) condujo a la expresión de luciferasa en las orejas y las patas delanteras (Figura 2B). Este resultado demuestra que la infección específica del AdSyn-CO176 se provocó por la lesión. Durante la observación posterior, se encontró que las señales de luciferasa de otros tejidos, principalmente del hígado y el bazo, se silenciaron dentro de una semana. Por el contrario, las señales de los sitios de las heridas duraron tres semanas. Este resultado indica que el adenovirus sintético con la fibra knob del Ad34 exhibe una expresión prolongada del transgén y no se silencia, lo cual es una característica ideal para la reparación de las heridas.
Ejemplo 3: Transducción posterior a la herida y suministro específico al tejido herido
La reparación de las heridas cutáneas se caracteriza por el solapamiento de tres etapas, denominadas (1) la hemostasis e inflamación, (2) la proliferación y (3) etapas de remodelación (Bielefeld y y otros., Cell Mol Life Sci 70:2059-2081,2013). La fase de hemostasis/inflamación dura hasta 48 horas. La etapa de proliferación dura alrededor de 2 a 10 días y el proceso de remodelación dura un año o más (Gurtner y otros., Nature 453:314-321, 2008). Para determinar si el suministro de vectores de adenovirus sintéticos puede infectar células en el sitio de una herida varios días después de la lesión, opuesto a antes o en el momento de la lesión, se realizó un a perforación de las orejas 48 horas antes de administrar los vectores de adenovirus sintéticos (AdSyn-CO171, AdSyn-CO174 y AdSyn-CO176). El adenovirus tipo 11 (AdSyn-CO174) y el tipo 34 (AdSyn-CO176) pertenecen a la especie B y a la subespecie B1, por lo que se esperaba que tuvieran tejidos diana similares. La detección de luciferasa mostró que el adenovirus sintético con la fibra quimérica de eje knob/Ad5 del Ad34 (AdSyn-CO176) todavía se expresa específicamente en los sitios de la herida. Pero otros adenovirus, incluído el adenovirus quimérico con eje de fibra knob/Ad5 de la fibra de Ad11 (AdSyn-CO174), no dieron señal en el sitio de la herida. Este resultado indica que el adenovirus quimérico con una fibra knob del tipo 34 también puede infectar los sitios de la herida en la fase tardía después de la lesión.
Ejemplo 4: Modelo de daño renal agudo
La observación de la expresión específica del adenovirus sintético con el dominio knob de fibra de del tipo 34 en la lesión cutánea y los broches de los dígitos óseos, impulsó la investigación de si el adenovirus sintético puede infectar tejidos internos adicionales dañados a través de mecanismos alternativos. Para explorar este tema, se estableció el modelo de lesión por isquemia-reperfusión renal (IRI). El IRI se ha usado más ampliamente como modelo para estudiar la patobiología de la lesión renal aguda, la cual se asocia con diversas afecciones clínicas que incluyen traumatismo, sepsis, toxicidad y paro cardíaco (Himmelfarb e Ikizler, Kidney Int 71:971-976, 2007). En dependencia de la gravedad de la agresión isquémica, la IRI aguda puede resolverse con la regeneración de los túbulos dañados o puede progresar a una enfermedad renal crónica con fibrosis intersticial (Burne-Taney y otros., Kidney Int 67:1002-1009, 2005). En el modelo usado en la presente descripción, la lesión isquémica moderada (25 minutos) resulta en una respuesta regenerativa y la resolución de la lesión.
Los ratones se inyectaron con el adenovirus quimérico AdSyn-CO176 por la vena de la cola, 24 horas después de la inducción de la lesión. La expresión de la luciferasa se detectó en el lado del riñón dañado, 48 horas después de la inyección. El riñón de un ratón infectado sin daño no dio señales de luciferasa. Además, los ratones no infectados en los que se indujo el daño al mismo tiempo que los ratones infectados tampoco dieron señal (Figura 3A). El día 7, se silenció la expresión del adenovirus en el hígado y el bazo, pero se mantuvo la expresión en el riñón dañado (Figura 3B). La detección de GFP por sección de tejido también apoyó este resultado. Interesantemente, para el ratón que no se sometió a la cirugía, la expresión de luciferasa se limitó al hígado y al bazo. Sin embargo, cuando se indujo el daño en el riñón, el AdSyn-CO176 infectó el riñón dañado y mostró una captación reducida por el hígado. Este fenómeno motivó un estudio para determinar si se podría obtener una señal más concentrada si se inyecta más virus. Por tanto, se realizó un segundo experimento en el que los ratones recibieron una dosis 10 veces mayor del AdSyn-CO176 que la que recibieron los ratones para el estudio anterior. Se realizó cirugía IRI en el riñón izquierdo de los ratones para inducir daño IRI. Cuarenta y ocho horas después de la cirugía, la dosis más alta del AdSyn-CO176 se inyectó en los ratones mediante inyección en la vena de la cola. Se realizaron imágenes IVIS™ 48 horas después de la inyección. A continuación, se separaron y seccionaron ambos riñones para observar la señal de GFP (Figura 4A). Una imagen IVIS™ de los ratones mostró que la expresión del AdSyn-CO176 se concentraba en el riñón dañado, con una acumulación reducida en el hígado y el bazo (Figura 4B). Las secciones de riñón normal no mostraron señal de GFP. Las secciones del riñón dañado por IRI mostraron una fuerte señal de GFP, lo que indica que el AdSyn-CO176 se expresa específicamente en el sitio del tejido dañado. En conjunto, estos hallazgos revelan que un adenovirus sintético, que tiene una fibra quimérica de eje knob/Ad5 del Ad34, tiene la capacidad de infectar, específicamente al riñón IRI.
Ejemplo 5: El Ad34 salvaje no presenta tropismo en los sitios de las heridas
Los ejemplos anteriores demostraron que un adenovirus sintético que comprende el dominio knob del Ad34 fue capaz de dirigirse a sitios de tejido herido. Para evaluar si el Ad34 salvaje también es capaz de rastrear la herida, se diseñó un virus reportero sintético basado en el Ad34 salvaje. Se generó el AdSyn-CO721 mediante el reemplazo de los genes de la región E1 del Ad34 salvaje con el reportero EF1a-[luc-GFP]-miR122. El AdSyn-CO721 no contiene otras modificaciones. Ratones FVB/NJ se inyectaron por la vena de la cola con AdSyn-CO171, AdSyn-CO176 o AdSyn-C0721. Se perforaron ambas orejas de los ratones al mismo tiempo que se inyectó el virus. Se realizaron imágenes IVIS™ 48 horas después de la inyección. Los resultados se muestran en las figuras 5A-5C. Como era de esperar, el AdSyn-CO176 infectó los sitios de la herida, mientras que el AdSyn-CO171 no lo hizo. El virus Ad34 (AdSyn-C0721) no dio señal de luciferasa específica después de la inyección intravenosa, lo cual es consistente con la literatura publicada. Estos resultados demostraron que el Ad34 salvaje no presenta tropismo en el tejido herido.
Ejemplo 6: Adenovirus sintético que codifica PDGF-P en un modelo de lesión por isquemia-reperfusión renal (IRI)
El modelo de lesión por isquemia-reperfusión renal (IRI) se usó como ejemplo para determinar si el adenovirus sintético que se aloja específicamente en el tejido dañado podría suministrar un factor de cicatrización de la herida para promover la reparación tisular. Se seleccionó el factor de crecimiento derivado de plaquetas-p (PDGF-p) como el factor de cicatrización de la herida porque se ha informado previamente que este factor de crecimiento es importante en el proceso de cicatrización de heridas en otros modelos de daño tisular. También se ha descrito previamente que un adenovirus sintético que codifica PDGF-p fue capaz de curar el tejido de la oreja dañado cuando se inyecta directamente en una oreja de conejo isquémica (Liechty y y otros., J Invest Dermatol 113:375-383, 1999). Sin embargo, este virus no es capaz de infectar específicamente los sitios de la herida después de la administración sistémica y, por lo tanto, se inyectó directamente en el tejido lesionado. Como se describe en los ejemplos anteriores, el adenovirus sintético AdSyn-CO176 es capaz de infectar específicamente los sitios de lesión tisular y, por lo tanto, puede usarse para atacar el tejido dañado después de la administración intravenosa.
Para el siguiente estudio, se generaron dos adenovirus sintéticos adicionales:
(1) El AdSyn-CO876 es una versión modificada del AdSyn-CO171 (el cual es un vector no dirigido al hígado que no se dirige a los tejidos heridos) que expresa PDGF-p; y
(2) El AdSyn-CO877 (SEQ ID NO: 10) es una versión modificada del AdSyn-CO176 (que es un vector no dirigido al hígado que transduce los tejidos heridos) que expresa PDGF-p.
Para evaluar estos virus en el modelo de IRI renal, se indujo lesión por isquemia-reperfusión en ambos riñones al pinzar los pedículos renales durante 30 minutos. A continuación, los ratones se inyectaron inmediatamente por a través de la vena de la cola con 200 pl de solución salina, 109 partículas de virus del AdSyn-CO876 o 109 partículas de virus del AdSyn-CO877. Los controles incluyeron un ratón con daño renal inducido que no recibió inyección, un ratón operado de forma simulada (el mismo procedimiento quirúrgico, excepto que no se aplicó la pinza) que no recibió infección, y un ratón sin daño renal que no recibió una inyección. Se extrajo sangre en el momento de la inyección (0 h), y después de 18 horas, para medir el nitrógeno ureico en sangre (BUN) y la creatinina. Los resultados se muestran en la Figura 7A (BUN) y Figura 7B (creatinina).
Los ratones IRI que no recibieron ningún tratamiento terapéutico mostraron niveles elevados de BUN y creatinina, consistente con la inducción del daño renal. El tratamiento de ratones IRI con el AdSyn-CO876 no redujo los niveles de creatinina y BUN en el suero. Esto es consistente con el hecho de que un vector Ad5 no dirigido al hígado con un eje del Ad5 salvaje (basado en AdSyn-CO171) no puede alojarse en el tejido dañado. Por el contrario, el tratamiento

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un adenovirus sintético que comprende:
un transgén que codifica al menos un factor heterólogo que promueve la reparación de las heridas o la regeneración tisular;
una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado; y
una proteína fibra quimérica que comprende un dominio de eje del adenovirus tipo 5 (Ad5) y un dominio knob del adenovirus tipo 34 (Ad34), para su uso en la promoción de la reparación de heridas o la regeneración tisular en un sujeto.
2. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de la reivindicación 1, en donde la herida es una herida cutánea.
3. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de la reivindicación 1, en donde el tejido dañado es tejido de riñón, corazón, hígado o pulmón, en donde opcionalmente el adenovirus sintético comprende una cápside modificada que no dirige el virus al hígado, en donde opcionalmente el adenovirus sintético comprende un proteína hexona, opcionalmente la proteína hexona modificada comprende una mutación E451Q.
4. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el adenovirus sintético comprende además uno o más sitios de unión para un microARN específico del hígado, opcionalmente el microARN específico del hígado es el miR-122, opcionalmente en donde uno o más sitios de unión están en 3'UTR de la región E1 del adenovirus
5. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el transgén codifica al menos un factor que promueve la reparación de heridas, opcionalmente al menos un factor que promueve la reparación de heridas se selecciona del grupo que consiste en:
i) un miembro de la vía de señalización Wnt o la vía de señalización TGF-p;
ii) se selecciona del grupo que consiste en Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16, TGF-(31, TGF-(32, TGF-P3, PDGF-a, PDGF-P, PDGF-c, PDGF-d, y TNF-a;
iii) PDGF-p.
6. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el transgén codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el riñón, opcionalmente el al menos un factor se selecciona del grupo que consiste en: Wt1, Pax2, Foxc1, Foxd1, Bmp4, Sall1, Fgf7, Gdnf, Notch2, Sox y progranulin (PGRN).
7. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el transgén codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el corazón, opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en: Mef2c, Tbx20, Hand2, Foxhl y Bop.
8. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el transgén codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el hígado, opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en; Hex, Gata4, Gata6, Tbx3, Cebp-a, Hnf1-a, Hnf1 -p, Foxa1, Foxa2, Foxa3, Hnf4-a y Hnf6.
9. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el transgén codifica al menos un factor que promueve la regeneración tisular en el pulmón, opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en factor de células madre (SCF), Hnf3-p, Shh, Nkx2.1, Foxf1, Gli, FGF-10, GATA y VEGF.
10. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la expresión de al menos un factor heterólogo que promueve la reparación de heridas o la regeneración tisular está regulado por un promotor específico de tejido, opcionalmente en donde el promotor específico de tejido se selecciona del grupo que consiste en:
i) un promotor específico de tejido activo en el tejido de riñón, corazón, pulmón, hígado o páncreas.
ii) un promotor específico de tejido seleccionado de:
el promotor específico del páncreas que comprende Pdx1;
el promotor específico del hígado que comprende albúmina o a1-antitripsina;
el promotor específico del corazón que comprende MLC-2v;
el promotor específico de pulmón que comprende las proteínas surfactantes A, B o C; o
el promotor específico de riñón que comprende Sglt2, nefrina y cadherina específica de riñón.
11. Un adenovirus sintético que comprende:
un gen reportero;
una cápside nativa o modificada que no dirige el adenovirus sintético al hígado; y
una proteína fibra quimérica que comprende un dominio de eje del adenovirus tipo 5 (Ad5) y un dominio knob del adenovirus tipo 34 (Ad34), para su uso en la detección de una herida o tejido dañado en un sujeto
12. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el adenovirus sintético se genera a partir de un genoma del vector Ad5 o Ad2.
13. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el adenovirus sintético comprende además uno o más sitios de unión para un microARN específico del bazo, opcionalmente en 3' UTR de la región E1 del adenovirus.
14. Un adenovirus sintético de acuerdo con el uso de la reivindicación 13, en donde el microARN específico del bazo es miR142-3p.
15. Un genoma de adenovirus sintético que comprende la SEQ ID NO: 6 para su uso en la detección del tejido herido o dañado en un sujeto.
16. Un genoma de adenovirus sintético que comprende la SEQ ID NO: 10.
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